TW201329105A - 人類ｎｏｔｃｈ１引誘物 - Google Patents

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TW201329105A
TW201329105A TW101135396A TW101135396A TW201329105A TW 201329105 A TW201329105 A TW 201329105A TW 101135396 A TW101135396 A TW 101135396A TW 101135396 A TW101135396 A TW 101135396A TW 201329105 A TW201329105 A TW 201329105A
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notch
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Jan Kitajewski
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Thr Trustees Of Columbia University In The City Of New York
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Abstract

本發明提供Notch1融合蛋白。該等融合蛋白含有人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域及與其結合之抗體之Fc部分。該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域(ECD)以存在於EGF樣重複序列10之N端之胺基酸開始，並至少延伸至EGF樣重複序列23之C端胺基酸。該人類Notch1受體蛋白之該ECD之N端部分可延伸至EGF樣重複序列24之C端胺基酸，或可延伸至EGF樣重複序列36之C端胺基酸。亦提供該等融合蛋白之組合物。亦提供使用本文所述之該等融合蛋白治療老年性黃斑病變(AMD)、糖尿病視網膜病變及癌症之方法。

Description

人類NOTCH1引誘物
在整個此申請案中，以作者及括號內之出版日期引用各種公開案。該等公開案完整引文可見於本說明書之結尾處或每一實驗部分之結尾處。該等公開案之揭示內容以引用的方式併入本申請案中，以更充分闡述本發明所屬領域。
Notch蛋白在涉及脈管系統、造血系統及神經系統之發育決定中起關鍵作用。因此，對其功能之瞭解係瞭解如何在發育期間及在成人組織中控制細胞命運決定及承諾之關鍵。迄今，若干關於Notch或Notch配體基因破壞之報導已闡述血管表現型，強調此途徑係指導血管發育之機制之基本部分。異常Notch活性與人類病狀有關；包括癌症及血管病症(CADASIL)二者。對腫瘤血管生成中Notch之分析最近才開始；然而，對Notch之可能下游標靶之發現表明在與血管生成相關之病理過程中之作用。例如，VEGFR-3與腫瘤血管生成及腫瘤淋巴管生成二者有關。若干其他可能Notch標靶之表現或功能亦與腫瘤血管生成有關；包括ephrinB2、Id3、血管生成素1及PDGF-B。對該等標靶在Notch基因功能中之作用之見解將明顯促進未來對人類病狀中Notch之分析。
本發明之其他背景可見於美國專利申請公開案第US 2011-0008342 A1號，其整個內容以引用的方式併入本申請案中，以更充分闡述本發明所屬領域。
本發明提供包含連續胺基酸之融合蛋白，該等連續胺基酸開始於融合蛋白之N端並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域(i)以存在於EGF樣重複序列10之N端之胺基酸開始，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列23之C端胺基酸。
例如，在本文所述融合蛋白之一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域延伸至EGF樣重複序列24之C端胺基酸。在另一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域延伸至EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
本發明亦提供包含上文所述融合蛋白及載劑之組合物。
本發明亦提供治療患有老年性黃斑病變(AMD)之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之AMD之量向該個體投與上文所述融合蛋白。
本發明亦提供治療患有糖尿病視網膜病變之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之糖尿病視網膜病變之量向該個體投與上文所述融合蛋白。
本發明亦提供治療患有癌症之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之癌症之量向該個體投與上文所述融合蛋白。
本發明亦提供治療患有老年性黃斑病變(AMD)之個體之 方法，該方法包含以有效治療個體之AMD之量向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含連續胺基酸，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白之N端並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域(i)包含存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸，限制條件係若該N端胺基酸係EGF樣重複序列1之N端胺基酸，則該C端胺基酸並非EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
本發明亦提供治療患有糖尿病視網膜病變之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之糖尿病視網膜病變之量向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含連續胺基酸，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白之N端並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域(i)包含存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸，限制條件係若該N端胺基酸係EGF樣重複序列1之N端胺基酸，則該C端胺基酸並非EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
本發明亦提供治療患有癌症之個體之方法，該方法包含 以有效治療個體之癌症之量向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含連續胺基酸，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白之N端並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域(i)包含存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸，限制條件係若該N端胺基酸係EGF樣重複序列1之N端胺基酸，則該C端胺基酸並非EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
術語
如本申請案中所用，除非本文中另外明確提供，否則以下術語中之每一者應具有下文所述含義。
「投與」可使用熟習此項技術者已知之任何方法來實現或實施。該等方法包含(例如)病灶內、肌內、皮下、靜脈內、腹膜內、脂質體介導、經黏膜、經腸、局部、經鼻、經口、經肛門、經眼或經耳遞送方式。
「黏附」應意指藉由任何方式附接。在一實施例中，黏附意指藉由共價鍵附接。在另一實施例中，黏附意指以非共價方式附接。
「胺基酸」、「胺基酸殘基」及「殘基」在本文中可互換使用，係指納入蛋白質、多肽或肽中之胺基酸。胺基酸可係(例如)天然存在之胺基酸或可以類似於天然存在之胺 基酸之方式起作用之天然胺基酸類似物。
本文所用「C端」及「N端」胺基酸係指分別在給定蛋白質、蛋白質結構域或胺基酸序列模體之羧基或胺基末端處或緊鄰其之胺基酸，以使得在該C端胺基酸或N端胺基酸更遠處無蛋白質、蛋白質結構域或胺基酸序列模體之結構、功能或特徵所必需之胺基酸殘基。
「抗體」應包括(但不限於)(a)包含兩個重鏈及兩個輕鏈且識別抗原之免疫球蛋白分子；(b)多株或單株免疫球蛋白分子；及(c)其單價或二價片段。免疫球蛋白分子可源自於普遍已知類別中之任一者，該等類別包括(但不限於)IgA、分泌IgA、IgG、IgE及IgM。IgG亞類為熟習此項技術者所熟知，並包括(但不限於)人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。抗體可係天然存在及非天然存在之抗體二者。此外，抗體包括嵌合抗體、完全合成抗體、單鏈抗體及其片段。抗體可係人類或非人類抗體。可藉由重組方法使非人類抗體人類化，以降低其在人類中之免疫原性。抗體片段包括(但不限於)Fab及Fc片段。在一實施例中，「抗體之Fc部分」係藉由免疫球蛋白之木瓜酶消化所獲得之可結晶片段且稱為免疫球蛋白之「效應區」，該片段係由兩個藉由二硫鍵連接之重鏈之C端半部分組成。在另一實施例中，「抗體之Fc部分」意指重鏈之一C端半部分之全部或實質上全部。
關於抗體，「人類化」意指其中CDR區外之一些、大部分或所有胺基酸經源自於人類免疫球蛋白分子之相應胺基 酸替代的抗體。可容許存在胺基酸之小添加、缺失、插入、取代或修飾，只要其不消除抗體結合給定抗原之能力即可。適宜人類免疫球蛋白分子包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgM分子。各種公開案闡述如何製造人類化抗體，例如美國專利第4,816,567號、第5,225,539號、第5,585,089號及第5,693,761號及PCT國際公開案第WO 90/07861號。
本文所用術語「組合物」，如在醫藥組合物中，意欲涵蓋包含活性成份及構成載劑之惰性成份之產物，以及直接或間接由該等成份中之任何兩者或更多者之組合產生、複合或聚集、或由該等成份中之一或多者之解離產生、或由該等成份中之一或多者之其他反應類型或相互作用產生的任何產物。
本文所用「有效量」係指能夠治療患有腫瘤、疾病或病症之個體之量。因此，有效量將因所治療個體以及與治療之病狀而變。熟習此項技術者可實施常規滴定來測定該充足量。化合物之有效量將視個體及所用之特定投與途徑而變。基於該化合物，該量可連續遞送，例如藉由連續幫浦或在週期性間隔處(例如，單獨一或多次)。熟習此項技術者無需過度實驗即可測定多個量之特定化合物之期望時間間隔。在一實施例中，該有效量係介於約1 μg/kg至10 mg/kg之間。在另一實施例中，該有效量係介於約10 μg/kg至1 mg/kg之間。在又一實施例中，該有效量係100 μg/kg。
與Notch受體蛋白連用之「細胞外結構域」意指Notch之全部或一部分，其(i)存在於細胞外(即，作為跨膜部分或細胞內部分存在)且(ii)與完整Notch受體蛋白所結合之細胞外配體結合。Notch之細胞外結構域視情況可包括信號肽(「sp」)。「細胞外結構域」、「ECD」及「胞外結構域」為同義。
「抑制」病症或不期望生物過程之發作應意指減小病症或過程發作之可能性或徹底預防病症或過程發作。在較佳實施例中，抑制病症或過程之發作意指徹底預防其發作。
「Notch」、「Notch蛋白」及「Notch受體蛋白」為同義。另外，術語「基於Notch之融合蛋白」及「Notch引誘物」為同義。以下Notch胺基酸序列為已知且以引用的方式併入本文中：Notch1(Genbank登錄號S18188(大鼠))；Notch2(Genbank登錄號NP_077334(大鼠))；Notch3(Genbank登錄號Q61982(小鼠))；及Notch4(Genbank登錄號T09059(小鼠))。以下Notch核酸序列為已知且以引用的方式併入本文中：Notch1(Genbank登錄號XM_342392(大鼠)及NM_017617(人類))；Notch2(Genbank登錄號NM_024358(大鼠)、M99437(人類)及AF308601(人類))；Notch3(Genbank登錄號NM_008716(小鼠)及XM_009303(人類))；及Notch4(Genbank登錄號NM_010929(小鼠)及NM_004557(人類))。
術語「核酸」、「多核苷酸」及「核酸序列」在本文中可互換使用，且每一者係指去氧核糖核苷酸及/或核糖核 苷酸之聚合物。去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸可係天然存在的或其合成類似物。「核酸」應意指任何核酸，包括(但不限於)DNA、RNA及其混合物。形成核酸分子之核酸鹼基可係鹼基A、C、G、T及U以及其衍生物。該等鹼基之衍生物為業內所已知，且例示於PCR Systems,Reagents and Consumables(Perkin Elmer Catalogue 1996-1997,Roche Molecular Systems有限公司，Branchburg,New Jersey,USA)中。核酸包括(但不限於)反義分子及諸如核糖酶及DNA酶等催化核酸分子。核酸亦包括編碼肽類似物、片段或衍生物之核酸，該等肽類似物、片段或衍生物在一或多個胺基酸殘基之一致性方面不同於天然存在形式(缺失類似物，其含有少於所有指定殘基；取代類似物，其中一或多個殘基經一或多個殘基取代；及添加類似物，其中有一或多個殘基添加至該肽之末端或中間部分)，且共享全部天然存在形式之一些或性質。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，且每一者意指胺基酸殘基之聚合物。胺基酸殘基可係天然存在的或其化學類似物。多肽、肽及蛋白質亦可包括諸如糖基化、脂質附接、硫酸鹽化、羥基化及ADP-核糖基化等修飾。
本文所擁「醫藥上可接受之載劑」意指該載劑與調配物之其他成份相容，且對其接受者無害，並涵蓋任一標準醫藥上接受之載劑。該等載劑包括(例如)0.01-0.1 M且較佳0.05 M磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。另外，該等醫藥上可接 受之載劑可係水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑之實例係丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油等植物油及諸如油酸乙酯等可注射有機酯。水性載劑包括水、醇性/水性溶液、乳液及懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格式右旋糖(Ringer’s dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格式及不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養素補充劑、諸如彼等基於林格式右旋糖等及諸如此類電解質補充劑。亦可存在防腐劑及其他添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及諸如此類。
「個體」應意指任一生物體，包括(但不限於)哺乳動物，例如小鼠、大鼠、狗、天竺鼠(guinea pig)、雪貂、兔及靈長動物。在一實施例中，該個體係人類。
「治療」意指減緩、停止或逆轉疾病或病症之進展。本文所用「治療」亦意指改善與疾病或病症相關之症狀。疾病包括(但不限於)腫瘤血管生成、動脈粥樣硬化、傷口癒合、早產兒視網膜病變、子癇前症、糖尿病視網膜病變、缺血、中風、心血管疾病、牛皮蘚、淋巴水腫、腫瘤生成及腫瘤淋巴管生成、老年性黃斑病變(AMD)、濕性AMD、胰腺癌及乳癌。
血管生成係在傷口癒合過程、女性月經週期及子宮重塑期間以及在胚胎發育及器官生長期間遇到。在病理學環境中，血管生成在諸如風濕性關節炎、牛皮蘚、黃斑變性、糖尿病視網膜病變及腫瘤生長等不同疾病中起重要作用。
已有重要的活體內證據，包括臨床觀察，異常血管生成與包括風濕性關節炎、炎症、癌症、牛皮蘚、退化性眼病及其他之多種疾病病狀有關。
使用Notch融合蛋白之其他疾病係代謝病症，例如(但不限於)糖尿病、肥胖症、糖尿病前期、動脈粥樣硬化、缺血、中風、心血管疾病、調節胰島素之表現及調節胰島素之功能。
Notch融合蛋白之使用亦適用於代謝症候群，該代謝症候群係指增加個人患心血管疾病及糖尿病之風險之醫學病症之組合。涉及該症候群之其他已知名稱係症候群X、胰島素抗性症候群、雷文氏症候群(Reaven’s syndrome)。該等症候群之若干特徵包括：空腹高血糖症、高血壓、中央型肥胖症(亦稱為內臟性肥胖症)、降低之脂蛋白(LDL)、升高之三甘油酯、升高之尿酸含量。上文所示空腹高血糖症包括糖尿病2型或空腹葡萄糖異常及葡萄糖耐受不良或胰島素抗性。除代謝症候群以外，Notch引誘物可具有糖尿病前期之適應症。
單位、前綴及符號可以其SI可接受形式表示。除非另有指示，否則核酸序列沿5’至3’定向自左向右寫，且胺基酸序列沿胺基端至羧基端定向自左向右寫。胺基酸在本文中可藉由其普遍已知的三個字母符號或藉由IUPAC-IUB生化命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦之一個字母符號來提及。同樣，核苷酸可藉由其普遍接受之單個字母代碼來提及。
本文中使用以下縮寫：ECD：細胞外結構域；IC：細胞內結構域；NECD/Fc：基於Notch之融合蛋白；N1：Notch1；N2：Notch2；N3：Notch3；N4：Notch4；Dll：δ樣；DLL1：δ樣1；DLL4：δ樣4；JAG：Jagged；JG：Jagged；JAG1：Jagged 1；JG1：Jagged 1；EC：內皮細胞；HUVEC：人類臍靜脈內皮細胞；m.o.i.：感染倍數；VEGF：血管內皮細胞生長因子；VEGFR：血管內皮細胞生長因子受體；sp：信號肽；PDGF：源自血小板之生長因子；PDGFR：源自血小板之生長因子受體；P1GF：胎盤生長因子。
本發明之實施例
在一實施例中，融合蛋白係包含連續胺基酸之融合蛋白，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白之N端並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域(i)以存在於EGF樣重複序列10之N端之胺基酸開始，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列23之C端胺基酸。
在本文所述融合蛋白之另一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域延伸至EGF樣重複序列24之C端胺基酸。
在另一實施例中，連續胺基酸之序列包含SEQ ID NO：3 中所述以24位置之胱胺酸開始並以833位置之離胺酸結束之序列。
在本文所述融合蛋白之另一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域延伸至EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
在另一實施例中，連續胺基酸之序列包含SEQ ID NO：5中所述以24位置之胱胺酸開始並以1318位置之離胺酸結束之序列。
在任一本文所述融合蛋白之另一實施例中，抗體之Fc部分係人類抗體之Fc部分。
在本文所述融合蛋白之另一實施例中，(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域位於信號肽之後。在又一實施例中，該信號肽係人類Notch1蛋白之信號肽或IgG重鏈之信號肽。
在任一本文所述融合蛋白之另一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域延伸至EGF樣重複序列24之C端胺基酸。在又一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：3中所述之連續胺基酸序列。
在任一本文所述融合蛋白之另一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域延伸至EGF樣重複序列36之C端胺基酸。在又一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：5中所述之連續胺基酸序列。
亦提供包含任一上文所述融合蛋白及載劑之組合物。
在一實施例中，該融合蛋白以有效抑制JAG1之活性之 量存在於醫藥上可接受之載劑中。
亦提供治療患有老年性黃斑病變(AMD)之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之AMD之量向該個體投與任一本文所述融合蛋白。
在一實施例中，AMD係濕性AMD。在另一實施例中，AMD係乾性AMD。
亦提供治療患有糖尿病視網膜病變之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之糖尿病視網膜病變之量向該個體投與任一本文所述融合蛋白。
在任一本文所述方法之一實施例中，該方法進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)之抑制劑。在另一實施例中，VEGF之抑制劑係VEGF-A、PGIF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D之抑制劑。
在任一本文所述方法之一實施例中，該方法進一步包含投與VEGF受體抑制劑。在另一實施例中，VEGF受體抑制劑係VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
亦提供治療患有癌症之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之癌症之量向該個體投與任一本文所述融合蛋白。
在一實施例中，該癌症係胰腺癌。在另一實施例中，該癌症係乳癌。
亦提供治療患有老年性黃斑病變(AMD)之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之AMD之量向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含連續胺基酸，該等連續胺基酸 開始於該融合蛋白之N端並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域(i)包含存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸，限制條件係若該N端胺基酸係EGF樣重複序列1之N端胺基酸，則該C端胺基酸並非EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
在一實施例中，AMD係濕性AMD。在另一實施例中，AMD係乾性AMD。
亦提供治療患有糖尿病視網膜病變之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之糖尿病視網膜病變之量向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含連續胺基酸，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白之N端並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域(i)包含存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸，限制條件係若該N端胺基酸係EGF樣重複序列1之N端胺基 酸，則該C端胺基酸並非EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
在任一本文所述方法之一實施例中，該方法進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)之抑制劑。在又一實施例中，VEGF之抑制劑係VEGF-A、PGIF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D之抑制劑。
在任一本文所述方法之一實施例中，該方法進一步包含投與VEGF受體抑制劑。在又一實施例中，VEGF受體抑制劑係VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
亦提供治療患有癌症之個體之方法，該方法包含以有效治療個體之癌症之量向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含連續胺基酸，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白之N端並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域(i)包含存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸，限制條件係若該N端胺基酸係EGF樣重複序列1之N端胺基酸，則該C端胺基酸並非EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
在一實施例中，該癌症係胰腺癌。在另一實施例中，該癌症係乳癌。
在任一本文所述方法之一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域以存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸開始並延伸至EGF樣重複序列23之C端胺基酸。
在任一本文所述方法之另一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域以存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸開始並延伸至EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
在任一本文所述方法之另一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域以存在於EGF樣重複序列1之N端之胺基酸開始並延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸。
在任一本文所述方法之另一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域以存在於EGF樣重複序列1之N端之胺基酸開始並延伸至EGF樣重複序列24之C端胺基酸。
在任一本文所述融合蛋白之一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域由EGF樣重複序列10-24組成。在又一實施例中，該融合蛋白包含連續胺基酸，其序列闡述於SEQ ID NO：3中。
在任一本文所述融合蛋白之一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域由EGF樣重複序列10-36組成。在又一實施例中，該融合蛋白包含連續胺基酸，其序列闡述於SEQ ID NO：5中。
在任一本文所述融合蛋白之一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域由EGF樣重複序列14-24組成。在又一實施例中，該融合蛋白包含連續胺基酸，其序列闡述於SEQ ID NO：7中。
在任一本文所述融合蛋白之一實施例中，人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域由EGF樣重複序列14-36組成。在又一實施例中，該融合蛋白包含連續胺基酸，其序列闡述於 SEQ ID NO：9中。
在任一本文所述融合蛋白之一實施例中，抗體之Fc部分係人類抗體之Fc部分。在任一本文所述融合蛋白之另一實施例中，該信號肽係人類Notch 1蛋白之信號肽或IgG重鏈之信號肽。
亦提供醫藥組合物包含本文所述融合蛋白中之任一者及醫藥上可接受之載劑。
本發明提供治療個體之老年性黃斑病變(AMD)之方法，該方法包含以有效治療該個體、從而治療該個體之AMD之量向該個體投與本文所述融合蛋白中之任一者之融合蛋白。
在一實施例中，該融合蛋白係本文所述用於治療個體之老年性黃斑病變之融合蛋白中之任一者。
本發明亦提供之治療個體之老年性黃斑病變(AMD)方法，該方法包含以有效減少血管生成、從而治療該個體之AMD之量向該個體投與Jagged-1抑制劑。在一實施例中，AMD係濕性AMD。在另一實施例中，JAGGED抑制劑係Notch1融合蛋白。
其他Notch1融合蛋白係闡述於(例如)2008年8月22日申請並代表紐約市哥倫比亞大學理事會(The Trustees of Columbia University in the City of New York)之PCT國際申請案第PCT/US2008/010045號中，其整個內容以引用的方式併入本申請案中。在另一實施例中，Notch1融合蛋白係任一本文所述融合蛋白。
本發明亦提供用於治療個體之老年性黃斑病變之Jagged-1抑制劑。在一實施例中，AMD係濕性AMD。在另一實施例中，JAGGED抑制劑係Notch1融合蛋白。在另一實施例中，Notch1融合蛋白係任一本文所述融合蛋白。
在上文所述方法之一實施例中，該方法進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)之抑制劑。在又一實施例中，VEGF之抑制劑係VEGF-A、PGIF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D之抑制劑。
在上文所述方法之一實施例中，該方法進一步包含投與VEGF受體抑制劑。在又一實施例中，VEGF受體抑制劑係VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
本發明提供治療個體之胰腺癌之方法，該方法包含向該個體以有效治療該個體、從而治療患有胰腺癌之個體之量投與本文所述融合蛋白中之任一者。
在一實施例中，該融合蛋白係本文所述用於治療個體之胰腺癌之融合蛋白中之任一者。
本發明提供延遲或抑制腫瘤生長之方法，其中該腫瘤包含胰腺癌細胞，該方法包含使該腫瘤與有效延遲或抑制該腫瘤生長之量之本文所述融合蛋白中之任一者接觸。
在一實施例中，該融合蛋白係本文所述用於抑制腫瘤生長之融合蛋白中之任一者，其中該腫瘤包含胰腺癌。
本發明提供治療個體之乳癌之方法，該方法包含以有效治療個體之量向該個體投與本文所述融合蛋白中之任一者，從而治療該個體之乳癌。
在一實施例中，該融合蛋白係本文所述用於治療個體之乳癌之融合蛋白中之任一者。
本發明提供延遲或抑制腫瘤生長之方法，其中該腫瘤包含乳癌細胞，該方法包含使該腫瘤與有效延遲或抑制該腫瘤之生長之量之本文所述融合蛋白中之任一者接觸
在一實施例中，該融合蛋白係本文所述用於抑制腫瘤生長之融合蛋白中之任一者，其中該腫瘤包含乳癌細胞。
在以下實驗細節部分中闡釋本發明。此部分經闡述以幫助理解本發明，但無意且不應理解為以任何方式限制其後申請專利範圍中所闡述之本發明。
實驗細節 第一系列之實驗 介紹
Notch信號傳導需要細胞-細胞接觸以使得Notch受體及配體相互作用。Notch細胞外結構域之主要部分包含最多36個含有Ca2+結合共有序列之EGF樣重複序列。Notch配體其細胞外區域內亦含有EGF樣重複序列，但其可藉由富含半胱胺酸之結構域之存在或不存在來區分。Jagged配體家族含有16個EGF樣重複序列及富含半胱胺酸之結構域，而δ樣配體家族含有8個或更少EGF樣重複序列。若干證據顯示，DSL區賦予Notch結合特異性且C端EGF樣重複序列有助於促進結合(Shimizu等人；Glittenberg等人；Henderson等人)。此處，顯示EGF樣重複序列11-13對於Notch/Dll1及Notch/Jag1相互作用係必需的(Cordle等人；Hambleton等 人)。
基於與作為Notch抑制劑之人類IgG Fc(Notch1引誘物)融合之大鼠Notch1細胞外結構域之36-EGF樣重複序列產生新穎可溶性構築體(Funahashi等人)。已顯示，Notch1引誘物抑制由Notch配體Jag1、Dll1及Dll4刺激之Notch活性。此發現證明，Notch之EGF樣重複序列足以與Notch配體有效地相互作用且從而預防Notch受體被其配體活化。已研究Notch-配體特異性是否由細胞外EGF樣重複序列決定。另外，已充分確定Notch係抗血管生成療法之標靶中之一者，因此吾人已基於人類NOTCH1產生新的Notch1引誘物構築體用於治療目的。大鼠Notch1及人類NOTCH1蛋白質序列為96%同源(92.6%一致)，且已顯示大鼠及人類Notch1引誘物在Notch信號傳導及功能分析中之活性無法區分。此處，使用人類Notch1引誘物，其將簡單地稱為Notch1引誘物，在下一章節中用於活體外研究以及活體內及腫瘤實驗。
除對Notch途徑之大量遺傳及細胞研究以外，Notch-配體相互作用之分子特徵仍難以捉模。為增進對Notch-配體識別之分子基礎之理解，亦產生包括EGF樣重複序列1-13及1-24之Notch1引誘物截短片段。由於EGF樣重複序列11-13參與配體結合，故假設11-13可係仍保留配體-結合活性之Notch之最短形式。Notch1引誘物1-36之分子量以其糖基化、分泌形式為大約180 kD或超過250 kD，故探究其是否可經修飾或縮短以使得其以較高含量產生並分泌用於治 療目的。利用該等新引誘物變體評估其抑制影響以及其配體特異性。本文所述結果證明Notch1引誘物1-13充當Dll4特異性抑制劑，且Notch1引誘物1-24充當泛Notch抑制劑。
亦成功構築Jag1特異性抑制劑。構築並測試第二代Notch1引誘物(包括10-24、10-36、14-24及14-36)。證明僅Notch1引誘物10-24具有Jag1特異性，並在基於內皮細胞之分析、視網膜血管生成及基因剖析分析中呈現不同活性。基於其不同活性，利用引誘物1-13、10-24及1-24作為可能的抗腫瘤及抗血管生成劑來實施腫瘤研究。
材料和方法 Notch1引誘物變體之產生
全長Notch 1引誘物1-36及Notch引誘物1-24之示意圖顯示於圖1(a)中。產生四個源自於Notch1引誘物1-36及1-24構築體之PCR誘變之截短Notch1引誘物變體。有Notch 10-36引誘物、Notch 14-36引誘物、Notch 10-24引誘物及Notch 14-24引誘物。該等引誘物之示意性代表圖顯示於圖1b中。人類Notch 1之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：1中。人類Notch1引誘物10-24之核酸序列闡述於SEQ ID NO：2中，且胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：3中。人類Notch1引誘物10-36之核酸序列闡述於SEQ ID NO：4中，且胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：5中。人類Notch1引誘物14-24之核酸序列闡述於SEQ ID NO：6中，且胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：7中。人類Notch1引誘物14-26之核酸序列闡述於SEQ ID NO：8中，且胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：9中。
截短Notch1引誘物變體在293T細胞中之表現及分泌
利用基於pCCL之Notch1引誘物質體藉由磷酸鈣轉染來轉染293T細胞。轉染後2天收集總細胞溶解產物，且使用兔抗人類Fc抗體實施西方墨點(Western blotting)。Notch1引誘物1-13、1-24及1-36引誘物之分子量分別為83 kD、127 kD及178 kD。參見圖2a。Notch1引誘物10-36、14-36、10-24及14-24之分子量分別為140 Kd、128 kD、91 kD及73 kD。參見圖2b。
Notch報告基因分析
為評估Notch引誘物對Notch信號傳導之影響，利用含有多個與螢光素酶基因連接之CSL-結合位點(11CSL-Luc)之Notch報告基因構築體。在表現Notch1及11CSL-Luc並與表現Notch配體之HeLa細胞一起共培養之HeLa細胞中量測Notch信號傳導之活化。所有Notch引誘物抑制DLL4誘導之Notch信號傳導。然而，Notch 1-13不抑制JAG1。平均螢光素酶誘導倍數±S.D.＊P值<0.002。參見圖3。顯示EGF樣重複序列1-9對於抑制DLL4誘導之Notch信號傳導必不可少(參見圖4a)。僅Notch 1引誘物10-24能夠阻斷JAG1，此證明EGF樣重複序列10-24可具有JAG1特異性。參見圖4b。
Notch1引誘物與可溶性配體之共轉染
在293T細胞中將Notch1引誘物與可溶性配體(參見圖5a1)或全長配體(參見圖5b)共轉染。用pcDNA3.1引誘物及 pCRIII-DLL4-FLAG或pCRIII-JAG1-FLAG或空載體共轉染293T細胞。亦添加交聯劑DSG以使引誘物與配體之相互作用穩定為蛋白質複合物。然後，收集細胞溶解產物並藉由蛋白A/G瓊脂糖沈澱(pull down)。然後藉由抗FLAG抗體對沈澱複合物進行免疫墨點分析。Notch1引誘物1-13與DLL4相互作用，且Notch1引誘物10-24與JAG1相互作用。
共免疫沈澱分析
利用Notch1引誘物及全長Notch1受體實施共免疫沈澱。藉由蛋白A/G瓊脂糖沈澱細胞溶解產物，並利用抗Fc或抗Notch1抗體對其進行墨點分析。Notch1引誘物不與Notch1受體相互作用。參見圖6。
視網膜血管生成
將50 μl表現不同引誘物(1-13、10-24、1-24及1-36)之5.0×109 ffu/ml腺病毒或50 μl之2 mg/ml DAPT經皮下注射至P2新生兒瞳孔中。在P5時收集視網膜並固定並利用同工凝集素B4針對視網膜脈管系統免疫染色。藉由血清之人類Fc西方墨點證實引誘物之表現及分泌。結果顯示於圖7a-7d中。Notch1引誘物1-13及10-24對視網膜血管生成展示相反影響。
基因表現剖析 i.原代細胞及癌症細胞系
在37℃下將細胞培養物維持於5% CO2及95%潮濕空氣中。使HUVEC在EGM-2培養基(Lonza Group,Walkersville,MD)中生長。Mm5MT、LLC及B16-F10係來自美國菌種保 存中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)。將癌症細胞系維持於具有10%胎牛血清(FBS)及Pen-Strep之1X高葡萄糖DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。
ii.表現Notch1引誘物之HUVEC
自慢病毒轉導之HUVEC收穫RNA用於逆轉錄物及定量RT-PCR。
對Notch受體(Notch 1-Notch4)之mRNA轉錄物實施定量RT-PCR。結果顯示於圖8a-8d中。平均相對值±S.D.＊P值<0.03。
對HEY1及HEY2之mRNA轉錄物實施定量RT-PCR。所有Notch1引誘物下調HEY1，但僅1-13及1-24下調HEY2。結果顯示於圖9a及9b中。平均相對值±S.D.＊P值<0.03。
對HEYL及HES1之mRNA轉錄物實施定量RT-PCT。亦藉由Notch1引誘物在HUVEC中之表現下調Notch信號傳導之下游標靶(HEYL及HES1)。結果顯示於圖10a及10b中。平均相對值±S.D.＊P值<0.03。
對DLL4、JAG1、VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3之mRNA轉錄物實施定量RT-PCR。Notch1引誘物1-13及10-24對VEGFR-1轉錄物具有不同影響。結果顯示於圖11a-11e中。平均相對值±S.D.＊P值<0.03。
iii.癌症細胞系之基因表現剖析
利用四個不同細胞系：小鼠乳房腫瘤細胞(Mm5MT)、人類胰腺癌細胞(KP1)、小鼠路易斯肺癌細胞(Lewis lung carcinoma cell，LLC)及小鼠黑色素瘤細胞(B16-F10)。自培養腫瘤細胞分離RNA並進行逆轉錄。進行PCR以探究所有Notch受體及配體在該等細胞系中之表現。PCR結果顯示於圖14中。
細胞增殖及凋亡細胞分析
利用不同Notch1引誘物變體慢病毒轉導腫瘤細胞並評估其細胞增殖及凋亡。使用FITC偶聯之膜聯蛋白V抗體實施凋亡分析。在圖15c及15d之右上象限中指示凋亡細胞之百分比。
藉由西方墨點及免疫染色之Notch1檢測
將表現Notch1引誘物1-13、10-24及1-24或作為對照之Fc之腺病毒經靜脈內注射至成年小鼠中。實施西方墨點分析，參見圖16a。收穫腫瘤，且藉由免疫螢光評估腫瘤切片中之引誘物含量，參見圖16b。結果顯示於圖16a及16b中。
腫瘤生長實驗
首先慢病毒轉導Mm5MT-FGF4及KP1-VEGF腫瘤細胞，以表現螢光素酶，從而利用螢光素酶活性或發光信號監測腫瘤生長。以2種方式實施實驗：第一，藉由慢病毒轉導將不同Notch1引誘物或Fc直接引入至腫瘤細胞中；第二，藉由使用腺病毒。在腫瘤收穫之前將缺氧探針TM(組織中之缺氧標記)及FITC偶聯之凝集素注射至小鼠中，以分析腫瘤缺氧及血管灌注。藉由使用Xenogen IVIS成像系統評估發光信號之總輻射率來監測腫瘤生長。平均總通量±S.D. ＊P值<0.05(n=4-5)。結果顯示於圖17a-17c及18a-18c中。
腫瘤脈管系統特徵
針對內皮黏蛋白(Endomucin)陽性區域(綠色)及Dll4(紅色)對腫瘤切片免疫染色。腫瘤脈管系統之定量係基於腫瘤切片中之內皮黏蛋白陽性區域。平均內皮黏蛋白陽性區域±S.D.＊P值<0.003(n=4-5)。比例尺：30微米。結果顯示於圖19a及19b及圖20a及20b。
腫瘤收穫前2分鐘將螢光黃偶聯之凝集素(100 μg)注射至小鼠中。針對內皮黏蛋白(紅色)及所灌注凝集素(綠色)對腫瘤切片免疫染色，且所灌注凝集素與腫瘤血管相關。血管相關凝集素之量反映功能性腫瘤脈管系統。平均凝集素陽性區域±S.D.＊P值<0.006(n=4-5)。比例尺：30微米。結果顯示於圖21a及21b中。
於Mm5MT及KP1腫瘤切片上之NG2及內皮黏蛋白免疫螢光。
針對內皮黏蛋白(綠色)及NG2(紅色)對腫瘤切片共免疫染色。量測NG2陽性區域之百分比作為腫瘤中之外周細胞募集之參數。平均NG2陽性區域±S.D.＊P值<0.02(n=4-5)。比例尺：10微米。結果顯示於圖22a及22b中。
腫瘤入侵及轉移
使用表現螢光素酶之皮下LLC及B16-F10腫瘤評估腫瘤入侵及轉移中之Notch1引誘物活性。第12天對來自不同引誘物群組(1-13、10-24及1-24)之具有發光信號之帶有腫瘤之小鼠進行拍照。基於總輻射率監測腫瘤生長並對其進行 定量。平均總通量±S.D.(n=5)。腫瘤收穫前第12天量測腫瘤重量。平均腫瘤重量±S.D.＊P值<0.05(n=5)。結果顯示於圖23a-23c及24a-24c中。
第12天自帶有腫瘤之小鼠收穫肺及肝，在30 mg/ml D-螢光素中培育，並藉由Xenogen IVIS成像系統分析。對於LLC模型，第12天每一群組之小鼠開始發生肺轉移，且不同群組之間腫瘤負荷並非顯著不同。任一群組中均未發現肝轉移。平均總通量±S.D.(n=5)。結果顯示於圖25a及25b中。
第12天自帶有腫瘤之小鼠收穫肺及肝，在30 mg/ml D-螢光素中培育，並藉由Xenogen IVIS成像系統分析。器官之成像展示肺(圖26a及26b)及肝(圖26c)中相對於Fc群組之轉移病灶。引誘物治療群組中未發現轉移。帶有B16-F10腫瘤之小鼠顯示引誘物治療群組中肺及肝轉移之發生延遲。
結果 JAG1特異性Notch1引誘物之構築
如藉由若干活體外功能分析所顯示，Notch1引誘物變體呈現不同抑制活性，此取決於Notch配體。顯示Notch1引誘物1-13僅抑制DLL4誘導之Notch信號傳導，且其在功能分析中之抑制影響與彼等其他DLL4中和劑(包括可溶性DLL4-Fc及抗DLL4抗體)極為類似。基於原始構築體，DLL4-及JAG1誘導之Notch活化二者均需要EGF樣重複序列1-24。且，EGF樣重複序列1-13僅阻斷DLL4，而不阻斷 JAG1。因此，假設EGF樣重複序列14-24及14-36可呈現JAG1特異性。然而，若干證據表明EGF樣重複序列11-13對於NOTCH與JAG1之相互作用係必需的。因此，產生Notch1引誘物變體10-24及10-36作為可能的JAG1特異性藥劑。對Notch1引誘物1-24或1-36質體實施PCR誘變，以缺失前9個或13個EGF樣重複序列。藉由在293T細胞中之表現及分泌來證實新構築體，如圖2中所顯示。其表現含量與彼等先前引誘物變體類似，此乃因相比於較小變體，較大變體以較低含量表現並分泌。
缺少EGF樣重複序列1-9或1-13之Notch1引誘物變體不能阻斷DLL4，但Notch1引誘物10-24顯著抑制JAG1誘導之Notch信號傳導
Notch1引誘物1-13作為DLL4特異性抑制劑起作用。實現新Notch1引誘物之構築後，利用共培養信號傳導分析測試Notch引誘物之抑制影響及配體特異性。所有第2代Notch1引誘物均不抑制DLL4誘導之Notch信號傳導(圖3a-c)。此表明受體與DLL4之相互作用需要EGF樣重複序列1-9。然而，Notch1引誘物10-24顯著阻斷JAG1誘導之Notch信號傳導，而其他引誘物不具有任何影響(圖4a-b)。Notch1引誘物10-36亦呈現較小JAG1抑制，但其抑制影響並不一致或顯著。此發現係尤其感興趣的，此乃因已顯示EGF樣重複序列11-13與δ樣及Jagged配體二者相互作用，但本文所述基於細胞之信號傳導分析證明EGF樣重複序列1-9之不存在似乎將轉變Notch受體對JAG1之親和力。
Notch1引誘物與Notch配體特異性結合
已證明Notch1引誘物係Notch抑制劑，且假設基於受體引誘物本身之性質，其藉由與Notch配體競爭性相互作用且從而防止Notch受體活化來阻斷Notch信號傳導。為進一步探究抑制機制，對Notch1引誘物及全長Notch配體、DLL4及JAG1實施共免疫沈澱。如人們所預期，顯示Notch1引誘物1-13僅與DLL4而非JAG1相互作用，而Notch1引誘物10-24僅與JAG1相互作用(圖5a及5b)。Notch1引誘物1-24與DLL4及JAG1二者相互作用，此支持先前之功能分析。
儘管目前Notch胞外結構域之寡聚合為未知，但研究Notch1引誘物是否可與Notch受體相互作用並阻斷Notch活性。在293T細胞中對Notch引誘物及全長大鼠Notch1實施共免疫沈澱，且結果顯示於圖6中。自Fc沈澱物未檢測到Notch1，此表明Notch1引誘物可能藉由與配體競爭且不與受體相互作用來抑制Notch信號傳導。
Notch1引誘物在視網膜血管生成中抗血管生成
出生後早期之小鼠視網膜已係經大量研究之血管生成模型。其在一系列明確界定之事件中形成血管模式，該等事件包括在周邊之血管發芽及在中心之修剪及重塑。因此，利用視網膜血管生成作為模型來進一步探究Notch1引誘物之影響。已證明，DLL4阻斷或DLL4缺失增加血管生成發芽(Lobov等人)，而內皮細胞特異性JAG1缺陷使得血管生成發芽減少(Benedito等人)。視網膜血管生成之一標誌係 在血管前面出現延伸絲狀偽足之內皮尖端細胞。Notch引誘物1-13表型模擬DLL4缺陷，其中視網膜脈管系統顯示尖端細胞數及血管生成發芽顯著增加。然而，Notch引誘物10-24使得血管生成減少，與內皮細胞中JAG1損失類似。兩種引誘物之視網膜脈管系統之間差異極顯著，且明確指示對Notch配體之不同抑制。Notch1引誘物1-24及1-36及GSI、DAPT增加但嚴重破壞發芽血管生成(圖7a)。
對表現Notch1引誘物之HUVEC變體之基因剖析證明其阻斷Notch信號傳導
接著，探究Notch1引誘物對Notch信號傳導及其下游標靶之影響(參見圖8-11)。NOTCH1之轉錄物含量隨著引誘物之表現而顯著減少(分別99%、97%及97%)，此表明NOTCH1由Notch活性之位準自動調節。令人感興趣的，其他NOTCH轉錄物含量不受該等引誘物影響。NOTCH2及NOTCH3通常不在內皮細胞中表現，但其有時可在培養之HUVEC中檢測到。Notch配體(JAG1及DLL4)之表現不隨Notch1引誘物表現而變。另外，亦探究Notch信號傳導之直接下游標靶來驗證活體外分析之結果。大部分標靶(包括HEY1、HEYL及HES1)隨所有引誘物之表現而顯著降低，此表明Notch1引誘物有效阻斷Notch活性。然而，不同於其他引誘物，Notch1引誘物10-24不減少HEY2之表現含量。此結果可表明Notch配體有差別的調節Notch對不同HEY及HES之活性。尚未完全瞭解對Notch信號傳導之JAG1及DLL4(或通常JAG及DLL配體)調節之機制，且該 等表現剖析數據可暗示下游標靶在配體特異性Notch信號傳導中甚為重要。已充分確定Notch途徑調節VEGF信號傳導。因此，進一步探究Notch1引誘物對VEGF受體之表現是否具有任何影響。所有Notch1引誘物變體增加HUVEC中之VEGFR-2表現，與N1IC相反。此發現支持此觀察結果：Notch1引誘物對Notch活性之抑制促進HUVEC增殖及遷移，此可能由VEGFR-2表現及活性之增加造成。此外，Notch之抑制似乎顯著降低VEGFR-3表現。Notch1引誘物1-13及1-24降低VEGFR-1表現；然而，Notch1引誘物10-24增加其表現，與在表現N1IC之HUVEC中類似。此結果係出乎意料的，此乃因Notch1引誘物10-24顯示顯著之Notch抑制活性。藉由流式細胞術驗證對VEGF受體之基因表現剖析。VEGFR-2之細胞表面表現在表現引誘物之HUVEC中增加，且VEGFR-3減少，如圖12中之直方圖所顯示。然而，VEGFR-1表面表現並未顯著改變，如qRT-PCR數據所表明。已知VEGFR-1以多個同種型存在：跨膜受體及可溶性蛋白。該等同種型源自於不同mRNA剪接變體。來自qRT-PCR及流式細胞術之數據表明VEGFR-1表現增加可歸因於可溶性同種型轉錄物，而非表面受體。然後，重複表現分析，利用對可溶性同種型之剪接變體具有特異性之PCR引物。如圖13中所顯示，可溶性VEGFR-1轉錄物因Notch1引誘物10-24而增加到14倍，但未受Notch1引誘物1-13及1-24顯著影響。此發現證明JAG1抑制導致可溶性VEGFR-1而非全長受體上調，且DLL4抑制減少全長 VEGFR-1且對可溶性VEGFR-1無影響。
癌症細胞系之界定Notch/Notch配體表現之基因表現剖析
為探究Notch1引誘物對腫瘤血管生成之影響，利用4個不同細胞系：小鼠乳房腫瘤細胞(Mm5MT)、人類胰腺癌細胞(KP1)、小鼠路易斯肺癌細胞(LLC)及小鼠黑色素瘤細胞(B16-F10)。Mm5MT及KP1細胞系不隨皮下移植而轉移，但LLC及B16-F10轉移至肺及肝。因此，該等腫瘤模型使能夠不僅研究引誘物對腫瘤生長及腫瘤血管生成之影響，且亦能夠研究腫瘤細胞入侵及轉移。結果顯示於圖14中。Mm5MT及LLC類似地表現高含量之Notch1、Notch2及Dll1及低含量之Notch3、Notch4及Jag1。KP1細胞表現NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、JAG1及DLL4。且，B16-F10細胞表現Notch2、Notch3、Notch4及僅一種配體Jag1。
Notch1引誘物對腫瘤細胞增殖及凋亡無任何影響
在於小鼠中利用該等腫瘤細胞用於腫瘤實驗之前，測試Notch1引誘物對培養物中之腫瘤細胞生長是否將具有任何影響。首先，利用不同Notch1引誘物變體(1-13、10-24及1-24)慢病毒轉導所有Mm5MT及KP1腫瘤細胞，並實施增殖及凋亡分析。在4天時期內觀測細胞增殖，且實驗結束時細胞數無顯著差異(圖15)。對於凋亡，將培養細胞重新懸浮，利用FITC偶聯之膜聯蛋白V抗體培育，並藉由流式細胞術分析。膜聯蛋白V陽性細胞之數量未觀測到顯著差異。
Notch引誘物分泌至血液循環中並在經由腺病毒載體表現時於腫瘤中檢測到
為模擬引誘物之全身遞送，利用腺病毒遞送方法。將表現Notch1引誘物或作為對照之Fc之腺病毒經靜脈內注射至成年小鼠中。經注射腺病毒感染肝細胞並產生高血清含量之經編碼Notch1引誘物，其可藉由西方墨點法來檢測(參見圖16a及b)。收穫腫瘤之後，亦藉由免疫螢光評估腫瘤切片中之引誘物含量，該免疫螢光顯示所有引誘物變體均到達腫瘤。
所有Notch1引誘物1-13、10-24及1-24顯著減少腫瘤生長並對腫瘤血管生成顯示不同影響
由於Notch1引誘物1-24及1-36以類似方式抑制腫瘤生長及腫瘤血管生成，故僅利用1-24變體隨同配體特異性引誘物實施後續腫瘤實驗。已廣泛顯示DLL4阻斷藉由增加非功能性腫瘤脈管系統來減少腫瘤生長(Noguera-Troise等人；Ridgway等人；Hoey等人)。因此，預期Dll4特異性引誘物1-13以相同方式起作用。首先慢病毒轉導Mm5MT-FGF4及KP1-VEGF腫瘤細胞以表現螢光素酶，從而使得可針對螢光素酶活性或發光信號監測腫瘤生長。以2種方式實施腫瘤實驗：第一，藉由慢病毒轉導將不同Notch1引誘物或Fc直接引入至腫瘤細胞中；第二，藉由使用腺病毒。另外，在腫瘤收穫之前將缺氧探針TM(組織中之缺氧標記)及FITC偶聯之凝集素注射至小鼠中，以分析腫瘤缺氧及血管灌注。不同引誘物之存在使得腫瘤生長顯著降低。分別 地，1-13、10-24及1-36 Mm5MT腫瘤之重量比對照小69%、52%及39%(圖17a-17c)，且KP1腫瘤小40%、49%及57%(圖18a-18c)。通常在移植後約一週腫瘤開始快速生長後，可見引誘物之影響。引誘物群組之腫瘤生長看起來經延遲或甚至逆轉，如KP1腫瘤中所見。由於腫瘤數據係收集自代表活細胞中之螢光素酶活性之發光信號，故預測在實驗末期腫瘤尺寸之減小可係由腫瘤細胞死亡及壞死造成。
Notch1引誘物1-13導致非功能性腫瘤脈管系統增加
藉由內皮黏蛋白免疫螢光及凝集素灌注分析腫瘤脈管系統。如圖19a及19b及20a及20b中所顯示，具有Notch1引誘物1-13之腫瘤顯示Mm5MT及KP1模型二者中之血管密度顯著增加。相比於對照腫瘤，1-13腫瘤中之脈管系統分支明顯更多且具有更廣泛之內皮網絡。Dll4免疫螢光亦顯示Dll4陽性內皮細胞增加，此支持內皮黏蛋白陽性細胞之高度發芽網絡。相比之下，10-24及1-24治療小鼠之腫瘤藉由內皮黏蛋白免疫染色明確顯示血管含量降低。該等形態變化亦由對來自內皮黏蛋白免疫螢光之血管區域之定量反映。另外，組織學評估顯示所有實驗群組中更廣泛之腫瘤缺氧，此表明引誘物1-13群組中之增加之腫瘤脈管系統可不具有適當功能。藉由血管內凝集素來比較血管灌注之分佈，針對凝集素陽性區域及內皮內皮黏蛋白免疫螢光定量該血管內凝集素。如圖21a及21b中所顯示，所有引誘物治療群組之脈管系統均顯示較差之血管灌注，分別降低 72%、90%及84%。通常一些較大腫瘤血管經灌注，但大部分較小分支血管不含有螢光凝集素。因此，腫瘤缺氧及凝集素灌注數據表明Notch1引誘物1-13抑制Notch/Dll4信號傳導途徑並導致功能性血管網絡增加。
腫瘤血管擴張及破壞之形態指示Notch1引誘物10-24之不同活性
與1-13腫瘤中增加之血管網絡不同，10-24腫瘤中之腫瘤脈管系統顯示內皮細胞含量及破壞之血管結構顯著降低。大部分腫瘤血管看起來較大且經擴張。已在活體外顯示Notch1引誘物10-24可充當Jag1特異性抑制劑，因此預測腫瘤脈管系統中之該等形態變化可係由於Jag1抑制而造成。Notch3係動脈一致性及血管平滑肌細胞成熟之主要Notch受體，且其表現及活性需要內皮表現之Jag1(Domenga等人；Liu、Kennard及Lilly)。因此，對Jag1介導之Notch信號傳導之抑制可造成破壞之壁性細胞覆蓋及異常腫瘤血管成熟。
藉由Notch引誘物10-24及1-24之Jag1阻斷使得內皮-外周細胞相互作用失調
由於在引誘物治療群組中腫瘤中之內皮細胞含量顯著受影響，故進一步探究是否亦改變血管周組份，尤其外周細胞及巨噬細胞。圖22顯示於Mm5MT及KP1腫瘤切片上之NG2及內皮黏蛋白免疫螢光。來自1-13群組之切片中NG2陽性外周細胞含量無顯著增加。在腫瘤血管周圍發現外周細胞，且其與腫瘤內皮之相互作用看起來正常並與對照腫 瘤切片類似。所看到的NG2陽性外周細胞極少呈無內皮黏蛋白陽性血管之自由組份形式。然而，於10-24及1-24腫瘤切片上之NG2免疫螢光顯示與腫瘤血管無關之外周細胞之數量顯著增加。NG2及內皮黏蛋白信號看起來有所減弱並以物理方式遭破壞。個別外周細胞自腫瘤血管不規律脫離，此證明正常血管結構損失。該等結果表明，需要Jag1介導之Notch活化來調節及維持內皮-外周細胞相互作用及功能，且該等相互作用之失調導致血管不穩定及缺陷性血管灌注。
Notch1引誘物不影響LLC腫瘤轉移，但延遲在肺及肝中形成B16-F10微轉移
皮下LLC及B16-F10腫瘤轉移至小鼠之肺及肝中。因此，利用該兩種其他腫瘤模型來評估腫瘤入侵及轉移中之引誘物活性，使用腫瘤系表現螢光素酶。圖23及24顯示所有Notch1引誘物顯著抑制LLC及B16-F10腫瘤二者之生長，在重量上抑制40%、37%、32%及58%、78%、71%(分別LLC及B16-F10；1-13、10-24及1-24)。收穫並分析帶有腫瘤之小鼠之肺及肝(表1及2)。對來自肺及肝之發光信號之分析可靠地檢測轉移病灶(圖25及26)。自整個器官之總光子輻射率定量總轉移負荷，而亦自個別信號評估轉移病灶之數量及尺寸。對於LLC，總轉移負荷在引誘物群組之間並無統計上的差異，且微轉移之數量亦如此。在此時間點無肝轉移。令人感興趣的，B16-F10腫瘤數據顯示一些來自對照群組之小鼠具有肺及肝轉移，而引誘物群組無 轉移。儘管腫瘤轉移實驗可需要不同實驗設計以延長腫瘤生長之長度，但該等數據表明Notch1引誘物可延遲腫瘤轉移。
Notch1引誘物誘導輕度杯狀細胞增生
泛Notch抑制劑之治療應用之障礙係由杯狀細胞增生導致之腸毒性。已證明該毒性需要抑制Notch1及Notch2受體，如以下GSI治療可見(Wu等人)。在圖27中，發現在裸小鼠中Notch1引誘物略微誘導腸毒性。然而，相對於GSI治療，此影響特別輕度。腸隱窩之結構保持不變，且使用引誘物治療之小鼠之重量無顯著變化。因此，證明在小鼠中個別Notch1引誘物可有效地阻斷Notch信號傳導並顯著減少杯狀細胞增生。
討論
活體內研究之主要發現係(1)Notch1引誘物不影響腫瘤細胞增殖及凋亡。(2)Notch1引誘物藉由破壞腫瘤血管生成及血管周組份來顯著抑制腫瘤生長。(3)腫瘤細胞入侵及轉移看起來因Notch1引誘物治療而延遲。(4)不同於GSI，在小鼠中所有Notch1引誘物均引起輕度腸毒性。此研究係顯示以下之第一證據：Notch1引誘物變體作為配體特異性(1-13及10-24)或泛Notch(1-24)抑制劑對腫瘤血管生成具有不同影響，但所有Notch1引誘物變體均阻斷腫瘤生長及腫瘤轉移。
Notch1引誘物1-36與小引誘物變體之間之差異
先前發現顯示Notch1引誘物1-36抑制由配體Jag1、Dll1及Dll4誘導之Notch1信號傳導(Funahashi等人)。Mm5MT及人類神經胚細胞瘤(NGP)研究證明Notch1引誘物1-36破壞腫瘤血管及活力。該等血管生成影響與彼等先前針對腫瘤 之Dll4阻斷、特定而言缺乏內皮高度發芽所報導者不同。因此，很明顯，Notch1引誘物1-36活性係獨特的且可能反映多個Notch-配體相互作用之抑制，與彼等在Dll4阻斷中所觀測者相反。該等數據亦表明血管網絡係由不同Notch受體及配體來調節，該等受體及配體可在不同血管生成過程或不同細胞類型中起不同作用。
基於原始Notch1引誘物之構築體，證明Notch1之細胞外結構域中之EGF樣重複序列足以抑制藉由與配體結合達成之Notch活化。已顯示EGF樣重複序列11及12調介與δ及(在較小程度上)Serrate之相互作用(Rebay等人)。Notch1引誘物構築體經修飾以具有Dll4特異性或Jag1特異性。由於已充分確定Notch/Dll4信號傳導在發育及腫瘤血管生成中之作用，故Dll4阻斷有效地充當對照，從而評估Notch1引誘物變體之影響。另外，已顯示不同Notch配體在不同類型之腫瘤中經上調。例如，在Mm5MT細胞中Jag1及Dll1係由FGF4誘導，而僅Jag1表現於B16-F10小鼠黑色素瘤細胞中。因此，該等腫瘤中之內皮中之Notch活性可能係由不同Notch配體組誘導。可設想，配體特異性Notch1引誘物在不同類型之腫瘤中可顯示不同影響。最後，配體特異性引誘物將允許瞭解Notch配體在腫瘤中之血管生成過程中之不同作用，以更好地設計用於癌症治療之治療劑。
Notch1引誘物之生物可用度
顯示較小引誘物變體(1-13、10-24及1-24)以比1-36高之含量產生並分泌。於腫瘤切片上之免疫組織化學亦表明限 制Notch1引誘物1-36進入腫瘤脈管系統，與大量透過進入腫瘤細胞之較小引誘物相反。引誘物抑制腫瘤血管生成之不同影響可部分地歸因於其生物可用度。由於腫瘤血管消退及過量產生經常與灌注較差之非功能性血管一起出現，故較小引誘物可具有一些優於較大變體之優點，此乃因其可容易地擴散並更好地進入腫瘤，即使當腫瘤脈管系統已受損時亦如此。
Notch1引誘物之抗血管生成及抗腫瘤活性
在所有四個腫瘤模型中，Jag1特異性及Dll4特異性引誘物二者類似地減少腫瘤生長並破壞腫瘤脈管系統。該等數據表明Notch信號傳導之微擾可引入對腫瘤內皮且可能腫瘤細胞本身顯著影響。然而，有可能該等影響由不同機制造成。充分確定阻斷Dll4/Notch信號傳導導致非功能性血管生成增加及較差之血管灌注。Notch1引誘物1-13具有類似活性並對Dll4阻斷產生類似影響。然而，Jag1抑制減少腫瘤血管生成。已顯示Notch調節廣泛範圍之促進內皮-外周細胞相互作用之信號傳導分子(Armulik、Abramsson及Betsholtz)。因此，一可能機制係藉助引誘物10-24及1-24達成之Jag1阻斷破壞血管之外周細胞覆蓋，從而阻抑腫瘤血管生成。
Notch1引誘物之抗轉移活性
利用兩個轉移模型研究Notch1引誘物在腫瘤細胞入侵及轉移中之作用。此研究之重要發現係在B16-F10模型中而非LLC中Notch1引誘物1-13、10-24及1-24均似乎延遲肺轉 移。由於在裸小鼠中該等腫瘤生長相當快，故實驗在12天後終止，此僅允許分析正常尺寸腫瘤但相當早期之轉移過程。該等腫瘤源自於腫瘤細胞之皮下移植，因此肺及肝轉移可來自於自最初位點之腫瘤細胞入侵。因此，引誘物對轉移之影響可集中於：腫瘤細胞內滲、循環系統中之存活及轉運、促進轉移區位及尋的及移生。一些證據顯示在Rip1/Tag2胰腺腫瘤模型中外周細胞覆蓋之遺傳破壞引發增加之轉移(Xian等人)。由於引誘物減小腫瘤血管完整性並降低外周細胞覆蓋，故有可能抑制腫瘤細胞散播及轉移超出原發腫瘤。
第一系列之實驗之參考文獻
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第二系列之實驗 介紹：
Notch係與細胞表面上所表現之配體相互作用之跨膜受體。在哺乳動物中，有四種Notch基因(1-4)及五種配體(稱為Jagged(Jagged1及Jagged2)或δ樣(1、3及4))。已確定藉助Notch1發揮作用之δ樣4(Dll4)在生理及病理視網膜血管生成期間在血管生成發芽限制方面起作用(Thurston,G及Kitajewski J，2008)。相比之下，已證明Jagged1為促血管生成因子，然而，尚未充分瞭解Jagged1此能力之作用機制(Benedito R等人2009)。
年齡相關之黃斑變性(AMD)係之失明普遍原因且對年老個體具有顯著之負面影響。在AMD之濕性(滲出性)形式中，血管自視網膜後面之脈絡膜成長。該等異常血管係漏的且可使視網膜脫離。濕性AMD之前線治療係經由減少血管之異常生長之抗血管生成劑達成。VEGF抑制劑目前用於該治療中。儘管該等藥劑係濕性AMD治療之有效方法，但可能的係，其他抗血管生成劑可同等有效，當與抗VEGF劑組合時可係有用的，或當VEGF阻斷不導致視力之 長期恢復時可係有效地的。此處，研究靶向Notch(血管生長及分化中之關鍵信號傳導途徑)之抗血管生成劑(Dufraine,J.等人2008)。具體而言，研發Notch途徑之基於蛋白質之受體拮抗劑(Notch1引誘物)(Funahashi Y,2008)。已研發靶向Jagged1/Notch1途徑之Notch1引誘物，且.已證明該等Notch1引誘物在視網膜血管生成及腫瘤血管生成之小鼠模型中為抗血管生成的。此處，使用病理血管生成之小鼠模型測定治療抑制視網膜血管生成中之Jagged1-Notch1之影響。
初步研究：
圖1中所示之Notch11-36引誘物結合且不活化若干Notch配體(包括Dll4及Jagged1)(Funahashi Y等人2008)。已報導藉由抑制性抗體僅抑制Dll4可促進非功能性血管生成，從而造成高度發芽但灌注較差之血管(Yan,M.等人，Nature 463及Ridgway J等人，Nature 2006)。相比之下,Notch11-36引誘物阻斷血管生成，但無證據證明發芽增加(Funahashi Y等人，2008)。因此，Notch11-36引誘物經由不同於Dll4阻斷之機制起作用，且在正常組織中不引發對血管之導致血管贅瘤形成之影響(Yan,M.等人，Clin.Cancer Res.207及Yan,M.等人，Nature 2010)。已產生源自於原始Notch11-36引誘物之配體特異性Notch1引誘物變體。使用活體外Notch信號傳導分析，Notch11-24及Notch11-36引誘物抑制Dll4及Jagged1介導之Notch信號傳導。Notch11-13引誘物抑制Dll4介導之Notch信號傳導，但不抑制Jagged1介導之 Notch信號傳導。由於Notch11-13引誘物對Dll4具有特異性且Notch11-24阻斷Dll4及Jagged1二者，故假設EGF重複序列14-24可涵蓋具有Jagged1特異性之區域。製造Notch110-24引誘物，且顯示其阻斷Jagged1而非Dll4介導之Notch1信號傳導。因此，有阻斷Jagged1及Dll4二者之Notch1引誘物(Notch11-24引誘物)、阻斷Dll4而非Jagged1之變體(Notch11-13引誘物)及阻斷Jagged1而非Dll4者(Notch110-24引誘物)。使用活體外血管生成分析測試該等變體，且證明Notch11-13引誘物使得內皮細胞過度發芽，如針對Dll4抑制劑所預測，而Notch110-24引誘物減少活體外血管生成發芽(數據未顯示)。使用視網膜血管生成小鼠模型藉由在新生兒中表現Notch1引誘物來測試Notch1引誘物變體。用於可視化新生長之脈管系統之全胚胎同工凝集素染色(Wholemount isolectin staining)證明，Notch11-13引誘物之表現使得視網膜脈管系統過度生長，與當向新生兒投與化學Notch信號傳導γ-分泌酶抑制劑(DAPT)時所見類似。相比之下，Notch110-24引誘物使得新生兒視網膜中之血管分支及生長減少(圖2C)。本文中闡述在病理性視網膜血管生成之小鼠模型中抑制Dll4、Jagged1或組合之Dll4/Jagged1阻斷之影響。
實驗程序：
測定Notch1引誘物對生理及病理性視網膜血管生成之影響。經由Notch1受體拮抗劑達成之Jagged1或泛Notch配體抑制可經由其抗血管生成影響來阻斷缺氧驅動之視網膜血 管生成。
Jagged1/Notch1之特異性抑制係應用於濕性AMD治療之極新穎抗血管生成方法，且值得探究以有助於改善對由異常血管生成所致之失明之治療。
測定小鼠中生理視網膜血管生成之Notch抑制之後果。
使用腺病毒載體感染剛出生之新生兒，使抑制所有Notch配體(Notch11-24)(Dll4(Notch11-13)或Jagged1(Notch110-24))之Notch1引誘物在新生兒小鼠中表現，且研究視網膜血管生成。視網膜係研究發芽血管生成之優良模型(Connolly,SE.等人1988及Gerhardt,H.等人2003)。在出生後第4天(P4)、P8及P21自表現Notch1引誘物之新生兒分離視網膜。P4時，視網膜正經歷發芽血管生成。P8時，初級血管叢已到達視網膜邊緣，在P21之前已完成視網膜血管生成。使用利用同工凝集素之全胚胎免疫組織化學(IHC)識別內皮細胞，且使用利用CD11b或F4/80之全胚胎免疫組織化學識別視網膜骨髓樣細胞，該等細胞積極參與視網膜血管生成。將藉由IHC測定內皮尖端細胞之尖端細胞標記、高VEGFR-2及Dll4。標準及共焦顯微鏡將評估血管密度、血管直徑、內皮細胞含量、毛細管間接合之數量及絲狀偽足之數量/位置。將測定初級神經叢自視神經生長之距離。針對內皮黏蛋白+或VE-鈣黏素+細胞及磷酸化組蛋白-3或ApoTag®抗體進行雙重染色，以分別使內皮細胞增殖或凋亡可視化。對視網膜切片進行白蛋白染色來評估毛細管間滲透性，評分作為血管外視網膜白蛋白染色。
測定小鼠中缺氧驅動之視網膜血管生成之Notch抑制之後果。
在早產嬰兒中，不適當氧暴露導致早產兒視網膜病變(ROP)，即由缺氧驅動且血管滲透性增加、基膜增厚且血管生長不受控之增生性視網膜病變。使用氧誘導之缺血性視網膜病變(OIR)之小鼠模型(Smith,LE等人1994)作為評估Notch1引誘物阻斷病理性視網膜血管生成之效力之方式。如上文，Notch1引誘物在新生兒中表現後，執行OIR模型，其中使P7小鼠暴露於75%氧中5天。視網膜在P8時呈現視網膜中央毛細管消失，該毛細管消失在P12之前變得廣泛。在P12時返回室內空氣使得內層視網膜變得缺氧，上調VEGF，且不受控視網膜新血管生成發生在P12至P17。已使用OIR模型顯示巨噬細胞係在活性新血管生成期間(P17)募集自骨髓(Kataoka,K.等人2011)，且有助於脈管系統正規化(Ritter,MR.等人2006)來評估巨噬細胞含量。對於OIR研究，將在P8、P12及P17時藉由視網膜之全胚胎及切片IHC評估實驗小鼠。藉由同工凝集素及CD11b或F4/80之雙重染色評估P8及P12視網膜之視網膜中央血管消失程度及巨噬細胞密度。評估P17視網膜之失調新血管生成程度及巨噬細胞密度。
第二系列之實驗之參考文獻
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第三系列之實驗 引言：
腫瘤血管生成作用係由各種信號傳導途徑所調節，其中有些已驗證成為抗血管生成療法之標靶。第一種批准之抗血管生成藥物貝伐珠單抗(bevacizumab，Avastin)用於若干 類型之癌症且有些已證明成功。然而，靶向VEGF途徑之抗血管生成劑未呈現持久腫瘤反應，最終誘導藥物抗性或影響腫瘤轉移(Bergers及Hanahan，2008；Ebos等人，2009；Pàez-Ribes等人，2009)。破壞腫瘤脈管系統可防止腫瘤灌注並造成缺氧。此結果儘管抑制VEGF，卻誘導許多會促進腫瘤血管生成及腫瘤生長之因子及化學引誘物。Notch信號傳導途徑代表一種抗血管生成療法之標靶，且已研發若干種Notch抑制劑。阻斷Notch信號活化所需要之γ-分泌酶活性或阻斷δ樣4(DLL4)之藥劑會破壞腫瘤血管生成(Noguera-Troise等人，2006；Ridgway等人，2006；Kalén等人，2011)。分子及遺傳研究顯示，Notch信號傳導調節細胞命運、細胞增殖、分化及凋亡，此取決於細胞環境。在內皮中，Notch信號傳導調節增殖、遷移及發芽(Hellström等人，2007)。
Notch信號傳導需要細胞-細胞接觸，允許Notch蛋白及其配體在鄰近細胞上相互作用。高度保留之Notch基因家族編碼跨膜受體Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。Notch之配體係兩個類型之跨膜蛋白：Jagged配體(Jag)Jag1及Jag2；及δ樣配體(Dll)、Dll1、Dll3及Dll4。在配體活化時，藉由γ-分泌酶依賴性蛋白水解反應裂解釋放細胞內Notch肽，並轉運至細胞核，使CSL轉錄抑制子轉化成活化劑(Kopan及Ilagan，2009)。Notch1配體結合結構域包含36個EGF樣重複序列。Notch配體有共通之保留之退化EGF樣重複序列、賦予Notch結合特異性之DSL結構域(Henderson 等人，1997；Shimizu等人，1999；Glittenberg等人，2006)，接著為變化之EGF樣重複序列區；Jagged具有16個EGF樣重複序列，且Dll含有8個或更少。Notch EGF樣重複序列11及12及DSL結構域係Notch與Dll1或Jag1之相互作用所必需(Hambleton等人，2004；Cordle等人，2008)。EGF樣重複序列24-29或Abruptex區藉由與Dll配體競爭配體結合位點來對抗Notch活化(Pei及Baker，2008)。人們尚未得知是否有獨特的Notch EGF樣重複序列可在Dll與Jag配體之間競爭相互作用。此知識落差限制了人們對與Notch之配體特異性相互作用及信號傳導結果之瞭解。
已顯示在若干癌症中Notch受體及配體經上調。Notch信號傳導在腫瘤細胞之作用包括促進及阻抑腫瘤之活性二者，此取決於腫瘤類型(Takebe等人，2010；Ranganathan等人，2011)。內皮Notch功能之抑制破壞腫瘤血管生成。DLL4阻斷藉由使腫瘤血管生成失調來抑制腫瘤生長，特徵在於導致非功能性脈管系統之增加之內皮細胞增殖及尖端細胞數(Noguera-Troise等人，2006；Ridgway等人，2006)。
Notch及VEGF信號傳導途徑錯綜連接。VEGF誘導Notch受體及Dll4之表現(Liu等人，2003；Funahashi等人，2011)，且Notch活化減少VEGFR-2之表現但增加VEGFR-1/sFlt-1之表現(Taylor等人，2002；Shawber等人，2007)。在內皮細胞中，VEGFR-3可藉由Notch誘導(Shawber等人，2007；Geudens等人，2010)或可藉由Notch信號傳導 減少(Tammela等人，2011)。在視網膜血管生成中，已證明Dll4及Jag1在內皮中具有獨特活性，此乃因內皮功能損失實驗造成不同表現型(High等人，2008；Benedito等人，2009)。
已產生編碼與人類IgG Fc融合之不同EGF樣重複序列之可溶性細胞外結構域NOTCH1構築體(NOTCH1引誘物)。NOTCH1引誘物作為Notch抑制劑起作用。具有所有36個EGF樣重複序列之人類NOTCH1引誘物以類似於抑制Jag1、Dll1及Dll4之大鼠Notch1引誘物之方式起作用(Funahashi等人，2008)。吾人問納入不同NOTCH1 EGF樣重複序列之NOTCH1引誘物是否將拮抗選擇性Notch配體。識別選擇性抑制DLL4或JAG1之NOTCH1引誘物變體，提供對人類NOTCH1中配體特異性相互作用結構域之首次描述。評估NOTCH1引誘物變體對活體外、視網膜及腫瘤血管生成之影響。特異性干擾DLL4之NOTCH1引誘物變體造成高度發芽表現型，促進功能不良腫瘤血管生成，並抑制腫瘤生長。阻斷JAG1之NOTCH1引誘物變體使得NOTCH1信號傳導減少，阻斷視網膜及腫瘤中之血管生成生長，並減少腫瘤生長。JAG1阻斷特異性增加抗血管生成可溶性VEGFR-1(sVEGFR-1/sFlt-1)含量並破壞外周細胞覆蓋，提供JAG1阻斷破壞腫瘤生長之機制。
材料和方法 原代細胞及癌症細胞系
在37℃下將細胞培養物維持於5% CO2及95%潮濕空氣 中。使HUVEC在EGM-2培養基(Lonza Group,Walkersville,MD)中生長。Mm5MT、LLC及B16-F10係來自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas，VA)。自健康科學研究資源庫(Health Science Research Resource Bank，Osaka，Japan)獲得KP1。將癌症細胞系維持於具有10%胎牛血清(FBS)及Pen-Strep之1X高葡萄糖DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。
Notch報告基因分析
利用pBOS-Notch1、pGL3-11CSL-Luc及Renilla轉染HeLa細胞，利用Effectene轉染試劑(Qiagen,Germantown,MD)或利用pCRIII-JAG1-FLAG或pCRIII-DLL4-FLAG或pCRIII-GFP-FLAG作為對照。轉染後24小時，於24孔板中共培養受體及配體細胞。收穫細胞，且共培養後24小時使用雙螢光素酶報告基因分析系統(Promega Corporation,Madison,WI)量測螢光素酶活性。以一式三份實施分析。
共免疫沈澱
藉由磷酸鈣轉染將Notch1引誘物及全長DLL4-FLAG或JAG1-FLAG共轉染至293T細胞中。轉染後24小時以20 nmol/ml之最終濃度將DSG(Thermo Scientific,Waltham,MA)添加至培養物中，培育30分鐘，並利用10 mM Tris淬滅15分鐘。藉由20 μl之蛋白A/G瓊脂糖(Santa Cruz Biotechnology有限公司，Santa Cruz，CA)沈澱溶解產物。為逆轉該交聯，用50 μmol/ml DTT處理免疫複合物並煮沸5分鐘，然後電泳。
發芽血管生成分析
發芽分析(Nakatsu及Hughes，2008)使用以400個細胞/珠粒黏附至Cytodex 3葡聚糖珠粒(GE Healthcare Bio-Sciences公司，Piscataway，NJ)之HUVEC。在24孔板中以250個珠粒/孔將珠粒包埋於由2 mg/ml血纖維蛋白元(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、0.15 U/ml抑肽酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)及0.0625 U/ml凝血酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)組成之血纖維蛋白凝塊中。1小時後，以1.0×105細胞/孔將Detroit 551纖維母細胞(ATCC,Manassas,VA)接種於血纖維蛋白凝膠頂部。以一式三份實施實驗。
視網膜分析
向P2小狗經皮下注射編碼不同Notch1引誘物或Fc之腺病毒(Ad)。在1X PBS中以5.0×109 ffu/ml製備Ad，且每一小狗接受50 μl之單一劑量。將P5時所收集之眼球固定於4% PFA中。解剖視網膜，在室溫下在1X PBS中利用1% BSA及0.5% Triton X-100使其透化2小時，且隨後在PBLEC緩衝液(1% Triton X-100，0.1 mM MgCl2，0.1 mM CaCl2，0.1 mM MnCl2，存於1X PBS中，pH 6.8)中洗滌3次。對於免疫螢光，將視網膜利用FITC偶聯之同工凝集素B4(Vector Laboratories有限公司，Burlingame，CA)培育過夜，用PBLEC洗滌，利用4% PFA後固定，並安裝。
定量即時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)
自培養細胞利用RNeasy微型套組(Qiagen,Germantown, MD)收集RNA。將經分離RNA用DNase I處理30分鐘，並使用用於RT-PCR之SuperScript第一鏈合成系統(Invitrogen,Carlsbad,CA)用於逆轉錄PCR。對於qRT-PCR，利用ABsolute Blue QPCR SYBR Green Mix(Thermo Scientific,Waltham,MA)進行反應。
腫瘤實驗
4-6週大的雌性NCr-裸小鼠(NCI-Frederick,Frederick,MD)經歷上側1.0×105 Mm5MT-FGF4細胞或2.0×106 KP1-VEGF細胞或5.0×105 LLC或B16-F10細胞之皮下移植。2天後，經由眼眶後靜脈內注射投與編碼Notch1引誘物之Ad。在第21天收穫腫瘤並分析。為量測腫瘤缺氧，在處死之前30分鐘向小鼠腹膜內注射60 mg/kg之缺氧探針-1(Hypoxyprobe有限公司，Burlington，MA)。利用抗缺氧探針抗體免疫染色腫瘤。為評估血管灌注，小鼠接受在左心室處100 μg螢光黃番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素(Vector Laboratories有限公司，Burlingame，CA)之心內注射。2分鐘後，向小鼠灌注1% PFA。藉由螢光顯微鏡法分析腫瘤之結合於內皮細胞表面之凝集素。對於腸毒性分析，自感染Ad、帶有腫瘤之小鼠收穫十二指腸。將組織於4% PFA中固定過夜，並在30%蔗糖溶液中脫水，然後石蠟包埋。實施PAS染色來分析杯狀細胞。
免疫螢光染色
將剛冷凍之7 μm厚腫瘤組織切片冷丙酮中後固定3分鐘，並在1X PBS中洗滌5分鐘，洗滌兩次，且然後在室溫 下在含有3% BSA及2%血清之阻斷溶液中阻斷1小時。然後，將一級抗體溶液添加至阻斷溶液中，添加至載玻片，並在4℃下培育過夜。將在1X PBS中洗滌5分鐘，洗滌兩次。將螢光偶聯之二級抗體添加至該等切片中並培育30分鐘。將載玻片在1X PBS中洗滌兩次並安裝。
結果 Notch1 1-13 引誘物增加毛細管發芽，而Notch1 10-24 引誘物減少發芽及血管平滑肌細胞覆蓋
為藉由內皮細胞測定Notch1引誘物對血管生成及含有管腔之芽形成之影響，使Notch1引誘物在HUVEC中表現並實施活體外發芽分析。將塗佈HUVEC之葡聚糖珠粒包埋於血纖維蛋白中，且在第7天評估芽形成。在Fc對照中，內皮細胞芽匯合以形成多細胞、分支且含有管腔之網絡(圖33A)。表現Notch11-13引誘物之HUVEC顯示高度發芽表現型之特徵在於增加之尖端細胞，如自毛細管芽數量增加76%可見(圖33A及33B)。Notch11-13引誘物表現型與DLL4/Notch信號傳導之衰減一致，此乃因已顯示抗DLL4抗體增強內皮細胞增殖及發芽(Ridgway等人，2006)。相比之下，表現Notch110-24及Notch11-24引誘物之HUVEC呈現芽發育不良及芽數分別降低40%及68%(圖33B)。表現Notch110-24及Notch11-24引誘物之HUVEC中不存在對照群組中所觀測到之吻合。該等結果說明JAG1之抑制為抗血管生成的且該影響超過DLL4抑制。
所有所測試之Notch1引誘物(Notch11-13、Notch110-24、 Notch11-24、Notch11-36)當以單層形式生長時促進HUVEC遷移及增殖(圖34A-34C)，與藉由Notch1IC達成之Notch信號活化相反。在毛細管樣網絡形成分析中，在將HUVEC包埋於膠原凝膠間之情況下，Notch11-13引誘物使得HUVEC形成更複雜之血管網絡且分支點增加，而Notch110-24不能形成完整網絡(圖35A及35B)。在單層分析中未見3維(3D)活體外分析(圖33A)中Notch11-13及Notch110-24引發不同血管生成反應之能力。該等差異之可能解釋係Notch配體表現受細胞外基質(ECM)影響。與膠原相比，當使HUVEC於血纖維蛋白上生長時，JAG1表現顯著增加且DLL4降低(圖36)。因此，在HUVEC中由Notch1引誘物變體引發之配體特異性反應受ECM影響，且當活體外以3D形式模擬毛細管樣發芽之評估時得到證明。
吾人問Notch1誘物對鼠類視網膜血管生成將具有何種影響、Notch信號傳導在何處限制芽形成(Lobov等人，2007；Suchting等人，2007)。將表現引誘物或Fc之腺病毒載體注射至新生兒中，藉由西方墨點法驗證循環中之引誘物表現，且評估循環引誘物對視網膜血管生成之影響。腺病毒感染導致Notch1引誘物之可檢測之血清含量(數據未顯示)。Notch11-13引誘物顯著增加內皮發芽及發芽尖端細胞數(圖33B)，與其選擇性阻斷DLL4之能力(圖33A)一致。Notch110-24引誘物減少視網膜中之血管密度(圖7B)。Notch11-24引誘物增加視網膜脈管系統密度(圖7B)。因此，Notch11-24引誘物在鼠類視網膜血管生成中作為Dll4拮抗劑 且在活體外發芽期間作為JAG1拮抗劑起作用。
已顯示Jag1對於血管平滑肌細胞之募集甚為重要(High等人，2008；Benedito等人，2009)。對α-平滑肌肌動蛋白(αSMA)免疫螢光之分析揭示在Notch110-24及Notch11-24引誘物治療群組中降低之沿動脈之血管平滑肌細胞覆蓋(圖33C)，即在內皮特異性Jag1突變小鼠中亦可見之表現型(High等人，2008；Benedito等人，2009)。NG2免疫螢光顯示視網膜外周細胞覆蓋無顯著差異(數據未顯示)。當評估對活體外及活體內發芽血管生成之影響時，Notch11-13引誘物作為DLL4抑制劑起作用，且Notch110-24引誘物作為JAG1抑制劑起作用。
Notch1 1-13 、Notch1 10-24 及Notch1 1-24 引誘物顯著減少腫瘤生長並使腫瘤血管生成失調
測試Notch1引誘物直接影響腫瘤細胞之能力；評估Notch11-13、Notch110-24及Notch11-24引誘物是否將影響Mm5MT-FGF4(小鼠乳房腫瘤)、KP1-VEGF(人類胰腺腫瘤)、LLC(小鼠肺腫瘤)及B16-F10(小鼠黑色素瘤)腫瘤細胞系之活體外群落形成、增殖及凋亡。所有Notch1引誘物顯著抑制Mm5MT-FGF4細胞之群落形成，但不抑制其他腫瘤細胞系之群落形成(圖37)。因此，在Mm5MT-FGF4腫瘤中，Notch1引誘物具有抑制腫瘤細胞及宿主細胞(內皮及壁性細胞)之可能性。Notch1引誘物不影響單層培養物中所生長之任一腫瘤系中之腫瘤細胞增殖或凋亡(圖15)。
為評估Notch1引誘物變體在腫瘤中之作用，使用4個不 同腫瘤細胞系實施異種移植研究。皮下腫瘤移植後3天，將編碼不同Notch1引誘物之腺病毒經靜脈內注射至小鼠中。在血清中藉由西方墨點早在注射後2天且在腫瘤中藉由免疫螢光檢測到高含量之蛋白質(圖16)。所有Notch1引誘物測試顯著降低Mm5MT-FGF4、LLC及B16-F10腫瘤之生長；而僅Notch110-24及Notch11-24引誘物抑制KP1-VEGF腫瘤之生長(圖38A-38D)。Notch11-24引誘物微擾Mm5MT-FGF4及KP1-VEGF腫瘤生長之能力類似於針對全長Notch1引誘物(Notch11-36)所觀測者(圖39)。在移植後約一週腫瘤開始快速生長後，可見Notch1引誘物之影響(數據未顯示)。
Notch11-13引誘物、Notch110-24及Notch11-24引誘物對腫瘤血管生成具有不同影響。Notch11-13引誘物顯著增加所有腫瘤模型中之內皮細胞密度(圖40A-40B)，類似於利用DLL4阻斷所見(Ridgway等人，2006)。相比之下，來自Notch110-24及Notch11-24引誘物群組之腫瘤顯示內皮細胞含量增加(圖40A-40B)。在Mm5MT-FGF4模型中，藉由凝集素灌注、接著對腫瘤內皮之內皮黏蛋白染色來測定血管灌注。與Fc腫瘤相比，來自所有Notch1引誘物治療群組之脈管系統顯示血管灌注較差，降低72%(Notch11-13)、90%(Notch110-24)及84%(Notch11-24)(圖41A及41B)。與較差灌注一致，Notch1引誘物治療之腫瘤已增加缺氧及腫瘤壞死(圖41A及41C)。為測定血管消退，針對內皮黏蛋白及膠原IV免疫染色腫瘤。膠原IV沈積在Notch11-13引誘物治療之 腫瘤中增加且在Notch110-24及Notch11-24引誘物腫瘤中減少(圖42A-42C)。當正規化至內皮黏蛋白染色時，Fc群組與Notch1引誘物治療群組之間無差異(圖42C)，此說明腫瘤脈管系統減少並非由血管消退所致。
總而言之，在鼠類腫瘤異種移植物中DLL4及JAG1抑制造成不同血管生成表現型。Notch11-13引誘物、DLL4抑制劑增加內皮細胞含量，減少血管灌注且增加腫瘤缺氧及壞死。Notch110-24引誘物、JAG1抑制劑減少腫瘤血管生成，且腫瘤血管灌注較差，從而導致缺氧增加。
Notch1引誘物展示微擾腫瘤血管之壁性細胞覆蓋之不同能力
基於Notch1引誘物對視網膜壁性細胞覆蓋之影響，評估Notch1引誘物治療之Mm5MT-FGF4腫瘤中之壁性細胞。針對內皮黏蛋白及NG2或αSMA免疫染色腫瘤切片，以分別使外周細胞及血管平滑肌細胞可視化。在Notch11-13引誘物腫瘤中，外周細胞與內皮細胞緊密相關(圖43A)。相對於Fc群組，Notch11-13引誘物使外周細胞含量增加，同時使內皮細胞含量增加(圖43B-43D)，此說明外周細胞密度不變。在Notch110-24及Notch11-24引誘物治療之腫瘤中使外周細胞自內皮細胞解離(圖43A)。在Notch110-24引誘物腫瘤中，相對於內皮細胞，外周細胞數顯著減少(圖43D)；亦即，血管之整個外周細胞覆蓋降低。αSMA免疫染色揭示Notch110-24及Notch11-24引誘物治療之腫瘤之大動脈血管之血管平滑肌細胞覆蓋減少(圖44)。在B16-F10腫瘤之壁性細胞上觀測到Notch110-24及Notch11-24引誘物之類似影響 (數據未顯示)。KP1-VEGF及LLC對照腫瘤具有較差之血管壁性細胞覆蓋(數據未顯示)。因此，在腫瘤血管生成中，Dll4抑制對血管壁性細胞無明顯影響，而經由Notch11-24及Notch110-24引誘物阻斷Jag1造成有缺陷之外周細胞及血管平滑肌細胞覆蓋。
Jagged特異性Notch1 10-24 引誘物增加可溶性VEGFR-1/sFlt-1
藉由評估Notch標靶基因表現來探究DLL4-及JAG1特異性Notch1引誘物變體在內皮細胞中引發不同影響之機制。利用編碼Fc、Notch11-13、Notch110-24或Notch11-24引誘物之慢病毒感染HUVEC，且測定對內皮Notch下游標靶之影響。在HUVEC中使用含有shRNA之慢病毒(J1KD)敲低JAG1。Notch11-13、Notch110-24及Notch11-24引誘物及J1KD之表現阻抑HEY1、HEYL及HES1(Notch/CSL反式活化之直接標靶(Nakagawa等人，2000))之表現(圖45)。不同於其他Notch1引誘物，Notch110-24引誘物或J1KD不減少HEY2轉錄物(圖45)。因此，在內皮細胞中Notch之DLL4及JAG1活化有差別地調節HEY2之表現。
Notch信號傳導調節內皮細胞中之VEGF信號傳導，在很大程度上藉助VEGF受體之調節達成(Thurston及Kitajewski，2008)。使用定量RT-PCR及FACS測定Notch1引誘物變體或J1KD對VEGF受體之表現之影響。Notch11-13、Notch110-24、Notch11-24引誘物變體及J1KD敲低增加HUVEC中之VEGFR-2表現(圖46)，與Notch1細胞內結構域(Notch1IC) 相反，該Notch1細胞內結構域減少VEGFR-2(數據未顯示)。藉由Notch1引誘物增加VEGFR-2可能有助於促進HUVEC增殖及遷移(圖34)。所有Notch1引誘物變體及J1KD顯著降低VEGFR-3表現(圖45)。
藉由Notch1引誘物達成之DLL4-或JAG1介導之Notch信號傳導之抑制有差別地調節VEGFR-1表現。Notch11-13及Notch11-24引誘物降低VEGFR-1轉錄物；而Notch110-24引誘物或J1KD增加VEGFR-1(圖46)。然而，VEGFR-1表面表現在Notch110-24引誘物HUVEC中未增加(圖46)。
VEGFR-1作為兩種產生跨膜受體(VEGFR-1)或可溶性蛋白(sVEGFR-1/sFlt-1)之剪接變體存在。使用對sVEGFR-1/sFlt-1轉錄物具有特異性之PCR引物，發現Notch110-24引誘物或J1KD顯著增加sVEGFR-1/sFlt-1轉錄物(圖47A)。抑制Dll4及Jagged1二者之Notch1 Notch11-241-24引誘物亦增加HUVEC中之sVEGFR-1/sFlt-1表現。在HUVEC中sVEGFR-1/sFlt-1剪接變體不受Dll4特異性Notch11-13引誘物影響(圖47A)。使用ELISA在條件培養基上自表現不同Notch1引誘物、J1KD或Notch1IC之HUVEC驗證JAG1/NOTCH信號傳導調節sVEGFR-1/sFlt-1之發現。sVEGFR-1/sFlt-1之含量隨著Notch110-24及Notch11-24引誘物或JAG1敲低而顯著增加，且不受Notch11-13引誘物或Notch1IC表現影響(圖47B)。
Mm5MT-FGF4腫瘤之VEGFR-1/sFlt-1免疫螢光顯示Notch110-24及Notch11-24引誘物群組中之VEGFR-1/sFlt-1顯 著增加(圖48A及48B)。Notch110-24及Notch11-24引誘物治療之腫瘤中之擴散及非血管染色模式指示可溶性VEGFR-1/sFlt-1增加。因此，發現利用Notch11-24或Notch110-24引誘物抑制JAG1/Notch信號傳導特異性增加HUVEC及鼠類腫瘤異種移植物中之sVEGFR-1/sFlt-1含量。由於sVEGFR-1/sFlt-1作為VEGF/VEGFR-2信號傳導之競爭性拮抗劑起作用，故在Notch110-24及Notch11-24引誘物治療之腫瘤中所觀測到之腫瘤血管生成降低可因VEGFR-2信號傳導降低而發生。
Notch1引誘物對於帶有腫瘤之小鼠無毒性
先前公開案報導在用GSI或合併之Notch1/Notch2阻斷治療之小鼠中之腸杯狀細胞增生(van Es等人，2005；Wu等人，2010)。在3週實驗結束時，Notch11-13、Notch11-24或Notch110-24引誘物之表現適度增加帶有腫瘤之小鼠之腸中之杯狀細胞數，小於2倍(圖27A及27B)。相比之下，治療小鼠之GSI(化合物E)使杯狀細胞增加到5倍。與輕度腸表現型一致，在帶有Notch1引誘物變體腫瘤之小鼠中未觀測到重量損失(圖27C)。該等結果表明，Notch1引誘物缺乏顯著腸毒性且代表抗血管生成療法之替代Notch靶向劑。
討論
為與Notch配體有效相互作用，Notch受體需要EGF樣重複序列11及12及鈣離子(Rebay等人，1991；Rand等人，2000)；然而，關於Notch上之配體特異性相互作用結構域所知甚少。利用生化及功能分析來界定與NOTCH1之配體 特異性相互作用之結構域，集中於DLL4及JAG1。使用此知識，揭露DLL4-或JAG1介導之Notch信號傳導之獨特下游信號傳導事件。具體而言，Notch11-24引誘物作為泛配體抑制劑起作用，與DLL4或JAG1相互作用並阻斷由DLL4或JAG1誘導之信號傳導。Notch11-13引誘物作為DLL4特異性拮抗劑起作用，從而界定前13個EGF樣重複序列能夠干擾DLL4但不干擾JAG1。相反地，含有NOTCH1之EGF樣重複序列10-24之Notch110-24引誘物抑制JAG1，但不抑制DLL4。使用該等配體選擇性Notch1引誘物，發現DLL4或JAG1抑制引發對sVEGFR-1/sFlt-1含量之相反調節，此證明在NOTCH1之下游DLL4及JAG1具有不同信號傳導影響。最後，證明腫瘤抑制可使用選擇性抑制DLL4或JAG1或抑制二者之Notch1引誘物來實現。然而，在視網膜及腫瘤異種移植物中，DLL4或Jagged1之抑制造成血管生成表現型。
內皮細胞中之JAG1對DLL4配體特異性Notch信號傳導
先前已闡述藉由Jag1、Dlll或Dll4阻斷Notch1信號傳導之大鼠Notch11-36引誘物(Funahashi等人，2008)。產生人類Notch11-36及Notch11-24引誘物(圖36)並顯示其阻斷JAG1及DLL4二者。Notch11-36及Notch11-24引誘物作為抗血管生成劑起作用，儘管其與DLL4相互作用，DLL4抑制應引發高度發芽反應。假設Notch11-36及Notch11-24引誘物之抗血管生成活性反映藉由阻斷JAG1或DLL4及JAG1二者所引發之表現型。所有為活性拮抗劑之Notch1引誘物變體含有 NOTCH1之EGF樣重複序列11-13。發現NOTCH1之10-13上游之EGF樣重複序列賦予對抗DLL4之抑制活性(圖3B及3C)及與DLL4之特異性結合(圖5B)。相反地，10-13下游之EGF樣重複序列賦予對抗JAG1之抑制活性(圖4A及4B)及與JAG1(圖5B)而非DLL4之結合。此係對NOTCH1蛋白中之配體選擇性結合結構域之首次描述。
研究表明JAG1/Notch及DLL4/Notch信號傳導具有重疊及獨特之分子標靶。泛配體Notch11-24引誘物、DLL4特異性Notch11-13引誘物及JAG1特異性Notch110-24引誘物所有均使Notch標靶HEY1、HEYL、HES1、VEGFR-3之含量減少及VEGFR-2增加，此證明該等基因係DLL4/NOTCH及JAG1/NOTCH信號傳導二者之標靶。當分析可溶性VEGFR-1/sFlt-1(抗血管生成劑，其作為VEGF之引誘物受體起作用且拮抗VEGFR-2信號傳導(Shibuya,2006))之配體特異性調節時，發現Notch1引誘物變體活性之差異。DLL4特異性Notch11-13引誘物減少sVEGFR-1/sFlt-1剪接變體及蛋白質含量，而JAG1特異性Notch110-24引誘物使sVEGFR-1/sFlt-1增加。因此，在活體外發芽分析及腫瘤異種移植中針對JAG1特異性Notch引誘物所觀測到之抗血管生成表現型可由sVEGFR-1/sFlt-1增加引起。
Notch1引誘物之抗血管生成及抗腫瘤活性
JAG1特異性及DLL4特異性Notch1引誘物二者均減少腫瘤生長並誘導腫瘤缺氧，此說明Notch1引誘物有效阻斷血液流向腫瘤。分析證明，當DLL4及/或JAG1係標靶時， Notch1引誘物變體之腫瘤抑制影響由不同血管生成機制造成。
Dll4/Notch之阻斷導致內皮細胞增殖增加及尖端細胞增加，最終造成非功能性血管生成及較差之血管灌注(Noguera-Troise等人，2006；Ridgway等人，2006；Li等人，2007；Hoey等人，2009)。與該等研究一致，在活體外血纖維蛋白珠粒分析中(圖33A及33B)、在視網膜血管生成期間(圖7B及7C)及在四種腫瘤異種移植中(圖38)DLL4特異性Notch11-13引誘物引起高度發芽。Notch11-13引誘物使得VEGFR-2升高及VEGFR-1減少，有人提出此變化係Dll4阻斷引起高度發芽表現型之基礎(Potente等人，2011)。因此，Notch11-13引誘物之血管生成表現型符合其作為DLL4抑制劑之生化活性。
JAG1抑制劑(Notch110-24引誘物)使得活體外(圖33A)、在視網膜血管生成期間(圖7B及7C)及在多種腫瘤異種移植中(圖38)發芽減少。此與先前研究一致，在先前研究中內皮Jag1損失減少視網膜血管生成發芽(High等人，2008；Benedito等人，2009)。藉由Notch110-24引誘物達成之JAG1抑制與減少之Notch信號傳導相關，如自降低之JAGGED1/NOTCH1誘導CSL報告基因表現及HEY1、HEYL及HES1表現可見。然而，Jagged1之抑制特異性促進內皮細胞中之sVEGFR-1/sFlt-1產生。因此，藉由Notch110-24引誘物達成之JAG1阻斷之影響係升高由內皮細胞產生之抗血管生成劑之含量。事實上，sVEGFR-1/sFlt-1之顯著升高 可見於用Notch110-24引誘物治療之腫瘤(圖48)；因此減少之腫瘤血管生成與高sVEGFR-1/sFlt-1含量相關。
Notch110-24引誘物表現減少並破壞與視網膜及腫瘤血管二者相關之血管壁性細胞。在視網膜中，Jag1特異性抑制減少小動脈之血管平滑肌細胞覆蓋(圖33D)。在Notch110-24引誘物治療之腫瘤中，外周細胞亦不能與腫瘤內皮相聯結。利用Notch110-24引誘物所觀測到之壁性細胞覆蓋之破壞亦與先前研究一致，先前研究顯示於動脈上之適當平滑肌細胞結合需要Jag1/Notch相互作用(High等人，2008；Benedito等人，2009)。
發現內皮-外周細胞相互作用之調節及維持需要Jag1介導之Notch活化，並斷定該等相互作用之失調有助於血管不穩定性。因此，除升高sVEGFR-1/sFlt-1外，提出Notch110-24引誘物阻斷腫瘤血管生成之另一機制。Notch110-24引誘物藉助抑制Jag1藉由破壞內皮外周細胞相互作用來使腫瘤血管去穩定。Notch調節廣泛範圍之促進內皮-壁性細胞相互作用之信號傳導分子(Armulik等人，2005)，且平滑肌細胞中之Notch藉由促進分化來響應內皮Jag1(Domenga等人，2004)。外周細胞產生VEGF-A且已知有助於內皮細胞存活(Franco等人，2011)。由於Notch110-24引誘物嚴重破壞腫瘤血管之外周細胞覆蓋且升高sVEGFR-1/sFlt-1，故此腫瘤內皮將對由VEGF-A提供之促存活信號之缺乏特別敏感。因此，Notch110-24引誘物代表腫瘤中之強效抗血管生成劑，其起作用以破壞外周細胞並升高 sVEGFR-1/sFlt-1。
Jag1：促血管生成Notch配體
血管中Notch信號傳導之調節歸因於內皮Notch配體(Jag1及Dll4)。不同於Dll4，Jag1之作用仍有點難以捉摸，直至證明若Notch經Manic Fringe糖基化，則內皮Jag1活化Notch信號傳導之能力降低為止(Benedito等人，2009)。此數據提出其中內皮Jag1藉由防止Dll4/Notch相互作用或藉由促進低於藉由Dll4介導者之Notch信號傳導來干擾Dll4/Notch信號傳導的模型(Benedito等人，2009)。在對此模型之支持中，內皮特異性Jag1損失使得視網膜血管中之Notch標靶Hey1及Hes1增加(Benedito等人，2009)。
提出內皮Jag1可經由Notch信號活化起作用，以藉由下調sVEGFR-1/sFlt1及可能其他尚待識別之Jag1特異性Notch標靶來促進血管生成。在所培養內皮細胞中，JAG1活化Notch信號傳導之能力在很大程度上類似於DLL4(圖3B-3C及4A-4b)。藉助Notch110-24引誘物或J1KD阻斷JAG1活性下調大部分Notch下游標靶(包括HEY1、HEYL、HES1、VEGFR-3)並上調VEGFR-2(圖45)。然而，藉由Notchi10-24引誘物或J1KD達成之JAG1/NOTCH信號傳導之抑制不抑制HEY2且升高sVEGFR-1/sFlt-1，不同於DLL4阻斷。因此，使用Notch110-24引誘物或J1KD之功能損失實驗證明內皮JAG1可藉由活化Notch信號傳導來促進血管生成，此使得sVEGFR-1/sFlt-1下調。當JAG1係活化配體時，內皮細胞將藉由減少sVEGFR-1/sFlt-1起反應，而若JAG1經manic fringe修飾且活性比配體低，則增加之DLL4信號傳導將抑制芽形成。因此，JAG1在血管生成中之特定作用係上下文相關的，基於NOTCH之含量及糖基化狀態或將Jag1呈遞至內皮Notch之細胞類型而有所不同。來自研究之所有證據與JAG1活性對於有效血管生成甚為關鍵之結論一致。
Notch1引誘物之阻斷DLL4及JAG1二者之功能
藉由研發阻斷DLL4及JAG1二者之Notch1引誘物及對每一者具有選擇性之Notch1引誘物，有機會將合併之DLL4及JAG1阻斷之影響與配體選擇性阻斷之影響相比較。類似於Notch110-24引誘物，使用活體外血纖維蛋白珠粒發芽分析Notch11-24引誘物阻斷內皮發芽(圖33A)並增加sVEGFR1/sFlt-1之蛋白質含量(圖47B)，儘管不如Notch110-24引誘物強勁。然而，Notch11-24引誘物亦以類似於DLL4特異性Notch11-13引誘物之方式起作用，如自增加之HUVEC增殖、遷移及網絡形成可見。在視網膜中，Notch11-24引誘物展示混合表現型，造成高度發芽(圖7B)，且亦減少壁性細胞覆蓋(圖33D)。因此，Notch11-24引誘物可微擾視網膜血管中之Dll4及Jag1功能二者。相比之下，在四個不同腫瘤模型中Notch11-24引誘物表型模擬Notch110-24引誘物，在Mm5MT腫瘤模型中使得腫瘤脈管系統減少並升高sVEGFR-1/sFlt-1。在腫瘤微環境中Notch11-24引誘物主要充當JAG1抑制劑，且其在腫瘤中之效用將明顯取決於不同Notch配體之存在及活性。
Notch1引誘物之治療可能性
Notch1引誘物之阻斷腫瘤血管生成之不同影響將受其生物可用度影響。Notch11-13及Notch11-24引誘物以高於Notch11-36引誘物之含量表現並分泌，且從而可更容易產生並可能更有效。對腫瘤切片之分析證明，Notch11-36引誘物受限於腫瘤脈管系統，與較小Notch1引誘物變體相反，該等較小Notch1引誘物變體在腫瘤血管周圍檢測到並遍佈腫瘤細胞擴散(圖39)。由於更具可擴散性，Notch11-13及Notch110-24引誘物具有影響腫瘤微環境中之腫瘤血管生成、腫瘤細胞、癌症幹細胞及其他細胞之可能性。在小鼠中過表現Jag1之腫瘤細胞促進腫瘤血管生成(Zeng等人，2005；Funahashi等人，2008)，此表明在VEGF阻斷之情形下源自腫瘤之Jag1可充當替代血管生成途徑。因此，對JAG1介導之Notch信號傳導之選擇性抑制對於靶向源自於許多細胞類型之JAG1之促腫瘤活性甚為重要。
Notch11-36引誘物之血管定位之可能優點可係使脫靶副作用降至最低。使用γ-分泌酶抑制劑(van Es等人，2005)或合併之Notch1/Notch2阻斷抗體(Wu等人，2010)達成之Notch阻斷之主要不利影響係胃腸功能受損。發現相對於GSI治療，Notch11-13、Notch110-24、Notch11-24引誘物僅誘導極小杯狀細胞化生，且由表現Notch1引誘物之小鼠耐受最多8週(數據未顯示)。
除活性及標靶之差異外，在四個不同腫瘤模型中Notch11-13、Notch110-24、Notch11-24引誘物在限制腫瘤生長方面均有效，且毒性極小。Notch途徑之複雜性及Notch起 作用之過程種類已提供研究並研發廣泛範圍之可以不同方式調節信號傳導途徑並提供癌症療法之新替代方案之治療劑的機會。
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圖1a-1b：截短Notch1引誘物變體之示意圖。圖1a.係Notch1引誘物1-36及Notch1引誘物1-24之示意圖，該等Notch1引誘物各自與Dll4及Jag1二者相互作用並充當泛Notch抑制劑。圖1b.係四個截短Notch1引誘物變體10-36、14-36、10-24及14-24之示意圖。
圖2a-2b：截短Notch1引誘物變體在293T細胞中之表現及分泌。圖2a顯示總細胞溶解產物及上清液之西方墨點法及Notch1引誘物1-13、1-24及1-36之分子量。圖2b顯示總細胞溶解產物及上清液之西方墨點法及Notch1引誘物10-36、14-36、10-24及14-24之分子量。
圖3a-3c：引誘物1-13、1-24及1-36之Notch報告基因分析。圖3a顯示含有多個與螢光素酶基因連接之CSL結合位點之Notch報告基因構築體之示意圖。圖3b顯示表現DLL4之HELA細胞之結果。圖3c顯示表現JAG1之HELA細胞之結果。
圖4a-4b：引誘物10-26、14-36、10-24及14-24之Notch報告基因分析。圖4a顯示表現DLL4之HELA細胞之結果。圖4b顯示表現JAG1之HELA細胞之結果。
圖5a-5b：使用抗Fc或抗FLAG抗體對293T細胞溶解產物實施之免疫墨點法，該等293T細胞溶解產物經Notch1引誘物及可溶性(圖5a)或全長(圖5b)Notch1配體共轉染。
圖6：Notch1引誘物與Notch1之共免疫沈澱。
圖7a-7c：在第P2天注射表現不同Notch1引誘物之腺病毒後對P5小鼠視網膜進行之同工凝集素B4染色。圖7a係對照引誘物、Notch1引誘物1-13、Notch 10-24引誘物及DAPT。圖7b係Fc、Notch1引誘物1-13、Notch1引誘物10-24及Notch1引誘物1-24。在圖7c中定量視網膜之血管區域。平均血管覆蓋區域±S.D.＊ P值<0.05。
圖8a-8d：表現Notch1引誘物之HUVEC之基因表現剖析。圖8a、8b、8c及8d中分別闡述Notch受體(Notch1、Notch2、Notch3及Notch4)之mRNA轉錄物之定量RT-PCR。
圖9a-9b：表現Notch1引誘物之HUVEC之基因表現剖析。圖9a中係HEY1之mRNA轉錄物之定量RT-PCR。圖9b中係HEY2之mRNA轉錄物之定量RT-PCT。
圖10a-10b：表現Notch1引誘物之HUVEC之基因表現剖析。圖10a中係HEYL之mRNA轉錄物之定量RT-PCR。圖10b中係HES1之mRNA轉錄物之定量RT-PCR。
圖11a-11e：表現Notch1引誘物之HUVEC之基因表現剖析。圖11a中係DLL4之mRNA轉錄物之定量RT-PCR；圖11b中係JAG1之mRNA轉錄物之定量RT-PCR；圖11c中係VEGFR-1之mRNA轉錄物之定量RT-PCR；圖11d中係VEGFR-2之mRNA轉錄物之定量RT-PCR；且圖11e中係VEGFR-3之mRNA轉錄物之定量RT-PCR。
圖12a-12c：VEGF受體之流式細胞術。表現VEGFR-1(圖12a)；VEGFR-2(圖12b)及VEGFR-3(圖12c)之Notch引 誘物之HUVEC之直方圖。
圖13a及13b：表現Notch1引誘物之HUVEC之基因表現剖析。圖13a及13b二者中係全長VEGFR-1及可溶性VEGFR-1之mRNA轉錄物之定量RT-PCR。
圖14：在小鼠乳房腫瘤細胞(Mm5MT)、人類胰腺癌細胞(KP1)、小鼠路易斯肺癌細胞(LLC)及小鼠黑色素瘤細胞(B16-F10)中表現之Notch受體及配體之基因表現剖析。
圖15a-15d：Notch引誘物1-13、10-24及1-24對Mm5MT及KP1腫瘤細胞之細胞增殖及凋亡之影響。圖15a係在Mm5MT-FGFT細胞中之腫瘤增殖研究之結果。圖15b係在KP1-VEGF中之增殖研究之結果。在右上象限中指示凋亡細胞之百分比。平均凋亡細胞百分比±S.D.。圖15c係在Mm5MT-FGF4中之凋亡研究之結果。圖15d係在KP1-VEGF中之凋亡研究之結果。
圖16a-16c：圖16a係小鼠血清中之Fc、Notch1引誘物1-13、10-24及1-24之西方墨點法分析，在該等小鼠中經靜脈內注射表現Notch1引誘物1-13、10-24及1-24或作為對照之Fc之腺病毒。圖16b及16c係藉由抗人類IgG Fc抗體免疫染色且經DAP1對比染色之腫瘤切片。比例尺：30微米。
圖17a-17c：圖17a係表現Notch1引誘物1-13、10-24、1-24或作為對照之Fc之小鼠之成像。Notch1引誘物降低Mm5MT腫瘤之生長。藉由使用Xenogen IVIS成像系統評估發光信號之總輻射率來監測腫瘤生長，且結果顯示於圖17b中。在即將收穫腫瘤之前最後一天量測腫瘤重量，且 結果顯示於圖17c中。
圖18a-18c：圖18a係對表現Notch1引誘物1-13、10-24、1-24或作為對照之Fc之小鼠之成像。Notch1引誘物降低KP1腫瘤之生長。藉由使用Xenogcn IVIS成像系統評估發光信號之總輻射率來監測腫瘤生長，且結果顯示於圖18b中。在最後一天即將收穫腫瘤之前量測腫瘤重量，且結果顯示於圖18c中。
圖19a-19b：Notch1引誘物對腫瘤脈管系統之影響。針對內皮黏蛋白(綠色)及Dll4(紅色)對腫瘤切片免疫染色，且結果顯示於圖19a中。腫瘤脈管系統之定量係基於腫瘤切片中之內皮黏蛋白陽性區域，且結果係在圖19b中。
圖20a-20b：腫瘤內皮含量之免疫螢光分析。針對內皮黏蛋白及Dll4對KP1腫瘤免疫染色，且結果顯示於圖20a中。腫瘤脈管系統之定量係基於KP1腫瘤切片中之內皮黏蛋白陽性區域，且結果係在圖20b中。
圖21a-21b：Notch1引誘物對腫瘤脈管系統之影響。在腫瘤收穫之前2分鐘，將螢光黃偶聯之凝集素(100 μg)注射至小鼠中。針對內皮黏蛋白(紅色)及所灌注凝集素(綠色)對腫瘤切片免疫染色，其與腫瘤血管相關。免疫染色之結果係在圖21a中。血管相關凝集素之量反映功能性腫瘤脈管系統，且結果顯示於圖2lb中。
圖22a-22b：針對內皮黏蛋白(綠色)及NG2(紅色)對腫瘤切片共免疫染色，且結果顯示於圖22a中。量測NG2陽性區域之百分比作為腫瘤中之外周細胞募集之參數，且結果 顯示於圖22b中。
圖23a-23c：來自不同Notch引誘物群組之具有發光信號之帶有LLC腫瘤之小鼠在第12天的照片係在圖23a中。基於總輻射率監測腫瘤生長並對其進行定量，且結果顯示於圖23b中。在第12天腫瘤收穫之前量測腫瘤重量，且結果顯示於圖23c中。
圖24a-24c：來自不同Notch引誘物群組之具有發光信號之帶有B16-F10腫瘤之小鼠在第12天的照片係在圖24a中。基於總輻射率監測腫瘤生長並對其進行定量，且結果顯示於圖24b中。在第12天腫瘤收穫之前量測腫瘤重量，且結果顯示於圖24c中。
圖25a-25b：在第12天自帶有LLC腫瘤之小鼠收穫肺及肝，在30 mg/ml D-螢光素中培育並藉由Xenogen IVIS成像系統分析。成像結果顯示於圖25a中。總輻射率結果顯示於圖25b中。
圖26a-26c：在第12天自帶有小鼠B16-F10腫瘤之小鼠收穫肺及肝，在30 mg/ml D-螢光素中培育並使用Xenogen IVIS成像系統分析。Fc群組之肺成像顯示於圖26a及26b中且肝成像顯示於26c中。
圖27a-27c：Notch1引誘物誘導輕度杯狀細胞增生。與泛Notch抑制劑、Notch1引誘物1-24及1-36類似，配體特異性引誘物使杯狀細胞數略微增加。保存小腸之正常結構並與對照相比較。結果顯示於圖27a中。計算每視野之平均杯狀細胞數，且結果顯示於圖27b中。圖27c顯示，帶有腫 瘤之小鼠對Notch1引誘物耐受良好。未觀測到治療群組與對照之重量變化之間有顯著差異。平均重量變化±S.D.(n=5)。
圖28：人類NOTCH1蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)。
圖29：人類Notch1引誘物10-24之核酸序列闡述於SEQ ID NO：2中。人類Notch 1信號肽對應於SEQ ID NO：2之核苷酸1-69，EGF樣重複序列10-24對應於SEQ ID NO：2之核苷酸70-1788，且人類Fc對應於SEQ ID NO：2之核苷酸1789-2502。人類Notch1引誘物10-24之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：3中。
圖30：人類Notch1引誘物10-36之核酸序列闡述於SEQ ID NO：4中。人類Notch 1信號肽對應於SEQ ID NO：4之核苷酸1-69，EGF樣重複序列10-36對應於SEQ ID NO：4之核苷酸70-3243，且人類Fc對應於SEQ ID NO：4之核苷酸3244-3957。人類Notch1引誘物10-36之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：5中。
圖31：人類Notch1引誘物14-24之核酸序列闡述於SEQ ID NO：6中。人類Notch 1信號肽對應於SEQ ID NO：6之核苷酸1-69，EGF樣重複序列14-24對應於SEQ ID NO：6之核苷酸70-1320，且人類Fc對應於SEQ ID NO：6之核苷酸1321-2034。人類Notch1引誘物14-24之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：7中。
圖32：人類Notch1引誘物14-36之核酸序列闡述於SEQ ID NO：8中。人類Notch 1信號肽對應於SEQ ID NO：8之核 苷酸1-69，EGF樣重複序列14-36對應於SEQ ID NO：8之核苷酸70-2775，且人類Fc對應於SEQ ID NO：8之核苷酸2776-3489。人類Notch1引誘物14-36之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：9中。
圖33a-33c：Notch1引誘物變體展示對活體外及視網膜血管生成之獨特影響。圖33a顯示使用HUVEC血纖維蛋白珠粒發芽分析實施之Notch1引誘物評估。7天後，內皮細胞形成管狀結構。表現N11-13引誘物之HUVEC顯示顯著增加之發芽。相比之下，表現N110-24或N11-24引誘物之HUVEC形成較短、較細的芽，與Fc對照相反。在圖33b中定量含有管腔之芽數。芽之平均數量±S.D.＊ P值<0.05。用αSMA對視網膜免疫染色以識別血管平滑肌細胞。N110-24及N11-24引誘物顯著降低沿視網膜動脈之血管平滑肌細胞覆蓋。結果顯示於圖33c中。
圖34a-34c：Notch1引誘物促進內皮細胞遷移。以1.0×105細胞/孔將慢病毒轉導之HUVEC接種於24孔板中，並過夜使其變得融合。然後，在每一孔中製造劃痕，且對遷移至受傷區域中之HUVEC進行拍照(圖34a)，並使用TScratch程式定量。平均遷移率±S.D.＊ P值<0.03(圖34b)。圖34c顯示，Notch1引誘物促進內皮細胞增殖。以1.0×104細胞/孔將經Fc、Notch1引誘物1-13、1-24、1-36或N1IC慢病毒轉導之HUVEC接種於24孔板中。在第1天及第4天定量細胞數。平均細胞數±S.D.＊ P值<0.005。
圖35a-35b：表現Notch1引誘物之HUVEC顯示內皮網絡 及分支增加。圖35a.在24孔板中以1.0×105細胞/孔將HUVEC接種於膠原層之間並培養4天。圖34b.藉由計數分支點數來定量HUVEC形成網絡之能力。HUVEC-N1IC及HUVEC-Notch4/int3由於缺乏適當網絡而不包括在內。分支點之平均數量±S.D.＊ P值<0.005。
圖36：針對Notch配體、JAG1及DLL4之定量即時PCR。與普通培養板或膠原凝膠上之彼等相比，於血纖維蛋白凝膠上培養之HUVEC顯著上調JAG1表現並同時下調DLL4表現。mRNA轉錄物之平均相對值±S.D.＊ P值<0.002。
圖37a-37b：Notch1引誘物1-13、10-24及1-24減少Mm5MTFGF4中之群落形成。圖37a.在24孔板中以3×103細胞/孔將Mm5MT-FGF4、KP1-VEGF、LLC及B16-F10腫瘤細胞接種於半固體瓊脂培養基中，並培養3週。向培養物中添加3 mg/ml之MTT以使群落可視化。圖37b.對群落區域實施定量。群落區域之平均百分比±S.D.＊ P值<0.001。
圖38：Notch1引誘物阻斷異種移植腫瘤生長。使用經皮下注射至裸小鼠中之Mm5MT-FGF4、KP1-VEGF、LLC或B16-F10評估腫瘤生長。腫瘤移植後3天經靜脈內注射編碼不同Notch1引誘物變體之Ad。在Notch1引誘物治療群組中腫瘤顯著較小。在收穫時量測腫瘤重量。平均腫瘤重量±S.D.＊ P值<0.05(n=4-5)。
圖39a-39c：Notch1引誘物1-24及1-36類似地降低Mm5MT-FGF4(圖39a)及KP1-VEGF腫瘤(圖39b)之生長。 自長度(L)及寬度(W)計算腫瘤體積(V)(V=0.5×L×W)，其係每週量測一次。平均腫瘤體積±S.D.＊ P值<0.05。Notch1引誘物1-24及1-36顯著減少腫瘤脈管系統。CD31免疫螢光顯示Notch1引誘物群組中腫瘤的血管含量降低且結構被破壞。比例尺：30微米。數據顯示於圖39c中。
圖40a-40b：Notch1引誘物阻斷異種移植腫瘤生長。圖40a顯示，Notch11-13引誘物阻斷Dll4/Notch活性且使腫瘤脈管系統增加，而Notch110-24或Notch11-24引誘物減少所有腫瘤模型中之腫瘤血管。藉由內皮黏蛋白免疫螢光(綠色)分析腫瘤脈管系統。圖40b顯示對圖40a影像中來自多個腫瘤切片之內皮黏蛋白陽性區域定量之數據。內皮黏蛋白陽性區域之平均百分比±S.D.＊ P值<0.003(n=4-5)。比例尺：30微米。
圖41a-41c：Notch1引誘物破壞腫瘤血管生成，減少灌注並誘導缺氧。針對內皮黏蛋白(紅色)及所灌注凝集素(綠色)對注射螢光黃偶聯之凝集素之小鼠之腫瘤切片免疫染色。內皮黏蛋白相關之凝集素之量反映功能性腫瘤脈管系統及正常灌注。用APC偶聯之抗缺氧探針抗體(紅色)及DAPI(藍色)對腹膜內注射缺氧探針之小鼠之腫瘤切片免疫染色，並針對腫瘤缺氧定量。數據顯示於圖41a中。凝集素陽性區域之平均百分比±S.D.＊ P值<0.006(n=4-5)顯示於圖41b中。缺氧探針陽性區域之平均百分比±S.D.＊ P值<0.002，＊＊ P值<0.05(n=4-5)顯示於圖41c中。引誘物治療小鼠之腫瘤顯示缺氧及壞死顯著增加。比例尺：30微 米。
圖42a-42c：Notch1引誘物破壞腫瘤血管生成。Mm5MT-FGF4腫瘤切片之IV型膠原(紅色)及內皮黏蛋白(綠色)免疫螢光。IV型膠原之存在與腫瘤脈管系統相關，此表明Notch1引誘物抑制腫瘤血管生成，而不引起血管消退。影像顯示於圖42a中。平均IV型膠原陽性區域及平均內皮黏蛋白陽性區域±S.D.分別顯示於圖42b及42c中。＊ P值<0.002。
圖43a-43d：靶向JAG1之Notch1引誘物破壞腫瘤中之壁性細胞-內皮細胞相互作用。針對內皮黏蛋白(綠色)及NG2(紅色)對腫瘤切片共免疫染色。影像顯示於圖43a中。比例尺：10微米。量測NG2陽性區域之百分比作為腫瘤中外周細胞覆蓋之參數。內皮黏蛋白或NG2陽性區域之平均百分比±S.D.分別顯示於圖43a及43b中。圖43d顯示NG2陽性/內皮黏蛋白陽性區域＊ P值<0.02(n=4-5)。
圖44：靶向JAG1之Notch1引誘物破壞腫瘤中之壁性細胞-內皮細胞相互作用。針對內皮黏蛋白(綠色)及αSMA(紅色)對腫瘤切片共免疫染色。覆蓋有血管平滑肌細胞之大血管通常位於腫瘤周邊。比例尺：10微米。
圖45：針對Notch下游標靶HEY1、HEY2、HEYL、HES1對表現N1引誘物或JAG1 shRNA之HUVEC進行之定量RT-PCR。
圖46：針對VEGF受體對表現Notch1引誘物或JAG1 shRNA之HUVEC進行之定量RT-PCR及流式細胞術。
圖47a-47b：圖47a顯示針對VEGF受體對表現Notch1引誘物之HUVEC或之HUVEC進行之定量RT-PCR。圖47b顯示可溶性VEGFR-1之酶聯免疫吸附分析之結果。
圖48a-48b：對腫瘤切片之VEGFR-1免疫螢光證實，N110-24引誘物及1-24促進可溶性VEGFR-1表現。免疫螢光影像顯示於圖48A中。平均VEGFR-1陽性區域±S.D.顯示於圖48b中。＊ P值<0.02。比例尺：30微米。
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Claims (38)

  1. 一種包含連續胺基酸之融合蛋白，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白之N端，並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域(i)以存在於EGF樣重複序列10之N端之胺基酸開始，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列23之C端胺基酸。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域延伸至EGF樣重複序列24之C端胺基酸。
  3. 如請求項1之融合蛋白，其中該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域延伸至EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
  4. 如請求項1至3中任一項之融合蛋白，其中該抗體之該Fc部分係人類抗體之Fc部分。
  5. 如請求項2之融合蛋白，其中該等連續胺基酸之序列包含SEQ ID NO：3中所述之序列，其以24位置之胱胺酸開始並以833位置之離胺酸結束。
  6. 如請求項3之融合蛋白，其中該等連續胺基酸之序列包含SEQ ID NO：5中所述之序列，其以24位置之胱胺酸開始並以1318位置之離胺酸結束。
  7. 如請求項1之融合蛋白，其中(a)該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域位於信號肽之後。
  8. 如請求項7之融合蛋白，其中該信號肽係人類Notch 1蛋白之信號肽或IgG重鏈之信號肽。
  9. 如請求項8之融合蛋白，其中連續胺基酸之該序列係闡述於SEQ ID NO：3中。
  10. 如請求項8之融合蛋白，其中連續胺基酸之該序列係闡述於SEQ ID NO：5中。
  11. 一種組合物，其包含如請求項1至6中任一項之融合蛋白及載劑。
  12. 如請求項11之組合物，其中該融合蛋白係以有效抑制JAG1之活性之量存在於醫藥上可接受之載劑中。
  13. 一種治療患有老年性黃斑病變(AMD)之個體之方法，其包含以有效治療該個體之AMD之量向該個體投與如請求項1至6中任一項之融合蛋白。
  14. 如請求項13之方法，其中該AMD係濕性AMD。
  15. 如請求項13之方法，其中該AMD係乾性AMD。
  16. 一種治療患有糖尿病視網膜病變之個體之方法，其包含以有效治療該個體之糖尿病視網膜病變之量向該個體投與如請求項1至6中任一項之融合蛋白。
  17. 如請求項13至16中任一項之方法，其進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)之抑制劑。
  18. 如請求項17之方法，其中該VEGF之抑制劑係VEGF-A、PGIF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D之抑制劑。
  19. 如請求項13至16中任一項之方法，其進一步包含投與VEGF受體抑制劑。
  20. 如請求項19之方法，其中該VEGF受體抑制劑係VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
  21. 一種治療患有癌症之個體之方法，其包含以有效治療該個體之癌症之量向該個體投與如請求項1至6中任一項之融合蛋白。
  22. 如請求項21之方法，其中該癌症係胰腺癌。
  23. 如請求項21之方法，其中該癌症係乳癌。
  24. 一種治療患有老年性黃斑病變(AMD)之個體之方法，其包含以有效治療該個體之AMD之量向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含連續胺基酸，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白之N端，並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域(i)包含存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸，限制條件係若該N端胺基酸係EGF樣重複序列1之N端胺基酸，則該C端胺基酸並非EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
  25. 如請求項24之方法，其中該AMD係濕性AMD。
  26. 如請求項24之方法，其中該AMD係乾性AMD。
  27. 一種治療患有糖尿病視網膜病變之個體之方法，其包含以有效治療該個體之糖尿病視網膜病變之量向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含連續胺基酸，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白之N端，並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域(i)包含存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸，限制條件係若該N端胺基酸係EGF樣重複序列1之N端胺基酸，則該C端胺基酸並非EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
  28. 如請求項24至27中任一項之方法，其進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)之抑制劑。
  29. 如請求項28之方法，其中該VEGF之抑制劑係VEGF-A、PGIF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D之抑制劑。
  30. 如請求項24至27中任一項之方法，其進一步包含投與VEGF受體抑制劑。
  31. 如請求項30之方法，其中該VEGF受體抑制劑係VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
  32. 一種治療患有癌症之個體之方法，其包含以有效治療該個體之癌症之量向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含連續胺基酸，該等連續胺基酸開始於該融合蛋白 之N端並對應於存在於以下中之連續胺基酸：(a)人類Notch1受體蛋白之細胞外結構域，之後為(b)抗體之Fc部分，其中該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域(i)包含存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸，並(ii)至少延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸，限制條件係若該N端胺基酸係EGF樣重複序列1之N端胺基酸，則該C端胺基酸並非EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
  33. 如請求項32之方法，其中該癌症係胰腺癌。
  34. 如請求項32之方法，其中該癌症係乳癌。
  35. 如請求項24至34中任一項之方法，其中該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域以存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸開始並延伸至EGF樣重複序列23之C端胺基酸。
  36. 如請求項24至34中任一項之方法，其中該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域以存在於EGF樣重複序列9之N端之胺基酸開始並延伸至EGF樣重複序列36之C端胺基酸。
  37. 如請求項24至34中任一項之方法，其中該人類Notch1受體蛋白之該細胞外結構域以存在於EGF樣重複序列1之N端之胺基酸開始並延伸至EGF樣重複序列13之C端胺基酸。
  38. 如請求項24至34中任一項之方法，其中該人類Notch1受 體蛋白之該細胞外結構域以存在於EGF樣重複序列1之N端之胺基酸開始並延伸至EGF樣重複序列24之C端胺基酸。
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