JP7640461B2 - 核酸オリゴマーの製造方法 - Google Patents

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Description

本特許出願は、日本国特許出願２０１９－１８７９３０号（２０１９年１０月１１日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
本発明は、リボースを含む核酸オリゴマーの製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、核酸オリゴマーに含まれるリボースの水酸基の保護基の脱保護方法に関する。
リボースを含む核酸オリゴマーであるＲＮＡは、ＲＮＡプローブ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、アプタマーなどとして利用可能であり、有用な素材である。
核酸オリゴマーは、固相合成法により合成可能であり、固相合成法ではヌクレオシドのホスホロアミダイト（以下、「アミダイト」と称する）が原料として用いられる。固相担体上で、核酸を伸長して合成された核酸オリゴマーは、固相担体から切り出し、次いで、リボースを含む核酸オリゴマーは、リボースの２’位の水酸基の保護基を脱保護して除いて、目的とする核酸オリゴマーが製造されている。このようにして合成された核酸オリゴマーの純度は、核酸の固相担体上での伸長反応工程、固相担体からの切り出し工程、各保護基の脱保護工程などの多段階の工程を経ているため必ずしも満足いくものではなく、合成は効率的ではなかった（特許文献１、２）。
国際公開第２００６／０２２３２３号公報 国際公開第２０１３／０２７８４３号公報
本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸オリゴマーに、酸素濃度が一定以下の不活性ガス雰囲気下で、フッ化物イオンを接触させることにより、該核酸オリゴマーに含まれるリボースの水酸基の保護基を効率よく脱保護することができるという知見を得て、結果として、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することができる。
本発明は、これら知見に基づき本発明を完成させたものであり、以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
項１． 酸素濃度が１５％以下の不活性ガス雰囲気下で、式（３）：
Figure 0007640461000001
 （式中、
Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、
Ｇ５は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
ＢＣは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基、または式（１）：
Figure 0007640461000002
 （式中、
ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素原子との結合であることを表し、
ｎは１～５の何れかの整数を表す。
ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。）
の保護基を表し、
Ｙは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
ｍは、２以上２００までの何れかの整数を表し、
ＷおよびＸは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかで定義され、
（ａ）Ｗが水酸基であるときは、Ｘは前記Ｒ基と同じ定義である。
（ｂ）Ｘが水酸基であるときは、ＷはＯＶ基を表し、
Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
ただし、前記Ｒ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。そして
ｍが３以上の整数のとき、式（３）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
で示される核酸オリゴマーを、フッ化物イオンと接触させることを特徴とする、式（４）：
Figure 0007640461000003
 （式中、
Ｒ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
Ｑ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
式（４）の置換基Ｇ４、Ｇ５、Ｙ、Ｂｃおよびｍの定義は、前記式（３）における定義と同じであり、
Ｗ０は、水酸基であり、
Ｘ０は、前記Ｒ’基と同じ定義である。
そして、ｍが３以上の整数のとき、式（４）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
で示される核酸オリゴマーの製造方法（以下、本明細書中、「本発明の製造方法」と呼称する）。
項２． 非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、前記項１に記載の製造方法。
項３． アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）または式（Ａ１４－３）の構造を有するリンカーである、前記項２に記載の製造方法。
Figure 0007640461000004
 （式中、５’および３’は、核酸オリゴマーの５’末端側および３’末端側をそれぞれ示す。）
項４． Ｗが水酸基であり、ＸがＲ基であり、Ｗ０が水酸基であり、そしてＸ０がＲ’基である、前記項１～３の何れか１項に記載の製造方法。
項５． フッ化物イオン源が、フッ化テトラアルキルアンモニウムである、前記項１～４の何れか１項に記載の製造方法。
項６． フッ化テトラアルキルアンモニウムが、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）である、前記項１～５の何れか１項に記載の製造方法。
項７． 酸素濃度が１０％以下の不活性ガス雰囲気下で反応を行う、前記項１～６の何れか１項に記載の製造方法。
項８． 酸素濃度が５％以下の不活性ガス雰囲気下で反応を行う、前記項１～６の何れか１項に記載の製造方法。
項９． 酸素濃度が０％の不活性ガス雰囲気下で反応を行う、前記項１～６の何れか１項に記載の製造方法。
項１０． 式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンの全量を添加するために要する時間が３０分以上である、前記項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
項１１． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が５％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項１２． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１０％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項１３． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が２０％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項１４． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が３０％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項１５． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が４０％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項１６． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が５０％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項１７． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が６０％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項１８． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が７０％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項１９． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が８０％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項２０． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が９０％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項２１． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が９５％以上である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
項２２． 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１００％である、前記項１～１０の何れか１項に記載の製造方法。
本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。製造される核酸オリゴマーの純度向上が期待できる。
酸素濃度が１５％以下の不活性ガス雰囲気下で、式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させ、式（１）の保護基が脱保護された式（４）で示される核酸オリゴマーを製造する方法について説明する。
式（１）において、Ｒａ及びＲｂはともに、メチル基、エチル基または水素原子でもよく、好ましくはＲａがメチル基またはエチル基、Ｒｂが水素であり、より好ましくはＲａがメチル基、Ｒｂが水素である。ｎは、好ましくは１～４の整数、より好ましくは１～３の整数、更に好ましくは１又は２、特に好ましくは１である。
式（３）のＲ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。Ｒ、ＷおよびＸのうち、式（１）の割合は、１％以上でもよく、より好ましくは５％以上であり、より好ましくは１０％以上であり、より好ましくは２０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、より好ましくは４０％以上であり、より好ましくは５０％以上であり、より好ましくは６０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、更により好ましくは９５％以上である。
式（３）で示される核酸オリゴマーとフッ化物イオンとの接触反応は、フッ化物イオンを式（３）で示される核酸オリゴマーに添加してもよいし、逆に、フッ化物イオンに式（３）で示される核酸オリゴマーを添加してもよいし、両者を同時に加えてもよい。フッ化物イオンを式（３）で示される核酸オリゴマーに添加する方法が好ましい。式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンの全量を添加するために要する時間は、５分以上が好ましく、１０分以上がより好ましく、１５分以上がより好ましく、３０分以上がより好ましく、更に好ましくは１時間以上かけて滴下することである。
かかる添加は、式（３）で示される核酸オリゴマーを含む溶液の液表面または液中に５分以上かけて滴下することが好ましく、１０分以上かけて滴下することがより好ましく、１５分以上かけて滴下することがより好ましく、３０分以上かけて滴下することがより好ましく、更に好ましくは１時間以上かけて滴下することである。
この式（１）で示される水酸基の保護基を脱保護する工程では、フッ化物イオン源として、典型的には、フッ化テトラアルキルアンモニウムが使用される。
フッ化テトラアルキルアンモニウムとしては、テトラブチルアンモニウムフルオリド、およびテトラメチルアンモニウムフルオリド等が挙げられる。中でもテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）がより好ましい。
使用するフッ化物イオンの量は、通常、除去される保護基１モル当たり１～１０００モル、好ましくは１～５００モル、より好ましくは２～２００モル、更に好ましくは４～１００モルである。
この工程では、通常、反応に不活性な有機溶媒が使用され、具体的には、例えば、スルホキシド溶媒、ニトリル溶媒、エーテル溶媒、アミド溶媒、ケトン溶媒、脂肪族炭化水素溶媒、エステル溶媒、芳香族溶媒、またはこれらの２種類以上の混合溶媒が挙げられ、これらの溶媒のうちスルホキシド溶媒が好ましい。スルホキシド溶媒としては、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。ニトリル溶媒としては、アセトニトリル、およびプロピオニトリル等が挙げられる。エーテル溶媒としては、テトラヒドロフラン等が挙げられる。アミド溶媒としては、Ｎ－メチル－２－ピロリドン等が挙げられる。ケトン溶媒としては、アセトン、およびメチルエチルケトン等が挙げられる。脂肪族炭化水素溶媒としては、ヘキサン、およびヘプタン等が挙げられる。エステル溶媒としては、酢酸メチル、および酢酸エチル等が挙げられる。芳香族溶媒としては、トルエン、およびピリジン等が挙げられる。中でも、ジメチルスルホキシド、またはジメチルスルホキシドとアセトニトリルとの混合溶媒が好ましい。
式（１）で示される水酸基の保護基を脱離する工程で使用される試薬であるフッ化物イオン源は、溶媒に溶解後、通常、脱水して使用する。脱水剤としてモレキュラーシーブ、硫酸塩などが挙げられ、好ましくはモレキュラーシーブ４Ａを使用する。
使用する溶媒の量は、通常、脱保護工程に供される核酸オリゴマー１モル当たり、５～８，０００Ｌ、好ましくは５０～２，０００Ｌ、より好ましくは１００～１，６００Ｌである。
必要であれば、本工程における副生成物である下記式（２）に示すニトリル化合物と反応して当該ニトリル化合物を捕捉する化合物を添加することができる。該捕捉する化合物としては、例えば、ニトロアルカン、アルキルアミン、アミジン、チオール、チオール誘導体又はこれらの２種類以上の混合物を挙げることができる。「ニトロアルカン」としては、例えばニトロメタンを挙げることができる。「アルキルアミン」としては、例えば、直鎖状の炭素数１～６のアルキルアミン、および炭素数１～８の環状アミンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、ｎ－ブチルアミン、ｎ－ペンチルアミン、ｎ－ヘキシルアミン、モルホリン、およびピペリジンを挙げることができる。「アミジン」としては、例えば、ベンズアミジン、およびホルムアミジンを挙げることができる。「チオール」としては、例えば、直鎖状の炭素数１～６のチオールを挙げることができる。具体的には、例えば、メタンチオール、エタンチオール、１－プロパンチオール、１－ブタンチオール、１－ペンタンチオール、および１－ヘキサンチオールを挙げることができる。「チオール誘導体」としては、例えば、同一又は異なる直鎖状の炭素数１～６のアルキルチオール基を有するアルコール又はエーテルを挙げることができる。具体的には、例えば、２－メルカプトエタノール、４－メルカプト－１－ブタノール、６－メルカプト－１－ヘキサノール、メルカプトメチルエーテル、２－メルカプトエチルエーテル、３－メルカプトプロピルエーテル、４－メルカプトブチルエーテル、５－メルカプトペンチルエーテル、および６－メルカプトヘキシルエーテルを挙げることができる。該捕捉する化合物としては、より好ましくはニトロメタンを使用する。
式（２）：
Figure 0007640461000005
 （式中、ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表す。ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。）
で示される化合物。
副生成物である式（２）に示す化合物を捕捉する化合物の使用量は、式（１）で示される水酸基の保護基を脱離させるフッ化物イオン源に対して０．１～１００．０モル％で用いることができ、好ましくは１．０～５０．０モル％、好ましくは２．０～４０．０モル％、より好ましくは３．０～３０．０モル％である。
式（１）で示される水酸基の保護基を脱保護する反応の温度は、使用する脱保護剤の種類によって異なるが、通常、０℃～８０℃、好ましくは１０℃～４５℃、より好ましくは１５℃～３５℃である。
更に、脱保護反応の時間は、使用する脱保護剤の種類、反応の温度によって異なるが、通常、１時間～１００時間、好ましくは、１～２４時間、より好ましくは２～１２時間、より好ましくは３～１０時間、より好ましくは３～８時間、更に好ましくは３～６時間である。
尚、反応の温度は、任意のタイミングで変更してもよく、また、式（１）で示される水酸基の保護基を脱保護する脱保護剤は、任意のタイミングで追加してもよい。
酸素濃度が１５％以下の不活性ガス雰囲気は、例えば、前記所定の酸素濃度以下の不活性ガスを調製して、反応系に供給し、気相中の酸素濃度が前記設定濃度範囲内であることを測定して、確認することにより調整してもよい。具体的には、反応系の気相にアルゴンもしくは窒素などの高純度の不活性ガス、または酸素濃度を所定の濃度に調製した不活性ガスを流通させるか、あるいは反応系の気相雰囲気を前記不活性ガスまたは濃度調整した不活性ガスで置換することによって調整することができる。
ここで、本発明の製法で使用する不活性ガスとは、窒素ガス、アルゴンガス、ヘリウムガス、二酸化炭素を挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、窒素ガスまたはアルゴンガスを挙げられる。
反応系雰囲気置換方法は、減圧置換、加圧置換、フロー置換、バブリングによる置換、または凍結脱気による置換でもよく、その際超音波をかけても加熱してもよい。より好ましい方法は、フロー置換および減圧置換である。
酸素濃度は、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下がよく、更により好ましくは０％である。
保護基の脱離反応時に反応系の攪拌は必須ではないが、通常、攪拌動力Ｐｖが０．０～０．５ｋＷ／ｍ３の範囲で攪拌を行い、Ｐｖが０．１～０．３ｋＷ／ｍ３の攪拌が好ましい。
反応後に生成した核酸オリゴマーの反応混合物からの分離精製手段は、通常の方法が採用され、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、沈殿（例えば、エタノール、イソプロパノール、メタノールまたはポリエチレングリコールを用いた核酸オリゴマーの沈殿）、透析、限外ろ過などの手段を用いることにより、２’位または３’位の水酸基の保護基である式（１）による保護が脱保護される。精製された核酸オリゴマーを単離することができる。単離された核酸オリゴマーは、通常、その５’末端の水酸基が保護された核酸オリゴマーとして得られる。
式（３）で示される核酸オリゴマーから式（１）で示される保護基を脱保護することにより下記式（４）で示される核酸オリゴマーを得る反応は、以下のとおりである。（スキーム１）。
Figure 0007640461000006
式（３）または式（４）において、Ｒが、ＯＱ基を表し、Ｒ’が、ＯＱ’基を表す際、リボースの構造は、下記式（ＬＮＡ－１）、（ＬＮＡ－２）または（ＬＮＡ－３）で示される。
Figure 0007640461000007
 （式中、Ｂａｓｅは、核酸塩基を示す）
本発明で使用される核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシド（リボース、およびデオキシリボース）としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ ＲＮＡ、および前記のＬＮＡが例示されるが、前記ヌクレオシドは、これらに限定されない。
式（３）で表される核酸オリゴマーは、例えば、スキーム２に示すように、式（５）で示される固相合成により製造される核酸オリゴマーを固相担体から切り出して得られる。
Figure 0007640461000008
固相担体上で合成される式（５）の核酸オリゴマーにおいて、
式中、
置換基Ｂａは、それぞれ独立して同一又は相異なる保護されていてもよい核酸塩基を表し、
Ｇ４およびＹは、前記の式（３）において定義されたとおりであり、
Ｇ２は、それぞれ独立して同一又は相異なるリン酸の保護基を表し、
Ｘ１がＯＺを表すとき、Ｗ１はＯＶ基を表し、
Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
Ｘ１がＲ基を表すとき、Ｗ１はＯＺで表される基を表し、
Ｚは、固相担体、および固相担体と核酸オリゴマーの３’末端のリボースの２’位もしくは３’位の水酸基の酸素原子とをつなぐ連結部からなる基を表す。
より具体的には、Ｚは、下記式（６）で示される構造を表し、
Figure 0007640461000009
 式（６）において、Ｓｐは、スペーサーを表す。
スペーサー（Ｓｐ）は、例えば、下記式（７）に示す構造式を有するものが例示される。
Figure 0007640461000010
Ｌｉｎｋｅｒは、例えば、下記式（８－１）、（８－２）、（８－３）、（８－４）、（８－５）、（８－６）、（８－７）、（８－８）に示す構造でもよい。
Ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔとしては、無機多孔質担体や有機系樹脂担体などが挙げられる。無機多孔質担体には、例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）およびゼオライトが挙げられる。有機系樹脂担体には、例えば、ポリスチレンからなる担体が挙げられる。
Figure 0007640461000011
Figure 0007640461000012
 （式中、Ａは、水酸基、アルコキシ基、またはアルキル基であってもよい。アルコキシ基としては例えばメトキシ基およびエトキシ基が挙げられる。アルキル基としては例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基が挙げられる。Ｓｉは、担体表面の水酸基の酸素と結合していることを示す。）
前記式（５）の化合物は、例えば、下記式（Ａ１３）のアミダイト化合物を用いてアミダイト法により製造される。
Figure 0007640461000013
 （式中、
Ｒは、水素原子、フッ素原子、またはＯＱ基を表し、
Ｑは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、４’の炭素原子と結合したメチレン基、４’の炭素原子と結合したエチレン基、４’の炭素原子と結合したエチリデン基、または前記式（１）で示される保護基を表し、
Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基を表し、
Ｇ１は、水酸基の保護基を表し、
Ｇ２は、リン酸の保護基を表し、
Ｇ３は、アルキル基、または互いにその末端で結合して環状構造を表す。）
Ｂａにおける核酸塩基は、特に限定されない。当該核酸塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、シュードウラシル、１－メチルシュードウラシルなどが挙げられる。また、核酸塩基は、置換基により置換されていてもよい。そのような置換基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、およびヨード基などのハロゲン原子、アセチル基などのアシル基、メチル基およびエチル基などのアルキル基、ベンジル基などのアリールアルキル基、メトキシ基などのアルコキシ基、メトキシエチル基などのアルコキシアルキル基、シアノエチル基などのシアノアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、アシルオキシメチル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、およびニトロ基など、並びにそれらの２種類以上の置換基の組み合わせが挙げられる。
核酸塩基が環外にアミノ基を有する場合、当該アミノ基の保護基としては、特に限定されず、公知の核酸化学で用いられる保護基を使用することができ、そのような保護基としては、例えば、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、および（ジメチルアミノ）メチレン基など、並びにそれらの２種類以上の保護基の組み合わせが挙げられる。
Ｂａは、より具体的には、
Figure 0007640461000014
（上記式中、
Ｒ４は、水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ５は、水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
Ｒ６は、水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
Ｒ７は、２－シアノエチル基を表し、
Ｒ８は、水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、
Ｒ９は、ジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで表される基を表す。
Ｇ１としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。
Ｇ１としては、好ましくは、以下の基である。
Figure 0007640461000015
 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は相異なって水素又はアルコキシ基を表す。）
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１つが水素であり、残りの２つが同一または相異なる（同一が好ましい）アルコキシ基であることが好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が特に好ましい。
Ｇ２としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｇ２としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキルアルキル基、シクリルアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリルアルケニル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、シリルオキシアルキル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリルオキシアルキル基などが挙げられ、これらは１つ以上の電子求引基で置換されていてもよい。
Ｇ２は、好ましくは、電子求引基で置換されたアルキル基である。当該電子求引基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基、アルキルスルホニル基、ハロゲン原子、アリールスルホニル基、トリハロメチル基、トリアルキルアミノ基などが挙げられ、好ましくはシアノ基である。
Ｇ２としては、特に好ましいのは、以下の基である。
Figure 0007640461000016
Ｇ３は、２つのＧ３が互いに結合して環状構造を形成していてもよい。Ｇ３としては、両方がイソプロピル基であることが好ましい。
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＧ２の定義におけるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数１～１２のアルキル基、より好ましくは炭素数１～６のアルキル基である。具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられる。前記置換基の定義におけるアルコキシ基を構成するアルキル基部分は、ここでのアルキル基の定義と同じ定義を有する。
Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、保護基を表す場合はＧ１と同じ保護基を表す。Ｇ４は脱保護された場合には水素原子であるが、その場合のヌクレオチド化合物もまた、一連の核酸伸張反応の工程に供される。
Ｇ５は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表す。アルキルアンモニウムイオンとして、具体的なアルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられるが、より具体的には、例えば、ジエチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン、ヘキシルアンモニウムイオン、およびジブチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。また、アルカリ金属イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、およびリチウムイオンが挙げられる。また、ヒドロキシアルキルアンモニウムイオンとして、具体的なヒドロキシアルキル部分の例としては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシ－ｎ－プロピル、ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシ－ｎ－ブチル、トリスヒドロキシメチルが挙げられるが、より具体的なヒドロキシアルキルアンモニウムイオンの例としては、トリスヒドロキシメチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。
本明細書においては、核酸塩基とは、天然型あるいは非天然型の核酸塩基骨格を有する基を意味する。前記核酸塩基は、天然型あるいは非天然型の核酸塩基骨格が修飾された修飾体も包含する。ＢＣで表される核酸塩基としては、より具体的には、以下の構造が例示される。
Figure 0007640461000017
（上記式中、
Ｒ４’は、水素原子、またはメチル基を表し、
Ｒ５’は、水素原子、またはアセチル基を表し、
Ｒ６’は、水素原子を表し、
Ｒ８’は、水素原子、メチル基を表す。）
Ｂａは、ＢＣで表される核酸塩基、または当該核酸塩基が保護基で保護された核酸塩基を表す。
式（１）で示される保護基で水酸基が保護されたリボースを含むヌクレオシドやそのアミダイト化合物の製造方法について、以下説明する。
リボースの２’位の水酸基が式（１）で示される保護基で保護されたアミダイト化合物は、例えば国際公開第２０１９／２０８５７１号公報および特願２０１８－０８３１４８号公報およびＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０１７２４９号公報に記載の以下のスキーム３および４に従って製造することができる。
Figure 0007640461000018
Figure 0007640461000019
 （式中、
ＲａおよびＲｂは同一または相異なって、メチル基、エチル基又は水素原子を表し、ただし、ＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない；
Ｒｃは、メチル基又はエチル基であり、
Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基を表し、
ｎは、１～５の何れかの整数を表し、
Ｇは、式中に示す水酸基の保護基を表し
Ｇ１およびＧ２は、それぞれ独立して同一または相異なって、水酸基の保護基を表し、そして、
Ｇ３は、同一または相異なってアルキル基を表す。）
前記スキーム３及びスキーム４を概説する。
まず、スキーム３に示す通り、化合物１をシアン化物イオンと反応させて、３－ヒドロキシアルキルニトリル化合物２を得る。次いで、該化合物２をビス（アルキルチオメチル）エーテルと反応させて、エーテル化合物３を得る。
次に、スキーム４に示す通り、化合物４を酸化剤の存在下、化合物５（これは、スキーム３に記載する方法に準じて製造する）と反応させて、化合物６（リボースの２’位の水酸基が式（１）で示される保護基で保護されている）を得る。次いで、該化合物６を脱保護して、化合物７を得る。該化合物７の水酸基を保護基Ｇ１を用いて選択的に保護して、化合物８を得る。また、該化合物８をホスホロジアミダイト化合物９と反応させて、所望するアミダイト化合物１０を製造する。
スキーム３
スキーム３の反応において、
シアン化物イオンとしては、例えば、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、シアン化銅、トリメチルシリルシアニドなどに由来するシアン化物イオンを使用することができる。
トリメチルシリルシアニドを用いる場合、塩基を添加することが好ましい。
本反応における塩基としては、例えば、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、および水酸化アンモニウムなど、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。本発明においては、水酸化リチウム及び水酸化リチウム一水和物が好ましく用いられる。塩基の量は、エポキシ化合物１に対して、通常０．０１～１当量であり、好ましくは０．１～０．３当量である。
シアン化物イオンの量は、化合物１に対して、通常０．３～２当量であり、好ましくは０．６～０．８当量である。
本明細書中で「当量」と呼称する場合、それは、特に断らない限り、「モル当量」を意味する。
本反応の反応温度は、通常－２０～４０℃であり、好ましくは０～３５℃である。本反応の反応時間は、通常０．５～２４時間であり、好ましくは通常１～５時間である。
エーテル化合物３は、例えばビス（アルキルチオメチル）エーテルまたはビス（フェニルチオメチル）エーテルと３－ヒドロキシ－３－アルキルプロパンニトリルとを、酸化剤及び酸存在下、溶媒中で反応させることにより製造することができる。
Figure 0007640461000020
ビス（アルキルチオメチル）エーテルまたはビス（フェニルチオメチル）エーテルは、例えば下式に示す通り、ビスクロロメチルエーテルまたはビス（アリールオキシメチル）エーテルと対応するアルキルメルカプタンまたはフェニルメルカプタンとを反応させることによって得ることができる。ビス（アリールオキシメチル）エーテルとしては例えば、ビス（２，４，６－トリクロロフェニルオキシメチル）エーテルが挙げられる。
Figure 0007640461000021
 また後述する実施例に記載の方法に則して又は必要によりこれらの方法に適宜変更を加えた方法によっても製造することができる。
酸化剤としては、例えば、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド等のＮ－ハロゲン化スクシンイミド、１，３－ジヨード－５，５－ジメチルヒダントイン等のＮ－ハロゲン化ヒダントイン、および塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン等、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。本発明においては、Ｎ－ハロゲン化スクシンイミドが好ましく用いられ、Ｎ－ヨードスクシンイミドが更に好ましく用いられる。
この反応においては、酸化剤のほかに、酸を用いてもよく、酸は、特に限定されないが、例えば、パーフルオロアルキルカルボン酸及びその塩、パーフルオロアルキルスルホン酸及びその塩、並びにアルキルスルホン酸及びその塩、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。塩としては、例えば、銅塩及び銀塩が挙げられる。酸としては、具体的には、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、およびトリフルオロメタンスルホン酸銀など、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。本発明においては、トリフルオロメタンスルホン酸が好ましく用いられる。
溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、ジオキサン、ジクロロメタン、およびトルエンなど、並びにこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。本発明においては、テトラヒドロフランが好ましく用いられる。
３－ヒドロキシアルキルニトリルの量は、ビス（アルキルチオメチル）エーテルもしくはビス（フェニルチオメチル）エーテルに対して、通常０．５～２．０当量であり、好ましくは０．８～１．５当量である。酸化剤の量は、ビス（アルキルチオメチル）エーテルもしくはビス（フェニルチオメチル）エーテルに対して、通常０．５～２当量であり、好ましくは０．７～１．２当量である。酸の量は、ビス（アルキルチオメチル）エーテルもしくはビス（フェニルチオメチル）エーテルに対して、通常０．００１～２．０当量であり、好ましくは０．０１～０．１当量である。
本反応の反応温度は、通常－８０℃～０℃であり、好ましくは－５０℃～－３０℃である。本反応の反応時間は、通常１～２４時間であり、好ましくは２～６時間である。
反応の終了は例えば、反応マスの一部をサンプリングし、ＧＣ、ＴＬＣ、ＬＣ等の分析法により確認することができる。反応終了後は、反応マスにトリエチルアミン等の塩基を加えて反応を停止させてもよい。反応マスを水に注加し、有機溶媒抽出、洗浄、濃縮等の通常の後処理操作に付すことにより、エーテル化合物６を含む残渣を得ることができる。当該残渣を、蒸留やカラムクロマトグラフィー等の精製操作に付すことにより、高純度のエーテル化合物３を得ることができる。
スキーム４
スキーム４の反応において、
工程１（エーテル化工程）
化合物６を製造する工程は、化合物４を化合物５と反応させて実施される。この反応は、通常、酸化剤を添加して実施される。この工程において用いる酸化剤は、特に限定されないが、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ヨウ素、１，３－ジヨード－５、５‘－ジメチルヒダントイン、臭素および塩素からなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。
この工程においては、酸を添加することも可能であり、用いる酸は特に限定されないが、ペルフルオロアルキルカルボン酸、ペルフルオロアルキルスルホン酸、アルキルスルホン酸およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。
この工程において用いる反応溶媒は、特に限定されないが、例えば、ジエチルエーテル、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、２－メチルテトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、４－メチルテトラヒドロピラン、ジメトキシエタン、ジグリム、シクロペンチルメチルエーテル、ジオキサン等のエーテル、アセ卜ニトリル等のニトリル、トルエン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等の芳香族炭化水素、ジクロロメタン等、並びにこれら溶媒の２種類以上の組み合わせが挙げられる。好ましい溶媒としては、ジエチルエーテル、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、２－メチルテトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、４－メチルテトラヒドロピラン、ジメトキシエタン、ジグリム、シクロペンチルメチルエーテル、ジオキサン等のエーテルが挙げられる。より好ましい溶媒は、テトラヒドロピラン、４－メチルテトラヒドロピランが挙げられる。
この工程において反応時間は、特に限定されないが、例えば、１０分～１２時間、好ましくは１０分～６時間である。
この工程において反応温度は、特に限定されないが、例えば－８０～３０℃、好ましくは、－６０～１０℃である。
この工程において前記エーテル化合物５の濃度も、特に限定されず、適宜設定可能である。
この工程においてエーテル化合物５のモル数は、化合物４のモル数に対し、例えば０．５～２倍、好ましくは０．８～１．５倍である。
この工程において前記酸化剤のモル数は、化合物４のモル数に対し、例えば０．５～１０倍、好ましくは０．８～６倍である。
工程２（脱保護工程）
前記工程１で得られた化合物６は、脱保護反応に供して化合物７に変換される。脱保護工程は、公知の方法で実施できるが、典型的には、溶媒中、フッ化水素／トリエチルアミンあるいはフッ化水素／ピリジンを作用させ、脱保護することができる。
工程３（５’水酸基の保護工程）
前記工程で得られた化合物７は、保護工程に供され、保護基の導入は、公知の方法で実施できるが、典型的には、ピリジン中、化合物７に４，４’－ジメトキシトリチルクロリドを反応させて保護基が導入され、化合物８が製造される。
工程４（アミダイト化工程）
この工程は前記工程で得られた化合物８に、化合物９を反応させることによって実施される。典型的には、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドの存在下、化合物９として２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイトを反応させて行われ、アミダイト化合物１０が製造される。アミダイト化は、特許第５５５４８８１号公報の実施例２～５に記載された方法に準じて行うことができる。
式（３）および式（４）の核酸オリゴマーの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、導入されうる非ヌクレオチドリンカーについて説明する。
非ヌクレオチドリンカーとしては、アミノ酸骨格からなるリンカー（例えば、特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載されたアミノ酸骨格からなるリンカー）が例示される。具体的には、非限定的な例として、例えば、式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）もしくは（Ａ１４－３）（例えば、特許第５５５５３４６号公報または特許第５８７６８９０号公報に記載）で表されるリンカーが例示される。これらのリンカー以外に国際公開第２０１２／００５３６８号公報、国際公開第２０１８／１８２００８号公報または国際公開第２０１９／０７４１１０号公報に記載のリンカーが例示される。
Figure 0007640461000022
式（３）におけるＲ基および式（４）におけるＲ’基が、水酸基以外の置換基であるヌクレオチドおよびアミダイトは、特許第３７４５２２６号公報などに記載された公知の方法、 国際公開第２００１／０５３５２８号公報あるいは特開２０１４－２２１８１７号公報およびそこに引用される公知の方法で合成されるヌクレオシドから製造することもでき、さらには、市販品として入手可能なものを用いて、後述する実施例に記載の方法に則して又はこれらの方法に適宜変更を加えた方法により製造することができる。
核酸オリゴマー（以下、オリゴヌクレオチドとも記す）の固相担体からの切り出し
切り出し工程は、所望の鎖長の核酸オリゴマーを、切り出し剤として濃アンモニア水を用いて実施した。
ホスホロアミダイト法では、一般的に公知の方法（例えば、前記の特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載の方法）に従って、脱保護工程、縮合工程、及び酸化工程の各工程を繰り返し行うことにより、核酸伸長反応を行う。
（核酸伸長反応）
本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、オリゴヌクレオチドを伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
核酸オリゴマーの鎖長は、例えば、２～２００ｍｅｒや１０～１５０ｍｅｒ、１５～１１０ｍｅｒであってもよい。
５’脱保護工程は、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程である。一般的な保護基としては、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）や４－モノメトキシトリチル基、４，４’，４”－トリメトキシトリチル基が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。
縮合工程は、前記脱保護工程により脱保護したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’ヒドロキシル基に対して、式（Ａ１３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させる反応である。なお、核酸伸長に用いるホスホロアミダイトとしては、式（Ａ１３）または（Ａ１２）で示されるアミダイト化合物を用いる。また、他に使用可能なホスホロアミダイトとして、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基，２’－Ｏ－メトキシエチル基，２’－Ｈ，２'－フルオロ－２’－デオキシ－β－Ｄ－アラビノフラノシル等が挙げられる。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’ヒドロキシル基が保護基（例、ＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール等が挙げられる。
縮合工程の後は、適宜、未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
酸化工程は、前記縮合工程により形成された亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程である。本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施することができる。
亜リン酸基をリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素、あるいはｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドや過酸化水素などの過酸、あるいは（１０－カンファースルホニル）オキサジリジン（ＣＳＯ）を使用することができる。該酸化剤は、０．００５～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応を妨げないものであればよく、特に限定されないが、ピリジン、ＴＨＦ、水、アセトニトリル、１－メチルイミダゾール（ＮＭＩ）又はこれらの２つ以上の任意の混合溶媒を挙げることができる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル、あるいはヨウ素／水／ピリジン、あるいはヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル／ＮＭＩ、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦ、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦ／ＮＭＩ、あるいはＣＳＯ／アセトニトリル、あるいはヨウ素／ピリジン－酢酸や過酸（ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド／メチレンクロリド）を用いることができる。
亜リン酸基をチオリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）、またはフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を使用することができる。該酸化剤は、０．０１～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの任意の混合溶媒が挙げられる。酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順序は限定されない。
リン酸保護基を脱保護する工程は、所望の配列を有する核酸の合成が完了した後は、リン酸部分の保護基を脱保護するためにアミン類を作用させる。アミン類としては、例えば、特許第４７０５７１６号公報に記載されるジエチルアミン等が挙げられる。
伸長の最後に導入したヌクレオシドの５’ヒドロキシル基の保護基は、後述の固相担体からの切り出し及び保護基の脱保護の後、５’保護基をタグとするカラム精製のために使用してもよく、カラム精製後、５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護してもよい。
更にアンモニア水又はアミン類等を用いて、例えば、前記スキーム２で示されるように固相担体からオリゴヌクレオチド鎖を切断して回収する。アミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン等が挙げられる。
本発明の製造方法を用いて製造可能な核酸オリゴマーとしては、核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ ＲＮＡ、およびＬＮＡである核酸オリゴマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例えば、Xiulong, Shenら著、Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46, No.46, 1584-1600、およびDaniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558には、様々なヌクレオシドの例が記載されている。
本発明の製造方法を用いて製造可能な核酸オリゴマーとしては、核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、並びに２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆを有するＲＮＡ、およびＬＮＡである核酸オリゴマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Xiulong, Shenら著、Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46, No.46, 1584-1600、およびDaniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載された、様々なヌクレオシドの例が挙げられる。
本発明の製造方法において使用可能な核酸オリゴマーの典型的な例を、実施例に記載の例に加えて下記の例を示すが、これらに限定されるものではない。
以下、配列の説明中、Ｕはウリジンを、Ｃはシチジンを、Ａはアデノシンを、またはＧはグアノシンを示す。
国際公開第２０１９／０６０４４２号に記載されている、下記の配列（Ｂ）および（Ｃ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｂ）：５’－AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT－３’（Antisense）（配列番号３） ２１ｍｅｒ
配列（Ｃ）：５’－GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT－３’（Sense）（配列番号４） ２１ｍｅｒ
配列（Ｂ）および（Ｃ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Cmは2'-O-メチルシチジンを、またdTはチミジンを示す。
Daniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558頁に記載されている核酸オリゴマー（553頁参照）が挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｄ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｄ）：５’－AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU－３’（配列番号５） ３６ｍｅｒ
ＪＰ４９６５７４５に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｅ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU－３’ ４９ｍｅｒ。CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC（配列番号６）、GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU（配列番号７）。
配列（Ｅ）中、”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。
Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547頁に記載されている、下記の配列（Ｆ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｆ）：５’－ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU－３’（配列番号８） ６７ｍｅｒ
ＪＰ ２０１５－５２３８５６, １７３頁に記載されている、下記の配列（Ｇ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｇ）：５’－GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU－３’（配列番号９） ９４ｍｅｒ
ＪＰ ２０１７－５３７６２６に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｊ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｆ）：５’－AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号１０） １００ｍｅｒ
配列（Ｇ）：５’－GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号１１） １１３ｍｅｒ
配列（Ｈ）：５’－dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU －３’（配列番号１２） １１３ｍｅｒ
配列（Ｈ）中、dTはチミジンを、dCは2'-デオキシシチジンを、dAは2'-デオキシアデノシンを、またdGは2'-デオキシグアノシンを示す。
配列（Ｊ）：５’－AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU－３’（配列番号１３） １１３ｍｅｒ
配列（Ｊ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Amは2'-O-メチルアデノシンを、Gmは2'-O-メチルグアノシンを、またsはホスホロチオエート修飾を示す。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
測定方法
以下の試験で用いた各測定方法を以下に示す。
（測定方法１：オリゴヌクレオチドの純度の測定方法）
固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。粗生成物をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８， ２．１ｍｍ×１００ｍｍ， １．７μｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からオリゴヌクレオチドの純度を算出した。
ＨＰＬＣ測定条件を下記表１に示す。
Figure 0007640461000023
（測定方法２：オリゴヌクレオチド収量の測定）
前記粗生成物のＯＤ２６０を測定した。ＯＤ２６０とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ２６０の測定値に基づき、収量を算出した。さらに、固相担体の単位体積当たりの収量を算出した。実施例１～５及び比較例１、２については実施例１の収量に対する相対収量を求めた。
（測定方法３：酸素濃度の測定）
反応系の雰囲気（気相）の酸素濃度はＩＩＪＩＭＡ ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ ＣＯＲＰ．製のＰＡＣＫ ＫＥＥＰＥＲ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｏｘｙｇｅｎ Ｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。酸素濃度測定前には空気中及び純窒素中酸素濃度の測定により装置を校正後、装置に付属の針をセプタムなどで蓋をしたフラスコなどの容器に突き刺し、系中気相部分の酸素濃度を測定した。酸素濃度の測定値はリアルタイムで表示され、測定値が安定した所をその雰囲気の酸素濃度とした。
オリゴヌクレオチドの固相合成
配列（Ｉ）：５’－AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G－３’（配列番号１、２） ５３ｍｅｒ
前記配列（Ｉ）において、”Ａ”は、以下の式（Ａ１）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｃ”は、以下の式（Ａ２）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｇ”は、以下の式（Ａ３）において波線で区切られる部分構造で示される。Ｕは、以下の式（Ａ４）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。なお、５‘末端の”Ａ”は、以下の式（Ａ６）において波線で区切られる部分構造で示される。また、３‘末端の”Ｇ”は、以下の式（Ａ７）において波線で区切られる部分構造で示される。但し、構造式中のリン酸基は塩であってもよい。
AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC（配列番号１）
GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC（配列番号２）
Figure 0007640461000024
Figure 0007640461000025
Figure 0007640461000026
Figure 0007640461000027
Figure 0007640461000028
Figure 0007640461000029
Figure 0007640461000030
固相担体として、コントロールド・ポア・ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ））を使用し、核酸合成機としてＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、上記配列（Ｉ）からなるオリゴヌクレオチドを３’側から５’側に向かって合成した。合成は７８．２０μｍｏｌスケールにて実施した。また、合成には、特許出願２０１８－０８３１４８号に記載のアデノシンＰＭＭアミダイト（化合物（Ａ８））、シチジンＰＭＭアミダイト（化合物（Ａ９））、グアノシンＰＭＭアミダイト（化合物（Ａ１０））、ウリジンＰＭＭアミダイト（化合物（Ａ１１））および国際公開第2017／188042号公報に記載の化合物（Ａ１２）を使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用した。核酸伸長終了後担体上の核酸にジエチルアミン溶液を作用させることでリン酸部分のシアノエチル保護基を選択的に脱保護した。ここで、ＰＭＭは、（（（１－シアノプロパン－２－イル）オキシ）メトキシ）メチル基の略号である。
Figure 0007640461000031
Figure 0007640461000032
Figure 0007640461000033
Figure 0007640461000034
Figure 0007640461000035
次に、本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチド（核酸オリゴマー）の具体的な製造例を示す。ここで、下記の実施例において本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチドは、前記配列番号１および２で示される配列（Ｉ）を有するオリゴヌクレオチドである。
また、以下の実施例および比較例中に記載するグアノシン誘導体とは、下記の構造式で示される化合物を意味する。下記構造式において図示されたサークルは、ＣＰＧを模式的に示すものである。
Figure 0007640461000036
（実施例１）
７８．２０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、１６．４６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水を用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた。次いで遊離オリゴヌクレオチドを６．６ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解後に、１．９７μｍｏｌ分の溶液を容量１００ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこにニトロメタン１０．６μＬと直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内を窒素に置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１０ｍＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、混合物を４時間保温することで２’－ＰＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１４．１ｍｇ、純度は６２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２）
７８．２０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、１９．９１μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水を用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた。次いで遊離オリゴヌクレオシドを８．０ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解後に、３．０３μｍｏｌ分の溶液を容量１００ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこにニトロメタン１５．９μＬと直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内を窒素に置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。気相中の酸素濃度は、実施例１と同様に測定することにより確認した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．６６ｍＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．０モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＰＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は２１．７ｍｇ、純度は６０％であった。得られた粗生成物について、実施例１と同様に、オリゴヌクレオチドの純度および収量を測定した。
（実施例３）
７８．２０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、１６．４６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水を用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた。次いで遊離オリゴヌクレオシドを６．６ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解後に、１．００μｍｏｌ分の溶液を容量１００ｍＬ口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこにニトロメタン５．３μＬと直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内を窒素に置換し、気相中の酸素濃度を５％とした。気相中の酸素濃度は、実施例１と同様に測定することにより確認した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．５６ｍＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＰＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は７．１ｍｇ、純度は６０％であった。得られた粗生成物について、実施例１と同様に、オリゴヌクレオチドの純度および収量を測定した。
（実施例４）
７８．２０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、１６．４６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水を用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた。次いで遊離オリゴヌクレオシドを６．６ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解後に、０．９８μｍｏｌ分の溶液を容量１００ｍＬ口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこにニトロメタン５．３μＬと直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内を窒素に置換し、気相中の酸素濃度を１０％とした。気相中の酸素濃度は、実施例１と同様に測定することにより確認した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．５６ｍＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．４モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＰＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は６．９ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、実施例１と同様に、オリゴヌクレオチドの純度および収量を測定した。
（実施例５）
７８．２０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、１６．４６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水を用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた。次いで遊離オリゴヌクレオシドを６．６ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解後に、１．００μｍｏｌ分の溶液を容量１００ｍＬ口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこにニトロメタン５．３μＬと直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内に窒素ボンベから窒素を吹き付ける針と、吹き付けた窒素を抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、窒素をフローすることで系内を窒素に置換し、気相中の酸素濃度を１５％とした。気相中の酸素濃度は、実施例１と同様に測定することにより確認した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．５６ｍＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＰＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は７．１ｍｇ、純度は４６％であった。得られた粗生成物について、実施例１と同様に、オリゴヌクレオチドの純度および収量を測定した。
（参考例１）
７８．２０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、１９．９１μｍｏｌ分を採取し、アンモニア水を用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた。次いで遊離オリゴヌクレオシドを８．０ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解後に、１．０１μｍｏｌ分を容量１００ｍＬ口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこにニトロメタン５．３μＬと直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。Ｏｘｙｇｅｎ Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、系内気相中の酸素濃度を実施例１と同様にして測定した所、酸素濃度は２１％であった。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．５６ｍＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．１モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、混合物を４時間保温することで２’－ＰＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は７．２ｍｇ、純度は４１％であった。得られた粗生成物について、実施例１と同様に、オリゴヌクレオチドの純度および収量を測定した。
（参考例２）
７８．２０μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、１６．４６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水を用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた。次いで遊離オリゴヌクレオシドを６．６ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解後に、１．９６μｍｏｌ分の溶液を容量１００ｍＬ口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこにニトロメタン１０．６μＬと直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。Ｏｘｙｇｅｎ Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、系内気相中の酸素濃度を実施例１と同様にして測定した所、酸素濃度は２１％であった。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１０ｍＬ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１０．２モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、混合物を４時間保温することで２’－ＰＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１４．２ｍｇ、純度は４７％であった。得られた粗生成物について、実施例１と同様に、オリゴヌクレオチドの純度および収量を測定した。
測定結果を下記表２に示す。
Figure 0007640461000037
上記表２に示す通り、明細書中に記載のオリゴヌクレオチドに含まれるリボースの水酸基の保護基の脱保護反応を、酸素濃度が１５％以下の濃度の不活性ガス雰囲気下で行ったところ、酸素濃度が１５％より高い濃度で行った場合と比べると、該脱保護反応が効率よく進行し、更にＴＢＡＦの添加に要する時間を３０分以上にすることで更に該脱保護反応が効率よく進行し、結果、生成する脱保護されたオリゴヌクレオチドの純度が高いことが分かった。
（参考例）
ＰＭＭアミダイトの製造
１）３－ヒドロキシブタンニトリルの製造
Figure 0007640461000038
 酸化プロピレン(１２．４ｇ、０．２１ｍｏｌ)に水酸化リチウム一水和物(１．８ｇ、４２．８ｍｍｏｌ)を加え、４℃に冷却し、トリメチルシリルシアニド(１５．５ｇ、０．１５ｍｏｌ)をゆっくり滴下した。滴下完了し数十分経過後、内温が３５℃まで上昇した。そのまま氷浴(内温５℃)で３０分間、１０～１５℃にて１時間、更に室温(２５℃)にて３０分間攪拌した。反応液に水(１５ｍＬ)を加え室温にて３０分間攪拌した。その後、ジエチルエーテル(５０ｍＬ×３回)抽出、飽和食塩水洗浄、無水硫酸ナトリウム乾燥を行い、溶媒を留去したところ、無色透明液状の粗３－ヒドロキシブタンニトリル１０．６ｇ(収率８４％)を得た。
２）ＰＭＭ化剤の製造
Figure 0007640461000039
 ビス(メチルチオメチル)エーテル(３２．４１ｇ、０．２３４ｍｏｌ、２．０ｅｑ．)をＤｒｙ ＴＨＦ(３００ｍＬ)に溶解、モレキュラーシーブス４Ａ(３２ｇ)を加え１０分間攪拌した。混合物を－５０℃まで冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸(ＴｆＯＨ)(０．８８ｍＬ、５．８５ｍｍｏｌ、０．０５ｅｑ．)とＮ－ヨードスクシンイミド(ＮＩＳ)(３１．５ｇ、０．１４０ｍｏｌ、１．２ｅｑ．)とを添加、そこに粗３－ヒドロキシブタンニトリル(１０ｇ、０．１１７ｍｏｌ)を滴下し、－５０～－４５℃付近にて２時間攪拌した。反応液に飽和亜硫酸ナトリウム水溶液(１５０ｍＬ)、飽和炭酸水素ナトリウム(１５０ｍＬ)及び酢酸エチル(３００ｍＬ)を加え、０～１０℃で１０分間攪拌した。分液後、有機層を飽和食塩水(１５０ｍＬ)にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製(Ｈｅｘａｎｅ／ＡｃＯＥｔ＝１０／１～５／１、シリカ８００ｍＬ)し、黄色液状物のＰＭＭ化剤を５．９ｇ(収率２８％)得た。ＧＣ／ＦＩＤにて純度分析した結果、純度９７．２％であった。
ＰＭＭ化剤
Figure 0007640461000040
 淡黄色透明液体
1H-NMR (CDCl3): δ 4.93-4.84 (m, 2H) 4.75(s, 2H) 4.06-4.00 (m, 1H) 2.57 (t, 2H), 2.17(s, 3H) 1.35 (d, 3H)
なお、ビス(メチルチオメチル)エーテルの製造方法は、特開２０１６－５０２０３号公報を参照。
３）ＰＭＭ化剤の製造
Figure 0007640461000041
 ビスメチルチオメチルエーテル(７．４５ｇ、５３．９ｍｍｏｌ)、モレキュラーシーブス４Ａ(７．５ｇ)及びＴＨＦ(１１１ｍＬ)を混合し、冷却後(－６０～－５５℃)、Ｎ－ヨードスクシンイミド(ＮＩＳ)(１４．４ｇ、１．１９ｅｑ)、トリフルオロメタンスルホン酸(ＴｆＯＨ)(１４３μＬ、０．０３０ｅｑ)及び３－ヒドロキシブタンニトリル(５．０ｇ、１．０９ｅｑ)を添加した。－５０～－４５℃にて４時間撹拌後、トリエチルアミン(５．１ｍＬ)を滴下した。反応容器を水浴に漬けて反応液を１０℃付近まで昇温した後、事前に調整しておいた１０℃の水溶液(チオ硫酸ナトリウム５水和物２１．８ｇと重曹７．７ｇと水１６５ｍＬ)に反応液を注いだ。酢酸エチル(５０ｍＬ)を加えて、１０～１５℃にて３０分間撹拌し、セライト(７．５ｇ)でろ過後分液し、有機層を飽和食塩水(３０ｍＬ)にて洗浄、硫酸マグネシウム(３．８ｇ)で乾燥、ロータリーエバポレーターで濃縮し、１１．５ｇの粗生成物(１１．５ｇ，ＧＣ純度４９．８％)を得た。シリカゲルカラム(シリカゲル３００ｍＬ、ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１)を用いて精製し、３－（（メチルチオメトキシ）メトキシ）ブタンニトリル(淡黄色透明液体、５．３２ｇ、収率５６％、純度９９．５％)を得た。
４）アミダイトの製造
核酸塩基部分がウラシルであるＰＭＭアミダイトＵの製造例を以下に示す。ウラシル以外の核酸塩基を有するＰＭＭアミダイトについても同様の方法で製造することができる。
Figure 0007640461000042
 ＴＩＰＳ－Ｕ(２０．０ｇ)、ＴＨＦ(４０ｍｌ)及びトルエン(６０ｍｌ)を容器に仕込み、７４ｍｌまで濃縮して脱水した。反応液を－５０℃まで冷却し、ＰＭＭ化剤(１０．８０ｇ)、ＴｆＯＨ(１２．４８ｇ)、及びＮＩＳ(１２．４ｇ)／ＴＨＦ(２６ｍｌ)溶液を滴下した。－５０℃で２時間撹拌後、反応液を氷冷した炭酸水素ナトリウム(７．０ｇ)・チオ硫酸ナトリウム(２０．０ｇ)／水(１３０ｍｌ)溶液へ注加し、室温にて分液した。その後、炭酸水素ナトリウム(３．５ｇ)・チオ硫酸ナトリウム(１０．０ｇ)／水(６５ｍｌ)溶液で洗浄した。有機層を濃縮し、目的化合物を含む粗生成物を得た。Ｅｘａｃｔ Ｍａｓｓ：６１３．３、Ａｃｔｕａｌ Ｍａｓｓ：６１２．３（ＥＳＩ（－））
Figure 0007640461000043
 前記の粗ＰＭＭ－Ｕ－１をアセトン(４０ｍＬ)に溶解させ、トリエチルアミン 三フッ化水素酸塩(７．２８ｇ)を加え２０℃で１８時間撹拌した。反応液をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル(２００ｍｌ)に注加し、３０分撹拌した。反応液を濾過し、ろ紙上に残った固体をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル(４０ｍｌ)で洗い、得られた沈殿物をろ取し、減圧乾燥し、目的化合物を含む粗生成物(１４．５６ｇ)を得た。Ｅｘａｃｔ Ｍａｓｓ：３７１．１、Ａｃｔｕａｌ Ｍａｓｓ：３７０．２（ＥＳＩ（－））
Figure 0007640461000044
 前記の粗ＰＭＭ－Ｕ－２(１４．５ｇ)、ピリジン(７２．５ｍｌ)、アセトニトリル(２９ｍｌ)及びトルエン(７２．５ｍｌ)を仕込み、氷冷した。該混合物に、４，４’－ジメトキシトリチルクロライド(１５．８６ｇ)を加え、室温で４時間撹拌した。その後、メタノール(７．２ｍｌ)及びトルエン(２９ｍｌ)を加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液(４３．５ｍｌ)で２回、１０％塩化ナトリウム水溶液(４３．５ｍｌ)で１回洗浄した。その後、有機層を濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、目的物(２１．１２ｇ)を得た。Ｅｘａｃｔ Ｍａｓｓ：６７３．３、Ａｃｔｕａｌ Ｍａｓｓ：６７２．３（ＥＳＩ（－））
Figure 0007640461000045
 ＰＭＭ－Ｕ－３(２０．０ｇ)、アセトニトリル(６０ｍｌ)、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(５．８８ｇ)、及び２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト(１０．７５ｇ)を仕込み、３５℃で４時間撹拌した。反応液に、トルエン(２００ｍｌ)を加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液(１００ｍｌ)で１回、５０％ＤＭＦ水溶液(２００ｍｌ)で５回、水(１００ｍｌ)で２回、１０％塩化ナトリウム水溶液(１００ｍｌ)で１回洗浄した。その後、有機層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、目的物(２２．７２ｇ)を得た。
本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。核酸オリゴマーの製造方法に従って製造される核酸オリゴマーの純度向上が期待できる。
配列表の配列番号１～１３は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。

Claims (19)

  1. 酸素濃度が１５％以下の不活性ガス雰囲気下で、式（３）：
    Figure 0007640461000046
     （式中、
    Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、保護基を表す場合は以下の基を表し、
    Figure 0007640461000047
    （式中、Ｒ １ 、Ｒ ２ 及びＲ ３ は同一又は相異なって水素又はアルコキシ基を表す。）
    Ｇ５は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
    ＢＣは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
    Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
    Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基、または式（１）：
    Figure 0007640461000048
     （式中、
    ＲａおよびＲｂは同一又は相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
    ＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素原子との結合であることを表し、
    ｎは１～５の何れかの整数を表す。
    ただしＲａおよびＲｂが同時に水素原子を表すことはない。）
    の保護基を表し、
    Ｙは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
    ｍは、２以上２００までの何れかの整数を表し、
    ＷおよびＸは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかで定義され、
    （ａ）Ｗが水酸基であるときは、Ｘは前記Ｒ基と同じ定義である。
    （ｂ）Ｘが水酸基であるときは、ＷはＯＶ基を表し、
    Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
    ただし、前記Ｒ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。そして
    ｍが３以上の整数のとき、式（３）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
    で示される核酸オリゴマーを、フッ化物イオンと接触させることを特徴とする、式（４）：
    Figure 0007640461000049
     （式中、
    Ｒ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
    Ｑ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
    式（４）の置換基Ｇ４、Ｇ５、Ｙ、Ｂｃおよびｍの定義は、前記式（３）における定義と同じであり、
    Ｗ０は、水酸基であり、
    Ｘ０は、前記Ｒ’基と同じ定義である。
    そして、ｍが３以上の整数のとき、式（４）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
    で示される核酸オリゴマーの製造方法であって、
    該フッ化物イオンのフッ化物イオン源が、フッ化テトラアルキルアンモニウムであり、
    該非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーであり、
    該アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、式（Ａ１４－２）または式（Ａ１４－３）の構造を有するリンカーである、方法。
    Figure 0007640461000050
    （式中、５’および３’は、核酸オリゴマーの５’末端側および３’末端側をそれぞれ示す。）
  2. Ｗが水酸基であり、ＸがＲ基であり、Ｗ０が水酸基であり、そしてＸ０がＲ’基である、請求項１に記載の製造方法。
  3. フッ化テトラアルキルアンモニウムが、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 酸素濃度が１０％以下の不活性ガス雰囲気下で反応を行う、請求項１～３の何れか１項に記載の製造方法。
  5. 酸素濃度が５％以下の不活性ガス雰囲気下で反応を行う、請求項１～３の何れか１項に記載の製造方法。
  6. 酸素濃度が０％の不活性ガス雰囲気下で反応を行う、請求項１～３の何れか１項に記載の製造方法。
  7. 式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンの全量を添加するために要する時間が３０分以上である、請求項１～６の何れか１項に記載の製造方法。
  8. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が５％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  9. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１０％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  10. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が２０％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  11. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が３０％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  12. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が４０％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  13. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が５０％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  14. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が６０％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  15. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が７０％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  16. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が８０％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  17. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が９０％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  18. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が９５％以上である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  19. 式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１００％である、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
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