TARIFNAME TIP 11 DIYABET RISKINI AZALTMA ÖZELLIGINE SAHIP FONKSIYONEL GIDA KATKI MADDESI Bulusun Ilgili Oldugu Alan Bulus, tip II diyabet riskini azaltma özelligine sahip destekleyici ve takviye edici olarak kullanilabilecek gida katki maddesi ve onun hazirlanma yöntemi ile ilgilidir. Bulusla ilgili Teknigin Bilinen Durumu (Önceki Teknik) Türkiye bulundugu cografi konum ve iklim özellikleri nedeniyle çok çesitli bitki türlerine sahiptir. Tedavi edici alternatifler olarak hastaliklarin tedavisinde ve sagligin korunmasinda sifali bitkilerin rolü dünya çapinda ve ülkemizde de hizla ilerlemektedir. Insan sagligi için bitkilerin ne kadar önemli oldugu ve hastaliklara sifa bulma noktasinda insanlik tarihinin ilk zamanlardan günümüze kadar el üstünde tutuldugu bilinmektedir. Ülkemiz sahip oldugu ekolojik kosullar sebebiyle birçok bitki türünün ana vatani konumundadir. 11 binin üzerinde bitki çesitliligi ile büyük bir zenginlige sahip Türkiye,de, tibbi ve aromatik bitkiler, bu zenginligin önemli bir parçasidir. Onlarca çesidi ticarete konu olan tibbi ve aromatik bitkilerin ihracatindan Türkiye 300 milyon dolardan fazla kazanç saglamaktadir. Ülkemizde dogadan toplanan tür ve çesitler ile iç piyasada ticarete konu olan bitki sayisi yaklasik 350 kadardir. 0 Bu bitkilerden de yaklasik 100 kadarinin ihracati yapilmaktadir. 0 Yillar içinde degisim göstermekle birlikte Türkiyeade 20 çesit tibbi ve aromatik bitkinin 1,3 milyon dekar alanda tarimi yapilmaktadir. 0 Üretim miktari bakimindan siyah çay, kirmizibiber, hashas, kimyon, nane, kekik, yaglik gül ve anason ilk siralarda yer almaktadir. 0 Bu bitkilerden 53 tanesi dogal bitki çayi olarak tüketilmektedir. Tibbi ve aromatik bitkiler ilaç olarak geleneksel ve modern tipta hastaliklarin önlenmesi, iyilestirilmesi ve sagligin sürdürülmesi için kullanilmaktadir. Ayni zamanda besin takviyeleri, bitkisel çay, tat, çesni olarak beslenmede de faydalanilmaktadir. Parfüm, vücut bakim ürünleri olarak parfümeri ve kozmetikte kullanilmasinin yani sira, parlaticilar hatta böcek ilaçlari olarak sanayinin farkli kollarinda genis bir kullanim alani bulmaktadir. Bu bitkilerin kurutulmus olarak hazirlanmis kök, yaprak, kabuk, çiçek, tohum, meyve kisimlarindan yararlanilmaktadir. Tibbi ve aromatik bitkilerin hemen hemen her alanda kullanimi mevcut olup bunlar biyolojik kültürel ve endüstriyel kaynaklar olarak degerlendirilmektedir. Yapilan arastirmalara göre son yillarda bu kaynaklara talebin oldukça arttigi bilinmekte ve gelecekte artmaya devam edecegi öngörülmektedir. Bunun baslica nedeni, bu bitkilerin tip ve saglik alaninda sentetik yolla elde edilen etkin maddelerine göre çok yönlü etkiye sahip olmasi ve yan etkilerinin bulunmamasidir. Her sektörde oldugu gibi ülkelerin gelismislik düzeyine göre bitkilerin tedavi amaçli kullanimi degisiklik göstermektedir. Gelismekte olan ülkelerde nüfusun %80,i tedavi amaçli bitkisel ürünlerden faydalanmaktadir. Asya, Afrika ve Orta Dogu gibi bölgelerin bazi ülkelerinde bu oran %95,e kadar çikmaktadir. Gelismis ülkelerde ise bu oran daha az olup Almanyaada %40- bitkilerin en önemli ticaret merkezleri de Almanya, ABD, Japonya ve Ingiltere,de bulunmaktadir. Dünya Saglik Örgütü tarafindan ilerleyen yillarda dünya genelinde bitkilerle tedavilerin artacagi öngörülmektedir. Genel olarak tibbi ve aromatik bitkilerin ticareti en fazla kurutulmus sekilde, daha sonra uçucu yag ve taze olarak yapilmaktadir. Dünya çapinda tip 2 diyabetli kisilerin yaklasik %90-95'i insülin direncine bagli olarak yüksek ve/veya dalgali kan sekeri seviyeleri ile karakterizedir. Obezite ve uygun bir yasam tarzina ve özellikle beslenme özelliklerine sahip olmama yogun olarak kandaki glikoz konsantrasyonunun artmasina ve ardindan yüksek kan kolesterolü ve kan basincini içeren vasküler bozukluklara neden olabilmektedir. GI (Glisemik indeks), çesitli gidalardan tespit edilen karbonhidratlardan olusur. Bazi gidalar kan sekerini hizli bir sekilde yükseltirken, bazilari bunu hafifçe aitirabilir. Bazilarinda glikoz gibi basit sekerler, bazilarinda ise modifiye ve dirençli nisastalar, lifler vb. içeren karmasik gidalar içeren temel gidalarla ilgilidir. Bu bilesenler, yukarida belirtilen enzimler tarafindan basitçe parçalanan nisasta hariç, ekstrakte edilmis polisakkaritlerin karmasik yapisi ile ilgili olan glikoz sentezini düsürmek için yükselebilir. GI tahmini 40'tan az olan karbonhidratlar, balkabagi ekmegi, makarna, baklagiller ve yari haslanmis pirinç gibi düsük glisemik indeksli gidalarda siniflandirilir. Yulaf lapasi gibi GI degeri 40 ile 70 arasinda olan karbonhidratlar orta bölgeye aittir ve patlamis misir, çikolata ve gofret gibi GI tahmini 70'in üzerinde olanlar yüksek glisemik indeksli karbonhidratlar olarak kabul edilebilir. Seker hastalarinda tokluk hiperglisemiyi azaltmak için kullanilan akarboz, miglitol ve vogliboza (a-glukozidaz ve (x-amilaz inhibitörleri) ragmen mide rahatsizligi, ishal, siskinlik, bulanti gibi yan etkiler ve rahatsizliklar görülmüstür. Bu nedenle nisastali gidalarda insüline benzer etkileri olan dogal maddeler elde etmek için birçok çalisma yapilmis ve polifenollerden zengin diyetlerin bazi sindirim enzimlerinin aktiVitesini engelleyerek kan sekerini düsürdügü kanitlanmistir. Bahsedilen polifenollerin özellikle ekstraksiyon ve saIlastirma ile iliskili inhibisyon etkileri, yüksek karbonhidrat içeren gidalarda glisemik indesksi düsürmüstür. Polifenol bilesenleri, nisastayi parçalamaya katilan kilit enzimleri etkileyebilir ve akabinde amilolitik enzimlerin inhibisyonu yoluyla glisemik kontrolü iyilestirebilir. Ülkemizde DSÖ"nün 2030 yili için öngördügü diyabet görülme sikligi rakamlarina bu yillarda ulasmis olmamiz diyabetle ilgili kritik hamlelerin de yapilmasi gerekliligini ortaya koymustur. Ülke saglik harcamalarinin %25 ,ine yakin bir kisminin, diyabet ve iliskili hastaliklara harcanmasi diyabetin vatandaslarimizin sagligi kadar ülke ekonomisine getirdigi yük acisindan da oldukça önemli oldugu gerçegini karsimiza çikarmaktadir. Bu anlamda 1.Basamak Koruyucu Saglik Hizmetleri sunumunda diyabetin önlenmesi ve kontrolü için etkin önlemlerin alinmasi erken tani ve uygun tedavisinin yapilmasi, diyabetle iliskili hastaliklarin ve komplikasyonlari önlenmesi konusunda farkindaligin arttirilmasi çalismalarinin yapilmasina ihtiyaç duyulmaktadir. Uluslararasi Diyabet Federasyonu (IDF), dünya genelinde 382 milyon yetiskinin diyabet hastasi oldugunu tahmin etmektedir. Diyabet görülme prevalansi epidemik oranlara ulasmis olup ve 2035 yilina kadar bu rakamin 592 milyona ulasmasi beklenmektedir. Su an Türkiye,de 7 milyonu askin diyabet hastasi oldugu tahmin edilmektedir. Teshis edilen diyabet hastalarinin sadece %11,i (800 bin kisi) hedeIlenen tedaVi sonuçlarina ulasarak komplikasyonsuz bir hayat sürebilmektedir. 2009,da IDF Türkiyeanin diyabetle iliskili saglik harcamalarinin 2030 yilina kadar 6.5 milyar $,a ulasacagini tahmin etmistir. Ancak bu rakama daha 2010 yilinda ulasilmistir. Diyabet komplikasyonlara neden oldugunda, tedaVi ve saglik hizmeti maliyetleri tek basina diyabet tedaVisinin 5 katindan fazla olabilir. 2013,e ait güncel IDF istatistikleri Türkiyeade diyabet hastasi bir kisi için yillik ortalama tedaVi maliyetinin 866 $ oldugunu göstermektedir (IDF, 2013). Geçtigimiz 15 yil içinde, Türkiye,de diyabet hastalarinin sayisi neredeyse üç katina çikarak yillarinda gerçeklestirilen toplum temelli iki diyabet çalismasi yetiskin nüfusta bu dönemde diyabetin yaklasik %90 oraninda arttigini ve artmaya devam ettigini göstermektedir. Türkiyeade diyabet hastasi sayisinin çok yüksek olmasi nedeniyle, Avrupa,daki diyabet yükünün neredeyse diyabetin öncüsü olarak adlandirilan bozulmus glukoz toleransi (IGT) vardir. IDF öngörülerine göre diyabet hastasi bireylerin sayisi 2035 yili itibariyle yaklasik 12 milyona ulasacaktir. Yapilan çalismalar beslenme dahil saglikli yasam tarzi degisiklikleri ile %44-58 oraninda diyabet riskinin azalmasi saglanarak, hastaligin önlenebilecegini veya en kötümser tahminle geciktirilebilecegini göstermistir. Dolayisiyla, tip II diyabet riskini azaltma özelligine sahip gida katki maddeleri ve bu katki maddelerinin eklenmesiyle üretilen gidalarin tüketilmesiyle diyabet riskinin ve bu hastaligin tedaVisi için harcanan maliyetlerin azaltilmasina yardimci olunacak ve ülke ekonomisine dolayli yoldan katki saglanabilecektir. Saglikli beslenme ve yasam tarzi gibi degisikliklerle diyabet riskinde %44-58,lik azalma saglanmasi mümkün oldugundan dolayi günlük tüketim aliskanligina sahip olunan gidalarin tip-II diyabet riskini azaltma özelligine sahip fonksiyonel gida katki maddeleri ile zenginlestirilmesi gerekmektedir. Türkiye'de yaygin dagilim gösteren Karaçam Agaç kabuklari, agacin kuru maddede agirlikça açiga çikmaktadir. Agaç kabugu, dericilik endüstrisi ve biyoyakit üretimi gibi alanlarda degerlendirilmektedir. Ancak agaç kabugunda bulunan degerli bilesenlerin elde edilerek gida endüstrisinde degerlendirilmesi teknikte bilinmemektedir. Bulusun Kisa Açiklamasi ve Amaçlari Bulusun öncelikli amaci, orman endüstrisi atigi olan Karaçam (Pinus nigra) agaç kabuklarindan gida sanayi için degerli katma degeri yüksek, fonksiyonel özellikte gida katki maddesinin üretilmesi ve antidiyabetik, antioksidan, antikanser etkinliginin kanitlanmasidir. Bulusun amaci, Karaçam (Pinus nigra) agaç kabuklarindan ekstrakte edilen toz halindeki biyoaktif bilesenleri içeren antidiyabetik, antikanser ve antioksidan özellikli fonksiyonel gida katki maddesinin elde edilmesidir. Bulus ile kisa sürede ve düsük sicakliklarda gida sanayisinde kullanilmayan karaçam agaç kabuklarindan gida sanayisi için katma degeri yüksek fonksiyonel özellikte ve tip-II diyabet riskini azaltan gida katki maddesi hazirlanmistir. Bulusun bir diger amaci, orman ürünleri üretiminde genel olarak atik olarak degerlendirilen ya da katma degeri düsük alanlarda kullanimi olan karaçam (Pinus nigra) endüstriyel agaç kabuklarinin gida endüstrisinde kullanim olanaklari saglamak ve yeni/katma degeri yüksek kullanim alanlarinin ortaya konulmasidir. Türkiye,de diyabetli hasta sayisindaki öngörülen artis hizi göz önüne alindigi zaman, günlük tüketim aliskanligina sahip olunan gidalarin tip II diyabet riskini azaltma özelligine sahip fonksiyonel gida katki maddeleri (biyoaktifçe zengin çözünür agaç kabuk ekstresi) ile zenginlestirilmesi ile bu hastalik riskinin azaltilmasinda yardimci olunabilecektir. Bulusun diger bir amaci, "SIFIR ATIK" yaklasimi kapsaminda çevreye birakilan atiklarin degerlendirilerek çevre kirliliginin önlenmesine yönelik katkida bulunmaktir. Bulus diyabetik hastanin kan glukoz konsantrasyonunu kontrol etmek ve insülin benzeri etkiler sunmak için bazi farmakolojik prosedürler olmasina ragmen, gida formülasyonunda dogal ürünlerin potansiyelini dahil etmek, (x-glukozidazin inhibisyonu yoluyla kan glukoz konsantrasyonunu kontrol etmek için yeni bir yaklasimdir ve gida-saglik iliskisi açisindan önem arz etmektedir. Günlük tüketim aliskanligina sahip olunan gidalarin tip-II diyabet riskini azaltma özelligine sahip fonksiyonel gida katki maddeleri (biyoaktifçe zengin suda çözünür agaç kabuk ekstreleri) ile zenginlestirilmesi ile; (i) hastalik riskinin azaltilmasinda yardimci olmakla birlikte, (ii) fonksiyonel özellikte gida katki maddesi üretimi ile destekleyici gida katki maddesi üretimi (iii) ülke ekonomisi açisindan yaygin dagilim gösteren karaçam kabuklarindan gida sanayisi için katma degeri yüksek yeni ürünler elde edilmesine de imkan saglanmaktadir. Yeni ekstraksiyon yöntemlerinden olan ultrases kullanilarak elde edilen karaçam kabuk ekstreleri tip-II diyabet tedaVisinde kullanilan akarboza karsi daha düsük dozda kan glikoz seViyesini azaltmistir. Ayni zamanda bagisiklik güçlendirici antioksidan özelligi ile de destekleyicidir. Bulus ile orman endüstrisi atigi olan, karaçam agaç kabuklarindan, biyoaktif bilesenlerin ekstraksiyonu ile elde edilen ekstrelerin, tip-II diyabet hastaligi riskini azaltmada etkili, bagisiklik güçlendirici antioksidanca zengin fonksiyonel gida katki maddesi olarak kullanilmasi gösterilmistir. Gida katki maddeleri ve yardimci maddeleri, gidalarin üretiminde, özelliklerinin iyilestirilmesinde ve düzenlenmesinde, endüstriyel üretim tekniklerine uyarlanmasinda, raf ömürlerini uzatarak katma degerinin arttirilmasinda ve son gida ürünlerinin duyusal özelliklerinin korunmasinda yaygin olarak kullanilmaktadir. Gida sanayinin girdileri arasinda önemli bir maliyet kalemi olusturan bu maddeler, ülkemizde yeterli üretimleri olmadigi için büyük oranda ithalatla karsilanmaktadir. Ülkemizin disa bagimligini azaltmaya yönelik gida katki maddeleri ve yardimci maddelerin gelistirilmesi, üretilmesi ve iyilestirilmesi önem tasimaktadir. Tüketici talepleri dogrultusunda, kimyasal/sentetik katki maddeleri yerine dogal kaynaklardan elde edilen katki maddeleri ve yardimci maddelerinin gelistirilmesi hizla önem kazanmakta ve bu nedenle sanayiye yönelik çalismalarin yapilmasi açisindan bulus önem arz etmektedir. Sekillerin Açiklamasi Sekil 1: Karaçam (Pinus nigra) kabugundan TIP II diyabet riskini azaltan fonksiyonel gida katki maddesinin hazirlanmasi yöntemi akis semasi. Sekil 2: Karaçam kabuk ekstraktlarinin uygulandigi CaCo-2, HEK ve MiaPaCa-2 hücrelerinde hücre canliligi (Cell Viability) sonuçlarinin karsilastirilmasi. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bulus, karaçam agaç (Pinus nigra) kabugundan ekstrakte edilen biyoaktif bilesenleri içeren bir TIP II diyabet riskini azaltan fonksiyonel gida katki maddesidir. Gida katki maddesi siVi veya toz formunda olabilmektedir. Karaçam (Pinus nigra), çamgiller (Pinaceae) familyasindan bir çam türüdür. Bulusta karaçam agaç kabuklarindan fonksiyonel biyoaktif maddelerin ekstraksiyonu için modern ekstraktsiyon tekniklerinden olan ultrasonik destekli ekstraksiyon sistemi kullanilmis olup, biyoaktif maddelerin in vitro biyolojik gida-saglik iliskisini destekleyici, antidiyabetik-antikanser- antioksidan aktivitesi belirlemistir. Bulusta gerekli olan karaçam agaç kabuklari Isparta-Egirdir bölgesinden temin edilmistir. Bulus ile karaçam (Pinus nigra) agaç kabuklarindan elde edilen suda çözünür biyoaktif maddelerin, kandaki seker seviyesinin düzenlenmesinde (x-D-glukozidaz enziminin üzerinde inhibe edici etkisi nedeniyle etkili oldugu tespit edilmistir. Orman endüstrisinde odun olarak degerlendirilen agaçlarin birçogu kesildikten sonra agaç kabuklari odun gövdesinden soyulmakta veya büyük ölçüde atik olarak degerlendirilmekte ya yakit olarak ya da nispeten farkli endüstri dallarinda (biyoyakit üretimi, dericilik vs.) hammadde olarak kullanilmaktadir. Agaç kabugu bilesimine bakildiginda, gida bilimi ve teknolojisinde büyük önem tasiyabilecek degerli bilesenleri içerdigi görülmüstür. Gida atigi olarak degerlendirilen meyve/sebze posalari ile kiyaslandiginda, agaç kabuklarinin daha yüksek düzeylerde fenolik madde ve antioksidan içerdiginin görülmesi, bulusun çikis noktasini olusturmus ve gida endüstrisi için degerlendirme imkâni olabilecek farkli bir endüstri dali atigi olarak kullanilabilecegi düsünülmüstür. Bulus kapsaminda hazirlanan agaç kabuk ekstrelerinden üretilen in vitro testlerle kan sekerini düsürme özelligi tespit edilmis fonksiyonel katki maddesi elde edilmistir. TIP II diyabet riskini azaltan fonksiyonel gida katki maddesinin hazirlanmasinin akis diyagrami Sekil l,de gösterilmektedir. TIP II diyabet riskini azaltan fonksiyonel gida katki maddesinin hazirlanmasi; ögütülmesi, süresi 3-9dk. ve ultrasonik güç 50-150 W olarak optimize edilen kosullarda ögütülen kabuklardan ultrasonik ekstraksiyon yöntemi ile alkol: su karisimi içerisinde karaçam agaç kabuklarindan fonksiyonel etkili biyoaktif bilesenlerin ekstraksiyonu, uzaklastirilmasi ve toz haline getirilmesi islem adimlarini içermektedir. Ultrasonik ekstraksiyon ile optimize edilen kosullar kullanilarak (sicakligi 20-40 oC, ekstraksiyon süresi 6-9 dk. ve ultrasonik güç 50-150 W) elde edilen ekstrelerinin antidiyabetik aktivitesi belirlenmektedir. Antidiyabetik aktivitesi yüksek bulunan ekstraktlarin antioksidan, antimikrobiyal ve antikanser aktivite ve HPLC'de fenolik asit kompozisyonu ile karakterizasyonu yapilmaktadir. Son olarak agaç kabuk ekstreleri fonksiyonel gida ürünlerine eklenerek ve glisemik indeksin düsürülmesi üzerindeki etkisi belirlenmektedir. Örnegin; beyaz ekmek ve makarnaya belirli konsantrasyolarda suda çözünür liyofilize toz karaçam agaç kabuk ekstresi ilave edilerek, kontrol beyaz ekmege göre glisemik indeksi düsürülmüstür. Örnek olarak kullanilacak karaçam agaç kabuklari, agaçlarin orman olusturdugu bölgedeki en düzgün forma sahip olan agaçlardan analizin yapilacagi dönemden hemen önce TAPPI T 257 cm-02 standardina göre temin edilmektedir. Örnekler agaç kesiminden sonra hizli bir sekilde laboratuvara alinip ön parçalama islemi ile mümkün oldugunca küçük parçalara ayrildi. Freeze- dryer (liyofilizatör, dondurarak kurutma) cihazinda kurutulan örnekler laboratuvar tipi Wiley degirmeninde parçacik boyutu 1 mm,den küçük olacak sekilde ögütüldü. ultrasonik güç 50-150 W kosullarinda ayarlanarak 17 farkli nokta çalisilmistir. Maksimum Bu noktalari, analiz sonuçlarini Tab102,de verilen datalari programa girerek Tablo3,de verilen R2 degerlerine göre program; Maksimum verim için öngörülen ekstraksiyon kosullari 34.33°C, 6.89 dk ve 98.45 W olarak yanit vermektedir. Karaçam agaç kabuklarindan biyoaktif bilesenlerin ekstraksiyonunda solvent olarak %80alik metanol:su kullanilmistir. Kabuk:solvent orani 1:10 (m:v) olarak ön denemelerle belirlenmistir. Ekstraksiyon islemleri, ultrasonik destekli olarak gerçeklestirilmis olup optimizasyon çalismasinda 3 faktörlü (ekstraksiyon süresi, ekstraksiyon sicakligi ve ultrason genligi) ve 3 seviyeli (düsük, orta ve yüksek) Yanit Yüzey Yönteminin (RSM) Yüzey Merkezli Kompozit Tasarimi ile elde edilen ve Tablo 1,de görülen deney tasarimindan faydalanilmistir. Mevcut çalismada, bir Box Behnken Design (BBD) olusturmak için Design Expert Version 7.0.0 (Stat- Ease Corporation, Minneapolis, MN, ABD) yazilimi kullanildi. Bagimsiz degiskenlerin etkisini degerlendirmek için BBD kullanildi; yani ekstraksiyon sicakligi (X1, , ekstraksiyon süresi (X2, 3-9 dk.) ve verimde ultrasonik güç (X3, 50-150 W) belirlendi. Proses degiskenlerinin seviyeleri, laboratuvarda yapilan ön denemelere ve ilgili literatür arastirmasina dayali olarak belirlenmistir. 3 tekrarli ve 3 faktörlü 17 rastgele deneme olarak kodlanmis ve kodlanmamis olarak deney tasarimi Tablo 1'de verilmistir. Yanit olarak verim ve toplam fenolik madde içerigi, toplam tanen içerigi ve antioksidan metotlarindan olan FRAP (Ferric Antioxidant Power) ve ABTS (2,2,-azinobis-(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) degerlendirmeye alinmis ve elde edilen degerler Tablo 2 de verilmistir. 17 farkli örnekte yanitlarinin tamaminin maksimum oldugu nokta ekstraksiyonun optimum kosulu olarak program yardimi ile belirlenmistir. belirlenmistir. 6.89 dk gibi kisa bir sürede antioksidan ve fenolikçe zengin, antimikrobiyal, antikanser ve antidiyabetik etkili ekstrakt elde edilmis olup deney sonuçlari ile ispatlanmistir. Fonksiyonel açidan zengin olan karaçam agaç kabuk esktresinin tip-II diyabet riskini azaltma özellikli olarak gida sanayisine katma degeri yüksek yeni bir gida katki maddesi kazandirilmistir. Sonuç olarak, karaçam agaç (Pinus nigra) agaç kabuk ekstresi, önemli fenolik bilesen içerigiyle antioksidan durumu güçlendirebilecegi ve (x-glukozidaz inhibisyon aktiviteleri sayesinde nutrasötik olarak yemek sonrasi hiperglisemiyi önleyebilecegi, tip-II diyabet riskini azaltici olarak kullanilabilecegi sonucuna varilabilir. Tablo 1 Yüzey Merkezli Kompozit Tasarimi (RSM) ile hazirlanan ultrasonik ekstraksiyon deney tasarimi Kodlanmis degerler Gerçek degerler Örnek X1 X2 X3 Sicaklik Zaman Ultrasonik (OC) (dk) Guç (Watt) 8 1 0 '1 40 6 50 X1, X2 ve X3 model parametreleri sirasiyla ekstraksiyon sicakligi, ekstraksiyon süresi ve ultrasonik Tablo 2 Karaçam (Pinus nigra) kabugu örneklerinin ekstraksiyon verimi ve biyoaktif özellikleri S m. 5170" Biyoaktif Ozellikler T0plam T0plam FRAP ABTS fenolik içerik tanen içerigi Run Y' ld (°/) (mg GAE/g (mg CE/g (mg TEAC/ g (mg TEAC/ g .25 13.45 14.63 90.26 99.28 62.76 86.45 127.65 100.58 90.63 120.34 17.85 17.07 13.52 16.11 21.98 18.23 17.18 19.35 585.67 560.46 520.76 550.75 680.75 583.78 560.46 660.48 729.45 699.43 540.81 700.37 796.34 700.16 640.75 733.84 GAE: gallik asit esdegerleri; CE: katesin esdegerleri; TEAC: Trolox esdegerleri antioksidan Karaçam (Pinus nigra) kabuk örnekleri için tahmin edilen model denklemleri ve regresyon katsayilari degeri ise Tablo 3'de verilmistir. R2 degerleri anlamli olup deney tasarimi basarili olarak yürütülmüstür. P degeri < 0.05 olup model anlamlidir. Sicakligin ve sürenin birlikte artmasiyla verim artmis ama sürenin etkisi sicakliga göre daha etkilidir. Ekstraksiyon sicakligin °C oldugu noktada gücün ve sürenin artmasiyla verim en yüksek noktadadir. Güç ve süre Tablo 3 Karaçam (Pinus nigra) kabuk örnekleri için tahmin edilen model denklemleri ve regresyon katsayilari degeri Parametreler Öngörülen Model Denklemler R2 Içerigi 003 * X32 Içerigi Tablo 4: Karaçam agaç kabuklarindan elde edilen ekstraktin mineral içerigi (ultrasound maserasyon ekstraksiyonu kiyaslamali) Dalga SIit LO Karaçam Karaçam Su Element Boyu Araligi It: Yöntem Ultrasound banyosu Literatürde karaçam agaç kabuk ekstresine ait mineral profiline iliskin bir çalisma bulunmamaktadir. Karaçam kabuklarinin ultrasonikasyon destekli ekstrelerinde bulunan mineral miktari su banyosu ekstresine göre daha fazladir. Karaçam Kabuklarinin mineral profili her iki ekstraksiyon yöntemi de göz önüne alindiginda ultrasonik ekstraksiyonda daha fazladir. Karaçam'da en yüksek miktarda bulunan mineralin sodyum oldugu ve bunu potasyum ve kalsiyumun izledigi görülmektedir (Tablo 4). Tablo 5 incelendiginde karaçam agaç kabugunda da major bilesen (x-Pinene olup, % 27.2 dir. Karaçam agaç kabugunda ana bilesenler (x-pinene, ß -pinene, limonene, ß-Caryophyllene ve germacren D'dir. Zengin uçucu aroma profili ile de antimikrobiyal etkisini desteklemektedir. Antimikrobiyal sonuçlari ise Tablo 7'de verilmistir. Antimikrobiyal sonuçlari incelendiginde Karaçam kabuklarinin ultrasonik ekstrasiyonunun, maserasyon örneklerine göre patojen mikroorganizlara karsi daha etkili oldugu bulunmustur. Konsantrasyonun düsük olmasi, daha düsük konsantrasyonda antimikrobiyal etki gösterdigini kanitlamaktadir. En iyi inhibisyon 0.350 mg/mL ile S. typhi'muri'um a karsi olmustur. Tablo 5: Karaçam ekstresinin GC ile Aroma Profili Analiz Sonuçlari Bilesik % Alan tricyclene 0.03 Camphene 0.41 limonene 4.01 ß-Myrcene 1.33 ß-Phellandrene 1.1 1 (x-Terpinolene 6.45 ß-Caryophyllene 9.21 Gerinacrene D 15.78 ö-Cadinene 2.4 hexenal 0.33 (x-copaene 1.16 (x-terpinyl acetate 2.23 trans-pinocarveol 0.68 (x-humulene 1 .54 (x-terpineol 0.56 Methyl eugenol 0.06 trans-methyl isoeugenol 0.13 T-muurolol 0.23 famesyl acetate 0.1 1 Toplam 98.9 Tablo 6: Kara çam kabuk ekstraktlarinin fenolik asit profili (ultrasound maserasyon ekstraksiyonu kiyaslamah) Kara Ultrasound Kara Su Banyosu Ahkonma Ahkonma Fenolik Asit Konsantrasyon Fenolik Asit Konsantrasyon Fenolik asit profili Tablo 6,da verilmistir. Ekstraksiyon metodu olarak seçilen ultrasonik ekstraksiyon, klasik maserasyon (su banyosu) ekstraksiyonu ile kiyaslanmistir. Degerler incelendiginde, ultrasound ekstraksiyon sonuçlari, su banyosu ekstraksiyonuna göre daha bulunurken, maserasyon ekstraktinda belirlenememistir. Karaçam kabuk ekstraktinda; caffeic, syringic, rans4hydroxycinnamic, rutin, ferulic, trans3hydroxy, dcoumaric, myricetin, quercetin, chyrsin, elagic, m-coumaric, gallic ve protocatechic olmak üzere toplam 14 fenolik asit belirlenmistir. Ultrasound gücü fenoliklerin açiga çikmasinda yardimci olmustur. Miktari en Karaçam agaç kabuklarinin ultrasound ile ekstraksiyonu su banyosuna göre fenolik asit profili açisindan daha zengindir. Yapida antidiyabetik etkili rutin fenolik asitinin bulunmasi (Tablo 6) karaçam agaç kabuklarinin tip-II diyabet riskini azaltici ve antidiyabetik etkili olmasini saglamistir. Rutin'in antihiperglisemik etkisi için önerilen mekanizmalar arasinda ince bagirsaktan karbonhidrat emiliminin azalmasi, doku glukoneOgenezinin inhibisyonu, doku glukoz aliminin artmasi, beta hücrelerinden insülin salgilanmasinin uyarilmasi ve Langerhans adaciginin dejenerasyona karsi korunmasi yer alir. Rutin ayrica sorbitol, reaktif oksijen türleri, gelismis glikasyon son ürün öncüleri ve inIlamatuar sitokinlerin olusumunu azaltir. Bu etkilerin, rutinin hiperglisemi ve dislipidemiye bagli nefropati, nöropati, karaciger hasari ve kardiyovasküler bozukluklara karsi koruyucu etkisinden sorumlu oldugu düsünülmektedir (Ghorbani 2017). Tip-II diyabet riskini azaltma özelligi ve antidiyabetik etkisi, (x-glukozidaz enzim inhibisyonu sonuçlari ise Tablo 8'de verilmistir. Tablo 8,de karaçam agaç kabuk ekstresinde kullanilan ultrasonik yöntemi klasik maserasyonla kiyaslanmis hem de karaçam agaç kabuklari ekstresinin tip-II diyabet tedavisinde kullanilan akarbozsa göre daha iyi bir antidiyabetik oldugu ispatlanmistir. IC50 degeri, enzimin %50'sini inhibe eden inhibitör konsantrasyonu olup düsük ultrasonik ekstraksiyonla elde edilmis karaçam agaç kabuk esktresinin IC50 degeri: ± 0.76idir. Yani Karaçam agaç kabuk ekstresi, akarbozdan daha düsük konsantrasyonda kullanilarak, (x-glukozidaz enZimini %50 inhibe edebilmistir. Bu sonuçlar gösteriyor ki karaçam agaç kabuk estresi TIP-II diyabet tedavisinde kullanilan akarboza göre daha iyi antidiyabetik etki göstermistir. Ayni zamanda ekstraksiyon yöntemi olarak seçilen ultrasonik ekstraksiyon elde edilen ekstrelerden daha iyi sonuç vermis olup, daha iyi bir antidiyabetiktir ve daha düsük dozda kan glikoz seViyesini azaltmistir. Tablo 7. Karaçam agaç kabuk ekstraktlar1n1n antimikrobiyal aktiVitesi (ultrasound maserasyon ekstraksiyonu kiyaslamali) Minimal Inhibisyon Konsantrasyonu (MIK) (mg/mL) B. cereus S. aureus E. coli _ _ typhimurium monocytogenes Ekstrakt WSBC- ATCC 10530 (+) Pinus nigra Ultrasonik Pinus nigra Maserasyon Tablo 8: Karaçam agaç kabuklarinin antidiyabetik etkisi, (x-glukozidaz enzim inhibisyonu Örnek Konsantrasyon (ug /ml) IC50 (ug /ml) Diyabet hastaliginin tedavisinde siklikla kullanilan sentetik ilaç ve bir (x-glukozidaz inhibitörü olan Akarboz'a karsi alfa-amilaz inhibisyon aktivitesi ve alfa-glukosidaz inhibisyon aktivitesi ön denemelerle in vitro andiyabetik aktivitesi belirlenmistir. Karaçam kabuklari Akarboza karsi daha etkili bir antidiyabetik ajandir. Deney sonuçlari karaçam agaç kabuklarindan ultrasonik ekstraksiyon ile elde edilen ekstrelerinin klasik su banyosu ekstrelerine göre daha iyi bir antidiyabetik ajan oldugunu ayni zamanda da akarboza göre daha etkili oldugu göstermistir. Sekil 2,de karaçam kabuk ekstraktlarinin pozitif kontrol olan saglikli hücrelerle, bagirsak ve mide kanseri hücreleri üzerindeki kiyaslamali olarak antikanser etkisi gösterilmektedir. Karaçam ekstraktlarinin insan saglikli epitelyal hücreleri (HECK 293) üzerinde sadece 1000 ug/mL dozunda zayif dereceli sitotoksik etkisi gözlenirken, kontrol grubuyla karsilastirildigi zaman CACO-2 (insan epitel kolorektal adenokarsinom) hücreleri üzerinde doza bagli olarak hücre canliligini azalttigi ve bu yüzden sitotoksik etkilerinin oldugu belirlenmistir ve antikanseroj en etkilidir (p<0.05). CaCo-2 hücrelerinde, karaçam kabuk ekstraktlarinin l ug/mL dozunun üzerindeki tüm dozlarda hücre canliligini istatistiksel olarak anlamli derecede azalttigi görülmektedir. CACO-2 ve HEK hücrelerindeki her bir doza ait hücre canlilik degerleri karsilastirildiginda ise 1 ve 10 ug/mL dozlari disindaki tüm deney gruplarinda anlamli derecede (P<0.05) farklilik bulunmustur (Sekil 2). Karaçam kabuklarinin CaCo-2 (bagirsak kanseri) hücre hatti üzerindeki IC50 degeri ise; 440 ug/mL olarak bulunmustur. Agaç kabuk ekstraklarinin antikanser aktivitesinin belirlenmesinde, mide kanseri hücreleri üzerine MiaPaCa-2 hücrelerinde daha etkili olmustur. Karaçam kabuklarinin MiaPaCa-2 hücre hatti üzerindeki IC50 degeri ise; 390 ug/mL olarak bulunmustur. TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR