TW201315809A - 一種使大腸桿菌大量表現丙酸代謝相關基因與合成聚羥基丁酯－羥基戊酯之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明揭露使用單一質體，同時攜帶phaCAB基因與prpE基因，在大腸桿菌中表達，生產聚羥基丁酯-羥基戊酯之方法。經由調整培養基中丙酸之濃度，可以得到不同比例之羥基戊酯之高分子聚合物。本發明將重組大腸桿菌所需之所有基因構築於單一質體，包括phaCAB，vgb與prpE等基因，實驗證實了攜帶此一質體的大腸桿菌菌株確實會產生PHBV產物。藉由調控培養基的組成以及所含丙酸之濃度，我們可以利用此菌株生產數種含不同比例之羥基戊酯(約5%-35%不等)之聚羥基丁酯-羥基戊酯聚合物。
Description
本發明係為一種應用大腸桿菌產生聚羥基烷酯的方法，特別係指利用重組大腸桿菌大量表現聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法。
聚羥基烷酯(polyhydroxyalkanoates,PHAs)為一種高分子聚合物，可用為生物高分子材料(biopolymers)，該材料具備生物相容性、吸收性和生物可分解性，目前多用作生醫材料，如植入體、膠片或縫合材料等。PHAs之單元體(HAs)間係由酯基鍵結，在C-3位置若接上甲基則為聚羥基丁酯(polyhydro-xybutyrate,PHB)，若接上乙基則為聚羥基戊酯(polyhydro-xyvalerate,PHV)，而當PHB與PHV共聚時即為聚羥基丁酯-羥基戊酯(poly 3-hydro-xybutyrate-co-3-hydro xyvalerate,PHBV)，其結構如下所示：
PHBV可作為生物性可分解塑膠，因其高度生物相容性及熱塑性，目前PHBV廣泛用於製成生物薄膜、藥物膠囊、骨材填充物或手術線。
目前已知羅爾斯頓氏菌(Ralstonia eutropha)可會利用丙酸通透酶(propionate permease,PrpP)將丙酸(propionic acid)從細胞外大量運送進入細胞內，並以丙醯輔酶A合成酶(propionyl-CoA synthase,PrpE)將丙酸合成丙醯輔酶A，因此，若將丙酸添加於細菌培養基中，則該菌株可利用自身含有的β-酮硫解酶(Beta-ketothiolase B,BktB)促使丙醯輔酶A(propionyl-CoA)與乙醯輔酶A(acetyl-CoA)合成3-酮基戊醯輔酶A(3-ketovaleryl-CoA)，再經還原酶作用後得到羥基戊酯(hydroxyvalerate,HV)，該羥基戊酯則可與羥基丁酯(hydroxybutyrate,HB)反應生成PHBV。
PHBV的抗張強度、彈性模數、結晶度會隨著HV比例增加而下降，PHBV材料的延伸性與柔軟度也會隨之提高；然而在自然界中，經由細菌合成的PHBV其HV的含量通常偏低(不超過5%)。若利用在野生菌株培養基添加丙酸以合成PHBV，則由於丙酸會抑制大多數微生物的生長，因此在產量或產物可利用性均受到極大之限制。先前研究曾將攜帶可合成PHB基因(phaCAB)之質體，以及攜帶丙酸代謝相關基因(bktB、prpP或prpE)之質體同時轉殖進入大腸桿菌以生產PHBV，然，此重組大腸桿菌菌株的缺點在於，在實際生產時會面臨到培養基中須同時添加兩種抗生素使而其成本上升的問題，同時也無法掌控兩種質體存在菌株體內之數目與比例，而該攜帶兩個不同質體的重組大腸桿菌株所生產之PHBV，其HV的含量僅佔所合成之PHBV的15-20%(mol%)。
本發明所揭露之重組大腸桿菌株經由調控培養基之丙酸含量，其生產之PHBV中的HV含量可達近35%。因此本發明申請所揭露之技術在利用微生物合成PHBV之方法上，有明顯的改善。
本發明之主要目的係提供一種藉由同時攜帶可合成聚羥基丁酯基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法。
本發明之次一目的係提供一種調控大腸桿菌培養基所含丙酸之濃度以生產含有不同比例之羥基戊酯(約5%-35%不等)之聚羥基丁酯-羥基戊酯之方法。
本發明的再一目的係提供具有高含量羥基戊酯的聚羥基丁酯-羥基戊酯。
本發明所述之一種藉由同時攜帶聚羥基丁酯合成基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶基因(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法，其方法包括：
(1)提供一具有phbCAB-vgb-prpE基因的DNA構築物；
(2)提供一大腸桿菌(Escherichia coli)微生物；
(3)將該DNA構築物轉殖到該大腸桿菌微生物體內；
(4)對所得之重組大腸桿菌進行篩選並培養；以及
(5)收取重組大腸桿菌菌體，純化獲得聚羥基丁酯-羥基戊酯。
將選殖出的prpE基因插入帶有vgb-phaCAB基因之質體，形成一具有phbCAB-vgb-prpE基因的DNA構築物，其中該phbCAB係為聚羥基丁酯合成基因，該prpE係為丙醯輔酶A合成酶基因，該vgb係為透明顫菌血紅素基因，該vgb基因有助於大腸桿菌生產PHB，將該DNA構築物轉殖進入大腸桿菌中，該大腸桿菌可為DH5α但不限此株，經篩選而得之重組大腸桿菌係命名為CT-2E，該重組大腸桿菌株CT-2E則接種於含有丙酸或丙酸鈉之MR培養基中，以生產PHBV。
利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)上已發表序列之腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)核苷酸序列，設計prpE基因之特異性引子，該引子兩端並帶有HindIII限制酶切位。以腸道沙門氏菌染色體DNA為模板，進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)，以DNA extraction kit(VIOGENE)純化所得之prpE基因，其序列長度為1887 bps(圖一)，將此片段與pGEM-T Easy vector進行接合並轉殖進入勝任細胞，利用含有X-gal、IPTG及Ampicillin之plate進行藍白篩選法，挑選出白色的菌株，培養12小時後萃取其質體DNA，再利用HindIII限制酶進行切割，其結果與預期之大小相符。
利用HindIII限制酶將prpE基因從質體pGEM-T Easy-prpE上切下，經瓊脂明膠膠體電泳後萃取得到大小約2 kb之DNA片段，同時將帶有phaCAB基因之質體pBHB-2以HindIII切割，經瓊脂明膠膠體電泳後萃取大小約8.7 kb之DNA片段，再將上述兩片段進行接合，形成質體pBHB-2-prpE(命名為pBHB-2E)，其建構詳細流程圖如圖二。將pBHB-2E轉殖至大腸桿菌株DH5α保存。為證實prpE與上游基因及轉錄起始點為同方向，利用pBHB-2E內prpE上游基因vgb的正向引子vgb-F與prpE的反向引子prpE-R進行PCR，若prpE與vgb同向即可獲得vgb-prpE的PCR產物，若為反向則無法獲得產物(圖三)，再將此PCR產物與酵素HindIII反應後，得到兩條大小分別為2 kb的prpE與0.5 kb的vgb片段(圖四)。
為了解大量表現prpE是否能如預期可增加羥基戊酯(hydroxyvalerate,HV)在聚羥基丁酯-羥基戊酯(poly 3-hydro-xybutyrate-co-3-hydro xyvalerate,PHBV)中的比例，因此將pBHB-2E轉殖進入大腸桿菌XL1-Blue中，並將此重組菌株命名為CT-2E，並與不含prpE基因之控制組CT-2進行對照，培養菌株後以氣相層析儀(Gas Chromatography,GC)作產物的分析比較，以了解過量產生prpE之菌株是否影響HV的產率。將菌株各別以LB培養基培養12小時後，以1%的接菌量接種至主培養基，在第48小時後回收菌塊並乾燥，經由GC分析後，利用檢量線計算後，將多次實驗結果平均並顯示為表一。實驗結果顯示：過量表達prpE之菌株CT-2E，由吸光值(Optical density,OD)與細胞乾重(Cell dry weight,CDW)可以看出該株大腸桿菌CT-2E在生長時受到抑制，相較於CT-2，CT-2E之OD值約下降4.62%，CDW約下降16.28%，且PHBV的生產也下降15.70%，但PHBV中HV比例有顯著上升，其比例為每克的PHBV中有22.81%是HV，經換算後丙酸轉換成HV的轉化率高達72.48%，此結果顯示過量表達prpE雖會使菌體在生長時受到抑制，但對於丙酸的利用程度有大幅上升，有助於累積大量的HV。
對0~48 mM之丙酸添加濃度進行探討。將前培養12小時的大腸桿菌株CT-2E以起始濃度OD600為0.05轉養至含2%葡萄糖與1.5%酵母菌萃取物之MR培養基中(起始pH值為6.5)，於30℃、200 rpm下進行培養，由表二可知，HV的含量會隨著丙酸濃度增加而增加，然而當丙酸濃度添加濃度為48 mM，HV的含量與細胞重量則呈現下降的狀況。推測過量的丙酸可能會抑制細胞生長進而影響PHBV合成。由此實驗結果顯示，最佳之丙酸添加濃度為32 mM，在此條件下可獲得之細胞乾重與PHA濃度分別為11.25與5.15 g/L，其中羥基丁酯(hydroxybutyrate,HB)與HV的含量分別為34.14與11.06%。
對丙酸鈉濃度的添加進行重組菌株CT-2E對PHBV之合成探討。丙酸鈉的添加濃度為0~48 mM，由表三可知，隨著丙酸鈉添加濃度增加其HV含量也隨之增加，細胞的生長情形則因丙酸鈉濃度增加造成些微生長延遲的現象，最終的細胞乾重則介於9.25~10.38 g/L之間。由此結果顯示當丙酸鈉添加濃度到達32 mM，其HV的含量則可高於5%。接著比較添加丙酸與丙酸鈉之PHBV生產結果(表三)可發現添加丙酸可獲得較佳的細胞乾重與HV濃度。
圖一 腸道沙門氏菌之prpE之PCR產物電泳圖(M: marker；S: Salmonella enterica)
圖二 pBHB-2-prpE質體之構築流程圖
圖三 pBHB-2-prpE之vgb-prpE之PCR產物電泳圖(M: marker；S: pBHB-2-prpE；-：pBHB-2)
圖四 vgb-prpE之PCR產物以HindIII切割所得之DNA片段電泳圖(M：marker；S：pBHB-2-prpE)
Claims (9)
- 一種藉由同時攜帶可合成聚羥基丁酯基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶基因(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法，其方法包括：(1)提供一具有phbCAB-vgb-prpE基因的DNA構築物；(2)提供一大腸桿菌(Escherichia coli)微生物；(3)將該DNA構築物轉殖到該大腸桿菌微生物體內；(4)對所得之重組大腸桿菌進行篩選並培養；以及(5)收取重組大腸桿菌菌體，純化獲得聚羥基丁酯-羥基戊酯。將prpE之DNA片段以接合酵素同向接入帶有phbCAB基因之質體，形成一具有phbCAB-vgb-prpE基因DNA構築物，將該DNA構築物轉殖進入大腸桿菌中，篩選而得一重組大腸桿菌，使該重組大腸桿菌於培養基增殖，以表現聚羥基丁酯-羥基戊酯。
- 如申請專利範圍第1項所述之藉由同時攜帶可合成聚羥基丁酯基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶基因(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法，其中該大腸桿菌株係為DH5α。
- 如申請專利範圍第1項所述之藉由同時攜帶可合成聚羥基丁酯基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶基因(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法，其中該phbCAB-vgb-prpE基因之phbCAB係為聚羥基丁酯合成基因，具有如SEQ ID NO: 1之序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之藉由同時攜帶可合成聚羥基丁酯基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶基因(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法，其中該phbCAB-vgb-prpE基因之vgb係為透明顫菌血紅素。
- 如申請專利範圍第1項所述之藉由同時攜帶可合成聚羥基丁酯基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶基因(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法，其中該phbCAB-vgb-prpE基因之prpE係為丙醯輔酶A合成酶基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之藉由同時攜帶可合成聚羥基丁酯基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶基因(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法，其中該phbCAB、vgb及prpE基因係構築於同一質體。
- 如申請專利範圍第1項及第6項所述之藉由同時攜帶可合成聚羥基丁酯基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶基因(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法，其phbCAB-vgb-prpE基因之質體帶有一段抗青黴素的基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之藉由同時攜帶可合成聚羥基丁酯基因(phbCAB)及丙醯輔酶A合成酶基因(prpE)之重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯-羥基戊酯的方法，其中該培養基為添加不同濃度之丙酸或丙酸鈉之MR培養基。
- 如申請專利範圍第9項，MR培養基含2%葡萄糖與1.5%酵母菌萃取物。
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