TW201400501A - 新穎抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

一種抗體或其功能性斷片，其可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列的多肽，且具有抗關節炎作用。

Description

新穎抗體及其用途
本發明係關於：識別期望之抗原且具有期望之活性的抗體；具有特定之互補性決定區域(complementarity determining region：以下稱為「CDR」)的該抗體；具有該CDR的嵌合抗體、人型化抗體(humanized antibody)、人類抗體；該抗體之功能性斷片；該抗體或其功能性斷片的修飾體；編碼該抗體或其功能性斷片或其修飾體之胺基酸序列的核苷酸；插入該核苷酸的重組載體(vector，後述若無特別註明時，載體皆指vector)；導入該載體的重組細胞；產生該抗體的細胞；包含培養此等細胞之任一種之步驟及從其培養物回收期望之抗體之步驟的該抗體之製造方法；包含該抗體的醫藥組成物；各種疾病之治療用或預防用的醫藥組成物，包含投與該抗體之步驟的各種疾病之治療方法或預防方法；用於調製各種疾病之治療用或預防用之醫藥組成物的該抗體之用途，用於各種疾病之治療或預防的該抗體之使用；包含該抗體的各種疾病之檢査用或診斷用組成物；使用該抗體的各種疾病之檢査方法或診斷方法；用於調製各種疾病之檢査用或診斷用組成物的該抗體之用途；用於各種疾病之檢査或診斷的該抗體之用途等。
類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis：以下稱為「RA」)係以關節滑膜為炎症主要部位的慢性炎症性疾病，最後經由骨‧軟骨之破壞，造成關節功能傷害，使患者的生活品質(QOL)顯著地降低的嚴重疾病。因免疫系統異常，本身的關節滑膜受到攻撃而發生炎症，其結果，引起關節的疼痛、腫脹、變形等症狀。先進國家之RA之罹病率為人口的0.5至1.0%，隨著年齡增高而增加(非專利文獻1)。
先前對於RA，係以甲胺喋呤(methotrexate)(MTX)等疾病修飾性抗類風濕症藥(DMARDS)或類固醇為中心進行治療，在抗炎症作用中雖呈現一定的效果，然而對於關節破壞的效果並不充分。近年，導入使用抗TNF生物製劑或抗IL-6受體抗體或CTLA4-Ig之先進治療，據報導對於一部分患者有達到緩解的案例，因係有效性高之治療法而受到注目。生物製劑之導入，將RA治療從延遲疾病進行之保守療法轉變為以積極達成緩解為目標之治療。
然而，即使投與抗TNF生物製劑，接受醫療之患者中3至4成效果不足，無法使所有RA患者得到完全緩解(非專利文獻2)。又，由於類固醇或先前生物製劑的藥效機制基本上為免疫抑制作用，所以被認為有使感染症風險增加的問題(非專利文獻3)。為了開發更安全且有效性高之治療藥，尋求建基於根據RA病因之新作用機制的治療方法。
至目前為止，RA之發病機制尚未解明，不過提出被稱為RA感受性基因之HLA-DR4或PADI4、PTPN22、TNFAIP3等基因之變異等遺傳性因素(非專利文獻4)。又，藉由年齡增長或壓力、生產、吸煙等引起之荷爾蒙平衡的異常、或細菌、病毒造成感染等環境因子亦被視為重要。就細菌而言，暗示黴漿菌或鏈球菌與RA有關係；就DNA病毒而言，指出EB病毒、B型肝炎病毒、疱疹病毒、細小病毒等感染與RA發病有關係(非專利文獻5)。又，來自逆轉錄病毒之因子之中，有被認定係RA之重要發病因子之一者。有文獻提出由下述2個機制誘發RA的假說：「HIV或HTLV-I使致癌基因(oncogene)之表現亢進，導致滑膜細胞的異常增殖」，以及「使被稱為tax或tat之轉錄活性化因子表現，而引起IL-1或IL-6等炎症性細胞激素(cytokine)的產生」(非專利文獻6)；亦有文獻暗示「人類內在性病毒(HERV)之群特異性抗原蛋白(gag)、超抗原(sag)或外殻蛋白(env)作用於T細胞受體，使T細胞過度活化，而使免疫功能出現破綻」而與RA發病相關(非專利文獻7)。不過，現認為實際上係由遺傳性原因與環境因子複雜地組合而使RA發病。
小鼠乳癌病毒(Murine Mammary Tumor Virus；以下稱為「MMTV」。)雖為誘導小鼠乳癌之逆轉錄病毒，然而有暗示存在於人類之乳癌患者中之報告(非專利文獻8)、MMTV之感染會影響小鼠免疫功能之報告(非專利文獻9)，不過不知MMTV與RA之關連。
又，雖然已知針對MMTV之env的單株抗體有抑制MMTV之感染或增殖的效果(非專利文獻10及11)，然而對於抑制RA或關節炎之發病及惡化的抗MMTVenv抗體，並未有任何揭示。
先前技術文獻 非專利文獻
非專利文獻1 Scott DL等人，「柳葉刀雜誌(Lancet)」，2010年，第376卷，p.1094-1108
非專利文獻2 Plant D等人，「關節炎風濕病學(Arthritis Rheumatology)」2011年，第63卷，第3號，p.645-653非專利文獻3 Tokuda H等人，「內科醫學(Internal Medicine)」2008年，第47號，p.915-923
非專利文獻4 Dieudé P，「關節骨骼脊椎(Joint Bone Spine)」2009年，第76卷，第6號，p.602-607
非專利文獻5 Berkun Y及Padeh S，「自體免疫力評論(Autoimmunity Reviews)」2010年，第9卷，第5號，p.A319-324．
非專利文獻6 Kalden JR及Gay S，「臨床及實驗免疫學(Clinical and Experimental Immunology)」1994年，第98卷，第1號，p.1-5
非專利文獻7 Balada E等人，「醫學病毒學評論(Reviews in Medical Virology)」2009年，第19卷，p.273-286
非專利文獻8 Taneja P等人，「分子診斷學之專業評論(Expert Review of Molecular Diagnostics)」2009年，第9卷，第5號，p.423-440
非專利文獻9 Acha-Orbea H等人，(生物科學新領域(Frontiers in Bioscience)」2007年，第12卷，p.1594-1604非專利文獻10 Mpandi MJ等人，「病毒學期刊(The Journal of Virology)」2003年，第77卷，第17號，p.9369-9377
非專利文獻11 Indik S等人，「癌症研究(Cancer Research)」2005年，第65卷，第15號，p.6651-6659
[發明之概要]
本案發明之一課題為提供本發明之識別蛋白質且可抑制關節炎的抗體、其功能性斷片或其修飾體。本發明之又一課題為提供包含該抗體之醫藥組成物。本發明之再一課題為提供用於治療或預防RA等自體免疫疾病的醫藥組成物。本發明之又再一課題為提供用於檢査或診斷RA等自體免疫疾病之發病、惡化、進行度、治療效果等的組成物。又，在本發明之其他課題中包含本發明之抗體之製造方法、供應於該製造方法之細胞、被導入該細胞之重組載體、被插入該載體之核苷酸、產生本發明之抗體的細胞等。
本發明係關於：(1)一種具有抗關節炎作用之抗體或其功能性斷片，其可識別包含下述(I)至(III)之任一項中所記載之胺基酸序列的多肽：(I)序列表之序列編號15所示之胺基酸序列；(II)具有可使關節炎發病及/或惡化之多肽的胺基酸序列，該胺基酸序列係由與具有互補鹼基序列之核苷酸在嚴苛條件下可雜交之核苷酸所具有之鹼基序列來編碼，其中該互補鹼基序列係與編碼序列表之序列編號15所示之胺基酸序列的鹼基序列互補，以及(III)可使關節炎發病及/或惡化之多肽所具有的胺基酸序列，該胺基酸序列係由在序列表之序列編號15所示之胺基酸序列中置換、刪除、附加或插入1個至數個胺基酸而成；(2)如(1)記載之抗體或其功能性斷片，其中該多肽在非還原狀態下之SDS-PAGE中之分子量為(I)50至55k、(II)50至55k及25至30k、或(III)70至75k；(3)如(1)或(2)記載之抗體或其功能性斷片，其可抑制骨破壞；(4)如(3)記載之抗體或其功能性斷片，其中該骨破壞係在膠原誘發性關節炎非人類動物模型中之作用；(5)如(1)至(4)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其中該抗關節炎作用係在膠原誘發性關節炎非人類動物模型中之作用； (6)如(1)至(5)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其中如(1)記載之多肽在膠原誘發性關節炎非人類動物模型中會使關節炎惡化；(7)如(1)至(6)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其中如(1)記載之多肽在膠原誘發性關節炎小鼠模型中可被檢測出；(8)如(1)至(7)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其可抑制於炎症患部之細胞激素產生；(9)如(8)記載之抗體或其功能性斷片，其中該細胞激素為炎症性細胞激素及/或趨化素(chemokine)；(10)如(8)或(9)記載之抗體或其功能性斷片，其中該炎症患部為膠原誘發性關節炎非人類動物模型的患部；(11)如(4)至(6)及(10)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其中該非人類動物為小鼠；(12)如(1)至(11)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽；(13)如(1)至(12)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其係由重鏈及輕鏈構成，該重鏈包含：由序列表之序列編號22所示之胺基酸序列所構成之CDRH1、由序列表之序列編號23所示之胺基酸序列所構成之CDRH2及由序列表之序列編號24所示之胺基酸序列所構成之CDRH3，該輕鏈包含：由序列表之序列編號25所示之胺基酸序列所構成之CDRL1、由序列表之序列編號26所示之胺基酸序列所構成之CDRL2及由序列表之序列編號27所示之胺基酸序列所構成之CDRL3； (14)如(1)至(12)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其係由重鏈及輕鏈構成，該重鏈包含：由序列表之序列編號36所示之胺基酸序列所構成之CDRH1、由序列表之序列編號37所示之胺基酸序列所構成之CDRH2及由序列表之序列編號38所示之胺基酸序列所構成之CDRH3，該輕鏈包含：由序列表之序列編號39所示之胺基酸序列所構成之CDRL1、由序列表之序列編號40所示之胺基酸序列所構成之CDRL2及由序列表之序列編號41所示之胺基酸序列所構成之CDRL3；(15)如(1)至(12)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其係由重鏈及輕鏈構成，該重鏈包含：由序列表之序列編號66所示之胺基酸序列所構成之CDRH1、由序列表之序列編號67所示之胺基酸序列所構成之CDRH2及由序列表之序列編號68所示之胺基酸序列所構成之CDRH3，該輕鏈包含：由序列表之序列編號69所示之胺基酸序列所構成之CDRL1、由序列表之序列編號70所示之胺基酸序列所構成之CDRL2及由序列表之序列編號71所示之胺基酸序列所構成之CDRL3；(16)如(1)至(12)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其係由重鏈及輕鏈構成，該重鏈包含：由序列表之序列編號112所示之胺基酸序列所構成之CDRH1、由序列表之序列編號113所示之胺基酸序列所構成之CDRH2及由序列表之序列編號114所示之胺基酸序列所構成之CDRH3，及該輕鏈包含：由序列表之序列編號115所示之胺基酸序列所構成之CDRL1、由序列表之序列編號 116所示之胺基酸序列所構成之CDRL2及由序列表之序列編號117所示之胺基酸序列所構成之CDRL3；(17)如(1)至(12)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其包含重鏈及輕鏈且可識別如(1)記載之多肽，該重鏈及輕鏈包含與如(13)至(16)之任一項記載之抗體的重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別具95%以上相同性的胺基酸序列；(18)如(1)至(12)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其係結合在如(13)至(16)之任一項記載之抗體或其功能性斷片所識別之抗原上之部位；(19)如(1)至(12)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其與如(13)至(16)之任一項記載之抗體或其功能性斷片競爭和(1)記載之多肽之結合；(20)如(1)至(19)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其中該抗體為嵌合抗體；(21)如(1)至(19)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其中該抗體為人型化抗體；(22)如(1)至(19)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其中該抗體為人類抗體；(23)一種核苷酸，其係在下述(I)至(III)之任一項中所記載之核苷酸：(I)包含編碼如(1)至(22)之任一項記載之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸； (II)由包含編碼如(1)至(22)之任一項記載之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列的鹼基序列所構成的核苷酸；及(III)由編碼如(1)至(22)之任一項記載之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列所構成的核苷酸；(24)一種重組載體，其中插入有如(23)記載之核苷酸；(25)一種重組細胞，其中導入有如(23)記載之核苷酸或如(24)記載之重組載體；(26)一種細胞，其產生如(1)至(22)之任一項記載之抗體；(27)一種如(1)至(22)之任一項記載之抗體或其功能性斷片之製造方法，其包含下述之步驟(I)及(II)：(I)培養如(25)或(26)記載之細胞的步驟；及(II)從前述步驟(I)所得到之培養物回收如(1)至(22)之任一項記載之抗體或其功能性斷片的步驟；(28)如(1)至(22)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其係藉由如(27)記載之方法而得到；(29)一種如(1)至(22)及(28)之任一項記載之抗體或其功能性斷片的修飾體；(30)一種醫藥組成物，其包含如(1)至(22)及(28)之任一項記載之抗體或其功能性斷片、或者如(29)記載之修飾體，做為有效成分； (31)如(30)記載之醫藥組成物，其為表現如(1)記載之多肽之個體之自體免疫疾病的治療藥或預防藥；(32)如(31)記載之醫藥組成物，其中該自體免疫疾病係類風濕性關節炎；(33)如(30)記載之醫藥組成物，其為表現如(1)記載之多肽之個體之關節炎的治療藥或預防藥，(34)一種類風濕性關節炎之檢査或診斷用組成物，其包含如(1)至(22)及(28)之任一項記載之抗體或其功能性斷片、或如(29)記載之修飾體；(35)如(13)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含在序列表之序列編號72至81(第40至49圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含在序列表之序列編號82至86(第50至54圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽；(36)如(13)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係在序列表之序列編號72至81(第40至49圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係在序列表之序列編號82至86(第50至54圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽；(37)如(13)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係以由序列表之序列編號19(第16圖)之胺基酸編號20至138所構成之胺基酸序列來表示，且輕鏈可變區域係以由序列表之序列編號21(第18圖)之胺基酸編號21至128所構成之胺基酸序列來表示； (38)如(35)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含選自序列表之序列編號72至74、76、及79至81(第40至42、44及47至49圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號82(第50圖)之胺基酸序列所示之肽；(39)如(36)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係選自序列表之序列編號72至74、76及79至81(第40至42、44及47至49圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係以序列表之序列編號82(第50圖)之胺基酸序列所示之肽；(40)如(35)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含選自序列表之序列編號72至74及76至78(第40至42及44至46圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號83(第51圖)之胺基酸序列所示之肽；(41)如(36)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係選自序列表之序列編號72至74及76至78(第40至42及44至46圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係在序列表之序列編號83(第51圖)中記載之胺基酸序列所示之肽；(42)如(35)記載之抗體或其功能性斷片，重鏈可變區域包含在序列表之序列編號72至74(第40至42圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號84(第52圖)之胺基酸序列所示之肽； (43)如(36)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係在序列表之序列編號72至74(第40至42圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係序列表之序列編號84(第52圖)之胺基酸序列所示之肽；(44)如(35)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含序列表之序列編號75(第43圖)之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號85(第53圖)之胺基酸序列所示之肽；(45)如(36)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係序列表之序列編號75(第43圖)之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係序列表之序列編號85(第53圖)之胺基酸序列所示之肽；(46)如(35)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含選自序列表之序列編號73、74、76及77(第41、42、44及45圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號86(第54圖)之胺基酸序列所示之肽；(47)如(36)記載之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係選自序列表之序列編號73、74、76及77(第41、42、44及45圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係序列表之序列編號86(第54圖)之胺基酸序列所示之肽；(48)一種抗體或其功能性斷片，其中該抗體係選自下述(i)至(xxi)： (i)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T13)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號76(第44圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(ii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T14)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號76(第44圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(iii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T15)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號76(第44圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(iv)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T8)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(v)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T9)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域； (vi)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T10)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號84(第52圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(vii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T11)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(viii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T18)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號78(第46圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(ix)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T12)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號75(第43圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號85(第53圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(x)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T1)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號72(第40圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域； (xi)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T2)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號72(第40圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T3)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號72(第40圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號84(第52圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xiii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T4)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xiv)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T5)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xv)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T6)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號84(第52圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域； (xvi)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T7)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xvii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T16)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號77(第45圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xviii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T17)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號77(第45圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xix)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T19)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號79(第47圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xx)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T20)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號80(第48圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域； (xxi)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T21)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號81(第49圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(49)如(1)至(22)及(28)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其包含重鏈及輕鏈且可識別如(1)記載之多肽，該重鏈及輕鏈包含與如(35)至(48)之任一項中所記載之抗體的重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別具95%以上相同性的胺基酸序列；(50)如(1)至(22)及(28)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其係結合在如(35)至(48)之任一項記載之抗體所識別之抗原上之部位；(51)如(1)至(22)及(28)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其與如(35)至(48)之任一項記載之抗體或其功能性斷片競爭和(1)記載之多肽之結合；(52)一種核苷酸，其係在下述(I)至(III)之任一項中所記載之核苷酸：(I)包含編碼如(35)至(51)之任一項記載之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸；(II)由包含編碼如(35)至(51)之任一項記載之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列的鹼基序列所構成的核苷酸；及 (III)由編碼如(35)至(51)之任一項記載之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列所構成的核苷酸；(53)如(52)記載之核苷酸，其中編碼如(35)至(51)之任一項記載之抗體之重鏈之一部分或全部胺基酸序列的鹼基序列係由序列表之序列編號91至10()(第58至67圖)之任一項所表示的鹼基序列，且編碼如(35)至(51)之任一項記載之抗體之輕鏈之一部分或全部胺基酸序列的鹼基序列係由序列表之序列編號103至107(第69至73圖)之任一項所表示的鹼基序列；(54)一種重組載體，其中插入有如(52)或(53)記載之核苷酸；(55)一種重組細胞，其中導入有如(52)或(53)記載之核苷酸或如(54)記載之重組載體；(56)一種細胞，其產生如(35)至(51)之任一項記載之抗體；(57)一種如(35)至(51)之任一項記載之抗體或其功能性斷片之製造方法，其包含下述之步驟(I)及(II)：(I)培養如(55)或(56)記載之細胞的步驟；及(II)從前述步驟(I)所得到之培養物回收如(35)至(51)之任一項記載之抗體或其功能性斷片的步驟；(58)如(35)至(51)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其係藉由如(57)記載之方法而得到；(59)一種如(35)至(51)及(58)之任一項記載之抗體或其功能性斷片的修飾體； (60)一種醫藥組成物，其包含如(35)至(51)及(58)之任一項記載之抗體或其功能性斷片、或者如(59)記載之修飾體，做為有效成分；(61)如(60)記載之醫藥組成物，其係表現如(1)記載之多肽之個體之自體免疫疾病的治療藥或預防藥；(62)如(61)記載之醫藥組成物，其中該自體免疫疾病係類風濕性關節炎；(63)如(60)記載之醫藥組成物，其係表現如(1)記載之多肽之個體之關節炎的治療藥或預防藥；(64)一種如(1)記載之多肽之檢測方法，其包含使可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體與受驗樣本接觸的步驟；(65)如(64)記載之檢測方法，其中該受驗樣本係來自受驗者的樣本；(66)如(65)記載之檢測方法，其中該來自受驗者之樣本係血漿；(67)一種RX蛋白質之定量方法，其包含使可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體與受驗樣本接觸的步驟；(68)如(67)記載之定量方法，其中該受驗樣本係來自受驗者之樣本；(69)如(68)記載之定量方法，其中該來自受驗者之樣本係血漿； (70)如(64)至(69)之任一項記載之方法，其中使用一種可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體；(71)如(64)至(69)之任一項記載之方法，其中使用二種以上之可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體；(72)如(71)記載之方法，其中使用三明治式ELISA(sandwich ELISA)；(73)一種類風濕性關節炎之檢査方法，其包含使可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體與受驗樣本接觸的步驟；(74)如(73)記載之檢査方法，其中該受驗樣本係來自受驗者之樣本；(75)如(74)記載之檢査方法，其中該來自受驗者之樣本係血漿；(76)一種類風濕性關節炎之診斷方法，其包含下述之步驟(I)至(III)：(I)使可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體與來自受驗者之血漿接觸的步驟；(II)測定來自受驗者之血漿中之如(1)記載之多肽之量的步驟；及(III)在來自受驗者之血漿中之步驟(II)記載之多肽之量，比來自健康者之血漿中之步驟(II)記載之多肽之量 多的情況，判定該受驗者罹患類風濕性關節炎或罹患該病之風險高的步驟；(77)一種多肽之測定用或診斷用組成物，其包含可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體；(78)如(77)記載之組成物，其係用於類風濕性關節炎之診斷；(79)如(77)或(78)記載之組成物，其包含一種可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體；(80)如(77)或(78)記載之組成物，其包含二種以上之可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體；(81)如(80)記載之組成物，其係用於三明治式ELISA法，(82)一種檢査用或診斷用之試藥或套組，其包含可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體；(83)如(82)記載之試藥或套組，其係用於自體免疫疾病之檢査或診斷；(84)如(83)記載之試藥或套組，其中該自體免疫疾病係類風濕性關節炎；(85)如(82)至(84)之任一項記載之試藥或套組，其包含一種可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體； (86)如(82)至(84)之任一項記載之試藥或套組，其包含二種以上之可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體；(87)如(82)至(86)之任一項記載之試藥或套組，其包含如(1)記載之多肽或其斷片或其修飾體；(88)如(13)記載之抗體或其功能性斷片，其中該抗體係大鼠抗體；(89)如(14)至(16)之任一項記載之抗體或其功能性斷片，其中該抗體係小鼠抗體；以及(90)如(30)至(33)及(60)至(63)之任一項記載之醫藥組成物，其係與另外的治療劑或預防劑組合使用。
藉由本發明所提供之抗體，可進行自體免疫疾病、關節炎、RA等之治療或預防，及RA等之檢査或診斷。
第1圖顯示藉由投與ADSF細胞所造成之膠原誘發性關節炎動物模型之關節炎惡化。縱軸顯示關節炎分數，横軸顯示初次膠原致敏後之日數。
第2圖顯示本發明中所製作之單株抗體與RX蛋白質的結合能力。縱軸係將與RX蛋白質之結合量之相對值以吸光度表示。
第3圖顯示從ADSF細胞培養液上清液所精製之RX蛋白質之SDS-PAGE解析結果(銀染色)。「MW標記」表示分子量標記。
第4圖表示使用從ADSF細胞培養液上清液所精製之RX蛋白質之單株抗體1(MAb1)的西方轉漬法解析結果。「MW標記」表示分子量標記。
第5圖表示從ADSF細胞培養液上清液所精製之RX蛋白質之MALDI-TOF-質量分析(以下稱為「MS分析」)結果。「*C」表示胺甲醯基甲基半胱胺酸(Carbamidomethyl cysteine)。「位置」表示相當於序列表之序列編號15所示之胺基酸序列中的胺基酸編號。「理論分子量」及「測定分子量」分別表示分子量之理論值及測定值。
第6圖顯示本發明之單株抗體與RX蛋白質的結合親和性。Ka表示結合速度常數，kd表示解離速度常數，KD表示解離常數。
第7圖顯示藉由投與RX蛋白質所造成之DBA/1小鼠之關節炎惡化。縱軸表示關節炎分數，横軸表示初次膠原致敏後之日數。載劑表示做為對照之PBS投與群。
第8圖顯示膠原誘發性關節炎小鼠模型中，單株抗體1(MAb1)及單株抗體2(MAb2)對關節炎惡化之抑制作用。縱軸表示關節炎分數，横軸表示初次膠原致敏後之日數。
第9圖顯示膠原誘發性關節炎小鼠模型中之MAb1的骨破壞抑制作用。縱軸表示骨破壞分數。
第10圖顯示RA患者之關節滑膜中之RX蛋白質之西方轉漬法解析結果。横軸表示患者之編號。M表示分子量標記，S表示來自ADSF細胞之RX蛋白質。
第11圖顯示從RA患者血漿精製之MAb1所識別之蛋白質帶的MALDI-TOF-MS分析結果。「*C」表示胺甲醯基甲基半胱胺酸。「位置」表示相當於序列表之序列編號15所示之胺基酸序列中之胺基酸編號。「理論分子量」及「測定分子量」分別表示分子量之理論值及測定值。
第12圖顯示從來自RA患者之關節滑膜之各RX基因之鹼基序列所轉譯的部分胺基酸序列(相當於序列表之序列編號15的胺基酸編號134至233)。ADSF表示來自ADSF細胞之部分序列，第1至4號表示來自RA患者(RA5至RA8)之部分序列。
第13圖顯示藉由三明治ELISA法所形成之RX蛋白質的校正曲線(決定係數R2=0.9993)。
第14圖顯示健康人及RA患者之血漿中的RX蛋白質量。RA9至RA26表示來自RA患者RA9至RA26的試料，HD1至HD8表示來自健康自願者HD1至HD8之試料。縱軸表示血中RX蛋白質濃度。
第15圖顯示MAb1重鏈基因之鹼基序列(序列表之序列編號18)。其中可變區域為核苷酸編號58至414。
第16圖顯示MAb1重鏈之胺基酸序列(序列表之序列編號19)。其中可變區域為胺基酸編號20至138。
第17圖顯示MAb1輕鏈基因之鹼基序列(序列表之序列編號20)。其中可變區域為核苷酸編號61至387。
第18圖顯示MAb1輕鏈之胺基酸序列(序列表之序列編號21)。其中可變區域為胺基酸編號21至129。
第19圖顯示MAb2重鏈可變區域基因之鹼基序列(序列表之序列編號32)。
第20圖顯示MAb2重鏈可變區域之胺基酸序列(序列表之序列編號33)。
第21圖顯示MAb2輕鏈可變區域基因之鹼基序列(序列表之序列編號34)。
第22圖顯示MAb2輕鏈可變區域之胺基酸序列(序列表之序列編號35)。
第23圖顯示MAb1、MAb2及單株抗體3(MAb3)之重鏈及輕鏈之可變區域中之CDR的胺基酸序列(序列表之序列編號22至27、36至41、及66至71)。
第24圖顯示編碼來自ADSF細胞之RX蛋白質之胺基酸序列的基因(RX基因)之鹼基序列(序列表之序列編號14)。為從序列編號60之鹼基序列(第28圖)削除相當於信號序列部分(序列編號60之核苷酸編號1至294)及3’-末端之111個鹼基(除去終止密碼子：序列編號60之鹼基序列的核苷酸編號1954至2064)者。
第25圖顯示來自ADSF細胞之RX蛋白質gp73ED的胺基酸序列(序列表之序列編號15)。為從序列編號61之鹼基序列(第29圖)削除信號序列(序列編號61之胺基酸編號1至98)及C末端之37個胺基酸(序列編號61之胺基酸編號652至688)者。
第26圖顯示編碼來自ADSF細胞之RX基因中gp52SU之胺基酸序列的鹼基序列：相當於序列表之序列編號14(第24圖)的核苷酸編號1至1128。
第27圖顯示來自ADSF細胞之RX蛋白質中gp52SU之胺基酸序列：相當於序列表之序列編號15(第25圖)的胺基酸編號1至376。
第28圖為編碼來自ADSF細胞之RX蛋白質前驅體之胺基酸序列的基因之鹼基序列(序列表之序列編號60)，其中該RX蛋白質前驅體之胺基酸序列包含信號序列及C末端序列。
第29圖顯示來自ADSF細胞之包含信號序列及C末端序列的RX蛋白質前驅體之胺基酸序列(序列表之序列編號61)。
第30圖顯示MAb3重鏈可變區域基因之鹼基序列(序列表之序列編號62)。
第31圖顯示MAb3重鏈可變區域之胺基酸序列(序列表之序列編號63)。
第32圖顯示MAb3輕鏈可變區域基因之鹼基序列(序列表之序列編號64)。
第33圖顯示MAb3輕鏈可變區域之胺基酸序列(序列表之序列編號65)。
第34圖顯示嵌合化MAb1對RX蛋白質之結合親和性。
第35圖顯示人型化MAb1中之重鏈蛋白質之表現質體及輕鏈蛋白質之表現載體(分別為H1至H10，及L1至L5)的組合，及賦予具有各個組合之人型化MAb1之編號(參考編號：T1至T21)。
第36圖顯示人型化MAb1對RX蛋白質之結合親和性。
第37圖顯示人型化抗體重鏈蛋白質之表現載體的製作。
第38圖顯示使用MAb2並藉由ELISA測定RX蛋白質之相對量所得到的校正曲線(決定係數R2=0.995)。
第39圖顯示使用MAb3並藉由ELISA測定RX蛋白質之相對量所得到的校正曲線(決定係數R2=0.9961)。
第40圖顯示人型化MAb1重鏈H1之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號72)。
第41圖顯示人型化MAb1重鏈H2之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號73)。
第42圖顯示人型化MAb1重鏈H3之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號74)。
第43圖顯示人型化MAb1重鏈H4之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號75)。
第44圖顯示人型化MAb1重鏈H5之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號76)。
第45圖顯示人型化MAb1重鏈H6之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號77)。
第46圖顯示人型化MAb1重鏈H7之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號78)。
第47圖顯示人型化MAb1重鏈H8之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號79)。
第48圖顯示人型化MAb1重鏈H9之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號80)。
第49圖顯示人型化MAb1重鏈H10之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號81)。
第50圖顯示人型化MAb1輕鏈L1之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號82)。
第51圖顯示人型化MAb1輕鏈L2之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號83)。
第52圖顯示人型化MAb1輕鏈L3之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號84)。
第53圖顯示人型化MAb1輕鏈L4之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號85)。
第54圖顯示人型化MAb1輕鏈L5之可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號86)。
第55圖顯示編碼人類IgG1之重鏈恆定區域的胺基酸序列之cDNA的鹼基序列(序列表之序列編號87)。
第56圖顯示人類IgG1重鏈恆定區域之增幅用引子F的鹼基序列(序列表之序列編號89)。
第57圖顯示人類IgG1重鏈恆定區域之增幅用引子R的鹼基序列(序列表之序列編號90)。
第58圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H1之可變區域之胺基酸序列的cDNA的鹼基序列(序列表之序列編號91)。
第59圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H2之可變區域之胺基酸序列的cDNA的鹼基序列(序列表之序列編號92)。
第60圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H3之可變區域之胺基酸序列的cDNA的鹼基序列(序列表之序列編號93)。
第61圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H4之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號94)。
第62圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H5之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號95)。
第63圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H6之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號96)。
第64圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H7之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號97)。
第65圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H8之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號98)。
第66圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H9之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號99)。
第67圖顯示編碼人型化MAb1重鏈H10之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號100)。
第68圖顯示編碼人類IgG1之輕鏈恆定區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號101)。
第69圖顯示編碼人型化MAb1輕鏈L1之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號103)。
第70圖顯示編碼人型化MAb1輕鏈L2之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號104)。
第71圖顯示編碼人型化MAb1輕鏈L3之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號105)。
第72圖顯示編碼人型化MAb1輕鏈L4之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號106)。
第73圖顯示編碼人型化MAb1輕鏈L5之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(序列表之序列編號107)。
第74圖顯示膠原誘發性關節炎小鼠模型中之人型化MAb1對關節炎惡化的抑制作用。縱軸表示關節炎分數。
第75圖顯示MAb4重鏈可變區域基因的鹼基序列(序列表之序列編號108)。
第76圖顯示MAb4重鏈可變區域之胺基酸序列(序列表之序列編號109)。
第77圖顯示MAb4輕鏈可變區域基因的鹼基序列(序列表之序列編號110)。
第78圖顯示MAb4輕鏈可變區域的胺基酸序列(序列表之序列編號111)。
第79圖顯示MAb4之重鏈及輕鏈可變區域中之CDR的胺基酸序列(序列表之序列編號112至117)。
第80圖顯示膠原誘發小鼠模型中之單株抗體4(MAb4)對關節炎惡化的抑制作用。縱軸表示關節炎分數，横軸表示初次膠原致敏後之日數。
第81圖顯示使用MAb4並藉由ELISA測定RX蛋白質之相對量所得到的校正曲線(決定係數R2=0.9905)。
第82圖為顯示小鼠膠原誘發性關節炎小鼠模型中，藉由投與本發明之人型化MAb1而達成之細胞激素產生之抑制作用之圖。縱軸表示四肢均質化樣本中之介白素6(IL-6)濃度。
第83圖為顯示小鼠膠原誘發性關節炎小鼠模型中，藉由投與本發明之人型化MAb1而達成之趨化素產生抑制作用之圖。縱軸表示四肢均質化樣本中之單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)濃度。
[用於實施發明之形態] 1.定義
本發明中，「基因」意指包含編碼蛋白質之胺基酸之鹼基序列的核苷酸或其互補鏈，例如，為包含編碼蛋白質之胺基酸之鹼基序列的核苷酸或其互補鏈的聚 核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等含於「基因」之意義中。該基因為單股、雙股或三股以上之核苷酸；DNA鏈與RNA鏈之聚合體，在單股之核苷酸鏈上核糖核苷酸(RNA)及去氧核糖核苷酸(DNA)混合存在者，及包含此種核苷酸鏈之雙股或三股以上的核苷酸亦包含於「基因」之意義中。就本發明之「RX基因」而言，可列舉如：包含編碼RX蛋白質之胺基酸序列之鹼基序列的DNA、mRNA、cDNA、cRNA等。
在本發明中，「核苷酸」與「核酸」為同義，例如，DNA、RNA、探針、寡核苷酸、聚核苷酸、引子等亦包含於「核苷酸」之意義中。該核苷酸為由單股、雙股或三股以上之鏈所構成之核苷酸，DNA鏈與RNA鏈之聚合體、單股之核苷酸鏈上，核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)混合存在者及包含此種核苷酸鏈之雙股或三股以上之鏈的聚合體亦包含於「核苷酸」之意義中。
在本發明中，「多肽」、「肽」及「蛋白質」為同義。
在本發明中，「抗原」有時以「免疫原」之意義來使用。
在本發明中，RX及RX蛋白質之任一者均意指包含小鼠乳癌病毒外套膜蛋白質(Murine Mammary Tumor Virus Envelope Protein；以下稱為「MMTVenv」)所具有之胺基酸序列的至少一部分，且使關節炎發病及/或惡化的多肽。
在本發明中，所謂「使關節炎發病及/或惡化」意指單獨、或與其他因子共同，或以與其他因子之聚合體之形式直接地或間接地使關節炎發病及/或惡化。
在本發明中，「細胞」亦包含來自動物個體之各種細胞、初代培養細胞、繼代培養細胞、細胞株、重組細胞及微生物等。
在本發明中，將識別RX蛋白質之抗體表記為「抗RX抗體」。「抗RX抗體」中包含抗RX嵌合抗體、抗RX人型化抗體、抗RX人類抗體等。
本發明中之「抗體之功能性斷片」意指達到原抗體所達到之功能之至少一部分的抗體斷片。就「抗體之功能性斷片」而言，可列舉如：Fab、F(ab’)2、scFv、Fab’、單股免疫球蛋白等，然而不以此等為限。該抗體之功能性斷片，除藉由將抗體蛋白質之全長分子以木瓜酵素、胃蛋白酶等酵素處理所得到者之外，亦可為使用重組基因，於適當宿主細胞中所產生之重組蛋白質。
在本發明中，抗體結合之「部位」，亦即抗體識別之「部位」，意指抗體所結合或識別的抗原上之部分肽或部分高階構造。在本發明中，該部位亦稱為抗原決定部位(epitope)、抗體之結合部位。就本發明之抗RX抗體所結合或識別之RX蛋白質上的部位而言，可例示RX蛋白質上之部分肽或部分高階構造等。
已知抗體分子之重鏈及輕鏈中各有3處互補性決定區域(CDR：complemetarity determining region)。互補性決定區域，亦可稱為高度變異區域(hypervariable domain)，其係在抗體之重鏈及輕鏈的可變區域內一次構造之變異性特別高的部位，在重鏈及輕鏈之多肽鏈的一次構造上，通常分別分離為3處。在本發明中，關於抗體之互補性決定區域，係將重鏈之互補性決定區域，從重鏈胺基酸序列之胺基末端側起，表記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之互補性決定區域，從輕鏈胺基酸序列之胺基末端側起，表記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等部位於立體構造上互相接近，決定對於所結合之抗原的特異性。
在本發明中，「抗體變異體」意指原抗體所具有之胺基酸序列中，具有經胺基酸置換、刪除、附加及/或插入(以下總稱為「變異」)而成之胺基酸序列，且可與本發明之RX蛋白質結合的多肽。該抗體變異體中之變異胺基酸的數目為1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個、1至10個、1至12個、1至15個、1至20個、1至25個、1至30個、1至40個或1至50個。該抗體變異體亦包含於本發明之「抗體」中。
在本發明中，「1至數個」中之「數個」意指2至10個。亦即，「1至數個」意指1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個、或1至10個，較佳為1至8個，更佳為1至5個，又更佳為1至3個，最佳為1至2個。
就本發明之抗體所表現之活性‧性質而言，可列舉如：生物活性、物理化學性質等，具體而言，可 列舉各種生物活性、對抗原或抗原決定部位之結合活性、製造或保存時之安定性、熱安定性等。
在本發明中，「在嚴苛條件下雜交」意指在含有5×SSC之溶液中，於65℃進行雜交，其次分別在含有2×SSC-0.1% SDS之水溶液中，於65℃進行20分鐘洗淨；在含有0.5×SSC-0.1% SDS之水溶液中，於65℃進行20分鐘洗淨；及在含有0.2×SSC-0.1% SDS之水溶液中，於65℃進行20分鐘洗淨，之條件或與此等同等條件下雜交。SSC意指150mM氯化鈉-15mM檸檬酸鈉之水溶液，n×SSC意指n倍濃度之SSC。
本發明中「抗關節炎作用」意指抑制關節炎之發病及/或惡化的活性或作用，與「抗關節炎活性」、「關節炎抑制作用」、「關節炎抑制活性」同義。
2.蛋白質 (2-1)特性
本發明之RX蛋白質具有以下之性質：(i)分子量為約73k(亦即70至75k；以下將顯示該分子量之肽稱為「gp73ED」)、約55k(亦即50至55k；以下將顯示該分子量之肽稱為「gp52SU」)及約28k(亦即25至30k；以下將顯示該分子量之肽稱為「gp28ED」)、或只約55k(gp52SU)。在本發明中，gp73ED意指為MMTVenv全長之gp73的細胞外區域，gp52SU意指由從gp73ED之N末端至約第376號之胺基酸所構成之區域，gp28ED意指具有接續gp52SU之C末端側之細胞膜貫通區域的亞單元(以下稱為「gp36TM」)之細胞外區域。雖 然序列表之序列編號15中之gp52SU與gp28ED之邊界在胺基酸編號第376號之絲胺酸殘基與胺基酸編號第377號之苯基丙胺酸殘基之間，然而本發明中之gp52SU與gp28ED之邊界並不以此為限。本發明之RX蛋白質，雖然皆係以從細胞膜等膜游離之形式存在，然而亦可為與細胞膜等膜結合之形式。其中所謂分子量，意指在SDS-PAGE中之非還原狀態下所觀察的分子量；(ii)在關節中會使關節炎發病及/或惡化。該關節炎之惡化亦包含有骨破壞之關節破壞等；以及(iii)包含以下(a)至(d)之任一項記載之胺基酸序列(以下稱為「RX胺基酸序列」)，或由包含RX胺基酸序列之胺基酸序列所構成，或由RX胺基酸序列所構成：(a)序列表之序列編號15(第25圖)所示之胺基酸序列；(b)顯示與序列表之序列編號15(第25圖)所示之胺基酸序列具80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上或99%以上之序列相同性，且可使關節炎發病及/或惡化之多肽的胺基酸序列；(c)在序列表之序列編號15(第25圖)所示之胺基酸序列中，置換、刪除、附加或插入1至50個、1至45個、1至40個、1至35個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個胺基酸，且可使關節炎發病及/或惡化之多肽的胺基酸序列；以及 (d)由與具有互補性鹼基序列的核苷酸在嚴苛條件下可雜交之核苷酸所具有的鹼基序列編碼，且可使關節炎發病及/或惡化之多肽的胺基酸序列，其中該互補性鹼基序列與編碼序列表之序列編號15(第25圖)所示之胺基酸序列的鹼基序列互補。
如前述，本發明之形態中，RX蛋白質為gp73ED、gp52SU、或包含gp52SU與gp28ED所成之複合體，本發明之形態中，本發明之抗體所識別之RX蛋白質，為gp73ED、gp52SU、或包含gp52SU及gp28ED之複合體。
又，RX蛋白質亦能以包含選自gp73ED及gp52SU所構成之族群中之1個或2個以上亞單元之同元(homo)或異元(hetero)寡聚合體的全部或一部分存在。若此種寡聚合體具有使關節炎發病及/或惡化之活性，為了方便，該寡會合體亦包含於本發明之「RX蛋白質」中；可識別該寡複合體且可抑制關節炎發病及/或惡化之抗體亦包含於本發明之「抗RX抗體」中。在本發明中，「複合體」亦可以「聚合體」之意義來使用。
序列表之序列編號15(第25圖)顯示gp73ED之胺基酸序列的一例。
gp52SU之胺基酸序列的一例係由序列表之序列編號15所示之胺基酸序列中之胺基酸編號1(Glu)至376(Ser)所構成(第27圖)。gp28ED之胺基酸序列的一例係由序列表之序列編號15所示之胺基酸序列中之胺基酸編號377(Phe)至553(Lys)所構成。但是，RX蛋白質 之胺基酸序列，並不以此等為限，只要為在關節中使關節炎發病及/或惡化之多肽的胺基酸序列，如上述(b)至(d)之任一項記載者，均包含於本發明之RX蛋白質中。
個體、組織、體液、細胞、含有RX蛋白質之部分、精製或部分精製RX蛋白質製劑等中，或複數個個體、組織、細胞、含有RX蛋白質部分或RX蛋白質製劑之間，RX蛋白質之所具有之胺基酸序列及/或其他性質，可不相同，亦可不均勻。在一個個體、組織、體液、細胞、含有RX蛋白質之部分、精製或部分精製RX蛋白質製劑等中，亦可包含複數種相異的胺基酸序列及/或具有相異性質的RX蛋白質。又，在複數個個體、組織、細胞、含有RX蛋白質部分或RX蛋白質製劑之間，RX蛋白質之胺基酸序列及/或其他性質可相異。縱使該胺基酸序列及/或性質相異之蛋白質，只要具備上述(i)至(iii)記載之性質，任一者均包含於本發明之「RX蛋白質」中。
再者，就MMTVenv之胺基酸序列而言，可列舉如：在序列編號15所示之胺基酸序列之C末端附加37個胺基酸(在序列編號61所示之胺基酸序列中可發現相當於該胺基酸的胺基酸)而成之胺基酸序列、從序列編號61所示之胺基酸序列刪減胺基酸編號1至98(信號肽)而成之胺基酸序列等。
(iv)本發明之RX蛋白質，可從來自脊椎動物(較佳為哺乳動物，更佳為小鼠、大鼠等齧齒類及人類，又更佳為人類或小鼠)之組織、來自該組織之細胞、該細 胞之培養物等得到。就該組織及細胞而言，只要有RX蛋白質存在即可，無特別限定，然而可列舉如：關節組織、血液、淋巴液、胸腺、脾臓、來自此等之任一者之細胞等。較佳之組織及細胞為來自關節炎發病者，或呈現類似症狀之動物或病患者。但是，本發明之RX蛋白質的來源不限定前述者，可為來自其他動物種類、其他組織、其他細胞等，只要具備上述(i)至(iii)記載之性質，即包含於本發明之RX蛋白質的意義中。
(v)本發明之RX蛋白質，可包含第5圖記載之1個或2個以上之胺基酸序列(序列表之序列編號1至13)。該胺基酸序列中之胺甲醯基甲基半胱胺酸可為半胱胺酸或胱胺酸，亦可在與分子內外之其他半胱胺酸之間以二硫鍵鍵鍵結。
本發明之RX蛋白質可包含第11圖記載之1個或2個以上之胺基酸序列(序列表之序列編號42至52)。該胺基酸序列中之胺甲醯基甲基半胱胺酸可為半胱胺酸或胱胺酸，亦可在與分子內外之其他半胱胺酸之間以二硫鍵鍵結。
本發明之RX蛋白質可為天然型及重組型之任一者。又，與載體(carrier)或標籤等其他肽或蛋白質之融合物亦包含於RX蛋白質之意義中。再者，施行包含PEG等聚合物附加之化學修飾及/或包含糖鏈修飾之生物學修飾者，亦包含於RX蛋白質之意義中。又，RX蛋白質斷片亦包含於本發明之RX蛋白質的意義中。將RX蛋白質斷片之中具備上述(ii)記載之性質者稱為RX蛋白質功能性斷片。
本發明之RX蛋白質，可在罹患關節炎或類風濕性關節炎等自體免疫疾病的個體及/或膠原誘發性關節炎小鼠模型中被檢測出。例如，在使用DBA/1品系小鼠製作膠原誘發性關節炎模型之情況中，可在該等小鼠血中檢測出本發明之RX蛋白質。但是，RX蛋白質之檢測會有物種差異、品系差異及個體差異。
(2-2)基因
本發明之RX基因，包含以下(a)至(c)之任一項記載之鹼基序列(以下稱為「RX基因序列」)，或由包含RX基因序列之鹼基序列所構成，或由RX基因序列所構成：(a)序列表之序列編號14(第24圖)所示之鹼基序列；(b)與互補性鹼基序列所構成之核苷酸在嚴苛條件下可雜交，且編碼使關節炎發病及/或惡化之多肽之胺基酸序列的鹼基序列，其中該互補性鹼基序列係與序列表之序列編號14(第24圖)所示之鹼基序列互補；及(c)在序列表之序列編號14(第24圖)所示之鹼基序列中，置換、刪除、附加或插入1至150個、1至140個、1至130個、1至120個、1至110個、1至100個、1至90個、1至80個、1至70個、1至60個、1至50個、1至45個、1至40個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個鹼基而形成，且編碼使關節炎發病及/或惡化之多肽之胺基酸序列的鹼基序列。
如前述，在本發明之一形態中，RX蛋白質係由gp73ED之單股多肽所構成。又，在其他形態中，gp52SU與gp28ED聚合，形成複合體。在本發明之一形態中，RX基因編碼gp73ED，或編碼gp52SU與gp28ED二者，在另一形態中，RX基因只編碼gp52SU。
RX基因之表現在自體免疫疾病，例如，類風濕性關節炎中表現亢進。尤其，在來自類風濕性關節炎患者或類風濕性關節炎動物模型之關節組織或血液部分，例如，在來自該患者之關節滑膜或血漿部分中，RX基因之表現亢進。
RX基因之表現及表現量的測定，可以RX基因之轉錄產物及RX蛋白質之任一者做為指標，前者可藉由RT-PCR法、北方轉漬‧雜交法等，後者可藉由酶聯免疫吸附檢定(enzyme-linked immuno-sorbent assay；以下稱為「ELISA」)等免疫檢定法等分別測定。
序列表之序列編號14(第24圖)表示編碼gp73ED之胺基酸序列之鹼基序列的一例。編碼gp52SU之胺基酸序列之鹼基序列的一例係由序列表之序列編號14所示之鹼基序列中核苷酸編號1至1128所構成(第26圖)。編碼gp28ED之胺基酸序列之鹼基序列的一例，係由序列表之序列編號14所示之鹼基序列中核苷酸編號1129至1659所構成。但是，RX基因的鹼基序列並不以此等為限；具有如上述(b)及(c)之任一項記載之鹼基序列的基因，只要具有編碼「在關節中可使關節炎發病及/或惡化之多肽之胺基酸序列」的鹼基序列，均包含於本發明之RX基因中。
(2-3)蛋白質之調製
本發明之RX蛋白質，可藉由從動物組織(包含體液)、來自該組織之細胞、或該細胞培養物之精製及分離、基因重組、體外轉譯、化學合成等而調製。
(2-3-1)天然型RX之精製、分離
天然型RX蛋白質，可從例如，來自罹患RA等自體免疫疾病、關節炎等之患者或非人類動物之組織(包含體液、細胞等)、來自該組織之細胞、該細胞之培養物等精製、分離。該非人類動物亦包含該疾病動物模型。就供給模型製作的動物而言，只要為脊椎動物即可，無特別限定，較佳為哺乳動物，更佳為小鼠、大鼠等齧齒類，又更佳為小鼠或大鼠。就此種患者或動物模型之組織及細胞而言，只要存在RX蛋白質即可，無特別限定，然而可列舉如：關節組織、血液、淋巴液、胸腺、脾臓、來自此等任一者之細胞等。較佳之組織及細胞為來自關節炎發病，或呈現類似症狀之患者或動物模型者。但是，本發明之RX蛋白質之來源，並不限定於前述項目，亦可為來自其他動物種類、其他組織、其他細胞等。
從該組織、細胞、細胞培養物等之精製‧分離，可藉由將本技術領域人士所周知之分餾、層析等方法組合而進行。該等方法包含鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、疏水層析、順相或逆相層析等，不過不以此等為限。親和層析用管柱可藉由製備及充填抗RX單株抗體交聯而成之親和凝膠而製作。藉由在該管柱 中添加含有RX蛋白質之粗部分或局部精製部分，繼而以滅菌之磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)除去非特異性吸附物後，添加溶出用緩衝液，可選擇性地回收RX蛋白質。含有RX蛋白質之溶液，可藉由凝膠過濾或Centriprep等濃縮裝置，進行緩衝液交換及/或濃縮。
從來自關節炎小鼠模型之細胞調製RX蛋白質之方法可用以下之例子例示。
若對小鼠等非人類動物投與佐劑、姥鮫烷(pristane)、抗膠原抗體、二型膠原蛋白等，可人為地使關節炎發病。
使關節炎惡化後，以無菌方式採取後肢踝關節部之組織，並在培養皿中從組織片浸潤出細胞。藉由將所得到之細胞在培養基中培養1至6個月，可取得天然型RX產生細胞。以該細胞本身及細胞培養上清液之濃縮物將動物免疫，可取得單株抗體。用於免疫之動物種類，可列舉如：大鼠、小鼠等齧齒類。最終免疫後，從動物之脾臓採取細胞，使其與骨髓瘤細胞進行細胞融合而得到融合細胞(融合瘤)。就抗體產生細胞而言，不限定於脾臓，亦可利用胸腺或淋巴節之細胞。就使用於細胞融合之骨髓瘤細胞而言，亦可使用8-653株、P3株、NS-1株等周知之細胞株。就細胞融合促進劑而言，可利用聚乙二醇(PEG)或仙台病毒(HVJ)等，並可視需要添加二甲基亞碸等補助劑。使用極限稀釋法，篩選產生與RX蛋白質特異性結合之抗體的融合瘤，可單一純系化。抗體產生細胞之選殖，除極限稀釋法外，亦可利用細胞螢 光儀(cytofluorometer)或ClonePix(Genetix公司)等細胞分離裝置。此種方式所製作之融合瘤可在通常之培養基中培養，又，可使用細胞保存液(例如，Cell Banker；Juji Field股份有限公司)等，在液體氮中長期保存。為了從該融合瘤得到抗體，可應用：使用抗體產生用燒瓶(例如，CL-1000燒瓶；Becton Dickinson公司)調製培養上清液之方法、將融合瘤接種於與融合瘤有適合性之哺乳類動物中而得到腹水之方法等。可從以此種方法所得到之含抗體溶液精製抗RX單株抗體。藉由使用充填有所得到之抗RX單株抗體交聯而成之親和凝膠的管柱，可將含有RX蛋白質之部分所含的RX蛋白質選擇性地濃縮。又，藉由將其他分離‧精製用之方法適當組合，可將RX蛋白質精製、分離。
(2-3-2)重組型RX蛋白質之調製
本發明之RX蛋白質，亦可調製為重組型。亦即，將編碼RX蛋白質或RX蛋白質斷片之胺基酸序列的基因導入宿主細胞中，可從該細胞之培養物回收RX蛋白質。例如，將RX基因或其斷片插入表現載體中，繼而將該重組載體導入原核或真核之宿主細胞中，並將所得到之重組細胞保溫，可在該細胞中使RX蛋白質表現。就表現形式而言，可使用分泌表現、細胞內可溶表現、包涵體(inclusion body)法等周知之形式。又，不僅可使胺基末端(N末端)及/或羧基末端(C末端)與天然型相同之分子表現，亦可以與分泌信號、細胞內定位信號、親和精製用標籤、配偶(partner)肽之融合蛋白質之形式 來表現。從該重組細胞培養物精製、分離RX蛋白質，可藉由將在(2-3-1)天然型RX蛋白質之精製、分離中所記載之分餾、層析等操作適當組合而進行。
RX基因或其斷片可藉由本技術領域人士周知之方法調製。可列舉如：以表現RX基因之cDNA基因庫做為模板，並使用可將該序列特異地增幅之一組引子來進行的聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」；Saiki,R.K.,et al.,Science(1988)239,p.487-489)；以表現RX基因之mRNA部分做為模板，並使用可將該序列逆轉錄之引子及可將該序列特異性增幅之一組引子來進行的逆轉錄PCR(以下稱為「RT-PCR」)；利用免疫檢定的表現選殖、利用精製RX蛋白質之部分胺基酸序列的cDNA選殖等。
(2-3-3)體外轉譯
本發明之RX蛋白質亦可藉由體外轉譯而調製。就該轉譯法而言，只要利用包含轉錄及轉譯中所需要之酵素、基質及能量物質之無細胞轉譯系統的方法即可，無特別限定，然而可列舉如：利用Roche Diagnostics公司製之快速轉譯系統(RTS)的方法。
(2-3-4)化學合成
本發明之RX蛋白質亦可藉由化學合成而調製。就化學合成法而言，可列舉如：Fmoc合成法、Boc合成法等肽固相合成法。
3.抗體 (3-1)抗體之種類
本發明之抗體，可為單株抗體及多株抗體之任一種。就本發明之單株抗體而言，可列舉來自非人類動物之抗體(非人類動物抗體)、來自人類之抗體(人類抗體)、嵌合抗體、人型化抗體等。
就非人類動物抗體而言，可列舉：來自哺乳類、鳥類等脊椎動物之抗體等。就來自哺乳類之抗體而言，可列舉小鼠抗體、大鼠抗體等來自齧齒類之抗體等。就來自鳥類之抗體而言，可列舉鷄抗體等。
就嵌合抗體而言，可列舉：將來自非人類動物抗體之可變區域與人類抗體(人類免疫球蛋白)恆定區域結合所形成之抗體等，然而並不以此為限。就來自非人類動物抗體之可變區域而言，可例示後述之來自MAb1、MAb2及/或MAb3之重鏈及輕鏈可變區域。
就人型化抗體而言，可列舉：將非人類動物抗體之可變區域中的CDR移植至人類抗體(人類免疫球蛋白之可變區域)者、除了CDR之外亦將非人類動物抗體之框架區域(framework region)之序列之一部分移植至人類抗體者、將來自此等之任一者的非人類動物抗體之1個或2個以上胺基酸以人型之胺基酸置換而成者等，然而不以此等為限。就非人類動物抗體之可變區域中之CDR而言，可例示後述之來自MAb1、MAb2及/或MAb3之重鏈可變區域中的CDRH1至3及輕鏈可變區域中的CDRL1至3。
就人類抗體而言，只要為識別本發明之抗原的抗體即可，無特別限定，然而可列舉如：具有本發明 之抗體之CDR的人類抗體。就本發明之人類抗體之CDR而言，可例示後述之來自MAb1、MAb2及/或MAb3之重鏈可變區域中的CDRH1至3及輕鏈可變區域中的CDRL1至3。
本發明中之抗體，可係由來自複數個相異抗體的部分所構成的抗體，可列舉如：複數個相異抗體間將重鏈及/或輕鏈交換者、將重鏈及/或輕鏈之全長交換者、只將可變區域或只將恆定區域交換者、將CDR之全部或只將一部分交換者等。嵌合抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域可來自相異之本發明抗體。人型化抗體之重鏈及輕鏈之可變區域中的CDRH1至3及CDRL1至3，可來自2種或以上之本發明抗體。人類抗體之重鏈及輕鏈之可變區域中的CDRH1至3及CDRL1至3，亦可為將2種或以上之本發明抗體所具有的CDR的組合。
本發明之單株抗體之同型(isotype)無特別限定，可列舉如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等IgG；IgM；IgA1、IgA2等IgA；IgD；IgE等，較佳可列舉IgG及IgM。單株抗體之同型及亞類(subclass)，可藉由例如，奧脫洛尼氏(Ouchterlony)法、ELISA法、放射免疫檢定(radio immunoassay)(以下稱為「RIA」)法等決定，亦可利用市售之鑑定用套組(Mouse Typer套組：Bio-Rad公司製等)。
(3-2)抗體之抗原結合活性
本發明之抗體識別RX蛋白質。換句話說，本發明之抗體係與RX蛋白質結合。該抗體表記為「抗RX抗體」。又，本發明之較佳抗體特異地識別RX蛋白 質。換句話說，本發明之較佳抗體係與RX蛋白質特異地結合。
本發明中「特異地識別」、亦即「特異地結合」，意指非以非特異地吸附之方式結合。就結合是否為特異之判定基準而言，可列舉如解離常數(dissociation consitant；以下稱為「KD」)。本發明之較佳抗體對RX蛋白質之KD值為1×10-5以下、5×10-6以下、2×10-6以下或1×10-6以下，更佳為5×10-7以下、2×10-7以下或1×10-7以下，又更佳為5×10-8以下、2×10-8以下或1×10-8以下，又再更佳為5×10-9以下、2×10-9以下或1×10-9以下，最佳為5×10-10以下、2×10-10以下或1×10-10以下。
本發明中之抗原與抗體之結合，可藉由ELISA法、RIA法、表面等離子共振(surface plasmon resonance)(以下稱為「SPR」)解析法等測定或判定。就使用於SPR解析之機器而言，可例示BIAcoreTM(GEHealth Care公司)、ProteOnTM(BioRad公司)、SPR-NaviTM(BioNavis公司)、SpreetaTM(Texas Instruments公司)、SPRi-PlexIITM(Horiba公司)、Autolab SPRTM(Metrohm公司)等。在細胞表面上表現之抗原與抗體之結合，可藉由流式細胞技術(flow cytometry)法等測定。
本發明之抗體所結合之RX蛋白質，如前述在關節中使關節炎發病及/或惡化。該關節炎之惡化亦包含具有骨破壞之關節破壞等。該關節炎之發病及/或惡化，可在，例如，膠原誘發性關節炎非人類動物模型，較佳該小鼠模型之關節中見到。
(3-3)抗體之生物活性
本發明之抗體，在某些較佳形態中，具有關節炎抑制活性(抗關節炎活性)。
抗關節炎活性意指抑制關節炎之發病及/或惡化的活性。
抗關節炎活性，依照常用方法可藉由關節炎分數之改善程度來評價。例如，膠原誘發性關節炎小鼠被廣泛使用做為RA及關節炎之病態模型，各肢之關節炎程度，按照後述來計分而判定「未發病：0，第一關節出現紅斑及浮腫：1，擴及第二關節之紅斑及浮腫：2，全肢出現紅斑及浮腫：3，出現變形或僵直：4」，可將四肢之判定結果的總點數做為個體的關節炎分數，進行評價。
在本發明中，將與對照群相比，使該個體之關節炎分數(記載於前段落中)降低稱為「具有抗關節炎作用」；將與對照群相比，使該個體之關節炎分數降低N%以上，稱為「具有N%以上之抗關節炎作用」。例如，將使該分數降低30%以上稱為「具有30%以上之抗關節炎作用」，將使該分數降低50%以上稱為「具有50%以上之抗關節炎作用」。該關節炎分數，較佳為在膠原誘發性關節炎非人類動物模型，更佳為在該小鼠模型中所測定之分數，又更佳為依照實施例6a及6b中記載之方法所測定之關節炎分數。從該小鼠模型之致敏至測定為止的日數為30日以上，較佳為40日以上。在受檢化合物為抗體之情況，較佳之對照群係從做為陰性對照之正 常大鼠血清所精製之IgG(以下稱為「對照IgG抗體」)投與群。
本發明之抗體，不僅具有抗關節炎活性，亦可具有抑制骨破壞之活性。就伴隨RA之骨破壞而言，一般有因血管翳(pannus)造成邊緣骨糜爛之形成或關節裂隙狹小化、軟骨下骨之骨嚢瘤的形成、伴隨關節周圍之骨質疏鬆症性變化的骨萎縮、骨壞死及藉由此等之複合所產生的脆弱性或疾病性骨折等。骨破壞之改善度可用以下之方式測定。例如，於動物模型之情況，可在實驗終了後，以軟X光攝影四肢，對於跟骨、跗骨、蹠骨等每個部分，按照，例如，正常：0，輕度：1，中度：2，重度：3來計分。在患者之情況，亦可在投藥治療之前後或治療中，同樣地以X光攝影四肢並計分。該骨破壞之抑制，可於例如膠原誘發性關節炎非人類動物模型(以該小鼠模型為較佳)中進行評價。
再者，抗關節炎活性，可用關節炎生化標記(關節炎標記)、骨破壞標記等做為指標進行測定或判定。
就關節炎標記而言，只要與關節炎之程度、進行度、治療所產生之治癒度等相關的指標即可，無特別限定，然而可列舉如：IL-1β、IL-6、IL-12等炎症性細胞激素；MCP-1、巨噬細胞發炎蛋白-1α(macrophage inflammatory protein 1 alpha；MIP-1α)、正常T細胞表現分泌之調節活化因子(regulated on activation,normal T cell expressed and secreted)(RANTES)等趨化素、脂質介質(mediator)等、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)等酵素、 抗環瓜胺酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide)(anti-CCP)抗體等抗體等。
本發明之抗體可具有細胞激素產生之抑制活性，更佳為具有抑制炎症性細胞激素及/或趨化素之產生之活性。該細胞激素產生之抑制活性較佳出現於炎症患部，例如，可在膠原誘發性關節炎非人類動物模型，較佳在該小鼠模型之炎症患部進行評價。
本發明之抗RX抗體可具有抑制血液中骨破壞標記產生之活性(包含抑制「促進產生」的活性)。就該骨破壞標記而言，可列舉如：二型膠原端肽、一型膠原端肽、MMP9等。雖可分別使用市售之ELISA套組測定，然而不以此等為限。本發明之由抗RX抗體所產生之關節破壞抑制活性，亦可利用微CT(電腦斷層掃描)等影像技術，以影像解析直接測定。在動物模型之情況，雖可於實驗終了後或經時地對四肢進行微CT攝影，並按照關節破壞之嚴重度計分而進行評價，不過只要為可評價關節破壞之影像技術即可，不限於該方法。
本發明之抗體，可具有使RX蛋白質之量減少的活性，較佳為具有使自體免疫疾病或關節炎中之RX蛋白質量減少的活性。該RX蛋白質之量之減少，可在例如膠原誘發性關節炎非人類動物模型(以該小鼠模型為較佳)中進行評價。
本發明之抗RX抗體可具有抗體依存性細胞毒性(ADCC)及/或補體依存性毒性(CDC)及/或抗體依存性細胞媒介吞噬作用(ADCP)活性。ADCC活性、CDC活性及ADCP活性可藉由周知之方法測定。
在ADCC活性之測定方面，可使用表現目標抗原的細胞(標的細胞)及殺傷該標的細胞之作用細胞(effector cell)。作用細胞經由Fcγ受體，識別與標的細胞結合之抗體之Fc區域。藉由從Fcγ受體傳達之信號，作用細胞將標的細胞殺傷。在測定來自人類之具有Fc區域之抗體之ADCC活性的情況，可使用人類NK細胞做為作用細胞。人類NK細胞可藉由周知之方法從人類末梢血液單核球(PMBC)調製。或者亦可將PMBC原樣做為作用細胞使用。
在ADCP活性之測定方面，可使用表現目標抗原的細胞(標的細胞)，及吞食該標的細胞的單核球或巨噬細胞等作用細胞。此等作用細胞，可藉由周知之方法從人類末梢血液單核球(PMBC)分離出單核球部分，並藉由周知之方法使其誘導分化成巨噬細胞而調製。
(3-4)使用於抗體檢定之細胞
本發明之抗RX抗體亦可應用於評價系統，其中該評價系統採用能藉由RX蛋白質誘發任何回應之細胞株或初代培養細胞。就此種細胞株而言，可例示來自人類滑膜之細胞株(SW982細胞、ATCC No.HTB-93)或小鼠巨噬細胞型細胞株(RAW 264.7 ATCC NO.TTB-71)等，就初代培養細胞而言，可例示小鼠骨髓細胞等。就藉由RX蛋白質所誘發之細胞活化指標而言，可列舉如：鈣流入(Ca influx)、來自細胞之細胞激素產生等。抗RX抗體對抗此等細胞活化之效果可藉由前述之評價系統評價。關於細胞內鈣，可使用例如FLUO-4 kit NW鈣檢定 套組(Cat.# F36206、Invitrogen公司)等來測定。細胞激素等可使用市售之套組來測定。但是，只要為能夠測定RX蛋白質所誘發之細胞反應及其之抑制的系統即可，不以此等為限。
(3-5)單株抗體
抗體1(MAb1)係依照實施例2之a)記載之方法，將ADSF細胞及其培養上清濃縮液混合，投與至WKY/NCrj大鼠之腹腔內及足蹟皮內而得到之單株抗體。
MAb1之重鏈的鹼基序列記載於序列表之序列編號18(第15圖)中，胺基酸序列記載於序列編號19(第16圖)中。MAb1之輕鏈的鹼基序列記載於序列表之序列編號20(第17圖)中，胺基酸序列記載於序列編號21(第18圖)中。重鏈可變區域的鹼基序列相當於序列表之序列編號18(第15圖)之核苷酸編號58至414，胺基酸序列相當於序列編號19(第16圖)之胺基酸編號20至138。重鏈恆定區域的鹼基序列相當於序列表之序列編號18(第15圖)的核苷酸編號415至1383，胺基酸序列相當於序列編號19(第16圖)的胺基酸編號139至460。輕鏈可變區域的鹼基序列相當於序列表之序列編號20(第17圖)的核苷酸編號61至387，胺基酸序列相當於序列編號21(第18圖)的胺基酸編號21至129。輕鏈恆定區域的鹼基序列相當於序列表之序列編號20(第17圖)的核苷酸編號388至705，胺基酸序列相當於序列編號21(第18圖)的胺基酸編號130至234。CDRH1之胺基酸序列記載於序列編號22(第23圖)中，CDRH2之胺基酸序列記載於 序列編號23(第23圖)中，CDRH3之胺基酸序列記載於序列編號24(第23圖)中。CDRL1之胺基酸序列記載於序列編號25(第23圖)中，CDRL2之胺基酸序列記載於序列編號26(第23圖)中，CDRL3之胺基酸序列記載於序列編號27(第23圖)中。
抗體2(MAb2)係依照實施例2之c)記載之方法，將從ADSF細胞之培養上清液所精製之RX蛋白質投與至BALB/c小鼠之腹腔內而得到之單株抗體。
MAb2之重鏈可變區域的鹼基序列記載於序列表之序列編號32(第19圖)中，胺基酸序列記載於序列編號33(第20圖)中。Mab2之輕鏈可變區域的鹼基序列記載於序列表之序列編號34(第21圖)中，胺基酸序列記載於序列編號35(第22圖)中。CDRH1之胺基酸序列記載於序列編號36(第23圖)中，CDRH2之胺基酸序列記載於序列編號37(第23圖)中，CDRH3之胺基酸序列記載於序列編號38(第23圖)中。CDRL1之胺基酸序列記載於序列編號39(第23圖)中，CDRL2之胺基酸序列記載於序列編號40(第23圖)中，CDRL3之胺基酸序列記載於序列編號41(第23圖)中。
抗體3(MAb3)係依照實施例2之c)記載之方法，將從ADSF細胞之培養上清液所精製之RX蛋白質投與至對BALB/c小鼠之腹腔內而得到之單株抗體。
MAb3之重鏈可變區域的鹼基序列記載於序列表之序列編號62(第30圖)中，胺基酸序列記載於序列編號63(第31圖)中。MAb3之輕鏈可變區域的鹼基序列 記載於序列表之序列編號64(第32圖)中，胺基酸序列記載於序列編號65(第33圖)中。CDRH1之胺基酸序列記載於序列編號66(第23圖)中，CDRH2之胺基酸序列記載於序列編號67(第23圖)中，CDRH3之胺基酸序列記載於序列編號68(第23圖)中。CDRL1之胺基酸序列記載於序列編號69(第23圖)中，CDRL2之胺基酸序列記載於序列編號70(第23圖)中，CDRL3之胺基酸序列記載於序列編號71(第23圖)中。
抗體4(MAb4)係依照實施例13中記載之方法，將ADSF細胞投與至BALB/c小鼠之腹腔而得到之單株抗體。
MAb4之重鏈可變區域的鹼基序列記載於序列表之序列編號108(第75圖)中，胺基酸序列記載於序列編號109(第76圖)中。MAb4之輕鏈可變區域的鹼基序列記載於序列表之序列編號110(第77圖)中，胺基酸序列記載於序列編號111(第78圖)中。CDRH1之胺基酸序列記載於序列編號112(第79圖)中，CDRH2之胺基酸序列記載於序列編號113(第79圖)中，CDRH3之胺基酸序列記載於序列編號114(第79圖)中。CDRL1之胺基酸序列記載於序列編號115(第79圖)中，CDRL2之胺基酸序列記載於序列編號116(第79圖)中，CDRL3之胺基酸序列記載於序列編號117(第79圖)中。
本發明之抗體變異體，較佳可降低對蛋白質之分解或氧化之敏感度、改善生物活性、改善抗原結合能力、或賦予物理化學性質或功能性質等。就此種抗體 變異體之例子而言，可列舉：在抗體所具有之胺基酸序列中，具有經保存性胺基酸置換之胺基酸序列的抗體。保存性胺基酸置換意指某胺基酸群組內所發生之與胺基酸側鏈有關之置換。
較佳之胺基酸群組係如以下所示：酸性群組=天冬胺酸、麩胺酸；鹼性群組=離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性群組=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及不帯電之極性族群=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其他較佳胺基酸群組係如以下所示：脂肪族羥基群組=絲胺酸及蘇胺酸；含有醯胺之群組=天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族群組=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；及芳香族群組=苯基丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。該抗體變異體中之胺基酸置換，以在不使原本抗體所具有之抗原結合活性降低之範圍內進行為較佳。
在本發明之MAb1、MAb2、MAb3或MAb4所具有之胺基酸序列中具有經保守性胺基酸置換之胺基酸序列的抗體變異體，以及來自MAb1、MAb2、MAb3及/或MAb4之CDRH1至3及CDRL1至3之任一者之胺基酸序列中包含具有經保守性胺基酸變異之胺基酸序列之該CDR的小鼠抗體、大鼠抗體、嵌合抗體、人型化抗體、人類抗體等亦包含於本發明中。
就本發明之抗體之恆定區域而言，雖無特別限定，然而就治療或預防人類疾病所用之本發明之抗體 而言，較佳為使用人類抗體者。就人類抗體之重鏈恆定區域而言，可列舉如：Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等。就人類抗體之輕鏈恆定區域而言，可列舉如Cκ、Cλ等。
人類疾病之治療或預防中所使用之本發明之單株抗體，較佳為具有人類抗體之恆定區域的嵌合抗體、人型化抗體及人類抗體，更佳為人型化抗體及人類抗體。
(3-6)使用抗體之RX蛋白質之檢測
本發明之抗體可識別人類之自體免疫疾病中存在之RX蛋白質。本發明之抗體亦包含可識別例如在RA患者之關節組織中所表現之RX蛋白質的抗體。將來自RA患者之RX蛋白質之部分胺基酸序列之例子示於第12圖之1至4號(序列表之序列編號56至59)中，然而不以此等為限。
(3-7)抗體之功能性斷片
本發明之一形態係提供本發明之抗RX抗體之功能性斷片。抗體之功能性斷片意指保持本發明之抗體所具有之功能之至少一部分的該抗體之斷片。就該抗體之功能而言，一般可列舉：抗原結合活性、調節抗原活性之活性、抗體依存性細胞毒性及補體依存性細胞毒性等。就本發明之抗RX抗體之功能而言，可列舉如：RX蛋白質結合活性；抗關節炎活性、亦即抑制RX蛋白質在關節中所造成之關節炎發病作用及/或關節炎惡化作用之活性；抑制骨破壞之活性等。
就抗體之功能性斷片而言，只要為保持該抗體所具有之活性之至少一部分的該抗體之斷片即可，無特別限定，可列舉如：Fab、F(ab’)2、Fv、重鏈及輕鏈之Fv以適當連接子(linker)連結而成之單鏈Fv(scFv)、雙體抗體(diabodies)、線狀抗體、及由抗體斷片所形成之多特異性抗體、在還原條件下處理F(ab’)2而得之抗體之可變區域之一價斷片即Fab’等，然而不以此等為限。
將抗體蛋白質之胺基末端及/或羧基末端之胺基酸1至數個或其以上刪除且保持該抗體所具有之功能之至少一部分的分子，亦包含於抗體之功能性斷片的意義中。例如，已知將於哺乳類培養細胞中所生產之抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基刪除(Journal of Chromatography A，705；129-134(1995))者，又，已知同樣地將重鏈羧基末端二個胺基酸殘基即甘胺酸、離胺酸刪除，並將位於新羧基末端的脯胺酸殘基醯胺化(Analytical Biochemistry，360；75-83(2007))。然而，此等重鏈序列之刪除及修飾不影響抗體之抗原結合能力及作用(effector)功能(補體之活化或抗體依存性細胞毒害作用等)。此種抗體之功能性斷片的修飾體亦包含於本發明之抗體或其功能性斷片、或其修飾體(後述)中。
本發明之抗體或其功能性斷片可為至少對2種相異抗原具有特異性的多特異性抗體。多特異性抗體不限於與2種相異抗原結合之二重特異性抗體(bispecific antibody)，對3種以上相異抗原具有特異性之抗體亦包含於本發明之「多特異性抗體」的意義中。
本發明之多特異性抗體可為全長抗體或其功能性斷片(例如，F(ab’)2二重特異性抗體)。二重特異性抗體亦可使2種抗體之重鏈與輕鏈(HL對)結合而製作。又，亦可使2種以上之產生單株抗體的融合瘤融合，製作二重特異性抗體產生融合細胞而得到(Millstein et al.，Nature(1983)305，p.537-539)。多特異性抗體亦可藉由同樣之方法調製。
本發明之抗體之一形態為單股抗體(以下稱為「scFv」)。scFv可藉由將抗體之重鏈V區域與輕鏈V區域以多肽之連接子連結而得到(Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113(Rosenburg及Moore編、Springer Verlag，New York，p.269-315(1994)、Nature Biotechnology(2005)，23，p.1126-1136)。又，亦可使用將2個scFv以多肽連接子結合而製作之BiscFv做為二重特異性抗體。再者，亦可使用來自3個以上scFv之MultiscFv，做為多特異性抗體。
本發明中，包含將抗體之重鏈及輕鏈之全長序列使用適當連接子連結而成之單股免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)(Lee,H-S,et.al.，Molecular Immunology(1999)36，p.61-71；Shirrmann,T.et.al.，mAbs(2010)，2，(1)p.1-4)。此種單股免疫球蛋白藉由二聚體化，可保持與原本為四聚體之抗體類似的構造及活性。又，本發明之抗體亦可為具有單一之重鏈可變區域，而不具有輕鏈序列的抗體。此種抗體被稱為單域抗體 (single domain antibody；sdAb)或奈米抗體(nanobody)，據報導其可保持抗原結合能力(Muyldemans S.et.al.，Protein Eng.，(1994)7(9)，1129-35，Hamers-Casterman C.et.al.，Nature(1993)363(6428)446-8)。此等抗體亦包含於本發明之抗體之功能性斷片的意義中。
(3-8)人型化抗體
本發明之抗體提供人型化抗體。就本發明之人型化抗體而言，可列舉：只將非人類動物抗體之CDR組入來自人類之抗體的抗體(參照Nature(1986)321，p.522-525)；藉由CDR移植法，除CDR之序列外，亦將一部分框架之胺基酸殘基移植入人類抗體而成的抗體(參照WO90/07861號、US6972323號公報)；此等之任一者中非人類動物抗體之1個或2個以上之胺基酸以人型之胺基酸置換所形成之抗體等，然而不以此等為限。
就抗RX人型化抗體或其功能性斷片而言，可列舉如：由重鏈及輕鏈構成且可識別本發明之RX蛋白質之抗體或保持該抗體之RX蛋白質結合活性之該抗體的斷片等，其中該重鏈包含：由序列表之序列編號22所示之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列表之序列編號23所示之胺基酸序列構成的CDRH2及由序列表之序列編號24所示之胺基酸序列構成的CDRH3，及該輕鏈包含：由序列表之序列編號25所示之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列表之序列編號26所示之胺基酸序列構成的CDRL2及由序列表之序列編號27所示之胺基酸序列構成的CDRL3。
就該人型化抗體而言，可列舉例如：由下述重鏈及輕鏈所構成之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含序列表之序列編號72至81(第40至49圖)之任一者記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域為包含序列表之序列編號82至86(第50至54圖)之任一者記載之肽；以及由下述重鏈及輕鏈所構成之抗體或其功能性斷片等，其中重鏈可變區域為序列表之序列編號72至81(第40至49圖)之任一者記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域為序列表之序列編號82至86(第50至54圖)之任一者記載之胺基酸序列所示之肽。
在本發明中，將可變區域為序列表之序列編號72至81(第40至49圖)之任一者記載之胺基酸序列所示之肽且恆定區域為來自人類IgG1之重鏈者分別稱為H1至H10。又，在本發明中，將可變區域為序列表之序列編號82至86(第50至54圖)之任一者記載之胺基酸序列所示之肽且恆定區域為來自人類IgG1之輕鏈者分別稱為L1至L5。再者，在本發明中，將重鏈為H1且輕鏈為L1之抗體稱為T1，將重鏈為H1且輕鏈為L2之抗體稱為T2，將重鏈為H1且輕鏈為L3之抗體稱為T3，將重鏈為H2且輕鏈為L1之抗體稱為T4，將重鏈為H2且輕鏈為L2之抗體稱為T5，將重鏈為H2且輕鏈為L3之抗體稱為T6，將重鏈為H2且輕鏈為L5之抗體稱為T7，將重鏈為H3且輕鏈為L1之抗體稱為T8，將重鏈為H3且輕鏈為L2之抗體稱為T9，將重鏈為H3且輕鏈為L3之抗體稱為T10，將重鏈為H3且輕鏈為L5之抗體稱為 T11，將重鏈為H4且輕鏈為L4之抗體稱為T12，將重鏈為H5且輕鏈為L1之抗體稱為T13，將重鏈為H5且輕鏈為L2之抗體稱為T14，將重鏈為H5且輕鏈為L5之抗體稱為T15，將重鏈為H6且輕鏈為L2之抗體稱為T16，將重鏈為H6且輕鏈為L5之抗體稱為T17，將重鏈為H7且輕鏈為L2之抗體稱為T18，將重鏈為H8且輕鏈為L1之抗體稱為T19，將重鏈為H9且輕鏈為L1之抗體稱為T20，將重鏈為H10且輕鏈為L1之抗體稱為T21。
T1 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號72(第40圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，以及該輕鏈具有由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T1具有對RX蛋白質之高結合活性。
T2 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號72(第40圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T2具有對RX蛋白質之高結合活性。
T3 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號72(第40圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號84(第52圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T3具有對RX蛋白質之高結合活性。
T4 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T4具有對RX蛋白質之高結合活性。
T5 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T5具有對RX蛋白質之高結合活性、活體內抗關節炎作用、及趨化素產生之抑制作用。
T6 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號84(第52圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T6具有對RX蛋白質之高結合活性。
T7 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T7具有對RX蛋白質之高結合活性。
T8 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T8具有對RX蛋白質之高結合活性、活體內抗關節炎作用、及炎症性細胞激素及趨化素產生之抑制作用。
T9 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中，該重鏈具有由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T9具有對RX蛋白質之高結合活性、及活體內抗關節炎作用。
T10 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號84(第52圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T10具有對RX蛋白質之高結合活性。
T11 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號86(第54圖)所示 之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T11具有對RX蛋白質之高結合活性。
T12 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號75(第43圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號85(第53圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該T12具有對RX蛋白質之高結合活性。
T13 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號76(第44圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T13具有對RX蛋白質之高結合活性、活體內抗關節炎作用、及炎症性細胞激素及趨化素產生之抑制作用。
T14 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號76(第44圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T14具有對RX蛋白質之高結合活性、活體內抗關節炎作用、及炎症性細胞激素及趨化素產生之抑制作用。
T15 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號76(第44圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定；該T15具有對RX蛋白質之高結合活性。
T16 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號77(第45圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T16具有對RX蛋白質之高結合活性。
T17 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號77(第45圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T17具有對RX蛋白質之高結合活性。
T18 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號78(第46圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T18具有對RX蛋白質之高結合活性。
T19 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號79(第47圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T19具有對RX蛋白質之高結合活性。
T20 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號80(第48圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T20具有對RX蛋白質之高結合活性。
T21 係由重鏈及輕鏈所構成之人型化抗體，其中該重鏈具有由序列表之序列編號81(第49圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，及該輕鏈具有由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；該T21具有對RX蛋白質之高結合活性。
本發明之抗RX人型化抗體，較佳為T1至T21，更佳為T8至T15及T18，又更佳為T8至T11、T13至T15及T18，又再更佳為T13至15。
關於T5、T8、T9、T13及T14，未觀察到因投與至膠原誘發性關節炎小鼠模型而出現體重變化、自律神經異常(立毛)、異常姿勢、異常步行、自主運動減少、呼吸異常、排尿過敏、流涎、流淚、眼球突出、四 肢或全身性運動失調等，呈現與無處理之正常小鼠同樣之臨床所見。
就其他抗RX人型化抗體或其功能性斷片而言，可列舉如：由重鏈及輕鏈構成且可識別本發明之RX蛋白質之抗體或保持該抗體之RX蛋白質結合活性之該抗體斷片，其中該重鏈包含：由序列表之序列編號36所示之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列表之序列編號37所示之胺基酸序列構成的CDRH2及由序列表之序列編號38所示之胺基酸序列構成的CDRH3，該輕鏈包含：由序列表之序列編號39所示之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列表之序列編號40所示之胺基酸序列構成的CDRL2及由序列表之序列編號41所示之胺基酸序列構成的CDRL3。
再者，就其他抗RX人型化抗體或其功能性斷片而言，可列舉如：由重鏈及輕鏈構成且可識別本發明之RX蛋白質之抗體或保持該抗體之RX蛋白質結合活性之該抗體斷片，其中該重鏈包含：由序列表之序列編號66所示之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列表之序列編號67所示之胺基酸序列構成的CDRH2及由序列表之序列編號68所示之胺基酸序列構成的CDRH3，該輕鏈包含：由序列表之序列編號69所示之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列表之序列編號70所示之胺基酸序列構成的CDRL2及由序列表之序列編號71所示之胺基酸序列構成的CDRL3。
又，就其他抗RX人型化抗體或其功能性斷片而言，可列舉如：由重鏈及輕鏈構成且可識別本發明之RX蛋白質之抗體或保持該抗體之RX蛋白質結合活性之該抗體斷片，其中該重鏈包含：由序列表之序列編號111所示之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列表之序列編號112所示之胺基酸序列構成的CDRH2及由序列表之序列編號113所示之胺基酸序列構成的CDRH3，該輕鏈包含：由序列表之序列編號114所示之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列表之序列編號115所示之胺基酸序列構成的CDRL2及由序列表之序列編號116所示之胺基酸序列構成的CDRL3。
包含下述重鏈或輕鏈且可與RX蛋白質結合的抗體或其功能性斷片亦包含於本發明中，其中該重鏈或輕鏈包含與本發明之MAb1至MAb4、此等之嵌合抗體、及此等之人型化抗體(包含T1至T21)之任一種抗體之重鏈或輕鏈之胺基酸序列有80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上或99%以上相同性之胺基酸序列。該序列相同性，較佳為95%以上，更佳為96%以上，又更佳為97%以上，又再更佳為98%以上，最佳為99%以上。又，此等抗體較佳具有一種或以上之(3-3)記載之活性。
二種胺基酸序列間之相同性或同源性，可藉由使用Blast algorithm version 2.2.2(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang, Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997)，「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」，Nucleic Acids Res．25：3389-3402)之內定參數(default parameter)來決定。Blast algorithm亦可藉由例如登入網際網路http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/而使用。
包含下述重鏈或輕鏈且可與RX蛋白質結合的抗體或其功能性斷片亦包含於本發明中，其中該重鏈或輕鏈包含在本發明之MAb1至MAb4、此等之嵌合抗體、及此等之人型化抗體(包含T1至T21)之任一種抗體之重鏈或輕鏈之胺基酸序列中，將1至50個、1至45個、1至40個、1至35個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個胺基酸置換、刪除、附加或插入而形成之胺基酸序列。該胺基酸變異係以置換為較佳，所變異之胺基酸的個數較佳為1至5個，更佳為1至4個，又更佳為1至3個，又再更佳為1至2個，最佳為1個。又，此等抗體較佳具有一種或以上之(3-3)記載之活性。
包含下述重鏈或輕鏈且可與RX蛋白質結合的抗體或其功能性斷片亦包含於本發明中，其中該重鏈或輕鏈包含由與具有互補性鹼基序列的核苷酸在嚴苛條件下可雜交之核苷酸所具有之鹼基序列編碼的胺基酸序列，該互補性鹼基序列係與編碼本發明之MAb1至MAb4、此等之嵌合抗體、及此等之人型化抗體(包含T1 至T21)之任一種抗體之重鏈或輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列互補。此等抗體較佳具有一種或以上之(3-3)記載之活性。
本發明之抗RX人型化抗體或其功能性斷片具有抗關節炎活性，較佳具有30%以上之抗關節炎活性，更佳具有50%以上之抗關節炎活性。
又，本發明之抗RX人型化抗體或其功能性斷片在安定性方面優良，例如，熱安定性高，並具有中性至弱鹼性之等電點。
本發明之人型化抗體對RX蛋白質之KD值為1×10-7以下，較佳為1×10-8以下，更佳為5×10-9以下，又更佳為2×10-9以下，又再更佳為1×10-9以下，最佳為5×10-10以下。
(3-9)與相同部位結合之抗體
與本發明所提供之抗體「於相同部位結合的抗體」亦包含於本發明之抗體中。與某種抗體「於相同部位結合的抗體」意指於該抗體識別之抗原分子上之部位所結合的其他抗體。在第一抗體所結合之抗原分子上的部分肽或部分立體構造上若有第二抗體結合，則可判定第一抗體與第二抗體於相同部位結合。又，藉由確認第二抗體會與第一抗體競爭對抗原之結合，亦即第二抗體會妨礙第一抗體與抗原之結合，即使未決定具體結合部位的肽序列或立體構造，仍可判定第一抗體與第二抗體於相同部位結合。再者，在第一抗體與第二抗體於相同部位結合且第一抗體具有抗關節炎活性等在本發明抗 體之一形態上具特徴性效果的情況，第二抗體亦具有同樣活性之概率極高。因此，在第一抗RX抗體所結合之部位上若有第二抗RX抗體結合，則可判定第一抗體與第二抗體，於RX蛋白質上之相同部位結合。又，若能確認第二抗RX抗體與第一抗RX抗體競爭對RX蛋白質之結合，則可判定第一抗體與第二抗體為於RX蛋白質上之相同部位結合的抗體。
在本發明之MAb1、MAb2、MAb3或MAb4、或此等之嵌合化抗體、人型化抗體、其功能性斷片、或此等之修飾體所識別之RX蛋白質上之部位結合的抗體、其功能性斷片、其修飾體亦包含於本發明中。
MAb2、其嵌合化抗體及人型化抗體可識別從gp73ED之胺基酸序列(第25圖：序列編號15)之胺基末端數起第10至16號之胺基酸，即PPILHPV。該部分之胺基酸序列亦出現於gp52SU之胺基酸序列上。
MAb3、其嵌合化抗體及人型化抗體可識別從gp73ED之胺基酸序列(第25圖：序列編號15)之胺基末端數起第336至340號之胺基酸，即EPWFD。該部分之胺基酸序列亦出現於gp73ED之胺基酸序列上。
MAb4、其嵌合化抗體及人型化抗體可識別gp28ED。
會與MAb1至MAb4之任一種抗體競爭對抗原之結合的抗體亦包含於本發明之抗體中，該抗體較佳為具有1種或以上之前述(3-3)記載之活性。
抗體之結合部位可藉由免疫檢定法等本技術領域人士所周知之方法決定。例如，藉由將抗原之胺基酸序列從C末端或N末端適宜剪切而製作成一連串抗原斷片肽，檢討抗體對此等抗原斷片肽之反應性，決定粗略識別部位後，合成更短之斷片肽，並檢討抗體對此等肽之反應性，可決定結合部位。該抗原斷片肽，可使用基因重組、蛋白酶分解、肽合成等技術來調製。
在抗體結合於或識別抗原之部分高階構造的情況，該抗體之結合部位可藉由使用X光構造解析、部位特異性變異導入實驗、重氫交換NMR法、重氫交換質量分析法等特定鄰接於該抗體之抗原上的胺基酸殘基而決定。
MAb1、其嵌合化抗體及人型化抗體(包含T1至T21)可識別gp52SU之部分立體構造。該部分立體構造亦出現於gp73ED中。推測從gp73ED之胺基酸序列(第25圖：序列編號15)的胺基末端數起第139及140號胺基酸，即離胺酸-天冬胺酸，對於該識別頗為重要。
(3-10)抗體或其功能性斷片之修飾體
本發明之一形態係提供抗體或其功能性斷片之修飾體。本發明之抗體或其功能性斷片之修飾體意指對本發明之抗體或其功能性斷片施以化學性或生物學性修飾而形成者。化學性修飾體，包含對胺基酸骨架之化學部分的鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈的化學修飾體等。化學上之修飾體可包含有毒性或細胞毒性之部分。生物學性修飾體，包含轉譯後修飾(例如，對N-鍵結 或O-鍵結附加糖鏈、N末端或C末端之加工)者、藉由使用原核生物宿主細胞使其表現，在N末端附加甲硫胺酸殘基者等。又，為了使本發明之抗體或抗原可檢出或分離而加以標識者，例如酵素標識體、螢光標識體、親和標識體，亦包含於該修飾體之意義中。本發明抗體或其功能性斷片之此等修飾體，在原本之本發明抗體或其功能性斷片之安定性及血中滯留性的改善、抗原性的降低、該抗體或抗原的檢出或分離等方面有用。
就化學性修飾體所包含之化學部分而言，可例示聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡萄聚糖、聚乙烯醇等水溶性聚合物。
就生物學性修飾體而言，可列舉：藉由酵素處理或細胞處理等而施行修飾者、藉由基因重組附加標籤等其他肽而成之融合體、及以表現內因性或外來性之糖鏈修飾酵素的細胞做為宿主而調製者等。
藉由調節與本發明之抗體或其功能性斷片所結合之糖鏈修飾(糖苷化、脫岩藻糖化等)，可增強抗體依存性細胞毒性。就抗體之糖鏈修飾的調節技術而言，已知有例如在WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等中所記載之方法，然而不以此等為限。在本發明抗體之修飾體中亦包含該糖鏈修飾經調節之抗體。
該修飾可在抗體或其功能性斷片中之任何位置，或期望之位置實施，亦可於1個或2個以上之位置實施相同之修飾或2種以上之相異修飾。
本發明之抗體或其功能性斷片之修飾體，在安定性方面優良，例如，熱安定性高、具有中性至弱鹼性之等電點。
在本發明中，「抗體斷片之修飾體」於其意義中亦包含「抗體之修飾體之斷片」。
在本發明中，有時將抗體之修飾體、其功能性斷片之修飾體分別簡稱為「抗體」、「抗體之功能性斷片」。例如，MAb1至MAb4、嵌合化MAb1至MAb4、及人型化MAb1至MAb4(包含T1至T21)之任一種「抗體」亦包含其重鏈或輕鏈之羧基末端之胺基酸1至數個經刪除者、羧基末端之胺基酸經修飾者等。
4.抗體之製造方法 (4-1)使用融合瘤之方法
本發明之抗RX抗體，可依照克拉氏與米爾斯坦氏之方法(Kohler and Milstein，Nature(1975)256，p.495-497、Kennet,R.ed.，Monoclonal Antibody，p.365-367，Prenum Press，N.Y.(1980))，藉由從以RX蛋白質免疫之動物的脾臓分離出產生抗RX抗體之細胞，並使該細胞與骨髓瘤細胞融合而建立融合瘤，並從該融合瘤之培養物取得單株抗體。
(4-1-1)抗原之調製
製作抗RX抗體所用之抗原，可藉由本發明之其他部分所記載之天然型或重組型之RX蛋白質的調製法等而取得。就能以此種方式調製之抗原而言，可列舉RX蛋白質或包含其至少6個連續之部分胺基酸序列 的RX蛋白質斷片、或在此等附加任何胺基酸序列或載體(carrier)而得之衍生物等(以下，總稱為「RX抗原」)。
重組型RX抗原，可藉由將包含編碼RX抗原所具有之胺基酸序列之鹼基序列的基因導入宿主細胞中，從該細胞之培養物回收該抗原而調製。天然型RX抗原，可從例如人類或齧齒類之關節炎組織或來自該組織之細胞、或該細胞之培養物中精製、分離。又，藉由體外(in virto)轉譯系統將包含編碼RX抗原之胺基酸序列之鹼基序列的基因轉譯而於無細胞系統中得到之RX抗原，亦包含於本發明之「RX抗原」中。
(4-1-2)抗RX單株抗體之製造
單株抗體之製造，通常經過如下述之步驟。
(a)調製抗原之步驟，(b)調製抗體產生細胞之步驟，(c)調製骨髓腫瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤細胞」)之步驟，(d)使抗體產生細胞與骨髓瘤融合之步驟，(e)篩選產生目標抗體之融合瘤群的步驟，及(f)得到單一細胞純系之步驟(選殖)。
視需要進一步增加：(g)融合瘤之培養步驟、移植有融合瘤之動物的飼育步驟等，(h)單株抗體之生物活性的測定步驟‧判定步驟等。
以下，依循上述步驟，詳述單株抗體之製作法，然而該抗體之製作法並不受此限制，例如亦可使用脾細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤細胞。
(a)抗原之精製
依據前述(2-3)記載之RX蛋白質的調製法。
(b)調製抗體產生細胞之步驟
將步驟(a)所得到之抗原，與弗氏(Freund)之完全或不完全佐劑、或如鉀明礬之助劑混合，將做為免疫原之實驗動物免疫。實驗動物，可無礙地使用周知之融合瘤製作法中所使用的動物。具體而言，可使用例如小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。但是，從與摘出之抗體產生細胞融合之骨髓瘤細胞的取得容易性等觀點而言，以小鼠或大鼠做為被免疫動物為較佳。
又，實際上所使用之小鼠及大鼠的品系，無特別限制，在為小鼠之情況，可使用例如：A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，在為大鼠之情況，可使用例如：Wistar、Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer等。
此等小鼠及大鼠，可從例如日本Clea、日本Charles River等實驗動物飼育販賣業者取得。
其中，若衡量與後述之骨髓瘤細胞融合之適合性，小鼠以BALB/C品系，大鼠以Wistar及Low品系，做為被免疫動物為特佳。
又，若考慮抗原在人類與小鼠中之相同性，亦以使用除去自身抗體之使身體機制降低的小鼠，亦即自體免疫疾病小鼠為較佳。
再者，此等小鼠或大鼠於免疫時之週齡係以5至12週齡為較佳，以6至8週齡為更佳。
以RX蛋白質將動物免疫時，可使用例如：Weir,D.M.，(Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1987))、Kabat,E.A.及Mayer,M.M.(Experimental Immunochemistry，Charles C.Thomas Publisher Spigfield，Illinois(1964))等之方法。
就抗體價之測定法而言，可列舉如：RIA法、ELISA法等免疫檢定，然而不以此等方法為限。
由從經免疫動物分離之脾臓細胞或淋巴球而來的抗體產生細胞，可依照例如Kohler et al.，Nature(1975)256，p.495；Kohler et al.，Eur.J.Immnol.(1977)6，p.511；Milstein et al.，Nature(1977)，266，p.550；Walsh，Nature，(1977)266，p.495)等周知之方法調製。
在脾臓細胞之情況，可採用一般方法，即將脾臓細切，並以不鏽鋼篩網將細胞過濾後，使其浮游於伊格爾最低營養素培養基(MEM)等中，分離抗體產生細胞。
(c)調製骨髓瘤之步驟
對於使用於細胞融合之骨髓瘤細胞，並無特別之限定，可從周知之細胞株適宜選擇而使用，然而考慮從融合細胞選擇融合瘤時之便利性，以使用選擇步驟已確立之次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT； hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損株，亦即來自小鼠之X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8．U1(P3U1)、X63-Ag8．653(X63．653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45．6TG1.7(45．6TG)、FO、S149/5XXO、BU．1等，來自大鼠之210.RSY3．Ag．1.2.3(Y3)等，來自人類之U266AR(SKO-007)、GM1500‧GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等為較佳。此等HGPRT缺損株可從例如美國模式培養物收集所(American Type Culture Collection(ATCC))等取得。
此等細胞株以適當之培養基，例如8-氮雜鳥嘌呤培養基[在RPMI-1640培養基中添加麩醯胺酸、2-巰基乙醇、見大黴素(gentamycin)、及胎牛血清(以下稱為「FCS」)而成之培養基中添加有8-氮雜鳥嘌呤的培養基]、經伊斯科夫修改之杜百可氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；以下稱為「IMDM」)、或經杜百可修改之伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；以下稱為「DMEM」)進行繼代培養，而於細胞融合之3至4日前以正常培養基，例如，含有10% FCS之ASF104培養基(味之素股份有限公司)進行繼代培養，並確保於融合當日有2×107以上之細胞數。
(d)使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合之步驟
抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合，可依照周知之方法(Weir,D.M.，Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1987)、Kabat,E.A.及Mayer,M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles C.Thomas Publisher Spigfield，Illinois(1964)等)，於不會使細胞之生存率極度降低之條件下實施。例如，可使用在聚乙二醇等高濃度聚合物溶液中將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞混合之化學上的方法，或利用電刺激之物理方法等。
(e)篩選產生目標抗體之融合瘤群的步驟
對於藉由細胞融合所得到之融合瘤的選擇方法並無特別限制，通常可使用HAT(次黃嘌呤‧胺喋呤‧胸苷)選擇法(Kohler et al.，Nature(1975)256，p.495；Milstein et al.，Nature(1977)266，p.550)。該方法在使用於胺喋呤(aminopterin)中無法生存之HGPRT缺損株作為骨髓瘤細胞而得到融合瘤的情況中有效。亦即，藉由將未融合細胞及融合瘤於HAT培養基中培養，可使只有對胺喋呤具有耐性之融合瘤選擇性地殘存並增殖。
(f)得到單一細胞純系之步驟(選殖)
就融合瘤之選殖法而言，可使用例如甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、極限稀釋法等周知之方法(例如，參照Barbara,B.M.and Stanley,M.S.：Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Company，San Francisco(1980))，然而較佳為極限稀釋法。
(g)融合瘤之培養步驟、移植有融合瘤之動物的飼育步驟
藉由培養經選擇之融合瘤，可產生單株抗體，然而較佳為選殖期望之融合瘤後，再供應於抗體之產生。
該融合瘤產生之單株抗體可從該融合瘤之培養物回收。又，從導入有該單株抗體基因之細胞的培養物，亦可以回收重組抗體。再者，亦可藉由將融合瘤注射於相同品系之小鼠(例如，上述之BALB/c)、或Nu/Nu小鼠之腹腔內，使該融合瘤增殖，然後從其腹水回收。
(h)單株抗體之生物活性的測定步驟‧判定步驟
可依照目的，選擇及適當使用各種生物試驗。
(4-2)細胞免疫法
使用表現天然型RX蛋白質之細胞、表現重組型RX蛋白質或其斷片之細胞等做為免疫原，藉由前述之融合瘤法，可調製抗RX抗體。
就表現天然型之RX蛋白質之細胞而言，可列舉來自誘發實驗性關節炎之動物或來自罹患RA等自體免疫疾病或關節炎之患者的細胞或來自該患者之組織的細胞等。該細胞較佳為來自小鼠之細胞，然而並不以此為限。就此種來自小鼠之細胞之例而言，可列舉本發明之ADSF細胞。此等來自小鼠之RX蛋白質表現細胞，在一次免疫中使用1×105至1×109個，較佳為1×106至1×108個，更佳為0.5至2×107個，又更佳為1×107個，然而可依據RX蛋白質之表現量，改變供免疫之細胞數。該免疫原一般係投與至腹腔內，然而亦可投與至皮內等。就融合瘤之製作手法而言，可適用(4-1-2)記載之方法。
(4-3)基因重組
本發明之抗體，可藉由將包含編碼其重鏈胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸(重鏈核苷酸)及包含編碼其輕鏈胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸(輕鏈核苷酸)、或者插入該重鏈核苷酸之載體及插入該輕鏈核苷酸之載體導入宿主細胞中，培養該細胞後，從其培養物回收該抗體而調製。亦可將重鏈核苷酸及輕鏈核苷酸插入在一個載體中。
就包含編碼本發明之重鏈可變區域之胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸(重鏈可變區域核苷酸)而言，可列舉例如H1至H10。就H1至H10之任一項所具有之鹼基序列而言，可分別例示序列表之序列編號91至100(第58至67圖)之任一項記載之鹼基序列。與包含和此等鹼基序列互補之鹼基序列的核苷酸在嚴苛條件下可雜交，且包含編碼本發明之人型化抗體重鏈可變區域所具有之胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸，亦可被例示做為重鏈可變區域核苷酸。
就包含編碼本發明之輕鏈可變區域之胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸(輕鏈可變區域核苷酸)而言，可列舉例如L1至L5。就L1至L5之任一項所具有之鹼基序列而言，可例示如序列表之序列編號103至107(第69至73圖)之任一項記載之鹼基序列。與包含和此等鹼基序列互補之鹼基序列的核苷酸在嚴苛條件下可雜交，且包含編碼本發明之人型化抗體輕鏈可變區域所具有之胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸，亦可被例示做為輕鏈可變區域核苷酸。
就宿主細胞而言，可使用原核細胞或真核細胞。使用真核細胞做為宿主之情況，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。
就動物細胞而言，可列舉如：來自哺乳類之細胞，亦即來自猴之COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23，p.175-182，ATCC CRL-1650)、小鼠繊維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、中華倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC CCL-61)、其二氫葉酸還原酵素缺損株(CHOdhfr-：Urlaub，G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，p.4126-4220)、來自雞等鳥類之細胞、來自昆蟲之細胞等。
又，亦可使用藉由改變糖鏈構造，而可提高抗體之生物活性般改變之細胞做為宿主。例如，可藉由使用：在與抗體之Fc區域結合之N-糖苷鍵結複合型糖鏈之中，讓於糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺之未與岩藻糖結合之糖鏈的比例成為20%以上般改變之CHO細胞，來調製ADCC活性或CDC活性提高之抗體(WO02/31140號)。
就真核微生物而言，可列舉如：酵母等。
就原核細胞而言，可列舉如：大腸桿菌、枯草菌等。
就用於使本發明之抗體(來自各種動物之單株抗體、大鼠抗體、小鼠抗體、嵌合化抗體、人型化抗體、人類抗體等)分泌之信號肽而言，不限定於與該抗體同種、同類型及同亞型之抗體之分泌信號、及該抗體本 身之分泌信號，只要為其他類型或亞型之抗體之分泌信號，或來自其他真核生物種或原核生物之蛋白質之分泌信號，均可任意選擇而利用。
在本發明中，藉由基因重組等調製方法所得到之成熟型抗體、其功能性斷片、其修飾體之重鏈及輕鏈，雖然通常其大部分不包含信號肽，然而可將信號肽之一部分或全部包含於輕鏈及/或重鏈中。
(4-4)人類抗體之調製法
就本發明之抗體而言，可進一步列舉人類抗體。抗RX人類抗體意指由來自人類之抗體之胺基酸序列所構成之抗RX抗體。抗RX人類抗體可藉由使用產生人類抗體之小鼠的方法而取得，其中該產生人類抗體之小鼠具有包含人類抗體之重鏈及輕鏈基因的人類基因組DNA斷片(參照Tomizuka,K.et al.，Nature Genetics(1997)16，p.133-143；Kuroiwa,Y.et.al.，Nuc.Acids Res.(1998)26，p.3447-3448；Yoshida,H.et.al.，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10，p.69-73(Kitagawa,Y.，Matuda,T.and Iijima,S.eds.)，Kluwer Academic Publishers，1999.；Tomizuka,K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，p.722-727等)。
此種基因轉殖動物，具體而言，可為藉由將非人類哺乳動物之內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座破壞，然後藉由酵母人造染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)載體等，將人類免疫球蛋白重鏈及輕 鏈之基因座導入之基因重組動物，並使此等動物彼此交配而得到之動物之任一者。
又，亦可為藉由基因重組技術，以分別編碼此種人類抗體之重鏈及輕鏈的cDNA，較佳以包含此等cDNA之載體，將真核細胞轉形，然後培養產生基因重組人類單株抗體之轉形細胞，藉此從培養上清液中得到該抗體。就分泌信號而言，除抗體本身之分泌信號外，可使用其他類及亞類之抗體、或來自其他物種之各種抗體的分泌信號；或者為來自真核生物或原核生物之分泌蛋白的任一種分泌信號。
其中，就宿主而言，可使用例如真核細胞，以使用CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤等哺乳動物細胞為較佳。
又，亦已知取得來自從人類抗體基因庫篩選之噬菌體展現(phage display)之人類抗體的方法(參照Wormstone,I.M.et.al，Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7)，p.2301-2308；Carmen,S.et.al.，Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002)，1(2)，p.189-203；Siriwardena,D.et.al.，Opthalmology(2002)109(3)，p.427-431等)。
例如，可使用下述噬菌體展現法：將人類抗體之可變區域做成單股抗體(scFv)並使其在噬菌體表面表現，然後選擇與抗原結合之噬菌體(Nature Biotechnology(2005)，23，(9)，p.1105-1116)。
藉由解析經由與抗原結合而選擇之噬菌體之基因，可決定編碼與抗原結合之人類抗體之可變區域的DNA序列。
若與抗原結合之scFv的DNA序列變得明朗，則藉由製作具有該序列之表現載體，並導入適當宿主使其表現，可取得人類抗體(WO92/01047，WO92/20791，WO93/06213，WO93/11236，WO93/19172，WO95/01438，WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12，p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9)，p.1105-1116)。
(4-5)抗體之功能性斷片之調製法
製成單股抗體之方法為在此技術領域中所周知(例如，參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。該scFv中，重鏈可變區域與輕鏈可變區域，可經由未交聯(conjugate)之連接子，較佳為多肽連接子連結(Huston,J.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)，85，p.5879-5883)。scFv中之重鏈可變區域及輕鏈可變區域可來自相同之抗體，亦可來自個別的抗體。
就連結可變區域之多肽連接子而言，可使用例如由12至19個殘基所構成之任何單股肽。
編碼scFv之DNA，可藉由以編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區域的DNA及編碼輕鏈或輕鏈可變區域的DNA中，編碼此等序列中全部或期望之胺基酸序列的DNA部分做為模板，使用規定其兩端之引子對，藉 由PCR法增幅，繼而藉由進一步將編碼多肽連接子部分之DNA以及被規定成兩端各可與重鏈、輕鏈連結之引子對加以組合並進行增幅而得到。
使用編碼scFv之DNA，可依照常用方法調製含有該DNA之表現載體及藉由該表現載體所轉形之宿主細胞，又，藉由培養該宿主細胞，可依照常用方法從該培養物回收該scFv。
其他抗體之功能性斷片，亦可依據前述之方法取得編碼該功能性斷片之基因並導入細胞中，並藉由從該細胞之培養物中回收該功能性斷片而得到。
本發明之抗體可為多聚化而提高對抗原之親和性者。就多聚化之抗體而言，可為1種抗體，亦可為識別相同抗原之複數個抗原決定部位的複數個抗體。就將抗體多聚化之方法而言，可列舉IgG CH3區域與2個scFv之結合、與鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)之結合、螺旋-轉角-螺旋基序(helix-turn-helix motif)之導入等。
本發明之抗體，可為胺基酸序列相異之複數種抗RX抗體之混合物，亦即多株抗體。就多株抗體而言，可列舉如：CDR之一部分或全部為相異之複數種抗體之混合物。此種多株抗體，可將相異抗體之產生細胞混合培養，並從該培養物回收(WO2004/061104號)。又，亦可將各別調製之抗體混合。再者，為多株抗體之一形態的抗血清，可藉由將動物用期望之抗原免疫，並依照常用方法從該動物回收血清而調製。
就抗體之修飾物而言，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合之抗體。
本發明之抗體，可為進一步將此等抗體與其他藥劑形成交聯(免疫交聯Immunoconjugate)。就此種抗體之例子而言，可列舉該抗體與放射性物質或具有藥理作用之化合物結合之物(Nature Biotechnology(2005)23，p.1137-1146)。
(4-6)抗體之精製
所得到之抗體可精製至均勻一致為止。抗體之分離、精製，只要使用通常使用於蛋白質之分離、精製方法即可。
例如，若適當選擇層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等並加以組合，可將抗體分離、精製(Strategies for Protein Purification and Charcterization：A Laboratoy Course Manual，Daniel R.Marshak et al.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual．Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，不過不以此等為限。
就層析而言，可列舉親和層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等。
此等層析亦可使用HPLC或FPLC等液相層析進行。
就用於親和層析之管柱而言，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱、抗原管柱等。
就市售之蛋白質A管柱而言，可列舉如：蛋白質A陶瓷HyperD F(Pall公司)、POROS(R)ProteinA(Applied Systems公司)、Mabselect、Protein A Sepharose F.F.(GE HealthCare公司)、Prosep rA、Prosep A(Millipore公司)等。
又，亦可使用將抗原固定化的載體(carrier)，利用對抗原之結合性將抗體精製。
(4-7)基因、載體、細胞
本發明亦提供編碼本發明之抗體或其功能性斷片或其修飾物的基因(以下稱為「抗體基因」)、插入該基因的重組載體、導入該基因或載體的細胞(以下稱為「抗體基因導入細胞」)、其他產生本發明之抗體的細胞(以下稱為「抗體產生細胞」)。
本發明之抗體基因，較佳為包含以下(a)至(e)之任一項記載之鹼基序列(以下稱為「抗體基因序列」)，或由包含抗體基因序列之鹼基序列構成，或由抗體基因序列構成：(a)編碼本發明之MAb1至MAb4、此等之嵌合抗體、及此等之人型化抗體(包含T1至T21)之任一種抗體之重鏈胺基酸序列之鹼基序列與編碼輕鏈胺基酸序列之鹼基序列的組合；(b)編碼本發明之MAb1至MAb4、此等之嵌合抗體、及此等之人型化抗體(包含T1至T21)之任一種抗體之包含CDRH1至CDRH3之重鏈之胺基酸序列的鹼基序列，與編碼包含CDRL1至CDRL3之輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列的組合； (c)編碼本發明之MAb1至MAb4、此等之嵌合抗體、及此等之人型化抗體(包含T1至T21)之任一種抗體之包含重鏈可變區域之胺基酸序列的重鏈胺基酸序列的鹼基序列，與編碼包含輕鏈可變區域之胺基酸序列的輕鏈胺基酸序列的鹼基序列的組合；(d)與由(a)至(c)之任一項記載之鹼基序列互補的鹼基序列所構成之核苷酸在嚴苛條件下可雜交，且編碼可與RX蛋白質結合之抗體之胺基酸序列的鹼基序列；及(e)由編碼在(a)至(c)之任一項中所記載之胺基酸序列中置換、刪除、附加或插入1至50個、1至45個、1至40個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至8個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1或2個、或1個鹼基而形成之胺基酸序列，且編碼可與RX蛋白質結合之抗體之胺基酸序列的鹼基序列；具有由(d)或(e)記載之鹼基序列所編碼之胺基酸序列的抗體，除了具有RX蛋白質結合活性以外，可具有上述(3-3)記載之1種或2種以上的活性。
但是，本發明之抗體基因不限於在上述(a)至(e)中所記載者。
本發明如(4-3)所記載，亦提供抗體或其功能性斷片或其修飾體的製造方法，其包含：培養導入有本發明抗體基因之細胞的步驟，以及從其培養物回收抗體或其功能性斷片或其修飾體的步驟。依照該製造方法所得到之抗體或其功能性斷片或其修飾體亦包含於本發明中。
5.醫藥組成物
本發明提供包含抗RX抗體或其功能性斷片或其修飾體的醫藥組成物。
本發明之醫藥組成物，在自體免疫疾病或關節炎，尤其表現RX蛋白質之個體中，治療或預防該疾病上有用。自體免疫疾病意指原本為對抗異物侵入之身體防禦機制的免疫系統，對自身的要素(包含細胞、組織等)產生反應而引起症狀之疾病。就自體免疫疾病而言，可例示：類風濕性關節炎(RA)、全身性紅斑狼瘡、修格連症候群(Sjogren's syndrome)、克隆氏病、乾癬、膠原病、全身性硬皮病、全身性紅斑狼瘡等所造成之冷凝球蛋白血症、多發性肌炎症、皮膚肌炎等。就RA而言，可例示狹義之RA、全身型少年性類風濕性關節炎(史迪爾氏病)、成人發病型史迪爾氏病(即史迪爾氏病於成人時發病)等。關節炎意指伴隨關節發炎的疾病。就關節炎之症狀而言，可例示：關節之發紅、腫脹、壓痛‧疼痛(關節痛)、僵硬、局部發熱、運動功能障礙、發熱、全身倦怠感、體重減輕等。關節炎中，有急性單關節炎、急性多關節炎、慢性單關節炎‧關節症、慢性多關節炎等。
就急性單關節炎而言，可例示細菌性關節炎、痛風等。就急性多關節炎而言，可例示病毒性多關節炎等。就慢性單關節炎‧關節症而言，可例示變形性關節症、外傷性關節炎等非炎症性者、炎症性者。就慢性多關節炎而言，可例示RA、乾癬性關節炎等。在本發明中，關節炎亦包含少年性特發性關節炎(juvenile idiopathic arthritis：以下稱為「JIA」)。就JIA而言，可例示全身型關節炎、RF陰性多關節炎、RF陽性多關節炎、少關節炎、乾癬性關節炎等。在本發明中，疾病之治療及/或預防包含：預防該疾病(較佳為表現RX蛋白質之個體中之該疾病)之發病、抑制或阻礙惡化或進行、減輕罹患該疾病之個體所呈現之一種或二種以上症狀、抑制或寬解其惡化或進行、治療或預防繼發性疾病等，但不以此等為限。
本發明之醫藥組成物中，可含有對治療或預防有效之量的抗RX抗體或該抗體之功能性斷片，及藥學上可容許之稀釋劑、載劑、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或補助劑。
「對治療或預防有效之量」，意指針對特定之疾病、投與形式及投與途徑而言，可發揮治療或預防效果的量。
本發明之醫藥組成物中可含有用於改變、維持、或保持pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、該組成物或其所含抗體之安定性、溶解性、緩釋性、吸收性、滲透性、劑型、強度、性狀、形狀等之物質(以下稱為「製劑用之物質」)。就製劑用之物質而言，只要為藥理學上可容許之物質即可，無特別限定。例如非毒性或低毒性為製劑用物質所適合具備的性質。
就製劑用之物質而言，可列舉如以下者，不過不以此等為限；甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸等胺基酸類；抗菌劑； 抗壞血酸、硫酸鈉或亜硫酸氫鈉等抗氧化劑；磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、三羥甲基胺基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液等緩衝劑；甘露醇或甘胺酸等充填劑；伸乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合劑；咖啡因；聚乙烯基吡咯啶、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精等錯化劑；葡萄糖、甘露糖或糊精等增量劑；單糖類、二糖類或葡萄糖、甘露糖或糖精等其他碳水化物；著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯基吡咯啶等親水聚合物；低分子量多肽；鹽形成對離子、羥基氯苯胺(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等防腐劑；甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶劑、甘露醇或山梨醇等糖醇；懸浮劑；PEG；山梨糖醇酯、聚山梨糖醇酯20或聚山梨糖醇酯80等聚山梨糖醇酯、Triton(一種非離子界面活性劑)、胺丁三醇(tromethamine)、卵磷酯或膽固醇等界面活性劑、蔗糖或山梨醇等安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀、甘露醇或山梨醇等彈性增強劑、輸送劑、稀釋劑、賦形劑、及/或藥學上的補助劑。
此等製劑用之物質之添加量，相對於抗RX抗體或其功能性斷片或其修飾體的重量，為0.001至1000倍、較佳為0.01至100倍，更佳為0.1至10倍。
含有用於使抗RX抗體或其功能性斷片或其修飾體含於微脂體中之免疫微脂體、抗體與微脂體結合而成之抗體修飾體(美國專利第6214388號等)的醫藥組成物亦包含於本發明之醫藥組成物中。
賦形劑或載劑通常為液體或固體，只要為注射用水、生理食鹽水、人工腦脊髓液、其他經口投與或非經口投與用製劑所用的物質即可，無特別限定。就生理食鹽水而言，可列舉中性者、包含血清白蛋白者等。
就緩衝劑而言，可例示：可將醫藥組成物之最終pH調成7.0至8.5之三羥甲基胺基甲烷(Tris)緩衝液、將最終pH調成4.0至5.5之乙酸緩衝液、將最終pH調成5.0至8.0之檸檬酸緩衝液、將最終pH調成5.0至8.0之組胺酸緩衝液等。
本發明之醫藥組成物為固體、液體、懸浮液等。可列舉冷凍乾燥製劑。在將凍結乾燥製劑成形上，可使用蔗糖等賦形劑。
就本發明之醫藥組成物之投與途徑而言，可為經腸投與、局部投與及非經口投與之任一種，例如，可列舉：静脈內投與、動脈內投與、肌肉內投與、皮內投與、皮下投與、腹腔內投與、經皮投與、骨內投與、關節內投與等。
該醫藥組成物之組成，可依照投與方法、抗體之RX蛋白質結合親和性等而決定。本發明之抗RX抗體或其功能性斷片或其修飾體對RX蛋白質之親和性越高(KD值越低)，越少之投與量就可發揮其藥效。
本發明之抗RX抗體之投與量，可依照個體物種、疾病之種類、症狀、性別、年齡、慢性病、該抗體之RX蛋白質結合親和性或其生物活性、其他要素而適宜決定，然而通常可將0.01至1000mg/kg，較佳為0.1 至100mg/kg，於1至180日之期間投與1次，或1日投與2次或3次以上。
就醫藥組成物之形式而言，可例示注射劑(包含冷凍乾燥製劑、點滴劑)、栓劑、經鼻型吸收製劑、經皮型吸收製劑、舌下劑、膠囊、錠劑、軟膏劑、顆粒劑、噴霧劑、丸劑、散劑、懸浮劑、乳劑、點眼劑、身體埋入型製劑等。
包含抗RX抗體或其功能性斷片或其修飾體作為有效成分之醫藥組成物，可與由DMARD、類固醇劑及/或非類固醇性抗炎症劑(NSAIDs)等所構成之治療劑或預防劑組合而使用，再者可與治療劑或預防劑同時或依序先後投與。例如，在投與DMARD、類固醇劑及/或NSAIDs之後，投與包含抗RX抗體或該抗體之功能性斷片做為有效成分之醫藥組成物，或在投與該醫藥組成物後，投與DMARD、類固醇劑及/或NSAIDs，或者，亦可將該醫藥組成物與DMARD、類固醇劑及/或NSAIDs同時投與。就DMARD而言，可列舉MTX等。又，對於接受抗TNFα劑、抗IL-6劑、CTLA4-Ig、抗CD20抗體、JAK阻害劑等投與之患者，亦可當做替代藥，或當做併用藥而進行投與。
本發明亦提供RA等自體免疫疾病或關節炎之治療方法或預防方法，用於調製RA等自體免疫疾病或關節炎之治療用或預防用醫藥組成物的本發明抗體之使用，用於治療或預防RA等自體免疫疾病或關節炎的本發明抗體之使用。包含本發明抗體的治療用或預防用套組亦包含於本發明中。
6.診斷用組成物
本發明提供包含本發明之抗RX抗體或其功能性斷片或其修飾體之檢査用或診斷用組成物(以下，總稱為「診斷用組成物」)。包含於本發明之診斷用組成物之抗體、其功能性斷片、其修飾體等，只要與RX蛋白質結合即可，無特別限定。
本發明之診斷用組成物，在RA等自體免疫疾病或關節炎之檢査或診斷上有用。在無法滿足先前診斷基準之早期RA或前RA症狀、無法確診是否會進展成RA之關節炎(UA)等之檢査或診斷上有用。在本發明中，檢査或診斷包含例如：罹患風險之判定或測定、有無罹患之判定、進行或惡化程度之測定、藉由抗RX抗體等之醫藥組成物而得到藥物治療效果之測定或判定、藥物治療以外之治療效果的測定或判定、再發風險之測定、有無再發之判定等，然而只要為檢査或診斷即可，不以此等為限。
與健康人樣本比較，受驗者樣本中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍或其以上之RX蛋白質量被驗出之情況，可診斷為該受驗者罹患類風濕性關節炎，或者罹患之風險高。又，在RX蛋白質之血中濃度超過特定之基準值的情況，可診斷為該受驗者罹患RA，或診斷為該受驗者罹患RA之風險高。
該診斷用組成物中，亦可含有pH緩衝劑、滲透壓調節劑、鹽類、安定劑、防腐劑、顯色劑、增感劑、凝集防止劑等。
本發明亦提供RA等自體免疫疾病或關節炎等之檢査方法或診斷方法、用於調製RA等自體免疫疾病或關節炎等診斷用組成物之本發明抗體之使用、用於檢査或診斷RA等自體免疫疾病或關節炎等之本發明抗體之使用。包含本發明抗體之檢査或診斷用套組亦包含於本發明中。該套組可含有RX蛋白質或其斷片或其修飾體等做為標準物質。
就含有本發明抗體之檢査或診斷方法而言，較佳為三明治ELISA法，然而通常可為ELISA法或RIA法、酶聯免疫斑點(enzyme-linked immunospot；ELISPOT)法、點漬法(dot blot)、奧克特洛尼法(Ouchterlony test)、對流免疫電泳(CIE；Counterimmunoelectrophoresis)法等利用抗體之檢測方法。就供三明治ELISA測定系統用之抗體而言，只要為識別MMTVenv之抗體中不會競爭之2種抗體之組合即可，可使用任一種抗體實施。就抗體之標識法而言，除生物素外，可利用HRP、鹼性磷酸酶、FITC等能實施生化學上解析之標識法。利用酵素標識之檢測，除使用TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)、BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽)、ρ-NPP(對硝基苯磷酸鹽)、OPD(鄰伸苯基二胺)、ABTS(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific公司)等發色基質或QuantaBluTM Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Fisher Scientific公司)螢光基質之外，可使用化學發光基質。本測定中，除來自人類或非人類動物之試料外， 亦可供給施加重組蛋白質等人工處理之試料。就來自生物個體之受檢試料而言，可列舉如血液、關節液、腹水、淋巴液、腦脊髓液、組織均質上清液等，就血液試料而言，可列舉血清及血漿，然而不以此等為限。
包含本發明抗體之檢査或診斷用三明治ELISA套組中，可包含RX蛋白質標準液、顯色試藥、稀釋用緩衝液、固相用抗體、檢出用抗體、及洗淨液等。就測定結合於抗原之抗體量的方法而言，較佳為使用吸光法、螢光法、發光法、RI(Radioisotope)法等，測定中以使用吸光盤式分析儀、螢光盤式分析儀、發光盤式分析儀、RI液體閃爍計數器等為較佳。
本發明提供RX蛋白質之檢測方法及RX蛋白質之定量方法。該方法包含使受檢試料與抗RX抗體接觸之步驟。又，包含抗RX抗體之試藥亦包含於本發明中。該檢測方法、定量方法及試藥等，可使用做為前述檢査及/或診斷用。
實施例
以下，藉由實施例具體地說明本發明，然而本發明並不以此等為限。
再者，實施例若無特別註明，係依照「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.，Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發刊)記載之方法、根據在其他本技術領域人士所使用之實驗書中所記載之方法，對於市售之試藥或套組則係依照其指示書操作。
實施例1 參與關節炎惡化之細胞株的建立 a)來自膠原誘發性關節炎小鼠模型關節部分之自律性增殖細胞株的建立
參與關節炎之惡化的細胞株，如下述，係藉由關節炎小鼠模型關節部分來建立。關節炎之誘發係依據T.S.Courtensy,Nature,283,666,1980記載之方法進行。亦即，將來自牛之二型膠原蛋白(膠原蛋白技術研修會)及弗氏完全佐劑之乳液經由皮內投與至雄性DBA/1小鼠(日本Charles River股份有限公司)之尾根部，2週後，將來自牛之二型蛋白膠原及弗氏不完全佐劑之乳液以同樣方式進行皮內投與，誘導膠原誘發性關節炎。關節炎嚴重化後，以無菌方式採取後肢踝關節部之組織，藉由在培養皿中搗碎並以培養基(添加10% FCS之RPMI1640培養基)培養，使細胞從組織片浸潤出。在顯微鏡下觀察浸潤細胞的狀態，同時每3~7日以每次交換半量之方式交換培養基，確認細胞充分浸潤出後，藉由胰蛋白酶處理將細胞剝離，從培養皿回收細胞及組織片。不需要之組織片藉由通過70μm之細胞過濾器(Becton Dickinson公司)而除去。對於透過過濾器之細胞，每3~7日以每次交換半量之方式交換培養基，繼續培養。細胞增殖安定化後，從包含10% FCS之培養基分階段交換成無血清培養基。以此種方式，從膠原誘發性關節炎小鼠模型之關節部分建立自律性增殖的細胞株(以下稱為「ADSF細胞」)。
b)由ADSF細胞引起之關節炎惡化作用的確認
為了檢討ADSF細胞與關節炎之關連，將ADSF細胞本身以腹腔內投與至膠原誘發性關節炎小鼠模型中，以評價參與關節炎之惡化作用的影響。膠原誘發關節炎，係藉由將來自牛之二型膠原蛋白及弗氏完全佐劑之乳液經由皮內投與至雄性DBA/1小鼠的尾根部2次，每次相隔14日而誘導。使用一群10隻小鼠，設定ADSF細胞投與群及做為陰性對照之小鼠脾臓細胞投與群，從以膠原初次致敏日開始，每7日將1×107個細胞經由腹腔內投與，共計7次。關節炎惡化，係分別將四肢之關節炎程度按照0至4級之5級計分法計分，並以四肢之合計點進行評價。關於ADSF細胞投與群及小鼠脾臓細胞投與群之關節炎分數，藉由Mann-Whitney U-test法實施有意義差檢定的結果，ADSF細胞投與群之關節炎分數，與小鼠脾臓細胞投與群之關節炎分數相較，於膠原致敏後第21日以後，有意義地較高，可確認藉由ADSF細胞投與造成有意義之關節炎惡化(第1圖，#：p<0.05)。
實施例2. 具有抗關節炎作用之單株抗體之製作 a)使用ADSF細胞及其培養上清濃縮液之單株抗體之製作
為了得到抑制關節炎惡化活性之抗體，將ADSF細胞(1×107個)及培養上清液之濃縮液混合，並投與至WKY/NCrj大鼠之腹腔內及足蹟皮內。為了使抗體價上升，進行追加免疫，在最後免疫之3日後，採取淋 巴節，取出細胞，依照常用方法，以使細胞數之比率成為1：7之方式添加8-653株之骨髓瘤細胞，進行細胞融合。將做為細胞融合促進劑之預先加溫至37度之聚乙二醇(分子量4000)以最終濃度成為35%(w/v)之方式添加，藉由緩慢離心操作(800 rpm，5分鐘以內)使細胞融合。然後，添加培養基，將細胞再懸浮，離心及回收細胞，並使用HAT選擇培養基(含有次黃嘌呤、胺喋呤、胸苷)篩選融合細胞。繼而，使用極限稀釋法單一純系化後，篩選可產生與ADSF細胞之培養上清液成分結合之抗體的融合細胞(融合瘤)。具體而言，使固定有ADSF細胞之培養上清液成分之微培養盤與抗體反應，繼而與以辣根過氧化酶(horseraddish peroxidase)(以下稱為「HRP」)標識之抗大鼠二次抗體反應，使TMB基質(Capel公司)顯色，然後用0.1N鹽酸停止反應，再使用盤式分析儀Multiscan Bichromatic(Labsystems公司)測定於波長450nm之吸光度。其結果，得到與ADSF細胞之培養上清液成分結合的單株抗體1(MAb1)。該抗體係將所產生之融合瘤經由腹腔內投與至裸小鼠，然後依照常用方法，使用ProteinG親和管柱從該裸小鼠之腹水中精製而得。
b)抗體所識別之抗原的解析 1)識別抗原之精製
藉由MAb1而被識別之抗原之精製係如以下之方式實施。亦即，使用偶合試藥(辛二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate))使依照實施例2之a)調製之 MAb1交聯於親和凝膠載劑(Immunopure Immobilized ProteinG Plus gel；Thermo Fisher Scientific公司)上而製作抗體管柱。將於CL-1000燒瓶中培養之ADSF細胞的培養上清液添加於該抗體管柱中，以管柱容量10倍量之滅菌PBS洗淨後，用100mM甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.8)溶出。將溶出液用其1/10體積之1M Tris鹽酸緩衝液(pH9.0)立即中和。使用超濾過濾器(Centriprep MWCO10K：Millipore公司)濃縮，將緩衝液以PBS置換。精製之抗原蛋白藉由非還原條件下之十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis；以下稱為「SDS-PAGE」)法解析之結果，檢測出分子大小約55kDa及約28kDa之帶(第3圖)。
2)識別抗原之確認
為了確認MAb1所識別之抗原的分子量，實施西方轉漬法解析。亦即，將在實施例2之b)1)中所精製之抗原於非還原條件下使用於SDS-PAGE後、依照常用方法轉錄於硝基纖維素膜。將轉錄之膜以Block Ace(DS Pharmo Biomedical公司)進行封阻(blocking)，添加經生物素標識之MAb1並反應1小時。以含有0.1% Tween20之PBS將膜充分洗淨後，與經HRP標識之鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)反應。繼而，以含有0.1% Tween20之PBS充分洗淨，與化學發光基質(SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate：Thermo Fisher Scientific公司)作用，檢測出可與MAb1反應之蛋白質 帶。其結果，MAb1識別出藉由親和層析所精製之分子大小約55kDa的蛋白質(第4圖)。再者，藉由SDS-PAGE分離預先用糖苷酶F(PNGaseF proteomics Grade；Sigma Aldrich公司)處理之試料，從銀染色之電泳後之凝膠切出相當於以西方轉漬法解析呈現陽性之蛋白質之帶，還原烷基化後，用胰蛋白酶(Trypsin Gold；Promega公司)分解。將分解物與CHCA(α-氰基-4-羥基桂皮酸)混合，使用Bruker Daltonics公司之UltraflexIITM實施MALDI-TOF-MS分析。對於所得到之離子化斷片峰之分子大小，使用蛋白質解析軟體(Mascot Server；Matrix Science公司)檢索該蛋白質之結果，判定MAb1所識別之蛋白質帶係逆轉錄病毒MMTV之外殼蛋白質(MMTVenv)的膜外區域gp52SU(第5圖)。又，對於分子大小約28kDa之蛋白質亦以同樣方式解析時，確認其係MMTVenv之gp36TM之細胞外區域的至少一部分。
c)對抗RX抗原之單株抗體之製作
以精製之RX蛋白質做為抗原，使其在弗氏完全佐劑中乳化，並經由腹腔內投與至BALB/c小鼠。為了使抗體價上升，對腹腔內及尾静脈進行追加免疫，在最後免疫之3~4日後，採取脾臓，取出細胞，與小鼠骨髓瘤細胞(P3-X63)株藉由PEG法融合，得到融合瘤。產生具有與RX蛋白質結合之能力之抗體的融合瘤之篩選係如以下之方式實施。首先，將精製之RX蛋白質添加於微培養盤之各孔中並固定化。使融合瘤所產生之抗體與固相化之RX蛋白質反應，繼而與可識別小鼠IgG 之經HRP標識之二次抗體反應，而使鄰苯二胺基質顯色，然後用2N硫酸使反應停止，使用盤式分析儀測定於波長490nm之吸光度。其結果，得到結合於精製RX蛋白質上之單株抗體2及3(MAb2及MAb3)。第2圖顯示對於使用ProteinG親和管柱所精製之MAb2、MAb3、及在實施例2之a)中所得到之MAb1，藉由ELISA法確認與精製RX蛋白質之結合能力的結果。該ELISA法係使用TMB基質(Capel公司)做為顯色基質，藉由盤式分析儀測定於波長450nm的吸光度。
實施例3. 單株抗體之序列解析
為了解讀MAb1之基因序列，依照常用方法從產生MAb1之融合瘤萃取mRNA。在周知之大鼠抗體基因之核酸序列(重鏈恆定區域：登錄編號P20759；輕鏈：登錄編號L22653)中，選取與人類及小鼠一致之序列，設計下述數種3’末端引子。藉由使用重鏈之CH3區域之C末端(序列表之序列16：CH-R1：TCATTTACCCGGAGAGTGGGAGAGA)、輕鏈之CL區域之C末端(序列表之序列編號17(CLK-R1)：CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC)並以上述之mRNA做為模板之5’-RACE之RT-PCR法(GeneRacer/SuperScript III，Invitrogen公司)，得到cDNA斷片。藉由瓊脂糖電泳分析，確認各個cDNA斷片為抗體基因之該部位的斷片大小。繼而，將各個cDNA斷片插入選殖載體(TOPO TA cloning，Invitrogen公司)，解讀全長之DNA鹼基序列。關於3’區域之序列，以其他方 式實施3’-RACE而確認。將MAb1之重鏈DNA鹼基序列示於序列表之序列編號18(第15圖)，將該抗體重鏈之胺基酸序列示於序列表之序列19(第16圖)，將MAb1之輕鏈DNA鹼基序列示於序列表之序列編號20(第17圖)，將該抗體輕鏈之胺基酸序列示於序列表之序列編號21(第18圖)。將MAb1之CDR之胺基酸序列示於第23圖(序列表之序列編號22至27)。
為了使MAb1之重鏈及輕鏈之基因在培養動物細胞中表現，組入使用IRES序列之串聯(tandem)表現載體pTandem-1(Novagen公司)。具體而言，首先將輕鏈基因插入在上游側之NcoI與XhoI所夾之部位，繼而將重鏈基因插在為IRES序列下游之NheI與ClaI所夾之部位，構築成MAb1基因表現載體pFFF05。用此表現載體導入FreeStyleTM CHO-S Cells(Invitrogen公司)，確認抗體蛋白質被分泌至其培養上清液中。使用蛋白質G管柱(GE Healthcare公司)從培養上清液精製MAb1。藉由西方轉漬(Western-blot)解析，可確認此重組MAb1，與來自融合瘤之MAb1同樣地與RX蛋白質交會。
MAb2係依照Wang Z.氏等之報告(Journal of Immunological Methods 233，pp.167-177，2000)，製作簡併引子(序列表之序列編號28：(小鼠)抗體序列解析用引子HF：CCGCTAGCATGSARGTNMAGCTGSAGSAGTC；序列表之序列編號29：(小鼠)抗體序列解析用引子HR：AGCGCTCTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA；序列表之序 列編號30：(小鼠)抗體序列解析用引子LF：CCCCATGGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA；序列表之序列編號31：(小鼠)抗體序列解析用引子LR：CCCTCGAGTTCAACACTCATTCCTGTTGAAGCCTTGACG)，藉由使用SuperScript III(Invitrogen公司)之RT-PCR法，將從來自融合瘤之mRNA逆轉錄的cDNA斷片插入選殖載體(TOPO TA cloning，Invitrogen公司)中，解讀重鏈可變區域及輕鏈可變區域之DNA鹼基序列。將MAb2之重鏈可變區域之DNA鹼基序列示於序列表之序列編號32(第19圖)，將該抗體重鏈可變區域之胺基酸序列示於序列表之序列編號33(第20圖)，將MAb2之輕鏈可變區域之DNA鹼基序列示於序列表之序列編號34(第21圖)，將該抗體輕鏈可變區域之胺基酸序列示於序列表之序列編號35(第22圖)。將MAb2之CDR之胺基酸序列示於第23圖(序列表之序列編號36至41)。
MAb3之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之DNA鹼基序列，藉由與MAb2同樣之方法解讀。將MAb3之重鏈可變區域之DNA鹼基序列示於序列表之序列編號62(第30圖)，將該抗體重鏈可變區域之胺基酸序列示於序列表之序列編號63(第31圖)，將MAb3之輕鏈可變區域之DNA鹼基序列示於序列表之序列編號64(第32圖)，將該抗體輕鏈可變區域之胺基酸序列示於序列表之序列編號65(第33圖)。將MAb3之CDR之胺基酸序列示於第23圖(序列表之序列編號66至71)。
實施例4. 單株抗體對RX蛋白質之結合親和性
使用SPR裝置(ProteOn XPR36：BioRad公司)測定實施例2中所取得之單株抗體對RX蛋白質的結合親和性。使用10mM乙酸鈉緩衝液(pH4.5)將MAb1及MAb3稀釋成10μg/ml，將MAb2稀釋成20μg/ml之濃度，並分別在感測片(Sensor Chip GLM；BioRad公司)上以胺偶合法固相化。封阻係藉由添加1M乙醇胺鹽酸鹽(pH8.5)而實施。使用ProteOn PBS/Tween，pH7.4(PBS pH7.4，0.005% Tween20)做為運行緩衝液(running buffer)。將精製之RX蛋白質進行階段性稀釋，使其與為分析物之固相化單株抗體互相作用，測定結合親和性。結合速度常數ka及解離速度常數kd係藉由使用ProteOn ManagerTM之動力學解析算出。其結果，所取得之抗體對RX蛋白質之結合親和性為10-10M層級(第6圖)。
實施例5. RX蛋白質之關節炎惡化作用的確認
為了確認RX蛋白質對關節炎之參與，利用膠原誘發性關節炎模型進行以下之實驗。膠原誘發性關節炎係藉由將來自牛之二型膠原蛋白及弗氏完全佐劑之乳液經由皮內投與至雄性DBA/1小鼠之尾根部，繼而於2週後，將來自牛之二型膠原蛋白及弗氏不完全佐劑之乳液以同樣方式投與而誘發(一群5隻)。藉由在實施例2之b)之1)中記載之方法，將從ADSF細胞之培養上清液精製的RX蛋白質，從膠原之第1次致敏日開始，每3日以200ng/小鼠之量經由静脈內投與。關節炎惡化之評價係分別將四肢之關節炎程度按照0至4之5級計分法 計分，並將四肢之合計點做為個體之關節炎分數來進行評價。其結果暗示藉由RX蛋白質之投與，關節炎惡化(第7圖)。誤差線(error bar)表示標準誤差(SE)。
實施例6. 單株抗體在關節炎小鼠模型中之藥效
驗證在實施例2之a)中所得到之單株抗體MAb1及在實施例2之c)所得到之單株抗體MAb2在膠原誘發性關節炎模型中之藥理作用。
a)膠原誘發性關節炎模型之製作
膠原誘發性關節炎係藉由將來自牛之二型膠原蛋白及弗氏完全佐劑之乳液經由皮內投與至雄性DBA/1小鼠之尾根部，繼而於3週後，將來自牛之二型膠原蛋白及弗氏不完全佐劑之乳液以同樣方式投與而誘發。一群為10隻，單株抗體係從第2次之膠原致敏日開始，每3日以2mg/kg之量經由腹腔內投與。就陰性對照而言，使用從正常大鼠血清精製之IgG(對照IgG抗體)。
就藥效而言，針對b)關節炎抑制作用(第8圖)，及c)骨破壞抑制作用(第9圖)進行評價。
b)關節炎抑制作用
關節炎惡化，係將四肢之各別關節炎程度按照未發病：0，第一關節中出現紅斑及浮腫之發病：1，擴及第二關節之紅斑及浮腫之發病：2，整肢出現紅斑及浮腫之發病：3，變形或僵直之發病：4來計分，將四肢之合計點做為個體之關節炎分數來進行評價。其結果，可見為陰性對照之對照IgG抗體投與群的關節炎分數經時地惡化，然而在單株抗體投與群中，可見顯著之關節 炎的抑制(第8圖)。有意義差檢定係藉由威爾科克森試驗(Wilcoxon’s-test)法，與對照IgG抗體投與群比較而進行。就MAb1而言，於第31日以後，就MAb2而言，於第35日以後，分別可見有意義之關節炎抑制(＊：p<0.05)。誤差線表示標準誤差(SE)。
c)骨破壞抑制作用
骨破壞係依據a)之方法，製作膠原誘發性關節炎模型，對於後肢用福馬林固定後攝影所得之軟X光攝影圖像，於跟骨、跗骨、蹠骨之各個部分，按照正常：0，輕度：1，中度：2，重度：3之4級計分法將骨破壞程度計分，將四肢之合計分數當做個體的骨破壞分數來進行評價。有意義差檢定係藉由Wilcoxon’s-test法與對照IgG抗體投與群比對而進行。其結果，可確認MAb1具有有意義之骨破壞抑制作用(第9圖，#：p<0.05)。誤差線表示標準誤差(SE)。
實施例7. 在RA患者中RX蛋白質及RX基因的表現
為了驗證在RA患者中RX蛋白質及RX基因的存在，蛋白質之表現量係藉由西方轉漬法及MS解析來確認，基因之表現量解析係藉由南方轉漬法及基因序列解析來確認。
a)藉由西方轉漬法之解析
將從RA患者於手術時摘出之關節滑膜用膠原酶處理後搗碎，以含有10% FCS之RPMI1640培養基培養2~5日。回收培養後之培養基上清液，添加於已固定有MAb1之親和管柱中並溶出結合蛋白。然後，為了 除去混入之白蛋白及人類IgG，使用SIGMA公司之Proteo Prep免疫親合白蛋白及IgG清除套組(Proteo Prep Immunoaffinity Albumin and IgG Depletion Kit；型號PROT-IA)處理。在親和管柱溶出液中添加SDS樣本緩衝液，藉由熱處理調製電泳樣本。電泳係依照Laemmli法(Nature，227：pp.680~685(1970)於非還原條件下進行。使用轉漬(blotting)裝置(BioRad公司SEMI DRY TRANSFER CELL；型號170-3940)，將蛋白質從泳動後之凝膠轉錄於硝基纖維素膜(BioRad公司Trans Blot：型號162-0093)上。轉錄後之膜藉由Block Ace(DS Pharmo Biomedical公司；型號UK-B80)進行封阻處理，與濃度為1μg/ml之生物素化MAb1反應1小時。將膜用含有0.1% Tween-20之PBS充分洗淨後，使其與經HRP標識之鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)(GE Healthcares公司；型號1058765)反應1小時。進一步以含有0.1% Tween-20之PBS充分洗淨後，使用化學發光基質Super Signal West Dura Extended Duration Substrate(Thermo Fisher Scientific公司；型號34075)並於反應後照相攝影，檢測出可與MAb1反應之蛋白質。在第10圖中顯示解析之一部分即病例1至4之西方轉漬法的結果。行編號RA1、RA2、RA3及RA4分別表示來自RA患者RA1、RA2、RA3及RA4之試料。在RA患者中，可觀察到與來自ADSF細胞之RX蛋白質(S行)相同大小的陽性帶。
b)質譜解析
藉由非還原條件下之SDS-PAGE分離從來自實施例7之a)記載之RA患者(RA1)的血漿親和精製而得的試料，切出相當於西方轉漬法解析時顯示MAb1陽性之蛋白質的帶，進行還原烷化後，用胰蛋白酶分解。將分解物與α-CHCA(α-氰基-4-羥基桂皮酸)混合，使用Applied Biosystems公司之Voyager-DE STRTM實施MALDI-TOF-MS分析。關於所得到之離子化片段峰之分子大小，使用蛋白質鑑定搜索引擎MS-Fit(UCSF)檢索蛋白質資料庫的結果，確認與MAb1反應之蛋白質為逆轉錄病毒MMTV之外殻蛋白質(MMTVenv)的膜外區域gp52SU。在第11圖(序列表之序列編號42至52)中顯示來自RA患者之蛋白質中與gp52SU為一致之肽斷片之胺基酸序列。
c)南方轉漬解析
使用在從RA患者於手術時摘出之關節滑膜中添加ISOGEN試藥(日本基因公司)並用均質機(IKA公司)進行30秒均質後萃取而得之總RNA試料，或從Scottish Biomedical公司購入之來自RA患者之關節滑膜的總RNA試料。以此等總RNA試料做為模板，使用SuperScript VILO cDNA合成套組(Invitrogen公司)合成cDNA。關於基因組DNA，同樣地使用Easy-DNA KIT(Invitrogen公司)將取出之組織試料的一部分精製。
編碼MMTVenv之基因序列的檢測係依照以下之方法實施。亦即，以來自上述組織試料之cDNA或基因組DNA做為模板，使用在MMTVenv基因編碼區域 內所設計之引子1(序列表之序列編號53：5’-CCAGATCGCCTTTAAGAAG-3’)與引子2(序列表之序列編號54：5’-CTATCATTGGGATCCTTAGGAGAATT-3’)之組合以及KOD FX DNA聚合酶(TOYOBO公司)，於以下所示之條件下實施PCR，該實施PCR之條件為：於94℃進行2分鐘之熱變性後，進行50次「於94℃，30秒；於55℃，30秒；於68℃，30秒」之循環。PCR增幅產物係藉由瓊脂糖凝膠電泳分離後，轉錄於尼龍膜，然後依照一般方法藉由雜交法檢測陽性帶。亦即，在預雜交溶液(DIG Easy Hyb：Roche Diagnostics公司)中於50℃，進行30分鐘緩慢振盪。在交換預雜交溶液後，添加經熱變性之檢測用探針，並於50℃緩慢振盪2小時以上，同時進行雜交。檢測用探針，係使用第2代DIG寡核苷酸3’-端標識用套組(DIG Oligonucleotide 3’-End Labeling kit，2nd Generation(Roche Diagnostics公司))將序列表之序列編號55(5’-TGCGCCTTCCCTGACCAAGGG-3’)所示之寡核苷酸之3’末端用DIG標識而製作。雜交後之膜，以包含0.1% SDS之2xSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉；pH7.0)溶液，於室溫進行5分鐘之洗淨2次，繼而以包含0.1% SDS之0.5xSSC溶液，於50度進行15分鐘之洗淨2次後，使用DIG沖洗及封阻緩衝液組(Roche Diagnostics公司)進行封阻，使其與抗-地高辛-AP(Anti-Digoxigenin-AP)抗體反應，檢測上述之探針所結合的DNA斷片。其結果，從複數個來自RA患者之試料檢測出陽性帶。
d)PCR陽性試料之序列解析
關於在實施例7之c)中記載之以南方轉漬解析判定為陽性之試料，藉由PCR產物之直接定序來解析DNA鹼基序列，或者將PCR產物次選殖入載體中並使用PRISM 3100-Avant Genetic AnalyzerTM(Applied Biosystems公司)來解析DNA鹼基序列。其結果，從來自RA患者(RA5至RA8)之試料所得到之DNA的鹼基序列，任一種均顯示與MMTVenv之鹼基序列具高同源性。將此等鹼基序列轉譯為胺基酸序列時，雖存在0至4處胺基酸變異，不過係與來自ADSF細胞之RX蛋白質所具有之胺基酸序列幾乎一致的序列(第12圖：序列表之序列編號56至59)。
實施例8. 針對RX蛋白質之三明治ELISA測定法的構築 a)使用精製RX蛋白質之測定範圍的確認
為提供測定血中之RX蛋白質量的手段，確立三明治ELISA測定法。具體而言，將MAb1以2μg/ml之濃度在高結合型免疫檢定用微培養盤(Coaster公司；型號3590)上固定化，並使用Block Ace(DS Pharmo Biomedical公司)封阻。添加測定之試料後，以含有0.1% Tween20之PBS充分進行洗淨作業後，添加為檢測用抗體之經生物素標識之MAb3並使其濃度成為1μg/ml。接著，以含有0.1% Tween20之PBS充分進行洗淨作業後，與經HRP標識之鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)作用，進一步以含有0.1% Tween20之PBS充分進行洗淨作 業後，使其與顯色基質TMB反應，用0.1N鹽酸停止顯色反應後，測定於波長450nm之吸收。使用精製RX蛋白質所製作之校正曲線係如第13圖所示，在0.0625ng/ml至1ng/ml之範圍內可得到直線性。
b)使用RA患者及健康人血液之檢討
使用18名RA患者病例(RA9至RA26)及8名健康人自願者(HD1至HD8)的血漿試料，將血中RX蛋白質量以上述之三明治ELISA測定系統進行解析。其結果，雖在一部分健康人中亦可見到其表現，然而在RA患者中檢測出平均為健康人11.5倍之血中RX蛋白質量(第14圖)。藉由學生-T試驗(Student-T test)所進行之有意義差檢定亦可確認RA患者之血中RX蛋白質量明顯地比健康人增加(p<0.001)。從此結果顯示可藉由測定血中之RX蛋白質量來判別RA患者與健康人的可能性。
實施例9. 嵌合抗體之製作及功能確認
藉由將在實施例3中被解讀之大鼠抗體之MAb1之H鏈(序列19)及L鏈(序列21)之個別可變區域移植至人類IgG1之H鏈及L鏈之可變區域之相同部位，而製作成大鼠與人類之嵌合抗體之基因序列(以下稱為「嵌合化MAb1」)。將該抗體基因藉由實施例3之方法，組入培養動物細胞用之表現載體中，依照一般方法使用轉染試藥，以該表現載體導入至HEK293細胞，使嵌合化MAb1暫時性地表現。將培養第4至5日之培養上清液中之分泌抗體添加於ProteinA管柱，將吸附部分以100mM甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.8)溶出，將溶出液立即使 用1M之Tris鹽酸緩衝液中和。所得到之嵌合化MAb1對RX蛋白之結合親和性藉由SPR法解析之結果，可確認為大鼠抗體之MAb1與嵌合化MAb1呈現相同程度之結合親和性(第34圖)。
實施例10. 人型化抗體之製作及功能確認 a)人型化抗體序列之設計
選取與實施例3中所解讀之MAb1之H鏈(序列編號19：第16圖)及L鏈(序列編號21：第18圖)之胺基酸序列具有高同源性之人類IgG1的H鏈及L鏈，藉由將MAb1之H鏈及L鏈之CDR序列移植至該人類IgG1之H鏈及L鏈的相同部位，設計與人類之IgG1抗體極類似之MAb1(以下稱為「人型化MAb1」)的序列。再者，根據所預測之MAb1之可變區域之分子模型，置換框架區域之幾個胺基酸殘基，以使CDR序列之構造安定化。對CDR序列相同部位之移植及框架區域之最適化的細節係依照下述之順序實施。
1)MAb1之可變區域之分子模型建立(modeling)
MAb1之可變區域之分子模型建立，就同源性模型建立而言，一般係藉由周知之方法(Methods in Enzymology，203，121-153，(1991))實行。亦即，從蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(Nuc.Acid Res.35，D301-D303(2007))中所登錄之人類免疫球蛋白之可變區域的胺基酸一次序列中，檢索與MAb1之可變區域的胺基酸一次序列同源性最高之序列，由於PDB code：1ZAN(L鏈；以下稱為「1ZAN輕鏈」)及PDB ID：2GHW(B 鏈；以下稱為「2GHW重鏈」)對MAb1之輕鏈及重鏈之可變區域顯示最高序列同源性，所以選擇做為構造預測之模型。框架區域之三次元構造，係使對應於MAb1之輕鏈及重鏈之1ZAN輕鏈及2GHW重鏈的座標組合而製作(以下稱為「框架模型」)。MAb1之CDR序列，依照Thornton等人(J.Mol.Biol.，263，800-815，(1996))之分類，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及CDRH2分別被分配至集群(cluster)11A、7A、9A、10A、及10B。另一方面，CDRH3根據H3規則(FEBS letter 399，1-8(1996))，採用kink型(8)。繼而，將有關各CDR序列之代表性構形組入前述框架模型而構築成MAb1之可變區域的三次元構造模型(以下稱為「MAb1構造模型」)。關於此種方式所得到之MAb1構造模型，藉由使用蛋白質立體構造預測程式Prime及構形探索程式MacroModel(Schroedinger，LLC)進行分子動力學模擬，求出構成主鏈及側鏈之所有原子之動態能量的最小值並決定MAb1構造模型之最安定構造。
2)對人型化MAb1之胺基酸序列的設計
用於設計人型化MAb1抗體之胺基酸一次序列的CDR移植(grafting)係依照Queen C等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))之方法實施。具體而言，由於將MAb1之框架區域之胺基酸序列，與Kabat資料庫(Nuc.Acid Res.29，205-206(2001))中所登錄之人類抗體之框架區域之胺基酸序列比較之結果，mAb58’CL抗體在框架區域中顯示77%之序列同源性， 所以選擇其做為提供人類抗體之框架區域的抗體(以下稱為「受體(acceptor)抗體」)。將該受體抗體之框架區域之胺基酸殘基與MAb1之框架區域之胺基酸序列比較，鑑定出不一致之胺基酸殘基的位置。此等不一致胺基酸殘基之位置，藉由投影在實施例10a-1中所構築之MAb1的構造模型上，並依照Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))之基準解析與MAb1之CDR序列互相作用之程度，然後決定位於被推測在保持CDR序列之立體構造上重要之框架區域中的不一致胺基酸殘基，即要從MAb1之序列移入受體抗體之序列的胺基酸殘基(以下稱為「供體(donor)殘基」)。就人型化MAb1之胺基酸序列而言，為了確保物理化學性質之多樣性，藉由使供體殘基之移入位置改變，設計為H鏈之10種序列(MAb1H1至H10：序列編號72至81；第40至49圖)及為L鏈之5種序列(MAb1L1至L5：序列表之序列編號82至86；第50至54圖)。
3)人型化MAb1之胺基酸序列
以此種方式所設計之各個人型化MAb1之胺基酸序列如以下所示。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號19(離胺酸)、23(纈胺酸)、24(甘胺酸)、42(離胺酸)、49(丙胺酸)、74(絲胺酸)、75(丙胺酸)、77(絲胺酸)、82(麩醯胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為精胺酸、丙胺酸、丙胺酸、甘胺酸、絲胺 酸、天冬醯胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H1」(序列編號91之胺基酸序列：序列編號72；第40圖)。在本發明中亦簡稱為「H1」。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號19(離胺酸)、23(纈胺酸)、24(甘胺酸)、42(離胺酸)、74(絲胺酸)、75(丙胺酸)、77(絲胺酸)、82(麩醯胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為精胺酸、丙胺酸、丙胺酸、甘胺酸、天冬醯胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H2」(序列編號92之胺基酸序列：序列編號73；第41圖)。在本發明中亦簡稱為「H2」。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號19(離胺酸)、23(纈胺酸)、42(離胺酸)、75(丙胺酸)、77(絲胺酸)、82(麩醯胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為精胺酸、丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H3」(序列編號93之胺基酸序列：序列編號74；第42圖)。在本發明中亦簡稱為「H3」。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號19(離胺酸)、23(纈胺酸)、42(離胺酸)、77(絲胺酸)、82(麩醯胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為精胺酸、丙胺酸、甘胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H4」(序列編號94之胺基酸序列：序列編號75；第43圖)。在本發明中亦簡稱為「H4」。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號19(離胺酸)、23(纈胺酸)、24(甘胺酸)、42(離胺酸)、75(丙胺酸)、77(絲胺酸)、82(麩醯胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為精胺酸、丙胺酸、丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H5」(序列編號95之胺基酸序列：序列編號76；第44圖)。在本發明中亦簡稱為「H5」。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號19(離胺酸)、23(纈胺酸)、42(離胺酸)、74(絲胺酸)、75(丙胺酸)、77(絲胺酸)、82(麩醯胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為精胺酸、丙胺酸、甘胺酸、天冬醯胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、離胺 酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H6」(序列編號96之胺基酸序列：序列編號77；第45圖)。在本發明中亦簡稱為「H6」。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號19(離胺酸)、23(纈胺酸)、42(離胺酸)、75(丙胺酸)、77(絲胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為精胺酸、丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H7」(序列編號97之胺基酸序列：序列編號78；第46圖)。在本發明中亦簡稱為「H7」。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號19(離胺酸)、23(纈胺酸)、24(甘胺酸)、42(離胺酸)、49(丙胺酸)、75(丙胺酸)、77(絲胺酸)、82(麩醯胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為精胺酸、丙胺酸、丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H8」(序列編號98之胺基酸序列：序列編號79；第47圖)。在本發明中亦簡稱為「H8」。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號13(麩醯胺 酸)、16(精胺酸)、19(離胺酸)、23(纈胺酸)、24(甘胺酸)、42(離胺酸)、75(丙胺酸)、77(絲胺酸)、82(麩醯胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為離胺酸、甘胺酸、精胺酸、丙胺酸、丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H9」(序列編號99之胺基酸序列：序列編號80；第48圖)。在本發明中亦簡稱為「H9」。
伴隨從序列表之序列編號19所示之MAb1之H鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號13(麩醯胺酸)、16(精胺酸)、19(離胺酸)、23(纈胺酸)、24(甘胺酸)、42(離胺酸)、49(丙胺酸)、75(丙胺酸)、77(絲胺酸)、82(麩醯胺酸)、88(絲胺酸)、93(蘇胺酸)、113(纈胺酸)、114(甲硫胺酸)被分別置換為離胺酸、甘胺酸、精胺酸、丙胺酸、丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、白胺酸而設計成之人型化MAb1之H鏈的可變區域被命名為「MAb1H10」。在本發明中亦簡稱為「H10」(序列編號100之胺基酸序列：序列編號81；第49圖)。
伴隨從列表之序列編號21所示之MAb1之L鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號9(丙胺酸)、15(白胺酸)、17(麩胺酸)、18(蘇胺酸)、22(麩胺酸)、43(絲胺酸)、45(麩醯胺酸)、70(麩醯胺酸)、72(絲胺酸)、74(離胺酸)、76(天冬醯胺酸)、77(絲胺酸)、80(絲胺酸)、83(纈 胺酸)、84(絲胺酸)、85(異白胺酸)、87(苯基丙胺酸)、100(丙胺酸)、102(丙胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)、109(丙胺酸)被分別置換為絲胺酸、纈胺酸、天冬胺酸、精胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、精胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸而設計成之人型化MAb1之L鏈的可變區域被命名為「MAb1L1」(序列編號103之胺基酸序列：序列編號82；第50圖)。在本發明中亦簡稱為「L1」。
伴隨從列表之序列編號21所示之MAb1之L鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號9(丙胺酸)、15(白胺酸)、17(麩胺酸)、18(蘇胺酸)、22(麩胺酸)、45(麩醯胺酸)、70(麩醯胺酸)、72(絲胺酸)、74(離胺酸)、76(天冬醯胺酸)、77(絲胺酸)、80(絲胺酸)、83(纈胺酸)、84(絲胺酸)、85(異白胺酸)、87(苯基丙胺酸)、100(丙胺酸)、102(丙胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)、109(丙胺酸)被分別置換為絲胺酸、纈胺酸、天冬胺酸、精胺酸、蘇胺酸、離胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、精胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸而設計成之人型化MAb1之L鏈的可變區域被命名為「MAb1L2」(序列編號104之胺基酸序列：序列編號83；第51圖)。在本發明中亦簡稱為「L2」。
伴隨從列表之序列編號21所示之MAb1之L鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號9(丙胺酸)、 15(白胺酸)、17(麩胺酸)、18(蘇胺酸)、22(麩胺酸)、70(麩醯胺酸)、72(絲胺酸)、74(離胺酸)、76(天冬醯胺酸)、77(絲胺酸)、80(絲胺酸)、83(纈胺酸)、84(絲胺酸)、85(異白胺酸)、100(丙胺酸)、102(丙胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)、109(丙胺酸)被分別置換為絲胺酸、纈胺酸、天冬胺酸、精胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、精胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸而設計成之人型化MAb1之L鏈的可變區域被命名為「MAb1L3」(序列編號105之胺基酸序列：序列編號84；第52圖)。在本發明中亦簡稱為「L3」。
伴隨從列表之序列編號21所示之MAb1之L鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號9(丙胺酸)、15(白胺酸)、17(麩胺酸)、18(蘇胺酸)、22(麩胺酸)、70(麩醯胺酸)、72(絲胺酸)、74(離胺酸)、76(天冬醯胺酸)、77(絲胺酸)、80(絲胺酸)、83(纈胺酸)、84(絲胺酸)、85(異白胺酸)、100(丙胺酸)、102(丙胺酸)、106(白胺酸)、109(丙胺酸)被分別置換為絲胺酸、纈胺酸、天冬胺酸、精胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、精胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、蘇胺酸而設計成之人型化MAb1之L鏈的可變區域被命名為「MAb1L4」(序列編號106之胺基酸序列：序列編號85；第53圖)。在本發明中亦簡稱為「L4」。
伴隨從列表之序列編號21所示之MAb1之L鏈的可變區域之N末端算起之胺基酸編號9(丙胺酸)、15(白胺酸)、17(麩胺酸)、18(蘇胺酸)、22(麩胺酸)、45(麩醯胺酸)、70(麩醯胺酸)、72(絲胺酸)、74(離胺酸)、76(天冬醯胺酸)、80(絲胺酸)、83(纈胺酸)、84(絲胺酸)、85(異白胺酸)、87(苯基丙胺酸)、100(丙胺酸)、102(丙胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)、109(丙胺酸)被分別置換為絲胺酸、纈胺酸、天冬胺酸、精胺酸、蘇胺酸、離胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸而設計成之人型化MAb1之L鏈的可變區域被命名為「MAb1L5」(序列編號107之胺基酸序列：序列編號86；第54圖)。在本發明中亦簡稱為「L5」。
b)人型化抗體重鏈表現用載體之構築
化學合成以序列表之序列編號87(第55圖)之鹼基序列所示之編碼人類IgG1之重鏈恆定區域的cDNA，藉由用其做為模板，並使用分別以序列表之序列編號89及90(第56圖及57)的鹼基序列所示之2種引子進行PCR，取得包含小鼠IgM信號序列及人類IgG1基因之重鏈恆定區域的DNA片段(以下稱為「CH片段」)。將所得到之CH片段插在動物細胞用之表現載體的CMV啟動子與胸苷激酶基因之polyA附加信號之間，構築成組入有人型化抗體之重鏈恆定區域的載體pIgG1-CH。
關於人類IgG1基因之重鏈可變區域，藉由化學合成在實施例10a-2中所設計之10個編碼候補序列之胺基酸序列的cDNA(序列表之序列編號91至100；第58至67圖)，或用PCR法導入變異而調製，藉由將所得到之編碼可變區域的cDNA斷片插入在前述之pIgG1-CH之小鼠IgM信號序列與人類IgG1之重鏈恆定區域之間所設計之限制酵素Eco47III識別部位，製成分別表現成為人型化MAb1之候補之重鏈蛋白MAb1H1至H10的載體。將所得到之表現載體分別命名為「pMAb1-H1」、「pMAb1-H2」、「pMAb1-H3」、「pMAb1-H4」、「pMAb1-H5」、「pMAb1-H6」、「pMAb1-H7」、「pMAb1-H8」、「pMAb1-H9」及「pMAb1-H10」。
關於人型化MAb1抗體之重鏈蛋白之表現載體之製作順序，於第37圖中展現其概況。
c)人型化抗體輕鏈表現用載體之構築
藉由化學合成編碼實施例10a-2中所設計之5個候補序列之胺基酸序列的cDNA(序列表之序列編號103至107；分別表示第69至73圖之鹼基序列)，或用PCR法導入變異，而調製成人型化MAb1基因之輕鏈可變區域之DNA斷片。與實施例10b同樣地，藉由在CMV啟動子之控制下，於IgM信號序列與胸苷激酶之基因的polyA附加信號序列之間插入編碼前述輕鏈可變區域之DNA斷片及以序列表之序列編號101(第68圖)的鹼基序列所示之化學合成之人類IgG1之輕鏈恆定區域的cDNA片段(以下稱為「CL片段」)，製成分別表現成為人型化 MAb1候補之輕鏈蛋白MAb1L1至L5的載體。將所得到之表現載體分別命名為「pMAb1-L1」、「pMAb1-L2」、「pMAb1-L3」、「pMAb1-L4」、及「pMAb1-L5」。
d)人型化抗體之調製
為了確認藉由實施例10b及10c中所製作之人型化MAb1之重鏈及輕鏈之表現載體所表現之由重鏈及輕鏈所構成之人型化MAb1的功能，將人型化MAb1之重鏈蛋白及輕鏈蛋白的表現載體各1種以第35圖所示之組合方式混合，並藉由轉染法導入對數增殖期之HEK293細胞，於37℃培養4至5日使其暫時性地表現後，回收培養上清液。將所得到之培養上清液添加於ProteinA親和管柱層析，用PBS洗淨後，以0.1M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.8)將含有抗體之部分溶出。在溶出液中添加為其液量之1/10體積的1M Tris鹽酸緩衝液，使之中和，並以超過濾法置換成PBS或組胺酸緩衝液。
經精製之各個人型化MAb1之精製試料的濃度係使用光度計測定於280nm之吸光度並根據人類IgG抗體之分子吸光係數13.8而算出。
e)人型化抗體對RX蛋白之結合親和性的測定
人型化MAb1與RX蛋白之結合親和性係藉由SPR法測定。亦即，在ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories公司)之GLM感測片上，藉由胺偶合法將蛋白質A與蛋白質G之融合蛋白質ProteinA/G(Thermo Fisher Scientific公司)固定化，繼而添加各個人型化MAb1，使其被固定化之蛋白質A/G捕捉。繼而，添加 RX蛋白質，從結合及解離時所產生之感應圖(sensorgram)的變化，使用解析軟體(ProteOn Manager version 3.0.1)求取結合速度常數、及解離速度常數，並從其比率算出解離常數，亦即結合親和性。將各個人型化MAb1對RX蛋白質之結合親和性示於第36圖。
實施例11. 針對RX蛋白質之ELISA測定法之構築
為了提供簡便測定RX蛋白質的方法，就關於藉由直接吸附法之ELISA測定進行檢討。將實施例2b中精製之RX蛋白質以2倍稀釋成指定的濃度，在高結合型免疫檢定用微培養盤(Coaster公司；型號3590)上固定化，並使用Block Ace(DS Pharmo Biomedical公司)封阻。以含有0.1% Tween20之PBS充分進行洗淨作業後，添加濃度1μg/ml之為檢測用抗體之經生物素標識之MAb2及MAb3。接著，以含有0.1% Tween20之PBS充分進行洗淨作業後，與經HRP標識之鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)作用，進一步以含有0.1% Tween20之PBS充分進行洗淨作業後，使其與顯色基質TMB反應，用0.1N鹽酸停止顯色反應後，測定於波長450nm之吸收。使用實施例2b中精製之RX蛋白質所製作之校正曲線係如第38圖與第39圖所示，在使用MAb2及MAb3時，分別於6.25ng/ml至400ng/ml及6.25ng/ml至200ng/ml之範圍內可得到直線性。
實施例12. 人型化單株抗體在關節炎小鼠模型中之藥效
關於在實施例10d中所記載之人型化MAb1中之5種，為了確認其在關節炎小鼠模型中之藥效，藉由於10L之培養液中暫時性表現來調製各種抗體。關節炎抑制作用係依照在實施例6a及6b中所記載之方法評價。其結果，任一個人型化MAb1投與群，與對照IgG抗體投與群相較，均可見顯著之關節炎的抑制。第74圖顯示致敏後第49日之各群的關節炎分數。有意義差檢定係藉由威爾科克森試驗(Wilcoxon’s-test)法與對照IgG投與群比較而進行(＊：p<0.05；＊＊：p<0.01)。誤差線表示標準誤差(SE)。
實施例13. 單株抗體MAb4之取得及其在關節炎小鼠模型中之藥效
於實施例2c中所記載之MAb2及MAb3之製作時，藉由使用ADSF細胞代替精製蛋白質做為抗原，得到MAb4。根據實施例3之方法，解讀MAb4抗體之重鏈及輕鏈的DNA鹼基序列。將MAb4之重鏈可變區域之DNA鹼基序列示於序列表之序列編號108(第75圖)，將該抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列示於序列表之序列編號109(第76圖)，將MAb4之輕鏈可變區域之DNA鹼基序列示於序列表之序列編號110(第77圖)，將該抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列示於序列表之序列編號111(第78圖)。將MAb4之CDR之胺基酸序列示於第79圖(序列編號112至117)。
藉由實施例4所記載之方法，測定MAb4對RX蛋白質之結合親和性。其結果，MAb4對RX蛋白質之結合親和性為1.4 x10-10M。
MAb4之膠原誘發性關節炎小鼠模型中之關節炎抑制作用係依照實施例6a及6b之方法驗證。其結果，MAb4投與群(黒圓)，相對於對照IgG投與群(白三角)，可見顯著之關節炎的抑制(第80圖)。有意義差檢定係藉由威爾科克森試驗(Wilcoxon’s-test)法，與對照IgG抗體投與群比較而進行(＊：p<0.05)。誤差線表示標準誤差(SE)。
用實施例11所記載之方法來檢討藉由使用MAb4的RX蛋白質之直接吸收法所進行的ELISA測定。其結果，如第81圖所示，在6.25ng/ml至200ng/ml之範圍內得到直線性。
實施例14 MAb1在炎症患部中之細胞激素產生之抑制作用
從實施例12之實驗終了時之各小鼠摘出四肢並凍結，使用Shake Master NEO(Biomedical Science公司)將組織破碎。在每1mg破碎組織中添加5μl之細胞溶解緩衝液(Cell lysis buffer，BioRad公司)並萃取，以於4℃，離心10分鐘3次之上清液做為均質液樣本。將各均質液樣本以PBS稀釋3倍，並使用Bio-plex Pro Cytokine Assay 10 plex(BioRad公司)測定細胞激素‧趨化素之產生量。將IL-6之結果示於第82圖，將MCP-1之結果示於第83圖。其結果，可確認人型化MAb1有意義地抑制炎症性細胞激素或趨化素之產生。有意義差檢定係藉由威爾科克森試驗(Wilcoxon’s-test)法，與對照IgG抗體投與群比較而進行(＊＊：p<0.01，＊：p<0.05 vs對照IgG)。再者，關於對照IgG抗體投與群，顯示相較於無處理(正常)群之有意義差檢定結果(# #：p<0.01 vs正常群)。誤差線表示標準誤差(SE)。
產業上之可利用性
藉由使用本發明所提供之抗體，可進行RA等自體免疫疾病、關節炎等之治療或預防，及RA等之檢査或診斷。
序列表自由正文(free text)
序列編號1：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列1(第5圖)
序列編號2：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列2(第5圖)
序列編號3：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列3(第5圖)
序列編號4：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列4(第5圖)
序列編號5：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列5(第5圖)
序列編號6：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列6(第5圖)
序列編號7：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列7(第5圖)
序列編號8：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列8(第5圖)
序列編號9：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列9(第5圖)
序列編號10：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列10(第5圖)
序列編號11：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列11(第5圖)
序列編號12：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列12(第5圖)
序列編號13：來自ADSF細胞之RX蛋白質的部分胺基酸序列13(第5圖)
序列編號14：編碼來自ADSF細胞之RX蛋白質gp73ED的基因之鹼基序列(第24圖)。即從序列編號60之鹼基序列，削除相當於信號序列部分(序列編號60之核苷酸編號1至294)及3‘-末端之111鹼基(終止密碼子除外：序列編號60之核苷酸編號1954至2064)者。
序列編號15：來自ADSF細胞之RX蛋白質gp73ED之胺基酸序列(第25圖)。從序列編號61之胺基酸序列削除信號序列(序列編號61之胺基酸編號1至98)及C末端之37胺基酸(序列編號61之胺基酸編號652至688)者。
序列編號16：(大鼠)抗體序列解析用引子CH-R1
序列編號17：(大鼠)抗體序列解析用引子CLK-R1
序列編號18：編碼MAb1重鏈之cDNA的鹼基序列(第15圖)
序列編號19：MAb1重鏈之胺基酸序列(第16圖)
序列編號20：編碼MAb1輕鏈之cDNA的鹼基序列(第17圖)
序列編號21：MAb1輕鏈之胺基酸序列(第18圖)
序列編號22：MAb1重鏈CDRH1之胺基酸序列(第23圖)
序列編號23：MAb1重鏈CDRH2之胺基酸序列(第23圖)
序列編號24：MAb1重鏈CDRH3之胺基酸序列(第23圖)
序列編號25：MAb1輕鏈CDRL1之胺基酸序列(第23圖)
序列編號26：MAb1輕鏈CDRL2之胺基酸序列(第23圖)
序列編號27：MAb1輕鏈CDRL3之胺基酸序列(第23圖)
序列編號28：(小鼠)抗體序列解析用引子HF
序列編號29：(小鼠)抗體序列解析用引子HR
序列編號30：(小鼠)抗體序列解析用引子LF
序列編號31：(小鼠)抗體序列解析用引子LR
序列編號32：編碼MAb2重鏈可變區域的cDNA之鹼基序列(第19圖)
序列編號33：MAb2重鏈可變區域之胺基酸序列(第20圖)
序列編號34：編碼MAb2輕鏈可變區域的cDNA之鹼基序列(第21圖)
序列編號35：MAb2輕鏈可變區域之胺基酸序列(第22圖)
序列編號36：MAb2重鏈CDRH1之胺基酸序列(第23圖)
序列編號37：MAb2重鏈CDRH2之胺基酸序列(第23圖)
序列編號38：MAb2重鏈CDRH3之胺基酸序列(第23圖)
序列編號39：MAb2輕鏈CDRL1之胺基酸序列(第23圖)
序列編號40：MAb2輕鏈CDRL2之胺基酸序列(第23圖)
序列編號41：MAb2輕鏈CDRL3之胺基酸序列(第23圖)
序列編號42：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列1(第11圖)
序列編號43：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列2(第11圖)
序列編號44：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列3(第11圖)
序列編號45：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列4(第11圖)
序列編號46：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列5(第11圖)
序列編號47：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列6(第11圖)
序列編號48：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列7(第11圖)
序列編號49：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列8(第11圖)
序列編號50：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列9(第11圖)
序列編號51：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列10(第11圖)
序列編號52：來自RA患者血漿之RX蛋白質的部分胺基酸序列11(第11圖)
序列編號53：RX蛋白質基因之PCR解析用引子1
序列編號54：RX蛋白質基因之PCR解析用引子2
序列編號55：RX蛋白質基因之南方轉漬檢測用探針
序列編號56：來自RA患者之RX蛋白質的部分胺基酸序列1(第12圖之No.1)
序列編號57：來自RA患者之RX蛋白質的部分胺基酸序列2(第12圖之No.2)
序列編號58：來自RA患者之RX蛋白質的部分胺基酸序列3(第12圖之No.3)
序列編號59：來自RA患者之RX蛋白質的部分胺基酸序列4(第12圖之No.4)
序列編號60：編碼包含來自ADSF細胞之信號序列及C末端序列之RX蛋白質前驅體之胺基酸序列的基因之鹼基序列(第28圖)
序列編號61：包含來自ADSF細胞之信號序列及C末端序列之RX蛋白質前驅體之胺基酸序列(第29圖)
序列編號62：編碼MAb3重鏈可變區域的cDNA之鹼基序列(第30圖)
序列編號63：MAb3重鏈可變區域之胺基酸序列(第31圖)
序列編號64：編碼MAb3輕鏈可變區域的cDNA之鹼基序列(第32圖)
序列編號65：MAb3輕鏈可變區域之胺基酸序列(第33圖)
序列編號66：MAb3重鏈CDRH1之胺基酸序列(第23圖)
序列編號67：MAb3重鏈CDRH2之胺基酸序列(第23圖)
序列編號68：MAb3重鏈CDRH3之胺基酸序列(第23圖)
序列編號69：MAb3輕鏈CDRL1之胺基酸序列(第23圖)
序列編號70：MAb3輕鏈CDRL2之胺基酸序列(第23圖)
序列編號71：MAb3輕鏈CDRL3之胺基酸序列(第23圖)
序列編號72：人型化MAb1重鏈H1之可變區域的胺基酸序列(第40圖)
序列編號73：人型化MAb1重鏈H2之可變區域的胺基酸序列(第41圖)
序列編號74：人型化MAb1重鏈H3之可變區域的胺基酸序列(第42圖)
序列編號75：人型化MAb1重鏈H4之可變區域的胺基酸序列(第43圖)
序列編號76：人型化MAb1重鏈H5之可變區域的胺基酸序列(第44圖)
序列編號77：人型化MAb1重鏈H6之可變區域的胺基酸序列(第45圖)
序列編號78：人型化MAb1重鏈H7之可變區域的胺基酸序列(第46圖)
序列編號79：人型化MAb1重鏈H8之可變區域的胺基酸序列(第47圖)
序列編號80：人型化MAb1重鏈H9之可變區域的胺基酸序列(第48圖)
序列編號81：人型化MAb1重鏈H10之可變區域的胺基酸序列(第49圖)
序列編號82：人型化MAb1輕鏈L1之可變區域的胺基酸序列(第50圖)
序列編號83：人型化MAb1輕鏈L2之可變區域的胺基酸序列(第51圖)
序列編號84：人型化MAb1輕鏈L3之可變區域的胺基酸序列(第52圖)
序列編號85：人型化MAb1輕鏈L4之可變區域的胺基酸序列(第53圖)
序列編號86：人型化MAb1輕鏈L5之可變區域的胺基酸序列(第54圖)
序列編號87：編碼人類IgG1之重鏈恆定區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第55圖)
序列編號88：人類IgG1之重鏈恆定區域之胺基酸序列
序列編號89：人類IgG1重鏈恆定區域之增幅用引子F的鹼基序列(第56圖)
序列編號90：人類IgG1重鏈恆定區域之增幅用引子R的鹼基序列(第57圖)
序列編號91：編碼人型化MAb1重鏈H1之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第58圖)
序列編號92：編碼人型化MAb1重鏈H2之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第59圖)
序列編號93：編碼人型化MAb1重鏈H3之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第60圖)
序列編號94：編碼人型化MAb1重鏈H4之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第61圖)
序列編號95：編碼人型化MAb1重鏈H5之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第62圖)
序列編號96：編碼人型化MAb1重鏈H6之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第63圖)
序列編號97：編碼人型化MAb1重鏈H7之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第64圖)
序列編號98：編碼人型化MAb1重鏈H8之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第65圖)
序列編號99：編碼人型化MAb1重鏈H9之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第66圖)
序列編號100：編碼人型化MAb1重鏈H10之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第67圖)
序列編號101：編碼人類IgG1之輕鏈恆定區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第68圖)
序列編號102：人類IgG1之輕鏈恆定區域之胺基酸序列
序列編號103：編碼人型化MAb1輕鏈L1之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第69圖)
序列編號104：編碼人型化MAb1輕鏈L2之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第70圖)
序列編號105：編碼人型化MAb1輕鏈L3之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第71圖)
序列編號106：編碼人型化MAb1輕鏈L4之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第72圖)
序列編號107：編碼人型化MAb1輕鏈L5之可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第73圖)
序列編號108：編碼MAb4重鏈可變區域之胺基酸序列的cDNA之鹼基序列(第75圖)
序列編號109：MAb4重鏈可變區域之胺基酸序列(第76圖)
序列編號110：編碼MAb4輕鏈可變區域之胺基酸序列之cDNA的鹼基序列(第77圖)
序列編號111：MAb4輕鏈可變區域之胺基酸序列(第78圖)
序列編號112：MAb4重鏈CDRH1之胺基酸序列(第79圖)
序列編號113：MAb4重鏈CDRH2之胺基酸序列(第79圖)
序列編號114：MAb4重鏈CDRH3之胺基酸序列(第79圖)
序列編號115：MAb4重鏈CDRL1之胺基酸序列(第79圖)
序列編號116：MAb4重鏈CDRL2之胺基酸序列(第79圖)
序列編號117：MAb4重鏈CDRL3之胺基酸序列(第79圖)
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 新穎抗體及其用途
<130> FP1327
<150> JP2012-112029
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 19
<210> 20
<211> 705
<212> DNA
<213> 大鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(705)
<400> 20
<210> 21
<211> 234
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 21
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 22
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 23
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 24
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 25
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 26
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 27
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> 其他特徵(misc_feature)
<222> (12)..(12)
<223> s為g或c
<220>
<221> 其他特徵
<222> (14)..(14)
<223> r為a或g
<220>
<221> 其他特徵
<222> (17)..(17)
<223> n為a,c,g或t
<220>
<221> 其他特徵
<222> (18)..(18)
<223> m為a或c
<220>
<221> 其他特徵
<222> (24)..(24)
<223> s為g或c
<220>
<221> 其他特徵
<222> (27)..(27)
<223> s為g或c
<400> 28
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> 其他特徵
<222> (10)..(10)
<223> y為c或t
<220>
<221> 其他特徵
<222> (17)..(17)
<223> m為a或c
<220>
<221> 其他特徵
<222> (19)..(19)
<223> s為g或c
<220>
<221> 其他特徵
<222> (22)..(22)
<223> m為a或c
<220>
<221> 其他特徵
<222> (25)..(25)
<223> r為a或g
<220>
<221> 其他特徵
<222> (26)..(26)
<223> w為a或t
<220>
<221> 其他特徵
<222> (29)..(29)
<223> m為a或c
<400> 30
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
<210> 32
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<400> 32
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 33
<210> 34
<211> 342
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(342)
<400> 34
<210> 35
<211> 114
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 35
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 36
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 37
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 38
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 39
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 40
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 41
<210> 42
<211> 25
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 42
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 43
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 44
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 45
<210> 46
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 46
<210> 47
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 47
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 48
<210> 49
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 49
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 50
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X為胺甲醯基甲基半胱胺酸
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X為胺甲醯基甲基半胱胺酸
<400> 51
<210> 52
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X為胺甲醯基甲基半胱胺酸
<400> 52
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
<210> 56
<211> 100
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 56
<210> 57
<211> 100
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 57
<210> 58
<211> 100
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 58
<210> 59
<211> 100
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 採自被驗者
<400> 59
<210> 60
<211> 2067
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 採自細胞株
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2067)
<400> 60
<210> 61
<211> 688
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 合成構築體
<400> 61
<210> 62
<211> 363
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<400> 62
<210> 63
<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 63
<210> 64
<211> 321
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 64
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 65
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 66
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 67
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 68
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 69
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 70
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 71
<210> 72
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 72
<210> 73
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 73
<210> 74
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 74
<210> 75
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 75
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 76
<210> 77
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 77
<210> 78
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 78
<210> 79
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 79
<210> 80
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 80
<210> 81
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 81
<210> 82
<211> 109
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 82
<210> 83
<211> 109
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 83
<210> 84
<211> 109
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 84
<210> 85
<211> 109
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 85
<210> 86
<211> 109
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 86
<210> 87
<211> 993
<212> DNA
<213> 人類(Homo sap iens)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(993)
<400> 87
<210> 88
<211> 330
<212> PRT
<213> 人類
<400> 88
<210> 89
<211> 93
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 89
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 90
<210> 91
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 91
<210> 92
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 92
<210> 93
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 93
<210> 94
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 94
<210> 95
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 95
<210> 96
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 96
<210> 97
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 97
<210> 98
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 98
<210> 99
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 99
<210> 100
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 100
<210> 101
<211> 318
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<400> 101
<210> 102
<211> 105
<212> PRT
<213> 人類
<400> 102
<210> 103
<211> 327
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<400> 103
<210> 104
<211> 327
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<400> 104
<210> 105
<211> 327
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<400> 105
<210> 106
<211> 327
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<400> 106
<210> 107
<211> 327
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<400> 107
<210> 108
<211> 357
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 123
<210> 109
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 124
<210> 110
<211> 324
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<400> 125
<210> 111
<211> 108
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 126
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 127
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 128
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 129
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 130
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 131
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 132

Claims (90)

  1. 一種具有抗關節炎作用之抗體或其功能性斷片，其可識別包含下述(I)至(III)之任一項中所記載之胺基酸序列的多肽：(I)序列表之序列編號15所示之胺基酸序列；(II)具有可使關節炎發病及/或惡化之多肽的胺基酸序列，該胺基酸序列係由與具有互補鹼基序列之核苷酸在嚴苛條件下可雜交之核苷酸所具有之鹼基序列來編碼，其中該互補鹼基序列係與編碼序列表之序列編號15所示之胺基酸序列的鹼基序列互補，以及(III)可使關節炎發病及/或惡化之多肽所具有的胺基酸序列，該胺基酸序列係由在序列表之序列編號15所示之胺基酸序列中置換、刪除、附加或插入1個至數個胺基酸而成。
  2. 如請求項1之抗體或其功能性斷片，其中該多肽在非還原狀態下之SDS-PAGE中之分子量為(I)50至55k、(II)50至55k及25至30k、或(III)70至75k。
  3. 如請求項1或2之抗體或其功能性斷片，其可抑制骨破壞。
  4. 如請求項3之抗體或其功能性斷片，其中該骨破壞係在膠原誘發性關節炎非人類動物模型中之作用。
  5. 如請求項1至4之任一項之抗體或其功能性斷片，其中該抗關節炎作用係在膠原誘發性關節炎非人類動物模型中之作用。
  6. 如請求項1至5之任一項之抗體或其功能性斷片，其中如請求項1之多肽在膠原誘發性關節炎非人類動物模型中會使關節炎惡化。
  7. 如請求項1至6之任一項之抗體或其功能性斷片，其中如請求項1之多肽在膠原誘發性關節炎小鼠模型中可被檢測出。
  8. 如請求項1至7之任一項之抗體或其功能性斷片，其可抑制於炎症患部之細胞激素產生。
  9. 如請求項8之抗體或其功能性斷片，其中該細胞激素為炎症性細胞激素及/或趨化素(chemokine)。
  10. 如請求項8或9之抗體或其功能性斷片，其中該炎症患部為膠原誘發性關節炎非人類動物模型的患部。
  11. 如請求項4至6及10之任一項之抗體或其功能性斷片，其中該非人類動物為小鼠。
  12. 如請求項1至11之任一項之抗體或其功能性斷片，其可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽。
  13. 如請求項1至12之任一項之抗體或其功能性斷片，其係由重鏈及輕鏈構成，該重鏈包含：由序列表之序列編號22所示之胺基酸序列所構成之CDRH1、由序列表之序列編號23所示之胺基酸序列所構成之CDRH2及由序列表之序列編號24所示之胺基酸序列所構成之CDRH3，該輕鏈包含：由序列表之序列編號25所示之胺基酸序列所構成之CDRL1、由序列表之序列編號26所示之胺基酸序列所構成之CDRL2及由序列表之序列編號27所示之胺基酸序列所構成之CDRL3。
  14. 如請求項1至12之任一項之抗體或其功能性斷片，其係由重鏈及輕鏈構成，該重鏈包含：由序列表之序列編號36所示之胺基酸序列所構成之CDRH1、由序列表之序列編號37所示之胺基酸序列所構成之CDRH2及由序列表之序列編號38所示之胺基酸序列所構成之CDRH3，該輕鏈包含：由序列表之序列編號39所示之胺基酸序列所構成之CDRL1、由序列表之序列編號40所示之胺基酸序列所構成之CDRL2及由序列表之序列編號41所示之胺基酸序列所構成之CDRL3。
  15. 如請求項1至12之任一項之抗體或其功能性斷片，其係由重鏈及輕鏈構成，該重鏈包含：由序列表之序列編號66所示之胺基酸序列所構成之CDRH1、由序列表之序列編號67所示之胺基酸序列所構成之CDRH2及由序列表之序列編號68所示之胺基酸序列所構成之CDRH3，該輕鏈包含：由序列表之序列編號69所示之胺基酸序列所構成之CDRL1、由序列表之序列編號70所示之胺基酸序列所構成之CDRL2及由序列表之序列編號71所示之胺基酸序列所構成之CDRL3。
  16. 如請求項1至12之任一項之抗體或其功能性斷片，其係由重鏈及輕鏈構成，該重鏈包含：由序列表之序列編號112所示之胺基酸序列所構成之CDRH1、由序列表之序列編號113所示之胺基酸序列所構成之CDRH2及由序列表之序列編號114所示之胺基酸序列所構成之CDRH3，及該輕鏈包含：由序列表之序列編號115所示之胺基酸序列所構成之CDRL1、由序列表 之序列編號116所示之胺基酸序列所構成之CDRL2及由序列表之序列編號117所示之胺基酸序列所構成之CDRL3。
  17. 如請求項1至12之任一項之抗體或其功能性斷片，其包含重鏈及輕鏈且可識別如請求項1之多肽，該重鏈及輕鏈包含與如請求項13至16之任一項之抗體的重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別具95%以上相同性的胺基酸序列。
  18. 如請求項1至12之任一項之抗體或其功能性斷片，其係結合在如請求項13至16之任一項之抗體或其功能性斷片所識別之抗原上之部位。
  19. 如請求項1至12之任一項之抗體或其功能性斷片，其與如請求項13至16之任一項之抗體或其功能性斷片競爭和如請求項1之多肽之結合。
  20. 如請求項1至19之任一項之抗體或其功能性斷片，其中該抗體為嵌合抗體。
  21. 如請求項1至19之任一項之抗體或其功能性斷片，其中該抗體為人型化抗體(humanizedantibody)。
  22. 如請求項1至19之任一項之抗體或其功能性斷片，其中該抗體為人類抗體。
  23. 一種核苷酸，其係在下述(I)至(III)之任一項中所記載之核苷酸：(I)包含編碼如請求項1至22之任一項之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸； (II)由包含編碼如請求項1至22之任一項之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列的鹼基序列所構成的核苷酸；及(III)由編碼如請求項1至22之任一項之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列所構成的核苷酸。
  24. 一種重組載體，其中插入有如請求項23之核苷酸。
  25. 一種重組細胞，其中導入有如請求項23之核苷酸或如請求項24之重組載體。
  26. 一種細胞，其產生如請求項1至22之任一項之抗體。
  27. 一種如請求項1至22之任一項之抗體或其功能性斷片之製造方法，其包含下述之步驟(I)及(II)：(I)培養如請求項25或26之細胞的步驟；及(II)從前述步驟(I)所得到之培養物回收如請求項1至22之任一項之抗體或其功能性斷片的步驟。
  28. 如請求項1至22之任一項之抗體或其功能性斷片，其係藉由如請求項27之方法而得到。
  29. 一種如請求項1至22及28之任一項之抗體或其功能性斷片的修飾體。
  30. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至22及28之任一項之抗體或其功能性斷片、或者如請求項29之修飾體，做為有效成分。
  31. 如請求項30之醫藥組成物，其為表現如請求項1之多肽之個體之自體免疫疾病的治療藥或預防藥。
  32. 如請求項31之醫藥組成物，其中該自體免疫疾病係類風濕性關節炎。
  33. 如請求項30之醫藥組成物，其為表現如請求項1之多肽之個體之關節炎的治療藥或預防藥。
  34. 一種類風濕性關節炎之檢査或診斷用組成物，其包含如請求項1至22及28之任一項之抗體或其功能性斷片、或如請求項29項之修飾體。
  35. 如請求項13之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含在序列表之序列編號72至81(第40至49圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含在序列表之序列編號82至86(第50至54圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽。
  36. 如請求項13之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係在序列表之序列編號72至81(第40至49圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係在序列表之序列編號82至86(第50至54圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽。
  37. 如請求項13之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係以由序列表之序列編號19(第16圖)之胺基酸編號20至138所構成之胺基酸序列來表示，且輕鏈可變區域係以由序列表之序列編號21(第18圖)之胺基酸編號21至128所構成之胺基酸序列來表示。
  38. 如請求項35之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含選自序列表之序列編號72至74、76、及79至81(第40至42、44及47至49圖)所構成之族群中 之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號82(第50圖)之胺基酸序列所示之肽。
  39. 如請求項36之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係選自序列表之序列編號72至74、76及79至81(第40至42、44及47至49圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係以序列表之序列編號82(第50圖)之胺基酸序列所示之肽。
  40. 如請求項35之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含選自序列表之序列編號72至74及76至78(第40至42及44至46圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號83(第51圖)之胺基酸序列所示之肽。
  41. 如請求項36之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係選自序列表之序列編號72至74及76至78(第40至42及44至46圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係在序列表之序列編號83(第51圖)中記載之胺基酸序列所示之肽。
  42. 如請求項35之抗體或其功能性斷片，重鏈可變區域包含在序列表之序列編號72至74(第40至42圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號84(第52圖)之胺基酸序列所示之肽。
  43. 如請求項36之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係在序列表之序列編號72至74(第40至42圖)之任一項中記載之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區 域係序列表之序列編號84(第52圖)之胺基酸序列所示之肽。
  44. 如請求項35之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含序列表之序列編號75(第43圖)之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號85(第53圖)之胺基酸序列所示之肽。
  45. 如請求項36之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係序列表之序列編號75(第43圖)之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係序列表之序列編號85(第53圖)之胺基酸序列所示之肽。
  46. 如請求項35之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域包含選自序列表之序列編號73、74、76及77(第41、42、44及45圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域包含序列表之序列編號86(第54圖)之胺基酸序列所示之肽。
  47. 如請求項36之抗體或其功能性斷片，其中重鏈可變區域係選自序列表之序列編號73、74、76及77(第41、42、44及45圖)所構成之族群中之胺基酸序列所示之肽，且輕鏈可變區域係序列表之序列編號86(第54圖)之胺基酸序列所示之肽。
  48. 一種抗體或其功能性斷片，其中該抗體係選自下述(i)至(xxi)：(i)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T13)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號76(第44圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域， 該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(ii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T14)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號76(第44圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(iii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T15)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號76(第44圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(iv)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T8)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(v)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T9)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之 胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(vi)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T10)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號84(第52圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(vii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T11)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號74(第42圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(viii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T18)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號78(第46圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(ix)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T12)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號75(第43圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號85(第53圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域； (x)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T1)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號72(第40圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xi)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T2)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號72(第40圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T3)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號72(第40圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號84(第52圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xiii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T4)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域； (xiv)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T5)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xv)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T6)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號84(第52圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xvi)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T7)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號73(第41圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xvii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T16)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號77(第45圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號83(第51圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域； (xviii)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T17)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號77(第45圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號86(第54圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xix)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T19)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號79(第47圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xx)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T20)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號80(第48圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域；(xxi)由重鏈及輕鏈所構成之抗體(T21)，其中該重鏈具有：由序列表之序列編號81(第49圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域，該輕鏈具有：由序列表之序列編號82(第50圖)所示之胺基酸序列所構成之可變區域及來自人類IgG1之恆定區域。
  49. 如請求項1至22及28之任一項之抗體或其功能性斷片，其包含重鏈及輕鏈且可識別如請求項1之多肽，該重鏈及輕鏈包含與如請求項35至48之任一項之抗體的重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別具95%以上相同性的胺基酸序列。
  50. 如請求項1至22及28之任一項之抗體或其功能性斷片，其係結合在如請求項35至48之任一項之抗體所識別之抗原上之部位。
  51. 如請求項1至22及28之任一項之抗體或其功能性斷片，其與如請求項35至48之任一項之抗體或其功能性斷片競爭和如請求項1之多肽之結合。
  52. 一種核苷酸，其係在下述(I)至(III)之任一項中所記載之核苷酸：(I)包含編碼如請求項35至51之任一項之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸；(II)由包含編碼如請求項35至51之任一項之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列的鹼基序列所構成的核苷酸；及(III)由編碼如請求項35至51之任一項之抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部胺基酸序列之鹼基序列所構成的核苷酸。
  53. 如請求項52之核苷酸，其中編碼如請求項35至51之任一項之抗體之重鏈之一部分或全部胺基酸序列的鹼基序列係由序列表之序列編號91至100(第58至67 圖)之任一項所表示的鹼基序列，且編碼如請求項35至51之任一項之抗體之輕鏈之一部分或全部胺基酸序列的鹼基序列係由序列表之序列編號103至107(第69至73圖)之任一項所表示的鹼基序列。
  54. 一種重組載體，其中插入有如請求項52或53之核苷酸。
  55. 一種重組細胞，其中導入有如請求項52或53之核苷酸或如請求項54之重組載體。
  56. 一種細胞，其產生如請求項35至51之任一項之抗體。
  57. 一種如請求項35至51之任一項之抗體或其功能性斷片之製造方法，其包含下述之步驟(I)及(II)：(I)培養如請求項55或56之細胞的步驟；及(II)從前述步驟(I)所得到之培養物回收如請求項35至51之任一項之抗體或其功能性斷片的步驟。
  58. 如請求項35至51之任一項之抗體或其功能性斷片，其係藉由如請求項57之方法而得到。
  59. 一種如請求項35至51及58之任一項之抗體或其功能性斷片的修飾體。
  60. 一種醫藥組成物，其包含如請求項35至51及58之任一項之抗體或其功能性斷片、或者如請求項59之修飾體，做為有效成分。
  61. 如請求項60之醫藥組成物，其係表現如請求項1之多肽之個體之自體免疫疾病的治療藥或預防藥。
  62. 如請求項61之醫藥組成物，其中該自體免疫疾病係類風濕性關節炎。
  63. 如請求項60之醫藥組成物，其係表現如請求項1之多肽之個體之關節炎的治療藥或預防藥。
  64. 一種如請求項1之多肽之檢測方法，其包含使可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體與受驗樣本接觸的步驟。
  65. 如請求項64之檢測方法，其中該受驗樣本係來自受驗者的樣本。
  66. 如請求項65之檢測方法，其中該來自受驗者之樣本係血漿。
  67. 一種RX蛋白質之定量方法，其包含使可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體與受驗樣本接觸的步驟。
  68. 如請求項67之定量方法，其中該受驗樣本係來自受驗者之樣本。
  69. 如請求項68之定量方法，其中該來自受驗者之樣本係血漿。
  70. 如請求項64至69之任一項之方法，其中使用一種可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體。
  71. 如請求項64至69之任一項之方法，其中使用二種以上之可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體。
  72. 如請求項71之方法，其中使用三明治式ELISA(sandwichELISA)。
  73. 一種類風濕性關節炎之檢査方法，其包含使可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體與受驗樣本接觸的步驟。
  74. 如請求項73之檢査方法，其中該受驗樣本係來自受驗者之樣本。
  75. 如請求項74之檢査方法，其中該來自受驗者之樣本係血漿。
  76. 一種類風濕性關節炎之診斷方法，其包含下述之步驟(I)至(III)：(I)使可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體與來自受驗者之血漿接觸的步驟；(II)測定來自受驗者之血漿中之如請求項1之多肽之量的步驟；及(III)在來自受驗者之血漿中之步驟(II)之多肽之量比來自健康者之血漿中之步驟(II)之多肽之量多的情況，判定該受驗者罹患類風濕性關節炎或罹患該病之風險高的步驟。
  77. 一種多肽之測定用或診斷用組成物，其包含可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體。
  78. 如請求項77之組成物，其係用於類風濕性關節炎之診斷。
  79. 如請求項77或78之組成物，其包含一種可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體。
  80. 如請求項77或78之組成物，其包含二種以上之可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體。
  81. 如請求項80之組成物，其係用於三明治式ELISA法。
  82. 一種檢査用或診斷用之試藥或套組，其包含可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體。
  83. 如請求項82之試藥或套組，其係用於自體免疫疾病之檢査或診斷。
  84. 如請求項83之試藥或套組，其中該自體免疫疾病係類風濕性關節炎。
  85. 如請求項82至84之任一項之試藥或套組，其包含一種可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體。
  86. 如請求項82至84之任一項之試藥或套組，其包含二種以上之可識別包含序列表之序列編號15所示之胺基酸序列之多肽的抗體或其功能性斷片或其修飾體。
  87. 如請求項82至86之任一項之試藥或套組，其包含如請求項1之多肽或其斷片或其修飾體。
  88. 如請求項13之抗體或其功能性斷片，其中該抗體係大鼠抗體。
  89. 如請求項14至16之任一項之抗體或其功能性斷片，其中該抗體係小鼠抗體。
  90. 如請求項30至33及60至63之任一項之醫藥組成物，其係與另外的治療劑或預防劑組合使用。
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