TW200909578A - Raccoon poxvirus expressing genes of porcine virus - Google Patents

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TW200909578A
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Stephen Qitu Wu
Michael A Gill
Hsien-Jue Chu
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Wyeth Corp
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Description

200909578 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於表現豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV)單 獨或其與豬環狀病毒（PCV)之組合之基因的新穎重組浣熊 痘病毒載體及其作為疫苗在由PCV及/或PRRSV所引起之疾 病預防中的用途。 【先前技術】 豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV)係正鏈RNA病毒，其 係動脈病毒科（Arteriviridae)動脈病毒屬（genus Arterivirus) 家族之成員。PRRSV感染豬，引起最初於1987年在北美檢 測到之"神秘豬疾病”，隨後該疾病在1990年傳播至並傳遍 歐洲。自1990年以來，PRRSV已成為豬產業之主要全球性 威脅，給豬群造成嚴重生產損失。 現稱為豬繁殖與呼吸症候群（PRRS)之神秘豬疾病（亦稱 為藍耳病、豬流行性流產及呼吸症候群（PEARS)或呼吸症 候群（SIRS))的特徵在於妊娠母豬之繁殖障礙，此導致妊娠 期之最後階段期間異常高數量流產、厭食症、死產、乾癟 胎兒、母豬分娩後呼吸問題及仔豬虛弱（出生之後不久即 死於呼吸系統疾病或二次感染）。在仔豬中，感染PRRSV 造成呼吸窘迫及可能高達70%及更高仔豬死亡率之高死亡 率。年長豬可能顯示呼吸系統疾病或二次感染之輕微體 徵。該病毒在豬群體中快速傳播，且畜群中高達95%的豬 在最初感染後兩個至三個月内可能變成血清陽性。即使感 染已經穩定化，亦存在藉由排菌幼小雌豬散佈之PRRSV將 131329.doc 200909578 感染妊娠母豬及再次發生繁殖問題的強烈可能性。PRRS 對豬飼養畜群之經濟影響相當大。 起因於神秘豬疾病，首先在荷蘭分離出之PRRSV被稱為
Lelystad病毒（LV)(G. Wesvoort等人，乂61卩1^1^办3:121- 13〇(1991))。其後不久’在西班牙發現不同之Olot分離株 (Plana等人，Vet. Microbiol.，33:203-21 1，1992)。隨後， PRRSV之新穎分離株已在若干公開案中予以闡述（參見， 例如’歐洲專利申請案第〇 529 584 A2號、WO 93/062 1 1及 WO 93/07898)。 其他公開案揭示PRRS病毒分離株之結構特徵，例如全 部 Lelystad 病毒（LV)基因組（J.J.M. Meulenberg 等人，
Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV" * Virology 192: 62-72 (1993))；
Tubingen(德國）PRRS病毒分離株（TV)基因組之區段（K_K
Cozelmann 等人，"Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the Arterivirus group”，Virology 193: 329-339 (1993))及允 許基因選殖及測序之其他分離株。 通常而言，動脈病毒之病毒粒子直徑為50-70 nm且含有 同質異構（很可能為二十面體）核衣殼，該同質異構核衣殼 之直徑為35 nm，由緊密黏附之包膜圍繞且具有蜂巢狀表 面結構。基因組由單個線性正義SSRNA(尺寸為13-15 kb)分 子組成。PRRS病毒之尺寸為50-60 nm ’在核衣殼内含有約 I31329.doc 200909578 30-3 5 nm之包膜及單個RNA分子。PRRSV之基因組RNA約 為15 kb(15 000個鹼基對）。該基因組編碼RNA複製酶 (ORFla及ORFlb)、糖蛋白GP2至GP5、整合膜蛋白Μ及核 衣殼蛋白N(ORF 2至7)。基因組RNA係經由全長反義複製 中間體合成。 PRRSV基因組之單鏈RNA分子在3’末端含有聚腺苷酸尾 (poly-A tail)。該結構含有7個編碼病毒蛋白之開放讀碼框 (ORF)。ORF1至ORF7在其之間顯示小重疊區段。病毒蛋 (、 白之合成係自具有不同長度亞基因組轉錄物（mRNA)但具 有相似之3'聚腺苷酸化末端、及源自非編碼5'末端序列之5’ 前導序列的群組產生。該病毒蛋白表現形式視為巢式 mRNA且先前已對冠狀病毒予以闡述（W. J. M. Spaan等 人，J. Gen. Virol. 69:2939-2952 (1988))。基於 Lelystad (LV)及Tubingen (TV) PRRSV病毒分離株核苷酸序列且藉 由與用其他動脈病毒所觀察到者同源，吾人已提出在病毒 基因組中，ORFl(a及b)編碼病毒聚合酶及複製酶。ORF2 U 至ORF6編碼病毒包膜蛋白，且ORF7編碼核衣殼蛋白。病 毒複製酶及聚合酶係大尺寸蛋白，分別為260及163 kDa， - 且兩者均含有三個可能之糖基化位點。位於3 ’末端之包膜 . 蛋白（ORF 2至6)較小，介於30與19 kDa之間。所有該等皆 含有兩個以上可能的糖基化位點，尤其ORF3含有7個位 點。所有該等蛋白皆在胺基（N-)及羧基（C-)末端含有疏水 性序列，其可作為前導序列及膜錨著點。通常而言，其為 疏水性蛋白，此與其與膜相關聯之位置一致。ORF6具有3 131329.doc 200909578 個位於在N-末端之90個胺基酸殘基内之疏水性區段。藉由 QRF7編碼之蛋白（可能對應於病毒核衣殼）與在N-末端之精 胺酸、離胺酸及組胺酸殘基一起極為鹼性。LV及TV病毒 聚合酶、結構蛋白及核衣殼之胺基酸序列與LDV病毒相比 顯示介於29°/。與67%之間之一致性且與EAV病毒相比顯示 介於20%與3 6%之間之一致性。 ' 由PRRSV引起之疾病係造成全球豬產業嚴重損失之原 因。為此，人們已研究開發能夠預防由PRRSV引起之感染 〇 的疫苗。以前疫苗研發之原理係PRRSV可在宿主細胞（豬） 之基本肺泡巨噬細胞及在猴腎細胞系中生長之事實。在很 大程度上，已在 WO 92/21375、WO 93/0621 1、WO 93/07898及西班牙專利第P930 1973號中闡述之抵抗PRRSV 的先前疫苗係自在巨噬細胞上生長之病毒獲得並隨後經不 活化之習用疫苗。揭示該等疫苗能夠避免豬繁殖與呼吸症 候群（PRRS)並預防母豬繁殖變異。 亦對豬興隆具有重要意義者係另一種廣泛傳播之稱為斷 乳後多系統消耗性症候群（PMWS)的疾病。PMWS( —般影 響約5-1 8週齡之斷乳仔豬）以流行比例對豬造成當前或潛在 - 之健康威脅並嚴重影響全球豬產業之經濟利益。PMWS之 . 臨床體徵由漸進性體重損失、呼吸困難、呼吸急促、貧 血、腹瀉及黃疸組成。儘管在斷乳仔豬中更為普遍，但該 衰弱疾病可影響包括豬、公豬及成年豬之豬家族的任何動 物。死亡率可自1 %至2°/。不等，且在一些複雜情形下全世 界死亡率可高達40%。已確定豬第二型環狀病毒（通常稱為 131329.doc 200909578 PCV-2)係PMWS之主要致病因子（G· M. Allan等人，"Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes”，Vet. Rec·，第 142 卷，第 467-468 頁，1998 ; G. M. Allan 等人，"Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe" ’ J. Vet. Diagn· Invest.，第 10 卷，第 3」0 頁， 1998) ^因此，在商業豬事務内，通過研發抵抗 PCV2(PMWS之病原體）之有效疫苗以對具有危險之動物實
施大規模疫苗接種來預防豬家族中PMWS發作係重要目 標。 美國專利第6,217,883號（與法國專利第2,7S1，159B號相 當）係關於5種經分離之PCV株及其與至少一種豬細小病毒 抗原之組合在多價免疫原性組合物中的用途，該等v株 係來自自加拿大、加利福尼亞及法國感染PMWS之豬取樣 之肺部或神經節樣品。藉由由〇RF1至〇RF13組成之PC” 開放讀碼框（ORF)編碼之蛋白質在該專利中予以粗略闡 述，但無展示免疫原性特性之任何具體蛋白質之例證。該 專利揭示由DNA質粒、線性DNA分子及含有並在活體㈣ 現編碼PC V抗原之核酸分子的重組病毒組成之載體。 美國專利第6,368,6〇1號係關於自肺部或神經節樣品分 之:穎豬隸病毒株，料肺部或神經節樣品係、自= =多系統消耗性症候群（PMWS)侵襲之農場獲得j體 言’該專利闡述該等株之純化製備品、習用減毒疫苗： 活化疫苗、重組活疫苗、質粒疫苗及亞單位疫苗以及:式 I31329.doc •10· 200909578 及診斷方法。該專利進一步揭示包含經分離之DNA分子序 列之載體，該等經分離之DNA分子序列可用於在活體外表 現載體中產生亞單元或用作擬整合至病毒或質粒型活體内 表現載體中之序列。該專利粗略闡述豬皰疹病毒、豬腺病 毒或痘病毒且更具體而言奥傑士基氏病（Aujesky's disease) 病毒、牛痘病毒、鳥痘病毒或豬痘病毒之載體。 先前，某些豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV)基因 (ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7)已在不同載 體系統中表現：桿狀病毒、僞狂犬病病毒、TGEV及質粒 DNA。所有該等表現系統皆受能夠在一個病毒構建體中表 現僅一個或兩個開放讀碼框限制。 例如，美國專利第5,888,5 1 3號係關於豬繁殖與呼吸症候 群（PRRS)之致病病毒之重組蛋白，其與PRRSV西班牙分離 株（PRRS-Olot)之ORF2至ORF7相對應，其已在桿狀病毒表 現系統中使用Sf 9(草地貪夜蛾昆蟲 細胞）細胞培養物作為容許宿主產生。該專利闡述適於調 配能夠保護豬家畜免於PRRS之疫苗且適於製備用以檢測 抗-PRRSV抗體以及豬生物樣品中之PRRSV之診斷套組的 重組蛋白。具體而言，該專利係關於包含重組桿狀病毒之 重組表現系統及表現來自至少一種經分離之核苷酸序列之 經分離的病毒亞單位蛋白之方法，該至少一種經分離之核 苷酸序列係選自由來自桿狀病毒轉移載體之PRRS_〇l〇ty> 離株之ORF2至〇RF7組成之群。該專利亦闡述含有至少_ 種重組PRRSV蛋白之重組疫苗。 131329.doc 200909578 存在大里關於用於表現豬抗原且用作疫苗之重組浣熊痘 病毋主題的出版資訊。例如，美國專利第號揭示 種重組》元知癌病毒（RCNV)載體，其使豬繁殖與呼吸症 候群病毋（PRRSV) '豬流感病毒血球凝集素（SIV ΗΑ)、豬 /瓜感病毋神經胺酸酶（SIV ΝΑ)及豬細小病毒（ρρν)之開放 °貝馬框（〇RF)之一個或兩個外來DNA序列（例如PRRSV之 〇RF2_7中的一個）傲入淀熊痘病毒基因組之"U”基 區域 HindUl Μ"基因組區域或基因組區 域内之非必需區域中。在該專利中浣熊痘病毒病毒基因組 闡述為在該病毒基因組之浣熊痘病毒宿主範圍基因中含有 缺失。5亥專利藉由向浣熊痘病毒基因組中礙入外來Dna序 列提供產生重組浣熊痘病毒之同源載體。在該等實例中， 該專利僅顯示如何預備將外來DNA嵌入//hc/rn ”u”基因組 區域中。DNA序列分析顯示，該等專利權所有人所揭示之 "U”基因組區域並非重組浣熊痘病毒基因組之血球 凝集素（Ζζα)嵌入及/或胸苷激酶（α)區域。 美國專利第7,109,025號揭示使用重組豬腺病毒之病毒載 體及疫苗。具體而言，該專利闡述活體内複製及包含異源 核苦酸序列之重組豬腺病毒，該異源核苷酸序列在能夠使 豬腺病毒在活體内複製並表現所嵌入異源核苷酸序列之條 件下嵌入豬腺病毒中。該專利進一步闡述使用來自豬腺病 毒（PAV)血清型3或5(PAV-3或PAV-5)之腺病毒基因組並嵌 入異源核苷酸序列，該異源核苷酸序列編碼至少一種在位 於主要晚期啓動子（MLP)下游之PAV-3或PAV-5基因組之 131329.doc •12- 200909578 E3區域的非必需區中之產物。該專利㈣關於包含所有或 部分參考核芽醆序列之DNA片段。顯示重组pAv載體可表 現選自由下列組成之群之豬病原體：偽狂犬病病毒、豬流 感病毒、豬繁殖與呼吸症候群病毒、細小病毒病毒、豬霍 • 亂病#、豬第二型環狀病毒、胸膜肺炎放線桿菌 (Actmobacillus pIeur〇pneum〇niae)及豬肺炎黴漿菌 (Mycoplasma hy〇pneumoniae)。 錢專利第M97,883號涉及含有來自豬第二型環狀病毒 Ο 之外來DNA之重組癌病毒（例如鳥痘病毒）的用途與治療或 預防由豬第二型環狀病毒引起之疾病的方法。具體而言， 该專利之重組痘病毒包含由豬第二型環狀病毒之丄至 13組成之經分離的DNA分子，其中該重組痘病毒係重組 ALVAC金絲雀痘病毒。 美國專利第7,211，379號係關於藉由藉助投與包含pcv_2 抗原之免疫原性組合物誘導抵抗PCV_2之免疫反應來降低 〇 #中豬第二型環狀病毒（pCV-2)之病毒負荷的方法。該專 利將該抗原闡述為含有外源pcv_2核苷酸序列之載體，其 中該PCV-2核苷酸序列編碼並表現〇RF4、〇RFi3或〇rf4 & ORF13。在該專利中所示之一些實施例中，免疫原性組 • 合物包括一或多種額外豬病原體。在該專利所揭示之方法 中所用之組合物另外包含至少一種來自至少—種額外緒病 原體之免疫原或表現該免疫原之载體，其中該額外豬病原 體係選自由下列組成之群：pRRS、豬肺炎黴漿菌、胸膜 肺k放線才干ig大腸桿菌（五sc/zer/c/n’a co/z·)、萎縮性鼻 131329.doc -13- 200909578 火、偽狂犬病、豬霍亂、豬流感、腦心肌炎病毒及ppv。 該專利中所揭示之载體包含DNA載體質粒、諸如大腸桿菌 等細菌、諸如以下等病毒：桿狀病毒、包括豬皰疹病毒或 奥保士基氏病病毒（僞狂犬病）之炮療病毒、包括豬腺病毒 之腺病毋及包括牛痘病毒、鳥痘病毒、金絲雀痘病毒、浣 知殖病毒及豬痘病毒之痘病毒。 美國專利第6,241，989號及其續篇美國專利第7,087,234號 之揭不内容涉及含有一種以上嵌入胸苷激酶基因或血球凝 集素基因中之外源基因的多價重組浣熊痘病毒。在該兩個 相關專利中所揭示之内容係該等多價重組浣熊痘病毒作為 疫苗來賦予貓抵抗隨後貓病原體之攻擊之免疫性的用途。 亦揭示藉由重組過程製造多價重組浣熊痘病毒之方法，該 重組過程涉及構建外源基因嵌入其中之嵌入載體；及使嵌 入基因之側翼係可重組至浣熊痘病毒胸苷激酶基因或血球 凝集素基因中之序列；肖易感染之宿主細胞中引入含有該 等外源基因之嵌入載體及浣熊痘病毒二者；及自所得蝕斑 中選擇重組淀熊殖病毒。該等專利之多價重組淀熊疫病毒 I在描細胞中感染並複製，且含有一個以上I人非病毒複 製所必需之由淀熊癌病毒基因，组之血球凝集素I因或胸苦 激酶基因組叙區域+料絲因，值得注意的是，其中 該等外源基因可操作地與用於表現之啓動子連接；且每一 外源基ID編碼猶病原體抗原。該等專利闡述編碼諸如以下 等描病原體抗原之外源基"白血病病毒(嫩Env)、 貓免疫缺陷病毒(FIV Gag)、貓免疫缺陷病毒㈣㈣、 I3I329.doc -14 - 200909578 I苗傳染性腦膜炎病毒（FIPV M)、描傳染性腦膜炎病毒 (FIPV N)、描杯狀病毒（FCV衣殼蛋白）、猫泛白細胞減少 症病毒（FPV VP2)及狂犬病_G。 除獸醫疫苗技術中所作之所有努力外，業内仍公認需要 可充分地保護豬不受一或多種病毒感染之安全且有效的單 價或多價PCV及/或酿SV重組疫苗，要通過投與能夠 給予豬抵抗PMWS及/或pRRS之充分保護性免疫反應的重 組疫苗來預防由PCV及/或PRRSV引起之感㈣疾病的安全 且有效之方法。在投與豬後除獲得安全性及功效外，藉由 該重組疫苗亦將獲得優於習用不活KPRRSV疫苗之其他益 處’即消除意外感染游離病毒或回復至其病原性狀態之不 活化病毒之風險。顯然，研發安全且有效之以淀熊癌病毒 為載體之豬疫苗在使用時將達成重要優點，其可預防嚴重 ，、確保疫苗生產期間雇員安全且完全消除病原性病 f未亡不活化之任何機會及商業生纟_所用之去污染程 序。 、 本說明書中所引用之所有專利及出版物的全文皆以引用 方式併入本文中。 【發明内容】 在本發明之最廣泛態樣中，本發明提供安全且有效之重 、、且痘病母载體疫苗，其中該載體表現-或多種藉由一或多 種豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV)分離株編碼之抗原蛋 白’較佳為藉由h及/或雜因座處之—或多種豬繁殖斑呼 吸症候群病毒（PRRSV)分離株之多個開放讀碼框單獨或其 131329.doc -15- 200909578 與一或多個豬第二型環狀病毒（pcv_2)之開放讀碼框之組 S爲馬的抗原蛋白。在特定實施例中，該載體進—步包含 編碼帶有FeLV P27+表型之描白A病病毒之糖蛋白的核酸 分子。FeLVP27stpcv_2衣殼基因可用作篩選不同組合中 之純系的單標籤。本發明亦提供藉由向需要保護之豬投與 強效新穎重組疫苗來保護豬抵抗斷乳後多系統消耗性症候 群及/或豬繁殖與呼吸症候群之方法。
口此本發明之第一態樣提供包含一或多個編碼豬繁殖 與呼吸症候群病毒（PRRSV)蛋白之外源核酸分子的重組浣 熊痘病毒載體（rRCNV)，其中： a. )將至少一個核酸分子嵌入該浣熊痘病毒基因組之血 球凝集素基因座或胸苷激酶基因座中；或 b. )將至少兩個核酸分子嵌入該浣熊痘病毒基因組之血 球凝集素基因座或胸苷激酶基因座中；或 c. )將至少一個核酸分子嵌入血球凝集素基因座中且將 至少一個核酸分子嵌入該浣熊痘病毒基因組之胸苷 激酶基因座中；或 在一個實施例中，該浣熊痘病毒載體包含至少兩個嵌入 血球凝集素基因座中之核酸分子及至少兩個嵌入浣熊痘病 毒基因組之胸苷激酶基因座中之核酸分子。 在一個實施例中，該重組浣熊痘病毒載體進一步包含除 被入）完熊痙病毒基因組之胸苷激酶及血球凝集素基因座中 外亦嵌入淀熊痘病毒基因組之第三非必需位點中之編碼豬 繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV)蛋白的核酸分子。重組淀 131329.doc 16 200909578 熊痘病毒基因組之任何非必需位點皆可涵蓋用於本發明。 在一個實施例中，該淀熊痘病毒基因組之第三非必需位 點係絲胺酸蛋白酶抑制劑位點。 在一個實施例中，一或多個外源核酸分子之每一者皆編 碼一或多個豬繁殖與呼吸症候群病毒之開放讀碼框。該等 開放讀碼框係選自由ORF1、ORF2、〇rf3、ORF4、 ORF5、ORF6、ORF7及其組合組成之群。 在一個實施例中，該痘病毒載體編碼相同豬繁殖與呼吸 症候群病毒蛋白之至少兩個拷貝。該相同蛋白之該兩個拷 貝可藉由兩個不同核酸分子編碼，或其可藉由相同核酸分 子編碼。該相同蛋白之該兩個拷貝可與一個啓動子可操作 地連接，或該相同蛋白之該兩個拷貝可與單獨啓動子可操 作地連接。該相同蛋白之該兩個拷貝可藉由選自由 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、〇RF6、ORF7及其 組合組成之群之豬繁殖與呼吸症候群病毒開放讀碼框編 碼。 在一個實施例中，將兩個或更多個核酸分子嵌入該浣熊 癌·病毒基因組之血·球凝集素基因座及/或胸普激酶基因座 中〇 在一個實施例中，兩個或更多個外源核酸分子編碼至少 兩個選自由下列組成之群之豬繁殖與呼吸症候群病毒的開 放讀碼框：ORF5-ORF6、ORF5-ORF6-ORF7、ORF3-ORF5-ORF6 、 ORF3-ORF4-ORF7 、 ORF3-ORF4-ORF5-ORF7 、 ORF3-ORF4-ORF6-ORF7 及 ORF3-ORF4-ORF5- 131329.doc 17 200909578 ORF6-ORF7。 在一個實施例令’豬繁瘦與呼吸症候群病毒係ISU12 (Iowa)、〇l〇t/91(西班牙）或二者。 在一個實施例中，該重組浣熊痘病毒载體進一步包含編 碼豬第二型環狀病毒（PCV2)之開放讀碼框（〇RF)的核酸分 子。 在個實施例中’諸環狀病毒2開放讀碼框係〇rf2。 在—個實施例中，可將PCV2 ORF2單獨嵌入該浣熊痘病 毒基因組之胸苷激酶基因座中。 在一個實施例中，該重組浣熊痘病毒載體進一步包含編 碼貓白血病病毒P27+表型之糖蛋白的核苷酸序列。 在一個實施例中，浣熊痘病毒係活病毒且可複製。 本發明之第二態樣提供包含免疫有效量之一或多種任何 本文所述重組淀熊痘病毒載體及視情況適宜載劑、稀釋劑 或佐劑之重組豬疫苗。 在個實把例中，邊重組豬疫苗包含免疫有效量之兩種 〆夕種本文所述之重組淀成痘病毒載體及視情況一種適宜 載劑或稀釋劑。 在個實施例中，浣熊痘病毒係活病毒且可複製。 在個實施例中，該疫苗不含佐劑。 在一個實施例中，該疫苗係以單次劑量或重複劑量投 與。 在一個實施例令，該重組豬疫苗進一步包含至少一種其 原°亥其他豬抗原係選自由下列組成之群··豬肺炎 131329.doc •18- 200909578 被漿囷抗原、副豬嗜血桿菌抗原、 多权巴斯德囷（/^sieMre/Za mw/iocWa)抗原、豬鏈球菌 (S^epiococcM mb)抗原、胸膜肺炎放線桿菌抗原、支氣 苔敗血性博德特菌（·δ〇^Άίβ//α △rcmchi^pi/ca)抗原、豬霍 亂沙門氏菌（6^//770/^//(3 c/zo/eraeiMZ’s)抗原、豬丹毒桿菌 [Erysipelothrix rhusiopathiae)机增、、钩端螺、爽馥細菌 (lept〇spira bacteria)抗原、豬流感病毒抗原、豬細小病毒 抗原、大腸桿菌抗原、豬呼吸冠狀病毒抗原、輪狀病毒抗 原、奥傑士基氏病之致病病原體抗原、豬傳染性胃腸炎抗 原及其組合。 本發明之第三態樣提供一種誘發抵抗豬繁殖與呼吸症候 群病毒之免疫反應的方法，其包含向豬類動物投與由一或 多種本文所述之重組浣熊痘病毒載體構成之重組豬疫苗。 在一個實施例中’該免疫反應係體液或抗體介導之反 應。在一個實施例中’該免疫反應係細胞介導或T細胞介 導之免疫反應。 在一個實施例中，該保護性免疫反應係由投與介於約 4·5 Logi〇TCID50/ml 至約 7.5 Log丨0TCID50/ml範圍内之疫苗 劑量誘發。 在一個實施例中，用於誘發免疫反應之重組豬疫苗包含 一或多種活的且可複製之重組浣熊痘病毒載體。 在一個實施例中，用於誘發免疫反應之重組豬疫苗包含 兩種或多種活的且可複製之重組浣熊痘病毒載體。 本發明之第四態樣提供一種預防豬繁殖與呼吸症候群及 131329. doc -19- 200909578 斷乳後多系統消耗性症候群 猪類動物投與包含免疫有效 淀熊痘病毒载體及視情況一 重組豬疫苗。 之方法’ Λ包含向需要保護之 ϊ之-或多種本文所述之重組 種適宜載劑、稀釋劑或佐劑之 在一個實施例中 體且可複製。 或該等重組⑦熊痘病毒载體係活 载
本發明之第五態樣提供本發明之任何載體或疫苗的用 途，其係用於製備用以誘發對哺乳動物豬類病毒之保護性 免疫反應或預防哺乳動物豬繁殖與呼吸症候群及/或斷乳 後多系統消耗性症候群的藥劑。 【實施方式】 在闡述本發明方法及治療方法學之前，應瞭解本發明並 不限於所述特定方法及實驗條件，因為該等方法及條件可 以變化。亦應瞭解，本文所用之術語僅出於闡述特定實施 例之目的而非意欲限制本發明之範圍，因為本發明之範圍 僅受限於隨附申請專利範圍。 除非上下文另外明確指出，否則本說明書及隨附申請專 利範圍中所用之單數形式"一（a、an)"及,,該（the)"包括複數 個指不物。因此，例如，”該方法"之指示物包括一或多種 方法及/或本文所述類型步驟及/或在閱讀該揭示内容後彼 等熟習此項技術者顯而易見者等等。 因此’在本申請案中，可使用熟習此項技術者所熟知之 習用分子生物學、微生物學及重組DNA技術。文獻中對該 等技術進行了充分闡釋。參見，例如，Byrd，CM及Hruby, 131329.doc -20- 200909578 ΏΕ、Methods in Molecular Biology ’ 第 269 卷 ’· Vaccinia
Fz.rw PoxWro/o幻/，第 3 章，第 31-40 頁；Sambrook’
Fritsch & Maniatis > Molecular Cloning: A Laboratory Mcrnwi?/，第二版（1989)，冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，紐約（本文中 "Sambrook 等人，1989") ; DTVJ CVom.wg·.. J Jpproac/z，第 I 及 II 卷（D.N· Glover 編輯，1985);
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Higgins編輯 ’（1984)) ; jm.ma/ Ce// Cw"wre(R.I. Freshney 編輯 ’（1986)) ; /mwo6z7/zed Ce/k 五似押 eiS (irl 出版 社 ’（1986)) ; Β· Perbal，3 Prachca/ GwWe Γο Mo/ecw/ar (1984) ; F.M. Ausubel 等人（編輯）’
Pr心cob Mo/ecw/w 5/o/og>>，J〇hn Wiley & 5〇則公司 (1994) ° 儘管任何類㈣等效於彼等本文所述者t方法及材料皆 可用於本發明之實踐或測試中，❽目前所述 材料。本文所提及之所有出版物之全文皆以引用方式併入 本文中。 定義 方便及完整起見 ，、有彼等沾習此項技術者所公認及習知 本文所用之術語 之含義’然而，為 其含義予以闡明。 下文將對特定術語及 131329.doc •21 200909578 術語"約”意指在20%内，更佳在1〇%内且更佳在5%内。 術語"佐劑”係指可增強對抗原之免疫反應之化合物及混 合物。佐劑可用作緩慢釋放抗原之組織庫且亦可用作非特 /、I·生e強免疫反應之淋巴樣系統激活劑等人， /__/切，第二版’ 1984，㈣—喂:— Park，加利福尼亞，第384頁）。端視環境而定，在無佐劑 存在下單獨用抗原實施基本攻擊可能不能引發體液或細胞 免疫反應。佐劑包括但不限於完全弗氏（Freund,^佐劑、 不完全弗氏佐劑、皂苷、諸如氫氧化鋁等礦物凝膠、諸如 溶血卵磷脂等表面活性物質、普流尼克(P — )多元醇、 聚陰離子肽、油或煙乳液、鑰孔蟲戚血蘭素、二硝基笨 酚及潛在有用之人類佐劑，例如BCG(卡介苗 及短小棒狀桿菌（c—如⑺·謂 。較佳地，佐劑係醫藥上可接受之佐劑。 術語"抗原"係指可在動物中刺激抗體產生或了_細胞反應 之化合物、組合物或免疫原性物質，包括注射或吸收至動 物中之組合物。該術語可用以指單個大分子或指抗原性大 分子之均質或非均質群體.抗原與特定體液或細胞免疫之 產物反應。術語”抗原”廣義上涵蓋包括蛋白 '多肽、抗原 蛋白片段、核酸、寡糖、多糖、有機及無機化學品或組合 物及諸如此類之部分。而且，抗原可自任何病毒、細菌、 寄生蟲、原生動物或真菌衍生或獲得，且可為整個生物 體。術語”抗原”包括所有相關抗原決定部位。類似地，表 現抗原之募核苷酸或聚核苷酸（例如在核酸免疫應用中）亦 131329.doc -22- 200909578 包括於該定義中。亦包括合成抗原，例如，多抗原決定部 位、側翼抗原決定部位及其他重組或合成衍生抗原 (Bergmann等人，（1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 2781 ; Bergmann 等人，（1996) J. Immunol. 157:3242 3249 ； Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75:402 408 ； Gardner 等人，（1998)第 12 屆世界 AIDS 會議，Geneva， Switzerland，1998 年 6 月 28 日至 7 月 3 日）。 "藉由…編碼"或”編碼"係指編碼多肽序列之核酸序列， * 其中該多肽序列含有具有至少3個至5個胺基酸、更佳至少 8個至10個胺基酸、且甚至更佳至少15個至2〇個胺基酸之 胺基酸序列’多肽藉由該核酸序列編碼。亦涵蓋可與藉由 多肽序列編碼之多肽在免疫學上視為一致之該多肽序列。 因此’抗原"多肽π、”蛋白質”或”胺基酸”序列可與抗原之 多肽或胺基酸序列具有至少7〇%相似性，較佳至少約8〇% 相似性，更佳約90-95%相似性且最佳約99%相似性。 丨 本文所用之術語”外源的"意欲涵蓋在浣熊痘病毒基因組 外部產生、起源、衍生或發展者，即，自痘病毒基因組外 部起源，例如，自相對於浣熊痘病毒基因組視為外來之 PRRSV獲得或分離之基因物質。
纟本發明上下文中所用之”基因”係基因功能與之相關聯 之核酸分子（染色體、質粒等）中之核《序列。基因係（例 如）生物體之遺傳單位，其包含在生物體基因組内佔據特 疋物理位置(”基因基因座(gene 1〇_广或”基因性基因座 (§_以1〇CUS)”）之聚核苦酸序列（例如’哺乳動物之DNA 131329.doc •23· 200909578 序列）。基因可編碼經表現之產 (例如，，。或者，基因可界定：:事：聚靡 組位置，例如蛋白質及/或核酸之結件/功能之基因 ^%, i^A 口（例如，噬菌體附著 ‘』），、中该基因不編碼經表現之產物。—般而言，基 因包括諸如多肽編碼序列等編碼序列及諸如啓動子序列、 聚腺普酸化序列、轉錄調節序列(例如，增強子序列)等非 :碼序列。許多真核基因具有藉由”内含子"(非編碼序列) 斷之外顯子’’(編碼序列）。在某些情形下，基因可與一 或多個另外基因(例如’重疊基因)共享序列。對抗原或疫 苗組合物之免疫反應”係在個體中形成對存在於所關注抗 原或疫苗組合物中之分子的體液及/或細胞介導之免疫反 應。對本發明而言’ ”體液免疫反應”係抗體介導之免疫反 應且涉及！生對於本發明抗原/疫苗具有親和性之抗體， 而，，細胞介導之免疫反應，，係藉由τ_淋巴細胞及/或其他白灰 細胞介導之免疫反應。”細胞介導之免疫反應”係藉由遞呈 與主要組織相容性複合物型或π型分子相關聯之 抗原決定部位引發。此激活抗原特異性CD4+ τ輔助細胞或 CD8 +細胞毒性Τ淋巴細胞（，，CTL”）。CTL對與藉由主要組織 相容性複合物（MHC)編碼且在細胞表面上表現之蛋白質— 起遞呈之肽抗原具有特異性。CTL幫助誘導及促進細胞内 微生物之細胞内破壞或感染該等微生物之細胞溶解。細胞 免疫之另一態樣涉及藉助輔助丁_細胞之抗原特異性反應。 輔助Τ-細胞用於幫助刺激該功能並使非特異性效應細胞之 活性集中抵抗在表面上顯示肽抗原與MHC分子的細胞。 131329.doc -24- 200909578 "細胞介導之免疫反應"亦係指產生細胞因子、趨化因子及 其他藉助激活τ-細胞及/或其他白血細胞（包括彼等衍生自 CD4+及CD8+ T-細胞者）產生之該等分子。特定抗原或組 合物刺激細胞介導之免疫反應的能力可藉由數種分析法測 定，例如藉由淋巴組織增生（淋巴細胞激活）分析法、cTL 細胞毋性細胞分析法、藉由分析對經敏化個體中之抗原具 有特異性之T-淋巴細胞、或藉由量測τ細胞響應抗原再刺 激而產生之細胞因子。該等分析法已為熟習此項技術者所 熟知。參見，例如，Erickson等人，J Immun〇1 (1993) 151:4189_4199 ; Doe 等人，EUr_ J. Immunol. (1994) 24:2369-2376 ° ”免疫原性ORF”或”免疫原性〇rf”係指能引發免疫反應之 開放讀碼框。
本文所用之”免疫有效量"係指藉由熟習此項技術者所習 知之標準分析法所量測之足以引發免疫反應（細胞（T細胞） 或體液（B細胞或抗體）反應）之抗原或疫苗的量。例如，對 於本發明而言’ ”免疫有效量m7 5 L〇g丨。TciD5〇/mL 之最小保護劑量（效價）β抗原作為免疫原之效力可藉由增 殖分析法、藉由細胞溶解分析法（例如鉻釋放分析法以量 測Τ細胞溶解其特異性把細胞之能力）或藉由量測Β細胞活 性程f (藉由量测對血清中之抗原具有特異性之循環抗體 的含量）來量測。而且，免疫反應之保護程度可藉由攻擊 具有經注射抗原之經免疫化的宿主來量測。例如，若期望 免疫反應之抗原係病毒或腫瘤細胞，則藉由"免疫有效量” 13I329.doc -25- 200909578 之该抗原誘導之保護程度可藉由檢測對動物實施病毒或腫 瘤細胞攻擊後之存活率百分比或死亡率百分比來量測。 本文所定義之淀熊疫病毒基因組中之”非必需位點，，章指 病毒基因組中非病毒感染或複製所必需之區域。浣熊痘病 毒基因組中之非必需位點的實例包括但不限於胸苷激酶 (TK)位點、血球凝集素（HA)位點及絲胺酸蛋白酶抑制劑位 點。淀熊痘病毒之TK位點闡述於c. Lutze_WaUace，M.
Sidhu及 A. Kappeler，Virus Genes 10 (1995)，第 81-84頁。 >完熊疫病毒之τκ基因的序列亦可參見PubMed登錄號 DQ066544及U08228。浣熊痘病毒之ha位點闡述於 Cavallaro KF及 Esposito, JJ，Virology (1992), 19〇⑴：434_ 9。浣熊痘病毒之HA基因的序列亦可參見pubMed登錄號 AF3 75 1 1 6。術語”核酸分子，，或，，核酸序列"具有其普通含 義’係指重複核苷酸（例如指導蛋白合成過程之嘌呤及嘧 啶鹼基重複單元）長鏈，即，其編碼並表現蛋白質物質。 與*亥術浯在申請專利範圍中之使用一樣，核酸係指編碼豬 繁殖與呼吸症候群病毒蛋白之已知外源或外來基因，期望 為開放讀碼框基因。 本文所用之術語，,開放讀碼框，，或"ORF”或"orf"係指無間 插、’·；止在、碼子下編碼特定病毒蛋白所需要之最小核苷酸序 列。 可操作地連接"係指元件之排列，其中所闡述之組件經 、且心以實知其通常功能。因此，當存在調節蛋白及合適酶 t與編碼序列（例如，編碼所關注抗原之序列）可操作地 131329.doc -26- 200909578 連接之給定啓動子能夠實現始· Z£ r1· 巧貫現編碼序列之表現。在—些 下’某些控制元件不需要盥绝成— ^ 而要一編碼序列鄰接， 元件起指導其表現之作用即可。々丨& 晋寺控制 ΡΤ例如，啓動子序列與編碼 序列之間可存在未經轉譯而蛵 轉錄之間插序列且該啓動子 序列仍可視為與該編碼序列” ♦ ，厅夕』可刼作地連接”。因此，在細 胞中，當RNΑ聚合酶將編碼序 3厅幻轉錄至mRNA(其隨後經 式RNA剪接並轉譯成蕻由 〜 错由°亥編碼序列編碼之蛋白質）中 時，編碼序列與轉錄及轉譯控制序列，，可操作地連接”。 術語'’豬（P⑽inuswine)”可互換使用且係指為豬科 (Suidae)家族成員之任何動物，例如豬。 ’’保護性”免疫反應係指疫苗引發免疫反應(體液或細胞介 導)之能力，其用以保護哺乳動物不嶋。所提供之保 護無需為絕對的，’感染無需完全預防或根除，若與豬 哺乳動物之對照群體（例如未投與疫苗之感染動物）相比存 在統計學之顯著改良。保護可限於減輕感染症狀發作之嚴 重性或迅速性。 、本文所用之術語”重組體”僅僅係指藉由標準基因工程方 法所產生之浣熊痘病毒構建體。 術語”可複製的”係指能夠在適宜宿主細胞中複製、重製 或再製之微生物，例如’諸如浣熊痘病毒等病毒。 術π疫田或疫苗組合物”在本文卡可互換使用且係指 包含至少一種可在動物中誘導免疫反應及/或保護動物免 於由感染所致之疾病或可能死亡之免疫活性組份的醫藥組 合物’且可能包括或可能不包括一或多種能夠增強活性組 131329.doc -27- 200909578 份之免疫活性的其他組份。疫苗可另外包含醫藥組合物之 其他典型組份。 "載體”係能夠在宿主生物體中複製且基因嵌入其中以構 建重組DNA分子之DNA分子。 概述 根據本發明，提供獨特的重組痘病毒載體，其中該載體 包含一或多個編碼豬繁殖與呼吸症候群病毒蛋白之外源核 酸分子。在一個實施例中，該痘病毒載體可編碼相同豬繁 殖與呼吸症候群病毒蛋白的至少兩個拷貝。該相同蛋白之 該兩個拷貝可藉由兩個不同核酸分子編碼或該相同蛋白之 該兩個拷貝可藉由相同核酸分子編碼。該相同蛋白之該兩 個拷貝可與一個啓動子或與單獨啓動子可操作地連接。 該等蛋白可藉由分別在血球凝集素（/m)及/或胸苷激酶 (A)基因座處的一或多種豬繁殖與呼吸症候群病毒 (PRRSV)分離株之開放讀碼框（例如ORFla或ORFlb至 ◦ RF7，較佳為 ORF5、ORF6 及 / 或ORF3/ORF4/ORF7)與或 不與豬第二型環狀病毒（PCV-2)之一或多個開放讀碼框（例 如ORF1至0RF13，較佳為ORF2)編碼。用於嵌入本文所述 任何核酸分子之痘病毒基因組的另一第三非必需位點係絲 胺酸蛋白酶抑制劑位點。在一個特定實施例中，兩個或更 多個外源核酸分子編碼兩個或更多個選自由下列組成之群 之豬繁殖與呼吸症候群病毒的開放讀碼框：ORF5-ORF6、 ORF5-ORF6-ORF7 、 ORF3-ORF5-ORF6 、 ORF3-ORF4-ORF7 、 ORF3-ORF4-ORF5-ORF7 、 ORF3-ORF4-ORF6- 131329.doc -28- 200909578 ORF7及 ORF3-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7。 亦在h及/或A基因座處嵌入者係表現帶有FeLV P27 +表 型（在FeLV P27 ELISA中為藍色）之貓白血病病毒（FeLV)之 糖蛋白的基因。在該等構建體中，FeLV P27+或PCV-2 ◦ RF2(衣殼基因）用作單標籤來篩選不同組合中之純系。較 佳之PRRSV分離株包含ISU12 (Iowa)及01ot/91(西班牙） 株，但其他分離株可容易地代替在下文實例中闡釋之本發 明株。 因此，本發明之目的係在一個病毒構建體中表現浣熊痘 病毒（RCNV)基因組之血球凝集素（k)及/或胸苷激酶（A)基 因座處之四個或更多個豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV) 之美國及歐洲株之開放讀碼框（ORF)單獨或其與豬環狀病 毒（PCV2)之ORF之組合以製造強效疫苗。 本發明之另一目的係使用新穎選殖篩選系統，該系統利 用有限稀釋及藍-至-白蝕斑途徑或有限稀釋及病毒ELIS A 而非習用篩選標籤（如ZacZ)作為篩選標籤。 上述目的係藉由提供包含重組浣熊痘病毒載體（rRCNV) 之新穎疫苗實現，其中該rRCNV表現分別在血球凝集素 (办幻及/或胸苷激酶基因座處之一或多種PRRSV分離株 之多個開放讀碼框（較佳為〇RF5 、ORF6及/或 ORF3/ORF4/ORF7)與或不與PCV-2之開放讀碼框（較佳為 ORF2)。 先前表現系統之能力限於在一個病毒構建體中僅表現一 個或兩個PRRSV基因之開放讀碼框（〇RF)。本發明有利地 131329.doc • 29- 200909578 容許表現四個或更多個豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV) 之美國及歐洲株之ORF單獨或其與豬第二型環狀病毒 (PCV-2)之開放讀碼框的組合。迄今業内無闡述，本發明 之優良表現系統容許在一個病毒構建體中將來自PRRSV之 多個ORF嵌入浣熊痘病毒（RCNV)基因組之及/或A基因 座及/或絲胺酸蛋白酶抑制劑基因座中由此產生保護豬抵 抗PRRS之強效重組疫苗。 本發明使用利用有限稀釋及藍-至-白蝕斑途徑或有限稀 釋及ELIS A用作篩選標籤之篩選系統。非常有益地，該篩 選系統在一個病毒構建體中可提供多個位點表現。 淀熊痘病毒（Herman株）首先由Y. F. Herman在Aberdeen, Mary 1 and於1 96 1 -1 962年自無臨床症狀之淀熊呼吸道中分 離出來（Y. F. Herman 5 "Isolation and characterization of a naturally occurring pox virus of raccoons"，於 Bacteriol. Proc.中，第64屆美國微生物學學會年會（64th Annual Meeting of the American Society for Microbiology)，第 117 頁（1964))。在本發明之rRCNV-PRRS構建體中，將一或多 種PRRSV基因株之多個開放讀碼框（例如，ORF5、ORF6及/ 或ORF3/ORF4/ORF7)嵌入浣熊痘病毒（RCNV)基因組之/ζα 及/或Α基因座中使無毒性之Her man株進一步減毒。有利 地，本發明以rRCNV為載體之PRRSV疫苗亦使疫苗生產期 間雇員之安全性得以改良且完全消除了病原性病毒未亡不 活化之機會及商業生產期間所用之去污染程序。 本發明涵蓋，本發明中所闡述之科學進步及新穎方法可 131329.doc -30- 200909578 由熟習此項技術者應用於具有多個自PRRSV株而非ISU12 及Olot/91獲得之開放讀碼框之抗原蛋白且可在浣熊痘病毒 載體之A及/或k基因座處嵌入以提供用於保護抵抗pRRS 之免疫原性疫苗。例如，諸如北美株VR_2332、歐洲株 Lelystad病毒及諸如此類等其他株可容易地代替18。12及/ 或Olot/91株。由於RNA病毒易發生突變，因此，或者，新 領域分離株或病毒突變體之期望〇RF基因可經分離並用於 本發明之重組疫苗中。儘管如此，在迄今發現之pRRSVi 許多突變體及衆多分離株間存在高度同源性，並且，因 此，在本發明疫苗構建體中使用某些開放讀碼框（例如 ORF5或〇RF6)具有可顯著有效抵抗pRRS之優點。對於彼 等具有約40%之較低同源性的分離株，本發明構建體之實 用優點在於其可容易地容納來自多種病毒來源之若干〇RF 的抗原蛋白以提供有效之廣譜疫苗。通過對仔豬成功實施 疫苗接種程序之該PRRS預防對豬產業極具重要性，因為 對於3亥疾病沒有有效之長期治療方宰。 本發明進一步涵蓋，可用於本發明之痘病毒載體可包含 但不限於淀熊痘病毒、金絲雀痘病毒、家禽痘病毒、豬痘 病毒、牛痘病毒及諸如此類，但期望使用浣熊痘病毒。雖 然不活化痘病毒載體可用於本發明方法之實踐中，但活載 體較佳。 本發明亦提供藉由向需要保護之豬投與強效新穎重組疫 苗來保護豬抵抗斷乳後多系統消耗性症候群（p M w s )及/或 豬繁殖與呼吸症候群（PRRS)之新穎方法。 131329.doc 31 200909578 在本發明方法中，將免疫有效量之本發明疫苗投與至需 要保護抵抗PMWS及/或PRRS之豬（尤其係幼小仔豬）以在動 物中誘導保護性免疫反應。給予豬之有效免疫量係可獲得 疫苗之充分免疫反應以保護豬不受PCV-2及/或PRRSV之有 害效應的量。當疫苗能夠如疫苗領域中之標準值所要求保 護至少相當數量之經接種的豬時，視為獲得保護性免疫反 應。給動物接種並引發滿意疫苗接種效應之免疫學有效劑 量或有效免疫量可藉由常規測試（例如，藉由標準滴定研 九）谷易地測定或容易地滴定。 本發明之新穎疫苗構建體可用於約3月齡之健康仔豬之 疫苗接種以預防斷乳後多系統消耗性症候群…河…”及/或 豬繁殖與呼吸症候群（PRRS) ^亦可將該疫苗給予生育之前 之成热或成年母豬（即，大於3個月）。該疫苗可以單次劑量 才又與或右抗體效價下降且認為需要加強注射則以重複劑量 該疫苗係以單次接種方式投與至健康動物
投與。期望地，該疫苗係以 以提供抵抗疾病之長期保護 更長。適當查丨丨景άΓ茲rt 4Φ推
131329.doc •32- 200909578 為困難。非經腸之投與途徑包括（但不限於）皮下、肌内、 靜脈内、腹膜内、皮内（即注射或置於皮膚下）途徑及諸如 此類。較佳地，該疫苗係經皮下投與。 雖然本發明疫苗高度期望使用活浣熊痘病毒以獲得最佳 且強效免疫功效，但是該痘病毒载體可為活載體或藉由習 用耘序不活化以製備不活化病毒疫苗，例如使用BEI(二元 氮丙咬）、曱醛及諸如此類，BEI係較佳不活化劑。 有盈的是’表現PCV-2及/或PRRSV之多個〇RFs的活重 j 組RCNV(單獨或與適宜載劑、稀釋劑及佐劑組合）為有用 之疫苗。疫苗產物可視情況含有多種典型無毒之醫藥上可 接受之添加劑、稀釋劑及佐劑，此包括（但不限於）防腐 劑；穩定劑；乳化劑；氫氧化鋁；鱗酸鋁；pH調節劑，例 如氫氧化鈉、鹽酸等；表面活性劑，例如Tween® 80(聚山 梨醇酯 80，可自 Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO購 得）；脂質體；免疫刺激複合物（iscom)佐劑；合成糖肽， 例如胞壁醯二肽；增量劑（extenders)，例如葡聚糖或葡聚 :; u 糖與例如麟酸鋁、硫酸葡聚糖、DEAE-葡聚糖及諸如此類 之組合；聚羧乙烯（carboxyp〇lymethylene)，例如 CARBOPOL (聚丙炸酸聚合物，可自B.F. Goodrich Company，Cleveland，Ohio購得）；乙烯馬來酸酐或乙烯/馬 來酸酐共聚物（EMA®，線性乙烯/馬來酸酐共聚物，具有 大約等量之乙烯及馬來酸酐，具有估計之平均分子量約 75,000 至 100,000，可自 Monsanto Co.，St. Louis，MO 購 得）；丙烯酸系共聚物乳液，例如苯乙烯與丙烯酸及甲基 131329.doc -33- 200909578 丙稀酸之混合物的共聚物’如neocryl® A640(例如美國 專利第5,047,238號’與苯乙烯混合之丙烯酸及甲基丙稀酸 之未聚結（uncoalesced)水性丙烯酸共聚物，可自 Chemicals，lnc., Wilmington，ΜΑ購得）；細菌細胞壁，例 如分枝桿菌細胞壁提取物；衍生自棒狀桿菌之佐劑，例如 短小棒狀桿菌；衍生自丙酸桿菌之佐劑，例如痤瘡丙酸桿 菌謂;牛分枝桿菌（吻⑺心以⑺·謂 6ον&)(卡介苗或BCG);亞病毒微粒佐劑，例如環狀病毒； 崔亂毒素；1^，]^-二（十八烧基）-]^’，1^’-雙（2-經基乙其）_丙-胺（阿夫立定（avridine));單磷醯脂質a;二甲基二（十八院 基）>臭化叙（DDA ’可自Kodak，Rochester, NY購得）·其八 成物及混合物。可用於本發明疫苗中之其他添加劑包括 (但不限於）右旋糖（dextrose)、習用抗氧化劑及習用餐合 劑，例如乙二胺四乙酸（EDTA)。可視情況補充於疫苗調 配物之其他醫藥上可接受之佐劑包括（但不限於）聚陰離 子、聚陽離子、肽、礦物油乳液、免疫調節劑、多種組合 及諸如此類。適宜佐劑之其他非限制性實例包括角黨院及 角鯊烯（或其他動物來源之油）；聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共 聚物，例如PLURONIC®(L121，例如，可自basf Aktiengesellschaft ’ Ludwigshafen ’ 德國講得）；息：g： · Quil A(皂樹皮經純化形式之商品名，可自Isc〇tec ab，瑞 典及 Superfos Biosector a/s ’ Vedbaek，丹麥獲得）；礦物 油，例如MARCOL®(液體飽和烴之經純化混合物，可自 Exxon-Mobil，Fairfax，VA購得）；植物油，例如花生油； 131329.doc -34- 200909578 介白素，例如介白素-2及介白素_12 ;干擾素，例如丫干擾 素’動物痘病毒蛋白或其混合物。適宜穩定劑之實例包括 但不限於簾糖、明膠、蛋白腺、諸如ΝΖ僅或取_胺^等 經消化之蛋白質提取物 乳化h彳之實例包括但不限於礦物 油、植物油、花生油及其他可用於可注射或鼻内疫苗之標
準可代謝無毒油。期望地，氫氧化鋁與諸如皂苷或Quil A 等其他佐劑混合以形成諸如皂苦_氫氧化鋁或Quu A_氫氧 化銘等組合。 〇
較仫佐劑包含乙稀/馬來酸酐共聚物、苯乙烯與丙烯酸 及甲基丙烯酸混合物之共聚物、礦物油乳液或其組合。可 顯著增強本發明rRCNV_PRRS構建體效能之尤佳佐^系統 包含諸如EMA-31®(線性乙烯/馬來酸酐共聚物，其乙烯及 馬來酸酐的量大致相等’其估計平均分子量為約75，刚至 100,000,可自 Monsanto公司，st L〇uis，M〇構得）等乙稀/ 馬來酸酐共聚物與諸如NE〇CRYL®(與苯乙烯混合之丙烯 酸及甲基丙烯酸之未接合水性丙烯酸共聚物（丙烯酸系-苯 乙稀礼液）’可自 P〇lyvinyl Chemicals公司，WUmingt〇n， ΜΑ購得）等丙烯酸共聚物乳液之組合。 本發明重組疫苗組合物亦可視情況含有—或多種額外豬 k原之混合物’該一或多種額外豬抗原係例如豬肺炎徽渡 菌、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎 放線桿®、支氣管敗血性博德特菌、冑霍亂沙門氏菌、緒 丹：桿菌、鈎端螺旋體細菌、豬流感病毒(SIV)、豬細小 病毒、大腸桿菌、豬呼吸冠狀病毒、輪狀病毒、奥傑士基 131329.doc -35- 200909578 氏病之致病病原體、豬傳染性胃腸炎等。 彼等熟習此項技術者所習知之任何方法皆可用於製備本 發明之基因構建體。例如，可利用特定限制位點使用標準 方法將任何期望核酸序列嵌入浣熊痘病毒載體中。或者， 如本文所述，當期望嵌入較大序列時或當期望嵌入多個基 因時，吾人可利用同源重組技術。在該方法中，欲入位點 (擬向其中嵌入多個基因）側翼之質粒序列含有與浣熊痘病 毒基因組中存在之序列具有充分同源性之序列以介導重 f 組。該等側翼序列必須與非浣熊痘病毒生長及繁殖所必需 之浣熊痘病毒區域同源，例如血球凝集素基因座或胸苷激 酶基因座或絲胺酸蛋白酶抑制劑基因座。儘管可使用一個 啓動子來推動擬重組之兩個外源基因表現，但是在嵌入載 體中使用兩個啓動子（每個啓動子與單個基因可操作地連 接）亦將提供充分表現。 通常而言，病毒rRCNV-PRRS可藉由藍-至-白蝕斑途徑 構建，例如，藉由以下五個主要步驟：（1)將PRRSV ISU12 ( V/ (Iowa)及 01ot/91(西班牙分離株）株之 ORF5、ORF6、ORF7 或ORF3選殖入質粒pFD2000A及/或pFD2003SEL中；（2)構 建質粒 pFD2000A PRRS ORF7 (Pd-ORFS (01ot)(PSEL)-ORF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL)或質粒 pFD2000A PRRS ORF3 (Pn)-〇RF5 (〇l〇t)(PSEL)-〇RF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL) ; (3)藉 由三方面感染/轉染創建純系庫：COS7細胞、步驟2中之質 粒及rRCNV-FeLV ; (4)藉由有限稀釋及藍-至-白蝕斑途徑 實施純系篩選；及（5)藉由PCR、ELISA及西方墨點法測定 131329.doc -36- 200909578 rRCNV-PRRSbtw之分子特徵。或者，可使用白-至-藍蝕斑 途徑，其中實施以下五個主要步驟：（1)將PRRSV ISU12及 Olot/91株之ORF5及ORF6、FeLV P27選殖入質粒 pFD2000A 及 / 或 pFD2003SEL 中；(2)構建質粒 pFD2000A FeLV P27 (P,,)-PRRS ORF5 (01ot)(PSEL)-ORF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL)或 pFD2000A PRRS ORF5 (01ot)(PSEL)-ORF6 (PSEL)-〇RF5//LacZ (P7.5) ; (3)藉由三方面感染/轉染創建純 系庫：COS7細胞、步驟2中之質粒及RCNV ; (4)藉由有限 稀釋及FeLV P27 ELISA或LacZ實施純系篩選；及（5)藉由 PCR、ELISA及西方墨點法測定rRCNV-PRRSwtb之分子特 徵。 本發明rRCNV-PRRS-PCV可藉由以下五個主要步驟構 建：（1)將 PRRSV ISU12 及 Olot/91 株之 ORF5、ORF6、 ORF3及PCV2 ORF2(衣殼基因）選殖入質粒pFD2000A及/或 pFD2003SEL 中；（2)構建質粒？戶02000八？11118 01^3(?11)-ORF5 (01ot)(PSEL)-ORF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL)-PCV2 ORF2 (Ρπ或Psel) ; (3)藉由三方面感染/轉染創建純系庫：COS7 細胞、步驟2中之質粒及RCNV ; (4)藉由有限稀釋及PCV2 ELISA(作為篩選標籤）實施純系篩選；及（5)藉由PCR、 ELISA及西方墨點法測定rRCNV-PRRSpev之分子特徵。或 者，可使用白-至-藍触斑途徑，其中實施以下四個主要步 驟：（1)將 PCV2 0RF2選殖入質粒 pFD2001TK或 pFD2006TK 中以產生質粒PFD2001TK PCV ORF2 ; (2)藉由三方面感染/ 轉染創建純系庫：COS7細胞、步驟1中之質粒及rRCNV- 131329.doc -37- 200909578 PRRS ORF3 (P,,)-ORF5 (01ot)(PSEL)-〇RF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL) ; (3)藉由有限稀釋及PCV2 ELISA或LacZ實施純系篩 選；及（5)藉由PCR、ELISA及西方墨點法測定rRCNV-PRRS//PCV之分子特徵。 實例 以下實例展示本發明之某些態樣。然而，應瞭解該等實 ' 例僅用於闡釋而非欲將本發明完全限定於該等條件及範 圍。應瞭解，當給出典型反應條件（例如，溫度、反應時 f) 間等）時，亦可使用規定範圍以上及以下二者之條件，雖 然通常較為不適宜。該等實例係在室溫（約23°C至約28°C) 及大氣壓力下實施。除非另有說明，否則本文所提及之所 有份數及百分比皆以重量計且所有溫度皆以攝氏度數表 示。 實例1 :構建rRCNV-PRRS(藍-至-白蝕斑途徑） rRCNV-PRRSbtdf、藉由以下五個主要步驟構建：（1)將 PRRSV ISU12 (Iowa)及01ot/91(西班牙分離株）株之ORF5、 v ORF6、ORF7或ORF3選殖入質粒pFD2000A及/或 pFD2003SEL 中；(2)構建質粒 pFD2000A PRRS ORF7 或 ORF3 (Pn)-ORF5 (01ot)(PSEL)-〇RF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL); . (3)藉由三方面感染/轉染創建純系庫：COS7細胞、步驟2 中之質粒及rRCNV-FeLV ; (4)藉由有限稀釋及藍-至-白蝕 斑途徑實施純系篩選；及（5)藉由PCR、ELISA及西方墨點 法測定rRCNV-PRRSbtw之分子特徵。 該藍-至-白蝕斑篩選途徑使用具有FeLV P27+表型（在 131329.doc •38- 200909578
FeLV P27 ELISA中為藍色）之親本病毒rRCNV-FeLV。通過 介於 rRCNV-FeLV 與 pFD200A PRRS ORF7- ORF5 (Olot)-ORF6-ORF5之間之RCNV HA側翼序歹的同源重組，重組 rRCNV-PRRS之表型將自藍蝕斑變成白蝕斑，因為PRRSV ORF嵌入/ζα基因座以替代親本株中之FeLV gag-env gp85序 列（rRCNV-FeLV-藍蝕斑）。 實例2 :構建rRCNV-PRRS(白-至-藍蝕斑途徑） rRCNV-PRRSwtb係藉由以下五個主要步驟構建：（1)將 PRRSV ISU12 及 Olot/91 株之 ORF5 及 ORF6、FeLV P27 選殖 入質粒pFD2000A及/或pFD2003SEL中；（2)構建質粒 pFD2000A FeLV P27 (Pn)-PRRS ORF5 (01ot)(PSEL)-ORF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL) ; (3)藉由三方面感染/轉染創建純系 庫：COS7細胞、步驟2中之質粒及RCNV ; (4)藉由有限稀 釋及FeLV P27 ELISA或LacZ實施純系篩選；及（5)藉由 PCR、ELISA及西方墨點法測定rRCNV-PRRSwtb之分子特 徵。 該白-至-藍蝕斑篩選途徑使用具有FeLV P27+或LacZ表 型（在FeLV P27 ELISA或LacZ+表型中為藍色）之重組病毒 rRCNV-PRRSwtb 5 而野生型 RCNV 在 FeLV P27 ELISA 或 LacZ染色中顯示白色。
實例 3 :構建 rRCNV-PRRS-PCV
rRCNV-PRRSpcv#藉由以下五個主要步驟構建：（1)將 PRRSV ISU12 及 Olot/91 株之 ORF5、ORF6、ORF3 及 PCV2 ORF2(衣殼基因）選殖入質粒PFD2000A及/或pFD2003SEL 131329.doc -39- 200909578 中；（2)構建質粒 pFD2000A PRRS ORF3 (PJ-ORFS (01ot)(PSEL)_〇RF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL)-PCV2 ORF2(Pn 或 Psel) ; (3)藉由三方面感染/轉染創建純系庫：COS7細胞、 步驟2中之質粒及RCNV ; (4)藉由有限稀釋及PCV2 ELISA(作為篩選標籤）實施純系篩選；及（5)藉由PCR、 ELISA及西方墨點法測定rRCNV-PRRSpev之分子特徵。 該？(2乂2途徑使用？0¥-2衣殼£1^8八作為單標籤來篩選純 系且用以在一個病毒構建體中創建rRCNV-PRRS/PCV之新 穎組合疫苗。 或者，該rRCNV-PRRSpcv係藉由以下四個主要步驟構 建··（1)將PCV2 ORF2(衣殼基因）選殖入質粒pFD2001TK及/ 或 pFD2006TK 中以產生質粒 pFD2001TK PCV2 ORF2(Pn 或 Psel) ; (2)藉由三方面感染/轉染創建純系庫：COS7細胞、 步驟1中之質粒及rRCNV-PRRS ; (3)藉由有限稀釋及PCV2 ELISA(作為篩選標籤）實施純系篩選；及（4)藉由PCR、 ELISA及西方墨點法測定rRCNV-PRRS//PCV之分子特徵。 實例4 : rRCNV-PRRS候選疫苗在豬中之功效研究 在有或無免疫增強佐劑下調配上述構建體（rRCNV-PRRSbtw、rRCNV-PRRSwtb及 rRCNV-PRRSpcv)並在豬中評 價疫苗功效。攻擊研究之成功結果將顯示重組PRRS、PCV 或組合疫苗在豬中之功效。
實例 5 :構建rRCNV-PRRSV 簡言之，病毒rRCNV-PRRS V係藉由將豬呼吸與繁殖症 候群病毒（PRRSV)ISU 12(美國株）之包膜糖蛋白（orf 5)基因 131329.doc -40- 200909578 及基質蛋白（〇^6)基因及卩111^¥01〇191(歐洲株）基因之包 膜糖蛋白（orf 5)基因嵌入RCNV基因組（無毒性Herman株） 之血凝集基因座中來構建。 rRCNV-PRRSV之構建過程通過兩個主要步驟來提供。 第一，將PRRSV ISU 12株之經PCR擴增之603-bp orf 5及 525-bp orf6 及 PRRSV Olot 91 株之 606-bp orf 5 亞選殖入質 粒pFD2003SEL載體（在啓動子PI 1控制下含有lacZ報告基 因）中以產生質粒pFD2003SEL-PRRSV01ot91orf5-(SEL)-ISU 12 orf 6 (SEL)-ISU 12 orf 5 (SEL)。PRRSV ISU 12 orf 5及orf 6及PRRSV Olo 91 orf 5基因二者均在啓動子Psel控 制下共表現。第二’實施COS-7細胞中之rRCNV-FCV (2280-DD1)及質粒 pFD2003SEL-PRRSV Olot 91 orf5-(SEL)-ISU 12 orf 6 (SEL)-ISU 12 orf 5 (SEL)之三方面共感 染/轉染以藉由k基因座處之等位基因交換產生rRCNV-PRRSV。藉由五個蝕斑純化相繼循環在非洲綠猴腎細胞中 選殖藍蝕斑（Lac+)。將候選純系在非洲綠猴腎細胞中使用 補充有0.05%乳清蛋白水解產物（LAH)、30 pg/mL硫酸慶大 黴素及5 %胎牛血清之最低必需培養基（MEM)進一步再擴展 兩次，且其後藉由基因特異性PCR證實。第七通道用以製 備預備種源。種源係藉由對預備種源及指定rRCNV-PRRSV分別實施1:20,000稀釋建立，其中作為活载體之淀 熊疫病毒能夠表現在k基因座處之PRRSV ISU 12及〇l〇t 91株之PRRSV包膜糖蛋白（orf 5)及基質蛋白（Μ)。prrsv 疫苗之種源病毒活浣熊痘病毒載體（rRCNV-PRRSV)係藉由 131329.doc •41 - 200909578 PRRSV orf 5或orf 6基因特異性PCR測試確定。正在仔豬及 母豬中實施豬呼吸與繁殖症候群病毒疫苗之免疫原性研究 (活/不活化浣熊癌：病毒載體單獨或其與Suvaxyn PCV2 One Dose及或Suvaxyn MH-one、或活嵌合cPCVl-2及或經修飾 之活豬肺炎徽漿菌（例如，J株）之組合）。 實例6:豬繁殖與呼吸症候群病毒疫苗在仔豬甲之免疫原 性研究，活浣熊痘病毒載髏單獨或其與Suvaxyn PCV2 One Dose之組合 為展示PRRSV部分之功效，將以兩次劑量方案以2-3週 為間隔向豬投與rRCNV-PRRSV疫苗（凍乾的餅）及作為稀釋 劑之含佐劑之無菌水或Suvaxyn PCV2 One Dose，繼之在 第二次疫苗接種後實施毒性PRRSV攻擊或PRRSV/PCV2共 攻擊2-3週。rRCNV-PRRSV部分之功效將基於PRRSV病毒 血症減輕及由PRRSV引起之肺損傷減輕來評價。Suvaxyn® PCV2 One含有用FDAH之專利佐劑調配之不活化豬第一型-第二型環狀病毒嵌合體（cPCVl-2)。 材料及方法 測試動物 - 至少40隻（20隻疫苗接種及20隻對照）混合飼養雄性及雌 . 性常見豬（3週齡或更大）用於該研究。用於該研究之豬將自 商業農場購得且使用耳標標識。將自單個來源畜群獲得 豬。在第一次疫苗接種時，如藉由IDEXX HerdCheck ELISA套組（S/P比率小於0.4)所測定，豬對PRRSV為血清 陰性。 131329.doc -42- 200909578 測試疫苗測試疫苗之組成 凍乾部分：該疫苗由活rRCNV-PRRSV組成。將在五份 平行測定分析中滴定疫苗之病毒效價以確定研究中之投與 劑量。液體部分：稀釋劑為Suvaxyn PCV2 One Dose或20% 之SL-CD佐劑。在疫苗接種時，將rRCNV-PRRSV之凍乾部 分用液體部分再水化。 研究設計 所提出之研究為隨機化完全區組設計（優效性試驗）。將 同胎幼仔分配至每一研究平行測定中。隨後將每研究中同 胎幼仔内之仔豬如下分成兩個群組： 群組 — 疫苗 動物數量 VI-疫苗接種 束乾 rRCNV-PRRSV(餅)+Suvaxyn PCV2 One Dose >20 C1-對照 Suvaxyn PCV2 One Dose(稀釋劑） >20 V2-疫苗接種 凍乾 rRCNY-PRRSV(餅)+水-SL-CD 佐 劑(稀釋劑） >20 C2-對照 水-SL-CD佐劑(稀釋劑） >20 疫苗接種 疫苗接種途徑為在頸右側上之肌内。 對於研九1中之猪.將給予群組V1兩次2.0 m L劑量之 rRCNV-PRRSV+Suvaxyn PCV2 〇ne Dose ;將給予對照群 組Cl中之豬兩次2.0 mL劑量之Suvaxyn PCV2 One Dose。 對於研究2中之豬：將給予群組V2兩次2.0 mL劑量之 rRCNV-PRRS V +水/SL-CD ;將給予對照群組C2中之猪兩次 2.0mL劑量之水-SL-CD佐劑。 131329.doc -43 · 200909578 第一次疫苗接種將在3週齡時實施，且重複疫苗接種將 在2-3週之後。 攻擊 所有動物將在第二次疫苗接種後兩週至三週實施毒性攻 擊。 用至少2xl〇4 8 FAIDsot野生型病原性pcv2(4〇895株）及 用至少2M04.0 TCIDso之PRRSV(ISU_12或等效物）對群組νι 及Cl中之緒進行攻擊。在攻擊之前將該等兩種攻擊材料在
Ο 一起混合至少30分鐘。攻擊劑量為鼻内4 mL(2 mL/鼻 孔）。 用至少2χ10“ 丁⑽狀叹咖⑽^或#效物）對群組 V2及C2中之豬進行攻擊。攻擊劑量為鼻内2爪以！出口鼻 孔）。攻擊報告參見附件2。 在攻擊之日藉由PCV2-特異性及PRRSV_特異性間接免疫 螢光分析（IF A)對攻擊病毒實施滴定。 觀測 在攻擊後（DPC)第-2天至第1G天每天觀測所有緒之臨床 體徵及溫度。將任何異常觀測報告认'" β、.、α研九主管或農場獸 所監測之臨床體徵可包括但不限於食慾不振、唁睡、抑 營症、腹濱、噴嗔、咳漱、流鼻洋、眼分泌物^吸困難 及死亡。若任何豬在攻擊後觀測時 又功間死亡，則將實 把屍祆且屍檢報告附於最後報告中。 樣品收集及測試 131329.doc -44· 200909578 樣品收集 鼻擦拭物 在PRRSV及PCV2分離株第一次疫苗接種後（DPV1)第0天 收集鼻擦拭物以確保在疫苗接種之前測試動物中無PRRSV 或PCV2感染。 將鼻擦拭物樣品放置於含有3 mL MEM之單獨滅菌管中 並在-50°C下或低於-50°C下儲存直至測試，該MEM中含有 乳清蛋白水解產物（LAH)及慶大黴素（60 pg/mL)、青黴素 (100 U/mL)及鏈黴素（100 pg/mL)。 血清樣品 在 0 DPV1、0 DPV2、7 DPV2、14 DPV2、-1、6及 9對豬 進行抽血以獲得血清樣品（不多於1 0 mL)用於ELIS A測試且 在-1、3、6及9抽血用於PCR測試。 屍檢 將在10-1 1 DPC對所有動物進行屍檢。收集肺用於肺損 傷記分。 樣品測試 酶聯免疫吸附分析（ELISA) 藉由 IDEXX® HerdCheck ELISA套組（Westbrook, ME)檢 測PRRSV之血清抗體。簡言之，將血清樣品1:40稀釋於樣 品稀釋劑中並將1 00 pL每種樣品一式兩份（一個孔用於 PRRSV抗原且一個孔用於正常宿主細胞（NHC)抗原）添加至 經抗原塗覆之96-孔板中。在於室溫下30分鐘培育時間段 後，將液體倒出並將該等板用約300 μι經磷酸鹽緩衝之洗 131329.doc -45 - 200909578 條溶液洗務3-5次。隨後向所有孔中添加丨〇〇 抗-豬-HRPO偶聯物。將板在室溫下培育3〇分鐘。在培育時間段 後’再次如上洗滌該等板。隨後向每一孔中添加丨〇〇 0 TMB受質溶液。將該等板在室溫下培育丨5分鐘之後向所有 孔中添加100 μί終止溶液以終止反應。隨後在65〇 nm處於 u !板讀數上量測光密度。任意血清效價將以樣品/ 陽性（S/P)比率報告且藉由使樣品OD-PRRSV減去樣品〇D· NHC的數值除以平均陽性對照_pRRS v減去平均陽性對照_ 〇 NHC的數值來測定。 PCR測試 PRRSV-特異性RT_PCR測試用以檢測血清令pRRSv之存 在。RNA提取將在血清樣品上使用QIAamp⑧病毒
Mini套組（Valencia, CA)實施。 肺損傷記分 各個體猪之肺將由兩個獨立記分員針對總肉眼可見損傷
基1損傷所改變之肺薄壁組織的量來檢驗。損傷記分員不 知情：豬之治療方案一致性。簡言之，每一肺葉中之肺損 傷記分將II由估計展示pRRSV樣損傷(基於顏色及紋理)之 料百分比來確定並乘以彼肺葉之可能點值。每_肺葉之 =大S己分係、藉由該肺葉佔總肺體積之相對百分比來測定。 ^後將所有肺葉之背側及腹側態樣的記分相加在-起以獲 付各豬之總記分。每-動物之可能的最大總記分係100。 一級結果 為主張肺損傷減少 將對肺上所存在之損傷的總記分予 131329.doc -46- 200909578 以評定。 二級結果 二級結果為PRRS V病毒血症之發生。 統計學分析 估計量 為對肺損傷嚴重性之降低予以評價，估計量將為減輕部 刀（MF)統§十罝。減輕部分將如下計算： = 口 ncnv 其中：
Wi魏克森專級和統計量（wiic〇x〇n Rank sum statistic) nc =對照群組中個體的數量 nv~每一疫苗接種群組中個體的數量 *注：將對每-研究平行測定之MF統計量予以估計。 計算區間估計之方法的陳述 ) 將计算每—研究平行測定之減輕部分之95%置信區間。 “假設陳述 為主張肺損傷嚴重性降低： H〇: Mv=Mc Ha： Mv^Mc 其中：
Mv=疫苗接種群組中肺損傷記分等級之中值
Mc=對照群組中肺損傷記分等級之中值 δ亥4研究將測試零假設 又又即對於每一研究平行測定疫苗 131329.doc -47- 200909578 接種群組與安慰劑對照群組 異 之間無肺損傷嚴重性（等級）差 其他統計學考慮 豬同胎幼仔分佈將在同胎幼仔内隨機分配。 統計學分析 統計學方法 一級結果 動物内記分之測試再現性將藉由同類相 測試再現性足夠，則㈣由_自# 為 平均值計算每只豬之平均肺> I心貝之肺記分的 #之肺§己分作為因變量且 r -研究平… 所包括之治療作為自變量對每 研：+仃測疋之兩個治療群組間的計算之肺 較。若存在足夠完全區 進仃比 °°、’·，則將藉由同胎幼仔對嗲八$ 施分級。估計HL偏移 對4刀析實 二級結果 魏克森統计罝估物。 針對病毒血症發生對二級結果予崎定。單主 血症將把豬歸類為病主 人毛生病毒 混合模型中以病毒血症發在瓜化線性 以所包括之治療作為自貞式口艾置且 比較。若存在 科、且間之病母血症進行 協變量包括於模型中。 子作“機效果 所有統計學分析將使用s AS系統（s AS 施。顯著性程度設置為㈣.05。 ^司）實 在前述中’已出於 '闡釋而非限制目的提供本發明特定實 13I329.doc -48- 200909578 施例之詳細闡述。應瞭解，彼等熟習此項技術者基於該揭 示内容顯而易見之所有其他修改、分支及等效物皆意欲包 括在所主張之本發明範圍内。 【圖式簡單說明】 圖1係PFD2000A-FDAH質粒之核酸序列（SEQ ID NO: 1) 圖2係pFD2001 TK-FDAH質粒之核酸序列（SEQ ID NO: 2) 圖3係pFD2003SEL-FDAH質粒之核酸序列（SEQ ID NO: 3) 圖4係pFD2 003SEL-GPV-PV-FDAH質粒之核酸序列（SEQ ID NO: 4) 圖 5係 PCV2A ORF2-FDAH之核酸序列（SEQ ID NO: 5) 圖 6係 PCV2B ORF2-FDAH之核酸序列（SEQ ID NO: 6) 圖 7係 PRRSV ISU12-ORF3-FDAH之核酸序列（SEQ ID NO: 7) 圖 8係 PRRSV ISU12-ORF4-FDAH之核酸序列（SEQ ID NO: 8) 圖 9 係 PRRSV ISU12-ORF5-FDAH 之核酸序歹ij (SEQ ID NO: 9) 圖 10 係 PRRSV ISU12-ORF6-FDAH之核酸序列（SEQ ID NO: 10) 圖 11係 PRRSV ISU12-ORF7-FDAH之核酸序列（SEQ ID NO: 11) 圖 12 係 PRRSV 01ot91-ORF5-FDAH之核酸序列（SEQ ID NO: 12) 131329.doc -49- 200909578
序列表 <110>美商惠氏 <120>表現豬類病毒基因之浣熊痘病毒 <130> AM102713 <140> 097120321 <141〉 2008-05-30 <150> 60/932421 <151> 2007-05-30 <160> 12 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211〉 6872 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 質粒 <400> 1 ttattggaca ctagataatc atcacatgtt accacaaaat tatataatgt ataaatgcga aattattaaa cgcaaatatc catgggaaaa cgcgcagtat acagacgatt ttttacagta tttggagagt tttataggaa gtatatagag tagaaccaga attttgtaaa aataaatcac atttttatac taatatgaaa caactatcga tagttatatt gctactatcg atagtatata caaccaaacc tcatcctaca cagatatcaa aaaaactagg cgatgatgct actctatcgt gtaatagaaa caatacacat ggatatcttg tcatgagttc ttggtataag aaaccagact ccattattct cttagcagcc aaaaacgatg tcgtatactt tgatgattat acagcggata aagtatcata cgattcaccg tatgatactc tagctacaat tattacaatt aaatcattga catctggaga tgcaggtact tatatatgcg cattctttat aacatcaaca aatgatacgg ataaaataga ttatgaagaa ttcgtcgacg cggccgcctg cagaagcttg gtaccattta tagcatagaa aaaaacaaaa tgaaattcta ctatattttt acatacatat attctaaata tgaaagtggt gattgtgact agcgtagcat cgcttctaga catctatata ctatatagta ataccaatac tcaagactac gaaactgata caatctctta tcatgtgggt aatgttctcg atgtcgatag ccatalgccc ggtagttgcg atatacataa actgatcact aattccaaac ccacccgctt tttatagtaa gtttttcacc cataaataat aaatacaata attaatttct cgtaaaagta gaaaatatat tctaatttat tgcacggtaa ggaagtagaa tcataaagaa cagtgacatg gatcccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atccccct11 cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac tgtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt aacctatccc attacggtca atccgccgtt tgttcccacg gagaatccga cgggttgtta ctcgctcaca tttaatgttg atgaaagctg gctacaggaa ggccagacgc gaattatttt tgatggcgtt aactcggcgt ttcatctgtg gtgcaacggg cgctgggtcg gttacggcca ggacagtcgt ttgccgtctg aatt tgacct gagcgcatΐt ttacgcgccg gagaaaaccg cctcgcggtg atggtgctgc gttggagtga cggcagttat ctggaagatc aggatatgtg 131329-序列表.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 200909578
gcggatgagc cgatttccat agttcagatg tgaaacgcag tggttatgcc cgaaatcccg tgaagcagaa gctgaacggc tggtcaggtc ctttaacgcc ccgctacggc caatcgtctg ggtgcagcgc ccacggcgct ggtgcagtat cgcgcgcgtg gctttcgcta taacagtctt gggcggcttc cccgtggtcg gaacggtctg gcagcagttt gttccgtcat ggcaagcggt tgaactaccg gaacgcgacc ggaaaacctc cgaaatggat ctttctttca gttcacccgt taacgcctgg gcagtgcacg gcatcagggg aatggcgatt cctgaactgc agaaaactat agacatgtat ggcat 11 tcc gttgccactc tgcggcgagt gtcgccagcg gatcgcgtca aatctctatc gcctgcgatg aagccgttgc atggatgagc gtgcgctgtt ctgtatgtgg accgatgatc gatcgtaatc aatcacgacg gaaggcggcg gatgaagacc cctggagaga ggcggtttcg gtctgggact gcttacggcg gtctttgccg t tccagt tcc agcgataacg gaagtgcctc cagccggaga gcatggtcag agtgtgacgc ttttgcatcg cagatgtgga gcaccgctgg gtcgaacgct gcagatacac aaaaccttat accgttgatg cagctggcgc cccgaccgcc accccgtacg gtgacgtctc gctttaatga tgcgtgacta gcaccgcgcc cactacgtct gtgcggtggt tcggtttccg tgattcgagg agacgatggt cgcattatcc tggatgaagc cgcgctggct acccgagtgt cgctgtatcg gagccgacac agccct tccc cgcgcccgct ctaaatactg gggtggatca gtgattttgg accgcacgcc gtttatccgg agctcctgca tggatgtcgc gcgccgggca aagccgggca tccccgccgc agctgggtaa ttggcgataa ataacgacat ggaaggcggc ttgctgatgc ttatcagccg ttgaagtggc aggtagcaga ttactgccgc tct tcccgag gttgctgcat tgatttcagc cctacgggta tttcggcggt caaggtcgaa tgaactgcac cgaggtgcgg cgttaaccgt gcaggatatc gaaccatccg caatattgaa accggcgatg gatcatctgg ctggatcaaa cacggccacc ggctgtgccg gatcctttgc gcaggcgttt gtcgctgatt cgatacgccg gcatccagcg gcaaaccatc ctggatggtg tccacaaggt actctggctc catcagcgcc gtcccacgcc taagcgttgg aaaacaactg tggcgtaagt gggccat tac ggtgctgatt gaaaacctac gagcgataca gcgggtaaac ctgt 11 tgac cgaaaacggt aaaccgacta cgcgctgtac acagtttctt gaaattatcg aacccgaaac accgccgacg attgaaaatg cacgagcatc ctgctgatga ctgtggtaca acccacggca agcgaacgcg tcgctgggga tctgtcgatc gatattattt aaatggtcca gaatacgccc cgtcagtatc aaatatgatg aacgatcgcc ctgacggaag gaagtgacca gcgctggatg aaacagttga acagtacgcg tggcagcagt atcccgcatc caatttaacc ctgacgccgc gaagcgaccc caggccgaag acgaccggtc cggattgatg ccgcatccgg tggctcggat cgctgggatc ctgcgctgcg cacaaatcag tggaggctga tatggcaggg atgagcgtgg tgtggagcgc gcacgctgat gtctgctgct atcctctgca agcagaacaa cgctgtgcga tggtgccaat taacgcgaat atgaatcagg cttcccgccc gcccgatgta tcaaaaaatg acgcgatggg cccgtttaca aaaacggcaa agttctgtat caaaacacca gcgaatacct gtaagccgct ttgaactgcc tagtgcaacc ggcgtctggc tgaccaccag gccagtcagg tgcgcgatca gcattgaccc cagcgttgtt acgcgtggca gtagtggtca cgcggattgg tagggccgca tgccattgtc ggacgcgcga 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 -2- 131329-序列表.doc 200909578
attgaat tat ggcccacacc agtggcgcgg cgacttccag ttcaacatca gccgctacag 3840 tcaacagcaa ctgatggaaa ccagccatcg ccatctgctg cacgcggaag aaggcacatg 3900 gctgaatatc gacggt t tcc atatggggat tggtggcgac gactcctgga gcccgtcagt 3960 atcggcggaa ttccagctga gcgccgttcg ctaccat tac cagttggtct ggtgtcaaaa 4020 ataaggatcc tcgataccaa caacggtaga aagtgttaca atatctacta caaaatatac 4080 aactagtgac tttatagaga tatttggcat tgtttcacta attttattat tggccgtggc 4140 gattttctgt attatatatt at t tctgtag tggacggtct cgtaaacaag aaacaaatat 4200 attatagatt ttaactcaga taaatgtctg gaataattaa atctatcgtt ttgagcggac 4260 catctggttc cggcaagaca gctatagtca ggagactctt acaagat tat ggaaatatat 4320 ttggatttgt ggtatcccat accactagat ttcctcgtcc tatggaacga gaaggtgtcg 4380 tctaccatta cgttaacaga gaggccattt ggaagggaat agccgctgga aacttgctag 4440 aacatacaga gtttttggga aatatttatg ggacttctaa aacatccatg aacacagctg 4500 ctat taataa tcgtatatgt gttatggatt taaacat tga cggagttagg agtcttaaaa 4560 acacatactt gatgcct tac tctgtttata taagacctac atctct taaa atggtagaaa 4620 ctgcatgccc tgatgcggta 111 tctcct t acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 4680 tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg 4740 ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 4800 gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 4860 gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg 4920 gt t tct taga cgtcaggtgg cact 11 tcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 4980 tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 5040 caataatat t gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 5100 ttttttgcgg cat 11 tgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 5160 gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 5220 aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 5280 ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtat t gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 5340 atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatct tacg 5400 gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 5460 gccaact tac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgct 11 tttgcacaac 5520 atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 5580 aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactat ta 5640 actggcgaac tact tactct agcttcccgg caacaat taa tagactggat ggaggcggat 5700 aaagttgcag gaccact tct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 5760 tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcat tgcag cactggggcc agatggtaag 5820 ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 5880 agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagt t 5940 tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 6000 aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atccct taac gtgagttttc gttccactga 6060 131329-序列表.doc
200909578 gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctct111tcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagagc tc <210> 2 <211〉 5508 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 質粒 <400> 2 gagctcataa atagtaaacc gatagtgtat aaagattgtg caatgctttt gcgatcaata aatggatcac aaccagtatc tgttgacgat gttcttcgca gatgatgatt cattttttaa atatttagct agtcaagacg atgaatcttc attatccgat atattgcaaa ttacccaata tcttgatttt ttattgttgt tattgataca gtcaaaaaat aaactagagg ctgtaggtca ttgttatgaa tctctttcgg aggaatatag acaattggcg aaatttacag acactcaaga gtttaaaaaa ctatttaata aggttcctat tgctacagac ggacgcgtta aacttaataa agggtattta tttgactttg ttgtcagtat gatgagattt aaaaaagagt catctataat accaaacata gatccggttc gatacataga tcctcgtcga gatatagtat tttctaacgt aatggatata ttaaagtcta ataaagtgaa caataattaa atttttattg tcacctagga attcgtcgac gcggccgcct gcagaagctt ggtaccattt atattccaaa aaaaaaaaat aaaatttcaa tttttacata catatattct aaatatgaaa gtggtgattg tgactagcgt agcatcgctt ctagacatct atatactata tagtaatacc aatactcaag actacgaaac tgatacaatc tcttatcatg tgggtaatgt tctcgatgtc gatagccata tgcccggtag ttgcgatata cataaactga tcactaattc caaacccacc cgctttttat agtaagt111 tcacccataa ataataaata caataattaa tttctcgtaa aagtagaaaa tatattctaa tttattgcac ggtaaggaag tagaatcata aagaacagtg acatggatcc ggtccgtcct gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca 131329-序列表.doc 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6872 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 200909578
attgctgtgc caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg cagatat teg taattatgcg 1140 ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc 1200 gtgctgcgtt tcgatgcggt cactcat tac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg 1260 atggagcatc agggcggcta tacgccatt t gaagccgatg tcacgccgta tgt tattgee 1320 gggaaaagtg tacgtatcac cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg 1380 ccgggaatgg tgat taccga cgaaaacggc aagaaaaagc agtettaett ccatgatttc 1440 11 taactatg ccggaatcca tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg 1500 gacgatatca ccgtggtgac gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg 1560 caggtggtgg ccaatggtga tgtcagcgt t gaactgcgtg atgeggatea acaggtggtt 1620 gcaactggac aaggcactag cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg 1680 ggtgaaggtt atctctatga actgtgcgtc acagccaaaa gccagacaga gtgtgatatc 1740 tacccgcttc gcgtcggcat ccggtcagtg gcagtgaagg gccaacagtt cctgattaac 1800 cacaaaccgt tctactttac tggctttggt cgtcatgaag atgeggaett acgtggcaaa 1860 ggattcgata acgtgctgat ggtgcacgac cacgcat taa tggactggat tggggccaac 1920 tcctaccgta cctcgcat ta ccct tacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat 1980 ggcatcgtgg tgattgatga aactgctgct gtcggctttt cgctctct 11 aggcattggt 2040 ttcgaagcgg gcaacaagcc gaaagaactg tacagcgaag aggeagteaa cggggaaact 2100 cagcaagcgc acttacaggc gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc 2160 gtggtgatgt ggagtattgc caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc aegggaatat 2220 t tcgcgccac tggcggaagc aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc 2280 aatgtaatgt tctgcgacgc tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc 2340 ctgaaccgtt attacggatg gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta 2400 ctggaaaaag aacttctggc ctggcaggag aaactgcatc ageegattat catcaccgaa 2460 tacggcgtgg atacgttagc cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag 2520 tatcagtgtg catggctgga tatgtatcac cgcgtctttg ategegteag cgccgtcgtc 2580 ggtgaacagg tatggaattt cgccgatttt gcgacctcgc aaggeatatt gcgcgttggc 2640 ggtaacaaga aagggatctt cactcgcgac cgcaaaccga agteggegge ttttctgctg 2700 caaaaacgct ggactggcat gaacttcggt gaaaaaccgc ageagggagg caaacaatga 2760 ggatccggaa atggtagtaa aactgacagc ggtatgtatg aaatgcttta aagaggcgtc 2820 gt 11 tctaaa cgtttgggaa cggaaaccga gatcgaaata attggtggtg aagatatgta 2880 tcaatccgta tgcagaaagt gttacatcaa cgaatgataa tttttctata aaaaactaaa 2940 aataaacatt gattaaattt taatataata cttaaaaatg gatgttgtgt cactggataa 3000 accgtttatg tattttgagg aaatagataa tgaactagaa tacgaaccag aaagtgcaaa 3060 tgaggttgct aaaaaacttc catatcaggg acaattaaaa ctat tactag gagaattgtt 3120 ttttcttagt aagctacaga gacacggtat attggacggt gccactgtag tgtatatagg 3180 atcggctcct ggtacacaca tacgt tatct acgtgatcat t tetataat t taggggtaat 3240 catcaaatgg atgctaattg acgggcatgc cctgatgcgg tat 11 tctcc t tacgcatct 3300 gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3360 131329-序列表.doc 200909578 gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata Ο
ggttaatgtc gcgcggaacc acaataaccc 11 tccgtgtc agaaacgctg cgaactggat aatgatgagc gcaagagcaa agtcacagaa aaccatgagt gctaaccgct ggagctgaat aacaacgt tg aatagactgg tggctggttt agcactgggg ggcaactatg t tggtaactg t taat t taaa acgtgagttt agatcct 111 ggtggtttgt cagagcgcag gaactctgta cagtggcgat gcagcggtcg caccgaactg aaaggcggac tccaggggga gcgtcgattt ggccttttta atcccctgat cagccgaacg atgataataa cctatttgtt tgataaatgc gcccttattc gtgaaagtaa ctcaacagcg acttttaaag ctcggtcgcc aagcatct ta gataacactg tttttgcaca gaagccatac cgcaaactat atggaggcgg at tgctgata ccagatggta gatgaacgaa tcagaccaag aggatctagg tcgttccact tttctgcgcg ttgccggatc ataccaaata gcaccgccta aagtcgtgtc ggctgaacgg agatacctac aggtatccgg aacgcctggt ttgtgatgct cggttcctgg tctgtggata accgagcgca tggtttctta tatttttcta ttcaataata ccttttttgc aagatgctga gtaagatcct ttctgctatg gcatacacta cggatggcat cggccaactt acatggggga caaacgacga taactggcga ataaagt tgc aatctggagc agccctcccg atagacagat 11 tactcata tgaagatcct gagcgtcaga taatctgctg aagagctacc ctgttcttct catacctcgc ttaccgggtt ggggttcgtg agcgtgagct taagcggcag atct t tatag cgtcaggggg cct 11 tgctg accgtattac gcgagtcagt gacgtcaggt aatacat tea ttgaaaaagg ggcattttgc agatcagttg tgagagtttt tggcgcggta ttctcagaat gacagtaaga acttctgaca tcatgtaact gcgtgacacc actacttact aggaccactt cggtgagcgt tategtagtt egetgagata tataetttag 111 tgataat ccccgtagaa ct tgcaaaca aactct 1111 agtgtagccg tetgetaate ggactcaaga cacacagccc atgagaaage ggtcggaaca tcctgtcggg gcggagccta gccttttgct egeetttgag gagegaggaa ggcacttttc aatatgtatc aagagtatga cttcctgttt ggtgcacgag cgccccgaag t tatcccgta gacttggttg gaattatgea aegateggag cgccttgatc acgatgcctg ctagcttccc ctgcgctcgg gggtctcgcg atctacacga ggtgcctcac at tgat t taa ctcatgacca aagatcaaag aaaaaaccac ccgaaggtaa tagttaggee ctgttaccag cgatagttac agettggage gccacgct tc ggagagegea tttcgccacc tggaaaaacg cacatgttct tgagctgata geggaaga ggggaaatgt cgctcatgag gtattcaaca t tgctcaccc tgggttacat aacgttttcc ttgaegeegg agtactcacc gtgctgccat gaccgaagga gttgggaacc tagcaatggc ggcaacaatt cccttccggc gtatcattgc cggggagtca tgattaagea aacttcattt aaatccct ta gatet tet tg cgctaccagc ctggcttcag accacttcaa tggctgctgc eggataagge gaacgaccta ccgaagggag egagggaget tctgact tga ccagcaacgc t tcctgcgt t ccgctcgccg 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5508 <210> 3 -6- 131329-序列表.doc
200909578 <211〉 6820 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 質粒 <400> 3 ttattggaca ctagataatc atcacatgtt accacaaaat tatataatgt ataaatgcga aattattaaa cgcaaatatc catgggaaaa cgcgcagtat acagacgatt ttttacagta 11tggagagt tttataggaa gtatatagag tagaaccaga attttgtaaa aataaatcac at111tatac taatatgaaa caactatcga tagttatatt gctactatcg atagtatata caaccaaacc tcatcctaca cagatatcaa aaaaactagg cgatgatgct actctatcgt gtaatagaaa caatacacat ggatatcttg tcatgagttc ttggtataag aaaccagact ccattattct cttagcagcc aaaaacgatg tcgtatactt tgatgattat acagcggata aagtatcata cgattcaccg tatgatactc tagctacaat tattacaatt aaatcattga catctggaga tgcaggtact tatatatgcg cattctttat aacatcaaca aatgatacgg ataaaataga ttatgaagaa ttcgtcgacg cggccgcctg cagaagcttg gtaccatggg tatttatatt ccaaaaaaaa aaaataaaat ttcaattttt gctctagaca tctatatact atatagtaat accaatactc aagactacga aactgataca atctcttatc atgtgggtaa tgttctcgat gtcgatagcc atatgcccgg tagttgcgat atacataaac tgatcactaa ttccaaaccc acccgctttt tatagtaagt ttttcaccca taaataataa atacaataat taatttctcg taaaagtaga aaatatattc taatttattg cacggtaagg aagtagaatc ataaagaaca gtgacatgga tcccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcttt gcctggtttc cggcaccaga agcggtgccg gaaagctggc tggagtgcga tcttcctgag gccgatactg tcgtcgtccc ctcaaactgg cagatgcacg gttacgatgc gcccatctac accaacgtaa cctatcccat tacggtcaat ccgccgtttg ttcccacgga gaatccgacg ggttgttact cgctcacatt taatgttgat gaaagctggc tacaggaagg ccagacgcga attatttttg atggcgttaa ctcggcgttt catctgtggt gcaacgggcg ctgggtcggt tacggccagg acagtcgt11 gccgtctgaa tttgacctga gcgcattttt acgcgccgga gaaaaccgcc tcgcggtgat ggtgctgcgt tggagtgacg gcagttatct ggaagatcag gatatgtggc ggatgagcgg cattttccgt gacgtctcgt tgctgcataa accgactaca caaatcagcg atttccatgt tgccactcgc tttaatgatg atttcagccg cgctgtactg gaggctgaag ttcagatgtg cggcgagttg cgtgactacc tacgggtaac agtttcttta tggcagggtg aaacgcaggt cgccagcggc accgcgcctt tcggcggtga aattatcgat gagcgtggtg gttatgccga tcgcgtcaca ctacgtctca aggtcgaaaa cccgaaactg tggagcgccg aaatcccgaa tctctatcgt gcggtggttg aactgcacac cgccgacggc acgctgattg aagcagaagc ctgcgatgtc ggtttccgcg aggtgcggat tgaaaatggt ctgctgctgc tgaacggcaa gccgttgctg attcgaggcg ttaaccgtca cgagcatcat cctctgcatg gtcaggtcat ggatgagcag acgatggtgc aggatatcct gctgatgaag 131329-序列表.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 m 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 200909578
ϋ cagaacaact ctgtgcgacc gtgccaatca acgcgaatgg gaatcaggcc tcccgcccgg ccgatgtacg aaaaaatggc gcgatgggta cgtttacagg aacggcaacc t tctgtatga aaacaccagc gaatacctgt aagccgctgg gaactgcctg gtgcaaccga cgtctggcgg accaccagcg cagtcaggct cgcgatcagt at tgacccta gcgttgttgc gcgtggcagc agtggtcaaa cggattggcc gggccgcaag ccattgtcag acgcgcgaat cgctacagtc ggcacatggc ccgtcagtat tgtcaaaaat aaatatacaa gccgtggcga acaaatatat gagcggacca ttaacgccgt gctacggcct atcgtctgac tgcagcgcga acggcgctaa tgcagtatga cgcgcgtgga II tcgctacc acagtcttgg gcggcttcgt cgtggtcggc acggtctggt agcagt 1111 tccgtcatag caagcggtga aactaccgca acgcgaccgc aaaacctcag aaatggat 11 t tct t tcaca tcacccgtgc acgcctgggt agtgcacggc atcaggggaa tggcgattac tgaactgcca aaaactatcc acatgtatac tgaattatgg aacagcaact tgaatatcga cggcggaatt aaggatcctc ctagtgactt III tctgtat tatagatttt tctggttccg gcgctgttcg gtatgtggtg cgatgatccg tcgtaatcac tcacgacgcg aggcggcgga tgaagaccag tggagagacg cggtttcgct ctgggactgg ttacggcggt ct t tgccgac ccagt tccgt cgataacgag agtgcctctg gccggagagc atggtcagaa tgtgacgctc ttgcatcgag gatgtggatt accgctggat cgaacgctgg agatacactt aaccttattt cgttgatgtt gctggcgcag cgaccgcctt cccgtacgtc cccacaccag gatggaaacc cggtttccat ccagctgagc gataccaaca tatagagata tatatattat aactcagata gcaagacagc cattatccga gatgaagcca cgctggctac ccgagtgtga dgtatcgct gccgacacca ccct tcccgg cgcccgctga aaatactggc gtggatcagt gattttggcg cgcacgccgc ttatccgggc ctcctgcact gatgtcgctc gccgggcaac gccgggcaca cccgccgcgt ctgggtaata ggcgataaaa aacgacattg aaggcggcgg gctgatgcgg atcagccgga gaagtggcga gtagcagagc actgccgcct ttcccgagcg tggcgcggcg agccatcgcc atggggattg gccgttcgct acggtagaaa tttggcattg ttctgtagtg aatgtctgga tatagtcagg accatccgct atattgaaac cggcgatgag tcatctggtc ggatcaaatc cggccaccga ctgtgccgaa tcct t tgcga aggcgtttcg cgctgattaa atacgccgaa atccagcgct aaaccatcga ggatggtggc cacaaggtaa tctggctcac tcagcgcctg cccacgccat agcgttggca aacaactgct gcgtaagtga gccattacca tgctgattac aaacctaccg gcgatacacc gggtaaactg gttttgaccg aaaacggtct acttccagtt atctgctgca gtggcgacga accattacca gtgttacaat tttcactaat gacggtctcg ataattaaat agactcttac gtggtacacg ccacggcatg cgaacgcgta gctggggaat tgtcgatcct tat tat t tgc atggtccatc atacgcccac tcagtatccc atatgatgaa cgatcgccag gacggaagca agtgaccagc gctggatggt acagt tgat t agtacgcgta gcagcagtgg cccgcatctg at t taaccgc gacgccgctg agcgacccgc ggccgaagca gaccggtcac gattgatggt gcatccggcg gctcggatta ctgggatctg gcgctgcggg caacatcagc cgcggaagaa ctcctggagc gttggtctgg atctactaca tttattattg taaacaagaa ctatcgtttt aagattatgg 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 131329·序列表.doc 200909578
aaatatatn ggatttgtgg tatcccatac cactagat 11 cctcgtccta tggaaegaga 4320 aggtgtcgtc taccattacg t taacagaga ggccatttgg aagggaatag ccgctggaaa 4380 ct tgctagaa catacagagt ttttgggaaa tatttatggg acttctaaaa catccatgaa 4440 cacagctgct at taataatc gtatatgtgt tatggattta aacattgacg gagttaggag 4500 tct taaaaac acatacttga tgccttactc tgtttatata agacctacat ctcttaaaat 4560 ggtagaaact gcatgccctg atgeggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 4620 accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc egeatagt ta agccagcccc 4680 gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 4740 acagacaagc tgtgaccgtc teegggaget gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 4800 cgaaacgcgc gagaegaaag ggcctcgtga tacgcctat t 11 tataggt t aatgtcatga 4860 taataatggt t tct tagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 4920 tttgtttatt 11 tetaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 49S0 aaatgct tea ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacat t tc cgtgtcgccc 5040 ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgttt ttgc tcacccagaa acgctggtga 5100 aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg t tacatcgaa ctggatctca 5160 acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgageaett 5220 ttaaagttct gctatgtggc geggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 5280 gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 5340 atettaegga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 5400 acactgcggc caact tact t ctgacaacga tcggaggacc gaaggageta accgcttttt 5460 tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 5520 ccataccaaa egaegagegt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca aegttgegea 5580 aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 5640 aggeggataa agttgcagga ccact tctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 5700 ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cat tgeagea ctggggccag 5760 atggtaagcc ctcccgtatc gtagt tatet acacgacggg gagteaggea actatggatg 5820 aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 5880 accaagttta ctcatatata ctttagattg at t taaaact tcatttttaa tttaaaagga 5940 tctaggtgaa gatccttttt gataatetea tgaccaaaat ccct taacgt gagttttcgt 6000 tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc t tct tgagat cctttttttc 6060 tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 6120 cggatcaaga gctaccaact ct 111 teega aggtaactgg ct teageaga gcgcagatac 6180 caaatactgt tct tetagtg tageegtagt taggccacca ct tcaagaac tctgtagcac 6240 cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 6300 cgtgtct tac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 6360 gaacgggggg t tcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 6420 acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca eget tcccga agggagaaag gcggacaggt 6480 atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggaget tcca gggggaaacg 6540 131329-序列表.doc 200909578 cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagagctc 6600 6660 6720 6780 6820
<210> 4 <211> 8373 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 質粒 <400> 4 ttattggaca ctagataatc atcacatgtt aattattaaa cgcaaatatc catgggaaaa tttggagagt tttataggaa gtatatagag at111tatac taatatgaaa caactatcga caaccaaacc tcatcctaca cagatatcaa gtaatagaaa caatacacat ggatatcttg ccattattct cttagcagcc aaaaacgatg aagtatcata cgattcaccg tatgatactc catctggaga tgcaggtact tatatatgcg ataaaataga ttatgaagaa ttcgtcgact gattcccatg aagatatgat cttcccgctt cctctgagat tgtgttgtgt aggttccgat aaaattatca acatcaaggc agtcagggcc ttcgggagac ccaagtcaac tcctgagatc acaaaatcct cagcctcgtc accgttcttg ataaggggga taaccgagga taccaacaac atctctggga ttaagacatt gccgtcaggt 11tacatgag gatgacacct ccccccaact ttccaagttc tgactgactt gtagtgagca gtatatgctt ttccaaaccc agggacaagt actgacttgg tggtcatgat ggactctagt aactcctcta caacaaggtg ctcaatttcg tgaccgggag ggcaccattt ggtttcattt ataagtctaa gtccgagaac tccacataac tataggcctc ΐ t tcatctac aaagccgcaa ctactattgg taaaaatgtc acaagacatc gtgtaatcgt ggttagtgga gcagtaggta accacaaaat tatataatgt ataaatgcga cgcgcagtat acagacgatt ttttacagta tagaaccaga attttgtaaa aataaatcac tagttatatt gctactatcg atagtatata aaaaactagg cgatgatgct actctatcgt tcatgagttc ttggtataag aaaccagact tcgtatactt tgatgattat acagcggata tagctacaat tattacaatt aaatcattga cattctttat aacatcaaca aatgatacgg cacagtccgg tctcaccccc gctcttgtat tggggagtga ctgacacctc cctccctgtc cgattgactc ttctccagca tgtcatcagg cctgcactca gtaatacata cttcccccag cgttcgtgca catcgggaag gtgaacttea aaaacggtag acgggtctgc cagggggtgc tccatatgtt gctggaggag ggatgattgc cctaatat ta taccat tgaa aaataccccg ct taaacacc ct 11 tgaagg gatgatetea tegget tcca tcaaggtct t gt tgaatatg 11tettaaat gactgagacg tctgaaaclc gcatccagac actcctctct cttcttgacc tctgagcgaa agtcgtgcaa attgatcaac gatgtttgea tcgagaccca tgttccatcc tggagtttgc atgctccttt taaagactta gtctcactcc ctttggatgc tetetteed cctagtctcg gatteteggg catccaaatg gaagacaccg ctactcctga gcacttcccg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 m 780 840 卯0 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 -10- 131329-序列表.doc 200909578
ccagggaaga ccctcgagtg aagggatctg tcatatgggt ccaaatctgc cacacttgga 1680 gatatgataa cgagagactc cttggtggtt tttacagttc gaagccagtg gtagtcaggg 1740 tacggattgt gtagagactc t tcatatctg gggtcaccgg ccatct tcca gttgtacgcg 1800 gctctacatg catctggtgt tgggcggaaa tgctttcttt tgaacgtggt tgtgacataa 1860 ccaacgaagt tagtgtaggt ΐ tcagcctcc gtcacaacgc ctgtgcaagt gaacccgt tc 1920 atttttatgg ctgagatgta tccaact t ta agttccatgt aggagaaccc tgacaggttg 1980 gtgcatcct t cgtcctccac taccaaattg tttgggcagc tgaggtgatg tatgtcaatc 2040 gggctccagg gaccaagct t gtctggtatc gtgtaaatag ggaatttccc aaaacacaat 2100 ggaaaaacca gaaggggtac aaacaggaga gcctgaggaa ccggtaccat gggtatttat 2160 at tccaaaaa aaaaaaataa aatttcaatt tttgctctag acatctatat actatatagt 2220 aataccaata ctcaagacta cgaaactgat acaatctct t atcatgtggg taatgttctc 2280 gatgicgata gccatatgcc cggtagttgc gatatacata aactgatcac taattccaaa 2340 cccacccgct 111 tatagta agtttttcac ccataaataa taaatacaat aattaatttc 2400 tcgtaaaagt agaaaatata ttctaattta ttgcacggta aggaagtaga atcataaaga 2460 acagtgacat ggatcccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 2520 aact taatcg cct tgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 2580 gcaccgatcg ccct tcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc tttgcctggt 2640 t tccggcacc agaagcggtg ccggaaagct ggctggagtg cgatcttcct gaggccgata 2700 ctgtcgtcgt cccctcaaac tggcagatgc acggttacga tgcgcccatc tacaccaacg 2760 taacctatcc cat tacggtc aatccgccgt ttgttcccac ggagaatccg acgggttgtt 2820 actcgctcac atttaatgtt gatgaaagct ggctacagga aggccagacg cgaattattt 2880 ttgatggcgt taactcggcg tttcatctgt ggtgcaacgg gcgctgggtc ggt tacggcc 2940 aggacagtcg 11 tgccgtct gaat t tgacc tgagcgcatt t ttacgcgcc ggagaaaacc 3000 gcctcgcggt gatggtgctg cgttggagtg acggcagt ta tctggaagat caggatatgt 3060 ggcggatgag cggcat 11 tc cgtgacgtct cgttgctgca taaaccgact acacaaatca 3120 gcgat t tcca tgttgccact cgctttaatg atgatttcag ccgcgctgta ctggaggctg 3180 aagt tcagat gtgcggcgag ttgcgtgact acctacgggt aacagtttct ttatggcagg 3240 gtgaaacgca ggtcgccagc ggcaccgcgc ctttcggcgg tgaaat tatc gatgagcgtg 3300 gtggttatgc cgatcgcgtc acactacgtc tcaaggtcga aaacccgaaa ctgtggagcg 3360 ccgaaatccc gaatctctat Cgtgcggtgg t tgaactgca caccgccgac ggcacgctga 3420 t tgaagcaga agcctgcgat gtcggtttcc gcgaggtgcg gat tgaaaat ggtctgctgc 3480 tgctgaacgg caagccgt tg ctgattcgag gcgt taaccg tcacgagcat catcctctgc 3540 atggtcaggt catggatgag cagacgatgg tgcaggatat cctgctgatg aagcagaaca 3600 act t taacgc cgtgcgctgt tcgcat tatc cgaaccatcc gctgtggtac acgctgtgcg 3660 accgctacgg cctgtatgtg gtggatgaag ccaatattga aacccacggc atggtgccaa 3720 tcaatcgtct gaccgatgat ccgcgctggc taccggcgat gagcgaacgc gtaacgcgaa 3780 tggtgcagcg cgatcgtaat cacccgagtg tgatcatctg gtcgctgggg aatgaatcag 3840 gccacggcgc taatcacgac gcgctgtatc gctggatcaa atctgtcgat cct tcccgcc 3900 13丨329-序列表.doc -11 - 200909578
cggtgcagta tgaaggegge ggagccgaca ccacggccac egatattatt tgcccgatgt 3960 acgcgcgcgt ggatgaagac cagcccttcc cggctgtgcc gaaatggtcc atcaaaaaat 4020 ggctttcgct acctggagag acgcgcccgc tgatcctttg cgaatacgcc cacgcgatgg 4080 gtaacagtct tggcggtttc gctaaatact ggcaggcgtt tegteagtat ccccgt t tac 4140 agggcggctt cgtctgggac tgggtggatc agtcgctgat taaatatgat gaaaacggca 4200 acccgtggtc ggettaegge ggtgattttg gcgatacgcc gaaegatege cagt tctgta 4260 tgaacggtct ggtctttgcc gaccgcacgc cgcatccagc gctgacggaa gcaaaacacc 4320 agcagcagt t 11 tccagt tc cgtttatccg ggcaaaccat cgaagtgacc agcgaatacc 4380 tgt tccgtca tagcgataac gagctcctgc actggatggt ggcgctggat ggtaageege 4440 tggcaagcgg tgaagtgcct ctggatgtcg ctccacaagg taaacagt tg at tgaactgc 4500 ctgaactacc gcagccggag agcgccgggc aactctggct cacagtacgc gtagtgcaac 4560 cgaacgcgac cgcatggtca gaagccgggc acatcagcgc ctggcagcag tggcgtctgg 4620 cggaaaacct cagtgtgacg ctccccgccg cgtcccacgc catcccgcat ctgaccacca 4680 gcgaaatgga 1111 tgeate gagctgggta ataagcgttg gcaatttaac cgccagtcag 4740 get t tct t tc acagatgtgg attggegata aaaaacaact gctgacgccg ctgcgcgatc 4800 agt tcacccg tgcaccgctg gataacgaca ttggcgtaag tgaagcgacc cgcattgacc 4860 ctaacgcctg ggtegaaege tggaaggegg cgggccat ta ccaggccgaa gcagcgttgt 4920 tgcagtgcac ggcagataca cttgctgatg cggtgctgat tacgaccggt cacgcgtggc 4980 agcatcaggg gaaaacct ta tttatcagcc ggaaaaccta ccggattgat ggtagtggtc 5040 aaatggcgat taccgt tgat gttgaagtgg cgagcgatac accgcatccg gegeggattg 5100 gcctgaactg ccagctggcg caggtagcag agcgggtaaa ctggctcgga ttagggccgc 5160 aagaaaacta tcccgaccgc ct tactgccg cctgttttga ccgctgggat ctgccattgt 5220 cagacatgta taccccgtac gtet tcccga gcgaaaacgg tctgcgctgc gggacgcgcg 5280 aat tgaat ta tggcccacac cagtggcgcg gcgacttcca gttcaacatc agccgctaca 5340 gtcaacagca actgatggaa accagccatc gccatctgct gcacgcggaa gaaggcacat 5400 ggctgaatat cgacggtttc catatgggga ttggtggcga cgactcctgg agcccgtcag 5460 tateggegga attccagctg agcgccgttc gctaccatta ccagttggtc tggtgtcaaa 5520 aataaggatc ctcgatacca acaacggtag aaagtgt tac aatatctact acaaaatata 5580 caactagtga etttatagag atatttggca ttgtttcact aattttatta ttggccgtgg 5640 cgattttctg tattatatat tatttctgta gtggacggtc tcgtaaacaa gaaacaaata 5700 tattatagat tttaactcag ataaatgtct ggaataat ta aatctatcgt tttgagcgga 5760 ccatctggt t ccggcaagac agetatagte aggagactct tacaagatta tggaaatata 5820 tttggatttg tggtatccca taccactaga tt tcctcgtc ctatggaacg agaaggtgtc 5880 gtctaccat t acgttaacag agaggccatt tggaagggaa tagccgctgg aaaettgeta 5940 gaacatacag agtttttggg aaatatttat gggaetteta aaacatccat gaacacagct 6000 getat taata ategtatatg tgttatggat ttaaacat tg aeggagttag gagtettaaa 6060 aacacatact tgatgeetta ctctgtttat ataagaccta catctct taa aatggtagaa 6120 131329·序列表.doc -12- 200909578
actgcatgcc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 6180 atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 6240 gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc t tgtctgctc ccggcatccg ct tacagaca 6300 agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 6360 cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 6420 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 6480 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatget 6540 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tat tcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 6600 cttttttgcg gcat 11 tgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 6660 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 6720 taagatcct t gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagea cttttaaagt 6780 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 6840 catacactat tctcagaatg act tggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 6900 ggatggcatg acagtaagag aat tatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 6960 ggccaactta ct tctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 7020 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 7080 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 7140 aactggcgaa ctact tactc tagcttcccg gcaacaat ta atagactgga tggaggcgga 7200 taaagt tgca ggaccact tc tgcgctcggc cct tccggct ggctggttta ttgctgataa 7260 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 7320 gccctcccgt atcgtagt ta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaaegaaa 7380 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gat taagcat tggtaactgt cagaccaagt 7440 ttactcatat atactttaga t tgat t taaa act teat 111 taat t taaaa ggatctaggt 7500 gaagatcctt 11 tgataatc tcatgaccaa aatccct taa cgtgagtttt cgttccactg 7560 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atet tct tga gatccitttt ttctgcgcgt 7620 aatctgctgc t tgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgeeggatea 7680 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 7740 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 7800 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 7860 taccgggt tg gactcaagac gatagt tacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 7920 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 7980 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgct tcc egaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 8040 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagett ccagggggaa acgcctggta 8100 tct t tatagt cctgtcgggt t tcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 8160 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 8220 cttttgctgg ccttttgctc acatgt tct t tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 8280 ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc ageegaaega ccgagcgcag 8340 cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagag etc 8373 13Π29-序列表.doc 200909578 <21ϋ> 5 <211> 702
<212> DNA <213>豬環狀病毒 <220> <221> misc_feature <222> (1).；(702) <223>豬第2Α型環狀病毒ORF2
<400> 5 atgacgtatc caaggaggcg ΐ taccgcaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60 cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgctaccg ttggagaagg 120 aaaaatggca tct tcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caaggctacc 180 acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat ttaatattga cgact t tgt t 240 cccccgggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag 3⑻ gttaaggttg aat tctggcc ctgctccccc atcacccagg gtgatagggg agtgggctcc 360 actgctgtta t tctagatga taact t tgta acaaaggcca cagccctaac ctatgaccca 420 tatgtaaact actcctcccg ccatacaatc ccccaaccct tctcctacca ctcccgttac 480 t tcacaccca aacctgttct tgactccacc attgattact tccaaccaaa taacaaaagg 540 aatcagctt t ggatgaggct acaaacctct agaaatgtgg accacgtagg cctcggcact 600 gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660 ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaaccct aa 702 <210> 6 <211> 702 <212> DNA <213>豬環狀病毒 <220> <221> misc feature <222> (1).7(702) <223>豬第2B型環狀病毒ORF2 <400> 6 atgacgtatc caaggaggcg t taccgaaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60 cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120 aaaaatggca tct tcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caagcgaacc 180 acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat tcaatat taa tgactt tct t 240 cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aataagaaag 300 gttaaggttg aat tctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360 agtgctgtta t tctagatga taact t tgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc 420 tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccggtac 480 tttaccccca aacctgtcct agattccact attgattact tccaaccaaa caacaaaaga 540 aaccagctgt ggctgagact acaaactgct ggaaatgtag accacgtagg cctcggcact 600 gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggaa tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660 ttcagagaat ttaattttaa agacccccca cttaaccctt aa 702 131329-序列表.doc •14-
200909578
<210> 7 <211> 765 <212> DNA <213>豬繁殖與呼吸症候群病毒 <220> <221> misc_feature <222> (1).7(765) <223〉豬繁殖與呼吸症候群病毒株ISU12 ORF3 <400> 7 atggctaata gctgtacatt cctccatatt ttcctctgtt gcagcttctt gtactctttt tgttgtgctg tggttgcggg ttccaatgct acgtactgtt tttggtttcc gctggttagg ggcaattttt ctttcgaact cacggtgaac tacacggtgt gcccgccttg cctcacccgg caagcagccg cagaggccta cgaacccggt aggtcccttt ggtgcaggat agggcatgat cgatgtgggg aggacgatca tgatgaacta gggtttgtgg tgccgcctgg cctctccagc gaaggccact tgaccagtgc ttacgcctgg ttggcgttcc tgtccttcag ctatacggcc cagttccatc ccgagatatt cgggataggg aatgtgagtc gagtctatgt tgacatcaag caccaattca tttgcgctgt tcatgatggg cagaacacca ccttgcccca ccatgacaac atttcagccg tgtttcagac ctattaccag catcaggtcg acggcggcaa ttggtttcac ctagaatggc tgcgtccctt cttttcctct tggttggttt taaatgtctc ttggtttctc aggcgttcgc ctgcaagcca tgtttcagtt cgagtctttc agacatcaag accaacacca ccgcagcggc aggctttgct gtcctccaag acatcagttg ccttaggcat cgcaactcgg cctctgaggc gattcgcaaa gtccctcagt gccgcacggc gatag
<210> 8 <211〉 537 <212> DNA <213>豬繁殖與呼吸症候群病毒 <220> <221> misc—feature <222> (1).7(537) <223>豬繁殖與呼吸症候群病毒株ISU12 ORF4 <400> 8 atggctgcgt cccttctttt cctcttggtt ggttttaaat gtctcttggt ttctcaggcg ttcgcctgca agccatgttt cagttcgagt ctttcagaca tcaagaccaa caccaccgca gcggcaggct ttgctgtcct ccaagacatc agttgcctta ggcatcgcaa ctcggcctct gaggcgattc gcaaagtccc tcagtgccgc acggcgatag ggacacccgt gtatatcact gtcacagcca atgttaccga tgagaattat ttgcattcct ctgatcttct catgctttct tcttgccttt tctatgcttc tgagatgagt gaaaagggat ttaaggtggt atttggcaat gtgtcaggca tcgtggcagt gtgcgtcaac ttcaccagtt acgtccaaca tgtcaaggaa tttacccaac gttccttggt agttgaccat gtgcggctgc tccatttcat gacgcccgag accatgaggt gggcaactgt tttagcctgt ctttttgcca ttctgttggc aatttga <210〉 9 <211> 603 131329-序列表.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 765 60 120 180 240 300 360 420 480 537 -15- 200909578
<212> DNA <213>豬繁殖與呼吸症候群病毒 <220> <221〉 misc一feature <222> (1)..(603) <223〉豬繁殖與呼吸症候群病毒株ISU12 ORF5 <400〉 9
atgttgggga aatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcaat tgcttttttt gtggtgtatc 60 gtgccgtctt gttttgttgc gctcgtcagc gccaacggga acagcagctc aaatttacag 120 ctgatttaca acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctagc taataaattt 180 gactgggcag tggagtgttt tgtcattttt cctgtgttga ctcacattgt ctcttatggt 240 gccctcacta ctagccattt ccttgacaca gtcggtctgg tcactgtgtc taccgctggg 300 tttgttcacg ggcggtatgt tctgagtagc atctacgcgg tctgtgccct ggctgcgttg 360 atttgcttcg tcattaggct tgcgaagaat tgcatgtcct ggcgctactc atgtaccaga 420 tataccaact ttcttctgga cactaagggc agactctatc gttggcggtc gcctgtcatc 480 atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgaa ggtcacctga tcgacctcaa aagagttgtg 540 cttgatggtt ccgcggctac ccctgtaacc agagtttcag cggaacaatg gggtcgtcct 600 tag 603
<210> 10 <211> 525 <212> DNA <213>豬繁殖與呼吸症候群病毒 <220> <221> misc—feature <222> (1).7(525) <223>豬繁殖與呼吸症候群病毒株ISU12 ORF6 <400> 10 atggggtcgt ccttagatga cttctgtcat gatagcacgg ctccacaaaa ggtgctcttg 60 gcgttttcta ttacctacac gccagtgatg atatatgccc taaaggtgag tcgcggccga 120 ctgctagggc ttctgcacct tttgatcttc ctgaattgtg ctttcacctt cgggtacatg 180 acattcgtgc actttcagag tacaaataag gtcgcgctca ctatgggagc agtagttgca 240 ctcctttggg gggtgtactc agccatagaa acctggaaat tcatcacctc cagatgccgt 300 ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgttga aagtgccgca 360 ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctcc 420 actacggtca acggcacatt ggtgcccggg ttaaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaaa 480 gctgttaaac agggagtggt aaaccttgtc aaatatgcca aataa 525
<210> 11 <211> 372 <212> DNA <213>豬繁殖與呼吸症候群病毒 <220> <221> misc一feature <222> (1).7(372) -16- 131329-序列表.doc 200909578 <223>豬繁殖與呼吸症候群病毒株ISU12 0RF7 <400> 11 atgccaaata acaacggcaa gcagcagaag agaaagaagg gggatggcca gccagtcaat cagctgtgcc agatgctggg taagatcatc gctcagcaaa accagtccag aggcaaggga ccgggaaaga aaaataagaa gaaaaacccg gagaagcccc atttccctct agcgactgaa gatgatgtca gacatcactt tacccctagt gagcggcaat tgtgtctgtc gtcaatccag accgccttta atcaaggcgc tgggacttgc accctgtcag attcagggag gataagttac actgtggagt ttagtttgcc tacgcatcat actgtgcgcc tgatccgcgt cacagcatca ccctcagcat ga 60 120 180 240 300 360 372 <210> 12 <211〉 606 <212> DNA <213>豬繁殖與呼吸症候群病毒 L· <220> <221> misc_feature <222> (1).7(606) <223>豬繁殖與呼吸症候群病毒株Olot/91 ORF5 <400> 12 atgagatgtt ctcacaaatt ggggcgtttc ttgactcctc actcttgctt ctggtggctt tttttgctgt gtaccggctt gtcctggtcc tttgtcgctg gcagcggcag cagctcgaca taccaataca tatataactt aacgatatgc gagctgaatg ggaccgactg gttgtccaac cattttgatt gggcagtcga gacctttgtg ctttacccgg ttgccactca tatcctctca ctgggttttc tcacaacaag ccattttttt gacgcgctcg gtctcggcgc tgtgtccact acaggatttg ttggcgggcg gtatgtactc agcagcgtgt acggcgcttg tgctttcgca gcgctcgtat gttttgtcat ccgtgctgtt aaaaattgca tggcttgccg ctatgcccac acccggttta ccaacttcat tgtggacgac cgggggagaa tccatcggtg gaagtctcca atagtggtag agaaattggg caaagctgaa gtcggtggcg accttgtcac catcaaacat gtcgtcctcg aaggggttaa agctcaaccc ttgacgagga cttcggctga gcaatgggaa gcctag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 606 131329-序列表.doc 17-

Claims (1)

  1. 200909578 十、申請專利範圍： 1. 一種重組浣熊痘病毒載體（rRCNV),其包含一或多個編 碼豬繁殖與呼吸症候群病毒（pRRSV)蛋白之外源核酸分 子，其中： (a) 至少一個核酸分子嵌入該浣熊痘病毒基因組之血球 凝集素基因座或胸苷激酶基因座中；或 (b) 至少兩個核酸分子嵌入該浣熊痘病毒基因組之血球 凝集素基因座或胸苷激酶基因座中；或 (c) 至少一個核酸分子嵌入該浣熊痘病毒基因組之血球 凝集素基因座中且至少一個核酸分子嵌入該浣熊痘 病毒基因組之胸苷激酶基因座中。 2. 如請求項1之重組浣熊痘病毒載體，其中至少兩個核酸 为子嵌入該浣熊痘病毒基因組之血球凝集素基因座令且 至少兩個核酸分子嵌入該浣熊痘病毒基因組之胸苷激酶 基因座中。 3_如請求項1或2中任一項之重組浣熊痘病毒載體，其進_ 步包含除在該浣熊痘病毒基因組之胸苷激酶及血球凝集 素基因座外亦在該浣熊痘病毒基因組之第三非必需位點 中嵌入一個編碼豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV)蛋白 的核酸分子。 4·如請求項3之重組浣熊痘病毒載體，其中該浣熊痘病毒 基因組之該第三非必需位點係絲胺酸蛋白酶抑制劑位 點。 5·如請求項1至4中任一項之重組浣熊痘病毒載體，其中該 131329.doc 200909578 痘病毒載體編碼相同豬繁殖與呼吸症候群病毒蛋白之至 少兩個拷貝。 6. 如請求項5之重組浣熊痘病毒載體，其中該相同蛋白之 該兩個拷貝係由兩個不同核酸分子編碼。 7. 如請求項5之重組浣熊痘病毒載體，其中該相同蛋白之 ' 該兩個拷貝係由相同核酸分子編碼。 ' 8.如請求項7之重組浣熊痘病毒載體，其中該相同蛋白之 該兩個拷貝可操作地連接於一個啓動子。 〇 9.如請求項6或7中任一項之重組浣熊痘病毒載體，其中該 相同蛋白之該兩個拷貝可操作地連接於各別啓動子。 1 0.如請求項6、7、8或9中任一項之重組浣熊痘病毒載體， 其中該相同蛋白之該兩個拷貝係由一個選自由ORF 1、 ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7及其組合組 成之群之豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV)開放讀碼框 (ORF)編碼。 1 1.如請求項1或2中任一項之重組浣熊痘病毒載體，其中各 ^ 外源核酸分子編碼PRRSV ORF。 12.如請求項11之重組浣熊痘病毒載體，其中該ORF係一或 多個選自由 ORF1 、 ORF2 、 ORF3 、 ORF4 、 ORF5 、 ORF6、ORF7及其組合組成之群。 1 3.如請求項2之重組浣熊痘病毒載體，其中該兩個或多個 外源核酸分子編碼兩個或多個選自由下列組成之群之 PRRSV ORFs : ORF5-ORF6、ORF5-ORF6-ORF7、ORF3-ORF5-ORF6 、 ORF3-ORF4-ORF7 、 ORF3-ORF4-ORF5- 131329.doc 200909578 ORF7、ORF3-ORF4-ORF6-ORF7 A ORF3-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7。 14.如請求項}至13中任一項之重組浣熊痘病毒載體，其中 該豬繁殖與呼吸症候群病毒係181；12 (I〇wa)、〇i〇t/91(西 班牙）或二者。 1 5.如請求項】至14中任一項之重組浣熊痘病毒載體，其中 兩個或多個核酸分子散入該淀熊痘病毒基因組之血球凝 集素基因座中。 16.如請求項15之重組浣熊痘病毒載體，其進一步包含一個 編碼豬第二型環狀病毒（PCV2)之開放讀碼框的核酸分 子。 1 7.如請求項1 6之重組浣熊痘病毒載體，其中該p(：v2開放讀 碼框係ORF2。 18.如請求項17之重組浣熊痘病毒載體，其中該PCV2 ORF2 各別嵌入該浣熊痘病毒基因組之胸苷激酶基因座令。 1 9·如請求項1 5至1 8中任一項之重組浣熊痘病毒載體，其進 一步包含一個編碼貓白血病病毒P27 +表型之糖蛋白的核 苷酸序列。 20. 如請求項i至丨9中任一項之重組浣熊痘病毒載體，其中 該 >完熊痘病毒係活病毒且可複製。 21. —種重組豬疫苗，其包含免疫有效量之如請求項^至n 中任項之重組 >完熊痘病毒載體及視情況一種適宜載 劑、稀釋劑或佐劑。 22· —種重組豬疫苗，其包含免疫有效量之兩種或多種如請 131329.doc 200909578 求項1至20中任一項之重組浣熊痘病毒載體及視情況一 種適宜載劑或稀釋劑。 23. 如請求項2 1或22中任一項之重組豬疫苗，其中該浣熊痘 病毒係活病毒且可複製。 24. 如請求項21或22之重組豬疫苗，其進一步包含至少一種 其他豬抗原。 ' 25 ·如請求項24之重組豬疫苗，其中該其他豬抗原係選自由 下列組成之群：猪肺炎黴衆菌（均 O w〇w_ae)抗原、副豬嗜血桿菌⑷抗 原、多殺巴斯德菌（Pasiewre/Ζα ww/ioc/cia)抗原、緒鏈球 菌w化）抗原、胸膜肺炎放線桿菌 {Actinobacillus pleuropneumoniae) H 增、、支氣管敗血性 博德特菌△ro/ic/njepi/cia)抗原、豬霍亂沙門 氏菌[Salmonella choleraesuis) H 瑪、、豬丹毒桿菌 (Erysipelothrix rhusiopathiae)机增、、钩端螺、旋馥細窗 (leptospira bacteria)抗原、豬流感病毒抗原、豬細小病 ◎ . 毋抗原、大腸桿菌（五*sc/ier/c/zk co/z·)抗原、豬呼吸冠狀 病毒抗原、輪狀病毒抗原、奥傑士基氏病（Aujesky's - disease)之致病病原體抗原、豬傳染性胃腸炎（Swine . Transmissible Gastroenteritis)抗原及其組合。 2 6 · —種誘發抵抗豬繁殖與呼吸症候群病毒之免疫反應的方 法，其包含向豬類動物投與免疫有效量之如請求項21至 2 5中任一項之重組豬疫苗。 2 7.如請求項2 4之方法’其中該重組豬疫苗包含活的且可複 131329.doc 200909578 製之重組浣熊痘病毒載體。 28. —種預防豬繁殖與呼吸症候群及斷乳後多系統消耗性 (Wasting)症候群之方法’其包含向需要保護之豬類動物 投與一種包含免疫有效量之如請求項16至19中任一項之 重組/70熙痘病毋載體及視情況一種適宜载劑、稀釋劑或 佐劑的重組豬疫苗。 29. 如請求項28之方法，其中該重組浣熊痘病毒載體係活載 體且可複製。 3 0.如請求項26之方法，其中該疫苗之免疫有效量介於約4·5 Log10TCID50/ml至約 7·5 Log10TCID50/ml範圍内。 3 1.如請求項26之方法，其中該疫苗係以單次劑量或以重複 劑量投與。 32.如請求項21至25中任一項之重組豬疫苗，其中該疫苗不 含佐劑。 I31329.doc
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