TW201212991A - Purification of amphoteric products, or of products liable to be converted into amphoteric products - Google Patents

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201212991 •六、發明說明： 本發明係關於藉由離心分配層析純化兩性產物，或可 被轉化為兩性產物的產物。 離心分配層析（CPC )為一種液液流體靜力層析技術。 CPC管柱由彼此連接且沿環雕刻（engrave)之腔室或分配 池系列構成。藉由引發垂直於環平面之軸的旋轉向環施加 離心力場。 c P C為液液逆流層析之特定種類，其中使用兩相溶劑 系統在熱力學平衡之兩個液相之間分配分析物。C p c管柱 (由兩相系統之兩個平衡液相填充）由雕刻成可形成由毛細 管連接在一起之分配池的分配盤製成。由於離心力場，_ 液相在管柱内部維持固定，而另一液相被泵送穿過其以使 分析物根據其分配性能移動（Berthod A.，Cowniercwrrewi Chromatography-The Support-Free Liquid Stationary Phase, Comprehensive Analytical Chemistry, Elsevier Science B.V., Amsterdam 2002 )。 CPC不同於逆流層析（CCC )。CCC管柱由以行星運動 圍繞軸旋轉之螺旋狀盤管構成。旋轉軸及盤管之軸平行。 CCC 進一步描述於 Countercurrent chromatography-Theory and practice，Mandava B, Ito Y.編，Marcel Dekker 公司，New York，1988，3，79-443 中之 Ito Y.，Principle and instrumentation of countercurrent chromatography 中 〇 201212991 置換模式為層析純化中所用之開發技術。置換模式涉 及物理或化學因素，其有利於欲純化產物溶解於兩個相（移 動相或固定相）之一中，視此因素而冑。置換模式促進產 物自一個相遷移至另一個相。其減慢產物沿管柱之遷移速 度，從而提高純化之分離度。所選物理或化學因素應能實 施置換模式以與欲純化產物相互作用。在適當實施過程 中，一些雜質不受置換模式影響，從而穿過管柱遷移.比欲 純化產物快，使得純化改良。 在液液無載體技術中，已知不同置換模式。 可引用pH區帶精製作為使用物理因素（亦即pH值） 之置換模式的一實例。PH精製區帶置換模式並非本發明之 主題’且進一步描述於以下中：Renault，j· H,; Nuzillard，J. M., Le Crouerour, G.; Thepenier, P.;Zeches-Hanrot, M.; Le Men-Olivier, L. ·/· j 1999, 5萃P, 421-431 及其中 之參考文獻；Y. Ito, K. Shinomiya, Η·Μ_ Fales, A.Weisz, A.L. Scher，W.D. Conway，265 R.J. Petroski (編），Modern Countercurrent Chromatography, American 266 Chemical Society，Washington, DC, 1995，第 156 頁（第 14 章）；八· Toribio, E. Delannay, B. Richard, K.Ple, M. Zeches-Hanrot, J.-M. Nuzillard, J. -H. Renault, Preparative isolation of huperzines A and B from Huperzia serrata by displacement centrifugal partition chromatography, J. Chromatogr. A, 2007, 1140, 101-106 ° •pH區帶精製限於中性形式與電離形式之間展示顯著極 201212991 異、從而展示顯著可溶性差異之溶質。此等限制使pH 區帶精製不能應用於已電離、嚴格水溶性或兩性分子P 可引用離子交換作為使用化學因素之置換模式的 例。離子交換置換模式依靠純化期間管柱中所引人之離子 的離子力，或換言之，&靠包括欲純化產物之離子對的形 成自由焓（或親和力），離子對由陽離子及陰離子構成。 此項技術中已報導使用置換模式之CPC純化天然產 物。舉例而言，吾人可能提及使帛cpc及pH區帶精製置 換模式純化環肽生物鹼牛角花素G(Le Cr〇u0〇ur等人， hioierapza’ 2002, 73, 63-68 ) ’或使用cpc及離子交換置換 模式用陰離子交換劑純化植物代謝物白芥子硫苷（Toribi〇 等人，Sci··, 2009, 3 2, 1801-1807 )。 狀純化在工業上藉由製備型層析（例如HPLC )主要使 用逆相或離子交換層析載體達成。所有此等技術均涉及固 體層析載體以用於吸附或分配模式。 CPC未用於以工業規模純化肽’因為其負載能力次於 上述常用純化技術。 然而，可使用僅基於分析物在兩個相之間分配的Craig ^ 置進行肽之工業生產（http://www.theliquidphase.org/ index.php?title = CCD )。 複合肽混合物難以純化。肽為可在惡劣化學條件下變 性或降解之脆弱化合物。此外，肽胺基酸序列可能密切相 關’從而提供具有幾乎類似物理-化學特性之化合物，其極 難用常見層析技術區分（Sewald N.，Jakubke H.D.，peptides: 201212991 chemistry and biology, Wiley CH, Weinheim, 2005, 1 2-1 8 本發明之一目的在於提供一種純化兩性產物或可被轉 化為兩性產物的產物（兩性可轉化產物）的方法。 本發明之一目的在於提供一種分離肽混合物之方法。 本發明之另一目的在於提供一種自天然產物萃取物萃 取肽之方法。 本發明之另一目的在於提供一種自粗反應混合物萃取 狀之方法。 本發明係關於離心分配層析在離子交換置換模式中之 用途，其用於實施自含有至少一種欲純化產物之基質純化 。玄至；一種產物的方法，該欲純化產物為兩性產物或兩性 可轉化產物。' 本發明係關於離心分配層析在離子交換置換模式中之 用途，其用於實施自含有至少—種欲純化產物之基質純化 該至少-種產物的方法，該欲純化產物為兩性產物。 在本發明中，本發明者已 合之離心分配層析可自含有至 效純化該至少一種產物，該欲 可轉化產物。 4監別與離子交換置換模式結 少一種欲純化產物之基質有 純化產物為兩性產物或兩性 人=自基質純化」表不使至少-種產物與基質中所 …、他產物分離。分離可為完全或部分分離。 :純化為完全純化時’所回收之產物為純產物。 5純化為部分純化時，—或數種雜質自基質移除，作 201212991 產物以至少兩種產物之組合形式獲得。 術語「基質」表示化.學產物之混合物，其中欲純化出 至少一種產物。基質可為反應混合物，此反應混合物可為 粗、經過濾或甚至部分純化之天然萃取物（自植物、細菌、 動物或任何類型之細胞）；此天然萃取物可為粗、經過濾或 甚至部分純化之天然萃取物。 術語「兩性」表示產物可作為酸或作為鹼反應。兩性 產物可接受或提供質子’從而可分別充當鹼或酸。 術語「兩性可轉化」表示產.物可在化學轉化（諸如移 除保護基）之後變為兩性。 根據另一具體實例’本發明係關於離心分配層析在離 子交換置換模式中之（諸如上文所定義）用途，其中該基 貝包含於層析混合物中，該層析混合物亦含有溶劑混合 物、至少一種置換劑、至少一種交換劑及至少一種保留劑。 術語「層析混合物」表示當引發純化方法時層析管柱 中所存在之含有基質之液體混合物。此層析混合物包含溶 劑混合物、置換劑之混合物、保留劑之混合物及交換劑之 混合物。 術語「溶劑混合物」表示形成層析之純化介質的溶劑 cpc為液液純化技術，因此層析混合物之所有組分必 須可混溶於或可溶於管柱中所存在之至少一種溶劑中。77 置換劑、保留劑及交換劑為實施置 。保留劑及置換劑分別與交換劑形 物質 換模式之三種離子 成離子對。 201212991 。文所定義之基質表示化學產物之混合物豆中欲 純化出至少—種產物。I質可溶於溶劑混合物中。’、 交換劑亦與欲純化產物形成離子對。 因此’形成三種不同類型之離子對： -至少一種欲純化產物與交換劑之間的離子對， -保留劑與交換劑之間的離子對，及 -置換劑與交換劑之間的離子對。 當形成離子對時，此形成會釋放對應於離子對之形成 自由焓的特定能量。在此離子對之兩種組分各自可… :子形成新離子對時且在該新離子對之形成自由焓優於先 前形成之離子對之形成焓時，此離子對破裂。 離子對形成自由給為作為形成離子對之兩種離子之特 徵的絕對值。 在包括交換劑之所有離子對中，具有最高形成焓之離 子對為「置換劑交㈣」料^在包括交換劑之離子對 中’此離子對具有最強親和力。 在包括交換劑之所有離子對中，具有最低形成給之離 子對為「保留劑交㈣」離子對。在包括交換#|之離子對 中，此離子對具有最弱親和力。 在純化開始時’當管柱中未注射欲純化產物時，交換 劑與保留劑形成離子對。此「交換劑.保留劑」離子對在盘 欲純化產物接觸時破裂，㈣「欲純化產物交換劑」之ς 成自由焓優於「交換劑-保留劑」離子對之形成自由焓。換 言之’欲純化產物對交換劑之親和力高於或優於保留劑對 201212991 交換劑之親和力。 離子·交換置換模式之驅動Λ t)|^ . 動力為置換劑。置換劑與交換 μ也成置換劑-交換劑離子對， 且忒置換劑-交換劑離子對之 =自在:Γ管柱令所存在之任何其他離子對之形成自 ;二：在置換劑之區域，置換劑排除與交換劑形成離 =二有其他產物。询若置換剩在純化方法期間連續注 柱中，則含有置換劑之管柱部分的含量逐漸增加。 離子交換置換模式之勝銶驻 _ .鍵特徵為在官柱内形成之離子 •，、及聯。具有高親和力（ V 4回幵7成自由焓）之離子對優 先於具有低親和力（或低报+ 6丄 β /成自由焓）之離子對形成，從 而开/成具有低形成自由焓上 趟也山 3之離子對的欲純化產物自固定相 進步遷移以在不含可形成具有 孕又阿$成自由焓之離子 … 了之產物的區域形成離子對。 從而，欲純化產物形点連 ^ 物心成離子對，該等產物彼此互相排 ，于、。排除次序基於所形成離 床卞對之親和力。在固定相中形 成均包含交換劑的離子對 ,. τ之糸列，且此系列稱作「等規系 列（isotachtic train),。耸相多 u .^ „ 4規糸列之各離子對部分構成等規 糸列之成員。 南或低親和力f开^ 士、ά 人 成自由)之概念係相對於層析混 合物中所存在之離子物質。 、 隹子對之向或低親和力係針對 另一離子對定義。在任何怦 Π匱况下，極限親和力值由「保留 刮父換劑」離子對（ 1低親和力）及「置換劑交換劑」離子 對（咼親和力）提供。 」 丁 圖1表示當向管;f主φ 3丨λ人一 中引入3有欲純化產物之基質時等 201212991 規系列之形成。 圖2表示當向管柱中引入置換劑時之等規系列。 等規系列由三種離子對構成’亦即：保留劑·交換劑離 子對、欲純化產物_交換劑離子對 ^ τ及置換劑-交換劑離子對。 此等規系列在固定相中形成。 欲純化產物以與相對離子之離 邮丁對形式引入CPC管杈 中。置換劑以與相對離子之離子針 雕于對彤式引入CPC管柱中。 此等相對離子可為相同或不同化學物質。 相對離子不能與交換劑形成離 Φ 』訂囚為其具有相同 电彳守 。 相對離子可溶於移動相。當保留劑、欲純化產物及置 換劑自固定相鹽析至移動相中 ;々日y且而要相反電荷之離子保持 :相之整體靜電平衡時，相對離子可分別與保留劑（「保留 相對離子」離子對)、欲純化產物(「欲純化產物-相對離 」離子對）及置換劑（「置換劑_相對離子」離子對）形成 離子對C* 在純化步驟期間’置換劑不斷地注射於管柱中。逐漸 :也：隨者時間流逝及管柱中注射之置換劑之量增加，在管 :tb目收到官柱中所存在之所有其他產物。產物在管 主輸出口排出，各產物在不同時間排丨，產物以純化方法 期間管柱中所形成之等規系列的次序排出。 褲另適且具體貫例，本發明係關於諸如上文所定 ^離“刀配層析在離子交換置換模式中之用途，其中該 化產物為至少一種蛋白質或至少一種肽或肽衍生物， 10 201212991 尤其經保護肽’或至少一種天然或非天然、經保護或未經 保護之胺基酸。 · 術s吾「狀」表示由至少兩個胺基酸構成之分子；該等 月女基酸由&胺型化學鍵鍵結。肽衍生物為化學上及結構上 與肽密切相關之產物’例如假肽或肽類似產物、肽片段、 經保護肽（Sewald N.，Jakubke H.D.，peptides: chemistry and biology，Wiley CH，Weinheim，2005, 5-55)。 術語「肽衍生物」尤其對應於N端及/或c端及/或至少 一個側鏈經保護之經保護肽。 ，，，Γ…、μ -*--、厂Μ 心 義之離心分配層析在離子交換置換模式中之用途，其中該 至少-種置換劑及該至少一種保留劑為陽離子型，且該‘ 少一種交換劑為陰離子型。. 上所这形成二種不同類型之離子對： -至少-種欲純化產物與交換劑之間的離子對， -保留劑與交換劑之間的離子對，及 -置換劑與交換劑之間的離子對。 若交換劑為陰離子型， 物必項展-5 I 置換劑、保留劑及欲純化產 /員展不至少-個陽離子部分。 離子產::於其化學性…㈣ 性彥物π 因此’在離子交換置換模式中， 物:用陰料或陽料交換劑純化。 、 用陽離子置換劑進行之 作陽離子模式m番父換置換模式CPC純化稱 "子置換劑進行之離子交換置換模式 201212991 CPC純化稱作陰離子模式。 在本發明之具體實例中’已發現陽離子模式為適宜的。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於離心分配層析 在離子交換置換模式中之用途，其中使用數種置換劑及一 種交換劑》 使用數種置換劑及一種交換劑之可能性使使用者可組 合強離子交換與弱離子交換模式。此結合從未進行過，且 使各種肽之間的選擇性改良。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於離心分配層析 在離子交換置換模式中之用途，其中一種置換劑及一種交 換劑以各種去質子化百分比使用，且該等去質子化百分比 自1 %至100 %變化’且尤其自1 %至30 %變化，且尤其自 5%至50%變化。 該等去質子化百分比對應於交換劑之不同活化率且自 1 %至33 %變化。 將管柱分成對應於不同交換劑活化率之區域的可能性 導致產生新的固定相設計，其稱作「分區固定相」。該分區 固定相在CPC方法中從未使用過。此包括一種置換劑及不 同活化度之相同交換劑之分區固定相由於固定相之液體性 質而變成可能’且可提高在各種肽之間的選擇性。 根據另一適宜具體實例’本發明係關於離心分配層析 在離子交換置換模式中之用途，其中數種置換劑及一種交 換劑以各種去質子化百分比使用。 本發明係關於一種藉由離心分配層析在離子交換置換 12 201212991 模式中自基質純化至少一種欲純化產物的方法， v次’该欲純化 產物為兩性產物或兩性可轉化產物， 其中該方法包含： ㈣牧平予 八 ^ 一 一 〜7哪，孩管柱包含 含有該基質、兩相溶劑混合物、至少一種置換劑、至少一 種交換劑及至少一種保留劑之層析混合物， 忒兩相溶劑混 合物由兩個不可混溶相構成，一個相為 π 口弋相且另一個相 為移動相，及 ^至少一個泵送該水性移動相穿過該管桎達足以純化該 欲純化產物之時間的步驟， 回收呈經純化形式之該至少一種欲純化產物之步驟。 該「兩個不可混溶相」可為 -有機相#水相（在此情況下，有機相為固定相且水相 .....…τ、作 〇 溶劑混合物為層析之純化介質；此溶劑混合物组合启 生兩個不同液相’即-固定液相與-移動液相。 1不可混溶相」表示如下溶劑混合物：針對該潭 2合物中所存在之至少-部分溶劑形成兩則目。換言 然。至少一部分溶劑導致有機相不混溶於水相，且反之亦 因此其需要兩相系統中之 CPC為一種液液純化技術 兩種液體。 其將與欲純化差物相互 稱作固定相之液相構成載體， 201212991 作用以減緩其穿過管柱擴散。固定相由於管柱旋轉所誘導 之重力場而保留在管柱内。 稱作移動相之液相在純化方法期間被泉送穿過管柱。 在純化方法期間，兩個相之體積呈流體動力學平衡狀 態。對於兩相溶劑系統、離心力場、流速及溫度，此平衡 由使移動相可穿過@定相渗透而不會損害固定相之固定相/ 移動相比率定義。在管柱輸出口收集在管柱輸入 於管柱令之等量移動相。 皮泉达 义須被泵送於管柱中之移動相之量取決於欲純化產物 與固定相中之交換劑之間的相互作用。若& u 右奴純化產物緩慢 多’則需純多體積之移動相，且足錢化該欲純化產 物之時間較長。相反地，若欲純化產物快速遷移，則 較少體積之移動相，且足以純化該欲純化產物之時間較短。 熟習此項技術者已知足以純化之時間隨各參數組合變 足以純化之時間使得可回收經純化產物。 " 回收」表不在管柱輸出口呈經純化形式收隼欲 純化產物。在純仆湘M ^ /叭收票奴 ’’㈣，在官柱輸出口收集被泵送穿過管 動相。所收集之移動相可含有雜質.、雜質 呈經純化形式之欲產物、不同欲純 雜質與欲純化產物之混合物。以不同批=之-5物或 隹湘H 不同4 _人收集移動相。收 浯「呈經純化形式之欲純化產物」表示至少 ::兩個的間隔可為任意的或由時間標度、體 定/ Μ裝置（例如UV光譜儀）或任何其他方式確 術 14 201212991 其涵蓋純產物，意謂 或產物及/或雜質之渴^ 之該欲純化產物的所 為對：所欲應用足夠純形式之產物。 無痕量住何其他產物或雜質之產物； 合物’雜質之量可滿足呈經純化形式 欲用途。 相 必需使管柱旋轉 穿過管柱時誘導固 ，因為所產生之重力場可在泵送移 定相保留。

重要的是請注意，置換模式仍需要使用被系送穿過管 移動相。此移動相之流動可基於洗提模式引起分離。 因,：基於置換模式純化之操作可包含洗提模式部分。此 洗提板式之涉及可在等規系列之不同成員之間出現一或數 個間隙（換言之，不含欲純化產物之區域）時觀察到。在 極$而it況下’當洗提模式部分很重要_，由於置換模式所 形成之各離子對由間隙間隔。 離子交換置換模式與洗提模式之組合可為尤其有利 的’因為其可提高純化之分離度。 在本發明中’基質可溶於或部分可溶於水。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中該基質可溶於水。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中該基質部分可溶於水。 術語「部分可溶」意謂至少少量該基質應能夠溶解於 水相中。 基質可溶於或部分可溶於水很重要，因為在本發明之 較佳具體實例中，移動相為水相。若基質不可溶於水相（移 15 201212991 動相）’則其將保留在有機相（固定相） 化。 -相）中且不可能進行純 欲純化產物應至少在小程度上可溶於移動相以能夠穿 過管柱遷移。有機相與水相之間的可溶性可由分配係數量 度。 刀配係數為產物（溶質）在平衡狀態之兩種不混溶溶 :之混合物的兩個相中的濃度比率。因此，此係數為產物 :此兩種溶劑（其—般為水及辛醇），差異可溶性的 置度。未電離溶質在溶劑中之濃度的比率的對數稱作丨。以: ㈣ P 辛醇，水=Ζο·9 •、[溶質]$電離 >指定分子之logp值愈低’指定分子於水中之溶解性愈 向。 欲純化產物不同於「欲純化產物-交換劑」離子對。 本二基質可溶於或部分可溶於水。因此，根據 本發明之基質應具有低log尸。 「欲純化產物·交換劑」離子對可溶於有機相。因此，根 4本發明之「欲純化產物_交換.劑」離子對應具有高i〇g卜 根據另-適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該基質為疏水性基質。 ::::水性」特性為對水無親和力；或趨 Π吸't，或趙向於不溶解於水，或不與水混合，或不會 …U之產物。該等疏水性產物趨向於具有高1心值。 16 201212991 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該基質為粗反應混合物或來自植物或生物 技術介質之粗天然產物萃取物。 術S吾「粗反應混合物」表示基質為尚未經純化之反應 混合物。此基質可在本申請案中所述之純化之前經或未經 用方；^止產生5亥反應混合物之化學反應的中和、或經或未 經過遽、。 術語「粗天然產物萃取物」表示基質為來自生物來源 之原料，該等生物來源諸如植物、細菌、真菌、單細胞生 物體、動物或任何其他活細胞種類，或甚至含有有機物質 之沈降物。該原料可在本申請案中所述之純化之前經預處 理或未經預處理。該預處理包括（但不限於）：過濾、研磨、 由溶劑萃取（蒸餾、蒸汽蒸餾、蒸煮或任何其他技術）。 術§吾「生物技術介質」表示獲自活細胞、酶或活體外 生物系統之基質。該等生物技術介質可在本申請案中所述 之純化之前經過濾、中和或藉由其他層析技術部分純化。 本發明係關於一種藉由離心分配層析在離子交換置換 模式中自基質純化至少一種欲純化產物的方法，該欲純化 產物為兩性產物，其中該方法包含： 至少一個旋轉離心分配層析管柱之步驟，該管柱包含 含有該基質、兩相溶劑混合物、數種置換劑、一種交換劑 及至少一種保留劑之層析混合物，該兩相溶劑混合物由兩 個不可混溶相構成，一個相為固定相且另一個相為移動 相，及 17 201212991 至少一個系送該水性移動相穿過該管柱達足以純化該 欲純化產物之時間的步驟， 回收呈經純化形式之該至少一種欲純化產物之步驟。 本發明係關於一種藉由離心分配層析在離子交換置換 模式中自基質純化至少一種欲純化產物的方法，該欲純化 產物為兩性產物，其中該方法包含： 至少一個旋轉離心分配層析管柱之步驟，該管柱包含 層析混合物，其含有該基質；兩相溶劑混合物；以各種去 質子化百分比使用之一種置換劑及一種交換劑，該等去質 子化百分比尤其自1 %至3〇〇/。變化；及至少一種保留劑，該 兩相溶劑混合物由兩個不可混溶相構成，一個相為固定相 且另一個相為移動相，及 至少一個泵送該水性移動相穿過該管柱達足以純化該 欲純化產物之時間的步驟， 回收呈經純化形式之該至少一種欲純化產物之步驟。 本發明係關於一種藉由離心分配層析在離子交換置換 模式中自基質純化至少一種欲純化產物的方法，該欲純化 產物為兩性產物，其中該方法包含： 至少一個旋轉離心分配層析管柱之步驟，該管柱包含 層析混合物’其含有該基質；兩相溶劑混合物；數種置換 劑及一種交換劑，其中一種置換劑及一種交換劑以各種去 質子化百分比使用，該等去質子化百分比尤其自1%至50% 變化。 該兩相溶劑混合物由兩個不可混溶相構成，一個相為 18 201212991 固定相且另一個相為移動相，及 至少一個泵送該水性移動相穿過該管柱達足以純化該 欲純化產物之時間的步驟， 回收呈經純化形式之該至少一種欲純化產物之步驟。 本發明可用於純化肽或肽衍生物，尤其經保護肽，或 單一胺基酸，尤其經保護之單一胺基酸。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該至少一種欲純化產物含有少於約ι〇〇個 月女基駄，較佳少於約80個胺基酸，較佳少於約6〇個胺基 酉文殘基，較佳少於約5 〇個胺基酸，較佳少於約4 〇個胺基 酸，較隹少於約20個胺基酸，較佳8〇至2〇個胺基酸，較 佳8 0至5 0個胺基酸，較佳5 〇至2 〇個胺基酸。 胺基酸為具有羧酸官能基與胺官能基之分子。天然存 在22種胺基酸：丙胺酸（Ala )、精胺酸（Arg )、天冬醯胺 西夂（Asn )、天冬胺酸（ASp )、半胱胺酸（CyS )、麩胺酸（Giu )、 麩醯胺酸（Gin)、甘胺酸（Giy)、組胺酸（His)、異白胺酸 (He)、白胺酸（Leu)、離胺酸（Lys)、甲硫胺酸（Met)、 苯丙胺酸（Phe )、脯胺酸（Pro )、吡咯離胺酸（pyi )、硒代 半胱胺酸（Sec)、絲胺酸（Ser)、蘇胺酸（Th〇、色胺酸（丁卬）、 酉各胺酸（Tyr)及纈胺酸（Vai )。胺基酸可為天然胺基酸， 但可認為具有綾酸官能基與胺官能基之任何其他化學產物 亦為根據本發明之胺基酸。非天然胺基酸不存在於天然產 '物萃取物中。 根據另一適宜具體實例’本發明係關於諸如上文所定 19 201212991 · 義之方法，其中該至少一種欲純化產物為蛋白質，且該蛋、 白質含有1000至100個胺基酸，較佳1 〇〇〇至3〇〇個胺基 酸，較佳500至100個胺基酸，較佳1000至5〇0個胺基酸， 較佳500至300個胺基酸，較佳300至1〇〇個胺基酸，或 其中該至少一種欲純化產物為肽或肽衍生物，尤其經保護 肽，或為天然或非天然、經保護或未經保護之胺基酸。 具有超過1000個胺基酸之蛋白質可能因CPC純化之條 件而難以純化。該等蛋白質之四級及三級結構可能因與有 機 >容劑接觸而變性。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該至少一種欲純化產物為天然或非天然、. 經保護或未經保護之胺基酸。. 胺基酸之保護基可見於科學文獻中熟知之書籍，諸如 「protective groups in organic synthesis」（T. W. Greene 及 P. G.M. Wuts，1999 John Wiley & Sons 公司，iSBN:〇-47u 16019-9(硬皮書）；0-471-22057-4 (電子版））e舉例而言’該 等保護基可為：Boc、Fmoc、Bz、Bn、Aloe、trt、Pbf、tBu、 ocHx、〇Dmp、StBu、烯丙基、Hmb、OMe、OEt、Fm ' Xan、 .Tmob、Mtt、Cbz、Npys、Acm、Dnp、Mis。 敏純化產物之極性為本發明之重要特徵。極性可能由 於極性基酸或由於欲純化產物藉由極性部分官能化所產 生。 根據另一適宜具體實例’本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該至少一種欲純化產物含有少於約8〇%極 20 201212991 性胺基酸，較佳少於約70%極性胺基酸，較佳少於約6〇% 極性胺基酸’較佳少於5 0 %極性胺基酸。 本發明之極性胺基酸為精胺酸、組胺酸、離胺酸、吡 咯離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯 胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、硒代半胱胺酸及麩醯胺酸，如 書籍 Peptides from A to Z」，Hans-Dieter Jakubke 及 Norbert Sewald，第 20-21 頁（2008，Wiley-VCH，ISBN 978-3-527- 31722-6)中所述。 以胺基酸之總數計，具有超過8〇%極性胺基酸之肽難 以自水相（移動相）萃取。其可能不能與交換劑（有機相 中）適當地相互作用且因此難以純化。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中該至少一種欲純化產物含有由極性化學部 分g此化之胺基酸’該等極性化學部分諸如碳水化合物； 聚乙二醇化（Pegylated )部分；脂族鏈，該等脂族鏈為經 B月b化或未經官能化、環狀或非環狀、分支鏈或非分支鏈； 毒素，例如： -小紅莓（Doxorubicin ); -N-乙酿基-g_刺抱黴素（N-acetyl-g-calicheamicin) -美登素（Maytansine)衍生物； -單曱基奥瑞他汀（Monomethyl auristatin)衍生物； _ CC-1065及倍癌黴素（duocarmycib )衍生物，包括環 丙烧本并。引 u朵（cyclopropabenzindole，CBI)類似物； -伊立替康（Irinotecan ); 21 201212991 -么杉燒（Taxane )衍生物； -沙泊寧（Saporin ); _ 表柔比星（Epirubicin); •克羅拉濱（Clofaribine); 細胞毒性劑，例如： -疏基。票吟（Mercaptopurine); _ 甲胺嗓吟（methotreate )， DNA ;經修飾DNA，亦即具有經修飾驗基之DNA或具 有填鍵修飾之DNA ; RNA ;經修飾RNA，亦即具有經修飾 驗基之RNA或具有磷鍵修飾之rna ; SiRNA ;或經修飾

SiRNA ’亦即具有經修飾鹼基之siRNA或具有磷鍵修飾之 SiRNA 〇 術語「極性化學部分」表示具有超過〇德拜（Debye ) 之偶極矩的化學官能基。此偶極矩由一或多個雜原子（諸 如氧、氮、硫、磷、>6西）或鹵素（諸如氟、氣、溴、碘） 誘導。 術βα §^乙一酵化」表不由聚乙二醇鍵官能化之胺美 酸。 根據另一適宜具體實例’本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該至少一種欲純化產物為肽或肽衍生物， 尤其含有少於約40個胺基酸殘基且該等胺基酸殘基中小& 60%為極性胺基酸殘基的經保護肽。 、 根據另一適宜具體實例’本發明係關於諸如上文 義之方法，其中該至少一種欲純化產物為下式之狀： ^ 22 201212991 H-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-OH ( SEQ ID N〇:l )。 根據另一具體實例，本發明係關於諸如上文所定義之 方法’其中該兩相溶劑混合物為兩相，且由2至5種不同 溶劑、較佳3種不同溶劑、尤其4種不同溶劑構成。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中水及正丁醇為構成該兩相溶劑混合物之兩 種溶劑。 根據另-適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 ^二法，其中該兩相溶劑混合物中所含之溶劑之一為極 '小於正丁醇之溶劑’諸如烷烴、乙化 親脂性_、親脂性酮、親脂性醚。 氣化“1 常數產物之極性可由兩個不同參數定義：電偶極矩或介電 電偶極矩U) A電荷系統中 量度，亦即電冇…w τ電何及負“了之間隔的 且ID對：極性的量度。此值以德拜⑻表示， D 對應於 3,33564x 1〇-3〇c.m。 大。正丁醇之電偶極矩為⑽。…洛劑之極性愈 在指定條件下物質之介電 集中靜電通量線的程度之量相對靜電電容率為其 電能的量相對於真空之電容^的比、^加電壓時所儲存之 頻率時評估之相對電容率相同。二二對靜電電容率與。 劑之極性愈大。正丁醇 ^ 6值愈向，溶 根掳s π晃吊數值為17,84。 —適宜具體實例’本發明係關於諸如上文所定 23 201212991 義之方法’其中該兩相溶劑混合物中所含之溶劑之一為與· h2o及正丁醇均可混溶之溶劑，諸如甲醇、乙醇、丙醇、乙 腈、丙酮。 可/、及正丁醇混溶之溶劑的極性小於水，但比 正丁醇之極性大β 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中該兩相溶劑混合物含有以下四種溶劑： -水，及 -與Ηζ〇及正丁醇均可混溶之溶劑，諸如曱醇' 乙醇、 乙腈、丙S同，及 _正丁醇，及 -極丨生小於正丁醇之溶劑，諸如烷烴、乙酸乙酯、氣化 溶劑、親脂性酯、親脂性酮、親脂性醚。 此兩相〉谷劑混合物因其在管柱中之流體動力學性能而 為適宜的。由此獲得之溶劑混合物具有令人滿意之極性。 此外，基質在此溶劑混合物中展示良好可溶性。此溶劑混 合物使得純化方法可具有良好選擇性。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中g玄兩相溶劑混合物含有四種以下溶劑：水、 乙腈、正丁醇及甲基-第三丁醚。 此兩相溶劑混合物為尤其適宜的。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該溶劑混合物含有 -約40%至約60%、較佳約45%至約55%水，以體積表 24 201212991 示，以溶劑混合物之總體積計’及 -約10%至約40%、較佳約15°/。至約30。/。正丁醇，以體 積表示，以溶劑混合物之總體積計。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該溶劑混合物含有 約1 %至約20%、較佳約5%至約15%該與H20及正丁 酉享均可混溶之溶劑’以溶劑混合物之總體積計。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該溶劑混合物含有 約10%至約40%、較佳約丨5%至約30〇/〇該極性小於正 丁醇之溶劑，以溶劑混合物之總體積計。 上文所定義之 且該保留劑為 根據另一具體實例，本發明係關於諸如 方法，其中該至少一種交換劑為陰離子型， 陽離子型。 恨爆乃一通 « ^ ^ ........两划上文所 義之方法，其中該至少一種交換劑與該保留劑形成離子對< 在純化開始時，保留劑為交換劑之相 期間所形成之離子對中，離子對保留劑_=化 形成自由焓之離子對。 為具有最低 根據另4宜具體實例，本發明係 義之方法，其中爷至+ Η於冲如上文所定 &明之此較佳具體實例中， 而交換劑必須可溶於有搪相為有機相，從 合於有機洛劑以保留於固定加 背J可溶於移動相（ 。若交'換 )則可能造成交換劑自管㈠漏。 25 201212991 根據另-適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 之方广’：中该至少—種交換劑與該至少一種欲純化產 物在陰離子交換劑盘欲蚰仆；& 士 ，、奴純化兩性產物之陽離子部分之間 成離子對，且其中兮· Μ工^ γ , π 2 1 、。/子對稱作交換劑-欲純化產物」離 子對。 術語「兩性產物之陽離 _ 子分J表示兩性產物中帶正 電之片段。兩性產物之正雷 之正電何與交換劑之負電荷之間產生 離子鍵。兩性產物可帶有負 ^員電何或正電何，或負電荷與正 電何（兩性離子產舶j、+ Λ 或不帶電荷。陽離子部分（正電荷） 與交換劑相互作用並非音祁 明此口 [5为自兩性產物之其餘部分 解離。 板據另-適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義，方法’其中該基質包含—種以上欲純化產物且其中 δ玄專欲純化產物各开4τ π「> 成不同父換劑_欲純化產物」離子對， 從而形成與欲自基質純化之 、1 化之產物—樣多之「交換劑-欲純化 產物」離子對。 在-特定具體實例中’本發明係關於純化混合物中之 ::人純化產物’其中欲純化產物各具有不同於其他 Γ產物，化學結構。因此’在該等欲純化產物之-與交換 刈之間獲得的各離子對 、

丁耵肘區別方；、換言之不同於所形 其他離子對。 乂I 所形成之離子對各具有固有形成自由焓，且該形成自 给可類似於或不同於所形成之其他離子對的形成自由 3 ’即使欲純化產物具有密切相關化學結構。 26 201212991 具有密切相關結構之欲純化產物可能對交換劑具有不 同親和力。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該「交換劑·欲純化產物」離子對可溶於有 機溶劑。 「交換劑-欲純化產物」離子對可溶於或部分可溶於有機 溶劑很重要。換言《，「交換劑-欲純化產物」離子對優先分 配於固定有機相中復售·垂_，# 置要 口為在本發明之較佳具體實例 中’固定相為有機相。. 根據另-適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中該層析混合物含有呈不同電離狀態之交換 劑。 術S吾「不同電離狀態」 交換劑可視其所帶有之化學 此電離狀態之差異由交換劑 換劑為+1、+2、+3、+4、+5 , -4 、 -5 。 關於交換劑分子之電子組態。 官能基而具有不同電離狀態。 分子之總電荷定性，陽離子交 或陰離子交換劑為-丨、_2、-3、 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該至少一種交換劑為烷基化磷酸衍生物， 尤其DEHPA。 術語「DEHPA」表示產物雙（2_乙基己基）磷酸。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中§玄至少一種交換劑之量由該欲純化產物之 胺基酸之數目計算出，且該交換劑與該等胺基酸之莫耳比 27 201212991 為約1至約1〇’尤其為2至6,較佳為4至6。 f ::: I月中所用之置換劑與交換劑形成離子對。置換叫 ::移動相（水相)’而「置換劑-交換劑」離子對可二 固定相（有機相）。 耵了岭於 根：另二具體實例，本發明係關於諸如上文所定義之 '、中δ玄至少一種置換劑為陽離子型。 1 ^ CPC f柱中之置換劑呈與相對離子之離子” ;他右在此具體實例中，置換劑為^ 子為陰離子。 丁則4相對離 根據另-適宜具體實例，本發明係關於諸如上文 義之方法，其中該至少-種置換劑可溶於水。 根據另-適宜具體實例，本發明係關於諸如上文 :之方法，其中該至少一種置換劑與該至少，種交 陰離子交換劑與陽離子置換劑 、 〜攻離子對，且其中玆 子對稱作「置換劑-交換劑」離子對。 :據另一㈣體實例’本發明係關於諸如上文所定 劑。 ⑷」離子對可溶於有機溶 本發明提及使用一種交換劑及—種 換劑及-種交換劑，或一種置換劑及數種’或數種置 置換劑及數種交換劑。. 數種父換劑，或數種 根據另-適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中對應於該「置換劑-吞祕如 白“ 關交換劑」離子對之形成 給的能「交換劑·欲純化產物」離子對中之 28 201212991 任一者的形成自由焓的能量。 在此具體實例中，使用一種置換劑及一種交換劑 換劑對交換劑之親和力高於任何欲純化產物對交 和力。 m現 以下具體實例描述數種置換劑與一種交換劑、數 換劑與一種置換劑及數種置換劑與數種交換劑之袓八: 出於置換劑或交換劑之觀點考慮形成「置換劑_交_^ 之離子相對於欲純化產物之親和力。 」子 根據另-適宜具體實例’本發明係關於諸 義之方法，其中該層析混合物含 又所义 在本發明之一特定具體實例中，可使用 ^。 —種置換劑之組合。.使用 乂換劑與 便用不冋父換劑可提高 度’因為相對於僅用-種交換劑純化，易於形成之：刀綠 之數目應乘以管柱中所存Λ 、成之雄子對 所存在之交換劑之數目。 在此具體實例中，置換劑對任何交 任何欲純化產物對任何交換劑之親和力。、 力高於 =另：：宜具體實例，本發明係關於 钱之方法，其中對應於該 文所疋 之形成自由焓的能量高於 广交換劑」離子對各自 對中至少一者之 / 交換劑-欲純化產物」離 之形成自由焓的能量。 在此具體實例中，使— 換劍。可使用之置換劍各對選艺文種置換劑及一或數種交 換劑具有親和力，i古 ' 可存在之不同交換劑的交 之親和力。 何奴純化產物對所選擇交換劑 29 201212991 換劑 其他 換言之，於含有數種欲純化產物之管柱中^置 可純化該等欲純化產物中至少一纟，且可能不可純化 欲純化產物。 根據另-適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所〜 義之方法’其中各交換劑對至少一種置換劑具有親和力夂 高於其對該等欲純化產物各自之親和力， ， 其中該親和力與對應於該等「置㈣交換劑」離 或该等「交換劑·欲純化產物」離子對之形成自由焓旦 成比例。 此夏 在此具體實例中，使用—或數種置換劑及-或數種六 換劑。可使用之各交換劑及選自可存在之不同置換劑的= 換劑形成「置換劑-交換劑」離子對，其具有高於可形成之 任何「欲純化產物·交換劑」離子對之形成自由焓的形成^ 由焓。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該置換劑選自包含H+及金屬鹽（諸如

Ca2+、Fe2+、Mg2+ ' Fe3+ ' Mn2+ ' κ+、Cu2+)之清單。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該交換劑及該置換劑之莫耳比為約1至： 15’尤其為2至15’較佳為5至1〇。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該置換劑及該等欲純化產物之莫耳比為約1 至約300 ’尤其為2至1 〇〇，較佳為5至1〇〇。 根據另一具體實例，本發明係關於諸如上文所定義之 30 201212991 方法，其中 _ 該兩相溶劑混合物含有四種以下溶劑：水'乙腈、正 丁醇及曱基第二丁鱗（MtBE)，且 該至少一種置換劑為Ca2+，且 該至少一種交換劑為DEHPA，且 s玄至少一種欲純化產物為肽’較佳為H Asp_Glu_

Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-

Thr-OH。 構成欲純化肽之胺基酸由三字母代碼表示，此代碼詳 述於上文中。「H-」端對應於肽之胺基端，「_〇H」端對應於 肽之酸端。 根.據另一適宜具體實例’本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中該兩相溶劑混合物含有四種以下溶劑：水、 乙腈、正丁醇及MtBE，且 該至少一種置換劑為Ca2+。 該等Ca2離子可以鹽形式引入，其中相對離子為α·陰 離子’從而以CaCl2鹽之形式引入。 相對陰離子可為例如氣離子、碘離子、溴離子、硝酸 根離子、乙酸根離子、擰檬酸根離子、硫酸根離子、三氟 乙酸根離子、甲酸根離子、磷酸氫根離子、草酸根離子及 雙羥萘酸根離子： 31 201212991

OH 根據另一適宜具體實例’本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中該兩相溶劑混合物含有四種以下溶劑：水、 乙腈、正丁醇及MtBE，且 該至少一種交換劑為DEHPA。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中該兩相溶劑混合物含有四種以下溶劑：水、 乙腈、正丁醇及MtBE，且 該至少一種置換劑為Ca2+，且 該至少一種交換劑為DEHPA。 根據另一適宜具體實例’本發明係關於諸如上文所定 義之方法’其中該兩相溶劑混合物含有四種以下溶劑：水、 乙腈 '正丁醇及MtBE，且 該至少一種欲純化產物為肽或肽衍生物，尤其經保護 肽 車乂 佳為 H-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Plie-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-OH。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中·· 該至少一種交換劑·為DEHPA，且 該至少一種欲純化產物為肽或肽衍生物，尤其經保護. 32 201212991 狀’較佳為 H-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-OH。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中： 該至少一種置換劑為Ca2+，且 該至少一種欲純化產物為肽或肽衍生物，尤其經保護 肽’較佳為 H-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His.Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-OH。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中： 該至少一種交換劑為DEHPA，且 該至少一種置換劑為Ca2+，且 該至少一種欲純化產物為肽或肽衍生物，尤其經保護 肽’較佳為 H-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-OH。 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中： 該兩相溶劑混合物含有四種以下溶劑：水、乙腈、正 丁醇及MtBE，且 該置換劑為Ca2+，且 該欲純化產物為肽或肽衍生物，尤其經保護肽，較佳為 H-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-OH 〇 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 33 201212991 義之方法，其中： 該兩相溶劑混合物含有四種以下溶劑：水、乙腈、正 丁醇及MtBE，且 該交換劑為DEHPA，且 該欲純化產物為肽或肽衍生物，尤其經保護肽，較佳為 H-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-

Thr-Pro-Arg-Thr-OH。 本發明係關於諸如上文所定義之方法，其包含： 於離心分配層析管柱中引入有機固定相之步驟，該有 機固定相包含至少一種交換劑及至少一種保留劑，及 於該離心分配層析管柱中引入含有至少一種欲純化產 物之基質的步驟，及 該移 .於離心分配層析管柱中引入水性移動相之步驟 動相包含至少一種置換劑，及 系送該水性移動相穿過該離心分配層析管柱以使該至 少一種欲純化產物可穿過該管柱移動之步驟，及 回收呈經純化形式之該等欲純化產物中至少一者之步 驟’該管柱在引入基質至回收呈 收呈絰純化形式之該等欲純化 產物中至少一者期間處於旋轉狀態。 可增加引入無置換劑之7k w^ , ]之水性移動相達足以移除不盥交 換劑形成離子對之產物之時間 ，、又 Ί的v驟。此可能步驟在於管 柱中引入基質之後且在弓丨入含 ^ Β 置換剑之移動相之前進行。 術語「移動」指被泵送兹^ & 退灯 lu 「 k言柱之移動相中所含之置 換劑置換「欲純化產物-交拖％ Τ3之置 換劑」離子對以形成「置換劑- 34 201212991 交換劑」離子對及「欲純化產物_相對離子」離子對的能力， 該「欲純化產物-相對離子」離子對隨後溶解於該移動相中， 因此與移動相流一起穿過管柱向輸出口移動。 以下具體貫例描述純化方法及操作該純化方法之任何 時間的管柱狀態。 本發明係關於諸如上文所定義之方法，其包含： 於離心分配層析管柱中引入有機固定相之步驟，該有 機固定相包含一種交換劑及至少一種保留劑，及 於該離心分配層析管柱中引入含有至少一種欲純化產 物之基質的步驟，及 於離心分配層析管柱中引入水性移動相之步驟，該移 動相包含數種置換劑，及 系送該水性移動相穿過該離心分配層析管枉以使該至 少一種欲純化產物可穿過該管柱移動之步驟，及 回收呈經純化形式之.該等欲純化產物中至少一者之步 驟， 該管柱在引入基質至回收呈經純化形式之該等欲純化 產物中至少一者期間處於旋轉狀態。 本發明係關於諸如上文所定義之方法，其包含： 於離心分配層析管柱中引入有機固定相之步驟，該有 機固定相包含以各種去質子化百分比使用之一種交換劑， 該等去質子化百分比尤其自1%至50%變化；及至少一種保 留劑，及 於該離心分配層析管柱中引入含有至少一種欲純化產 35 201212991 物之基質的步驟，及 於離心分配層析管柱中引入水性移動相之步驟，該移 動相包含至少一種置換劑，及 泵送該水性移動相穿過該離心分配層析管柱以使該至 少一種欲純化產物可穿過該管柱移動之步驟，及 回收呈經純化形式之該等欲純化產物中至少一者之步 驟， 該管柱在引入基質至回收呈經純化形式之該等欲純化 產物中至少一者期間處於旋轉狀態。 本發明係關於諸如上文所定義之方法，其包含： 於離心分配層析管柱中引入有機固定相之步驟，該有 機固定相包含以各種去質子化百分比使用之一種交換劑， 該等去質子化百分比尤其自1%至50%變化；及至少一種保 留劑，及 於該離心分配層析管柱中引入含有至少一種欲純化產 物之基質的步驟，及 於離心分配層析管柱中引入水性移動相之步驟，該移 動相包含數種置換劑，及 泵送該水性移動相穿過該離心分配層析管柱以使該至 少一種欲純化產物可穿過該管柱移動之步驟，及 回收呈經純化形式之該等欲純化產物中至少一者之步 驟， 該管柱在引入基質至回收呈經純化形式之該等欲純化 產物中至少一者期間處於旋轉狀態。 36 201212991 本發明係關於諸如上文所定義之方法’其包含： 至少一個引發離心分配層析管柱旋轉之步驟，該管柱 包含分離混合物，其包含該兩相溶劑混合物、該至少一種 保留劑、該至少一種交換劑、可能存在之該基質及可能存 在之該至少一種置換劑， 其中該離心分配層析管柱包含： 一端之輸入口’於適當時間在此處於管柱中引入水相 與有機相、該保留劑、該交換劑、可能存在之該基質及可 能存在之該置換劑，及 另一端之輸出口，在此處自管柱回收該有機固定相、 該水性移動相 '該保留劑、該交換劑、可能存在之呈經純 化形式之該等欲純化產物及可能存在之該置換劑，且 其中該置換離心分配層析方法可在離心分配層析管柱 内形成2至2n+3個區域’且其中η為欲自基質純化之不同 產物之數目： -八可二存在之鄰接於管柱輸出口之頭部區域，該頭部區 成…解於該固定相中之該保留劑及該交換劑， 可能存在之鄰接於管柱輸人口 、 部區域包含「置換劑-交換劑」離子對， ，、中該尾 •位於頭部區域與尾部區域之 區域或頭部區域時位於該f 或在》別不存在尾部 區域， 口與輪出口之間的中心 至2n+l範圍内 其中該等中心區域之數目介於 其中 37 201212991 在巾區域中，第—中心區域為最接近於管柱輸出口 或在存在該頭部區域時鄰接於頭部區域之區域，且 ，在中心區域中，最末中心區域為最接近於管柱輸入口 或在存在該尾部區域時鄰接於尾部區域之區域，且 其中，該等令心區域各彼此獨立地包含或不包含至少 個父換劑·欲純化產物」離子對， 心㈣包含至少-種欲純化產物即 可， S玄專欲純化產物中至少一去私技 夕者知佳位於不含其他欲純化 產物之中心區域中， =種㈣化產物較佳各位於不含其他欲純化產物之 τ〜區域中。 管柱如下調節： 當管柱準備純化時，在任 w 隹任仃其他成分之前引入固定相 (有機相）及交換劑-保留劑 Μ X P m s往填充有固定相之後， 引入無置換劑移動相（水相） 銘叙知2| ’ 5丨入基質’隨後引入置換劑。 移動相:丨入可在基質引入之前或之後進行。 術5吾「區域」指在έφ 卜tw 隹珧化方法期間管 同區域。置拖槿彳咖丁 A r , 丁』規？了、到之不 之離子f“ Μ之間的關係為管柱内所形成 之離子對相互排除。在理論觀 ^ 離方法之祕女,\ 在各區域中，參與分 離方法之所有組分的濃度藉由 固定。 …、力干及酸鹼平衡而恆定且 上文。羊述’形成二種不同類型之離子對. 至少-種欲純化產物與交換劑之間的離子對，. 38 201212991 -保留劑與交換劑之間的離子對，及 -置換劑與交換劑之間的離子對。 頭部區域對應於管柱中含有保留劑與交換劑的 子對的池。 中心區域對應於管柱中含有欲純化產物與交換劑 的離子對的池。 尾部區域對應於管柱中含有置換劑與交換劑之 子對的池。 +構成中心區域之區域數目取決於「欲純化產物-交換劑」 離子對之間的分離及存在或不存在洗提模式。 在藉由無洗提模式之置換純化中，中心區域為且有^ 至最多η個不同區域之組；其中,為欲自基質純化之不同 產物之數目。纟中心區域對應於一或數個特定「欲純化產 物-交換劑」離子對。一或多種欲純化產物可具有相同滞留 時間，此意謂其以相同速度穿過管柱遷移且在管柱輸出口 (口收。此荨產物在同一中心區域中。 換&之，單一中心區域對應於不存在產物分離；且η 個中心區域對應於各欲純化產物與其他欲純化產物分離。 中“區域之數目與「欲純化產物-交換劑」離子對之間 的分離有關，且限於對應於可形成之「欲純化產物-交換劑」 離子對之最大數目的最大值。 當置換模式與洗提模式組合時，.移動相可在含欲純化 產物之中心區域之間產生「間隙」。 在一極端情況下，不存在洗提作用，故中心區域之數 39 201212991 目仍為1至π，如上所述。 在相反極端情況下，洗提作用在各含有欲純化產物之 中心區域之間產生間隙，從而產生2η+1個區域。中心區域 含有欲純化產物，且不含欲純化產物的「間隙」交替出現 於其間。 區域之總數包括含有「保留劑-交換劑」離子對之頭部 區域及含有「置換劑-交換劑」離子對之尾部區域。 因此，在以下情況下，區域之總數可達成多達211+3個 區域之最大值： 自管柱完全回收，且 離子對與其他「欲純化產 ’中心及尾部）之間產生間 •操作純化方法，且 -引入置換劑且保留劑尚未 -各「欲純化產物-交換劑」 物-交換劑」離子對分離，且 _洗提棋式在各區域（頭部 隙。 一極端情況下 未引入置換劑 區域之最小數目取決於不同因素在 最少之區域可為1個（保留劑完全回收， 未藉由置換或洗提模式分離）。 及有機相、保留劑、交換劑、基質、置：：。 以下具體實例係關於上文所述之方法且進 在純化方法之任何時間且在任行 ν田\ 何不同區域中，移動相及固 定相'其可能含有之離子。 #相 根據另一適宜具體實例 本發明係關於諸如上文所定 40 201212991 義之方法，其中該離心分配層析管柱包含 =存在之鄰接於管柱輸入口之尾部區域，其中 μ毛部區域包含由兩個不可混溶相 該移動相）構成之兩相溶劑混合物，i '、ρ '固疋相及 該尾部區域包含至少-種溶解於移動相中之 至少一種溶解於固定相中之厂交換 俠w保留劑」離子對，且 ”中’中心區域各彼此獨立地包含或不包含至少一個 溶解於固定相中之「交換劑-欲純 ' 」離子對，且包含 5 ι3至少一種溶解於移動相中之欲純化產物， 只要至少一個中心區域包含至少一種溶解於移動相中 之欲純化產物或至少一個溶解於固定相中之「交換劑-欲純 化產物」離‘子對即可， 較佳地，該等欲純化產物中至少一者或至少—個「交 換劑-欲純化產物」離子對存在於不含其他欲純化產物之中 心區域移動相中，或其不含其他欲純化「交換劑·欲純化產 物」離子對的各別中心區域固定相中， 較佳地，該η種欲純化產物或「交換劑·欲純化產物」 離子對各存在於不含其他欲純化產物之中心區域移動相 中，或其不含欲纯化「交換劑-欲純化產物」離子對的各別 中心區域固定相中。 上文所定義之區域各包含移動相及固定相。純化方法 而要欲純化產物在此兩個相之間遷移。然而，離子對隨著 所考慮之相變化。’ 與交換劑之離子對在固定相中形成，因為交換劑不可 201212991 溶於移動相。從而存在於固定相令之欲純化產物與交換劑 形成離子對。在有機固定相中形成離子對（其使欲純化產 物穩定’從而防止其惡化且使得可在水相中回收該等產物） 亦較佳地保護欲純化產物，從而實現該等產物之生#Μ 性。 移動相含有分別與欲純化產物、保留劑及置換劑形成 離子對之相‘對離子。相較於固定相，此等相對離子較易溶 於移動相。此等相對離子對應於於管柱中引入之欲純 物或置換劑之相對離子。 因此’移動相令之欲純化產物與可泫 子形成離子對。 產物與了-於移動相之陽離 移動相及固定相總為電中性的。陰離子或陽離子自一 =至另-個相之各自遷移總由相反方向之電相等離子流 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸 義之方法‘， 上文所疋

Jir在離心分配層析管柱内形成2至㈣個區域 的该置換離心分配層析方法中，各區域對應於在管二 口回收之各別批次： 輪出 批次·，包含溶解於有機固定相中之交換劑及保留劑的頭部 -包含溶解於水性移動相中之置換劑的尾部批欠 -位於頭部批次與尾部批次之間的中心批欠， 其中該等中心批次之數目介於u2n+1範圍内， 42 201212991 其中 在中心批次中，第 出口第一個回收的批次 中心批次為按時間順序在管杈輸 且 杈輪 在中心批次中’最末中心批次為按時間順序在管 出口最後一個回收的批次，且 其中 ，且 包含或不包含至少一種欲 中心批次各包含水性移動相 S亥荨中心批次各彼此獨立地 純化產物，且 一種欲純化產物即 只要至少一個中心批次包含至少 可， 該等欲純化產物中至少一 產物之中心批次中， 者較佳位於不含其他欲純化 該 種欲純化產物較佳各位於不含其他欲 中心批次中 純化產物之 該等中心批次各包含或不包含_或多種欲純化產物。 當一種以上欲純化產物存在於同—中心批次中時，表明該 等欲純化產物具有類似或極接近滯留時間，從而以相同速 度穿過管柱遷移。此類似滯留時間可能由具有類似或接近 形成自由焓之「欲純化產物_交換劑」離子對所致。換言之， 此等欲純化產物具有類似層析性能。. 純化目的在於分離純產物或至少自混合物移除被視為 雜質之產物。纟管柱輸出口回收呈經純化形式之產物。回 收為連續過程，因為在管柱中連續引入置換劑。 43 201212991 術語「連續引入」意謂可能含有 定速率在管柱輸入口衆入管柱中…之移動相以相 規則且不間斷的，直至# a疋速率下泵送；^ 方法停止。為達成欲純化產物之回收且純: 重要的是需記住，在置換

排出之驅動力為管柱中增加量之^ 物在管杈輪出D ^ 置換劑的引入。坤Λ β 置換劑將與交換劑形成離 a加量之 管柱。 R㈣化產物完全「推」出 術語「連續回收，吾^田+ & 逆只口收_!思明在管柱輸出口 :相以對應於在管柱輸入口引入移動相之速率：出之移 。因為輸人為連續且不間斷的，且管 、牟回 管柱輸出口回收為連續且不間斷的。當在管柱^，故在 引入移動相時，在管柱輸出口亦停止回收移D停止 ，純化方法期間可觀察固.定相之茂漏。術 表=在官柱輸出口回收到^漏」 不應回收到，且應保留在管 、化期間 個相之特定流體動力學性能。：個：疋相Μ漏歸因於兩 声只而兩個相之物理-化學特性 度、界面張力、體積質量差） （黏 象。 ”丨起移動相驅使固定相之現 :下具體實例係關於一種自純化方法開始， 官柱中未引入置換劑時起始之方法。已引入基質’且 ^產物-交換劑」離子對之間基於親和力之組織出=欲 未進行置換模式。 、印現，但 根據該具體實例，本發明係關於諸如上文所定義之方 44 201212991 法， 其中該置換離心分配屉张古、+ . 、 刀配層析方法可在離心分配層析管 内形成2至211+2個區域’且其中η為欲自基質純化之不同 產物之數目，遠等區域由以下組成： '鄰接於管柱輸出口之頭部區域，該頭部區域包含溶解 於該固定相中之該保留劑與該交換劑，及 解 -位於頭部區域與該管柱輪出口之間的中心區域 该等令心區域之數目介於U2n+i範圍内，’、 在中心區域中，第一 φ、、ρ α 之區域，且 °°域為最接近於管柱輸出口 在中心區域中，畏古&、、广 之區域。 〜A域為最接近於管柱輸入口 以下具體實例係關於當於cp 發明之純化方法…換劑於 柱中引入置換劑時本 規系列形成且穿過管柱向其 $入口連續注射時，等 柱向官柱輸出口前進。 根據另一具體實例，本 方法， 月係關於諸如上文所定義之 其中該置換離心分配層析 内形成⑷至2n+3個區域，且了在離心分配層析管才主 同產物之數目，該等區域由以下、^為欲自基質純化之不 -鄰接於管杈輪出口之頭 士 · 於該固定相中$ % 〇〇 5亥頭部區域包含溶艇 疋相中之该保留劑與該交換 -解 -鄰接於管柱輪入口之尾 「置換劑-交換劑」離子對，及°Π ，，、中該尾部區域包含 45 201212991 -位於頭部區域盥 、毛。p區域之間的中心區域， 其中 口亥專令心區域之救曰人& 1 数目介於1至2n+l範圍内， 在中心區域中，笛 丄 _ 之區域，且 一中心區域為最接近於管柱輪出 在中心區域中，蛊 中心區域為最接近於管柱輪X 之區域。 &位铡入 以下具體貫例係關於告 — 、田成乎元成純化時本發明 方法。欲純化產物已在管 赞月之純' 之產物以外。在管柱輸入口連續注射置換劑。.在口 之方^該適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定^ 其中該置換離心分# 此層析方法可在離心分配 内形成n+1至2n + 3個區域，且复 s才 其中n為欲自基質純化之7 同產物之數目，s亥等區域由以下組成. 厂 -鄰接於管柱輸入口之尾部區域，其 置換劑-交換劑」離子對，及 ^毛。卩區域包^ -位於該離心分配層析瞢 曰竹S柱之輪出口與 的中

心區域， 興尾部區域之R 該寺中心區域之數目介於〗石1 1至2η+ι範圍内。 在此具體實例中，包含嗲仅 , 亥保留劑之頭部區4已自 完全田收’從而不予考慮- " 以下具體實例係關於本發明 上m 0 <"中規定特定純化 之純化方/去 46 201212991 择據該具體實例，本發明係關於諸如上文所定義之方 法，其包含： 於離心分配層析管柱中引入有機固定相之步驟，該有 機固定相包含至少一種交換劑及至少一種保留劑，且該有 機相包含以下四種溶劑： -少於有機相體積之1 5%的水 -體積比例小於50%之與HA及正丁醇均可混溶之溶 劑’諸如曱醇、乙醇、乙腈、丙酮，及 -正丁醇（5 至 90%，v/v)，及 -極性小於正丁醇之溶劑（5至90% Wv )，諸如烷烴、 乙酸乙酯、氣化溶劑、親脂性酯、親脂性酮、親脂性醚， 及 於該離心分配層析管柱中引入包含至少—種欲純化產 物之基質的步驟，及 於離心分配層析管柱中連續引入水性移動相之步驟， 該水性移動相包含以下三種溶劑： -水（超過50%，v/v )，及 -體積比例小於50%之與HA及正丁醇均可混溶之溶 劑，諸如甲醇、乙醇、乙腈 '丙嗣或其混合物，及 -少於25%.之可能存在之正丁醇，及 -少於25%之極性小於正丁醇之溶劑’諸如烷烴、乙酸 乙酯、氣化溶劑、親脂性酯、親脂性酮、親脂性醚， 在該水性移動相中連續引入至少一種置換劑，及泵送 包含該至少一種置換劑之水性移動相穿過該離心分配層析 47 201212991 官柱以使該至少一種欲純化產物可穿過該管杈移動的步 驟，及 ，/ 在管柱輸出口連續回收呈經純化形式之該等欲純化產 物中至少一者之步棘， 其中維持管柱連續轉動、在該水相中連續引入至少一 種置換劑及連續泵送該水相穿過管柱， 該連續回收步驟在於管柱輸出口回收到第—中心批次 時引發。 根據另一適宜具體實例’本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其中 3亥有機相包含乙腈、正丁醇、MtBE及痕量水，該水性 移動相包含水、乙腈、正丁醇及痕量MtBE。 根據另一具體實例，本發明係關於諸如上文所定義之 方法’其包含： 於離心分配層析管柱中引入有機固定相之步驟，該有 機固定相包含至少一種交換劑及至少一種保留劑，且該有 機相包含：乙腈 '正丁醇、MtBE及痕量水（少於10% ) 於该離心分配層析管柱中引入包含欲純化之肽或肽衍 生物 '尤其欲純化SF 328之基質的步驟，及 於離‘U分配層析管柱中連續引入水性移動相之步驟， X艮丨生移動相包含水 '乙腈、正丁醇及痕量MtB£ (少於 10%) » ' 在6玄水性移動相中連續引入至少一種置換劑，及泵送 匕3 °亥至少一種置換劑之水性移動相穿過該離心分配層拚 48 201212991 S柱以使该至少—種欲純化產物可穿過該管柱移 驟，及 在管杈輪出口連續回收呈經純化形式之欲純化 肽衍生物、尤其欲純化SF 328之步驟， 〃中、.隹持管柱連續轉動、在該水相中連續引入 種置換^丨及連續果送該水相穿過管柱， °亥連、’男回收步驟在於管柱輸出口回收到第—中 時引發。 根據另—具體實例，本發明係關於諸如上文 方法，其中 於離心分配層析管柱中連續引入水性移動相之 在/ “目中連續引入至少一種置換劑之步驟重 循環， 該等循％之數目足以回收所有欲純化產物， 其中’對於指定循環，戶斤用置換劑不同於先前 所用之置㈣’且可形成親和力高於管柱中^ 個「交換劑-欲純化產物」離子對之親和力的「保. 劑」離子對， _ 以使各循環可在管柱輸出口回收至少 :呈經純化形式保留於管柱中之該等欲純化產物; 術語「循環 如& 扣砘化方法之時段；在該時段期 > 一種欲純化產物穿w^ β 官柱移動且在管柱輸出口回 日Τ ·ί又在於管柱中弓I入里仏+ 置換诏時起始，且在於管桎輸 動的步 之肽或 至少— 心批次 定義之 步驟及 至4個 循環中 至少― U -交換 ’其包 至少—· 間，至 收。該 出口回 49 201212991 收該置換劑時結束。換 有置換劑之移動相時柱輪入口引入含 純化產物（移動相中）時結束。 主輸出口完全回收欲 當循環結束’亦即在 時，或換-之a μ 輸出口不再排出欲純化產物 于飞換。之當在管柱輸出口排 座物 不同於先前所用t胃μ & 換劑時，可藉由使用 所用之置換劑引發新循環。 在任何循環之前，管柱填充有含 離子對之固定相，於总 又換4 -保留劑」 在不同…引入基質且弓丨發管柱旋轉。 交換劑」離子對 用數種不同置換劑，因為「置換劑- .二二：形成自由焓可隨著所要分離（亦即分離 或#刀純化一種產物或數種產物）調整。 舉例而言，可使用對交換劑之親和力弱於— 產物之親和力的置換劑。在此 —机..屯化 在此it况下，僅一部分欲純化產 物（對父換劑之親和力低於所引入置換劑之親和力的欲純 化產物）受引入置換劑影響。 藉由引入對乂換劑之親和力各高於先前所引入置換劑 之數種置換劑·’對於各循環’可產生梯度，置換模式之力 以逐步方式增加。此可提供欲純化產物之混合物的改良純 化0 根據另一適宜具體實例，本發明係關於諸如上文所定 義之方法，其包含： 於離心分配層析管柱中引入有機固定相之步驟，該有 機固定相包含至少一種交換劑及至少一種保留劑，且該有 機相包含：乙腈、正丁醇、MtBE及痕量水（少於1 〇% )， 50 201212991 及 於該離心分配層析管柱中引入含有至少—種欲純化產 物之基質的步驟，及 於離心分配層析管枉中連續引入水性移動相之步驟， 且遠水性移目包含水及乙腈、正了醇及痕量獅 10%)，及 >巧、 在該水性移動相中連續引 錄罢她十丨 .包含該至少一插罢她 丨八至夕—種置換劑，及泵送 管柱以使該至少一種欲純化::動相穿過㈣心分配層析 驟，及 ，，屯化產物可穿過該管柱移動的步 於離心分配層析管 及在兮笙！^ 土 連、戈弓丨入水性移動相之該步挪 及在忒寻水相步驟中連續、 /驟 til 2 J. 4 ^ 一種置換劑之該步驟， 至饭z主4個猶環，該 純化產物， 衣之數目足以回收所有欵 其中，對於指定循環 所用之置換劑，且可 ^置換劑不同於先前循壤中 劑 離子對 以使各循環可在管 含呈經純化形式保留於管：中=收：少-個批次’其包 者。 °Λ專欲純化產物中至少 個「交換劑-欲純化產物」離°馬於管柱中保留之至少〜 離子對， +之親和力的「保留劑-交換 實驗 實驗條件 51 201212991 溶劑 所有溶劑均以層析級溶劑自Carlo ErbaC Rodano, Italy ) 購得。水藉由去電離及逆滲透加以純化。 兩相系統（1 L )藉由於分液漏斗中混合指定比例之適 合溶劑加以製備》將其劇烈震盪，隨後使其沈降直至各相 變得清澈。 隨後於有機相中添加適合濃度之離子交換劑。亦向水 性移動相中添加置換劑。 層析裝置 於 FCPC Kromat〇n Technologies 裝置（Angers，France) 上使用由20個圓形分配盤（丨320個分配池：每個池〇丨3〇 mL ;總管柱容量：205 mL，怠體積：32.3 mL· )構成之轉子 執行分離》轉速可自200 rpm調節至2000 rpm，在分配池 中得到離心力場，在l000 rpm下為約12〇g，且在2〇〇〇rpm 下為約480 g。溶劑藉由Dionex P580HPG 4通二元高壓梯 度泵（Sunnyvale，CA，USA)泵送。 首先用有機固定相填充管枉。 穿過配備有10 mL樣品環管之低壓喷射閥（lJpchurch， CIL Cluzeau，Sainte-Foy-La-Grande，France)向管柱中引入 樣品。隨後以遞減模式泵送水性移動相。流速為2 mL/min 且轉速為1200 rpm。藉由配備有製備型流動池（6 内部 體積’路徑長度為2 mm)之Dionex UVD 170S偵測器（在 M=220 nm下）控制流出物偵測。藉由pharmacia Superfrac 收集器（Uppsala，Sweden)收集洗提份（2 mL )。在室溫 52 201212991 (22±1°C )下進行實驗。 分析 於配備有P 5 8 0泵、A SI -1 〇 〇自動注射器、s TH管柱烘 箱及UVD340S二極體.陣列偵測器及具有安全防護 (Phenome.nex，France)之 Jupiter Proteo 90A ( 250 mm><4_6 nrn内徑’ 4 μιη粒徑）管柱的定製Di〇nex Summit HPLC系 統上執行洗提份定量。以梯度模式用溶劑A : 〇，1 %三氟乙 酸之ΗζΟ溶液及溶劑Β : 〇,〇9%三氟乙酸之Ch3cN溶液執 行洗提（對於梯度曲線參見下文）。流速為1 mL/min。uv 偵測波長固定在220 nm。管柱烘箱之溫度設為4〇〇c。層析 數據處理由Chromeleon軟體6.0.1版進行。 梯度： 時間（分鐘） %Α %Β 0 ' 85 15 30 55 45 55 45 36 85 15 40 85 15 樣品：2,5 mg/mL，於 AcOH/水（1:1，v/.v)中 注射體積：40 μΐ 4、l3C、COSY (關聯光譜法）、HSQC (異核單量子關 聯）及HMBC (異核多鍵關聯）NMR實驗於CDC13中執行。 其於 Bruker ( Wissembourg，France) Avance+DRX 500 光譜 儀（在500 MHz下，且13C在125 MHz下）上記錄。 1二肽純化 對如下五種二肽之混合物研究以離子交換置換模式進 53 201212991 行肽混合物之CPC純化之方法的效率：甘胺醯甘胺酸 (GG )、甘胺醯酪胺酸（GY )、丙胺醯酪胺酸（AY )、白胺醯 纈胺酸（LV )及白胺醯酪胺酸（LY )。 於管柱中引入20 mg至200 mg各肽。 此等肽具有範圍為6_08至6.1 (根據EMBOSS)之極接 近之專電點’表明其在相同pH下帶同種電荷。然而，此等 肽覆蓋自極具極性之G G至極具非極性之LV及LY的大的 「極性」範圍。GY及AY為具有中等極性之肽，此外，在·結 構觀點上其亦極接近。此混合物可研究該方法根據極性以 及分子結構之選擇性。 GG ( >99%)及 GY ( >99%)購自 Bachem ( Bubendorf， Switzerland)。AY ( >99%)、LV ( >99%)及 LY ( >99%)購 自 TCI Europe ( Zwijndrecht，Belgium )。 執行狀混合物之純化 *第一次，在無置換模式下洗提（此方法不為本發明之 標的之一部分，且在本文中作為比較實施例提出），此方法 據證明為低效的（實施例1 _6 );且 *第二次，根據本發明，在離子交換置換模式下洗提， 此方法為成功的（實施例7-38 )。 研究離子交換置換模式以辟定CPC純化之最佳實驗條 件。 研究如下參數，諸如： *陽離子置換劑濃度（實施例7- 1 〇 )， *陰離子交換劑濃度（實施例11-16)， 54 201212991 *陽離子置換劑類型（實施例1 7-22 ) ’ *陰離子交換劑去質子化之狀態（實施例2 3 ) ’ *CPC管柱之分區（實施例24-26 )， *作為第二陽離子置換劑之H+之濃度（實施例27-30 ) ’ 及 *陽離子保留劑及陰離子交換劑之用途（實施例 31-38)〇 1.1洗提模式 此方法不為本發明標的之一部分，且以下實施例在本 文中作為比較實施例提出。 實施例1 溶劑系統為 MtBE/n-BuOH/乙酸/水（1:4.5:1.5:6，v/v)。 管柱之轉速為1〇〇〇 rpm。 流速為4 m L / m i η。 洗提為遞減模式。 狀質量為103.8.mg。 固定相保留為60%。 回收之產物：98% 肽甘胺醯甘胺酸（GG )自肽混合物分離。 肽甘胺醯酪胺酸（GY )與丙胺醯酪胺酸（AY )未分離。 肽白胺醯纈胺酸（LV )與白胺醯酪胺酸（LY )未分離。 實施例2 溶劑系統為 MtBE/n-BuOH/CH3CN/含 1% TFA的水 (2:2:1:5，v/v )。 55 201212991 管柱之轉速為1000 rpm ° 流速為3 mL/min。 洗提為遞減模式。 狀質量為100.2 mg。 固定相保留為65%。 回收之產物：5 8 % .肽GG自肽混合物分離。 肽GY與AY未分離。 未自管柱回收到肽LV及LY。 實施例3 溶劑系統為MtBE/n-BuOH/CH3CN/含1% TFA的水 (2:2:1:5，v/v )。 管柱之轉速為10〇〇 rpni。 流速為3mL/miri。 以雙重模式（遞減，隨後遞增）+洗提。 肽質 $為114.21118。 固定相保留為65%。 回收之產物：88% 狀GG自肽混合物分離。 肽GY與ay未分離。 未自管柱完全回收肽LV及LY。 實施例4 溶劑系統為MtBE/n-BuOH/CH3CN/含 1% TFA的水 (3:1:1:5，v/v )。 56 201212991 管柱之轉速為1000 rpm。 流速為 3 mL/min。 以雙重模式（遞減，隨後遞增）洗提。 肽質量為1 08.3 mg。 固定相保留為65%。 ， 回收之產物：9 5 % 肽GG與GY未分離（GY與GG混合）。 · 肽GY與AY未分離。 肽LV與LY未分離。 實施例5 溶劑系統為 MtBE/n-BuOH/CH3CN/含 1% TFA的水 (3 :1:1: 5，v/v )。 · 管柱之轉速為900 rpm。 流速為 3 mL/min。 洗提為遞減模式。 肽質量為l〇7.2mg。 固定相保留為65%。 回收之產物：99% 肽GG與GY未分離（GY與GG混合）。 肽GY與AY未分離。 肽LV與LY未分離。 實施例6 溶劑系統為 MtBE/n-BuOH/CH3CN/含 1% TFA的水 (2:2:1:5，Wv)，隨後 MtBE/n-BuOH/CH3CN/含 1% TFA 的 57 201212991 水（3:1:1:5，v/v) I柱之轉速為1000 rpm。 流速為3 mL/min。 洗钕為遞減模式。 肽質量為100.3 mg。 固定相保留為66%。 回收之產物：9 7 % 肽GG與Gy分離。 肽GY與ay未分離。 肽Lv與LY未完全分離。 無離子交換置換之洗提模式不為所 CPC純化的選擇，因為未發現使：⑽合物 意之溶劑系統。 種肽之間的分離令人 Ι·2離子交換模式 Ι·2·1置換劑濃度 溶劑系統為 MtBE/CH3CN/n-BuOH/水（2:1:2:5，Wv)。 離子父換劑DEHPA濃度為46.5 mM，且由三乙胺部分 去質子化（5，1 5 % )。 DEHPA/肽比率為丨6 6。 置換劑為HC1。 洗提為遞減模式。 官柱之轉速為1200 rpm。 流速為2 mL/min。 實施例7 58 201212991 HC1濃度為1 mM。 固定相保留為74%。 肽GG、GY及AY分離。分離很缓慢（200分鐘 未自管柱回收到肽LV及LY。 實施例8 HC1濃度為5 mM。 固定相保留為75%。 肽GG分離。 肽GY與AY未完全分離。 未自管柱完全回收肽LV及LY。 實施例9 HC1濃度為20 mM。 固定相保留為75%。 肽GG分離。 肽GY與AY未分離。 自管柱回收到肽LV及LY，但其未分離。 實施例10 HC1濃度為10 mM。 固定相保留為74%。 肽GG分離。 肽GY與AY未分離。 自管柱回收到肽LV及LY，但其未分離。 1.2.2交換劑濃度 v/v ) ° 溶劑系統為 MtBE/CH3CN/n-BuOH/水（2:1:2:5， 59 201212991 離子交換劑為DEHPA。 置換劑為HC1 ( 10 mM)。 洗提為遞減模式。 管柱之轉速為1200 rpm。 流速為2 mL/min。 實施例Π DEPHA 濃度為 30 mM。 DEHPA/肽比率為10.7。 固定相保留為74%。 肽GG分離。 肽GY與AY未分離。 肽LV與LY未分離。 實施例12 DEPHA 濃度為 20 mM。 DEHPA/肽比率為7.1。 固定相保留為75%。 肽GG分離。 肽GY與AY未完全分離。 肽LV與LY未完全分離。 實施例13 DEPHA 濃度為 10 mM。 DEHPA/肽比率為3.6。 固定相保留為73%。 肽GG分離。 60 201212991 肽GY與AY未完全分離。 肽LV與LY未完全分離。 實施例14 DEPHA濃度為5 mM。 DEHPA/肽比率為1.8。 固定相保留為73%。 肽GG與GY未完全分離。 肽GY與AY未分離。 肽LV未完全分離。 實施例15 DEPHA 濃度為 15 mM。 DEHPA/肽比率為5·4。 固定相保留為73%。 分離良好。 實施例16 DEPHA濃度為2 mM。 DEHPA/肽比率為0.72。 固定相保留為73%'。 無分離。 1.2.3置換劑類型 溶劑系統為 MtBE/CH3CN/n-BuOH/水（2:1:2:5，v/v)。 離子交換劑為DEHPA ( 1 5 mM )。 DEHPA/肽比率為5.4。 洗提為遞減模式。 61 201212991 管柱之轉速為1 200 rpm。 流速為2 mL/min。 實施例17 置換劑為 CaCl2 ( 1.44 mM)。 第二置換劑為HC1 ( 10 mM)。 實驗操作時間為230分鐘。 固定相保留為72%。 實施例1 8 置換劑為 CaCl2 ( 1.44 mM)。 第二置換劑為HC1 ( 10 mM)。 實驗操作時間為180分鐘。 固定相保留為72%。 圖3呈現實施例1 8之層析譜。 實施例19 置換劑為 CaCl2 ( 5_4 mM )。 第二置換劑為HC1 ( 10 mM)。 實驗操作時間為230分鐘。 固定相保留為73%。 實施例2 0 置換劑為MgCl2 ( 5 mM)。 第二置換劑為HC1 ( 10 mM)。 實驗操作時間為250分鐘。 固定相保留為74%。 實施例21 62 201212991 置換劑為MnCl2 ( 5 mM，隨後50 mM )。 第二置換劑為HC1 ( 50 mM )。 實驗操作時間為2 5 0分鐘。 固定相保留為74%。 實施例22 置換劑為KC1 ,( 1 〇 mM，隨後5〇 mM )。 第二置換劑為HC1 ( 50 mM)。 貫驗操作時間為250分鐘。 固定相保留為7 5 %。 對於各實驗，肽GY與AY充分分離。 對於各實驗，肽LV與LY需要HC1來洗提。 1.2.4去質子化交換劑 確定去質子化交換劑之百分比對CPC純化二肽GG、 GY及LV之影響。 〇£1^八以5.15%'8%、13%、180/〇及33%去質子化。 結果提供於圖4中。 田父換劑去質子化至3〇%時，展現肽Lv萃取有所改良。 實施例23 溶劑系統為 MtBE/CH3CN/n-Bu〇H/水（2:1:2:5，v/v)。 離子交換劑為DEHPA (丨5 mM，由三乙胺33%去質子 化）。 置換劑為 CaCl2 ( 1.44 mM )。 在達成平衡狀態之後ίο分鐘添加CaCh。當固定相不 吕柱輸入口於官柱中泵送移動相（開始純化之後34 63 201212991 分鐘）而被迫離開管柱（在管柱輸出口）時，達成平衡片大 態。 第二置換劑為HC1 ( 10 mM)。 在回收到肽GY之後30分鐘添加HC1 (在開始純化之 後7 1分鐘）。 洗提為遞減模式。 管柱之轉速為1200 rpm。 流速為2 mL/min。 固定相保留為76%。 肽LV與LY分離。 1.2.5 分區之CPC管柱 溶劑系統為 MtBE/CH3CN/n-BuOH/水（2:1:2:5，v/v)。 離子交換劑為DEHPA(15mM，由三乙胺5·15%或33% 去質子化）。 置換劑為 CaCl2(1.44mM)。 第二置換劑為HC1 ( 10 mM)。 洗提為遞減模式。 管柱之轉速為1200 rpm。 流速為2 mL/min。 實施例24 將管柱分成兩部分： 自輸入口至管柱中央之前半部分（100 mL)，其含有 以5.15%去質子化之交換劑， 自吕柱中央至輸出口之後半部分（1〇〇 mL)，其含有 64 201212991 以33%去質子化之交換劑。 固定相保留為72%。 在達成平衡狀態之後10分鐘添加’ CaCh (在開始純化 之後4 5分鐘）。 在回收到肽GY之後30分鐘添加HC1 (在開始純化之 後1 0 5分鐘）。 肽GY與AY分離。 肽LY與LY未完全分離。 實施例25 將管柱分成兩部分： *自輸入口至管枉前四分之一之前半部分（5〇 mL ),其 含有以5.15%去質子化之交換劑， *自管柱前四分之一至輸出口之後半部分（丨5〇爪乙）， 其含有以33%去質子化之交換劑。 固定相保留為76%。 在達成平衡狀態之後10分鐘添加CaCh (在開始純化 之後4 5分鐘）。 在回收到肽GY之後30分鐘添加Ηα (在開始純化之 後1 0 5分鐘）。 肽GY與AY分離。 肽LV與LY未分離。 實施例26 將管柱分成兩部分： .*自輸入口至管柱前四分之一之前半部分（5〇ml〇，其 65 201212991 含有以33%去質子化之交換齊|丨， *自管柱前四分之一至輸出口之後半部分（15〇 mL)， 其含有以5.1 5 %去質子化之交換劑。 固定相保留為76%。 在達成平衡狀態之後1 〇分鐘添加CaCl2 (在開始純化 之後4 5分鐘）。 在回收到肽GY之後30分鐘添加HC1 (在開始純化之 後105分鐘）。 肽GY與AY分離。 肽LV與LY幾乎分離。 Ι·2·6 HC1 濃度 溶劑系統為 MtBE/CH3CN/n-BuOH/水（2:1:2:5，ν/ν)。 離子交換劑為DEHPA ( 1 5 mM ) 置換劑為 C a C12 ( 1.4 4 m Μ )。 第二置換劑為HC1。 洗提為遞減模式。 官柱之轉速為1200 rpm。 速為 2 mL/miri。 實施例27 DEHPA由三乙胺5.1 5%或33%去質子化。 將管柱分成兩部分： *自輸入口至管柱前四分之一之前半部分（5〇mL)，其 含有以33%去質子化之交換劑， *自管柱前四分之一至輸出口之後半部& ( 15〇社）， 66 201212991 其含有以5 .1 5%去質子化之交換劑。 HC1濃度為5 mM。 固定相保留為76%。 實施例28 DEHPA由三乙胺5 15%或33%去質子化。 將管柱分成兩部分： :50 mL)，其 (150 mL )， *自輸入口至管柱前四分之一之前半部分 含有以3 3 %去質子化之交換劑， *自官柱前四分之一至輸出口之後半部分 其含有以5.15%去質子化之交換劑。 HC1 ;辰度為 2,5 mM。 固定相保留為77%。 肽LV與LY分離。 實施例29 DEHPA由三乙胺5.15%或33〇/〇去質子化。 將管柱分成兩部分： :50 mL)，其 (150 mL)， *自輸入α至管柱前四*之一之前半部分 含有以33%去質子化之交換劑， *自管柱前四分之一至輸出口之後半部分 其含有以5.15%去質子化之交換劑。 HC1濃度為3.5 mM。 固定相保留為77%。 肽LV與LY幾乎分離。 實施例3 0 67 201212991 0丑1^八由三乙胺5.15%去質子化。 HC1濃度為2.5 mM。 固定相保留為77%。 肽LV與LY未分離。 圖5呈現實施例27、28及29之層析譜。 1.2.7陰離子置換劑及陽離子交換劑 藉由於溶劑系統中添加鹼使溶液pH值穩定至8。肽呈 陰離子形式。純化混合物含有肽GG、GY、AY、LV。 洗提為遞減模式。 管柱之轉速為1 200 rpm。 流速為2 mL/miii。 實施例31 溶劑系統為 AcOEt/n-BuOH/水（3:2:5，v/v)。 離子交換劑為aliquat( 27.7 mM)，aliquat為四級銨鹽， 其炫·基鏈為C8 (辛基）與CIQ (癸醯基）鏈之混合物，其中 C 8占主導地位。 AHquat/肽比率為1〇。 置換劑為 Nal ( 13.85 mM )。 所用鹼為三乙胺。 固定相保留為72%。 系統不穩定，未達成純化。 實施例3 2 〉谷劑系統為 AcOEt/n-BuOH/EtOH/水（1:3:1:5，v/v )。 離子交換劑為aliquat ( 27.7 mM)。. 68 201212991

Aliquat/肽比率為10 〇 置換劑為 Nal ( 1 3.85 mM )。 所用鹼為三乙胺。 固定相保留為72%。 系統不穩定，未達成純化。 實施例33 溶劑系統為 AcOEt/n-BuOH/水（3:2:5，v/v)。 離子交換劑為aliquat ( 27·7 mM )。

Aliquat/肽比率為10。 置換劑為 Nal ( 13.85 mM)。 所用鹼為NH4OH。 固定相保留為73%。 肽LV分離。 肽GG、GY及AY未分離（未保留在管柱中）。 實施例3 4 溶劑系統為 AcOEt/n-BuOH/水（3:2:5，v/v)。 離子交換劑為aliquat ( 5 5.4 mM )。

Aliquat/肽比率為20。 置換劑為Nal ( 27.7 mM)。 所用鹼為NH4OH。 固定相保留為74%。 肽LV.分離。 肽GY與AY未分離。 肽GG未保留在管柱中。 69 201212991 實施例3 5 v/v ) ° 溶劑系統為 AcOEt/n-BuOH/水（3:2:5 ’ 離子交換劑為aliquat ( 83 _ 1 mM )。 Aliquat/肽比率為30。 置換劑為 Nal ( 41.55 mM )。 所用鹼為NH4OH。 固定相保留為72%。 肽GG與GY分離。 肽GY與AY未分離。 肽AY與LV未分離。 肽GG未完全保留在管柱中。 實施例36 v/v ) ° 溶劑系統為 AcOEt/n-BuOH/水（2:3:5， 離子交換劑為aliquat ( 83 · 1 mM )。 Aliquat/肽比率為30。 置換劑為 Nal ( 41.55 mM )。 所用鹼為ΝΉ4ΟΗ。 固定相保留為72%。 未達成純化。 實施例37 v/v ). 0 溶劑系統為 AcOEt/n-BuOH/水（4:1:5， 離子交換劑為aliquat ( 83.1 mM )。 Aliquat/肽比率為30。 置換劑為 Nal ( 41.55 mM)。 70 201212991 所用鹼為nh4oh。 固定相保留為7 3 %。 未達成純化。 實施例38 溶劑系統為AcOEt/丙酮/水（3:2:5，v/v)。 離子交換劑為aliquat ( 83.1 mM )。

Aliquat/肽比率為30。 置換劑為 Nal (41.55 mM)。 所用鹼為NH4OH。 固定相保留為74%。 未達成純化。 藉由使用陰離子置換函丨月嗒祕ν > μ 及陽離子父換劑之離子交換模 ^•'之CPC純化二肽混合物效率不佳。 11 植物萃取物純化 儘官苜稽作為飼料植物之商業價值很低，但經由萃取/ 乾燥獲得之產物可用於化妝品、營養藥劑或治療領域。 精由離子交換置換模式cpc層析純化三㈣同首稽植 物萃取物： *來自苜㈣液之蛋白質（實施例39-45)， 目猜葉η素蛋白之水解物（實施例46_49 )，及 來自苜辖白色蛋白初& 尺解物之二肽（實施例50-53 )。 U.1苜蓿漿液 苜蓿漿液可根據以下方 ^ ^ 乃在獲付，3亥方法包含以下步驟： -研磨且壓製苜蓿，雜 心件油餅及綠色汁液。 71 201212991 -用NH4OH調節綠色汁液之pH值至約7.5-8，藉由添 加水蒸汽加熱至約85°C之溫度。 -隨後離心。離心可獲得兩種產物：蛋白質之濃縮物及 苜蓿漿液。 所用苜蓿漿液為預先分級分離之PEP-1 5，其為濃苜蓿 聚液。苜稽毁液 PEP-15 由 Agro Industrie Recherche et Developpement ( ARD ) ( Route de Bazancourt, 5 1110 POMACLE, FRANCE)慷慨提供。 該漿液具有以下特徵： 乾物質（DM) (%) ： >93% 總氮物質（Νχ6.25) (%DM) : 20%±2 礦物質 (%DM) : 26%±2 總糖（蔗糖型） (%DM) : 13% 土 1 總纖維 (%DM) ： <5% 自由有機酸（乳酸當量） (%DM ) : 8% 土 C/N比率 :11 ± 1 pH (10%溶液）：5.8 土 肽分佈（％ )為： >10310 道爾頓（dalton) 0.3 1140-10300 道爾頓 4.5 350-1140道爾頓 44.5 130-350道爾頓 34.6 < 130道爾頓 16.1 72 201212991 胺基酸圖為： 丙胺酸 精胺酸 天冬胺酸 胱賤酸 麩胺酸 甘胺酸 組胺酸 異白胺酸 白胺酸 . 離胺酸 曱硫胺酸 苯丙胺酸 脯胺酸 絲胺酸 蘇胺酸 色胺酸 酷胺酸 纈胺酸 總計（g/16 g N) 3.58 1.77 12.07 0.95 5.82 2.34 0.95 1.81 2.82 2.48 0.38 2.00 2.96 2.82 2.53 0.86 1.53 2.39 由於各部分之氮至蛋白質的轉化因子未知，故胺基酸 組成以g/16gN表示。若使用習用轉換因子或6.25,則g/i6 g N等效於g/i〇〇 g蛋白質。 在藉由本發明之+ 齡15猶級分離。藉由在:法分級分離之前，預先將 脂安百來XAD-丨6上通過來广W—ch之芳族樹 來移除…濃难所=移除多'。隨後藉由用丙㈣殿 聚液。 夜，冷束乾燥且形成所用苜稽 73 201212991 針對不同洗提模式研究純化苜蓿漿液之最佳溶劑系 統： *無置換模式之CPC (實施例39 )(此方法不為本發明 標的之一部分’且在本文中作為比較實施例提出）， *PH區帶精製置換模式CPC (實施例40 )(此方法不為 本發明標的之一部分’且在本文中作為比較實施例提出）， 及 *根據本發明之離子交換置換模式CPC (實施例4 1 )。 藉由在離子交換置換模式下洗提之CPC·來達成苜蓿激 液純化（實施例42-45 )。 在不同溶劑系統中測試苜精踱液之可溶性。用少量溶 劑樣品（總體積2 mL )及少量產物（例如1 mg )在藥丸盒 (pillbox)中操作實驗。藉由TLC (薄層層析）檢驗苜蓿漿 液肽之可溶性。 11.1.1 洗提模式 此方法不為本發明標的之一部分，且以下實施例在本 文中作為比較實施例提出。 典型溶劑系統 Arizona ( Pauli，G. F·; Pro, S. M; Friesen, J. B., Countercurrent Separation of Natural Products. Journal /Voi/wcb 2008, 7/ (8)，1489-1508 )或丙酮（Maciuk， A. Nouvelles methodologies en chromatographie de partage liquide-liquide sans support solide: Application a l'isolement de substances naturelles. These de doctorat, Universite de Reims Champagne Ardenne，Reims，2005 )研究失敗。 74 201212991 實施例39 研究藉由CPC純化肽之典型極性溶劑系統： n-BuOH/乙酸/水（4,3:1，4:4,3，v/v) 產物保留於水 相中，

AcOEt/CH3CN/水（4:2:4，Wv )產物保留於水相中， n-BuOH/Ι-丙醇/水（4:2:4，v/v) 產物保留於水相 中， n-BuOH/EtOH/水（5 :2:6 ’ v/v ) 1/5 之產物遷移至有 機層，4/5保留於水相中， n-BuOH/水（1:1，v/v ) 產物保留於水相中， 異丁烷/水（1:1，v/v ) 產物保留於水相中。 玄洗k模式不為c P C純化苜蓿漿液肽之選擇，因為未 發現令人滿意之溶劑系統。 Π.1.2 pH區帶精製模式 此方法不為本發明標的之一部分，且以下實施例在本 文中作.為比較實施例提出。 pH區帶精製模式為cpc純化經保護肽之典塑方法。 實施例4 0 研究以下溶劑系統：

MtBE/n-BuOH/水（4:1:5，v/v) 酸性條件：產物保留於水相中 驗性條件：產物保留於水相中

MtBE/n-Bu〇H/CH3CN/水（2:2:1:5，v/v) 酸性條件：產物保留於水相中 75 201212991 驗性條件：產物保留於水相中

MtBE/n-BuOH/CH3CN/水（3:1:2:3，v/v) 酸性條件：產物保留於水相中 產金性條件：產物保留於水相中 pH區帶精製模式不為cpc純化苜蓿漿液肽之選擇，因 為未發現令人滿意之溶劑系統。 ΙΙ·1·3 離子交換模式 此方法為本發明之一部分。 實施例41 研究以下溶劑系統： n-Bu〇H/乙酸/水（4:1:4,5，ν/ν) 交換劑：雙（2-乙基己基）磺酸基丁二酸鈉（ΑΟΤ ); 在有機相中萃取到肽。 A.c〇Et/CH3CN/水（6:11:11，ν/ν) 交換劑：雙（2-乙基己基）磺酸基丁二酸鈉（ΑΟΤ ); 在有機相中萃取到少量肽。 n-Bu〇H/EtOH/水（5:2:6，ν/ν) 交換劑：DEHPA ; 在有機相中萃取到肽。

AcOEt/n-BuOH/EtOH/水（1:3:1:5，ν/ν) 交換劑：DEHPA ; 在有機相中萃取到肽。

AcOEt/n-BuOH/EtOH/水（1:3:1:5，ν/ν) 交換劑：ΑΟΤ ; 76 201212991 當使用大量過量AOT時，在有機相中萃取到肽。 MtBE/n-BuOH/CH3CN/水（2:2:1:5，’ ν/ν) 交換劑：DEHPA ; 在有機相中萃取到肽。 離子交換模式適合於CPC純化苜蓿漿液肽’適宜溶劑 系統為 AcOEt/n-BuOH/EtOH/水（1:3:1:5，ν/ν)及 MtBE/n·

BuOH/CH3CN/水（2:2:1:5，v/v)。 II.1.4離子交換模式CPC純化 此方法為本發明之一部分。 溶劑系統為 MtBE/CH3CN/n-BuOH/水（2:1:2:5，v/v )。 親脂性離子交換劑為DEHPA (磷酸雙（2-乙基己基） 酯），且置換劑為CaCl2。 洗提為遞減模式。 管柱之轉速為1200 rpm。 bu·速為 2 rnL/min。 實施例4 2 離子交換劑DEHPA濃度為3 1.3 mM，DEHPA由三乙胺 部分去質子化（5,1^%)。 置換劑CaCl2濃度為3 mM。 在用CaC】2第一次置換之後引入第二置換劑HC1(濃度 2 0.9 m Μ ) 樣品質量為5 13.5 mg。 DEHPA/肽比率為5 4。 固定相保留為74%。 (：： 77 201212991 肽分離產率為29%。 實施例43 離子交換劑DEHPA濃度為29.5 mM，DEHPA由三乙胺 部分去質子化（2,15%)。 置換劑CaCl2濃度為2.83 mM。 樣品質量為5 6 1.8 m g。 DEHPA/肽比率為5.4。 固定相保留為75%。 肽分離產率為2+9%。 實施例4 4 離子交換劑DEHPA濃度為88.5 mM，DEHPA由三乙胺 部分去質子化（2,15%)。 置換劑CaCl2濃度為8.48 mM。 樣品質量為562.9 mg。 DEHPA/肽比率為16.2。 固定相保留為75%。 肽分離產率為63%。 實施例4 5 離子交換劑DEHPA濃度為72 mM，DEHPA由三乙胺 部分去質子化（33%，隨後5,15%)。 置換劑CaCl2濃度為6.9 mM。 樣品質量為503.7 mg。 DEHPA/肽比率為32。 固定相保留為74%。 78 201212991 月太分離產率為91%。 葉二素蛋白CPC純化之濃縮水解物 蛋白貝葉黃素濃縮物為牛飼料中所 方法之產物。此嘖 之工業音蓿去水 ^ 此/辰細物由嗜熱菌蛋白酶水解。 /辰縮水解物純化藉由以下執行 *在無置制式下洗提之CPC(實 不為本發明庐认 ；Ό 4 / U此方忐 出)，及 的之-部分，且在本文中作為比較實施例提 根據本發明之在離子交換置換模式下洗提之CPC (實 施例 4 8 - 4 9 )。 工1.2·1洗提模式 此方法不為本發明標的之一部分，且以下實施例在本 文中作為比較實施例提出。 官柱之轉速為1000 rpm。 流速為3 mL/min。 實施例4 6 溶劑系統為MtBE/CH3CN/n-BuOH/含1% TFA的水 (2:1:2:5，Wv )。 洗提為遞增模式。 樣品質量為500 mg。 固定相保留為.70%。 未達成純化。洗提份未完全確定。 實施例47 溶劑系統為n-BuOH/乙酸/水（4:1:5，v/v)。 79 201212991 洗提為雙重模式，遞増隨後遞減。當層 時（約在實驗2小時之後），將洗提模式逆轉。回到基線 樣品質量為508.9 mg。 固定相保留為75%。 之濃 未達成純化。洗提份未完全確定。 無離子交換置換之洗提模式對於CPC純化 縮水解物不具有足夠選擇性。

黃素蛋白 ΙΙ·2·2離子交換模式 此方法為本發明之一部分。 溶劑系統為 MtBE/CH3CN/n-Bu〇H/水（2:1:2:5，ν/ν) 管柱之轉速為1200 rpm。 流速為2 m L / m i η。 洗提為遞減模式。 實施例48 離子交換劑DEHPA濃度為26.7 mM。 交換劑由三乙胺部分去質子化（5，15〇/〇 )。 置換劑CaC丨2濃度為2.56mM。 在用CaC〗2第一次置換之後引入第二置換劑hci (濃度 1 7.8 mM )。 樣品質量為509.9 mg。 固定相保留為74%。 回收之產物：96% 實施例49 離子交換劑DEHPA濃度為36 mM。 80 201212991 又換劑由三乙胺部分去質子〖（33%，隨後5, ”％ )。 置換劑CaCl2濃度為3.45 mM。 在用CaCl2第一次置換之後引入第二置換劑hc 5.99 mM)。 樣品質量為25 1.8 mg。 固定相保留為7 5 %。 回收之產物：99% Π.3離子交換模式之類鸦片二肽CPC純化 粗物質為苜稽白色蛋白水解物及該水解物之超濾液。 以:實施例.（實施例50_53)之目標在於藉由在離子交 、置奐模式下洗提之cpc來純化或選擇性富集—種含有對 血管緊張素轉化酶（ACE)具有抑制能力之二肽vw (綠胺 醯色胺酸）的洗提份。此方法為本發明之一部分。 粗萃取物之HLPC層析圖呈現於圖6中。 /合劑系統為 MtBE/CH3CN/n-BuOH/水（2:1:2:5，v/v)。 ’柱之轉速為1 200 rpm。 速為 2 mL/rnin。 洗提為遞減模式。 父換劑由三乙胺部分去質子化（30%，隨後2,1 5% )。 實施例50 離子交換劑DEHPA濃度為94.4 mM。 置換劑CaCl2濃度為9 mM。 在用CaCL第一次置換之後引入第二置換劑HC丨（濃度 15.5 mM，然後 3〇 7 mM)。 81 201212991 粗物質為蛋白質水解物。 樣品質量為254.9 mg。_ DEHPA/肽比率為42。 固定相保留為75%。 回收之產物：1〇〇% 實施例51 離子交換劑DEHPA濃度為11 ·2 mM。 置換劑CaCl2濃度為1.06 mM。 在用CaCl2第一次置換之後引入第二置換劑HC1 (濃度 1.85 mM，然後 2.78 mM )。 粗物質為蛋白質水解物。 樣品質量為254.6 mg。 DEHPA/肽比率為5。 固定相保留為76%。 回收之產物：iOQO/o 實施例52 離子交換劑DEHPA濃度為33.6 mM。 置換劑CaCl2濃度為3.18 mM。 在用CaC〗2第一次置換之後引入第二置換劑(濃度 7.5 m Μ )。 粗物質為蛋白質水解物。 樣品質量為252.9 mg。 OEHPA/肽比率為1 5。 固定相保留為7 5 %。 82 201212991 回收之產物：100% 實施例5 3 離子交換劑DEHPA濃度為33.6mM。 置換劑CaCl2濃度為3.1 8 mM。 在用CaCh第一次置換之後引入第二置換劑hci (濃度 7.5 mM )。 粗物質為蛋白質水解物超濾液。 樣品質量為250.1 mg。 DEHPA/狀比率為15。 固定相保留為74%。 回收之產物：1〇〇〇/0 實施例53中獲得之含有所要二肽VW之洗提份的 HLPC層析圖呈現於圖7中。 III 肽純化 藉由CPC進行本文中稱作.SF328 (德魯考肽 (dirucotide ))之肽 H-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-OH 的純化。 SF 328 為多發性硬化症治療（http://en.wikipedia.org/wiki/ Dirucotide)中之活性藥物。 III.1.肽合成 III.1.2肽組裝 SF328藉由固相肽合成以預裝載之Fm〇c_Thr(tBu)-

Wang樹脂（3026 g ; 0.7 mmol/g)為起始物進行組裝。 使用用於Fmoc/tBu合成策略之經適合保護之胺基酸： 83 201212991

Fmoc-Asp(tBu) ' Fmoc-Glu(OtBu) > Fmoc-Asn(Trt) ' Fmoc-Pro、Fmoc-Val、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Phe、Fmoc-Lys(Boc)、 Fmoc-Ile、Fmoc-Thr(tBu)及 Fmoc-Arg(Pbf)。 對於所有胺基酸，胺基酸過量為1.5當量，除使用2 5 當量過量之[Fmoc-Thr(tBu)]14以外。 偶合步驟： 經保護之胺基酸藉由在室溫下使用兩種試劑偶合。 其完成藉由茚滿三酮（凱撒（Kaiser))測試加以確定。 胺基酸1至1 3、1 5及1 6藉由連續添加以下偶合： -含 HOBt ( 430 g)之 DMF ( 7060 ml) -DIC ( N，N’-二異丙基碳化二亞胺）（498 ml) • 1小時之後第二次添加DIC ( 498 ml ) -PyBop (苯并三唾-〗·基-氧基三吼咯啶基鎮六氟磷酸 鹽）（1104.3 g)’僅在第二次添加DIC後未完全偶合之情況 下（1%性凱撒測試）。 而[Fm〇C-Thr(tBu)] 14藉由依次添加以下試劑偶合： -HOBt ( 143.3 g) -含TBTU ( 0-(苯并三唑基）_N，N，N,，N，四曱基铖四 ㈣酸鹽)( 1 703.3 g)之DMF(J1甲基甲酿胺)( 376(}ml) -1小時之後第二次添加含TBTU ( 1703 3 g)之dmf (3760ml) '含 TBTU ( 68 l·3 g)之 DMF ( 1880 ml)，僅在第二次 添加TBTU後未完全偶合之情況下（陽性凱撒測試） 各偶合步驟之後，各用18156 ml DMF洗務狀-樹脂8 84 201212991 二欠。

Fmoc保護基去除步驟：

Fmoc保護基去除步驟藉由在宮、、田丁 /古田工仏# /外秸田隹至，皿下使用兩種基於哌 之混合物執行。 對於胺基酸4至17，Fm〇c保護基藉由使用ΐ8ΐ56如 由含5〇/〇哌。定、1% DBU、89% 〇經及5% ΒτΜΑα (氯化笨 甲基三甲基錄）之曱醇構成之混合物裂解。反應之完成藉 由NIR (近紅外線光譜法）藉由量測反應混合物令卿（二 苯富烯（dibenz〇fulvene))含量之穩定性來監控。 對於胺基酸1至3，Fmoc保護基藉由使用18156⑹由 20〇/♦定及80% 〇] M H〇Bt^ DMF溶液組成之混合物裂 解。 各Fmoc裂解之後，各用18156如〇河1?洗務肽樹脂8 次。 當肽完全組裝時，用DMF (8次，18156加）及DCM (二氯曱烷）（6次，18156 ml)洗滌肽樹脂。隨後在25ι下， 在真空（約20毫巴（mbar))下乾燥直至恆重（9〇55 g)。 產率：96.8%。 III.1.2全部保護基去除 在稅拌的同時’向由TIS (三異丙基石夕院）（2.7L)、水 (2.7L)及TFA(l〇3.2L)構成之經冷卻混合物（1(rc)中 逐步添加經乾燥肽樹脂（9055 g )。 在樹脂添加結束時，將溫度設為2〇t且攪拌懸浮液3 小時。 85 201212991 過濾懸浮液且用53.4 L裂解混合物洗滌樹赌3次。 在減壓下蒸發經合併之濾液直至殘餘體積為約27 L。 .將此濃溶液傾倒於經冷卻（7°C)之二異丙峻（89 L) 中以使粗SF328沈澱。 儘快過濾沈澱物且用二異丙醚洗滌7次（每次約1 3 L )。 在不超過3(TC之溫度下在真空（約20毫巴）下乾燥粗 SF328 直至恆重（4.l71Kg)。 產率：68°/。；純度：86% 111 · 1 ·狀純化 考慮SF328之肽性質，研究洗提模式與置換模式。尤 其開發了離子交換模式，因為近期研究展示該模式對肽純 化之效率。 評估肽SF 328之溶劑分配且藉由以下進行純化： *在無置換模式下洗提之CPC (實施例54 )(此方法不 為本發明標的之一部分，且在本文中作為比較實施例提 出），及 *根據本發明之在離子交換置換模式下洗提之CPC (實 施例 5 5-60 ) 〇 86 201212991

SF328粗樣品（CPC純化之前）之HPLC 編號 Ret.時間 min 高度 mAU 面積 mAU*min 1 6,22 6,190 1,733 2 7,44 3,740 1,169 3 8,17 7,021 1,115 4 9,15 5,168 1,970 5 9,82 2,897 1,265 6 10,69 3,625 1,157 7 11,85 24,743 4,392 8 12,24 3,411 0,456 9 13,45 2,055 1,211 10 13,92 10,529 1,212 11 14,41 1,654 0,411 12 15,39 2,715 0,287 13 16,44 3,763 1,477 14 18,59 11,926 16,488 15 20,03 50,395 18,179 16 20,31 76,029 24,494 17 21,00 1704,101 631,812 18 22,10 51,556 24,684 19 24,41 10,677 2,134 20 26,05 3,331 0,768 21 26,86 2,527 0,501 22 27,88 14,733 2,537 23 29,82 4,569 0,958 知計： 2007,354 740,410

Rel.面積 %_ '0^3 0,16 0,15 0,27 0,17 0,16 0,59 0,06 0,16 0,16 0,06 0,04 0,20 2,23 2,46 3,31 85.33 3.33 0,29 0,10 0,07 0,34 0,13 1^00 相關HPLC譜圖呈現於圖8中。 ΠΙ.3在無置換模式下洗提 此方法不為本發明標的之一部分，且以下實施例在本 文中作為比較實施例提出。 兩相溶劑系統之選擇 .藉由TLC於不同兩相溶劑系統中評估SF328之分配係 數在洗知模式下，需要相關化合物之KD值位於0.2與5 之間（較佳為約1 )。 87 201212991 SF328 之 KD 評估 兩相溶劑系統 上層相 下層相 KD BuOH/乙酸/水（4:1:5，v/v) + +++ 一般 BuOH/乙酸/水（5:1:4，v/v) + ++++ 不良 MtBE/CH3CN/BuOH/含 1% TFA 的水（2:1:2:5，v/v) ++ ++ 良好 MtBE/CH3CN/水（2:2:3，v/v) - +++ 不良 MtBE/CH3CN/水（3:2:5，v/v) ++ +++ 一般 CPC操作 實施例54 僅測試系統 MtBE/CH3CN/Bu〇H/含 1% TFA 的水 (2:1:2:5，v/v)。實驗條件為： 轉速：1 300 rpm。 注射之樣品：1 0 0 m g。 洗提模式：遞增。 流速：8 ml/min。 此系統造成SF328降解。

藉由洗提純化之SF328樣品的HPLC 編號 Ret.時間 min 高度 mAU 面積 mAU* min Rel·面積 % 1 5,97 3,210 2,480 0,31 2 8,56 2,296 1,524 0,19 3 8,95 5,440 0,468 0,06 4 9,59 2,498 0,890 0,11 5 11,10 2,560 2,643 0,33 6 15,60 2,958 6,451 0,81 7 21,21 746,514 451,896 56,80 8 23,78 423,808 329,246 41,38 總計： 1189,284 795,600 100,00 相關HPLC譜圖呈現於圖9中。 III.4在離子交換置換模式下洗提 88 201212991 此方法為本發明之—部分。 純化參數 :5，v/v ) ° -乙基己基） 浴劑系統為 MtBE/CH3CN/BuOH/水（2:1:2 親脂性離子交換劑為DEHPA (磷酸雙（2 酯）’且置換劑為CaCl2。 交換劑由三乙胺部分去質子化（5,15%)。 洗提為遞減模式。 管柱之轉速為1200 rpm。 k 速為 2 mL/min。 CPC操作 實施例55 離子交換劑DE.HPA濃度為1.5 mM。 置換劑CaCl2濃度為0.14 mM。 樣品質量為104.4 mg。 不添加置換劑。 22%，純度 la fraction) 回收之產物：19 mg (產率75%，回收率 89%)。 產率總體上質量平衡 回收率為洗提份令之SF328 ( SF328 pur de Λ主射之 SF328 (SF328 purinject6)之比率

溶劑消耗：對於固定相，200 mL 對於移動相，140 mL。 生產力12.6毫克/小時。 實施例56 89 201212991 肖子交換齊1 DEHPA濃度為15 mM。 置換劑CaCl2濃度為“賴。 樣品質量為101.4mg。 不添加置換劑。 回收之遂斗 . 純度 .30 mg (產率50%，回收率35%，

合齊丨'肖耗：對於固定相，200 mL 對於移動相，1 40 mL。 生產力2 0毫克/小時。 實施例5 7 離子交換劑DEHPA濃度為3〇 mM。 置換劑CaCl2濃度為2 8 mM 樣品質量為99.8 mg。 j成平衡狀態之後18分鐘添加 ^官枝輸入口於管柱中菜送移動相而被迫離開 "輪出口）B寺，達成平衡狀態。 回收之產物：30 mg (產率85 5〇/〇， 94%) 0 回收率36%， 不再 (在 純度

/容劑消耗：對於固定相，2〇〇 mL 對於移動相，1 80 mL。 生產力15毫克/小時。 實施例58 離子交換劑DEHPA濃度為3〇 mM。 置換劑CaCl2濃度為2.8 mM。 90 201212991 樣品質量為98.2 mg。 達成平衡狀態之後5分鐘添加置換劑。 回收之產物：27 mg (產率1 〇〇%，回收率33%，純度 97%) 〇

溶劑消耗：對於固定相，2〇〇 mL 對於移動相，180 mL。 生產力1 3 · 5毫克/小時。

經純化SF3 28肽之HPLC 編號 ·_ _ Ret._ 間 min 1 2 7,55 10,89 3 13,94 4 5 6 16,35 20,58 21,03 L ~~~---- 高度 面積 Rel.面積 mAU__mAU* min__%_ 4,6〇5 0,536 〇,〇6 1，〇13 0,098 〇〇! 5,579 0,708 0:08 1，〇7〇 0,299 〇〇3 89,052 21,635 2,47 2086,473 853,423 97.34 2187,79 f 876,700 ~ ι〇〇?〇〇 相關HPLC譜圖呈現於圖1 〇中。 實施例59 離子交換劑DEHPA濃度為60 mM 置換劑CaCMj|度為5.6mM。 樣品質量為197.5 mg 達成平衡狀態 回收之產物： 98% )。 之後5分鐘添加置換劑 80 mg (產率96%，回收率48%，純度 '合蜊消耗.對於固定相，200 mL· 對於移動相，160 mL。 91 201212991

生產力44.4毫克/小時。 經，純4匕SF328月大之HPLC 編號 1 2 3 4 5 6 緦計：

Ret·時間 min8^1 9,69 11,47 13,71 17,36 18,68 20,94

高度 mAU 面積 mAU* min 9 6 4 16 6 3, 7 8 2 2 5 828 ο 2 8 9 9 ο02

Rel·面積 % 1,501 1,474 0,498 1,014 0,725 0,232 434.085 0,34 0,340,11 0,23 0,16 0,05 08 1048,085 439,528 100,00 相關HPLC譜圖呈現於圖U中。 藉由NMR光谱法分析此實驗中獲得之肽sF328 (參見 圖1 2及圖13 )。 實施例60 離子交換劑DEHPA濃度為12〇 mM。 置換劑CaCl2濃度為ll.i mM。 樣品質量為405.5mg。 達成平衡狀態之後5分鐘添加置換劑。 回收之產物：204.1 mg (產率94%，回收率6〇%，純度 98%) 〇

溶劑消耗：對於固定相，2〇〇 mL 對於移動相，160 mL。 生產力11 3.4毫克/小時。 實施例61 離子交換劑DEHPA濃度為300 mM » 92 201212991 置換劑CaC!2濃度為27 8囊。 樣品質量為1.0043 g。 達成平衡狀態之後5分鐘添加置換劑。 回收之產物：586.9 mg (產率_%，回收率69%，純 度 97% )。

浴削靖粍：對於固定相，2〇〇mL 對於移動相，160 mL。 生產力320.2毫克/小時。 【圖式說明】 、 為表不在引入基質時CPC管柱内進行之置換方法 的流程。其表；A A & 1 1 、。s柱中引入置換劑之前，從而在藉由 離子，換置換模式進行之任何純化之前進行的工序。 :圖刀成編號為0纟3之四個時序，其由代㈣ 官柱中引入基質前 , 、 "間的t = 0起始。時間單位為任意 勺且不反映任何種類之 ni ^ 1史用時間早位夂性不同連續 4 ’以瞭解置換方法。 个丨J連項 官柱由自—個池之底部連接至 池（在真實rpr - 個池之頂部的六個 具貫CPC官柱中為數千個） 示藉由CPC之鏈表不。黑色箭頭表 管桎h 之離心場。白色箭頭表干自 Μ主輸入口向管柱輸出口㈣移動相之方向。·^表不自 池中填為灰色之上部表示固定相 表示移動相。 见中未填色之下部 保留劑由白色圓盤表示。 在本發明之實施例中，認為 貝s有二種不同欲純化 93 201212991 之欲純化產 產物。欲自基質純化之產物由三種三角形表示， 黑色三角形表示對交換劑具有強親和力 物 物 灰色三角形表示對交換劑具有中等親和力 之欲純化產 物

白色三角形表示對交換劑具有低親和力之欲純化I 交換劑由白色正方形表示。 相對離子由白色星形表示。 在/ =()時，咖管柱之各池填充有平衡之固定相及移 動相。保@劑.交換劑」離子對溶解於固^相中。 古雜ΓΓ1時，向管柱中引入欲純化產物。對交換劑具有 =7之欲純化產物與交換劑形成離子對。❹劑自固 疋相鹽析至移動相中，且斑 ^ 、父換劑具有高親和力之欲純 化產物之相對離子形成離子對。 固定等及低親和力之欲純化產物不溶解於 動相中且洗提至下=與交換劑形成離子對。其保留於移 在t - 2時’對交換劑 第二池中與交換劑形成離子：。:和力之欲純化產物在 動相中，且與對交換劑中呆留劑自固疋相鹽析至移 對離子形成離子對。、 #親和力之欲純化產物之相 對交換劑具有低親和 中，因為其不能與交換❹，屯化產物不溶解於固定相 /成離子對。其保留於移動相中 94 201212991 且洗提至下一池。 一、 _寻對交換劑具有低親和力之欲純化產物在第 。又換知丨形成離子對。保留劑自固定相鹽析至移動 相中’且與對交換劑具有低親和力之欲純化產物之相對離 子形成離子對。 所有欲純化產物均與交換劑形成離子對’作因其對交 換劑之不同親和力而在不同池中。 多力相僅S有「保留劑_相對離子」離子對，其不可溶 於固定相且向管柱輪出口洗提。 :2為表示在弓丨入置換劑時cpc管柱内進行之置換方 法的*程。其表不已如目1中所述向管柱中引入之欲純化 、物藉由離子交換置換模式純化之方式。_ 2中所述之方 法在如圖1中所述^欲純化產物之後進行。 ^ 。玄圖分成編號為〇至4之五個時序，其由表示向Cpc “主中引入置換劑之前之時間的t = 〇開始。 所用％間單位、管柱表示方法及符號如圖1中所述。 置換劑由黑色圓盤表示。 ^在藉由置換模式純化期間連續引入置換劑。因此，對 T序在官柱輸入口向管柱中引入置換劑。 在t = 〇時，CPC管柱之各池填充有平衡之固定相及移 動相。「欲純化產物_交換劑」離子對存在於鄰接於管枉輸入 口之池中。在所有欲純化產物中，對交換劑具有最強親和 力之產物在距輸入口之第一個池中。在所有欲純化產物 中對父換劑具有最低親和力之產物在距輸入口么含有「欲 95 201212991 純化產物·交換劑」離子對的最後一個池中。 ”他池在固定相中含有「保留劑·交換劑」離子對。 此時間對應於圖1之時間t = 3。 在1 1時，向皆柱中引入置換劑。置換劑與交換劑形 ^離子對。在所有欲純化產物中，對交換劑具有最強親和 產物瓜析於移動相中，與置換劑之相對離子形成離子 對’且洗提至下一池。. 在t = 2時，向管柱中引入置換劑。距輸人口之第一個 池的固定相已含有「置換劑_交換劑」離子對，從而新引入 之置換劑不溶解於固定相中 τ 1示V於移動相中且洗提至下 一池。 ^所有欲純^物中，對交換劑具有最㈣和力 .產物中，對錢劑具有中等心所有欲純化 .且與對交換劑且有最二 產物鹽析至移動相中 中… 力之產物（在所有欲純化產物 ^目―’離子形成離子對。此離子對洗提至下一池。 第-個Γ3時’向管柱中引入置換劑。距輸入口之第一及 第一個池之固定相会右「 弟及 池之f 奐Μ·交換劑」離子對。第—個 移動相含有「置換劑相對離子」離子對。 -在所有欲純化產物中，對交換 m距輸入口之第二個池的移動之產 對離子.形成離子冑，且洗提至下―；也。 -置換劍之相 在所有欲純化產物中，對交換劑 物溶解於距輸入口之第三個池的固定相Γ 之產 的U疋相中’且與交換劑形 96 201212991 成離子對。 在所有欲純化產物中，+ μ + β Α τ對父換劑具有最低親和力之產 物鹽：於距輸入口之第三個池的移動相中，與對交換劑具 有中等親和力之產物（在所有欲純化產物中）的相對離子 形成離子對，且洗提至下一池。 _在t 4日寸’向官柱中引入置換劑。距輸入口之第—及 第二個池之固定相含有「置換劑.交換劑」離子對。第一及 第二個池之移動相含有「置換劑相對離子」離子對。 在所有欲純化產物中，拟士 ^對父換劑具有最強親和力之 物溶解於距輸入口之第二伽4从巾 成離子對。 之弟—個池的固定相中’且與交換劑形 在所有欲純化產物中，對交換劑具有中等親和力之產 士乱 第一個池的移動相中，與對交換劑罝 有最強親和力之產物（在所古 、^ 在所有欲純化產物·中）的相對離子 形成離子對，且洗提至下—池。 在所有欲純化產物中，斜上^ ^ W 1父換劑具有最低親和力之產 物溶解於距輸入口之第四個 產 成離子對。 的固疋相中，且與交換劑形

距：入口之第四個池的固定相中所含之保留 移動相中’且與對交換劑具有最低親和力 J 欲純化產物中）的相對離/ 所有 離子」離子對向管柱輸出口洗Γ 保留劑相對 圖3為藉“ CPC管柱輸 錄之化合物的洗提曲線。橫座標表示進行：:::广 v谓挪時之洗提時

S 97 201212991 間，且縱座標表示偵測峰之相對強度。 如實施例18令詳述，向cpc管柱中引入五種二肽之混 合物。圖3表示在CPC管桎輸出口該五種肽之回收。 .五個區域塗有陰影，久主- λ 各表不不同化合物。自洗提曲線 之左側至右側，此等區域為·· 標記為GG之第一/¾ #主-> zj· /» 3丨心 匕或表不在純化引發之後約2 5分鐘 至約4 2分鐘範圍内進杆的_ r,从於* 逆仃的—肽GG (甘胺醯甘胺酸）之回 收。 為GY之第—區域表示在純化引發之後約μ分鐘 至約75分鐘範圍内進行的二肽gy (甘胺醯酪胺酸）之回 收。 標記為AY之第三區域表示在純化引發之後約75分鐘 至約1〇2分鐘範圍内進行的二肽Αγ (丙胺酿赂胺酸）之回 收。 '. 么標記為LV之第四區域表示在純化引發之後約丨42分鐘 至为152分鐘範圍内進行的二肽LV (白胺醯纈胺酸）之回 為LV之第五區域表示在純化引發之 分鐘範圍内進行的二狀LV(白胺酸.绳胺酸）= 圖4為表不二肽於有機相或水相中之可 水相中$六4 ^ ^ ^ 交換劑之父ί俐的去質子化百分比變化的圖。橫座標表示 座枳_負子化百分比，該橫座標自〇漸變為30%。縱 不在有機相與水相之間的分配係數，該等縱座標自〇 98 201212991 漸變為1。 此圖上標出三條曲線，各表示二肽。 第一條曲線為含黑色菱形之實線。此曲線表示二肽甘 胺醯甘胺酸。 第二條曲線為含灰色正方形之實線。此曲線表示二肽 甘胺醯酪胺酸。 第三條曲線為含灰色三角形之實線。此曲線表示二肽 白胺醯纈胺酸。 圖5表示藉由在Cpc管柱輸出口在2丨5 nm下偵測uv 記錄之化合物的洗提曲線。橫座標表示進行偵測時之洗提 时間’且縱座標表示偵測峰之相對強度。 該洗提曲線標出三條不同曲線。各曲線表示一實驗之 洗提曲線。 在實施例27、28及29中詳述之條件下向cpc管柱中 引入五種—肽之混合物。圖5表示對於此等實驗中每一者， 在C P c 才主輸出口該五種肽之回收。 上部之曲線表示實施例42中所得之洗提曲線，其中 HC1遭度為2.5mM。 中間之曲線表示實施例43中所得之洗提曲線，i HC1濃度為3.5mMe 八 下部之曲線表示實施例44中所得之洗提曲線，直 HC1濃度為5 mM。 ^ …圖6為白色苜蓿蛋白水解物之HPLC層析圖。橫座標表. 可留寺間（分！童），I縱座標表示每之相對強度（相對單 99 201212991 位）。 以黑線表示之HPLC層析圖曲線在215 nm波長下記 錄，且以灰線表示之HPLC層析圖曲線在28〇 nm波長下記 錄。 層析圖上彳示出對應於二肽Vw (結|胺醯色胺酸）之峰。 圖7為白色苜蓿蛋白水解物之HPLC層析圖。橫座標表 示吓留時間（分知），且縱座標表示峰之相對強度（相對單 位）°層析圖在215 nm波長下記錄。 以黑線表示之HPLC層析圖曲線表示藉由cpc純化之 洗提份’其富含相關二肽（。 以灰線表示之HPLC層析圖曲線表示在藉由cpc純化 之前的粗白色苜蓿蛋白水解物。 圖8為肽SF328粗萃取物之HpLC層析圖。橫座標表 示滯留時間（分鐘且縱座標表示峰之相對強度（相對單 位）。層析圖在220 nm波長下記錄。 圖9為肽SF328粗萃取物在根據實施例54，藉由洗提 模式之CPC純化之後的HPLC層析圖。橫座標表示滯留時 間（分鐘），且縱座標表示峰之相對強度（相對單位）。層 析圖在220 nm波長下記錄。（比較實施例） 曰 圓10為肽SF328粗萃取物在根據實施例58,藉由離子 交換模式之CPC純化之後的HPLc層析圖。橫座標表示滞 留時間（分鐘），且縱座標表示峰之相對強度（相對單位）。 層析圖在2 2 0 n m波長下記錄。 圖11為肽SF328粗萃取物在根據實施例59，藉由離子 100 201212991 % 交換模式之CPC純化之後的HPLC層析圖。横座和 你衣不滯 留時間（分鐘），且縱座標表示峰之相對強度（相對單位）。 層析圖在220 nm波長下記錄。 圖12為狀SF328之質子NMR譜。橫座標表示信號之 化學位移（ppm )。 圖 13 為肽 SF328 之 COSY NMR 譜。c〇SY NMR 譜表 月一名圖中之分子之質子間的關聯。在該圖之上側及左 側，再次提供肽SF328之質子NMR譜（參見圖12)，且下 側及右侧表示化學位移。 谱圖上之各點表示兩個質子之間的關聯。 【主要元件符號說明】 益 101 201212991 序列表 <110〉中央國家研究科學爭會（Centre National de la Recherche Scientifique) 斯大卓（Universite de Reims Champagne-Ardenne) 备沙股份公司（Lonza AG) <120> 兩性產物的純化，或可被轉化為兩性產物的產物的純化 <130> I0B 10 BK LON SIXC <160〉 1 <170〉 Patentln 3.5版 列 Τ工 ▲17叩人 <210> <211〉 <212> <213> <220〉 <223〉合成肽 <220〉 <M1> 胜肽 <222> (1)..(17)

<400〉 I

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg 1 5 10 15

Thr

Claims (1)

1. 201212991 七申凊專利範圍： 、l一種離心分配層析在離子交換置換模式中之用途，其 用：實施自含有至少一種欲純化產物之基質純化該至少一 種奴純化產物的方法，該欲純化產物為兩性產物。 2·如申請專利項之離心分配層析 置換模式中之用途，其中該基質包含於層析混合物中，該 層析混合物亦含有溶劑混合物、至少一種置換劑、至少一 種交換劑及至少—種保留劑。 3·如申請專利範圍第i項或第2項中任—項之離心分配 層析：離子交換置換模式中之用冑，其中該欲純化產物為 至少-種蛋白質或一種肽或肽衍生物，尤其經保護肽，或 為至v —種天然或非天然、經保護或未經保護之胺基酸。 4.如申請專·圍第2項或第3項中任—項之離心分配 層析在離子交換置換模式中之用$，其中該至少一種置換 劑及該至少-種保留劑為陽離子型，且該至少—種交換劑 為陰離子型。 5·如申請專利範圍第2項或第3項中任一項之離心分配 層析在離子交換置換模式中之用途，丨中使用數種置換劑 及一種交換劑。 6. 如申請專利範圍第2項或第3項中任一項之離心分配 層析在離子交換置換模式中之用途，其中一種置換劑及一 種交換劑以各種去質子化百分比使用，且該等去質子化百 分比尤其自1 %至50%變化。 7. 如申請專利範圍第2項至第6項中任一項之離心分配 201212991 層析在離子交換置換模式中之用途，其中數種置換劑及一. 種交換劑以各種去質子化百分比使用。 8_ —種藉由離心分配層析在離子交換置換模式中自基 質純化至少一種欲純化產物之方法，該欲純化產物為兩性 產物， 其中該方法包含： 至少一個旋轉離心分配層析管柱之步驟該管柱包 含含有該基質、兩相溶劑混合物、至少—種置換劑、至 少一種交換劑及至少一種俤留劑之層析混合物， 該兩相溶劑混合物由兩個不可混溶相構成，一個相 為固定相且另一個相為移動相，及 至少-個料該水性移動相穿過該管柱達足以純化 該欲純化產物之時間的步驟， 回收呈經純化形式之# s ^ 巧孓s亥至少一種欲純化產物之步 驟。 9.-種藉由離心分配層析在離子交換置換模式中自基 質純化至少-種欲純化產物之方法，該欲純化產物為兩性 產物， 其中該方法包含： 至少一個旋轉離心分配層 ^增析管柱之步驟，該管柱包 含含有該基質、兩相溶劑混人 相成合物 '數種置換劑、一種交 換劑及至少一種保留劑之層析混合物， 該兩相溶劑混合物由兩 阿個不可混溶相構成，一個相 為固定相且另一個相為移動相，及 2 201212991 至少一個泵送該水性移動相穿過該管柱達足以純化 該欲純化產物之時間的步驟， 回收呈經純化形式之該至少一種欲純化產物之步 驟。 10·—種藉由離心分配層析在離子交換置換模式中自基 質純化至少一種欲純化產物之方法，該欲純化產物為兩性 產物， 其中該方法包含： 至少一個旋轉離心分配層析管柱之步驟，該管柱包 含層析混合物，其含有該基質、兩相溶劑混合物、以各 種去質子化百分比使用之一種置換劑及一種交換劑，該 等去質子化百分比尤其自1%至5〇%變化、及至少一種保 留劑， 該兩相溶劑混合物由兩個不可混溶相構成，一個相 為固定相且另一個相為移動相，及 至少一個泵送該水性移動相穿過該管柱達足以純化 該欲純化產物之時間的步驟， 回收呈經純化形式之該至少一種欲純化產物之步 驟 11.一種藉由離心分配層析在離子交換置換模式中自基 質純化至少-種欲純化產物之方法，該欲純化產物為兩性 產物， 其中該方法包含： 至少一個旋轉離心分配層析管柱之步驟，該管柱包 201212991 含層析混合物，其含有該基 置換劑及一種交換劑，其中 各種去質子化百分比使用， 1%至50%變化， 質、兩相溶劑混合物、數種 一種置換劑及一種交換劑以 該等去質子化百分比尤其自 «亥兩相洛劑，¾合物由兩個不可混溶相構成，一個相 為固定相且另一個相為移動相，及 至^個栗送该水性移動相穿過該管柱達足以純化 該欲純化產物之時間的步驟， 回收呈經純化形诖夕# , 心式之该至少一種欲純化產物之步 驟0 12.如申請專利範圍第8項至第1〇項中任一項之方法， 其中該至少一種欲純化產物為蛋白質，且該蛋白質含有 1000至100個胺基酸，較佳1〇〇〇至3〇〇個胺基酸較佳 500至100個胺基酸，較佳1〇〇〇至5〇〇個胺基酸，較佳5〇〇 至300個胺基酸，較佳300至1〇〇個胺基酸， 或其中該至少一種欲純化產物為肽或肽衍生物，尤 其經保護肽，或為天然或非天然、經保護或未經保護之 胺基酸。 13. 如申請專利範圍第8項至第U項中任一項之方法， 其中該至少一種欲純化產物含有少於約8〇%極性胺基酸， 較佳少於約70%極性胺基酸’較佳少於約極性胺基酸， 較佳少於50%極性胺基酸。 14. 如申請專利範圍第8項至第12項中任一項之方法， 其由2至5種不同溶劑構成，較佳3種不同溶劑，尤其4 201212991 » 種不同溶齊||，且士、盆甘士 .，„ 尤其其中水及正丁醇為構成該兩相溶劑混 合物之溶劑中之兩者；且尤其 其中該兩相溶劑混合物中所含之溶劑之一為極性小 醇之，劑，諸如貌烴、乙酸乙醋、氯化溶劑、親 曰f酗、親脂性酮、親脂性醚；或 其中該兩相溶劑混合物，所含之溶劑之-為鱼h2〇 及正丁醇均可混溶之溶劑，諸如歹醇、乙醇、丙醇、乙 腈、丙_。 15.如申請專利範圍第8項至第13項中任一項之方法， 其中該兩相溶劑混合物含有以下四種溶劑·· 水，及 、2及正丁醇均可混溶之溶劑，諸如甲醇、乙醇、 乙暗、丙酮，及 ._ 正丁醇，及 極性小於正丁醇之溶劑，諸如烧煙、乙酸乙酿、氣 化溶劑、親脂性酿、親脂性_、親脂性醚。 16·如申請專利範圍第8項至第14項中任一項之方法， ^該至少-種交換劑為陰離子型，且該保留劑為陽離子 17.如申請專利範圍第8項至第15項中 其中該至少一種交換劑為烷A 之方法， 、誠&基化磷酸衍生物，尤其DEHpA。 18·如申請專利範圍第8項至第16項中任 其中該至少一種置換劑為陽離子型。 方法， 19·如申請專利範圍第8項至第 項之方法， 201212991 其包含： 於該離心分配層析管柱中引入該有機固定相之步 驟，該有機固定相包含至少一種交換劑及至少—種保留 劑，及 —種欲純 於該離心分配層析管柱中引入該含有至少 化產物之基質的步驟，及 於該離心分配層析管柱中引入該水性移動相之步 驟’該移動相包含至少—種置換劑，及 泵送該水性移動相穿過該離心分配層析管杈以使該 至少一種欲純化產物可穿過該管柱移動之步驟及 回收呈經純化形式之該等欲純化產物中至少—者之 步驟， 該管柱在引入該基質至回收呈經純化形式之該等欲 純化產物中至少一者期間處於旋轉狀態。 20.如申請專利範圍第8項至第17項中任一項之方法， 其包含： ' 於該離心分配層析管柱中引入該有機固定相之步 驟，該有機固定相包含一種交換劑及至少一種保留劑， 及 於該離心分配層析管柱中引入該含有至少一種欲純 化產物之基質的步驟，及 於該離心分配層析管柱中引入該水性移動相之步 驟，該移動相包含數種置換劑，及 泵送該水性移動相穿過該離心分配層析管杈以使該 6 201212991 至少一種欲純化產物可穿過該管柱移動之步驟，及 回收呈經純化形式之該等欲純化產物中至少一者之 步驟， 该管柱在引入該基質至回收呈經純化形式之該等欲 純化產物中至少一者期間處於旋轉狀態。 21. 如申請專利範圍第5項至第12項中任一項之方法， 其包含： 於該離心分配層析管柱中引入該有機固定相之步 驟’該有機固定相包含各種去質子化百分比之一種置換 劑及一種交換劑，該等去質子化百分比尤其自1%至5〇% 變化，及至少一種保留劑，及 於該離心分配層析管柱中引入該含有至少一種欲純 化產物之基質的步驟，及 於該離心分配層析管柱中引入該水性移動相之步 驟’該移動相包含至少一種置換劑，及 泵送該水性移動相穿過該離心分配層析管柱以使該 至少一種欲純化產物可穿過該管柱移動之步驟，及 回收呈經純化形式之該等欲純化產物中至少一者之 步驟， »亥ί柱在引入成基質至回收呈經純化形式之該等欲 純化產物中至少一者期間處於旋轉狀態。 22. 如申請專利範圍第8項至第17項中任一項之方法， 其包含： 於該離心分配層析管柱中引入該有機固定相之步 7 201212991 驟’該有機固定相包含各種去質子化百分比之一種置換 劑及一種交換劑，該等去質子化百分比尤其自。至5〇% 變化，及至少一種保留劑，及 於S亥離心分配層析管柱中引入該含有至少—種欲純 化產物之基質的步驟，及 於該離心分配層析管柱中引入該水性移動相之步 驟，該移動相包含數種置換劑，及 泵送該水性移動相穿過該離心分配層析管柱以使該 至少一種欲純化產物可穿過該管柱移動之步驟，及 回收呈經純化形式之該等欲純化產物中至少一者之 步驟， 該·管柱在引入該基質至.回收呈經純化形.式之該等欲 純化產物中至少一者期間處於旋轉狀態。 23‘如申請專利範圍第8項至第21項中任一項之方法， 其包含： 至少一個引發離心分配層析管柱之該旋轉之步驟， 該管柱包含分離混合物，其包含該兩相溶劑混合物、該 至少一種保留劑、該至少一種交換劑、可能存在之該基 質及可能存在之該至少一種置換劑， 其中該離心分配層析管柱包含： 一端之輪入口，於適當時間在此處於該管柱中引入 水相與有機相、該保留劑、該交換劑、可能存在之該基 質及可能存在之該置換劑，及 另一端之輸出口 ’在此處自該管柱回收該有機固定 201212991 相、該水性移動相、該保留劑、該交換劑、可能存在之 呈經純化形式之該等欲純化產物及可能存在之該置換 劑，及 其中該置換離心分配層析方法可在該離心分配層析 管柱内形成2 i 2n+3個區域，且其中n為欲自該基質純 化之該等不同產物之數目： 可此存在之鄰接於该官柱輸出口之頭部區域，該頭 部區域包含溶解於該固定相中之該保留劑及該交換劑， 可能存在之鄰接於該管柱輸入口之尾部區域，其中 該尾部區域包含「置換劑-交換劑」離子對， 位於該頭部區域與該尾部區域之間《在分別不存在 尾部區域或頭部區域時位於該管柱之該輪人口與該輸出 口之間的中心區域， 其中該等中心區域之數目介於2〇+1範圍内， 其中 ^該等中心區域區域為最接近於該管 輪出口或在存在該頭部區域時鄰接於該頭部區 埤，且 在該等“區域中’最末中心區域為最接近於該管 域，\^在存在該尾部區料轉_尾部區域之區 其中，該等中心區域各彼此獨 人 少一加「一 巴含或不包含至 個「父換劑-欲純化產物」離子對， 即 只要至少一個中心區域包含至少-種欲純化產物 201212991 可， 該等欲純化產物中至少一者較佳位於不含其他 化產物之中心區域中 該η種欲純化產物較佳各位於不含其他欲純化產物 之中心區域中。 24. 如申請專利範圍第8項至第21項中任一項之方法， 其中該置換離心分配層析方法可在該離心分配層析 管柱内形成2η+2個區域，且其中4欲自該基質純 化之該等不同產物之數目，該等區域由以下組成： 鄰接於該管柱輸出口之頭Αβρά , , Α J< 项0丨4匕域，該頭部區域包含 溶解於該®定相中之該保留劑與該交換劑及 位於該頭部區域與該管柱輸出口之間的中心區域， 其中 該等中心區域之數目介於1至2Π+1範圍内， 在該等中心H域中’第―中心區域為最接近於該管 柱輸出口之區域，且 在該等中心區域中，界士 + r-, 场肀最末中心區域為最接近於該管 柱輸入口之區域。 25. 如申請專利範圍第8 jg 51 TS上 矛β項至第23項中任一項之方法， 其中該置換離心分配屉奴t ,土 狀 0層祈方法可在該離心分配層析 管柱内形成n+2至2n+3個F . 個£域，且其中η為欲自該基質 純化之該等不同產物之數目 9 忒寺區域由以下組成： 鄰接於該管检輸出口之 <頌。P 域，该頭部區域包含 溶解於該固定相中之马·仅&立，& ΤD哀保留劑與該交換劑，及 10 201212991 鄰接於該管柱輸入口之尾部區域’其中該尾部區域 ^ 3置換劑-交換劑」離子對，及 位於邊頭部區域與該尾部區域之間的中心區域， 其中 该等中心區域之數.目介於1至2n+l範圍内， * ^等中^區域中，該第一中心區域為最接近於該 管柱輸出口之區域，且 *在該等中心區域中，該最末t心區域為最接近於該 管柱輸入口之區域。 26.如申請專利範圍第8項至第24項中任一項之方法， 其包含： 於該離心分配層析管柱中引入該有機固定相之步 驟.，該冑機固定才目包含至少—種交換劑及至少、一種保留 劑’且s亥有機相包含以下四種溶劑： 少於該有機相體積之1 5 ◦/〇的水， 體積此例小於5G%之與h2〇及正丁醇均可混溶之溶 劑，諸如甲醇、乙醇、乙腈、丙_，及 正丁醇（5至90%，v/v)，及 極性小於正丁醇之溶劑（5至9〇% v/v)，諸如烷烴、 乙酸乙酯、氣化溶劑、親脂性酯、親脂性酮、親脂性醚， 及 於該離心分配層析管柱中引入該包含至少一種欲純 化產物之基質的步驟，及 於該離心分配層析管柱中連續引入該水性移動相之 201212991 步驟’該水性移動相 夕助相包含以下三種溶劑： 水，及 與ha及正丁醇均可混溶之溶劑，諸如甲醇、乙醇、 乙腈 '丙酮或其混合物，及 可能存在之正丁醇，及 極丨生小於正丁醇之溶劑，諸如烧烴、乙酸乙酯、氯 化冷劑、親脂性酯、親脂性酮、親脂性醚， 在S亥水性移動相中連續引入至少一種置換劑，及泵 送該包含該至少一種置換劑之水性移動相穿過該離心分 配層析管柱以使該至少一種欲純化產物可穿過該管柱移 動的步驟，及 在該管柱輪出口連續回收呈經純化形式.之該等欲純 化產物中至少一者之步驟， 其中該管柱連續轉動、在該麥相中連續引入至少一 種置換劑及連續泵送該水相穿過該管柱被維持， 该連續回收步驟在於該管杈輸出口回收到第一中心 批次時引發。 27.如申請專利範圍第8項至第2S項中任一項之方 其包含： '’ 於該離心分配層析管柱中引入該有機固定相之步 驟，該有機固定相包含至少一種交換劑及至少一種保^ 劑，且該有機相包含：乙腈、正丁醇、MtBE及痕量水， 及 ， 於該離心分配.層析管柱中 弓丨入該包含欲純化之肽或 12 201212991 肽衍生物、尤其欲純化之SF 328之基質的步驟，及 於該離心分配層析管柱中連續引入該水性移動相之 步驟，且該水性移動相包含水、乙猜、正丁 MtBE， 艮 S ，在該水性移動相中連續引入至少一種置換劑，及泵 圮,亥。3 -亥至v 一種置換劑之水性移動相穿過該離心； 配層析管柱以使該至少-種欲純化產物可穿過該管柱移 動的步驟，及 官柱移 在該管柱輸出π連續回收呈經純化形式之該欲吨化 之肽或肽衍生物、尤其該欲純化之冗328之㈣， 其m柱連續轉動、在該水相中連續引人至 種置換劑及連續系送該水相穿過該f柱被維持， 該連續回收步驟在於該管柱輸出σ回收 、、 批次時引發。 r〜 28.如申請專利範圍第5項至第26項中任一項 其中 $ <方法， 於該離心分配層析管柱中連續引入該水性移動相之 … 連續引入至少-種置換劑之該步驟 重锼2至4個循環， 鄉 該等循環之數目足以回收所有該等欲純化產物， 其中'，對於指定循環，所用置換劑不同 中所用之置換劑，j_可形成親Η ▲ 、先别循％ 該η〜、了$成親和力两於該管柱中保留之 χ 乂換劑_欲純化產物」離子對中至少一去 的「保留劑-交換劑」離子對， 遭和力 13 201212991 以使各循環可在該管柱輸出口回收至少一個批次， 其包含呈經純化形式保留於該管柱中之該等欲純化產物 中的至少一者。 八、圖式. (如次頁） 14