BRPI0720729A2 - Moléculas de transporte que utilizam polipeptídeos hiv-tat de sequência inversa. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE TRANSPORTE QUE UTILIZAM POLIPEPTÍDEOS HIV-TAT DE SE- QÜÊNCIA INVERSA".

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido reivindica a prioridade de Pedido Provisório U.S. N0 de Série 60/882.639, depositado em 29 de dezembro de 2006, cujos conteú- dos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a novas moléculas de transporte que compreende um polipeptídeo possuindo resíduos de aminoácido dispostos em uma seqüência que é a seqüência inversa da parte básica da proteína HIV-TAT. As novas moléculas de transporte são úteis para liberação trans- membrana ou intracelular de moléculas de carga, exemplos não-limitadores dessas incluem polipeptídeos e ácidos nucleicos. As novas moléculas de transporte podem ser covalente ou não-covalentemente ligadas às molécu- las de carga. O tamanho reduzido da molécula de transporte preferida dessa invenção também reduz interferências na atividade biológica da molécula de carga.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A liberação transmembrana ou intracelular de agentes diagnósti- cos ou terapêuticos é geralmente complicada pela incapacidade de tais a- gentes atingirem os tecidos ou sítios intracelulares de interesse. Essa com- plicação pode surgir, em parte, devido ao organismo de membrana se de- senvolver para excluir compostos externos como uma maneira de proteger o organismo.

Considerando-se, por exemplo, a estrutura complexa da pele humana, que protege os órgãos do corpo de ameaças ambientais externas e atua como um termostato para manter a temperatura do corpo. A pele con- siste em diversas camadas diferentes, cada uma com funções especializa- das. As camadas principais incluem a hipoderme, a derme e a epiderme. A hipoderme é a camada mais profunda da pele. Essa atua tanto como um isolante para a conservação de calor corporal quanto como um absorvedor de choque para proteção dos órgãos (lnlander, Skin1 New York, N. Y.: Peo- ple's Medicai Society, 1-7 (1998)). Ademais, a hipoderme também armazena gordura para reservas de energia. O pH da pele é normalmente entre 5 e 6. Essa acidez se deve à presença de aminoácidos anfotéricos, ácido lático, e 5 ácidos graxos das secreções das glândulas sebáceas. O termo "manto áci- do" se refere à presença das substâncias solúveis em água sobre a maior parte das regiões da pele. A capacidade de tamponagem da pele se deve em parte àquelas secreções armazenadas na camada córnea da pele.

A derme, que se situa acima da hipoepiderme, possui 1,5 a 4 10 milímetros de espessura. Essa é a mais grossa das três camadas da pele. Ademais, a derme também é interna à maioria das estruturas da pele, inclu- sive glândulas sudoríparas e oleosas (que secretam substâncias através de aberturas na pele chamadas de poros, ou comedões), folículos capilares, terminações nervosas, e vasos sanguíneos e linfáticos (lnlander, Skin, New 15 York, NY: People’s Medicai Society, 1 -7 (1998)). Entretanto, os componen- tes principais da derme são colágeno e elastina.

A epiderme é a camada de estratificação de células epiteliais que cobre a pele e é a camada superior da pele. A epiderme possui apenas 0,1 a 1,5 milímetro de espessura (lnlander, Skin, New York, NY: People’s 20 Medicai Society, 1-7 (1998)), essa consiste em queratinócitos e é dividida em várias camadas com base no seu estado de diferenciação. A epiderme pode ser ainda classificada dentro do estrato córneo e a epiderme viável, que consiste nas células melfigianas granulares e basais.

Um problema significativo na aplicação de agentes fisiologica- 25 mente ativos de maneira tópica ou transdérmica é que a pele é uma barreira eficaz contra penetração. A natureza oleosa do estrato córneo e a firme compactação de suas células fornecem uma barreira eficaz contra agentes químicos gasosos, sólidos ou líquidos, sejam usados separadamente ou em água ou em soluções oleosas. Assim, o estrato córneo anula esforços para 30 aplicar agentes terapêuticos, cosméticos ou diagnósticos topicamente a á- reas locais do corpo. Isso é problemático, pois muitos agentes fisiologica- mente ativos, idealmente, deveriam ser aplicados topicamente em uma área localizada para atingir concentrações locais suficientemente altas do agente para obter um benefício terapêutico, sem superdosagem sistêmica. De ma- neira adicional, geralmente a absorção de um agente terapêutico ou diag- nóstico através do trato gastrointestinal é indesejável, pois pode resultar em 5 alteração química indesejada do agente através de processos metabólicos normais.

Além de estruturas macroscópicas, tal como, a pele, as células são geralmente impermeáveis ou quase impermeáveis a muitos agentes te- rapêuticos de diagnóstico, particularmente se os agentes forem macromolé- 10 cuias, tais como, proteínas e ácidos nucleicos. Ademais, algumas pequenas moléculas entram nas células vivas em taxas muito baixas. A falta de meios para liberação de macromoléculas em células in vivo é um obstáculo para o uso terapêutico, profilático e diagnóstico de um número potencialmente grande de agentes terapêuticos e diagnósticos que possuem sítios intracelu- 15 lares de ação, tais como, proteínas e ácidos nucleicos.

Vários métodos foram desenvolvidos para liberação de macro- moléculas em células in vitro. Uma lista de tais métodos inclui eletroporação, fusão de membrana com lipossomas, bombardeio em alta velocidade com microprojéteis cobertos com DNA, incubação com precipitado de cálcio- 20 fosfato-DNA, transfecção mediada por DEAE-dextrano, infecção com ácidos nucleicos virais modificados, e microinjeção direta em células simples. Esses métodos in vitro tipicamente liberam as moléculas de ácido nucléico apenas em uma fração da população celular total, e esses tendem a danificar gran- des números de células. A liberação experimental de macromoléculas em 25 células in vivo foi realizada com "scrape loading", precipitados de fosfato de cálcio e lipossomas. Entretanto, essas técnicas mostraram, até agora, utili- dade limitada para liberação celular in vivo. Ademais, mesmo com células in vitro, tais métodos são de utilidade extremamente limitada para liberação de proteínas.

São necessários métodos gerais para liberação eficaz de proteí-

nas biologicamente ativas em células intactas, in vitro e in vivo. (L. A. Stem- son, "Obstacles to Polipeptídeo Delivery", Ann. N. Y. Acad. Sei, 57, pp. 19-21 (1987)). A adição química de um lipopeptídeo (P. Hoffmann et al., "Stimulati- on of Human and Murine Adherent Cells by Bacterial Lipoprotein and Synthe- tic Lipopeptide Analogues", Immunobiol., 177, pp. 158- 70 (1988)) ou um po- límero básico, tal como, polilisina ou poliarginina (W. -C. Chen et al., "Conju- 5 gation of Poly-L-Lysinc Albumin and Horseradish Peroxidase: A Novel Me- thod of Enhancing the Cellular Uptake of Proteins", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, pp. 1872- 76 (1978)) não foi considerada altamente confiável ou geralmente útil. Ácido fólico foi usado como uma porção de transporte (C. P. Leamon and Low, Delivery of Macromolecules into Living Cells: A Method 10 That Exploits Folate Receptor Endocytosis", Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88, pp. 5572-76 (1991)). Foi apresentada uma indicação de internalização de conjugados de folato, porém não de liberação citoplásmica. Dados os altos níveis de folato circulante in vivo, a utilidade do sistema não foi completa- mente demonstrada. A exotoxina de pseudomonas também foi usada como 15 uma porção de transporte (T. I. Prior et al., "Barnase Toxin: A New Chimeric Toxin Composed of Pseudomonas Exotoxin A and Barnase", Cell, 64, pp. 1017-23 (1991)). Entretanto, a eficiência e aplicabilidade geral desse sistema para a liberação intracelular de moléculas de carga biologicamente ativas não estão evidentes a partir do trabalho publicado.

Um método anteriormente relatado de liberação intracelular de

algumas classes de agentes terapêuticos envolve a utilização de agentes de transporte que contêm a região básica da proteína HIV-TAT para liberação intracelular de algumas classes de compostos. Veja, por exemplo, Patente U.S. N0 5.652.122; 5.670.617; 5.674.980; 5.747.641; 5.804.604; e 6.316.003. 25 Adicionalmente, foi relatado que a proteína TAT ("HIV") tipo-l do vírus da imunodeficiência humana purificado é recolhida do meio circundante por meio de células humanas que se desenvolvem em cultura (A. D. Frankel and C. O. Pabo, "Cellular Uptake of the TAT Protein from Human Immunodefici- ency Virus", Cell, 55, pp. 1189-93 (1988)). Geralmente, a proteína TAT trans- 30 ativa alguns genes do HIV e é essencial para replicação viral. A proteína HIV-I TAT de comprimento total possui 86 resíduos de aminoácido. O gene HIV TAT possui dois éxons. Os aminoácidos TAT 1-72 são codificados pelo éxon 1, e os aminoácidos 73-86 são codificados pelo éxon 2. A proteína TAT de comprimento total é caracterizada por uma região básica que contém du- as Iisinas e seis argininas (aminoácidos 49-57) e uma região rica em cisteína que contém sete resíduos de cisteína (aminoácidos 22-37). Em particular, a 5 região básica (Le., aminoácidos 49-57) é considerada importante para locali- zação nuclear. (Ruben, S. ct al.. J. Virol. 63: 1-8 (1989); Hauber, J. et al., J. Virol. 63 1181-1187(1989).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Considerando que a região básica de HIV-TAT tenha sido ante- riormente usada para aumentar a liberação intracelular de algumas classes de moléculas, essa invenção se baseia na descoberta inesperada que a se- qüência inversa da região básica de HIV-TAT pode ser usada para aumentar a liberação transmembrana ou intracelular da molécula de carga, conforme definido aqui. Como resultado dessa descoberta, essa invenção proporciona novas moléculas de transporte que são capazes de aumentar a penetração transmembrana ou intracelular de moléculas de carga. Assim, as moléculas de transporte da presente invenção podem ser usadas para liberar uma mo- lécula de carga através da membrana (por exemplo, de maneira transdérmi- ca) ou através de uma membrana celular em células eucarióticas (por exem- pio, no núcleo da célula ou citoplasma), in vitro ou in vivo. Essa invenção se refere ainda a conjugados covalente ou não-covalentemente ligados de uma molécula de transporte e uma molécula de carga.

Adicionalmente, essa invenção proporciona um método de utili- zação de novas moléculas de transporte da invenção para aumentar a pene- 25 tração transmembrana ou intracelular de moléculas de carga. Esse método é particularmente adequado para moléculas de carga que não são (1) ineren- temente capazes de entrar nas células-alvo, núcleos das células, ou mem- branas, ou (2) não são inerentemente capazes de entrar nas células-alvo, núcleos das células ou membranas em uma taxa útil. Em algumas modali- 30 dades, as moléculas de transporte da invenção são úteis para liberação de proteínas ou peptídeos, tais como, fatores reguladores, enzimas, anticorpos, fármacos ou toxinas, bem como, DNA ou RNA1 no núcleo da célula ou atra- vés de membranas. As moléculas de carga particularmente preferidas inclu- em toxinas, exemplos não-limitadores dessas incluem toxinas botulínicas, waglerinas e tetânicas. A liberação intracelular de moléculas de carga de acordo com essa invenção é realizada por meio da administração de conju- 5 gados das novas moléculas de transporte e moléculas de carga às células de interesse. Em outras modalidades, a invenção proporciona métodos de liberação de moléculas de carga através de membranas, ao administrar um conjugado de molécula de transporte/molécula de carga às membranas de interesse. Em uma modalidade particularmente preferida, o conjugado de 10 molécula de transporte/molécula de carga é topicamente administrado para proporcionar penetração transdérmica da molécula de carga de interesse. BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

FIGURA 1: Penetração percutânea in vitro de radioatividade as- sociada a 125I na pele humana com K15RT2, quinze (15) Iisinas com um po- lipeptídeo correspondente à SEQ ID NO. 1 ligado a cada extremidade atra- vés de um espaçador G.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Formação das moléculas de transporte

As moléculas de transporte preferidas dessa invenção são ca- racterizadas pela presença de um polipeptídeo tendo uma seqüência que corresponde à seqüência inversa da seqüência de aminoácido de região bá- sica de HIV-TAT (aminoácidos 49-57 de proteína HIV-TAT naturalmente o- corrente). Essa seqüência inversa da região básica de HIV-TAT1 que é RR- RQRRKKR (SEQ ID NO. 1) é referida mais adiante neste documento como o "polipeptídeo de seqüência inversa", e pode ser covalente ou não- covalentemente ligada a uma molécula de carga de interesse para formar um conjugado. Em algumas modalidades, é vantajoso ligar covalentemente um ou mais polipeptídeos de seqüência inversa a uma molécula de carga de interesse, diretamente como através de um peptídeo ou Iigante polimérico. Por exemplo, o polipeptídeo de seqüência inversa pode ser vantajosamente ligado às moléculas de carga por reticulação química ou por fusão genética, como descrito aqui. Variantes do polipeptídeo de seqüência inversa também são contempladas pela invenção. Geralmente, qualquer variante do polipeptídeo de seqüência inversa que pode ser usada em uma molécula de transporte para aumentar a penetração transdérmica ou transmembrana de uma molé- 5 cuia de carga é considerada uma parte dessa invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, variantes do polipeptídeo de seqüência inversa são produzidas por deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido presente no polipeptídeo de seqüência inversa para produzir um polipeptí- deo de seqüência inversa modificado. Os polipeptídeos de seqüência inver- 10 sa modificados podem ser, desse modo, produzidos possuindo seqüências de aminoácido que são substancialmente similares, embora não idênticas, àquelas do polipeptídeo de seqüência inversa. Os polipeptídeos de seqüên- cia inversa modificados preferidos incluem aqueles que são fragmentos de peptídeo equivalentes funcionais ou funcionalmente equivalentes desses. 15 Tais fragmentos equivalentes funcionais ou funcionalmente equivalentes possuem capacidade de penetração transmembrana e intracelular que é substancialmente similar àquela do polipeptídeo de seqüência inversa natu- ralmente ocorrente.

Os polipeptídeos de seqüência inversa ou variantes desses po- dem ser obtidos utilizando uma variedade de métodos, inclusive técnicas de engenharia genética ou síntese química. Em algumas modalidades preferi- das, uma ou mais substituições podem ser feitas para modular as capacida- des de penetração do polipeptídeo de seqüência inversa, de modo que a molécula de transporte resultante tende a se localizar em algumas áreas, tal como, o citoplasma de uma célula-alvo. Um comportamento similar foi ante- riormente observado na região básica de HIV-TAT naturalmente ocorrente, e foi usado para localizar ou localizar parcialmente o fragmento HTV-TAT no citoplasma (veja, por exemplo, Dang, C. V. and Lee, W. M. F., J. Biol. Chem. 264: 18019-18023 (1989); Hauber, J. et al., J.Virol. 63: 1181-1187 (1989); Ruben, S. A. et al., J. Virol. 63: 1-8 (1989)). Alternativamente, uma seqüên- cia de ligação de um componente citoplásmico pode ser ligada ao polipeptí- deo de seqüência inversa para reter o polipeptídeo de seqüência inversa e a molécula de carga no citoplasma ou para regular a absorção nuclear de uma molécula de carga. Em outras modalidades, colesterol ou outros derivados lipídicos podem ser adicionados ao polipeptídeo de seqüência inversa ou uma variante desse para aumentar a solubilidade da membrana da molécula 5 de transporte. Naturalmente, a liberação de uma determinada molécula de carga ao citoplasma pode ser seguida pela liberação adicional da mesma molécula de carga ao núcleo. A liberação nuclear envolve necessariamente atravessar alguma parte do citoplasma.

Embora o polipeptídeo de seqüência inversa seja útil para forne- cer a liberação transmembrana ou intracelular de moléculas de carga, as moléculas de transporte contempladas por essa invenção também podem conter qualquer outra parte da proteína nativa HIV-TAT e que aumenta o transporte transmembrana ou intracelular. Por exemplo, se desejado, as mo- léculas de transporte também podem conter todos os 86 resíduos do poli- peptídeo HIV-TAT total possuindo a seqüência de uma região da proteína HTV-TAT nativa que aumenta a seqüência de qualquer parte dessa, de- monstrando um aumento na atividade de absorção, exemplos não- Iimitadores desses incluem resíduos 1-58, 37-72, ou 49-57. Entretanto, em modalidades preferidas, a molécula de transporte não contém a região rica em cisteína de HIV-TAT, essa corresponde aos aminoácidos 22-37 da se- qüência de HIV-TAT nativa, e onde 7 dentre 16 aminoácidos são cisteína. Aqueles resíduos de cisteína são capazes de formar ligações dissulfeto uns com os outros, com resíduos de cisteína na região rica em cisteína de outras moléculas de proteína HTV-TAT ou fragmentos dessas podem estar presen- tes, e com resíduos de cisteína que podem haver em uma proteína ou poli- peptídeo que constitui a molécula de carga de interesse. Tal formação de ligação dissulfeto pode causar perda da atividade biológica da molécula de carga. Ademais, mesmo que não haja potencial para ligação dissulfeto à mo- lécula de carga (por exemplo, quando o agente terapêutico for uma proteína sem resíduos de cisteína), a formação de ligação dissulfeto entre as molécu- las de transporte resulta na agregação e insolubilidade da molécula de transporte, o conjugado de molécula de transporte - molécula de carga, ou ambas. Assim, a região rica em cisteína da proteína HIV-TAT nativa é po- tencialmente uma fonte de sérios problemas no uso de proteínas relaciona- das com HTV-TAT para liberação de agentes terapêuticos ou diagnósticos. Devido à ausência da região rica em cisteína presente nas proteínas HTV- 5 TAT1 as moléculas de transporte preferidas dessa invenção evitam o pro- blema de agregação de dissulfeto, podendo resultar em perda da atividade biológica ou insolubilidade do conjugado covalente ou não-covalente do a- gente polipeptídico de transporte/terapêutico, ou ambos. Ademais, o tama- nho reduzido das moléculas de transporte preferidas dessa invenção tam- 10 bém reduz vantajosamente a interferência na atividade biológica do agente terapêutico ou diagnóstico. Uma vantagem adicional do tamanho de molécu- la de transporte reduzido é a eficiência de absorção aumentada em modali- dades dessa invenção envolvendo a ligação de múltiplos polipeptídeos de seqüência inversa por molécula de carga.

Ademais, essa invenção também contempla moléculas de trans-

porte que contêm um ou mais polipeptídeos de seqüência inversa em con- junto com proteínas TAT de outros vírus cujos exemplos não-limitadores in- cluem HIV-2 (M. Guyader et al., "Genome Organization and Transactivation of the Human Immunodeficiency Virus Type 2", Nature, 326, pp. 662-669 20 (1987)), vírus da anemia infecciosa equina (R. Carroll et al., "Identification of Lenttvirus TAT Functional Domains Through Generation of Equine Infectious Anemia Virus/Human Immunodeficiency Virus Type 1 TAT Gene Chimeras", J. Virol., 65, pp. 3460-67 (1991)), e vírus da imunodeficiência símia (L. Cha- krabarti et al., "Sequence of Simian Immunodeficiency Virus from Macaque 25 and Its Relationship to Other Human and Simian Retroviruses", Nature, 328, pp. 543-47 (1987); S. K. Arya et al., "New Human and Simian HTV-ReIated Retroviruses Possess Functional Transactivator (tal) Gene", Nature, 328, pp. 548-550 (1987)). Deve ser entendido que as moléculas de transporte que compreendem o polipeptídeo de seqüência inversa e qualquer polipeptídeo 30 derivado dessas outras proteínas TAT estão incluídas dentro do escopo da presente invenção, inclusive aquelas caracterizadas pela presença da região básica TAT e a ausência da região rica em cisteína TAT. As moléculas de transporte dessa invenção podem ser quimica- mente sintetizadas ou produzidas por métodos de DNA recombinante quan- do as moléculas de transporte forem polipeptídeos. Métodos de síntese quí- mica ou produção de DNA recombinante de polipeptídeos contendo uma 5 seqüência de aminoácido conhecida são bem conhecidos. Um equipamento automático para síntese polipeptídica ou de DNA está comercialmente dis- ponível. As células hospedeiras, vetores de clonagem, seqüências de con- trole de expressão de DNA e Iigantes oligonucleotídicos também estão co- mercialmente disponíveis para preparar moléculas de transporte polipeptídi- 10 cas.

De acordo com a invenção, uma molécula de carga é combina- da, tanto covalente como não-covalentemente, com uma molécula de trans- porte para formar um conjugado. Em modalidades preferidas, as moléculas de carga contempladas pela invenção incluem qualquer substância que pos- sui aplicação profilática, terapêutica ou diagnostica. Entretanto, qualquer a- gente biologicamente ativo também é contemplado por essa invenção, inclu- sive moléculas de carga que podem possuir um efeito adverso sobre o re- ceptor, tal como, uma toxina que é útil para eutanásia de animais. Há uma grande liberdade na seleção de moléculas de carga para uso na prática des- sa invenção. Exemplos não-limitadores de moléculas de carga contemplados pela invenção incluem fármacos, agentes diagnósticos, enzimas, proteínas, polipeptídeos, oligonucleotídeos, antígenos e toxinas. As moléculas de carga contempladas pela invenção podem ser obtidas ou produzidas utilizando técnicas conhecidas, tais como, síntese química, métodos de engenharia genética ou isolamento de fontes onde essas ocorrem naturalmente.

Em uma modalidade preferida, a molécula de carga é uma mo- lécula de toxina derivada de um sorotipo de toxina botulínica. As toxinas par- ticularmente preferidas são aquelas diretamente isoladas de sorotipos botu- línicos A, B, C, D, E, F e G, embora formas modificadas desses sorotipos 30 botulínicos também sejam expressamente consideradas como uma parte dessa invenção. Tais formas modificadas incluem, sem caráter limitativo, moléculas de toxina que contêm adições ou deleções de resíduos de amino- ácido, desde que aquelas adições ou deleções não alterem substancialmen- te o efeito biológico da molécula de toxina. Em outras modalidades, a molé- cula de carga é um antígeno e a conjugação à molécula de transporte serve para o propósito de fazer uma vacina. Por exemplo, a molécula de carga 5 pode ser um antígeno das bactérias ou vírus ou outro agente infeccioso que será imunizado pela vacina (por exemplo, gp120 de HIV). Proporcionando-se o antígeno dentro do citoplasma celular permite-se que a célula processe a molécula e a expresse sobre a superfície celular. A expressão do antígeno sobre a superfície celular irá aumentar uma resposta de linfócitos T destrui- 10 dores, desse modo, induzindo a imunidade.

Ainda em outra modalidade da invenção, a molécula de carga é uma proteína, tal como, uma enzima, anticorpo, toxina ou fator regulador (por exemplo, fator de transcrição) cuja liberação em células, e particular- mente no núcleo da célula é desejada. Por exemplo, alguns oncogenes vi- 15 rais ativam inadequadamente a expressão de genes celulares mediante liga- ção a seus promotores. Proporcionando-se uma proteína de ligação concor- rente no núcleo da célula, a atividade de oncogene viral pode ser inibida.

Em uma modalidade adicional, a molécula de carga é uma se- qüência de nucleotídeo que será usada como uma ferramenta de diagnósti- co (ou sonda), ou como um agente terapêutico, tal como, uma seqüência de oligonucleotídeo que é complementar a um gene celular ou região de gene- alvo e capaz de inibir a atividade do gene celular ou região de gene por hi- bridização com esse. A taxa na qual os ácidos nucleicos de cadeia simples ou cadeia dupla entram nas células, in vitro e in vivo, pode ser vantajosa- mente aumentada, utilizando as moléculas de transporte dessa invenção. Por exemplo, métodos de reticulação química de polipeptídeos para ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferida dessa invenção, a molécula de carga é um ácido nucléico antissenso de ca- deia simples. Os ácidos nucleicos antissenso são úteis para inibir a expres- são celular de seqüências às quais são complementares. Em outra modali- dade dessa invenção, a molécula de carga é um ácido nucléico de cadeia dupla que compreende um sítio de ligação reconhecido por uma proteína de ligação de ácido nucléico. Um exemplo de tal proteína de ligação de ácido nucléico é um transativador viral.

A molécula de carga de interesse também pode ser um fármaco, tal como, um análogo de peptídeo ou inibidor de enzima de pequena molé- 5 cuia, cuja introdução específica e confiavelmente em um núcleo da célula é desejada.

As moléculas de carga dessa invenção também podem ser a- gentes diagnósticos que fornecem informações, in vitro ou in vivo, sobre o ambiente local onde as moléculas de carga estão presentes. Os fatores que 10 devem ser considerados na seleção de agentes diagnósticos incluem, porém sem caráter limitativo, o tipo de informações experimentais procurado, a condição que será diagnosticada ou imaginada, a via de administração, não- toxicidade, conveniência de detecção, capacidade de quantificação de de- tecção e disponibilidade. Muitos tais agentes diagnósticos são conhecidos 15 pelos versados na técnica. Exemplos não-limitadores de agentes diagnósti- cos adequados incluem agentes de contraste radiopacos, agentes de con- traste paramagnéticos, agentes de contraste superparamagnéticos, agentes de contraste CT e outros agentes de contraste. Por exemplo, os agentes de contraste radiopacos (para formação de imagens de raio x) irão incluir com- 20 postos de iodo inorgânicos e orgânicos (por exemplo, diatrizoato), metais radiopacos e seus sais (por exemplo, prata, ouro, platina e similares) e ou- tros compostos radiopacos (por exemplo, sais de cálcio, sais de bário, tais como, sulfato de bário, tântalo e óxido de tântalo). Os agentes de contraste paramagnéticos adequados (para formação de imagens de MR) incluem áci- 25 do gadolínio dietilenotriamina pentaacético (Gd-DTPA) e seus derivados, e outros complexos de gadolínio, manganês, ferro, disprósio, cobre, európio, érbio, cromo, níquel e cobalto, inclusive complexos com ácido 1,4,7,10- tetraazaciclododecano-N,N’,N”,N”’-tetraacético (DOTA), ácido etilenodiami- natetraacético (EDTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,-N”,N”’- 30 triacético (D03A), ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N’,N”-triacético (NOTA), ácido 1,4,8,10-tetraazaciclotetradecano-N,N’,N”,N”’-tetraacético (TETA), á- cido bidroxibenziletileno-diamina diacético (HBED) e similares. Os agentes de contraste superparamagnéticos adequados (para formação de imagens MR) incluem magnetitas, óxidos de ferro superparamagnéticos, óxidos de ferro monocristalino, particularmente formas complexas de cada um desses agentes que podem ser covalente ou não-covalentemente ligados a um poli- 5 peptídeo de seqüência inversa ou uma cadeia principal positivamente carre- gada que contém um polipeptídeo de seqüência inversa, como descrito aqui. Ainda outros agentes de formação de imagens adequados são os agentes de contraste CT que incluem agentes de contraste CT iodados e não- iodados e iônicos e não-iônicos, bem como agente de contraste, tais como, 10 marcadores de spin ou outros agentes diagnosticamente eficazes.

Outros exemplos de agentes diagnósticos incluem genes mar- cadores que codificam proteínas que são facilmente detectáveis quando ex- pressas em uma célula, inclusive, porém sem caráter limitativo, β- galactosidase, proteína verde fluorescente, proteína azul fluorescente, Iucife- 15 rase, e similares. Uma ampla variedade de marcadores pode ser emprega- da, tais como, radionuclídeos, flúor, enzimas, substratos de enzima, cofato- res de enzima, inibidores de enzima, Iigantes (particularmente hapteno), e similares. Ainda outras substâncias úteis são aquelas marcadas com espé- cies ou componentes radioativos, tal como, glucoeptonato 99mTc.

A ligação da molécula de carga à molécula de transporte pode

ser realizada por qualquer meio que produza uma ligação entre os dois constituintes que seja suficientemente estável para suportar as condições usadas e que não altere a função de cada constituinte. A ligação entre essas pode ser não-covalente ou covalente. Por exemplo, técnicas recombinantes 25 podem ser usadas para ligar covaIentemente as moléculas de transporte que são polipeptídeos a moléculas de carga baseadas em a proteí- na/polipeptídeo, ligando o gene que codifica a molécula de carga ao gene que codifica a molécula de transporte de polipeptídeo e então introduzindo o constructo de gene resultante em uma célula capaz de expressar o conjuga- 30 do. Alternativamente, as duas seqüências de nucleotídeo separadas podem ser expressas em uma célula ou podem ser sintetizadas quimicamente e subsequentemente e covalentemente ligadas, utilizando técnicas conheci- das. Também, o conjugado de molécula de carga à base de proteí- na/peptídeo com a molécula de transporte pode ser quimicamente sintetiza- do como uma única seqüência de aminoácido (ou seja, uma onde ambos os constituinte estão presentes) e, assim, a ligação não é necessária.

5 Inúmeros métodos de reticulação química são conhecidos e po-

tencialmente aplicáveis para conjugar os polipeptídeos de transporte dessa invenção às moléculas de carga que são macromoléculas. Muitos métodos de reticulação química são não-específicos, isto é, esses não direcionam o ponto de acoplamento para nenhum sítio particular sobre o polipeptídeo de 10 transporte ou macromolécula de carga. Como resultado, o uso de agentes de reticulação não-específicos pode atacar sítios funcionais ou sítios de blo- queio estericamente ativos, tornando as proteínas conjugadas biologicamen- te inativas.

Uma abordagem preferida para aumentar a especificidade de acoplamento na prática dessa invenção é o acoplamento químico direto a um grupo funcional encontrado apenas uma vez ou poucas vezes em um ou ambos os polipeptídeos que serão reticulados. Por exemplo, em muitas pro- teínas, cisteína, que é o único aminoácido de proteína que contém um grupo tiol, ocorre apenas algumas vezes. Também, por exemplo, se um polipeptí- deo não possuir resíduos de lisina, um reagente de reticulação específico para aminas primárias será seletivo para a terminação amino daquele poli- peptídeo. A utilização bem-sucedida dessa abordagem para aumentar a es- pecificidade de acoplamento exige que o polipeptídeo possua os resíduos adequadamente raros e reativos em áreas da molécula que podem ser alte- radas sem perda da atividade biológica da molécula.

Os resíduos de cisteína podem ser substituídos quando esses ocorrerem em partes de uma seqüência de polipeptídeo onde sua participa- ção em uma reação de reticulação provavelmente poderia interferir na ativi- dade biológica. Quando um resíduo de cisteína for substituído, é tipicamente 30 desejável reduzir alterações resultantes em enovelamento de polipeptídeos. Alterações no enovelamento de polipeptídeos são reduzidas quando a subs- tituição for química e estericamente similar à cisteína. Por esses motivos, a serina é preferida como uma substituição de cisteína. Um resíduo de cisteína pode ser introduzido em uma seqüência de aminoácido do polipeptídeo para propósitos de reticulação. Quando um resíduo de cisteína for introduzido, a introdução na ou próxima à terminação amino ou carbóxi é preferida. Méto- 5 dos convencionais estão disponíveis para tais modificações de seqüência de aminoácido, se o polipeptídeo de interesse for produzido por síntese química ou expressão de DNA recombinante.

O acoplamento dos dois constituintes pode ser realizado através de um agente de acoplamento ou conjugação. Há diversos reagentes de reticulação intermoleculares que podem ser utilizados (veja, por exemplo, Means, G. E. and Feeney, R. E., Chemical Modification of Proteins, Holden- Day, 1974, pp. 39-43). Entre esses reagentes estão, por exemplo, propiona- to de J-succinimidil 3-(2-piridilditio) e (SPDP) ou bismaleimido de N,N’-(1,3- fenileno) (ambos são altamente específicos para grupos sulfidril e formam ligações irreversíveis); N, N’-etileno-bis-(iodoacetamida) ou outro tal reagen- te que possui 6 a 11 pontes de metileno de carbono (que é relativamente específico para grupos sulfidril); e 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno (que forma ligações irreversíveis com grupos amino e tirosina). Outros reagentes de re- ticulação úteis para esse propósito incluem: p.p’-difluoro-m,m’- dinitrodifenilsulfona (que forma reticulações irreversíveis com grupos amino e fenólicos); adipimidato de dimetila (que é específico para grupos amino); fenol-1,4-disulfonilcloreto (que reage principalmente com grupos amino); he- xametilenodiisocianato ou diisotiocianato, ou azofenil-p-diisocianato (que reage principalmente com grupos amino); glularaldeído (que reage com di- versas cadeias laterais diferentes) e disdiazobenzidina (que reage principal- mente com tirosina e histidina).

Os reagentes de reticulação podem ser homobifuncionais, ou seja, possuindo dois grupos funcionais que se submetem à mesma reação. Um reagente de reticulação homobifuncional preferido é bismaleimidoexano 30 ("BMH"). BMH contém dois grupos funcionais maleimida, que reagem espe- cificamente com compostos contendo sulfidril sob condições moderadas (pH 6,5-7,7). Os dois grupos maleimida são conectados por uma cadeia de hi- drocarboneto. Portanto, BMH é útii para reticulação irreversível de polipeptí- deos que contêm resíduos de cisteína.

Os reagentes de reticulação também podem ser hetero- bifuncionais. Os reagentes de reticulação hete-robifuncionais possuem dois 5 grupos funcionais diferentes, por exemplo, um grupo amino-reativo e um grupo tiol-reativo, que irá reticular duas proteínas possuindo aminas e tióis livres, respectivamente. Exemplos de agentes de reticulação heterobifuncio- nais são 4-(N-maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato de succinimidila ("SMCC"), éster de m-maleiraidobenzopl-N-hidroxisuccinimida ("MBS"), e 10 succinimida 4-(p-maleimidofenil)butirato ("SMPB"), um análogo de cadeia estendida de MBS. O grupo succinimidila desses reticuladores reage com uma amina primária, e maleimida tiol-reativa forma uma ligação covalente com o tiol de um resíduo de cisteína.

Os reagentes de reticulação geralmente possuem baixa solubili- dade em água. Uma porção hidrofílica, tal como, um grupo sulfonato, pode ser adicionada ao reagente de reticulação para aprimorar sua solubilidade em água. SuIfo-MBS e sulfo-SMCC são exemplos de reagentes de reticula- ção modificados para solubilidade em água.

Muitos reagentes de reticulação produzem um conjugado que é 20 essencialmente não-clivável sob condições celulares. Entretanto, alguns re- agentes de reticulação contêm uma ligação covalente, tal como, um dissulfe- to, que é clivável sob condições celulares. Por exemplo, ditio- bis(succinimidilpropionato) ("DSP"), reagente de Traufs e propionato de N- succinimidil 3-(2-piridilditio) ("SPDP") são reticuladores cliváveis bem conhe- 25 cidos. O uso de um reagente de reticulação clivável permite que a porção de carga se separe do polipeptídeo de transporte após a liberação na célula- alvo. A ligação dissulfeto direta também pode ser útil.

Alguns novos reagentes de reticulação, tais como, éster η-γ- maleimidobutirilóxi-succinimida ("GMBS") e sulfo-GMBS, reduziram a imu- nogenicidade. Em algumas modalidades da presente invenção, tal imunoge- nicidade reduzida pode ser vantajosa.

Inúmeros reagentes de reticulação, inclusive aqueles discutidos acima, estão comercialmente disponíveis. Instruções detalhadas para seu uso estão facilmente disponíveis junto aos fornecedores comerciais. Uma referência geral sobre reticulação de proteína e preparação de conjugado é: S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press 5 (1991).

A reticulação química pode incluir o uso de braços espaçadores. Os braços espaçadores proporcionam flexibilidade intramolecular ou ajustam distâncias intramoleculares entre porções conjugadas e desse modo podem ajudar a preservar a atividade biológica. Um braço espaçador pode estar sob 10 a forma de uma porção polipeptídica que compreende aminoácidos espaça- dores. Em uma modalidade particular, o Iigante espaçador é composto de uma ou mais unidades de glicina, tal como, um dímero GG, por exemplo. Alternativamente, um braço espaçador pode ser parte do reagente de reticu- lação, tal como, em "SPDP de cadeia longa" (Pierce Chem. Co., Rockford, 15 IU., cat. N0 21651 H).

Será reconhecido pelos versados na técnica que, quando o poli- peptídeo de transporte for geneticamente fundida com a porção de carga, é vantajoso adicionar uma metionina amino-terminal, porém os aminoácidos espaçadores (por exemplo, CysGIyGIy ou GIyGIyCys) não precisam ser adi- 20 cionados em algumas modalidades. Um único resíduo de cisteína terminal é um meio preferido de reticulação química. De acordo com algumas modali- dades preferidas dessa invenção, a terminação carbóxi do polipeptídeo de seqüência inversa é geneticamente fundido com a terminação amino de uma molécula de carga que inclui um polipeptídeo ou uma proteína.

Em algumas modalidades preferidas, o próprio polipeptídeo de

seqüência inversa é uma molécula de transporte que se associa não- covalentemente com uma molécula de carga para formar um conjugado não- covalente que aumenta a liberação da molécula de carga. Alternativamente, o polipeptídeo de seqüência inversa é covalentemente ligado, não à molécu- 30 Ia de carga, porém a uma estrutura molecular (diretamente ou através de um ligante) para formar uma molécula de transporte que se associa não- covalentemente com a molécula de carga para formar um conjugado. Em uma modalidade particularmente preferida, a molécula de transporte inclui uma ou mais cópias do polipeptídeo de seqüência inversa, covalentemente ligadas a uma cadeia principal positivamente carregada. Opcionalmente, outros fragmentos intensificadores de transporte de proteínas HTV-TAT nati- vas ou de proteínas TAT de outros vírus também podem ser ligados à cadeia principal positivamente carregada. Uma cadeia principal positivamente car- regada é tipicamente uma cadeia linear de átomos, com grupos na cadeia transportando uma carga positiva em pH fisiológico, ou com grupos transpor- tando uma carga positiva ligada a cadeia laterais que se estendem a partir da cadeia principal. A cadeia principal linear é uma cadeia principal de hidro- carboneto, que é, em algumas modalidades, interrompida por heteroátomos selecionados entre nitrogênio, oxigênio, enxofre, silício e fósforo. A maior parte dos átomos de cadeia principal é geralmente carbono. Adicionalmente, a cadeia principal será geralmente um polímero de unidades de repetição (por exemplo, aminoácidos, poli(etilenoóxi), polipilenoamina), e similares). Em um grupo de modalidades, a cadeia principal positivamente carregada é um polipropilenoamina onde inúmeros átomos de nitrogênio amina estão presentes como grupos amônio (tetrassubstituídos) que transportam uma carga positiva. Em outro grupo de modalidades, a cadeia principal ligou uma pluralidade de porções de cadeia lateral que inclui grupos positivamente car- regados (por exemplo, grupos amônio, grupos piridínio, grupos fosfônio, gru- pos sulfônio, grupos guanidínio ou grupos amidínio). As porções de cadeia lateral nesse grupo de modalidades podem ser subtituidas em espaçamen- tos ao longo da cadeia principal são constantes em separações ou variáveis. Adicionalmente, o comprimento das cadeias laterais pode ser similar ou dife- rente. Por exemplo, em um grupo de modalidades, as cadeias laterais po- dem ser cadeias de hidrocarboneto lineares ou ramificadas tendo de um a vinte átomos de carbono e terminando na extremidade distai (distante da cadeia principal) em um dos grupos positivamente carregados observados acima.

Em um grupo de modalidades, a cadeia principal positivamente carregada é um polipeptídeo tendo múltiplos grupos de cadeia lateral positi- vãmente carregados (por exemplo, lisina, arginina, ornitina, homoarginina, e similares). Um versado na técnica irá avaliar que, quando os aminoácidos são usados nessa parte da invenção, as cadeias laterais podem possuir a forma D ou L (configuração R ou S) no centro de ligação.

5 Alternativamente, a cadeia principal pode ser um análogo de um

polipeptídeo, tal como, um peptoide. Veja, por exemplo, Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993); Zuckcrmann et al. Chemtracts- Macromol. Chem. 4:80 (1992); and Simon et al. Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA 89:9367 (1992)). Em suma, um peptoide é uma poliglicina onde a cadeia 10 lateral é ligada aos átomos de nitrogênio de cadeia principal em vez de os átomos α-carbono. Como exposto acima, uma parte das cadeias laterais irá tipicamente terminar em um grupo positivamente carregado para proporcio- nar um componente de cadeia principal positivamente carregado. A síntese de peptoides está descrita, por exemplo, na Patente U.S. N0 5.877.278. Con- 15 forme o termo é usado aqui, as cadeias principais positivamente carregadas que possuem uma construção de cadeia principal peptoide são consideradas "não-peptídicas" visto que essas não são compostas de aminoácidos tendo cadeias laterais naturalmente ocorrentes nos locais .alfa.-carbono.

Uma variedade de outras cadeias principais pode ser usada em- pregando, por exemplo, simulações estéricas ou eletrônicas de polipeptídeos onde as ligações amida do peptídeo são substituídas por substitutos, tais como, ligações éster, tioamidas (--CSNH--), tioamida inversa (--NHCS--), aminometileno (--NHCH2-) ou os grupos metilenoamino (--CH2NH--), grupos ceto-metileno (--COCH2--), fosfinato (-PO2RCH2--), fosfonamidato e éster fosfonamidato (--PO2RNH--), peptídeo transportador (--NHCO--), trans- alceno (--CR=CH--), fluoroalceno (-CF=CH-), dimetileno (--CH2CH2--), tioéter (-CH2S-), hidroxietileno (--CH(OH)CH2-), metilenoóxi (--CH2O--), tetrazol (CNt), sulfonamido (-SO2NH-), metilenosulfonamido (-CHRSO2NH-), sulfo- namida inversa (-NHSO2-), as cadeias principais com malonato e/ou subuni- dades de gem-diamino-alquil, por exemplo, como analisado por Fletcher et al. ((1998) Chem. Rev. 98:763) e detalhado a título de referência citada nes- se. Muitas das substituições anteriores resultam em cadeias principais poli- méricas aproximadamente isostéricas relativas às cadeias principais forma- das a partir de a-aminoácidos.

Em outra modalidade particularmente preferida, a parte de ca- deia principal é uma polilisina e os polipeptídeos de seqüência inversa são 5 ligados aos grupos amino de cadeia lateral lisina. A polilisina usada nessa modalidade particularmente preferida pode ser qualquer uma das polilisinas comercialmente disponíveis (Sigma Chemical Company, St Louis, Mo., LI- SA), tais como, por exemplo, polilisina contendo MW>70.000, polilisina con- tendo MW de 70.000 a 150.000, polilisina contendo MW 150.000 a 300.000 10 e polilisina contendo MW>300.000. A seleção apropriada de uma polilisina irá depender dos componentes restantes da composição e será suficiente para proporcionar uma carga positiva líquida total à composição.

Liberação do Conjugado de Molécula de Transporte/Molécula de

Carga

Essa invenção é geralmente aplicável para liberação intracelular

ou transmembrana terapêutica, profilática ou diagnostica de moléculas pe- quenas e macromoléculas, tais como, proteínas, ácidos nucleicos e polissa- carídeos, que não são inerentemente capazes de entrar nas células-alvo ou penetrar as membranas biológicas em uma taxa útil. Os processos e compo- 20 sições dessa invenção podem ser aplicados a qualquer organismo, inclusive seres seres humanos. Os processos e composições dessa invenção tam- bém podem ser aplicados a animais e seres humanos no útero. De acordo com uma modalidade preferida dessa invenção, uma molécula de carga é liberada nas células de vários órgãos e tecidos após a introdução de um 25 conjugado de molécula de transporte-carga em um ser humano ou animal vivo. Por exemplo, o conjugado de molécula de carga/molécula de transporte pode ser posto em contato com células onde se deseja a introdução da mo- lécula de carga. Como resultado, o conjugado entra nas células, passando dentro do núcleo. Em outra modalidade, o conjugado de molécula de car- 30 ga/molécula de transporte é administrado a uma superfície de uma membra- na para induzir a penetração transmembrana do conjugado de molécula de carga/molécula de transporte. Por exemplo, o conjugado de molécula de carga/molécula de transporte pode ser administrado topicamente a uma re- gião que poderia tirar vantagem da ação terapêutica da molécula de carga. Em uma modalidade particularmente preferida, a molécula de carga é um sorotipo de toxina botulínica, e o conjugado de molécula de carga/molécula 5 de transporte é topicamente administrados em regiões da pele que possuem sulcos ou rugas, para reduzir a aparência dos sulcos ou rugas.

Alternativamente, o conjugado de molécula de carga/molécula de transporte pode ser liberado in vivo por células que são produzidas e im- plantadas em um indivíduo. As células são geneticamente elaboradas de modo que essas expressem o conjugado de molécula de carga/molécula de transporte continuamente in vivo.

Alternativamente, a presente invenção pode ser usada para libe- rar uma molécula de carga in vitro. Por exemplo, em aplicações in vitro onde a molécula de carga será liberada dentro das células em cultura, o conjuga- 15 do de molécula de carga/molécula de transporte pode ser simplesmente adi- cionado ao meio de cultura. Isto é útil, por exemplo, como um meio de libe- ração nas substâncias do núcleo cujo efeito sobre a função celular será ava- liado. Por exemplo, a atividade de fatores de transcrição purificados pode ser medida, ou o ensaio in vitro pode ser usado para proporcionar um teste im- 20 portante da atividade de molécula de carga, antes de seu uso em tratamento in vivo.

A liberação também pode ser realizada in vitro ao produzir célu- las que sintetizam o conjugado de molécula de carga/molécula de transporte desejado in vitro ou ao combinar uma amostra (por exemplo, sangue, medu- 25 Ia óssea) obtida de um indivíduo com o conjugado de molécula de car- ga/transporte, sob condições apropriadas. Por exemplo, uma molécula de carga selecionada em combinação com a proteína TAT ou a molécula de carga de conjugado de proteína TAT de interesse pode ser combinada com uma amostra obtida de um indivíduo (por exemplo, sangue, medula óssea) 30 para introduzir a molécula de interesse nas células presentes na amostra e, após o tratamento dessa maneira, a amostra retornou para o indivíduo. Uma série de tratamentos realizada dessa maneira pode ser usada para prevenir ou inibir os efeitos de um agente infeccioso. Por exemplo, o sangue pode ser removido de um indivíduo infectado com HIV ou outro vírus, ou de um indiví- duo com um defeito genético. O sangue pode ser então combinado com o conjugado de molécula de carga/molécula de transporte onde a molécula de 5 carga de interesse é um fármaco capaz de inativar o vírus, ou uma seqüên- cia de oligonucleotídeo capaz de se hibridizar em uma seqüência de vírus selecionada e inativá-la, ou uma proteína que suplementa uma proteína au- sente ou defeituosa, sob condições apropriadas para a entrada nas células do conjugado e manutenção da amostra em tal condição que essa possa 10 retornar para o indivíduo. Após o tratamento, o sangue retorna para o indiví- duo.

A liberação pode ser realizada in vivo ao administrar o conjuga- do de molécula de carga/molécula de transporte a um indivíduo no qual esse será usado para propósitos diagnósticos, preventivos ou terapêuticos. As 15 células-alvos podem ser células in vivo, ou seja, células que compõem os órgãos ou tecidos de animais ou seres humanos vivos, ou micro-organismos encontrados em animais ou seres humanos vivos.

Em algumas modalidades, o conjugado de molécula de transpor- te/molécula de carga é combinado com um agente que aumenta a estabili- 20 dade e penetração. Por exemplo, íons de metal que se ligam à proteína HIV- TAT e aumentam sua estabilidade e penetração, podem ser usados para esse propósito. Alternativamente, um agente lisosomotrópico é fornecido de maneira extracelular em conjunto com a molécula de transporte e molécula de carga para aumentar a absorção por células. O agente lisosomotrópico 25 pode ser usado separadamente ou em conjunto com um estabilizador. Por exemplo, os agentes lisosomotrópicos, tais como, cloroquina, monensina, amantadina e metilamina, que foram mostrados para aumentar a absorção de HTV-TAT naturalmente ocorrente em algumas células algumas centenas de vezes, podem ser usados para esse propósito.

Em outra modalidade, um peptídeo básico, tal como, uma se-

qüência peptídica que corresponde aos resíduos 38-58 ou HIV-TAT ou pro- tamina, é fornecido de maneira extracelular com a molécula de transporte e molécula de carga para aumentar a absorção da molécula de carga. Tais peptídeos básicos também podem ser usados separadamente, ou em com- binação com agentes estabilizantes ou agentes lisosomotrópicos.

As composições farmacêuticas dessa invenção podem servir para aplicações terapêuticas, profiláticas ou diagnosticas, e podem se en- contrar em uma variedade de formas. Essas incluem, por exemplo, formas de dosagem sólidas, semissólidas e líquidas, tais como, pílulas, pós, solu- ções ou suspensões líquidas, aerossóis, lipossomas, supositórios, soluções injetáveis e infusíveis e formas de liberação sustentada. A forma preferida depende do modo pretendido de administração e a aplicação terapêutica, profilática ou diagnostica. De acordo com essa invenção, um conjugado de molécula de carga/molécula de transporte selecionado pode ser administra- do por vias convencionais de administração, tais como, vias parenterais, subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intralesionais, intraesternais, intracranianas ou aerossóis. As vias tópicas de administração também po- dem ser usadas, com a aplicação das composições localmente a uma parte particular do corpo (por exemplo, pele, trato intestinal inferior, vagina, reto) onde apropriado. As composições também incluem, de preferência, veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis convencionais que são conheci- dos pelos versados na técnica.

Geralmente, as composições farmacêuticas da presente inven- ção podem ser formuladas e administradas utilizando métodos e composi- ções similares àqueles usados por polipeptídeos farmaceuticamente impor- tantes, tais como, por exemplo, alfa interferon. Será entendido que as doses 25 convencionais irão variar dependendo da molécula de carga particular en- volvida, bem como a saúde, peso, idade, sexo do paciente, a condição ou doença e o modo desejado de administração. As composições farmacêuti- cas dessa invenção incluem veículos, adjuvantes e veículos farmacologica- mente apropriados. Em geral, esses transportadores incluem soluções a- 30 quosas ou alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, inclusive solução salina e meios tamponados. Os veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos de Ringer Iactados ou fixados. Ademais, os veícuios intravenosos podem incluir repositores de fluidos e nutrientes, e repositores de eletrólitos, tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer. Conservantes e outros adi- tivos também podem estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobici- 5 das, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes. Veja, geralmente, Remington1S Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. 1980.

Deve ser avaliado, entretanto, que as modalidades alternativas dessa invenção não se limitam a aplicações clínicas. Essa invenção pode ser vantajosamente aplicada em pesquisa médica e biológica. Em aplica- 10 ções de pesquisa dessa invenção, a molécula de carga pode ser um fárma- co ou um agente diagnóstico. As moléculas de transporte dessa invenção podem ser usadas como reagentes de laboratório de pesquisa, separada- mente ou como parte de um kit de conjugação de molécula de transporte.

Embora sejam descritas inúmeras modalidades dessa invenção, 15 é evidente que as construções básicas podem ser alteradas para proporcio- nar outras modalidades que utilizam os processos e produtos dessa inven- ção. Portanto, será avaliado que o escopo dessa invenção deve ser definido pelas reivindicações em anexo e em vez de pelas modalidades específicas que foram apresentadas a título de exemplo.

Exemplo 1

O objetivo do presente estudo é avaliar a possibilidade de libera- ção de uma molécula de carga grande (toxina botulínica tipo A) à pele hu- mana in vitro utilizando células de difusão de passagem de fluxo. Uma vez que a toxina tem um tamanho considerável, espera-se que a absorção dér- 25 mica sem o uso de nenhuma molécula de transporte seja insignificativamen- te baixa. Portanto, uma solução transportadora foi adicionada em razões de toxina/transportador diferentes em uma tentativa de aumentar/facilitar a ab- sorção dérmica através da camada do estrato córneo. Além da quantidade presente no fluido receptor em vários pontos de tempo, a distribuição nas 30 várias camadas da pele foi avaliada após 24 horas. Para completar, o produ- to Neuronox® (ou seja, o complexo toxina/albumina que inclui proteínas au- xiliares) foi radiomarcado utilizando 125I. 1.1 Sistema de teste

Preparação de membranas da pele: as membranas da pele hu- mana foram preparadas a partir da amostra de pele congelada (um único doador diretamente após cirurgia abdominal). Após o descongelamento, a 5 pele foi cortada utilizando um Dermátomo de 25 mm (Nouvag GmbH, Ger- many) em uma espessura registrada de aproximadamente 400 prn.

Células de difusão de passagem de fluxo: as membranas da pe- le foram colocadas em células de difusão automática de passagem de fluxo de 9 mm (PermcGear Inc., Riegelsville, PA, USA). A temperatura de superfí- 10 cie da pele foi mantida a aproximadamente 32°C, em umidade ambiente. O fluido receptor foi bombeado em uma velocidade de cerca de 1,6 mL h-1 e consistia em Salina Tamponada com Fosfato (PBS) contendo 0,01 % de azi- da de sódio (w/v).

1.2 Desenho experimental e procedimentos

A marcação com 125I das substâncias de teste: Os conteúdos de

um frasco contendo o produto Neuronox foram reconstituídos em 100 pL 50 mM de tampão KH2PO4, pH 7,2. Durante a iodação 37 MBq Na125I (10 μΙ), 20 μΙ de uma solução de peróxido de hidrogênio aproximadamente 100.000 ve- zes diluída em água (30 % (v/v) de peridrol) e 20 μΙ de lactoperoxidase. (4 20 pg.10 μί-1 de água) foram adicionados ao frasco contendo o produto Neu- ronox®. Após cerca de 60 segundos, a iodação foi interrompida pela adição de 50 pL de solução de tirosina (1 mg mL-1) em tampão fosfato para remo- ver o excesso de 125I que ainda não foi reagido com as proteínas disponíveis (toxina, albumina, etc.). Após um minuto, 125I (ligação a L-tirosina) foi sepa- 25 rado das proteínas radiomarcadas utilizando uma coluna fina Sephadex G25 de cerca de 10 mL de volume equilibrada com o tampão de análise contendo 0,5 % (w/v) de BSA. As frações de cerca de 250 pL foram coletadas. As sub- frações foram retiradas para medida de radioatividade. As frações foram ar- mazenadas a 2-100C até o novo uso.

Desenho experimental: o produto Neuronox® foi avaliado por

sua capacidade de penetrar a pele em soluções transportadoras K15RT2. Antes da aplicação do composto de teste, a integridade da pele foi avaliada ao determinar o coeficiente de permeabilidade (Kp) de água tritiada. A estru- tura experimental era da seguinte forma:

Grupo n Razão transportador/toxina Substância de teste A 4 Controle (sem transportador) NNX unitário B 5 1.1:1 K15TR2 + NNX Procedimento de recuperação: após 24 horas, a substância de teste não absorvida (dose deslocável) foi removida do sítio de aplicação utili- 5 zando uma solução de sabão suave (3 % de Teepol em água) e chumaços de algodão. A superfície da pele foi seca após lavagem utilizando chumaços de algodão secos. O compartimento receptor e o compartimento doador fo- ram lavados com água (2 vezes 1 mL). Subsequentemente, cada membrana da pele foi removida por fita (10 vezes por membrana) utilizando escala D 10 (Monaderm, Monaco). A remoção por fita foi descontinuada no caso de a epiderme ser rompida. Os pedaços de fita contendo (partes de) a epiderme foram agrupados com a membrana da pele (epiderme). Por fim, a epiderme e derme foram separadas mecanicamente utilizando um bisturi e pinças. A radioatividade em todas as frações foi medida por contagem de radiação γ.

1.3 Análise

Determinação de radioatividade: a radioatividade nas amostras do teste de integridade foi determinada por contagem de cintilação líquida (LSC) utilizando DOT-DPMTM (técnica de sobreposição digital que utiliza a biblioteca de espectro e o espectro padrão externo) para correção de extin- 20 ção em um contador de cintilação Wallac Pharmacia modelo S 1414. Os procedimentos de calibração dos instrumentos são estabelecidos nos apare- lhos de teste.

Formulações de dose: alíquotas da formulação de dose obtidas justo antes e diretamente após a dosagem foram diretamente adicionadas 25 ao cintilante líquido (Ultima Gold®) e medidas por LSC. As amostras de fluido receptor do fluido receptor foram diretamente adicionadas a um cintilante líquido (Ultima Gold®) e medidas por LSC. A radioatividade nas amostras do teste de absorção utilizando o composto de teste marcado por 125I foi deter- minada utilizando um Contador Gama (Perkin Elmer).

1.4 Cálculos

A absorção total é definida como a quantidade de radioatividade relacionada ao composto no fluido receptor, o fluido de compartimento re- ceptor, e a pele (excluindo os pedaços de fita).

2. Resultados

Absorção percutânea do item de teste

A absorção percutânea de [125I] Neuronox®, foi avaliada em membranas da pele humana. O tempo de exposição foi de 24 horas. A dis- tribuição (tecido) é apresentada na tabela 1.

Tabela 1: Tabela da visão geral da penetração percutânea in vitro de radioatividade associada a 135I na pele humana (expressa como por- centagem da dose aplicada)_

Grupo Média A Média B sd sd Lavagem de pele 111,15 2,10 101,44 3,51 Filtro de carvão 0,01 0,00 0,01 0,00 Estrato Córneo 0,76 0,59 2,43 1,43 Epiderme 0,28 0,09 0,30 0,09 Derme 0,27 0,41 1,03 0,77 Fluido receptor 0,43 0,38 0,93 0,72 Recuperação total 112,94 1,14 106,28 1,52 A Figura 1 mostra a penetração percutânea in vitro de radioativi- dade associada com 125I1 na pele humana com K15RT2. Os dados mostram claramente que a penetração percutânea in vitro de radioatividade associada com 125I é muito maior com toxina botulínica mais K15RT2, comparada com a toxina botulínica por si só. Listagem de Seqüência

<110> Waugh1 Jacob M. Lee, Jae Hoon

<120> Moléculas de Transporte que Utilizam Polipeptídeos HIV-TAT de Seqüência Inversa

<130> 13720-105127

<140> US 11/954.885

<141 > 2007-12-12

<150> US 60/882.639

<151 > 2006-12-29

<160> 1

<170> Patentln version 3.4

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Vírus da Imunodeficiência humana

<400> 1

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg

1 5

Claims (15)

1. Molécula de transporte para a liberação de uma molécula de carga, onde a dita molécula de transporte compreende um polipeptídeo de seqüência inversa que possui uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO 1.

2. Molécula de transporte, de acordo com a reivindicação 1, on- de o polipeptídeo de seqüência inversa é covalentemente ligado à molécula de carga.

3. Molécula de transporte, de acordo com a reivindicação 1, on- de o polipeptídeo de seqüência inversa é covalentemente ligado a uma ca- deia principal positivamente carregada que é não-covalentemente ligada à molécula de carga.

4. Molécula de transporte, de acordo com a reivindicação 3, on- de o polipeptídeo de seqüência inversa é covalentemente ligado a uma ca- deia principal positivamente carregada que é não-covalentemente ligada à molécula de carga.

5. Molécula de transporte, de acordo com a reivindicação 1, on- de a dita molécula de transporte aumenta a penetração da molécula de car- ga através de uma membrana biológica.

6. Molécula de transporte, de acordo com a reivindicação 5, on- de a membrana biológica é encontrada na pele.

7. Molécula de transporte, de acordo com a reivindicação 1, on- de a dita molécula de transporte aumenta a penetração intracelular da molé- cula de carga.

8. Conjugado para a liberação de uma molécula de carga, sendo que o dito conjugado compreende uma molécula de transporte que compreende um polipeptídeo de seqüência inversa dotado de uma seqüência de aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO. 1; e uma molécula de carga.

9. Conjugado, de acordo com a reivindicação 8, onde a dita mo- lécula de transporte é covalentemente ligada à dita molécula de carga.

10. Conjugado, de acordo com a reivindicação 8, onde a dita molécula de transporte é não-covalentemente ligada à dita molécula de car- ga.

11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 8, onde a dita molécula de carga é um agente terapêutico.

12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 11, onde o dito agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em peptí- deos, proteínas, oligonucleotídeos, enzimas e antígenos.

13. Conjugado, de acordo com a reivindicação 11, onde o dito agente terapêutico é derivado de um sorotipo de toxina botulínica ou um fragmento desse.

14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, onde o dito agente de diagnóstico é selecionado a partir do grupo que consiste em agen- tes de contraste rádio-opaco, agentes de contraste paramagnético, agentes de contraste superparamagnético, e agentes de contraste CT.

15. Método para o tratamento de uma doença, onde o dito méto- do compreende selecionar uma molécula de carga; selecionar uma molécula de transporte; ligar a dita molécula de carga à dita molécula de transporte de maneira covalente ou não-covalente para formar um conjugado de molécula de carga/molécula de transporte; e administrar o dito conjugado às células-alvo ou a uma membra- na para induzir a liberação intracelular ou transmembrana da molécula de carga.