TW200936155A - Anti-bacterial compositions - Google Patents

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200936155 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗細菌組合物及治療或預防致病性細菌感 染之方法。更特定言之，本發明係關於用於治療或預防細 菌感染及與其有關之疾病的抗細菌醫藥組合物。可自下文 . 說明中瞭解到本發明之其他態樣、目的及優點。 【先前技術】 ¥ 腸上皮將細菌圍護於腸腔中，此使得宿主能夠收穫自身 〇 不能合成之原核代謝產物，同時防止感染。由於上皮細胞 持續暴露於胃腸道之微生物區，故其亦為許多病原體之主 要進入點。為預防伯主感染，上皮細胞表現多種模式識別 受體（PRR)(例如Nod2)以提供抵抗入侵之第一道防線。 PRR係先天免疫系統之基本組件。其識別細菌、卵菌、線 蟲動物、真菌、病毒及昆蟲中發現之保守基序並立即在宿 主中觸發對入侵微生物之精確及靶向反應。（Ting JpY及

Davis BK，2005) » ® 包括N〇d、Nalp及植物R蛋白家族在内之許多Prr的共同 元件係富白胺酸重複序列（LRR)結構域。儘管保守之富白 . 胺酸重複序列為LRR結構域之圖像馬蹄形提供結構支架， . 但PRR侧翼區域係賦予共同微生物基序識別之不同多肽區 段（Matsushima N.等人，2005)。LRR結構域可見於自植物 至人類之PRR中且對於宿主抵抗病原體至關重要。含有 LRR之特定蛋白之缺失或自發突變會使宿主易受感染 (Dangl JL 及 Jones jDG，2001)。低等無顎魚（Agnathan 137481.doc 200936155 fish)利用LRR結構域作為支架以基於各LRR肽序列之重組 生成新穎適應性免疫系統（Pancer Z等人，2004 ; Alder MN 等人，2005 ; Nagawa F等人，2007)。 在人類中，遺傳研究已在許多LRR中鑒定到與易感多種 疾病有關之單核苷酸多態性（SNP)，該等疾病包括彼等由 於感染或炎症而發生之疾病（Matsushima N.等人，2005)。 . Nod2或許為研究最為深入之與疾病有關的含LRR蛋白。其 使得易患克隆氏病（Crohn’s disease)且其與該疾病之聯繫已 〇 在多項單獨研究中得到證實（Hugot JP等人，2001 ; Ogura Y等人，2001 ; Hampe J等人，2007 ; Libioulle C等人， 2007 ; Raelson JV等人，2007 ; The Wellcome Trust Case Control Consortium，2007)。LRR結構域中之Nod2突變使 得易患克隆氏病，而Nod2之相鄰NACHT結構域中之特定 突變係Blau症候群之遺傳原因；Blau症候群係罕見的常染 色體顯性病症，其特徵在於早發性肉芽腫關節炎、葡萄膜 炎、及皮療以及先天性指屈曲（Miceli-Richard C等人’ ® 2001)。此表明Nod2 LRR結構域之特定分子功能使得易患 腸疾病。 ' 圍繞Nod2之大多數研究集中在響應推定配體而激活信號 * 轉導途徑上。最常見地與克隆氏病有關之三種Nod2 SNP皆 不能響應MDP(細菌蛋白聚糖包被之組份）且展示無NFkB易 位及細胞因子產生（Barnich N等人，2005)。相反，克隆氏 病之特徵在於NFkB依賴性細胞因子產生增加。關於與克 隆氏病有關之Nod2 SNP是功能增加還是功能損失突變的爭 137481.doc 200936155 論仍在進行中（Watanabe T等人，2004 ; Kobayashi KS等 人，2005 ; Maeda S，2005) ° 在使用Nod2基因剔除小鼠品系之研究中Nod2保護宿主 對抗細菌感染之作用亦被突出（Kobayashi KS等人， 2005)。Nod2基因剔除者更易經口（但非全身性的）感染單 - 核細胞增生利斯特氏菌（Lbier/α mowocyiogewes)。此係重 . 要的觀察結果，因為據報導克隆氏病患者展示細胞内及上 皮有關細菌大量增加（Swidsinski A等人，2002 ; 〇 Darfeuille-Michaud A，2002 ; Liu Y等人，1995)。一些報 導已表明Nod2在預防細胞受細菌感染中起作用（Hisamatsu T等人，2003)。該等研究表明，與克隆氏病有關之Nod2 3020insC蛋白不能起對抗細胞内細菌之防禦因子的作用。 相同組之後續研究表明，Nod2依賴性防止沙門氏菌 感染依賴於線粒體蛋白griml 9(Barnich N等 人，2005)。其他NOD家族成員（Nodi)亦展示對抗細胞内 細菌之保護功能（Zilbauer Μ等人，2007 ; Travassos LH等 ® 人，2005)。與 Nod2相比，Nodi 與 grim 19無關（Barnich N等 人，2005)，此表明NOD蛋白預防細菌感染之機制仍需確 定。 • 本說明書中所揭示之所有參考文獻，包括該申請案主張 優先權之任何說明書，皆以引用方式明確地且全部地併入 本文中。 【發明内容】 本發明至少部分係基於以下發現：含有富白胺酸重複序 137481.doc 200936155 列（LRR)基序的蛋白質具有直接抗細菌活性。 在本發明之一個態樣中提供包含（或實質上由以下組 成、或由以下組成）具有式（I)之LRR的經分離蛋白質： (FlLxxLxLxxZF2 ) (I)， 其中 - F1及F2獨立地為具有1至30個殘基之鄰接胺基酸序列； . X可為任何胺基酸； L 可為 Leu、lie、Val 或 Phe ; φ Ζ可為 NxL 或 CxxL; N係 Asn、Thr、Ser或 Cys ; C係 Cys 或 Ser。 在本發明之另一態樣中，提供以串聯方式包含（或實質 上由以下組成、或由以下組成）兩個或更多個（例如兩個至 五十個）具有式（I)之LRR的經分離蛋白質。 在本發明之另一態樣中提供包含（或實質上由以下組 成、或由以下組成）兩個或更多個（例如兩個至五十個）衍生 ® 自天然存在之含LRR蛋白的具有式（I)之LRR(例如以串聯方 式）的經分離蛋白質。 * 在本發明之另一態樣中，提供包含（或實質上由以下組 • 成、或由以下組成）核苷酸結合位點（NBS)-LRR之經分離蛋 白質，該核苷酸結合位點（NBS)-LRR係例如NOD-LRR(例 如NOD2-LRR或NOD1-LRR，特定言之為人類NOD2-LRR 或人類NOD1-LRR)。在其他態樣中，提供包含（或實質上 由以下組成、或由以下組成）CIITA-LRR、鐸受體-LRR(例 137481.doc 200936155 如 TLR2、4、5、7、8、9-LRR結構域）、ΝΑΙΡ-LRR之經分 離蛋白質。 在本發明之一個態樣中提供包含（或實質上由以下組 成、或由以下組成）核苷酸結合寡聚化結構域（NOD)、胺基 末端之效應子結構域及羧基末端之富白胺酸重複序列 • (LRR)結構域的經分離蛋白質。 . 在本發明之另一態樣中提供包含（例如作為唯一活性成 份）經分離蛋白質之組合物（特定言之為具有抗細菌活性之 〇 醫藥組合物），該經分離蛋白質包含（或實質上由以下組 成、或由以下組成）NOD結構域、胺基末端之死亡折疊結 構域（例如CARD、匹林（Pyrin)、死亡結構域或死亡效應子 結構域）及羧基末端之LRR結構域。 在本發明之另一態樣中提供包含（或實質上由以下組 成、或由以下組成）NOD結構域、胺基末端之胱天蛋白酶 募集結構域（CARD)及羧基末端之LRR結構域的經分離蛋白 質。 ® 在本發明之另一態樣中提供包含（例如作為唯一活性成 份）經分離蛋白質之組合物，該經分離蛋白質包含（或實質 ' 上由以下組成）NOD結構域、胺基末端之CARD結構域及羧 ‘ 基末端之LRR結構域。 在本發明之再一態樣中提供包含（例如作為唯一活性成 份）經分離NOD蛋白之組合物，該組合物特定言之為醫藥 組合物，該經分離NOD蛋白特定言之為NOD1及/或 NOD2，且更特定言之為人類NOD1及/或人類NOD2。 137481.doc 200936155 在本發明之再一態樣中提供包含（例如作為唯一活性成 份）經分離TLR蛋白之組合物，該組合物特定言之為醫藥組 合物（例如殺細菌醫藥組合物），該經分離TLR蛋白特定言 之為哺乳動物TLR蛋白，且更特定言之為人類TLR蛋白， 例如人類TLR2及/或人類TLR4及/或人類TLR5。 • 在另一態樣中提供包含（例如作為唯一活性成份）經分離 . NOD2蛋白（特定言之為人類NOD2)之抗細菌（例如殺細菌） 組合物（特定言之為醫藥組合物）。 φ 在本發明之另一態樣中提供包含經分離蛋白質與醫藥上 可接受之載劑之醫藥組合物，該經分離蛋白質包含（或實 質上由以下組成、或由以下組成）NOD結構域、胺基末端 之死亡折疊結構域（例如CARD結構域）及羧基末端之LRR結 構域。 在本發明之另一態樣中提供包含（例如作為唯一活性成 份）經分離NOD蛋白（例如人類NOD1或人類NOD2，特定言 之為經分離人類NOD2)及醫藥上可接受之載劑的醫藥組合 ® 物（特定言之為殺細菌醫藥組合物）。 在本發明之另一態樣中提供治療或預防病原體感染（特 ' 定言之為細菌感染）之方法，該方法包含提供包含經分離 • 蛋白質之組合物，該經分離蛋白質包含（或實質上由以下 組成、或由以下組成）NOD結構域、胺基末端之死亡折疊 結構域（例如CARD結構域）及羧基末端之LRR結構域。 在本發明之另一態樣中提供治療或預防病原體感染（特 定言之為細菌感染）之方法，該方法包含提供包含經分離 137481.doc 200936155 蛋白質之組合物，該經分離蛋白質包含（或實質上由以下 組成、或由以下組成）NOD結構域、胺基末端之死亡折疊 結構域（例如CARD結構域）及羧基末端之LRR結構域。 在本發明之另一態樣中提供治療或預防病原體感染（例 如細菌感染）之方法，該方法包含提供包含經分離NOD蛋 - 白之組合物，該經分離NOD蛋白係例如經分離人類NOD1 . 及/或人類NOD2。 在本發明之另一態樣中提供在人類患者中治療或預防病 〇 原體感染（特定言之為細菌感染）之方法，該方法包含向該 患者投與（一種醫藥組合物，其包含）治療有效量之分離之 NOD蛋白，特別是分離之人類NOD1及/或人類NOD2。 在本發明之另一態樣中提供經分離蛋白質於醫學（特定 言之為人類醫學）中之用途，該蛋白質包含NOD結構域、 胺基末端之死亡折疊結構域（例如CARD)及羧基末端之LRR 結構域。 在本發明之另一態樣中提供經分離蛋白質（例如經分離 ® 人類NOD2)於製備用於治療或預防病原體感染之藥劑中的 用途，該病原體感染特定言之為細菌感染，更特定言之為 ' 革蘭氏陽性細菌感染，該蛋白質包含NOD結構域、胺基末 ' 端之死亡折疊結構域（例如CARD)及羧基末端之LRR。 在本發明之另一態樣中提供經分離蛋白質於製備用於治 療克隆氏病、炎症性腸病、敗血病之藥劑中的用途，該蛋 白質包含NOD結構域、胺基末端之死亡折疊結構域（例如 CARD)及羧基末端之LRR結構域。 137481.doc •10- 200936155 在本發明之另一態樣中提供經分離nod蛋白（例如人類 NOD1或人類NOD2)於製備用於治療克隆氏病、炎症性腸 病之藥劑中的用途。 在本發明之另一態樣中提供包含蛋白質與醫藥上可接受 之載劑的殺細菌醫藥組合物，該蛋白質包含（或實質上由 以下組成、或由以下組成）LRR結構域（例如作為唯一活性 . 成份）。在一個實施例中，該LRR結構域係人類NOD- LRR，例如人類NOD1-LRR或人類NOD2-LRR。在其他實 φ 施例中，該LRR結構域係TLR-LRR結構域，例如人類TLR- LRR > jtp TLR2-LRR > TLR4-LRR ' TLR5-LRR ' TLR7-LRR、TLR8-LRR、TLR9-LRR。 本發明亦涵蓋該蛋白質及/或本發明蛋白質殺死細菌（尤 其為革蘭氏陽性細菌）之用途。 在另一實施例中，提供經分離之非人類哺乳動物LRR蛋 白（例如NOD或TLR蛋白），其係用於在衍生出LRR蛋白之 非人類哺乳動物中治療及/或預防致病性細菌感染。 ® 在本發明之另一態樣中提供識別殺細菌蛋白之方法，該 方法包含使細菌（特定言之為對諸如人類等哺乳動物具有 ' 致病性之細菌）與經分離LRR蛋白接觸並鑒定該蛋白是否展 * 示殺細菌活性。在一些實施例中，細菌為好氧的；在其他 實施例中為厭氧的；在另外其他實施例中細菌為革蘭氏陽 性或革蘭氏陰性細菌。 【實施方式】 因此，本發明提供包含多個LRR(富白胺酸重複序列）結 137481.doc • 11 - 200936155 構域之經分離蛋白質’其可用作抗微生物劑。在例如下文 所述之本發明用途中’已發現該等蛋白質可有效殺死多種 細菌且效能與習知抗生素相當。 在本發明之較佳實施例中，在蛋白質之c端上具有 LRR。已發現此可提高蛋白質之抗微生物活性。 ' 更佳之情形係每一 LRR結構域均獨立地包含（或實質上 、 由以下組成）具有式（I)之胺基酸序列： (F 1LxxLxL(xxZ)yF2) (I)， β 其中： F1及F2獨立地為具有1至3〇個殘基之鄰接胺基酸序列； X可為任何胺基酸； L可為 Leu、lie、Val 或 Phe ; Z可為NxL或CxxL ; N係 Asn、Thr、Ser或 Cys ; C係Cys或Ser ;且 Y:。或 1 〇 富白胺酸重複序列（LRR)通常為形成α/β馬蹄形折疊之蛋 白質結構基序。每一LRR通常由重複的20-30段胺基酸序列 構成，該等胺基酸序列顯著富含白胺酸殘基，儘管該等殘 基可藉由其他疏水性殘基所替代。每一重複單位可具有β 鏈-轉角·α螺旋結構，由此由多個該等LRR構成之裝配部分 具有馬蹄形或弓形，内部為平行β片層且外部為螺旋排 列。β片層之一面及螺旋排列之一側暴露於溶劑中且因此 通常受親水性殘基支配。介於螺旋與片層之間的區域通常 137481.doc 12 200936155 形成疏水性核心，其在空間上通常緊密堆積白胺酸殘基。 在本發明替代實施例中，諸如異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺 酸'甲硫胺酸、色胺酸或半胱胺酸等其他疏水性胺基酸殘 基可替代白胺酸殘基。 通常而言，本發明蛋白質中之所有LRR結構域皆形成單 連續結構且採用弓形或馬蹄形。弓形或馬蹄形之内部凹 面主要由平行β_鏈構成，而外部凸面可包含多種二級結 構’例如α-螺旋、31G-螺旋、聚脯胺酸π螺旋、或串聯排列 之β-轉角。在本發明實施例中，凹面上之卜鏈及凸面之主 要螺旋元件係藉由短環或β-轉角連接。 本發明蛋白質包含足夠LRR以具有抗微生物活性，且本 發明蛋白質適宜包含3至20個LRR結構域。本發明之尤佳 實施例包含至少3個LRR、至少5個LRR或至少7個LRR。在 本發明之其他實施例中’該等蛋白質可包含至少4個、至 少6個、至少8個、至少9個、至少1〇個、至少^個 '至少 12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少 17個、至少18個、至少19個或至少2〇個LRR結構域。 在形成本發明實施例之一類蛋白質中，存在之白胺酸殘 基佔較向比例。因此，每一 LRR中之至少2個L殘基係 Leu ’或每一 LRR中之至少3個L殘基係Leu。在某些實施例 中’實質上所有L殘基皆為Leu。本發明蛋白質進一步較佳 具有水溶性。 本發明蛋白質之尤佳亞類包含5個或更多個lrr(富白胺 酸重複序列）結構域以用作抗細菌劑，其中該蛋白質之C端 137481.doc -13- 200936155 係LRR結構域且每一LRR結構域均包含具有式⑴之胺基酸 序列： (FlLxxLxL(xxZ)YF2) (I)， 其中： F1及F2獨立地為具有1至3〇個殘基之鄰接胺基酸序列； • X可為任何胺基酸； • L可為 Leu、Ile、Val 或 Phe ; Z可為NxL或CxxL ; ❹ \係 Asn、Thr、Ser或 Cys ; C係Cys或Ser ;且 Y=0 或 1 o 在該蛋白質亞類中，較佳地，每一 LRR*之至少2個[殘 基係Leu。 本文所用之術語"經分離的"視情況係指所存在物理環境 不同於自然界中之存在環境之本發明蛋白質及聚核苷酸。 ❹’該、經分離蛋白質或聚核苷酸就其天然存在之複雜細 胞環境而言可為實質上經分離的（例如經純化的）。然而， 應注意，儘管本發明蛋白質在本文中可能閣述為"經分離 的"，但此並不意味著該蛋白質必然在自然界中存在。 術語"何生自”及’’衍生”係指所討論蛋白或聚核苷酸與其 物理來源無關。因此，例如，"衍生自天然存在之含 蛋白之具有式（I)的LRR(例如以串聯方式）"係指LRR所具有 的-級胺基酸序列與天然存在之含蛋白中所發現者相 同，但無需自彼天然存在之來源進行純化。 137481.doc 14 200936155 術語"死亡折疊結構域"係指在漸進性細胞死亡（細胞凋 亡）中起突出作用之特徵在於六個緊密堆積之(X螺旋的結構 域家族。該家族之成員包括胱天蛋白酶募集結構域 (CARD)、匹林結構域（PYD)、死亡結構域（DD)及死亡效應 子結構域（DED)。讀者可尤其參照Lahm A等人（2003); Cell death and Differentiation，10，10-12及其中所引用之 . 參考文獻來獲得關於該家族之進一步資訊。 術語"LRR"或"LRR基序"及其語法變化形式係指具有式 ❹ （I)之富白胺酸重複序列基序。 術語"LRR結構域"係指包含（或實質上由以下組成、或由 以下組成）兩個或更多個（至多約五十個）（通常以串聯方式） 具有式（I)之LRR的蛋白質結構域。 術語"NOD蛋白”係指含有中心核苷酸結合寡聚化結構域 (NOD)、胺基末端之CARD結構域及羧基末端之LRR結構 域的蛋白質。讀者可尤其參照Inohara N.等人（2005) ’ Annu.Rev.Biochem 74:355-383之第 361 頁，表I來獲得人類 ® NOD家族成員之細節（但未必詳盡無遺）。 後綴”-LRR"係指前述蛋白質之天然存在的LRR結構域且 ' 因此” NOD-LRR"係指可見於天然存在之NOD家族成員中之 • LRR結構域。 "LRR蛋白"意指包含至少一個LRR結構域之蛋白質。 ”TLR"係指鐸樣受體家族。鐸樣受體（TLR)係識別衍生自 微生物之結構保守分子的單跨膜非催化性受體類型。參見 Mitchell JA (2007)，J Endocrinol 193(3) ; 323-30，其全部 137481.doc -15- 200936155 内容以引用方式併入本文中且讀者可尤其參照。 ”蛋白質"包括多肽。 "人類NOD2”係指具有SEQ ID NO: 1之蛋白質。 "人類NOD 1”係指具有SEQ ID NO: 2之蛋白質。 "人類NOD2-LRR”係指具有SEQ ID NO: 3之蛋白質。 • "人類NOD1-LRR”係指具有SEQ ID NO: 4之蛋白質。 . "人類CIITA-LRR”係指具有SEQ ID NO: 5之蛋白質。 "人類TLR2-LRR"係指具有SEQ ID NO: 6之蛋白質。 φ "人類Nalp3-LRR"係指具有SEQ ID NO: 7之蛋白質。 ”抗細菌醫藥組合物”係指在投與至個體中之前尤其具有 抗細菌活性的醫藥組合物。 5.1蛋白質 本發明至少部分基於以下驚人觀察：含有一個LRR基序 (具有式（I))之蛋白質具有抗細菌（特別是殺細菌）活性。儘 管吾人證實包含LRR結構域與其他結構域（例如NOD蛋白 質家族中所見者）之天然存在的蛋白質具有顯著抗細菌活 ® 性，但吾人亦證實LRR結構域本身具有抗細菌活性。 在一些實施例中，該分離之蛋白質包含2至100個、更特 別是2至50個、例如2至45個串聯排列的式（I)之LRR基序。 • 在典型實施例中，LRR基序之長度為1 5至50個殘基，例 如長度為20至3 0個殘基。因此，在一些實施例中，該分離 之蛋白質包含兩個至一百個（例如兩個至五十個）串聯排列 之式（I)之LRR基序，每一基序由15至50個鄰接胺基酸殘基 (例如20至30個殘基）組成。 137481.doc • 16- 200936155 在一些實施例中，蛋白質係人造的，即其具有未在自然 界中發現之排列。在該等實施例中，該蛋白質可包含一個 中心核苷酸結合寡聚化結構域（NOD)、一個羧基端之LRR 結構域（包含例如人為數量之LRR結構域，較佳串聯排列） 及一個胺基端之效應子結構域。效應子結構域可以例如促 - 進殺死（例如藉由細胞〉周亡）把細胞，諸如致病細菌。該等 • 效應子結構域之實例係死亡折疊結構域，例如CARD、匹 林（Pyrin)、死亡結構域及死亡效應子結構域。 φ 在本發明之其他態樣中，提供包含衍生自天然存在之蛋 白質之LRR結構域的經分離蛋白質。在本發明該態樣之一 些實施例中，經分離蛋白質係包含LRR結構域之天然存在 之蛋白質（在本文中有時稱為"LRR蛋白"）。天然存在之 LRR蛋白可為"RI樣"、"CC"、"細菌"、"SDS22樣"、"植物 特異性的"、"典型"或"TpLRR"，參見Kajava A.V· (1998)， J.Mol.Biol. 277，519-527 及 Ohyanagi T 等人（1997)， FASEB J 11: A949，二者之全部内容均併入本文中且讀者 ® 可尤其參照。該等天然存在之蛋白質的實例係衍生自動物 之蛋白質且包括NOD家族成員，且特定言之為人類（或其 他靈長類動物）NOD蛋白（例如人類NOD1或人類NOD2)。其 • 他成員包括鐸樣受體（TLR)家族且包括TLR 2、4、5、7、8 及9及特定言之其人類及其他哺乳動物直系同源物。其他 進一步實例包括成員CIITA及NAIP。 在一些實施例中，該經分離蛋白質係選自由SEQ ID NO: 1、2、3或4組成之群。 137481.doc 17 200936155 在本發明之其他態樣中’提供經分離之LRR結構域，即 由經分離之LRR結構域組成之蛋白質。在一些實施例中， 該蛋白質可為經分離之LRR結構域。 在本發明之其他態樣中提供經分離之LRR蛋白，前提條 件係該LRR蛋白不為包含以下之經分離多肽：n端富白胺 * 酸重複序列、一或多個富白胺酸重複序列、C端富白胺酸 . 重複序列、及連接肽，其中該連接肽包含α螺旋。 5·2聚核苦酸 ® 在本發明之其他態樣中提供編碼本發明蛋白質之經分離 聚核苷酸（例如RNA或cDNA)。該等聚核苷酸可用於製備本 發明經分離蛋白質之方法中，例如用於製備包含本發明經 分離蛋白質之藥劑（例如醫藥組合物）中。在其他態樣中， 可將編碼本發明蛋白質之聚核苷酸納入至諸如質粒、病 毒、微型染色體、轉座子及諸如此類等載體中作為治療用 或預防用免疫原性組合物（例如疫苗，例如DNA疫苗）的一 _ 4刀來七·局宿主對病原體（例如致病性細菌）之防禦。 因此，在本發明之一個態樣中提供編碼包含（或實質上 由以下組成、或由以下組成）具有式⑴之LRR之蛋白質的 經分離聚核苷酸，例如DNA(例如cDNA)或RNA。 在本發明之另一態樣中提供編碼包含LRR結構域之蛋白 質的經分離聚核苷酸，例如DNA(例如cDNA)或RNA。在 該態樣之一些實施例中提供編碼天然存在之LRR結構域的 經分離聚核苷酸，該天然存在之LRR結構域係例如N〇D LRR結構域，特定言之為人類NOD LRR結構域，例如具有 137481.doc -18- 200936155 SEQ ID NO: 2或3之蛋白質。 在本發明之另一態樣中提供編碼LRR蛋白之經分離聚核 苷酸（例如DNA(例如cDNA)或RNA)，該LRR蛋白特定言之 為衍生自動物之天然存在的LRR蛋白（例如NOD蛋白），且 更特定言之為人類或其他靈長類動物NOD蛋白。其實例包 括編碼人類NOD1或人類NOD2之經分離聚核苷酸。其他實 例包括編碼鐸樣受體（TLR)(例如，TLR2、7、8或9)及 CIITA或NAIP之經分離聚核苷酸。 ❹ ❹ 5·3產生方法 本發明某些態樣涉及產生經分離蛋白質及本發明蛋白f 及尤其彼等5.1部分中所提及者之方法。 經分離蛋白質及本發明蛋白質通常使用彼等熟習此項技 術者所熟知之重組細胞培養技術來產生。分離編碼蛋白質 之聚核苷酸或蛋白質並插入至可複製載體（例如質粒）中以 進一步選殖（擴增）或表現。一種可用之表現系統係麵胺酸 合成酶系統（例如由Lonza Biologies出售者），在宿主細胞 係CHO或NSO之情形下尤其如此（參見下文）^編碼聚核皆 酸或蛋白質之聚核苷酸可容易地使用習用程序（例如寡核 苷酸探針）來分離及測序。可使用之載體包括質粒、病 毒、嗔菌體、轉座子、微型染色體’其中質粒係典型實施 例。通常而言’該等載體進一步包括可操作連接至聚校 酸上以促進表現的信號序列、複製起點、一或夕 -乂夕個標記基 因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。 5.3.1 信號序列 137481.doc -19- 200936155 本發明蛋白質可以與在成熟蛋白質之N末端具有特異性 切割位點之異源性信號序列融合之蛋白質形式產生。信號 序列應可藉由宿主細胞識別及加工。對於原核宿主細胞， 信號序列可為鹼性磷酸酶、青黴素酶、或熱穩定性腸毒素 II前導物。對於酵母分泌，信號序列可為酵母轉化酶前導 物、[α]因子前導物或酸性磷酸酶前導物，參見例如 WO90/13646。在哺乳動物細胞系統中，可使用病毒促分 泌前導物（例如單純皰疹gD信號）及天然免疫球蛋白信號序 列。通常而言，信號序列在讀碼框中與編碼本發明抗體之 DNA連接。 5.3.2 複製起點 複製起點已為熟習此項技術者所熟知，pBR322適於大 多數革蘭氏陰性細g，2μ質粒適於大多數酵母且諸如 SV4(^多瘤、腺病毒、vsv或Βρν等多種病毒起點適於大 多數哺乳動物細胞。通常而言’哺乳動物表現載體不需要

複製起點組件’但可使用SV4〇 ’此乃因其含有早期啟動 子。 5.3.3 選擇標記 典型選擇基因編碼具有 -丨，工月叼贫w只.螂卞對 抗生素或其他毒素(例如胺节西林、新黴素、"蝶呤或 四環素）之抗性’或⑻補足營養缺陷型不足或供應在複合 培養基中無法㈣的營養物。選擇方案可涉及崎宿主細 胞生長。由於具有（例如）選擇標記所賦予之藥物抗性，故 已用編碼树明之治㈣抗體之基因成功熟的細胞會存 I37481.doc 200936155 活。另一實例係所謂的〇1117尺選擇標記，其中在胺甲喋呤 存在下培養轉化體。在典型實施例中，細胞係在增加量之 胺甲喋呤存在下進行培養以擴增所關注外源基因之拷貝 數。對於DHFR選擇，CH〇細胞係特別有用之細胞系。其 他實例係麩胺酸合成酶表現系統（L〇nza Bi〇1〇gies)。用於 酵母之適宜選擇基因係丨印丨基因；參見Stinchc〇mb等人，

Nature 282，38，1979。 5.3.4 啟動子 將適於表現本發明蛋白質及聚核苷酸之啟動子可操作連 接至編碼抗體之DNA/聚核苷酸上。用於原核宿主之啟動 子包括phoA啟動子、β-内醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性 麟酸酶、色胺酸及雜合啟動子（例如Tac)^適於在酵母細胞 中表現之啟動子包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解 酶，例如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙 酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、6_磷酸葡萄糖異構酶、3•磷 酸甘油酸酯變位酶及葡糖激酶。誘導型酵母啟動子包括醇 脫氫酶2、異細胞色素c (iSOCyt〇chrome C)、酸性碟酸酶、 金屬硫蛋白及造成氮代謝或麥芽糖/半乳糖利用的酶。 適於在哺乳動物細胞系統中表現之啟動子包括病毒啟動 子’例如多瘤、禽痘病毒及腺病毒（例如腺病毒2)、牛乳頭 瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、巨細胞病毒（特定言之為即時早 期基因啟動子）、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒、肌動蛋 白、勞氏肉瘤病毒（rous sarcoma virus) (RSV)啟動子及早 期或晚期猿猴病毒40。當然，啟動子之選擇應基於與用於 137481.doc 21 200936155 。因此，在一個實施例中

(VH)之DNA、編碼[γ] 1怪定區之dNA、 表現之宿主細胞具有適宜相容性。因此， 提供第一質粒及第二質粒，該第一質与 SV40及/或CMV啟動子、編碼本發明之 丨土 3¾伴保§己，且該第 編碼本發明之重鏈V區 NA、DHFR及胺苄西林 抗性標記。 5.3.5 增強子元件 ® 若適於在例如高等真核生物中表現，則可使用可操作連 接至載體中之啟動子元件上的增強子元件。適宜哺乳動物 增強子序列包括來自珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白胎蛋 白及胰島素之增強子元件。或者，吾人可使用來自真核細 胞病毒之增強子元件，例如SV4〇增強子（bpl〇〇_27〇)、巨 細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤增強子、杆狀病毒增強 子或鼠科動物lgG2a基因座（參見W004/009823)。增強子較 佳位於載體上啟動子上游位點處。 5.3.6 宿主細胞 適於選殖或表現編碼本發明經分離蛋白質之載體的宿主 細胞係原核、酵母或高等真核細胞。適宜原核細胞包括真 細菌類’例如腸桿菌科（enter〇bacteriaeeae)，例如埃希氏 菌屬（Escherichia) ’例如大腸桿菌（e. c〇li)(例如ATCC 31’446 ’ 31’537，27,325);腸桿菌屬（Enterobacter);歐文 氏菌（Erwinia);克雷伯氏菌屬（Klebsiella);變形桿菌屬 (Pr〇teus);沙門氏菌屬（Salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌 137481.doc 22- 200936155 (Salmonella typhimurium);沙雷氏菌屬（Serratia) ’ 例如黏 質沙雷氏菌（Serratia marcescens);及志賀氏菌屬 (Shigella);以及芽孢桿菌屬（Bacilli)，例如枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)及地衣芽抱桿菌（B.licheniformis)(參見 DD 266 710);假單胞菌屬（Pseudomonas)，例如銅綠假單胞菌 • (P.aeruginosa);及鍵黴菌屬（Streptomyces)。亦涵蓋以下 酵母宿主細胞：讓酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)、 粟酒裂殖酵母菌（schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵 ❹ 母菌屬（Kluyveromyces)(例如 ATCC 16,045 ; 12,424 ; 24，178 ; 56,500)、解脂耶氏酵母菌屬（yarrowia)(歐洲專利 第402,226號）、曱醇酵母菌（Pichia Pastoris)(歐洲專利第 183,070號，亦參見Peng等人，J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192)、念珠菌属（Candida)、裏氏木黴菌（7WcA〇i/erwa reesei)(歐洲專利第244,234J號）、青黴菌屬（Penicillin)、灣 頸黴屬（Tolypocladium)及曲黴菌屬（Aspergillus)宿主’例 如構巢麵菌（A.nidulans)及黑黴菌（A.niger)。 Φ 本發明宿主細胞可為高等真核細胞。適宜高等真核宿主 細胞包括哺乳動物細胞’例如COS-1 (ATCC No. CRL 1650)、COS-7 (ATCC CRL 1651)、人類胚腎細胞系 293、 • 幼倉鼠腎細胞（BHK) (ATCC CRL.1632)、BHK570 (ATCC NO: CRL 10314)、293 (ATCC NO.CRL 1573)、中國倉鼠卵 巢細胞 CHO(例如 CHO-K1 (ATCC NO: CCL 61)、DHFR-CHO細胞系，例如DG44(參見 Urlaub等人，（1986) Somatic Cell Mol.Genet.12，555-556))，尤其彼等適於懸浮培養之 137481.doc •23- 200936155 CHO細胞系、小鼠塞特利氏細胞（Sertoli cell)、猴腎細 胞、非洲綠猴腎細胞（ATCC CRL-1587)、HELA細胞、犬 腎細胞（ATCC CCL 34)、人類肺細胞（ATCC CCL 75)、Hep G2及骨髓瘤或淋巴瘤細胞，例如NSO(參見美國專利第 5,807,71 5號）、Sp2/0、Υ〇。因此’在本發明之一個實施例 中提供經穩定轉化之宿主細胞，該宿主細胞包含編碼經分 離蛋白質之載體，該經分離蛋白質包含兩個或更多個具有 式（I)之LRR(LRR結構域或LRR蛋白）。

5.3.7 細菌發酵 可使用細菌系統來產生本發明蛋白質。通常而言，該等 蛋白質係按照彼等熟習此項技術者所習知之方法以不溶性 周質蛋白形式產生，其可經提取及再折疊以形成活性蛋 白’參見 Sanchez 等人（1999) J.Bioteehnol. 72，13-20 及 Cupit PM等人（1999) Lett Appl Microbiol，29，273-277。 5.3.8 細胞培養方法 可藉由彼等熟習此項技術者所習知的任何方法來培養用 編碼本發明蛋白質或其抗原結合片段之載體轉化之宿主細 胞。宿主細胞可在旋轉培養瓶、滾瓶或中空纖維系統中進 行培養，但對於大規模生產而言較佳係使用攪拌罐反應 器，對於懸浮培養尤其如此。較佳地，該等攪拌罐適合用 (例如）分佈器、擋流板或低剪切力葉輪來通氣。對於泡罩 塔及氣升式反應器可採用直接用空氣或氧氣泡通氣。在宿 主細胞於無金清培養基進行培養《情形中，車交佳係培養基 補充有細胞保護劑（例如普盧蘭尼克F_68 (plur〇nie 137481.doc •24- 200936155 以助於防止細胞因通氣過程而受損。端視宿主細胞特徵’ 可使用微載體作為貼壁依賴性細胞系之生長基質’或使細 胞適應懸浮培養（典型方式）。宿主細胞（尤其為無脊椎動物 宿主細胞）之培養可採用多種作業方式，例如補料分批、 重複分批加工（參見 Drapeau 等人（1994) cytotechnology 15: • 103-109)、擴展分批加工或灌注培養。儘管可將以重組方 . 式轉化之哺乳動物宿主細胞在含有血清之培養基（例如肽 牛血清（FCS))中進行培養，但較佳係將該等宿主細胞在合 〇 成的無血清培養基（例如Keen等人（1995) Cytotechnology 17:153-163中所揭示者）或市售培養基（例如ProCHO-CDM 或UltraCHO(TM)(CambrexNJ，USA))中進行培養，必要時 該等培養基中補充有能量來源（例如葡萄糖）及合成的生長 因子（例如重組胰島素）。宿主細胞之無血清培養可能需要 使該等細胞適應在無血清條件下生長。一種適應方法係在 含有血清之培養基中培養該等宿主細胞並重複將80%之培 養基更換為無血清培養基以使宿主細胞逐漸適應無血清條 ® 件（參見例如 Scharfenberg K等人，（1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.G.等人編輯），第 619-623頁，Kluwer Academic - publishers) 〇 可使用多種技術來回收及純化分泌至培養基中之本發明 蛋白質以提供適於預期用途之純度。例如，使用本發明之 治療用蛋白質治療人類患者時通常需要至少95°/。之純度、 更通常為98%或99%或更高之純度（與粗培養基相比）。在 137481.doc -25- 200936155 第一種情形中，通常利用離心隨後用（例如）微量過渡、超 過濾及/或深度過濾進行上清液之澄清步驟去除來自培養 基之細胞碎片。諸如透析及凝膠電泳以及層析技術（例如 經磷灰石（HA)層析、親和層析（視情況涉及親和加標籤系 統’例如聚組胺酸）及/或疏水性相互作用層析（HIC，參見 美國專利第5,429,746號））等多種其他技術均可用。通常， 亦採用各種病毒去除步驟（例如使用（例如）Dv_2〇過滤器進 行之奈米過濾）。在此等不同步驟後，得到包含至少35 該 mg/ml或更多（例如10〇 mg/ml或更多）經分離本發明蛋白質 之經純化製品且因此形成本發明之實施例。適宜地該等 製品實質上不含聚集形式之本發明蛋白質。 5·4醫藥組合物 在某些實施例中，將本發明之經分離蛋白質及聚核苷酸 納入至醫藥組合物中以治療及/或預防致病性細菌感染。 在一些實施例中，該醫藥組合物係用於治療及/或預防對 象 人類具有致病性之細菌的感染。在其他實施例中，該醫藥 組合物係用於治療及/或預防對非人類動物具有致病性之 細菌感染，例如用於獸醫用途。治療及/或預防特定致病 性細菌感染之實施例在下文中予以更詳細閣述。讀者可認 為，吾人意欲將闞述於部分3、部分51及部分52中之每一 (each及every)蛋白f或聚核*酸態樣或實施例明確地及個 別地涵蓋於本文中以納入醫藥組合物中。 通常而σ ’本發明醫藥組合物包含(或實質上由以下組 成）治療有效量（例如以單位劑量量）之本發明經分離蛋白質 137481.doc -26· 200936155 與由公認之製藥實踐所習知及要求的醫藥上可接受之載 劑。用於醫藥用途之蛋白質的調配已為吾人充分瞭解且讀 者可尤其參照 Hovgaard L (2000) "Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins"，CRC Press ， ISBN: 0748407456 ; Nail S.等人（2002) "Development and manufacture of protein pharmaceuticals" » Springer，ISBN: 0306467453 ； McNally E.J. (1999) "Protein formulation and delivery (Drugs & the Pharmaceutical ❿ Sciences)，Marcel Dekker有限公司，ISBN: 0824778839。 亦參見 Oslo 等人編輯之 Pharmaceutical iSc/ewcej，第 16版，1980，Mack Publishing公司，其揭示 内容以引用方式併入本文中。端視期望治療之潛在疾病或 病狀可使本發明醫藥組合物適於藉由任何適宜或需要途徑 投與。因此，在一些實施例中提供可靜脈内投與之包含治 療有效量之本發明蛋白質的醫藥組合物。在其他實施例 中，提供適於經皮下投與之含有治療有效量之本發明蛋白 ¥ 質的醫藥組合物。 為儲存或投與目的，藉由將具有期望純度之本發明蛋白 • 質與生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備 ， 本發明蛋白質。該等物質在所用劑量及濃度下對接受者無 毒性。若本發明蛋白質係水溶性的，則其可在諸如磷酸鹽 或其他有機酸鹽等pH值較佳為約7至8的緩衝液中進行調 配。若蛋白質僅部分溶於水，則可藉由將其與諸如 Tween、普盧蘭尼克、或PEG(例如Tween 80)等非離子型表 I37481.doc 27- 200936155 液以提高其 面活性劑以0.04-0.05% (w/v)的量調配成微乳 溶解性來製備。 可視情況添加諸如下述其他成份：抗氧化劑，例如，抗 壞血酸；低分子量（小於約10個殘基）多肽，例如，聚精胺 酸或三肽；蛋白質’例如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋 白；親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例 如甘胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、或精胺酸；單糖、二糖及 其他碳水化合物’包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露 糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ;及糖醇，例如甘露糖醇 或山梨糖醇》 擬用於治療用投與之本發明蛋白質必須為無菌的。無菌 後可藉由藉助無菌過渡膜（例如，G2微米膜）過濾容易地達 成本發明蛋白質一般以凍乾形式或水溶液形式（若其對 熱及氧化變性高度穩定）儲存。本發明蛋白質製品之pH值 2常為約6至8，儘管較高或較低之pH值在某些情形下亦適

«。應瞭解，使用某些上述賦形劑、載劑或穩定劑將會導 致形成本發明蛋白質的鹽。 若本發明蛋白質擬非經腸使用，則通常將含有本發明蛋 白質之治療用組合物置於具有無菌進入孔之容器中例 如，具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈内溶液袋或 小瓶。 吕’若疾病/病症容許’吾人應調配及投用適於 位點特異性遞送之本發明蛋白質。此在創傷及潰瘍情形下 較為適宜。例如，可將本發明蛋白質納入至凝膠（例如水 137481.doc •28- 200936155 凝膠）中並投與至創傷或潰瘍床中。 亦可製備緩釋調配物，且包括形成微膠囊顆粒及可植入 物品。為製備緩釋組合物’較佳將本發明蛋白質納入至生 物可降解之基質或微膠囊中。適於此目的之物質係聚交 酯，儘管可使用其他聚合物聚_(^羥基羧酸），例如聚 3-經基丁酸（歐洲專利第133,988A號）。其他生物可降解聚 合物包括聚（内酯）、聚（縮醛）、聚（原酸酯）、或聚（原碳酸 S曰）。此處最初考慮必須為載劑本身或其降解產物在目標 組織中無毒性且不會進一步惡化病狀。此可藉由在患有目 標病症之動物模型或若不能得到該等模型在正常動物中實 施常規筛選來測定。許多科技出版物提供該等動物模型之 資料。 緩釋組合物之實例可參見美國專利第3,773 919號、歐洲 專利第58,481入號、美國專利第3,887,699號、歐洲專利第 158,277A號、加拿大專利第ι 176565號、u. Sidman等人， o/州的 22，547[1983]、及 R_ Langer 等人，CA亂 12, 98[1982]。 當局部施用時’本發明蛋白質適宜與諸如載劑及/或佐 劑等其他成份組合。對該等其他成份之性質沒有限制，只 是其必須為醫藥上可接受的且對於其擬定投與具有功效， 且不能降格組合物活性成份之活性。適宜媒劑之實例包括 軟膏、乳霜、凝膠、或懸浮液，有或無純淨膠原。亦可將 組合物較佳以液體或半液體形式灌注至經皮貼片、膏藥及 端帶中。 137481.doc -29- 200936155 為獲得凝膠調配物，可將調配於液體組合物中之本發明 蛋白質與有效量之水溶性多糖或合成聚合物（例如聚乙二 醇）混合以形成具有合適黏度之凝膠來局部施用。可使用 之多糖包括（例如）纖維素衍生物，例如醚化之纖維素衍生 物’包括烧s纖維、經院基纖維t、及&基經燒基纖維 素’例如，曱基纖維素、經乙基纖維素、叛甲基纖維素、 經丙基甲基纖維素、及經丙基纖維素；搬粉及精製殿粉； 瓊脂；海藻酸及海藻酸鹽；阿拉伯樹膠；f魯蘭多聽 (PulluUan);瓊脂冑；角又菜勝；右旋糖；冑精；果聚 糖；菊糖；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；殼聚糖；糖 原；葡聚糖；及合成的生物聚合物；以及膠，例如黃原 膠；瓜爾豆膠；刺槐豆膠；阿拉伯樹膠；黃箸膠；及刺梧 桐樹膠’及其何生物及混合物。本文中之較佳凝膠劑係如 下者：對生物系統呈惰性、無毒性、易於製備且不過於 易流動或黏稠》且不會使伸_甘士 >丄 个I1史保存於其中之本發明蛋白質不穩 定。 ❹ <較佳之多糖仙化之纖維素衍生物，更佳者係精製、純 淨且列示於USP中纟，例如’甲基纖維素及羥烷基纖維素 衍生物，例如經丙基纖維素、經乙基纖維素、及經丙基甲 基纖維素。在本文中最佳者係甲基纖維素。 可用於凝膠之聚乙二醇通常為低與高分子量聚乙二醇之 混合物以獲得合適黏度。例如，當將分子量為議之 聚乙二醇與分子量為⑽者以合適比例混合以獲得膏糊 時，此混合物可有效用於此目的。 13748l.doc • 30 - 200936155 應用於多糖及聚乙二醇之術語"水溶性"意指包括膠體溶 液及分散液。通常而言’纖維素衍生物之溶解性係藉由醚 基團之取代程度來確定’且可用於本文之穩定化衍生物的 纖維素鏈中之每個脫水葡萄糖單位應具有足量該等醚基團 以使該等衍生物具有水溶性。每個脫水葡萄糖單位至少 0.35個醚基團之醚取代程度通常足夠。另夕卜，纖維素衍生 物可呈驗金屬鹽形式，例如，Li、Na、Kg^。

❹ 若甲基纖維素係於凝膠中使用時，其較佳包含約2_5%、 更佳約3%之凝膠且本發明蛋白質係以約3〇〇 i〇〇〇 mg/mi凝 膠的量存在。 擬使用之難端視上輯述因素而定。通常建議以能夠 在組織中確立大於約(M ng/ee之含量的劑量至高達有效但 無過分毒性之最大劑量將本發明蛋白f調配並遞送至目標 位點或組織。若可能’應藉由連續輸注、緩釋、局部施 用、或注射以經驗確定之頻率來保持此組織内濃度。 本發明實踐中使用之尤其適於臨床投與此本發明蛋白質 之組合物包括(例如)無菌水溶液、或無菌可水合粉末(例如 凍乾蛋白質）。通常期望在調配物中進一步包括合適量的 醫藥上可接受之鹽’通常以足以使調配物等滲的量。通常 亦以足以保持合適pH值（通常為55至7 5)的量包括諸如精 胺酸驗及餐等PH值調節劑。而且，為改良水性調配物之 存架期或穩定性’亦期望包括諸如甘油等其他試劑。以此 方式，使調配物適合非經腸投與且尤其靜脈内投與。 本發明醫藥組合物之劑量及期望藥物濃度可端視所預見 137481.doc •31- 200936155 之特定用途而有所變化且在主治醫師/健康護理專業人員 之範圍内。 因此，在一些實施例中提供包含經分離NOD蛋白、特定 言之為諸如人類NOD1或人類NOD2等經分離人類NOD蛋白 (例如作為唯一活性成份）之抗細菌（例如殺細菌）醫藥組合 • 物。 . 在其他實施例中提供製備醫藥組合物、特定言之抗細菌 醫藥組合物之方法，該方法包含提供經分離NOD蛋白，特 φ 定言之為諸如人類NOD1及/或人類NOD2等經分離人類 NOD蛋白。 因此，在一些其他實施例中提供包含經分離NOD-LRR 結構域、特定言之為諸如人類NOD1-LRR或人類NOD2-LRR等經分離人類NOD-LRR結構域（例如作為唯一活性成 份）的抗細菌（例如殺細菌）醫藥組合物。 因此，在一些其他實施例中提供包含（作為唯一活性成 份）蛋白質之醫藥組合物（例如抗細菌（例如殺細菌）醫藥組 W 合物），該蛋白質由以下組成：經分離LRR結構域，例如經 分離NOD-LRR結構域，特定言之為諸如人類NOD1-LRR或 ' 人類NOD2-LRR等經分離人類NOD-LRR結構域（例如作為 • 唯一活性成份）或經分離人類TLR-LRR結構域〇lWTLR2-LRR、TLR4-LRR、TLR5-LRR、TLR9-LRR)。 在其他實施例中提供製備醫藥組合物、特定言之抗細菌 醫藥組合物之方法，該方法包含提供經分離LRR蛋白，例 如經分離之人類LRR蛋白，例如經分離NOD-LRR結構域， 137481.doc -32- 200936155 特定言之為經分離之人類NOD-LRR結構域，例如人類 NOD1-LRR及 / 或人類 NOD2-LRR。 在其他實施例中，提供抗細菌（例如殺細菌）醫藥組合 物，其包含（例如作為唯一活性成份）經分離TLR蛋白，例 如經分離之哺乳動物TLR蛋白，例如人類TLR 4、5。 ^ 在其他實施例中，提供抗細菌（例如殺細菌）醫藥組合 . 物，其包含（例如作為唯一活性成份）經分離TLR-LRR，例 如經分離之哺乳動物TLR-LRR，例如人類TLR4-LRR、人 ❹類TLR5-LRR、人類 TLR2-LRR。 在其他實施例中，提供製備抗細菌（例如殺細菌）醫藥組 合物之方法，該方法包含提供（例如作為唯一活性成份）經 分離TLR-LRR，例如經分離之哺乳動物TLR-LRR，例如人 類 TLR4-LRR、人類 TLR5-LRR或人類 TLR2-LRR。 5.4.1 其他組合物及製備物品 在一些實施例中，將有效量之本發明經分離蛋白質（例 如詳述於上文部分3及5.1中者）納入至消毒劑組合物（例如 W 水性消毒劑組合物）中以為有需要之表面或物品進行消 毒。讀者可認為，陳述於該說明書部分3及5.1中之所有態 ' 樣及實施例皆個別地及明確地涵蓋用於此部分中。該等表 面之實例包括彼等常見於臨床環境中者，例如醫院病房、 外科用表面及諸如此類及期望降低致病性細菌暴露之其他 表面。本發明之消毒劑組合物亦可用於視情況與為良好臨 床實踐所習知及要求之其他滅菌技術組合來為諸如醫學物 品（例如導管或外科用儀器）等物品進行消毒。本發明蛋白 137481.doc -33- 200936155 質亦可用於為受致病性細菌污染之水進行消毒且本發明包 括為受細菌（特定言之為對人類及/或其他哺乳動物具有致 病性之細菌）污染之水進行消毒的方法，該方法包含將該 受污染之水與本發明蛋白質混合。 在其他實施例中，亦提供包含（或實質上由以下組成）本 • 發明蛋白質之創傷及/或外科用衣服。 5.5致病性細菌 在本發明之某些實施例中，諸如醫藥組合物等組合物可 〇 用於治療及/或預防致病性細菌感染。如上所述，細菌可 能對人類及/或其他哺乳動物具有致病性。在一些實施例 中，致病性細菌係革蘭氏陽性的，在其他實施例中，為革 蘭氏陰性的。在其他所涵蓋實施例中，致病性細菌係對宿 主（例如人類）具有致病性之厥氧細菌。致病性細菌之實例 包括： 鲍氏不動桿菌（Acinetobacter baumanii)、放線桿菌屬 (Actinobacillis spp)、放線菌類（Actinomycetes)、放線菌屬 (Actinomyces)(例如衣氏放線菌（Actinomyces israelii)、内 氏放線菌（Actinomyces naeslundii)、放線菌屬（Actinomyces spp))、氣單胞菌屬（Aeromonas spp)(例如嗜水氣單胞菌 • (Aeromonas hydrophila)、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria)、 脉鼠氣單胞菌（Aeromonas Caviae))、厭氧球菌（Anaerobic Cocci)(例如消化鏈球菌屬（Peptostreptococus)、韋榮球菌 屬（Veillonella))、革蘭氏陽性厭氧桿菌（Gram positive Anaerobic Bacilli)，例如活動彎曲桿菌屬（Mobiluncus 137481.doc -34- 200936155 spp)、痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes)、乳桿菌屬 (Lactobacillus)、真桿菌屬（Eubacterium)、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium spp)、革蘭氏陰性厭氧桿菌，例如擬桿菌 屬（Bacteroides)、普雷沃氏菌屬（Prevotella spp)、紅掠色 單胞菌屬（Porphyromonas spp)、梭桿菌屬（Fusobacterium spp)、芽胞桿菌屬（Bacillus spp)(例如炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)、臘狀芽孢桿菌（Bacillus cereus)、枯 草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 ❹ （Bacillus stearthermophilus))、擬桿菌屬（例如脆弱擬桿菌 (Bacteroides fragilis))、博德特氏菌屬（Bordetella spp)(例 如百曰咳博德特氏菌（Bordetella pertussis)、副百曰咳博德 特氏菌（Bordetella parapertussis)、支氣管炎博德特氏菌 (Bordetella bronchiseptica))、疏螺旋體屬（Borrelia spp)(例 如回歸熱疏螺旋艘（Borrelia recurrentis)、伯氏疏螺旋體 (Borrelia burgdorferi))、布魯氏菌屬（Brucella spp)(例如流 產布魯氏菌（Brucella abortus)、犬布魯氏菌（Brucella 胃 canis)、山羊布魯氏菌（Brucella melintensis)、豬布魯氏菌 (Brucella suis))、伯霍爾德桿菌屬（Burkholderia spp)(例如 類鼻症伯霍爾德桿菌（Burkholderia pseudomallei)、洋蔥伯 • 霍爾德桿菌（Burkholderia cepacia))、·彎曲桿菌屬 (Campylobacter spp.)(例如空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni)、大腸彎曲桿菌（Campylobacter coli)、紅嘴酵弯曲 桿菌（Campylobacter lari)、胚胎弯曲桿菌（Campylobacter fetus))、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter spp)(例如弗氏檸檬酸 137481.doc -35- 200936155 桿菌（Citrobacter freundii)、差異檸檬酸桿菌（Citrobacter diversus))、梭菌屬（Clostridium spp)(例如產氣莢膜梭菌 (Clostridium perfingens)、難辨梭菌（Clostridium difficile)、 肉毒梭菌（Clostridium botulinum))、棒狀桿菌屬 (Corynebacterium spp)(例如白喉棒狀桿菌（Corynebacterium • diphtheriae)、傑氏棒狀桿菌（Corynebacterium jeikeum)、 . 解脲棒狀桿菌（Corynebacterium urealyticum))、遲.純愛德 華氏菌（Edwardsiella tarda)、腸桿菌屬（Enterobacter 〇 spp)(例如產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、成團腸桿 菌（Enterobacter agglomerans)、陰溝腸桿菌（Enterbacter cloacae))、大腸桿菌（Escherichia coli)(例如腸產毒性大腸 桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸出血性 大腸桿菌、致腎盂腎炎大腸桿菌）、克雷伯氏菌屬（例如肺 炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)、產酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca))、摩氏摩根菌（Morganella morganii)、 變形桿菌屬（Proteus spp.)(例如奇異變形桿菌（Proteus ® mirabilis)、普通變形桿菌（Proteus vulgaris))、普羅威登斯 菌屬（Providencia spp.)(例如產驗普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens)、雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)、 ， 斯氏普羅威登斯菌（Providencia stuartii))、腸沙門氏菌 (Salmonella enterica)(例如傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi)、昌(]傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi)、腸炎沙門 氏菌（Salmonella enteritidis)、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuis)、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium))、 137481.doc -36- 200936155 沙雷氏卤屬（Serratia spp.)(黏質沙雷氏菌（serratia marcescens)、液化沙雷氏菌（Serratia liquifaciens))、志賀 氏菌屬（shigella spp)(例如痢疾志贺氏菌（shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌（Shigella flexneri)、鮑氏志賀 氏函（Shigella boydii)、索氏志賀氏菌（shigella sonnei))、 耶爾森氏菌屬（Yersinia spp.)(例如小腸結腸炎耶爾森氏菌 (Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis)、 假結核病耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis))、腸球 ❹ 菌屬（Enterococcus spp.)(例如糞腸球菌⑺nterococcus faecalis)、屎腸球菌（Enterococcus faecium))、豬丹毒桿菌 (Erysipelothrix rhusopathiae)、土拉熱弗朗西絲氏菌 (Francisella tularensis)、嗜血桿菌屬（Haemophilus spp.)(流 感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae)、杜克雷嗜血桿菌 (Haemophilus dureyi)、埃及嗜血桿菌（Haemophilus aegyptius)、 副流感嗜血桿菌（Haemophilus parainfluenzae)、副溶血嗜 血桿菌（Haemophilus parahaemolyticus))、螺旋桿菌屬 (Helicobacter spp.)(例如幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori)、同性戀螺旋桿菌（Helicobacter cinaedi)、芬納爾螺 旋桿菌（Helicobacter fennelliae))、嗜肺退伍軍人桿菌 (Legionella pneumophila)、問號鉤端螺旋艎（Leptospira interrogans)、單核細胞增生利斯特氏菌、微球菌屬 (Micrococcus spp.)、卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis)、 麻風分枝桿菌（Mycobacterium leprae)、結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)、奴卡氏菌屬（Nocardia 137481.doc -37- 200936155 spp.)(例如星形奴卡氏菌（Nocardia asteroides)、巴西奴卡 氏菌（Nocardia brasiliensis))、奈瑟氏球菌屬（Neisseria spp.)(例如淋病奈瑟氏球菌（Neisseria gonorrhoeae)、腦膜 炎奈瑟氏球菌（Nesseria meningitides))、出血敗金性巴斯 德氏菌（Pasteurella multocida)、類志贺鄰單胞菌 (Plesiomonas shigelloides)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、紅球菌屬（Rhodococcus spp.)、葡萄球菌屬 (Staphylococcus spp.)(例如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus 〇 aureus)，尤其抗曱氧西林（methicUlin)金黃色葡萄球菌 (MRSA)及抗萬古黴素（Vancomycin)金黃色葡萄球菌 (VRSA)、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)、腐 生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus))、嗜麥芽寡養 單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)、鍵球菌屬（Streptococcus SPP·)(例如釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes)、無乳鍵球 菌（Streptococcus agalactiae)、咽峽炎鍵球菌（Streptococcus anginosus)、類馬鍵球菌（Streptococcus equismilis)、牛鏈 ❹ 球菌（Streptococcus bovis)、咽峽炎鏈球菌、變異鍵球菌 (Streptococcus mutans)、唾液鍵球菌（Streptococcus salivarius)、血·鍵球菌（Streptococcus sanguis)、緩症鍵球 菌（Streptococcus mitis)、米氏鍵球菌（Streptococcus milleri))、鏈徽菌屬（Streptomyces spp·)、密螺旋體屬 (Treponema spp.)(例如蒼白密螺旋體（Treponema pallidum)、地方性密螺旋體（Treponema endemicum)、極細 密螺旋體（Treponema pertenue)、斑點病密螺旋體 137481.doc -38- 200936155 (Treponema carateum))、弧菌屬（Vibrio spp )(例如霍亂弧 菌（Vibrio cholerae)(包括其致病血清型，例如〇1及 0139)、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)、創傷弧菌 (Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌（Vibri〇 algin〇lyticus)、最小 弧菌（Vibrio minicus)、河流弧菌（Vibri〇 fluviaHs)、麥氏弧 菌（Vibrio metchnikovii)、美人魚弧菌（vibri〇 damsela)、弗 氏弧菌（Vibrio furnisii))。 因此’本發明提供醫藥組合物（及與其相關之治療方 ® 法），其係用於尤其在人類患者中治療及/或預防任何一種 上文提及之致病性細菌感染，該組合物包含（或實質上由 以下組成）陳述於部分3及/或部分5.1中之任何蛋白質實施 例。讀者可認為，陳述於部分3或部分5· 1中之蛋白質的所 有可能組合皆明確地及個別地涵蓋用於治療及/或預防陳 述於該部分中之任何致病性細菌感染且所有該等組合中之 母一者均構成本發明之單獨實施例。然而，尤其提及用於 在人類中治療及/或預防致病性細菌（例如其菌株）感染之包 含（或實質上由以下組成）人類LRR蛋白（例如人類n〇D蛋白 (例如人類NOD1或人類NOD2))或人類TLR蛋白的醫藥組合 物’該致病性細菌對習用藥物發生抗性或已發生抗性，例 5 · 6 床疾病 熟習此項技術之讀者基於本文揭示内容應瞭解，組合物 (特定言之為醫藥組合物）可用於治療及/或預防多種疾病， 尤其為人類疾病。因此，包含上文部分3及/或部分51之任 137481.doc -39· 200936155 何蛋白質及/或實質上由其組成之醫藥組合物可用於治療 及/或預防任何一種以下感染性疾病，在人類中尤其如 此： 炭疽、細菌性腦膜炎、肉毒中毒、布魯桿菌病 (Brucellosis)、彎麴菌病、貓抓病、霍亂、白喉、流行性 斑療傷寒、食物傳播病（例如食物中毒）、淋病、膿皰病、 軍團才干菌病、麻風（漢森氏病（Hansen's Disease))、鉤端螺 •體病、利斯特菌病（Listeri〇sis)、萊姆病（Lyme disease)、類鼻疽、MRSA感染、腦膜炎、奴卡氏菌病 (Nocardiosis)、百曰咳（Pertussis 或 Whooping Cough)、鼠 疫、肺炎球菌性肺炎、鸚鵡熱、（^熱、洛磯山斑疹熱 (Rocky Mountain Spotted Fever) (RMSF)、沙門氏菌病、猩 紅熱、志贺氏菌病、梅毒、破傷風、沙眼、結核病、土拉 菌病（Tularemia)、傷寒、斑疹傷寒、尿道感染。 在一些實施例中，醫藥組合物可用於在諸如人類（例如 患囊性纖維化病及/或免疫抑制之人類）等易感患者中治療 及/或預防機會性感染。 讀者可認為，上文部分3及部分51之蛋白質的所有可能 組合皆個別地及明確地涵蓋用於組合物（例如醫藥組合物） 中、/U療及/或預防上文所陳述之任何一種感染性疾病。 在其他實施例令，提供包含如上文部分3及51中所述蛋 白質之醫藥組合物的用冑’其係用於治療及/或預防細菌 在其中起病理學作用之疾病。其實例包括消化性潰癌病、 及其他胃腸疾病（例如炎症性腸病（IBD)，例如克隆氏病及 137481.doc -40- 200936155 潰瘍性結腸炎、應激性腸症候群（IBS))、及血液疾病（例如 敗血症）。 在其他實施例中提供包含如部分3及5.1中所述蛋白質之 醫藥組合物於治療炎症性疾病或病症中的用途。其實例勺 括諸如牛皮濟關節炎等關節炎性病症》 6. 例證 藉由以下非限制性實例來闡述本發明。 6.1縮窝列表

縮寫

CIITA 第11類、主要組織相容性複合物、反式激活子

GuHCl 鹽酸胍 LRR 富白胺酸重複序列 MDP 胞壁醯二肽 MIC 最小抑制濃度

Naip 神經元細胞凋亡抑制蛋白

Nalp3 Naeht結構域-、富白胺酸重複序列_及含PYD蛋白3

NFkB 激活B細胞之核因子κ-輕鏈增強子

Nodi 核苷酸寡聚化結構域1

Nod2 核苦酸寡聚化結構域2 PFA 多聚甲醛

PRR SNP TLR2 3020insC 模式識別受體 單核苷酸多態性 鐸樣受體2

Nod2之與克隆氏病有關的SNP 6.2市售試劑 137481.doc 41 200936155 6.2.1 細菌 以下細菌菌株係購自ATCC :單核細胞增生利斯特氏菌 (ATCC 7644) '枯草芽孢桿菌（ATCC 6633)、糞腸球菌 (ATCC 29212)、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213)、肺炎鍵球 菌（SirepiococJcrw·? (ATCC 49619)、大腸桿菌 • (ATCC 8739)、大腸桿菌（ATCC 25922)、肺炎克雷伯氏菌 (ATCC 700603)、銅綠假單胞菌（ATCC 27853)、豬霍亂沙 門氏菌（5^/wc>«e//a c/zo/eraeiMi·?) (ATCC 13076)、嗜麥芽糖 〇 募氧單胞菌（ATCC 17666)、脆弱擬桿菌（ATCC 25285)、具 核梭桿菌«Mc/eaiww) (ATCC 29148)、中間 普雷沃氏菌臨床分離物）、遲緩真 細菌（五/ewiM/w) (ATCC 43055)、產氣笑膜梭菌 per/Wwgews) (ATCC 13124)、難辨梭菌（臨床 分離物）、多枝梭菌（C/osiW 山.wm rarwoji/TW) (ATCC 25 5 82)、厭氧消化鏈球菌（Pepiojirepiococcw·? a«aero6z_wj) (ATCC 49031)、痤瘡丙酸桿菌（ATCC 25746)。 6.2.2其他 蛋白聚糖、脂磷壁酸、及熱滅活之金黃色葡萄球菌全部 購自Invivogen。結合羅丹明（Rhodamine)之鬼筆毒肽係來 • 自 Sigma 〇 6.2.3 質粒 全長NOD2 cDNA係藉由裝配來自外周血淋巴細胞庫之 數種PCR產物來獲得並將其選殖至pENTR/SD/D-Topo載體 (Invitrogen)中。編碼 NOD1 之 cDNA 係購自 Invitrogen 137481.doc -42- 200936155 (pENTR221-Nodl)。NODI 及 NOD2 之 LRR結構域係藉由 PCR使用LRR區域側翼之引物來產生，對於NODI : NodlLRRFwd ： 5'-caccatgaacaaggatcacttccagttcacc-3' (SEQ ID NO: 8)及 NodlLRRrev : S'-tcagaaacagataatccgcttctcatc-S1 (SEQ ID NO: 9)。對於NOD2 : Nod2LRRFwd : 5'-caccatg accatgccagctgcaccgggtgagg-3’（SEQ ID NO: 10)及Nod2LRRrev : 5'-tcaaagcaagagtctggtgtccctgcagc-3，（SEQ ID NO: 11)。為 產生Nod2之與克隆氏病有關的3020insC突變體，將脫氧胞 〇 嘧啶插入核苷酸位置3020 (NM_022162)中。所用所有 cDNA之完整性係藉由DNA測序來證實。將編碼全長蛋白 質或各自LRR結構域之cDNA轉移至以下質粒（Invitrogen) 中以用於以下指定應用：在293細胞（pEF5/FRT/V5-Dest)中 表現、細菌表現（PDEST17)、杆狀病毒裝配（pDESTIO)。 6.2.4 抗艎 使用如下市售一級抗體：與Alexa-488、-568或-647結合 之綿羊、兔、及小鼠二級抗體，其皆來自Molecular 〇

Probes (Leiden，The Netherlands)。經 IR標記之對抗兔或小 鼠之二級抗體係來自 Rockland Laboratories (West Grove， PA)。兔抗-NOD2抗體係藉由Eurogenetec使用純化自大腸 • 桿菌之重組Nod2 LRR結構域作為免疫原來產生。使用重 組LRR管柱對血清實施親和純化。抗體之特異性係藉由西 方墨點法及免疫螢光顯微鏡檢查使用表現重組Nod2或 Nodi之細胞系來進行測試。 6.3 表現Nod2、Nod2 3020insC、Nodi及其各自 LRR結構 137481.doc -43- 200936155 域之293細胞系 按照製造商建議使用轉染試劑脂質體2000 (Lipofectamine 2000) (Invitrogen)將含有編碼 Nod2、Nod2 3020insC、 Nodi > Nod2 LRR、Nod2 3020insC LRR、Nodi LRR之 cDNA的表現質粒（pEF5/FRT/V5-DEST)轉染至 293 Flp-In細 ' 胞（Invitrogen)中。穩定細胞系係在200微克/ml潮徽素中進 - 行選擇。各蛋白質之表現係藉由定量PCR及西方墨點法予 以證實。 © 6.3.1免疫螢光 為實施免疫染色，使腸上皮細胞在玻璃蓋玻片上生長並 於3%多聚甲醛（PFA)中固定20分鐘。將經PFA固定之細胞 用存於PBS中之0.1%曲拉通（Triton) X-100透化5 min。抗 體培育皆在含有0.2% BSA之PBS中實施。用0·5 mg/ml煙酸 己可驗（Hoechst) (Sigma)將細胞核染色，並將蓋玻片安放 在原金（pro-gold)試劑（Invitrogen)中。圖像係在具有標準 物鏡及濾光器裝置之Nikon eclipse顯微鏡上獲得。用 ❹

Adobe Photoshop 6對圖像進行處理。 6.3.2 蛋白質純化 利用入門（gateway)技術藉由LR重組將編碼NOD 1、 NOD2及NOD2-3020之LRR結構域的互補DNA序列（如部分 6.2.3中所述）轉移至pDEST17 (Invitrogen)中。使LRR結構 域在大腸桿菌Rossetta (DE3)細胞（Novagen)中過表現，藉 由胍-HC1 (6 M)溶解，在15000 X g下旋轉並藉由在Ni-NTA 及HiLoad 16/60 Superdex 200尺寸排阻管柱上依序層析進 137481.doc 200936155

行純化。藉由考馬斯藍（Coomassie blue)染色使經純化之蛋 白質顯現。藉由LR重組將全長NOD2及NOD2-3020 cDNA 自 pENTR/SD/D-Topo (Invitrogen)轉移至 pDESTIO 中並隨 後在DH5aBac中轉化以產生桿粒。遵循來自Bac-to-Bac桿 狀病毒表現系統（Invitrogen)之方案以獲得重組病毒。為純 化全長NOD2及NOD2-3020insC，將裝有Hi5細胞之二十個 . T-162 Nunc組織培養燒瓶感染72 hr。刮下細胞並在冷PBS 中洗滌。將細胞沉澱物再懸浮於25 ml 0.5 M KC1、50 mM © tris、10%甘油、5 mM酼基乙醇、1 mM MgCl2、0.1%曲拉 通X100、10 mM味吐及蛋白酶抑制劑（完全無EDTA (Roche))(pH 7.0)中並在冰上培育15 min。將懸浮液超音波 處理兩次，持續40 sec，在15000 X g下於40°C下離心30 min。將混合物依序裝載至Ni-NTA管柱及HiLoad 16/60 Superdex 200尺寸排阻管柱上。藉由考馬斯藍染色使經純 化之蛋白質顯現。 6.4抗細菌分析 利用BacTiter-GloTM微生物細胞生存能力分析（Promega) 基於定量各培養物中之ATP來測定培養物中存活細菌細胞 的數量。在指定蛋白質濃度下以5xl05個細胞/ml接種細 • 菌。將培養物在37°C下培育4 hr並將BacTiter-Glo試劑直接 添加至培養基中之細菌細胞中並使用Pherastar (BMG scientific)來定量發光。報告值係一式兩份實施之至少三 次單獨實驗的結果。利用Excel (Microsoft)來計算IC50之 標準偏差。最小抑制濃度值係用好氧或厭氧培養物使用標 137481.doc -45· 200936155 準程序來測定。簡言之，將5xl〇5個細菌接種至0.1 ml含有 指定濃度之LRR結構域或抗生素對照的MHB培養液中。培 育培養物20-24小時並藉由藉助視鏡目測來評價細菌生 長。MIC確定為完全抑制可見細菌生長之最低藥物濃度。 6.4.1 庚大徽素（Gentamycin)保護分析 表現氣黴素轉移酶（對照）、Nod2或Nod2 3020insC之穩 . 定293 Flpln (Invitrogen)細胞系係在24孔跨孔培養板（1χ1〇5 個 /孔）（Corning Incorporated，Corning，NY)中進行培養。

β 在達到鋪滿後，以1〇:1之ΜΟΙ添加肺炎鏈球菌。在於37°C 下培育1小時後，用漢克氏溶液（Hanks，solution)洗滌細胞 並於0.5 mg/mL慶大黴素/漢克氏溶液存在下培養9〇分鐘以 殺死任何細胞外細菌。隨後藉由機械破碎獲得細胞裂解物 並將裂解物用0.5 ml MHB培養液稀釋並鋪板於巧克力瓊脂 板上。將板在37°C下放置過夜並於第二天計數菌落。 6·4·2 Nod2 LRR有關蛋白之親和純化及質譜蛋白質識別 將大腸桿菌（ATCC 3556, ATCC 1655)接種於MHB培養液 攀 中並使細菌生長至飽和》藉由離心（2800 X g)來收穫細菌。 使用奈米級均質機（emulsiflex) C5裂解細胞並藉由在15〇〇〇 x g下於4 °C下離心30分鐘分離細菌裂解產物。回收細菌沉 澱物並再懸浮於曲拉通XI 〇〇(1 〇/〇，存於PBS中）中並再次於 30000 X g下旋轉。用胍_HCL (6 M)將殘留沉澱物溶解並藉 由凝膠過濾脫鹽。藉由快速稀釋使蛋白質重折疊並裝載於 與所述重組NOD2-LRR或NOD2-LRR-3020insC結構域共價 連接之激活NHS管柱上。藉由鹽梯度將經親和純化之蛋白 137481.doc 200936155 質自管柱中溶析出來，藉由SDS-PAGE凝膠電泳分離並藉 由考馬斯藍染色進行分析。將識別出之蛋白質帶自凝膠上 切割下來，用DTT還原，用碘乙醯胺烷基化並用經修飾騰 蛋白酶於37°C下消化過夜。在藉由LC-ESI-MS/MS分析之 前用1微升100%甲酸將肽酸化。奈米-LC-MS實驗係使用與 LTQ-FT 質譜儀（Thermo Electron，Bremen，Germany)連接 之 Eksigent/PAL HPLC 系統（Axel Semrau GmbH， Sprockh5ve卜Germany)來實施。將肽混合物直接裝載至分 ❹ 析型 PicoFrit管柱（New 〇bjective, .Woburn，ΜΑ)上並使用自 98%相Α(0.1%曱酸水溶液）至75〇/〇相β(〇.ι〇/0曱酸，80〇/〇乙腈） 之梯度以200 nl/min流動50 min將其自管柱中溶析出來。 儀器係以數據依賴性獲取模式在MS與MS2之間自動轉換來 運行。隨後使用内部Mascot伺服器（Matrix science有限公 司’ London，UK)針對大腸桿菌序列庫對原始文檔進行檢 索。選擇胰蛋白酶作為酶來實施檢索並容許兩次誤切割。 選擇羧基曱基（C)作為固定修飾且氧化（μ)作為可變修飾。 檢索數據為肽質量容許量為± 5 ppm且片段質量容許量為± 〇·8 Da。若至少兩種肽之識別分值高於2〇則所識別之蛋白 ' 質係可接受的。 6.5結果 數項獨立研究已確定，Nod2之LRR結構域中的特定SNP 係發生克隆氏病之易感因子。對胃腸道中共生細菌之強烈 免疫反應被認為是疾病發病之主要因素。實施以下實驗來 評價Nod2及與克隆氏病有關之SNP在宿主對細菌之反應中 137481.doc 47- 200936155 的功能作用。 651 Nod2在結腸中之活艟内表現。 胃腸道中居住著約1〇13個細菌，單層上皮細胞將該等細 菌與其宿主分開。使用對抗Nod2之LRR結構域的多株抗體 來評價Nod2蛋白在活體内之表現（圖丨）。經免疫組織化學 - 分析測定’ Nod2主要在結腸上皮中表現。主要在與管腔之 . 共生菌群直接接觸之上皮的頂面發現強烈染色。另外，在 上皮下面可觀察到巨噬細胞及單核細胞樣細胞之黏膜下層 ❹ 染色。 6·5·2 響應細菌之細胞Nod2定位 Nod2在培養的SW480腈上皮細胞中 為研究Nod2在上皮中之功能，將SW480腸上皮細胞與大 腸桿菌一起培育並藉由免疫螢光測定Nod2在細胞中之定位 (圖2)。不存在細菌（Sw480對照）時，吾人發現N〇d2主要在 培養細胞之胞質溶膠中。在與大腸桿菌一起培育後，可在 細胞内長約1微米之點狀（通常為長橢圓形）結構中觀察到 Nod2。在該等不同區域中觀察到的N〇d2類似於大腸桿菌 本身的形狀’因此實施額外實驗以明確識別該等結構中的 Nod2。用Caco2腸上皮細胞重複該實驗。此細胞系更接近 表現正常上皮層之表現型，乃因其具有緊密聯結並形成跨 上皮電阻。將該等細胞與大腸桿菌一起培育可在類似點狀 結構中識別Nod2，如同在使用SW480細胞與細菌共培養後 所見者（圖3)。將該等細胞與對大腸桿菌LPS具有特異性之 抗體共染色，該大腸桿菌LPS係革蘭氏陰性細菌之外部膜 137481.doc -48- 200936155 的組份。在LPS與Nod2之間觀察到明顯共定位，表明所識 別之Nod2陽性結構係細菌。 所培養細胞之細胞質中細菌之Nod2陽性染色可為Nod2 與細菌之直接相互作用或由Nod2與細菌共定位於未識別之 多孔結構中所致。為測試Nod2與大腸桿菌間之相互作用係 直接的假設，將來自Nod2之經純化重組LRR結構域與大腸 . 桿菌一起培育（圖4)。大腸桿菌在PBS中之對照培養物展示 各細菌在蓋玻片上均勻分佈（上部圖片，圖4)。然而，在與 〇 Nod2 LRR結構域一起培育後，大腸桿菌聚集且檢查時可 觀察到碎片。此支持Nod2 LRR結構域可與大腸桿菌直接 相互作用之假設。 6.5.3 細菌感染 先前研究已證實Nod2具有對抗細菌感染之保護效果 (Hisamatsu T，2003)。上文提供之數據表明此保護效果可 能緣於Nod2 LRR結構域與細菌之直接相互作用。為檢驗 此假設，構建表現Nod2或Nod2 3020insC LRR結構域之穩 — 定同類系細胞系以對照蛋白質表現程度及其他因素。給培 養細胞接種肺炎鏈球菌；肺炎鏈球菌係已知的可在培養物 ' 中活躍感染293細胞之病原體（Opitz B，2004)。隨後可對受 慶大黴素保護之細胞内細菌進行評價（圖5)。在受感染對照 細胞中觀察到細菌菌斑。此數量在表現Nod2 LRR結構域 之細胞中顯著降低。在表現與克隆氏病有關之Nod2 3020insC LRR結構域之細胞中未觀察到對抗肺炎鏈球菌之 明顯保護。此證實，Nod2之信號轉導功能對於防止細胞感 137481.doc -49- 200936155 染不是必要的，此乃因Card及Nacht結構域在該等細胞系 中不表現。此外，Nod2 LRR結構域足以保護細胞免於細 菌感染。 6.5.4 Nod2及LRR結構域在活體外的抗細菌活性 提供之數據證實Nod2 LRR結構域與細菌直接結合並防 止細胞感染。由於據報導LRR結構域不具有任何信號轉導

• 能力，因此吾人對Nod2 LRR結構域係抗微生物多肽之假 設進行了研究。將增加濃度之來自Nod2之經純化重組LRR φ 結構域、與克隆氏病有關之Nod2 3020insC或Nodi與一系 列好氧革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌一起培育並藉由檢測 ATP濃度來評價細菌生長（表1)。可證實LRR結構域具有抗 微生物活性。數次觀察證實Nod2及Nodi LRR結構域對某 些細菌具有特異性。與Nodi LRR相比，Nod2 LRR結構域 對抗糞腸球菌及金黃色葡萄球菌之效能至少高一個數量 級。與Nod2相比，Nodi LRR結構域展示對抗一些革蘭氏 陰性細菌（例如大腸桿菌（ATCC8739)及肺炎克雷伯氏菌）之 ® 功效更大。另外，與Nod2 3020insC LRR結構域相比，

Nod2 LRR結構域對抗所有敏感細菌之效能通常顯著更 ' 高，單核細胞增生利斯特氏菌除外。此證實，與克隆氏病 • 有關之SNP缺乏抗微生物活性且在現有知識狀況下認為此 係攜帶此等位基因之患者患克隆氏病之根本原因。 6.5.5 好氧細菌 137481.doc -50- 200936155 表1. Nod LRR對抗好氧細菌之抗細菌活性（IC50)，藉由細 菌ATP含量來測定 革蘭氏 細菌(ATCC) 【LRR結構域](微克/ml +/- SD，n=3) Nod2 ^od2 3020insC Nodi 單核細胞增生利斯特氏菌(7644) 13.7+/-13.0 16.5 +/- 13.3 32.0+/-2.1 十 枯草芽孢桿菌(6633) 3.9+/-0.6 54.0 +/- 20.2 15.5+/-12.0 糞腸球菌(29212) 6.8+/-1.6 未檢測到 >100 金黃色葡萄球菌(29213) 6.0 +/- 4.0 未檢測到 111.3+/-13.0 肺炎鏈球菌(49619) 3.0+/-1.6 未檢測到 13.5+/-4.9 大腸桿菌(8739) >100 未檢測到 29.0 +/- 2.8 大腸桿菌(25922) >100 未檢測到 >100 肺炎克雷伯氏菌(700603) 未檢測到 未檢測到 30.8 +/- 4.9 銅綠假單胞菌(2*7853) 未檢測到 未檢測到 >100 豬霍亂沙門氏菌(13076) 未檢測到 未檢測到 >100 嗜麥芽糖寡氧單胞菌(17666) 未檢測到 未檢測到 >100 > 100表明檢測到活性但抑制小於50%。 6.5.6 厥氧細菌 胃腸道中之絕大多數細菌都是厭氧的。因此，針對一系 © 列革蘭氏陽性及革蘭氏陰性厭氧細菌來評價Nod2 LRR結 構域之抗微生物活性（表2)。環丙沙星（Ciprofloxacin)係可 • 有效對抗所有測試菌株之廣譜抗生素。以重量（微克/ml) 計，重組Nod2 LRR結構域對抗所有菌株之活性與環丙沙 星相當。重要的是，當考慮到兩種化合物之分子量時，以 莫耳（molar)(毫莫耳/ml)計，Nod2 LRR結構域對抗所有測 試細菌之效能較環丙沙星高約25-200倍。 137481.doc -51- 200936155 表2. Nod2 LRR對抗厭氧細菌之最小抑制濃度（MIC):與 環丙沙星相比（微克/ml) 菌株號 NOD2 環丙沙星 脆弱擬桿菌 NB85001 4 8 具核梭桿菌 NB86006 8 2 中間普雷沃氏菌 NB88001 4 1 遲緩真細菌 NB94001 8 2 產氣莢膜梭菌 NB95001 4 2 難辨梭菌 NB95002 4 8 多枝梭菌 NB95010 4 8 厭氧消化鏈球菌 NB97001 2 1 痤瘡丙酸桿菌 NB99001 4 1

Nod2 LRR結構域之分子量約為30000 da。環丙沙星HC1之 分子量為386 da。 6.5.7 其他LRR結構域 Nod2之抗細菌機制 提出Nod2之唯一推定配體係於革蘭氏陽性及革蘭氏陰性 細菌之蛋白聚糖包被中發現的MDP基序。若此相互作用係 Nod2 LRR抗微生物效果之起始因素，則預期將該等結構 域與含有此基序之細菌組份一起預培育會抑制抗細菌活 性。利用Nod2 LRR對抗金黃色葡萄球菌之活性實施競爭 分析。在添加活金黃色葡萄球菌之前將重組LRR結構域或 BS A(對照）與金黃色葡萄球菌膜之多種組份一起預培育並 137481.doc -52- 200936155 如上文表1中評價細菌生存能力（圖6)。含有MDP基序之金 黃色葡萄球菌蛋白聚糖及脂鱗壁酸均不抑制Nod2 LRR結 構域之抗細菌效果。僅熱滅活之金黃色葡萄球菌能夠抑制 Nod2 LRR活性。此表明，Nod2之抗細菌效果之把標不依 賴於其與細菌蛋白聚糖之相互作用且表明Nod2之信號轉導 功能及抗細菌活性具有不同的細菌靶標。 6.5.8 Nod2對抗革蘭氏陰性細菌流出幫浦突變艟之活性 對Nod2 LRR結構域之抗微生物活性的靶標進行研究。 ❹ 此活性似乎不依賴於與細菌外部膜之結合（圖6) ^因此，使 用大腸桿菌、銅綠假單胞菌或流感嗜血桿菌之流出幫浦突 變體對Nod2、Nodi及Nod2 3020insC LRR結構域之作用機 制進行研究（表3)。流出幫浦突變體藉由將細胞内分子自壁 膜間隙抽吸跨過外部膜來降低細胞内分子的濃度。測試之 兩種流出突變體細菌（大腸桿菌及流感嗜血桿菌）展示對 Nod2及Nodi之LRR結構域的敏感性顯著增加。與野生型相 比’該兩種細菌對N〇d2之與克隆氏病有關之LRR突變體亦 ❹ 更具抗性》此表明LRR結構域之把標係細胞内且與克隆氏 病有關之Nod2相比其對野生型更敏感。 137481.doc 53· 200936155 表3. Nod LRR結構域對抗妤氧革蘭氏陰性細菌之最小抑制 濃度（MIC)(微克/ml)。 菌株號 Nodi Nod2 3020 四環素 大腸桿菌 NB27004 >128 >128 >128 4 大腸桿菌 NB27005* 32 32 >128 0.5 銅綠假單胞菌 NB52019 >128 >128 >128 32 銅綠假單胞菌 NB52020* >128 >128 >128 1 流感嗜Jk桿菌 NB65027 >128 >128 >128 0.5 流感嗜血桿菌 NB65027-CDS0021* 4 4 64 0.5 *表示流出幫浦（TolC :大腸桿菌、流感嗜血桿菌； mexAB/oprM :銅綠假單胞菌）突變體菌株 6.5.9 藉由質譜來識別、部分純化及潛在識別Nod2之抗 細菌把標 提供之證據表明Nod2藉由經由其LRR結構域與細胞内細 菌靶標結合而具有直接抗細菌活性。另外，與克隆氏病有 〇 關之Nod2突變3020insC缺乏抗微生物活性。實施一系列實 驗來識別介導LRR結構域之抗微生物活性的Nod2細菌靶 ， 標。藉由細胞破碎儀（French press)、洗滌劑及HC1胍鹽依 . 序對大腸桿菌實施分級分離，並藉由競爭分析實施評價以 找出抑制Nod2 LRR殺死金黃色葡萄球菌之部分（圖7)。抑 制性部分最初發現於大腸桿菌之洗滌劑不溶性膜部分中， 將其溶解於HC1胍鹽中並藉由凝膠過濾實施分級分離。來 自凝膠過濾之部分5含有抑制Nod2 LRR對抗金黃色葡萄球 137481.doc -54- 200936155 菌之抗微生物活性的蛋白質，此藉由用蛋白酶尺處理該部 分後所檢測之活性予以證實。將此部分裝載至N〇d2 LRR 親和官柱上並藉由NaCl梯度溶析相關蛋白質（圖8)。藉由 SDS-PAGE來分離溶析出的蛋白質，提取帶並藉由質譜來 識別蛋白質。溶析出的主要帶（圖8,圖片Β，帶Η1)含有兩 種外部膜蛋白（膜孔蛋白）〇mpF及〇mpC。該等蛋白質可見 於革蘭氏陰性細菌之外部膜上並容許肽進入細菌之壁臈間 隙中（參考文獻）。膜孔蛋白可能係N〇d2 LRR結構域之第一 ❹ 接觸點且容許N〇d2 LRR結構域穿透至革蘭氏陰性細菌之 壁膜間隙中。考慮到LRR結構域對抗大腸桿菌流出幫浦突 變體之功效增強（表3)，因而可能膜孔蛋白本身並不是靶 標’而是藉由作為細菌侵入點來參與抗微生物機制。另 外’革蘭氏陽性細菌通常不表現膜孔蛋白，但仍對N〇d LRR結構域敏感，表明此不是Nod2抗細菌活性之最終靶 標。 為識別推定的細胞内靶標，用HC1胍鹽自大腸桿菌提取 ❹ 所有不溶於洗滌劑之部分，分成兩部分並將各部分裝載於 1) Nod2 LRR結構域親和管柱或2) Nod2 LRR 3020insC結構 . 域親和管柱上。藉由質譜隨後SDS-PAGE來分析與任一管 • 柱結合之蛋白質（圖9)。再次在帶C3及E3(圖9中所表示的

帶）中識別出膜孔蛋白。表4列示在溶析自Nod2 LRR親和管 柱之帶E3及溶析自N〇d2 LRR 3020insC親和管柱之帶F3$ 所識別出的所有蛋白質。值得注意的是，膜孔蛋白（〇mpC 及OmpF)特定地於來自Wt LRR管柱而非3020insc LRR管 137481.doc -55- 200936155 柱之溶析物中識別到。此表明克隆氏突變體不能進入到細 胞内細菌區室中。表5列示用WT或3020insC親和管柱特定 識別到的所有蛋白質。如上所述，證實OmpC及OmpF特定 地與WT LRR親和管柱有關。亦識別出其他特定蛋白質， 其中一些經證實對於正常大腸桿菌生長至關重要。因此， 已識別出Nod2 LRR抗微生物靶標之數種推定候選者。 ❿ 137481.doc 56- 200936155 表4. WT而非3020insC LRR結構域親和純化蛋白質中 OmpC及OmpF之質譜識別，該等蛋白質來自不溶於洗滌 劑之大腸桿菌部分。

帶 管 柱 質譜蛋白質識別 SWISS-PROT 預測MW E3 WT 丙酮酸脫氫酶複合物之二氫硫辛醯胺乙酿基轉 移酶組份 P06959 65.9 kDa E3 WT 外部膜蛋白A前體(外部膜蛋白II*) P02934 37.2 kDa E3 WT 轉醛醇酶B P30148 35.2 kDa E3 WT PTS系統，甘露糖特異性IIAB組份 P08186 34.8 kDa E3 WT 外部膜蛋白C前體(膜孔蛋白ompC) P06996 40.3 kDa E3 WT 蘋果酸脫氫酶 P06994 32.4 kDa E3 WT 丙酮酸脫氫酶E1組份 P06958 99.8 kDa E3 WT 外部膜蛋白F前體(膜孔蛋白ompF) P02931 39.3 kDa E3 WT D-半乳糖結合周質蛋白前體(GBP) P02927 35.6 kDa E3 WT 3-磷酸甘油醛脫氫酶A P06977 35.5 kDa E3 WT 饑餓期間之DNA保護蛋白質 P27430 18.5 kDa E3 WT 重組有關蛋白rdgC P36767 34.2 kDa E3 WT推定的胺基酸ABC轉運蛋白結合蛋白yhdW前體 P45766 37.2 kDa E3 WT DNA促旋酶亞單元A P09097 97.1 kDa E3 WT蛋白酶VII前體(外部膜蛋白3B) P09169 35.5 kDa E3 WT 假定蛋白yecA P06979 25.3 kDa E3 WT 杆狀決定蛋白mreB P13519 37.1 kDa F3 3020 丙酮酸脫氫酶複合物之二氫硫辛醯胺乙醯基轉 移酶組份 P06959 65.9 kDa F3 3020外部膜蛋白A前體(外部膜蛋白IP) P02934 37.2 kDa F3 3020轉醛醇酶B P30148 35.2 kDa F3 3020 3-鱗酸甘油醛脫氫酶A P06977 35.5 kDa F3 3020 PTS系統，甘露糖特異性IIAB組份 P08186 34.8 kDa F3 3020 D-半乳糖結合周質蛋白前體(GBP) P02927 35.6 kDa F3 3020推定的胺基酸ABC轉運蛋白結合蛋白yhdW前體 P45766 37.2 kDa F3 3020蘋果酸脫氫酶 P06994 32.4 kDa F3 3020饑餓期間之DNA保護蛋白質 P27430 18.5 kDa E3及F3表示如圖9中所示切除的帶。 137481.doc -57- 200936155

❹ 表5·特定地舆WT或3020insC LRR結構域有關之大腸桿菌 蛋白質的質譜識別。 帶 管柱 質譜蛋白質識別 SWISS-PROT 預測MW E2 WT 硫胺生物合成蛋白thiC P30186 71.3 kDa G2 WT 6-磷酸葡萄糖異構酶 Q8FB44 61.6 kDa A3 WT 胺基醯基組胺酸二肽酶 P15288 52,9 kDa A3 WT 轉錄終止因子rho P03002 47.0 kDa A3 WT 氮調節蛋白 P06713 52.3 kDa A3 WT ATP合梅α鏈 P00822 55.4 kDa C3 WT 假定蛋白ycfD P27431 42.6 kDa C3 WT 肽酶T P29745 45.1 kDa C3 WT 外部膜蛋白C前艘(膜孔蛋白〇mpC) P06996 40.3 kDa E3 WT 外部膜蛋白C前體(臈孔蛋白ompc) P06996 40.3 kDa E3 WT 外部膜蛋白F前體(膜孔蛋白〇mpF) P02931 39.3 kDa E3 WT 重組有關蛋白rdgC P36767 34.2 kDa E3 WT 蛋白酶VII前體(外部膜蛋白3B) P09169 35.5 kDa E3 WT 杆狀決定蛋白mreB P13519 37.1 kDa G3 WT 核糖核酸酶I前體 P21338 30.0 kDa G3 WT GrpE蛋白(HSP-70輔因子） P09372 21.7 kDa G3 WT 假定的胺基酸ABC轉運蛋白ATP結合蛋白 yhdZ P45769 28.8 kDa G3 WT 3-甲基-2-側氧基丁酸酯羥基曱基轉移酶 P31057 28.3 kDa B1 3020 ClpB蛋白(熱休克蛋白F84.1) P03815 95.7 kDa F2 3020 甲酸乙醯基轉移酶1 P09373 85.4 kDa H2 3020 葡聚糖生物合成蛋白G前體 P33136 57.7 kDa H2 3020 麩胺醯胺合成酶 P06711 51.9 kDa H2 3020 丙酮酸激酶I P14178 51.4 kDa B3 3020 甘油激梅 P08859 56.3 kDa H3 3020 單鏈結合蛋白(SSB) P02339 18.8 kDa 蛋白質係自用GuHCl提取之不溶於1 %曲拉通的大腸桿菌 部分識別出。所述帶與彼等圖3-9中識別出者相關。 137481.doc •58- 200936155 7. 文獻目錄資訊。

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圖3:腸上皮細胞中用大腸桿菌實施Nod2免疫定位。將 Caco2腸上皮細胞之鋪滿單層與大腸桿菌以10000:1之MOI 137481.doc -63- 200936155 一起培育2小時。將細胞固定並利用共焦顯微鏡檢查用抗-Nod2 (AB5)及抗-LPS抗體藉由免疫螢光進行分析。 圖4 :在與重組Nod2 LRR結構域一起培育後大腸桿菌之 活體外聚集。將存於1 ml PBS中之大腸桿菌（106個）與20微 克/ml BSA或純化之重組Nod2 LRR結構域一起培育12小 • 時。將培養物分液接種於覆蓋蓋玻片之載玻片上並藉由光 . 學顯微鏡檢查使用63X物鏡進行分析。 圖5 :表現Nod2之293細胞的肺炎鏈球菌感染。將來自相 〇 同染色體位點之穩定表現氣黴素乙醯基轉移酶（對照）、

Nod2或與克隆氏病有關之Nod2突變體（Nod2-302⑴·《$(：)的 293細胞用肺炎鏈球菌（ATCC 49619)以10:1之MOI進行感 染。將受慶大黴素保護之細菌鋪板於巧克力瓊脂上以觀測 每一細胞系中細胞内細菌之數量》 圖6 :在添加金黃色葡萄球菌之前將經純化Nod2 LRR結 構域（Nod2 : 3 0微克/ml)與200微克/ml指定細菌組份一起預 培育。添加BS A以作為蛋白質對照。使用市售蛋白聚糖提 — 取物（sPGN :可溶性蛋白聚糖，iPGN :不溶性蛋白聚 糖）、脂磷壁酸（LTA :粗脂磷壁酸提取物，upLTA :超純 脂磷壁酸提取物）、或熱滅活之金黃色葡萄球菌（HKSA)。 • 對照表示僅存在BSA下之細菌生長。 圖7 : Nod2 LRR抗細菌靶標之純化（大腸桿菌）。使大腸 桿菌（ATCC)在LB培養液中生長過夜、沉澱並藉由細胞破 碎儀（French press)提取細菌沉殿物。實施競爭分析以檢測 Nod2 LRR結構域對金黃色葡萄球菌（ATCC 29233)之活 137481.doc -64- 200936155 性。在每一步驟，將各部分之體積補足至相同體積並添加 樣品以實施抗細菌分析。最終在洗滌劑（NP40)不溶性部分 中發現抑制部分。將該部分用HC1胍鹽提取，藉由凝膠過 濾分離並收集各部分並評價Nod2 LRR對金黃色葡萄球菌 之抑制活性。部分5 (F5)含有抑制LRR活性之蛋白質，如 . 藉由對蛋白酶K之敏感性所測定。 . 圖8 : Nod2抗細菌靶標之LRR親和純化及質譜識別。圖 片A:將部分5裝載至Nod2 LRR結構域親和管柱上，該部 〇 分5係來自圖2中經HC1胍鹽提取之洗滌劑不溶性大腸桿菌 部分之凝膠過濾。藉由NaCl梯度溶析結合之蛋白質。圖片 B : Nod2 LRR結構域親和純化之前部分5 (F5)及來自親和 管柱之經鹽溶析部分（E)的考馬斯藍染色凝膠。圖片C :如 圖片B中所示之提取帶十的質譜儀蛋白質識別》

圖9:自大腸桿菌中分離野生型及經3020insC LRR結構 域親和純化之洗滌劑不溶性蛋白質。藉由細胞破碎儀對大 腸桿菌實施分級分離、離心並用HC1胍鹽提取沉澱物。將 ® 溶解之沉澱物分成兩部分並將每一部分分離於Nod2 LRR (WT)或Nod2 3020insC LRR (3020)親和管柱上。將結合於 任一管柱上之蛋白質用鹽溶析、用冷丙酮或TCA/丙酮沉澱 並藉由SDS PAGE凝膠電泳分離。選擇凝膠之各區、切除 並處理以用於蛋白質之質譜識別（如表4、表5中所述）。 圖10 : TLR2及Nalp3 LRR結構域抑制單核細胞增生利斯 特氏菌生存能力，如藉由結合ATP之發光分析所證實。將 單核細胞增生利斯特氏菌（5 X 105個細菌/100 μΐ)與增加濃 137481.doc • 65· 200936155 度之指定重組LRR結構域在37t下一起培育6小時並藉由 發光分析評價ATP含量（BacTiter_Gi〇: Pr〇mega)。所示值係 相對於在不存在LRR結構域下培育之對照（1〇〇%)而言。結 果係TLR2及Nalp3之兩個實驗的代表。

圖11.攜帶與克隆氏病有關之N〇d2 3020insC突變的蛋 白質不能藉由純化之Nod2 LRR結構域殺死細菌。所示結 - 果係數次實驗之所有代表性結果。圖片A及B : N〇d2 LRR 結構域影響大腸桿菌（圖片A)及枯草芽孢桿菌（圖片B)之膜 〇 極性。將蛋白質以指定濃度添加至存於1〇〇 μΐ生長培養基 中之5 X 1〇5個細菌中並於37乞下培育2小時。在該時間進 程結束之前15分鐘，向每一孔中添加5〇 μι 1〇 yg/ml DiBAC4溶液》用750 μΐ冰冷PBS/孔洗滌板兩次。藉由流式 細胞儀來測定吸收染料之去極化細菌的百分比。圖片c : 枯草芽抱桿菌膜極性受來自一系列模式識別受體之1尺尺結 構域所影響。如對於圖片A及B所述’用指定lrr結構域處 理細菌並定量其對細菌膜極性之影響。圖片D :藉由凌脂 擴散分析來證實Nodi及Nod2而非Nod2 3020insC LRR結構 域具有抗細菌活性。用指定細菌菌斑接種瓊脂板。用無菌 玻璃移液管在遵脂中沖約0.5 cm直徑的孔並向每一孔中添 ' 加存於無菌PBS中之0.5 mg/ml濃度的指定蛋白質（BSA蛋白 質對照.或指疋LRR結構域）或抗生素（胺节西林或卡那黴素 (kanamycin)) 〇 圈12 : Nod2 SNP(全長）抑制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄 球菌、單核細胞增生利斯特氏菌及糞腸球菌生存能力，如 137481.doc •66- 200936155 藉由結合ATP之發光分析所證實。攜帶與克隆氏病有關之 Nod2 3020insC及G908R突變的蛋白質缺乏此活性。 圖13 :藉由結合ATP之發光分析證實之Nod2對金黃色葡 萄球菌生存能力的影響係在細菌應激條件下於35°C、37°C 及3 9°C下來測試。Nod2之抗細菌活性隨細菌應激而增加。 圈14 :增加濃度之Nod2抑制枯草芽孢桿菌（圖片A)及金 黃色葡萄球菌（圖片B)生長。所示值係相對於在不存在LRR 結構域下培育之對照（100%)而言。 Ο 圖15 : NAIP抑制嗜麥芽糖募氧單胞菌生長（圖片A)。

Nodi抑制大腸桿菌生長（圖片B)且Nodi、Nod2、Nod2 3020insC及CIAS1抑制單核細胞增生利斯特氏菌生長（圖片 C)。 圈16 : Nod2抑制金黃色葡萄球菌生長。此抑制不受共投 與MDP、LPS或PGN影響。 ❹ 137481.doc -67· 200936155 序列表 <110> 瑞士商諾華公司 <120> 抗細菌組合物

<130> 52356-EP-EPA <140> 098101271 <141> 2009-01-14 <150> 08150290.8 <151> 2008-0M5 <160〉 11 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 1040 <212> PRT <213> 智人 <400> 1

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Gin Gin Leu Ala Ala Ser Leu Are Ar£ Cys Pro His Val Glu Thr Leu 405 4】0 415

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137481.doc

Claims (1)

1. 200936155 七、申請專利範圍： 1. —種分離之蛋白質，其包含多個LRR(富白胺酸重複序 列）結構域’其係用作抗微生物劑。 2. 如請求項1之蛋白質，其中該蛋白質之C端係一個LRR結 構域。 3. 如請求項！或2之蛋白質，其中各lrr結構域獨立地實質 • 上由式（I)之胺基酸序列組成： (FlLxxLxL(xxZ)YF2) (I) e 其中： F1及F2獨立地為1至3〇個殘基之鄰接（contigU〇us)胺基 酸序列； X可為任何胺基酸； L可為 Leu、Ile、Val 或 Phe ; Z可為NxL或CxxL ; N係 Asn、Thr、Ser或 Cys ; C係Cys或Ser ;及 Y=0 或 1。 4. 如請求項3之蛋白質，其中各LRR中之至少2個1殘基係 ' Leu 〇 月求項4之蛋白質，其中各LRR中之至少3個[殘基係 Leu。 6.如請求項1至5中任__谓 T依項之蛋白質’其包含至少3個LRR結 構域。 月求項1至6中任一項之蛋白質，其包含至少4個lrr結 137481.doc 200936155 構域。 8.如請求項1至7中任一項之蛋白質，其包含至少^固乙尺尺結 構域。 9. 如叫求項丨至8中任一項之蛋白質，其包含至少6個lrr結 構域。 10. 如請求項1至9中任一項之蛋白質，其中該蛋白質係抗細 菌劑。 11.如請求項1〇之蛋白質，其係用於革蘭氏陽性細菌。 © 12.如請求項H)之蛋白f，其係用於革蘭氏陰性細菌。 13.如請求項1〇至12中任一項之蛋白f，其係用於治療人類 細菌感染。 14·如請求項丨至13中任一項之蛋白質，其係選自由n〇d、 TLR、CIITA組成之群。 15. 如請求項14之蛋白質，其中該NOD係NOD 1或NOD2。

   16. 如請求項14之蛋白質，其中該TLR係選自 群：⑽、⑽、似3、TLR4、TLR5、]二、 TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、 TLR13 〇 17.如請求項16之蛋白質，其中該TLR係TLR2、TLR4或 TLR5。 / 18. 如請求項1至17中任一項之蛋白質’其中該蛋白質本身 具有直接抗微生物活性。 19. 如請求項18之蛋白質，其中該直接抗微生物活性在活體 外條件下有效。 137481.doc 200936155 20. 如前述請求項中任一項之蛋白質，其包含5個或更多個 LRR(富白胺酸重複序列）結構域，其係用作抗細菌劑， 其中該蛋白質之C端係一個LRR結構域，各LRR結構域獨 立地包含式（I)之胺基酸序列： (F1LxxLxL(xxZ)yF2) ⑴ • 其中： . F1及F2獨立地為1至3〇個殘基之鄰接胺基酸序列； X可為任何胺基酸； ❹ L可為 Leu、lie、Val 或 Phe ; Z可為NxL或CxxL ; N係 Asn、Thr、Ser或 Cys ; C係Cys或Ser ;及 Y=0或 1。 21. 如請求項20之蛋白質，其中各LRR中之至少2個[殘基係 Leu。 22. 一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之分離 •之蛋白質。 23. 如請求項22之醫藥組合物’其係用作抗微生物劑。 • 24.如請求項22或23之醫藥組合物，其係用於治療及/或預防 • 易受感染宿主之細菌感染。 25. 如請求項24之組合物，其中該宿主係哺乳動物，諸如人 類。 26. 如請求項24之組合物，其中該人類患有胃腸疾病，諸如 克隆氏病（Crohns disease)、IBD或 IBs。 I37481.doc 200936155 27. —種治療人類微生物感染之方法，其包含向該人類投與 有效量之一種包含多個LRR(富白胺酸重複序列）結構域 的分離之蛋白質。 28. 如請求項27之方法’其中該蛋白質之^端係一個LRR結 構域。 29. 如請求項27或28之方法，其中各lrr結構域獨立地實質 . 上由式（I)之胺基酸序列組成： (FlLxxLxL(xxZ)YF2) ⑴ Φ 其中： F1及F2獨立地為1至30個殘基之鄰接胺基酸序列； X可為任何胺基酸； L 可為 Leu、lie、Val 或 Phe ; Z可為NxL或CxxL ; N係 Asn、Thr、Ser或 Cys ; C係Cys或Ser ;及 Y=0 或 1 o 30. 如sf求項29之方法’其中各LRR中之至少2個l殘基係 Leu 〇 31. 如請求項29之方法，其中各LRR中之至少3個L殘基係 * Leu。 32. 如請求項27至31中任一項之方法，其中該蛋白質包含至 少3個LRR結構域》 33. 如請求項27至31中任一項之方法，其中該蛋白質包含至 少4個LRR結構域。 137481.doc 200936155

   ❹ 34. 如請求項27至31中任一項之方法，其中該蛋白質包含至 少5個LRR結構域。 35. 如請求項27至31中任一項之方法，其中該蛋白質包含至 少6個LRR結構域。 137481.doc