TW200926986A - Quorum sensing inhibitor - Google Patents

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200926986 5 Ο 10 15 ❹ 九、發明說明： t發明所屬二 發明領域 本發明係有關於一種群體感應抑制劑。 發明背景 已知一些細菌存有可以感知本身的細菌數並進而控制 其病原性表現之基因調制網路（群體感應），且以機會性感 染細菌為代表的許多細菌，可以利用群體感應，在確保其 達到可耐受源自於宿主防禦機制或敵對生物所作之攻擊程 度的細菌數之後，才進行諸如毒素之類的病原性表現此 已知為以集體位準活動。 一方面，細菌性植物病害已知為難以防治之病害。— 般市售對黴菌（即絲狀菌）所造成的植物病害具有效用的 藥劑多半對於細菌性病害不具效用，且僅止於使用無機或 有機之銅劑、鏈嫉素、。惡啥酸(〇x〇linjc acid)、生物農藥等 作為細菌性病害防治劑。又，即便使用此等防治劑亦無法 得到一定可以符合作物的所需的防治效果。再者，近年來 亦有報告指出已發生有對料酸㈣受性的榖類枯菌病 菌，故細菌性植物病害的防治之情況變得愈來愈困難。又， 已知身為細菌性植物病害之病因菌中的穀類括菌已知是在 稻感染後利用群體感應而—起排出毒素，進而引起病害（非 專利文獻1)。 專利文獻1中曾報告指出一些種類的嘧啶酮化合物可 -技術領域】 20 200926986 使用作為巾㈣㈣的興奮劑。但是，在該文獻中，完全 沒有記載該射酮化合物對細菌性植物病害有防治效果， ^上，繼㈣試崎物知，紅獻完全沒有 具體記載射酮化合物對於細菌性病害的防治效果。 在專利文獻2中則記載―些射鋼化合物具有鎮痛作 用’但該文獻完全沒教示該•酮化合物對於細菌性病害 具有防治效果。

在專利文獻3中則報告指出一些醯胺化合物具有調節 細菌類之生物膜形成的作用。但是，該文獻中完全沒有記 10載該醯胺化合物對細菌性植物病害具有防治效果，事實 上，由其後記的試驗例明顯可知，該文獻所記載之酿胺化 合物對細菌性病害沒有防治效果。 在對於細菌性植物病害具有效用之藥劑種類不足之今 日事實上-直想要發開出對細菌性植物病害具有優異防 15 治效果之藥劑。 【專利文獻1】 特開昭4 8 - 3 6 1 9 3号公報 ® 【專利文獻2】 特開昭5 4 — 4 8 7 9 5号公報 20【專利文獻3】 特表2006 — 5 1 229〇号公報 【非專利文獻1】

Molecular Microbiology, 54 (4) , 921-934 (2004) 6 200926986 【發明内容3 發明概要 【發明所欲解決之課題】 本發明係以提供一種對於細菌性病害極為有效之防治 劑作為課題。 【解決該課題之手段】 ❹ 10 本發明者等為解決上述課題，反覆鋭意檢討而得之結 果為，一些嘧啶酮化合物具可有效抑制一些細菌之群體感 應的作用。具體來說，該化合物可具有抑制細菌毒素産生 之作用與抑制細菌生物膜形成之作用，且具有將已形成之 生物膜剝離除去的作用，因而找到可解決上述課題的手 段。本發明是基於此一發現所完成者。 本發明係提供一種群體感應抑制劑，其含有具通式 (1 )所示之嘴咬朗I化合物

15 [式中，R1係為Ci-5烷基或苯基、R 2係為氫原子或Ci-5烷基基；但、若R 2為氫原子時、R1不得為曱基]。 本發明係提供一種含有具上述通式（1)所示之嘧啶 酮化合物的農園藝用細菌性病害防治劑。 本發明係提供一種生物膜形成抑制劑，其含有具上述 通式（1 )所示之嘲咬酮化合物。 20 200926986 本發明係提供一種生物膜剝離劑，其含有具上述通式 (1)所示之0^咬酮化合物。 圖式簡單說明 第1圖係圖式顯示試驗例2中在培養2 4小時與3 6 5 小時後培養液中所存在之生菌數。 第2圖係圖式顯示試驗例3中在化合物（1 )之試測 濃度下每培養時間與生菌數之間的關係。 第3圖係圖式顯示試驗例4中化合物（1 )之測試濃 度（μΜ)與毒素量（gg/m 1 )之間的關係。 ίο 第4圖係為試驗例7及試驗例8中所使用流動室系統 的概略圖。 第5圖係為一圖面，其是使用試驗液時生物膜形成狀 況與使用對照試驗液時生物膜形成狀況（對照組）作對比 而得之試驗例7結果。 15 第6圖係圖式顯示試驗例9中化合物（1 )及比較化 合物（5 )之測試濃度（μΜ)與毒素量（pg/m 1 )之 間的關係。 I：實施方式3 較佳實施例之詳細說明 20 在上述通式（1 )中，C i-5烷基可為，舉例來說，甲 基、乙基、η _丙基、異丙基、η — 丁基、異丁基、第二 一丁基、第三一丁基、η—戊基、1—甲基一η—丁基、 2_甲基一η-丁基、3 —曱基一η—丁基、1，1—二 甲基一η —丙基、1，2—二甲基一η —丙基、2，2 — 200926986 二甲基一η —丙基、1—乙基一η —丙基之類碳數在1〜 5之直鏈型或分支型烷基。 為本發明有效成分之具上述通式（1 )的0^°定酮化合 物，較佳者為R 1係直鏈型或分支型C 2-5烷基且R 2為氫原 5 子之嘧啶酮化合物。特別是，R 1為直鏈型C 3-5烷基且R 2 為氫原子之具通式（1 )的嘴σ定酮化合物尤佳。

又，為本發明有效成分之具上述通式（1 )的嘧啶酮 化合物，較佳者為R1係直鏈型或分支型C i-3烷基且R 2 為直鏈型或分支型C ι-s烷基之嘧啶酮化合物，又以R1為 10 直鏈型C 1-3烷基且R 2為曱基之嘧啶酮化合物尤佳。 作為本發明有效成分之具上述通式（1 )的嘧啶酮化 合物，例如，可以依下述反應式一1所示之方法，將化合 物（2)與化合物（3)在芳香族碳氫化合物（例如，苯、 曱苯、二甲苯等）等溶劑中並在迴流下進行反應而予以製 15 得，具體的製法可依後述之製造例來加以製造。 反應式_ 1

0H

〔式中，R1與R2係如前所定義者。113為(：1-5烷基。〕 本發明之嘧啶酮化合物對於下列的細菌所造成的病害 20 是有效的：屬於伊文氏桿菌屬、假單孢菌屬或黃原菌 9 200926986 (Xanthomonas)屬等屬之細菌、例如，水稻白葉枯病 - (Xanthomonas oryzae pv. oryzae )、細囷性榖枯病囷 (Pseudomonas glumae )、稻苗枯病菌（Pseudomonas plantarii)、瓜類斑點細菌病菌（Pseudomonas syringae)、柑 5 橘潰瘍病菌（Xanthomonas campestris pv. citri)、蘋果火傷 病菌（Erwinia amylovora )、桃/杏穿孔細菌病菌 (Xanthomonas campestris pv. pruni )、梅潰癌病菌 (Pseudomonas syringae pv.morsprunorum )、甘藍菜黑腐病 (Xanthomonas campestris )、油菜科蔬菜之黑斑細菌病菌 ❿ 10 ( Pseudomonas syringae pv. maculicola)、白菜軟腐病菌 (Erwinia carotovora )、萵苣腐敗病（Pseudomonas cicihorii，P. marginars，P. viridiflava )、筠篛腐敗病菌 (Erwinia carotovora subsp· cartovora )、蕃茄 / 茄子青枯病 . 菌（Pseudomonas solanacearum)等，且其對於假單孢菌屬， _ 15特別是細菌性穀枯病菌，可發揮出優異防治效果。

本發明之痛咬酮化合物具有抑制穀類枯菌病菌之毒素 産生（參照後述試_ 9 )。又’榖類枯菌之細菌性病害菌 Q 會依據群體感應而調節與細菌氧耐受性有關且被稱作a匕 P F (院基過氧化物還原酶子單元f，响^如p⑽硫 20 reductase subunit F )之睡各从 L , 酵素的生成。據此，本發明之嘧啶 化合物可抑制穀類枯菌之細菌性病害菌的ahpF表現 量’且具有藉空氣氧化而使細菌病害菌自我滅亡的效果。 有通式（1)之喷唆酮化合物使用作為農園藝用細 菌ί病。防…劑日夺雖可以不添加其它他成分而直接使用 10 200926986 • 作為防治劑，但亦可與諸如固體狀、液體狀、氣體狀等各 種擔體相混合，且因應需要添加有界面活性劑、固著劑、 分散劑、安定劑等製劑用補助劑、而製劑成乳劑、水和劑、 乾式可流動劑（dry flowable agent)、可流動劑（flowable 5 agent)、水溶劑、粒劑、微粒劑、顆粒劑、粉劑、塗布劑、 喷務用製劑、氣霧製劑、微膠囊製劑、燻蒸用製劑、燻煙 用製劑等各種製劑形態來加以使用。 此等製劑，有效成分之具通式（1 )的嘧啶酮化合物 〇 含有量是因應其製劑形態、使用場所等各種條件，而自一 10 廣範圍中加以適當選擇，其相對於製劑全體量，通常為0 · 0 1〜9 5重量％程度、較佳為0 · 1〜5 0重量％程度。 本發明之製劑中混合之固體狀擔體舉例來說可以是例 • 如高嶺土、黏土、石夕藻土、膨士、富巴沙明黏土 (Fubasami - clay)、酸性白土等黏土類、滑石類、陶莞類、石夕藻土(Celite)、 15 石英、硫黄、活性碳、碳酸二氧化矽、水和二氧化矽等無 機礦物、化學肥料等微粉末、粒狀物等。 ® 本發明之製劑中混合之液體狀擔體舉例來說可以是例 如，水、醇類；丙酮、甲基乙基酮等酮類；η—己烷、環 己烷、燈油、輕油等脂肪族乃至環脂族碳氫化合物；苯、 20 甲苯、二甲苯、萘等芳香族碳氫化合物；乙酸乙酯、乙酸 丁酯等酯類；乙腈、異丙腈等腈類；二異丙醚、二噁烷等 醚類；Ν，Ν —二甲基甲醯胺、Ν，Ν —二甲基乙醯胺等 醯胺；二氯甲烷、四氯乙烷、四氯曱烷等鹵化破氫化合物； 二甲基亞砜、大豆油、綿實油等植物油等。 200926986 本發明之製劑中混合之氣體狀擔體可以是一般作為喷 · 射劑使用之物，舉發來說，例如丁烷氣體、液化石油氣體、 乙醚、二氧化碳氣體等。 在製劑中混合之界面活性劑舉例來說可為例如、聚氧 5 伸乙基烷醚、聚氧伸乙基烷酯、聚伸乙基山梨糖醇烷酯等 非離子性界面活性劑；苯甲績酸烧醋、績琥拍酸烧S旨、硫 酸烷酯、聚氧伸乙基烷磺酸酯、磺酸烯丙酯、亜硫酸鹽木 質素等陰離子界面活性劑等。 作為固著劑與分散劑者舉例來說可為例如酪蛋白、明 © 10 膠、多糖類（澱粉、阿拉伯膠、纖維素衍生物、藻酸等）、 木質素衍生物、膨土、糖類、合成水溶性高分子（聚乙烯 醇、聚乙烯、吡咯啶、聚丙烯酸類等）等。 作為安定劑者舉列來說可為例如，PAP (酸性磷酸 - 異丙基）、BHT( 2，6_二一第三一丁基一4 —甲基酚）、 - 15 BHA (2—第三一丁基一4 —甲氧紛七3 —第三_ 丁基 —4 —甲氧紛等的混合物）、植物油、礦物油、界面活性劑、 脂肪酸其等酯類等。 © 本發明之製劑亦可使用有機染料及/或無機染料來加 以著色。 20 本發明之製劑雖是可以直接使用，但亦可利用水之類 的溶劑予以稀釋使用。若為粒劑、粉劑時、通常不經稀釋 直接使用。又，以水等溶劑稀釋而使用乳劑、水和劑、流 動劑時，通常要使用具有有效成分濃度係在0 · 〇 〇 〇 1 〜100重量％程度，較佳是在0·001〜10重量％ 12 200926986 程度。 本發明之農園藝用細菌性病害防治劑，亦可以其它的 除草劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、殺壁_、殺菌劑、植物成 長調節劑、協力劑、土壤改良劑等予先混合而作成製劑。 5又，本發明之製劑與上述各劑亦可在使用時合併使用。 將本發明之農園藝用細菌性病害防治劑施用到栽培植 物之方法舉例來說可以是，例如、地上液劑散布、地上固 形散布、空中液劑散布、空中固形散布、液面散布、施設 内施用、土壤混和施用、土壤灌溉中施用、表面處理（種 1〇子粉衣、塗布處理等）、育苗箱施用、單花處理、株元處理 等方法。習知對細菌性植物病害多進行預防性種子處理（消 毒），本發明之農園藝用細菌性病害防治劑可以在觀察到發 生的時點，即便藉由在莖葉散布亦可表現出效果故可以 選擇多樣的處理方法。 15 本發明之農園藝用細菌性病害防治劑中所使用之嘧啶 _化合物施用量，沒有特別限制，可因應製劑之形熊、施 用方法、施用時期、施用場所、施用作物種類、細菌種類 等各種條件而可自廣範圍中作適當的選擇，通常，誃量係 每100m2為〇· ig〜i〇〇〇g程度，較佳是1 ◦二 20 5 〇 〇 g程度。又、乳劑、水和劑、流動劑等以水稀釋而 使用時，其施用濃度通常為1〜1000PPm程声較 佳為1 〇〜5 0 0 p p m程度。粒劑、粉劑等通常不用稀 釋直接施用製劑本身。 本發明之群體感應抑制劑不僅對農園藝用細菌性病害 13 200926986 菌具有防治效果，亦發現其對綠膿菌（Pseudomonas aeruginosa )、牙周炎病原性細菌（Porphyromonas gingivalis 、 Tannerella forsythensis 、 Actinobacillus actinomycetemcomitans、Prevotella intermedia ' Eikenella 5 corrodens 、 Campyrobacter rectus 、 Fusobacterium necleatum、Treponema denticola、Actinomyces naeslundii、

Streptococcus mutans)、鼻疽菌（Burkholderia mallei)及類 鼻症菌（Burkholderia mallei)等亦具有防治效果。 綠膿菌及牙周炎病原性細菌已知是利用群體感應形成 10生物膜。生物膜係由微生物分泌生成之黏液所構成的膜， 其係複數種類微生物共存而形成之複合體（群生），且呈附 著於固體表面之狀態。換言之，生物膜係以微生物所分泌 出黏液來包封之微生物集合體。本發明之嘧啶化合物具有 抑制綠膿菌或牙周炎病原性細菌所進行之生物膜形成的效 15用（生物膜形成抑制效果），或者具有將已形成出來的生物 膜予以剝離除去的效用（生物媒剝離效果）。另-方，鼻疽 菌以及類鼻疽菌雖沒如同穀枯病菌之細菌病害菌同樣地會 明確進行生物膜之形成，但其可依據群體感應調節毒素産 生本發月之喷°定化合物亦具有抑制鼻疽菌及類鼻疽菌之 2〇 群體感應效用。 本發月由於具有抑制生物膜形成，更可將已形成之生 物膜予以除去制離之特有效果，其可涉及廣的適用範圍， 且其中即便是針辦難治性生物膜感染症，本發明亦可有效 用 可乂 ’月待其可以對該感染症之根本的治療具有重 200926986 大的貢獻。 5 ❹ 10 15 Ο 20 針乂 士〜囷是常在自然環境中存在者，其由於在僅 .,下砘會增殖而形成生物膜，故構成院 ^微生物取代、機會性感染等原因或者構成水道管 么:、貯水槽内等衛生環境惡化相。又，牙周炎病原 =菌所形成之齒垢料生物膜之形態，因而構成鶴齒、 牙周病、㈣膿漏等口腔内疾病及口臭等病因。習知雖已 知去除齒垢係為口腔衛生及口腔内疾病治療上十分重要的 清事’但因生物膜是係為《劑等藥劑之防御膜，故有此 等藥劑效力難以發揮的問題。 β藉由使用本發明之群體感應抑制劑，病院施設；家庭、 等配S ’貯水槽内等綠膿菌之生物膜形成可以受到抑 制。且可以促進已形成之生物膜的除去 ，整理衛生環境， 而可以有效地預防或治療院内感染或其他種種損害。又， 發月之群體感應抑制劑可以抑制在歯、歯肉、口腔内之 歯科材料等牙周炎病原性細g之生物膜形成，並促進已在 表面附著形成之生物膜的除去 ，故可以有效地預防或治療 等歯科疾病、牙周病、歯槽膿漏等牙周疾病、口内炎 等等口腔内疾病等。 具通式（1 )之嘧啶酮化合物，如後述試驗例所示者， 具有生物臈除去作用以及生物膜成抑制作用。因此，具有 通式（1)之嘧啶酮化合物可於一種以除去剝離生物膜或 抑制生物膜為目的之組成物（生物膜剝離劑或生物膜形成 抑制劑）中作為有效成分。 15 200926986 10 15 20 具通式（1 )之♦定酮化合物對形成生物膜之細菌以 及所形成出來的生物膜具有效用，且其對於綠膿菌 (Ud〇monas aeruginosa )或牙周炎病原性細菌以及其等 形成之生物膜特別發揮出優異之生物膜剝離效果及生物膜 形成抑制效果。 人因此，本發明提供一種以具有通式（1)之射酮化 、乍為有效成分之生物賴離劑或生物膜形成抑制劑 乂下此等生物__或生物卿成抑制韻稱為「製 劑」）。 製劑疋可以僅由具通式（i )之㈣酮化合物所構 ’或者是其與任意之擔體或添加劑相組合，而利用已 右2調1成適用於所欲料之組成物。本製劑形態並沒 太^劍丨可為例如’鍵劑、粉末劑、顆粒劑、丸劑、粉 膠囊劑（硬囊劑及軟囊劑）等固體狀製劑；乳霜、 糖'膠等膏狀或膠狀製劑；液劑、懸浮劑、乳液劑、 漿在:劑、喷霧劑及氣霧劑等液體狀製劑等。 例，料巾所淑之騎式⑴之♦㈣化合物比 制作用的^發揮出生物膜除去剝離作用或生物膜形成抑 量％中以’沒有特別限制，可在製劑每10 0重 重量％、更# 99重量％、較佳為0.01〜50 定調製 為〇·0 5〜1 〇重量％之範圍下作適宜設 本製劑〇 物膜形成_要3有可W輯4生物麟*麟效果或生 效果的具通式U)之+定_化合物即可， ❹ ❹ 16 200926986 5 e 10 15 Ο 20 在不妨礙此效果的範圍下’亦可配合有其他成分。此等其 他成分可以因應生物膜剝離劑或生物膜形成抑制劑之使用 目的或使用對象的種類而作適當選擇。例如，其它的成分 雖沒有限制，可包含有賦形劑、結合劑、分散劑、增黏劑、 潤滑劑、ρ Η調節劑、可溶化劑等一般製劑製造上所使用 的擔體之外，還可含有抗生物質、抗菌劑、殺菌劑、防腐 劑、補助劑(builder))、漂白劑、酵素、螯合劑、消泡劑、 著色料（染料、顏料等）、柔軟劑、保濕劑、界面活性劑、 氧化防止劑、香料、矯味劑、矯臭劑、溶劑等。 本製劑除了具有通式（1 )之鳴咬_化合物之外，較 佳是含有例如鹽酸米諾環素(MinoCydine Hydrochloride)等 四裱黴素系殺菌劑、三氣沙(tricl〇san)、氣化十六烷吡啶鏽、 氣化τ索氣銨等陽離子性殺菌劑、巨環内醋系抗生物質等 抗菌或殺菌劑。 又，本製劑亦可配合併用有用以提高抗菌或殺菌劑活 性之化合物、例如，精胺酸、白胺酸、組胺酸等鹼性胺基 酸；菌綠烯醇(farnesol)、轉葡糖苷酶、c G T a s e等澱 粉改變酵素、α_澱粉酶等澱粉水解酵素之酵素。 本製劑可廣泛地適用於形成有生物膜場所或因該生物 膜形成而造成問題之場所。 是對産業用設備或循環式浴槽等之生物祺，使用方法 可以是在配管等内循環有懸浮劑、水和劑、水溶劑，或使 用局部喷霧方法，或在水槽或浴㈣中投Μ濃度液體或 鍵劑、粉劑、粒劑等固形劑並以在槽内水加以稀釋或溶解 17 200926986 予以施用的方法。又，若使用作為醫藥時，亦可以是適合 經口、非經口或局所投藥之適當形態，特別在口腔用時是 可呈口腔清洗劑。 本製劑使用量因使用之場所、劑形，特別是緩釋型劑 5之情況而有不同，故全部皆無庸予以限定，例如，在使用 本製劑於生物骐感染症之預防或治療之目的時，1日適當的 投藥換鼻成為上述本發明醯胺化合物或其鹽類投藥量通常 為在lng/ml〜1〇〇mg/ml ，較佳為1〇ng /m 1〜1 〇 m g/in丨範圍下作適當設定調整(例如，在 ❹ 1〇人的情況下總量大概為300mg)。 本發係提供一種含有上述生物膜剝離劑或生物膜形成 抑制劑之口腔用組成物。本發明是-種以具通式（1 )所 不之嘴咬則b合物作為有效成分之生物蘭_丨或生物冑 开V成抑制劑X特別是一種口腔用組成物其係基於本身 15對於口腔内、，.田菌具有除去剝離由口腔内細菌形成之生物膜 或者抑制口腔内細H之生物卿成能力而構成者。 在此本發明對象之口腔用組成物係可被包含於牙 〇 膏牙粉餘/絮齒劑、濕潤型潔齒劑等潔齒劑中；片狀、 疑劑狀#狀、黏膠狀、薄膜狀等口腔清涼劑或口 20腔/月洗劑中，具有霜狀、軟膏狀或果床狀形態之歯肉用製 劑中，藥片中，口香糖中；液狀或粉末或者錠劑之口腔清 洗劑；_或發泡劑等假牙或齒科用材料之洗淨劑等。 在口腔用組成物中所配合之生物膜剝離劑或生物膜形 成抑制劑的比例’舉來說是，在生物膜剝離劑或生物膜形 18 200926986 成抑制劑中作為有效成分之具通式（1 )的嘧啶酮化合物 含有量（總量）為該組成物10 0重量％之0 · 00 1〜 9 9重量％以上，較佳為0 · 0 1〜5 0重量％，更佳為 0 · 0 5〜1 0重量％之比例。 5 ❹ 10 15 ❹ 20 在本發明口腔用組成物中，因應其種類或形態，必要 時，可以添加在通常使用量的範圍内之上述成分。 <研磨劑> 矽膠、沈降性氧化矽、火成性氧化矽、含水矽酸、無 水石夕酸、石夕酸鈦、沸石、鋁石夕磚、錯矽磚(zircono-silicate) 等氧化矽系研磨劑；磷酸二氫鈣、磷酸氫鈣二水和物、磷 酸氫約無水和物、焦磷酸弼、構酸鎂、構酸妈、氫氧化铭、 氧化銘、輕質碳酸飼、重質碳酸#5、碳酸鎂、構酸鎮、石夕 酸锆、不溶性偏磷酸鈉、不溶性偏磷酸鈣、氧化鈦、及合 成樹脂系研磨劑等。此等研磨劑亦可1種或2種以上併用 來使用。若配合有研磨劑時（例如，潔齒劑等），其配合量 並無特別限制，在口腔用組成物1 0 0重量％中落在3〜 8 0重量％、較佳為1 0〜5 0重量％之範圍内可作為其 例示範圍。 <濕潤劑或黏稠劑> 此可為甘油、濃甘油、二甘油、乙二醇、二丙二醇、 聚乙二醇、丙二醇、聚丙二醇、1，3_丁二醇等多價醇 類；木糖醇、麥芽糖醇、乳醇(lactol)等糖醇等。此亦可是 1種或2種以上併用來加以應用。 <黏結劑> 19 200926986 藻酸、藻酸鈉、藻酸丙二醇酯、含有鈣之藻酸鈉、藻 酸鉀、藻酸鈣、藻酸銨等藻酸鹽或其衍生物；角叉菜膠（I、 λ、K)、黃原膠、龍膠、刺梧桐樹膠、阿拉伯膠、刺槐豆膠、 古亞膠等樹膠類；羧基甲基纖維素鈉、甲基纖維素、乙基 5 纖維素、酢酸纖維素、羥基乙基纖維素鈉等纖維素類；明 膠、洋菜、聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、羧基乙烯聚合物、聚 °比11各桐、卡波姆(carbopol)、碎膠、紹碎氧化物膠、增黏性 氧化矽等。此亦可是1種或2種以上併用來加以應用。配 合有黏結劑時（例如，潔齒劑等），其配合量並沒有特別限 © 10 制，在口腔用組成物1 0 0重量％中具有0.1〜1 0重量 %程度範圍可為其例示範圍。 <發泡劑> 月桂基硫酸鈉、月桂醢肌氨酸鈉、烷基磺琥珀酸鈉、 - 椰子油脂肪酸單甘油磺酸鈉、α-烯烴磺酸鈉、N-醯基榖胺 - 15 酸等Ν-醯胺酸鹽、2-烷基-Ν-羧基甲基-Ν-羥基乙基咪唑啉氮 鑌甜菜鹼、脂肪酸麥芽糖醇酯、果糖脂肪酸酯、聚甘油脂 肪酸酯、脂肪酸二乙醇醯胺、聚乙二醇山梨糖醇單硬脂酸 〇 基、聚乙二醇硬化蓖麻子油、聚乙二醇脂肪酸酯等。此亦 可是1種或2種以上併用來加以應用。 20 <界面活性劑> 界面活性劑係可使用陰離子性界面活性劑、陽離子性 界面活性劑、非離子性界面活性劑、兩性離子界面活性劑 中任一者。 陰離子性界面活性劑舉例可為、月桂基硫酸納、莖缝 20 200926986

基硫酸納、N —月桂酿基肌胺酸納、N —莖藉基肌胺酸納、 十二基苯磺酸鈉、氫化椰子脂肪酸單甘油單硫酸納、月桂 基橫乙酸納、α—婦烴績酸鈉、N —棕櫚醯基穀胺酸鋼等n 一醯基榖胺酸鹽、Ν—甲基一Ν —醯基胺基牛磺酸鈉等Ν 5 一醯基牛磺鹽等。非離子性界面活性劑舉例可為果糖脂肪 酸酯、麥芽糖醇脂肪酸酯等果糖脂肪酸酯、麥芽糖醇脂肪 酸酯、乳醇脂肪酸酯等糖醇脂肪酸酯、烷醇醯胺、聚乙二 醇山梨糖醇單硬脂酸醋等聚乙二醇山梨糖醇脂肪酸醋、聚 乙二醇硬化ϋ麻子油等聚乙二醇脂肪酸醋、月桂酸單或二 ω乙醇醯胺等脂肪酸二乙醇酿胺、山梨糖醇脂肪酸醋、聚: 二醇高級醇謎、聚乙二醇聚丙二醇共重合體、聚乙二醇聚 丙二醇脂肪酸醋、聚甘油脂肪酸醋、普盧蘭尼克(ρι⑽㈣。 又、兩性離子界面活性劑舉例來說為、2—烷基〜N一羧 基甲基經基乙基味唾琳氮錯甜菜驗、1月桂基二 15胺乙基甘胺酸、N —莖謹基二胺二胺乙基甘胺酸等ν—烧 基，胺乙基甘胺酸或者N —院基—工—經基基味唾琳氣= 甜菜鈉等。此等界面活性劑可以單獨使用，亦可2種以上 <甘味劑> 2〇 糖精納、阿斯巴田、甜菊苦、甜菊萃取物、對曱氧基 肉桂酿、難皮#二氫查酮、紫蘇葶、甘科、索馬甜等。 此亦可疋1種或2種以上併用來加以應用。 <防腐劑> 對本甲酸甲酿、對苯曱酸乙醋、對苯甲酸内醋、對苯 21 200926986 甲酸丁酯等笨甲酸酯；安息香酸鈉、苯氧基乙醇、鹽酸烷 基一胺乙二醇等。此亦可是1種或2種以上併用來加以應 用。 <香料成分> 5 1一薄荷醇、茴香腦、薄荷_、桉樹腦、檸檬油精、 香旱芹酮、水揚酸甲酯、丁酸乙酯、丁香油、茴香油、n 癸醇、香茅醇、α—萜品醇、乙酸香茅酯、芫荽醇、乙基 το荽醇、香草精、茴香油、薄荷糖、肉桂醛、反式己烯 醛等。此亦可是1種或2種以上併用來加以應用。又、此 ❹ 10等成分雖可使用純品（精製物），但不限於此，本發明亦可 將含有此等成份之精油等以粗精製物狀態來加以調製（例 如’檸檬油、柑橘油、鼠尾草精油、迷迭香油、桂皮油、 胡椒油、桂葉油、紫蘇油(shiso oil)、冬綠油、丁香油尤 加利精油等）。 15 又，本發明除了上述香料成分外，在不妨礙本發明效 果的範圍下’亦可配合脂肪族醇或類或其酯類、萜系碳氫 化物、酚醚、醛、_、内酯等香料成分或精油。有配合香 ❹ 料成分時，其配合量是以口腔用組成物全體i 〇 〇重量％ 中為0 . 0 2〜2重量％之範圍為其例示範圍。 20 <抗菌成分> 銀、銅及鋅等抗菌性金屬或其水難溶性金屬鹽（例如、 氧化銀、氯化銀、碳酸銀、磷酸銀、氫氧化銅'葡糖酸銅、 氧化鋅、檸檬酸鋅、硬脂酸鋅、十一碳烯酸鋅、氫氧化鋅、 草酸鋅、磷酸鋅等）；葉綠素鋼、乙醯吡咬鏽氣化物、氣化 22 200926986 烴基一甲基苄基胺、二氣沙、日爲柏素(hinokitiol)、氯化溶 解酶等。 <防腐成分> 5 θ 10 15 會 20 各種苯甲酸酯、安息香酸鈉、三氯沙等非離子性抗菌 劑；苄索氣銨、西°比氯銨等陽離子性抗菌劑等。 < 口腔用有效成分> 氯化溶解酶、氟化鈉、氟化鉀、單氟磷酸鈉、聚乙二 醇，聚乙烯吡咯酮、日扁柏素、抗壞血酸、抗壞血酸鹽類、 克羅西希定鹽類、西吡氣銨、氣化苯二甲烴(benzalk〇nium chloride)、苄索氣銨(benzethonium chloride)、甜沒藥[祐]醇 (bisabolol)、三氣沙、異丙基曱基盼、乙酸生育齡、卜胺 基已酸、傳明酸、紹氫基尿膜素、乳酸鋁、二氫膽固醇、 甘草次酸(glycyrrhetinic acid)、甘草次酸鹽類、銅葉綠素 鹽、氣化納、瓜奠績酸鹽、聚葡糖酶(dextranase)、鹽酸維 生素B6(Pyridoxine Hydrochloride)、傳明酸、氣化鈉、維生 素C或E、各種酵素（例如、聚葡糖酶、搬粉酶、蛋白酶、 葡聚醣變構水解酶(mutanase)、果膠酶等）、奠（azulene)、 聚磷酸鹽等齒結石預防劑、聚乙二醇或聚乙烯吡咯酮等菸 或臭味除去劑、乳酸銘、；e肖酸卸等φ近〈過敏預防劑等。 此亦可是1種或2種以上併用來加以應用。 <其他> 藍色1號等色素、氧化鈦等顏料、二丁基羥基三烯等 氧化防止劑、茶乾餾液、穀胺酸鈉等矯味劑等。 又、本發明口腔用組成物可以依據—般方法來製造， 23 200926986 5 15 20 其製造方法並沒有特別的限定。又，所得到之牙膏等口腔 用，，且成物係可U填充於㉝管、積層管、玻璃蒸著管、塑膠 管、塑膠瓶、氣霧式容器等之形態來製造或販壳’使用時 再由此等容器取使用即可。 依據本發明口腔用組成物，因可抑制在口腔内由口腔 内t菌所形成生物膜，或者可去除已形成之生物膜，故可 、曰’、出種可防止細菌叢生成之口腔用組成物，若其同 時配合有抗菌劑時可提高該抗菌效果，且更可提供一種在 齒斑形成抑似果及抗8絲±十分優㈣口腔用組成 物午因此、本發明口腔用組成物可利用來有效預防或治療 蛀、牙周炎或牙周病（例如、牙槽膿漏等）口腔用疾病。 ^本發明之口腔肋成物可利用來有效預防或除去因姓 牙、牙周炎或牙周病(例如、牙槽膿漏等）而造成之 【發明之效果】 、 性二: = = = -， =別是對於穀枯細菌等之毒素產:具有二: =藝用具通式⑴之_化合物適合使用作為 晨園藝用細菌性病害防治劑。 马 月病^具通式⑴之做嗣化合物可對於綠膿菌、牙 周病原性細菌等之群體感應有作用，故其適合使 牙 物膜形成抑制劑或生物膜剝離劑。 ·'、生 【圖式簡單說明】 第1圖係圖式顯示試驗例2中在培養24小時與3

24 200926986 後培養液中所存在之生菌數。 第2圖係圖式顯示試驗例3中在化合物（1)之試測 浪度下每培養時間與生菌數之間的關係。 第3圖係圖式顯示試驗例4中化合物（1)之測試濃 5度（μΜ )與毒素量（Mg/m 1 )之間的關係。 第4圖係為試驗例7及試驗例8中所使用流動室系統 的概略圖。

第5圖係為一圖面，其是使用試驗液時生物膜形成狀 况與使用對照試驗液時生物膜形成狀況（對照組）作對比 10而得之試驗例7結果。 第6圖係圖式顯示試驗例9中化合物（1)及比較化 合物（5 )之測試濃度（μΜ)與毒素量（μ§/ιη丨）之 間的關係。 【元件符號説明】 15 1 :培養瓶（N u n c社製品） :泵（4頻道蠕動型泵、ISMATEC社製品j SM9 3 5 :空氣除去部（附有旋塞之玻璃管柱轉用） 4 :玻璃室（觀察用玻璃化細管lm 丄 in mx 丄 4mm

BioSurface Technni n n 0 1 0 g y社製品 20 C 9 1 ) 5 :廢液槽（Nunc社製品） 6 :石夕管（φΐ · 5mm) 社製品） 7a、7b:二方活栓（于小乇社製品） 8a、8b :薄膜過濾器（〇 . 4 4μπι、 25 200926986 9 ·培養基 1 0 :廢液 【實施例】 以下是舉例說明具通式（1 )之嘧啶酮化合物的製造 5 例及試驗例，俾使本發明更容易明白，而非將本發明限定 於此等製造例及試驗例中。 製造例1 2 — n_丙基一9—羥基一4H—吡啶並〔 1，2 — a〕嘧啶一 4 一酮（以下此化合物稱「化合物（1 )」） 之合成 ❿ ίο 3 —經基一2 —胺基°比咬 3 · 13g (28 · 5mm ο 1)及3 —雜氧己酸乙酯4 · 50g (28 · 5mmo 1 )溶解於二甲苯1 5 m 1中，所得到的溶液在室温下攪 拌約1 2小時之後，在加温迴流下使之反應約1 6小時。 — 冷卻該反應液後、減壓濃縮該反應液，所得到之殘渣用乙 15 酸乙酯萃取。所得到有機層以飽和食鹽水洗淨並以硫酸鎂 乾燥，之後、減壓濃縮。得到的殘渣在矽膠層法加以純化 (展開溶劑：η —己烷/乙酸乙酯=9 / 1 )，因而得到化 ® 合物（1 )。

20 收量：3.8g(18.5mmol) 收率：6 5% 26 200926986 1H-NMR(CDC13> 500MHz)： 1 · Olpp m (t，3H)，1 . 76ppm(m，2H)，2 . 66 ppm (m，2H)，6 . 32ppm(s，1H)，7 . 02ppm(m，1H)，7 . 14ppm(m，1H)， 7.26ppm(s，lH)，8.53ppm(m，1H)。 製造例2 9 —經基一 2 — n—戊基一4H_^咬並〔 1，2 — a〕嘧啶一4 —酮（以下此化合物稱「化合物（2 )」） 之合成 除了使用3—雜氧辛酸乙酯取代3—雜氧己酸乙酯之 外，以相同於製造例1之操作方式得到化合物（2 )。

❹ 10 0 收量：3-0g (13· lmmol) 15 收率：4 6% 'H —NMR (CDC 13, 500MHz): 0 · 92pp m (t，3H)，1 · 37ppm(m，4H)，1 · 74 ppm (m，2H)，2 · 67ppm (m，2H)，6 . 32ppm(s，1H)，7 . 03ppm(m，1H)， 7· 13ppm(m，lH)，7-26ppm(s，1H)， 8 · 52ppm (m，1H)。 27 200926986 製造例3 3 _乙基_ 9 一羥基一 2 —甲基一 4 Η—吡啶 並〔1，2 _ a〕嘧啶一4 一酮（以下此化合物稱為「化 合物（3 )」）之合成 除了使用2 _乙醯丁酸乙酯取代3 —雜氧己酸乙酯之 5 外，以相同於製造例1之操作方式得到化合物（3 )。

OH 人人/CH3

收量：3.7g (18.0mmol) 收率：6 3 % 'H-NMRCCDC Is* 500MHz)： 1 · 22pp ίο m(t，3H)，2-55ppm(s，3H)，2.77 ppm(m，2H)，7 . 02ppm(m，1H)，7 . 10ppm(m，1H)，7· 31ppm(s，1H)， 8 · 51ppm (m，1H)。 15 製造例4 3 — n — 丁基一9 —羥基一2—甲基一4 H — 吡啶並〔1，2 — a〕嘧啶一4 —酮（以下此化合物稱「化 合物（4 )」）之合成 除了使用2—乙醯己酸乙酯取代3_雜氧己酸乙酯之 外，以相同於製造例1之操作方式得到化合物（4 )。 200926986

OH

收率：6 6 % 'H-NMRCCDClr 500MHz): 〇 · 98pp 5 m(t，3H)，l-45ppm(m，2H)，1.56 〇 ppm(m，2H)，2.52ppm(s，3H)，2· 72ppm(m，2H)，6 · 99ppm(m，1H)， 7.06ppm(m，1H)，7· 28ppm(s，1H)， 8 . 48ppm (m，1H)。 ' 10 - 製造例5 9_羥基一2 —異丙基一4H —吡啶並〔1， 2 _ a〕嘧啶一4 一酮（以下此化合物稱「化合物（5 )」） 之合成 ® 除了使用3—雜氧_4一甲基一戊酸乙酯取代3 _雜 15 氧己酸乙酯之外，以相同於製造例1之操作方式得到化合 物（5 )。 收量：

29 200926986 收率：3 2% 'H-NMRCCDCla» 500MHz)： 1 · 30pp m (m，6H)，2 . 97ppm(m，1H)，6 . 18 ppm(s，lH)，7.02ppm(m，1H)，7· 5 13ppm(m，1H)，7. 34ppm(s，1H)， 8 · 50ppm(m，1H)。 製造例6 9 —羥基一2_第三一丁基一4 H —吡啶並〔 1 ’ 2 — a〕嘴咬一4 —綱（以下此化合物稱「化合物（6 )」） © 10 之合成 除了使用3 —雜氧一4、4一二甲基一戊酸乙酯取代 3 —雜氧己酸乙醋之外，以相同於製造例1之操作方式得 到化合物（6 )。

收量：4 . 7g (21 . 7mmo 1) 收率：7 6% W-NMRCCDCls，500MHz): 1 ·39ρρ m (m，9Η)，6 . 53ppm(s，1Η)，7 . 〇2 20 Ppm(m，1H)，7 . 16ppm(m，ih)，7. 49ppm(s，1H)，8. 52ppm(m，ih)〇 30 200926986 製造例7 9 —羥基一2 _苯基一 4 Η —吡啶並〔1，2 —a〕定一 4—_(以下此化合物稱「化合物（7)」） 之合成 除了使用3 —雜氧一3—苯基一丙酸乙s旨之外，以相 5 同於製造例1之操作方式得到化合物（7 )。

收量：547mg (2 . 3mmo 1) 收率：8% H-NMR (CDC 13，500MHz): 7 . 〇〇ρρ 10 m(s，lH)，7.10ppm(m，lH)，7.21 ppm (m，1H)，7 . 52ppm (m，3H)，8 . 〇 8 p p m ( m，2 H )，8 . 5 8 p p m ( m，！ H )。 製k例8 9~赵基一2 —乙基一4H~。比咬並〔i，2 —a〕嘧啶一4—酮（以下此化合物稱「化合物（8 )」） 15 之合成 除了使用3-雜氧戊酸乙醋取代3—雜氧己酸乙醋之 外，以相同於製造例丄之操作方式得到化合物（8)。 31 200926986

OH

CH3 收量：2.6g (13.7mmol) 收率：4 8 % 'H-NMRCCDClr 500MHz): 1 · 33pp 5 m(t，3H)，2.61ppm(m，2H)，6.28

ppm(s，1H)，6 . 85ppm(m，1H)，7 . 〇4ppm(m，1H)，8 . 52ppm(m，1H)。 製造例9 9 一羥基一2 _ n —丁基4 H —吡啶並〔1， 10 2 — a〕定一4 —酮（以下此化合物稱「化合物（9 )」） 之合成 . 除了使用3 —雜氧庚酸乙酯取代3 —雜氧己酸乙酯之 外，以相同於製造例1之操作方式得到化合物（9)。 0H ❹

CH3 15 收量：2.4g(ll.lmmol) 收率：3 9% 'H-NMR (CDC 13> 500MHz)： 〇 · 96pp m(t，3H)，1 .41ppm(m，2H)，1 . 73 32 200926986 ppm (m ’ 2H)，2 . 68ppm (m，2H)，6 · 32ppm(s，lH)，7.02ppm(m，1H)， 7· 15ppm(m，lH)，8.52ppm(m，1H)。 5 ❹ 10 鲁 15 製造例1 0 9 —經基—2—異丁基一4H — e比咬並〔 1，2 _ a〕一 4 一銅（以下此化合物稱「化合物（1 0 )」）之合成 除了使用5 —甲基一3 —雜氧戊酸乙酯取代3 —雜氧 己酸乙酯之外，以相同於製造例1之操作方式得到化合物 (10)°

0 收量：3.7g (16.8mmol) 收率：5 9 % 1H — NMR (CDC13，500MHz): 0 · 97p pm(m，6H)，2· 18ppm(m，1H)，2. 5 4ppm(m，2H)，6.3〇Ppm(s，1H)’7 . 04ppm(m，1H)，7. l〇PPm(m，1H)， 8 · 53ppm (m，1H)° 製造例11 2—第二一丁基一9 一羥基一 4 H—吡啶並 〔1，2 — a〕嘧啶一4 一酮（以下此化合物稱「化合物 33 200926986 (1 l )」）之合成 除了使用4一曱基〜3 —雜氧戊酸乙酯取代3 —雜氧 己酸乙醋之外’以相同於製造例1之操作方式得到化合物 (11)°

收率：4 1 % iH-NMR(CDCl3, 5〇〇mHz): 〇 . 89PP m(t，3H)，1 .28ppm(t，3H)，1 . 62 10 Ppm(m’lH)’1.78Ppm(m，lH)，2. 67ppm (m，1H)’ 6 · 33ppm(s ’ 1H)’ 7*03ppm(m’ 1H)，7. 1 ippm(m，1H)’ 8 · 52ppm(m，1H)。

15製造例1 2 9 —經基一 2 — (2—戊基）一4H_ °比唆 並〔1，2 — a〕嘧啶一4一酮（以下此化合物稱「化合 物（1 2 )」）之合成 除了使用4一甲基一3 —雜氧庚酸乙酯取代3 —雜氧 己酸乙醋之外，以相同於製造例1之操作方式得到化合物 20 (12)° 34 200926986 OH CH3

收量：1 . 9 g ( 8 . 〇mm ο 1 ) ch3 收率：2 8% j-NMR (CDC 13，500MHz): 0 · 90pp 5 m(t，3H)，1.29ppm(m，4H)，1.55 0 ppm(m，lH)，1.73ppm(m，lH)，2. 77ppm(m，1H)，6 · 32ppm(s ’ 1H)， 7.02ppm(m，lH)’7-09ppm(m，1H)， 8.52ppm(m，lH)。 10 比較製造例1 2 — n —丙基小_ 4 Η —吡咬並〔1，2 —a〕°f°定一4 一酮（以下此化合物稱「比較化合物（1 )」） 之合成 參 除了使用2 —胺基D比。定取代3 —雜氧己酸乙醋並以聚 15磷酸取代二曱笨之外’以相同於製造例1之操作方式得到 比較化合物（1)°

收量：1.3g(6.8mmol) 35 200926986 收率：2 4 % iH-NMRCCDCls，500MHz): 1 ·00ΡΡ m (t，3Η)，1 . 80ppm(m，2Η)，2 . 67 ppm(m，2H)，6 . 36ppm(s，1H)’ 7· 5 llppm(m，lH)，7-61ppm(m’ 1H)’ 7 . 74ppm(m，1H)’ 9 . 05ppm(m’ 1H)。 比較製造例2 2一 n —戊基_4Η_β比咬並〔1 ’ 2 — a〕嘧啶一4 —酮（以下此化合物稱「比較化合物（2 )」） 〇 1〇 之合成 除了使用2 —胺基吡啶取代3 _雜氧己酸乙酯、使用 3 —雜氧辛酸乙酯取代3 —雜氧己酸乙酯並以聚磷酸取代 二甲苯之外，以相同於製造例1之操作方式得到比較化合 物（2 )。 15

ch3

收量：1.7g (8 . Ommo 1) 收率：2 8% W-NMRCCDC 13, 500MHz): 0 . 89PP 2〇 m(t，3H)，1.36ppm(m，4H)，1.74 ppm(m，2H)，2-67ppm(m，2H)’6. 37ppm(s，1H)，7. llppm(m，1H)， 36 200926986 7-60ppm(m，lH)，7.71ppm(m，1H)’ 9 · 02ppm(m，1H)。 比較製造例3 9 —甲氧基一 2 — n —丙基一4 Η —吡啶 5 並〔1，2 — a〕喊咬一 4一嗣（以下此化合物稱「比較 化合物（3 )」）之合成 除了使用3 —曱氧基一 2 —胺基吡啶取代3 —羥基一 2 —胺基吡啶並以聚磷酸取代二曱苯之外’以相同於製造 © 例1之操作方式得到比較化合物（3)。

收量：1.6g(7.4mmol) 收率：2 6%

'H-NMR (CDC 13, 500MHz): 1 . 〇〇pp m(m，3H)，1 . 79ppm(m，2H)，2 . 74 15 Ppm(m，2H)，4.06ppm(s，lH)，6. 39ppm (s，1H)，7 . OOppm (m，2H)， 8 . 69ppm (m，1H)。 試驗例1 穀枯細菌（Pseudomonas ( = Burkholderia) glumae ) 20 接種於L B培養基（B D社製 DifcoLB湯：胰化蛋白1 〇 · 0 g，酵母萃取物5 . 0 g，氣化鈉1 0 . 〇 g)， 37 200926986 3 7 °C下培養一晚。培養得到之菌液以離心機集菌後，以 2次新之L B培養基洗淨，以添加有4 〇μΜ之化合物（1 ) 及6 ΟμΜ之0 . 4%二曱基亞砜（DMS Ο)溶液以及作 為比較試驗用之不含有化合物（1 )但加有〇 . 4 % d Μ 5 S◦之L Β培養基振盪培養2 4小時。各菌液以0 . 2 2μ m之薄膜過滤膜渡過，在經去除細菌之〇 . 5 m 1上清液 中添加0 . 5 m 1乙酸乙酯，以乙酸乙酯萃取出群體感應 (Q S)訊息分子。減壓濃縮乙酸乙酯層，將殘渣再度溶 解於2 0μ1甲醇中，此作為試驗液。 Ο ίο 將1 μ 1試驗液點在T l c上，以展開溶劑：甲醇/水 =7 0/3 0之條件下分離出作為q s訊息分子之c 6 —

HSL與C8—HSL。展開後將T L C板乾燥，先前l Β培養基培養出之QS訊息分子檢出細菌（紫色色桿菌 Chromobacterium violaceum CV026 株）與含有瓊脂之培養 15液塗佈於T LC板’而對C6—HSL與C8—HSL進 行檢測。紫色色桿菌（Chromobacterium violaceum)已知係為 一種利用QS而會產生紫色色素（紫色桿菌素，violacein ) Q 的細菌，故可使用CV026株來檢測Q S訊息分子 (Microbiology，（1997)，143, 3703-3711、（2004)，54(4)， 20 921-934、（2007)，64(1), 165-179)。檢測之細菌塗布後，在 2 8°C下培養一晚，而進行紫色桿菌素的檢測。用於定量 而預先化學合成之C 6—HSL與C8—HSL作成紫色 桿菌素産生之標準曲線，由該標準曲線求得其等Q S訊息 分子之産生量。結果如表1所示。 38 200926986 【表l】 化合物漉度（A Μ) C6-HSL (n g/ml) C8 - HSL (#g/nil) 1 2時間 2 4時間 1 2時間 2 4時間 0 16 3 5 3 6 16 5 5 4 0 16 3 0 14 0 6 0 16 7 0 13 0 試驗例2 穀枯細菌接種於L B培養基，3 7°C下培養一晚。培 5 養得到之菌液以離心機集菌後，以2次新之L B培養基洗 淨。將新的L B培養基加至該菌體中，在調整成約3 . 〇χ 1 0 5 c f u /m 1後，加入製造例1〜5所製得之化合物 (1 )、4匕合物（2 )、4匕合物（3 )、4匕β物（4 )、4匕> 物（5 )、化合物（8)及化合物（9)而使之最終濃度為 10 1 〇 〇μΜ濃度，振盪培養3 6小時，並利用以下方法，求 得在2 4小時及3 6小時下該培養液中所存在之生菌數。 即，取出一部分培養液並作1千倍稀釋後塗在L Β培養基 瓊脂盤上，計算出其菌落數並加以換算。 又，參考例1〜3所製得之比較化合物（1)〜（3) 15及上述專利文獻1所記載之下述化合物（比較化合物（4 )) 使用作為比較試驗，進行同樣的試驗，並求得生菌數。其 結果顯示於第1圖。 39 200926986

由第1圖可知，本發明之嘧啶酮化合物（化合物（l) 〜化合物（5 )、化合物（8 )及化合物（9 ))對於穀枯 細菌可表現出優異的防治活性，在培養3 6小時後可使穀 5 枯細菌幾乎全部死亡，而比較化合物（1 )〜比較化合物 (4)則對於穀枯細菌幾乎表現不出有防治活性。 試驗例3 榖枯細菌接種在L B培養基，在3 7 °C下培養一晚。 培養得到之菌液以離心機集菌後，以2次新之L B培養基 ίο 洗淨。將新的L B培養基加至該菌體中，在調整成約3·

〇 X 1 0 5 c f u/m 1後添加由製造例1所製之化合物 (1 )並使其最終濃度為預定濃度（0、80及100μ Μ)，振盪培養4 0小時，求得在預定小時後（2 0、2 4、 28、32、36及4 0小時後）該培養液中所存在之生 15 菌數。即，取出一部分培養液並作1千倍稀釋後塗在L Β 培養基瓊脂盤上，計算出其菌落數並加以換算。結果如第 2圖所示。 由第2圖可知，本發明之嘧啶酮化合物（化合物（1 )) 對於穀枯細菌具有優異的防治活性。 20 試驗例4 穀枯細菌接種在L Β培養基，在3 7 °C下培養一晚。 40 200926986 5 Ο 10 15 φ 20 培養得到之菌液以離心機集菌後，以2次新之L Β培養基 洗淨。將新的L Β培養基加至該菌體中，而後加入製造例 1所製造得之化合物（1 )使之最終濃度為預定濃度（0、 20、40、60、80 及 100 μΜ)，振盪培養 2 0 小 時。以下述步驟求得在該培養液中菌體所生成之毒素（毒 黃素，toxoflavin)量。 各培養液以0 · 2 2 μΠΊ之薄膜過濾膜所濾過，取濾液 1m 1，加入氣仿1m 1並加以萃取，減壓濃縮所得到之 氯仿層，在殘渣中加入8 0% (V/V)甲醇水溶液而使 之溶解。測定該溶解液之吸光度（2 6 0 nm)，而由化學 合成之毒素標準物所得到之標準曲線算出毒素量。 結果是如第3圖所示者。 由第3圖可知，將製造例1所製得之化合物（1 )加 入榖枯細菌時，細菌產之毒素量會依化合物（1 )濃度變 高而顯著地降低。 試驗例5 化合物（1 )之二甲基甲醯胺1 0 0 0 p p m溶液以 水稀釋成預定濃度（50、100及200 μΜ)，以調製 出試驗液。另一方面，穀枯細菌接種於L Β培養基，在3 7 °C下培養一晚，而調製出感染用培養液。 在温室中將1 0 m 1各試驗液喷霧至栽培到開花時期 之稻米（韓國品種、Milyang 23)。1小時後，對該稻米喷 霧感染用培養液，評價其栽培7日後穀枯細菌病發症狀態。 評價係為由1株採任意1根稻穂，共採計3本，而對 41 200926986 每個花房（子實），以目視出有為榖枯細菌産生毒素（毒黃 素toxoflavin)病害發作出來（變色成茶色）部分所占之比 例，用以下基準來加以評價，全花房中所顯示之各評價的 比例來表示其發症狀態 5 (評價基準） 病症發作部分所占之比例為 0 · 1 %未满時：0 0 · 1 %以上2 0%未满時：1 2 0%以上4 0%未满時：2 © ίο 4 0 %以上6 0 %未满時：3 60%以上80%未满時：4 8 0%以上1 0 0%時：5 在此評價中，準備三個進行相同條件，並反覆進行三 — 次，以確認其再現性。又，作為比較試驗者則以水代替試 - 15 驗液，而作相同的處理。又，對照組則是用試驗液或感染 用培養液取代水而作相同的處理。結果如表2所示者。 ❹ 42 200926986 【表2】 評價 對照組 化合物⑴ 比較試験 5 0 μΜ 1 0 0 μ Μ 2 00 βΜ 0 9 8% 6 8% 8 0% 8 2% 1 6 % 1 2% 7% 6% 6% 4 1% 2 0% 6% 4% 6% 12% 3 0% 7% 3% 2% 9% 4 0% 6% 3% 2% 9% 5 0% 6% 4% 2% 13% 由表2可以了解到下述情事。含有化合物（1)之試 驗液喷霧至稻米時，即便該稻米被噴有含有縠枯細菌之感 5染用培養液，仍可以抑制該穀枯細菌病之發生。再者，在 以水喷霧稻米且對該稻米喷以含有縠枯細菌之感染用培養 液的比較試驗，則有許多稻米皆發生有穀枯菌病。 試驗例6

調製出與試驗例5同樣之試驗液及y感染用培養液。 ίο在眞至下’感染用培養液噴霧至一被栽培至開花時期之稻 米（韓國種、Milyang23)，1小時後喷霧各試驗液工〇 m 1 :此等稻㈣培7日後以與試驗例4相同方式評價穀 枯細菌病發症狀態。又’以水代替試驗液作同樣處理以作 為比較試驗。再者，财來代種試驗液域㈣培養液作 同樣的處理者疋作為對照組。結果貞彳顯示於表3。 43 15 200926986 【表3】

由表3可以了解到下述情事。含有穀枯細菌之感染用 培養液噴霧至稻米後再喷霧含有化合物（1)之試驗液的 情況下，與上述試驗例4相同，仍可以抑制該穀枯細菌病

之發生。再者，含有穀枯細菌之感染用培養液噴霧至稻米 後，再以水噴霧稻米的比較試驗，則有許多稻米皆發生有 榖枯菌病。 試驗例7 第4圖顯示使用流動室系統來評價上述製造例2所製 造之化合物（2 )對綠膿菌（Pseudomonas aerUginosa)生 物膜形成抑制作用。 <流動室系統> 將培養觀（1 )、螺動型泵（2 )、玻璃室（4 )及廢 15液瓶（5 )以碎管（6 )連接，在培養瓶（丄）中的培養 基（9 )可利用續動型泵送入玻璃室（4)内。流動室系 44 200926986 統（2 )與活栓（7 a )二者間’具有用來將混入空氣予 以除去之空氣除去部（3 )。在此流動室系統所使用之器具 為先經γ射線滅菌或高壓釜滅菌過者。 5 ❹ 10 15 ❹ 20 如後所述，在玻璃室（4)内培養細菌，而使得該室 的内壁形成有生物膜，將含有上述各醯胺化合物之試驗液 流過此處時觀察該生物膜樣子，因而可以評價該化合物之 生物膜形成抑制作用。又，該生物膜之樣子是可以用螢光 共焦點顯微鏡（LeicaTCSSP2，今彳力社製）予以觀察。 <材料> 細菌：以電穿孔法將pTdk_LVAgfp質體導入綠膿菌PA01 株’使用作為可以表現出綠色螢光蛋白之經轉形綠膿菌 PA01株（以下稱「gfp表現PA01株」）（參見TeresaR· De Kievit et al., Applied and Environmental Microbiology, Apr. 2001, p.1865-1873) 〇 培養基：在前培養中使用含有3 〇mM葡萄糖之FAB培

養基’而在本培養中則使用含有0.3 mM葡萄糖之FAB 培養基。 含有葡萄糖之F AB培養基：在3〇mM葡萄糖或〇 . 3 mM葡萄糖、1 5mM硫酸銨、3 3 . 7mM磷酸氫二鈉 二水和物、2 2 . 1mM磷酸二氫鉀、5 1 . 7 mM氣化 鈉、〇.47111]^氣化鎂、〇.〇8111]^氣化鈣及下記〇. 1 %微量金屬溶液所構成之水溶液中加入2 0 Ogg/m 1羧苄青黴素加以調製。（0152) 微量金屬溶液：1 · 1 6 mM硫酸鈣二水和物、0 · 7 2 45 200926986 mM硫酸鐵七水和物、〇 .〇 8mM硫酸錳—水和物、〇 . 0 8 mM硫酸銅五水和物、〇 .〇 7 mM硫酸鋅七水和物、 〇 . 0 4mM硫酸鈷七水和物、〇 . 〇 4mM過錳酸鈉一 水和物、及α含有0.〇8mM硼酸之水溶液。 5菌液：含有3 0 mM葡萄糖之f A B培養基中接種有gfp 表現PAOl株’在3 7 °C恒温槽中振盪培養一晚後所得到 過夜培養液’以含有3 OmM葡萄糖之F A B培養基加以 稀釋而調製成OD590：=〇 . 1。 試驗液及對照試驗液： ίο試驗液：實施例2所製得之化合物（2 )用1 〇 〇0]\4之〇 MSO溶液而被加至含有〇.3mM葡萄糖之FAB培養 基中，而使該化合物之濃度為〇 . i % (v/v )，此係作 為試驗液。 對照試驗液：使用不含有上述化合物之DMS0，而與試 15驗液作同樣之調製’而得到對照試驗液。 <試驗方法> 在流動室系統内充滿7 〇容量％乙醇，靜置12小時 以上而將該系統杳滅菌。而後，内利用蠕動型泵（2)將 通過薄膜過濾器（8 a)之送入該流動室系統内部，將該系 20統内部乾燥後，在其中充滿0 . 3mM含有葡萄糖之Pa B培養基。利用注射器自上面將菌液5〇〇μ1注入破螭室 (4)，關閉3方活栓（7 a，7b)而密柱該玻璃室，在 室温下1靜置培養小時。 靜置培養後，開打開該3方活栓（7 a，7 b )之2 46 200926986 個方向，以流速2 〇 〇pL/分鐘因而分別流出試驗液與對 照試驗液，在玻璃室内壁上由所附著之綠膿菌（gfp表現 PA01株）形权生物膜樣刊料光共焦_微鏡，而自 玻璃至上方，依時間作三次元的觀察（1小時後、4 8小 5時後、6 0小時後、7 2小時後、8 4小時後）。又，試驗 液及對照試驗液在每3 6小時更換新鮮培養液。 使用試驗液之生物膜形成情況與使用對照試驗液之生 物膜形成情況（對照試驗）二者對比出來的結果是顯示於 第5圖。又、第5圖是由玻璃室内壁表面圖與斷面圖，而 10以三次元的方式顯示出玻璃室内壁所附著之綠膿菌（gfp表 現PAOl株）情況。 由該結果可知，使用對照試驗液之對照試驗中，綠膿 菌（gfp表現PAO1株）形成有相當厚之巨大生物膜，而使 用試驗液者，沒有一者皆被認為有形成生物膜。由此可知， 15化合物（2 )係被認為是具有生物膜形成抑制作用者或去 除已形成之生物膜的作用。 試驗例8 第4圖是使用流動室系統而評估由前述製造例2所製 得之化合物（2)對於牙周病原細菌形成生物膜之# 20 用 隹!作 <材料> 細菌：使用牙周病原性細菌（牙報卟琳單胞菌 Porphyromonas gingivalis) 381 株（臨床株）。 培養基：使用含有高鐵血紅素5 pg / L及K維生素 、坟3 1 μ 47 200926986 g/L之G AM培養基。 菌液：在前記G AM培養基接種該_，培養

D 550=l.8)，a^GAMW##^2；V 試驗液及對照試驗液： ° 5試驗液：化合物（2)溶解於DMs〇而使之 Μ的議0溶液，而後將之加入前述菌液中而使:〇, 物濃度為0.1%(ν/ν)，此是作為試驗液。〜化合 對照對象液：使用不含有化合物（2} <DMS 、 驗液相同方式調製者作為對照試驗液。 以試 10 <試驗方法> 流動室系統之玻璃室⑷更換成不_室（3 X 1 2 0mm)’在該到内設置i 〇個減磷灰 x 怪6_、厚度―)。1^碟是使用經唾液= 15 試驗液或對照試驗液以流速8 m1/分流工4日 又，試驗液及對照試魏每2日更換新鮮者。日 〇 培養終了後’將HA碟滅菌浸潰訪水3 並於4T：下超音波處理3〇分鐘，而將在^碟上^中， 20

生物膜予以剝離，並使之懸浮於蒸财卜取該料T 〇 0μί以吸光度計（型式C07500色度叶十 測定濁度（測定波長：55〇nm)。 〜社製） ODr到之0D値中，去除最大值與最小値而求得平均 又

使用對象試驗液之試驗的濁度係取平均對照〇 D 48 200926986 値’也以同樣方式求平均値，並以下述公式求得生物膜形 成抑制率（抑制率）。 抑制率（％) = 1 〇 0 — {(平均OD値）/ (平均對照0 D 値）} xl 〇 0 5 結果顯示於表4。 [0166] 【表4】 化合物漉度（WM) 平均OD値 .平均對照〇D値 _摔（％) 1 Ο 〇 0.041 0. 0 9 4 5 6 * 4 試驗例9

10 穀枯細菌（Pseudomonas (= Burkholderia) glumae ) 接種於L B培養基上（B D社製Difco LB湯：肤化蛋白 1 0 . 0 g ’酵母萃取物5 · 0 g，氯化鈉1 〇 · 〇 g， 在3 7°C下培養一晚。以離心機將該培養液集菌後，菌體 用新的L B培養基洗淨2次。將該菌體加入新的L b培養 15基，而後加入製造例1所製得之化合物（1 )，而使之最終 濃度為所預定濃度（〇、2〇、40、6〇、8〇及1〇 ΟμΜ)，振盈培養2 〇小時^培養液令菌體所產生之毒 素（毒黃素，toxoflavin)量以下列步驟求得。 各培養液以0 . 2 2μιη薄膜過過濾器滤過，取遽液丄 2〇 m卜加人氣仿lml進行萃取。所得到氣仿層作減壓濃 縮，將8 〇 % ( V/ V )甲醇士水溶液“入殘清中使之 溶解。測定出該溶解液之吸光度（2 6 〇 n m )，由化學人 49

200926986 成之毒素標準物所得到之標準曲線算出毒素量。 又，比較試驗則是使用以前述專利文獻3中所記載之 下記化合物（比較化合物（5 ))作同樣的試驗。結果如第 6圖所示者。 5【化1 9】 比較化合物（5) CH3 由第6圖可知，製造例1所製得之本發明醯胺化合物 (1 )加入穀枯細菌時，該細菌所産生之毒素量會隨著該 醯胺化合物（1 )濃度增高而顯著的減少。另一方、將比 ίο 較化合物（5 )加入穀枯細菌時，即便比較化合物（5 ) 之濃度增高，細菌所產生之毒素量也大致沒有變化。 L圖式簡單說明：] 第1圖係圖式顯示試驗例2中在培養2 4小時與3 6 15 小時後培養液中所存在之生菌數。 第2圖係圖式顯示試驗例3中在化合物（1)之試測 濃度下每培養時間與生菌數之間的關係。 第3圖係圖式顯示試驗例4中化合物（1 )之測試濃 度（μΜ )與毒素量（μ g / m 1 )之間的關係。 20 第4圖係為試驗例7及試驗例8中所使用流動室系統 的概略圖。

50 200926986 第5圖係為一圖面，其是使用試驗液時生物膜形成狀 況與使用對照試驗液時生物膜形成狀況（對照組）作對比 而得之試驗例7結果。 第6圖係圖式顯示試驗例9中化合物（1 )及比較化 5 合物（5 )之測試濃度（μΜ)與毒素量（pg/m 1 )之 間的關係。 【主要元件符號說明】 1 :培養瓶（N u n c社製品） 2 :泵（4頻道螺動型泵、ISMATEC社製品I SM9 3 5 ) 3:空氣除去部（附有旋塞之玻璃管柱轉用） 4 :玻璃室（觀察用玻璃化細管1mmx 1 mmx 14mm、B i 〇 S urface Technolog y社製品F C 91) 5 :廢液槽（N u n c社製品） 6 :石夕管（φΐ . 5mm) 7a、7b :三方活栓（于小乇社製品） 8a、8b :薄膜過滤器（〇 . 4 4μιη、$ ”社製品） 9 :培養基 1 0 :廢液 51

Claims (1)

1. 200926986 十、申請專利範圍： 1. 一種群體感應抑制劑，其含有具通式（1)所示之嘧啶 酮化合物

   ⑴ 5 [式中、R1係為Ci -5烧基或笨基、R 2係為氫原子或c 1-5烷基，但若R 2為氫原子時、R1不得為曱基] ❹

   10 2·如申請專利範圍第1項之群體感應抑制劑，其係含有R 為c 2-5烧基且R 2為氫原子之鳴唆酮化合物。 H 3.如申請專利範圍第1項之群體感應抑制劑，其係含有R 為匸卜3烷基且RSgCn统基之嘧啶酮化合物。 4·種農園藝用細菌性病害防治劑，其含有具通式（1 ) 15 所示之嘧啶酮化合物 通式（1 ) 52 200926986 0H

   R1 (1) R2 [式中、R1係為C! -5烧基或苯基、R 2係為氮原子或 C卜5院基，但若R2為氫原子時、…不得為甲基]。 5

   10 5·如申請專利範圍第4項之農園藝用細菌性病害防治 劑，其係含有R1為C2-5烧基且R2為氫原子之嘴咬嗣 化合物。 6·如申請專利範圍第4項之農園藝用細菌性病害防治 劑，其係含有111為（：1-3烷基且R2為Ci 5烷基之嘧 啶酮化合物。 7·—種具有下列通式（1)之嘧啶酮化合物， 通式（1 )

   [式中、R1係為直鏈或分枝狀之C2-5烷基，R2係為氮原 15 子]。 8.如申請專利範圍第7項之嘧啶酮化合物，其中R 1係為 直鏈狀C 2-5烷基。 9·—種具有下列通式（1)之嘧啶酮化合物， 53 200926986 通式（l) OH

   [式中，R 1係為直鏈狀C 1-3烷基，R 2為曱基]。 5

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