TARIFNAME Teknik Alan Mevcut bulus prognoz belirteci ve kanser tedavisinde spefisik hedef olarak kullanima uygun hekzokinaz l (HKl) izoformlarina, özellikle hekzokinaz lb (Hklb) izoformuna iliskindir. Teknigin Bilinen Durumu Kanser genel olarak hücrelerin kontrolsüz büyümesi olarak tanimlanir. Kanserin en önemli belirteçlerinden birisi metabolik yeniden programlamadir (] ). Kanser hücreleri bu yetenekleri sayesinde, normal hücrelerden farkli olarak, büyümek ve yayilmak için artan glikolitik akistan destek alir ve bu durum onlari glikoz metabolizmasinin bozulmasina daha hassas hale getirir (2). Her ne kadar degisen glikoz metabolizmasini hedefleyen yeni terapilerin gelistirilmesi ön klinik çalismalarda basari göstermis olsa da, görülen klinik basari olusan yan etkilerden dolayi sinirli kalmistir (3). Glikolizin düzensizlesmesi küçük hücreli olmayan akciger kanserinde (NSCLC) yaygin görülen bir olgudur (4). p53'ün 'onemli düzenleyici görevlerinden biri glikoz ve oksijen seviyesine bagli olarak glikolizi arttirmak için hekzokinazlari (HK) aktive ederek hücresel metabolizma yolagini kontrol etmektir(5, 6). Hekzokinazlar (HK) glikoz metabolizmasinin temel olarak geri döndürülemeyen ilk adimi olan glikozu fosforlayarak glukoz-ö-fosfata (G-6-P) çevirme adimini katalize eder. HK enzimleri HKl, HK2, HK3 ve HK4 olarak adlandirilan dört genle kodlanir. HKl hemen hemen tüm memeli dokularinda yer almaktayken, HK2 normalde adipoz doku, iskelet doku veya kardiyak kaslar gibi insüline duyarli dokularda ifade edilir. HK3 genelde düsük miktarlarda ifade edilir ve HK4 ifadesi pankreas ve karacigerle sinirlidir (7). Bunlardan l-lKl, HK2 ve HK3 glikoz için düsük Km degerine sahiptir, bu durum bunlarin HK4'e göre daha yüksek glikoz afinitesi oldugunu ifade etmektedir. Ancak, HKl inorganik fosfat varliginda kendi ürünü olan G6P tarafindan azaltilmis inhibisyon gösteren tek izoformdur. Bu nedenle, yüksek enerji ihtiyaci olan, Pi'nin hücreler arasi konsantrasyoiiunuii arttigi ve G6P konsantrasyonunun azaldigi, dönemlerde HK] aktivitesi artarak HKl tarafindan daha fazla glikozun fosforlanmasi ve enerji üretimi için asagi akim metabolizmasina girmesi saglanmaktadir.HK1 esas olarak mitokondri ile iliskili iken, HK2 hem mitokondri hem de sitoplazmik bölmelerle iliskilidir (8, 9 ve 10) Sadece bir transkripti olan HK2 geninden farkli olarak, HKl geninin alternatif zincirlesme nedeniyle birkaç transkripti vardir. Her ne kadar RNA dizileme teknolojilerinin ortaya çikmasiyla transkript yapilari hakkinda daha fazla bilgiye sahip olsak da, transkriptomun tam kapsamini tanimlamaktan hala uzaktayiz. Bilinen birden fazla gen ek açiklama veritabani bulunmaktadir ancak bunlarin hepsi birbiriyle tutarli degildir. Burada transkript tanimlari için en büyük kaynaklardaii biri olan RefSeq gen açiklamalarini kullaniyoruz. RefSeq gen açiklamalarina göre, HKl geninin 10 farkli izoformu vardir. Bu izoforrnlarin yarisi testis dokusuna özgüdür ve diger dokularda görülmezler (11, 12). HKla, HKlb ve HKlc olmak üzere yüksek sekans ve yapisal homolojiyi paylasan HKl 'in geri kalan izoformlarinin üçünün diferansiyel ekspresyon kaliplari incelenmemistir ve NSCLC ve diger kanserlerde tümörigenez, hücre sag kalimi ve ilaç yanitindaki rolleri hala net olarak bilinmemektedir. Burada bulusçular kanser hücresinin glikoz metabolizmasinda etkili izoform spesifik katilimcilari tanimlamayi hedeflemektedir. Söz konusu izoform spesifik katilimcilar normal hücredeki sistemik homeostaz veya buna karsilik gelen metabolik fonksiyonlardan taviz vermeden seçici olarak kanser hücrelerini elimine etmeyi saglayacagindan, bunun kanser tedavisinde ilgi çekici bir yaklasim olacagi düsünülmektedir. Bulusun 'Ozeti Mevcut bulus HKlb'ye ve onun tümörigenezdeki rolüne iliskindir. Özel olarak, mevcut bulus kanserin, özellikle küçük hücreli olmayan akciger kanserinin (NSCLC) tedavisi/'Önlenmesi için bir yönteme iliskindir. Mevcut bulus temel olarak HKl'in üç izoformundan, 'özellikle HKlb ve HKl c'den sadece HKlb'nin agirlikli olarak A549 hücrelerinde ve NSCLC hastalarinda ifade edildigi bulusuna dayanmaktadir. Bu durum NSCLC hücrelerini çevre dokudaki normal akciger hücrelerinden ayirmakta ve HKlb düsük hasta sag kalimi ile iliskilendirilmektedir. Ayrica, bulusçular p53 durumuna göre HKlb ifadesinin degistigini p53 içermeyen (p53 null) ve p53 içeren (p53WT) küçük olmayan hücreli akciger kanseri (NSCLC) hücreleri kullanarak göstermislerdir. HKlb'nin p53 ile kontrol edilmesinin mekanizmasinin belirlenmesinde, CRlSPR/Cas9 sistemi kullanilarak insan NSCLC A5549 hücrelerinde p53 ve HKlb izoformu silindi ve sonuçta p53 pozitif sekilde HKlb'yi kontrol ettigi gösterildi. HKlb nakavt edilmis insan A549 hücrelerinde yapilan deneyler (A549 HKlb -/-), HKlb'nin NSCLC hücrelerinde proliferasyonu inhibe ettigini ve in vivo tümör büyümesini durdurdugunu gösterdi. HKlb nakavt hücreleri hazirlamak için, SEQ lD No: 1, SEQ 1D No: 2 veya SEQ 1D No: 3'e karsilik gelen bir yolcu dizi ve sirasiyla SEQ ID No: 4, SEQ 1D No:5 veya SEQ 1D No:6'ya karsilik gelen bir rehber dizi içeren çift sarmalli moleküller hazirlandi. Ayrica, bu yolcu dizi ve rehber diziler çift sarmalli yapiyi olusturmak için birbiriyle hibridize edildi. Örnegin, SEQ ID No:1 içeren yolcu dizi, SEQ ID No: 4 içeren rehber dizi ile hibridize edildi (çift sarmalli molekül 1); SEQ ID No:2 içeren yolcu dizi, SEQ ID No: 5 içeren rehber dizi ile hibridize edildi (çift sarmalli molekül 2); SEQ 1D No:3 içeren yolcu dizi, SEQ 1D No: 6 içeren rehber dizi ile hibridize edildi (çift sarmalli molekül 3). Bir açidan, bulusun bir amaci, bir hücreye girdiginde HKlb'yi nakavt eden ve sonuç olarak glikoliz ve proliferasyon ve kanser hücrelerinin, 'Özellikle de NSCLC hücrelerinin büyüinesini inhibe eden izole çift sarmalli moleküller saglamaktir. Bulusun bir baska amaci ilaç olarak, tercihen kanser, özellikle NSCLC tedavisi için bir yöntemde kullanilmak üzere izole çift sarmalli moleküller saglamaktir. Bulusun bir baska amaci kanser gibi, Özellikle NSCLC gibi HKlb ilintili hastaliklarin engellenmesinde ve/veya tedavisinde kullanim için bilesimler gelistirmek olup, söz konusu bilesimler çift sarmalli moleküller 1, 2 veya 3'ten en az bir tanesini içerir. Bulusun bir diger amaci, bir canlidaki HKlb izoformu ifadesini indeks olarak kullanarak kanserin, `ozellikle NSCLC'nin teshis edilmesi veya saptanmasi için bir metot saglamakta". Ozelikle, bir canlidan alinan biyolojik numunede test edilen izoformun kontrol seviyesine kiyasla daha yüksek seviyede HKlb olmasi canlida kanserin varligini veya canlinin kanserden muzdarip oldugunu ifade eder. Bulusun bir basla amaci, kanser, özellikle NSCLC gibi HKlb ilintili hastaliklarin tedavisi ve/veya önlenmesinde kullanim için bir aday maddenin taranmasinda kullanim için bir tarama yöntemi saglamaktir. Bu baglamda, aday madde belirli bir indeks kullanilarak; (i) HKlb izoformuna baglanma aktivitesine göre veya (ii) HKlb izoformuiiun biyolojik aktivitesine karsi inhibitör aktivitesine göre veya (iii) HKlb izoformunun ifadesine karsi baskilayici aktivitesine göre seçilebilir. Bulusa uygun tarama metodu için özellikle ilgi çekici olan HKlb izoformu biyolojik aktivitesi glikolizi içerir. Yukarida bir dizi amaç siralanmistir. Bulusun ilgili alaninda uzman kisi tarafindan anlasilacagi gibi bulusun bir veya daha fazla uygulamasi bazi amaçlari tek basina veya digerleriyle kombine olarak karsilayabilir. Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil HK] 'in fazla eksprese edildigini göstermektedir. Sekil lve Sekil 2 toplam 13 NSCLC hastasi tümör vakasinda ve 10 bitisiginde tümör yer almayan normal akciger dokusunda iki farkli western blot analizinde HKlb seviyelerini gösterir. Sekil 3, NSCLC tümöründe (n = 13) ve normal akciger örneklerinde (n=10) HK] düzeylerinin miktarinin belirlenmesini göstermekte olup HK] ekspresyonunun anlamli olarak yükseldigi görülmektedir (p< 0.0001). Sekil 4, immünohistokimya testini kullanarak HKl'in in situ ifadesini göstermektedir. Kanserli olmayan tüm epitel doku zayif HK] boyamasi verirken, tümör hücreleri orta derece ile güçlü derecede boyairia vermektedir. Sekil 5, p5 3 gen imza ekspresyonuna (p53 WT ve p53mutant) dayanan gen seti zenginlestirme analizi (GSEEA) kullanilarak GSE3]2]0 veri kümesindeki NSCLC ve normal numuneler arasindaki karsilastirma analizini gösterinekte olup, burada 1nutantp53'e sahip hastalarin daha yüksek HK] seviyelerini ifade ettigini görülmektedir. Sekil 6'da, evre ] ve ]] hastalarinin gen seti zenginlestirme analizi (GSEEA) kullanilarak GSE31210 veri kümesindeki NSCLC ve normal numuneler arasindaki karsilastirma analizini göstermekte olup, evre ll hastalarinin sadece p53 WT grubunda daha yüksek HK] ekspresyonuna sahip oldugu görülmektedir. Sekil 7'de, daha yüksek HK] ekspresyonunun azalmis relapssiz/nüks etmeden sagkalim ile iliskili oldugunu gösteren sag kalim analizini göstermektedir (P:0.01), burada daha yüksek HKl ekspresyonunun hastalik ilerlemesi ile iliskili oldugunu görülmektedir. Istatistiksel analiz için ögrenci t-testi (**p < 0.05) yapildi. Sekil 8-10 RefSeq HK] gen transkript varyantlarini, HK2 gen transkriptini ve HKlb izoformunun yapisal farklarini gösteren moleküler dinamik simülasyonlarini göstermektedir, Sekil 8, dokuya Özgü diferansiyel üç HKl izoformunun; HKla, HKlb ve HKlc'nin ve HK2 geninin bir transkriptinin RefSeq gen anotasyonunu göstermektedir. Hkla transkripti 5' ucunda farkli ekzonlar tasidigindan bu transkripti ayirt etmek mümkündür. Hem HKlb hem de HKla izoformlari bir ekstra ekzona, ekzon 8°e, sahip olup, bu ekzon HKlc izoformunda eksiktir. Sekil 9, HKlb ve HKlc modellerinin kristal yapilari arasindaki yapisal uyumu göstermektedir. Sekilde maviyle gösterilen HKlb'de yer alan ekstra ekzon, N-ucunun alt alaninin bir parçasi olan 32 aminoasit uzunlugundaki alfa sarmalini kodlamaktadir. Konuyu basitçe açiklamak için sadece bir monomer gösterilmektedir. Sekil 10 HKlb, HKlc izoformlari ve HK2 egrileri kullanilarak gerçeklestirilen kök ortalama kare degisim degerlerini göstermekte olup, burada HKlb izoformunun N-alaninin stabilitesini saglayan özgün sekanslar içerdigi görülmektedir. Sekil 1 1-14 NSCLC hastalarinda l-lKlb izoformu upregülasyonunu göstermektedir. Sekil hücrelerindeki immünoblot analizini göstermektedir. Sekil 13, NSCLC hasta tümörlerinde (n:3) HKl izoformlari, HK2 ve p53'ün temsili semi q-PCR amplifikasyon sonuçlarini göstermektedir. Sekil 14, NSCLC hastalarinin normal akciger dokusu ve tümör numunelerinden ekstrakte edilen RN A'lari göstermekte olup, HKlb, HKlc, HK2 belirlenmistir. mRNA seviyeleri ACTB mRNA'ya göre normalize edilmistir. Veriler iki veya üç bagimsiz deneyden üç tekrarla elde edilmis olup student's t-test kullanilarak ortalama +/-orta1amanin standart hatasi olarak sunulmustur. Sekil 15-17 HKlb izoformunun ifade edilmesindeki/ekspresyonundaki artisin kanser genom atlasi hasta verilerinde kötü prognoz ile iliskili oldugunu göstermektedir. Sekil 15, kanser genom atlasi toplulugundan hastalarinin TCGA adenokarsinom numuneleri ve normal numuneler arasindaki HKlb izoformu yüksek ekspresyonu iliskisini gösteren Kaplan-Meier grafigini göstermektedir. Sekil 16 adenokarsinom (n: 501) için Kaplan- Meier sag kalim egrilerini göstermektedir. Sekil 17 skuainöz hücreli karsinom (n=489) için Kaplan-Meier sag kalim egrilerini göstermektedir. Bu testler için hastalar düsük veya yüksek HKlb ifadesine/ekspresyonuna göre gruplandirilmistir. P degerleri, log-siralama (Mantel-Cox) testini kullanarak sag kalim egrilerinin karsilastirilmasindan elde edilen anlamlilik seviyelerini gösterir Sekil 18-20 genetik olarak HKlb izoformunun uzaklastirilmasinin NSCLC hücrelerinin metabolizmasi ve tümörigenez üzerindeki etkilerini göstermektedir. Burada CRISPR/Cas9 sistemi ve ayni CRISPR sekansinin siRNA'yla ifadesinin azaltilmasi PCR seviyelerini göstermektedir. Hata çubuklari ortalama +/- standart ölçüm hatasini (n=3) gösterir ve p53 KO immünoblot analizi A549 hücrelerinde yapilmistir.Sekil 19 HKlb, HKlc, HK2 ve p53'ün A549 hücrelerindeki qRT-PCR seviyelerini göstermektedir. Hata çubuklari ortalama +/- standart ölçüm hatasini (n:3) gösterir ve HKlb KO immünoblot analizi A549 hücrelerinde yapilmistir. Sekil 20, A549 WT ve A549 HKlb-/- hücrelerinin HKl antikoru kullanarak yapilan immünofloresans ve immünoblot analizlerini göstermekte olup endojen nHKl proteininin tamamen eksik oldugunu ve endojen p53 proteininin seviyesinde bir degisiklik olmadigini göstermektedir. Sekil 21-23'te Seahorse metabolik analiz cihazi kullanilarak NSCLC hücrelerinin glikoza bagimli oldugu ve HKlb'nin NSCLC hücrelerinin glikolitik aktivitesi için elzem oldugunu göstermektedir. Sekil 21, HKlb nakavti (Knockout/KO) sonrasi mitokondriyal solunumun analiz sonuçlarini göstermekte olup, burada oksijen tüketim oraninda (OCR) ve solunumda kayda deger bir degisiklik olmadigi görülmektedir. Sekil 22, XF glikoliz testiyle hücre disi asidifikasyon orani (ECAR) ölçümü sonuçlarini göstermektedir. XF glikolitik oran analizi kontrol hücrelerine (A kiyasla HKlb izoformunun kaybi durumunda (A A549 hücrelerinin glikolitik aktivitesinde önemli azalma oldugunu göstermektedir. Sekil 23, proliferasyon belirteci olan Ki-67'nin in vitro akis sitometrisi analizi sonuçlarini göstermekte olup burada A549 -/- hücrelerinin yaklasik Sekil 24 ve 25 HKlb nakavtinin A549 hücrelerinin tümör olusmasi üzerindeki etkisini göstermektedir. Sekil 24'te A549 WT veya A549 HKlb-/- hücreleri immün yetmezligine sahip NSG erkek farelere trake içerisinden verilmesiyle alinan veriler bulunmaktadir. Sol taraftaki grafikler A ve A549 HKlb -/- verilen farelerdeki (her biri için n:7) tümör hacmini göstermekte olup, çikarilan tümörlerin görüntüleri de solda verilmektedir. Tümör hacimleri ortalama +/- standart ölçüm hatasi ile gösterilinekte olup çift kuyruk eslestirilmemis t-testi uygulanmistir. Sekil 25, HK] ifadesinin/ekspresyonunun immünohistokimyasal boyamasini ve temsili A549WT tümörü fare ksenografti (sol) ve A boyamasini göstermektedir. Görüntüler 40X büyütmeyle, küçük resimler 200X büyütmeyle hazirlanmistir. Olçü çubuklari, 100 um boyutundadir. Sekil 26, A549 WT ve A549 HKlb -/- hücrelerinin cisplatin tedavisi sonrasi mitokondriyal solunum oraninin analizini göstermektedir. Analiz sonucunda bazal solunum oraninda kayda deger degisiklik olmadigi görülmektedir. Sekil 27, A549 WT ve A549 HKlb -/- hücrelerinin cisplatin tedavisi sonrasi XF glikoliz stres testiyle hücre disi asidifikasyon orani (ECAR) ölçümü sonuçlarini göstermektedir. Sonuçlara bakildiginda kayda deger olmasa da bazal glikoliz ve glikolitik kapasitenin azaldigi ve cisplatin tedavisi uygulanan A549 HKlb -/- hücrelerinde glikolitik rezervin tamamen eksik oldugu görülmektedir. Sonuçlar 3 bagimsiz deneyin +/- standart sapmasidir (SD). P-degerleri Student's t-test kullanilarak hesaplanmistir (***, P < 0.001). Sekil 28, hücre canliligi deneyinin sonuçlarini göstermekte olup, A549 WT HKlb -/- hücreleri A lC50 degerine sahiptir. Sekil 29, propidyum iyodür (Pl) boyamayla ölçülen hücre ölümünün akis sitometrik kantifikasyon analizini göstermekte olup, HKlb silinmesinin ve cisplatinin sinerjik etki göstererek A549 HKlb -/- hücrelerde belirgin sekilde hücre ölümünü amirdigi görülmektedir. Sekil 30, apoptotik yolagin ammünoblot analizini rapamisinin kontrol tedavi yöntemi olarak kullanilmasiyla göstermektedir. Burada, sadece cisplatin tedavisinin PARP ve Kaspaz 3 kirilmasini arttirdigi ancak A549 HKlb -/- hücrelerinde bu kirilmanin daha Sekil 31 HKl ve Bcl*'nin immünoblot analizini göstermektedir. Anti-beta-aktin yükleme kontrolü olarak kullanilmistir. Sekil 32, HKlb ablasyonu ve cisplatin kullaniminin sinerjik etkisinin p53 -aracili apoptotik hücre ölümünü arttirdigini göstermektedir. Cisplatin (sirasiyla 75uM ve 47 uM) veya rapamisin (sirasiyla lOOuM ve 47 uM) ile muamele edilen hücrelerin immünoblot analizleri ve p53 ve HZAXB'nin immünoblot analizleri verilmektedir. Ayrica, apoptosis karakteristiklerini gösteren temsili geçirim elektron mikroskopu (TEM) mikrogratlari verilmis olup, görüntüler bagimsiz iki deneyi göstermektedir. Burada ölçü çubugu solda lum (left) ve sagda 400 nm'dir. Sekil 33, otofajik sinyal yolaginin immünoblot analizini göstermektedir. LC3II olusumunun A549 HKlb -/- hücrelerinde belirgin sekilde yüksek olmasi nedeniyle HKlb eliminasyonu glukoz yokluguna cevap olarak otofa ji olusumunu hafifletmektedir. HKlb silinmesi ve cisplatin A549 HKlb -/- hücrelerinde mTOR fosforilasyonunu belirgin sekilde inhibe etmektedir. Bu etkinin AMPK araciligiyla olusturulmadigi oldukça açiktir. Sekil 34'de otofaji karakteristiklerini gösteren temsili geçirim elektron mikroskopu (TEM) mikrograflari verilmis olup, görüntüler bagimsiz iki deneyi göstermektedir. Burada ölçü çubugu solda 2 um ve sagda 400 nm'dir. Kirmizi oklar otofajik kesecileri, siyah yildizlar myelinoid cisimcikleri ve n çekirdek parçalarina isaret etmektedir. Sekil 35, inTOR aktivasyonunun akis sitomerisi analizini göstermekte olup, HKlb Silinmesi ve cisplatinin mTOR fosforilasyonunu belirgin sekilde inhibe ettigi görülmektedir (p:0.001).Sonuçlar 3 bagimsiz deneyin +/- standart sapmasidir (SD). P- degerleri Student's t-test kullanilarak hesaplanmistir (***, P < 0.001). Sekil 36, Sanger sekanslama analizi sonuçlarini göstermektedir. HKlb izoformuna spesifik sgRNA'lar sadece insan HKl geninin sekizinci eksonunu hedeflemek için tasarlandi. sgHKlb ifade eden/eksprese eden GFP siralamasi yapilmis tek hücre klonlarinin ifadesi/ekspresyonu HKlb izoform eliminasyonu ve hedef alanlardaki spesifik indel mutasyonlar için PCR ile gözden geçirildi ve Sanger siralamasi ve HKlb hedef DNA'daki l4bp nükleotitlerin silindigini gösterdi. Bulusun Detayli Açiklamasi Bulusun bir unsuru bir canlida kanserin tespit edilmesi veya teshis edilmesi için bir yöntem olup, söz konusu yöntem canlidan alinan bir biyolojik numune içerisindeki HKlb izoformu ifadesinin seviyesinin belirlenmesini içerir, ki burada söz konusu HKlb izoformunun normal kontrol seviyesine kiyasla daha yüksek olmasi söz konusu canlinin kanserden muzdarip oldugunu ifade eder. Burada ifade/ekspresyon seviyesi immünoblotlama ve arkasindan dansitometriyle bant intensitesinin kantifiye edilmesiyle belirlenir. Dansitometri metotlari teknigin bilinen durumunda uzman kisilerce bilinmekte Olup, örnegin dansitomeri için Image] veya Quantity One gibi bir yazilim kullanilabilir. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, bir canlidan alinan numunede HKlb izoformunun ifadesinde en az %10 veya daha fazla artis, normal seviyeye kiyasla yüksek seviyede olarak kabul edilir. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, canlidan alinan numune biyopsi numunesi, tükürük, balgam, kan, serum, plazma, plevral efüzyon veya idrar içerisinden seçilir. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda kanser, küçük hücreli olmayan akciger kanseridir (NSCLC). Bulusun bir diger uygulamasi kanserin tedavisinde veya hücre büyümesinin durdurulmasina kullanima uygun bir aday maddenin taranmasinda kullanilacak bir metot olup (Metot 1), söz konusu metot; 3.. Test edilecek aday maddenin HKlb izoformu (SEQ 1D No: 7 ve SEQ ID No:8) veya HKlb izoformunun fonksiyonel bir esdegeriyle temas ettirilmesi; b. Test edilen aday maddeyle HKlb izoformu (SEQ 1D No: 7' ve SEQ ID No:8) veya HKlb izoformunun fonksiyonel bir esdegeri arasindaki baglanma aktivitesinin belirlenmesi; veLsgpj c. HKlb izoformu ((SEQ lD No: 7 ve SEQ ID No:8) veya HKlb izoformunun fonksiyonel bir esdegerine baglanan aday maddenin seçilmesi adimlarini içerir. Bulusun bir diger uygulamasi, kanserin tedavisinde veya hücre büyümesinin durdurulmasina kullanima uygun bir aday maddenin taranmasinda kullanilacak bir metot olup (Metot 2), söz konusu metot; a. Test edilecek aday maddenin HKlb izoformu (SEQ ID No: 7 ve SEQ ID No:8) veya HKlb izoformunun fonksiyonel bir esdegeriyle temas ettirilmesi; b. a) adimindan sonra elde edilen HKlb izoformu (SEQ ID No: 7 ve SEQ ID No:8) veya HK] b izoformunun fonksiyonel bir esdegerinin biyolojik aktivitesinin belirlenmesi; c. (c) HKlb izoformu (SEQ 1D No: 7 ve SEQ ID No:8) veya HKlb izoformunun fonksiyonel bir esdegerinin biyolojik aktivitesini test maddesinin ortamda olmadigi duruma göre azaltan test maddesinin seçilmesi. Metot 2'de bahsi geçen biyolojik aktivite glikolizdir. Bulusun bir diger uygulamasinda mevcut bulus bir hücreye konuldugunda HKlb ekspresyonunu inhibe eden, bir yolcu dizi ve bir rehber dizi içeren çift sarmalli moleküllere iliskin olup, yolcu dizi SEQ lD No:1'e karsilik gelen nükleotit sekansini ve rehber dizi SEQ ID No:4'e karsilik gelen nükleotit sekansini içerir ve burada bahsi geçen yolcu dizi ve rehber dizi çift sarmalli bir yapi olusturmak üzere birbiriyle hibridize olur ve söz konusu çift sarinalli yapi HKlb Ifade/eksprese eden bir hücreye konuldugunda HKlb izoformunun ifadesini/ekspresyonunu inhibe eder. Bulusun bir diger uygulamasinda mevcut bulus bir hücreye konuldugunda HKlb ekspresyonunu inhibe edeii, bir yolcu dizi ve bir rehber dizi içeren çift sarmalli moleküllere iliskin olup, yolcu dizi SEQ ID No:2'ye karsilik gelen nükleotit sekansini ve rehber dizi SEQ ID No:5'e karsilik gelen nükleotit sekansini içerir ve burada bahsi geçen yolcu dizi ve rehber dizi çift sarmalli bir yapi olusturmak üzere birbiriyle hibridize olur ve söz konusu çift sarmalli yapi HKlb Ifade/eksprese eden bir hücreye konuldugunda HKlb izoformunun ifadesini/ekspresyonunu inhibe eder. Bulusun bir diger uygulamasinda mevcut bulus bir hücreye konuldugunda HKlb ekspresyonunu inhibe eden, bir yolcu dizi ve bir rehber dizi içeren çift sarmalli moleküllere iliskin olup, yolcu dizi SEQ 1D No:3'e karsilik gelen nükleotit sekansini ve rehber dizi SEQ ID No:6'ya karsilik gelen nükleotit sekansini içerir ve burada bahsi geçen yolcu dizi ve rehber dizi çift sarmalli bir yapi olusturmak üzere birbiriyle hibridize olur ve söz konusu çift sarmalli yapi HKlb Ifade/eksprese eden bir hücreye konuldugunda HKlb izoformunun ifadesini/ekspresyonunu inhibe eder. Bir canlida kanserin önleninesi ve/veya tedavi edilinesi için bir metot söz konusu canliya HKlb izoformuna karsi etkili çift sarmalli molekülün farmasötik olarak etkin bir Bulusun bir baska unsuru ilaç olarak, tercihen kanserin önlenmesinde ve/veya tedavisinde kullanim için SEQ ID No: 1 yolcu dizisini ve SEQ ID No: 4 rehber dizisini içeren çift sarmalli moleküldür. Bulusun bir baska unsuru ilaç olarak, tercihen kanserin önlenmesinde ve/veya tedavisinde kullanim için SEQ ID No: 2 yolcu dizisini ve SEQ ID No: 5 rehber dizisini içeren çift sarmalli moleküldür. Bulusun bir baska unsuru ilaç olarak, tercihen kanserin önlenmesinde ve/veya tedavisinde kullanim için SEQ ID No: 3 yolcu dizisini ve SEQ ID No: 6 rehber dizisini içeren çift sarmalli mo leküldür. Bir eanlida kanserin önlenmesi ve/veya tedavi edilmesi içiii bir metot söz konusu canliya HKlb izoformuna karsi etkili çift sarmalli molekülün farmasötik olarak etkin bir miktarinin cisplatin, karboplatin okzaliplatinden seçilen bir kemoterapi ajaniyla kombine olarak verilmesini içerir. Bulusun bir diger unsuru aktif ajan olarak HKlb ifade eden/ekspresyonu yapan bir hücreye verildiginde glikolizi ve HKlb izoformu ifadesini/ekspresyonunu inhibe eden SEQ ID No:1 yolcu dizisi ve SEQ 1D No: 4 rehber dizisi içeren bir çift sarmalli molekül veya SEQ 1D No:2 yolcu dizisi ve SEQ ID No: 5 rehber dizisi içeren bir çift sarmalli molekül veya SEQ ID No:3 yolcu dizisi ve SEQ ID No: 6 rehber dizisi içeren bir çift sarmalli molekül ve en az bir farmas'otik olarak kabul edilebilir eksipiyan içeren farmasötik bilesimdir. Tanimlar: Metinde geçen "bir", ifadesi buradaki anlamiyla aksi net sekilde belirtilmedikçe "en az bir" anlamina gelmektedir. olarak olusan amino asitlere benzer sekilde islev gören amino asit analoglari ve amino Amino asitler, burada yaygin olarak bilinen üç harfli sembolleri veya lupac-IUB biyokimyasal isimlendirme komisyonu tarafindan önerilen tek harfli sembollerle ifade edilebilir. molekülleri" terimleri, aksi spesifik olarak belirtilmedigi sürece birbirinin yerine kullanilir ve amino asitlere benzer sekilde, yaygin olarak kabul edilen tek harfli kodlarla ifade edilir. Amino asitlere benzer sekilde, hem dogal olarak olusan hem de dogal olmayan nükleik asit polimerlerini kapsarlar. Polinükleotid, oligonükleotid, nükleotidler, nükleik asitler veya nükleik asit molekülleri DNA, RNA veya bunlarin bir kombinasyonundan olusabilir. Bu bulus baglaminda, "HKlb izoform" ifadesi, insan HKl izoformunu veya insan HKlb izoformunun islevsel esdegerlerinden herhangi birini kodlayan polinükleotidleri kapsar. Bu bulusta HKlb izoformu veya fonksiyonel bir esdegeri, dogal olarak olusan proteinler olarak dogadan geleneksel klonlama yöntemleri veya seçilen nükleotid dizisine dayanan kimyasal sentez yoluyla elde edilebilir (örn. SEQ 1D No: 7 ve SEQ ID No: 8) Bir madde (örnegin, polipeptit, antikor, polinükleotid, vb.) için kullanilan "izole edilmis" veya "saflastirilmis" terimleri, maddenin orijinal ortamindan (örnegin, dogal olarak meydana gelirse, dogal ortamdan) uzaklastirildigini ve böylece dogal durumundan degistirildigini belirtir. örnegin protein (antikorun) elde edildigi kaynak hücre veya dokudaki karbonhidrat, lipit veya diger kontamine edici proteinlerden, arindirilmis antikorlara, veya kimyasal olarak elde edildiyse kimyasal baslangiç maddeleri veya diger kimyasallardan arindirilmis antikorlari ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle, "biyolojik örnek" terimi, tüm organizmayi veya dokularinin, hücrelerinin veya bilesen parçalarinin bir alt kümesini (örnegin, kan, mukus, lenfatik sivi, sinovyal sivi, beyin omurilik sivisi, tükürük, amniyotik sivi, amniyotik kordon kani, idrar, vajinal sivi ve semen dahil ancak bunlarla sinirli olmamak üzere vücut sivilarini) ifade eder. "Biyolojik örnek" ayrica bir bütün organizmadan veya hücrelerinin, dokularinin veya bilesen parçalarinin bir alt kümesinden veya bir fraksiyonundan veya bir kismindan hazirlanan bir homojenat, lizat, ekstrakt, hücre kültürü veya doku kültürünü ifade eder. Son olarak, "biyolojik örnek", örnegin, proteinler veya polinükleotitler gibi hücresel bilesenleri içeren bir organizmanin yayildigi bir besin suyu veya jel gibi bir ortami ifade eder. Bu bulus baglaminda, biyolojik bir örnek, tercihen akciger, serviks, mesane, yemek borusu veya prostat veya osteo sarkom veya yumusak doku tümöründen çikarilan dokulari veya hücreleri içerebilir. Aksi belirtilmedikçe "kanser" terimi, HKlb izofonnunu asiri ifade eden kanserlere isaret Burada "profilaksi " terimi, hastalik kaynakli ölüm veya morbiditeyi azaltan herhangi bir aktiviteyi ifade eder. Profilaksi, bir hastaligin ilerlemesinin 'Önlenmesi ve hastaligin ilerlemesinin profilaksisine ve `Önlenmesine ve semptomlarin ortaya çikmasinin komplikasyonlari azaltarak zaten varolan bir hastaligin olumsuz etkisini azaltmaya yönelik faaliyetleri kapsar. Alternatif olarak, 'Önleme ve profilaksi, belirli bir hastaligin siddetini hafifletmeyi amaçlayan çok çesitli profilaktik terapileri içerebilir, örnegin tümörlerin proliferasyonunu ve metastazini azaltmak Mevcut bulus bir açidan kanser tedavisi ve/veya profilaksisine ve/Veya ameliyat sonrasi nüksetmenin engellenmesine yönelik metotlara iliskin olup, söz konusu metot asagidaki adimlardan herhangi birini içerebilir: hücrelerin ameliyatla çikarilmasi, kanser hücrelerinin büyümesinin inhibe edilmesi, tümörün küçülmesi veya geri çekilmesi, remisyonun baslamasi ve kanserin olusumunun baskilanmasi, tümör regresyonu ve metastazin azaltilmasi veya inhibisyonu. Etkili tedavi ve/veya kanserin profilaksisi mortaliteyi azaltir ve kanserli bireylerin prognozunu gelistirir, kandaki tümör belirteçlerini azaltir ve kansere eslik eden saptanabilir semptomlari hafifletir. Bir tedavi, HKlb izoformunun ekspresyonunda azalma veya konuyla ilgili kanserin boyutu, prevalansi veya metastatik potansiyelinde azalma gibi klinik faydaya yol açarsa "etkili" olarak kabul edilebilir. Bir açidan çift sarmalli bir molekülün SEQ lD No:1 olarak adlandirilan yolcu dizisi su dizilime sahiptir; AAGCGAUUUAAAGCGAGCGGAUU Bir açidan çift sarmalli bir molekülün SEQ ID No:2 olarak adlandirilan yolcu dizisi su dizilime sahiptir; AAAGCGAUUUAAAGCGAGCGGUU. Bir açidan çift sarmalli bir molekülün SEQ ID No:3 olarak adlandirilan yolcu dizisi su dizilime sahiptir; GCGAUUUAAAGCGAGCGGAGUU. Bir açidan çift sarmalli bir molekülün SEQ ID No:4 olarak adlandirilan rehber dizisi su dizilime sahiptir; UCCGCUCGCUUUAAAUCGCUUUU. Bir açidan çift sarmalli bir molekülün SEQ ID No:5 olarak adlandirilan rehber dizisi su dizilime sahiptir; CCGCUCGCUUUAAAUCGCUUUUU. Bir açidan çift sarmalli bir molekülün SEQ ID No:6 olarak adlandirilan rehber dizisi su diziliine sahiptir; AAAGCGAUUUAAAGCGAGCGGUU. Bir uygulamada, çift sarmalli bir molekül olan HKlb izoformunun SEQ ID No:7 olarak adlandirilan yolcu dizisi su amino asit dizilimine sahiptir; Bir uygulamada, çift sarmalli bir molekül olan HKlb izoformunun SEQ ID No:8 olarak adlandirilan rehber dizisi su amino asit dizilimine sahiptir; Bulus simdi, mevcut bulusun kapsamini örneklemek için verilen asagidaki örneklerle açiklanacaktir, bu nedenle mevcut bulusun belirli sekil, boyut, malzeme, metodoloji, protokol vb. ile sinirli olmadigi anlasilmalidir. Burada açiklananlar, bu rutin deneme ve optimizasyona uygun olarak degisebilir. Ayrica, tanimlamada kullanilan terminolojinin yalnizca belirli versiyonlari veya düzenlemeleri tanimlamak amaciyla oldugu ve yalnizca istemlerle sinirli olacak olan mevcut bulusun kapsamini sinirlamak için tasarlanmadigi anlasilmalidir. Bu tarifnamede belirtilen her yayin, patent veya patent basvurusu özellikle bütünüyle burada referans yoluyla dahil edilmistir. Aksi belirtilmedikçe, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler, mevcut bulusun ait oldugu teknik alandaki siradan becerilere sahip biri tarafindan yaygin olarak anlasilan anlama sahiptir Burada tarif edilenlere benzer veya esdeger olan yöntem ve malzemeler, bu bulusun uygulanmasi veya test edilmesinde kullanilabilir, ancak uygun yöntem ve malzemeler asagida açiklanmistir. Buna ek olarak, malzemeler, yöntemler ve örnekler sadece açiklayici ve sinirlayici olmasi amaçlanmamistir. Ornekler: 1) Malzeme Ve Yöntem A) Hücre Kültürü hücre hatlari, Dr. Engin Ulukaya'nin (Istinye Universitesi) laboratuvarindan elde edildi ve RPMI 1640'da %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin ve %1 l-glutamin ile desteklenmis tek tabakali kültürde çogaltildi. Tüm hücreler 37C'DE %5 CO2 içeren nemlendirilmis bir atmosferde muhafaza edildi. Tüm hücre hatlari mycoplasma için rutin olarak her 3 ayda bir mycoprobe Mycoplasma algilama Kiti (Ar-Ge sistemleri) kullanilarak test edildi. Tüm hücre hatlari 10 pasaj penceresi arasinda kullanildi. B) Akciger Kanseri Hücrelerinde Gen Nakavti ve Gen Çikarimi A549-HK lb izoform-nakavt hücreleri CRISPR/ Cas9 genom düzenleme sistemi kullanilarak üretildi. Kisaca, HKlb izoformuna 'Özgü sgRNA'lar sadece insan HK] geminin sekizinci eksonunu hedeflemek için tasarlandi. Addgene'den GFP seçim isaretleyicili pX458 vektörü daha önce de açiklandigi gibi [19], Cas9 ve hedef hücrelere HKlb (yani sgHKlb) hedefleyen bir sgRNA iletmek için kullanildi. HKlb'yi hedef alan CRISPR kilavuz dizileri; Yolcu: GCGATTTAAAGCGAGCGGAG Rehber: CTCCGCTCGCTTTAAATCGC SgHKlb'yi ifade eden GFP siralanmis tek hücreli klonlarin ekspresyonu 1353 veya HKlb izoform eliminasyonu için tarandi ve hedef lokuslarda spesifik indel mutasyonlari PCR, DNA parçalanma analizleri ve Sanger sekanslaina ile dogrulandi SiRNA aracili gen çikarimi için, Hlb'yi hedefleyen üç farkli siRNA oligosu, insan HK] geninin sekizinci eksonunu asagidaki gibi hedeflemek için tasarlandi. Söz konusu siRNA'lar su sekildedir: siCRISPR gsiRNA#3 ! Yolcu: GCGAUUUAAAGCGAGCGGAGUU Fonksiyonel ablasyon deneylerinde, esit sayida hücre (1x105) kaplandi ve geçici çikarim için, Lipofectoamine RNAiMAX (Life Technologies) kullanilarak ters transfeksiyon yöntemi ile hücreler siRNA dupleksleri ile transfekte edildi. Hücreler transkripsiyonel analiz için qRT-PCR için 48 saat sonra hasat edildi. C) Hastadan Doku Toplama ve Immünohistokimvasal Bovama Bu çalisma Istanbul Medipol Universitesi Etik Kurulu tarafindan onaylanmistir. Istanbul Medipol Universitesine bagli Hastaneden (Istanbul, Türkiye) klinik ve immünohistolojik olarak dogrulanmis 18 vakadan tüm hastalarin kabuli'iyle NSCLC primer tümör ve normal akciger dokusu toplandi. Hastalarin nitelikleri Tablo 1'de gösterilmistir. Kesitler belirtilen antikorlarla boyandi ve HKI, p53 ve Ki-67'nin boyanmasi, pozitif hücrelerin yüzdesine ve boyama yogunluguna bagli olarak patologlarca ölçüldü. Hastalarin klinik özellikleri Tablo 1'de listelenmistir Hasta Cinsiyet Yas Histolojik Tip Evre Asama P53 Kullanilan Deney 1 Erkek 64 ADC 2 pTZaNl Positif(%95] WB 2 Erkek 67 ADC 3 pT3N0 Negatif (0/0 1] WB 3 Kadin 75 ADC 2 pTibNo Negatif (% 1) WB 4 Erkek 68 ADC 3 pTZle Positif(% 90) WB, q-PCT Kadin 53 ADC 1 pT2aNÜ Negatif (0/0 1) IHC, WB, q-RT 6 Erkek 54 ADC 3 pTZaN2 Negatif [% 0) IHC, WB, q-RT 7 Erkek 54 ADC 3 pT3N0 Negatif (% 1) WB, q-RT 3 Erkek 62 Solid ADC 3 ypTZbNÜ Positif(% 95) IHC, WB 9 Erkek 66 Enteric type ADC 2 pT1aN1 Negatif (% 0] IHC, WB Erkek 65 lnvasive mucinous ADC 1 pT4N1 Negatif (% 0] IHC, WB 11 Erkek 66 Enteric type ADC 2 pTZbNO Positif(% 95] IHC, WB 12 Erkek 72 Acinar dominant type ADC 2 pTZNl Positif(% 90] WB 13 Erkek 68 Solid ADC 3 pTZNl Positif(% 90] lHC, WB, qRT 14 Kadin 76 Acinar dominant type ADC 2 pTZaNÜ Negatif (% 0) WB Erkek 48 Enteric type ADC 2 pT2aN1 Negatif (% 0) lHC, WB, qRT 16 Erkek 62 Basaloid SCC 2 pT3NÜ Positif(% 100) WB, qeRT 17 Erkek 40 SCC 3 pTZaNZ Negatif (0/0 1) WB, q-RT D) Kanser Genomu Atlasi NSCLC Kohoit Analizleri Kamuya açik Kanser Genom Atlasi (TCGA) adenokarsinom (n= RNA-seq datasi adenokarsinom ve SCC arasindaki DEG'leri dogrulamak için harici kohort olarak ve normal ve TCGA akciger adenokarsinom numuneleri (RefSeq id NM_001322366) arasindaki HKlb izoformu ekspresyonu/ifadesini analiz etmek için kullanildi. Akciger adenokarsinom projesi, GTEX Pro jesinden 602 normal akciger dokusu ile eslesen 426 RNA akciger tümör doku dizilimini içerirHer veritabani için RSEM yazilim paketi kullanilarak olusturulan beklenen transkript okuma sayilari karsilastirma için kullanilir. Okuma sayilari DESeqZ varyans stabilize normallestirme yöntemi kullanilarak normallestirilir. E) RNA Izolasyonu ve Kantitatif PCR RNA, üreticinin talimatlarina göre trizol reaktifinde (lnvitrogen) homojenizasyon ile insan NSCLC hücrelerinden ve insan klinik NSCLC tümöründen ve normal örneklerden izole edildi ve ardindan bir RNeasy kolonunda (Qiagen) saflastirma yapildi RNA safligi Thermo NanoDrop tarafindan a260/a280 5 1.8 ve a260/a230 5 1.5 olarak standart absorbans oranlari ile degerlendirildi.Tamamlayici DNA'lar, RevertAid First Strand cDNA sentez Kiti (Thermo Fisher Scientific, Inc.) kullanilarak toplam RNA'nin 2 ng'indan sentezlendi. Gerçek Zamanli Kantitatif PCR (RT-qPCR) sonuçlari Bio-Rad'in itaq Universal SYBR Green Supermix ile elde edildi.Bireysel reaksiyonlar için esik döngüsü (BT) iCycler IQ dizi analiz yazilimi (Bio- Rad) kullanilarak tanimlanmistir. Verilerin normallestirilmesi için ß-aktin kullanildi. Tüm deneyler üç kopya halinde gerçeklestirildi. Bu çalismada asagidaki dizilime sahip asagidaki primerler kullanilmistir: HKla izoformu: HKlb izoformu: HKl c izoformu: Hýß-aktin F) Reaktifler ve Antikorlar Kirilmis Kaspaz-3 (Asp ß-Aktin (-konjuge tavsan and fare sekonder antikorlarina karsi tavsan monoklonal primer antikorlari Cell Signaling Technologies (USA) firmasindan satin alindi. p53 (DO-1), Bel-2 (C-2), MAP LCSB (G-2), and BECNl antikorlarma (G-l 1) karsi fare monoklonal antikorlari Santa Cruz Biotechnologies (USA) firmasindan satin alindi. Cisplatiii (50 mg/ lOOmL) Koçak Farma'dan satin alindi. G) Hücre Canliligi Testi A tasiyiciyla (PBS/Salin) veya &100 uM/ml arasinda degisen konsantrasyona sahip cisplatinle 48 saat daha inkübe edildi.Hücre canliligi, üreticinin talimatlarina ve 595 nm'de bir mikroplaka okuyucu (model ile ölçülen absorbansa göre CellTiter-Blue assay kit (Promega) kullanilarak belirlendi. ICSO, negatif kontrole göre absorbansta %50 azalmaya neden olan konsantrasyon olarak tanimlandi. IC50, Graphpad Prism V8 (Graphpad Software, CA, USA) kullanilarak dogrusal olmayan regresyon analizi ile belirlendi. saatlik uygulamanin ardindan hücreler triprinizasyon ile hasat edildi, santrifüj ile toplandi ve bir kez 1 ml PBS ile yikandi ve propidyuin iyodür ile (BD Biosciences) üreticinin prosedüiüne göre boyandi ve florasant aktif hücre siralayiciyla ölü hücrelerin sayisi belirlendi. H) FACS Analiziyle Hücre Proliferasyonu Analizi edildi. Hücreler, vorteks yaparken damla damla buz soguklugunda %70'lik etanol ile sabitlendi ve en az 24 saat için eksi 20 derecede inkübe edildi Sabitlenen hücreler pelletlendi ve PES ile iki kez yikandi. Anti-insan Ki-67, FITC kiti, üreticinin protokolüne (BD Biosciences) göre hücreleri boyamak için kullanildi, hücreler bir FACS AriaII akis sitometresi ile analiz edildi ve FlowJo yazilimi kullanilarak islendi. l; Western Blot Analizi Hücreler hasat edildi ve PES çözeltisi içinde yikandi, toplandi ve daha sonra proteinaz inhibitörü kokteyli ve fosfataz inhibitörü kokteyli (Roche) içeren RIPA tamponunda lizise tabi tutuldu. Lizatlar, 20 dakika boyunca 4c'de 10.000 g santrifüj islemine tabi tutuldu ve süpernatanlar uzaklastirildi. Toplam protein (50 ug) %10 SDS-PAGE ile fraksiyone edildi ve elektroforetik olarak Immobilon-FL PVDF membranlarina aktarildi. Membran, oda sicakliginda 1 saat boyunca bloklama tamponu (Li-Cor) ile bloke edildi ve daha sonra gece boyunca 4 0C'de uygun primer antikor ile inkübe edildi. % 0.05 Tween 2 içeren PBS (PBST) ile yikandiktan sonra, membran oda sicakliginda 2 saat boyunca 1:2500 seyreltmeyle uygun sekonder antikor ile inkübe edildi. Membran tekrar PBST ile yikandi ve immüiioreaktif bantlarin gelisimi için Pierce ECL Western Blotting substrat (Therino Scientific) kullanildi. Doku örneklerinin immünoblotlanmasi için, proteinler, insan NSCLC hastalarindan toplanan tümör ve komsu tümör disi akciger örneklerinden ekstre edildi, sivi azot içinde donduruldu ve -80 oC'de saklandi. Daha sonra protein lizis tamponu (yukarida tarif edilen) örneklere eklendi. Numuneler vortekslendi, hoinojenize edildi ve kuru buzda üç donina / çözülme döngüsüne tabi tutuldu, santrifüjlendi ve süpernatant toplandi ve daha sonraki immüiioblotlaina için -80 OC'de saklandi. J) Oksiien Tüketim Orani ve Hücre Disi Asitlenine Oranlarinin Olcülmesi Seahorse Xfe96 deneyleri için, seahorse XF-96-Well plakalarina önceden optimize edilmis 1.5 X 104 hücre/kuyu son konsantrasyonunda hücreler ekildi ve glikolitik hiz, glikoliz stresi ve mito stres testleri üreticinin spesifikasyonuna göre yapildi (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Her veri üç kopya halinde minimal olarak belirlendi. OCR ve ECAR mutlak oranlar (OCR için pmoles/dak ve ECAR için mpH/dak) olarak rapor edildi veya hücre sayimina karsi normallestirildi veya temel oksijen tüketiminin bir yüzdesi olarak ifade edildi. K) In Vivo Ortotopik Xenograft Tümörigenez Testi NSG fareleri Jackson Laboratuvarindan satin alindi ve deiieyler Istanbul Medipol Üniversitesi'nde yapildi. Tüm fareler belirli bir patojensiz tesiste muhafaza edildi ve tüm hayvan deneyleri Istanbul Medipol Universitesi kurumsal hayvan bakim ve kullanim komiteleri tarafindan onaylanan protokollere uygun olarak gerçeklestirildi. A549 WT ve A549 HK lb-/- hücreleri, ortotopik NSCLC tümör modelini indüklemek icin immün yetersiz NSG erkek farelere ortotopik olarak enjekte edildi. Göreceli/Rölatif tümör hacmi, implantasyondan sonraki 8 hafta içinde ölçüldü ve asagidaki gibi hesaplandi: (uzunluk < genislik < yükseklik) X It / 6. Son noktalara ulasildi ve tümör boyutu 2 cm ölçüldügünde fareler öldürüldü. L) Immünofloresans ve Mikroskopi Hücreler 8-kuyu odasi kültür slaytlarinda (Lab-tek II, Thermo Fisher Scientific) ekildi. Uygun uygulama veya transfeksiyondan sonra, hücreler oda sicakliginda 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit (Wako) ile sabitlendi ve 15 dakika boyunca PBS tamponunda %05 Triton-X100 ile permeabilize edildi. Hücreler, 4 °C'de, HKl, %3 BSA ile PBS'te seyreltilmis p53 için primer antikorlarla gece boyunca inkübe edildi. PBS'de üç adet 10 dakikalik yikainadan sonra, hücreler oda sicakliginda florokrom konjuge sekoiider antikorlarla 60 dakika inkübe edildi. Kültür Slaytlari PBS'de 10 dakika boyunca üç kez yikandi. Görüntüleme için, hücreler DAPI (H1500, vektör Laboratuvarlari) ile Vectashield katilasmis gömme ortaminda saklandi. Hücre görüntüleme FV-lOOO konfokal mikroskop (Olympus) ile gerçeklestirildi. M) Yapi Hazirlama HKlb (PDB ID: IQHA) ve HK2 (PDB 1D: 2nzt) kristal yapilari kullanildi, HKlc ise Isviçre-homoloji-modelleme-yazilimi kullanilarak modellendi. Kristal yapilarin çözülmemis kisimlari Swiss-Modeller'la modellendi ve döngü bölgelerinin ince ayari ModLoop ile yapildi. Kalintilarin protonasyon durumlari PROPKA kullanilarak belirlendi. Beta konformasyonunda glikoz kullanildi. ATP ve Mg2+, her bir sisteme Glukokinazin kristal yapisindan (PDB 1D: BFGU) çevrildi. N) Moleküler Dinamik Simülasyonlari MD simülasyonlari GROMACS 5.1.4 ile CHARMM36 kuvvet alani kullanilarak gerçeklestirildi. Sistemler, konjugat gradyan algoritmasi kullanilarak en aza indirildi. Tüm sistemlerde, bi tür optimizasyon algoritmasi olan dik inis (steepest-descent) yöntemiyle 1000 adimda enerji azaltilmasi saglandi. Sistemler Berendsen algoritmasi ile NVT grubu kullanilarak dengelendi. Son yapilar l atm basinç ve 310 K sicaklikta NPT grubunda islendi. MD simülasyonlari 300-ns süresince çalistirildi. Tüm koordinatlar analiz için 2-ps araliklarla kaydedildi. Uzun menzilli elektrostatik kuvvetler PME kullanilarak ele alindi ve Van der Waals kuvvetleri 0.9 nm esik degeriyle muamele edildi. Su molekülleri TIP3P modeli ile modellenmistir. O) Istatistiksel Analiz Aksi belirtilmedikçe, veriler ortalama ± SEM (standart ölçüm hatasi) olarak ifade edilir. Grafik ve istatistiksel analiz için GraphPad Prism 8 yazilimi kullanildi. Normalite Shapiro-Wilk testi ile hesapladiktan sonra iki örnegi karsilastirmak için Student t veya Mann-Whitney testi kullanildi.Ç0klu grup karsilastirmalari için tek yönlü ANOVA analizi ve ardindan Tukey'in çoklu karsilastirma testleri kullanildiN'nin kesin degeri de dahil olmak üzere istatistik parametreler istatistiksel test ve anlamlilik dsekil ve sekil lejandlarinda bildirilmistir. p<0.05 olan degerler istatistiksel olarak anlamli kabul edildi 2) Sonuçlar A) HKl Ekspresyonu insan NSCLC'de Upregüledir ve Hastalarda Zayif Klinik Sonuçlarla Iliskilidir Insan NSCLC'DE HKl'in spesifik upregülasyonunu dogrulamak için, insan NSCLC tümör dokularini ve tümöre komsu olmayan akciger dokulari HK2 ve p53 ile birlikte HKl ekspresyonu için analiz edildi. Hastalarin küçük bir kohortunda immünoblotlama ile yapilan analizlerde, HKl, HK2 ve p53'ün NSCLC tümör dokularinda ayni hastalardan gelen normal akciger dokusuna kiyasla upregüle edildigini bulduk (Sekil 1 ve 2). Bununla birlikte, HK 1 ve HK2 bant yogunluklarinin nicellestirilmesi, insan NSCLC tümörlerinin HK] ekspresyonunun HK2'den öneinli ölçüde daha yüksek oldugunu ortaya koymustur (Sekil 3), bu durum HK] 'in küçük örneklem boyutuna ragmen NSCLC'de HK2'den daha fazla ifade edildigini düsündürmektedir. Bu çalismada NSCLC hücrelerindeki HK] in situ ekspresyonu immünohistokimya ile degerlendirildi. Tüm kanserli olinayan epitel doku HKl için zayif boyama gösterirken, tümör hücreleri HK] için orta-güçlü boyama göstermektedir (Sekil 4). Verileri genisletmek için TCGA RNA-Seq verilerinde NSCLC ve normal örnekler arasinda karsilastirma yapildi. Hastalar daha önce tarif edildigi gibi p53 gen imzasinin ekspresyonuna dayanarak p53 WT ve inutant olarak ayrildi. Analizde mutant p53 olan hastalarin daha yüksek seviyede HK] eksprese ettigi/ ifade ettigi saptandi (Sekil 5). Ayrica evre ll hastalarinda sadece p53 WT grubunda HK] ekspresyonunun daha yüksek oldugu görülmekte olup (Sekil 6), bu durum HK] ekspresyonunun NSCLC'deki tümör derecesi ve hastalik evresi ile iliskili oldugunu düsündürmektedir. Son olarak; sagkalim analizi, HKl'in daha yüksek ekspresyonunun azalmis relapssiz (hastaligin nüksetmedigi) sagkalim ile iliskili oldugunu gösterdi (p : 0.01; sek. '7), bu durum daha yüksek HK] ekspresyonunun hastalik ilerlemesi ile iliskili oldugunu düsündürmektedir. B) Insan NSCLC Hücreleri Agirlikli Olarak HK] lzoformlarindan Sadece Birini Ifade Eder - Zayif Bir Prognostik Faktör Olarak Heksokinazl b (HK lb) HK] geni yaklasik 131 kb'ye kadar uzanir ve 25 ekzondan olusur. RefSeq gen ek açiklamalarina göre, HK] geninin 5 ' ucunda alternatif sekilde zincirlesmesi, farkli hücre tiplerinde farkli transkriptler üretir. Testis spesifik ekzonlar, eritroid spesifik ekzon R'nin yaklasik 15 kb yukarisinda bulunur. HK-I geninin ilk 5 ekzonu testise özgü dizileri kodlar. 6. ekson, eritroid spesifik ekson R'dir [10]. Bu dokuya özgü transkriptleri hariç tuttugumuzda, odaklandigimiz 3 adet transkriptimiz bulunmaktadir bunlar: HKla, HKlb ve HKlc. Öte yandan HK2 geninin RefSeq gen ek açiklamalarinda bir adet transkripti vardir (Sekil 8). Testis spesifik transkriptler [11] üzerinde birkaç çalisma olmasina ragmen, farkli dokularda (kanser dokulari dahil) HK] geminin bu üç izoformunun diferansiyel ifadesi ve islevleri gösterilmemistir. HK] transkriptlerini analiz ettigimizde, bunlari diferansiyel olarak kullanilan ekzonlar sayesinde ayirt etmek mümkündür. HKla transkripti 5" ucunda farkli eksonlar içerir ve bu nedenle bu transkripti ayirt etmek mümkündür. HKlb ve HKlc izoformlarini ayirt etmek, aralarindaki yüksek oranda ortak olan ekzonlar nedeniyle daha zordur. Hem HKlb hem de HKla izoformlari, HKlc izoforinunda eksik olan bir ekstra ekzon olan, ekzon 8'e sahiptir. Ekzon 8 etrafindaki bu ekzon-ekzon baglanti noktalarini kullanarak, HKlb ve HKlc izoformlarini ayirt etmek için özel genomik problar tasarlayabildik. Bu nedenle, bu ekzonlari hedeflemek, bu transkriptlerin farkli dokulardaki ifadesini ölçmemizi saglayacaktir. NSCLC'NIN tedavisi için yeni, HK] izoform spesifik metabolik hedef tanimlamak için, ve p53 ile birlikte HK] izoformlari (HKl a, Hklb ve HK] c) analiz edildi. Hem A549 hem de H1299 hücrelerinin yari qPCR verileri, HK] a izoformunun ifadesinin/ekspresyonunun olmamasi nedeniyle bu izoformun NSCLC'ye özgü olmadigini gösterdi. HKlb izoformu hücrelerinde ifade edilmemektedir. Bununla birlikte, A549 ve H1299 hücreleri arasindaki HK] ve HK2 ifadelerinin düzeylerinde hiçbir fark gözlemlenmedi (Sekil 11). HK] izoformlarini tespit etmek için mevcut izoform spesifik antikor olmadigindan, hem A549 hem de H1299 hücrelerindeki ekspresyon seviyesini tespit etmek için HK] antikoru kullanildi. Bu nedenle, immünoblot analizi ile HK] protein ekspresyonunun A549 hücrelerinde H1299 hücrelerinden daha yüksek oldugunu ve her iki hücrede de HK2 ekspresyon düzeylerinin degismedigini göstererek (Sekil 12) PCR sonuçlarini dogruladik bu duruni, HKlb ifadesinin a549 hücrelerine özgü oldugunu göstermektedir. Insan NSCL kanserinde HKlb upregülasyonunun klinik iliskisini degerlendirmek için NSCLC hastalarindan tümörler ve komsu tümör disi örnekler üzerinde yari q-PCR ve qRT-PCR analizleri yaptik. Ozellikle HKlb'nin, NSCLC tümöründe, tümöre bitisik normal dokuya kiyasla HK2 transkriptinden (p:0.03) daha fazla upregüle (p : 0.005) oldugu görüldü (Sekil 13 ve Sekil 14). HKlc izoformunun ekspresyonu/ifadesi anlamli degildi, bu durum da HKlb'nin HKlc izoformu ve HK2 ile karsilastirildiginda benzersiz bir sekilde upregüle oldugu görüsünü desteklemektedir. Ilginç sekilde, p53 gen ekspresyonu da HKlb'ye benzer sekilde artmistir (p=0.005). A549 NSCLC hücrelerine benzer sekilde, NSCLC hasta tümör hücrelerinde de HKla izoformunun ekspresyonu/ifadesi görülmemektedir (Sekil 13 ve Sekil 14). NSCL adenokarsinom ve normal akciger dokulari arasindaki HKlb izoformlarinin artan ekspresyonunu bir kez daha dogrulamak için, en kapsamli kanin veri tabanlari olan TCGA (Kanser Genom Atlasi) Projesi ve GTEX (genotip-doku ekspresyonu) projesini birlestirdik. TCGA akciger adenokarsinomu projesi, akciger tümör dokularinin 426 RNA dizilimini içerir. Bu tümör örnekleri GTEX Pro jesinden 602 normal akciger dokusu ile eslestirildi. Her veritabani için RSEM yazilim paketi kullanilarak olusturulan beklenen transkript okuma sayilari karsilastirma için kullanildi. Okuma sayilari DESeqZ varyans stabilize normallestirme yöntemi kullanilarak normallestirildi. RT-PCR analizleri ile uyumlu olarak, normal ve TCGA akciger adenokarsinom örnekleri (RefSeq 1d NMIOOI322366) arasinda HKlb izoformunun (transkript varyanti-S) ekspresyonu karsilastirildiginda, NSCLC tümör dokularinda HKlb'nin normal akciger dokularina kiyasla önemli derecede upregüle oldugu görüldü (P=1.85 em). Bir arada degerlendirildiginde bu veriler, normal akciger dokulariyla kiyaslandiginda çok çesitli akciger kanseri hastasi olmasina ragmen yüksek HKlb ekspresyonunun NSCLC'ye özgü oldugunu ortaya koymaktadir. Ayrica, HKlb izoformunun daha yüksek ekspresyonu, her ne kadar ikincisindeki sag kalim orani çok kaydedeger olmasa da (sirasiyla p: 2.69 cm, p:9.5 em), NSCLC'nin türlerinden hem adenokarsinomun (Sekil 16) hem de skuamöz hücreli karsinomun (Sekil 17) sagkalim olasiliginin azalmasi ile iliskilidir. Toplu olarak, verilerimiz, NSCLC'de çekici bir metabolik hedef olarak kullanilabilecek l-lKlb izoformunun özgüllügü için ikna edici kanitlar sunmaktadir. C) HKlb Eksikliginin NSCLC Hücrelerinde Metabolizma, Proliferasyon ve Tümörigenez Uzerine Etkisi. HKl ve HK2'nin N-terminalinin genel olarak enzime stabilite saglamaktan ve dis mitokondriyal membrana baglanmadan sorumlu oldugu bilinmektedir. HKla, b, c ve HK2 yapisal benzerliklere sahip olsa da, N-terminal dizisindeki farkliliklar onlari benzersiz kilar ve bu da metabolizmada degisime ve dolayisiyla tümörigeneze önemli ölçüde yansir. Burada HKlb izoformunun N-bölgesinin stabilitesini saglayan kendine özgü sekanslar içerdigini destekleyen yapisal farkliliklar oldugunu bulduk, bu durum kök ortalama kare degisim analizi ile gösterilinektedir (Sekil 10). Bu yapisal farkliliklar mitokondri ile HKlb arasindaki etkilesimin gücünü arttirmaktadir. Hep birlikte degerlendirildiginde bu veriler, HKlb'nin glikolizde ve dolayisiyla NSCLC tümörgenezinde önemli bir role sahip olabilecegini göstermektedir. Proliferasyon, sagkalim ve tümörigenezde HKlb izoformunun fonksiyonel rolünü ve mekanizmasini anlamak için HKlb izoform eksikliginin metabolik sonuçlari analiz edildi. Seahorse metabolik analizörü kullanilarak HKlb'nin silinmesinden sonra glikoliz ve solunumdaki degisiklikler ölçüldü. HKlb nakavti (KO) sonrasi mitokondriyal solunum hizi analiz edildiginde, oksijen tüketim orani (OCR) ve solunumda önemli bir degisiklik görülmemesi (Sekil 21), HKlb ablasyonunun mitokondri kaynakli OXPl-IOS bakimini baslattigi düsündürmektedir. Bununla birlikte, XF glikoliz stres testi ve XP glikolitik hiz testi kullanilarak hücre disi asitlenme orani (ECAR) ölçüldügünde, HKlb izoform kaybinin (a A549 hücrelerindeki glikolitik aktivitede kontrol hücrelerine (A kiyasla önemli azalmalar görülmesine neden oldugu görüldü (sirasiyla hücrelerinin metabolik yakit bagimliliklari ve kapasiteleri belirlendi. A549 HKlb-/- hücrelerinin önemli derecede düsük glikoz bagimliliklarina (p=0.006`) sahip oldugu ve A549 WT hücrelerine kiyasla glikoz kapasitelerinde veya glutamin bagimliliklarinda ve kapasitelerinde önemli bir degisiklik olmadigi görüldü. Bu bulgular, A549'un glutamin yerine glikoza tercih ettigini ve HKlb'nin bir glikolitik regülatör olarak islev gördügünü ve glikoz metabolizmasinda genis bir rol oynadigini göstermektedir. Ilginç sekilde, HKlb'nin silinmesi, yag asidi bagimliliklarini (p< 0.0001) ve yag asidi kapasitelerini önemli ölçüde artirmistir (p:0.03). Gerçekten de, önceki çalismalardan kanser hücrelerinin besin tükenmis kosullarda mitokondriyal yag asidi oksidasyonuna giderek daha fazla bagimli hale geldigi görülmektedir. Azaltilmis glikolizin in vitro proliferasyon üzerindeki etkisini degerlendirmek için proliferasyon için bir isaret olan Ki67'nin akis sitometri analizleri yapildi ve A549 HKlb - / - hücreleri Ki-67 seviyesinde yaklasik %35 azalma gösterdi (Sekil 23). Önemli olarak, HKlb'nin in vivo potansiyel tümörijenik rolünü test etmek için, A549 WT ve A549 HKlb -/- hücreleri oitotopik olarak, ortotopik NSCLC tümör modelini indüklemek için iininün yetersiz NSG erkek farelere enjekte edildi. Implantasyon sonrasi 8 hafta içinde relatif tümör hacmi ölçüldü. A549 HK lb -/- hücreleri tasiyan farelerde tüinör boyutu A549 WT veya A549HKlb -i'- hücrelerinden karakterizasyonu, her ikisinin de NSCLC akciger adenokarsinomu oldugunu gösterdi. Tümör dokusunun HK] ile boyanmasi, A549 HKlb-/- verilen farelerden gelen tümörde, A549 WT verilen farelerinden gelen tümörlere kiyasla HKl ekspresyonunun gözlenmedigini dogruladi (Sekil 24). Tümör dokularindaki Ki67'nin immünohistokimyasal analizi, HKlb-/- olan tümörlerin WT tümörlerle karsilastirildiginda Ki67 boyamalarinin anlamli derecede düsük oldugunu göstermistir (p=0.001) (Sekil 25), bu durum HKlb nakavt (KO) hücrelerinin daha az çogalma kabiliyetine sahip oldugunu göstermektedir. Tüm bu veriler, HKlb'nin inhibisyonunun, NSCLC'de glikolizi hafifleterek hücre proliferasyonunu ve tümör büyümesini azalttigini gö stermektedir. D) NSCLC Hücrelerinde HKlb KO ve Cisplatin Tedavisinin Metabolizma, Ilaç Etkisi ve Sagkalim Yolu Üzerine Etkisi NSCLC için tedavi seçenekleri esas olarak çesitli faktörlere dayanir, ancak genel olarak kemoterapi NSCLC hastalari için ilk uygulanan tedavilerinden biridir. Cisplatin, NSCLC'nin tedavisinde yaygin olarak kullanilan biraz daha etkili bir platindir. Ancak, cisplatinin daha fazla yan etki ile iliskili oldugu bildirilmistir. Ayrica, metabolik degisiklikleri hedefleyen inhibitörler potansiyel bir terapötik olarak gelistirilmistir ve birkaç tanesi erken evre klinik çalismalarda bulunmaktadir, ancak ilaçlarin olumsuz yan etkisi nedeniyle simdiye kadar yapilan çalismalar basarili olamamistir. Bu nedenle, NSCLC hastalarinda sagkalimi iyilestirmek ve hastaliga bagli advers olaylari azaltmak için kanser hücrelerinde kesin ve etkili metabolik terapötik hedef için klinik olarak henüz karsilanmayan bir ihtiyaç vardir. Biz ilk olarak HKlb eliminasyonunun glikolizde azalmaya neden olmasi nedeniyle, HKlb eliminasyonu ve cisplatinin sinerjik etki göstererek glikolizi daha da azaltarak NSCLC için terapötik özellik gösterebilecegi hipotezini gelistirdik. Bazal glikoliz ve glikolitik kapasitenin önemli olmasa da daha fazla azaldigini ve cisplatin ile tedavi edilen A549 HKlb-l- hücreleri üzerinde glikolitik rezervin toplam yoklugunu gözlemledik (Sekil 21). Cisplatin ile tedavi edilen A549 WT ve A549 HKlb -/- hücreleri arasinda bazal solunum hizinda belirgin bir degisiklik gözlenmedi. Bununla birlikte, cisplatin ile tedavi edilen A549 WT hücrelerinde sadece yedek solunum kapasitesi azalmistir (P = 0.02) (Sekil 26-27). Daha sonra HKlb delesyonunun NSCLC hücrelerini cisplatin tedavisine duyarli hale getirip getiremeyecegini arastirdik ve cisplatiriiri HKlb ablasyonu ile veya HKlb ablasyonu olmadan ilaç etkisini degerlendirdik. Hücre canliligi testi yapildi ve A göre anlamli olarak düsük bulundu (Sekil 28). Hücre ölümünün akis sitometrisi ölçümü propidyum iyodür (PI) ile yapildi. HKl b'nin silinmesi ve cisplatinin sinerjik etkisi, A. Ayrica, sadece cisplatin tedavisinin PARP ve Caspase 3'ün kirilmasina neden oldugunu, ancak A549 HKlb-/- hücrelerinde kirilma indüksiyonunun anlamli olarak daha yüksek oldugu görüldü (Sekil 30). Rapamisin tedavisini kontrol olarak kullanarak rapamisinin degil cisplartinin apoptozu baslattiginu gördük (Sekil 30) ve HKlb elimiiiasyonuyla beraber cisplatin kullaniminin, daha fazla cisplatin kaynakli hücresel apoptozunu tesvik ettigi tespit edildi. Ilginçtir ki, HKlb silme islemi, ilaç uygulanmayan A549 HK 1 B-/- hücrelerinde Bel-2 ekspresyonunun asagi regülasyonunu hafifçe baslatir ve Bcl-2 ekspresyonunun asagi regülasyonunun cisplatin tedavisi ile belirgin oldugu görülmüstür (Sekil 31). Gerçekten de, HK 1 veya HKZ, mitokondri ile dogrudan etkilesim yoluyla mitokondriyal düzenlenmis apoptozise karsi korunmada açik bir rol oynar. Sasirtici bir sekilde, HK2 degil ancak HKl'in ekspresyonunun/ifadesinin, cisplatin ile tedavi edilen HKl'in (temel olarak HKlb izoformunun) NSCLC'ye özgü oldugunu göstermektedir. Ayrica cisplatin ile tedavi edilen A549 HKlb -/- hücrelerinde HK2 ekspresyonunun azaldigi gözlemlendi (Sekil 31). Bu sonuçlar, HKlb kaybinin NSCLC hücrelerinde apoptozu indüklemek için NSCLC hücrelerini cisplatine duyarli hale getirdigini göstermektedir. HKlb delesyonunun ve cisplatin tedavisinin apoptozuii sinerjik indüksiyonu üzerindeki etkilerinin altinda yatan mekanizmayi belirlemek için proliferasyon ve sagkalim sinyal yollarini incelendi. HKlb'nin susturulmasi üzerine, AKT aktivasyonunun ve asagi akim hedefi GSK3ß'nin aktive edildigini gözlemlendi, ancak HKlb'nin susturulmasi ile cisplatin tedavisi kombinasyon halinde oldugunda bunun tamemn inhibe edildigi görüldü. HKlb'nin silinmesi ve cisplatinle birlikte mTOR'un fosforilasyonunu (Sekil. 33) ve STAT3 transkripsiyon faktörünü (Sekil 32) önemli ölçüde inhibe etti. Bir arada degerlendirildiginde bu sonuçlar HKlb ablasyonunun ve cisplatinin Pl3-kinaz ve NSCLC hücrelerindeki STAT yollari gibi çesitli onkojenik kaskadlari asagi dogru düzenledigini göstermekte olup, kanser hücresi çogalmasi, sagkalim ve tümör büyüme yollarinin inhibisyonunun arkasindaki altta yatan mekanizmayi ortaya koymaktadir. E) HKlb Çikarimi/Ablasyonu ve Cisplatin Kombinasyonu Sinerjik Olarak hem Apoptotik hem de Otofajik Hücre Olümünü Arttirir HKlb çikariminin/silinmesinin cisplatine duyarlilastirdigini ve bununla birlikte daha fazla sayida apoptotik hücre indükledigi tespit edildi. Hücre ölümünün altinda yatan mekanizmayi arastirmak için A549 WT ve A549 HKlb -/- hücrelerinin cisplatin veya rapamisin tedavisi ile farkli hücre ölüm yollari incelendi. Ayrica, HKlb ablasyonu ve cisplatinin apoptozu p53'ün hem aktivasyonu hem de yüksek ekspresyonu ile arttirdigi gösterildi. Son çalismalar otofaji ve apoptoz arasinda karmasik ve çok yönlü bir iliski oldugunu ortaya koymaktadir. Dahasi, glikoz yoksunlugu tipik olarak enerji homeostazini korumak için otofaji indüksiyonuna neden olur. HKlb çikarimi ve cisplatin kombinasyonunun A549 hücrelerinde otofajinin aktivasyonuna neden olup olmadigini belirlemek için, rapamisin tedavisini kontrol olarak kullanarak otofajik sinyalizasyon yolu incelendi. Beklendigi gibi, HKlb eliminasyoiiu, glikoz yoksunluguna yanit olarak otofaji indüksiyonuiiu azaltir bu A549 HKlb-l- hücrelerinde LC3ll olusumu önemli ölçüde yükselmesinden anlasilmaktadir. Ayrica, cisplatin veya rapamisiii tedavisi ile HKlb eliminasyonu/silinmesi, A549 HKlb - / - hücrelerinde daha fazla otofajiye neden olur. HK lb silinmesi ve cisplatin, A549 HKlb -/- hücrelerinde mTOR'un fosforilasyonunu önemli ölçüde inhibe eder (Sekil 33). Bu noktada dikkati çeken bir unsur da bu etkilere AMPK tarafindan aracilik edilmeinesidir, bu enziinin aktivitesi HKlb seviyelerinin eliminasyoiiundan etkilenmediginden, AMPK fosforilasyonunda degisiklik olmamistir. Ayrica, cisplatin veya rapamisin tedavisi üzerine, AMPK fosforilasyonunun A549 WT hücrelerinde azaldigi, ancak fosforilasyonun A549 HKlb -/- hücrelerinde tamamen inhibe oldugu görüldü (Sekil 33). Her ne kadar cisplatiii veya rapamisin ile tedavi edilen A549 HKlb-/- hücrelerinde daha yüksek LC3II ekspresyon seviyesi gözlense de, hem A549 WT, hem de A549 HKlb -/ - hücrelerinde diger otofaji indikatörleri olan beclin-l ve ATG13 ekspresyon/ifade düzeylerinin asagi regüle oldugu gözlendi. Bununla birlikte, rapamisin tedavisi ile birlikte beclin-l ve ATG13 seviyeleri degismedi. Ayrica, HKlb silinmesi ve cisplatinin, elektron mikroskobuyla (EM) da gösterildigi gibi önemli sayida otofajik vezikül ve miyelinoid cismi indükledigi gösterilmektedir. Tüm veriler ele alindiginda; otofajinin temel olarak glikoliz azaltilmasiyla ve apoptotik hücre ölümünün büyük oranda cisplatinle baslatildigmi gösterildi. Bu veriler, HKlb silme isleminin cisplatin ile kombinasyonunun, apoptotik ve otofajik yolaklarin aktivitesini arttirarak daha fazla hücre ölümüne neden oldugunu göstermektedir. TR TR TR TR