TW201345551A - 流行性感冒抗原遞送載體和構築體 - Google Patents

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Carlton B Brown
Bertrand Georges
Philip J Sizer
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Immune Targeting Systems Its Ltd
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Abstract

本發明係關於用於向免疫反應性標靶細胞遞送流行性感冒抗原之碳氟化合物載體。本發明進一步係關於碳氟化合物載體-流行性感冒抗原構築體及該等與抗原締合之載體在動物(包括人類)體內用作疫苗及免疫治療劑之用途。

Description

流行性感冒抗原遞送載體和構築體
本發明係關於用於向免疫反應性標靶細胞遞送流行性感冒抗原之碳氟化合物載體、碳氟化合物載體-流行性感冒抗原構築體、及該等與抗原締合之載體在動物體內用作疫苗及免疫治療劑之用途。
流行性感冒為由流行性感冒病毒引起之疾病或感染的通用術語。流行性感冒病毒為病毒之正黏病毒(Orthomyxoviridae)家族成員且包含兩個屬：A型及B型流行性感冒病毒，及C型流行性感冒病毒。A型、B型及C型流行性感冒病毒基於其內部核蛋白及基質蛋白區分，其對各病毒型為特異的。A型流行性感冒病毒能天然感染一定範圍之動物物種，包括人類、豬、鳥、海豹及馬。然而，B型流行性感冒病毒僅感染人類，而C型流行性感冒病毒感染人類及豬。A型流行性感冒病毒進一步分類為由表面醣蛋白(血球凝集素(H)及神經胺糖酸酶(N))之抗原性決定的子類。
歷史上，A型流行性感冒人類感染由3種血球凝集素子類(H1、H2及H3)及兩種神經胺糖酸酶子類(N1及N2)引起；最近亦報導先前僅限於禽類之子類H5、H7及H9引起之人類感染。迄今已識別出總共16種不同血球凝集素及9種神經胺糖酸酶A型流行性感冒子類；此等均僅在鳥類中流行。豬及馬與人類一樣，限於更狹窄之子類範圍。
A型及B型流行性感冒病毒粒子在結構上為多形的，球形實例直徑為80-120nm，而絲狀形式長度可高達300nm。每個粒子存在約500個包埋於 宿主產生之脂質雙層膜中的表面刺突醣蛋白(一般為4至5個血球凝集素蛋白比1個神經胺糖酸酶之比率)。在膜內為跨膜粒子通道蛋白M2，而結構蛋白M1在雙層之下。在病毒核內，單股陰性有義RNA與6種其他自其染色體組表現之病毒蛋白締合：核蛋白(nucleoprotein，NP)、三種轉錄酶(PB2、PB1及PA)及兩種非結構蛋白(NS1及NS2)。流行性感冒病毒染色體組包含8個片段；使能進行「基因交換(gene swapping)」再分類之特徵。血球凝集素使病毒能夠與宿主細胞受體結合且在病毒將複製時促進其進入細胞。神經胺糖酸酶蛋白酶促裂解末端唾液酸殘基，且咸信其幫助病毒傳遞穿過呼吸道黏液素層以及促進後代病毒遠離宿主細胞出芽。對人類呈現較少健康風險之C型流行性感冒病毒具有單個表面蛋白，該蛋白組合有血球凝集素融合活性及受體破壞活性。
由於易於出錯之RNA聚合酶，流行性感冒病毒之血球凝集素及神經胺糖酸酶蛋白兩者易於點突變，此不一定會影響病毒複製之能力。該由宿主抗體反應鑑別之位點中之一者處的突變(或重合突變)可導致由疫苗接種或先前感染誘發之宿主抗體不能有效結合「新(new)」病毒株，藉此使得持續感染。因為人類流行性感冒病毒株經由此等點突變持續進化，所以病毒能逃逸人類免疫反應之有限抗體譜且引起流行病。流行性感冒感染之規則「季節性(seasonal)」發作因此由經歷抗原漂移之人群中之流行病毒株引起。
在季節性流行期間，流行性感冒可在世界範圍迅速傳播且就醫院而言造成顯著經濟負擔及其他護理成本及生產力損失。病毒以空氣中之液滴形式自人類傳播至人類且靶向上呼吸道的氣管及支氣管中之上皮細胞。流行性感冒病毒亦可自受污染表面獲得且傳至口中。疾病尤其在擁擠環境中藉由咳嗽及打噴嚏極其迅速傳播。低相對濕度及低溫有利於病毒穩定性且因此溫帶地區的季節流行傾向於在冬季出現。觀測到A型流行性感冒病毒株 的較高發病率及死亡率，而B型流行性感冒一般與較低侵襲率及輕度疾病有關。然而，B型流行性感冒有時可能會引起與A型病毒相同嚴重程度的流行病。B型流行性感冒主要為兒童期病原體且一般不展現與A型相同程度之抗原性變異。
典型簡單流行性感冒感染特徵為迅速發生疾病(頭痛、咳嗽、寒戰)，隨後發熱，喉嚨痛、顯著肌肉痛、不適及失去食慾。其他症狀可包括鼻溢、胸骨下發緊及眼部症狀。最顯著感染病徵為一般38-40℃溫度範圍內的發熱。儘管多數人將無需任何醫學治療在1至2週內自流行性感冒感染恢復，但對於群體之某些成員而言疾病可存在嚴重風險。該等個體包括極年輕者、老年人及罹患諸如肺病、糖尿病、癌症、腎病或心臟問題之醫學病況者。在此「風險(at risk)」人群中，感染可導致潛在疾病、細菌性肺炎(由諸如肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之呼吸病原體引起)的嚴重併發症及死亡。流行性感冒感染之臨床特徵在兒童中類似，儘管其發熱可能較高且可能發生熱性驚厥。此外，兒童具有較高之嘔吐及腹痛發生率以及中耳炎併發症、哮吼及肌炎。
世界衛生組織(World Health Organization)估算每年流行性感冒流行病中有5-15%群體受上呼吸道感染影響。高風險群體(老年人及慢性病)中主要住院治療及死亡。儘管難以評估，但認為此等每年流行病在全世界範圍內每年導致3,000,000與5,000,000例之間的嚴重疾病及約250,000與500,000例之間的死亡。在工業化國家中在超過65歲老年人中，目前90%以上死亡與流行性感冒有關。在美國，CDC估算平均每年超過200,000人在季節性流行性感冒感染引起的併發症後住院治療，其中記錄有超過約36,000例死亡。
控制自流行性感冒感染恢復之宿主免疫反應由針對表面蛋白之血清抗 體、黏膜分泌之IgA抗體及細胞介導之免疫反應的組合賦予。初次感染後約1至2週，血清中可偵測到中和血球凝集抑制(HAI)抗體以及針對神經胺糖酸酶之抗體，峰值在約3至4週時。再感染後，抗體反應更迅速。流行性感冒抗體可持續數月或數年，儘管在一些高風險群體中抗體含量在疫苗接種數月內可能開始下降。分泌性IgA抗體峰在感染後約14天，且可在唾液、鼻腔分泌物、痰液及氣管洗液中偵測到。在出現產生抗體之細胞之前，出現對流行性感冒具有特異性之細胞毒性T淋巴細胞，且藉由減少最大病毒負荷來限制感染，同時藉由誘發抗病毒細胞介素介導更迅速之病毒清除及溶解感染之細胞。此外，單核細胞滲入感染之氣道，提供針對流行性感冒感染之細胞的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。
迄今為止，針對呼吸道病毒感染(諸如流行性感冒)之疫苗法基本上依賴於誘發抗體，該抗體可藉由中和病毒粒子或阻斷病毒進入細胞進行保護免於病毒感染。此等體液免疫反應靶向對於給定病毒株為保守之外部病毒表面蛋白。抗體介導之保護因此以血清學上顯著之表面蛋白有效針對同源病毒株，但不足以針對異源病毒株。此差別具有意義，因為許多病毒之表面蛋白能迅速突變；例如有效的針對流行性感冒病毒形式之基於體液反應之疫苗針對下一季季節變異體可能無效。
目前存在兩種主要類型之得到許可之流行性感冒疫苗。一組疫苗含有病毒之血球凝集素及神經胺糖酸酶表面蛋白作為活性免疫原。此等包括完全滅活病毒疫苗、因清潔劑處理而破裂之滅活病毒粒子組成之裂解病毒疫苗、基本上由已移除其他病毒組份之純化表面蛋白組成之次單位疫苗及表面蛋白呈現於脂質表面上的病毒顆粒。第二組包含減毒、適冷之活病毒株。對於所有此等疫苗而言，需要一般來自3或4種病毒株之表面抗原的摻合物；目前市售流行性感冒疫苗含有來自兩種A子類(H3N2及H1N1)及一種B型病毒之抗原。分別在每年的9月及2月，WHO全球流行性感冒計劃 (WHO Global Influenza Program)推薦用於下一季之流行性感冒疫苗之組合物，該下一季在南半球一般在5-6月開始且在北半球在11-12月開始。組合物基於來自國家流感中心(national influenza centre)及WHO合作中心(WHO collaborating centre)的世界網路之監視資料且嘗試覆蓋9個月後將流行之可能病毒株。為此原因，責成製造商在每年的基礎上改變流行性感冒疫苗之組合物以確保實現流行病毒株之精確匹配。
多數滅活流行性感冒疫苗在三角肌內經由肌肉內途徑給藥，嬰兒除外，其推薦部位為大腿前外側。每年一次給予滅活疫苗為適當的，例外為先前未經疫苗接種的先前存在醫學病況之學齡前兒童，其至少隔一個月接受兩次給藥。活減毒流行性感冒疫苗(LAIV)經鼻內遞送。此等在俄羅斯市售數年，且最近特許用於美國小兒人群。該等疫苗能在鼻上皮表面引起局部抗體及細胞介導之免疫反應。然而，活減毒流行性感冒疫苗未經許可用於美國老年人群(超過50歲)。
為增強發動於流行性感冒病毒表面蛋白之免疫反應之廣度及強度，已評估各種佐劑及替代免疫增效劑以將其容納於疫苗調配物中。本文中之佐劑為能調節針對共同投予之抗原的免疫反應，而單獨給藥時具有少量(若存在)直接作用之試劑。流行性感冒疫苗領域中新近許可之研發包括MF-59，其為亞微米水中油乳液。一些製造商亦使用含鋁佐劑。此等佐劑意為擴增針對所投予抗原之所得血清抗體反應。
假設疫苗株與一般群體中流行之彼等之間存在良好抗原性匹配，則滅活流行性感冒疫苗預防約70%-90%健康成人體內實驗室確認之疾病。然而，CDC表明老年人(超過65歲)體內之疫苗功效可低至30-40%。此方面之相關性為人類之老化在記憶性T細胞反應中形成缺陷的報告，該等缺陷可降低疫苗功效且增加天然感染之風險。此外，社區(community based)背景的臨床研究證明細胞介導之免疫性而非體液免疫性與超過60歲組之流 行性感冒疾病保護有關。
此外，若疫苗株與流行病毒株抗原性不同，則功效率(efficacy rate)顯著下降。抗原性變異研究已表明A型流行性感冒血球凝集素之至少兩個抗原位點的4個或4個以上胺基酸取代導致足夠離散之漂移變異來破壞疫苗功效(Jin H,Zhou H,Liu H,Chan W,Adhikary L,Mahmood K，等人.「Two residues in the hemagglutinin of A/Fujian/411/02-like influenza viruses are responsible for antigenic drift from A/Panama/2007/99.」Virology.2005；336：113-9)。在2003-04季期間一患有實驗室確認之流行性感冒的50-64歲成人之病例控制性研究(case controlled study)中，當疫苗與流行性A/H3N2病毒株未良好匹配時，根據CDC，疫苗效用在健康個體中經估算為52%，且在彼等具有一或多個高風險病況者中為38%。錯配之可能性由有限機率製造窗；自病毒株確認經晶種製造來製造抗原及純化之時間產生，且三價摻合與產品填充通常必須在少於6個月內全部發生。
有時，新穎流行性感冒病毒株以高致病性及抗原新穎性在群體中萌發，此導致世界範圍之流行病。大流行性感冒(Pandemic influenza)為表面蛋白中抗原漂移之結果，且代表對全球健康之嚴重威脅，因為個體尚未發展出預先存在之免疫性。流行性病毒株特徵為其在群體中突然萌發及其抗原新穎性。在二十世紀期間，發生四次流行病；1918年之致病性病毒株為H1N1，在1957年為H2N2，在1968年為H3N2且在1977年為H1N1。
存在三種針對出現抗原漂移之替代性解釋。第一，由於流行性感冒病毒染色體組為分段的，因此兩種流行性感冒病毒株可在共同感染單個宿主(例如，豬)時交換其基因，導致構造出攜帶不同親本病毒之遺傳資訊的有複製能力後代。咸信此稱為遺傳再分類之過程為1957年及1968年流行病的起因。當H3血球凝集素基因及來自禽類供體之另一內部基因以N2神經胺糖酸酶及來自已流行之H2N2人類病毒株的5個其他基因再分類時，引起 1968年的流行病。其次，非人類流行性感冒病毒株獲得感染人類之能力。當禽類H1N1病毒株突變以使其能迅速且有效自人類轉移至人類時，引起1918年之流行病。第三，先前已引起流行病之病毒株在人類群體內可保持隔離及未改變。例如，1977年之H1N1流行病病毒株與27年前引起流行病之病毒株基本上相同，且在居間年份中在人類及動物儲集層中未偵測到。
一旦滿足三個主要準則，則受到流行性感冒流行病威脅：
1.未見於人類群體中至少一代中的HA子類之流行性感冒病毒萌發(或再萌發)。
2.病毒在人體內有效感染及複製，引起嚴重疾病。
3.病毒在人類之間迅速且保持一定速度傳播。
全球流行病一年可折磨20%與40%之間的世界人口。例如，1918-19之流行病影響全世界200,000,000人口，殺死超過30,000,000人。在美國，超過500,000個體死亡，其代表0.5%人口。儘管自那時起衛生保健已顯著改良，其中疫苗及抗病毒療法正在開發，但是CDC估算目前之流行病將會導致全球2,000,000至7,000,000例死亡。
自1999年起，三種不同流行性感冒子類病毒株(H5N1、H7N7及H9N2)已自禽類物種跨越至人類，其均引起人類死亡。如2007年8月14日，全世界記錄到總共320個H5N1高致病性禽流感病毒(Highly Pathogenic Avian Influenza Virus，HPAIV)感染之人類病例，其中193例死亡。
與感染在多數健康人體內僅引起輕微呼吸道症狀之常見季節性流行性感冒不同，由H5N1引起之疾病遵循具有迅速惡化及高死亡率的不常見侵略性臨床過程。原發性病毒性肺炎及多器官衰竭為常見的。重要的是，多數病例已在先前健康之兒童及青壯年中發生。在引起症狀之前，H5N1 HPAIV比其他人類流行性感冒病毒培養更長時間，在一些病例中高達8天。在家庭群組病例(clusters of case)中，介於各病例之間的時間一般在2天至5天 範圍內，但據報導耗時長達17天。
H5N1 HPAIV感染之最初症狀更可能包括腹瀉且可在任何呼吸道症狀之前出現長達1週。此特徵與糞便樣本中之病毒RNA的偵測組合表明病毒可在胃腸道內繁殖。在疾病過程早期出現下呼吸道症狀(諸如呼吸短促)，而上呼吸道症狀(諸如，鼻溢(rhinorrheoa))較不常見。
H5N1 HPAIV目前滿足流行病所需條件中之兩者；H5血球凝集素代表人類之新抗原。若萌發H5N1樣流行病病毒則無人具有免疫性。此外，病毒已感染超過300個人，表觀死亡率超過60%。
因此滿足開始流行病之所有前提，其中一者除外：確立有效且持續之人類至人類病毒傳播。只要出現人類感染之機會，則H5N1病毒獲得此能力之風險將持續。咸信此經由逐步突變或經由以人類適用病毒株再分類具有現實可能性。
在科學層次下，在病毒株可準備好人類至人類傳播且開始流行之前，病毒表型之一或多個改變為必要的。然而，多項新近觀測，包括來自土耳其(Turkey)的新近人類分離株中偵測到之特異性突變，流行病毒對哺乳動物增加之致病性，H5N1 HPAIV宿主範圍擴展以包括其他哺乳動物，諸如先前認為對禽流感病毒感染具有抗性之老虎及貓，所有均表明H5N1病毒繼續發展可最終促進人類至人類傳播的能力。
亦可能萌發具有更大可能之流行病潛力之其他流行性感冒病毒。此等包括許多H9及H7病毒株，其近年來亦傳播至人類。H9病毒現為亞洲家禽的地方病且在中國東南部及東部亦有效跨越至豬群體。有意義的是，H9N2病毒株具有典型人類樣受體特異性且具有廣泛宿主範圍。
在2003年早期，H7N7 HPAIV在荷蘭家禽中出現爆發。在至少82個病例中出現H7N7病毒的鳥至人類傳播。結膜炎為感染H7病毒株的人中最常見之疾病症狀，其中僅7例展示典型流行性感冒樣疾病。病毒未證實對人 類具有高度致病性且僅觀測到1例致命病例。具有流行病潛力之其他病毒為彼等H2子類(因為其既往史為流行病病毒)及H6(由於其在亞洲及北美家禽物種中之高發病率)。
此表明新人類流行性感冒流行病之威脅並非僅與HPAI H5N1之萌發有關。
在針對流行性感冒流行病之準備中，已進行多種候選物H5N1流行性感冒疫苗的臨床試驗。此等已一致展示，為了產生預測為保護性之血清抗體反應，需要比季節性疫苗通常所用高得多量之血球凝集素抗原之多次給藥或包含佐劑。此為群體對H5血球凝集素免疫學上未感染之直接反映。目前，流行之流行性感冒疫苗可用之僅有選擇物因此為具有極高HA含量者(此將嚴格限制可產生之給藥次數)或使用多數國家目前未許可之佐劑。亦應瞭解與流行病病毒株匹配之疫苗在人體內首次分離後將耗時許多月來製造；流行病萌發前製造之儲存疫苗將最可能為抗原不相同的且因此僅提供(若存在)有限之保護。抗原漂移之證據在最近爆發之H5N1已顯而易見。
總之，季節性及流行之流行性感冒疫苗明確需要改良：
1.尤其在未經初免之個體中，其功效存在明顯限制。對於由抗原漂移產生之流行性感冒流行病的前景而言，此尤其受到關注。
2.對能準確預測在下一秋季/冬季可能流行之流行性感冒病毒株之依賴性。疫苗病毒株與彼等實際上引起感染者之間的錯配將使得顯著比例之群體易受流行性感冒影響。
3.因為病毒經歷抗原漂移，所以風險組需要以每年為基礎再次接種疫苗。
4.因為全世界僅存在有限數目之潛在生物學製造工廠，所以生產能力受限。
5.提供給老年組之保護受限於習知疫苗。
改良類別之流行性感冒疫苗因此較佳為在老年(處於風險中之)組中具有增強之功效的合成的，穩定的，有效針對所有A型流行性感冒的病毒株(包括潛在流行病病毒株)。
T細胞在針對流行性感冒疾病之保護中的作用
儘管習知流行性感冒疫苗技術主要關注對病毒表面蛋白之抗體反應，但此等蛋白常遭受可破壞功效且形成所述邏輯漏洞之抗原漂移及遷移。相反，介導細胞免疫反應之T細胞可靶向在異源病毒株及進化枝上更高度保守之蛋白質。此特性使得誘發保護性細胞免疫反應的疫苗具有針對異源病毒株及分化枝進行保護之潛力(異源子類免疫性)。對流行性感冒病毒而言，PB1、PB2、PA、NP、M1、M2、NS1及NS2蛋白之保守及相應抗原特異性CD4+及CD8+ T細胞之持續使此等蛋白成為有吸引力的疫苗標靶。
保護性抗病毒細胞介導之免疫性由1型CD4+ T-輔助淋巴細胞(Th1)支持的導致免疫效應機制活化之1型反應之誘發組成，包括誘發及維持細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)以及免疫刺激細胞介素(諸如IFN-γ及IL-2)。CD4+ T輔助細胞主要負責在鑑別與主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex，MHC)II類分子結合之抗原性T細胞肽抗原決定基後藉由直接細胞-細胞相互作用或藉由分泌細胞介素輔助其他免疫細胞。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)通常表現CD8且誘發細胞之溶解或細胞凋亡(細胞毒性T淋巴細胞在該等細胞上鑑別由MHC I類分子呈現之外來抗原)，提供針對胞內病原體(諸如病毒)之防禦。此表型及功能之締合併非絕對，因為CD4+細胞可展現細胞毒性活性，而CD8+細胞分泌抗病毒細胞介素，尤其干擾素-γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子。實際上，已提出CD4+ CTL活性為控制人體內急性及慢性病毒感染的另一免疫機制。CD4+ CTL可藉由直接抗病毒細胞溶解作用控制病毒傳播且可藉由產生諸如IFN-γ之抗病毒細胞介素發揮直接抗病毒活性。已知IFN-γ對病毒產生具 有直接抑制作用及非細胞毒性作用。CD4+ T輔助細胞在測定B細胞抗體反應及類別轉換中，且在使吞噬細胞(諸如，巨噬細胞)之滅菌活性最大化中亦為必要的。
咸信細胞免疫反應在控制流行性感冒感染、改善疾病病徵及促進疾病恢復中起重要作用。在天然感染後引起流行性感冒特異性細胞免疫性且已識別出若干病毒蛋白質為人類記憶性異源子類T細胞反應之標靶，包括核蛋白(NP)、聚合酶(PB1、PB2及PA)、M1及M2蛋白及非結構蛋白-1(NS1)。亦可包含NS2。此等內部蛋白含有高度保守且免疫顯性區域，使其成為理想T細胞標靶。詳言之，實驗性研究已展示，流行性感冒-A NP表示小鼠及人類體內子類特異性及交叉反應性CTL的重要標靶抗原。此與血球凝集素(HA)及神經胺糖酸酶(NA)相反，該兩者由於流行性感冒子類內及之間的高度序列可變性而為不合適之標靶。
更特定言之，細胞介導之免疫性強力牽涉於針對流行性感冒疾病(包括高度致病性病毒株)之保護中。記憶性CD4+及CD8+ T細胞存在於肺氣道中且證據表明此等細胞藉由在病原體負荷低時介導病原體接合於感染部位對流行性感冒激發產生肺免疫性中起一定作用。CD8+ T細胞之耗盡降低經初免小鼠對流行性感冒感染起反應之能力，此表示CD8+ T細胞在保護性二次反應中之作用。因為病毒複製限於呼吸道上皮中之細胞，所以CD8+ T細胞在此部位發揮其效應功能，產生抗病毒細胞介素且溶解呈現病毒決定子之標靶細胞(該等標靶細胞攜帶對病毒決定子具有特異性之T-細胞受體)。受感染上皮細胞之溶解係藉由含有穿孔素及顆粒酶之胞吐作用顆粒以及Fas機制介導。(Thomas PG,Keating R,Hulse-Post DJ,Doherty PC.「Cell-mediated protection in influenza infection.」Emerg Infect Dis.2006年1月；12(1)：48-54)。
對流行性感冒之劇烈CD4+ T細胞反應在引流淋巴結中起始，隨後在脾 臟中，且其在感染後第6-7天在肺及支氣管肺泡分泌中達到峰值。雖然此對流行性感冒感染之初級CD4 T-細胞反應之量值小於CD8反應，但其已展示涉及穩固CD4+擴展，Th-1分化及其向感染部位之遷移。CD4+ T輔助細胞對流行性感冒感染的持久及有效CD8記憶性亦為必要的。CD4效應T細胞及記憶性反應經由多種機制有助於針對流行性感冒之免疫性，包括其在產生流行性感冒特異性CD8+ CTL反應期間作為輔助子之傳統貢獻，其驅使IgG2a中和傳染性病毒粒子之能力，及其藉由分泌IFN-γ直接的抗病毒活性。CD4+及CD8+ T-細胞抗原決定基兩者皆已展示促進病毒清除且在小鼠體內賦予針對流行性感冒激發之保護。
A型流行性感冒病毒之小鼠模型提供分析T細胞介導之免疫性的實驗系統。詳言之，對流行性感冒感染之T細胞免疫反應已在C57BL/6(H2b)及Balb/C(H2d)小鼠及其雜交物中充分表徵。Plotnicky等人.(Plotnicky H,Cyblat-Chanal D,Aubry JP,Derouet F,Klinguer-Hamour C,Beck A,Bonnefoy JY,Corva A「The immunodominant influenza matrix T cell epitope recognized in human induces influenza protection in HLA-A2/K(b) transgenic mice.」Virology.2003年5月10日；309(2)：320-9.)論證流行性感冒基質蛋白(M1)抗原決定基58-66對致死轉殖基因鼠科動物激發的保護性功效。保護係由T細胞介導，因為保護在CD8+及/或CD4+ T-細胞活體內耗盡後廢除。小鼠存活與肺中之M1-特異性T-細胞有關，其對流行性感冒激發後之流行性感冒感染的細胞直接具有細胞毒性。Woodland等人(Crowe SR,Miller SC,Woodland DL.「Identification of protective and non-protective T cell epitopes in influenza.」Vaccine.2006年1月23日；24(4)：452-6)亦表明單個CD4+ T細胞抗原決定基HA(211-225)可在疫苗接種小鼠體內賦予對病毒感染之部分控制。
儘管T細胞標靶相較於流行性感冒病毒表面蛋白B細胞抗原決定基傾向於較不易於頻繁突變，但CD8+及CD4+ T細胞抗原決定基亦將在保護性 免疫壓力下隨時間突變(Berkhoff EG,de Wit E,Geelhoed-Mieras MM,Boon AC,Symons J,Fouchier RA,Osterhaus AD,Rimmelzwaan GF.「Fitness costs limit escape from cytotoxic T lymphocytes by influenza A viruses.」Vaccine.2006年11月10日；24(44-46)：6594-6.)。此逃逸可能由病毒與高度多型人類白血球抗原(HLA)I類及II類蛋白之間的對抗產生，其分別決定抗原加工及對宿主CD8+及CD4+ T-細胞的抗原決定基呈現。此病毒逃逸機制已針對HIV及HCV更明確確立，且已知符合病毒之進化。因此，具有低固有變異性(熵值)之高度保守之肽序列的選擇為可特異性對抗抗原漂移及遷移之T-細胞疫苗設計中待考慮之重要因子。該等方法已由Berkhoff等人(Berkhoff EG,de Wit E,Geelhoed-Mieras MM,Boon AC,Symons J,Fouchier RA,Osterhaus AD,Rimmelzwaan GF「Functional constraints of influenza A virus epitopes limit escape from cytotoxic T lymphocytes」J Virol.2005年9月；79(17)：11239-46.)描述。
65歲以上的成人目前占所有流行性感冒相關性死亡率的約90%。此亦為目前疫苗最不有效的標靶組。在人類中，老化看似與自記憶性子群產生T-細胞效應子之能力下降有關。老年人疫苗接種後體內已觀測到中心記憶性CD4+ T-細胞的增加之頻率及效應記憶性CD4+ T細胞的降低之頻率，此可能與血清IL-7降低之含量有關。老年個體亦表明與IgG1反應直接相關之對流行性感冒疫苗接種之1型T細胞弱反應。此外，小鼠亦在原發性A型流行性感冒感染期間展示年齡相關之抗原決定基特異性CD8+ CTL活性障礙。此與CD8+ CTL擴展之缺陷而非流行性感冒特異性CD8+ T細胞之效應活性有關。(Mbawuike IN,Acuna C,Caballero D,Pham-Nguyen K,Gilbert B,Petribon P,Harmon M.「Reversal of age-related deficient influenza virus-specific CTL responses and IFN-gamma production by monophosphoryl lipid A.」Cell Immunol.1996年10月10日；173(1)：64-78.)
因為T細胞反應之重要要素係針對感染細胞之清除，所以T細胞疫苗 可以預防性方式用於產生記憶性應答以及在感染後以治療性模式增強宿主之天然細胞介導之免疫性。T細胞疫苗亦可藉由共投予或藉由單獨投予與產生習知抗體之流行性感冒疫苗(基於體液反應)組合使用。
T-細胞疫苗法
T-細胞及流行性感冒疫苗領域之回顧表明廣泛交叉保護性T細胞疫苗之設計中所面臨的多種重大挑戰。T細胞疫苗必需首先能在高百分比疫苗接受者中初免及促升CD4+ HTL及CD8+ CTL T-細胞記憶性及效應功能。該疫苗亦必需解決病毒遺傳多樣性，及正在進行之突變，以及以MHC等位基因多態性層面出現之人類遺傳多樣性。本發明尋求藉由組合新穎氟肽疫苗遞送系統以及高度保守之流行性感冒肽來解決此等設計問題。該等肽較佳為已知含有一或多個抗原決定基，尤其T-細胞抗原決定基之抗原。
慣用之基於肽的T-細胞疫苗法已以抗原決定基為主且致力於以單個抗原決定基或重組人工串形式遞送之最小CTL(8-11aa)或T-輔助子(13aa)抗原決定基。非天然序列可能面臨不足抗原加工約束以及引起不相關新抗原決定基之潛在形成。在單個肽序列中含有重疊T-細胞抗原決定基、叢集T-細胞抗原決定基或混雜T-細胞抗原決定基之天然保守長肽序列允許天然抗原加工，同時實現廣泛群體覆蓋。此外，在一種疫苗調配物中使用多種此等天然長肽可能提供甚至更大之群體覆蓋。先例展示包含CD4+ & CD8+ T-細胞抗原決定基之長肽(30-35aa)具有在動物及人類體內誘發多抗原決定基反應之能力(Coutsinos Z,Villefroy P,Gras-Masse H,Guillet JG,Bourgault-Villada I.Gahery-Segard H,Pialoux G,Figueiredo S,Igea C,Surenaud M,Gaston J,Gras-Masse H,Levy JP,Guillet JG.「Long-term specific immune responses induced in humans by a human immunodeficiency virus type 1 lipopeptide vaccine：characterization of CD8+-T-cell epitopes recognized」.J Virol.2003年10月；77(20)：11220-31.)。對於有效抗病毒CTL反應(CD8T細胞驅使)而言，需要適當Th-1細胞介素環境(由CD4細胞確保)，因此預測CD4及CD8抗原決定基之重組遞送會增強細胞反應(Krowka,JF.,Singh,B.,Fotedar,A.,Mosmann,T.,Giedlin,MA.,Pilarski,LM.「A requirement for physical linkage between determinants recognized by helper molecules and cytotoxic T cell precursors in the induction of cytotoxic T cell responses」J.Immunol 1986年5月15日；136(10)：3561-6.)。
CD4+及CD8+ T細胞鑑別由胞外及胞內加工外來及自身蛋白產生的短肽，其呈現與MHC系統所編碼之特異性細胞表面分子結合。存在兩種離散類別之MHC分子：(i)MHC I類呈現內因性肽；及(i)MHC II類呈現外因性肽。MHC I類抗原呈現之過程涉及蛋白質降解，肽傳遞至內質網，肽-MHC結合及肽-MHC複合物輸出至細胞表面用於藉由CD8+ T細胞鑑別。肽在特異性MHC結合槽內結合，其形狀及特徵導致共享一共用結合基元之特異性亞類肽結合。當T-細胞受體鑑別特異性肽-MHC複合物時T細胞受到活化，且以此方式識別由胞內寄生蟲或病毒所感染之細胞或含有異常蛋白之細胞(例如，腫瘤細胞)且針對其發動適當免疫反應。激發T-細胞鑑別之特異性肽-MHC複合物中涉及之肽(T-細胞抗原決定基)為診斷及治療感染、自體免疫、過敏及贅生性疾病的重要工具。因為T-細胞抗原決定基為MHC-結合肽之亞類，所以可結合MHC分子之蛋白質部分的準確鑑別對於設計疫苗及免疫治療劑而言為重要的。MHC多態性在具有迄今已知的580 HLA-A、921 HLA-B、312 HLA-C、527 HLA-DR(β)、127 HLA-DRQ(β)及86 HLA-DQ(β)等位基因之人類群體內極高。當必須設計覆蓋廣泛群體之基於T細胞之疫苗時此狀況具有挑戰性。MHC-結合肽含有與MHC分子之槽(groove)相互作用的位置特異性胺基酸，造成肽結合。結合基元在 各位置的較佳胺基酸可在MHC分子之對偶基因變異體之間變化。計算模型促進結合各種MHC分子之肽的識別。多種計算方法、MHC結合檢定、X-射線晶體學研究及此項技術中已知的眾多其他方法可識別與MHC分子結合之肽。新穎電腦(in silico)抗原識別法提供迅速加工篩選HLA結合基元之肽序列中涉及之大量資料的能力，該等結合基元為描繪適用於T細胞疫苗之病毒序列所需。基於HLA之生物資訊法已成功應用於許多免疫學領域，且使其可解決人類遺傳多樣性關注問題，例如：Depil S,Morales O,Castelli FA,Delhem N,Francois V,Georges B,Dufosse F,Morschhauser F,Hammer J,Maillere B,Auriault C,Pancre V.「Determination of a HLA II promiscuous peptide cocktail as potential vaccine against EBV latency II malignancies.」,J Immunother(1997).2007年2月-3月；30(2)：215-26；Frahm N,Yusim K,Suscovich TJ,Adams S,Sidney J,Hraber P,Hewitt HS,Linde CH,Kavanagh DG,Woodberry T,Henry LM,Faircloth K,Listgarten J,Kadie C,JojicN,Sango K,Brown NV,Pae E,Zaman MT,Bihl F,Khatri A,John M,Mallal S,Marincola FM,Walker BD,Sette A,Heckerman D,Korber BT,Brander C.「Extensive HLA class I allele promiscuity among viral CTL epitopes.」Eur J Immunol.2007年8月17日；37(9)：2419-2433；Schulze zur Wiesch J,Lauer GM,Day CL,Kim AY,Ouchi K,Duncan JE,Wurcel AG,Timm J,Jones AM,Mothe B,Allen TM,McGovern B,Lewis-Ximenez L,Sidney J,SetteA,Chung RT,Walker BD.「Broad repertoire of the CD4+ Th cell response in spontaneously controlled Hepatitis C virus infection includes dominant and highly promiscuous epitopes.」J Immunol.2005年9月15日；175(6)：3603-13；Doolan DL,Southwood S,Chesnut R,Appella E,Gomez E,Richards A,HigashimotoYI,Maewal A,Sidney J,Gramzinski RA,Mason C,Koech D,Hoffman SL,Sette A.「HLA-DR-promiscuous T cell epitopes from Plasmodium falciparum pre-erythrocytic-stage antigens restricted by multiple HLA class II alleles.」J Immunol.2000年7月15日；165(2)：1123-37.)。
結合一種以上MHC對偶基因變異體之肽(「混雜肽」)為疫苗及免疫治療劑開發之主要標靶，因為其與較大比例之人類群體有關。混雜CD4+ T細胞抗原決定基亦經報導與多種MHC II類分子結合。(Panina-Bordignon P,Tan A,Termijtelen A,Demotz S,Corradin G,Lanzavecchia A.Universally immunogenic T cell epitopes：promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells.Eur J Immunol.1989年12月；19(12)：2237-42.)另一方面，先前描述一些混雜CD8+ T細胞抗原決定基具有結合多種MHC I類分子之能力，共享結合特徵且形成所謂超類型(supertype)(Frahm N,Yusim K,Suscovich TJ,Adams S,Sidney J,Hraber P,Hewitt HS,Linde CH,Kavanagh DG,Woodberry T,Henry LM,Faircloth K,Listgarten J,Kadie C,JojicN,Sango K,Brown NV,Pae E,Zaman MT,Bihl F,Khatri A,John M,Mallal S,Marincola FM,Walker BD,Sette A,Heckerman D,Korber BT,Brander C.「Extensive HLA class I allele promiscuity among viral CTL epitopes.」Eur J Immunol.2007年8月17日；37(9)：2419-2433；Sette A,Sidney J.‘HLA supertypes and supermotifs：a functional perspective on HLA polymorphism.’Curr Opin Immunol.1998年8月；10(4)：478-82)。混雜CD4+及CD8+ T細胞抗原決定基之識別代表疫苗設計中之重要策略以實現廣泛群體覆蓋。MHC多態性亦藉由選擇已知或預測含有MHC結合基元之肽來解決，該基元與特定種族群或跨越多個種族群之高頻率MHC等位基因有關。
藉由選擇提供廣泛群體覆蓋且在一定範圍之流行性感冒病毒株(藉由使用(例如)美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)或洛斯阿拉莫斯國家實驗室(Los Alamos National Laboratory，LANL)流行性感冒序列資料庫識別)上保守之序列組合，吾人能解決病毒遺傳多樣性且實現針對多數(若並非所有)相關流行性感冒病 毒株之保護。
歷史上，T-細胞疫苗技術(DNA及病毒載體疫苗)之關鍵失敗一直為對疫苗起反應的低百分比之疫苗個體，通常為低水準之免疫原性及其達成促升性擴增記憶性及效應T細胞反應之能力。有效流行性感冒T-細胞疫苗之主要目標為促進穩固T-細胞記憶性反應使得在再暴露於抗原時存在控制病毒負荷且促進病毒自肺部清除之效應功能的迅速擴展。為實現此，需要穩固病毒特異性Th-1方向之CD4+ & CD8+ T-細胞中心及效應記憶性反應。對可行之市售產物而言，必需在高百分比疫苗接受者(>90%)中引起此反應且能產生長期記憶性反應，此將需要記憶性應答及隨後之感染後疾病保護。然而，為了產生此類型之持久免疫性，疫苗必需亦以重複疫苗暴露實現穩固促升擴增作用。
改良由疫苗及免疫治療劑誘導之細胞免疫性的目前免疫學策略包括開發病原體之活減毒版本且使用活載體來遞送適當抗原或編碼該等抗原之DNA。該等總是不能在未經選擇群體中產生有意義促升反應之方法已導致複雜的初免-促升組合且亦受日益嚴格之調節環境內的安全考慮因素的限制。此外，由製造方法及抑制性成本的可量測性產生之問題通常限制生物源產品的商業生存力。在本文上下文中，合成肽為極具吸引力之抗原，因為其在化學結構明確、高度穩定且可經設計以含有T及/或B細胞抗原決定基。
為了刺激活體內T淋巴細胞反應，疫苗或免疫治療劑產品中所含之合成肽較佳應藉由抗原呈現細胞且尤其樹突狀細胞而內在化。樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)在初級T-細胞介導之免疫反應的起始中起決定性作用。此等細胞存在於與不同功能有關之兩個主要成熟階段中。不成熟樹突狀細胞(iDC)位於多數組織中或位於循環中且募集至身體發炎部位。其為高度專有之抗原捕獲細胞，表現抗原攝取及吞噬作用中所涉及的大量受 體。在抗原捕獲及加工後，iDC移動至淋巴結或脾臟中的局部T-細胞位置。在此過程中，DC喪失其抗原捕獲能力，轉為免疫刺激成熟DC(mDC)。
樹突狀細胞為有效呈現細胞，其起始宿主對與I類及II類MHC分子締合之肽抗原的免疫反應。其能初免天然未處理CD4及CD8 T-細胞。根據抗原加工及呈現路徑之目前模型，外源性抗原內在化為將其降解為肽之抗原呈現細胞的內吞隔室，其中一些肽與MHC II類分子結合。接著將成熟MHC II類/肽複合物傳遞至細胞表面用於CD4 T-淋巴細胞呈現。相反，內源性抗原藉由蛋白體作用在細胞質中降解，隨後傳遞至其與初生MHC I類分子結合的細胞質中。接著將與肽複合之穩定MHC I類分子傳遞至細胞表面以刺激CD8 CTL。外源性抗原亦可藉由專職APC在稱為交叉呈現之過程中呈現於MHC I類分子上。含有胞外抗原之吞噬體可與內質網融合且抗原可獲得將肽負載於MHC I類分子上所必需之器械。
在數十年期間，已評估眾多遞送法，包括諸如穿膜肽(Penetratin)、TAT及其衍生物、DNA、病毒載體、病毒微體(virosome)及脂質體之載體。然而，此等系統引起極弱CTL反應，未能對記憶性反應產生促升性之擴增，具有相關毒性問題或或以商業規模製造為複雜且昂貴的。
因此，在意欲引起細胞免疫反應之疫苗及藥物開發中公認需要改良載體以引導抗原之胞內遞送。本文中免疫治療劑或疫苗之載體為能將抗原傳遞或引導至宿主體內之免疫反應性細胞的任何試劑。
氟化界面活性劑已展示具有低臨界微胞濃度且因此以低濃度自身組織為多分子微胞結構。此物理化學特性與氟化鏈相關之強疏水性相互作用及低凡得瓦爾相互作用(Van der Waal’s interaction)有關，該等鏈顯著增加氟化兩性分子在水中自身裝配且在界面處聚集之趨勢。形成該等結構可促進細胞(例如，抗原呈現細胞)對其的內吞攝取(Reichel F.等人.J.Am.Chem. Soc.1999,121,7989-7997)。此外，溶血活性大大降低且通常在將氟化鏈引入界面活性劑中時受抑制(Riess,J.G.；Pace,S.；Zarif,L.Adv.Mater.1991,3,249-251)，藉此導致細胞毒性降低。
本發明尋求藉由使用碳氟化合物載體來克服將流行性感冒抗原遞送至免疫反應性細胞之問題以增強其免疫原性。碳氟化合物載體可包含一或多個由全氟碳或混合碳氟化合物/烴基產生之鏈且可為飽和或不飽和的，各鏈具有3至30個碳原子。
為了藉由共價鍵將載體鍵聯至抗原，將活性基團或配位基作為載體之組份併入，例如包括-CO-、-NH-、S、O或任何其他合適基團；該等配位基用於實現共價鍵之用途為此項技術中熟知的。反應性基團可位於碳氟化合物分子上之任何位置。
碳氟化合物載體與抗原之偶合可藉由抗原任何部位上天然存在或引入抗原任何部位上之諸如-OH、-SH、-COOH、-NH2之官能基實現。合適鍵可以直鏈或環狀形式含有氮、氧或硫原子。藉由接合形成之鍵結的實例可包括肟、腙、二硫化物或三唑或任何合適共價鍵。詳言之，可藉由硫酯鍵引入碳氟化合物部分以增加肽之免疫原性(Beekman,N.J.C.M等人.「Synthetic peptide vaccines：palmitoylation of peptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity.」J.Peptide Res.1997,50,357-364)。視情況而言，可併入間隔元件(肽、前驅肽或非肽)以允許自碳氟化合物元件裂解抗原以供在抗原呈現細胞中加工且使抗原呈現最佳化，如先前針對脂肽所展示(Verheul,A.F.M.；Udhayakumar,V.；Jue,D.L.；Wohlhueter,R.M.；Lal,A.L. Monopalmitic acid-peptide conjugates induce cytotoxic T cell responses against malarial epitopes：importance of spacer amino acids.Journal of Immunological Methods 1995，第182卷，第219-226頁)。
因此，在第一態樣中，本發明提供具有化學結構CmFn-CyHx-(Sp)-R之碳氟化合物載體-抗原構築體或其衍生物，其中m=3至30，n<=2m+1，y=0至15，x<=2y，(m+y)=3-30且Sp為視需要的化學間隔部分且R為衍生自流行性感冒病毒之抗原。
在本發明之上下文中，「衍生物」係指碳氟化合物之相對微小之改質使得化合物仍能如本文所述遞送抗原。因此，例如，多個氟部分可經諸如氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)之其他鹵素部分置換。此外，可將多個氟部分以甲基置換且仍保持如本文所述之分子特性。
在上式之特定實例中，載體可為下式之2H,2H,3H,3H-全氟十一酸：
因此在第二態樣中，本發明提供如下結構之碳氟化合物載體-抗原構築體：
其中Sp為視需要的化學間隔部分且R為衍生自流行性感冒病毒之抗原。
如本文所用，術語「抗原(antigen)」係指具有由免疫學受體(諸如，T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR或抗體)鑑別之能力的分子。抗原可為天然或非天然之蛋白質、蛋白質子單元、肽、碳水化合物、脂質或其組合，限制條件為其存在至少一個抗原決定基，例如T細胞及/或B細胞抗原決定基。
該等抗原可藉由自天然蛋白質純化產生或藉由重組技術或藉由化學合成製造。製備抗原之方法為此項技術熟知的。此外，抗原亦包括編碼抗原肽或蛋白質之DNA或寡核苷酸。
與載體締合之抗原可為能夠在動物(包括人類)體內誘發免疫反應之任何流行性感冒抗原。較佳地，免疫反應將在宿主體內具有有益作用。
流行性感冒抗原可含有一或多個T細胞抗原決定基或一或多個B細胞抗原決定基或T及B細胞抗原決定基之組合。
T細胞抗原決定基可為MHC I類或II類限制性抗原決定基。
如本文所用，術語「抗原決定基(epitope)」包括：(i)CD4+ T細胞抗原決定基，其為含有MHC II類結合基元且具有由MHC II類分子在抗原呈現細胞表面呈現之能力的肽序列，及(ii)CD8+ T細胞抗原決定基，其為含有MHC I類結合基元且具有由MHC I類分子在細胞表面呈現之能力的肽序列，及(iii)B細胞抗原決定基，其為對B細胞受體具有結合親和力之肽序列。
抗原可包含一或多個來自A型流行性感冒蛋白、B型流行性感冒蛋白或C型流行性感冒蛋白的抗原決定基。來自A型及B型流行性感冒之流行性感冒病毒蛋白之實例包括：任何該組合形式之血球凝集素、神經胺糖酸酶、基質(M1)蛋白、M2、核蛋白(NP)、PA、PB1、PB2、NS1或NS2。
因此在另一態樣中，本發明提供一種載體-抗原構築體，其中流行性感冒病毒抗原為蛋白質、蛋白質子單元、肽、碳水化合物或脂質或其組合。對於為免疫學活性之構築體而言，抗原必需包含一或多個抗原決定基。較佳地，抗原為衍生自流行性感冒病毒之肽序列。本發明之肽或蛋白質較佳含有至少7個，更佳介於9與100個之間的胺基酸且最佳介於約15至40個之間的胺基酸之序列。較佳地，選擇攜帶抗原決定基之肽之胺基酸序列以增強分子在水性溶劑中之溶解度。此外，未與載體結合之肽末端可經改變以促進構築體經由形成多分子結構(諸如，微胞、薄片、細管或脂質體而溶解。舉例而言，可向肽中添加帶正電之胺基酸以促進微胞之自發裝配。肽之N末端或C末端可與載體偶合以形成構築體。為促進大規模合成構築 體，可對肽之N或C末端胺基酸殘基進行修飾。當所要肽對肽酶裂解尤其敏感時，正常肽鍵結可由不可裂解之肽模擬物置換；該等鍵結及合成方法為此項技術熟知的。
亦可將非標準、非天然胺基酸併入肽序列中，限制條件為其不干擾肽與MHC分子相互作用的能力且保留與鑑別天然序列之T細胞的交叉反應性。非天然胺基酸可用於改良肽對蛋白酶之抗性或化學穩定性。非天然胺基酸之實例包括D-胺基酸及半胱胺酸修飾。
在與碳氟化合物載體連接之前，可將一個以上抗原鍵聯在一起。一個該實例為使用融合肽，其中混雜T輔助抗原決定基可與一或多個CTL抗原決定基或一或多個B細胞抗原決定基(其可為肽、碳水化合物或核酸)共價鍵聯。作為實例，混雜T輔助抗原決定基可為PADRE肽，破傷風類毒素肽(830-843)或流行性感冒血球凝集素，HA(307-319)。或者，肽序列可含有兩個或兩個以上抗原決定基，其可重疊以形成密集封裝之多特異性抗原決定基(或連續，或由胺基酸之伸展隔開)的叢集。
因此，在另一態樣中，本發明提供載體-抗原構築體，其中R為一個以上鍵聯在一起之抗原決定基或抗原。抗原決定基亦可線性重疊，藉此形成密集封裝之多特異性抗原決定基之叢集。
由於碳氟化合物之強非共價分子相互作用特徵，抗原亦可與載體非共價締合，且仍實現由抗原呈現細胞有利吸收的目標。
因此，在另一態樣中，本發明提供載體/抗原構築體，其中抗原與碳氟化合物載體非共價締合。
攜帶一或多個B-細胞抗原決定基之抗原亦可以或不以一或多個抗原決定基與碳氟化合物載體連接。可使用電腦法預測B細胞抗原決定基(Bublil EM,Freund NT,Mayrose I,Penn O,Roitburd-Berman A,Rubinstein ND,Pupko T,Gershoni JM.「Stepwise prediction of conformational discontinuous B-cell epitopes using the Mapitope algorithm.」Proteins.2007年7月1日；68(1)：294-304.Greenbaum JA,Andersen PH,Blythe M,Bui HH,Cachau RE,Crowe J,Davies M,Kolaskar AS,Lund O,Morrison S,Mumey B,Ofran Y,Pellequer JL,Pinilla C,Ponomarenko JV,Raghava GP,van Regenmortel MH,Roggen EL,Sette A,Schlessinger A,Sollner J,Zand M,Peters B.「Towards a consensus on datasets and evaluation metrics for developing B-cell epitope prediction tools」J Mol Recognit.20073月-4月；20(2)：75-82)。
本發明亦提供包含一或多個碳氟化合物載體-抗原構築體之疫苗及免疫治療劑。需要此類型之多組份產物，因為可能在較大數目個體中更有效引起適當免疫反應。由於人類體內之極端HLA多態性，單個氟肽將不太可能在高百分比給定群體中誘發多抗原決定基免疫反應。因此，為使疫苗產物有效跨越群體，疫苗調配物中可能必需多種氟肽以提供廣泛覆蓋。此外，流行性感冒疫苗或免疫治療劑之最佳調配物可包含由不同流行性感冒病毒抗原產生的多個不同肽序列。在此狀況下，肽可鍵聯在一起與單個碳氟化合物載體連接或各肽抗原可與專用載體結合。
多組份產物可含有一或多個載體-抗原構築體，更佳2至約20個，更佳3至約10個。在特定具體實例中，多組份疫苗可含有5、6、7或8個構築體。此確保多抗原決定基T-細胞反應係由廣泛群體覆蓋產生(亦即，解決HLA多樣性)。舉例而言，多氟肽之調配物可由僅A型流行性感冒產生之肽、僅B型流行性感冒產生之肽或僅C型流行性感冒產生之肽或各類型流行性感冒之組合，最佳A型及B型流行性感冒構成。
在一具體實例中，產物包含至少兩個載體-抗原構築體，第一構築體包含流行性感冒肽序列：HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK且第二構築體包含流行性感冒肽序列： YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE。
在另一具體實例中，產物包含8個載體-抗原構築體，該等構築體包含以下流行性感冒肽序列：構築體1 HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
構築體2 VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG
構築體3 YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
構築體4 APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA
構築體5 SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY
構築體6 KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG
構築體7 DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS
構築體8 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER
或者，可將多個抗原決定基併入至調配物中以賦予針對一定範圍病原體之免疫性，其中一者為流行性感冒病毒。舉例而言，呼吸道感染疫苗可含有來自流行性感冒病毒及呼吸道融合病毒之抗原。
本發明組合物包含與抗原締合之碳氟化合物載體，以及視需要之一或多種醫藥學上可接受之載劑及/或佐劑。該等佐劑及/或醫藥學上可接受之載劑將能進一步增強免疫反應之量值及/或細胞介素特性，且可包括(但不限於)：(1)天然細菌組份之天然或合成來源之精製品，諸如弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)及其衍生物、胞壁醯二肽(muramyldipeptide，MDP)衍生物、CpG、單磷醯脂A；(2)其他已知佐劑或增效劑，諸如皂素、鋁鹽及細胞介素；(3)以或不以外來佐劑(參見上文之1及2)調配抗原之方法，諸如水中油佐劑、油中水佐劑、免疫刺激複合物(ISCOM)、脂質體、經調配物之奈米及微米粒子； (4)細菌毒素及類毒素；及(5)熟習此項技術者熟知的其他適用佐劑。
若需要，載劑之選擇通常為組合物遞送途徑之函數。在本發明中，組合物可經調配用於任何合適投予途徑及方式。醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑包括彼等適用於經口、經眼、經直腸、局部(包括經口腔及舌下)、經陰道或非經腸(包括皮下、肌肉內、靜脈內、皮內、經皮)投予之調配物中者。
調配物可以任何合適形式投予，例如以液體、固體、氣溶膠或氣體形式投予。舉例而言，經口調配物可為乳液、糖漿或溶液或錠劑或膠囊形式，其可經腸衣塗覆以保護活性組份不在胃中降解。經鼻調配物可為噴霧或溶液。經皮調配物可適用於其特定遞送系統且可包含皮膚貼。用於注射之調配物可為蒸餾水或另一醫藥學上可接受之溶劑或懸浮劑中之溶液或懸浮液。
因此在另一態樣中，本發明提供包含具有或不具有合適載劑及/或佐劑之載體-抗原構築體之預防性或治療性調配物。
將在診所測定待向患者投予之疫苗或免疫治療劑之適當劑量。然而，作為指導，可視較佳投予途徑而定之合適人類劑量可為1至1000μg。可需要多次給藥實現免疫學或臨床作用，此(若需要)通常將以介於2至12週間隔投予。在需要長期促升反應的情況下，可應用間隔1個月至5年之重複給藥。
調配物可將載體-抗原構築體與另一活性組份組合以實現一種以上疫苗或藥物之投予。經兩種或兩種以上活性物質之共投予亦可觀測到協同作用。
包含一或多種氟肽之本發明之疫苗調配物可用於與基於體液反應之流行性感冒疫苗組合，諸如Fluzone®、AgrippalTM、BegrivacTM、Fluvax®、Enzira®、FluarixTM、FlulavalTM、FluAd®、Influvac®、Fluvirin®、FluBlok®或 包含血球凝集素作為活性組份之任何流行性感冒疫苗，或活減毒流行性感冒病毒，包括適冷病毒株，諸如Flumist®。可以同時投予或時間間隔投予之組合混合物或單獨疫苗試劑形式進行投予。
在另一態樣中，流行性感冒疫苗調配物可與抗病毒治療組合物組合投予，包括神經胺糖酸酶抑制劑治療，諸如阿瑪尼啶(amanidine)、金剛乙胺(rimantidine)、紮那米韋(zanamivir)或奧司他韋(oseltamivir)。投予可同時或具有時間間隔。
在其他態樣中，本發明提供
i)如本文所述之免疫原性構築體之用途，其係用於製備用以治療或預防疾病或其症狀之藥物。
ii)藉由在投予本文所述之調配物後誘發免疫反應進行治療之方法。
圖1：展示藉由活體外IFN-γ ELIspot檢定所評定在初免或初免-促升後，多價氟肽疫苗與其天然肽等效物在BALB/c(左)及CBF6(右)小鼠中免疫原性之比較(以個別肽試管內再刺激(累積))。將每組7隻或8隻小鼠以氟肽疫苗(由8種經調配氟肽構成，劑量為100μl中每氟肽1nmol)或等效天然肽(由8種經調配天然肽構成，劑量為100μl中每肽1nmol)皮下免疫。對照組接受僅含有賦形劑之調配物。最終注射後10天，藉由頸部錯位將小鼠處死。移除脾臟且自個別小鼠製備單個脾臟細胞懸浮液。根據製造商說明進行鼠科動物IFN-γ ELISpot檢定(Mabtech,Sweden)。在37℃及5% CO2下，將脾臟細胞(5×105)一式兩份以8種個別天然肽以完全培養基(補充有10%胎牛血清之RPMI)中每肽10μg/ml之濃度以200μl之總體積刺激18小時。使用CTL-免疫墨點讀取單元對墨點進行計數。對於各 小鼠而言，將所有8種肽之墨點總數累積且將對照孔(僅媒劑)之值減去8次。結果對應於每百萬輸入脾臟細胞墨點形成細胞(SFC)之平均值±標準差。
圖2：展示藉由活體外IFN-γ ELIspot檢定所評定在初免或初免-促升後，多價氟肽疫苗與其天然肽等效物在BALB/c(左)及CBF6(右)小鼠中免疫原性之比較(以肽混合物試管內再刺激)。將每組7隻或8隻小鼠以氟肽疫苗(由8種經調配氟肽構成，劑量為100μl中每氟肽1nmol)或等效天然肽(由8種經調配天然肽構成，劑量為100μl中每肽1nmol)皮下免疫。對照組接受僅含有賦形劑之調配物。最終注射後10天，藉由頸部錯位將小鼠處死。移除脾臟且自個別小鼠製備單個脾臟細胞懸浮液。根據製造商說明進行鼠科動物IFN-γ ELISpot檢定(Mabtech,Sweden)。在37℃及5% CO2下，將脾臟細胞(5×105)一式兩份以8種肽之混合物以完全培養基(補充有10%胎牛血清之RPMI)中每肽1μg/ml之濃度以200μl之總體積刺激18小時。使用CTL-免疫墨點讀取單元對墨點進行計數。對於各小鼠而言，將所有8種肽之墨點總數累積且將對照孔(僅媒劑)之值減去8次。結果對應於每百萬輸入脾臟細胞墨點形成細胞(SFC)之平均值±標準差。
圖3：展示藉由活體外IFN-γ ELIspot所評定在初免或初免-促升後，氟肽與天然肽在BALB/c(左)及CBF6(右)小鼠中的個別肽免疫原性之比較(以個別肽試管內再刺激)。將每組7隻或8隻小鼠以氟肽疫苗(由8種經調配氟肽構成，劑量為100μl中每氟肽1nmol)或等效天然肽(由8種經調配天然肽構成，劑量為100μl中每肽1nmol)皮下免疫。對照組接受僅含有賦形劑之調配物。最終注射後10天，藉由頸部錯位將小鼠處死。移 除脾臟且自個別小鼠製備單個脾臟細胞懸浮液。根據製造商說明進行鼠科動物IFN-γ ELISpot檢定(Mabtech,Sweden)。在37℃下在5% CO2氣氛下，將脾臟細胞(5×105)一式兩份以8種個別天然肽以完全培養基(補充有10%胎牛血清之RPMI)中每肽10μg/ml之濃度以200μl之總體積刺激18小時。使用CTL-免疫墨點讀取單元對墨點進行計數。結果對應於每百萬輸入脾臟細胞墨點形成細胞(SFC)之平均值±標準差。
圖4：展示初免-促升後多價氟肽疫苗與其天然肽等效物在BALB/c(左)與CBF6(右)小鼠中免疫原性之比較；細胞介素特性之評定(以肽混合物試管內再刺激)。將每組8隻小鼠以氟肽疫苗(由8種經調配氟肽構成，劑量為100μl中每氟肽1nmol)或等效天然肽(由8種經調配天然肽構成，劑量為100μl中每肽1nmol)皮下免疫。將對照組小鼠注射僅含賦形劑之調配物。將小鼠以15天間隔免疫。最終注射後10天，藉由頸部錯位將小鼠處死。移除脾臟且自個別小鼠製備單個脾臟細胞懸浮液。在37℃下在5% CO2氣氛下，將脾細胞以8種天然肽之混合物以完全培養基(補充有10%胎牛血清之RPMI)中每肽1μg/ml之濃度以200μl之總體積刺激48小時。來自刺激細胞之培養物上清液之細胞介素濃度(介白素-2(IL-2)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、干擾素-γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子(TNF))之分析根據製造商說明使用鼠科動物流式細胞小球陣列套組(CBA；BD Biosciences,UK)進行且使用FacsCanto II流式細胞儀分析。測定各細胞介素在210-2500 pg/ml範圍內之標準曲線。根據製造商，CBA偵測之下限視分析物而定為2.5-3.2 pg/ml。結果對應於各組小鼠針對各細胞介素計算出的平均值及標準差。結果表示為以pg/ml計之細胞介素濃度。
圖5：CD4+ T細胞及CD8+ T細胞兩者皆由BALB/c小鼠中氟肽疫苗刺激。每組4隻小鼠以氟肽疫苗(由8種經調配氟肽構成，劑量為100μl中每氟肽1nmol)皮下免疫。小鼠以15天間隔接受2次注射(初免-促升)。最終注射後10天，藉由頸部錯位將小鼠處死。移除脾臟且自個別小鼠製備單個脾臟細胞懸浮液。將細胞以每孔0.5×106再懸浮且在37℃及5% CO2下以僅媒劑或8種天然肽(疫苗)之混合物刺激72小時。在培養最後5小時，正對照培養物(PMA/I)接受50ng/ml PMA及0.5μg/ml離子黴素(ionomycin)。培養最終5小時，所有培養物接受10 μl/ml布雷菲德菌素A(Brefeldin A)。將細胞針對CD4及CD8胞外染色，且針對IFN-γ胞內染色，且藉由流式細胞技術使用BD FACSCanto II細胞儀分析。個別小鼠之結果展示為表現胞內IFN-γ之CD4+或CD8+ T細胞百分比。
圖6：展示BALB/c小鼠體內單次免疫後多價氟肽疫苗與CFA中乳化之疫苗的免疫原性比較；細胞介素特性之評定(以肽混合物試管內再刺激)。每組10隻小鼠以氟肽疫苗(由8種經調配氟肽構成，劑量為100μl中每氟肽1nmol)或在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化之氟肽疫苗皮下免疫。將對照組小鼠注射僅含賦形劑之調配物。10天後，將小鼠藉由頸部錯位處死。移除脾臟且自個別小鼠製備單個脾臟細胞懸浮液。在37℃下在5% CO2氣氛下，將脾細胞以8種天然肽之混合物以完全培養基(補充有10%胎牛血清之RPMI)中每肽1μg/ml之濃度以200μl之總體積刺激48小時。來自刺激細胞之培養物上清液之細胞介素濃度(介白素-2(IL-2)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、干擾素-γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子(TNF))之分析根據製造商說明使用鼠科動物流式細胞小球陣列套組(CBA；BD Biosciences, UK)進行且使用FacsCanto II流式細胞儀分析。測定各細胞介素在2.5-2500 pg/ml範圍內之標準曲線。根據製造商，CBA偵測之下限視分析物而定為2.5-3.2 pg/ml。結果對應於各組小鼠針對各細胞介素計算出的平均值±標準誤差。結果表示為以pg/ml計之平均細胞介素濃度。
圖7：展示BALB/c小鼠體內單次免疫後以皮下與皮內途徑投予氟肽疫苗的比較：活體外IFN-γ ELISpot檢定(以個別肽試管內再刺激)。每組10隻小鼠以氟肽疫苗(由8種經調配氟肽構成，劑量為100μl中每氟肽1nmol)皮下(s.c.)或皮內(i.d.)免疫。對照組接受皮下投予之僅含有賦形劑之調配物。10天後，將小鼠藉由頸部錯位處死。移除脾臟且自個別小鼠製備單個脾臟細胞懸浮液。根據製造商說明進行鼠科動物IFN-γ ELISpot檢定(Mabtech,Sweden)。在37℃下在5% CO2氣氛下，將脾臟細胞(5×105)一式兩份以8種個別天然肽以完全培養基(補充有10%胎牛血清之RPMI)中每肽10μg/ml之濃度以200μl之總體積刺激18小時。使用CTL-免疫墨點讀取單元對墨點進行計數。對於各小鼠而言，將所有8種肽之墨點總數累積且將對照孔(僅媒劑)之值減去8次。結果對應於每百萬輸入脾臟細胞墨點形成細胞(SFC)之平均值±標準誤差。
本發明現將參照以下實施例進行描述。此等實施例表明與相應非氟化抗原相比藉由將碳氟化合物載體與抗原連接獲得之有差異的T細胞免疫反應。所例示之8個抗原選自本文定義之流行性感冒序列清單。此臨時選擇利用涵蓋參數組合之專屬選擇演算法，包括：免疫資訊選擇、試管內結合檢定、使用先前經流行性感冒感染之人類PBMC的活體外再刺激檢定、製 造及調配物參數。最終，小鼠體內之評定確認因此個別或組合選出之氟肽為免疫原性的且所獲得之反應優於天然肽抗原。關注且需要利用此疫苗原型之抗原組合的抗原選擇使得病毒遺傳多樣性及人類HLA多樣性以此合理疫苗設計得以解決。此為肽疫苗領域中關鍵失敗中之一者。儘管可在氟肽疫苗中利用單個抗原，但將限制遠親後代人類(或其他)群體中之疫苗免疫原性潛力且因此選擇多種肽對於廣泛有效疫苗而言為必需的。
如本文所用，術語「氟肽(fluoropepetide)」係指與基於肽之抗原結合的碳氟化合物載體(鏈)。該等實施例參考所附圖式。
實施例1 實例肽
與碳氟化合物載體結合以包含於預防性或治療性流行性感冒疫苗中之候選物可包括以下一或多種肽或其片段，或類似物(包括如洛斯阿拉莫斯國家實驗室流行性感冒序列資料庫(Los Alamos National Laboratory influenza sequence database)中所提及之相應一致、祖先或中心樹序列(Macken,C.,Lu,H.,Goodman,J.,& Boykin,L.,"The value of a database in surveillance and vaccine selection." in Options for the Control of Influenza IV.A.D.M.E.Osterhaus,N.Cox & A.W.Hampson(編)2001,103-106.)或來自NCBI之流行性感冒病毒資源)或其天然及非天然變異體，但並非必要為獨佔地。適當肽之特定實例在下文中給出，其中利用標準一字縮碼(one letter code)。同系物相較於參考序列具有至少50%一致性。較佳地，同系物與天然存在之序列具有80、85、90、95、98或99%一致性。非天然胺基酸之使用必需不干擾肽與MHC I類或II類受體結合之能力。含有一或多個抗原決定基之此等序列之片段亦為用於與碳氟化合物載體連接之候選肽。
此等序列選自A型流行性感冒一致序列。規定流行性感冒病毒蛋白及肽於彼蛋白中之位置。自流行性感冒病毒資源收集蛋白質序列。http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/
SEQ ID N°1 PB2 位置027至061 HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
SEQ ID N° 2PB2 位置123至157 ERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDINPGHADLSAK
SEQ ID N° 3 PB2 位置155至189 SAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEK
SEQ ID N° 4 PB2 位置203至237 VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG
SEQ ID N° 5 PB2 位置249至283 EVRNDDVDQSLIIAARNIVRRAAVSADPLASLLEM
SEQ ID N° 6 PB2 位置358至392 EGYEEFTMVGRRATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQ
SEQ ID N° 7 PB2 位置370至404 ATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVF
SEQ ID N° 8 PB2 位置415至449 RGDLNFVNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLFQNW
SEQ ID N° 9 PB2 位置532至566 SSSMMWEINGPESVLVNTYQWIIRNWETVKIQWSQ
SEQ ID N° 10 PB2 位置592至626 YSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTVQIIKLLPFAAAPP
SEQ ID N° 11 PB2 位置607至641 LGTFDTVQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVR
SEQ ID N° 12 PB2 位置627至659 QSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNK
SEQ ID N° 13 PB1 位置012至046 VPAQNAISTTFPYTGDPPYSHGTGTGYTMDTVNRT
SEQ ID N° 14 PB1 位置114至148 VQQTRVDKLTQGRQTYDWTLNRNQPAATALANTIE
SEQ ID N° 15 PB1 位置216至250 SYLIRALTLNTMTKDAERGKLKRRAIATPGMQIRG
SEQ ID N° 16 PB1 位置267至301 EQSGLPVGGNEKKAKLANVVRKMMTNSQDTELSFT
SEQ ID N° 17 PB1 位置324至358 YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
SEQ ID N° 18 PB1 位置340至374 APIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLA
SEQ ID N° 19 PB1 位置404至436 SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY
SEQ ID N° 20 PB1 位置479至513 KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG
SEQ ID N° 21 PB1 位置486至520 KTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGINES
SEQ ID N° 22 PB1 位置526至560 GVTVIKNNMINNDLGPATAQMALQLFIKDYRYTYR
SEQ ID N° 23 PB1 位置656至690 EYDAVATTHSWIPKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQ
SEQ ID N° 24 PB1 位置700至734 FPSSSYRRPVGISSMVEAMVSRARIDARIDFESGR
SEQ ID N° 25 PA 位置107至141 PDLYDYKENRFIEIGVTRREVHIYYLEKANKIKSE
SEQ ID N° 26 PA 位置122至156 VTRREVHIYYLEKANKIKSEKTHIHIFSFTGEEMA
SEQ ID N° 27 PA 位置145至179 IHIFSFTGEEMATKADYTLDEESRARIKTRLFTIR
SEQ ID N° 28 PA 位置166至200 ESRARIKTRLFTIRQEMASRGLWDSFRQSERGEET
SEQ ID N° 29 PA 位置495至529 RRKTNLYGFIIKGRSHLRNDTDVVNFVSMEFSLTD
SEQ ID N° 30 PA 位置642至676 AKSVFNSLYASPQLEGFSAESRKLLLIVQALRDNL
SEQ ID N° 31 PA 位置173至207 PRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFW
SEQ ID N° 32 NP 位置240至274 DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS
SEQ ID N° 33 M1 位置002至026 SLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKN
SEQ ID N° 34 M1 位置023至057 EIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTK
SEQ ID N° 35 M1 位置038至072 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER
SEQ ID N° 36 M1 位置055至089 LTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGD
SEQ ID N° 37 M1 位置166至200 ATTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAA
SEQ ID N° 38 NS1 位置128至162 IILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGAIVGEISP
SEQ ID N° 39 NS2 位置026至060 EDLNGMITQFESLKLYRDSLGEAVMRMGDLHSLQN
以下序列選自B型流行性感冒一致序列。規定流行性感冒病毒蛋白及肽於彼蛋白中之位置。自流行性感冒病毒資源收集蛋白質序列。http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/
SEQ ID N° 40 PB2 位置016至050 NEAKTVLKQTTVDQYNIIRKFNTSRIEKNPSLRMK
SEQ ID N° 41 PB2 位置117至151 YESFFLRKMRLDNATWGRITFGPVERVRKRVLLNP
SEQ ID N° 42 PB2 位置141至175 ERVRKRVLLNPLTKEMPPDEASNVIMEILFPKEAG
SEQ ID N° 43 PB2 位置197至231 GTMITPIVLAYMLERELVARRRFLPVAGATSAEFI
SEQ ID N° 44 PB2 位置311至345 DIIRAALGLKIRQRQRFGRLELKRISGRGFKNDEE
SEQ ID N° 45 PB2 位置404至438 MVFSQDTRMFQGVRGEINFLNRAGQLLSPMYQLQR
SEQ ID N° 46 PB2 位置519至553 VSELESQAQLMITYDTPKMWEMGTTKELVQNTYQW
SEQ ID N° 47 PB2 位置537至571 MWEMGTTKELVQNTYQWVLKNLVTLKAQFLLGKED
SEQ ID N° 48 PB2 位置572至606 MFQWDAFEAFESIIPQKMAGQYSGFARAVLKQMRD
SEQ ID N° 49 PB2 位置717至751 LEKLKPGEKANILLYQGKPVKVVKRKRYSALSNDI
SEQ ID N° 50 PB1 位置001至035 MNINPYFLFIDVPIQAAISTTFPYTGVPPYSHGTG
SEQ ID N° 51 PB1 位置097至131 EEHPGLFQAASQNAMEALMVTTVDKLTQGRQTFDW
SEQ ID N° 52 PB1 位置227至261 MTKDAERGKLKRRAIATAGIQIRGFVLVVENLAKN
SEQ ID N° 53 PB1 位置393至427 KPFFNEEGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVAALGI
SEQ ID N° 54 PB1 位置616至650 DPEYKGRLLHPQNPFVGHLSIEGIKEADITPAHGP
SEQ ID N° 55 PB1 位置701至735 SASYRKPVGQHSMLEAMAHRLRMDARLDYESGRMS
SEQ ID N° 56 PA 位置160至194 SSLDEEGKGRVLSRLTELQAELSLKNLWQVLIGEE
SEQ ID N° 57 PA 位置491至525 ESFDMLYGLAVKGQSHLRGDTDVVTVVTFEFSSTD
SEQ ID N° 58 PA 位置696至723 VIQSAYWFNEWLGFEKEGSKVLESVDEIMDE
SEQ ID N° 59 NP 位置173至207 FLKEEVKTMYKTTMGSDGFSGLNHIMIGHSQMNDV
SEQ ID N° 60 NP 位置253至287 EAIRFIGRAMADRGLLRDIKAKTAYEKILLNLKNK
SEQ ID N° 61 NP 位置308至342 IADIEDLTLLARSMVVVRPSVASKVVLPISIYAKI
SEQ ID N° 62 NP 位置338至372 IYAKIPQLGFNVEEYSMVGYEAMALYNMATPVSIL
SEQ ID N° 63 NP 位置418至452 GFHVPAKEQVEGMGAALMSIKLQFWAPMTRSGGNE
SEQ ID N° 64 M1 位置166至300 ARSSVPGVRREMQMVSAMNTAKTMNGMGKGEDVQK
SEQ ID N° 65 M1 位置209至237 IGVLRSLGASQKNGEGIAKDVMEVLKQSS
包含於預防性或治療性流行性感冒疫苗中之候選肽可為來自任何組合形式之病毒蛋白血球凝集素、神經胺糖酸酶、基質(M1)蛋白、M2、核蛋白(NP)、PA、PB1、PB2、NS1或NS2中之任一者的肽。
氟肽及天然肽(未修飾肽)之合成
藉由固相肽合成(SPPS)獲得8種天然肽及8種氟肽(選自本文所包含之肽清單；SEQ ID N° 1至65)。在林克醯胺PEG樹脂(Rink amide PEG resin)上藉由使用標準9-茀基乙氧羰基(Fmoc)化學法合成所有肽。藉由以20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺處理30分鐘，且藉由使用1,3-二異丙基碳化二亞胺/1-羥基-苯并三唑/N-甲基嗎啉使經保護之胺基酸偶合歷時120分鐘重複移除Fmoc保護基，在樹脂上組裝肽鏈。每次偶合後進行寧海準測試(Ninhydrin test)來檢驗偶合功效。添加N-末端離胺酸基殘基後，樹脂嵌段分裂以允許(1)在樹脂第一半上，將2H,2H,3H,3H-全氟十一酸碳氟化合物鏈(C8F17(CH2)2COOH)併入至N-末端離胺酸之ε鏈上以產生氟肽，及(2)在樹脂第二半上，使N-末端離胺酸之ε鏈乙醯化產生天然肽。將樹脂洗滌及乾燥，接著以試劑K處理以裂解且移除側鏈保護基。粗肽自冷乙醚沈澱且藉由過濾收集。藉由RP-HPLC評定純度且對於所有肽而言超過92%。在氮氣下製備凍乾氟肽且在-20℃下儲存。氟肽在儲存條件下之穩定性已由RP-HPLC及LC-MS經6個月確認。
疫苗劑量製備
調配8種凍乾氟肽(氟肽1、氟肽2、氟肽3、氟肽4、氟肽5、氟肽6、氟肽7及氟肽8)或8種凍乾等效天然肽(肽1、肽2、肽3、肽4、肽5、 肽6、肽7及肽8)以形成等克分子調配物，產生用於非經腸遞送之廣泛中性pH值。
構築體之流行性感冒肽部分之序列如下：氟肽1 HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK-NH2
氟肽2 VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG-NH2
氟肽3 YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE-NH2
氟肽4 APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA-NH2
氟肽5 SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY-NH2
氟肽6 KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG-NH2
氟肽7 DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS-NH2
氟肽8 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER-NH2
動物及免疫
雌性6-8週齡BALB/c或CB6F1(BALB/c x C57BL/6J)小鼠購自Charles River(UK)及/或Harlan(UK)。使用1ml針筒及22-G針頭皮下進行注射。進行免疫使得小鼠接受單次免疫(初免)或兩次免疫(初免/促升)。每次注射之間間隔14天。
氟肽疫苗在BALB/c及CB6F1小鼠兩者體內具有強免疫原性且優於天然肽。
在BALB/c及CB6F1小鼠體內，將氟肽疫苗(如上文所述之8種氟肽之混合物)之免疫原性與天然肽等效物(如上文所述之8種未修飾肽，所謂天然肽之混合物)進行比較。研究亦比較使用初免或初免-促升攝生法之兩調配物的免疫原性。將兩調配物在BALB/c及CBF6小鼠體內不使用佐劑皮下注射。將小鼠以含有1nmol/氟肽之氟肽疫苗劑量(8種氟肽總共8nmol)或1nmol/肽之天然肽疫苗等效物(8種天然肽總共8nmol)免疫。疫苗製劑均不含有任何佐劑。最終免疫後10天，將脾臟細胞以各個別天然肽以10μg/ml再刺激且使用IFN-γ ELISpot檢定評定。根據活體外IFN-γ ELISpot 檢定(圖1及2)，在初免-促升免疫攝生法後氟肽疫苗之免疫原性優於僅賦形劑及天然肽疫苗等效物兩者(P<0.001)。結果亦表明對於僅氟肽疫苗組而言，使用初免-促升攝生法相較於單次免疫，墨點形成細胞數目大量增加(圖1及2)。此等結果表明與肽序列鍵聯之碳氟化合物鏈的自身輔佐特性。
氟肽疫苗在BALB/c及CB6F1小鼠兩者體內誘發穩固多抗原決定基T細胞反應。
在BALB/c及CB6F1小鼠體內，將氟肽疫苗(如上文所述之8種氟肽之混合物)之免疫原性與其天然肽等效物(如上文所述之8種未修飾肽，稱為「天然肽」之混合物)進行比較。研究亦比較初免及初免-促升攝生法之兩調配物的免疫原性。將兩調配物在BALB/c及CB6F1小鼠體內不使用佐劑皮下注射。將小鼠以含有1nmol/氟肽之氟肽疫苗劑量(8種氟肽總共8nmol)，1nmol/肽之天然肽疫苗等效物(8種天然肽總共8nmol)免疫。疫苗製劑均不含有任何佐劑。對照組由僅經賦形劑免疫之小鼠組成。免疫後10天，將脾臟細胞藉由各個別天然肽以10μg/ml再刺激且使用IFN-γ ELISpot檢定評定。氟肽疫苗在BALB/c小鼠中誘發針對8種肽中之5者的肽特異性反應且在CB6F1小鼠中誘發針對8種肽中之7者的肽特異性反應，此優於疫苗等效物(未修飾肽)誘發之反應。此表明以氟肽疫苗接種可誘發品質上及數量上優於其天然肽等效物之免疫學反應。
氟肽疫苗視所測試之鼠科動物病毒株而定誘發Th1細胞介素特性。
在BALB/c及CB6F1小鼠體內，將氟肽疫苗(如上文所述之8種氟肽之混合物)之免疫原性與天然肽等效物(如上文所述之8種未修飾肽之混合物)進行比較。將調配物在BALB/c及CB6F1小鼠體內不使用佐劑皮下注射。將小鼠以含有1nmol/氟肽之氟肽疫苗劑量(8種氟肽總共8nmol)，1nmol/肽之天然肽疫苗等效物(8種天然肽總共8nmol)免疫。疫苗製劑均 不含有任何佐劑。最後免疫10天後，將脾臟細胞以8種天然肽混合物以每肽1μg/ml再刺激。48小時後，藉助於多重流式細胞小球檢定(multiplexed bead assay，CBA)評定刺激培養物上清液之細胞介素。結果表明CBF6小鼠中之細胞介素特性受IFN-γ產生及表明Th1特性之TNF-α之大量產生支配(圖4)。由於此等Th1反應相較於CB6F1小鼠之較低強度(亦如IFN-γ ELISpot所觀測-參看圖1及2)及Th2細胞介素之增加，此Th1-支配之細胞介素特性相較於BALB/c小鼠更顯著。然而，在以氟肽免疫之BALB/c小鼠體內相較於其天然肽等效物觀測到增強之Th1反應。
氟肽疫苗刺激產生IFN-γ之肽-特異性CD4+及CD8+ T細胞兩者。
IFN-γ之胞內細胞介素染色用於提供關於產生IFN-γ之肽特異性CD4+及CD8+ T細胞頻率的資訊。小鼠經氟肽疫苗(如上文之8種氟肽之混合物)免疫且在使用8種天然肽(疫苗)之混合物的短刺激期後藉由流式細胞技術評定CD4+或CD8+脾細胞之胞內細胞介素染色。結果表明以氟肽疫苗使小鼠免疫能引起以0.5-2.6%頻率產生IFN-γ之肽特異性CD4+及CD8+ T細胞(圖5)。此驗證若肽含有相關MHC I類及II類抗原決定基，則氟肽嚙合MHC I類及II類抗原加工肽。
實施例2 由氟肽疫苗接種引發之免疫反應藉由與佐劑組合而促升。
在佐劑(弗氏完全佐劑(FCA))存在下，將氟肽疫苗(如上文之8種氟肽的混合物)之免疫原性與氟肽疫苗之免疫原性進行比較。氟肽疫苗(1nmol/肽)或在CFA中乳化之氟肽疫苗(1nmol/肽)用於使BALB/c小鼠免疫。免疫10天後，脾細胞以個別肽以10μg/ml刺激。48小時後，收集培養物上清液且使用多重流式細胞小球檢定(CBA)測試細胞介素。結果展示使用CFA作為另一佐劑可顯著促升Th1細胞介素(IFN-γ及IL-2)產生而不影響Th2細胞介素(IL-4、IL-5)產生(圖6)。因此，氟肽疫苗接種誘發之Th1反應在免疫期間較佳由與佐劑組合而促升。
氟肽疫苗投予之皮下及皮內途徑皆可誘發免疫反應。
在BALB/c小鼠體內使用皮內或皮下投予途徑比較氟肽疫苗(如上文之8種氟肽的混合物)之免疫原性。免疫10天後，脾細胞以個別肽以10μg/ml刺激且藉助於ELISPOT評定活體外IFN-γ產生。結果展示氟肽投予之皮下及皮內途徑皆適於誘發穩固抗原特異性反應(圖7)。
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Claims (26)

  1. 一種結構CmFn--CyHx-(Sp)-R之碳氟化合物載體-抗原構築體，其中m=3至30，n<=2m+1，y=0至15，x<=2y，(m+y)=3-30，Sp為視需要之化學間隔部分且R為選自下列之免疫性流行性感冒病毒之肽：HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK(SEQ ID NO：1)VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG(SEQ ID NO：4)YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE(SEQ ID NO：17)APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA(SEQ ID NO：18)SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY(SEQ ID NO：19)KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG(SEQ ID NO：20)DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS(SEQ ID NO：32)DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER(SEQ ID NO：35)及其同系物及組合，其中該同系物與SEQ ID NO：1、4、17、18或20具有至少50%一致性，與SEQ ID NO：19或32具有至少80%一致性或與SEQ ID NO：35具有至少95%一致性。
  2. 如申請專利範圍第1項之碳氟化合物載體-抗原構築體，其中R為選自下列之免疫性流行性感冒病毒之肽：HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK(SEQ ID NO：1)VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG(SEQ ID NO：4)YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE(SEQ ID NO：17)APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA(SEQ ID NO：18)SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY(SEQ ID NO：19) KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG(SEQ ID NO：20)DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS(SEQ ID NO：32)及DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER(SEQ ID NO：35)。
  3. 如申請專利範圍第1項之碳氟化合物載體-抗原構築體，其中該同系物與SEQ ID NO：1、4、17、18、19、20或32具有至少80%一致性，或與SEQ ID NO：35具有至少95%一致性。
  4. 如申請專利範圍第3項之碳氟化合物載體-抗原構築體，其中該同系物與SEQ ID NO：1、4、17、18、19、20、32或35具有至少95%一致性。
  5. 如申請專利範圍第1項之碳氟化合物載體-抗原構築體，其具有如下結構
  6. 一種醫藥組合物，其包含一或多種定義於申請專利範圍第1至5項中任一項之碳氟化合物載體-抗原構築體，以及視需要一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或佐劑。
  7. 如申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其經調配用於非經腸、經口、經眼、經直腸、經鼻、經皮、局部或經陰道投予或其為液體、乳液、固體或氣溶膠形式。
  8. 如申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其包含選自以下之佐劑：(1)天然細菌組份之天然或合成來源之精製品；(2)佐劑或增效劑；(3)水中油佐劑、油中水佐劑、免疫刺激複合物(ISCOM)、脂質體、 經調配之奈米及微米粒子；及(4)細菌毒素及類毒素。
  9. 如申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該天然細菌組份之天然或合成來源之精製品為弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)及其衍生物、胞壁醯二肽(muramyldipeptide，MDP)衍生物、CpG及單磷醯脂A。
  10. 如申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該佐劑或增效劑為皂素、鋁鹽或細胞介素。
  11. 如申請專利範圍第6至10項中任一項之醫藥組合物，其包含2至20種載體-抗原構築體。
  12. 如申請專利範圍第11項之醫藥組合物，其包含2至8種載體-抗原構築體。
  13. 如申請專利範圍第6至10項中任一項之醫藥組合物，其包含至少兩種載體-抗原構築體，第一構築體包含流行性感冒肽序列：HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK(SEQ ID NO：1)且第二構築體包含流行性感冒肽序列：YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE(SEQ ID NO：17)。
  14. 如申請專利範圍第6至10項中任一項之醫藥組合物，其包含5、6、7或8種載體-抗原構築體。
  15. 如申請專利範圍第14項之醫藥組合物，其包含5、6、7或8種載體-抗原構築體，該構築體包含下列流行性感冒肽序列：HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK(SEQ ID NO：1)VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG(SEQ ID NO：4) YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE(SEQ ID NO：17)APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA(SEQ ID NO：18)SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY(SEQ ID NO：19)KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG(SEQ ID NO：20)DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS(SEQ ID NO：32)DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER(SEQ ID NO：35)。
  16. 一種用於預防或治療流行性感冒之預防性疫苗或免疫治療性醫藥產品，其包含一或多種定義於申請專利範圍第1至5項中任一項之碳氟化合物載體-抗原構築體。
  17. 如申請專利範圍第16項之預防性疫苗或免疫治療性醫藥產品，其經調配用於非經腸、經黏膜、經口、經鼻、局部、經眼、經直腸、經皮或經陰道投予。
  18. 一種用於在動物中刺激對抗流行性感冒之免疫反應的藥劑，其包含定義於申請專利範圍第6至15項中任一項之醫藥組合物。
  19. 如申請專利範圍第18項之藥劑，其中該動物為鳥類或哺乳動物。
  20. 如申請專利範圍第19項之藥劑，其中該哺乳動物為人類。
  21. 如申請專利範圍第18至20項中任一項之藥劑，其中該醫藥組合物與抗流行性感冒療法組合。
  22. 如申請專利範圍第21項之藥劑，其中該抗流行性感冒療法為神經胺糖酸酶抑制劑。
  23. 如申請專利範圍第18至20項中任一項之藥劑，其中該醫藥組合物係同時地或分開地與基於體液反應之流行性感冒疫苗組合投予。
  24. 如申請專利範圍第23項之藥劑，其中該疫苗為含有血球凝集素之流行性感冒疫苗。
  25. 一種製備用於預防或治療流行性感冒之預防性疫苗或治療性醫藥產品之方法，其包含結合一或多種定義於申請專利範圍第1至5項中任一項之碳氟化合物構築體與一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或佐劑。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該預防性疫苗或治療性醫藥產品係用於非經腸、經黏膜、經口、經鼻、局部、經眼、經直腸、經皮或經陰道投予。
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