TW200907066A - Method for washing a column and method for extracting membrane-bound target molecules - Google Patents

Description

200907066 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種用於清洗一管之方法及一種用於萃取 諸如二氧化石夕膜結合核酸、DNA、或RNA等膜結合乾分子 之方法。 【先前技術】 多種商品採用基於二氧化矽離液技術之膜管（或通常稱 作離心管）來分離及提純核酸（DNA/RNA)。有一個或數個 膜設置於一管之底部，且可給該管内之空間充注液體。當 將液體載入該膜管内時，施加一適當力抽吸液體穿過底 膜’且隨後廢棄或收集該所抽吸之液體。通常，當在一離 心機上或常壓下操作該製程，當採用真空歧管時，用於抽 吸該液體穿過該等膜之所謂適當力可係離心力。 般而5，使用一氧化石夕膜離液技術之提純程序包含三 個步驟’即結合、清洗及洗脫。該等商品之手冊通常提供 兩種程序供操作者選擇。其一係離心方案，而另一係真空 方案。與真空方案相比，離心方案包含更多步驟且花費更 長時間’ 1因此其適於應對較小數量之試樣。然而，離心 方案係更加穩定’此乃因管内之液體在每一離心步驟後更 加几王地穿過該（等）膜，且幾乎無液體殘餘物留在管内。 另方面，真空方案較離心方案更易於操作且花費較少之 時間’且因此其適於應對較大數量之試樣。然而，真空方 ' :疋此乃因通常該管内之液體在每一真空程序後 ° 全地穿過該（等）膜，且似乎有更多液體留在管 H7495.doc 200907066 内。特定而言，在清洗步驟結束時，該殘留清洗液極可能 >可染下一洗脫步驟且導致經洗脫之核酸溶液含有該殘留清 洗液。因此，該污染可影響該等核酸之隨後應用。因此π 較佳在該清洗步驟之後施加一額外離心步驟以除去該殘留 清洗液。然而，由於可在一自動工作站容易地操作該真空 方案，因而該額外離心步驟將會導致整個程序甚至更加繁 瑣。 ’、 此外，用於二氧化矽離液技術之清洗液通常含有諸如酒 精等有機溶劑。使用清洗液之主要目的係在不影響該等核 西文與該膜之結合狀態之情形下移除該等不需要之雜質，而 使用洗脫緩衝液（通常係水或低鹽溶液）之主要目的係洗脫 結合在該膜上之核酸以使其能夠被收集並用於隨後應用 中。核酸之某些應用對少量有機溶劑敏感。舉例而言，若 用於聚合酶鏈反應（PCR)中之試劑含有少量酒精，其將對 PCR具有顯著抑制作用。或者，亦可加熱該膜管代替離心 來除去該膜管内之殘留有機清洗液。但必須將加熱條件調 節至最佳狀態。若二氧化石夕膜被過度加熱，其可能變得 過幹，而導致結合之核酸無法溶解於該洗脫緩衝液中。因 、、、《果可此減少核酸之良率。若該膜加熱不足，則不能 除去有機溶劑殘餘物。 因此針對真空方案之應用，尤其係針對自動化，設計一 種用於清洗一管之方法及一種用於萃取膜結合靶分子（諸 如一氧化發膜結合核酸、DNA或RNA)之方法，來除去有 機β洗液殘餘物而無需額外之離心步驟或加熱步驟係頗具 117495.doc 200907066 價值。 【發明内容】 本發明之一目的係提供一種適於真空方案之應用、尤其 適於自動化之清洗一管之方法，以便除去 丄 1文降云有機清洗液及/ 或雜質殘餘物。 本發明之另—目的亦係提供—種用於萃取膜結合把分子 之含有上述清洗方法之方法。

根據本發明，該清洗一管之方法的特徵在於：該二氧化 石夕膜管含有諸如核酸、DNA或RNA及雜f等膜結合乾分 且隨後α種具有一將該等膜結合把分子自該膜釋放 成液體游離形式之能力之清洗液（諸如洗脫緩衝液或水） 充注忒s，且最後，隨後將未透過該膜而留在該管内之清 洗液移除以為下一洗脫步驟留下一清潔膜管。 人根據本發明之另__態樣種用於萃取膜結合把分子之 含有以上清洗方法之方法包含以下步驟： a)製備一在其底端至少含有一個膜之管； )x 3有膜結合靶分子及雜質之溶液充注該管； c)抽吸該溶液透過該膜以使該等臈結合靶分子結合至该 膜且將該溶液排出該管； )x第一清洗液充注該管以移除該等雜質，同時仍俤 留結合在該臈上之該等膜結合靶分子； e)抽吸該第-清洗液穿過該膜且排出該管； 、’、有―將該等膜結合乾分子自該膜釋放成一液艘 游離形式之能力之第二清洗液充注該管； I17495.doc 200907066 g) 自該管之頂部移除該第二清洗液； h) 以-洗脫液充注該管以將該等膜結合乾分子自該膜釋 放成一液體游離形式；及 0抽吸該洗脫液穿過該膜且收集該洗脫液以回收該等膜 結合輕分子。 【實施方式】 々-管(或-離心管)中之—臈對於液體通常係半滲透且一 管在其底端具有至少-個膜。當給管充注一液體時，該液 體可又阻且通系保持約一或數分鐘。然而，由於渗透性之 影響’液體仍可向下流動且慢慢地穿過該膜。由於該現 象’當將-具有-將該等膜結合乾分子自該膜釋放成一液 體游離形式之能力之液體載入該管内時，一旦該液體將該 等結合乾分子溶解成一自由形式，該等結合乾分子將與因 滲透性而被下拉之液體一起被進一步帶入該膜内。此幾乎 未給該等自由乾分子留下向上移回至仍保留在該管内之液 體中之機會。因此’該膜將該等乾分子與保留在該管内之 液體隔開且可認為管内之液體幾乎不含有該等乾分子。 匕在膜管（諸如一二氧化矽或玻璃膜離心管）與靶 :子(諸如核酸、應或RNA)結合且含有雜質(諸如㈣ 物Π—清洗步驟後之有機清洗緩衝液或離液鹽殘餘 有—將該等㈣^分子自該膜釋放成— 私離形式之能力之清洗液(諸如水或一與該等靶分子 之隨後應用相容之洗脫緩衝液）載入該管内一旦該 液將該等結合纪分子溶解成_自 …月/ 曰由形式，戎等靶分子將與 H7495.doc 200907066 I’:：性'下拉之清洗液一起被進-步帶入該臈内。因 “膜將D亥等靶分子與保留在該管内之液體隔開。由於 =所有乾分子在該膜内或已穿過該膜，而大部分雜質仍 二於:亥清洗液中且保留在該管内。當將未穿過該臈之管 旦^洗液移除時，亦將—起移除該等㈣且幾乎無或極少 子損失掉’此隨後可有效地為隨後之洗脫步驟減少 前一清洗步驟（若存在）之污染。 i 種用於萃取膜結合乾分子之含有以上清洗方法 之方法可包含以下步驟·· a) 製備一至少含有一個膜11之管1〇; b) 給管10充注—含右胺；社人知a， 3有臈結合靶分子及雜質之溶液丨昭 圖 1A); ”、、 C)抽吸溶液12穿過膜11以使該等膜結合靶分子結合至膜 11並將溶液12排出管10(參照圖1B); d) 以第’肖洗液13(通常係有機的）充注管1〇以移除該等 雜質’同時仍保留結合在該臈上之該等靶分子(參照圖 1C); e) 抽吸第—清洗液13穿過膜11且排出管HK參照圖1D); f) 以-具有-將該等膜結合靶分子自該膜n釋放成_液 體游離形式之能力之第二清洗液14(諸如一洗脫緩衝液 或水）充注管10(參照圖1E); g) 自管10之頂部移除第二清洗液丨4(參照圖1F); h) 以-洗脫液15充注管1〇以將該等靶分子自該_釋放 成一液體游離形式（參照圖1G); 117495.doc 200907066 1)抽吸洗脫液15穿過膜11且收集該洗脫液以回收該等膜 結合靶分子（參照圖1H)。 實驗： 根據真空方案使用QIAGEN QIAamp DNA血液試劑盒提 純基因組DNA。簡言之，將一 5毫升試管中之一 17毫升血 樣與170 μΐ QIAGEN蛋白酶及1.7毫升緩衝液AL混合，然後 在56°C下培育16分鐘，將1.7毫升乙醇加至該試樣，且再 藉由脈衝渦流混合20秒，然後將630 μΐ等分至8個QIAamp 離〜言内’繼續該等清洗步驟。在該清洗步驟結束時，稱 重每一離心管以近似地估算該管内之殘留清洗液量；離心 管之平均重量較其原始重量增至25毫克+/- 2毫克。然後， 將該等八管試樣分為四組： 1. 在組I中，在未進一步移除該管内之殘留清洗緩衝液 之情況下，將200 μΐ洗脫緩衝液（AE)施加至該等離心 管’然後藉由一離心步驟洗脫該基因組DNA。 2. 在組II中，包括一額外離心步驟來移除該管内之殘留清 洗液’然後再次稱重該離心管，該管内約20毫克殘留 清洗液藉由離心移除。然後，加入2〇〇 μΐ洗脫緩衝液 (ΑΕ)且藉由其他離心步驟洗脫該基因組DNA。 3_在組III中，將85〇 μ1水加至該離心管内，且然後立即移 除。最後，加入200 μΐ洗脫緩衝液（ΑΕ)且藉由離心洗脫 基因組DNA。 4·在組IV中，將850 μΐ洗脫緩衝液（ΑΕ)加入該離心管内， 且然後立即移除。最後，加入200 μΐ洗脫緩衝液（ΑΕ)且 117495.doc -10- 200907066 藉由離心洗脫基因組dna。 藉由光譜計來確定每一試樣之DNA量（O.D.260)以估算 核酸之良率。此外，採用使用QuantiTect SYBR Green PCR 套組（QIAGEN)之定量PCR(QPCR)，藉由GAPDH之擴增及 檢測來評價不同清洗方法對QPCR之影響；將來自每一試 樣之含有基因組DNA之15 μΐ洗出液與含有引物之35 μΐ QPCR主要試劑混合。結果列於以下表1中。 表1 組 試樣 良率(OD260) QPCR 之 α I 1 6.5 μβ 27.0 2 6.8 μβ 27.5 II 3 6.6 22.8 4 6.7 pg 23.0 III 5 7.0 μβ 22.8 6 6.4 μβ 23.0 IV 7 6.7 μ8 22.9 8 6 6 μβ 22.9

C 自表一可看出’四組之收率均彼此接近，因此，本發明 之方法未減少核酸製備之良率，而加入及移除額外之清洗 液（諸如洗脫緩衝液AF或水）具有自二氧化矽膜釋放該核酸 之能力。此外，對使用QPCR之前一清洗步驟之該等管内 殘留清洗液之抑制效應的分析顯示，在未移除該等管内之 殘留清洗液之情況下組I具有約27之Ct值，而使用離心來 移除該管内之殘留清洗液之組Η具有約23之Ct值。該結果 明顯顯示由於基因組DNA與該等管内之殘留清洗液之相互 洗脫之QPCR抑制效應。組π〗及組1¥中qPcr之(^值均係約 117495.doc 200907066 23且接近組„之〇值’此顯示本發明之方法可有效地移除 前一清洗步驟之該等管内之殘留清洗液。 總之，本發明提供於清洗—管之方法及—種用於 萃取臈結合乾分子之方法，其特徵在於將一洗脫緩衝液、 水或甚至任-期望緩衝液用作一額外清洗液來移除前一清 ·’ ❹驟之該管内之雜質或殘留清洗液。在易於操作，尤其 1 胃於自動化的同時’本發明可取代在該傳統清洗步驟與該 &脫步驟之間的上述額外離心或加熱步驟而不減少使用- m管或一離心管之二氧化矽臈離液技術之靶分子(核酸)良 率〇 雖然已依據-較佳實施例來闡述本發明，但彼等熟習此 項技術者應認識到可以隨附申請專利範圍之精神及範圍内 之修改來實行本發明。 【圖式簡單說明】 …口附圖參閱本發明之較佳實施例之以上詳細闡述會瞭 υ 解本發明之其他目的、優點及新穎特徵，附圖中： 圖1Α圖解說明根據本發明一較佳實施例之方法之一步 驟； ，.圖1Β圖解說明根據本發明一較佳實施例之方法之一步 . 驟； 圖ic圖解說明根據本發明一較佳實施例之方法之一步 驟； 圖1D圖解„兒明根據本發明一較佳實施例之方法之一步 驟； 117495.doc 12· 200907066 圖1E圖解說明根據本發明—較佳實施例之方法之一步 驟； 圖1F圖解說明根據本發明—較佳實施例之方法之一步 驟； 圖1G圖解說明根據本發明—較佳實施例之方法之一步 驟；及 圖1Η圖解說明根據本發明—較佳實施例之方法之一步 驟。 【主要元件符號說明】 10 管 11 膜 12 溶液 13 第一清洗液 14 苐一清洗液 15 洗脫液 117495.doc -13-

Claims (1)

1. 200907066 十、申請專利範圍： -，清洗一含有至少一個膜、雜質及膜結合靶分子 之官之方法’其特徵在於： 將:具有-將該等膜結合把分子自該膜釋放成_液體 離形式之能力之清洗液載入該管内且 :除未穿過該膜而留在該管内之清洗液以有效地移除= '内之雜質。 如哨求項1之方法’其中該膜係一二氧化矽或玻璃膜。 f 3.如凊求項i之方法，其中該等靶分子係核酸、DNA威 RNA。 4. 如請求们之方法，其中該清洗液係—洗脫緩衝液。 5. 如請求項丨之方法，其中該清洗液係水。 6. 一種用於萃取膜結合靶分子之方法，其包含以下步驟： a) 製備—在其底端含有至少一個膜之管； b) 以—含有該等膜結合靶分子及雜質之溶液充注該管； 「 c)抽吸該溶液穿過該膜以使該等臈結合靶分子結合裘該 膜且將該溶液自該管排出； d) 以第一清洗液充注該管以移除該等雜質，同時仍保 留結合在該膜上之該等膜結合靶分子； e) 抽吸該第一清洗液穿過該膜且排出該管； f) 以具有一將忒專臈結合把分子自該膜釋放成一液體 游離形式之能力之第二清洗液充注該管； g) 自該管之頂部將該第二清洗液移除； h) 以一洗脫液充注該管以將該等膜結合靶分子自該膳釋 117495.doc 200907066 放成一液體游離形式；及 Ο抽吸該洗脫液穿過該膜且收集該洗脫液以回收該等膜 結合靶分子。 7. 如請求項6之方法，其中該膜係一二氧化矽或玻璃膜。 8. 如請求項6之方法，其中該等靶分子係核酸、DNA或 RNA。 / 9·如請求項6之方法，其中該第一清洗液係有機物。 1〇·如請求項6之方法’其中該第二清洗液係—洗脫緩衝 液。 11.如請求項6之方法，其中該第二清洗液係水。 117495.doc