TW200401827A - Hsp70 from arthrobacter - Google Patents

Description

200401827 玫、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於來自棒狀桿菌屬（c〇rynebacteria) 的熱休克蛋白（hsp)基因以及編碼的蛋白質。特別地，本 务明是有關於來自關節桿菌〜一_的_7〇 之分離的黯序列及胺基酸序列，以及與其同源性的序列 。此外’本發明也有關於關節桿菌屬hsp7〇的各種用途： 用於製備疫苗，特別是魚類疫苗；作為佐齊"以及作為抗 原之載劑。 【先前技術】 一個成功對抗細胞内病原體的疫苗，不僅將經由主要 組織相容複合體（MHC)第„型途徑刺激體液免疫反應， 而且（更重要地）還將經由騰帛！型途徑的活化，而誘 發感染細胞的破壞。後者的反應是經由在感染細胞中的外 源性蛋白質之胞液降解而達成，使得外源性物質的片段穿 梭到細胞表面呈現給CD8 +細胞毒性τ細胞（CTL)。無法活 化MHC帛I型途徑’是以純化的重組抗原為基底的疫苗之 常見缺點。 熱休克蛋白（Hsps” ）是一種原核及真核細胞所製 造的分子伴護者蛋白質之家族，其在許多細胞内及細胞間 的過程中扮演必要的角色，特別是在抗原處理以及將抗原 片段呈現到細胞表面處的MHC第I型系統。特定的hsp蛋 白裊與其他肽的融合蛋白質，已成功地在活體内誘發對該 200401827 等肽專一性的CTL反應。 此外，hsps是目前已知對許多細菌、真菌、腸蟲及原 生動物疾病的抗〜病原體免疫反應之標的。具有各種不同 病原性hsps (主要是微生物來源）的哺乳動物之免疫作用 ，可誘發強烈的免疫反應，並且提供對抗由這些病原體所 引起的疾病之保護。對於病原性hsps的哺乳動物免疫反應 之強度，推測部份是由於在這些蛋白質上的多種β細胞及 T細胞抗原決定部位之存在所致。 ^ 一種活的、非致命性的關節桿菌屬菌株（棒狀桿菌家 無之成貝）’疋在用於保護鮭魚及其他養殖魚類對抗細菌 t生月臟疾病（BKD)的疫苗中，以“p ，， ^ w ;又田甲以Renogen的名稱銷售 。這個菌株的特徵是揭露於wo 98/33884。這個疫苗是獨 特的’在於它是第一個被許 。 用於水產養殖的活體培養物 hsp70可有效地用 令人驚訝地，目前顯示關節桿菌屬 於對抗各種魚類病原體的疫苗中。 【發明内容】 發明概述 本發明的第一形態係提供—種 括關節捍菌属h 7ηΑΓΊ ^刀離的核酸序列，其包 不干囷屬hsp70基因之序列、並 基因包括P卩说w / 一片段或相關的序列。 匕栝開放#讀架構（〇RF ) 及3,未韓嘐γ θ ι 未轉譯區域（5，UTR) 禾轉澤區域以及任何構成的啟 、終結子及局部元素。 、增強子、調控子 200401827 本發明的第 包括關節桿菌屬 關的蛋白質。 一形恶係提供一種分離的胺基酸序列，其 hsP70蛋白質之序列、其免疫原片段或相 本發明的另 編碼關節桿菌屬 hsp70蛋白質、 苗組合物可用於 )之藥劑。 一形態係提供一種疫苗組合物，其包括·· hsp70蛋白質之核酸序列、或關節桿菌屬 或富含hsP7〇的關節桿菌細胞萃取物。疫 製備人類或獸醫用途（包括用於水產養殖 的另—形態係提供一種核酸序歹,]，其編碼具有 /、源性多狀的關節桿菌屬 p杆囷屬hsP7〇蛋白質之全部或部份的融 口蛋白貝。本發明也提供融合蛋白質本身。 x 一形態係提供-種包括多肽的實體，該多 肽包括關節桿菌屬hsp7G蛋白f的全部或部份，其為共價 或非共價地連接到異源性分子。 /、 /、貝 本發明的另一形態係提供關節桿菌屬hsp70蛋白質或 核酸序列的用it，以作為疫苗抗原、作為佐劑、或作為異 源性分子的載劑，具有治療或預防動物疾病之目的。 本發明的另一形態係提供一種誘發或增強動物對免疫 原或半抗原（hapten )的免疫反應之方法，該方法包括將 一醫藥組合物投予該動物，該醫藥組合物包括本發明之 hsp70胺基酸序列，其共價或非共價地連接到異源性分子 其中異源性分子包括該免疫原或半抗原。 本發明的另一形態係提供一種治療或預防性治療魚類 的感染性疾病之方法，其包括將一治療組合物投予該魚類 200401827 列該治療組合物包括本發明《hsp7G核酸序列或胺基酸序 本發明的另一形態係提供關節桿菌屬h㈣啟動子之 返’以驅動異源性基因之表現。 本發明的另-形態係提供分離的熱休克蛋白或編碼執 =蛋白的核酸分子之用途，以製造用於免疫魚類對抗病 的：病之疫苗組合物；可選擇地，一種預防或治療魚類 =原性疾病之方法，#包括將_組合物投予該魚類，該 、、且5物包括分離的熱休克蛋白或編碼熱休克蛋白的核酸分 子。分離的熱休克蛋白較佳是來自細菌 桿菌屬）之hSp70。 發明詳述 士本發明之分離的hsp70基因之新穎序列以及編碼的分 離或純化之蛋白質，是分別提供在第1圖及第2圖。本發 明包含核酸序列及胺基酸序列，其實質上是同源於圖示中 所提供的序列。“實質上同源”是指當與參考序列比較時 ，序列與參考序列具有至少60%的同源性，較佳至少7〇% 的同源性’更佳至少、80%、85%、90%、95%、98%或更 大的同源性。 為了決定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同源性百 分比，將序列以最適的比對目的而排列（例如，在第一胺 基I或私酸序列的序列中導入缺口，以最適地與第二胺基 酸或核酸序列排列’以及為了比對之目的，可忽視在缺口 200401827 中，I於中間的非同源性序列）。不需要兩個序列是相同的 長f。除非有不同的指明，否則橫跨要比對序列的序列長 度疋排列的凡整内容。視需要，用於比對目的而排列之參 考序列的長度，是至少30%，較佳至少鄉，更佳至少 50%，還要更佳至少6〇%，以及還要更佳至少7〇%、鄕 或90%的參考序列之長度。可將同源性分析限制在參考序 列的任何特定部份，例如，纟hsP7G的例子t，有人可能 希望將參考序列限制在基因或蛋白質的胺基端半部，或更 特別地’限制在結構葉n (Fiaherty等人⑺9。）—㈣ 346 . 623-628，以及 Zhu 等人（1 996 ) w⑽ 272 : 1606-1614)。 田第（苓考）序列的位置被相同的胺酸殘基或核穿 酸佔據作為在序列中的對應位置時，在該位置處的分子是 同源性的（也就是，在該位置處有同一性）。在核酸序列 2對的例子中，於特定位置處也有同源性，其中包括核苷 =的猃碼子三聯體在要比對的兩個分子中編碼相同的胺基 酸，這是由遺傳密碼的簡併性所致。 在兩仏序列間的同源性百分比，是同源位置數被序列 分攤的函數（也就是，％同源性=同源位置數/總位置數 )。視需要，序列的比對以及同源性百分比的決定，可利 用數學演算法而完成。適合的演算法是納入在Altschul等 (990 ) /·如人心0入 215 : 430-1 0 的 NBLAST 及 XBLAST程式中。 也包含在本發明的核酸序列範圍内的是在嚴格條件下 200401827 ，可與參考序列編m 1雜合的序列。在本發明的意思中， “嚴格的’’雜合條件是定義為如Sambr〇〇k等人“分子選殖 :實驗室手冊”冷泉港實驗室出版（1 989 ) 1 1 〇1 —κ ι〇4 所說明之條件，也就是，在以ΐχ SSC緩衝液及〇1%sDs 在55°C，較佳是62°C，以及最佳是6yc清洗丨小時之後 ，特別是以0· 2x SSC緩衝液及〇· 1%SDS在55〇c，較佳是 62t，以及最佳是紙清洗丨小時之後，還能觀察到= 的雜合訊號。 本發明之序列包括參考核酸序列或胺基酸序列之片段 。hsP70核酸參考序列的“片段，，，是包括至少5〇個，= 需要至少75個或至少1 〇〇個連續核苷酸的序列之任何部份 〇 hsP70蛋白質的“片段”，應理解為是指具有參考 hsp70胺基酸序列的至少25個，視需要至少35個或至少 45個連續胺基酸的任何肽分子。“免疫原性，，蛋白質片段 是可以誘發抗體的片段，該抗體可中和病原體感染力及/ 或调節抗體-補體或抗體依賴性的細胞毒性，以提供經免 疫的佰主之保護作用。一個關節桿菌屬hsp7〇的免疫原性 片段之實例是功能部位n片段，類似於分枝桿菌屬的功能 部位 Π 片段（Huang Q 等人（2000 ) /· #以· 191(2) :4〇3-8)。關節桿菌屬hsp7〇的功能部位π片段是來自 序列編號2的胺基酸162至365之序列，或是其由至少 100個連續胺基酸，更佳是至少15〇個連續胺基酸，以及 最佳是至少200個連續胺基酸所組成的部份。 11 200401827 本發明之胺基酸序列也包括第2圖序列的衍生物或該 序列的同源物。胺基酸序列的“衍生物”是在胺基酸序列 層次上（例如，同源性序列，其中特定天然存在的胺基酸 是以合成的胺基酸取代物而取代）或是在三維層次上（也 就是，具有大約相同於參考胺基酸序列的形狀及構形之分 子），與參考序列相關的序列。因此，衍生物包括突變物 、模擬物、模擬部位（mimotopes )、類似物、單體形式以 及功能等價物。胺基酸序列衍生物保留可誘發抗體產生之 能力’該抗體係可辨認及（交叉）反應來自魚類病原體（ 例如’魚圭魚腎桿菌（yp.以/观⑽/刀)及匹氏魚虱（

Piscirickettsia salmonis)、之氚增、，反/氙保嗜$ 議發 魚類免疫反應以避免這些病原體感染之能力。 本發明之hsp70核酸序列納入hsp70基因的開放譯讀 架構（0RF)，而且還納入5,及3,未轉譯區域（UTR)。本 發明包括任何構成的啟動子、增強子、調控子、終結子及 局4 7L素’以及利用這些元素連結異源性基因。特別地， 本2明擴張至DNA表現載體，其包括連接到異源性基因的 關節枠菌屬hsp70啟動子序列（如序列編號J之描述）或 只夤上同源性的序列，以驅動該基因的表現。 此處所提供的關節桿菌屬hsp7〇序列表（序列編號工 )，疋由存在於關節桿菌的基因體選殖所鑑定的基因之序 列j =及序列編號2從其中推論得到的胺基酸序列。原始 ::關節捍菌屬菌株之培養物，是再1 996年12月2〇日，以 、“扁就ATCC 55921寄存於美國標準菌種中心（1〇8〇ι， 12 200401827 大學大道，麻州，VA 201 1 0-2209 )。 相同屬的物鞴夕ΗοτΛ ^ ^ ^ 守性的，所以= 質，一般而言是非常高度保 基因及蛋白質之皮& ^ 蜀汀特有的hsP70 序列編號2、： 會分別大幅背離序列編號1及 子。從：個狹 本發明也擴張至這些相關的hSp70分 子從-個棒狀捍菌屬得到的hsp7〇基因之 促進相同基因從相關生物體中 ^ 了 法，是在此技藝中所熟知的。 刀〜些基因的方 刀離的hsP70基因或核酸序列應理解為# 於其在關節桿菌屬λ 解為係扎不同 可來自％: 7:之基因或序列。編碼 資料庫“ 7 βΡ〇的細胞物質所製備之cm hSP70的美:〇是普遍存在的，並且A量表現）。編碼 广：基因也可來自基因體資料庫，例如，藉 把例所§兄明的步驟或藉由寡核¥酸合成所得的資料庫。Μ 天然的hsp7G蛋白質可藉由適當的純化方案，利用f =蛋白質純化技術’而從細菌細胞來源 ： 的同-性可藉由例如西方墨潰法或免疫沈澱 = ：：：Γ 55921 : 西 =基端胺基酸的定序，可用於決定部份或完整的胺基 。廷可設計探針以促進天然的h 基因體資料庫中分離。 CDMA或 蛋白t庫可利用設計用於鑑定有興趣的基因或其編碼的 於美白U=(例如’對_70的抗體或至少約2〇,個 双土、刀核·#酸）而筛選。例如’探針可設計成同源於此 13 200401827 處所揭露的關節桿菌屬基因序列的 針可與其他細菌性的hsp基因（例如σ:。可選擇地，探 _基因序列）具有高度的同源性。以7屬（^-) cDNA或基因體資料庫，可利用標準方法’的振針筛選 明於Sambrook等人“分子選殖：實驗：進:丁 ’例如，說 泉港實驗室出版，1 989 )之方法。另—冊（紐約··冷 的基因之方法是利肖PCR法（Sam 2馬hsp7〇 D—h等人“PCR引子： ：，人’上述文獻； 室出版，娜)）。 …手冊，，（冷泉港實驗 以這種資料庫篩選方法所鑑 ,u 吓μ疋的序列，可與序列編號 1所副_70或其他已知經寄存並可在公開資料庫（ 例如’ GenBank)獲得的hsp7〇序列進行比對及排列。在分 子的定義區域内或橫跨全長序列之序列同一性（在胺基酸 或核芽酸層次），可經由成而丨Μ α ^ 、、二甶序列排列，利用電腦軟體程式而 測定，例如，BLAST、BLAST_2、AUgn、醒及 INHERIT，其使用各種演算法以測量同源性。 可觀察到關節桿菌屬hsp70蛋白質帶有與其他物種（ 特別是細菌物種）的同源物之相似性。已知hsp基因在相 關物種之間是高度保守性的。然而，令人驚訝的是發現到 ，關節桿菌屬hsP70與結核分枝桿菌（你π加 tuberculosis)良氟氟分故椁 ％ QMyc〇bacterj_ ieprae )的hsp70s，在胺基端區域顯示接近的同一性（前2〇個 胺基酸事實上是相同的）。 在κ施例2所說明的實驗中，明顯連接到細胞壁肽多 200401827 醣力67仟道耳吞（kDa)之大量關節桿菌表面蛋白質，是 藉由胺基端的胺基較序而分析。頃發現⑼個殘基的胺基 端胺基酸序列，是相同於分枝桿菌4 hsP70的胺基酸序列 ，以及這個67仟道耳吞的蛋白質，咸信是相當於本發明之 hsp70蛋白質。本發明的_種形態係提供齡題所測量 、仟道耳吞之刀離熱休克蛋白，其位於關節桿菌細胞的 細胞壁，亚且具有胺基端的胺基酸序列··（ Μ ) SRAVGIDLGTTNSVVSVLE 。 我們實驗的結果證明，魚類中的關節桿菌屬hsP70之 免疫原性，是可與哺乳動物中的分枝桿㈣匕州相比較 。事後的認識，我們現在相信當用於接種疫苗的魚類時， 關節桿菌屬hsp7G對於RenQgenTM活體關節桿g疫苗所提供 的疾病保護作出某程度的解釋。 本發明事實上提供第一證據，在於任何來源的分離或 純化之熱休克蛋白，是有效於作為魚類的疫苗。魚類的免 疫系統並不能與其他物種直接相比，特別是哺乳動物，並 被貝乏地瞭解。因此，令人驚詩的是，熱休克蛋白可在 魚類中誘發強力的免疫反應。本發明的_種形態是有關於 分離或純化的熱休克蛋白之用途，以製備投予魚類之疫苗 ，合物:較佳地，熱休克蛋白是使用作為疫苗組合物的佐 劑:或是作為疫苗組合物中異源性分子的載劑。熱休克蛋 白車父佳是hsP7〇家族的成員，但可選擇地，可以是任 他類型的已知熱休克蛋白，例如，hsp6〇、hsp9〇、hs_ 或任何小的熱休克蛋白（sHSPs)。熱休克蛋白可來自任何 15 200401827 物種（原核或真核物種），但較佳是來自細菌物種，例如 ，關節桿菌屬。 認識關節桿菌屬與分枝桿菌屬共享高度同源性的 hsp70基因，開啟了許多關節桿菌同源物之未預見到的應 用刀離的分枝桿菌屬hsp70蛋白質已證實可表現為有效 的疫苗佐劑。關節桿菌^ hsp7“可以純的或分離的形式 ，結合抗原而作為佐劑。此處所定義的“佐劑，，，是非專 一性地增強對抗原專—性免疫反應的物質，當結合抗原投 予時或當分別投予相同部位時。在本發明的一種形態中， ::離或純化的關節桿菌屬hsp7〇蛋白質是使用作為動物疫 田的佐片》J才寺別疋魚類疫苗。在相關的應用中，以州基 因或其部份是提供於DNA載體上，以輔助核酸疫苗。在^ 發明的料内係提供疫苗組合物，其包括本發明之hsD70 月女基酸或核酸序列，廿纟士人 並、、Ό 3至少一種其他的抗原或編碼抗 原的核酸序列，U 0 々 一種或夕種醫藥上可接受的賦形劑。 其他的抗原可以是重組或分離的單一抗原，或可以是來自 病原體的抗原分子之混合物。 :用I:即#囷J hsp7〇作為佐劑，可使醫師或獸 遇離使用傳統減毒的活雕八姑和#从令丨 ^ 杯囷佐劑，其可引起對動物 ". 粍疋由於回復到致命性菌株的危險所致。對 的利益在於，將關節桿菌屬—酸 4刀肖隹的蛋白質注矣+ 十入l 隆起或節結H ^θ /主射部位引起難看的 的商業價值。 先的佐劑是常見的，並且會降低魚類 16 200401827 關節桿菌屬hsp7〇蛋白質不僅有效於辅助包括豆他抗 h原的广其本身也具有免疫原活性。關節桿菌屬 响〇可提供疫苗的活性起源，以預防或治療各種人類及 被醫疾病，包括由魚類病原體引起的疾病，特別是，作並 不限於？ 〇及SRS (鞋類立克次體敗血症）。在本發明的 另-：態巾’疫苗組合物包括分離或純化的hsp7〇蛋白質 作為單獨的抗原或免疫原成份，並且伴隨—種或多種醫藥 上可接受的賦形劑。 μ ▲本發明也提供-種包括表現載體的核酸疫苗組合物， ^表現載體包括本發明< hsp7G核酸序列，其編碼成為疫 田組合物❸單獨抗原或免疫原成份之抗原'，並且伴隨一種 或多種醫藥上可接受的賦形劑。 從分枝桿菌屬及其他hsp7〇s的同源物推導出高度免疫 原潛力的關節桿㈣hsp70，也顯示可製備hsp7〇蛋白質 舁異源性（非hsp70)分子，通常但並不限於非h邛蛋 （例如，半抗原）的基因或肽共價結合物（例如，嵌 $體或融合體）。以此方式，關節桿菌屬hsp7〇蛋白質^ 演無佐劑載劑的角色，以刺激對於伴隨的異源性分子之^ 液及細胞免疫反應。此處所使用的名詞“載劑，，是指包含 T細胞抗原決定部位的分子，當共價連接到第二分子時， ^可桌助誘發及增強對抗第二分子的免疫反應（第二分子 可以是蛋白質、肽、寡核苷酸或募糖）。 這個疫苗開發的方法是特別有利的，當所涉及到的抗 原丨生狀不是非常大並且是差的免疫原性，但卻是疫苗的適 17 200401827 hsp70攜帶的異源性分子，有利 白質分子，例如，碳水化合物的 合標的時。由關節桿菌屬 地是蛋白質半抗原或非蛋 分子部份。 此處所使用的hsn7n ‘‘ 4人-e ^ ΒΓ甘〇 融3蛋白質，，，係包括hsp70 狀’八可操作地連接到 银巧不冋多肽（“異源性多肽，，）。 異源性多肽，，或“非hs〇7〇夕盹” H ^ L ^ ΜΡΜ夕肽是指具有對應到實質 上非同源性於hsp70蛋白皙沾疋a所 、 贪白貝的蛋白質胺基酸序列之多肽。 在hsp70融合蛋白質的益一 .^ 勺乾命内，hsP7〇多肽可對應到所有 或部份的hsp70蛋白皙f在，口 , s 贫曰貝 <:例如，功能部位j j蛋白質）。在 2蛋白貝的輯内，名詞“可操作地連接，，是指匕州 夕狀及非hSp7G多肽是在架構内彼此融合。非hsp7〇多肽 可融合到hSp7G多狀的胺基端或竣基端 kp70多肽之内。 在 /藉由共價或非共價連結而非藉由產生融合蛋白質，可 將hsp70多肽及異源性分子連接。“異源性分子，，是不同 於hsP70蛋白質的任何蛋白質、肽、寡核苷酸或募糖分子 例如，可將化學間隔基團插入到多肽之間，例如，以產 生一般式hsp70-X-異源性多肽的分子，其中χ是間隔基團 例如，一個或多個胺基酸的短序列。可選擇地，不同於 在直鏈胺基酸中經由醯胺連結，hsp7〇多肽也可例如藉由 化孥結合或化學的、光（例如，紫外光）或放射線—誘發 的父聯，而共價連接到非hsp分子。戊二醛及巯基結合交 聯制是適合的化學交聯劑之實例。特定的物質是edc+nhs 或硫-NHS、硫-SMCC、硫-SBED以及SAED，其可以套組的形 18 200401827 式購得。 在本發明的較佳具體實例中，hsP70多肽是結合到半 抗原。半抗原是一種可結合抗體的低分子量物質（例如， 肽或寡糖）Μ旦只有當共價連接到大的載劑分子 發免疫反應。 曰" 可藉由/舌體外複合細胞溶胞產物、流份、萃取物、病 毒顆粒以及類似物’而⑽70結合到來自抗原性細胞： 顆粒之完整族群的蛋白質。 /、源丨生刀子或多肽可來自任何來源，但最可能是病原 性生物體之成份。特別地，它們可以是來自動4勿（特別是 水生動物）的病毒、細_、原生動物、腸蟲或真菌病原： 之多肽。 分離的hSp70基因可以傳統的方式開發，藉由將基因 選殖到表現載體，以產生大量純化或分離的重M hsp70蛋 :質（或hSp7°融合蛋白質）。純化的hsP70抗原也可夢 由非重組的技術而獲得。這個蛋白質是大量的，並可從： 即桿菌細胞中’藉由傳統的純化方法而萃#。可選擇地， ，蛋白質或多0太，也可利用標準的肽合成技術而化學 :成。包括這個純化或分離的重組或非重組蛋白質之疫苗 可稱作以抗原為基礎的疫苗。 分離” 純化”的蛋白質是定義為實質上不含細 月“"或衍生hSp7〇蛋白質的其他來自細胞或組織來源的 :染蛋白f ’或當化學合成時’實質上不含化學前驅物或 其他化學物質。“實質上不含細胞物質，、表達方式係包 19 200401827 括hsp70蛋白質的製備物，其中蛋白質是分離自它所分離 或重組製造的細胞之細胞成份。在一具體實例中，“實質 上不含細胞物質”之表達方式係包括hsp70蛋白質的製備 物，其具有少於約30% (乾重）的非hsp70蛋白質（此處 也稱為“污染的蛋白質”），更佳是少於約20 %的非 hsp70蛋白質，還要更佳是少於約1〇%的非hsp7〇蛋白質 ，以及最佳是少於約5%的非hsp70蛋白質。當重組製造 hsp70蛋白質或其生物活性部份時，也較佳是實質上不含 培養液，也就是，培養液代表少於約2〇%，更佳是少於約 10%，以及最佳是少於約5%的蛋白質製備物之體積。 画含 hsp70的關節桿菌細胞萃取物，也可用於實 行本發明作為選擇分離或純化的hsp7〇。藉由去活化或殺 死整個關節桿菌細胞、將細胞溶解、#由傳統方法將所得 的細胞溶胞產物分層以及鑑定hsp7〇蛋白質是比其他流份 更大量的流份（例如藉由西方墨潰法），而可獲得“富含 ”的細胞萃取物。富含hsp7〇的細胞萃取物，也可藉由在 可導致增加表現熱休克蛋白的條件下（也就是，在^或其 他細胞壓力的條件下）培養關節桿菌細胞，以及去活化^ 殺死’並且將細胞溶解而掣供 ^ 哪向衣備。視需要，將所得的細胞萃 取物（溶胞產物）分層，並且松 n鑑疋畜含hsp70的流份。 較佳地，本發明之农人々^ Α β 入ΰ或融合蛋白質是藉由標準的重 組DNA技術而製造。例如， 、、届碼不同多肽序列的DNA片ρ ’是根據傳統技術而在牟禮向 ,. … 木構内一起接合，例如，藉由使用 平私或父錯端接合、限制醃、、& / 市」晒4化以提供適合端、如果適合 20 200401827 的話凝端的填入、驗性鱗酸酶的處理以避免不想要的連結 、一酵素接。。在另一具體實例中，融合基因可藉由傳統 技衡而口成’其包括自動化的刪合成儀。可選擇地，基 因片段的PCR放大可利用錯狀引子而進行，其可引起連續 兩個基因片段間的互補突出，接著可煉回並且再次放大， 以產生嵌合基因序列（例如，參& “現代分子生物學方法 ，AuSubel 等人編輯，J〇hnWiely&s〇ns;i 992 )。 本發明的另—开九態是有關於載體，較佳是表現載體， 其包括編碼hsP70 (或其一部份）的核酸序列。此處所使 用的名列載體’’是指核酸分子，其可運送與它們連接的 另外核酸。一種載體的類型質體’，，是指環狀的雙股 舰環圈，而另外的DNA片段可接合於其中。另一種載體 的類型是病毒載體’其中另外的醜片段可接合到病毒基 因體中。特定的載體可引導與它們操作 現。這樣的載體在此處稱為“表現載體”。 表現載體應用於重、组DNA技術，通常是以質體的形式。然 而’本發明希望包括其他形式的表現載體，例如，病毒載 T (例如’複製缺失性反轉錄病毒、腺病毒以及腺相關病 ’）’其提供相等的功能。 種或多種以用於表現的宿主細胞為基礎 ’可操作地連接到要表現的核酸序列。 可用於在所要的hsp70抗原接受者内表 本發明之重組表現載體包括本發明以適合於在宿主細 胞中使核酸表現的形式之核酸，係指重組表現載體包括一 而選擇的調控序列 本發明之表現載體 現（作為DNA疫苗 21 200401827 )’或用於在不同於最終接受者的宿主生物體内表現（以 製造重組抗原疫苗）。 在表現載體内，“可操作地連接，，希望是指將有興趣 核芽酸序列，以容許該核苷酸序列表現的方式連接到調控 序列（例如’在活體外的轉錄/轉譯系統或在宿主細胞中 ’ §載體被導入至宿主細胞時）。名詞“調控序列，，是希 望包括啟動子、增強子及其他表現控制元素（例如，聚腺 苷酸化作用訊息）。這樣的調控序列是說明於，例如， Goeddel基因表現技術”酵素學方法】85，大學出版，聖 地牙哥，加州（1 990 )。調控序列包括可在許多類型的宿 主細胞中引導核苷酸序列本質性表現之序列，以及僅可在 特定宿主細胞中引導核苷酸序列表現之序列（例如，組織 j一性的調控序列）。熟悉於此技藝者應可理解，表現載 =的°又°十可取决於許多因素，例如，要轉形的宿主細胞之 ，擇、所要的蛋白質表現量等等。可將本發明之表現載體 ‘入佰主細胞’藉以產生蛋白質或肽，包括由此處說明的 核&L所、，扁碼之融合蛋白質或肽（例如，匕叩蛋白質、 hsp70的突變形式、hsp7()與異源性狀之融合蛋白質等等） 本I月的另_形態是有關於宿主細胞，其中本發明的 ，、且表現載體已藉由轉形作用而導入宿主細胞。宿主細胞 口、 何的原核或真核細胞（包括多細胞真核生物體内 的真核細胞）〇 ☆丨丨丄 1 ηίΛ 如’ hsp70蛋白質可在細菌細胞（例如 大腸;f于囷）、昆蟲細胞（利用桿狀病毒表現载體）、酵 22 200401827 母菌細胞或。甫乳動物細胞中表現。其他適合的宿主細胞是 在此技藝中之人士所熟知的（例如，Goeddel，上述文獻） 。可將重組表現載體設計成在宿主魚類細胞中表現（在 DNA疫苗接種後）。可選擇地，例如，利用T7啟動子調控 序列及Τ7聚合酶，可在活體外轉錄及轉譯重組表現載體。 蛋白質在原核生物中的表現，最常在大腸桿菌中進行 ，其具有包含引導融合或非融合蛋白表現的連續或可誘發 啟動子之載體。融合載體將許多胺基酸加到在其中編碼的 蛋白質，通常是加到重組蛋白質的胺基端。通常，在融合 表現載體中，蛋白水解切割位置是導入到融合分子與重組 蛋白質的接合處，以便在後續融合蛋白的純化中，可從融 合分子中分離重組蛋白質。這樣的酵素以及它們同族的辨 認序列，包括因子Xa、凝血酶以及腸激酶。典型的融合表 現載體包括pGEX (法瑪亞生技公司；Smi1：h D· B及

Johnson L S. ( 1988 ) 67 : 3卜40 ) 、pMAL (新英格 蘭生物實驗室，貝芙麗，麻州）以及pRIT5 (法瑪亞，

Piscataway，紐澤西），其分別將穀胱甘肽s—移轉酶（ GST )、麥芽糖E結合蛋白質或蛋白質a融合到標的重組蛋 白質。 可將hsp70基因納入到核酸疫苗中（nav)，藉此nav 可被活體動物的宿主細胞化去，以及hsp7〇基因的表現是 在細胞質中發生。由於細胞間hsp7〇抗原的短狀被運送到 匕們可與MHC I系統接觸的細胞表面，因此，源自gv的 hsp70抗原理想地是置於誘發細胞免疫反應的位置。 23 200401827 插到DNA載體中的hsp70基因，可直接接種到魚類（ 例如，口服、肌肉内或腹膜内），以在魚類細胞的活體内 表現DNA疫苗接種也可在其他的動物物種中進行。因此 ，本發明的一種形態係提供核酸疫苗，其包括醫藥上可接 文的载劑以及DNA質體，其中編碼關節桿菌屬hsp7〇的核 酸序列可操作地連接到轉錄調控序列。轉錄調控序列包括 啟動子、聚腺苦酸化作用序列以及它核苦酸序列，例如， 具有未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激募核苷酸，或是可 編碼其他抗原性蛋白質或輔助細胞激素的核苷酸序列。真 核或病毒性轉錄調控序列的存在，可使hsp70基因在魚類 細胞中表現。DNA質體本身可在細菌細胞中複製，以製備 疫苗組合物，但一般係缺少可使hsp70基因在原核細胞内 表現的轉錄調控序列。為了適於在活體内表現，較佳可選 擇與要接種疫苗的魚類係内源性的轉錄調控序列。例如， 可考慮内源性的細胞激素或肌動蛋白基因啟動子。DNA可 以裸露的形式存在，或它可與促進細胞攝取的作用劑（例 如’微脂體或陽離子性脂質）一起投藥。魚類的DNA疫苗 接種之技術，是更詳細地解釋在美國專利第5, 780, 448號 ’其以引用方式納入本文中。 本發明也有關於一種產生對抗分子的單株或多株抗體 之方法’係使用結合到該分子的hsp70蛋白質之結合體。 在這個具體實例中，將有效量的結合體（也就是，可在宿 主中引起免疫反應的量），導入到動物宿主中，其可引起 對抗宿主中的物質之抗體產生。抗體是利用已知的技術（ 24 200401827 例如，色層分析法）從宿主中移除並且純化，藉此引起多 株抗體的產生。可選擇地，利用本發明之方法所產生的抗 體，可用於產生融合瘤細胞，其可利用已知的技術造單株 抗體。 在本發明的具體實例中，關節桿菌屬hsp7〇基因的啟 動子序列，是用於驅動異源性基因（也就是，不同於編碼 關節桿菌屬hsp7〇的基因）之表現。啟動子可插入生物體 的染色體DNA中之異源性基因的上游，或插入到染色體外 的質體或其他表現載體。例如，在想要大量表現内源性關 節桿菌基因的事件中，或想要將外源性基因插入到關節桿 菌的内源性質體的事件中，上游的h_啟動子可驅動對 刺激（例如’熱休克）反應的該異源性基因之表現。 根據本發明方法所製造的疫苗，是適合投藥給具有體 及/或細胞免疫系統的任何動物物種。人類是包括在本 务:二文中的“動物”及“哺乳動物”之意義内。可使用 菌(：hsp7°輔助任何用於哺乳動物、鳥類、爬蟲類 或…、類（有鰭魚或貝類） # 。同樣地’關節桿菌屬 hsp7〇也可用於疫苗中，作為共價連接的 需要排除任何傳統的佐劑 戰d視 關節桿菌…。也可用二 為單獨的免疫原），以提古7特\為免疫原（視需要作 是BKD、，鞋類立克次^ 疾病的免疫反應，尤其 性疾病。、 組敗也症（SRS)以及其他魚類的感染 名詞“疫苗”是以其最廣的意義而使用，並且不僅包 25 200401827 括用於對病原體免疫作用的組人 、口物，逛包括抗腫瘤疫苗、 自體性抗原為基礎的疫苗（例 例如，用於化學去勢）等等。 在被醫疫苗接種的範圍内，任 ^ ^ 17非人類的動物都可接種疫 田，包括主要的農場動物物種 ▲ #… 亦即牛、馬、綿羊、豬及 禽4°對於水產養殖、本發明之疫苗可用於貝類或有縛魚 2別是用於治療硬骨魚類，“，链魚、鱒魚、缠魚、 ·、、周魚、黑鱸、黃尾魚、鯰魚、 大比目魚、黑線鱈，或視需 要用於治療其他水生物雜 生物種例如’甲殼綱動物（例如，小 瑕、對蝦、龍瑕、蟹）以及軟體動物（例如，牡螺、珠蛘 。對於適合與疫苗中之關節桿菌屬hsp7〇序列結合的候 邊抗原，並無限制。病眉柹妤 κ 』届原陡抗原可衍生自細菌、病毒、原 生動物、線蟲及真菌。一藉 ^ 囷 種特別的焦點是在魚類病原性生 物體的抗原上，特別是表面抗原。

Hsp70胺基酸或核酸序列可用於疫苗組合物中，並且 結合或連接到會侵襲貝類或有_疾病之細菌、原生動 物病毋或真囷抗原，包括衍生自下列之抗原（或它們的 ▲焉序列）·感染性鮭魚貧血症病毒（isav )、感染性胰 &死病毋（IPNV )、感染性造血壞死病毒（IHNV)、虹彩 ^毒、^壞死病毒（NNV)、經魚胰病病毒（謂）、經 :、春季毋血症病毒（svcv )、病毒性出血敗血症病毒（ HSV )汽頭病毒（YHV )、桃拉症候群病毒（TSV )、白 Q WSSV )、鮭魚腎桿麵（細菌性腎臟疾病的 致病原）及匹氐念η / ^…、風（鮭類立克次體敗血症的致病原）、 弧圓屬、7欠Φ方# οσ 一瑕i早胞菌屬（Jera/Z?⑽狀5卯·）、魯克氏 26 200401827 耶爾森氏菌（)、假單胞菌屬（ Pseudomonas spp·)、诲龜發先％ q⑽ 办we/奸）等等。大量以及漸多數量的來自這些及其他病 原丨生生物體之多肽，已被純化及/或選殖並表現，並且可 在疫苗組合物中用於連接或結合關節桿菌屬hsp7〇或其編 碼序列。較佳的實例包括IPNV蛋白質νρι、vp2、vp3及 NS及其編碼的核苷酸序列；揭露於w〇 〇1/1〇469的isav蛋 白質，其包括血球凝集素、核蛋白殼、聚合酶及片段7 p4 及P5蛋白質及其編碼的核苷酸序列；揭露於w〇 〇1/68865 的鮭魚腎桿菌蛋白質，其包括0spA及IcmE編碼的核苷酸 序列，野田病毒蛋白質，例如，核蛋白殼；以及來自sp扒 的結構多肽及其編碼的核苷酸序列（揭露於w〇 99/58639 )。本發明較佳的疫苗組合物包括DNA表現載體，其攜帶 在架構内與IPNV VP2序列或IPNV VP3序列融合的hsp7〇 核脊酸序列。視需要，疫苗包括攜帶hsp7〇-Vp2融合體的 第一質體，以及攜帶hsp70-VP3融合體的第二質體。

Hsp70序列也可用於結合或連接到來自其他動物病原 體或寄生蟲的抗原（或它們的編碼序列），包括：牛病毒 性腹瀉病毒（BVDV )、牛疱疹病毒（BHV)、足口症病毒、 牛呼吸道融合病毒（BRSV )、牛副流行性感冒第3型病毒 (PI3)、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBR)、豬呼吸與繁殖 症候群病毒（PRRSV )、分枝桿菌屬、利什曼原蟲（ Lei shmania)、埃i希氏後慝（i chia)、愛矣或氣屣 (iV仍eria )、梭菌屬（)、巴斯德桿菌屬 27 200401827 、黴漿菌屬（例如，牛黴漿菌（#· 、豬肺炎黴漿菌（Μ· /iyopneu/iionj_ae))、钩端螺旋體屬

、分歧螺旋菌屬（方rac/?/57?i>a)、沙門氏 择遠凰（Sal monel la)、布智、氏蛰慝（Bruce 1 la)、斯tl A 戛 i Neospora)、隱、抱子 A 屬（Cryptosporiciiu/n)、梭 得儀屬（Fusobacterium)、大腸桿菌、輪狀病毒、冠狀病 毒、落缸 1 氏菌（Mannhei’/nia haemolytica)、睡眼考缸 桿菌（SO/Z//7Z7S·)、胸膜肺炎放線桿菌（ Actinobacillus pieuropneumoniae ) 、錐 蟲屬 ( Trypanosoma )、紅血球胞子蟲屬（)、密螺旋 龍 M ( Treponema)等等。 本發明包含hsp70序列結合任何上述的抗原或它們的 編碼序列之用途，以製造醫藥組合物，用於治療或預防由 抗原衍生的致病劑所感染而引起的疾病。

所提供結合hsp70基因或蛋白質的疫苗抗原，可化學 地連結到hsp70 (以嵌合體或融合蛋白質之形式），或它 們可提供為分離的分子，一起在單一的疫苗組合物中。另 一種選擇，hsp70基因或蛋白質可在套組中提供抗原或編 碼抗原的核酸序列，以用於分開、連續或同步的投藥。所 提供與hsp70基因或蛋白質連結的疫苗抗原，可以是菌苗 (bac ter in )、細胞萃取物、重組蛋白質、質體攜帶的基 因或活體/減毒的病原體菌株。 可藉由本發明融合蛋白質或分離的hsp70蛋白質之中 性或鹽形式，經單獨投藥或與醫藥上可接受的載劑或賦形 28 200401827 劑混合而免疫個體 液；也可製備固㈣田疋製備成液體溶液或懸浮 液或懸浮液。可：:二藥前適合於液體載劑中的溶 載劑中。本發明之：:’或將活性成份包膜在微脂體 之面樂組合物可以迅速釋放的形式或_由 延長釋放而投藥。 /、q猎由 :藥上可接受的載劑是例如水、鹽溶液、葡萄糖、甘 漸卜（例如’ _劑或乳化劑）、膨服劑、黏結 朋月^稀釋劑、潤滑劑、PH緩衝劑或傳統的佐劑（ 例如，胞壁醯二肽、旁 匕 «Α 夂立疋（avndine)、氫氧化鋁、油 月:植物皂素、成塊共聚物及其他在此技藝中所已知的物 質）。 田為了免疫個體’ hsp7〇抗原《hsp7G基因載體可非腸 月：才又$通吊’疋藉由在適合的載劑中肌肉内注射，但視 而要可藉由皮下返杈、藉由靜脈注射或皮内或鼻内傳遞。 在免疫魚類的例子中，通常的投藥途徑是藉由注射到腹腔 、在食物中口服、或藉由浸泡。本發明較佳的抗原性疫苗 、合物疋適曰方、藉由注射或浸泡而投藥的形式。DMA疫 苗接種一般是藉由肌肉内注射。 有效劑里可根據個體的大小及物種，以及根據投藥的 杈式而改變。最適劑量可由醫師或獸醫師經由反覆試驗而 決定。通常’單一劑量的hsp70抗原將會在約〇· 〇1至 1 0 00微克/公斤體重的範圍内，較佳是〇· 5至5〇0微克/公 斤體重，更佳是0.1至1〇〇微克/公斤體重。對於DNA疫苗 ’ 10微微克（Pg)的最小劑量至1 〇〇〇微克的質體/動物之 29 200401827 劑量，應足夠抗原在活體内的適當表現。 本^月口 (M刀所揭路的新穎抗原，也有效於筛選對抗广 原體蛋白貝之k體。本發明另外包括這些抗原的診斯用途 ，例如，用於製備診斷套組，以有效於測試動物是否 致病的生物體。 以此處所揭露之純化的hsp70抗原及/或hsp7〇融人蛋 白質所引起的抗體’也包括在本發明的範嘴内。其包含這 樣的抗體可具有診斷以及治療的應用於疾病處理及魚類健 康。多株抗體以及單株抗體都可有效於此__觀點。以蛋白 質免疫動⑯（例如’老鼠）’以及產生免疫原專_性單株 抗體的的融合瘤之篩選，是在此技藝中所熟㈣（例如， 簽見 Kohler 及 Milstein ( 1975 )心㈣ 256 : 495-497) 。二明治分析法以及酵素連結免疫吸附分析法（eusa )可 視為診斷分析的特定實例。 本發明之hsp70核酸序列具有診斷之應用，例如，引 子的設計，以用於聚合酶鏈鎖反應（PCR)放大分析。 【實施方式】 實施例 實施例1 :來自關節桿菌ATCC 55921基因體的hsp70 基因之分離及定序 使5笔升的關節桿菌培養物在包含康那黴素（3 〇微克 /毫升）的LB培養液中，於3(rc搖晃生長隔夜。然後利用 Puregene DNA 分離套組（Gentra)或 instagene™樹脂，根 據製造商的操作指南而進行DNA萃取。 30 200401827 簡併PCR : 在核苷酸的層次上，數個分枝桿菌屬及鏈黴菌屬 hsp70 ( dnaK )序列之間的最大相似性區域，是用於設計 PCR及定序的簡併引子。所選擇的引子是dnak_1Fdeg ( 5，一 gtcggnatcgacctvggnac-3，）以及 dnak-4Rdeg ( 5,-gcggtsggctcgttgac-3’）。這些引子是在5(rc煉回溫度的 PCR反應中，用於關節桿菌DNA的放大。放大的DNA之品 質，是藉由膠體電泳而評估。將1〇微升的分裝物在〇.8% 瓊月曰糖私體上，於IX Tris-硼酸鹽電泳緩衝液（tbe)中 ，以100伏特進行電泳約1小時。然後將65〇鹼基對（bp )的產物從膠體中割下，並且利用Qiaquick純化套組（ Qiagen)而純化。PCR產物是利用Qiagen pcR清理套組， 根據製造商的操作指南而弄乾淨，並且利用B丨gj)ye引子化 學（應用生物系統公司），根據製造商的操作指南而定序 ，並將每個引子都用於pcR。延伸反應混合物是利用AM PRISM ( 8r ) BlgDye終結子循環定序快速反應混合物，約 6 00示克的DNA模板、3. 2微微莫耳的適合引子以及ddH2〇 至20微升而製備。循環定序的條件如下：熱循環儀是設定 25個循環，其包含96t: 10秒、5(rc 5秒以及6〇t 4分 鐘。序列顯不這個片段包含第一個約4〇〇鹼基對的dnaK基 因。 為了付到另外的h s p 7 0 / d n a K基因序列，使用簡併引子 以放大關節桿菌屬hsp70基因的下游部份。這些引子是選 擇鱼 專 κ (an) BiochenUca et Bi〇physjca

31 200401827 dch 1 130 : 203-208。[正向引子 hsp70 通用-FI ( 5,-CAR GCN CAN AAR GAY GCN GG-3’），反向引子 hsP70 通用-R1 ( 5^GCM CAN GCY TCR TCN GGR TT-3’）]。引子是設計成在 hsp70基因内煉回兩個高度保守性的區域，以產生65〇鹼 基對的產物。 PCR反應物包含（50微升總體積）：5微升ι〇χ PCR 緩衝液、5微升25 mM氣化鎂、2· 5微升1〇 mM各個dNTP、 2 微升 HsP70 通用-F1 ( 200 " Μ) 、2 微升 HsP70 通用-R1 ( 200 // M) 、〇· 5微升Amplitaq DNA聚合酶（5單位/微升） 、10微升Instagene萃取的DNA、23微升ddH20。PCR反應

疋以下列條件而循環：9 4 °C 2分鐘，然後4 0個包含9 4 °C

1.〇刀4里、50(：或58C 0.5分鐘以及72°C 1.0分鐘的pcR 循環。PCR循環是在72它3 〇分鐘的延長步驟而結束。將 PCR產物如上所述的進行電泳、清潔以及定序。發現這個 片段的序列是與第一定序嘗試所鑑定的約4〇〇鹼基對序列 之3 ’重疊並延伸。 基因體步移 基因體步移是用於延伸已鑑定序列的5,及3,序列。引 子疋攸基因體步移者手冊（cl〇nteck)所說明的序列中設 計。一開始，製作四個基因體資料庫（DraI、e⑶rv、 pvuii、stui)，接著製作三個基因體資料庫（Aiui、 及SnaFI )。所有的資料庫以及後續的pcR反應，都如基 因體步移者手冊之說明。 5’基因體步移產生_段約5〇〇鹼基對的片段，其與先 32 200401827 前所得到的序列重疊。 子以及5，未轉譯區域。 RACE ： 延伸包纟hSp7〇基因的起始密碼 3步移無法延伸基因。 3 RACE疋用於獲得另外的3，序列。利用p咖叫i RN )謝分離套組，根據製造商的操作指南，而將 ，從關節桿菌的隔夜培養物中分離（如上述之 3,關是利用Boehringer ㈡，r織套组，根

據製造商的操作指南而進行。_的引子是從已知序列的 3 :…。PCR反應是如上述說明而進行，"反應物 包含卿二甲基賴（義）並且具有阶煉回溫度之外 。-段約U仟驗基對的條帶被放大，並利用一卿 的Τ0Ρ0定序套組’根據所附的方法而選殖到p⑽載體中 。利用載體引子筛選選殖株，並使筛選的選殖株隔夜生長 ’然後㈣Invitrogen的SNAP小量套組進行舰萃取， 以及利用上述的載體引子而定序。

相連圖譜（contigs)是利用Genec〇de的定序者軟體 而組合。利用相連圖譜序列所進行的Genbank檢索，證實 它是hsp70。 hsp70的其餘部份以及3,未轉譯區域是利用上述之基 因體步移而獲得。再者，相連圖譜是利用Gene⑶de的定序 者軟體而鑑定。利用相連圖譜序列所進行# Genbank檢索 ’證實它包括hsp70基因，其包括3,未轉譯區域及5,未轉 譯區域。 33 200401827 實施例2 :關節桿菌細胞壁蛋白質之特性描述 電泳及西方墨潰法： 關節桿菌ATCC 55921細胞懸浮液是藉由直接從胰蛋白 大豆瓊脂（TSA )培養盤中移除繼代培養的細菌，然後在 23°C培養48小時而製備。將細菌再懸浮於丨〇毫升的“ TET 缓衝液’其包含100 mM Tris-HC1緩衝液（pH 7.2) 、1 niM EDTA 以及 〇· 1%Trit〇n—x 1〇〇 ( Bi〇Rad 實驗室，海克力 斯’加州），至光學密度約5〇個〇D66〇單位（1個〇D66〇 單位已估計是1 X 109個細胞），並以6500 g離心。將上 /月液丟棄’並將細胞懸浮於另外1 〇毫升的TET，並重複離 心步驟。將細胞沈澱物再懸浮於4毫升的TET，並且分成i 笔升的分裝物裝到1 · 5毫升的小試管。將一個分裝物進一 步與200微升的5毫克/毫升雞蛋蛋白溶菌酶混合，並在 37 C搖无培養隔夜（丨8小時）。將細胞懸浮液在桌上型微 離心機中，以最大速度離心5分鐘。將150微升無細胞之 上清液與50微升NuPage 4X LDS樣本緩衝液（invitrogen ’卡爾斯巴，加州）混合，並在7(rc培養丨〇分鐘同時搖 晃將所传上，月液的1 〇微升分裝物，在8% Mini Protean II膠體（BioRad)上分析，並以半乾的轉移單元（Bi〇Rad )’以20伏特西方墨潰3〇分鐘到pvDF ( Millip〇re，貝福 德’麻州）。在墨潰後迅速將膜以〇·丨％ p〇nceau s ( Amersham Pharmacia 生技公司，Uppsala，瑞典）清洗 i 分 4里，並以數次蒸餾水清洗而去染色，直到墨潰的蛋白質顯 現為止。分子量標準品以及特定蛋白質是在免疫染色後以 34 200401827 船筆標記參考點，然後藉由重複在墓 狀你芬、制艰干滑冼而移除粉 紅色，並將膜風乾，以製備進一步的染色。 對於考馬斯藍鑑定胺基酸定序的蛋白質條帶，將脫色 的膜在包含50%甲醇、7%醋酸及〇1%R_25()的溶液中培 養1〇分鐘，然後利用不含考馬斯藍的上述溶液，而將背^ 去染色。之後將墨潰在蒸餾的去離子水中潤洗丨〇分鐘並風 乾，以藉由Edman降解法，利用自動蛋白質定序儀（應用 生物系統公司）而進行胺基端的胺基酸定序。 免疫反應性抗原的顯露，是藉由將乾燥的墨潰與i : 200倍稀釋於1%酪胺酸三羥甲基胺基甲烷緩衝溶液邱 7· 4 ( cTBS) ( BiRad)的抗體（多株兔子抗關節桿菌）培 養60刀釦，以TBS清洗1〇秒兩次，然後與！ ： 20〇〇倍稀 釋的山羊抗兔子免疫球蛋白鹼性磷酸酶培養（Pierce，洛 克4田U 伊利論州）而達成。呈色是以一步驟的NBT/BCIP ( c e )、、、勺3为4里而達成，並且藉由在蒸館水中清洗而 終止。所有的培養都是以最終體積1 0毫升，在紅搖動平台 上進行（Hoef er，舊金山，加州）。文件是以影像管理者 乂及相關的軟體而完成（Amersham Pharmacia生技公司， Uppsala ί而典）。分子量的估計是經由將抗原的移動與精 崔勺麽範圍預染標準品（)做比較而得到。分子量 的估"十疋藉由計算相對遷移率，利用一階Lagrange而完成 〇 抗血清的產生： 對抗關節桿菌抗原的多株抗血清，是將0· 5毫升包含 35 200401827 3份先以無菌Dulbecc〇氏鹽溶液清洗的4 χ以”固細胞及 1份F=und氏不完全佐劑所組成的懸浮液，藉由肌肉内注 射、’丑西蘭兔而產生。四週之後，將相同體積的材料注射到 兔子、。在第六週時從周圍耳靜脈回升5毫升血液，並藉由 使血液凝集然後離心而收集血清。 曰 結果 ·· -經溶®酶處理的關節桿菌懸浮液之⑽咖分析，顯 不有150至1(Mf道耳吞⑽）範圍間的蛋 久這些中顯著的是約67、63及59仟道耳吞的 =67仟道耳吞的蛋白f明顯地交聯至關節桿菌細胞壁之 多因為只有它在以溶菌酶處理後被釋放出來。 當SDS-PAGE蛋白質圖像被西方墨潰並以對抗關節 全細胞的抗血清染色日车 月木色日守’主要的免疫反應條帶是在122及 序二f處被鑑定。將67仟道耳吞蛋白質的胺基端定

SRAVG IDLGT TNSVV SVLE 〇 BLASTS 白貝-蛋白質演算法之同源性檢索 枝桿菌的hsP70蛋白質，且右1nn〇/ J….“亥刀 、♦ 、 /、有1⑽乂的同源性。這個β7仟 道耳呑蛋白質咸信是盥美 .,^ ”基口體疋序所鑑定以及此處所揭露 的hsp70蛋白質相同。 實施例3: hsP70之重組表現 將關節桿菌熱休克蛋白7〇的 pET3〇EKLIC 載體（N ^ 。胺基端融合的標鐵是由5個=融合以及作為融合肽 ,^ 5個匕括各種特質的胺基酸所組 成，以提供標的蛋白質之進一步純化（包括有組胺酸標鐵 36 200401827 、s-標籤、腸激酶切割位置）。位於HSp7〇蛋白質内的 200個胺基酸活性主體結構，已知為功能部位丨丨，也選殖 作為非融合以及融合肽。 重組的HSP70及重組的功能部位丨丨之表現，是在大腸 桿菌DE3細胞中進行。一旦得到適合的細胞密度，則將 DE3培養物區分成兩個單獨的錐形瓶。蛋白質的表現是在 T個培養物中以IPTG基質而誘發，第二個培養物則扮演對 照組。以融合或非融合表現的Hsp7〇以及功能部位丨丨，主 要是以溶解的形式在細胞質中被發現，或是與大腸桿菌的 胞質周緣區（peripl細）結合。因此，在大腸桿菌中，重 組的HSP7G及其功能部位η是成功地標定至細胞表面，就 像是關節桿菌中的天然蛋白質般。將融合標籤納入到蛋白 論安基端，財並不會影響蛋白質的移位。根據這些觀 祭，全長的HSP70以及功能部位π可將其他抗原性序列移 位到細胞表面。 實施例4:與hsp70的基因融合體為基礎之對抗膽 的核酸疫苗 將維持在流動清水中之大西洋鞋魚（如卯如 前期銀色幼缝⑽幻，以稀釋於乾淨水族箱水中之 本^卡因（benzene)麻醉。在接種疫苗之前，將六隹 魚藉由致死劑量的麻醉劑而安樂 八又 集免疫前血清。 以尾-脈放血以收 將核酸疫苗及磷酸鹽緩衝溶液（pBs)對照組，以Μ 37 200401827 U升的疫田肌肉内接種到左背側，就在背鰭下方。將每重 祓40隻魚接種疫苗（每組8。隻，在兩箱之間區分）。接 種疫田之後’使魚回復到乾淨的水中，並分配到它們適合 的箱子。 經過測试的核酸疫苗是·· pUKrsxHSP70_ipnVP2以及 pUKi'sxHSPTO-ipnm。在細胞巨大病毒（CMV )啟動子的控 制下，乂些夤體分別攜帶關節桿菌屬hsp70與IPNV VP2或 IPNV VP3的完整編碼序列之架構内融合體。將 pUKrsxHSP7HpnVP2單獨測試，並將兩㈣體也_併測試 〇 為了進行比較，也製備包括先前研究已知序列的3，融 合之IPNVP2蛋白質的質體，以冑VP2成份的免疫保護功 效推增約20% (也就是，“黃金標準’，m_為基礎的㈣ 核酸疫苗）。 在疫苗接種後六週，將魚轉移到海水。在激發

田，攸每個二重複組的四隻魚中取樣血清。也採樣注 部位的肌肉樣本，並以福馬林固定以尋找疫苗的存在。 激發之後的第21天，從每個二重複組的最大量四隻存洛 魚中取樣血清。在激發之後’於每天第一次觀察：移開 亡的魚’並將腎臟樣本冷凍以藉由ELISA分析。 激發是在轉移到海水後4_6 Μ ’藉由與標記的姊妹 魚6同居而舉行，姊妹種魚已藉由腹膜内注射致命的IP則 W群洛形成單位（cfu))而激發。此項試驗是在 後終止。 38 200401827 結果顯示，所有以IPNV的VP2序列為基礎之核酸疫苗 ’都可保護對抗病毒的激發，包括hsp7〇-VP2融合體。 實施例5 :在對抗ISAV的疫苗中之重組Hsp7〇 在開始實驗之前，使大西洋鮭魚的幼魚在補充通氣及 流動良好的水（1(TC )之〇· 5毫升保存槽中適應一週，並 且在整個實驗期間每日餵食。每組55隻魚分成2槽25隻 ，以提供二重複的處理組。當以ISAV激發時，大西洋鮭魚 的幼魚經歷50至80%之間的死亡率。 將魚麻醉，然後以腹膜内注射〇·2毫升鹽溶液或〇·2 耄升包含特定重組蛋白質的鹽溶液而接種疫苗。陰性對照 組是磷酸鹽緩衝溶液注射液（鹽溶液）。處理組是·· （ a )組胺酸標籤的純化之關節桿菌屬hsp7〇重組蛋白質，U 微克；（B ) ISAV重組的組胺酸標籤之核蛋白殼蛋白質（ NC) ，12微克；（c)組胺酸標籤的純化之關節桿菌屬 hsp70重組蛋白質，12微克，混合組胺酸標籤的ISAV肊 ，12 U克，（β )組胺酸標籤的純化之關節桿菌屬 重組蛋白質，12微克，交聯到組胺酸標籤的ISAV NC，丄2 微克；（E)組胺酸標籤的純化之關節桿菌屬hsp7〇功能部 位2重組蛋白質，12微克，混合組胺酸標籤的ISM NC， 12微克；（F)組胺酸標籤的純化之關節桿菌屬hsp7〇功 能部位2重組蛋白質，12微克，交聯到組胺酸標籤的isav NC，12微克。 處理組])及F接受共價交聯的蛋白質。使用EDc及硫— 39 200401827 NHS作為交聯劑，並且根據標準方法而使用。 使用同居激發，其中少量的經魚是給予〇. j 的致命ISAV之腹膜内注射（約1〇4 TCID5q/魚） 到每個處理的魚的槽中。每天監測每槽的死亡率 存活的相對百分比是藉由在特定的時間點， 不同處理組以及對照組間的死亡率而評估。 【圖式簡單說明】 第1圖說明序列編號1，也就是，分離自 ATCC 55921 的 hsp70 基因之 DNA 序列（5’至 3,） 及3’未轉譯區域序列。 第2圖顯示序列編號2，也就是，預測為 hsp70基因序列所編碼之胺基酸序列。 毫升培養 ，並且力口 〇 藉由比較 關節桿菌 ，包括5’ $ 1圖的 200401827 1/6 序列表 <110> Novartis AG <120> 來自關節桿菌屬的Hsp70 <130> VA/H-32534A <150> GB 0216414.3 <151> 2002-07-15 <160> 2 <17 0> Patentln 第 3.1 版 <210> 1 <211> 2464 <212> DNA <213> 關節桿菌屬 <400> 1 ctgcgaatgt ccacgtggtg cgtgcagtga tgcgcttgaa gggcatcgca ccgcgctgaa 60 ccgggttcga cccggtccca ctgagttcgc caactgagtg ggacaagccc gttctgtccc 120 agtcacgcgg tcgactcagt gggaccacgc cgcagcgcga tcgatggtcg ccgcacagct 180 ttttccaaag ttgagcacag gtggctcaac ttagacttga cattggtcgg ctcaagcgta 240 aagttgatat cagaacsctc aacttgtaag aaatcccgaa aggaaaaaac atgtcacgtg 300 csgtaggcat cgacctcgga accaccaact cggtggtttc cgtcctcgaa ggcggcgagc 360 ccgtcgtcat cgcgaacgcc gaaggcggcc gcaccacccc ctcagtcgtc gcgttctcca 420 agagcggtga agtcctggtc ggcgaaatcg ccaagcgcca ggccgtcaac aacatcgatc 480 gcaccatcgc ctcggtcaag cgccscatgg gcaccgactg gaccgtcggc atcgacgaca 540 200401827 2/6 agaagtacac cgcgcaggaa atctccgccc gcaccctgat gaagctcaag aacgacgccg 600 agtcctactt gggcgaaaag gtcaccgacg cggtgatcac ggttcctgcc tacttcaacg 660 acgccgagcg ccaggccacc aaagaagccg gtgagatcgc cggcctgaac gtgctgcgca 720 tcgtcaacga gcccactgcg gcggcgctgg cctatggctt ggacaaaggc aaagaagacg 780 aactcatcct ggtcttcgac ctcggtggcg gcaccttcga cgtctcgctg ctggaagtcg 840 gcaaagacga cgacggcttc tccacgatcc aggtccgcgc cacctccggc gacaaccgcc 900 tgggcggcga cgactgggat cagcggatcg tcgactactt gctgaaccag ctcaaggtca 960 agggcatcga cctctccaag gacaagatcg cgctgcagcg tctgcgcgaa gcttccgagc 1020 aggccaagaa ggaactctcc tcggccacca gcaccaacat ctcgctgcag tacctctcgg 1080 tcacccctga cggtccggtg cacttggacg agcagctgac ccgggcgaag ttccaggaac 1140 tgaccgctga tctgctcgag cgcaccaaga agccgttcca ggacgtgatc gccgaggccg 1200 ggatcaaggt ttccgacatc gaccacatcg tgctggtcgg cggttccacc cggatgcccg 1260 cagtgaccga attggtcaag cagctggccg gtggcaagga gccgaacaag ggcgtcaacc 1320 cggacgaggt ggtcgccgtc ggcgccgcgc tgcaagccgg cgtgctcaag ggcgaacgca 1380 aagacgtgct gctcatcgac gtcaccccgc tttccctcgg catcgaaacc aagggcggcg 1440 tgatgaccaa gctgatcgag cggaacaccg cgattccgac caagcggtcc gagaccttca 1500 ccacggcgga cgacaaccag ccttcggtgg ccatccaggt gttccaaggc gagcgcgagt 1560 tcacccggga caacaagccg ttgggcacct tcgaactgac cggcatcgca ccggctccgc 1620 gcggcgtgcc gcaggtcgaa gtcaccttcg acatcgacgc caacggcatc gtgcacgtgt 1680 cggccaaaga caagggcacc ggcaaggagc agtcgatgac catcaccggc ggttcctcgc 1740 200401827 3/6 tgtccaagga agacatcgag cgcatggtcg ccgacgccga ggcacacgct gcagaggaca 1800 aggcccggcg cgagcaggcc gaggcccgca acagcgccga gcagctggcg tactcggtgg I860 acaagatcct caccgacaat gacgacaagc tgccggaaga ggtcaagacg gaggtcaagg 1920 ccgacgtcgg ggcgctcaag accgcgctgg ccggcaccga tgaggacgcg gtcgaggcgg 1980 cctcggagaa gctgcaggct tcgcagacca aactcggcgg agcgatttac gcttcggccc 2040 aggccgaggg tgccgccgct gccggtgacg ccccgagcga aggtgccaag cccgacgaag 2100 acatcgtcga cgccgagatc gtggacgaag aagaaccgaa gaacgagaag aagtagtcat 2160 gtccgaccag agccaatctg atcagggccg caaccccgaa aaagacgaaa ccgacgtgga 2220 cccggcaacg ggtcccgccg gggacgttcc ggaggagcag gatcctttgg cgcaagtcga 2280 agacatcctg aacaatgccg aggtgcccgc cgacgagtcg gtggcccagg gcgccgggca 2340 ggtggatgcc gcagaactca agaacgatct gctgcgcttg caggccgaat acgtgaacta 2400 ccgcaaacgc gtcgagcggg acaccagccc gggccgtcga ccacgcgtgc cctatagtaa 24 60 gggc 2464 <210> 2 <211> 621 <212> PRT <213> 關節桿菌屬 ! <400> 2

Met Ser Arg Ala Val Gly lie Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val 15 10 15

Ser Val Leu Glu Gly Gly Glu Pro Val Val lie Ala Asn Ala Glu Gly 20 25 30

Gly Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Ser Lys Ser Gly Glu Val 200401827 4/6 35 40 45

Leu Val Gly Glu lie Ala Lys Arg Gin Ala Val Asn Asn lie Asp Arg 50 55 60

Thr 工le Ala Ser Val Lys Arg His Met Gly Thr Asp Trp Thr Val Gly 65 70 75 80 lie Asp Asp Lys Lys Tyr Thr Ala Gin Glu lie Ser Ala Arg Thr Leu 85 90 95

Met Lys Leu Lys Asn Asp Ala Glu Ser Tyr Leu Gly Glu Lys Val Thr 100 105 no

Asp Ala Val lie Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Glu Arg Gin 115 120 125

Ala Thr Lys Glu Ala Gly Glu lie Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg lie 130 135 140

Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly 145 150 155 160

Lys Glu Asp Glu Leu lie Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe 165 170 175

Asp Val Ser Leu Leu Glu Val Gly Lys Asp Asp Asp Gly Phe Ser Thr 180 185 190 lie Gin Val Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn Arg Leu Gly Gly Asp Asp 195 200 205

Trp Asp Gin Arg lie Val Asp Tyr Leu Leu Asn Gin Leu Lys Val Lys 210 215 220

Gly lie Asp Leu Ser Lys Asp Lys lie Ala Leu Gin Arg Leu Arg Glu 225 230 235 240

Ala Ser Glu Gin Ala Lys Lys Glu Leu Ser Ser Ala Thr Ser Thr Asn 245 250 255 200401827 5/6 lie Ser Leu Gin Tyr Leu Ser Val Thr Pro Asp Gly Pro Val His Leu 260 265 270

Asp Glu Gin Leu Thr Arg Ala Lys Phe Gin Glu Leu Thr Ala Asp Leu 275 280 285

Leu Glu Arg Thr Lys Lys Pro Phe Gin Asp Val lie Ala Glu Ala Gly 290 295 300 lie Lys Val Ser Asp He Asp His lie Val Leu Val Gly Gly Ser Thr 305 310 315 320

Arg Met Pro Ala Val Thr Glu Leu Val Lys Gin Leu Ala Gly Gly Lys 325 330 335

Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala 340 345 350

Ala Leu Gin Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Arg Lys Asp Val Leu Leu 355 360 365 lie Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly lie Glu Thr Lys Gly Gly Val 370 375 380

Met Thr Lys Leu lie Glu Arg Asn Thr Ala lie Pro Thr Lys Arg Ser 385 390 395 400

Glu Thr Phe Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gin Pro Ser Val Ala lie Gin 405 410 415

Val Phe Gin Gly Glu Arg Glu Phe Thr Arg Asp Asn Lys Pro Leu Gly 420 425 430

Thr Phe Glu Leu Thr Gly He Ala Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gin 435 440 445

Val Glu Val Thr Phe Asp lie Asp Ala Asn Gly lie Val His Val Ser 450 455 460

Ala Lys Asp Lys Gly Thr Gly Lys Glu Gin Ser Met Thr lie Thr Gly 465 470 475 480 200401827 6/6

Gly Ser Ser Leu Ser Lys Glu Asp lie Glu Arg Met Val Ala Asp Ala 485 490 495

Glu Ala His Ala Ala Glu Asp Lys Ala Arg Arg Glu Gin Ala Glu Ala 500 505 510

Arg Asn Ser Ala Glu Gin Leu Ala Tyr Ser Val Asp Lys lie Leu Thr 515 520 525

Asp Asn Asp Asp Lys Leu Pro Glu Glu Val Lys Thr Glu Val Lys Ala 530 535 540

Asp Val Gly Ala Leu Lys Thr Ala Leu Ala Gly Thr Asp Glu Asp Ala 545 550 555 560

Val Glu Ala Ala Ser Glu Lys Leu Gin Ala Ser Gin Thr Lys Leu Gly 565 570 575

Gly Ala lie Tyr Ala Ser Ala Gin Ala Glu Gly Ala Ala Ala Ala Gly 580 585 590

Asp Ala Pro Ser Glu Gly Ala Lys Pro Asp Glu Asp lie Val Asp Ala 595 600 605

Glu lie Val Asp Glu Glu Glu Pro Lys Asn Glu Lys Lys 610 615 620

Claims (1)

1. 200401827 拾、申請專利範圍： 1 · 一種分離的核酸序列，其編碼關節桿菌屬hsp70蛋 白質或其片段。 2·如申請專利範圍第！項之分離的hsp7〇核酸序列， 其係來自以登錄編號ATCC 55921寄存之關節桿菌屬菌株。 3· —種分離的核酸序列，其包括序列編號丨的核酸 序列或其片&，或肖其具有至彡85%同源性之序列，或在 嚴格條件下與序列編號丨的序列雜合之序列。 4· 一種嵌合體核酸序列，其包括如申請專利範圍第工 3項中任一項之分離的核酸序列，在架構内融合到異源 性編碼序列。 ^ •如申請專利範圍第4項之嵌合體核酸序列，其中 忒異源性編碼序列編碼來自動物病原體之抗原。 …6·如中請專利範圍第5項之後合體核酸序列，其中 该抗原是IPNV VP2或VP3。 f•一種DNA表現載體， 至6項中任一項之核酸序列， 接到轉錄調控序列。 其包括如申請專利範圍第J 其中該核酸序列可操作地連 其以如申請專利範圍第7項之Dna • 一種宿主細胞， 表現載體而轉形。 種分離的關節桿菌屬hsp70胺基酸序列或其片段 hsp70胺基酸序 之關節桿菌屬菌 1 〇·如申請專利範圍第9項之分離的 “係來自以登錄編號ATCC 55921寄存

   41 200401827 株0 U· 一種分離的胺基酸序列，其包括序列編號2之胺 基酸序列或其免疫原性片段；或來自其胺基酸丨62至365 之序列；或與其具有至少85%同源性之序列；或其衍生物 12*如申請專利範圍第9至11項中任一項之胺基酸 序列’其係共價或非共價地連接到異源性分子，以形成一 結合分子。 13·如申請專利範圍第12項之胺基酸序列，其中該 結合分子是一融合蛋白質。 14_如申請專利範圍第12項之胺基酸序列，其中該 異源性分子是選自細菌、病毒、真菌、原生動物、線蟲以 及腫瘤抗原。 ，其中該 、線蟲以 15.如申請專利範圍第13項之胺基酸序列 異源性分子是選自細菌、病#、真菌、原生動物 及腫瘤抗原。 16.如申請專利範圍第14項之胺基酸序列，盆中嗜 抗原是以下來自ISAV的任一種蛋白質：核蛋白殼蛋：質： 血球凝集素、聚合酶以及片段7 p4及？5蛋白質。、 Π.如申請專利範圍第 貝I妝丞酉夂序列，其中該 抗原疋以下來自腿的任一種蛋白質：核蛋白殼、 血球減集素、聚合酶以及片段”4及p5蛋白質。、 18· —種分離的胺基酸序 1 $ R , 你田如甲凊專利範圍第 員中任一項之核酸分子所編碼。 42 200401827 19. 一種分離的核酸分子，苴維 ‘碼如申凊專利範圍第 9至1 7項中任一項之分離的胺基酸序列。 2〇.-種疫苗組合物’其包括如申請專利範圍第！至 6項中任-項之核酸分子、或如申請專利範圍第7項之麵 表現載體、或如以專利範圍第9至17項中任—項之胺基 酸序列、或富含hsp70的關節捍菌細胞萃取物、以及醫藥 上可接受的载劑。 乂如申請專利範圍第20項之疫苗組合物，更包括 至少一種異源性抗原、或編碼異源性抗原的核酸序列。 ^ 22· 一種套組，其包括如申請專利範圍第2〇項之疫 物卩及異源性抗原或編碼異源性抗原的核酸序列 ，以用於分開、連續或同步的投藥。 23.—種如申請專利範圍帛】至3項中任一項之核酸 序列或如中π專利乾圍第9至i i項中任—項之胺基酸序列 之用途，以作為疫苗佐劑。 24· 一種輔助疫苗之方法，其包括將疫苗抗原與申請 專利乾圍第9 $ 1 1 ΤΗ A / 1 1項中任一項之胺基酸序列混合。 25>種由申請專利範圍第9至17項中任一項之胺 基酸序列所引起之抗體。 26· 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項之核酸 序列或如申請專利範圍第9至17項中任一項之胺基酸序列 之用途，以作為藥劑。 27·種如申請專利範圍第1至6項中任一項之核酸 分子、或士 口申古軎蛮u > 專利乾圍第7項之DNA表現載體、或如申 43 200401827 請專利範圍第9至17項中任一項之胺基酸序列、或富含 hsp70的關節桿菌細胞萃取物之用途，以製備用於免疫動 物以對抗感染性疾病之藥劑。 28_如申請專利範圍第27項之用途，其中該動物是 硬骨魚。 29·如申請專利範圍第2 8項之用途，其中該疾病是 細菌性腎臟疾病（BKD)或鮭類立克次體敗血症（srs )。

   3 0 · —種具有由SDS-PAGE測量約6 7什道耳吞之分離 的熱休克蛋白’係位於關節桿菌的細胞壁，並且具有胺基 端的胺基酸序列：（M) SRAVG IDLGT TNSVV SVLE。 31 · —種DNA表現載體，其包括序列編號1的啟動子 序列或實質上同源的序列，其連接到異源性基因。 32. 一種熱休克蛋白之用途，以製造用於預防或治療 魚類感染性疾病之疫苗組合物。

   拾壹、圖式： 如次頁 44