TW201217523A - Single-strand nucleic acid molecule for controlling gene expression - Google Patents

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TW201217523A TW100124393A TW100124393A TW201217523A TW 201217523 A TW201217523 A TW 201217523A TW 100124393 A TW100124393 A TW 100124393A TW 100124393 A TW100124393 A TW 100124393A TW 201217523 A TW201217523 A TW 201217523A
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201217523 六、發明說明： 【韻~明戶斤屬之_相厅々貝】 技術領域 本發明有關於一種抑制基因表現之單股核酸分子、含 有其之組成物及其用途。 t ^tr Ί 背景技術 就抑制基因表現之技術而言，舉例來說，已知有RNA 干擾(RNAi)(非專利文獻1)。rNA干擾所致之抑制基因表 現，舉例而言，一般是藉由將短雙股之RNA分子投予細胞 等來實施。前述雙股RNA分子通常被稱為siRNA(small interfering RNA)。此外，有報告指出，透過屬環狀RNA分 子且因分子内黏著（anneal)而部分形成雙股之RNA分子，亦 可抑制基因表現(專利文獻1)。然而，在此等手法中，誘導 抑制基因表現之RNA分子具有如下述般之問題。 首先，製造前述siRNA時’必須具備一先分別合成出正 意股及反意股，最後使此等股進行雜交之步驟。因此而有 製造效率不佳之問題。此外，將前述siRNA投予細胞時，必 須在抑制朝單股RNA解離之狀態下投予至細胞，因此其處 理條件之設定亦需煞費勞力。其次，在環KRNA分子之狀 況下’還有其合成甚是困難之問題。 先行技術文獻 專利文獻 【專利文獻1】日本特開2008-278784 201217523 非專利文獻 【非專利文獻1】法伊亞氏等(Fire，et al)，Nature第391 卷，p.806-81 1，1998年。 C 明内】 發明概要 於此本發明之目的在於提供一種可抑制基因表現之 新賴核酸分子，_酸分子可容易並且效率良好地進行製 造。 為了達成則述目的，本發明之單股核酸分子含有抑制 目標基因表現之抑制表現序列’其特徵在於：從5,端側至3, 端側，依序含有5,端側區域(xc)、内部區域(2)及3,端側區 域(Yc) ’前述内部區域(z)係由内部5’端側區域(X)及内部3’ 端側區域(Y)連結所構成，前述5,端側區域(Xc)與前述内部 5’端側區域(X)互補，前述3,端側區域(Yc)與前述内部3,端 側區域(Y)互補’並且前述内部區域、前述5,端側區域(XC) 及前述3’端側區域(Yc)中之至少一者含有前述抑制表現序 列0 本發明之組成物係用以抑制目標基因表現之組成物， 其特徵在於含有前述本發明之單股核酸分子。 本發明之組成物為藥學組成物，其特徵在於含有前述 本發明之單股核酸分子。 本發明之抑制表現方法係抑制目標基因表現之方法， 其特徵在於使用前述本發明之單股核酸分子。 本發明之疾病治療方法之特徵在於：包含將前述本發 4 201217523 _ %之單股紐分子投予患者之㈣，前料股核酸分子具 有抑制基因表現之序列作為前述前述抑制表現序列，且該 序列為前述疾病之成因。 右依本發明之單股核酸分子，則可抑制基因表現，且 因非呈環狀’其合成甚容易，又因屬單股，而無需雙股之 黏合步驟，可效率良好地進行製造。 另，本發明之單股核酸分子結構可抑制基因表現一 事，乃由本案發明人所首先發現者。本發明之單股核酸分 子之抑制基因表現效果雖推測係因與111^八干擾之相同現象 所致’但本發明中之抑制基因表現並不偈限及限制於rna 干擾。 圖式簡單說明 第1(A)〜1(B)®|為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子 Λ 之一例。 第2(A)〜2⑼圖為模式圖’顯示本發明之單股核酸分子 之另一例。 第3(Α)〜3(D)ffi為模式圖’顯林發明之單股核酸分子 之其他例。 第4圖為圖表’顯示本發明實施例中之以歷基因表 現量的相對值。 第5圖為圖表，顯示本發明實施例中之GAPDH基因表 現量之相對值。 第6圖為圖表’顯示本發明實施例中A549細胞之 GAPDH基因表現量的相對值。 201217523 第7圖為圖表，顯示本發明實施例中293細胞之GAPDH 基因表現量的相對值。 第8圖為圖表’顯示本發明實施例中之TGF-β 1基因表現 量的相對值。 第9圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群中每單位 重量之肺的TGF-βΙ基因表現量。 第10圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之BAFL 樣本中的細胞數。 第11圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之BALF 樣本中的嗜十性球細胞數。 第12圖為照片，顯示本發明實施例中BALF樣本中之細 胞的吉姆沙染色(Giemsa stain)結果：（A)為LPS(+)/RNA(-) 投予群4之結果，（B)為LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投 予群6的結果，（C)為LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5 的結果。 第13圖為照片，顯示本發明實施例之肺組織HE染色結 果：（A)為LPS(+)/RNA(-)之投予群4的結果，（B)為LPS(+)/ 陰性控制組NK-0035(+)之投予群6的結果，（C)為 LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5的結果。 第14(A)圖係顯示本發明實施例中之TGF-βΙ基因表現 量的結果；第14(B)圖係顯示本發明實施例中之IFN-a基因 表現量的結果；第14(C)圖係顯示本發明實施例中之IFN-β 基因表現量的結果。 第15圖為圖表，顯示本發明實施例中TGF-βΙ基因表現 201217523 量之相對值。 第16圖為圖表，顯示本發明實施例TGF-β 1基因表現量 之相對值。 第17圖為圖表’顯示本發明實施例中各投予群之每單 位重量之肺的TGF-βΙ表現量。 第18(A)圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之 BALF樣本中之TNF-α量；第18(B)圖為圖表，顯示本發明實 施例中各投予群之BALF樣本中之IFN-β量。 第19圖為圖表，顯示本發明實施例中293細胞之LAMA 基因表現量的相對值。 第20圖為圖表，顯示本發明實施例中A549細胞之 LMNA基因表現量的相對值。 第21圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。 第22圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 第23圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。 第24圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 第25圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。 第26圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 第27圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。 第28圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 7 201217523 第29圖為_表’顯*本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 第3〇圖為_表，顯示本發明實施射HCT116細胞之 GAPDH基因表現量的相對值。 第31圖為電泳照片，顯示本發明實施例中之核糖核酸 酶财性。 第32圖為電泳照片，顯示本發明實施例中之S7核酸酶 财性。 C 方包 3 本發明之實施形態 本說明書所使用之用語只要未特別提及，即可使用所 屬技術領域通常使用之意義。 1. ssNc分子 如前所述，本發明之單股核酸分子係一種含有抑制目 標基因表現之抑制表現序列的單股核酸分子，其特徵在 於：從5’端側至3’端側依序含有5’端側區域(Xc)、内部區域 (Z)及3 ’端側區域(Yc)，前述内部區域(z)係由内部5，端側區 域(X)與内部3’端側區域(γ)連結而構成者，前述5,端側區域 (Xc)與前述内部5’端側區域(X)互補，前述3,端側區域(Yc) 與前述内部3’端側區域(Y)互補，且前述内部區域(z)、前述 5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(YC)中之至少一者含有 前述抑制表現序列。 於本發明中’舉例來說，「抑制目標基因表現」意指 妨礙前述目標基因之表現。前述抑制之機制並未特別受 8 201217523 限，舉例而言’可為調降（down_regulati〇n)或靜默 g)則述目標基因表現之抑制，舉例而言，可透過 源自前述目標基因之轉錄產物生成量減少、前述轉錄產物 2減）、源自前述目標基因之轉譯產物生成量減少、或 3述轉譯產物活性減少等來確認。舉例來說，前述蛋白 貝可列舉如成熟蛋白質、或是經處理(processing)或轉譯後 接又修飾前之前驅蛋白質。 以下，本發明之單股核酸分子亦稱為本發明 之「ssNc 刀子」舉例來說，由於本發明之ssNc分子可於活體内（in ,)或活體外(ln vltr〇)使用於抑制目標基因表現，因此亦 稱為用於抑制目標基因表現之ssNc分子」或「目標基因 表見抑制劑」。此外，舉例來說，本發明之ssNe分子可透過 RNA干擾來抑制前述目標基因表現，因此亦稱為「RNA干 擾用ssNc分子」、「RNA干擾誘導分子」、「rna干擾劑」或 RNA干擾誘導劑」。再者，舉例來說，本發明之ssNc分子 了抑制干擾素誘導(interferon induction)等之副作用。 本發明之ssNc分子之5’端與3,端未連結’因此亦可稱為 線狀單股核酸分子。舉例來說，本發明之ssNc分子於其前 述内部區域(Z)中，前述内部5,區域(X)與前述内部3,區域(γ) 直接連結。 於本發明之ssNc分子中，前述5,端側區域(Xc)與前述内 部5’端側區域(X)互補’且前述3’端側區域(Yc)與前述内部 3’端側區域(Y)互補。因此，於5’端側中，前述區域(以)朝 前述區域(X)回折’前述區域(Xc)與前述區域(X)可透過自黏 201217523 合(self-annealing)而形成雙股，又，於3’端側中，前述區域 (Yc)朝前述區域(Y)回折，前述區域(Yc)與前述區域(γ)可透 過自黏合而形成雙股。本發明之ssNc分子可如此這般於分 子内形成雙股，舉例來說，與習知之用於RNA干擾之 siRNA(已分離之兩條單股RNA透過黏合而形成雙股rna) 結構明顯不同。 本發明之ssNc分子中，舉例來說，前述抑制表現序列 在本發明之ssNc分子以in viv。或in咖。形式導入細胞内 時，係一顯示出抑制前述目標基因表現之活性的序列◊前 述抑制表現序列並未特別受限，可因應目標基因種類來適 當設定。舉例來說’前述抑制表現序射適#地運用與利 用siRNA所致RNA干擾相關之序列。—般而言，rna干擾 為下述現象.長雙股RNA(dsRNA)在細胞内透過裁切器 (D—而被截斷成3,端突出之㈣鹼基對程度的雙股 RNA(siRNA :酿U interfering RNA)，其中一單股rna與目 標mRNA結合，藉由分解前述爪驅來抑制前述出疆之轉 譯。舉例來說，與前述目標mRNA結合之前述siRNA中，單 股RNA之序列依目標基因之種類而異，[有各種受到報 σ於本發月中’舉例而言，可將前述收⑽之單股RNA 序列用作前述抑制表現序列。 另，本發明並非將相對前述目標基因之前述抑制表現 序列的序列資訊作為重點，而是關於—種核酸分子之結 構，該核酸分子伽以使前述抑制表現相所產生之抑制 前述目標基因表現騎性在諸如細胞__能。因此， 10 201217523 於本發财，舉例而言，除了巾請日化成為習知之前述 Si腿的單股臟序敎外，較^料會_化之序 列’亦可作為前述抑制抑制表現序列來予以利用。 舉例來說，前述抑制表現序列相對於前述目標基因之 預定區域宜具有90%以上之互補性，且宜為95%，更宜為 98/。’而以100/。尤佳。II *滿足此種互補性，舉例來說， 可使脫靶(off-target)情況充分減少。 作為具體例，在目標基因為GAPDH基因時，前述抑制 表現序列可使用例如序列編號丨所示19個鹼基長之序列；目 標基因為TGF-βΙ時，前述抑制表現序列可使用例如序列編 號16所示21個鹼基長之序列；目標基因為LAMA1基因時， 前述抑制表現序列可使用例如序列編號5所示19個鹼基長 之序列；目標基因為LMNA基因時，可使用序列編號6所示 * 19個鹼基長之序列。 5 ’ -GUUGUC AUACUUCUC AUGG-3，（序列編號 1) 5,-AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3,(序列編號 16) 55-AUUGUAACGAGACAAACAC-35 (序列編號5) 5’-UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3’ （序列編號6) 推測本發明之ssNc分子所致前述目標基因表現之抑制 係因RNA干擾或類似於RNA干擾之現象（類RNA干擾之現 象)所引起，該現象舉例來說係藉由採用前述内部區域(Z)、 前述5,端側區域(Xc)及前述3,端側區域(Yc)中之至少一者 配置有前述抑制表現序列之結構而產生。此外，本發明並 11 201217523 ，咖杨分子並非如 條單股rna所構成之祕形式來導 現序二之二:舉例來說’在細胞内未必需要前述抑制表 子 刀目此，舉例來說’亦可稱本發明之ssNc分 子具有類RNA干擾之機能。 1 \ I月之咖分子中’前述抑制表現序列係如前所 地’匕含在前述内部區域(z)、前述5,端側區域⑽及前述3, ^區域(增之至少—者。舉例Μ，本㈣以⑽ 可具有1個前述抑制表現序列，且亦可具有2個。 在後者之情況下，舉例來說，本發明之嫌分子可具 有2個以上相對於相同目標基因之相同抑制表現序列，且可 具有2個以上相對於相同目標基因之相異抑制表現序列，亦 可具有2似上相對於相異目標基因之相異抑制表現序 列。本發明之祿分子具有2個以上前述抑制表現序列時， 各抑制表現序狀配置處縣特财限，可為前述内部區 域(Z)、前述5’端側區域(Xe)及前述3，端側區域㈣中之任一 區域，且亦可為不同區域。本發明之嫌分子具有細以上 相對於相異目標基因之前述抑制表現序列時，舉例來說， 依本發明之邊分子而；^，可抑制2種以上之相異目標基因 的表現。 前述内部區域(Z)係如前述般，前述内部5，端區域(χ) 七前述内部3’端區域(Υ)呈連結。舉例來說，前述區域(χ) 與前述區域(Υ)直接連結，其間不具有介入序列。前述内部 區域(Ζ)為了表示與前述5’端側區域(Xc)及前述3,端側區域 12 201217523 (Xc)之序列關係’而表記成「係由前述内部5’端側區域(χ) 與前述内部3’端側區域(Υ)連結所構成」，且於前述内部區域 (Ζ)中，舉例來說，前述5’端側區域(Xc)與前述3,端側區域 (Xc)在前述ssNc分子之使用過程中，並未限定為各別獨立 之區域。即，舉例來說，前述内部區域(2)具有前述抑制表 現序列時，於前述内部區域(Z)中，前述抑制表現序列可跨 前述區域(X)與前述區域(Y)作配置。 本發明之ssNc分子中，前述5,端側區域(Xc)與前述内部 5’端側區域(X)互補。於此，前述區域(Xc)僅需具有相對於 前述區域(X)之全區域或其部分區域呈互補之序列即可，具 體來說，例如，以含有與前述區域(X)之全區域或其部分區 域互補之序列，或是由前述互補序列所構成為佳。舉例來 說，前述區域(Xc)相對於前述區域(X)之前述互補全區域或 刚述互補部分區域可為完全互補，亦可有丨個或數個鹼基非 呈互補，但以完全互補為佳。本發明之ssNc分子中，前述3, 端側區域(Yc)與前述内部3,端側區域(γ)互補。於此，前述 區域(Yc)僅需具有與前述區域(γ)之全區域或其部分區域互 補之序列即可，具體來說，例如，以含有相對於前述區域 (Υ)之全區域或其部分區域呈互補之序列，或是由前述互補 序歹]所構成為佳。前述區域(Ye)相對於前述區域(Υ)之前述 互補全區域或前述互補部分區域，舉例來說，可為完全互 補亦可有1個或數個鹼基非呈互補，但以完全互補為佳。 舉例來說，前ai個驗基或數個驗基為卜3個驗基，且宜為( 個鹼基或2個鹼基。 13 201217523 本發明之ssNc分子中，舉例而言，前述5’端側區域(xc) 與前述内部5’端側區域(X)可直接連結，亦可間接連結。在 前者之情況下，直接連結可列舉如利用磷酸二酯 (phosphodiester)鍵之連結。在後者之情況下，舉例來說可 列舉如：前述區域(Xc)與前述區域(X)之間具有連結區域 (Lx) ’且前述區域(Xc)與前述區域(X)透過前述連結區域(Lx) 而連結的形態。 本發明之ssNc分子中，舉例來說，前述3’端側區域(yc) 與前述内部3’端側區域(Y)可直接連結，亦可間接連結。在 前者之情況下，直接連結可列舉如利用鱗酸二醋鍵之連 結。後者之情況下’舉例來說則可列舉如：前述區域(Yc) 與前述區域(Y)之間具有連結區域(Ly)，且前述區域(Yc)與 前述區域(Y)透過前述連結區域(Ly)而連結的形態。 舉例而言，本發明之ssNc分子可具有前述連結區域(Lx) 及前述連結區域(Ly)兩者，亦可具有其中之任一者。在後 者之情況下，舉例來說，可列舉如：前述5,端側區域(Xc) 與削述内部5 ’端側區域(X)之間具有前述連結區域(lx)，且 前述3 ’端側區域(Yc)與前述内部3 ’端側區域(γ)之間不具有 前述連結區域(Ly) ’即’前述區域(Yc)與前述區域(γ)直接 連結之形態。此外’在後者之情況下’舉例來說，可列舉 如：前述3’端側區域(Yc)與前述内部3’端側區域(γ)之間具 有前述連結區域(Ly)，且前述5’端側區域(Xc)與前述内部5, 端側區域(X)之間不具有前述連結區域(Lx)，即，前述區域 (Xc)與前述區域(X)直接連結之形態。 201217523 則述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)宜分別呈在本 身之區域内部不會發生自黏合之結構。 就本發明之ssNc分子，茲將不具有前述連結區域之 ssNc分子之一例顯示於第1圖之模式圖中。第1(A)圖係一模 式圖，其針對前述ssNc分子顯示從5’端側朝3,端側之各區域 順序概略’第1(B)圖則是顯示前述ssNc分子在前述分子内 形成雙股之狀態的模式圖。如第1(B)圖所示，前述ssNc* 子中’則述5’端側區域(Xc)回折，前述5’端側區域(xc)與前 述内部5’端側區域(X)之間形成雙股，前述3,端側區域(Yc) 回折’前述3’端側區域(Yc)與前述内部3’端側區域(γ)之間 形成雙股。第1圖僅用以顯示各區域之連結順序及形成雙股 之各區域的位置關係，舉例來說’各區域之長度等並不受 其限制。 就本發明之ssNc分子，茲將具有前述連結區域之ssNc 分子之一例顯示於第2圖之模式圖中。第2(A)圖為模式圖， 其針對前述s s N C分子顯示從5，端側朝3 ’端側之各區域順序 概略作為一例，第2(B)圖則是顯示前述ssNc分子於前述分 子内形成雙股之狀態的模式圖。如第2(B)圖所示，前述ssNc 分子中，前述5’端側區域(Xc)與前述内部5,端側區域(χ)之 間以及前述内部3’端側區域(γ)與前述3’端側區域(Yc)之間 形成雙股，前述Lx區域及前述Ly區域採迴圈結構(1〇〇p structure)。第2圖僅用以顯示各區域之連結順序及形成雙股 之各區域的位置關係’舉例來說，各區域之長度等並不受 其限制。 15 201217523 於本發明之ssNc分子中，前述5,端側區域(Xc)'前述内 部5’端側區域(X)、前述内部3,端側區域及前述3，端側區 域(Yc)之鹼基數並未特別受限，例如下述者。於本發明中， 舉例來說，「鹼基數」意指r長度」，亦可稱為「鹼基長」。 别述5’端側區域(xc)係如前述，舉例來說，亦可與前述 内部5’端側區域(X)之全區域互補。此時，舉例來說，前述 區域(Xc)宜與前述區域(X)為相同鹼基長，且宜由與前述區 域(X)之5’端至3’端之全區域互補的鹼基序列所構成。前述 區域(Xc)更宜與前述區域(χ)為相同鹼基長，且前述區域(Xc) 之全部鹼基與前述區域(X)之全部鹼基互補，即，例如宜呈 元全互補。另，並不受限於此’舉例來說亦可如前述，有1 或數個驗基非呈互補。 此外’前述5’端側區域(Xc)係如前所述，例如，可與前 述内部5’端側區域(X)之部分區域互補。此時，舉例來說， 前述區域(Xc)與前述區域(X)之部分區域宜為相同鹼基長， 即’宜由較前述區域(X)短1個鹼基以上之鹼基長的鹼基序 列所構成。前述區域(Xc)更宜與前述區域(X)之前述部分區 域為相同鹼基長，且前述區域(Xc)之全部鹼基與前述區域 (X)之前述部分區域的全部鹼基互補，即，例如宜完全互 補。舉例來說，前述區域(X)之前述部分區域宜為前述區域 (X)中由5’端之鹼基（第1個鹼基）起連續之鹼基序列所構成 的區域（片段）。 前述3’端側區域(Yc)係如前所述，舉例來說，亦可與前 述内部3’端側區域(Y)之全區域互補。此時，舉例來說，前 201217523 述區域(Yc)宜與前述區域(γ)為相同鹼基長，且宜由與前述 區域(Υ)之5’端至3’端之全區域互補的鹼基序列所構成。前 述區域(Yc)更宜與前述區域(γ)為相同鹼基長，且前述區域 (Yc)之全部鹼基與前述區域(γ)之全部鹼基互補，即，例如 宜完全互補。另，不受此限，舉例來說，亦可如前述般有1 或數個鹼基非為互補。 此外，此外，前述3’端側區域(Yc)係如前所述，例如， 可與前述内部3’端側區域(Y)之部分區域互補。此時，舉例 來說’前述區域(Yc)宜與前述區域(Y)之部分區域為相同驗 基長，即，宜由較前述區域(Y)短1個鹼基以上之鹼基長的 鹼基序列所構成。前述區域(Yc)更宜與前述區域(Y)之前述 部分區域為相同鹼基長，且前述區域(Yc)之全部鹼基與前 述區域(Y)之前述部分區域的全部鹼基互補，即，例如宜完 全互補。舉例來說，前述區域(Y)之前述部分區域宜為前述 區域(Y)中由3’端之鹼基（第1個鹼基）起連續之鹼基序列所 構成的區域（片段）。 本發明之ssNc分子中，前述内部區域(Z)之鹼基數(Z) 與前述内部5,端側區域(X)之鹼基數(X)及前述内部3’端側 區域(Y)之鹼基數(Y)的關係、以及前述内部區域(Z)之鹼基 數(Z)與前述内部5 ’端側區域(X)之鹼基數(X)及前述5 ’端側 區域(Xc)之驗基數(Xc)的關係，舉例來說，滿足下述式⑴ 及(2)之條件。 Ζ=Χ+γ ... (1) Z^Xc+Yc · · · (2) 17 201217523 本發明之ssNc分子中，前述内部5’端側區域(χ)之鹼基 數(X)與前述内部3 ’端側區域(Y)之鹼基數(Y)的長度關係並 未特別受限’舉例來說’亦可滿足下述式中之任一條件。 X=Y · · · (19) Χ< Υ Χ> Υ • · · • •參 (20)(21) 本發明之ssNe分子中，前，端㈣域(χ)之驗基 數(X)、前述5,端側區域(Xc)之驗基數(Xc)、前述内部3，端 側區域⑺之驗基數〇〇及前述3,端側區域(Yc)之驗基數(Yc) 的關係舉例來說滿足下述(a)〜(d)中之任一條件 (a)滿足下述式(3)及(4)之條件。 X>Xc · · · (3) Y=Yc · · · (4) (b)滿足下述式（5)及(6)之條件。 X=Xc · · · (5) Y>Yc · · · (6) (c) 滿足下述式(7)及(8)之條件。 X>Xc · · · (7) Y>Yc . · . (8) (d) 滿足下述式(9)及（10)之條件。 X=Xc · · . (9) Y=Yc · . · (10) 前述(a)〜(d)中，前述内部 1 )端側區域(X)之鹼基數(X) 、前述内部3’端側 18 201217523 區域(Y)之驗基數(Y)與前述3，端㈣域(Ye)之驗基數⑽ 的差，舉例來說宜滿足下述條件。 (a) 滿足下述式（11)及（12)之條件。 …⑼ • · -(14) •(15) •(16) X-Xc=l〜10 ;且以1、2、3或4為宜，更宜為卜2或3 c Y-Yc=0 · · . (12) (b) 滿足下述式（13)及（14)之條件。 X-Xc~0 · · · (13) Y-Yc=l〜10 ;且以卜2、3或4為宜，更宜為1、2或3。 (c) 滿足下述式（15)及（16)之條件。 X-Xc=l〜10 ;且以卜2或3為宜，更宜為1或2。· · Y-Yc=l〜10 ;且以1、2或3為宜，更宜為1或2。· · (d) 滿足下述式（17)及（18)之條件。 X-Xc=0 . · · (17) Y-Yc=0 · · · (18) 茲就前述⑷〜(d)之ssNc分子，將其等之個別結構的一 例顯示於第3圖之模式圖。第3圖為含有前述連結區域(Lx) 及前述連結區域(Ly)之ssNc ’（A)為前述（a)之ssNc分子之 例，（B)為前述(b)之ssNc分子之例，（C)為前述(c)之ssNc分 子之例，（D)為前述⑷之ssNc分子之例。於第3圖中，虛線 表示因自黏合而結合形成雙股的狀態。第3圖之ssNc分子將 前述内部5’端側區域(X)之鹼基數(X)與前述内部3’端側區 域(Y)之鹼基數(Y)以前述式（20)之「X<Yj形式來表現， 但並不限於此，而如前述般可為前述式（19)之「X=Y」，亦 可為前述式(21)之「Χ>Υ」。此外，第3圖僅是用以表示前 19 201217523 述内部5’端側區域(X)與前述5,端側區域(Xc)之關係以及前 述内部3 ’端側區域(Y)與前述3，端側區域(Yc)之關係的模式 圖’舉例來說’各區域之長度及形狀等並侷限於此，又， 連結區域(Lx)及連結區域(Ly)之有無亦不受其限制。 舉例而言，前述(a)〜(c)之ssNc分子藉由前述5,端側區域 (Xc)與前述内部5 ’端側區域(X)以及前述3，端側區域(Yc)與 前述内部3’端側區域(Y)分別形成雙股，而成為於前述内部 區域(Z)中前述5’端側區域(xc)及前述3,端侧區域(Yc)均具 有無法對準（alignment)之鹼基的結構，亦可稱為具有不形成 雙股之鹼基的結構。以下，將前述内部區域(z)中之前述無 法對準之鹼基（亦稱為不形成雙股之鹼基）稱為「自由鹼 基」。於第3圖中，以「F」表示前述自由驗基之區域。前 述區域(F)之鹼基數並未特別受限。舉例來說，前述區域 之鹼基數(F)在前述(a)2SsNc*子的情況下為「x〇Cc」之鹼 基數，在前述(b)之ssNc分子的情況下為「γ_Yc」之鹼基數， 在前述(c)之ssNc分子的情況下則為rx_Xc」之鹼基數與 「Y_Yc」之驗基數的合計數值。 另一方面，前述(d)2SsNc分子呈現例如前述内部區域 (Z)之全區域與前述5，端側區域(Xc)及前述3，端側區域(γ幻 對準之結構，亦可稱為前述内部區域(z)之全區域形成雙股 之結構。另外，前述⑷之邊分子巾，前述5，端側區域(xc) 之5’端與前述3’端側區域(Yc)之3,端未連結。 蛛就本發明之ssNc分子，將各區域之長度例示如下， 但本發明並不受其侷限。於本發明中，舉例來說，鹼基數 20 201217523 之數值範圍係將隸屬該範圍之全部正整數予以揭示，例 如’「1〜4驗基」之記載意指「1、2、3 ' 4驗基」之全部揭 示内容（以下同樣）。 舉例來說，前述5’端側區域(xc)、前述3,端側區域(yc) 及前述内部區域(Z)中之前述自由鹼基之鹼基數合計會 成為前述内部區域(Z)之鹼基數。因此，前述5,端側區域(xc) 及前述3’端側區域(Yc)之長度舉例來說可因應前述内部區 域(Z)之長度、前述自由驗基數(f)及其位置來適當決定。 舉例來說，前述内部區域(Z)之鹼基數在19個鹼基以 上。舉例來說，前述鹼基數之下限為19個鹼基，且宜為2〇 個驗基，更宜為21個驗基。舉例而言，前述驗基數之上限 為50個驗基，且宜為40個驗基，更宜為3〇個鹼基。前述内 部區域(Z)之驗基數的具體例係例如19個驗基、2〇個驗基、 21個驗基、22個鹼基、23個驗基、24個驗基、25個驗基、 26個鹼基、27個鹼基、28個鹼基、29個鹼基或3〇個鹼基。 前述内部區域(Z)含有前述抑制表現序列時，舉例來 說，前述内部區域(Z)可為僅由前述抑制表現序列所構成之 區域，亦可為含有前述抑制表現序列之區域。前述抑制表 現序列之鹼基數舉例來說為19〜30個鹼基，且宜為19、2〇 或21個驗基1述内部區域(z)含有前迷抑制表現序列時， 前述抑制表現序列之5,端側及/或3’端側亦可更具有附加序 列。前述附加序列之驗基數舉例來說為丨〜31個驗基，且宜 為1〜2H固鹼基，更宜為ι〜η個鹼基，尤宜為丨〜7個鹼基。 舉例來說’前述5,端側區域(Xc)之驗基數為卜29個驗 21 201217523 基，且宜為卜11個鹼基，較宜為1〜7個鹼基，更宜為丨〜4個 鹼基，而以1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基尤佳。前述内部區 域(Z)或前述3’端側區域(YC)含有前述抑制表現序列時舉 例而言，宜具有此種鹼基數。作為具體例，前述内部區域 (Z)之驗基數為19〜30個驗基(例如19個驗基）時，舉例來令兒 前述5’端側區域(Xc)之驗基數為1〜11個驗基，且宜為1〜7個 鹼基，較宜為1〜4個鹼基，且更宜為丨個鹼基、2個鹼基、3 個驗基。 前述5 ’端側區域(Xc)含有前述抑制表現序列時，舉例來 說，前述5’端側區域(Xc)可為僅由前述抑制表現序列所構成 之區域’亦可為含有前述抑制表現序列之區域。前述抑制 表現序列之長度例如前述。前述5，端側區域(X c)含有前述抑 制表現序列時’前述抑制表現序列之5,端側及/或3,端側亦 可更具有附加序列。舉例來說，前述附加序列之鹼基數為 1〜11個鹼基，且以1〜7個鹼基為佳。 舉例來說，前述3’端側區域(YC)之鹼基數為卜29個鹼 基，且宜為1〜11個驗基，較宜為1〜7個鹼基，更宜為卜4個 驗基，且以1個鹼基、2個鹼基、3個驗基尤佳。前述内部區 域(Z)或前述5’端側區域(Xc)含有前述抑制表現序列時，舉 例來說，宜為此種驗基數。作為具體例，前述内部區域(Z) 之驗基數為19〜30個驗基(例如19個驗基）時，舉例來說，前 述3’端側區域(Yc)之驗基數為1~11個驗基，且宜為1〜7個驗 基，更宜為1〜4個鹼基，且以1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基 尤佳。 22 201217523 月』述3知侧區域(yc)含有前述抑制表現序列的情況 下，舉例來說’前述3,端側區域(Yc)可為㈣前述抑制表現 序列：構成之區域，亦可是含有前述抑制表現序列之區 域月,J述抑制表現序列之長度如前述所示。前述3,端側區 域(YC)含有前述抑制表現序列時’前述抑制表現序列之5, 端侧及/或3,端側亦可更具有附加序列。前述附加序列之驗 基數例如可為1〜11健基’纽1〜7個驗基為佳。 如則所述，前述内部區域(z)、前述5，端側區域(又幻及 前述3’端側區域(Yc)之鹼基數舉例來說可以前述式（2)之 pZ2Xc+Yc」來表示。作為具體例，舉例來說，「Xc+Yc」 之鹼基數與前述内部區域(z)相同，或是較前述内部區域(z) 更小。在後者之情況下，舉例來說「Z-(Xc+Yc)」為1~10， 且且為1〜4，更宜為1、2或3。舉例而言’前述「z_(Xc+Yc)」 相當於刚述内部區域(Z)中前述自由鹼基之區域(F)的鹼基 數(F) 〇 於本發明之ssNc分子中，前述連結區域(Lx)及前述連結 區域(Ly)之長度並未特別受限。舉例來說，前述連結區域(Lx) 宜為削述内部5’端側區域(X)與前述5,端側區域(xc)可形成 雙月又之長度’舉例來說’前述連結區域(Ly)宜為前述内部3， 端側區域(Y)與前述3’端側區域(yc)可形成雙股之長度。前 述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)之構成單元含有鹼基 時，前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)各別之鹼基數可 相同亦可不同，此外，其鹼基序列亦可相同或不同。前述 連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)之鹼基數的下限舉例來 23 201217523 說為1個鹼基，且宜為2個鹼基，更宜為3個鹼基，其上限則 舉例來說為1〇〇個鹼基，且宜為80個鹼基’更宜為5〇個鹼 基。前述各連結區域之驗基數就具體例而言，舉例來說可 例示如1〜50個驗基、卜30個驗基、丨〜2〇個鹼基、個驗 基、1〜7個鹼基及1〜4個鹼基等’但並不侷限於此。 本發明之ssNc分子的全長並未特別受限。本發明之 ssNc分子中’前述驗基數合計（全長之鹼基數）的下限舉例來 說為38個驗基，且宜為42個驗基’更宜為5〇個驗基，且更 以51個鹼基為佳’尤宜為52個驗基；其上限舉例來說為3⑻ 個鹼基，且宜為200個鹼基’更宜為150個鹼基，更以1〇〇個 驗基為佳’且尤宜為80個驗基。本發明之ssnc分子中，前 述連結區域(Lx)及連結區域(Ly)除外之鹼基數合計的下限 舉例來說為38個鹼基，且以42個鹼基為宜，更宜為5〇個驗 基’且更以51個驗基為佳’尤且為5 2個驗基；上限則舉例 來說為300個驗基’並以200個驗基為宜，更宜為15〇個驗 基，更以100個鹼基為佳，尤宜為80個鹼基。 本發明之ssNc分子的構成單元並未特別受限，可列舉 如核苷酸殘基。前述核苷酸殘基則可列舉如核糖核苦酸殘 基及去氧核糖核苷酸殘基。前述核苷酸殘基可列舉如未經 修飾之非修飾核苷酸殘基以及業經修飾之修飾核普酸殘 基。舉例而言，本發明之ssNc分子可藉由含有前述修飾核 苷醆殘基而提高核酸酶对性，並提高安定性。再者，舉例 來s兒’本發明之ssNc分子除了前述核苷酸殘基之外，更可 含有非核苷酸殘基。前述核苷酸殘基及前述非核苦酸殘基 24 201217523 之詳情則如後述。 於本發明之嫌分子中，前述内部區域(z)、前迷 側區域(Xc)及前述3,端側區域(Ye)之構成單元分別以前述 核苷酸殘基為宜。舉例來說，前述各區域可以下述; 之殘基來構成： (1) 非修飾核苷酸殘基； (2) 修飾核苷酸殘基；以及 (3) 非修飾核普酸殘基及修飾核發酸殘基。 於本發明之ssNc分子中，前述連結區域(Lx)及前述連結 區域(Ly)之構成單元並未制受限，舉例來說，可列舉如前 述核《殘基及前述非核紐殘基。前述連結區域舉例來 說可僅由前述核賊殘基所構成，亦可僅由前述非核苦酸 殘基所構成，尚可由前述料酸殘基與前述非料酸殘基 所構成。刖述連結區域舉例來說由下述(丨)〜(7)之殘基所構 成： (1) 非修飾核苷酸殘基； (2) 修飾核苷酸殘基； (3) 非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基； (4) 非核苷酸殘基； (5) 非核苷酸殘基及非修飾核苷酸殘基； (6) 非核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基；以及 (7) 非核苷酸殘基、非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘 基。 本發明之ssNc分子具有前述連結區域(Lx)及前述連結 25 201217523 區域(Ly)兩者時，舉例來說，兩者之構成單元可相 同亦可 不同。就具體例來說，可列舉如：兩者之連結區域的構成 單元為别述核苷酸殘基之形態；兩者之連結區域的構成單 元為前述非核苷酸殘基之形態；以及，其中一區域之構成 單元為前述核苷酸殘基，另一連結區域之構成單元則為非 核苦酸殘基的形態等。 本發明之s s Nc分子舉例來說可列舉如僅由前述核苷g 斤構成之分子、除了前述核苷酸殘基之卜 非核料殘基之分子等。於本發明之— =殘基係如前所述’舉例來說，可僅為前述非修飾⑹ =基’亦可僅為前述修飾料酸絲，尚可為前述非个 人亥:峻殘基與前述修飾核芽酸殘基兩者。前述_分: 述迷非修飾核㈣殘基與前述修飾核叫殘基時，% 個“核替酸殘基之個數並未特別受限’例如為「_ 個」，，而具體而言則例如為Η個，且宜為W個，更宜為卜 酸殘^宜為1或2個。本發明之邊分子含有前述_ =，前述非核碰絲之個數並未特料限，㈣ 况马1或數個」’具體而言則例如為丨〜8個、彳t 個、1、2或3個。 1〜6個、卜 ㈣ί發明之嫌分子中，舉例來說前述核*酸殘基宜》 稱為「，基。此時，舉例而言’本發明之爾Η 舉如僅子」？讓分子」。前述 堇^㈣核糖核魏殘基所構成之分子、除前述核相 ^次綫基之外還含有前述非核苷酸殘基之分子。前g 26 201217523 ssRNA分子中，前述核糖核苦酸殘基如前所述般，舉例來 說可僅為前述非修飾核糖«酸殘基，亦可僅為前述修飾 核糖核苦酸殘基，亦可含有前述非修飾核糖核苦酸殘基與 前述修飾核糖核苷酸殘基兩者。 舉例來說，前述ssRNA分子在除了前述非修飾核糖核 苦酸殘基之外還含有前述修飾核糖核苷酸殘基時，前述修 飾核糖核苷酸殘基之個數並未特別受限，例如為「丨或數 個」，具體來說例如為卜5個，且宜為K4個，更宜為^個， 而最宜為丨或2個。舉例來說’相料前述非料核糖核普 酸殘基之前述修飾核糖歸酸殘基亦可為核糖殘基業經去 =核糖殘基取代之前述去氧核糖核料殘基。舉例來說， I述ssRNA分子在除了前述祕飾核糖料酸殘基之外還 含有前述去氧核糖核紐殘基時’前述去氧核糖核芽酸殘 基之個數並未特別受限，例如為「丨或數 :如為一宜為W且最宜= 义舉例來說’本發明之爆分子亦可含有標識物質且以 前述標識物f而受到標識化。前述標識物質並未特別為 ^:列舉如螢光物質、色素及同位素等。前述標識物; 列+如匕、TAMRA、螢光黃（fluorescein)、Cy3色素、印 色素等之螢光團’且前述色素可列舉如他⑽叫之a拉 ^素等。前述同位素可列舉如敎同位素及放射性同位 二且宜為穩定同位素。前述穩定同位素舉例來說由於幅 ，夕戌之危險性較少，且無需專門設備而具優異之處理 27 201217523 性’此外’亦可減低成本。再 同位素掉墦 舉例來說，經前述穩定 知Ά之化合物無物性變 質亦優異。益、+.雜— 用作示蹤劑(tracer)之性 ,3 、 述穩疋同位素並it牲^ Ν、丨 70 ' 丨 8〇 ' 本發明之ssNc分子如 C、丨5ΧΤ ,7一 ·。 “.、待別党限，可列舉如2Η、 S 及 36s 現。因此，舉例來說，本發明之 制前述目標基因之表 因之疾病的治療劑。舉例來說：&子可用作基因為成 可抑制前述疾病成因之基之邊分子在含有 現序列時，例如，w 錢的序列來作為前述抑制表 前述疾病。於本發明中過 H 前述目「標基因之表現來治療 之預防、疾病之改善及預後之二=療」包含前述疾病 者。 D專意義，可為其中任一 斜具二 =::Γ之使用方法並未特別受限，例如， 前# ^之投予對象投予前述_c分子即可。 j4投予對象可列舉如 對象可列舉如人_及人類心。前述投予 物。舉例來說，前述投予可作=·人哺乳類等之非人動 :―。前述細胞並未特別受限，可列 ：卜 Γ細胞、N_細胞，細胞等之各種培養細胞、ES 、·田胞、造血幹細胞等之幹 離出之細胞等。 H代培養細料由活體單 於本發明中’抑制表現對象之前述目標基因並未特別 可設定:欲之基因。且如前所述，僅需因應前述目 基因之種類來適當設計前述抑制表現序列即可。 28 201217523 效將本發明之ssNc分子之具體例顯示如下，但本發明 並不因此而受到任何限制。前述ssNc分子之鹼基序列可例 示如序列編號2、7、8、13、14、29-35、37、43、44、47、 48及51-80之驗基序列’此外’前述驗基序列中，舉例來說 亦可是1或數個缺損、取代及/或附加之鹼基序列。前述目 標基因為GAPDH基因時，可列舉如序列編號2、7、8、13、 37及51-80之驗基序列；目標基因為TGF-βι時，可列舉如序 列編號14、29-35之鹼基序列；前述目標基因為1^八1^八1基因 時，可列舉如序列編號43、44之驗基序列；前述目標基因 為LMNA基因時，則可列舉如序列編號47、48之鹼基序列。 關於本發明之ssNc分子的用途，則可參照後述之本發 明組成物、抑制表現方法及治療方法等之記載。 如前所述，由於本發明之邊分子可抑制目標基因之 表現，舉例來說’作為醫藥品 '診_、農藥以及農藥、 醫學、生命科學等之研究工具等甚是有用。 2.核苷酸殘基 舉例來說，前述核皆酸殘基含有糖、驗基及鱗酸作為 構成要素。前述核賊殘基係如前述，可列舉如核糖核苦 酸殘基及去氧錄料_基。舉㈣言，前述核糖核苦 酸殘基具有核糖殘基作為糖，且具有腺鳥# ⑹、胞射(邮曝_)作从基；前述絲核糖殘基 則例如具有去氧核糖殘基作為糖，且具有㈣⑽}、Μ 吟(G)、胞錢(C)及胸腺·(τ)作為驗基。 前述核芽酸殘基可列舉未修飾核《殘基及修飾核苦 29 201217523 酉欠殘基。舉例來說，前述未修飾核苷酸殘基之前述各構成 要素可與天然存在物相同或實質相同’且宜與天然存在於 人體内者相同或實質相同。 舉例來說，前述修飾核苷酸殘基為將前述未修飾核普 酸殘基予以修飾而成之核苷酸殘基。又舉例來說，前述修 飾核苷酸殘基之前述未修飾核苷酸殘基的構成要素中之任 —者亦可經修飾。於本發明中，舉例來說，「修飾」即是前 述構成要素之取代、附加及/或缺損、前述構成要素中之原 子及/或官能基之取代、附加及/或缺損，亦可稱為「改變」。 前述修飾核苷酸殘基可列舉如天然存在之核穿酸殘基、經 人工修飾之核苷酸殘基等。前述源自天然之修飾核苷酸殘 基可參照如林巴赫氏等人(Limbach et al.，1994, Summary : the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res.22 ： 2183〜2196)。此外，前述修飾核苷酸殘基舉例來說亦可為 前述核苷酸替代物之殘基。 前述核苷酸殘基之修飾可列舉如核糖-填酸骨架（以下 稱核糖磷酸骨架）之修飾。 前述核糖磷酸骨架中，例如可將核糖殘基進行修飾。 舉例來說，前述核糖殘基可修飾2’位之碳，具體來說例如 可將與2’位之碳鍵結之羥基取代成氫或氟等鹵素。藉由將 前述2’位碳之羥基取代成氫，可將核糖殘基取代成去氧核 糖。舉例來說’前述核糖殘基可取代成立體異構物，例如， 亦可取代成阿拉伯糖殘基。 前述核糖磷酸骨架舉例來說亦可取代成具有非核糖殘 30 201217523 基及/或非罐酸之非核糖磷酸骨架。前述非核糖構酸骨架可 列舉如前述核糖磷酸骨架之非帶電體。經取代為前述非核 糖磷酸骨架之前述核苷酸替代物可列舉如N-嗎啉基 (morpholino) '環丁基、吡啶等。前述替代物除前述者外還 可列舉如人工核酸單體殘基。作為具體例，可列舉如 PNA(月大核酸）、LNA(鎖固核酸：Locked Nucleic Acid)、 ENA(2’-〇，4’-C-伸乙基橋接核酸：2，-0，4’-C-Ethylene bridged Nucleic Acid)等，且宜為PNA。 於前述核糖磷酸骨架中，舉例來說，可將磷酸基予以 修飾。於前述核糖磷酸骨架中，最與糖殘基鄰接之磷酸基 被稱為α磷酸基。前述α磷酸基帶負電，其電荷跨非與糖殘 基結合之2個氧原子而均勻分佈。前述α磷酸基之4個氧原子 中’在核苷酸殘基間之磷酸二酯鍵結中非與糖殘基鍵結之2 個氧原子以下亦稱作「非結合(ηοη_1丨nking)氧」。另一方面， 在前述核苷酸殘基間之磷酸二酯鍵結中，與糖殘基鍵結之2 個氧原子則以下稱為「結合(linking)氧」。舉例來說，前述 α磷酸基宜進行呈非帶電之修飾，或是使前述非結合氧中之 電荷分布呈非對稱型之修飾。 舉例而言’前述磷酸基亦可將前述非結合氧取代。前 述之氧可藉由例如S(硫）、Se(砷）、Β(糊）、C(碳）、Η(氫）、 Ν(氮)及〇R(R為烷基或芳基）中之任一原子作取代
，且宜以S 作取代°舉例來說’前述非結合氧例宜兩者均被取代，且 更宜兩者均被S取代。前述修飾磷酸基可列舉如硫代磷酸酯 (phosphorothioate)、二硫代填酸醋（ph〇sphorodithioate)、磷 31 201217523 石申酸 SI (phosphoroselenate)、 侧烧填酸鹽 (boranophosphate)、石朋烧填酸酯（boranophosphate ester)、氫 鱗酸酯、填醯胺酯（phosphoroamidate)、烧基或芳基構酸酯、 以及雄酸三酯（phosphotriester)等，其中尤以前述2個非結合 氧均以S取代之二硫代磷酸酯為佳。 舉例來說，前述磷酸基亦可將前述結合氧作取代。前 述氧可以例如S(硫）、C(碳)及N(氮）中之任一原子作取代。 前述修飾鱗酸基可列舉如經N取代之交聯填酸胺醋、經s取 代之交聯硫代磷酸酯及經C取代之交聯亞甲基磷酸酯等。舉 例來說’前述結合氧之取代宜在本發明之SSNC分子之5,末 端核苷酸殘基及3’末端核苷酸殘基中之至少一者中進行， 且在5’端側時宜以C作取代，在3’端側時則宜以n作取代。 舉例來說，前述磷酸基亦可取代為前述非含磷之連接 子(linker)。前述連接子包含如矽氧烷、碳酸酯、羧曱基、 胺甲酸酯（carbamate)、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接子、磺 酸酯（sulfonate)、磺醯胺、硫代甲縮醛(thi〇f〇rmaceta〇、曱 縮醛、肟、亞甲基醯亞胺基、亞甲基曱基醯亞胺基、亞甲 基伸肼基、亞曱基二曱基伸肼基及亞甲基氧基甲基醯亞胺 基等，且宜包含亞曱基羰胺基及亞甲基甲基醯亞胺基。 舉例來說，本發明之ssNc分子之3,末端及5，末端中之至 少-者的《酸殘基亦可受到修鋅。前述修飾例如可為3, 末端及5’末端中之任-者，亦可為兩者。前述修飾例如前 述，且宜對末端之磷酸基進行。舉例來説，前述磷酸基可 將全體作修飾，亦可將前述磷酸基中之以上原子作修 32 201217523 飾。在前者之情況下，例如 可為磷酸基全體之取代，亦 可為缺損。 前述末端核苦酸殘基之修飾可列舉如附加其他分子。 ㈣其他分子如前較可列舉如輯物質、碰基等之機 月b|·生刀子則述保遵基可列舉如§(硫）、Μ⑼、b(棚）、含 S曰之基團等。刖述標識物質等之機能性分子，舉例來說可 利用於本發明ssNc分子之檢測等。 月’』述其他分子例如可附加至前述核普酸殘基之破酸 基，亦可透過間1%子(spacer)而附加至前述填酸基或前述糖 殘基。舉例來說，前述間隔子之末端原子可對前述磷酸基 之則述結合氧或者糖殘基之0、N、s或c作附加或取代。前 述糖殘基之結合部位例如宜為3,位之〇或5，位之c，或者是 與其等結合之原子。例如前述間隔子可對前述pNA等之核 苷酸替代物之末端原子作附加或取代。 前述間隔子並未特別受限，舉例來說可包含_(CH2)n_、 -(CH2)nN- 、 -(CH2)„〇. 、 -(CH2)nS-、 0(CH2CH20)nCH2CH20H、無驗基糖、醯胺、叛基、胺、氧 基胺、氧基亞胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺醯胺及队咮 啉基等，以及生物素試劑及螢光黃試劑等。於前述式中，n 宜為正整數，且宜η=3或6。 附加於前述末端之分子除了此等之外，尚可例示如色 素、插入(Intercalate)劑（例如吖啶）、交聯劑（例如補骨脂素 (psoralen)、絲裂黴素 c)、紫質（TPPC4、Texaphyrin、
Sapphyrin)、多環式芳香族烴(例如啡畊、二氫啡讲）、人工 33 201217523 内核酸酶(例如EDTA)、親油性載體(例如膽固醇、膽酸、金 剛烷乙酸、1-芘酪酸、二氫睪固酮、1，3-雙-〇(十六烷基) 甘油、香葉基氧基己基、十六烧基甘油、冰片、薄荷醇、 1，3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、〇3_(油醯基) 石膽酸、03-(油醯基）膽酸、二甲氧基三苯甲基或啡。等〇井) 及肽複合物（例如Antennapedia peptide、Tat肽）、烧基化劑、 磷酸、胺基、酼基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、 聚胺基、烷基、經取代烷基、放射線標識標記、酵素、半 抗原（例如生物素）、輸送/吸收促進劑（例如阿斯匹靈、維生 素E、葉酸）、合成核糖核酸酶(例如σ米吐、雙D米唾、組織胺、 米0坐鎮（imidazole cluster)、吖咬米吐複合物、四氮巨環 (tetraza micro ring)之Eu3+複合物）等。 舉例來說，本發明之ssNc分子的前述5’末端亦可以填 酸基或磷酸基類似物作修飾。前述磷酸基可列舉如5’單磷 酸（(H0)2(0)P-0-5，）、5,二磷酸（(H0)2(0)P-0-P(H0)(0) _〇-5，）、5’ 三磷酸（(H0)2(0)P-0-(H0)(0)P-0-P(H0)(0)_ 0-5，）、5’-鳥苷帽（7-甲基化或非曱基化7〇1-0-0-5’-(H0)(0)P-0-(H0)(0)P-0-P(H0)(0)-0-5，）、5’-腺苷帽 (Αρρρ)、任意修飾或非修飾核苦酸帽結構（义〇-5’-(ηο)(〇)ρ-〇-(ηο)(ο)ρ-ο-ρ(ηο)(ο)-ο-5’)、5,單硫代磷酸(硫 代磷酸酯：（H0)2(S)P-0-5，）、5’一二硫代磷酸(二硫代磷酸 酯：（H0)(HS)(S)P-0-5，）、5’-磷硫醇酸((HO)2(〇)P-S-5，）、 經硫取代之單碳酸、二礙酸及三鱗酸（例如5’-01_硫代三構 酸、5，_γ-硫代三磷酸等）、5’-磷醯胺酯（(H0)2(0)P-NH-5’、 34 201217523 (H0)(NH2)(0)P-0-5，）、5’-烷基膦酸(例如RP(0H)(0)-0-5,、 (OH)2(〇)P-5，-CH2 ; R為烷基(例如曱基、乙基、異丙基、丙 基等）)、5，-烷基醚膦酸(例如RP(〇H)(0)-〇-5 ’ ； R為烷基醚(例 如甲氧基曱基、乙氧基曱基等))等。 於前述核苷酸殘基中，前述鹼基並未特別受限。舉例 來說，前述鹼基可為天然鹼基，亦可為非天然鹼基。舉例 來說，前述鹼基可源自天然，亦可為合成品。舉例來說， 前述鹼基可使用一般之鹼基，亦可使用其修飾類似物等。 前述驗基可列舉如腺嘌呤及鳥嘌吟等之嘌吟驗基、胞 嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶等之嘧啶鹼基。前述鹼基除此之 外還可列舉如肉苷、胸腺嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、 nubularine、isoguanisine、殺結核菌素(tubercidine)等。前述 鹼基可列舉如2-胺基腺嘌呤、6-曱基化嘌呤等之烷基衍生 物·’ 2-丙基化嘌呤等之烷基衍生物；5_函基尿嘧啶及5鹵基 胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；6_偶氮尿嘧 。定、6-偶氮胞。密。定及6-偶氮胸腺η密咬；5-尿〇密咬(假尿n密咬）、 4-硫代尿嘧啶、5-函基尿嘧啶、5-(2-胺基丙基)尿嘧啶、5_ 胺基烯丙基尿嘧啶；8_鹵基化、胺基化、硫醇化、硫烷基 化、羥基化及其他之8-取代嘌呤；5_三氟曱基化及其他之5_ 取代嘧啶，7-甲基鳥嘌呤；5-取代嘧η定；6-氮雜嘧。定；n-2、 Ν-6及0-6取代嘌呤(含2_胺基丙基腺嘌呤）；5_丙炔基尿嘧啶 及5-丙炔基胞嘧啶；二氫尿嘧啶；3_去氮_5•氮雜胞嘧啶 (3-deaZa-5-azacytosine) ; 2_胺基嗓呤；5烧基尿嘧啶；7烧 基鳥嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7_去氮腺嘌呤；N6, N6_二曱基 35 201217523 腺嘌呤；2, 6-二胺基嘌呤；5-胺基-烯丙基-尿嘧啶；N3-曱 基尿β密咬；取代1，2，4-三咕；2-°比咬酮；5-確基吲°朵；3-硝基吡咯；5-曱氧基尿嘧啶；尿嘧啶_5_氧乙酸；5-曱氧羰 基甲基尿嘧啶；5-曱基-2-硫代尿嘧啶；5-甲氡羰基曱基-2-硫代尿嘧啶；5-曱基胺基-2-硫代尿嘧啶；3-(3-胺基-3-羧丙 基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙醯基胞嘧 啶；2-硫代胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-異戊基腺嘌呤； 2-曱基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤；N-曱基鳥嘌呤；〇-烷基 化驗基等。此外，舉例來說，嘌吟及鳴咬包含：美國專利 第3,687,808號「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」，第858〜859頁，克羅修比茲.J. I.氏 (Kroschwitz J.I.)編，John Wiley & Sons，1990 ;及，英格 利修氏等人(Englisch等），Angewandte Chemie，International Edition ’ 1991，第 30 卷，ρ·613 所揭示之物。 前述修飾核苷酸殘基除了此等之外，舉例來說，亦可 包含缺損鹼基之殘基，即無鹼基之核糖磷酸骨架。又，舉 例來說’前述修飾核苷酸殘基可使用如美國暫時申請案第 60/465,665號（申請曰：2003年4月25曰）及國際申請案第 PCT/US04/07070號（申請曰：2004年3月8曰）所記載之殘 基’本發明可援用此等文獻。 3.非核苷酸殘基 刖述非核苷酸殘基並未特別受限。舉例來說，本發明 之ssNc分子可具有含吼啶骨架或哌啶骨架之非核苷酸結構 作為則述非核苷酸殘基。舉例來說，宜於前述連結區域(Lx) 36 201217523 及前述連結區域(Ly)中之至少一者具有前述非核苦酸殘 基。舉例來說，可於前述連結區域(Lx)具有前述非核苷酸 殘基’亦可於前述連結區域(Ly)具有前述非核苷酸殘基， 還可在前述連結區域之兩者中具有前述非核苷酸殘基。舉 例來說，前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)可相同亦可 相異。 舉例來說，前述吡啶骨架亦可為：構成吡啶之5員環的 碳中有1個以上受到取代之哌啶衍生物的骨架，且受取代的 情况下，舉例來說宜為C-2之碳以外的碳原子。舉例來說， 前述碳可以氮、氧或硫來取代。舉例來說，前述吡啶骨架 亦可在《•比奴5員環内含有例如碳_碳雙鍵或碳_氮雙鍵。前 述°比咬骨架中’舉例來說’構成喊之5員環的碳及氮可結 合有虱基’亦可結合有如後述之取代基。舉例來說，前述 連結區域(Lx)亦可透過前述㈣骨架巾之任__基而與前述 ，域(X)及前述區域(Xc)結合，且宜為前述5員環中之;壬一個 碳原子與氮原子’更宜為前述5員環之2位碳(C-2)與氮。前 ^比咬骨架可列舉如脯胺酸(_ine)骨架、脯胺醇㈣_ 骨架^ _來說’前述脯胺酸骨架及脯胺醇骨架等由於 是活體内㈣及其還原物’在安全性上亦優異。 舉例來說，前述靖架亦可為構成派咬之㈣環的碳 _上受到取代之娘销生物的骨架，受取代時，舉例 氮6 之碳以外的碳原子。舉例來說，前述碳可以 之6員^ Λ來取代°舉例來說，前述°辰°定骨架亦可在娘咬 衣内3有例如碳-碳雙鍵或碳_氮雙鍵。前述㈣骨架 37 201217523 中，舉例來說’構H定之6員環的碳及氮亦可結合氮基， 亦可結合如後狀取代基。舉例來說，料連結區域(Lx) 可透過前述㈣骨架中之任—基而與前述區域(X)及前述 區域㈣結合’且宜是前述6員環_之任—個碳原子與氣， 且更宜是前述6員環之2位碳(c_2)與氮。就前述連結區域㈣ 而言，亦是相同。 舉例來說，前述連結區域亦可僅是由前述非核賊結 構所構成之非核賊殘基，亦可含有前述非核賊構所構 成之非核苷酸殘基與核苷酸殘基。 前述連結區域例如可以下述式⑴表示。 【化1】 R3
前述式⑴令，X1及X2各自獨立為H2、〇、s或NH ; Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、Ο、或S ; R3為結合至環A上之C-3、C-4、C-5或C-6的氫原子或取 代基，且前述取代基為OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、 SH、SR4或側氧基(=〇); R3為前述取代基時，取代基R3可為1個或多數個，亦可 不存在，且有多數個時可相同亦可不同； R4及R5為取代基或保護基，且可相同或不同； 38 201217523 為η個原子所構成之伸絲鏈，於此，伸烧基碳原子 上之氫原子可以〇Η、〇Ra、簡2、NHRa ' NRaRb、犯或肥 取代，且亦可不受取代，或者是 L1為前述伸絲鏈中之―個以上碳原子受到氧原子取 代而成之聚趟鍵； 但Y1為NH、〇或S時，與γ1結合之L,的原子為碳，且與 OR結2合之L1的原子為碳’氧原子則彼此不鄰接， 為m個原子所構成之伸烧基鍵，於此，伸烧基碳原子 上之氫原子可以QH、〇Re ' Μ%、NHRC NReRd、阳或 取代或不受取代，或者， L2為前述伸絲鏈中之—個以上碳原子受到氧原子取 代而成之聚_鏈； 仁Y為NH、〇或S時，與γ2結合之的原子為碳，與 OR2結合之L2的原子為碳，氧原子彼此則不鄰接； R R'RAR各自獨立為取代基或保護基； 1為1或2 ; m為〇〜3〇範圍内之整數； n為〇〜30範圍内之整數； % Α中之刚述被Α上之C-2以外的1個碳原子亦可以 氮、氧或硫來取代； 削述内亦可含有碳，碳雙鍵或碳·氮雙鍵。前述連結 區域(Lx)以別述式⑴表示時’前述區域⑽及前述區域⑻ 刀别透過-OR _或-OR2·而結合至前述連結區域㈣。再者， 前述連結區域㈣以前述式⑴表示時 ，前述區域(Yc)及前 39 201217523 述區域⑺分別透過赚或视2_而結合至前述連結區域 C^y)。於此’ R>R2可存在亦可*存纟且存在時，^及 R分別獨立為核苷酸殘基或前述構造(I)。 前述式⑴中，舉例來說，X1及X2分別獨立為h2、〇、S 或nh。前述式附，X、H2意指：#χ|所結合之碳原子 共同形成阳(亞曱基）。就X2而言亦是相同。 於前述式(1)中，環A中之1為1或2。1=1時，環A為5員環， 舉例來說則為前述t定”。前述_骨架可例示如補胺 酸骨架、脯胺醇骨架等，其等之二價結構。1=2時，環八為6 員環，舉例來說則為前述哌啶骨架◊環八之♦，環A上之 以外的1個碳原子亦可經氮、氧或硫取代。此外，環A亦可 在％A之中含有碳-碳雙鍵或碳_氮雙鍵。舉例來說，環a可 為L型及D型中之任一者。 前述式（1)中，γΐ及γ2分別獨立為單鍵、CH2、NH、Ο 或S。 前述式(I)中，R3係與環A上之c_3、C_4、C-5或c_6結合 的氫原子或取代基。前述取代基為〇H、〇R4、NH2、NHR4、 R、SH、SR4或側氧基(=〇)。r3為前述取代基時，取代 基R3可為1個或多數個，亦可不存在；有多數個時，可相同 亦可不同^ R及R為取代基或保護基，且可相同亦可不同。 前述取代基可列舉如函素、烷基、烯基、炔基、鹵烷 基、芳基、雜芳基、芳烷基 '環烷基、環烯基、環烷基烷 基、環基烷基(cydylalkyl)、羥烷基、烷氧基烷基、胺烷基、 雜環基烯基(heterocyclyl alkenyl)、雜環基烷基、雜芳基烷 40 201217523 基、碎基及砍乳烧基等。以下相同。 舉例來說，前述保護基係將反應性較高之官能基轉換 成不活性之官能基，可列舉如習知之保護基等。前述保護 基可援用例如文獻(J. F. W. McOmie，「in
Organic Chemistry j Prenum Press, London and New York, 1973)之s己載。前述保護基並未特別受限，可列舉如第三 丁基二甲基矽基(TBDMS基）、雙(2-乙醯氧基乙基氧基）甲基 (ACE基）、三異丙基矽氧基甲基(T〇M基）、丨_(2_氰基乙氧基） 乙基(CEE基）、2-氰基乙氧基甲基(CEM基)及曱苯磺醯基乙 氧基甲基(TEM基）、二甲氧基三苯曱基(DMTr基）等。R3為 〇R4時’前述保護基並未特別受限，可列舉如TBDMS基、 ACE基、T01V[基、CEE基、CEM基及TEM基等。此外，亦 可列舉如後述[化5]之含矽基的基團。以下相同。 月1J述式(I)中’ L1為η個原子所構成之伸烧基鏈。舉例來 說’則述伸院基碳原子上之氫原子亦可經〇H、〇Ra、ΝΗ2、 NHRa ' NRaRb、SH或SRa取代，亦可不受取代。或者，Ll 亦可為前述伸烷基鏈之一個以上碳原子經氧原子取代而成 的I醚鏈。舉例來說，前述聚醚鏈為聚乙二醇。此外，γΐ 為ΝΗ、〇或s時，與γι結合之Li的原子為碳，與〇Rl結合之 L的原子為碳，氧原子彼此不鄰接。亦即，例如Y1為0時， 其氧原子與L,之氧原子不鄰接，且OR1之氧原子與L1之氧原 子不鄰接。 則述式⑴中，L2為m個原子所構成之伸烷基鏈。舉例來 先則述伸燒基碳原子上之氫原子可經OH、ORc、NH2、 201217523 、取^、SH或犯取代，亦可不受取代。或者，L2 亦可為前述伸綠狀—如上碳原子經㈣子取代而成 t㈣鏈。另，γ2為NH、〇物，與Y2結合之L2的原子為 反與OR結合之L2的原子為碳，氧原子則彼此不鄰接。亦 即’例如丫2為〇時’其氧原子紅2之氧原子不鄰接，⑽之 氧原子與L2之氧原子不鄰接。 L1之η及L\m並未特別受限，各自之下限例如為〇，上 阳亦未特別文限。舉例纟說，咕山可因應前述連結區域⑽) 之所欲長度而適當地料設定。舉例來說，從製造成本及 收率等觀點來看，nAm分別宜為Q〜3()，且更宜為Q〜2〇，尤 且為0〜15。11與„1可相同（n=m)亦可不同。舉例來說，n+m為 〇〜30，且宜為〇〜2〇，更宜為〇〜15。 R、R、Re及Rd各自獨立，可列舉如取代基或保護基。 舉例來說，前述取代基及前述保護基與前述者相同。 刖述式(I)中，舉例來說氫原子可分別獨立地被C卜Br、 F及I等i素取代。 前述連結區域(Lx)以前述式(I)表示時，舉例來說，前 述區域(Xc)及前述區域(X)分別透過_〇Rij_〇R2·而與前述 連結區域(Lx)結合。於此，R1及R2可存在亦可不存在。Ri 及R2存在時，R1及R2各自獨立為核苷酸殘基或前述式⑴之 結構。R1及/或R2為前述核苷酸殘基時，舉例來說，前述連 結區域(Lx)係由下述者形成：由核苷酸殘基Ri及/或r2除外 之前述式(I)結構所構成的前述非核苷酸殘基；及，前述核 苷酸殘基。R1及/或R2為前述式(I)結構時，舉例來說，前述 42 201217523 連結區域(Lx)會成為連結有2個以上前述式⑴結構所構成 之前述非核苷酸殘基而成的結構。前述式(I)之結構例如可 含有1個、2個、3個或4個。如前述般含有多數前述結構時， 牛例來》兒，刖述(I)之結構可直接連結亦可透過前述核苷酸 殘基而連結。另一方面，R1及R2不存在時，舉例來說，前 述連結區域(Lx)僅由前述式(I)結構所構成之前述非核苷酸 殘基所形成。此外，前述連結區域(Ly)以前述式⑴表示時， 舉例來說，前述區域(Yc)、前述區域(Y)及前述連結區域(Ly) 亦可援用前述連結區域(Lx)之說明。 前述區域(Xc)及前述區域(X)、以及前述區域(Yc)及前 述區域(γ)與前述-OR1-及-OR2-之結合的組合並未特別受 限’可列舉如下述任一條件。 條件（1) 前述區域(Xc)透過-〇R2-且前述區域(X)透過_〇Ri·而與 前述式(I)之結構結合；並且 月1J述區域(Yc)透過-OR1-且前述區域(γ)透過_〇R2_而與 前述式(I)之結構結合。 條件(2) 月1J述區域(Xc)透過-〇R2-且前述區域(X)透過_〇Ri_而與 前述式(I)之結構結合；並且 月’J述區域(Yc)透過-〇R2-且前述區域(γ)透過_〇RL而與 前述式(I)之結構結合。 條件(3) 月1J述區域(Xc)透過_〇Ri_且前述區域(X)透過_〇R2_而與 43 201217523 前述式（i)之結構結合；並且 前述區域(Yc)透過-OR1 -且前述區域(Y)透過-OR2-而與 前述式（I)之結構結合。 前述式(I)之結構可例示如下述式(1-1)〜式（1-9)，於下述 式中，η及m與前述式(I)相同。下述式中，q為0〜10之整數。 【化2】 44 201217523
• -(1-2)
45 201217523 前述式(1-1)-(1-9)中，η、m及q並未特別受限，如同前 述。作為具體例，可列舉如：前述式(M)中，n=8 ;前述(1-2) 中，n=3 ;前述式(1-3)中，n=4或8，前述(1-4)中，n=7或8 ; 前述式(1-5)中，n=3且m=4 ;前述(1-6)中，n=8且m=4 ;前述 式(1-7)中，n=8且m=4 ;前述(1-8)中，n=5且m=4 ;前述式(1-9) 中，q=l且m=4。茲將前述式（1-4)之一例（n=8)示於下述式 (I-4a)，並將前述式（1-6)之一例（n=5、m=4)示於下述式（I-6a)。 【化3】
於本發明中，舉例來說「烷基」包含直鏈狀或分枝狀 烷基。前述烷基之碳數並未特別受限，例如為1〜30，且宜 為1〜6或1〜4。前述烷基可列舉如：曱基、乙基、正丙基、 異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、 異戊基、新戊基、正己基、異己基、正庚基、正辛基、正 壬基及正癸基等。且較佳者可列舉如曱基、乙基、正丙基、 異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、 異戊基、新戊基、正己基及異己基等。 46 201217523 於本發明中’舉例來說「婦基」包含直鏈狀或分枝狀 之稀基。前料基可列舉如在前狀基巾具有_ 魏者等。祕烯基之钱並未特料限，_來說與前 述絲相同，且宜為2〜8。前述稀基可列舉如乙稀基、Η 烯基、2-丙烯基、i-丁稀基、2_丁埽基、3_ 丁稀基、卜％ 丁一烯基、3-甲基-2-丁烯基等。 於树明中，舉例來說「块基」包含直鏈狀或分枝狀 述絲刊舉如在前魏基中具有1個或多數個參 =專。前述炔基之碳數並未特別受限，舉例來說與前述 烧基相同，且线2〜8。前述絲可尊如乙絲、丙料、 Z炔基#。舉例來說，前述炔基亦可更具#1個或多數個雙 及中’舉例來說「芳基」包含單環芳香族煙基 等夕=⑽基。前料料香㈣射列舉如苯基 專。前述多環芳香族煙基可列舉如b蔡基、 2-蒽基、9-茛美、丨_站坡心丞 A 土 土、-菲基、3_菲基、4-菲基及9-菲 基專。且料者可釋如苯基、卜萘基及2.萘鱗之萘基等。 月中’舉例來說「雜芳基」包含單環芳香族雜 &芳香族雜環基。前述雜芳基可列舉如咬喃基(例 =-咬喃基、外南基卜塞吩基(例如：2_。塞吩基、3嗟 口力基）、吡咯基（例如· 比各基、2_吡咯基、3-吡咯基）、咪 1 :二如·1_咪唑基、2_咪唑基、4_咪唑基)、D比唑基(例如： 一一土、3_°比唾基、4_°比唾基）、三唾基(例如··卜2，4_ 二0坐小基、1，2，4_三〇坐_3_基、卜2，4-三唾-4.基）、四唾 47 201217523 基（例如：1 -四α坐基、2-四唾基、5-四α坐基）、。坐基（例如： 2- 噚唑基、4-噚唑基、5-哼唑基）、異哼唑基(例如：3-異。号 。坐基、4-異σ坐基、5-異4 α坐基）、η塞α坐基(例如：2-°塞α坐基、 4-。塞唾基、5_°塞°坐基）、α塞二α坐基、異°塞。坐基(例如：3-異嗔 0坐基、4-異。塞。坐基、5-異°塞唾基）、α比。定基(例如：2-°比°定基、 3- σΛσ定基、4-σ比σ定基）、塔11井基（例如：3-°荅σ牛基、井基）、 。密。定基(例如：2-°密α定基、4-°密α定基、5-。密α定基）、σ夫咕基(例 如：3-呋咭基）、吡畊基(例如：2-吡啡基）、哼二唑基(例如： 1，3，4-哼二唑-2-基）、苯并呋喃基(例如：2-苯并[b]呋喃 基、-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、 6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基）、苯并噻吩基(例如： 2-苯并[b]噻吩基、3-笨并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基）、苯并 咪唑基(例如：1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑 基、5-苯并咪唑基）、二苯并呋喃基、苯并噚唑基、苯并噻 。坐基、喧基（例如：2-啥°号淋基、5-啥。等琳基、6-啥。号 啉基）、咔啉基(例如：3-咔啉基、4_咔啉基、5_啐啉基、6-0辛琳基、辛琳基、8-吟琳基）、啥°坐淋基(例如：2-啥哇琳 基、4-喧。坐琳基、5-0¾°坐琳基、6-喧°坐淋基、7-喧。坐琳基、 8-喧。坐琳基）、喧琳基(例如：2-喧琳基、3-喧淋基、4-喧琳 基、5-喧琳基、6-喧琳基、7-喧琳基、8-啥琳基）、吹_基(例 如：1-°太α井基、5-吹°井基、6-吹σ井基）、異喧琳基（例如：1-異喹啉基、3-異喹啉基、4-異喹啉基、5-異喹啉基、6-異喹 琳基、7-異唾琳基、8-異喧琳基）、嘌呤基、嗓σ定基(例如： 48 201217523 基、。丫，基、7,定基)，基、，定 A 9卿列如…丫…小定基、3十定基、… :了觸如：，基〜㈣基 二：基、5__、6，基'7侧、㈣ 輕1Γ “啊基、2·啡他編销例：【- 卜=基、2•啡料基、3_啡替基、4+議)等。 碳數Γ;發财’舉例來說，「環燒基」為環狀飽和烴基， :戍美：：3〜15。前述環烷基可列舉如環丙基、環丁基、 二二、％、己基、環庚基、環辛基、橋接環烴基及螺煙基 基等。宜為環丙基、環丁基、環戊基、環己基及橋接環煙 ;本發月+橋接環煙基」可列舉如雙環[2.1.0]戊基、 雙環[2·2.1]庚基、雙環[2·2·2]辛基及雙環p训辛基、三環 [2.2.L〇]庚基、雙環[3.3·1]壬烧、1-金剛烧基、2-金剛烧基 於本發明中「螺烴基」可列舉如螺[3.4]辛基等。 於本發明中，舉例來說「環烯基」包含環狀不飽和脂 肪族L基，ί反數則例如3〜7個。前述基可列舉如環丙稀基、 %丁烯基、環戊烯基、環己烯基及環庚烯基等，且宜為環 丙烯基、環丁烯基、環戊烯基及環己烯基等。舉例來說， 則述裱烯基亦包含環中具有不飽和鍵之橋接環烴基及螺烴 基。 於本發明中’ 「芳烷基」可列舉如苄基、2_笨乙基及 奈甲基等，「環烷基烷基」或「環基烷基(cyclylalkyl)」可 49 201217523 列舉如環己基曱基及金剛烷基曱基等，「羥烷基」則可列 舉如羥曱基及2-羥乙基等。 於本發明中，「烷氧基」包含前述烷基-0-基，可列舉 如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基及正丁氧基等， 「烷氧基烷基」可列舉如曱氧基甲基等，「胺基烷基」則 可列舉如2-胺基乙基等。 於本發明中，「雜環基(heterocyclyl)」可列舉如1-°比σ各 淋基、2-°比π各淋基、3-°比咯琳基、1-°比°各。定基、2-。比略°定基、 3-。比11各。定基、°比°各α定酮、1-°米唾琳基、2-味唾淋基、4-°米。坐 淋基、定基、2-°米。坐。定基、4-_α坐σ定基、味唾11定酮、 1_〇比α坐琳基、3-°比σ坐嚇基、4-。比。坐琳基、1-°比°坐。定基、3-0比 。坐。定基、4-。比。坐°定基、。比。坐。定酮、Ν-六氫°比°定基、2-旅0定 基、3-α辰。定基、4-旅α定基、1-旅°丼基、2-°底。井基、D底 口井酮、2-咮琳基、3-咮琳基、N-味琳基、四氫α底喃基及四 氫呋喃基等。 於本發明中，「雜環基烷基」可列舉如哌啶基甲基、 哌D井基曱基等，「雜環基烯基」可列舉如2-哌啶基乙烯基 等，「雜芳基烷基」則可列舉如吡啶基曱基及喹啉-3-基曱 基等。 於本發明中，「矽基」包含式R3Si-所示之基，R可獨 立選自前述烷基、芳基及環烷基，可列舉如三曱基矽基、 第三丁基二甲基矽基等，「矽氧基」可列舉如三曱基矽氧 基等，「矽氧基烷基」可列舉如三甲基矽氧基曱基等。 於本發明中，「伸烷基」可列舉如亞甲基、伸乙基及 50 201217523 伸丙基等。 於本發明中’前述各種基亦可經取代。前述取代基可 列舉如經基、羧基、鹵素、鹵化烷基(例如：cf3、ch2cf3、 CI^CCl3)'硝基、亞硝基、氰基、烷基(例如：曱基、乙基、 異丙基、第三丁基）、烯基(例如：乙烯基）、炔基(例如：乙 炔基）、環烷基(例如：環丙基、金剛烷基）、環烷基烷基(例 如：環己基曱基、金剛烷基曱基）、環烯基(例如：環丙烯基）、 芳基(例如：苯基、萘基）、芳烷基(例如：苄基、笨乙基）、 雜芳基(例如：°比啶基、呋喃基）、雜芳烷基(例如：吡啶基 曱基）、雜環基（例如··哌啶基）、雜環基烷基（例如： Morpholylmethyl)、烷氧基(例如：曱氧基、乙氧基、丙氧 基、丁氧基）、齒化烷氧基(例如：OCF3)、烯氧基(例如：乙 稀氧基、_氧基）、耗基(例如：笨氧基）、絲叛基(例 如：甲氧Μ、乙氧数基、第三T氧縣）、芳院氧基(例： 苄氧基）、胺基[烷基胺基(例如：曱基胺基、乙基胺基、二 甲基胺基）、醢基胺基(例如：乙醯基胺基、苯其 芳院基胺基(例如1基胺基、三苯甲基胺基）、經^胺^]、 院基胺基錄(㈣：二f基料f基）、㈣喊、側氧基 等。 4.本發明之ssNc分子之合成方法 本發明之優分子合0法並切㈣限，可採用習 用公知之方法。前述合成方法可列舉如㈣基因工學手法 之合成法及化學合成法等。基因工與左1 ^ ^ ^ 予乎法可列舉如活體外 轉錄合成法、使用載體之方法、利 用PCR卡E之方法。前 201217523 述載體並未特別受限’可列舉如質體等之非病毒載體以及 病毒載體等。前述化學合成法並未特別受限，可列舉如亞 鱗醢胺法（phosphoramidites meth〇d)及H_膦酸鹽法 (H-phosphonate method)。舉例來說，前述化學合成法可使 用市售之自動核酸合成機。前述化學合成法一般使用亞醯 胺（amidite)。前述亞醯胺並未特別受限，市售之亞醯胺可列 舉如RNA Phosphoramidites(2’-〇-TBDMSi，商品名，三千 里製藥）、ACE亞醯胺及TOM亞醯胺、CEE亞醯胺、〇ΕΜ亞 醯胺、TEM亞醯胺等。 5.組成物 如前述，本發明之抑制表現用組成物係一種用以抑制 目標基因表現之組成物，特徵在於含有前述本發明2SsNc 分子。本發明之組成物係以含有前述本發明之ssNc分子為 特徵，至於其他構成則並未受到任何限制。舉例來說，本 發明之抑制表現用組成物亦可稱為抑制表現用試劑。 若依本發明，舉例來說，可藉由投藥予存有前述目標 基因之對象來進行前述目標基因之表現抑制。 此外，本發明之藥學組成物係如前述，其特徵在於含 有前述本發明之嫌分子。本發明之組成物係以含有前述 本發明之ssNc分子為特徵，至於其他構成則並未受到任何 限制。本發明之藥學組成物例如亦可稱為醫藥品。 若依本發明，舉例來說，藉由投藥予基因為疾病成因 之患者，則可抑制前述基因之表現進而治療前述疾病。於 本發明中，舉例來說’「治療」如前述般包含前述疾病之預 52 201217523 防、疾病之改善及預後之改善等意義，且可為其中任一者。 於本發明中’治療對象之疾病並未特別受限，可列舉 如基因表現為成因之疾病。僅需因應前述疾病之種類，將 該疾病成因之基因設定為前述目標基因’再因應前述目標 基因來適當設定前述抑制表現序列即可。 作為具體例’若將前述目標基因設為前述TGF_pi基 因，並將對於前述基因之抑制表現序列配置於前述ssNc* 子，則可使用於例如炎症性疾病（具體來說則是急性肺傷害） 等的治療上。 本發明之抑制表現用k成物及藥學組成物（以下稱為 組成物）的使用方法並未特別受限，舉例來說，僅需將前述 ssNc分子投予具有前述目標基因之投傾象即可。 月’J述技藥對象可列舉如細胞、組織或器官。前述投藥 對象可列舉如人類、人_除外之非人哺乳類等之非人動 物。舉例來說，前述投予 』為活體内（in vivo)亦可為活體外 )月】述、、、田胞並未特別受限，可列舉如HeLa細胞、 293細胞、NIH3T3細胞、
b u C〇S細胞等之各種培養細胞、ES 、-、田胞、造血幹細胞等之蘇 離出之細_。 幹、，及初代培養細麟從活體單 前述投予方法並未牲 對象來適當衫。前述^ $限，舉例純，刊應投予 可列舉如使用轉:象為培養細胞時，舉例來說， method)等。 去及電穿孔法（electroporation 舉例來說，本發明 、'且成物可僅含本發明之ssNc分 53 201217523 選擇 亦可更s有其他添加物。前述添加物並未特別受限， 例來說’宜為藥學上可接受之添加物。前述添加物之種 Γ未特別受限’舉例來說可因應投予對象之種類來適當 於本發明之組成物中舉例來說前述_分子亦可 杨物㊉成錯合物。前述添加物舉例來說亦可稱為 a #由形成刖述錯合物’舉例來說，可有效率地輪 分子。前述ssNe分子與前述錯化劑之結合並^ 又^可列舉如非共價結合。前述錯合物可列舉如内 含錯合物（inclusioncomplexati〇n)。 前述錯化劑並未特別受限’可列舉如聚合物、環糊精 =金剛烧胺等。前述環糊精可列舉如線狀環糊精共聚物、 線狀氧化環糊精共聚物等。 除此之外，則述添加劑可列舉如載子(carder)、對目伊 物為、縮合劑、融合劑及賦形劑等。 舉例來說、述裁子宜為高分子，更宜為生源高分子。 舉例來說’前述栽子宜具生分解性。前述載子可列舉如， 人類血清白蛋白⑽Α)、低密度脂蛋白（LDL)、球蛋. 蛋白質；聚葡糖、聚三葡萄糖(pullulan)、幾丁質、幾之 糖、菊糖、環糊精、玻尿酸等之糖質；脂質等。前述I聚 舉例來說亦可使用合成聚胺基酸等之合成聚合物。前:子 胺基酸可列舉如聚離賴(PLL)、聚[_天門冬㈣酸、=聚 麵醯胺酸、苯乙秦順謂二醆酐共聚物、聚(L•乳酸交妒 共-乙交S旨）共聚物、二乙烯_•順τ烯二酸酐共聚物、=' 54 201217523 羥丙基）甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚 乙烯醇(PVA)、聚胺甲酸_、聚(2_乙基丙婦酸）、N-異丙基 丙烯醯胺聚合物或聚磷腈(p〇1yphosPhazine)等。 前述結合物質玎列舉如促甲狀腺激素、促黑細胞素、 凝集素、醣蛋白、表面張力素蛋白A(surfactant protein A)、 黏蛋白糖質、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳胺糖、 N-乙醯葡萄糖胺、多價甘露糖、多價海藻糖、醣化聚胺基 酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸鹽（酯）類 (Bisphosphonate)、聚麩醯胺酸、聚天門冬醯胺酸、脂質、 膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸鹽、維生素B12、生物素、 納普洛仙(Neproxin)、RGD狀、RDG狀擬似物等。 前述融合劑及縮合劑可列舉如聚乙亞胺(PEI)等之聚胺 基酸鏈等。舉例來說，PEI為直鏈狀及分枝狀中之任一者皆 可，且可為合成物及天然物中之任一者。舉例來說，前述 PEI可經烷基取代，亦可經脂質取代。再者，除此之外，前 述融合劑可使用聚組胺酸、聚米°坐、聚°比η定、聚丙亞胺' 蜂毒肽(melittin)及聚乙縮醛物質（例如陽離子性聚乙縮醛等） 等。舉例而言，前述融合劑亦可具有α螺旋結構。前述融合 劑舉例來說亦可為蜂毒肽等之膜崩解劑。 舉例而言，本發明之組成物就前述錯合物之形成等可 援用美國專利第6，509，323號、美國專利公報第 2003/0008818 號及 PCT/US04/07070號等。 除此之外’前述添加劑可列舉如兩親媒性分子。舉例 而言，前述兩親媒性分子為具有疎水性區域及親水性區域 55 201217523 之分子。前述分子舉例來說宜為聚合物。舉例而古，& ° 月 聚合物為具有一級結構之聚合物，且宜為具有反復性_級 結構之聚合物。作為具體例，聚例來說宜為多肽，更宜為α 螺旋狀多肽等。 前述兩親媒性聚合物舉例來說亦可為具有2個以上兩 親媒性次單元之聚合物。前述次單元(subunit)可列舉如具有 環狀結構之次單元，且該環狀結構具有至少丨個親水性基及 1個疎水性基。前述次單元舉例來說亦可具有膽酸等之類固 醇、方香族結構尊。舉例來說，前述聚合物亦可具有芳香 族次單元等之環狀結構次單元與胺基酸兩者。 6.表現抑制方法 如前述，本發明之表現抑制方法係一種抑制目標基因 表現之方法，特徵在於使用前述本發明2SsNc分子。本發 明之表現抑制方法係以使用前述本發明之SSNC分子作為特 徵’至於其他步驟及條件則不受任何限制。 本發明之表現抑制方法中’抑制前述基因表現之機制 並未特別受限’可列舉如RNA干擾或類RNA干擾現象所引 起之表現抑制。於此，舉例來說，本發明之表現抑制方法 係一誘導可抑制前述目標基因表現之干擾的方法，亦 可說是以使用前述本發明之ssNc分子為特徵之表現誘導方 法0 本發明之表現抑制方法舉例來說包含一對存有前述目 標基因之對象投予前述ssNc分子的步驟。透過前述投予步 驟，舉例來說，使前述ssNc分子接觸前述投予對象。前述 56 201217523 投予對象可列舉如細胞、組織或⑼。前述投予對象可列 舉如人類、人類以外之非人哺乳類等之非人動物。前述投 予舉例來說可在減内（in viv。)亦可在活财加vi加）。 舉例而§’本發明之表現抑制方法可單獨投予前述 ssNc分子’亦可投予含有前述_分子之前述本發明植成 物。前述投予方法並未特別受限，舉例來說可因應投予對 象之種類來適當選擇。 7.治療方法 本發明之疾病治療方法係如前述，包含一將前 明之嫌好投予患者之㈣，且_在於1述咖八 子具有-可抑制前述疾病成因之基因表現的序列刀 抑制表現序列。本發明之治療方法細使用前述本發^ 嫌分子作為⑽4料他步㈣料财月之 制。本發明之治療方法舉例來财援㈣述本」限 抑制方法。前雜予枝衫特觀制例 ^表現 予及非經口投予中之任一者。 馬故口投 8. ssNc分子之用途 本發明之用途係-種用以抑制前述目標基 前述本發明ssNc分子的用途。茈々k丄 衣現的 述此外，本發明之用途 用以誘導RNA干擾之前述本發明晰分子的用途。糸1 本發明之核酸分子係一種用於治療疾病之核峻分子 前述核酸分子為前述本發明之SsN 刀千， 之特徵在於:具有可抑制前述疾病分子 义庆病成因之基因表 作為前述抑制表現序列。 凡的序列 57 201217523 以下藉由實施例等來詳細說明本發明，但本發明不受 此等之限定。 【實施例】 (實施例Al) RNA之合成 合成如下所示之SSRNA(NK-0016)作為實施例之 RNA(Ex)。前述NK-0016具有19個鹼基長的抑制表現序列 (序列編號1)，其可抑制GAPDH基因之表現。NK-0016之序 列中，區域(Xc)與區域(X)之間為連結區域(Lx)，區域（Y) 與區域(Yc)之間為連結區域(Ly)(以下相同）。 GAPDH基因抑制表現序列(序列編號1) 5 ’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3， 【化4】
Ex :NK-00 1. 6 (序列編號 2) 5，_ .caugaqaagaaugacaacaqccccACAcqgacuGMtfGUCAUACBWCttCAO^uo^ocqqa^ -3* xc x Y Tc 合成如下所示之RNAi陽性控制組（pc)之 dsRNA(NI-0011)作為比較例之RNA。NI-0011於各單股之3, 末端具有2個驗基之突出（overhang)，且序列編號4之單股與 前述NK-0016相同地具有前述19個驗基長之抑制表現序列。 【化5】
Pc:NI-0011 S# - CCAUGAGAAGUAUGACAACAG -3f (序列編號3) 3f - Ul/GGUACUCUUCAUACUGUUG -5f i序歹丨」編號4) 前述RN A係以亞磷醯胺法為準且利用核酸合成機（商· 58 201217523 品名 ABI Expedite(註冊商標）8909 Nucleic Acid Synthesis System，Applied Biosystems)來合成。前述合成中，RNA 亞 醯胺係使用 RNA Phosphoramidites(2’-0-TBDMSi，商品 名，三千里製藥）(以下相同）。前述亞醯胺之脫保護係依定 法進行者。以HPLC純化所合成之RNA。純化後之RNA分別 進行冷凍乾燥。於以下之實施例中，只要無特別表示，即 與本實施例相同地進行RNA之合成。 使用注射用蒸餾水（大塚製藥，以下相同），使經冷凍乾 燥之RNA溶解成所需濃度。 (實施例A2)HCT 116細胞中之G APDH基因之表現抑制效果 使用本發明之ssRNA，確認活體外（in vitro)之GAPDH 基因表現抑制。 (1)材料及方法 使用前述實施例A1之ssRNA(NK-0016)作為實施例之 RNA(Ex) 〇 【化6】 E X : NK —0 〇 1 6 (序列編號2)
5,_ ^ugagaaguaugacaacaqccpCACftCCGGCOGiiugOCAUACliucucAPyOTUiyUUCqga^ _3, XC X Y YC 使前述RNA溶解於注射用蒸餾水至所需濃度，調製出 RNA溶液。細胞使用 HCT116細胞(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd)，培養基使用含有l〇%FBS之McCoy’s 5A(Invitrogen)培養基，令培養條件為37°C且5%C〇2下。 首先，於前述培養基中培養HCT116細胞，將400μί之 59 201217523 該培養液分別注入24井皿中而成為2><104細胞/井。更將前述 井中之細胞培養24小時後，使用轉染試劑Lipofectamine 2000(商品名’ Invitrogen)，依照所附規程（protocol)將前述 RNA進行轉染。具體來說，則是將前述每井之組成設定如 下並進行轉染。此外，於前述井中，令前述RNA之最終濃 度為 5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L。 表1 (每井之組成：μΐ^) 培養液 400 (A)Lipofectamine 2000 1.5 (B)Opti-MEM (Invitrogen) 98 iC)RNA溶液 0.5 合計 500 轉染後，將前述井中之細胞培養48小時，之後使用 RNeasyMiniKit(商品名，Qiagen)， 依照所附規程回收RNA。接著，使用逆轉錄酶（商品名
Superscript III，Invitrogen)，依照所附規程而從前述RNA 合成出cDNA。接著，以合成出之前述cDNA為模板進行 PCR，測定GAPDH基因之表現量以及為内部標準之β_肌動 蛋白基因的表現量。前述GAPDH基因之表現量已藉前述β_ 肌動蛋白基因之表現量來修正。
前述PCR使用 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(商品名，Roche)作為試劑，並使用Light Cycler DX400(商品名，Roche)作為機器（以下相同）。前述GAPDH 60 201217523 基因及β-肌動蛋白基因之擴增分別使用以下之引子組。 GAPDH基因用引子組 5，-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3,(序列編號 9) 5 ’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3 ’ (序列編號 10) β-肌動蛋白基因用引子組 5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’(序列編號 11) 5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’(序列編號 12) 此外，作為控制組1 ’亦對僅添加前述(Β)ΙΟΟμΙ^之細胞 測定基因表現量(-)。又，作為控制組2，亦對在轉染過程中 未添加前述RNA溶液而添加前述（A)1.5pL與前述（Β)共 1 ΟΟμί以外經同樣處理之細胞測定基因表現量（mock)。 而就修正後之GAPDH基因表現量，則令控制組㈠之表 現量為1，求出已導入各RNA之細胞的表現量相對值。 (2)結果 茲將其等之結果示於第4圖。第4圖為顯示GAPDH基因 表現量相對值之圖表。如第4圖所示般，前述NK-0016與未 添加RNA之控制組㈠相較下為較低之表現量，而得知已抑 制GAPHD基因之表現。此外，如第4圖所示，得知顯示出 投予量相依性之基因表現抑制效果。 (實施例A3 )HCT 116細胞中之GAPDH基因之表現抑制效果 使用本發明之ssRNA，確認活體外（in vitro)之GAPDH 基因表現抑制。 (1)材料及方法 使用前述貫施例A1之ssRNA(NK-0016)作為實施例之 61 201217523 RNA(Ex)。比較例之RNA則使用RNAi陽性控制組(pc)之前 述dsRNA(NI-0011)。使前述RNA溶解於注射用蒸餾水至成 為40pmol/L，調製出RNA溶液。 除使用前述RNA溶液之外，與前述實施例A2同樣地確 認HCT116細胞中之GAPDH基因表現量。令轉染時之RNA 濃度為40nmol/L。 (2)結果 兹將其等之結果示於第5圖。第5圖係一顯示GAPDH基 因表現量相對值之圖表，縱軸為相對基因表現量。如第5圖 所示，前述實施例之NK-0016與比較例之NI-0011相較下， 顯示出極強之基因表現抑制活性。 (實施例A4)A5 49細胞及293細胞中之GAPDH基因表現抑制 效果 使用本發明之ssRNA ’確認RNA干擾效果所引起之活 體外(invitro)GAPDH基因表現抑制。 (1)材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用前述實施例A1之ΝΚ-0016及以 下之Ex-ssRNA(PK-0004)。前述PK-0004中，連結區域(Lx) 及連結區域(Ly)係使用實施例B所示流程3之化合物1 〇(L-脯 胺酸二醯胺亞醯胺）而使Xc與X之間及Yc與Y之間結合。茲 將前述兩鏈結（linker)之化學式顯示於下。前述NK-0016與 前述PK-0004除了 Xc與X之間的連結區域(Lx)以及Yc與Y之 間的連結區域(Ly)不同之外’製成相同序列。 【化7】 62 201217523
Ex :ΝΚ-0016 (序列編號2) 5'- .cauqagaaguaugacaacagccCCftCACCGGCUGWUGWCAWACUWCUCAUGGUacuuCGgaa. -3,
Xc x Y TC
Ex : ΡΚ—0004 (序列編號 13) 5，_ .caugagaaguaugacaacagcc·-Lx-pocuguaaucAUACPUCPCAuagutiq-Ly-qaa -3·
Xc Z Yc 〇 (FH2)4〇-〇 V-nh , i r
—o(h2cv 使前述RNA溶解於注射用蒸餾水至成為2(^m〇l/L，調 製出RNA溶液。細胞使用A549細胞及293細胞(DS Pharma Biomedical)。前者之培養基使用含l〇〇/〇FBS之 DMEM(Invitrogen)，後者之培養基則使用含i〇%FBS之 MEM(Invitrogen)培養基。令培養條件為37°C且於5%C02下。 首先，於前述培養基中培養細胞，並將該培養液以 400μί各別注入24井皿而成為5χ104細胞/井。更將前述井中 之細胞培養24小時後，使用轉染試劑Lipofectamine 2000(商 品名’ Invitrogen)並依照所附規程而將前述RNA予以轉染。 具體來說，則是對A549細胞及293細胞分別將前述每井之組 成設定如下並進行轉染《於下述組成中，（B)為Opti-ΜΕΜ(商 品名’ Invitrogen)，（C)為20pmol/L之前述RNA溶液，將兩 者一起添加98.5pL或99pL。此外，於前述井中，令前述RNA 之最終濃度為 lnmol/L、3nmol/L、10nmol/L。 表2 63 201217523 (每井之組成：μι) A 549細胞 293細胞 培養液 400 400 (A) Lipofectamine 2000 1.5 1 98.5 99 合計 500 500 轉染後，將前述細胞培養48小時，與前述實施例A2同 樣地進行RNA回收、cDNA合成及PCR，測定GAPDH基因 之相對表現量。 (2)結果 茲將該等結果示於第6及7圖。第6圖為A549細胞之結 果，第7圖為293細胞之結果。第6及7圖為顯示GAPDH基因 表現量相對值之圖表。如第6及7圖所示，實施例之NK-0016 及PK-0004顯示出強烈之基因表現抑制活性’且顯示出濃度 相依性之效果。 (實施例A5)Hepal-6細胞中之TGF-βΙ基因表現抑制效果 就本發明之ssRNA，確認活體外之TGF-β 1基因表現抑 制效果。 (1)材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用以下所示之ssRNA(NK-0033)。 前述NK-0033具有可抑制TGF-βΙ基因表現且21個鹼基長之 下述序列。該序列係以Cheng氏等人所使用之siRNA(Mol. Pharm·, 2009, 6, 772-779)為準設計者。 TGF-βΙ基因抑制表現序列（序列編號16) 64 201217523 5，- AAAGUC A AUGUAC AGCUGCUU-3， 比較例之RNA使用如下所示之RNAi陰性控制組(Nc)的 ssRNA(NK-0035)。NK-0035並非組入前述抑制表現序列， 而疋組入與表現抑制無關之擾亂序列（scramble sequences)。 【化8】
Ex :ΝΚ—0033 (序列編號80) s，-cagcuguacauugacuuuagccccftCACCGCCUAAAaucAAUGuacAGcuGcuucuucGgaa-s^
Xc 2 Yc
Nc :NK — 00 3 5 (序列編號 15) 5’-pgucaqugcucauuuacaagcqCCACAOCpgcuu 抑 xc ζ 使前述RNA溶解於注射用蒸餾水而調製出RNA溶液。 細胞使用Hepal-6細胞（理化學研究所BioResource Center)，培養基使用含 10%FBS之DMEM(Invitrogen)培養 基，令培養條件為37°C、5%C02。 首先，於前述培養基中培養Hepal-6細胞，將該培養液 各以400μί分別注入24井皿中，成為3xl04細胞/井。更將前 述井中之細胞培養24小時後，使用轉染試劑Lipofectamine 2000(商品名，Invitrogen)並依照所附規程，將前述ssRNA 予以轉染。具體來說，則是將前述每井之組成設定如下並 進行轉染。於下述組成中，（B)為Opti-ΜΕΜ(商品名， Invitrogen) ’（C)為20pmol/L之前述RNA溶液，將兩者一起 添加98·5μί。此外，於前述井中，令前述RNA之最終濃度 為 10nmol/L、25nmol/L、50nmol/L及 100nmol/L。 表3 65 201217523 (每井之組成：μΐ) 培養液 400 (A) Lipofectamine 2000 1.5 98.5 合計 500 轉染後，將前述井中之細胞培養48小時，之後使用 RNeasy Mini Kit(商品名，Qiagen)並依照所附規程回收 RNA。接著，使用逆轉錄酶（商品名Superscript Ill(Invitrogen))，依照所附規程而從前述RNA合成出 cDNA。接著，除了使用下述TGF-βΙ基因用PCR引子組及β_ 肌動蛋白基因用引子組之外，與前述實施例Α2同樣地進行 PCR，測定TGF-βΙ基因表現量及内部標準之β-肌動蛋白基 因表現量。前述TGF-βΙ基因之表現量係以前述β-肌動蛋白 基因之表現量來修正。 TGF-βΙ基因用引子組 5’-CCATTGCTGTCCCGTGCAGAGCTG-3’(序列編號 17) 5’-ATGGTAGCCCTTGGGCTCGTGGATC-3’(序列編號 18) β-肌動蛋白基因擴增用引子組 5 ’-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3 ’ (序列編號 19) 5 ’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3 ’ (序列編號 20) 首先，與前述實施例Α2同樣地就控制組㈠及控制級 (mock)測定基因表現量。接著，針對補正後之TGF-βΙ基因 表現量，令控制組(-)之細胞表現量為1，求出導入有各RNA 之細胞的表現量相對值。 66 201217523 (2)結果 錄將该等結果示於第8圖。第8圖為顯示TGF-βΙ基因表 現里相對值之圖表。如第8圖所示，前述實施例之NK-0033 於活體外抑制了 TGF卩丨基因之表現。另一方面，陰性控制 組之NK-0035則未抑制TGF (31基因之表現。 (實施例A6)活體内（in vivo)之TGF-βΙ基因表現抑制效果 及急性肺傷害抑制效果 針對本發明之s s RN A確認活體内之基因表現抑制及急 性肺傷害抑制效果。前述效果之確認係依照Takagi氏等人 (J.Thromb Hemost 2009 ; 7 : 2053-2063)所記載之方法進行。 (1)材料及方法 (1 · 1)對急性肺傷害小鼠投予ssrna 實施例之RNA(Ex)使用前述實施例A5之 ssRNA(NK-0033)。比較例之RNA則使用前述實施例A5所示 之RNAi陰性控制組(Nc)的 ssRNA(NK-0035)。 使l〇〇Hg之前述RNA溶解於滅菌生理食鹽水（日本化 藥’以下相同）80μί，調製出RNA溶液。另一方面’使1〇〇μβ 之脂多醣(LPS)溶解於滅菌生理食鹽水50pL，調製出LPS溶 液0 首先，使80μί之前述RNA溶液滴定至小鼠之氣管内。 從滴定起1小時後，使50μί之前述LPS溶液滴定至前述小鼠 之氣管内而誘發肺傷害亡。 作為相對於前述LPS之陰性控制組，使用50pL未添加 LPS之滅菌生理食鹽水來取代前述LPS溶液。此外’相對於 67 201217523 前述RNA溶液之陰性控制組則使用80μί之滅菌生理食鹽 水0 以下顯示各投予群。各投予群使用4〜6隻小鼠。 •投予群1 自投予8(^L之滅菌生理食鹽水起1小時後，投予50μί 之滅菌生理食鹽水。 •投予群2 自投予80μί之RNA溶液(ΝΚ-0033)起1小時後，投予 50pL之滅菌生理食鹽水。 •投予群3 自投予8(^L之RNA溶液（NK-0035)起1小時後，投予 50pL之滅菌生理食鹽水。 •投予群4 自投予80μί之滅菌生理食鹽水起1小時後，投予50μΙ 之前述LPS溶液。 •投予群5 自投予80μΙ^之RNA溶液(ΝΚ-0033)起1小時後，投予 50μί之前述LPS溶液。 •投予群6 自投予80μί之RNA溶液(ΝΚ-0035)起1小時後，投予 50μί之前述LPS溶液。 (1.2)支氣管肺胞洗淨液(BALF)之採樣 自滴定前述LPS溶液起24小時後，對前述小鼠之腹腔投 予過剩量之戊巴比妥使其安樂死，製成生化學解析及組織 68 201217523 學解析之樣本。陰性控制組則是添加滅菌生理食鹽水來取 代前述LPS溶液。 穿刺則述小鼠之心臟，回收血液樣本並添加至含有 3.8°/。擰檬酸鈉水溶液之試管。令前述擰檬酸鈉水溶液之量 (體積）為前述血液樣本之1/1〇。依照Yasui氏等人(Ain j
Respir Crit Care Med 2001 : 163 : 1660-8)之記載，從該混合 液回收BALF樣本。接著，使用Nucie〇c〇unter(商品名， ChemoMeted社）測定前述bALF樣本中之總細胞數。 此外’將前述BALF樣本供予離心分離，回收前述BALF 樣本之上清液，至進行生化學分析為止，保存於_80°c下。 再者，為了計數前述BALF樣本所含不同種類之細胞，使用 細胞離心塗片器（CytoSpin)將前述BALF樣本作離心分離， 並使用May-Grunwald-Giemsa(商品名，Merck)將分離出之 細胞作吉姆沙染色。此外，從前述小鼠採取肺組織，進行 HE染色。 (2)結果 (2.1)肺中之TGF-β1基因表現抑制 針對前述小鼠之肺樣本，使用TGF-βΙ Quantikine Colorimetric Sandwich ELISA(商品名，R&D Systems社）， 測定每單位重量之肺的TGF-βΙ表現量。 兹將其結果示於第9圖。第9圖為圖表’顯示各投予群 中每單位重量之肺的TGF-P1基因表現量。LPS(+)/RNA(-) 之投予群4與LPS(-)/RNA(-)之投予群1相較下，經LPS處理 之結果即是前述基因之表現量增加。且LPS(+)/NK-0033(+) 69 201217523 之實施例投予群5與LPS(+)/RNA(-)投予群4相較下，前述基 因之表現量上昇受到抑制。該抑制效果並未在LPS(+)/陰性 控制組NK-0035(+)之投予群6觀察到。從此一結果得知，可 藉由前述實施例之NK-0033來有效抑制TGF-βΙ基因之表 現。 (2 · 2 )急性肺傷害抑制效果 急性肺傷害之炎症係因嗜中性球等之細胞浸潤至肺而 產生。因此，可抑制嗜中性球等細胞對肺浸潤之藥物會成 為急性肺傷害之炎症治療藥。在此，將支氣管肺胞洗淨液 (BALF)中之細胞數作為已朝肺浸潤之細胞數的指標，確認 本發明ssRNA之藥理效果。 茲將前述BALF樣本中之細胞數測定結果示於第1〇 圖。第10圖為圖表，顯示各投予群之BAFL樣本中之細胞 數》LPS(+)/RNA(-)之投予群4與LPS(-)/RNA(-)之投予群1相 較下，經LPS處理之結果即是前述BALF樣本中之細胞數增 加。這顯示出炎症作用因LPS而受到誘導，其結果為細胞浸 潤至肺。再者，LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5與 LPS(+)/RNA(-)之投予群4相較下，細胞數之上昇受到抑 制。這顯示急性肺傷害之炎症因前述NK-0033而受到抑制。 此一抑制效果並未在LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投 予群6中觀察到。由此結果得知，可藉由前述實施例之 NK-0033來有效抑制急性肺傷害之炎症。 茲將前述BALF樣本中之嗜中性球數測定結果示於第 11圖。第11圖為圖表，顯示各投予群之BALF樣本中之嗜中 70 201217523 性球細胞數。LPS(+)/RNA(-)之投予群4與LPS(-)/rna(-)之 投予群1相較下，經LPS處理之結果即是前述Balf樣本中之 嗜中性球數增加。這顯示炎症作用因LPS而受到誘導，其結 果為嗜中性球浸潤至肺。再者，LPS(+)/NK-0033(+)之實施 例投予群5與LPS(+)/ssRNA㈠之投予群4相較下，前述BALF 樣本中之嗜中性球數之上昇受到抑制。這顯示急性肺傷害 之炎症因前述NK-0033而受到抑制。此一抑制效果並未在 LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6中觀察到。由此 結果得知’可藉由前述實施例之NK-0033來有效抑制急性肺 傷害之炎症。 (2.3) 組織學上的觀察：吉姆沙染色 茲將吉姆沙染色之結果示於第12圖。第12圖為照片， 顯示前述BALF樣本中之細胞的吉姆沙染色結果（倍率1〇〇 倍）。於第12圖中，（A)為LPS(+)/RNA(-)之投予群4的結果， (B)為LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6的結果，（C) 顯示LPS(+)/NK-003 3(+)之實施例投予群5的結果。 如第12圖所示，LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群 5 (C)與LPS(+)/RNA(-)之投予群4(A)及LPS(+)/陰性控制組 NK-0035(+)之投予群6(B)相較下，浸潤至肺之細胞數顯著 較少。此種組織學上的觀察與前述BALF樣本中之細胞數結 果一致。 (2.4) 組織學上的觀察：HE染色 茲將HE染色之結果示於第13圖。第1〇圖為照片，顯示 前述肺組織之HE染色結果(倍率10倍）。於第1〇圖中，（A)為 71 201217523 LPS(+)/RNA㈠之技予群4的結果’⑻為Lps(+)/陰性控制組 NK-0035(+)之技予群6的結果，（c)顯示Lps(+)/NK 〇〇33(+) 之實施例投予群5的結果。從第13圖得知嗜巾性球等之細 胞朝血管關、肺胞腔内、肺胞壁及支氣管周邊之浸潤減 少，肺組織之傷害性降低。 (實施例A7)以誘導干擾素為指標之副作用評估 習知方法之iRNA劑已知其副作用會序列非相依性地 誘導干擾素，且該副作用被視為問題。於此，就本發明之 ssRNA評估誘導干擾素之副作用。 (1)材料及方法 藉由與前述實施例A6相同之方法及條件，對急性肺傷 害小鼠進行ssRNA之投予。接著，與前述實施例A6相同地 滴定前述LPS溶液或滅菌生理食鹽水（相對於LPS之陰性控 制組）’過24小時後使小鼠安樂死，採取肺組織。 表4 投予群 RNA LPS 1 — — 2 Ex ： NK-0033 — 4 — + 5 Ex ： NK-0033 +
EX :實施例之RNA
Nc : RNAi陰性控制組之RNA 為了測定各基因之表現量，使用TRIZOL(商品名， Invitrogen)從前述肺組織分離出RNA。其次，使用逆轉錄酶 (商品名SuperScriptll，Invitrogen)，依照所附規程從前述 RNA合成出cDNA。接著，將合成出之前述cDNA用作模板 72 201217523 進行PCR，測定出TGF-βΙ基因、IFN-α基因及IFN-β基因之 表現量。 前述 PCR 使用 Gold AmpliTaq(商品名，Applied Biosystem，美國）作為試劑，測定機器則使用AB Applied Biosystem 7600(商品名，Applied Biosystem)°TGF-pi基因、 IFN-α基因及IFN-β基因之擴增分別使用以下之引子組。 GAPDH基因用引子組 5’-CCCTTATTGACCTCAACTACATGGT-3’(序列編號 21) 5 ’-GAGGGGCCATCC AC AGTCTTCTG-3 ’ (序列編號 22) TGF-βΙ基因用弓|子組 5’-ACTCCACGTGGAAATCAACGG-3 ’(序列編號23) 5’-TAGTAGACGATGGGCAGTGG-3 ’(序列編號24) IFN-α基因用引子組 5’-ATGGCTAGRCTCTGTGCTTCCT-3’(序列編號25) 5’-AGGGCTCTCCAGAYTTCTGCTCTG-3’(序列編號 26) IFN-β基因用引子組 5 ’-CATCAACTATAAGCAGCTCCA-3，(序列編號27) 5’-TTCAAGTGGAGAGCAGTTCAG-3(序列編號28) 接著，使所得PCR產物進行瓊脂電泳。此外，針對電 泳後之瓊脂使用NIH imaging system進行密度解析，確認各 基因之表現量。前述TGF-βΙ基因、前述IFN-α基因及前述 IFN-β基因之表現量係各自以前述GAPDH基因之表現量為 標準，並相對性地作評估。具體來說，則是令使用前述 GAPDH基因用引子組之PCR產物的測定強度為標準1，求出 73 201217523 使用各基因用引子組之PCR產物的測定強度相對值並進行 評估。 (2)結果及考察 茲將關於前述TGF-βΙ基因、IFN-α基因及IFN-β基因之 表現量的定量解析結果分別顯示於第14(A)〜(C)圖之圖 表。各投予群與前述實施例A6同樣地係如下所示。 第14(A)圖為TGF-βΙ基因表現量之結果。如第14(A)圊 所示，已投予前述NK-0033之實施例投予群5與RNA(-)之投 予群4相較下，以抑制了受LPS誘導之TGF-βΙ基因表現上 昇。此一結果與前述實施例A5之第8圖所示TGF-βΙ表現量 的測定結果呈正相關。 第14(B)圖係顯示IFN-a基因表現量之結果’第14(C)圖 係顯示IFN-β基因表現量之結果。如第14(B)圖及第14(C)圖 所示，未添加LPS時，將RNA(-)之投予群1與RNA(+)之投予 群2予以比較之結果’並未發生因添加ssRNA所導致之 IFN-a基因及IFN-β基因（屬1型干擾素）的表現誘導。此外， 如第14(B)圖及第14(C)圖所示，添加LPS時，將RNA(-)之投 予群4與NK-0033(+)之投予群5予以比較的結果’同樣地未 發生因添加ssRNA所導致之1FN_a基因及IFN-β基因的表現 誘導。 此一結果與會產生1型干擾素誘導之副作用的習知 siRNA結果呈對照。亦即’本發明之ssRNA超乎意料地不會 產生在習知方法中成為問題之干擾素誘導的副作用，此一 事實已受到證實。 74 201217523 (實施例A8)Hepal-6細胞中之TGF-βΙ基因的表現抑制效果 針對本發明之SSRNA，確認活體外之TGF-βΙ基因的表 現抑制效果。 (1)材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用前述實施例A5之NK-0033以及 如下所示之NK-0061、NK-0055及NK-0062。於下述序列中， 「*」表不自由驗基。 【化9】
Ex :NK —0033 (序列編號80) 5' -cagcuguacauugacuuuagccCCACACCGGCUftAAGUCAAUGUACAGCUGCUUCUUCGgaa-3， Xc z Yc
Ex :NK—0061 (序列編號29) b'- agcuguacauugacuuuagccCCACACCGGCUAAAGUCAAUGUACAGCUGCUUCUUCGgaa -3, Xc Z Yc
Ex : NK-0055 (序列編號30) 5,- agcagcuguacauugacuuuagccCCACACC<3GCUAAAGUCAAUGUACAGCUGCWCUUCG|g| -3f Xc z Yc
Ex :NK—0062 (序列編號31)
,gcagcuguacauugacuuuagcccCACACCGGCUAAAGUCAAUGUftCAGCUGCUUCTOCGg |-3f Xc z YC 此外，實施例之RNA(Ex)使用下述PK-0007、PK-0026、 PK-0027及PK-0028。該等ssRNA中，連結區域(Lx)及連結 區域(L y)係使用實施例B所示流程3之化合物1 〇 (L -脯胺酸二 亞醯胺）而使Xc與X之間以及YC與γ之間結合。 【化10】 75 201217523
Ex : ΡΚ—0007 (序列編號32) 5/- _cagcuguacauugacuuuagcc「Lx-^OCUAAROUCAAUOTACAOCtiecuvc·-Ly'ga今-3’ xc z Yc E x : P K - ◦ 0 2 6 (序列編號33) 5,_ -peCUAAAeUCJUUIGUACAeCUeClHiCTliy^ga^ -3/
Xcl z YC
Ex :PK—0027 (序列編號34)
Xc z Yc
Ex : PK—00 2 8 (序列編號35) 5,- ,gcagcuguacauugacuuuagcq-L>{-_GgCUAAAOTCAAllGUAC；vqcu<gC<Juq-Ly~；g_ -3, Xc z yc [NK-0033、NK-006卜 NK-0055、NK-0062]與[PK-0007、 PK-0026、PK-0027]及[PK-0028]除了 前述第 1 連接子(LI)及 第2連接子(L2)不同之外，為相同之序列，且均有可抑制 TGF-β 1基因表現之序列（序列編號16)。 (1.2)基因之表現抑制 使已冷凍保存之前述RNA溶解於注射用蒸餾水而成為 20pmol/L ’調製出RNA溶液。接著，除了使用前述RNA溶 液之外’與前述實施例A5同樣地進行前述ssrnA對 Hepal-6細胞之轉染、RNA回收、cDNA合成及PCR。測定 TGF-βΙ基因之相對表現量。令轉染時之RNA濃度為 lnmol/L 〇 (2)結果 茲將此等結果示於第15及16圖。第15圖及第16圖為圖 表，分別顯示TGF-βΙ基因表現量之相對值。第15圖係使用 NK-0033、NK-0061、NK-0055及NK-0062之結果，第 16圖 76 201217523 係使用 ΡΚ-0007、ΡΚ-0026、PK-0027及PK-0028之結果。如 第15及16圖所示，任一個SSRNA均顯示出強烈之基因表j見 抑制活性。 (實施例A9) 活體内之T G F - β 1基因表現抑制效果及急性肺傷害抑制 效果 (Α9-1)活體内之TGF-βΙ基因表現抑制效果 使用本發明之ssRNA，確認活體内之TGF-βΙ基因的表 現抑制效果。 (1)材料及方法 對於急性肺傷害小鼠之RNA投予，只要未特別表示， 即與前述實施例A6相同地進行。 實施例之RNA(Ex)使用前述實施例A85之PK-0007及 NK0033。此外，比較例之RNA則使用以下所示之RNAi陰 性控制組(Nc)的PK-0008及NK-0035、RNAi陽性控制組(pc) 之dsRNA(NI-0030)及RNAi陰性控制組（Nc)之 dsRNA(NI-0031)。陰性控制組之PK-0008與PK-0007相同， 具有源自前述亞醯胺（流程3之前述化合物10 : L-脯胺酸二 醯胺亞醯胺）之連接子Lx及Ly。 【化11】 77 201217523
Ex : ΡΚ—0007 (序列編號32) 5,- ΙιΧ-(ίΟ<：υΑΑΑ<«>€ΑΑ_ΑΟΑ(Κ：υ<ί<：1»；ς- I»y-_ga弓-3,
Xc z yc
Ne : ΡΚ—00ϋ8 (序列編號36) 5#- .ugucaqugcucauuuacaagcc^-Lx-pqcuuquAAAUOAqcACOOACAcauq-Ly-ga^ -3' Xc Z Yc
Ex:NK-〇〇33 (序列編號 80) y -cagcuguacauugacuuuagc^ccacRCCG<K：UAAasucAAUQUACA〇cuGCUucuucGgaf>-3, Xc z Yc N c : N K - 0 〇 3 5 (序列編號 15) S’-ugucagugcucauuuacaagccCCACACCqacauoPAiVAUOAqcACPOACACOPCUUCGffaa-3· Xc z Tc
Pc:NI-0030 5/ - GCAGCUGUACAUUGACUUUA6 -3f (序列編號39) 3/ -UUCGUCGACAUGUAACUGAAA -5^ (序列編號40) N c : N I - 0 0 3 1 - GUGUCAGUGCUCAUUUACAAG -3/ (序列編號41) 3' -UUCACAGUCACGAGUAAAUGU -S' ί序列編號42) 使100pg之前述RNA溶解於滅菌生理食鹽水75gL，調製 出RNA溶液。另一方面，使100pg之脂多醣(LPS)溶解於滅 菌生理食鹽水50μί，調製出LPS溶液。 茲將各投予群顯示如下。只要無特別表示，即與前述 實施例Α6同樣地進行投予。各投予群中使用4〜6隻小鼠。 •投予群1 自投予滅菌生理食鹽水75pL起5分鐘後，投予滅菌生理 食鹽水50pL。 •投予群2 自投予滅菌生理食鹽水75μί起5分鐘後，投予前述LPS 溶液50μί。 78 201217523 •投予群3 自投予75μί之RNA溶液(PK-0007)起5分鐘後，投予前 述LPS溶液50μί。 •投予群4 自投予75μί之RNA溶液(ΡΚ-0008)起5分鐘後，投予前 述LPS溶液50μί。 •投予群5 自投予75μί之RNA溶液(ΡΚ-0033)起5分鐘後’投予前 述LPS溶液50μί。 •投予群6 自投予75pL之RNA溶液(ΡΚ-0035)起5分鐘後’投予前 述LPS溶液50μ[。 •投予群7 自投予75μί之RNA溶液(ΡΚ-0030)起5分鐘後’投予前 述LPS溶液50μί。 •投予群8 自投予50μ[之RNA溶液(ΡΚ-0031)起5分鐘後’投予前 述LPS溶液50μΙ。 接著，與前述實施例Α6同樣地調製肺樣本’測定每單 位重量之肺的TGF-βΙ表現量。 茲將其結果示於第Π圖。第17圖為圖表’顯示各投予 群中每單位重量之肺的TGF-βΙ表現量。LPS(+)/PK-0007(+) 之投予群3及LPS(+)/NK-0033(+)之投予群5分別與 LPS(+)/ssRNA㈠之投予群2相較，TGF-βΙ基因之表現量受 79 201217523 到抑制。此一抑制絲與LPS(+)/陽性控制組NI_0〇30之投予 群7相較下日_較強。制是，LPS(+)/PK-_7(+)之投予群 3顯不出顯著之抑制效果。另，經投予陰性控制組之RNA的 投予群4(ΡΚ-0〇〇8)、投予群6(nk_〇〇35)及投予群8(ni 〇〇;31) 未確認抑制效果。 (A9-2)活體内之脫靶(off-target)效果 使用本發明之ssRNA，確認活體内之脫靶效果，並評 估副作用。 實施例之RNA使用前述實施例A8之 ssRNA(PK-0007)。比較例之RNa則使用前述實施例A9-1所 示之RN Ai陰性控制組(Nc)的ssRNA(PK_〇〇〇8)、RNAi陽性控 制組（Pc)之dsRNA(NI-0030)及RNAi陰性控制組之 dsRNA(NI-0031)。接著，使ΐ〇〇μβ之前述RNA溶解於滅菌生 理食鹽水75μί，調製出RNA溶液。 茲將各投予群顯示如下。各投予群中使用2〜4隻小鼠。 •投予群1 投予滅菌生理食鹽水75μί。 •投予群2 投予75pL之RNA溶液(ΡΚ-0007)。 •投予群3 投予75μί之RNA溶液(PK-0008)。 接著，從投予起24小時後’與前述實施例Α6相同地從 小鼠回收BALF樣本，獲得前述BALF樣本之上清液。就刖 述上清液測定TNF-α量及IFN-β量。前述TNF-α量係使用商 80 201217523 品名 Mouse TNF set II(Beckton Dickinson and Company)，依照其使用說明書作定量。此外，前述iFN-β 量係使用利用商品名 Rabbit Anti-Mouse Interferonp(PBL InterferonSource)及商品名 Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化 學研究所）而製作出之ELISA分析微量盤(ELISA plate)，依 照其等之使用說明書作定量。 茲將其等之結果示於第18圖。第18(A)圖為圖表，顯示 各投予群之BALF樣本中之TNF-α量；第18(B)圖為圖表，顯 示各投予群之BALF樣本中之IFN-β量。於第18圖中，橫軸 顯示個別之量。前述PK-0007(+)之投予群2與RNA(-)之投予 群1相較下，並未引發TNF-α及IFN-β之表現。 (實施例A10)293細胞中之LAMA1基因表現抑制效果 使用本發明之ssRNA，確認RNA干擾效果所導致之活 體外LAMA1基因的表現抑制。 (1)材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用下示NK-0(M3及NK-0064。於下 述序列中，「*」表示自由鹼基（以下相同）。 【化12】
Ex :ΝΚ — 0043 (序列編號43) GGAUAUUGUAACGAGACAAAC^OTCOTJCG^ga| - 2 Yc 3f 5f- uguuugucucguuacaauauccCCACACC Xc
Ex ·· NK— 0 0 6 4 (序列編號44) 承 5’- aguguuugucucguuacaauauccCCACACCG6AUAimgUAa.CGAG&CRaACACUCCUOCGtg丨-3’ Xc Z Yc 81 201217523 除了使用前述RNA之外，與前述實施例A4相同地對293 細胞進行轉染，將前述細胞培養48小時。令轉染時之RNA 濃度為10nmol/L。接著，除了引子使用以下之LAMA1基因 用引子組之外，與前述實施例A2相同地進行RNA回收、 cDNA合成及PCR，測定LAMA1基因表現量及内部標準之β-肌動蛋白基因表現量。藉由内部標準之β-肌動蛋白基因表 現量來修正前述LAMA1基因之表現量。 LAMA1基因用引子組 5’-AAAGCTGCCAATGCCCCTCGACC-3’(序列編號 45) 5 ’-TAGGTGGGTGGCCCTCGTCTTG-3 ’ (序列編號 46) 此外，與前述實施例A2同樣地，亦就控制組1(-)及控制 組2(mock)測定表現量。之後，針對修正後之LAMA1基因表 現量，令控制組(-)之細胞表現量為卜求出已導入各RNA之 細胞的表現量相對值。 (2)結果 茲將該等結果示於第19圖。第19圖為圖表，顯示293細 胞之LAMA1基因表現量的相對值。如第19圖所示，得知實 施例之NK-0043及NK-0064顯示出強烈的基因表現抑制活 性。 (實施例A11)A549細胞中之LMNA基因表現抑制效果 使用本發明之ssRNA，確認RNA干擾效果所導致之活 體外LMNA基因的表現抑制。 (1)材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用以下所示之NK-0063及 82 201217523 NK-0066。於下述序列中，「*」表示自由鹼基（以下相同）。 【化13】
Ex :ΝΚ — 0063 (序列編號47) cgucaccaaaaagcgcaauuccCCACACCGGAAUUGCGCUUUUUGGUGACGCUUCUUCGgaa| -3， Xc z Yc
Ex :NK— 0066 (序列編號48) 5* - agcgucaccaaaaagcgcaauuccccACACCj3GaAUUGCGCUUUUUGGUGftCG〇iUCUUCGg| -3, Xc z Yc 除了使用前述RNA之外，與前述實施例A4相同地對 A549細胞進行轉染，培養前述細胞48小時。令轉染時之RNA 濃度為3nmol/L。接著，除了引子使用以下之LMNA基因用 引子組之外，與前述實施例A2相同地進行RNA回收、cDNA 合成及PCR ’測定LMNA基因之表現量及内部標準之β-肌動 蛋白基因表現量。藉由内部標準之β_肌動蛋白基因表現量 修正前述LMNA基因表現量。 LMNA基因用引子組 5 ’-CTGGACATCAAGCTGGCCCTGGAC-3 ’ (序列編號 49) 5 ’-CACCAGCTTGC0CATGGCCACTTC-3 ’ (序列編號 50) 此外’與前述實施例A2相同地，亦就控制組1㈠及控制 組2(mock)測定表現量。接著，針對修正後之LMNA基因表 現量’令控制組(-)之細胞表現量為1，求出已導入各RNA之 細胞的表現量相對值。 (2)結果 茲將該等結果顯示於第20圖。第20圖為圖表，顯示A549 83 201217523 細胞之LMNA基因表現量的相對值。如第20圖所示，得知 實施例之ΝΚ-0063及ΝΚ-0066顯示出強烈之基因表現抑制 活性。 (實施例Al2)Xc與Yc之長度 針對本發明之ssRNA，使與前述内部5’端側區域(X)互 補之前述5 ’端側區域(XC)的長度以及與前述内部3，端側區 域(Y)互補之前述3’端側區域(YC)的長度發生變化，確認活 體外之GAPDH基因表現抑制。 (1)材料及方法 實施例之RNA使用第21圖所示ssRNA。於第21圖中， 右端之編號表示序列編號。於第21圖中，從5’端側起，劃 底線之小寫字母區域表示前述區域(Xc)，劃底線之大寫字 母區域表示前述内部區域(Z)，劃底線之小寫字母區域表示 前述區域(Yc)。前述Xc與前述Z之間為連結區域(Lx)，前述 Z與前述Yc之間為連結區域(Ly)。此外，「Xc/Ycj表示前 述區域(Xc)之驗基長（Xc)與前述區域(Yc)之驗基長（Yc)的 比。於第21圖中，「*」表示自由鹼基（以下相同）。 各ssRNA均令内部區域(Z)之鹼基長為26個鹼基、連結 區域(Lx)之鹼基長為7個鹼基、連結區域(Ly)之鹼基長為4 個鹼基。此外，NK-0036及NK-0040係令前述區域(XC)與前 述區域(Yc)之合計鹼基數(Xc+Yc)為26鹼基，除此之外，令 前述區域(Xc)與前述區域(Yc)之合計鹼基數(XC+YC)為25個 鹼基。接著，在此條件下，使前述區域(Xc)及前述區域(YC) 之鹼基長發生變化。藉此，將NK-0〇36及NK-0040製成不具 84 201217523 有自由鹼基之分子。其等之外的則是令前述内部 區域(z)中不形成雙股之自由鹼基全部成為1個鹼基，且使 前述内部區域(Z)中前述自由鹼基之位置從3,端側變動為5’ 端側。 除了使用前述RNA之外，與前述實施例A2相同地進行 對於HCT116細胞之轉染、培養、RNa回收、cdnA合成及 PCR，測定GAPDH基因之相對表現量。令轉染時之rnA濃 度為 10nmol/L。 (2)結果及考察 茲將該等結果示於第22圖。第22圖為圖表，顯示使用 最終濃度為1 Onmol/L之RNA時的GAPDH基因表現量相對 值。如第22圖所示，已使前述5,端側區域(xc)及前述3,端側 區域(Yc)之長度發生變化的任一 ssRNA均可確認到GAPDH 基因之表現抑制。 特別是，已確認隨著前述區域(Xc)之鹼基長與前述區 域(Xc)之鹼基長的差增大，基因表現量相對降低，表現抑 制活性增加。亦即，越是將前述内部區域(Z)中自由鹼基之 位置配置在較前述内部區域中央更偏5’端側或3’端側，越可 提高前述表現抑制活性。 於前述實施例A2中，已確認NK-0016具有極強烈之表 現抑制活性。在本實施例中，則是確認NK-0025及NK-0037 具有更超越前述NK-0016之活性。 另外’關於自由鹼基之位置，舉例來說，即使是以不 同於本實施例之TGF-βΙ基因作為對象的實施例A8、以 85 201217523 LAMA1基因作為對象之實施例A10、以LMNA基因作為對 象之實施例All，亦獲得同樣之效果。 亦即，在前述實施例A8中，如前述序列所示，NK-0033 與NK-0055均具有1個鹼基之自由鹼基，前者位在内部區域 (Z)之3,末端起算第4個，後者位在内部區域(Z)之3’末端起 算第2個。接著，如前述第15圖所示，自由鹼基位在更靠3’ 末端側之NK-0055顯示出較高之表現抑制。即使在自由鹼基 為2個鹼基之NK-0061與NK-0062之間，亦是同樣的結果。 此外，實施例A 9及實施例10係在與前述實施例8相同之條件 下使自由驗基之位置發生變化，但仍是相同地，自由驗基 位在更靠3’末端側之ssRNA顯示出較高之表現抑制。 從此等結果亦可明確看出，無論目標基因之種類以及 對其之抑制表現序列，均顯示出同樣的行為(behavior)。因 此’本發明之ssRNA可說是可不論目標基因種類而均適用 之工具。 (實施例A13)X、Xc、Y及Yc之長度 針對本發明之ssRNA，使前述内部5’端側區域(X)、前 述5’端側區域(xc)、前述内部3,端側區域(Y)及前述3’端側 區域(Yc)之各個長度發生變化，並確認活體外之GAPDH基 因表現抑制。 (1)材料及方法 實施例之RNA使用第23圖所示ssRNA。第23圖中，右 端編號表示序列編號。第23圖中，自5,端側起，劃底線之 小寫字母區域表示前述區域(Xc)，劃底線之大寫字母區域 86 201217523 表示前述内部區域(z) ’劃底線之小寫字母區域表示前述區 域(Yc)。此外，「Xc+Yc/X+Y」表示前述區域(Xc)及前述 區域(Yc)之鹼基長合計與前述區域(X)及前述區域(Y)之鹼 基長合計的比。於第23圖中，「*」表示自由鹼基。 各ssRNA均令連結區域(Lx)之鹼基長為7個鹼基、連結 區域(Ly)之鹼基長為4個鹼基 '前述區域(Yc)之鹼基長為1 個鹼基’且令前述内部區域(Z)之3’端側起第2個鹼基為自由 鹼基。接著，使前述内部區域(Z)之鹼基長與前述區域(Xc) 之鹼基長發生變動。 只要無特別表示，即與前述實施例A2相同地就前述 RNA ’進行對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA 合成及PCR，測定GAPDH基因表現量。前述轉染條件係使 前述每井之組成設定如下。於下述組成中，（B)為 Opti-MEM(商品名、Invitrogen) ’（C)為20pmol/L之前述RNA 溶液，兩者合併添加98.5μί。於前述井中，令前述RNA之 最終濃度為lnmol/L。利用内部標準之修正以及表現量相對 值之算出亦是與前述實施例A2相同地進行。 表5 (每井之組成：pL) 培養液 400 (A) Lipofectamine 2000 1.5 (B) +(C)_93Λ 合計 500 87 201217523 (2)結果及考察 茲將該等結果示於第24圖。第24圖為圖表，顯示使用 最終濃度為lnmol/L之RNA時GAPDH基因表現量之相對 值。如第24圖所示’針對業已使前述區域(X)、前述區域 (Xc)、前述區域(Y)及前述區域(Yc)之長度發生變化之任一 ssRNA，均已確認到GAPDH基因之表現抑制。此外，前述 實施例A2中’已確認NK-0 016顯示出極強烈之表現抑制活 性。在本實施例中，則是確認NK-0016以外之ssrnA均具有 更超越NK-0016之活性。 (實施例A14)Xc之長度 針對本發明之ssRNA，使與前述内部5,端側區域(X)互 補之前述5 ’端側區域(Xc)的長度發生變化，確認活體外之 GAPDH基因表現抑制。 (1)材料及方法 貫施例之RNA使用第25圖所示ssrna。於第25圖中， 自5知側起，劃底線之小寫子母區域表示前述區域(xc)，劃 底線之大寫字母區域表示前述内部5,區域(X)，劃底線之小 寫字母區域表示前述區域(YC)。此外，「Xc/Yc」表示前述 區域(Xc)之鹼基長(Xc)與前述區域(χ)之鹼基長(X)的比。第 25圖中，「*」表示自由鹼基。下述尺^^八之序列顯示於序 列編號74〜76。 各ssRNA均令内部區域(Z)之鹼基長為26個鹼基、前述 區域(X)為25個鹼基、前述區域(¥)為丨個鹼基、前述區域(Yc) 為1個鹼基、連結區域(Lx)之鹼基長為7個鹼基、連結區域(Ly) 88 201217523 之鹼基長為4個鹼基。接著在此條件下，使前述區域(XC)之 驗基長發生變化。各SSRNA藉此使前述内部區域(Z)中不形 成雙股之自由鹼基的有無及數量發生變化。另外，NK-0001 不具有自由驗基。 除了使用前述RNA之外，與前述實施例A13同樣地進行 對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及 PCR，測定GAPDH基因表現量。利用内部標準之修正以及 表現量相對值之算出亦是與前述實施例A13同樣地進行。 (2)結果及考察 茲將其該等結果示於第26圖。第26圖為圖表，顯示使 用最終濃度為1 nmol/L之RNA時GAPDH基因表現量之相對 值。如第26圖所示，已使前述5,端側區域(Xc)長度發生變化 之任一ssRNA均已確認到GAPDH基因之表現抑制。特別是 在具有自由鹼基時，其數量越少，越可提高前述表現抑制 活性。此外，前述實施例A2中，已確認NK-0016具有極強 烈之表現抑制活性。在本實施例中，則是確認NK-0016以外 之ssRNA全部具有超越NK-0016之活性。 另外，就自由鹼基之個數，舉例來說，即使是以不同 本實施例之TGF-βΙ基因作為對象的實施例A8，亦獲得同樣 之效果。亦即，如前述實施例A8之序列所示，NK-0033與 NK-0061之自由鹼基在前者為1個鹼基，後者為2個鹼基。接 著，如前述第15圖所示，自由鹼基較少之NK-0033顯示出 較高之表現抑制。再者’ NK-0055與NK-0062係如實施例A12 所示，與前述NK-0033及前述NK-0061相較下，使自由鹼基 89 201217523 之位置變動至更偏内部區域(Z)之3’端側，藉此表現出較高 之表現抑制。由此等結果亦可明確得知，無論目標基因之 種類以及對其之抑制表現序列，均顯示出同樣的行為。因 此，本發明之ssRNA可說是可不論目標基因種類而均適用 之工具。 (實施例A15)連接子（linker)之互換性 針對本發明之ssRNA，使前述内部5’端側區域(X)與前 述5 ’端側區域(Xc)間之連結區域(Lx)以及前述内部3 ’端側 區域(Y)與前述3 ’端側區域(YC)間之連結區域（Ly)發生變 化，並確認活體外之GAPDH基因表現抑制。 (1) 材料及方法 實施例之RNA使用第27圖所示ssRNA。第27圖中，從5, 端側起，劃底線之小寫字母區域表示前述5,端側區域(χ〇 , 劃底線之大寫字母區域表示前述内部區域(Ζ)，劃底線之小 寫字母區域表示前述3’端側區域(yc)。前述X與前述xc間之 序列為連結區域(Lx) ’前述Y與前述Yc間之序列為連結區域 (Ly)。此外’針對各RNA，顯示連結區域(Lx)之鹼基長(Lx) 與連結區域(Ly)之鹼基長（Ly)的比（Lx/Ly)。於第27圖中， 「*」表示自由驗基。 除了使用前述RNA以外，與前述實施例A13相同地進行 對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及 PCR ’測定GAPDH基因表現量。利用内部標準之修正、表 現量相對值之算出亦是與前述實施例A13同樣地進行。 (2) 結果及考察 90 201217523 茲將此等結果示於第28圖。第28圖為圖表，顯示用最 終濃度為1 nmol/L之RNA時GAPDH基因表現量之相對值。 如第28圖所示，即使就已使前述連結區域(Lx)及(Ly)之條件 (即長度、兩者間之長度比、序列等）發生變化的任一ssRNA 而言，同樣地確認到GAPDH基因之表現抑制。從此結果得 知，前述連結區域(Lx)及(Ly)之條件並未特別受限，可設計 成各種長度及序列等。 (實施例A16)HCT116細胞中GAPDH基因之表現抑制效果 使用已藉具有脯胺酸或脯胺醇之連接子作置換的 ssRNA，確認HCT116細胞中之GAPDH表現抑制效果。 (1)材料及方法 合成下示RNA(Ex ssRNA)以作為實施例之RNA(Ex)。 此外，合成下示RNAi之陰性控制組(Nc)的Nc ssRNA以作為 合成比較例之RNA。於下述式中，連結區域(Lx)及連結區 域(Ly)使用具有脯胺酸或脯胺醇之下表的亞醯胺（實施例B 參照），使Xc與X之間以及Yc與Y之間結合。 【化14】 E X s s RNA (序列編號14) 5,- .caugagaaguaugacaacagccTLx-^GCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUC^Ly-gaa」-3,
Xc 2 Yc N c s s R N A (序列編號38) 5f- ccaucaacgauaagugaaagcC"Lx-GGCUUUCACUUAUCGUUGAUGGCUUC-Ly--gaaj-3，
Xc Z Yc 91 201217523 表6 ssRNA 用於LJLy之亞醯胺 ------- -------- 比較例 實施例 PK-0003 PK-0004 L-脯胺酸二醯 (流程 3 ——__ PK-0005 PK-0006 脯胺醇胺甲酸酯亞醯胺 (流程 7 --- PK-0009 PK-0010 — 脯胺酸醯胺-胺亞醯胺 (流程 3 ---- PK-0011 PK-0012 脯胺酸醯胺醯脲亞醯胺 (流程 3 ---- PK-0015 PK-0016 — 脯胺醇醯脲亞醯胺 (流程 7 --- 除了使用前述RN A以外，與前述實施例A13同樣地進行 對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及 PCR，測定GAPDH基因之表現量。利用内部標準之修正、 表現量相對值之算出亦是與前述實施例A13同樣地進行。 (2)結果 兹將該等結果示於第29圖。第29圖為圖表，顯示 GAPDH基因表現量之相對值。如第29圖所示，得知含有脯 胺酸或脯胺醇之連結區域(Lx)及連結區域(Ly)的每一 Εχ ssRNA均確認有強烈之基因表現抑制活性，且顯示濃度相 依性之效果《另一方面，陰性控制組之ssRNA則未觀察到 抑制效果。 (實施例A17)HCT116細胞中GAPDI^因之表現抑制效果 使用業已經具有脯胺酸之連結子置換的沾臟，並確 認HCT116細胞中之GAPDH表現抑制效果。 (1)材料及方法 合成出下示之RNACEx _ ι ssRna)作為合成實施例之 92 201217523 RNA(Ex)。此夕卜，合成出下示RNAi之陰性控制組(Nc)的Nc ssRNA作為比較例之RNA。於下述式中，連結區域(Lx)及連 結區域(Ly)係使用具有脯胺酸或脯胺醇之下述表中之亞醯 胺（參照實施例B)而使Xc與X之間及Yc與Y之間結合。 【化15】 E X s s R N A (序列編號13) 5,- caugagaaguaugacaacagcc-Lx-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUC-Ly-paa ^3*
Xc 2 yq N c s s R N A (序列編號38) 5,- •cc:aucaaggauaaguga.aagccT；Lx-9GCUUUCACUUAlJCGUUGAUGGCUUC厂:Ly—只aa j -3«
Xc Z yc 表7 ssRNA 用於Lx及Ly之亞醯胺 比較例 實施例 PK-0033 PK-0034 D-脯胺酸二醢胺亞醯胺 (流程3之化合物9) PK-0035 PK-0036 脯胺酸二醯胺亞醯胺B型 (流程4之化合物22) PK-0003 PK-0004 L脯胺酸二醯胺亞醢胺 (流程3之化合物1〇) 除了使用則述RNA之外，與前述實施例A13同樣地進行 對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及 PCR，測定GAPDH基因之表現量。利用内部標準之修正、 表現量相對值之算出亦是與前述實施例A13同樣地進行 (2)結果 兹將該等結果示於第3〇圖。第3〇圖為圖表，顯示 HCT116細胞之GAPDH基因表現量相對值。如第3〇圖所 示，得知含有脯胺酸作為連結區域(Lx)及連結區域 ssRNA顯示出強烈基因表現抑制活性，顯示出濃度相依性 93 201217523 之效果。另一方面，陰性控制組之ssRNA則未觀察到抑制 效果。 (實施例A18)核糖核酸酶耐性 針對本發明之ssRNA確認核糖核酸酶耐性。 (1) 材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用實施例A5之NK-0033及實施例 A8之PK-0007。此外，比較例之RNA使用實施例A9之陽性 控制組(Pc)之dsRNA(NI-0030)。 首先’於 20mmol/L 之 Tris-HCl(pH8)中混入 60pm〇l 之前 述 RNA、5><10_5 單位之 RNase A(Roche)及 5xlCr5 單位之 RNaseTl(Roche)，於37°C下保溫（incubate)。自開始保溫起 算10分鐘、20分鐘' 30分鐘後依定法使RNase反應停止。接 著’使前述反應液於15%聚丙烯醯胺凝膠中電泳後，以
SYBR Green II(Lonza，瑞士）染色，並使用 E-BOX-VX2(MS 機器，東京）進行分析。 (2) 結果 兹將該結果示於第31圖。第31圖為顯示核糖核酸酶耐 生之電泳照片。於第31圖中，巷(iane)「μ」為分子量標記， mi η表不保溫時間。 如第31圖所示，比較例之ΝΙ_0030於保溫1〇分鐘後幾乎 完全分解。相對於此，實施例之ΝΚ_〇〇33及ρκ_〇〇〇7即使在 保溫ίο分鐘後亦殘存下來。從此結果得知，本發明之ssRNA 較dsRNA具有更優異之核糖核酸酶耐性。 (貫施例A19)核酸酶耐性 94 201217523 針對本發明之SSRNA確認核酸酶耐性。 (1) 材料及方法 與前述實施例A18相同地使用RNA。首先，於含有 5mmol/L CaCl2之50mmol/L Tris-HCl(pH8)中，混入60pmol 之前述RNA、0·5單位之S7核酸酶(Roche)，於37°C下保溫。 自保溫開始(Oh)起0.5小時後，依定法使S7核酸酶之反應停 止。接著，使前述反應液依定法而在7M尿素-15%聚丙烯醯 胺凝膠中電泳後，以SYBRGreenll(商品名，Lonza)染色， 並使用E-BOX-VX2(商品名，MS機器）分析。 (2) 結果 茲將該結果示於第32圖。第32圖為顯示S7核酸酶耐性 之電泳照片。於第3 2圖中，巷「Μ」為分子量標記。此外， h表示保溫時間。 如第32圖所示，比較例之NI_003〇在保溫〇 5小時後幾乎 全部分解。相對來說，實施例之NK-0033及PK-0007即使在 保溫0.5小時後亦殘存下來M足此結果得知，本發明之ssRna 較dsRNA具有更優異之S7核酸酶耐性。 從刖述貫施例A之結果得知，本發明之ssRNA舉例來說 可不依賴目標基因種類而構築。具體來說，則是得知前述 ssRNA中’例如前述區域(X)與前述區域(Xc)所形成之雙股 長度及前述區域(Y)與前述區域(Yc)所形成之雙股長度、前 述内部區域(Z)中不形成雙股之自由鹼基的有無、個:及位 置、以及連結(I域(Lx)與連結區域(Ly)之有無、種類及長度 等均可改變。據此，本發明之ssRNA可不依賴目標基因二 95 201217523 類地使用在基因之表現抑制上，而可說是具泛用性之新穎 工具。 (實施例B1) 1.脯胺醇之合成 依照下式所示流程1，合成出經二甲氧基三苯曱基保護 之脯胺醇。 【化16】
Ο
(l)Fmoc-L-脯胺醇(化合物2) 將L-脯胺醇（化合物l)(0.61g，6.0mmol)溶解於純水 70mL中，調製出L-脯胺醇水溶液。將N-(9-苐基曱氧基羰氧 基）琥拍醯亞胺（Fmoc-OSu)(2.0g，6.0mmol)溶解於 THF 10mL。將該THF溶液加至前述L-脯胺醇水溶液，攪拌1小時 使兩者反應。使該反應液分離成液體部分（liquid fraction) 96 201217523 與沉殿部分，相乙酸乙㈣各部份抽提，分仙收有機 層。接著，合併各各別之有機層後，添加無水硫酸納，使 其吸收水分（以下稱為乾燥）。過;慮前述有機層，回收渡液， 減壓濃縮前述濾液。將所得殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析 法（展開溶劑己烷：乙酸乙酯=1 :丨）純化，製得化合物 2( 1.4g，收率74%)。以下顯示化合物2NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： δ7.77(2Η, d, J=7.7Hz, Ar-H), 7.60(2H, d, J=7.3Hz, Ar-H), 7.40(2H, t, J=7.5Hz, Ar-H), 7.31(2H, t, J=7.6Hz, Ar-H), 4.40-4.50(2H, m, COOCH2), 4.22(1H ,t, J=6.5Hz, Ar-CH), 3.20-3.80(5H, m, H-5, H-6), 1.75(3 H, m, H-3, H-4), 1.40(1H, m, H-3). (2)Fmoc-DMTr-L-捕胺醇（化合物3) 使前述Fmoc-L-脯胺醇（化合物2)(1.4g，4.3mmol)溶解 於吡啶20mL中’共沸3次。使所得殘留物溶解於吡啶2〇mL 中。將該溶液於氬氣下且在冰浴中一邊攪拌一邊添加4，4，_ 二曱氧基三苯甲基氯(DMTr-a)(l_8g，5.3mmol)。針對該反 應液’以氣仿/甲醇之TLC追縱反應’至Fmoc-L-捕胺醇之點 (spot)消失為止，使其反應4小時。接著，為了使過剩之 DMTr-Cl·;卒冷(quench)，於前述反應液中加入曱醇3mL並授 拌10分鐘。更於前述反應液中加入氣仿後，回收有機層。 對回收之前述有機層進行飽和食鹽水之洗淨及5%碳酸氫 鈉水溶液之洗淨，再次進行飽和食鹽水之洗淨。以無水硫 酸鈉使洗淨後之有機層乾燥。過濾前述有機層，使所得濾 液減壓濃縮。以二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑氯 97 201217523 仿’ 1%°比咬)純化所得殘漁’製得化合物3(2.〇8，收率74%)。 茲將化合物之NMR結果顯示如下。 iH-NMIKCDCb) : δ7·77(2Η，d，J=7.7Hz，Ar_H)，7 6〇(2H， d, J-7.3Hz, Ar-H), 7.40-7.18(13H, m, Ar-H), 6.89(4H, d, J=8.6Hz, Ar-H), 4.20-4.40(2H, m> CO〇CH2), 4.02(1H, t, J=6.5Hz, Ar-CH), 3.80-3.10(5H, m, H-5, H-6), 3.73(s, 6 H, OCH3)3 1.84(3Η, m, H-3, H-4), !.58(1^ m, H-3). (3)DMTr-L-脯胺醇(化合物4) 使前述Fmoc-DMTr-L-脯胺醇(化合物3)(2 〇g，3 2_〇1) 溶解於含20%哌啶之DMF溶液25mL中，攪拌12小時。將該 /奋液減壓濃縮，使所得殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法（氣 仿.甲醇=85 : I5 ’含1〇/〇吡。定）純化，製得化合物4(1 〇g， 收率78%)。茲將化合物之NMR結果顯示如下。 H-NMR(CDC13) · 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J -8.6Hz, Ar-H), 3.78(6H, s, OCH3), 3.31(1H, m, H-6), 3-〇7(2H, m, H-2, H-6), 2.90(2H, m5 H-5), 1.84(3H, m, H -3, H-4), 1.40(1H, m, H-3). 2·亞醯胺衍生物之合成 其次，依照下式所示流程2，合成出具有脯胺醇之亞酿 胺何生物。以下，將丨-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞 胺鹽酸鹽稱為「EDC」，將N，N_二甲基胺基吡啶(4_二甲 基胺基吡啶)稱為「dMap」。 【化17】 98 201217523
DMTrO
(l)DMTr-酿胺-L-脯胺醇(化合物5) 使前述DMTr-L-脯胺醇（化合物4)(〇 8〇g，2 〇mm〇l)、 EDC(0.46g，2.4mm〇l)及DMAP(0.29g，2.4mmol)溶解於二 氣甲烷20mL並進行攪拌。於該溶液中添加1〇羥基癸酸
(〇.45g，2.4mmol)並攪拌。針對該反應液，以乙酸乙酯之TLC 追蹤反應，至DMTr-L-脯胺醇之點消失為止，使其反應20 小時。接著’於前述反應液中添加二氣曱烧後，回收有機 層。將回收之前述有機層⑽和食財洗淨後，以無水瑞 酸納使其麟。職前述有機層，將所㈣液減壓浪縮， 再使其殘潰以二氧化錢膠管柱層析法（乙酸乙醋，含1%0比 。定)純化，製得化合物5(〇.7lg，收率咖）。以下顯示化合物 之NMR結果。 m，Ar-H)，6.82(4H，d， 'H-NMRCCDCla) ： δ7.4〇-7.ΐ4(9Η 99 201217523 =8.6Hz, Ar-H), 3.78(6H, s, OCH3)5 3.68-2.93(7H, m, H-2 ’ H-5, H-6)，2.27-i_72(6H，m，燒基，H 3, H-4)，i 58(4h， s，烷基)，1.30(10H, s，烷基)· ’ (2) DMTr-烷基-L-脯胺醇(化合物 使前述DMTr-L-脯胺醇(化合物4)(〇卿，2 〇晒〇1)溶解 於甲醇15mL，添加5_經基戊_3lg，3 〇匪〇1)並搜摔。於 溶液中添加氰基氫化石朋納（0.25g，4 〇_〇1)，更進行揽掉。 針對該反應液’以乙酸乙醋/己烷之TLC追蹤反應，至 DMTr-L·脯胺醇之點消失為止，使其反應24小時。接著， 於前述反應液巾添加乙酸“，回收有機層。將回收之前 述有機層以鮮食鹽水洗淨後，叫水祕鈉使其乾燥。 過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，再使其殘渣以二 氡化矽凝膠管柱層析法（己烷：乙酸乙酯=1 :丨，含1%吡啶) 純化，製得化合物6(0_62g，收率63°/〇)。以下顯示化合物之 NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： 57.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d5 J =8-6Hz, Ar-H), 3.78(6H, s, OCH3), 3.70-2.86(4H, m, CH2 〇H，H-6)，2·06-1·79(5Η, m，烷基，H-2, H-5)，1.74-1.49(6 H，m，烷基，H-3, H-4)，1.45-1.27(4H，m，烷基 (3) DMTr-胺甲酸醋-L-脯胺醇(化合物7) 使 1，4-丁二醇(〇.9〇g ’ i〇mm〇i)溶解於二氣甲烧3〇mi， 更添加羰基二咪唑（1.4g，8.6mm〇i)後攪拌3小時。將該反應 液之有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使其乾 燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，使其殘渣以 100 201217523 一氧化妙㈣管柱層析法(氣仿：甲醇=9 : 1)純化。藉此， 製得1，4*> 丁 - *含* 一 ％之一側末端業經羰基二咪唑活性化之化合 物（〇‘25g，i.5mm〇1)。將該化合物溶解於二氯甲烷15灿_， 添加刖述DMTr-L-脯胺醇（化合物4)(0.6g，j 5mm〇1)，攪拌 24小時。於該混合液中更添加乙酸乙酯，回收有機層。將 回收之則述有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使 其乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，使其殘 渣以二氧化石夕凝膠管柱層析法（己烷：乙酸乙酯=1 : 1，含 1/〇比定）純化，製得化合物7(0.61g，收率77%)。以下顯示 化合物之NMR結果。 H-NMR(CDC13) ： 57.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz, Ar-H), 4.24-3.94(2H, m, COOCH2), 3.78(s, 6H, OCH3)，3.72-2.96(7H，m，烷基，H_2, H_5, H_6), 2 1(M 3〇 (8H，m，烷基，H-3, H-4). (4)DMTr-醯脲-L-脯胺醇(化合物8) 使前述DMTr-L-脯胺醇(化合物4)(〇 5〇g，丨2mm〇1)及三 光氣（0.12g、0.40mmol)溶解於二氣甲烷8πΛ，於氬氣下且 在冰浴中攪拌。接著，對前述溶液添加N，N_二異丙基乙基 胺(0.31g ’ 2.4mmol)，授拌1小時。更對前述溶液添加8_胺 基-1-辛醇(0.17g，1.2mm〇l)，同樣於冰浴中攪拌3〇分鐘後’ 於室溫下攪拌20小時。於前述溶液中加入二氯甲烷，回收 有機層。將回收之前述有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無 水硫酸鈉使其乾燥。過遽前述有機層，將所得瀘液減壓濃 縮’並使其餘以二氧切凝料柱層析法（己烧：乙酸乙 101 201217523 酯=4 : 1，含1%三乙胺）純化，製得化合物8(0.44g，收率 62%)。以下顯示化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, m, Ar-H)，3.78(s，6H，OCH3), 3_68-3·25(9Η，m, CH2NH，CH 2〇H, H-2, H-5, H-6)，1.74-1.18(16H，m，烷基，H-3, H-4) (5)具有脯胺醇之亞醯胺衍生物（化合物9〜12) 將前述經修飾之脯胺醇(化合物5〜8)分別用作原料，藉 以下所示方法合成出化合物9〜12。將前述經修飾之脯胺醇 及5-苄基硫代-1H-四唑溶解於乙腈3mL中。前述經修飾之脯 胺醇的使用量在化合物5時為〇.69g(1.2mmol)，在化合物6 時為 0.60g(1.2mmol)，在化合物7時為0.60g(1.2mmol)，在化 合物8時為〇.25g(0_43mmol)。此外，5-苄基硫代坐之 使用量對於化合物5〜7為0.15g(0.78mmol)，對於化合物8則 是54mg(0.15mmol)。於氬氣下，對前述溶液添加2-氰基乙 基Ν，Ν，Ν’，Ν’-四異丙基偶磷基二亞醯胺，攪拌2小時。前 述2-氰基乙基Ν，Ν，Ν’，Ν，-四異丙基偶磷基二亞醯胺之添 加量在使用前述化合物5〜7之系統中為〇.54g(1.8mmol)，使 用前述化合物8之系統則是〇.l9g(〇.64mmol)。接著，對前述 溶液添加飽和碳酸氫鈉水溶液，更以二氣甲烷抽提並回收 有機層。使回收之前述有機層以無水硫酸鈉乾燥。過濾前 述有機層，將所得濾液減壓濃縮，將其殘渣以二氧化矽凝 膠管柱層析法（己烷：乙酸乙酯=1 :丨，含1%三乙胺）純化， 製得化合物9〜12。以下顯示各化合物之nmR結果。 102 201217523 DMTr-醯胺-L-脯胺醇亞醯胺（化合物9，0.60g，收率55%) 'H-NMRCCDCb) ： 57.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz, Ar-H), 3.78(6H, s, OCH3), 3.68-2.93(1 1H, m, C H20, POCH2, CHCH3, H-2, H-5, H-6), 2.58(2H, m, CH2 CN), 2.27-1.72(6H, m,烷基，H-3, H-4)，1.58(4H，s,烷 基)，1.30(22H，s,烷基，CHCH3)· DMTr-炫基-L-脯胺醇亞醯胺（化合物10，0.71g，收率60%) ^-NMRCCDCla) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz，Ar-H)，3_78(6H，s，OCH3)，3.70-2.86(8H，m, CH2 O, POCH2, CHCH3, H-6), 2.58(2H, m, CH2CN), 2.06-1.7 9(5H, m，烧基，H-2, H-5)，1·74-1·49(6Η，m,烧基，H-3， H-4)，1_37_1_10(16H，m，烷基，CHCH3). DMTr-胺甲酸酯-L-脯胺醇亞醯胺(化合物1卜0_67g，收率5 2%) •H-NMRCCDCb) ： 87.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz, Ar-H), 4.24-3.94(2H, m, COOCH2), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.72-2.96(11H, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-2, H-5, H-6)，2.58(2H，m，CH2CN)，2.10-1.46(8H, m，烷基， H-3, H-4), 1.34-1.10(12H, m, CHCH3). DMTr-酿脲-L-脯胺醇亞醯胺（化合物12，0.20g，收率61%) 'H-NMR(CDC13) ： δ7.40-7.14(9Η, m, Ar-H), 6.82(4H, m5 Ar-H), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.65-3.25(13H, m, CH205 P〇 CH2, CHCH3, H-2, CH2NH, CH2OH, H-2, H-5, H-6), 2.7 3(2H，m, CH2CN), 2.10-1.48(16H，m，烷基，H_3, H-4)，1 103 201217523 ,35-1.10(12H, m, CHCH3). (實施例B2) 接著，依照下述式所示流程3，合成出具有L-脯胺酸之 亞醯胺衍生物。 【化18】 〇 Fmoc-
D 〇rL D：LUZ
Fmoc-
D：i L:4
DMTrO(H2C)4 〇. .NH HO(H2C)^
HO(H2C)s D:5, L;6 DMTrO(H2C)4 尸一o(h2c)/
(»Pr)2N D：2, L:JLfi 0 rir 人
.0 DMTrO(H2C)4 / ) 〇r 〇 v ，—P-0(H2C)5 ^ k/ 〇Ρ〇ζΝ l) ii ji DMTrO(H2C)4 o…Ah DMTrO{H2C)4HNOCT_SU-丫 ό DMTrO(H2C)4HNOC HO/ $
IS ^ DMTrO(H2C)4HNOC,VU°Y〇 o DMTrO(H2C)4HNOCηοΗγηνυ〇 o Ιέ J4 CN ^ DMTrO(H2C)4HNOC(J：P^HNT〇 o 流程3 104 12 201217523 (1) DMTr-羥基醯胺胺基_L-脯胺酸(化合物u) 於冰冷下’將乙酸緩衝液(7mL)加入含有〇MTr_醯胺-L_ 脯胺酸（化合物6)(1.00§，2.05111111〇1)及5-羥基戊醛（0.338， 3.07mmol)之乙醇溶液(7mL)。於冰冷下將該混合液攪拌2〇 分鐘後，加入氰基化删鈉（0.77g，12 28mm〇1)，更於室溫下 授拌7小時。以一乳曱烧稀釋前述混合液，再以水洗淨後， 更以飽和食鹽水洗淨之。接著，回收前述有機層，以硫酸 鈉使其乾燥。過據前述有機層，針對濾液，於減壓下德除 溶劑。將所得殘渣供至二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑 CHzCl2 : CH3〇H=98 : 2，含0.05%吡啶）。接著，將所得生 成物供至二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑CH2C12 : CH3〇H=98 : 2，含〇_〇5%吡啶）’更將所得生成物供予二氧 化石夕凝膠管柱層析法(展開溶劑二氣甲烧：丙酮=7 : 3，含 0.05%。比啶）。藉此，製得無色糖毁狀之化合物11(〇 49g，收 率 41%) 〇
Ms(FAB+) ： m/z 575(M+) ' 303(DMTr+) (2) DMTr-醯胺胺基-L-脯胺酸亞醯胺(化合物12) 將所得前述DMTr-羥基醯胺胺基-L-脯胺酸（化合物 11)(0.5〇g、0.87mmol)與無水乙腈混合， 在室溫下共沸乾燥。對所得殘留物添加四嗤二異丙基 l*(diisopropylammonium tetrazolide)(178mg > 1.04mmol) > 減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物添加無水乙腈 (lmL) ’更加入2-氰基乙氧基_N，N，N，，N，-四異丙基偶磷 基一亞酸胺（313mg，l.〇4mmol)之無水乙腈溶液（lmL)。於 105 201217523 氬氣環境下將混合物於室溫下攪拌4小時。接著，以二氣甲 烷稀釋前述混合物，再依序以飽和碳酸氫鈉水及飽和食鹽 水洗淨。回收有機層，並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機 層。針對所得前述濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣 供予充填劑使用胺基二氧化石夕之管柱層析法（展開溶劑己 烷：丙酮=7 : 3 ,含0.05%吡啶），製得無色糖漿狀之化合物 12(0.57g，純度93%’收率79%)。前述純度係以HPLC測定（以 下相同）。以下顯示化合物之NMR結果。 'H-NMR (CDC13): 57.41-7.43(m, 2H, Ar-H)'7.28-7.32(m, 4H, Ar-H)、7.25-7.27(m，2H, Ar-H)、7.18-7.21(m, 1H，Ar-H)、 6.80-6.84(m，4H，Ar-H)、3.73-3.84(m，1H)、3.79(s，6H, OCH3)、3.47-3.64(m, 3H)、3.12-3.26(m，2H)、3.05(t，J=6.4 Hz, 2H，CH2)、2.98-2.02 (m, 2H)、2.61(t，J=5.8Hz，2H，CH2)、 2.55-2.63(m，2H)、2.27-2.42(m，1H，CH)、2.3 l(t，7.8 Hz, 2H, CH2)、2.03-2.19(m，1H, CH)、1.40-1.90(m，8H)、1.23-1.33(m， 5H)、1.14-1.20(m，12H，CH3); P-NMR (CDC13) ： 5146.91 ；
Ms (FAB+) : m/z 774(M+)、303(DMTr+)，201(C8H19N2OP+). (3)DMTr-羥基醯胺胺甲醯基-L-脯胺酸(化合物13) 於氬氣環境下，對已溶有DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物 6)(1.00g，2.05mmol)之無水乙腈溶液（10mL)，於室溫下加 入已溶有1-咪唑羰氧基-8-羥基辛烷（M2g，4.92mmol)之無 水乙腈溶液(20mL)。於40〜50°C下將該混合液加熱2天後， 室溫下放置5天。針對前述混合液，減壓下餾除溶劑。將所 106 201217523 得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑二氯甲 烷：丙酮=4 : 1，含0.05%吡啶）。藉此，製得無色糖漿狀之 化合物13(0.68g，收率50%)。以下顯示化合物之NMR結果。 'H-NMR (CDC13)： 87.40-7.42(m, 2H, Ar-H)'7.27-7.3 l(m, 6H,
Ar-H)、7.17-7.21(m, 1H，Ar-H)、6.79-6.82(m，4H, Ar-H)、 4.23-4.30(m，1H)、4.05-4.10(m, 2H)、3.79(s，6H，OCH3)、 3.60-3.65(m, 2H)、3.32-3_55(m，2H)、3.16-3.29(m，2H)， 3.01-3.07(m，2H)、2.38-2.40(m，1H，CH)、1.83-l‘90(m，2H)、 1.57-1.69(m，8H)、1.26-1.36(m，2H);
Ms(FAB+) : m/z 602(M+)、303(DMTr+). (4)DMTr-醯胺胺甲醯基-L-脯胺酸亞醢胺(化合物14) 將所得前述DMTr-羥基醯胺胺甲醯基-L-脯胺酸（化合 物13)(0.63g，l.OOmmol)與無水吡啶混合，於室溫下共沸乾 燥。對所得殘留物添加四β坐二異丙基錢（2〇6mg， 1.20mmol) ’減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物加入無 水乙腈（lmL) ’更加入2-氰基乙氧基_>^，：^>}，，：1^，-四異丙基 偶磷基二亞醯胺（282mg，i.Ummoi)之無水乙腈溶液 (lmL)。於氬氣環境下將混合物於室溫下搜拌4小時。接著， 以二氣甲㈣釋前述混合物，依序以飽和碳酸氫納水及飽 和食鹽水洗淨。回收有機層’並以硫酸鈉乾燥後，過滤前 述有機層。針對所得濾、液’於減壓下齡溶劑。將所得殘 渣供予充㈣使用胺基二氧切之管柱層析法(展開溶劑 己院：丙酮=7: 3,含〇鳥以），製得無色料狀之化合 物M(0.74g，純靡％，_7%Ww合物之麵 107 201217523 結果。 P-NMR(CDC13) ： 5147.19 ；
Ms(FAB+) : m/z 860(M+)、303(DMTr+) ’ 2〇1(c8Hi9N2〇P+). (5) DMTr-第三丁基二曱基石夕氧基醯胺醢腺-L-脯胺酸(化合 物15) 於氣氣環境及冰冷下’對二光氣（1.22g，4.1 Ommol)加 入無水四氫呋喃溶液（10mL)。於氬氣環境及冰冷下，以30 分鐘對該混合液中滴定溶有DMTr-醯胺-L-脯胺酸（化合物 6)(1.00g，2.05mmol)及DIEA(9.80g，75.8mm〇l)之無水四氫 呋喃溶液（10mL)，之後，室溫下攪拌1小時。於氬氣環境及 冰冷下’以45分鐘對前述混合液滴定溶有1〇_胺基_丨_第三丁 基一甲基石夕氧基癸烧（2.66g ’ l〇.25mmol)及DIEA(3.20g， 24.76mmol)之無水四氫呋喃溶液(2〇mL)。接著，於氬氣環 境下將前述混合物於室溫下攪拌一夜。以乙酸乙酯（2〇〇mL) 稀釋s亥混合液，回收有機層。將前述有機層以飽和碳酸氫 納水洗淨後’更以飽和食鹽水洗淨。接著，回收有機層， 以硫酸鈉使其乾燥。過濾前述有機層，針對濾液，於減壓 下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展 開溶劑二氣甲烧：丙酮=4 : 1，含0·05%吡啶）。藉此，製得 無色糖毁狀之化合物15(0.87g，收率55%)。 (6) DMTr-羥基醯胺醯脲-L-脯胺酸（！ 6) 於氬氣環境下，將無水四氫呋喃二氯曱烷溶液（1〇mL) 於室溫下加人所得前述DMTr··第三丁基二甲基石夕氧基醯胺 醯脲-L-脯胺酸（15)(0.87g，1.12mmoip於氬氣環境下，於 108 201217523 前述混合液中加入lmol/L含有氟化四丁基銨之四氫呋喃溶 液(4.69mL ’東京化成）’於室溫下攪拌3天。以二氯甲院 (150mL)稀釋前述混合液，再以水洗淨後，更以飽和食鹽水 洗淨之。回收有機層，以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。 針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧 化石夕凝膠管柱層析法(展開溶劑二氣曱烧：丙酮=1 : 1，含 0.05% α比啶）’製得無色糖漿狀之化合物16(0.68g，收率 92%)。以下顯示化合物之NMR結果。 'H-NMRCCDCls)·· 57.41-7.43(m, 2H, Ar-H)'7.27-7.3l(m, 4H, Ar-H)、7.19-7.26(m，2H, Ar-H)、7.19-7.21(m，1H, Ar-H)、 6.80-6.83(m，4H，Ar-H)、4.34(t，2H，CH2)、3.79(s, 6H， OCH3)、3.63(d，1H，J=6.4 Hz，CH2)、3.61(d，1H，J=6.4 Hz, CH2)、3.34-3.37(m，1H，CH)、3.16-3.27(m，5H)，3.04(t，J=5.9
Hz, 2H, CH2) ' 2.38-2.45(m, 1H, CH) ^ 1.83-2.05(m, 3H) > 1.45-1.64(m, 8H)、1.25-1.38(m，7H)· (7)DMTr-醯胺醯脲-L-脯胺酸亞醯胺(化合物π) 將所得前述DMTr-羥基醯胺酿脲-L-脯胺酸（化合物 16)(0.62g ’ 0.94mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾 燥。於所得殘留物中加入四唑二異丙基銨（192mg， 1.12mmol)，減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合液加入無 水乙腈（lmL)，更加入2_氰基乙氧基_N，n，Ν’，Ν’-四異兩 基偶填基一亞醯胺（282mg ’ 1.12mmol)之無水乙腈溶液 (lmL)。於氬氣環境下將該混合物於室溫下攪拌4小時。接 著’以一氣甲烧稀釋前述混合物，再依序以飽和碳酸氣納 109 201217523 水及飽和食鹽水洗淨。回收有機層，以硫酸納乾燥後，過 濾前述有機層。針對所得前述濾液’於減壓下顧除溶劑。 將所得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽之管枝層析法 (展開溶劑己烷：丙酮=1 : 1，含有〇.〇5%°比啶）’製得無色 糖漿狀之化合物17(0.77g ’純度88% ’收率84°/。）。以下顯示 化合物之NMR結果。 P-NMR(CDC13) ： 5147.27 ；
Ms(FAB+) : m/z 860(M++1)、303(DMTr+) ’ 201((^Η】9Ν2〇Ρ+)· (實施例B3)脯胺酸二醯胺亞醯胺之合成 為了生成含有具脯胺酸骨架之連結子的本發明核酸分 子，利用前述流程3合成出L-脯胺酸二醢胺亞醯胺及D-脯胺 酸二醢胺亞酿胺。 (B3-1)L-脯胺酸二醯胺亞醯胺 (l)Fmoc-羥基醯胺-L-脯胺酸(化合物4) 將前述流程3之化合物2(Fmoc-L-脯胺酸）作為起始原 料。混合則述化合物2(10.00g ’ 29.64mmol)、4-胺基-1-丁醇 (3.18g，35_56mmol)及 1-羥基苯并三唑（1〇 9〇g， 70.72mmol) ’對前述混合物，於減壓下脫氣後充填氬氣。 於室溫下對前述混合物加入無水乙腈（14〇mL)，更添加二環 己基碳二亞胺（7.34g，35.56mm〇l)之無水乙腈溶液（7〇mL) 後，於氬氣環境下，於室溫下攪拌15小時。反應結束後濾 別所生成之沉澱，針對所回收之濾液，於減壓下餾除溶劑。 於所得殘渣中加入二氣甲烷(2〇〇mL)，以飽和碳酸氫鈉水 (200mL)洗淨之。接著回收有機層，以硫酸鎂乾燥後，過濾 110 201217523 前述有機層。針對所得渡液’於減壓下顧除溶劑，對其殘 渣添加二乙醚(200mL)而粉末化。藉由濾取產生之粉末，獲 得無色粉末狀之化合物4(10.34g’收率84。/。）。以下顯示前 述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ； 57.76-7.83 (m, 2H, Ar-H) ^ 7.50-7.63 (m, 2H，Ar-H)、7.38-7.43(m，2H,Ar-H)、7.28-7.33 (m, 2H，Ar-H) 4.40-4.46 (m，1H，CH)，4.15-4.31 (m，2H，CH2)，3 67_3 73 (m 2H, CH2)' 3.35-3.52 (m,2H,CH2)'3.18-3.30 (m 2h CH2) ' 2.20-2.50(m，4H)、1.81-2.03 (m，3H)、1.47-l.54 (m 2H); Ms (FAB+) : m/z 409 (M+H+). (2)DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物6) 將Fmoc-羥基醯胺-L-脯胺酸（化合物4)(7 8〇g， 19.09mmol)與無水吡啶（5mL)混合，於室溫下共沸乾燥2 次。對所得殘留物添加4，4，-二甲氧基三苯甲基氣(8 2〇g， 24.2〇mmol)、DMAP(23mg、0.19mmol)及無水D比咬(39mL)。 於至溫下擾拌該混合物1小時後，加入甲醇（7 8mL)，於室 溫下攪拌30分鐘。以二氣曱烷（100mL)稀釋該混合物，並以 飽和碳酸氫鈉水(l50mL)洗淨後，分離有機層。將前述有機 層以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於 減壓下紐溶劑。對所得未純化餘添加無水二甲基甲酿 胺(39mL)及派咬(18.7mL，189職〇1)，室溫下授摔^時。 反應結束後，針對前述混合液，於減壓下以室溫贿溶劑。 將所得殘渣供予二氧切凝膠錄層析法⑽品名糧 C-300 ’展開溶劑CH2Ci2 : c_=9 :卜含_州， 111 201217523 製得淡黃色油狀之化合物6(9_llg，收率98%)。以下顯示前 述化合物之NMR結果。 'H-NMR (CDCl3)：67.39-7.43(m, 2H, Ar-H)> 7.30(d, j=8 g H2 4H，Ar-H)、7, 21(tt，1H，4.9, 1.3 Hz, Ar-H)、6.81(d，j=8 8 Hz 4H，Ar-H)、3.78(s, 6H，OCH3)、3.71(dd, H，J=6.3 Hz，5.4 Hz
CH)、3.21 (2H, 12.9, 6.3 Hz，2H, CH2)、3.05 (t，J=6.3 Hz, 2H CH2)、2.85-2.91(m, 2H，CH2)、2.08-2.17 (m，1H, CH)、 1.85-2.00(m, 3H) ' 1.55-1.65(m, 5H)：
Ms(FAB+) ; m/z 489 (M+H+)、303(DMTr+). (3)DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸(化合物8) 混合所得前述DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物6y6 Q丨g， 12.28mmol)、EDC(2.83g，14.74mmol)、1-經基笨并二 (3.98g，29.47mmol)及三乙胺(4.47g，44.21mm〇l)之無水 _ 氣甲烷溶液（120mL)。更於氬氣環境下，以室溫對該混入I 添加6-經基己烧酸（l_95g，14_47mmol)，之後，於氣考产下 以室溫攪拌1小時。以二氯曱烷(600mL)稀釋前述渴^合液 並以飽和食鹽水(800mL)洗淨三次。回收有機層，使十述有 機層以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得、慮液 於減壓下餾除溶劑。藉此，製得淡黃色泡狀之前述化入物 8(6.29g，收率85%)。以下顯示前述化合物<NMR結果。 'H-NMR (CDC13) ： 57.41-7.43 (m, 2H, Ar-H) > 7.27-7 31(m
4H，Ar-H)、7.19-7.26(m，2H，Ar-H)、7.17-7.2l(m, 1H
Ar-H)、6.79-6.82(m, 4H，Ar-H)、4.51-4.53(m，1H, CH)、3.79(s， 6H，〇CH3)、3.61(t，2H，J=6.4 Hz，CH2)、3.5〇_3.55(m，ih， 112 201217523 CH)、3.36-3.43(m, 1H，CH)，3.15-3.24(m，2H，CH2)，3_04(t， J=6.3 Hz，2H，CH2)、2.38.2.45(m，1H，CH)、2.31(t，6.8 Hz， 2H，CH2)、2.05-2.20(m, 1H，CH)、1.92-2.00(m，1H，CH)、 l_75-l_83(m, 1H，CH)、1.48-1.71(m，8H)、1.35-1.44(m，2H， CH2)；
Ms(FAB+) : m/z 602 (M+)、303 (DMTr+). (4)DMTr-二醯胺-L-脯胺酸亞醯胺(化合物10) 將所得前述DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸（化合物 8)(8.55g、14.18mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾燥 3次。於所得殘留物中添加四唑二異丙基銨（2.9ig， 17.02mmol)，於減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物加 入無水乙腈（10mL)，更加入2-氰基乙氧基-N，N，N，，N，-四異丙基偶磷基二亞醯胺(5.13g，17.02mmol)之無水乙腈溶 液(7mL)。於氬氣環境下’將該混合物於室溫下擾拌2小時。 接著，以一乳甲烧稀釋前述混合物，並以飽和礙酸氫納水 (200mL)洗淨3次後，以飽和食鹽水(2〇〇mL)洗淨。回收有機 層並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得前述濾 液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填劑使用胺基 二氧化矽凝膠之管柱層析法(展開溶劑己烷：乙酸乙酯=1 : 3，含0.05%吡啶），製得無色糖漿狀之化合物1〇(1〇 25g，純 度92% ’收率83%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR (CDC13) ： 67.40-7.42(m, 2H, Ar-H) ^ 7.29-7.3 l(m, 4H, Ar，H)、7.25-7.27(m, 2H, Ar-H)、7.17-7.2l(m，iH,
Ar-H) ^ 6.80-6.82(m, 4H, Ar-H) M.51-4.53(m5 1H, CH) > 3 113 201217523 • 75-3.93(m，4H)、3.79(s，6H，OCH3)、3.45-3.60(m, 4H)、3 • 35-3.45(m, 1H，CH)、3.20-3_29(m，1H)、3.04(t, J=6.4 Hz ,2H, CH2)、2.62(t，J=5.8 Hz, 2H，CH2)、2.40-2.44(m, 1 H, CH)'2.31(t, 7.8 Hz, 2H, CH2) ' 2.03-2.19(m, 1H, CH) ' 1.92-2.02(m, 1H, CH) ' 1.70-1.83(m, 1H, CH) ' 1.51-1.7 l(m, 8H)' 1.35-1.44(m, 2H, CH2)' 1.18(d, J=6.8 Hz, 6H, CH3) ' 1.16(d, J=6.8 Hz, 6H, CH3)； P-NMR(CDC13) Ms5147.17 ；
Ms(FAB+) : m/z 802(M+)、303(DMTr+)，201(C8HI9N2OP+). (B3-2)D-脯胺酸二醯胺亞醯胺 (l)Fmoc-經基醯胺-D-脯胺酸(化合物3) 將前述流程3之化合物1 (Fmoc-D-脯胺酸）用作起始原 料。對於前述化合物l(1.5g，4.45mmol)、二環己基碳二亞 胺（l.lg，5.34mmol)及 1-經基苯并三 °坐（1.5§，10.69mmol) 之混合物，減壓下脫氣後填充氬氣。於室溫下對前述混合 物添加無水乙腈（24mL)，更添加4-胺基-1-丁醇（0.48g， 5.34mmol)之無水乙腈溶液（6mL)後，於氬氣環境下，於室 溫下攪拌15小時。反應結束後濾別所生成之沉澱，針對所 回收之濾液，於減壓下餾除溶劑。對所得殘渣加入二氣甲 烧，以乙酸緩衝液(pH4.0)洗淨3次，並以飽和碳_酸氫納水洗 淨3次。接著回收有機層，以硫酸鎮乾燥後，過渡前述有機 層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑，於其殘渣中加入 二乙醚(50mL)，使其粉末化。藉由濾取產生之粉末，獲得 白色粉末狀之化合物3。以下顯示前述化合物之NMR結果。 114 201217523 ,H-NMR(400MHz, CDC13) ： 57.77(d, J=7.3 Hz, 2H) ； 7.58(br, 2H) ； 7.41(t, J=7.3 Hz, 2H) ； 7.32(t, J=7.3 Hz, 2H)； 4.25-4.43(m，4H) ; 3.25-3.61(m，6H) ; 1.57-1.92(m，8H). MS(FAB+) ： m/z 409(M+H+). (2)DMTr-醯胺-D-脯胺酸(化合物5) 將Fmoc-羥基醯胺-D-脯胺酸(化合物3)(l.〇g,2.45mmol) 與無水吡啶(5mL)混合，室溫下共沸乾燥2次。對所得殘留 物添加4，4，-二曱氧基三苯甲基氯（1.05g，3 1〇mm〇1)、 DMAP(3mg，0.024mmol)及無水《•比n定(5mL)。於室溫下搜拌 該混合物1小時後加入甲醇（lmL)，於室溫下攪拌3〇分鐘。 以二氣曱烧稀釋該混合物，以飽和碳酸氫鈉水洗淨後，分 離有機層。將前述有機層以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機 層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。於所得未純化之 殘渣中加入無水二曱基曱醯胺（5mL)及哌啶（2 4mL， 24mmol) ’於室溫下攪拌丨小時❶反應結束後，針對前述混 合液，於減壓下且於室溫下餾除溶劑。將所得殘渣供予二 氡化石夕凝膠管柱層析法（商品名Wakogel C-300，展開溶劑 CHAl2 : CH3〇H=9 : 1，含0.05%吡啶）’製得淡黃色油狀之 化&物5(l_26g’收率96%)。以下顯示前述化合物之nmr結 果。 'H-NMR(400MHz5 CDCI3) ： 67.62(br, 1H) ； 7.41-7.44(m, 2H) ； 7.26-7.33(m, 6H) ； 7.17-7.22(m, 1H) ； 6.80-6.84(m, 4H)；3.78(s, 6H)；3.71(dd, J=8.8, 5.4 Hz, lH)；3.22(q, 6.5 Hz, 2H) ； 3.07(t, J=6.1 Hz, 2H) ； 2.97-3.03(m, 1H) ； 2.85-2.91(m, 115 201217523 1H) ； 1.85-2.15(m, 3H) ； 1.55-1.73(m, 6H). MS(FAB+) : m/z 489(M+H+), 303(DMTr+). (3) DMTr-羥基二醯胺-D-脯胺酸(化合物7) 混合所得前述DMTr-醯胺-D-脯胺酸（化合物5)(1.2g， 2.45mmol)、EDC(566mg，2.95mmol)、1-經基苯并三。坐 (796mg，5.89mmol)及三乙胺（1.2mL，8.84mmol)之無水二 氣曱烷溶液(24mL)。更於氬氣環境下且於室溫下，對該混 合液加入6-羥基己烧酸(390mg，2.95mmol)，之後於氬氣環 境下且於室溫下攪拌1小時。以二氣甲烷稀釋前述混合液， 再以飽和碳酸氫鈉水洗淨3次。回收有機層，以硫酸鈉乾燥 前述有機層後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓 下餾除溶劑。藉此，製得淡黃色油狀之化合物7(1.4g，收率 95%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(400MHz, CDC13) ： 87.40-7.43(m, 2H) ； 7.25-7.3(m, 6H) ； 7.17-7.22(m, 1H) ； 6.79-6.83(m, 4H) ； 3.79(s, 6H)； 3.58-3.63(m, 2H) ； 3.49-3.55(m, 1H) ； 3.15-3.26(m, 2H)； 3.02-3.07(m, 2H) ； 2.30-2.33(m, 2H) ； 2.11-2.20(m, 1H)； 1.50-1.99(m, 13H) ； 1.36-1.43(m, 2H). MS(FAB+) ： m/z 602(M+), 303(DMTr+). (4) DMTr-二醯胺-D-脯胺酸亞醯胺(化合物9) 將所得前述DMTr-羥基二醯胺-D-脯胺酸（化合物 7)(1.2g，1.99mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾燥3 次。對所得殘留物添加四唾二異丙基敍（41 Omg， 2.40mmol) ’減壓下脫氣並充填氬氣。對前述混合物添力口無 116 201217523 水乙腈(2.4mL)，更添加2-氰基乙氧基-N，N，Ν’，N，-四異 丙基偶磷基二亞醯胺（722mg ’ 2.40mmol)。於氬氣環境下且 於室溫下攪拌該混合物2小時。接著，以二氯曱烷豨釋前述 混合物，再以飽和碳酸氫鈉水洗淨3次後，以飽和食鹽水洗 淨之。回收有機層，並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。 針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填 劑使用胺基二氧化矽凝膠之管柱層析法(展開溶劑己烷：乙 酸乙酯=1 : 3)，製得無色油狀之化合物9(1.4g，純度95%， 收率83%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(400MHz, CDC13) ： 67.40-7.43(m, 2H) ； 7.25-7.32(m, 6H) ； 7.14-7.21(m, 1H) ； 6.80-6.83(m, 4H) ； 3.80-3.85(m, 2H) ； 3.79(s, 6H) ； 3.49-3.65(m, 5H) ； 3.02-3.06(m, 2H)； 2.60-2.63(m5 2H) ； 2.29-2.33(m, 2H) ； 1.77-1.82(m, 2H)； 1.56-1.68(m, 8H) ； 1.38-1.43(m, 2H) ； 1.15-1.29(m, 18H). 31P-NMR(162 MHz，CDC13) : δ146·94. MS (FAB+) ： m/z 802(M+), 303(DMTr+), 201(C8H19N2OP+). (實施例B4) 為了生成含有具脯胺酸骨架之連結子的本發明核酸分 子’利用下述流程4 ’合成出L-脯胺酸二醯胺亞醯胺B型。 【化19】 117 v201217523
(ch2)4oh NH
Fmoc·
TBDMSO(H2C)4 〇v"H •N-
Fmoc-
•IT ii
L-踊胺酸-一醒胺-亞酿胺（B 型)[L-Proline-diamide-amidite (type B)] 22 Fmoc: 9-荛基甲氧羰基 TBDMS:第三丁基二甲基砂基 DMTr: 4,4·-二甲氧基三苯甲基 (Fmoc;9-fluorenylmethyloxycarbonyl) (TBDMS: tert-butyldimethylsilyl) (DMTr^^'-dimethoxytrityl) 流程4 TBDMSO(H2C)4 HN^ 19 (l)Fmoc-第三丁基二曱基矽氧基醯胺_L_脯胺酸(化合物ι8) 混合Fmoc-羥基醯胺_L·脯胺酸（化合物句(2 00g， 30mmol)、第三丁基二甲基石夕基氣（j llg，35nim〇l)及咪唑 (10.90g，71mmol)。對於前述混合物，於減壓下脫氣後充 填氬氣。於室溫下將無水乙腈(2〇mL)加入前述混合物，於 氮亂環境下且於室溫下攪拌整夜。反應結束後，於前述混 合物中加入m(150mL)，以水洗淨3次再以飽和食 鹽水洗淨。㈣有機層並以硫義乾驗，祕前述有機 層。針對所料液’於減壓下㈣溶劑，將其殘渣供予二 氧化石夕凝膠管柱層析法(展開溶劑 ：CH3OH=95 ： 5) > 118 201217523 製得無色糖漿狀之化合物18(2.35g，收率92%)。以下顯示 前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDCl3)：57.76-7.78(m, 2H, Ar-H)'7.50-7.63(m, 2H, Ar-H)、7.38-7.42(m，2H，Ar-H)、7.29-7.34(m，2H，Ar-H)， 4.10-4.46(m, 4H, CH2), 3.47-3.59(m, 4H, CH2) ' 3.20-3.26(m, 2H, CH)、1.85-1.95(m，2H)、1.42-1.55(m, 6H)、0.96(s，9H， t-Bu) ' 0.02(s, 6H, SiCH3)；
Ms(FAB+) ： m/z 523(M+H+). (2) 第三丁基二甲基矽氧基醯胺-L-脯胺酸(化合物19) 對所得前述Fmoc-第三丁基二曱基矽氧基醯胺_L-脯胺 酸(化合物18)(1.18g ’ 2.5mmol)加入無水乙腈（5mL)及哌啶 (2.4mL)，於室溫下攪拌1小時。反應結束後，對前述混合 物加入乙腈（50mL)，渡別不溶物。針對所得渡液，於減壓 下餾除溶劑，將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展 開溶劑CHjCl2 : CH3〇H=9 : 1)，製得無色糖漿狀之化合物 19(0.61g ,收率90%)。以下顯示前述化合物iNMR結果。 H-NMR(CDCl3) · 53.71(dd, 1H, J=9.〇 Hz, 5.2 Hz, CH) ' 3.61-3.64(m, 2H, CH2) ^ 3.22-3.28(m, 2H, CH2)' 2.98-3.04(m, 1H，CH)、2.86-2.91(m，1H，CH)、2.08-2.17(m，1H, CH)、 1.86-1.93(m, 1H, CH)、1.66-1.75(m, 2H，CH2)、1.52-1.57(m, 4H) ' 0.89(s, 9H, t-Bu) > 0.05(s, 6H, SiCH3)：
Ms(FAB+) ； m/z 301(M+H+). (3) 第二丁基二甲基石夕氧基醯胺經基醯胺_L_脯胺酸(化合物 20) 119 201217523 混合所得前述第三丁其_田甘 ^ ^ ^ ^ . 卷一甲基矽氧基醯胺-L-脯胺酸 (化合物 19)(550mg， m〇丨）' 6-經基己烧酸（300mg， 2.3_〇1)、EDC(434mg ’ 2 3_〇1)及卜羥基苯并三口坐 (695吨，4_5瞧°丨)之無水二氣曱燒溶液(2GmL)。於減環 境下且於室溫下，將三已胺（689mg，“麵⑷加入前述混 合物，之後於氬氣環境且室溫下麟一整夜。 以飽和食鹽 水洗淨前述混合液。回W機層，使前述者㈣酸納乾燥 後’過誠述有機層。針對所得驗，於減壓補除溶劑。 將所付殘〉查供予-氧化發凝膠管柱層析法（展開溶劑 CHfl2 · CH3〇H=9 : 1)，製得無色糖漿狀之化合物 20(696mg ’收率92%)。以下顯示前述化合物之丽尺結果。 lH-NMR(CDCl3) : 54.54(d，1H，CH)、3.58-3.67(m，5H)、 3.52-3_56(m，1H，CH)，3.32-3·39(ιώ, 1H)，3.20-3.25(m， 2H)、2.4G-2_43(m，1H，CH)、2.33(t，j=7 3 Hz，2H，CH2)、 2.05-2.25(m，2H) ' 1.93-2.〇3(m，1H, CH)、175_185(m，1H， CH)' 1.50-1.73(m, 8H) ' 1.37-1.46(m, 2H, CH2)' 0.87(s, 9H, t-Bu)、0.04(s，6H, SiCH3);
Ms (FAB+) : m/z 415(M++l)· (4)DMTr-經基二酿胺-L-捕胺酸B型（化合物2i) 將所得前述第三丁基二甲基矽氧基醯胺羥基醯胺_L_ 脯胺酸（化合物20)(640mg ’ i_54mmol)與無水吡啶（lmL)混 合’於室溫下共沸乾燥。於所得殘留物中加入4，4，-二曱氧 基二本甲基虱（657mg ’ 1.85mmol)、DMAP(2mg)及無水°比 °定(5mL) ’至溫下撥摔4小時後，加入曱醇（1 mL)並於室溫下 120 201217523 授拌30分鐘。以二氣甲㈣釋前述混合物，並以飽和碳酸 氫鈉水洗淨之。回收有機層並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述 有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。於所得殘渣 中加入無水乙腈（5mL)及含有lm〇1/L氟化四丁基銨之四氫 呋喃溶液（1.42mL，氟化四丁基銨1.42mm〇l),室溫下攪拌 一整夜。反應結束後，對前述混合物加入乙酸乙酯 (100mL)，以水洗淨後，以飽和食鹽水洗淨。回收有機層並 以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減 壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法 (展開溶劑CH2C12 : CH3〇H=95 : 5，含〇.〇5%di^d定），製得無 色糖漿狀之化合物21(680mg，收率73%)。以下顯示前述化 合物之NMR結果。 'H-NMR(CDCl3) ： 57.41-7.44(m, 2H, Ar-H)> 7.26-7.33(m, 4H, Ar-H)、7.18-7.21(m, 2H, Ar-H)、7.17-7.21(m，1H, Ar-H)、 6.80-6.84(m, 4H, Ar_H)、4.51-4.53(d, 6.8 Hz, 1H, CH)、3.79(s, 6H, OCH3)'3.61(dd, 2H, J=ll Hz, 5.4 Hz, CH2)'3.50-3.54(m, 1H, CH) ' 3.36-3.43(m, 1H, CH), 3.20-3.26(m, 2H, CH2), 3_05(t，J=6.4 Hz，2H，CH2)、2.38-2_45(m，1H, CH)、2.30(t， J=7.8 Hz, 2H，CH2)、2.05-2.25(m, 1H，CH)、1.92-2.00(m, 1H, CH) ' 1.75-1.83(m, 1H, CH) ' 1.52-1.67(m, 8H) ' 1.35-1.45(m, 2H, CH2)；
Ms(FAB+) : m/z 602 (M+)、303(DMTr+). (5)DMTr-二醯胺-L-脯胺酸亞醯胺B型（化合物22) 將所得前述DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸B型（化合物 121 201217523 21)(637mg，l.〇6mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾 燥。對所得殘留物加入四唑二異丙基銨（20lmg， 1.16mmol) ’於減壓下脫氣並充填氬氣。對前述混合物加入 無水乙腈（lmL)，更加入2-氰基乙氧基-N，N，Ν’，N，-四異 丙基偶麟基二亞酸胺（350mg，1.16mmol)之無水乙腈溶液 (lmL)。於氬氣環境下且室溫下，將該混合物攪拌4小時。 以二氣甲烷稀釋前述混合物，再以飽和碳酸氫鈉水及飽和 食鹽水洗淨。回收有機層，以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有 機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供 予充填劑使用胺基二氧化矽凝膠之管柱層析法（展開溶劑 己烷：丙酮=7 : 3) ’製得無色糖漿狀之化合物22(680mg， 純度95%，收率76%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13)： 67.41-7.43 (m, 2H, Ar-H)'7.25-7.32(m, 4H, Ar-H)、7.17-7.22(m，2H，Ar-H)、6.80-6.83(m，4H, Ar-H)、 4.53(d，J=7.8Hz，1H，CH)、3.75-3.93(m，3H)、3.79(s，6H， OCH3)、3.46-3.68(m，5H)、3.34-3.41(m，1H，CH)、 3.10-3.31(m，1H，CH)、3.05(t，J=6.3 Hz，2H，CH2)、2.62(t， J=6.3 Hz，2H，CH2)、2.39-2.46(m，1H，CH)、2.29(t，7.3 Hz, 2H, CH2) ' 2.03-2.19(m, 1H, CH) ' 1.90-2.00(m, 1H, CH) ' 1.70-1.83(m，1H, CH)、1.51-1.71(m, 8H)、1.35-1.45(m，2H, CH2)、1.18(d，J=6.4 Hz，6H，CH3)、1.16(d, J=6.4 Hz，6H， CH3); P-NMR (CH3CN)6 146.90 ；
Ms(FAB+) : m/z 803(M++1)、303(DMTr+). 122 201217523 (實施例B5) 為了生成含有具脯胺酸骨架之連結子的本發明核酸分 子，利用下述流程5，合成出DMTr-醯胺伸乙基氧基乙基胺 基-L-脯胺酸亞醯胺（以下’稱為peg間隔子型）。 【化20】 〇 (pH2)4〇DMTr ㈠
24 流程5 (l)DMTr-醯胺羥基乙氧基乙基胺基-L-脯胺酸(化合物23) 混合DMTr-醯胺-L-脯胺酸（化合物6)(i.0〇g， 2.05mmol)、4-曱苯磺酸2-(2-羥基乙氧基）乙基酯（3 1〇g， 12_30mmol)及碳酸鉀(0.85g，6.15mmol)之無水二甲基甲酿 胺溶液（10mL)，於氬氣環境下且室溫下攪拌4天。針對前述 混合物，於減壓下且室溫下餾除溶劑後，加入二氣甲^ (20mL)後過濾。濃縮濾液，將所得殘渣供予二氧化砂凝膠 管柱層析法。前述二氧化矽凝膠管柱層析法之添力〇溶劑係 首先使用含0.05%吡啶之乙酸乙酯，之後使用含〇.〇5〇/吼咬 123 201217523 之CH2C12與CH3OH之混合液(CH2C12:CH30H=9: 1)。結果， 製得無色糖漿狀之化合物23(1.15g，收率97%)。以下顯示 前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13)： 57.41-7.45(m, 2H, Ar-H)'7.27-7.31(m, 6H, Ar-H)、7.17-7.21(m, 1H, Ar-H)、6.79-6_82(m, 4H，Ar-H)、 3.79(s，6H，OCH3)、3.60-3.70(m, 2H)、3.39-3.57(m，4H)， 3.13-3.27(m, 3H), 3.07-3.08(m, 2H) ' 2.71-2.84(m, 1H) > 2.38-2.46(m，1H)、2.14-2.19(m, 1H)、1.84-1.87(m, 1H)、 1.57-1.76(m，8H). (2)DMTr-醯胺伸乙基氧基乙基胺基-L-脯胺酸亞醯胺（化合 物24) 將所得前述DMTr-醯胺羥基乙氧基乙基胺基-L-脯胺酸 (化合物23)(0.63经，1.00111〇1〇1)與無水吡啶混合，室溫下共沸 乾燥。對所得殘留物加入四哇二異丙基銨（206mg， 1.20mmol)，減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物加入無 水乙腈（lmL)，更加入2-氰基乙氧基-N，N，Ν’，Ν’-四異丙 基偶構基二亞醯胺（282mg，1.12mmol)之無水乙腈溶液 (lmL)。於氬氣環境下且於室溫下攪拌該混合物4小時。接 著，以二氣甲烷稀釋前述混合物，並以飽和碳酸氫鈉水及 飽和食鹽水洗淨。回收有機層，以硫酸納乾燥後，過濾前 述有機層。針對所得前述濾液，於減壓下餾除溶劑。將所 得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽凝膠之管柱層析法 (展開溶劑己烷：丙酮=7 : 3，含0.05%吡啶），製得無色糖 漿狀之化合物24(0.74g，純度100%，收率87°/。）。以下顯示 124 201217523 前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CD3CN) ： δ7.41-7.43(ιη > 2Η > Ar-H)' 7.28-7.3l(m > 6H，Ar-H)、7.18-7.22(m，1H，Ar-H)、6.84-6.86(m，4H， Ar-H)、3.73-3.84(m，2H，CH2)、3.79(s，6H，OCH3)、 3.47-3.64(m，7H)、3.15-3.23(m，1H)、3.11(t，J=6.4 Hz， 2H，CH2)、3-01(t，J=5.9 Hz，2H，CH2)、2.95-2.99(m，1H)、 2.58-2.63(m，2H)、2_31-2.35(m，1H，CH)、2.03-2.19(m， 1H，CH)、1.48-1.78(m，10H)、1.12-1.57(m，12H，CH3); P-NMR(CD3CN) ： 5148.00 ；
Ms(FAB+) : m/z 776(M+)、303(DMTr+) 201(C8H19N2OP+). (實施例B6) 1.受保護脯胺醇之合成 依照以下所示流程6，合成受到二曱氧基三苯曱基保護 之脯胺醇(化合物3)。 【化21】 125 201217523
流程6 (1) 三氟乙醯基-L-脯胺醇（化合物1) 將L-脯胺醇(2.0g，20mmol)溶解於THF 20mL。另一方 面，使三11乙酸乙自旨（3.0§，21111111〇1)溶解於丁1^2〇1111^。接 著，將後者之THF溶液滴定至前者之含L-脯胺醇的THF溶 液，攪拌12小時。使該反應液減壓濃縮，製得化合物1(3.7g， 收率97%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： 54.28-4, 23(1.OH, m, OH), 3.90-3.41(5H ,H-2, H-5, H-6, m), 2.27-1.77(4H, H-3, H-4, m). (2) 三氟乙醯基-DMTr-L-脯胺醇（化合物2) 將所得前述三氟乙醯基-L-脯胺醇（化合物1)(3.7g， 19mmol)溶解於吡啶中，於室溫下共沸乾燥3次。使所得殘 留物溶解於吡啶15mL中，在氬環境下，於冰浴中一邊攪拌 一邊加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氣（DMTr-Cl)(8.1g， 126 201217523
24mmol)’更於室溫下反應4小時。接著為了使過剩之 DMTr-Cl淬冷，於前述反舰中更加入甲醇l〇mL並搜掉ι〇 分鐘。之後，於前述反應液加入二氣甲烷，洗淨飽和碳酸 氫鈉水溶液錢和健水。使洗淨後之已讀有機層以硫 酸鈉乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，並將 其殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑CH2Cl2 : CH3〇H=95 . 5，含0.1%吡啶）’製得已純化之化合物2(8 &， 收率89%)。以下顯示前述化合物之結果。 H-NMR(CDC13) · 67.39-7.18(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J
_8_6Hz，Ar-H), 3.78(6H, s，OCH3)，3.70-3.41(5H, H-2, H -5, H-6, m), 2.19-1.85(4H, H-3, H-4, m). (3)DMTr_L-脯胺醇(化合物3) 使所得刖述二氟乙醯基-DMTr-L-脯胺醇（化合物 2)(5g’ lOmmol)溶解於THF 100mL。於該THF溶液中加入5% 水酸化鈉水溶液100mL並攪拌。於此溶液中加入1M之氟化 四正丁基胺(TBAF)溶液5mL，於室溫下攪拌12小時。以飽 和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨該反應液。使洗淨後 之已回收有機層以硫酸鈉乾燥。過濾前述有機層，使所得 滤液減壓濃縮’製得化合物3(3.6g，收率90%)。以下顯示 前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDCl3) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J=8.6Hz, Ar-H), 3.78(6H, s, OCH3), 3.31(1H, m, H-6), 3.07(2H, m, H-2, H-6), 2.90(2H, m, H-5), 1.84(3H, m, H-3, H-4), 1.40(1H, m, H-3). 127 201217523 2.亞醯胺衍生物之合成 使用前述「1.」所合成之受保護脯胺醇（化合物3)，利 用下述流程7，合成出鍵結形式不同且具有脯胺醇之亞醯胺 衍生物。 【化22】
(l)DMTr-胺甲酸酯-L-脯胺醇(化合物4) 使 1，8-辛二醇(9.0g，62mmol)溶解於THF 90mL，置於 氬環境下。另一方面’將幾基二味〇^(2.〇g，i2mmol)溶解 於THF 10mL中。將後者之THF溶液加入前者之THF溶液 中，於室溫下攪拌1小時。以水洗淨該反應液至丨，8_辛二醇 之TLC點消失為止。更將洗淨後所回收之有機層以飽和食 鹽水洗淨，以無水硫酸鈉使回收之有機層乾燥，過濾前述 有機層，將所得濾液減壓濃縮。將其殘渣供予二氧化矽凝 膠管柱層析法(展開溶劑CHAh : CH3〇H=95 : 5)，製得已 純化之化合物。該化合物為1，8-辛二醇之單側末端已藉羰 基二咪唑而活性化之化合物（2.3g，收率77%)。 128 201217523 將前述化合物0.9g溶解於乙腈10mL中，置於氬環境 下。另一方面，使〇]\4!>-[-脯胺醇(化合物3)(1.9§，4.8111111〇1) 溶解於乙腈20mL中。將後者之乙腈溶液加入前述前者之乙 腈溶液，於室溫下攪拌24小時。接著，以飽和碳酸氫鈉水 溶液與飽和食鹽水洗淨該反應液，以無水硫酸鈉使回收之 有機層乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮。將 其殘渣供予二氧化矽凝膠管枉層析法（展開溶劑二氣甲 烷：丙酮=9 : 1，含0.1%吡啶），製得已純化之化合物4(脯 胺醇胺曱酸酯亞醯胺)(1.5g，收率65%)。以下顯示前述化合 物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J=8.6Hz, Ar-H), 4.24-3.94(2H, m, COOCH2), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.72-2.96(7H, m, alkyl, H-2, H-5, H-6), 2.10-1.30(16H, m, alkyl, H-3, H-4). FAB-MS ： 576 [M+H]+. (2)DMTr-醯脲-L-脯胺醇(化合物5) 於氬環境下，使三光氣（2.0g，6.7mmol)溶解於THF 10mL中，並於0°C下攪拌。另一方面，使DMTr-L-脯胺醇(化 合物3)(1.3g，3.2mmol)及N，N-二異丙基乙基胺（16g， 124mmol)溶解於THF 10mL中，滴定至前述三光氣之THF溶 液。將該反應液於〇°C下攪拌1小時，接著於室溫下攪拌2小 時。之後，將8-胺基-1-辛醇(2.3g，16mmol)及N，N-二異丙 基乙基胺(5.0g，38mmol)溶解於THF 30mL中。於0°C下將前 述攪拌後之反應液滴定至該THF溶液中1小時，於室溫下攪 129 201217523 拌48小時。將該反應液減壓濃縮，使其殘渣溶解於二氣甲 烧。以飽和破·酸氳納水溶液與飽和食鹽水洗淨該溶液，並 以無水硫酸鈉使回收之有機層乾燥。過濾前述有機層，將 所得濾液減壓濃縮後，將其殘渣供予逆相二氧化矽凝膠管 柱層析法而純化。此時，展開溶劑使用含有ο.1%吡啶之丙 酮與水的混合溶劑，令前述丙酮與水之混合比例採步進式 (stepwise)，具體來說，則是使丙酮：水之莫耳比依照2 : 8、 3 : 7、4 : 6及5 : 5之順序變化°以一氣曱烧抽提含有目的 化合物5之分液，使該有機層以無水硫酸鈉乾燥。過濾前述 有機層，使所得濾液減壓濃縮，製得化合物5(脯胺醇醯脲 亞醯胺）(〇.9g ’收率49%)。以下顯示前述化合物之NMR結 果。 'H-NMR(CDC13) ： 87.40-7· Ar"H)> 6.82(4H, m,
Ar-H), 3.78(s, 6H, OCH3). 3-68-3.25(9H, m, CH2NH, CH2OH, H-2, H-5, H-6), 1.74-1.18(16H, m, alkyl, H-3, H-4). FAB-MS : 575 [M+H]+· (3)具有脯胺醇之亞醯胺衍生物（化合物6及7) 作為經修飾脯胺酵，將所得刖述化合物4(0.8〇g ’ 1.4_〇1)溶解於乙猜，於室温下共沸乾燥3次。使所得殘留 物溶解於乙腈lmL·，ί於氬環境下。對該乙腈溶液添加四 唑二異丙基銨(〇.24g，Mmmol)而作為反應液。另一方面， 使2-氰基乙基N，N，N，，N，-四異丙基偶磷基二亞醯胺 (0.50g，1.7mmol)溶解於乙腈1mL*。將其添加至前述反應 液中，於室溫下搜拌4小時。對前述反應液添加二氣曱烧， 130 201217523 以飽和碳酸氫納水溶液與飽和食鹽水洗淨。以無水硫酸鈉 使洗淨後之已回收有機層乾燥，過濾前述有機層，將所得 渡液減壓濃縮。將其驗供傾基三氧切凝膠f柱層析 法（展開溶劑己烷：丙酮=10 : 1，含〇.1%吡啶），製得已純 化之化合物6(DMTr-胺曱酸酯-L-脯胺醇亞醯胺）(〇 9〇g，收 率83%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDCl3) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J=8.6Hz, Ar-H), 4.24-3.94(2H, m, COOCH2), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.72-2.96(11H, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-2, H-5, H-6), 2.58(2H, m, CH2CN), 2.10-1.46(16H, m, alkyl, H-3, H-4), 1.34-1.10(12H，m，CHCH3)。31P-NMR(CD3CN)3 146.82. FAB-MS : 776 [M+H]+. 除了使用前述化合物5取代前述化合物4來作為前述經 修飾脯胺醇以外，同樣地進行處理，製得已純化之化合物 7(DMTr-醯脲-L-脯胺醇亞醯胺)(〇.80g，收率74%)。以下顯 示前述化合物之NMR結果。 'H-NMRCCDCb) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, m, Ar-H), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.65-3.25(13H, m, CH2〇, P〇CH2, CHCH3, H-2, CH2NH, CH2OH, H-2, H-5, H-6), 2.73(2H, m, CH2CN), 2.10-1.48(16H, m, alkyl, H-3, H-4), 1.35-1.l〇(12H, m, CHCH3). 31P-NMR(CD3CN)5 146.83. FAB-MS ： 775 [M+H]+. 131 201217523 以上，參照實施形態來說明本案發明，但本案發明並 非受上述實施形態所限定者。本案發明之構成及詳情可在 本案發明之要旨（scope)範圍内進行業界人士可理解之各種 變更。 本申請案主張以下列申請案為基礎之優先權，並在此 納入其等之全部揭示内容：已於2010年7月8日提申之曰本 申請案特願2010-156122號、已於2010年10月13日提申之曰 本申請案特願2010-230808號、已於2010年12月2日提申之 曰本申請案特願2010-269824號、已於2010年8月3日提申之 曰本申請案特願2010-174915號、已於2010年1〇月13曰提申 之曰本申請案特願2010-230806號以及已於2010年12月2曰 提申之日本申請案特願2010-269823號。 產業上之可利用性 若依本發明之單股核酸分子，可抑制基因之表現，且 因非為環狀而合成容易，又，因其為單股，無需雙股之黏 合步驟，而可效率良好地進行製造。由於本發明之ssNc* 子係如前述般可抑制目標基因表現，舉例來說，作為醫藥 品、診斷藥及農藥以及農藥 '醫學、生命科學等之研究工 具均甚有用。 【圖式1簡單_說^明】 第1(A)〜1(B)圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子 之一例。 第2(A)〜2(B)圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子 之另一例。 132 201217523 第3(A)〜3(D)圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子 之其他例。 第4圖為圖表’顯示本發明實施例中之GAPDH基因表 現量的相對值。 第5圖為圖表’顯示本發明實施例中之GAPDH基因表 現量之相對值。 第ό圖為圖表，顯示本發明實施例中A549細胞之 GAPDH基因表現量的相對值。 第7圖為圖表，顯示本發明實施例中293細胞之GAPDH 基因表現量的相對值。 第8圖為圖表，顯示本發明實施例中之TGF-βΙ基因表現 量的相對值。 第9圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群中每單位 重量之肺的TGF-βΙ基因表現量。 第10圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之BAFL 樣本中的細胞數。 第11圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之BALF 樣本中的嗜中性球細胞數。 第12圖為照片，顯示本發明實施例中BALF樣本中之細 胞的吉姆沙染色(Giemsa stain)結果：（A)為LPS(+)/RNA(-) 投予群4之結果，（B)為LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投 予群6的結果，〇為lps(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5 的結果。 第13圖為照片，顯示本發明實施例之肺組織he染色結 133 201217523 果：（A)為LPS(+)/RNA(-)之投予群4的結果，⑻為LPS(+)/ 陰性控制組NK-0035(+)之投予群6的結果，（〇為 LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5的結果。 第14(A)圖係顯示本發明實施例中之TGF-βΙ基因表現 量的結果；第14(B)圖係顯示本發明實施例中之ifn-cx基因 表現量的結果；第14(C)圖係顯示本發明實施例中之iFN-β 基因表現量的結果。 第15圖為圖表，顯示本發明實施例中TGF-βΙ基因表現 量之相對值。 第16圖為圖表，顯示本發明實施例TGF-βΙ基因表現量 之相對值。 第17圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之每單 位重量之肺的TGF-βΙ表現量。 第18(A)圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之 BALF樣本中之TNF_a量；第18(叫圖為圖表，顯示本發明實 施例中各投予群之BALF樣本中之IFN-β量。 第19圖為圖表，顯示本發明實施例中293細胞之LAMA 基因表現量的相對值。 第20圖為圖表，顯示本發明實施例中A549細胞之 LMNA基因表現量的相對值。 第21圖係一顯示本發明實施例所使用ssrnA之圖。 第22圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 第23圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。 134 201217523 第24圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 第25圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。 第26圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 第27圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。 第28圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 第29圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現 量之相對值。 第30圖為圖表，顯示本發明實施例中HCT116細胞之 GAPDH基因表現量的相對值。 第31圖為電泳照片，顯示本發明實施例中之核糖核酸 酶对性。 第32圖為電泳照片，顯示本發明實施例中之S7核酸酶 财性。 【主要元件符號說明】 (無） 135 201217523 序列表
<110> BONAC CORPORATION <120〉 用以控制基因表現之單股核酸分子
<130> TF11005TW <150〉 JP 2010-156122 <151〉 2010-07-08 <150〉 JP 2010-174915 <151〉 2010-08-03 <150> JP 2010-230806 <151〉 2010-10-13 <150> JP 2010-230808 <151〉 2010-10-13 <150> JP 2010-269823 <151〉 2010-12-02 <150> JP 2010-269824 201217523 <151〉 2010-12-02 <160〉 80 < 170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211〉 19 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 〈223〉siRNA <400> 1 guugucauac uucucaugg <210〉 2 <211〉 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 201217523 〈223> 核酸分子 <400〉 2 caugagaagu augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aa <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 〈2 2 3〉正意 <400> 3 ccaugagaag uaugacaaca g <210〉 4 <211> 21 <212〉 RNA <213〉 人工的 201217523 <220〉 <223〉 反意 <400> 4 guugucauac uucucauggu u <210> 5 <211〉 19 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉siRNA <400〉 5 auuguaacga gacaaacac <210〉 6 <211〉 19 <212> RNA <213〉 人工的 201217523 <220〉 <223〉siRNA <400> 6 uugcgcuuuu uggugacgc 19 <210> 7 〈211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 〈220〉 <223〉 核酸分子 <400> 7 agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaaccauga gaaguaugac 60 aa 62 <210〉 8 58 <211> 5 201217523 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 8 accaugagaa guaugacaac agccuucggg cuguugucau acuucucaug guucaugg 58 〈210〉 9 <211> 23 <212〉DNA 〈213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400> 9 ggagaaggct ggggctcatt tgc 23 <210〉 10 23 <211> 6 201217523 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400〉 10 tggccagggg tgctaagcag ttg 23 <210〉 11 <211〉 23 <212〉DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400〉 11 gccacggctg cttccagctc etc 23 <210〉 12 〈211〉 25 7 201217523 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400〉 12 aggtctttgc ggatgtccac gtcac 25 <210〉 13 <211〉 51 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400> 13 caugagaagu augacaacag ccggcuguug ucauacuucu caugguucga a 51 <210> 14 <211〉 62 8 201217523 <212〉RNA <213〉 人工的 <220> <223〉 核酸分子 <400> 14 augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aaccaugaga 60 ag 62 <210> 15 <211〉 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 15 ugucagugcu cauuuacaag ccccacaccg gcuuguaaau gagcacugac acuucuucgg 60 aa 62 9 201217523 <210〉 16 <211〉 21 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223> siRNA <400> 16 aaagucaaug uacagcugcu u 21 <210〉 17 <211〉24 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400> 17 ccattgctgt cccgtgcaga gctg 24 10 201217523 <210〉 18 <211〉 25 <212〉DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400> 18 atggtagccc ttgggctcgt ggatc <210〉 19 <211〉 24 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400〉 19 gtcgtaccac aggcattgtg atgg 201217523 <210〉 20 <211〉 22 <212〉 DNA <213〉 人工的 <220> <223〉 引子 <400> 20 gcaatgcctg ggtacatggt gg 22 <210> 21 <211〉 25 <212> DNA <213〉 人工的 <220> <223> 引子 <400> 21 cccttattga cctcaactac atggt 25 12 201217523 <210〉 22 <211〉 23 <212> DNA 〈213> 人工的 <220〉 <223> 引子 <400> 22 gaggggccat ccacagtctt ctg 23 <210〉 23 <211〉 21 <212〉DNA <213〉 人工的 <220> <223〉 引子 <400〉 23 actccacgtg gaaatcaacg g 21 13 201217523 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223> 引子 <400> 24 tagtagacga tgggcagtgg 20 <210> 25 <211〉 22 <212〉DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400> 25 atggctagrc tctgtgcttc ct 22 14 201217523 <210〉 26 <211〉 24 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400〉 26 agggctctcc agayttctgc tctg <210〉 27 <211〉 21 <212> DNA <213〉 人工的 〈220〉 <223〉 引子 <400> 27 catcaactat aagcagctcc a 201217523 <210> 28 <211> 21 <212〉DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400〉 28 ttcaagtgga gagcagttca g 21 <210〉 29 <211> 61 <212> RNA 〈213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉29 agcuguacau ugacuuuagc cccacaccgg cuaaagucaa uguacagcug cuucuucgga 60 16 201217523 a 61 <210〉 30 <211〉 62 <212〉RNA <213〉 人工的 <220> <223〉 核酸分子 <400> 30 agcagcugua cauugacuuu agccccacac cggcuaaagu caauguacag cugcuucuuc 60 gg 62 <210〉 31 〈211〉 61 <212> RNA <213〉 人工的 〈220〉 <223〉核酸分子 17 201217523 <400〉 31 gcagcuguac auugacuuua gccccacacc ggcuaaaguc aauguacagc ugcuucuucg 60 g 61 <210〉 32 <211> 51 <212〉 RNA <213> 人工的 <220> <223> 核酸分子 <400> 32 cagcuguaca uugacuuuag ccggcuaaag ucaauguaca gcugcuucga a 51 <210> 33 <211> 50 <212> RNA <213> 人工的 18 201217523 <220> <223> 核酸分子 <400> 33 agcuguacau ugacuuuagc cggcuaaagu caauguacag cugcuucgaa 50 <210〉 34 <211〉 51 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400> 34 agcagcugua cauugacuuu agccggcuaa agucaaugua cagcugcuuc g 51 <210〉 35 <211〉 50 <212〉 RNA <213〉 人工的 19 201217523 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 35 gcagcuguac auugacuuua gccggcuaaa gucaauguac agcugcuucg 50 <210〉 36 <211〉 51 <212> RNA <213〉 人工的 <220> <223〉 核酸分子 <400〉 36 ugucagugcu cauuuacaag ccggcuugua aaugagcacu gacacuucga a 51 <210> 37 <211> 63 <212> RNA <213> 人工的 20 201217523 <220〉 <223〉核酸分子 <40〇> 37 accaugagaa guaugacaac agccuucaag agaggcuguu gucauacuuc ucaugguuca ugg <210〉 38 <211> 51 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 38 ccaucaacga uaagugaaag ccggcuuuca cuuaucguug auggcuucga a <210〉 39 <211〉 21 <212>
RNA 201217523 <213〉 人工的 <220〉 <223〉 正意 <400> 39 gcagcuguac auugacuuua g 21 <210> 40 <211〉 21 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 反意 <400〉 40 aaagucaaug uacagcugcu u 21
<210〉 41 <211〉 21 <212〉 RNA 22 201217523 〈213> 人工的 <220〉 <223〉 正意 <400> 41 gugucagugc ucauuuacaa g 21 <210〉 42 <211〉 21 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> <223〉反意 <400〉 42 uguaaaugag cacugacacu u 21
<210〉 43 <211> 62 <212〉 RNA 23 201217523 <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 43 uguuugucuc guuacaauau ccccacaccg gauauuguaa cgagacaaac acuccuucgg 60 ga 62 <210〉 44 <211> 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400> 44 aguguuuguc ucguuacaau auccccacac cggauauugu aacgagacaa acacuccuuc 60 gg 62 24 201217523 <210〉 45 <211〉 23 <212> DNA <213〉 人工的 <220> <223〉 引子 <400> 45 aaagctgcca atgcccctcg acc <210〉 46 <211> 22 <212〉DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400〉 46 taggtgggtg gccctcgtct tg 201217523 <210〉 47 <211> 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 47 cgucaccaaa aagcgcaauu ccccacaccg gaauugcgcu uuuuggugac gcuucuucgg 60 aa 62 <210〉 48 <211> 62 <212> RNA <213> 人工的 <220> <223> 核酸分子 <400> 48 26 201217523 agcgucacca aaaagcgcaa uuccccacac cggaauugcg cuuuuuggug acgcuucuuc 60 gg 62 <210〉 49 <211> 24 <212〉DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400> 49 ctggacatca agctggccct ggac 24 〈210〉 50 <211〉 24 <212〉DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 27 201217523 <400> 50 caccagcttg cgcatggcca cttc 24 <210〉 51 <211〉 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> <223> 核酸分子 <400> 51 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu 60 eg 62 <210〉 52 <211> 62 <212> RNA <213> 人工的 28 201217523 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 52 accaugagaa guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc 60 gg 62 <210> 53 <211> 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 53 ccaugagaag uaugacaaca gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg 60 ga 〈210〉 54 29 62 201217523 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 54 augagaagua ugacaacagc cccacaccgg cuguugucau acuucucaug guucuucgga 60 ac 62 <210〉 55 <211> 62 <212> RNA <213〉 人工的 〈220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 55 ugagaaguau gacaacagcc ccacaccggc uguugucaua cuucucaugg uucuucggaa 60 30 201217523 cc 62 <210〉 56 <211〉 62 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 56 agaaguauga caacagcccc acaccggcug uugucauacu ucucaugguu cuucggaacc 60 au 62 <210〉 57 <211> 62 <212〉RNA 〈213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 31 201217523 <400〉 57 aaguaugaca acagccccac accggcuguu gucauacuuc ucaugguucu ucggaaccau ga <210〉 58 <211〉 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> <223> 核酸分子 <400> 58 guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaaccauga ga
<210〉 59 <211> 62 <212> RNA 201217523 <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 59 acaacagccc cacaccggcu guugucauac uucucauggu ucuucggaac caugagaagu 60 au 62 <210> 60 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 60 aacagcccca caccggcugu ugucauacuu cucaugguuc uucggaacca ugagaaguau 60 ga 62 33 201217523 <210> 61 <211〉 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> <223〉核酸分子 <400〉 61 cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu cggaaccaug agaaguauga 60 <210> 62 <211> 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 62 34 201217523 gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg gaaccaugag aaguaugaca 60 ac <210〉 63 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220> <223〉 核酸分子 <400> 63 » ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aaccaugaga aguaugacaa 62 60 ca <210〉 64 <211> 62 <212> RNA <213〉 人工的 62 35 201217523 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 64 cccacaccgg cuguugucau acuucucaug guucuucgga accaugagaa guaugacaac 60 ag 62 <210〉 65 <211〉 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 65 ccacaccggc uguugucaua cuucucaugg uucuucggaa ccaugagaag uaugacaaca 60 gc <210> 66 36 62 201217523 <211> 64 <212〉RNA <213〉 人工的 <220> <223〉核酸分子 <400> 66 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucgu 60 ucgc 64 〈210〉 67 <211> 60 <212> RNA <213〉 人工的 〈220〉 <223〉 核酸分子 <400> 67 accaugagaa guaugacaac agcccacacc gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 37 201217523 <210> 68 <211〉 58 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400> 68 ccaugagaag uaugacaaca gcccacaccg cuguugucau acuucucaug guuuucga 58 <210> 69 <211〉 58 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400> 69 accaugagaa guaugacaac agccacaccc uguugucaua cuucucaugg uucuucgg 58 38 201217523 <210> 70 <211〉 56 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 70 ccaugagaag uaugacaaca gccacacccu guugucauac uucucauggu uuucga 56 <210> 71 <211> 54 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 71 caugagaagu augacaacag ccacacccug uugucauacu ucucaugguu ucga 54 39 201217523 <210> 72 <211〉 54 <212> RNA 〈213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 72 ccaugagaag uaugacaaca ccacaccugu ugucauacuu cucaugguuu ucga 54 <210〉 73 <211〉 52 <212> RNA <213〉 人工的 <220> <223> 核酸分子 <400> 73 caugagaagu augacaacac cacaccuguu gucauacuuc ucaugguuuc ga 52 40 201217523 <210〉 74 <211〉 63 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 74 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu 60 egg 63 <210> 75 <211〉 61 <212> RNA <213〉 人工的 <220> <223〉核酸分子 <400> 75 41 201217523 ccaugagaag uaugacaaca gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg 60 g 61 <210〉 76 <211〉 60 <212〉 RNA <213> 人工的 <220> 〈223〉 核酸分子 <400> 76 caugagaagu augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 <210> 77 <211〉 62 <212> RNA <213> 人工的 <220> <223> 核酸分子 42 60201217523 <400〉 77 accaugagaa guaugacaac agccuucggg cuguugucau acuucucaug guucccacac eg <210〉 78 <211〉 65 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 78 ggaaccauga gaaguaugac aacagccaag ucuuggcugu ugucauacuu cucaugguuc 62 60
cucug <210> 79 <211〉 63 <212> RNA 65 43 201217523 <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 79 60 63 ggaaccauga gaaguaugac aacagccaag cuuggcuguu gucauacuuc ucaugguucc ucg <210〉 80 <211> 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220> <223〉 核酸分子 <400> 80 60 cagcuguaca uugacuuuag ccccacaccg gcuaaaguca auguacagcu gcuucuucgg aa 44 62

Claims (1)

  1. 201217523 七、申請專利範圍： 1· 一種單股核酸分子，係含有抑制目標基因表現之抑制表現 序列者，其特徵在於： 從5’端側至3,端側依序含有5’端側區域(Xc)、内部區域 (Z)及3’端側區域(Yc), 前述内部區域(Z)係内部5,端側區域(X)及内部3,端側 區域(Y)連結而構成者， 前述5 ’端側區域(xc)與前述内部5，端側區域(X)互補， 前述3 ’端側區域(YC)與前述内部3，端側區域(γ)互補， 且’前述内部區域(Z)、前述5,端側區域(XC)及前述3, 端側區域(Y c)中之至少一者含有前述抑制表現序列。 2. 如申請專利範圍第1項之單股核酸分子，其中前述5,端側區 域(Xc)與前述内部5，端側區域(χ)之間具有連結區域(Lx)， 且則述5 ’端側區域(xc)與前述内部5，端側區域(χ)透過前述 連結區域(Lx)而連結D 3. 如申請專利範圍第丨或2項之單股核酸分子，其中前述3，端 側區域(Yc)與前述内部3’端側區域(γ)之間具有連結區域 (Ly)’且刖述3’端側區域(Yc)與前述内部3，端側區域(γ)透過 前述連結區域(Ly)而連結。 4·如申印專利範圍第1項之單股核酸分子，其中前述5,端側區 域(Xc)與前述内部5,端側區域(χ)之間具有連結區域㈣， 則述5鈿側區域(xc)與前述内部5，端側區域(X)透過前述連 結區域(Lx)而連結，前述3,端側區域(Ye)與前述内部3’端側 區域(Y)之間具有連結區域(Ly)，且前述3，端側區域(Yc)與 1 201217523 前述内部3 ’端側區域(Y)透過前述連結區域(Ly)而連結。 5_如申請專利範圍第1至4項中任一項之單股核酸分子，其中 前述内部區域(Z)之鹼基數(Z)、前述内部5,端側區域(X)之 驗基數(X)、前述内部3’端側區域(γ)之驗基數(γ)、前述5, 端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)以及前述3,端侧區域(Yc)之鹼 基數(Yc)滿足下述式（1)及(2)之條件： ζ=χ+γ · · · (1) Z^Xc+Yc · · - (2)。 6·如申請專利範圍第丨至5項中任—項之單股核酸分子，其中 前述内部5’端側區域(X)之鹼基數(χ)、前述5，端側區域(xc) 之鹼基數(Xc)、前述内部3,端側區域(γ)之鹼基數(γ)以及前 述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)滿足下述(a)〜(d)中之任一 條件： (a) 滿足下述式(3)及(4)之條件； X>Xc · · · (3) Y=Yc · · · (4) (b) 滿足下述式(5)及(6)之條件； X=Xc · · · (5) Y> Yc · · · (6) (c) 滿足T述式(7)及(8)之條件； X>Xc · · ·⑺ Y> Yc · · •⑻ (d) 滿足下述式(9)及（10)之條件； X=Xc · · · (9) 2 201217523 Y=Yc · · · (10)。 7. 如申請專利範圍第6項之單股核酸分子，其中前述（a)〜(d) 中，前述内部5’端側區域(X)之鹼基數與前述5，端側區域 (Xc)之鹼基數(Xc)的差、前述内部3’端側區域⑺之驗基數(γ) 與前述3’端側區域(Yc)之驗基數(Yc)的差滿足下述條件： (a) 滿足下述式（11)及（12)之條件； X-Xc=l、2或3 · · · (11) Y-Yc=0 · · · (12) (b) 滿足下述式（13)及（14)之條件； X-Xc=0 · · · (13) Y-Yc=l、2或3 ... (14) (c) 滿足下述式（15)及（16)之條件； X-Xc=l、2或3 · · · (15) Y-Yc=l ' 2或3 ... (16) (d) 滿足下述式（17)及（18)之條件； X-Xc=〇 · · · (17) Y-Yc=0 · · · (18)。 8. 如申請專利範圍第丨至7項中任一項之單股核酸分子，其中 前述内部區域(Z)之鹼基數(Z)為19個鹼基以上。 9·如申請專利範圍第8項之單股核酸分子，其中前述内部區 域(Z)之鹼基數(z)為19個鹼基至30個鹼基。 10_如申請專利範圍第1至9項中任一項之單股核酸分子，其中 月1J述5’端側區域(Xc)之鹼基數(乂幻為丨〜丨丨個鹼基。 •如申請專利範圍第項之單股核酸分子，其中前述5,端側 201217523 區域(Xc)之驗基數(xc)為丨〜7個驗基。 12·如申請專利範圍第1〇項之單股核酸分子，其中前述5,端側 區域(Xc)之驗基數(\〇)為1〜3個驗基。 13. 如申μ專利範圍第1至12項中任_項之單股核酸分子，其中 前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(丫幻為丨〜丨丨個鹼基。 14. 如申請專利範圍第13項之單股核酸分子，其中前述3，端側 區域(Yc)之鹼基數(YC)為1〜7個鹼基。 15. 如申請專利範圍第13項之單股核酸分子，其中前述3，端側 區域(Yc)之驗基數(Yc)為1〜3個驗基。 16. 如申请專利|已圍第1至15項中任一項之單股核酸分子，其含 有至少1個經修飾之殘基。 17·如申請專利範圍第1至16項中任一項之單股核酸分子，其含 有標記物質。 18. 如申清專利範圍第1至π項中任一項之單股核酸分子，其含 有穩定同位素。 19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項之單股核酸分子，其係 RNA分子。 20. 如申請專利範圍第2至19項中任一項之單股核酸分子，其中 前述連結區域(Lx)及/或前述連結區域(Ly)係由核苷酸殘基 (nucleotide residue)及非核苦酸殘基中之至少一者所構成。 21. 如申請專利範圍第20項之單股核酸分子，其中前述核苷酸 殘基為非經修飾核普酸殘基及/或經修部核芽酸殘基。 22. 如申請專利範圍第20或21項之單股核酸分子，其中前述連 結區域(Lx)及/或前述連結區域(Ly)係由下述（1)〜(7)中之任 201217523 一殘基所構成： (1) 非經修飾核苷酸殘基； (2) 經修飾核苷酸殘基； (3) 非經修飾核苷酸殘基及經修飾核苷酸殘基； (4) 非核苷酸殘基； (5) 非核苷酸殘基及非經修飾核苷酸殘基； (6) 非核苷酸殘基及經修飾核苷酸殘基；及 (7) 非核苷酸殘基、非經修飾核苷酸殘基及經修飾核苷 酸殘基。 23.如申請專利範圍第1至22項中任一項之單股核酸分子，其中 則述單股核酸分子中，鹼基數總計為5〇鹼基以上。 认如申請專利範圍第m項中任一項之單股核料子，其中 則述基因之抑制表現係RN A干擾所致之抑制表現。 25. 如申响專利範圍第丨至24項中任一項之單股核酸分子，其中 前述單股核酸分子之鹼基序列為序列編號2、7、8、丨3、Μ、 29至35、37、43、44、47、48及51至8时之任_驗基序列。 26. —種抑制表現用組成物，係用以抑制目標基因之表現者， 其特徵在於：含有如申請專利範圍第丨至25項中任—項之單 股核酸分子。 27. —種藥學組成物’其特徵在於：含有如申請專利範圍第工至 25項中任一項之單股核酸分子。 其係供炎症治療用 28·如申請專利範圍第27項之藥學組成物 者。 29· —種抑制表現方法，係抑制目標基因之表現者，其特徵在 201217523 於：使用如申請專利範圍第丨至25項中任一項之單股核酸分 子。 30. 如申請專利範圍第29項之抑制表現方法，其含有：將前述 單股核酸分子投予細胞、組織或器官之步驟。 31. 如申請專利範圍第30項之抑制表現方法，其係於活體内（in vivo)或活體外(in vitro)投予前述單股核酸分子。 32. 如申請專利範圍第29至31項中任一項之抑制表現方法，其 中前述基因之抑制表現係RNAt擾所致之抑制表現。 33· —種誘導表現方法，係誘導抑制目標基因表現iRNA干擾 者，其特徵在於：使用如申請專利範圍第丨至25項中任一項 之單股核酸分子。 34. —種治療方法，係疾病之治療方法，其特徵在於： 包含將如申請專利範圍第1至25項中任一項之單股核 酸分子投予患者之步驟； 且，前述單股核酸分子具有一抑制基因表現之序列作 為前述抑制表現序列，且該基因係前述疾病之成因。 35. —種單股核酸分子之用途，係將如申請專利範圍第1至項 中任一項之單股核酸分子用於抑制目標基因之表現者。 36. 一種單股核酸分子之用途，係將如申請專利範圍第1至25項 中任—項之單股核酸分子用於誘導RNA干擾者。 37_ —種核酸分子，係用於治療疾病者，其特徵在於： 前述核酸分子為如申請專利範圍第1至25項中任— 項之單股核酸分子， 且，前述單股核酸分子具有一抑制基因表現之序列作 6 201217523 為前述抑制表現序列，且該基因係前述疾病之成因。
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