TARIFNAME BCL-Z INHIBITÖRÜ OLARAK KULLANILAN YENI KÜÇÜK TERAPÖTIK BILESIKLERIN FIZIK ODAKLI OLARAK KESFI Teknik Dayanak 1980`lerin ortalarindan beri kanser patolojisine katki saglayan moleküler mekanizmalarin ve nedensel iliskilerin anlasilmis olmasina ragmen, kansere tedavi bulunmasi zorlu bir is olmaya devam etmektedir. Apoptoz olarak da bilinen programlanmis hücre ölümü, fizyolojik fonksiyonlarin sona erinesinin veya genetik materyale verilen önemli bir hasarin ardindan hücrenin kendi kendini yok etmesiyle sonuçlanan bir moleküler yoldur. Iyi tanimlanan temel apoptoz yollari, dissal ve içsel yollar çesitli sekillerde uyarilir ve belirli sinyal elementleri kullanir. Dissal yol, ölüm reseptörlerinin distan uyarilmasi ile aktive edilmektedir. Ölüm reseptörleri, kaspaz-8 biriktirip, tetikleyebilen ve sonrasinda kaspaz-3, -6 ya da -7 dahil olmak üzere effektör kaspazlarin çalistirilmasi islemi meydana gelen hücre içi ölüm alanina sahip olan tümör nekroz faktörü (TNF) reseptör ailesinin üyeleridir. Bu birikim, B- Hücre lösemi / i'eiçfoma -2 (BCL-2)'nin dogrudan katilimiyla sonuçlanmamaktadir. Mitokondriyal yol olarak da adlandirilan intrinsik yol, bazilari genetik kararsizlik, yetersiz gelisimsel stimülasyon, Viral patojen istilasi olarak ortaya çikan çesitli sitotoksik hasarlar veya büyüme sinyalleri ile baslatilmaktadir. BCL-2 bu islemi siki bir sekilde düzenlemekte ve daha sonra kaspaz-9 aktivasyonuna yol açmaktadir (Cory ve digerleri, 2003; Eimon ve digerleri, 2010; Youle ve digerleri, 2008). BCL-2 protein ailesinin tüm üyeleri, BCL-2 homolojisi (BH) alanlari olarak kabul edilen dizi düzenlerini muhafaza etmistir ve 3 ana sinifa ayrilabilmektedir. Birinci protein sinifi, sadece BIM, BID, PUMA gibi pro-apoptotik aktivatör BH alan 3'ten (BH3) meydana gelmektedir. Aktivasyonlarindan hemen sonra, dis mahmuzlari mitokondriyal yola baglayan moleküler koruyucu görevi üstlenmektedirler. Asagidaki grup BAX, BAK gibi çok alanli proteinler olan proapoptotik efektörleri içermektedir ve her birinin üç BH alani bulunmaktadir. Bu proteinler, sitokrom C'nin sitoplazmaya serbest dolasimina yol açan mitokondriyal dis zarin bütünlügünü bozarak, asagi akim kaspaz aktivitesini baslatir ve sonuç olarak tetiklendiginde hücrenin sonlandirilmasiyla sona erer. BCL-2 ailesinin son sinifi antiapoptotik protein, BCL- XL, BOL-2, MCL-l vb. gibi proteinlerdir. Bu üyelerin tümü dört BH alanindan olusmakta ve proapoptotik akranlarini ayirarak, hücreleri güvende tutmaktadir. Apoptozun tesvik edilmesindeki en önemli nokta, sadece BH3 içeren protein miktarini arttirmak veya antiapoptotik BCL-2 muadillerinden birini kapatmaktir. Apoptotik hücre ölümü, tümör hücrelerinin büyümesi için dogustan gelen bir engeldir, bu nedenle kanser hücrelerinin temel özelliklerinden biri de kemoterapötiklere karsi dirençte önemli süreçleri içeren apoptozdan kaçinmaktir. Bu fenomen, çok sayida malignite kapsaminda asiri üretildigi tespit edilen sagkalim faktörlerinin baskilanmasi dahil olmak üzere apoptoza odaklanan antikanser tedavilerinde tuhaf yaklasimlara yol açmistir. Teknigin Bilinen Durumu BH3 mimetiklerinin umut verici antikanscr ilaçlari oldugu fikri, çok sayida kanserin BCL-2 aile proteinlerine dayandigi ve bu proteinler arasindaki etkilesimin spesifik BH alanlari üzerinden gerçeklestigi sonucundan kaynaklanmistir. Gerçek bir BH3 mimetiginin, proapoptotik BCL-2 proteininin BH3 alanini taklit etmesi ve bu sekilde antiapoptotik aile üyelerini BH3 baglama ceplerini doldurarak deaktive etmesi beklenmektedir. Kanser hücrelerinde asiri üretilen anti-apoptotik protein BCL-Z'nin inhibisyonu, kanser arastirmalarinda en çok çalisilan yaklasimlardan biridir. Su anda; venetoklaks, Gida ve Ilaç Dairesi (FDA) tarafindan kronik lenfositik lösemi (KLL) tedavisi için onaylanmis tek ilaçtir ve seçici bir BCL-2 protein inhibitörüdür. Farkli kanser hücre dizileri üzerinde yapilan çesitli çalismalarda gösterildigi gibi BCL-2 için çok yüksek bir afiniteye sahip olmasina ragmen, bu ilaca karsi direnç halihazirda gözlemlenmis olmaktadir. Bu nedenle, BCL-2 inhibitörleri olarak hedef yapidaki mutasyonlara karsi daha etkili olabilecek ve yan etkisi olmayan yeni bilesikler ve iskeleler önerilmesi gerekmektedir. Mucitler, formül I ile gösterilen yeni bilesigin, BCL-Z'nin inhibitörü olarak islev gördügünü tespit etmistir. Formül 1 Mevcut bulusa göre formül I ile gösterilen bilesik, BCL-2 protein inhibisyonunun terapötik olarak arzu edilen bir sonuç ürettigi çesitli bozukluklarda kullanim için uygun yeni bir bilesigin bir temsilcisi niteligindedir. Bu tür hastaliklar, örnegin kanser gibi proliferatif hastaliklar olabilir. Bu nedenle, mevcut bulus sadece formül I ile gösterilen yeni bilesiklerle degil, ayni zamanda bahsedilen bilesiklerin kanser gibi proliferatif hastaliklarin tedavisinde kullanimiyla da ilgilidir. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bulus, DRG-BCL2-4 olan formül I ile gösterilen bilesik veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir türevi ile ilgilidir. Formül 1 Aksi belirtilmedikçe, "mevcut bulusa ait bilesik" veya "bulusa ait bilesik" veya yerine kullanilabilir ve formül I'e ait bilesikler ve bunlarin tuzlari, hidratlar veya formül l bilesiginin veya tuzlarinin solvatlari, tüm stereoizomerler (diastereomerler ve enantiyomerler), totomerler, izotopik olarak etiketlenmis bilesikler (döteryum sübstitüsyonlari dahil) veya insan vücudunun fizyolojik kosullari altinda olusan formlarin yani sira dogal olarak olusanlar (örnegin polimorflar, solvatlar ve/veya hidratlar) anlamina gelecektir. Yani, "farrnasötik olarak kabul edilebilir türev" terimi, hidratlari, solvatlari, ön ilaçlari, tüm stereoizomerleri, tuzlari, esterleri, totomerleri, izotopik olarak etiketlenmis türevleri veya insan Vücudunun fizyolojik kosullari altinda olusan formül I'e ait bilesik formlarini ifade etmektedir. Bulusun tercih edilen bir düzeneginde formül I bilesigi, Formül la ile gösterildigi gibi spesifik bir stereoizomer seklinde olabilir. Formül la Bulusun tercih edilen bir düzeneginde formül I bilesigi, Formül lb ile gösterildigi gibi spesifik bir stereoizomer seklinde olabilir. F ormüi' Ib Bulusun tercih edilen bir düzeneginde formül I bilesigi, Formül lc ile gösterildigi gibi spesifik bir stereoizomer seklinde olabilir. Formül Ic Bulusun tercih edilen bir düzeneginde formül Ibilesigi, Formül 1d ile gösterildigi gibi spesifik bir stereoizomer seklinde olabilir. Formül Id Mevcut bulusa ait bilesik, formül H ile gösterildigi gibi serbest bir baz formunda da olabilir. F ormül II Bulusun tercih edilen bir düzeneginde formül II bilesigi, Formül 113 ile gösterildigi gibi spesifik bir stereoizomer seklinde olabilir. F ormül Ha Bulusun tercih edilen bir düzeneginde formül II bilesigi, Formül IIb ile gösterildigi gibi spesifik bir stereoizomer seklinde olabilir. F ormül Hb Bulusun tercih edilen bir düzeneginde formül II bilesigi, Formül Ile ile gösterildigi gibi spesifik bir stereoizomer seklinde olabilir. Formül HC Bulusun tercih edilen bir düzeneginde formül II bilesigi, Formül IId ile gösterildigi gibi spesifik bir stereoizomer seklinde olabilir. F ormül Hd Bulusun çesitli düzenlemeleri burada tarif edilmektedir. Belirtilen her bir düzenlemenin, baska düzenlemeler saglamak için diger belirlenmis özelliklerle birlestirilebilecegi düsünülmelidir. Tekil olarak kullanilan terimler, çogul formlarini da ifade edebilir. Burada açiklandigi gibi "enantiomerler" terimi, birbirinin üzerine bindirilemeyen ayna görüntüleri olan bir stereoizomer çifti anlamina gelmektedir. Bir çift enantiyomerin lzl karisimi "rasemik" karisim olarak adlandirilmaktadir. Mutlak stereokimya, Cahn- oldugunda, her bir kiral karbondaki stereokimya, R veya S ile belirtilebilir. Formül Pin bilesigi, kiral bir merkeze sahiptir. Bulusun tercih edilen düzeneginde formül I bilesigi, R ve S enantiomerlerinin 121 rasemik karisimi formundadir. Formül I'e ait bilesik ayrica saf R formunda veya saf S formunda veya bunlarin herhangi bir oranda Mevcut bulus, rasematlar ve formül I'e ait bilesigin optik olarak saf formlari dahil Olmak üzere tüm olasi izomerleri içermektedir. Bahsedilen formlar, kiral reaktiflerin veya baska yöntemlerin kullanilmasi gibi bilinen geleneksel teknikler kullanilarak hazirlanabilir. Burada açiklandigi gibi "tuzlar" terimi, bulus bilesiginin baz ilaveli tuzlarina asit ilave edilen hallerini ifade etmektedir. Özellikle tuzlar, bulus bilesiginin biyolojik etkinligini ve kendi etkinligini korurken, toksisite veya herhangi bir formülasyon zorluguna neden olan herhangi bir biyolojik veya farkli istenmeyen özelliklere sahip olmayan tuzlari ifade eden "fannasötik olarak kabul edilebilir tuzlari" içermektedir. Farmasötik olarak kabul edilebilir asit ilaveli tuzlar, organik asitler ve/veya inorganik asitler ile olusturulabilir. Mevcut bulusa göre bilesigin asit ilaveli tuzlari asagidakileri içeren bir gruptan seçilebilmektedir; asetat, aspartat, benzoat, besilat, bromür / hidrobromür, bikarbonat / karbonat, bisülfat / sülfat, kamforsülfonat, klorür / hidroklorür, klortheofillonat, sitrat, etabisülfonat, fumarat, gluceptat, glukonat, glukuronat, sitrat, etabisülfat, lakodiyot, lakodiyot laktobiyonat, laurilsülfat, malat, maleat, malonat, mande'lat, mesilat, metilsülfat, naftoat, naflat, nikotinat, nitrat, oktadekanoat, oleat, oksalat, palmitat, pamoat, fosfat / hidrojen fosfat / dihidrojen fosfat, poligalaktu steakat sülfosalisilat, tartarat, tosilat ve trifloroasetat tuzlari. Farmasötik olarak kabul edilebilir baz ilaveli tuzlar organik bazlar ve/veya inorganik bazlar ile olusturulabilir. Bulusa ait bilesigin baz ilaveli tuzlarinin hazirlanmasi için uygun bazlar sodyum hidroksit, sodyum karbonat, sodyum bikarbonat, kalsiyum hidroksit, kalsiyum karbonat, kalsiyum bikarbonat, magnezyum hidroksit, magnezyum karbonat, magnezyum bikarbonat, potasyum hidroksit, potasyum karbonat, potasyum bikarbonat ve benzerleri arasindan seçilebilir. Burada açiklandigi gibi "izotopik olarak etiketlenmis bilesikler" terimi, bir veya daha fazla atomun, seçilmis atomik kütle veya kütle sayisina sahip bir atom ile degistirildigi formül l'e ait bilesikleri belirtmektedir. Bu tür degisimler, örnegin, sunlarla bilesigin bu izotopik isaretli varyantlari, teknolojide bilinen saptama veya görüntüleme teknikleri veya hastalarin radyoaktif tedavisi için kullanilabilir. Baska bir yönünde mevcut bulus, formül I bilesigi, DRG-BCL2-4 veya bunun farmasötik açidan kabul gören bir türevini ve farmasötik açidan kabul gören en az bir eksipiyan içeren farmasötik kompozisyonlar ile ilgilidir. Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde, farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan asagidakileri içeren bir gruptan seçilebilmektedir;çözücüler, antioksidanlar, koruyucular (örn. antibakteriyel ajanlar, antifungal ajanlar), izotonik ajanlar, emilim geciktirici ajanlar, doyurucu maddeler, koruyucular, stabilizatörler, baglayicilar, parçalayicilar, yaglayicilar, tatlandirici ajanlar, aroma ajanlari ve bunlarin kombinasyonlari. Her bir grubun özel örnekleri Remington's Pharrnaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990 ve buna eklenen belgeler kapsaminda verilmistir. Formül l'e ait bilesik veya bunun farmasötik açidan kabul edilen türevlerini içeren farmasötik kompozisyonlar, farkli uygulama yollari için formüle edilebilir. Bulusun bir düzeneginde formül l'e ait bilesikleri ihtiva eden farmasötik kompozisyonlar, oral uygulama, parenteral uygulama, topikal uygulama veya rektal uygulama için formüle edilebilmektedir. Bulusun tercih edilen bir düzenegindeki oral uygulama için bulusa ait olan farmasötik kompozisyonlar, tabletler, pastiller, sulu veya yagli süspansiyonlar, dagilabilir tozlar veya granüller, emülsiyon, sert veya yumusak kapsüller veya suruplar ya da iksirler formunda olabilmektedir. Bulusun tercih edilen bir düzeneginde parenteral uygulama için bulusa ait olan farmasötik kompozisyonlar, izotonik çözeltiler veya süspansiyonlar formunda veya uygulamadan önce sulandirrna için uygun liyofilize toz formunda olabilmektedir. Parenteral uygulama için bulusa ait adi geçen farmasötik kompozisyonlar, intramüsküler, intravenöz, subkütan, intraperitoneal, intratrakeal uygulama için kullanilabilmektedir. Bulusun tercih edilen bir düzeneginde topikal uygulama için bulusa ait farmasötik kompozisyonlar, sulu çözeltiler, süspansiyonlar, merhemler, macunlar, losyonlar, transdermal yamalar, jeller, kremler veya aerosoller gibi püskürtülebilir formülasyonlar seklinde olabilir. Bu topikal uygulama cilt, göz veya burun yoluyla uygulamalari kapsamaktadir (yani burun içi uygulamalar). Dolayisiyla, bulusun farmasötik bilesimleri, uygun bir iticiyle veya itici olmaksizin, basinçli kaplar, pompa, sprey, atomizer veya nebülizör yoluyla uygulama için kuru tozlar, çözeltiler veya aerosoller formunda olabilir. Mevcut bulusa ait farmasötik kompozisyon veya kombinasyon, yaklasik 50-70 kg veya yaklasik l-500 mg veya yaklasik 1-250 mg ya da yaklasik olarak bir denek için aktif bilesen birim dozajinda olabilir. Bir bilesigin, farrnasötik bilesimin veya bunlarin kombinasyonlarinin terapötik olarak etkili dozaji, hastanin türüne, vücut agirligina, yasina ve bireysel durumuna, bozukluklarina veya hastaliklarina veya uygulanan tedavi agirligina baglidir. Siradan becerilere sahip bir doktor, klinik görevlisi veya veteriner, bozuklugun veya hastaligin ilerlemesini önlemek, tedavi etmek veya inhibe etmek için gerekli aktif bilesenlerin her birinin etkili miktarini kolay bir sekilde belirleyebilmektedir. Tercih edilen bir düzenekte bulus, BCL2 aktivitesinin (normal aktivite veya özellikle asiri aktivite dahil) aracilik ettigi bir bozuklugun tedavisinde kullanilmak üzere formül l bilesigi, DRG- BCL2-4 veya bunun farmasötik açidan kabul gören bir türevi ile ilgili olmaktadir. Bir düzenekte bulus, formül la, formül Ib, formül lc veya formül ld bilesigi gibi formülün bir bilesigi veya bunun, BH3 taklidi uygulamasi sirasinda arzu edilen bir terapötik yanitin gözlendigi, fannasötik açidan kabul edilen bir türevi ile ilgilidir. Bu basvuru kapsaminda ise "BCL-Z inhibitörü" ve "BH3 mimetik" terimleri ayni bilesikleri ifade eder ve birbirlerinin yerine kullanilabilir. Tercih edilen bir düzenekte BCL2 aktivitesinin aracilik ettigi bozukluk, kanser gibi proliferatif bir hastaliktir. Bulusun bir düzeneginde kanser, iyi huylu veya kötü huylu tümörler, yumusak doku sarkomu veya sarkom (örn. Liposarkom, rabdomiyosarkom) veya kemik kanseri (örn. Osteosarkomlar), karsinom (örn. Beyin, böbrek, karaciger, adrenal bezi, mesane, meme, mide, yumurtalik, kolon, rektum, prostat, pankreas, akciger, vajina veya tiroid gibi), glioblastom, meningioma, glioma, mezotelyoma, multipl miyelom, gastrointestinal kanser (özellikle kolon karsinomu veya kolorektal adenom), bas ve boyun tümörü, melanoma, prostat hiperplazisi, neoplazi, epitelyal karakterli neoplazi, akut miyeloid lösemi veya B hücresi kronik lenfositik lösemi, lenfoma (8- veya T- hücre orij ini) ve diger organlardaki metastazlari içermektedir. Baska bir yönden bulus, burada tanimlandigi gibi formül I'e ait bir bilesigin veya bu bilesigin farmasötik olarak kabul edilen bir türevinin, BCL2'nin aktivitesinin aracilik ettigi bir hastada bir bozuklugun veya hastaligin tedavisi için ilacin üretiminde kullanimi ile ilgilidir. Baska bir yönden bulus, formül I'e ait bir bilesigin veya bu bilesigin farmasötik olarak kabul edilen bir türevinin ve asagidakileri içeren bir gruptan seçilen bir veya daha fazla ilave aktif madde içeren kombinasyonlar ile ilgilidir; anti-proliferatif ajanlar, immünomodülatör ajanlar, antiviral ajanlar, antimikrobiyal ajanlar, anti-enfektif ajanlar, anti-enflamatuar ajanlar, anestezik ajanlar, antiemetikler veya uygun oldugunda bunlarin kombinasyonlari. Tercih edilen bir düzenekte ilave aktif ajan, bir veya daha fazla anti-proliferatif ajandir. Bulusun bir düzeneginde anti-proliferatif aktif ajan, asagidakileri içeren ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilen bir veya daha fazla ajan olabilir; alkilleyici ajanlar, antrasiklinler, taksanlar (sitoskeletal yikicilar), epotilonlar, histon deasetilaz inhibitörleri, topoizomeraz I inhibitörleri, topoizomeraz II inhibitörleri, kinaz inhibitörleri, tirozin kinaz inhibitörleri, nükleotit analoglari ve prekürsör analoglari, peptit antibiyotikler, platinum türevleri, platinum, ve türevler veya diger ajanlar. Alkilleyici ajanlar asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir: bendamustin, siklofosfamid, mechloretharnine, klorambucil, melfalan, dakarbazin, nitrosoureler, streptozotosin, temozolomid, trabectedin. Antrasiklinler, bunlarla sinirli olmamak üzere asagidakileri içeren bir gruptan seçilebilir;daunorubisin, doksorubisin, epirubisin, idarubisin, mitoksantron, valrubisin. Taksanlar (hücre iskeleti bozuculari) asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir: paklitaksel, dosetaksel, abraksan, cabazitaksel, Epotilonlar, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir; epotilon A, epotilon B, epotilon C, epotilon D, epotilon E, epotilon F veya iksabepilon gibi farmasötik olarak kabul edilen bir türevi. Histon deasetilaz inhibitörleri, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir; belinostat, panobinostat, valproat, vorinostat, romidepsin. Topoizorneraz I inhibitörleri, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir; irinotekan, topotekan. Topoizomeraz II inhibitörleri, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir: etoposit, teniposit, tafluposit. Kinaz inhibitörleri, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir; bortezomib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib, Vismodegib. Tirozin kinaz inhibitörleri, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir; afatinib, aksitinib, bosutinib, kobimetinib, crizotinib, dasatinib, erlotinib, getitinib, imatinib, lapatinib, nilotinib, osimertinib, pazopanib, ruxolitinib, sunitinib, vandetanib. Nükleotid analoglari ve öncü analoglari, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir; azasitidin, azatiyoprin, kladribin, klofarabin, kapesitabin, sitarabin, doksifluridin, desitabin, floksuridin, fludarabin, florourasil (5- FU), florourasil, gemsitabin, hidroksurea, metotreksatrintaintatan, tritatin, Peptit antibiyotikler, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir; bleomisin, aktinomisin. Platin bazli ajanlar asagidakileri içeren ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir: karboplatin, cisplatin, oksaliplatin. Retinoidler, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir: tretinoin, beksaroten, izotretinoin, tamibaroten. Vinka alkaloidleri ve türevleri, asagidakileri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir; Vinblastin, Vinkristin, Vindesine, Vinflunin, Vinorelbin. Diger ajanlar asagidakileri içeren ancak bunlarla sinirli olmayan bir gruptan seçilebilir: metotreksat, pemetrexed, raltitrexed, etoposide teniposid, abirateron, bicalutamide, siproteron, degarelix, exeniestane, fulvestrant, goserelin, histrelin, leuprolid, rnifepriston, triptorelin, lenalidoniid, pomalidoniid, talidomid, everolimus, temsirolinius, anagrelid, ceritinib, dabrafenib, idelalisib, ibrutinib, palbociclib, vemurafenib, bleomisin, daktinomisin, eribülin, estramustin, ixabepilone, mitomisin, prokarbazin, alektinib, iobenguane, interferon, ixazomib, lanreotid, lentinan, oktreotid, omasetaksin, tegafur, oterasil, urasil, combretastatin Bulusun bir düzeneginde bu gibi kombinasyonlar, formül I'e ait bilesigin veya bunun farmasötik açidan kabul gören bir türevinin ve bir veya daha fazla terapötik açidan aktif ajanin, tercihen anti-proliferatif ajanlarin birlikte formüle edildigi bir formda olabilir. Bulusun baska bir düzeneginde formül I'e ait bilesik ve bir veya daha fazla terapötik açidan aktif ajan, tercihen anti-proliferatif ajanlar ayri ayri formüle edilir ancak buna ihtiyaç duyan bir hastaya ayni anda veya sirayla uygulanir. Mevcut özellikler kapsaminda içerme anlami da dahil edilebilmektedir. Teknik olarak uygun olan yerlerde, bulusa iliskin düzenlemeler birlestirilebilir. Burada, düzenlemelerin belirli özellikler/elemanlar içerdigi belirtilmektedir. Açiklama ayrica temel olarak adi geçen özellik]erden/elemanlardan olusan ayri uygulamalara da uzanmaktadir. Patentler ve basvurular gibi teknik referanslar, isbu belgeye referans olarak dahil edilmistir. Burada spesifik olarak ve açikça belirtilen herhangi bir düzenleme, tek basina veya bir veya daha fazla baska düzenleme ile kombinasyon halinde bir feragatnamenin temelini olusturabilmektedir. Mevcut bulusun diger amaçlari, özellikleri ve avantajlari asagida ayrintili bir sekilde açiklanmistir. Bununla birlikte, bulusun tercih edilen düzenlemelerini gösterirken, detayli bir sekilde açiklanan tarifin ve spesifik örneklerin sadece tanimlamak için verildigi anlasilmalidir; çünkü bulusun özü ve kapsamindaki çesitli degisiklikler ve modifikasyonlar, bu ayrintili açiklamalar konusunda teknik olarak uzman kisilere verilmektedir. Bulus su anda yalnizca açiklayici olan ve hiçbir sekilde asagidakilerin kapsamini sinirlayici olarak yorumlanmamasi gereken, asagidaki örneklere referans verilmek suretiyle tanimlanacaktir. ÖRNEKLER Örnek 1: Hücre Kültürü Deneyleri Hücre kültürü deneyleri için çesitli kanser hücre dizileri, HCT-116 kolon kanseri, U87- MG glial tümör, MCF7 meme kanseri hücre dizileri kullanilmistir. Hücreler, glikoz DMEM ortami (Biosera) ile tohumlanmistir. Moleküler islemden yirmi dört saat önce 24 oyuklu hücre kültür plakalarinin her bir oyuguna 10.000 hücre tohumlanmistir. Moleküller, DMSO'da (Amresco) 4 mM stok çözeltisi hazirlanarak kullanilmistir. Molekül tedavisi için molekül stok çözeltileri, %10 PES ile DMEM içerisinde seyreltilmis ve karsilik gelen her oyuktaki hücrelere ilave edilmistir. Araç DMSO'sunun nihai konsantrasyonu maksimum %2 olarak hesaplanmistir. Bu nedenle, deneylerdeki araç grubu sadece maksimum %2 DMSO konsantrasyonu içermistir. Daha yüksek plaka konfluens seviyeleri, moleküler tedaviden bagimsiz olarak hücre proliferasyonunu yavaslatacagindan, tedavi süresince hücrelerin hiçbirinin %60'tan fazla konfluansa ulasmadigindan emin olmak için tohumlanacak hücre sayisini hesapladik. Yari-maksimal inhibisyon konsantrasyonunun degerleri (IC50), MTT hücre çogalma analizleri kapsaminda belirlenmistir. HCT-116 hücre hatlari üzerinde 10-9 ila 10-4 M arasinda degisen farkli molekül konsantrasyonlari tek bir islemle test edilmistir. 570 nm absorbans degerleri kaydedilmis ve Ey› degerleri, doz yanitlari - Graphpad Prism 8 yazilimi inhibisyon egrileri ve dogrusal olmayan regresyon analizi kullanilarak hesaplanmistir. Hücre çogalma tahlilleri için bes günlük deneyler yapilmis ve tüm hücre dizileri ile en az üç kez çalisilmistir. Uygulamanin üçüncü gününden sonra sagkalim oranlari önemli ölçüde degismemistir. Bu nedenle, üç günlük sonuçlar sunulmustur. MTT analizi, baslangiçta 1 X 104 hücre/oyuk ile 24 oyuklu plakalar üzerinde gerçeklestirilmis ve gece boyunca gelistirilmistir; ardindan en az 3 gün boyunca farkli konsantrasyonlarda seçilen moleküller ile islenmistir. Ilk inkübasyon gününden sonra moleküller ilave edilmis ve MTT ile 37°C'de 4 saat inkübasyondan sonra formazan, DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD) ile çözündürülerek, absorbans degeri, 570 nm'de ölçülmüstür. Sekil l'deki grafikte gösterildigi gibi, araç grubu HCT-llö hücrelerinin düzgün çogaldigini gösterirken, formül l bilesigi ile uygulamaya maruz birakilan grup daha az çogalma ve apoptotik hücre yapilari göstermistir. IC50 Formül 1 bilesiginin degeri (Sekil 1) 24 HM olarak belirlenmistir. Hücre Canliligi (Kontrol'ün %'sine göre) Süre (Saat) TR TR TR