TW201422246A

TW201422246A - 藉由調節ｗｉｐｉ－１改善皮膚老化外觀之方法

Info

Publication number: TW201422246A
Application number: TW102136614A
Authority: TW
Inventors: Permanan Raaj Khusial; Uma Santhanam; John W Lyga
Original assignee: Avon Prod Inc
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2013-10-09
Publication date: 2014-06-16
Also published as: US20140161916A1; BR112015008324A2; US9675543B2; CN104736204A; US9238000B2; EP2931383A4; EP2931383A1; CA2886506A1; US20150190339A1; WO2014092859A1; HK1209074A1; US20160089327A1

Abstract

本發明係關於使用WIPI-1來賦予皮膚抗老化益處及/或改善因自噬活性降低引起之皮膚狀況之方法。

Description

藉由調節WIPI-1改善皮膚老化外觀之方法

本發明概言之係關於局部施用至皮膚之包含至少一種WIPI-1激動劑之組合物及該等組合物對皮膚提供益處之用途，具體而言，改善皮膚細胞內之自噬活性且在又一實施例中改善實足年齡性老化或光老化皮膚之狀況及外觀。

消費者對處理、減緩或延遲老化或衰老皮膚之跡象之化妝品之興趣日益增加。在老化過程期間，皮膚情況(即，皮膚之顏色及外觀)因老化及/或暴露於日光而逐漸惡化。實足年齡性老化、荷爾蒙性老化或光老化皮膚之皮膚病學跡象自身表現為細紋及皺紋、下垂、暗沉、變色、不均勻色調及/或粗糙紋理。此外，老化皮膚缺乏強度及彈性且因此脆弱。化妝品工業一直積極地尋求可用於減少老化或衰老皮膚之跡象且藉此提供抗皺、復原及皮膚著色益處之產品(抗老化化合物)。

自噬係幫助保持蛋白質之合成與降解之間之明確平衡及細胞產物之後續再循環的分解代謝過程。自噬係用於使細胞組份及胞器再循環及解毒之機制，即，其除去龐大細胞組份，例如受損傷胞器(例如粒線體)及蛋白質聚集體。具體而言，自噬能夠調控、修復並消除皮膚細胞(例如，纖維母細胞、黑色素細胞及/或角質細胞)中具有長使用期限之蛋白質，由此確保在人類皮膚之分化及老化期間之控制。

在細胞平面上，自噬機制包含4個階段：(1)啟動；(2)形成初始液泡(「自噬體」)，從而隔離細胞質物質；(3)自噬體成熟，變成降解性液泡；及(4)與溶酶體融合直至達成經隔離物質之降解。若此過程破壞或減慢，則受損傷胞器及蛋白質將在細胞內累積，從而干擾正常細胞功能、尤其蛋白質合成，且最終干擾細胞活力。

WIPI-1(Atg-18)係WD40重複蛋白之成員且具有7葉片螺旋槳結構，此允許可逆之蛋白-蛋白相互作用。WIPI-1亦含有與磷脂相互作用之保守基序。該等結構特徵使得WIPI-1係自噬體液泡之一部分之良好候選者，且最近的研究已證實其參與人類細胞之自噬。Autophagy 7：3,279-296；2011年3月；© 2011 Landes Bioscience及Anne Simonsen及Sharon A.Tooze，「Coordination of membrane events during autophagy by multiple class III PI3-kinase complexes」J.Cell Biol.，第186卷，第6期，773-782。已證實內源性WIPI-1蛋白與自吞噬標記物LC3共同位於人類細胞中之點狀細胞質結構以引發液泡之形成。Proikas-Cezanne等人，Human WIPI-1 puncta-formation：A novel assay to assess mammalian autophagy,FEBS Letters 581(2007)3396-3404。

標題為Cosmetic Use of Skin Cell Autophagy Activators之美國專利申請案第20120225092號論述藉助上調ATG5-12及MAP-LC3蛋白質複合物增加皮膚細胞內之自噬之各種化合物之用途。此外，Hu等人，WIPI1 Coordinates Melanogenic Gene Transcription and Melanosome Formation Via TORC1 Inhibition,Journal of Biological Chemistry，第286卷第14期，第12509頁至第12523(2011)頁揭示WIPI1對調控黑素體形成之影響。

因此，業內仍需要減少與皮膚細胞內之自噬活性降低相關之皮膚老化之表現之化妝品組合物。因此，本發明之一目的係提供用於增加、保持及/或恢復皮膚細胞內之自噬活性程度之新組合物及方法。本發明之又一目的係藉由上調皮膚細胞內之WIPI-1改善皮膚之整體外觀，包括處理、逆轉及/或預防皮膚老化之跡象或損傷，例如皺紋、細紋、變色、色調損失、彈性損失、變薄等。

以上論述僅為該技術所面臨問題之本質提供更佳之理解且不應以任何方式理解為對先前技術之認同，亦不應將本文任何參考文獻之引用理解為認同該參考文獻構成本發明之「先前技術」。

本發明係關於改善受實足年齡性老化或光老化影響之皮膚之外觀之方法，其係藉由以下方式達成：對該皮膚局部施用有效量之存於化妝品可接受之媒劑中之至少一種WIPI-1激動劑足以達成該皮膚之自噬活性之改善之時間。

自噬活性隨著因內在因素或光老化(UV暴露)影響所致之細胞老化而減慢。光老化亦會損害WIPI-1表現。所產生之自噬活性損害導致受損傷細胞組份在細胞中累積，進而產生不合適細胞功能(包括蛋白質合成)。皮膚細胞自噬活性之此損害可轉變為皮膚細胞內之老化之表現加劇，例如形態學變化增加及皮膚纖維母細胞內之細胞體塌陷；由黑色素細胞產生之黑色素減少及/或不一致；週轉期增加及/或表皮內之角質細胞之結構完整性降低。令人遺憾的是，對皮膚細胞之該等影響加劇細紋、皺紋及/或變色之外觀、並且損害皮膚之結構完整性，即，皮膚無彈性、薄且可滲透。

在一實施例中，本發明涵蓋改善受由皮膚細胞內之自噬活性降低引起之老化影響之皮膚之美學外觀之方法，其包含對該皮膚局部施用有效量之存於化妝品上可接受之媒劑中之至少一種WIPI-1激動劑達足以達成該皮膚之外觀改善之時間。

在另一實施例中，本發明涵蓋其中老化可能因實足年齡性、荷爾蒙性或環境影響所致之方法。

在本發明之又一方法中，美學外觀之改善係選自：(a)處理、減少及/或預防細紋或皺紋；(b)減小皮膚毛孔大小；(c)改善皮膚厚度、飽滿度及/或緊致度；(d)改善皮膚柔順度及/或柔軟度；(e)改善皮膚色調、光彩(radiance)及/或透明度；(f)改善原膠原及/或膠原產生；(g)改善彈性蛋白之保持及重塑；(h)改善皮膚紋理及/或促進再組織化(re-texturization)；(i)改善皮膚屏障修復及/或功能；(j)改善皮膚輪廓之外觀；(k)恢復皮膚光澤及/或亮度；(l)補充皮膚中必需之營養素及/或成份；(m)改善因老化及/或停經而變差之皮膚外觀；(n)改善皮膚保濕度及/或含水量；(o)增加皮膚彈性及/或彈力及/或預防損失皮膚彈性及/或彈力；(p)處理、減少及/或預防皮膚下垂；(q)處理、減少及/或預防皮膚變色；及其任一組合。

在又一實施例中，美學外觀之改善可為使皮膚解毒。

在另一實施例中，本發明涵蓋其中皮膚係敏感性皮膚之方法。

在另一實施例中，本發明涵蓋其中組合物係每日至少1次局部施用達至少1週之方法。

在本發明方法之另一實施例中，WIPI-1激動劑以該組合物之總重量計可以約0.0001重量%至約90重量%之量存在。在又一實施例中，WIPI-1激動劑係以該組合物之總重量之約0.01重量%至約10重量%之量存在。

在另一實施例中，本發明涵蓋其中WIPI-1激動劑可為下列之方法：(a)；(b)猴耳環(Archidendron clypearia)提取物；(c)仙丹花(Ixora chinensis)提取物；(d)杜莖山(Maesa japonica)提取物；(e)六月雪(Serissa japonica)提取物；(f)非洲茉莉(Stephanotis jasminoides)提取物；(g)亞襄(Tiliacora triandra)提取物；或其任何組合。

在又一實施例中，WIPI-1激動劑不為亞襄、仙丹花或猴耳環之提取物。

在另一實施例中，本發明涵蓋其中皮膚改善係因皮膚細胞內之自噬活性增加所致之方法。在又一實施例中，皮膚細胞內之自噬活性增加為約20%。

在另一實施例中，本發明涵蓋其中皮膚細胞包含纖維母細胞或角質細胞之方法。

在另一實施例中，本發明涵蓋其中WIPI-1激動劑係與類視色素組合使用之方法。

在另一實施例中，本發明涵蓋用於改善其組成皮膚細胞內之自噬活性降低之皮膚之外觀之方法，其係藉由以下方式達成：對該皮膚局部施用有效量之存於化妝品上可接受之媒劑中之至少一種WIPI-1激動劑達足以調節WIPI-1介導之自噬活性之時間。在又一實施例中，組成皮膚細胞包含纖維母細胞或角質細胞。

在另一實施例中，本發明涵蓋其中WIPI-1激動劑可為下列之方法：(a)；(b)猴耳環提取物；(c)仙丹花提取物；(d)杜莖山提取物；(e)六月雪提取物；(f)非洲茉莉提取物；(g)亞襄提取物；或其任何組合。

在又一實施例中，WIPI-1激動劑係以該組合物之總重量之約0.01重量%至約10重量%之量存在。

在另一實施例中，本發明涵蓋篩選可用於改善皮膚之美學外觀之活性劑之方法，其包含分析候選物質上調WIPI-1表現之能力。

在另一實施例中，本發明涵蓋處理皮膚之方法，其包含對該有需要的皮膚區域局部施用有效量之上調WIPI-1之活性劑，其中已藉由量測已與該活性劑接觸之細胞中編碼WIPI-1之mRNA之含量之分析來測定該活性劑上調WIPI-1之能力。

參照以下詳細說明及附圖，將更佳地理解本發明之該等及其他態樣。

圖1係猴耳環提取物之HPLC曲線。

圖2係亞襄提取物之HPLC曲線。

圖3係仙丹花提取物之HPLC曲線。

圖4係六月雪提取物之HPLC曲線。

圖5係杜莖山提取物之HPLC曲線。

圖6係非洲茉莉提取物之HPLC曲線。

本文揭示本發明之詳細實施例；然而，應理解，所揭示實施例僅說明本發明且可以多種形式實施。另外，結合本發明之各實施例所給出之每一實例皆意欲為說明性而非限制性。此外，圖式不必按比例，且可放大一些特徵以顯示一實施例組份之細節。另外，圖中所顯示之任何量測、說明及諸如此類均意欲為說明性而非限制性。因此，本文所揭示之特定結構及功能細節不應理解為限制性，而僅應理解為用於教示熟習此項技術者以不同方式採用本發明之代表性基礎。

本發明提供藉助向有需要的皮膚投與WIPI-1激動劑來處理、預防及/或對抗皮膚老化或損傷之各種表現之新且新穎之方法。具體而言，WIPI-1激動劑設法藉由上調WIPI-1且藉此調節(即增加、保持或恢復)目標皮膚細胞內之WIPI-1介導之自噬活性來處理、預防或對抗皮膚老化之表現(例如細紋、皺紋、變色等)。目標皮膚細胞可包括纖維母細胞、角質細胞及/或黑色素細胞，且在某些實施例中係纖維母細胞及/或角質細胞。皮膚損傷或老化之表現可能因皮膚以及組成皮膚細胞、以及環境組織、營養組織或遺傳組織之實足年齡性老化、荷爾蒙性老化、光老化或光化性老化所致。另外，WIPI-1激動劑設法藉由增加、保持及/或恢復WIPI-1介導之自噬活性來處理、預防或對抗皮膚老化或損傷之表現(例如細紋、皺紋、變色、皮膚變薄、皮膚屏障之損害)。

本發明提供包含有效量之WIPI-1激動劑之局部施用組合物來處理、逆轉、改良及/或預防皮膚損傷或皮膚老化之跡象/表現。該等益處包括(不限於)以下： (a)處理、減少及/或預防細紋或皺紋；(b)減小皮膚毛孔大小；(c)改善皮膚厚度、飽滿度及/或緊致度；(d)改善皮膚柔順度及/或柔軟度；(e)改善皮膚色調、光彩及/或透明度；(f)改善原膠原及/或膠原產生；(g)改善彈性蛋白之保持及重塑；(h)改善皮膚紋理及/或促進再組織化；(i)改善皮膚屏障修復及/或功能；(j)改善皮膚輪廓之外觀；(k)恢復皮膚光澤及/或亮度；(l)補充皮膚中必需之營養素及/或成份；(m)改善因老化及/或停經而變差之皮膚外觀；(n)改善皮膚保濕度及/或含水量；(o)增加皮膚彈性及/或彈力及/或預防損失皮膚彈性及/或彈力；(p)處理、減少及/或預防皮膚下垂；及/或(q)處理、減少及/或預防皮膚變色。

在實際中，本發明之組合物係施用至需要處理之皮膚。即，遭受上述屬性中之任一者之缺失或損失或將以其他方式受益於上述皮膚屬性中之任一者之改善之皮膚。

在一實施例中，該組合物意欲用作非治療性處理。在另一實施例中，根據美國食品、藥物及化妝品法案(US FD&C Act)第201(i)章，該組合物係意欲經擦拭、傾倒、噴灑或噴霧、引入或以其他方式施用至人體用以清潔、美化、促進吸引力或改變外觀之物件。

除非另有規定，否則本文使用之所有術語均意欲具有其普通含義。

本文所用術語「基本上由...組成」意欲將本發明限於指定材料或步驟及彼等不會顯著影響所主張發明之基本及新穎特性者，如自閱讀本說明書所理解。除非另有說明，否則所有百分比均係以基於該組合物之總重量之重量計。

「化妝品上可接受」意指通常將具體組份視為在所用量下安全且無毒。

術語「活性量」係指不存在稀釋劑、溶劑、載劑、填充劑或任一其他成分時WIPI-1激動劑之量。「有效對皮膚提供具體抗老化益處之量」或「對皮膚提供具體抗老化益處之有效量」係指當施用足以提供臨床上可測量之老化皮膚之具體表現之改善之時間時提供臨床上可測量之皮膚老化之具體表現之改善所需WIPI-1激動劑之「活性量」。

片語「有需要的個體」係指可受益於改善之皮膚外觀或健康之人類，包括男性或女性。

本文所用術語「預防(prevent、preventing等)」意指延遲各種化妝品性或皮膚病性狀況、損傷、影響或症狀之開始、妨礙其發展、妨礙其顯現、保護免受其干擾、抑制或消除其出現或減少其發生率。術語「預防」之使用並非意欲暗示投與化妝品組合物之受試者群體中之所有受試者將一直不受化妝品性或皮膚病性狀況、損傷、影響或症狀影響或不會發生該等情況，而是受試者群體將展示化妝品性或皮膚病性損傷、影響或症狀之減少。舉例而言，許多流感疫苗並非在彼等投與該疫苗者中100%有效預防流感。

術語「激動劑」涵蓋任一物質，包括(但不限於)有機分子；化學組合物；生物分子(例如肽、蛋白質、抗體、核酸寡聚物等)；及物質組合，例如植物提取物。激動劑上調WIPI-1之細胞含量意指藉由活性劑來增加WIPI-1之細胞含量。術語「上調」可指誘導、刺激、加強及/或緩解抑制。激動劑可不限於活化劑，其係(例如)結合、刺激、增加、開放、活化、促進WIPI-1、增強其活化、使其敏化或上調其表現程度之化合物。調節WIPI-1含量之機制為上調並不重要。在一些實施例中，與在不存在WIPI-1激動劑時WIPI-1基因表現程度相比，WIPI-1基因表現增加至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%或至少約80%。下文實例3說明用於評價WIPI-1表現增加之方法。

本文所用術語「調節自噬活性」係指增加、保持、恢復、復原或增強皮膚細胞內之WIPI-1介導之自噬活性程度。在本發明之一實施例中，增加可包括相對於投與WIPI-1激動劑前的自噬活性，皮膚細胞內之自噬活性增加約10%、自噬活性增加約20%、自噬活性增加約30%、自噬活性增加約40%、自噬活性增加約50%及自噬活性增加大於約50%。在本發明之又一實施例中，舉例而言，在損傷(即暴露於UV輻射)前可預防性地投與WIPI-1激動劑以保持皮膚細胞中之自噬活性程度。在又一實施例中，皮膚細胞中之自噬活性可恢復至先前(即損傷前)存於皮膚細胞內之程度。在另一實施例中，自噬活性可復原及/或增強，即增加至比彼等經處理細胞及或個體更年輕之皮膚細胞內或更年輕個體之典型活性程度。測定該等活性程度之方式詳述於下文實例1中。

本文所用術語「表現程度」係指在細胞中表現之基因及/或蛋白質之量。本文所用「基因」包括含有至少一個能夠編碼具體多肽之開放閱讀框的多核苷酸。本文所用術語「多核苷酸」與「寡核苷酸」同義且包括任一長度之核苷酸之聚合形式，去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物，包括(但不限於)mRNA、DNA、cDNA、引子、探針及諸如此類。

本文所用術語「精油」係指藉由物理分離方法(例如蒸餾或層析分離)自植物或植物部分獲得之揮發性含醚餾分。精油通常係通常包含單萜之類萜且具有提取其之植物之氣味及香味。

本文所用術語「皮膚」包括面部、口腔、頸部、胸部、背部、臂部、手部、腿部及頭皮上或其中之皮膚。

本文所用「處理」以及相關術語(例如「處理(treat或treating)」)係指根除、減少、改良或逆轉一或多個與待處理皮膚狀況相關之不期望特徵，以便消費者察覺皮膚外觀之改善或其他關於該狀況之處理益處。處理衰老或老化皮膚係指根除、減少、改良或逆轉與老化相關之不期望特徵中之一或多者。處理益處包括(例如)調節WIPI-1介導之自噬活性；減少細紋或皺紋；減少皮膚毛孔大小；改善皮膚厚度、飽滿度及/或緊致度；改善皮膚柔順度及/或柔軟度；改善皮膚色調、光彩及/或透明度；改善原膠原及/或膠原產生；改善彈性蛋白之保持及重塑；改善皮膚紋理及/或促進再組織化；改善皮膚屏障修復及/或功能；改善皮膚輪廓之外觀；恢復皮膚光澤及/或亮度；補充皮膚中必需之營養素及/或成份；改善因老化及/或停經變差之皮膚外觀；改善皮膚保濕度及/或含水量；增加皮膚彈性及/或彈力；減少皮膚下垂；及/或減少皮膚變色。

在一實施例中，本發明涵蓋用於識別潛在WIPI-1激動劑之篩選方法。在一實施例中，提供用於測定在細胞經候選物質處理、與其一起培育或以其他方式與其接觸後WIPI-1之表現程度的分析。術語「候選物質」係指任一作為WIPI-1激動劑經測試活性之物質，不論該物質是否疑似具有該活性。該細胞可為任一表現WIPI-1之皮膚細胞，且在一實施例中該等細胞可為纖維母細胞、角質細胞或黑色素細胞，且在某些實施例中，該等細胞可為纖維母細胞或角質細胞。在其他實施例中，細胞係人類或小鼠細胞。在細胞與候選物質一起培育達足以提供可量測之表現程度變化之時間長度(其通常應為至少1小時，且更通常為約24小時至約144小時(1至6天))後，然後使細胞溶解以釋放細胞組份(例如WIPI-1及編碼WIPI-1之mRNA)。然後可藉由任一適於檢測並定量肽及蛋白質及/或多核苷酸(例如，mRNA)之技術量測WIPI-1蛋白質或其任一亞單位之量。

在一實施例中，用於量測WIPI-1表現程度之方法包括定量mRNA表現。適於測定mRNA表現之方法包括定量PCR(QPCR)、實時QPCR、逆轉錄PCR(RT-PCR)及定量逆轉錄PCR(QRT-PCR)，如已為業內所熟知。如美國專利第7,101,663號及第7,662,561號中所詳述，用於檢測mRNA之定量逆轉錄聚合酶鏈反應(QRT-PCR)可包括以下步驟：(a)將來自細胞溶胞物之RNA試樣與逆轉錄酶及高濃度靶標序列特異性逆轉錄酶引子在適於產生cDNA之條件下一起培育；(b)隨後向逆轉錄酶反應中添加適宜聚合酶鏈反應(PCR)試劑，包括高濃度對cDNA具有特異性之PCR引子組及對逆轉錄酶反應熱穩定之DNA聚合酶；及(c)在適於產生對cDNA具有特異性之PCR產物(「擴增子」)之條件下使PCR反應循環期望循環數量。可在固定數量之PCR循環後比較QRT-PCR方法之產物，以藉由(例如)南方墨點法(Southern blotting)測定RNA物質與給定報告基因相比之相對量。更通常地，藉由分析每一PCR引子組之擴增子產生之相對速率、例如藉由以下來監測PCR反應過程：(1)插入任何雙鏈DNA之非特異性螢光染料，及/或(2)由經螢光報告基因標記之寡核苷酸組成的序列特異性DNA探針，該螢光報告基因僅容許在探針與其互補DNA靶標雜交後檢測。mRNA可為任一業內一般技術人員已知與WIPI-1相關之mRNA。

另外，下文實例3提供另一用於測定細胞經候選物質處理、與候選物質一起培育或以其他方式與候選物質接觸後WIPI-1之表現程度之方法。

可將上文所揭示測定WIPI-1表現程度之方法中之表現程度與未經候選物質處理之對照進行比較以確定相對調節程度。在一些實施例中，候選物質將mRNA表現上調至少約10%、更適宜地至少約20%、至少約30%、至少約40%或至少約50%。在其他實施例中，候選物質將mRNA表現上調至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。可選擇滿足該等準則之候選物質用於使用或用於進一步評價。

如下文實例4所顯示根據上文所說明程序識別之WIPI-1激動劑可包括天然存在之肽或合成肽、胺基酸及化學實體，例如(但不限於)經取代胺基雜環胺甲醯基類似物，如(例如)美國專利申請案第13/217,870號中所述。在一實施例中，該類似物可為：

此外，WIPI-1激動劑可包括植物提取物，例如下列之提取物：猴耳環、仙丹花、杜莖山、六月雪、非洲茉莉、亞襄或其任何組合。

猴耳環係具有呈圓形傘罩之優雅深綠色樹葉的常綠樹。其產生小的白色有絨毛狀花及扭曲之淺橙紅色果實。該等樹產自印度北部之高降雨量區域、整個東南亞，例如新幾內亞及菲律賓。猴耳環進一步闡述於(例如)2011年8月24日申請之美國專利申請案第13/216,626號中，其出於所有目的以全文引用方式併入本文中。

仙丹花係原產於華南之開花植物，其特徵在於其幾乎無柄之葉及紅色花。其用於治療各種疾病，如風濕病及創傷，且闡述於(例如)2010年6月30申請之美國專利申請案第13/158,947號及2011年12月13日申請之美國專利申請案第13/324,150號(其出於所有目的以全文引用方式併入本文中)中。

杜莖山係小至中等大小之常綠灌木，有時具有攀緣莖，具有交替的桃葉珊瑚屬(Aucuba)樣大致卵形之橢圓形鋸齒狀且紋理薄得多之葉。在所有葉腋中均具有乳白色花之短的簇擁總狀花序，其具有淺粉色肉質漿果。杜莖山進一步闡述於頒予Siming Chen等人之2012年12月11日申請之標題為「Maesa japonica extracts and methods of use」之美國申請案第13/710,585號中，其出於所有目的以全文引用方式併入本文中。

六月雪(亦稱為千星樹)係具有小的淺綠色卵形葉之常綠灌木，其原產於東南亞之開闊亞熱帶林地及濕草甸。端視品種而定，晚春時節該樹遍佈白色或粉色的小花。樹幹之天然色彩係灰色且樹皮隨著年齡而變粗糙。六月雪進一步闡述於頒予Qian Zheng等人且2012年12月11日申請之標題為「Serissa japonica extracts and methods of use」之PCT申請案第PCT/US12/68858號中，其出於所有目的以全文引用方式併入本文中。

非洲茉莉(亦稱為馬達加斯加茉莉(Madagascar Jasmine))係具有有光澤厚的深綠色卵形葉之纏繞且分枝之常綠攀緣植物。該常綠植物從春天至秋天均產生芳香蠟狀白色花。非洲茉莉進一步闡述於頒予Permanan Raaj Khusial等人且2012年12月11日申請之標題為「Stephanotis jasminoides extracts and methods of use」之PCT申請案第PCT/US12/68866號中，其出於所有目的以全文引用方式併入本文中。

亞襄(「亞襄(Yanang)」)係原產於東南亞大陸之開花植物物種且在泰國東北部及老撾尤其用於烹調。在傳統東南亞藥物中，亞襄已用作用於發熱緩解、酒精中毒、發炎及細菌性/真菌性感染之草藥。舉例而言，戴爾亞襄(Tiliacora triandra Diels)對抗惡性瘧原蟲(引起人類瘧疾)之用途揭示於Pavanand等人，Phytother.Res.,3,215-217(1989)中且闡述於(例如)2008年12月30日申請之美國專利申請案第12/345,707號(美國公開案2010.0166677)；2010年6月30日申請之第 13/158,947號(美國公開案第2012.0003332號)；及2010年6月30日申請之第12/827,001號(美國公開案第2012/0003331號)中，其出於所有目的以全文引用方式併入本文中。

上述提取物含有多種活性化合物，其中一或多者上調WIPI-1。在本發明之某些實施例中，WIPI-1激動劑可不包括上述化合物及/或提取物中之一或多者，且在另一實施例中可不包括亞襄提取物。

植物材料可呈包括(但不限於)以下之任何形式：整株植物、乾燥植物、磨碎的植物、或其部分(包括(但不限於)種子、針葉、葉、根、樹皮、球花、莖、根莖、癒傷組織細胞、原生質體、花及分生組織)、或於天然植物材料及/或該植物之部分中發現的或自其中分離出的組份及/或成份或其任何組合。在一實施例中，天然植物材料呈源自整株植物或植物之選擇部分(例如植物之葉)之提取物形式。在關於猴耳環、六月雪或杜莖山之某些實施例中，提取物可來源於該等植物之莖及葉。在使用仙丹花之實施例中，提取物可來源於其花，且在亞襄之情形下，提取物可來源於該植物之藤。應理解，「天然植物材料」亦包括來源於天然植物材料之成分、組份、組成份或提取物。

特定而言，植物組份來源於自可含有期望成份之植物收集之原料，例如種子、針葉、葉、根、樹皮、球花、莖、根莖、癒傷組織細胞、原生質體、器官及器官系統、及分生組織。在某些實施例中，將自植物收集之原料研磨成小粒徑。另外，可乾燥原料以減少水含量。可藉由多種不同方式來乾燥原料，例如，風乾、烘箱乾燥、在真空下旋轉蒸發或凍乾。

可藉由將原料與汽提劑蒸餾來獲得上述植物之提取物。汽提劑可為與來自植物之期望提取物可混溶、不可混溶或可部分混溶之液體。適宜汽提劑包括(但不限於)水；醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇及諸如此類)；二醇；醚(例如乙醚、二丙基醚及諸如此類)；酯(例如乙酸丁酯、乙酸乙酯及諸如此類)；酮(例如丙酮、乙基甲基酮及諸如此類)；二甲基亞碸；乙腈；其他有機溶劑；及其組合。在一實施例中，汽提劑與來自植物之期望提取物(例如，精油)不可混溶。在又一實施例中，汽提劑係水。在又一實施例中，藉由蒸汽蒸餾來獲得提取物。可藉由與汽提劑進行相分離來收集提取物(例如，精油)。認為汽提劑會增加用於獲得提取物之蒸餾系統之總蒸氣壓且藉此降低期望產物(提取物)之沸點。

在其他實施例中，植物組份可呈藉由溶劑提取獲得之提取物形式，在一實施例中，提取物可藉由有機溶劑提取來獲得。簡言之，有機溶劑提取方法涉及使用有機溶劑洗滌及提取原料(其可為整體或研磨成小粒徑)。有機溶劑之非限制性實例包括甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、己烷、二甲苯及石油醚。如該領域內所熟知，可使用提取機進行有機溶劑提取。藉由推進器(其慢慢向前移動植物原料)將原料推擠至提取機中。可藉助位於廢料排放出口之頂部之溶劑入口將有機溶劑(例如，乙醇)添加至機器中。由於重力之差異及平衡，溶劑朝向原料入口流動，浸泡材料並自溶劑入口之相對側流出。由於植物材料及溶劑相對於彼此以相反方向移動，故植物材料一直浸漬於含有低濃度提取物之溶液中。由於平衡，可藉由對低濃度溶液連續提取植物材料來達成植物成份之高產率。

使用適於提取植物成份之提取時間，通常介於約1小時至10小時之間係適宜的，且在另一實施例中介於約2小時至8小時之間係適宜的，且在又一實施例中介於約3小時至6小時之間係適宜的。提取溫度介於約30℃至100℃之間，在又一實施例中介於約40℃至70℃之間，且在又一實施例中介於約50℃至60℃之間。然後對所收集提取物實施精濾以去除殘渣，且其可直接使用或藉由(例如)蒸餾溶劑或藉由其他習用處理將其濃縮。可在真空下旋轉蒸發或凍乾提取物活性物之溶液。典型提取物活性物含量高於約25%，在又一實施例中高於50%，且提取物亦可以精油或具有半固體或固體稠度之濃縮物形式提供。

相似地，水性有機溶劑提取涉及首先自所述植物收集原料(其可為整體或研磨成小粒徑)。將經研磨植物材料浸泡於酸性或鹼性水溶液中，此端視期望提取物在酸性或鹼性(鹼性)條件下之溶解度及穩定性而定。對於在酸性條件下之提取而言，將酸(例如鹽酸或硫酸)(例如)以約3%(w/v)之濃度添加至水中。對於在鹼性條件下之提取而言，將鹼(例如氫氧化鈉或碳酸鈉)添加至水中。提取時間及提取溫度通常與用於上文所述有機溶劑提取方法之提取時間及提取溫度相似。

然後收集提取物並精濾以去除殘渣。可將鹼性試劑(例如，氨)或酸化試劑(例如，硫酸)添加至提取物中以藉由調節pH中和溶液，此端視所收集提取物之酸性或鹼性而定。水性提取物可直接使用，經濃縮或乾燥。另一選擇為，然後可將有機溶劑添加至經中和溶液中以將提取物自水相轉移至有機相。該等有機溶劑之實例包括(但不限於)乙醇、異丙醇、丁醇、戊醇、己醇及二甲苯。包含溶解於有機溶劑中之經轉移提取物活性物之提取物可直接以精油或濃縮物形式使用，或藉由多種不同方式(例如，風乾、烘箱乾燥、在真空下旋轉蒸發或凍乾)乾燥成半固體或固體稠度。

亦應注意，可將含有不同成份之不同植物一起混合並提取。在一實施例中，此混合提取製程可用於提取彼等含有在用於提取之溶劑(例如乙醇)中具有相似溶解度之成份之植物。可濃縮提取物之混合物並儲存於適當溶劑中。

在另一實施例中，如本文所用植物提取物亦包括「合成」提取物，即已知植物組份及/或成份之各種組合，其經組合以實質上模擬具有調節活性之脂肪隔膜蛋白之天然來源之上述植物提取物中任一者或多者之組成及/或活性。在一實施例中，合成提取物具有實質上相同數量之活性組份作為天然植物材料。合成提取物與天然植物材料間之以數值表示之活性之一致性亦可在「共同性%」方面加以描述。合成提取物與植物或天然提取物之化學組成具有約50%或更大之共同性。換言之，合成提取物具有植物或天然提取物中發現之活性成分的約50%或更多。在其他實施例中，合成提取物之化學組成與植物或天然提取物之化學組成具有約70%或更大之共同性。最佳地，合成提取物與植物或天然提取物之化學組成具有約90%或更大之共同性。

在本發明之又一實施例中，可自植物組織培養物獲得提取物/代謝物。在一實施例中，可自植物細胞培養物獲得非洲茉莉之提取物/代謝物。一般而言，在一實施例中可使用生物反應器之高度受控環境來產生可重複及/或可靠之提取物。控制生物反應器中之環境之能力亦促進使用各種誘發劑來刺激或控制有益化學物質之產生及比率(且視情況減少不期望化學物質)。

本文所用培養植物細胞組織之方法係習用的，參見美國專利申請案第20110159121號。舉例而言，以下係提供此領域教示內容之公認教科書：Plant Cell and Tissue Culture,a Laboratory Manual，Reinert及Yoeman，Springer-Verlag 1982(ISBN 3-540-11316-9)；Plant Tissue Culture Propagation，de Fossard,Filmfiche公司，1981(ISBN 0-949801-003)；In Vitro Culture of Higher Plants,Pierik,Martinus Nijhoff出版社，1987(ISBN 90-247-3531-9)；Plant Culture Media，第1卷，Formulations and Uses,George，Puttock及George，Exegetics公司，1987(ISBN 0-9509325-2-3)；Plant Cell Culture Secondary Metabolism：toward industrial application，DiCsomo及Misawa，CRC Press LLC 1996(ISBN 0-8493-5135-9)；Plant Tissue Culture：Theory and Practice,a revised edition，Bhojwani及Rasdan，Elsevier 1996(ISBN 0-444-81623-2)；Plant Cell Culture Protocols，第2版，Loyola- Vargas及Vazquez-Floga，Humana Press 2006(ISBN 1-59259-959-1)等等。

植物組織培養物可自植物之任一部分產生，包括(例如)局部分生組織或芽、根(包括根尖、根毛等等)、莖/樹幹(包括樹皮、外果皮、內果皮、韌皮部、木質部等等)、葉(包括葉各部分及其受傷部分)、花(包括花各部分，例如花藥、翼瓣、雄蕊、雌蕊等)、花粉、種子(及種子各部分)、果實(及果實各部分，例如果皮、果肉、種子等)、角質層等等。在一實施例中，組織培養物來源於分生組織或受傷葉組織。然後可將組織/細胞種植於熟習此項技術者熟知之習用植物細胞培養基上。熟習此項技術者習用之該等植物細胞培養基之實例闡述於以下著作中：E.F.Georges、D.J.Puttock及J.G.Heather，(1987)Plant Culture Media,(第1卷，Formulations and uses)，Exegetics公司；Dodds J.H.Roberts L.W.(1982).Experiments in Plant Tissue Culture.Cambridge Univ.Press,Cambridge.第178頁；Evans D.A.,Sharp W.R.,Ammirato P.V.,Yamada Y.(1984).Handbook of Plant Cell Culture.Techniques for Propagation and Breeding.Macmillan Publ.公司，New York，第970頁，第1卷至第6卷；Reinert J.,Yeoman M.M.(1982).Plant Cell and Tissue Culture.A Laboratory Manual.Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg,N.Y.第83頁；Sala F.,Parisi B.,Cella R.,Cifferi O.(1980).Plant cell cultures.Elsevier/North Holland,Amsterdam；Sharp W.R.,Larsen P.O.,Paddock E.F.,Raghavan V.(1979)；Plant Cell and tissue culture.Principles and applications.Ohio State University Press,Columbus；Vasil I.(1985-1991).Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants.第1卷至第8卷；Bhojwani S.,Razdan I.Z.K.(1983).Plant tissue culture：theory and practice.Elsevier,Amsterdam；Debergh P.,Zimmermann(1991).Micropropagation.Technology and application. Kluwer,London；及Zyrd J.P.(1988).Cultures de cellules,tissus et organes végétaux[Plant organ,tissue and cell cultures].Presses Polytechniques Romandes,Lausanne。針對期望性狀選擇最終培養物並繼代培養超過數週以提供具有期望性狀之未分化細胞之聚集體(稱作癒傷組織)。

然後可將具有期望性狀之癒傷組織轉移至生物反應器中之液體培養基中，其中該等癒傷組織保持於懸浮液中。針對癒傷組織之生長優化液體培養基及生物反應器之條件。適於植物細胞懸浮培養之培養基為熟習此項技術者熟知。在一具體實例中，植物細胞懸浮培養培養基包括Murashige及Skoog(MS)鹽(例如，目錄編號M524，Phytotech,Shawnee Mission,Kans.)及Nitsch及Nitsch維生素(例如，目錄編號N608，Phytotech,Shawnee Mission,Kans.)。例如，參見Nitsch及Nitsch，Science 163：85-87,1969。

視情況，可在自培養物提取或收穫代謝物之前對培養物中之細胞實施誘發步驟。可使用各種類型誘發劑來暴露或處理植物組織，由此誘發處於基因表現之組織之反應及合意或有益化學物質之產生或改變化學物質之比率。可藉助試劑或藉助各種應激(例如壓力、降壓、真空、壓力變化、氣體之存在、可變氣氛、溫度、寒冷、亮度之光強度或光譜分佈或比率或週期、輻射、毒素、植物毒素、除毒素以外之植物提取物、抗氧化劑或其摻合物、攪動、細菌、病毒、真菌、微生物、超音波、IR、UV、窒息等)來影響細胞誘發。任一熟習此項技術者已知之誘發方法皆可用於刺激如本文所述之組織培養物。其進一步涵蓋其他可用於影響在細胞培養物中之表現(及/或代謝物產生)之有機或無機化學物質/物質(包括元素)。舉例而言，特定抗氧化劑化合物之產生可經引發或該產生在暴露於植物病原體或環境挑戰(例如模擬之乾旱或寒冷或模擬昆蟲侵襲之存於昆蟲唾液中之化學物質)後增加。

隨後，可將組織植物培養物均勻化且在提取階段及各種過濾後實施冷凍乾燥以將所獲得提取物納入化妝品或醫藥製劑中。該等方法闡述於(例如)美國專利第4,241,536號；美國公開申請案2005/0265953、EP 378 921、WO 88/00968、EP 1 203 811等等中。

在一實施例中，使用業內一般技術者已知之方法在植物組織培養物中繁殖細胞以快速地產生可分離出活性成分之「透明儲液」。

本發明化妝品組合物可調配成多種用於局部施用之形式且可包含約0.00001重量%至約90重量%之一或多種上調WIPI-1之活性物，且在其他實施例中可包含約0.001重量%至約25重量%之該等活性物，且在又一實施例中其可包含約0.001重量%至約1重量%之該等活性物。

本發明之另一實施例涵蓋一種組合物，其包含適於與活的動物組織(包括人類組織)接觸且幾乎對使用者無不利生理影響之化妝品上或皮膚病學上可接受之調配物。本發明涵蓋之組合物可呈任一化妝品上及/或皮膚病學上適宜之形式提供，在一實施例中呈洗劑或乳霜提供，且亦可呈無水基質或水性基質形式，及呈可噴霧液體形式提供。本發明組合物之其他適宜化妝品產物形式包括(例如)乳液、乳霜、香膏、唇彩、洗液、面膜、精華液、化妝水、軟膏、慕思、貼劑、髮蠟、溶液、噴霧、蠟質條膏或小毛巾。另外，本發明涵蓋之組合物可包括一或多種熟練實踐者常用且已知之相容化妝品上可接受之佐劑，例如著色劑、芳香劑、軟化劑、保濕劑、防腐劑、維生素、螯合劑、增稠劑、紫蘇油或紫蘇籽油(關於「Method of Treating a Skin Condition」之WO 01/66067)及諸如此類、以及其他植物，例如蘆薈、洋甘菊及諸如此類，且如下文進一步闡述。

此外，本發明涵蓋經皮遞送模式，例如貼劑及諸如此類(含或不含適宜滲透增強劑)。本發明實施之方法及組合物提供可有效地將WIPI-1激動劑投與經皮系統中之構件。因此，將組合物或調配物(通常具有滲透增強組合物)遞送至皮膚之經皮構件係經皮貼劑或如業內已知且闡述之相似裝置。經皮貼劑經設計以穿過使用者之皮膚遞送有效量之化合物。經皮貼劑通常包括可納入上述提取物中之一或多者之液體凝膠、固體基質或壓敏黏著劑載劑。貼劑調配物及製劑為業內熟知。例如，參見Kenneth A Walters(編者)之「Dermatological and Transdermal Formulations」(Drugs and the Pharmaceutical Sciences，第119卷)，Marcel Dekker；及Richard H.Guy(編者)、Jonathan Hadgraft(編者)之「Transdermal Drug Delivery」(Drugs & the Pharmaceutical Sciences)，原版第2修訂版，Marcel Dekker；及Russell O.Potts及Richard H.Guy編輯之「Mechanisms of Transdermal Drug Delivery」(Drugs & the Pharmaceutical Sciences，第83卷)(1997)。該等裝置之實例揭示於美國專利第5,146,846號；第5,223,262號；第4,820,724號；第4,379,454號；及第4,956,171號；及美國專利申請案第US20110300198號中。將組合物儲存及遞送至皮膚(包括頭髮)上及形成活性組合物之經皮模式係習用的且極適於本發明之一實施例之目的。在另一方法中，藉助持續釋放媒劑、載劑或稀釋劑(例如，局部施用之持續釋放貼劑)施用。當使用局部貼劑時，可將貼劑施用至期望區域達延長之時間段。該延長之時間段可大於1小時，且在某些實施例中該延長之時間段係過夜，即，當使用者睡覺時。在本發明之又一實施例中，可視需要將經皮貼劑施用至老化皮膚或處於老化風險之皮膚(即，經uv暴露之皮膚)達延長之時間段(至少1天、2天或更多天、至少1週或更久)以提供對WIPI-1激動劑之長期暴露以達成衰老或老化皮膚之期望增殖。

該等組合物可包括化妝品上可接受之媒劑。該等媒劑可採取業內已知適於施用至皮膚之任何形式且可包括水(例如，去離子水)；植物油；礦物油；酯，例如棕櫚酸辛酯、肉豆蔻酸異丙酯及棕櫚酸異丙酯；醚，例如二辛醚及二甲基異山梨醇；醇，例如乙醇及異丙醇；脂肪醇，例如十六烷醇、鯨蠟硬脂醇、硬脂醇及聯苯醇；異烷烴，例如異辛烷、異十二烷及異十六烷；聚矽氧油，例如環甲基聚矽氧烷、二甲聚矽氧烷、二甲聚矽氧烷交聯聚合物、聚矽氧烷及其衍生物(例如有機經修飾衍生物)；烴油，例如礦物質油、礦脂、異二十烷及聚異丁烯；多元醇，例如丙二醇、丙三醇、丁二醇、戊二醇及己二醇；蠟，例如蜂蠟及植物蠟；或上述之任何組合或混合物。

媒劑可包含水相、油相、醇、聚矽氧相或其混合物。化妝品上可接受之媒劑亦可包含乳液。適宜乳液之非限制性實例包括油包水乳液、水包油乳液、水包聚矽氧乳液、聚矽氧包水乳液、水包蠟乳液、水-油-水三重乳液或諸如此類具有乳霜、凝膠或微乳液外觀者。乳液可包括乳化劑，例如非離子型、陰離子型或兩性表面活性劑。

在一實施例中，乳液之油相具有一或多種有機化合物，包括軟化劑；保濕劑(例如丁二醇、丙二醇、甲基葡糖醇聚醚-20及甘油)；其他水可分散或水溶性組份，包括增稠劑，例如矽酸鎂鋁或羥基烷基纖維素；膠凝劑，例如高MW聚丙烯酸，即CARBOPOL 934；及其混合物。乳液可具有能夠乳化組合物中存在之各種組份的一或多種乳化劑。

適用於油相中之化合物包括(但不限於)植物油；酯，例如棕櫚酸辛酯、肉豆蔻酸異丙酯及棕櫚酸異丙酯；醚，例如二辛基醚；脂肪醇，例如十六烷醇、硬脂醇及山萮醇；異烷烴，例如異辛烷、異十二烷及異十六烷；聚矽氧油，例如二甲聚矽氧烷、環狀聚矽氧及聚矽氧烷；烴油，例如礦物質油、礦脂、異二十烷及聚異丁烯；天然或合成蠟；及諸如此類。適宜疏水性烴油可為飽和或不飽和的，具有脂肪族特徵且為直鏈或具支鏈或含有脂環族或芳族環。含油相可由單一油或不同油之混合物組成。

可使用包括彼等具有6至20個碳原子者之烴油，且在一實施例中其可具有10至16個碳原子。代表性烴包括癸烷、十二烷、十四烷、十三烷及C_8-20異烷烴。石蠟烴可以商標ISOPARS自Exxon購得並可自Permethyl公司購得。另外，預期C_8-20石蠟烴，諸如Permethyl Corporation製造之商品名Permethyl 99A^TM之C₁₂異烷烴(異十二烷)亦係適宜的。諸如異十六烷(商品名為Permethyl®)等多種市售C₁₆異烷烴亦係適宜的。揮發性烴之實例包括聚癸烷，例如，異十二烷及異癸烷，其包括(例如)Permethyl-99A(Presperse公司)及C₇-C₈至C₁₂-C₁₅異烷烴(例如，可自Exxon化學物質購得之Isopar系列)。代表性烴溶劑係異十二烷。

油相可包含一或多種蠟，包括(例如)米糠蠟、巴西棕櫚蠟、小冠椰子蠟、堪地里拉蠟(candelilla wax)、褐煤蠟、甘蔗蠟、地蠟、蟲膠蠟、米糠蠟、聚乙烯蠟、Fischer-Tropsch蠟、蜂蠟、微晶蠟、聚矽氧蠟、氟化蠟及其任一組合。

非限制性乳化劑包括乳化蠟、乳化多元醇、聚醚多元醇、聚醚、多元醇之單酯或二酯、乙二醇單硬脂酸酯、甘油單硬脂酸酯、甘油二硬脂酸酯、含有聚矽氧之乳化劑、大豆固醇、脂肪醇(例如鯨蠟醇)、丙烯酸酯、脂肪酸(例如硬脂酸)、脂肪酸鹽及其混合物。乳化劑可包括大豆固醇、鯨蠟醇、硬脂酸、乳化蠟、丙烯酸酯、含有聚矽氧之乳化劑及其混合物。可用於本發明組合物中之其他特定乳化劑包括(但不限於)以下中之一或多者(僅列舉幾個例子)：丙烯酸C_10-30烷基酯交聯聚合物；二甲聚矽氧烷PEG-7異硬脂酸酯、丙烯醯胺共聚物；礦物油；山梨醇酐酯；聚甘油-3-二異硬脂酸酯；山梨醇酐單硬脂酸酯、山梨醇酐三硬脂酸酯、山梨醇酐倍半油酸酯、山梨醇酐單油酸酯；甘油酯，例如甘油單硬脂酸酯及甘油單油酸酯；聚氧乙烯酚，例如辛基酚聚氧乙烯醚及壬基酚聚氧乙烯醚；聚氧乙烯醚，例如聚氧乙烯鯨蠟基醚及聚氧乙烯硬脂基醚；聚氧乙烯二醇酯；聚氧乙烯山梨醇酐酯；二甲聚矽氧烷共聚醇；聚甘油酯，例如聚甘油-3-二異硬脂酸酯；月桂酸甘油酯；硬脂醇聚氧乙烯醚-2、硬脂醇聚氧乙烯醚-10及硬脂醇聚氧乙烯醚-20。其他乳化劑係提供於INCI成分詞典及手冊，第11版，2006中，其揭示內容以全文引用方式併入本文中。

該等乳化劑通常可以約0.001重量%至約10重量%之量、尤其以約0.01重量%至約5重量%且在一實施例中約0.1重量%至約3重量%之量存在於組合物中。

油相可包含一或多種揮發性及/或不揮發性聚矽氧油。揮發性聚矽氧包括環狀及直鏈揮發性二甲基矽氧烷聚矽氧。在一實施例中，揮發性聚矽氧可包括環二甲聚矽氧烷，其包括四聚物(D₄)、五聚物(D₅)及六聚物(D₆)環甲基聚矽氧烷、或其混合物。尤其可提及者係揮發性環甲基聚矽氧烷-六甲基環三矽氧烷、八甲基-環四矽氧烷及十甲基-環五矽氧烷。適宜二甲聚矽氧烷可以名稱Dow Corning 200® Fluid自Dow Corning購得且具有介於0.65厘斯托克(centistoke)至600,000厘斯托克之間或更高之黏度。適宜非極性揮發性液體聚矽氧油係揭示於美國專利第4,781,917號中。其他揮發性聚矽氧材料闡述於Todd等人，「Volatile Silicone Fluids for Cosmetics」,Cosmetics and Toiletries,91：27-32(1976)中。直鏈揮發性聚矽氧在25℃下通常具有小於約5厘斯托克之黏度，而環狀聚矽氧在25℃下具有小於約10厘斯托克之黏度。不同黏度之揮發性聚矽氧之實例包括Dow Corning 200、Dow Corning 244、Dow Corning 245、Dow Corning 344及Dow Corning 345(Dow Corning公司)；SF-1204及SF-1202 Silicone Fluids(G.E.Silicones)、GE 7207及7158(General Electric公司)；及SWS-03314(SWS Silicones公司)。直鏈揮發性聚矽氧包括低分子量聚二甲基矽氧烷化合物，例如(僅列舉幾個例子)六甲基二矽氧烷、八甲基三矽氧烷、十甲基四矽氧烷及十二甲基五矽氧烷。

非揮發性聚矽氧油通常會包含聚烷基矽氧烷、聚芳基矽氧烷、聚烷基芳基矽氧烷或其混合物。聚二甲基矽氧烷係非揮發性聚矽氧油。非揮發性聚矽氧油在25℃下通常可具有約10厘斯托克至約60,000厘斯托克，在一實施例中介於約10厘斯托克與約10,000厘斯托克之間，且在一實施例中仍介於約10厘斯托克與約500厘斯托克之間之黏度；且在大氣壓下具有高於250℃之沸點。非限制性實例包括二甲基聚矽氧烷(二甲聚矽氧烷)、苯基三甲聚矽氧烷及二苯基二甲聚矽氧烷。揮發性及不揮發性聚矽氧油可視情況經各種官能基取代，例如(僅列舉幾個例子)烷基、芳基、胺基、乙烯基、羥基、鹵代烷基、烷基芳基及丙烯酸酯基團。

可用非離子型表面活性劑(乳化劑)乳化聚矽氧包水乳液，例如，聚二有機矽氧烷-聚氧基伸烷基嵌段共聚物，包括彼等闡述於美國專利第4,122,029號中者。該等乳化劑通常包含具有包含-(EO)_m-及/或-(PO)_n-基團之側鏈之聚二有機矽氧烷主鏈(通常聚二甲基矽氧烷)，其中EO係伸乙基氧基且PO係1,2-伸丙基氧基，該等側鏈通常經氫或低碳烷基(例如，C_1-6，通常C_1-3)包封或封端。其他適宜聚矽氧包水乳化劑揭示於美國專利第6,685,952號中。市售聚矽氧包水乳化劑包括彼等可以商標名3225C及5225C FORMULATION AID自Dow Corning購得者、自General Electric購得之SILICONE SF-1528、自Goldschmidt Chemical公司(Hopewell,Va.)購得之ABIL EM 90及EM 97及由OSI Specialties(Danbury公司)出售之SILWET系列乳化劑。

聚矽氧包水乳化劑之實例包括(但不限於)二甲聚矽氧烷PEG 10/15交聯聚合物、二甲聚矽氧烷共聚醇、鯨蠟基二甲聚矽氧烷共聚醇、PEG-15月桂基二甲聚矽氧烷交聯聚合物、月桂基矽酮交聯聚合物、環矽酮及二甲聚矽氧烷共聚醇、二甲聚矽氧烷共聚醇(及)辛酸/癸酸甘油三酸酯、聚甘油-4異硬脂酸酯(及)鯨蠟基二甲聚矽氧烷共聚醇(及)月桂己酯、及二甲聚矽氧烷共聚醇(及)環五矽氧烷。在一實施例中，聚矽氧包水乳化劑之實例包括(但不限於)PEG/PPG-18/18二甲聚矽氧烷(商品名5225C，Dow Corning)、PEG/PPG-19/19二甲聚矽氧烷(商品名BY25-337，Dow Corning)、鯨蠟基PEG/PPG-10/1二甲聚矽氧烷(商品名Abil EM-90，Goldschmidt Chemical公司)、PEG-12二甲聚矽氧烷(商品名SF 1288，General Electric)、月桂基PEG/PPG-18/18矽酮(商品名5200 FORMULATION AID，Dow Corning)、PEG-12二甲聚矽氧烷交聯聚合物(商品名9010及9011聚矽氧彈性體摻合物，Dow Corning)、PEG-10二甲聚矽氧烷交聯聚合物(商品名KSG-20，Shin-Etsu)、二甲聚矽氧烷PEG-10/15交聯聚合物(商品名KSG-210，Shin-Etsu)及二甲聚矽氧烷PEG-7異硬脂酸酯。

聚矽氧包水乳化劑通常應以約0.001重量%至約10重量%之量、在另一實施例中以約0.01重量%至約5重量%且在又一實施例中低於1重量%之量存在於組合物中。

乳液之水相可包括一或多種其他溶劑，包括低碳醇，例如乙醇、異丙醇及諸如此類。揮發性溶劑亦可為化妝品上可接受之酯，例如乙酸丁酯或乙酸乙酯；酮，例如丙酮或乙基甲基酮；或諸如此類。

含油相通常應佔乳液總重量之約10重量%至約99重量%、約20重量%至約85重量%或約30重量%至約70重量%，且水相通常應佔總乳液之約1重量%至約90重量%、約5重量%至約70重量%或約20重量%至約60重量%。

該等組合物可包括脂質體。脂質體可包含其他添加劑或物質及/或可經修飾以更特定地到達或保留在投與後部位。

該組合物可視情況包含對熟習此項技術者顯而易知之其他化妝品活性物及賦形劑，其包括(但不限於)填充劑、乳化劑、抗氧化劑、表面活性劑、膜形成劑、螯合劑、膠凝劑、增稠劑、軟化劑、保濕劑、潤濕劑、維生素、礦物質、黏度及/或流變性調節劑、防曬劑、角質溶解劑、脫色劑、類視色素、荷爾蒙化合物、α-羥基酸、α-酮基酸、抗分枝桿菌劑、抗真菌劑、抗微生物劑、抗病毒劑、鎮痛劑、脂質化合物、抗過敏劑、H1或H2抗組胺劑、消炎劑、抗激動劑、抗腫瘤劑、免疫系統加強劑、免疫系統抑制劑、祛痘劑、麻醉劑、防腐劑(antiseptic)、驅蟲劑、冷膚化合物、護膚劑、皮膚滲透增強劑、磨砂劑、潤滑劑、芳香劑、著色劑、脫色劑、色素淡化劑、防腐劑(preservative)(例如，DMDM己內醯脲/碘丙炔丁基碳酸酯)、穩定劑、醫藥劑、光穩定劑、中和劑(例如，三乙醇胺)及其混合物。除上述外，本發明之化妝品組合物亦可含有用於處理皮膚病症之任一其他化合物。

著色劑可包括(例如)有機及無機顏料及珠光劑。適宜無機顏料包括(但不限於)氧化鈦、氧化鋯及氧化鈰、以及氧化鋅、氧化鐵、氧化鉻及亞鐵藍。適宜有機顏料包括鋇、鍶、鈣及鋁色澱、及炭黑。適宜珠光劑包括經氧化鈦、氧化鐵或天然顏料塗佈之雲母。

可添加各種填充劑及額外組份。填充劑以組合物之總重量計通常以約0重量%至約20重量%、在一實施例中約0.1重量%至約10重量%之量存在。適宜填充劑包括(但不限於)二氧化矽、經處理二氧化矽、滑石粉、硬脂酸鋅、雲母、高嶺土、耐綸(Nylon)粉末(例如，Orgasol^TM)、聚乙烯粉末、鐵氟龍(Teflon)^TM、澱粉、氮化硼、共聚物微球體(例如，Expancel^TM(Nobel Industries)、Polytrap^TM(Dow Corning)及聚矽氧樹脂微珠粒(來自Toshiba之Tospearl^TM))、及諸如此類。

在本發明之一實施例中，組合物可包括其他皮膚活性物，例如 (但不限於)植物性藥材、角質溶解劑、脫皮劑、角質細胞增殖增強劑、膠原酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑、脫色劑、抗發炎劑、類固醇、祛痘劑、抗氧化劑、水楊酸或水楊酸酯、硫二丙酸或其酯及晚期糖基化終產物(AGE)抑制劑。

在特定實施例中，該組合物可包含至少一種其他植物性藥材，例如，植物提取物、精油或該植物自身。適宜植物性藥材包括(但不限於)來自下列之提取物：印度冷杉(Abies pindrow)、兒茶(Acacia catechu)、寬葉榆綠木(Anogeissus latifolia)、紫萁(Asmunda japonica)、印度苦楝(Azadirachta indica)、紫鉚(Butea frondosa)、膠蟲樹(Butea monosperma)、喜馬拉雅雪松(Cedrus deodara)、餘甘子(Emblica officinalis)、孟加拉榕(Ficus benghalensis)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra)、冬青(Ilex purpurea Hassk)、總狀土木香(Inula racemosa)、川芎(Ligusticum chuangxiong)、拉維紀草(Ligusticum lucidum)、粗糠柴(Mallotus philippinensis)、牛油果(Mimusops elengi)、檄樹(Morinda citrifolia)、辣木(Moringa oleifera)、補血草(Naringi crenulata)、夾竹桃(Nerium indicum)、補骨脂(Psoralea corylifolia)、烏蕨(Stenoloma chusana)、紅果欖仁果樹(Terminalia bellerica)、番茄糖脂及其混合物。

組合物可包含具有抗老化益處之其他活性成分，如預計可利用該等組合獲得協同改善。例示性抗老化組份包括(但不限於，僅舉幾個例子)植物性藥材(例如紫鉚提取物)；硫二丙酸(TDPA)及其酯；類視色素(例如全反式視黃酸、9-順式視黃酸、植烷酸及其他)；羥酸(包括α-羥酸及β-羥酸)、水楊酸及水楊酸酯；表皮脫落劑(例如乙醇酸、3,6,9-三氧雜十一烷二酸等)、刺激化合物之雌激素合成酶(例如，咖啡因(caffeine)及衍生物)；能夠抑制5α-還原酶活性之化合物(例如亞麻酸、亞麻油酸、非那雄胺(finasteride)及其混合物)；及屏障功能增強劑(例如神經醯胺、甘油酯、膽固醇及其酯、α-羥基及ω-羥基脂肪酸及其酯等)；膠原酶抑制劑；及彈性蛋白酶抑制劑。

例示性類視色素包括(但不限於)視黃酸(例如全反式-或13順式)及其衍生物、視黃醇(維生素A)及其酯(例如視黃醇棕櫚酸酯、視黃醇乙酸酯及視黃醇丙酸酯)及其鹽。

在另一實施例中，本發明之局部組合物亦可包括以下中之一或多者：皮膚滲透增強劑、軟化劑、皮膚豐潤劑、光學散射劑、防曬劑、表皮脫落劑及抗氧化劑。

軟化劑提供增強皮膚光滑度及減少細紋及深紋(coarse wrinkle)之外觀之功能益處。實例包括肉豆蔻酸異丙酯、礦脂、羊毛脂酸異丙酯、聚矽氧(例如，甲基聚矽氧烷、二甲聚矽氧烷)、油、礦物油、脂肪酸酯、乙基己酸酯鯨蠟基酯、苯甲酸C12-15烷基酯、異硬脂酸酯異丙酯、二聚亞油酸二異丙酯或其任何混合物。軟化劑可佔該組合物之總重量之約0.1重量%至約50重量%。

皮膚豐潤劑充當皮膚之膠原增強劑。適宜皮膚豐潤劑之實例係棕櫚醯寡肽。其他皮膚豐潤劑係膠原及/或其他糖胺聚多糖(GAG)增強劑。當存在時，皮膚豐潤劑可佔該組合物之總重量之約0.1重量%至約20重量%。

光學散射劑係改變皮膚之表面光度量以達成(例如)細紋及皺紋之視覺模糊及柔和化之粒子。可用於本發明之光學散射劑之實例包括(但不限於)氮化硼、雲母、耐綸、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚胺甲酸酯粉末、絹雲母、二氧化矽、聚矽氧粉末、滑石粉、鐵氟龍、二氧化鈦、氧化鋅或其任何混合物。當存在時，光學散射劑可佔該組合物之總重量之約0.01重量%至約20重量%。

亦可包括用於保護皮膚免於紫外線損傷之防曬劑。在一實施例中，防曬劑可包括彼等具有寬範圍之UVB及UVA保護者，例如奧克立林(octocrylene)、阿伏苯宗(avobenzone)(Parsol 1789)、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯、羥苯甲酮(oxybenzone)、胡莫柳酯(homosylate)、二苯甲酮(benzophenone)、樟腦衍生物、氧化鋅及二氧化鈦。當存在時，防曬劑可佔組合物之約0.01重量%至約70重量%。

適宜表皮脫落劑包括(例如)α-羥酸、β-羥酸、含氧酸、含氧二酸及其衍生物(例如酯、酐及其鹽)。適宜羥酸包括(例如)乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、2-羥基烷酸、扁桃酸、水楊酸及其衍生物。在一實施例中，表皮脫落劑係乙醇酸。當存在時，表皮脫落劑可佔組合物之約0.1重量%至約80重量%。

抗氧化劑可清除皮膚之自由基，從而保護皮膚免於環境侵襲者。可用於本發明組合物中之抗氧化劑之實例包括含有酚系羥基官能基之化合物，例如抗壞血酸及其衍生物/酯；α-羥酸；β-胡蘿蔔素；兒茶酚；薑黃素；阿魏酸(ferulic acid)衍生物(例如，阿魏酸乙酯、阿魏酸鈉)；沒食子酸衍生物(例如，沒食子酸丙酯)；番茄紅素；還原酸；迷迭香酸；丹寧酸；四氫薑黃色素；生育酚及其衍生物(例如，生育酚乙酸酯)；尿酸；或任何其混合物。其他適宜抗氧化劑係彼等具有一或多個硫醇官能基(-SH)者(呈還原形式或非還原形式)，例如麩胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸及其他巰基化合物。抗氧化劑可係無機抗氧化劑，例如亞硫酸氫鹽、偏亞硫酸氫鹽、亞硫酸鹽或其他含硫無機鹽及酸。在一實施例中，本發明組合物可包含該組合物之總重量之約0.001重量%至約10重量%、且在一實施例中約0.01重量%至約5重量%之抗氧化劑。

其他習用添加劑包括：維生素，例如生育酚及抗壞血酸；維生素衍生物，例如單棕櫚酸抗壞血酸基酯；增稠劑，例如羥基烷基纖維素；膠凝劑；結構劑，例如膨潤土、膨潤石、矽酸鎂鋁及矽酸鎂鋰；金屬螯合劑，例如EDTA；顏料，例如氧化鋅及二氧化鈦；著色劑；軟化劑；及保濕劑。

在一實施例中，包含WIPI-1激動劑之本發明組合物可具有介於約1與約8之間之pH。在某些實施例中，該組合物之pH應為酸性，即，小於7.0，且在其他實施例中應介於約2與約7之間，在其他實施例中應介於約3.5與約5.5之間。

本發明提供用於藉助在受影響區域上局部施用包含WIPI-1激動劑之組合物(在一實施例中存於化妝品上可接受之媒劑中)達足以減少、改良、逆轉或預防皮膚老化影響之時間段來處理衰老或老化皮膚的方法。

在一些實施例中，該等化妝品組合物可進一步包含抗脂質劑。舉例而言，化妝品組合物以有效(或量有效)改善皮膚外觀之量包含肉鹼棕櫚醯轉移酶-1(CPT-1)刺激劑(例如五歛子(Averrhoa carambola)葉提取物)。

例示性抗橘皮組織劑包括(但不限於)磷酸二酯酶抑制劑，例如黃嘌呤類似物，例如咖啡因、胺茶鹼及茶鹼；腺苷酸環化酶活化劑，例如福司柯林(forskolin)及毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)提取物；脂質分解刺激劑，例如山楂(hawthorne)提取物及可樂樹提取物；β腎上腺素受體激動劑，例如異丙腎上腺素(isoproterenol)；α-2-腎上腺素拮抗劑，例如育亨賓(yohimbine)及銀杏(Ginkgo biloba)提取物；紫蘇油(例如，參見US 7,410,658)；肉鹼及/或肌酸(例如，參見標題為「Cosmetic Composition having Carnitine Creatinate and Methods for Using」之US 2007/0264205)。在一些實施例中，其他活性物可包括膠原刺激劑及/或彈性蛋白刺激劑(例如，刺激彈性蛋白產生之物質)、及/或糖胺聚多糖增強劑。膠原、彈性蛋白及糖胺聚多糖增強劑之實例包括(例如)小茴香提取物、胡蘿蔔提取物及紫花苜蓿提取物。在一些實施例中，其他活性物可包括膠原酶抑制劑及/或彈性蛋白酶抑制劑。

在一些實施例中，化妝品組合物可進一步包含至少一種膠原及/或彈性蛋白刺激劑。該等膠原或彈性蛋白刺激劑有效(例如)提供原膠原及/或膠原產生之改善及/或彈性蛋白之保持及重塑之改善。

處理老化或衰老皮膚之方法

本發明之一實施例係關於藉由局部施用WIPI-1激動劑(在一實施例中存於化妝品上適宜之媒劑中)來調節有需要的皮膚細胞內之WIPI-1介導之自噬活性之方法。在又一實施例中，皮膚細胞中之自噬活性增加至少約20%，在一實施例中增加至少約40%，且在另一實施例中與未經處理之對照及/或暴露於WIPI-1激動劑前之皮膚細胞之自噬活性相比均增加至少60%。

本發明進一步提供處理老化皮膚之方法，其係藉由以下方式達成：在受影響區域上局部施用包含WIPI-1激動劑提取物(在一實施例中存於化妝品上可接受之媒劑中)之組合物達足以減少、改良、逆轉或預防老化之皮膚病學跡象之時間段。此方法尤其可用於處理皮膚光老化及內因性老化之跡象。

通常，狀況/美學外觀之改善選自由下列組成之群：減少實足年齡性老化、光老化、荷爾蒙性老化及/或光化性之皮膚病學跡象；預防及/或減少細紋及/或皺紋之外觀；減少面部細紋及皺紋、面頰、前額上之面部皺紋、介於眼睛之間的垂直皺紋、眼睛上方水平皺紋及圍繞口部之木偶紋、且尤其較深皺紋或皺褶之顯著性；預防、減少及/或減退細紋及/或皺紋之外觀及深度；改善眶下細紋及/或眼眶周圍細紋之外觀；減少魚尾紋之外觀；復原及/或複新皮膚，尤其老化的皮膚；減少皮膚脆性；預防及/或逆轉糖胺聚多糖及/或膠原之損失；改良雌激素失調之影響；預防皮膚萎縮；預防、減少及/或處理色素沉著過度；最小化皮膚變色；改善皮膚色調、光澤、透明度及/或緊致度；預防、減少及/或改良皮膚下垂；改善皮膚堅實度、飽滿度、柔順度及/或柔軟度；改善原膠原及/或膠原產生；改善皮膚紋理及/或促進再組織化；改善皮膚屏障修復及/或功能；改善皮膚輪廓之外觀；恢復皮膚光澤及/或亮度；最小化疲勞及/或應激之皮膚跡象；抵抗環境應激；補充皮膚中因老化及/或停經而減少的成份；改善皮膚細胞間之流通；增加細胞增殖及/或倍增；增加因老化及/或停經而減少的皮膚細胞代謝；延緩細胞老化；改善皮膚保濕度；增強皮膚厚度；增加皮膚彈性及/或回彈性；增強表皮脫落；改善微循環；減少及/或預防橘皮組織形成；及其任何組合。

在又一實施例中，本發明方法用於使有需要的皮膚細胞解毒，該等皮膚細胞可包括(但不限於)歷經應激(例如自由基、UV暴露、環境及/或化學物質)或自其恢復之細胞；展示降低之蛋白質合成及/或自噬活性之細胞；或老化細胞。

在又一方法中，向有需要的黑色素細胞投與包括經取代胺基雜環胺甲醯基、猴耳環提取物、仙丹花提取物、杜莖山提取物、六月雪提取物、非洲茉莉提取物、亞襄提取物或任何組合之組合物以改善與黑色素相關之狀況。此方法尤其可用於處理由光老化及內因性老化引起之色素沉著不足。通常，狀況及/或美學外觀之改善係選自由下列組成之群：增加黑色素產生、使色素沉著不足之頭髮、皮膚、唇及/或指甲著色；均勻化或優化皮膚變色；提供非日光依賴性人類皮膚曬黑；在自然日光存在下加速曬黑；變黑、抵消由投與藥品引起之色素沉著不足或在活體內使頭髮再著色；或在活體內預防灰色(脫色)頭髮。

通常將該組合物每日一次、每日兩次或每日三次施用至皮膚、頭髮、指甲及/或唇且在又一實施例中施用至經歷降低之自噬活性之皮膚、頭髮、指甲及/或唇達達成期望結果所需之時長。處理方案可包含每日一次施用達至少一週、至少兩週、至少四週、至少八週或至少十二週。亦涵蓋慢性處理方案。

在特定實施例中，將WIPI-1激動劑提供於醫藥上、生理學上、化妝品上及皮膚病學上可接受之媒劑、稀釋劑或載劑中，其中該組合物係以有效改善皮膚之狀況及美學外觀之量局部施用至皮膚之受影響區域並使其保留在該受影響區域上。

將包含WIPI-1激動劑之組合物局部施用至「有需要的個體」意指個體有望受益於減少皮膚損傷或老化之可見跡象。在特定實施例中，將WIPI-1激動劑提供於醫藥上、生理學上、化妝品上及皮膚病學上可接受之媒劑、稀釋劑或載劑中，其中該組合物係以有效改善皮膚之狀況及美學外觀之量局部施用至皮膚之受影響區域並使其保留在該受影響區域上。

在一實施例中，用於處理細紋及皺紋之方法包含將包含WIPI-1激動劑之發明性組合物局部施用至有需要的個體之皮膚，例如，以足以減少該等細紋及/或皺紋之嚴重程度或預防或抑制新細紋及/或皺紋之形成之量及時間直接局部施用至該細紋及/或皺紋。可分別藉由(例如)目視檢查或藉由(例如)顯微鏡或電腦輔助量測皺紋形貌(例如，每單位皮膚面積之皺紋的數量、深度、長度、面積、體積及/或寬度)定性地或定量地評價組合物對細紋及皺紋之形成或外觀之影響。此實施例包括對手部、臂部、腿部、頸部、胸部及面部(包括前額)之皮膚上之皺紋之處理。

可預防性地採用本發明方法來對抗包括尚未表現皮膚老化跡象之患者、最常見年齡25歲以下個體中的老化。該方法亦可逆轉或處理如在年齡超過25歲之患者中常見之已經表現之老化跡象。

實例實例1 老化對自噬之影響 A.皮膚角質細胞中之自噬隨著年齡而下降

使用西方墨點法(Western blotting)來評價年輕與年老原代皮膚角質細胞中之自噬活性。藉由LC3含量之變化來量測自噬，即LC3-I轉化為脂質化形式LC3-II提供自噬活性之指示劑(J Pathol.，2010年6月；221(2)：117-124)。正常人類表皮角質細胞(HEK)係自平均年齡為23歲之三個年輕供體及平均年齡66歲之三個年老供體獲得。將HEKa保持於補充有HGSK(Cascade Biologics公司，S0015)之Epilife(Cascade Biologics公司，MEPI500CA)中並生長至約80%鋪滿。自溶解於含有62.5mM Tris-HCl(pH 6.8)、50mM DTT、2% SDS及10%甘油之緩衝液中之HEKa細胞獲得總蛋白。然後藉由凝膠電泳來解析蛋白質，轉移至穩定素-P膜(Millipore IPVH00010)，並用LC3之特異性抗血清(Cell Signaling Technology,4108S)、β-肌動蛋白(Sigma,A1978)實施免疫墨點法。用適當HRP偶聯二級抗體及ECL試劑(Millipore)來檢測信號，並Image J軟體(NIH，版本1.38x)進行定量。3個獨立實驗之平均結果匯總於下文表1中；所有值均在p<0.05時係統計學上顯著的。免疫墨點之定量揭示，年老供體中之LC3-II含量與年輕供體相比少32%。因此，可證實年老供體中之自噬活性與年輕供體相比有所降低。

B.自噬活性隨著UV暴露而下降

藉由西方墨點法來評價纖維母細胞在UVA暴露時及角質細胞在暴露於UVB輻照時之自噬活性。正常人類皮膚纖維母細胞(HDF)係生長於含有10%胎牛血清(Perbio,SH30070.03)、青黴素/鏈黴素(Mediatech,30-001-C1)、L-麩醯胺酸(Mediatech,25-005-CI)之DMEM(Mediatech；目錄編號：15-013-CV)中且正常人類表皮角質細胞(HEK)係生長於補充有HGSK(Cascade Biologics公司，S0015)之Epilife(Cascade Biologics公司，MEPI500CA)中。然後在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中輻照細胞：HDFa以1J/cm² UVA之劑量且HEK以20mJ/cm² UVB之劑量。用具有分別在365nm及305nm波長下發射之UVA源之UVM-28 EL系列UV燈來實施UVA及UVB輻照。用OPHIR UV計來測定通量。輻照後24小時，收穫細胞用以藉由西方墨點法實施蛋白質分析(如上文所述)。免疫墨點之定量揭示，用UVA輻照之纖維母細胞中之自噬活性與未經輻照細胞相比少60%且用UVB輻照之角質細胞中之自噬活性與未經輻照細胞相比少50%(表2)。因此，該等數據指示UV暴露導致皮膚纖維母細胞及角質細胞二者中之自噬活性顯著降低。所有值均在p<0.05時係統計學上顯著的。

C.WIPI-1隨著UV暴露而下降

藉由西方墨點法來評價皮膚細胞中、纖維母細胞在UVA暴露時及角質細胞在暴露於UVB輻照時之WIPI-1含量。正常人類皮膚纖維母細胞(HDF)係生長於含有10%胎牛血清(Perbio,SH30070.03)、青黴素/鏈黴素(Mediatech,30-001-C1)、L-麩醯胺酸(Mediatech,25-005-CI)之DMEM(Mediatech；目錄編號：15-013-CV)中且正常人類表皮角質細胞(HEK)係生長於補充有HGSK(Cascade Biologics公司，S0015)之Epilife(Cascade Biologics公司，MEPI500CA)中。在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中輻照細胞：HDFa以1J/cm² UVA之劑量且HEK以20mJ/cm² UVB之劑量。用具有分別在365nm及305nm波長下發射之UVA源之UVM-28 EL系列UV燈來實施UVA及UVB輻照。用OPHIR UV計來測定通量。輻照後24小時，使用來自Qiagen之RNeasy RNA提取套組(74106)來分離RNA。然後使用NanoDrop分光光度計ND 1000(Agilent Technologies)來測定RNA濃度。

然後使用來自AB(PN 4368814)之高容量cDNA套組以20μl總體積實施逆轉錄反應。製備含有2μl 10X TaqMan逆轉錄緩衝液、1.2μl dNTP混合物(100nm)、1.0μl 10X隨機六聚體、1μl核糖核酸酶抑制劑、1μl MultiScribe逆轉錄酶(50U/ml)、100ng RNA及用於補足最終20μl體積之不含核糖核酸酶抑制劑之水之逆轉錄混合物。在BIORAD MY CYCLER中將反應在25℃下培育10min，在45℃下培育45min且然後在95℃下培育5min。

隨後，使用Applied Biosystems通用型PCR混合母液(PN 4369016)來實施聚合酶鏈反應(PCR)。該混合物含有10μl Taqman通用型PCR混合液、1μl引子及探針混合物、2μl逆轉錄產物及7μl去離子水。所有探針、Taqman分析均係自Applied Biosystems購得，用於WIPI-1之Hs00215872_m1及人類GAPDH(PN 4352934)。在Stratagene Mx 3005P qPCR機器中實施之qPCR之溫度曲線係在50℃下保持2min並在95℃下保持10min達1個循環，然後在95℃下保持15sec，並在60℃下保持1min達40個循環。

輻照後24小時，使用GAPDH作為內部對照藉由RT-qPCR來檢驗給予1J/cm2 UVA之纖維母細胞及給予20mJ/cm2 UVA之角質細胞之WIPI-1之表現程度。與未經輻照細胞相比，經輻照細胞中之WIPI-1含量顯著更低。下文表3顯示，用UVA輻照之纖維母細胞中之WIPI-1表現與未經輻照細胞相比少約25%且用UVB輻照之角質細胞中之WIPI-1表現與未經輻照細胞相比少約50%。因此，UV暴露導致WIPI-1表現顯著降低，WIPI-1表現在皮膚纖維母細胞及角質細胞二者中之自噬活性中發揮重要作用。所有值均在p<0.05時係統計學上顯著的。

實例2-例示性HPLC方案

通常藉由高效液相層析來表徵提取物。將約5mg/mL之樣品量分散於25/75 MeOH/H₂O中並實施超音波處理。在Zorbax SBC-18管柱(7.5cm×4.6mm，粒徑為3.5μm)上實施表徵並使用260nm，300nm及360nm二極體陣列UV吸光度來達成檢測，其中HPLC圖上之線以上升順序繪示且260nm位於底部。在一實施例中，在實質分離中，化合物之經提取組合物展示與本文所繪示之HPLC曲線實質上相似之HPLC曲線。

操作條件係流速1.5ml/min；溫度，40℃；樣品注射體積，20μL；及運行時間，19分鐘。所用流動相梯度如下：

實例3.提取物之製備 A.猴耳環提取物之製備(例示性)

可搜集一定量(g)之經切碎猴耳環莖及葉並微粉化。隨後，可使用業內一般技術人員已知之方法在100℃下使用8-10x微粉化之花之重量之水實施回流提取。可重複此步驟。可使用業內一般技術人員已知之方法將所得提取物過濾並濃縮，此後可在業內一般技術人員已知之適當條件下對提取物實施真空蒸餾。隨後，可將提取物與適宜量之糊精混合並實施噴霧乾燥。

B.亞襄提取物之製備.

可使用如業內熟知之水性有機溶劑提取方法自天然原料提取亞襄。下文陳述該兩種提取方法。

1.藉由乙醇提取亞襄

藉由使用乙醇提取方案提取亞襄植物之藤來獲得提取物。簡言之，首先將戴爾亞襄之藤手動研磨成小粒子，得到約250克/燒瓶粉末(2個燒瓶)。然後用80%乙醇(2×2,000ml/燒瓶)提取經研磨粉末。在過濾並真空蒸發後，將全部經濃縮提取物凍乾，得到50克乙醇提取物。去除單寧酸(Tannin)，得到46.04克亞襄醇提取物。

2.藉由己烷提取亞襄

藉由使用己烷提取方案提取亞襄植物之藤來獲得提取物。簡言之，首先將亞襄之藤手動研磨成小粒子，得到約250克/燒瓶粉末(2個燒瓶)。然後用100%己烷(2×2,000ml/燒瓶)提取經研磨粉末。在過濾並真空蒸發後，藉由熱空氣烘箱在40℃下乾燥全部經濃縮提取物，得到0.61克亞襄己醇提取物。

如在餘下的說明書中所說明，尤其在按比例放大至更大體積之製造期間可對此提取方法進行修改及調整。

亞襄水相提取之代表性HPLC示蹤繪示於圖2中。

C.仙丹花之製備

仙丹花提取物之製備大體闡述於2010年6月30申請之美國專利申請案第13/158,947號(其出於所有目的以全文引用方式併入)及2011年12月13申請之美國專利申請案第13/324,150號(其出於所有目的以全文引用方式併入)中。藉由使用乙醇提取、隨後用己烷再次提取來提取乾燥經切碎仙丹花植物以獲得提取物。簡言之，首先將經切碎仙丹花植物手動研磨成小粒子，得到約250克粉末。然後用50%乙醇提取經研磨粉末。在過濾並真空蒸發後，用水稀釋全部經濃縮提取物，離心並過濾。然後用己烷提取液體3次，棄除己烷上層並將水層凍乾，得到約90克提取物。

代表性仙丹花提取物之HPLC示蹤參見圖3。

D.六月雪之製備

六月雪提取物之製備大體闡述於2012年12月11日申請之PCT專利申請案第PCT/US12/68858號草案(其中Qian Zheng作為主發明者)中，其出於所有目的以全文引用方式併入。

在室溫下用1000ml EtOH/H₂O(50：50,v/v)使250g來源於六月雪葉及/或莖之乾燥粉末狀物質滲濾24小時。重複此滲濾2次且然後藉由旋轉蒸發儀在40℃至50℃及真空下將EtOH/H₂O提取溶液濃縮至150 ml或蒸餾結束(取決於首先發生者)。

然後用純淨水將經濃縮溶液稀釋至1500ml體積並實施超音波處理20分鐘以產生水性懸浮液。將懸浮液在4℃下靜置12h且然後離心。然後將上清液轉移至分液漏斗中，於其中每次用500ml己烷實施單獨提取。將己烷溶劑再循環，並棄除己烷提取物。

然後將炭(相對於總乾物質含量為10重量%)添加至自己烷提取得到之水相中並攪拌1小時。然後過濾溶液並在40℃至50℃及真空下濃縮以將溶液濃度調節至其乾物質的5%(w/v)。然後使經調節溶液通過Diaion HP-20管柱(該乾重的20倍)並用以下進行連續洗滌：1)H₂O：2倍Diaion HP-20管柱體積(100g HP-20等於210ml管柱體積)；2)20% EtOH水溶液：2倍Diaion HP-20管柱體積；3)50% EtOH水溶液：2倍Diaion HP-20管柱體積；4)95% EtOH水溶液：3倍Diaion HP-20管柱體積。

分別將洗滌物1至4之洗脫液濃縮至乾燥以獲得餾分1至4。

代表性六月雪提取物之HPLC示蹤參見圖4。

E.杜莖山之製備

杜莖山提取物之製備大體闡述於2012年12月11日申請之美國專利申請案第13/710,585號(其中Siming Chen作為主發明者)中，其出於所有目的以全文引用方式併入。

搜集250g經切碎杜莖山花且然後在電子烘箱中在60℃下乾燥2或3天。然後將經乾燥之花添加至存於容器中之1L 50%含水乙醇(EtOHIH₂O 50-50 v/v；3×4體積)中並藉由在37℃下以150rpm震盪該容器12h進行提取。重複此提取3次以達成3L總提取物。然後使用旋轉蒸發儀在40℃至50℃之溫度下對總提取物實施真空濃縮直至體積降低至約150ml。然後用純淨水將經濃縮餾分稀釋至1500ml並使其在4℃下靜置12h(或更久)且然後離心以去除任一殘留物。在分液漏斗中用750ml己烷處理1500ml現在澄清之溶液2次並棄除有機層。藉由量取150ml均勻溶液樣品並將該樣品凍乾以證實剩餘水性均勻溶液之乾含量。稱量所得粉末並用於計算均勻溶液中乾物質之總量。然後將所得粉末再溶解於水(約100ml至150ml)中並與該均勻溶液彙集。然後將10重量%炭添加至該均勻溶液中，對於約1500ml溶液而言約17g炭。然後在50℃下將溶液攪拌1小時且然後在濾紙(類型，製造商)上過濾並重複該步驟。隨後，藉由使用經水飽和之正丁醇之液/液提取對現在澄清之溶液實施分餾。藉由在分液漏斗中向丁醇中添加相同體積之水來製備飽和丁醇，在混合後，收集有機上層並用於液/液提取透明溶液。對於1500ml透明溶液而言製備約2250ml經水飽和之丁醇。將經水飽和之丁醇分成三份(各750ml)並在分液漏斗中使用每一者來處理該透明溶液3次。收集每次流經分液漏斗得到之有機層(丁醇提取物)及水層並單獨地彙集。首先，將等體積之水添加至經彙集丁醇提取物中並在旋轉蒸發儀中在真空下濃縮該溶液。當蒸餾停止時，添加等體積之水並重複濃縮。重複濃縮第三時間並將所得溶液凍乾(第一經純化提取物)。其次，藉由旋轉蒸發儀在真空下濃縮每次流經分液漏斗得到之水層以去除丁醇(共沸物沸點小於100℃，浴溫度60℃)。當蒸餾停止時，將水溶液凍乾(第二經純化提取物)。然後將第一提取物及第二提取物合併並稱量。

提取方案2(例示性)

可搜集一定量(g)之經切碎杜莖山花並微粉化。隨後，可使用業內一般技術人員已知之方法在100℃下使用8-10x重量經微粉化之花之水實施回流提取。可重複此步驟。可使用業內一般技術人員已知之方法將所得提取物過濾並濃縮，此後可在業內一般技術人員已知之適當條件下對提取物實施真空蒸餾。隨後，可將提取物與適宜量之糊精混合並實施噴霧乾燥。

代表性霸王櫚(Medemia nobilis)提取物之HPLC示蹤參見圖5。

F.非洲茉莉組織培養物之製備

非洲茉莉提取物之製備大體闡述於2012年12月11日申請之PCT專利申請案第PCT/US12/68866號中(其中Raaj Khusial作為主發明者)，其出於所有目的以全文引用方式併入。

切除非洲茉莉之分生組織並轉移至固體培養基中並繁殖。使所得癒傷組織生長至特定重量且然後轉移至存於生物反應器中之液體培養基中，其中使細胞在期望條件下生長直至達成期望密度。然後將細胞培養物均勻化並過濾以去除任何固體。將所得提取物凍乾。

在餘下的說明書中所說明，尤其在按比例放大至更大體積之製造期間可對此細胞培養物/提取方法進行修改及調整。

代表性非洲茉莉提取物之HPLC示蹤參見圖6。

實例4--WIPI-1篩選

測試多種植物提取物及合成化合物上調WIPI-1之能力。在含有適當培養基之經組織培養物處理之96孔板中培養正常人類皮膚纖維母細胞或角質細胞。在適當媒劑(水/乙醇/DMSO)中製備活性物之儲備溶液。在具有10% CO₂之加濕37℃培育箱中用稀釋於生長培養基中之測試材料或各別媒劑對照處理細胞24小時。提供以給定植物提取物之乾重(此意指在已去除揮發性提取溶劑後提取物之重量)計之每一提取物之濃度。在培育後，自每一板去除生長培養基並向各孔中添加100μL溶胞緩衝液並將其放置於具有10% CO₂之37℃培育箱中達30分鐘。在培育結束時，將細胞收集於冷凍機板中並放置於-80℃冷凍機中直至分析。根據製造商說明書(Affymetrix,CA)使用採用分支DNA (branched DNA)技術之Panomics Quantigene多倍儀分析來分析處理後mRNA之變化。藉由比較測試結果與對照來計算WIPI-1之mRNA之增加(上調)%。將上調%轉化成量表分數：0：0至20%；+：21%至40%；++：41%至60%；+++：61%至80%；++++：>80%。

如上文表5中所顯示，發現有前景之WIPI-1激動劑中之每一者皆上調纖維母細胞或角質細胞中之WIPI-1。具體而言，六月雪、杜莖山及亞襄上調纖維母細胞中之WIPI-1。0.1%濃度之杜莖山及亞襄二者均使WIPI-1上調大於60%。類似物1、非洲茉莉、猴耳環及仙丹花上調角質細胞中之WIPI-1。

實例4 例示性組合物 A.例示性抗橘皮組織組合物

用於局部施用至展示老化跡象或處於展示老化跡象之風險之皮膚之包含WIPI-1激動劑之化妝品組合物提供於表7中。

B.例示性抗老化面部化妝品組合物

用於局部施用至展示因自噬活性品質降低所致之老化跡象或處於展示該老化跡象之風險之面部區域之包含WIPI-1激動劑之化妝品組合物提供於表8中。

認為該等抗老化組合物有效處理、逆轉、改良及/或預防老化跡象，特定而言，認為該等組合物減少皮膚中之皺紋、細紋及下垂之外觀。將表7及表8之組合物施用至需要處理之皮膚(此意指需要抗老化益處之皮膚)。可將該等化妝品組合物直接施用至需要處理之皮膚。

將該等化妝品組合物每日2次或3次施用至老化皮膚達達成期望抗老化或皮膚煥發結果所需之時長，處理方案可包含每日施用達至少1週、至少2週、至少4週、至少8週或至少12週。另一選擇為，例示性化妝品組合物可用於老化或變色皮膚之慢性處理。

熟習此項技術者應瞭解，可在不背離本發明之精神及範圍之情況下對本發明進行多種修改及調整。本文所述之特定實施例僅以實例方式提供，且本發明僅受限於各項隨附申請專利範圍以及該等申請專利範圍所授權之等效物之全部範圍。

Claims

一種改善因皮膚細胞內之自噬活性降低而受老化影響之皮膚之美學外觀之方法，其包括對該皮膚局部施用有效量之存於化妝品上可接受之媒劑中之至少一種WIPI-1激動劑達足以達成改善該皮膚外觀之時間。
如請求項1之方法，其中老化係因實足年齡性、荷爾蒙性或環境影響所致。
如請求項1之方法，其中該美學外觀之改善係選自由下列組成之群：(a)處理、減少及/或預防細紋或皺紋；(b)減小皮膚毛孔大小；(c)改善皮膚厚度、飽滿度及/或緊致度；(d)改善皮膚柔順度及/或柔軟度；(e)改善皮膚色調、光彩(radiance)及/或透明度；(f)改善原膠原及/或膠原產生；(g)改善彈性蛋白之保持及重塑；(h)改善皮膚紋理及/或促進再組織化(re-texturization)；(i)改善皮膚屏障修復及/或功能；(j)改善皮膚輪廓之外觀；(k)恢復皮膚光澤及/或亮度；(l)補充皮膚中必需之營養素及/或成份；(m)改善因老化及/或停經而變差之皮膚外觀；(n)改善皮膚保濕度及/或含水量；(o)增加皮膚彈性及/或彈力及/或預防損失皮膚彈性及/或彈力； (p)處理、減少及/或預防皮膚下垂；(q)處理、減少及/或預防皮膚變色；及其任一組合。
如請求項1之方法，其中該美學外觀之改善包括使該皮膚解毒。
如請求項1之方法，其中該皮膚係敏感性皮膚。
如請求項1之方法，其中該組合物係每日至少1次局部施用達至少1週。
如請求項1之方法，其中該WIPI-1激動劑之含量佔該組合物總重量之約0.0001重量%至約90重量%。
如請求項7之方法，其中該WIPI-1激動劑之含量佔該組合物總重量之約0.01重量%至約10重量%。
如請求項1之方法，其中該WIPI-1激動劑包含：(a)；(b)猴耳環(Archidendron clypearia)提取物；(c)仙丹花(Ixora chinensis)提取物；(d)杜莖山(Maesa japonica)提取物；(e)六月雪(Serissa japonica)提取物；(f)非洲茉莉(Stephanotis jasminoides)提取物；(g)亞襄(Tiliacora triandra)提取物；或其任何組合。
如請求項9之方法，其中該WIPI-1激動劑不為亞襄提取物。
如請求項1之方法，其中該皮膚之該改善係因皮膚細胞內之自噬活性之增加所致。
如請求項11之方法，其中該皮膚細胞內之自噬活性之增加約20%。
如請求項1之方法，其中皮膚細胞包含纖維母細胞或角質細胞。
如請求項1之方法，其中該WIPI-1激動劑係與類視色素組合。
一種改善其組成皮膚細胞內之自噬活性降低之皮膚外觀之方法，其包括對該皮膚局部施用有效量之存於化妝品上可接受之媒劑中之至少一種WIPI-1激動劑達足以調節WIPI-1介導之自噬活性之時間。
如請求項15之方法，其中該等組成皮膚細胞包含纖維母細胞或角質細胞。
如請求項15之方法，其中該WIPI-1激動劑包含：(a)；(b)猴耳環提取物；(c)仙丹花提取物；(d)杜莖山提取物；(e)六月雪提取物；(f)非洲茉莉提取物；(g)亞襄提取物；或其任何組合。
如請求項15之方法，其中該WIPI-1激動劑之含量佔該組合物總重量之約0.01重量%至約10重量%。
一種篩選可用於改善皮膚美學外觀之活性劑之方法，其包括分析候選物質上調WIPI-1表現之能力。
一種處理皮膚之方法，其包括對該有需要的皮膚區域局部施用有效量之上調WIPI-1之活性劑，其中藉由量測與該活性劑接觸之細胞中編碼WIPI-1之mRNA之含量之分析法來測定該活性劑上調WIPI-1之能力。