TW201609794A - 編碼單鏈ｉｌ－１２之核酸、多肽及彼等之用途 - Google Patents

Abstract

本發明關於新穎單鏈介白素-12多肽。本發明亦關於編碼該單鏈介白素-12多肽之經分離之核酸、包含彼等之載體及細胞、及彼等之用途，特別是使用本發明之單鏈IL-12多肽、多核苷酸、載體及細胞以用於增強免疫系統功能(例如作為疫苗佐劑)及用於治療感染及癌症之方法。

Description

編碼單鏈IL-12之核酸、多肽及彼等之用途

與本申請案一併送件之序列表電子檔(檔名：SequenceListing.txt；檔案大小：127,325位元組；創建日期：2013年12月16日)係全部以引用方式併入本文中。

本發明提供編碼單鏈介白素介白素-12融合蛋白、包含彼等之載體、由彼等所編碼之多肽、及彼等於治療應用之用途。

介白素-12(IL-12)係一種發炎細胞介素，其由免疫系統中的各種細胞於反應感染時所製造，該些細胞包括吞噬細胞、B細胞及經活化之樹突細胞(Colombo and Trinchieri(2002),Cytokine & Growth Factor Reviews,13：155-168)。IL-12在調介免疫系統的先天性及後天性防禦之交互作用、作用於T細胞及自然殺手(NK)細胞、增強胞毒型淋巴球的增生和活性及其他發炎性細胞介素、特別是干擾素-γ(IFN-γ)之製造，扮演關鍵角色。

IL-12已於人體臨床試驗中測試作為免疫治療 劑以供治療各種不同癌症之用(Atkins et al.(1997),Clin.Cancer Res.,3：409-17；Gollob et al.(2000),Clin.Cancer Res.,6：1678-92；Hurteau et al.(2001),Gynecol.Oncol.,82：7-10；以及Youssoufian,et al.(2013)Surgical Oncology Clinics of North America,22(4)：885-901)，包括腎癌、結腸癌、及卵巢癌、黑色素瘤及T細胞淋巴瘤，以及作為癌症疫苗之佐劑(Lee et al.(2001),J.Clin.Oncol.19：3836-47)。然而，當以重組性蛋白質全身性投與時，IL-12係有毒性的。Trinchieri,Adv.Immunol.1998；70：83-243。為了最大化IL-12的抗腫瘤效果同時最小化其全身性毒性，已提出IL-12基因治療方法，使該細胞介素在腫瘤位點製造，藉此達到高局部量之IL-12且血清濃度低。Qian et al.,Cell Research(2006)16：182-188；美國專利公開20130195800。

IL-12係一種異二聚體分子，由雙硫鍵共價連 接α鏈(p35次單元)及β鏈(p40次單元)所構成，以形成具生物活性之70kDa二聚體。同步表現二個次單元為製造生物活性異二聚體所必須的。已使用雙順反子(bicistronic)載體達成重組IL-12表現，該雙順反子載體含有p40及p35次單元，彼等以IRES(內核糖體進入位點(internal ribosome entry site)序列分隔，以使兩個次單元均自單一載體獨立表現。然而，使用IRES序列會損害蛋白質表現。Mizuguchi et al.Mol Ther(2000)；1：376-382。 再者，p40及p35次單元的不等量表現，會導致同質二聚體(homodimeric)蛋白質(例如p40-p40)的形成，其會對IL-12訊息傳遞具有抑制效果。Gillessen et al.Eur.J.Immunol.1995 Jan；25(1)：200-6。

作為IL-12次單元雙順反子表現之替代物，已 藉由以(Gly4Ser)3或Gly6Ser連接子結合p40及p35次單元而製造功能性單鏈IL-12融合蛋白。Lieschke et al.,(1997),Nature Biotechnology 15,35-40；Lode et al.,(1998),PNAS 95,2475-2480。然而，較長之連接子序列會干擾構築用於基因療法之病毒載體的能力，且會增加誘發致免疫性反應(例如藉由產生抗單鏈IL-12抗體)的可能性。

因此，本技術領域中仍有用於增強免疫系統功 能(例如作為疫苗佐劑)及用於治療感染及癌症的經改善之單鏈IL-12融合蛋白及編碼此等融合蛋白之核酸的需求。

本發明關於新穎單鏈IL-12(scIL-12)多肽，其 中，若有連接子，該連接子序列長度藉由將IL-12 p35多肽序列插入IL-12 p40多肽序列內而最小化，同時保有至少一種IL-12生物活性。

本發明關於scIL-12多肽，其從N端至C端包含：(i)第一IL-12 p40結構域(p40N)， (ii)隨意之第一胜肽連接子，(iii)IL-12 p35結構域，(iv)隨意第二胜肽連接子，及(v)第二IL-12 p40結構域(p40C)。

在較佳實施態樣中，本發明之scIL-12多肽保有至少一種IL-12之生物活性。

本發明另關於編碼如本文所述之scIL-12多肽之多核苷酸，且關於包含該scIL-12多核苷酸之載體。

本發明亦關於變異體scIL-12多肽，其與揭示在本文中之scIL-12多肽具有80%、85%、90%、或95%之一致性(identity)。

本發明亦關於以如本文所述之scIL-12多核苷酸或載體轉形或轉染之細胞或非人有機體。

本發明亦關於醫藥或診斷組成物，其包含如本文所述之scIL-12多肽、多核苷酸、載體、或細胞作為活性劑。

本發明亦關於使用本發明之scIL-12多肽、多核苷酸、載體及細胞方法以用於增強免疫系統功能(例如作為疫苗佐劑)及用於治療感染及癌症之方法。

發明詳述

本發明有利地提供編碼單鏈IL-12(scIL-12)多肽之經分離之多核苷酸。本發明之多核苷酸及多肽可用於增強宿主免疫反應(例如作為疫苗佐劑)及用於治療增生性 失調(例如癌症)、感染性疾病、及免疫系統失調之方法。

本發明之各種態樣將於下列有關本發明之核 酸、多肽、載體、組成物、抗體及使用方法之章節中詳述。組織成各種章節係意欲促進理解本發明，而並非意欲限制本發明。

定義

該下列界定之用語係於整個說明書中使用者，且應有助於理解本發明之範圍及實施。

在特定實施態樣中，用語“約”或“近似”意指在給定值或範圍的20%內、較佳為10%內、更佳為5%內、且再更佳為1%內。

用語“實質上不含”意指：當在組成物中至少約75重量%的蛋白質、DNA、載體(取決於A及B所屬之物質分類)為“A”時，包含“A”(其中“A”係單一蛋白質、DNA分子、載體、重組宿主細胞等等)之組成物係實質上不含“B”(其中“B”包含一或多種污染蛋白質、DNA分子、載體等等)。較佳的是，“A”占組成物中A+B物質的至少約90重量%、最佳為至少約99重量%。亦較佳的是，實質上不含污染物之組成物，僅含單一分子量物質，該物質具有活性或所關注之該物質特性。

以本發明之目的而言，用語“經分離”代表已自生物性物質(細胞、核酸或蛋白質)之原始環境(在該環境中該物質係天然存在)移除之物質。舉例來說，以天然狀態 存在於植物或動物體內之多核苷酸係未經分離，然而與該多核苷酸天然存在之環境中的鄰近核酸分開之相同多核苷酸被認為是“經分離”的。用語“經純化”不要求該物質以展現絕對純粹、排除其他化合物存在之形式存在。其反而為相對性定義。

起始物或天然物質純化後，多核苷酸是在“經 純化”狀態到至少一個數量級、較佳為2或3、且較佳為4或5個數量級。

如本文所使用，用語“實質上純的”描述已經與 其天然污染物分離的多肽或其他材料。典型上，當至少約60至75%的樣品展現單一的多肽骨架時，單體多肽係實質上純的。輕微變異體或化學修飾典型上共有相同的多肽序列。通常實質上純的多肽占多肽樣品中超過約85至90%，且較佳為會超過約99%的純度。通常，純度係在聚丙醯胺凝膠上測量，藉由染色判定均勻性。或者，為某些目的，高解析度是必要的，並且使用HPLC或用於純化的類似手段。為大多數目的，可使用簡單的層析管柱或聚丙醯胺凝膠測定純度。

用語“實質上不含天然上相關的(naturally- associated)宿主細胞成分”描述的多肽或其他材料，其與在彼之天然宿主細胞狀態中伴隨著彼的天然污染物分離。因此，經化學合成或於不同於該多肽天然來源之宿主細胞的細胞系統中所合成的多肽，會不含該多肽天然上相關的宿主細胞成分。

用語“核酸”或“多核苷酸”在本文中係交替使 用，係指包含共價連接稱為核苷酸之次單元之聚合化合物。核酸包括聚核糖核酸(RNA)及聚去氧核糖核酸(DNA)，二者可為單股或雙股。DNA包括但不限於cDNA、基因體DNA、質體DNA、合成DNA、及半合成DNA。DNA可為線性、環狀、或超螺旋(supercoiled)。

“核酸分子”係指呈單股形式或雙股螺旋之核糖 核苷(腺苷、鳥苷、尿苷、或胞苷；“RNA分子”)或去氧核糖核苷(去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷、或去氧胞苷；“DNA分子”)之磷酸酯聚合型式，或彼等之任何磷酯(phosphoester)類似物，諸如磷硫代酯(phosphorothioate)及硫酯(thioester)。雙股DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA螺旋也是可能的。用語核酸分子、且特別是DNA或RNA分子，僅指分子之一級及二級結構，且不限彼於任何特定的三級形式。因此，此用語包括但不限於雙股DNA，特別是線性或環狀DNA分子(例如限制片段)、質體、及染色體中所發現者。在討論特定雙股DNA分子之結構時，可能根據通常習慣之僅給予該DNA之非轉錄股之5’至3’方向之序列(即具有和mRNA同源之序列之股)以描述此處之序列。“重組DNA分子”係指經歷分子生物操縱之DNA分子。

用語“片段”將被理解為意指相對於參照核酸長 度經減少之核苷酸序列，且除共同部分以外包含與該參照核酸一致之核苷酸序列。根據本發明，當適當時，此核酸 片段可被包括在更大之多核苷酸中，該核酸片段為該多核苷酸之組成分。該等片段包含根據本發明之核酸之至少6至1500個連續核苷酸長度之寡核苷酸，或由該等寡核苷酸組成。

如本文中所使用，“經分離之核酸片段”係指單 股或雙股RNA或DNA之聚合物，該聚合物可隨意含有合成、非天然或經改變之核苷酸鹼基。呈DNA聚合物形式之經分離之核酸片段可包含一或多個cDNA、基因體DNA或合成DNA之區段。

“基因”係指編碼RNA轉錄物或多肽之核苷酸組 合，且包括cDNA及基因體DNA核酸。“基因”亦指表現特定蛋白質或多肽之核酸片段，包括在該編碼序列之前(5’非編碼序列)及之後(3’非編碼序列)之調節序列。“天然基因”係指在天然中發現具有其本身之調節序列之基因。 “嵌合基因”係指非天然基因之任何基因，其包含不在天然中一起發現之調節及/或編碼序列。因此，嵌合基因可包含源自不同來源之調節序列及編碼序列，或源自相同來源但以不同於在天然中發現之方式排列之調節序列及編碼序列。嵌合基因可能包含源自不同來源之編碼序列及/或源自不同來源之調節序列。“內源性基因”係指位於有機體之基因體中之天然位置之天然基因。“外來”基因或“異源性”基因係指正常不在宿主有機體內發現、但藉由基因轉移被導入宿主有機體內之基因。外來基因可包含被插入非天然有機體內之天然基因，或嵌合基因。“轉基因(transgene)” 係經由轉形程序被導入基因體內之基因。

“異源性”DNA係指非天然存在於細胞內或細胞 內之染色體部位之DNA。較佳的是，異源性DNA包括對細胞而言為外來之基因。

用語“基因體”包括染色體DNA或RNA，還包 括粒線體、葉綠體及病毒DNA或RNA。

當單股形式之核酸分子(諸如cDNA、基因體 DNA、或RNA)可在適當之溫度及溶液離子強度之條件下與其他核酸分子黏合(anneal)時，該核酸分子“可雜交”至另一核酸分子(見下文Sambrook et al.,1989)。雜交及清洗條件係廣為周知，並於Sambrook et al.in Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989)中舉例說明，特別是其中的第11章及表11.1(以引用方式併入本文中)。溫度及離子強度之條件決定雜交之“嚴苛度(stringency)”。

嚴苛度條件可經調整以篩選中度類似之片段 (諸如來自相關性遙遠之有機體之同源性序列)至高度類似之片段(諸如源自密切相關之有機體複製功能性酵素之基因)。以同源性核酸之初步篩選而言，可使用對應T_m為55℃之低嚴苛度雜交條件，例如5x SSC、0.1% SDS、0.25%乳及不含甲醯胺；或30%甲醯胺、5x SSC、0.5% SDS。中度嚴苛度雜交條件對應較高之T_m，例如40%甲醯胺及5x或6x SSC。高度嚴苛度雜交條件對應最高之T_m， 例如50%甲醯胺、5x或6x SSC。

雜交要求二個核酸必須含有互補序列，但是取 決於雜交嚴苛度，鹼基之間可能有錯誤配對之情形。用語“互補”係用來描述核苷酸鹼基之間彼此能夠雜交之關係。 舉例來說，以DNA而言，腺嘌呤係與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶係與鳥嘌呤互補。因此，本發明亦包括與本文中所揭示或使用之完整序列互補之經分離之核酸片段，以及該些實質上類似之核酸序列。

在本發明之特定實施態樣中，多核苷酸係藉由 採用雜交條件加以偵測，該等雜交條件包含於Tm為55℃之雜交步驟及利用如上述之條件。在某些實施態樣中，該Tm係60℃、63℃、或65℃。

雜交後之清洗亦決定嚴苛度之條件。在某些實 施態樣中，雜交條件使用一系列清洗步驟，一開始在室溫下以6X SSC、0.5% SDS清洗15分鐘(min)，接著在45℃下以2X SSC、0.5% SDS重複清洗30分鐘，再於50℃下以0.2X SSC、0.5% SDS重複清洗30分鐘兩次。較嚴苛條件組使用較高之溫度，其中清洗步驟與上述相同，除了最後二次以0.2X SSC、0.5% SDS清洗30分鐘之溫度增加至60℃。高度嚴苛條件組使用的是最後二次在65℃下以0.1X SSC、0.1% SDS清洗。

核酸雜交之適當嚴苛度取決於該等核酸之長度 及互補之程度，這些是該領域眾所周知之變數。二個核苷酸序列之間的類似性或同源性程度越高，具有該些序列之 核酸的雜交物具有越高之T_m值。核酸雜交之相對穩定性(對應較高之T_m)依下列順序遞減：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。以長度超過100個核苷酸之雜交物而言，計算T_m之方程式已被推衍出(見同上文之Sambrook et al.,9.50-0.51)。以較短核酸(即寡核苷酸)之雜交而言，錯誤配對之位置更顯重要，且寡核苷酸之長度決定彼之特異性(見同上文之Sambrook et al.,11.7-11.8)。

當相對於完全缺少特異性，雜交的發生較具選 擇性時，雜交之選擇性會存在。典型上，當在一段至少約14/25核苷酸有至少約55%同源性、較佳為至少約65%、更佳為至少約75%、且最佳為至少約90%時，會發生選擇性雜交。見Kanehisa,M.(1984),Nucleic Acids Res 12：203-213，其以引用方式併入本文中。嚴苛雜交條件典型上包括鹽類濃度少於約1M、更多時為通常少於約500mM，且較佳為少於約200mM。溫度條件典型上大於20℃、更多時為通常大於約30℃，且較佳為超過約37℃。 作為可顯著影響雜交嚴苛度之其他因子，其他尚包括互補股之鹼基組成及大小、有機溶劑的存在及鹼基錯誤配對程度，參數之組合較任一者之絕對量度重要。

在本發明之特定實施態樣中，多核苷酸係藉由 採用雜交條件加以偵測，該等條件包含在低於500mM的鹽及至少37℃下之雜交步驟，及在至少63℃之溫度下使用2X SSPE之清洗步驟。在某些實施態樣中，該等雜交條件包含低於200mM的鹽及至少37℃下之雜交步驟。在另 一實施態樣中，該等雜交條件包含2X SSPE及在63℃下之雜交及清洗步驟。

在一個實施態樣中，可雜交之核酸之長度係至 少約10個核苷酸。較佳地，可雜交之核酸之最短長度係至少約15個核苷酸；較佳為至少約20個核苷酸；且更佳為長度至少30個核苷酸。另外，熟悉本技術者將瞭解該溫度及清洗溶液鹽濃度可根據諸如探針長度之因素而視需要調整。

用語“探針”係指可與互補性單股標的核酸鹼基 配對以形成雙股分子之單股核酸分子。

如本文中所使用，用語“寡核苷酸”係指可與基 因體DNA分子、cDNA分子、質體DNA或mRNA分子雜交之核酸，通常為至少18個核苷酸。寡核苷酸可以例如³²P-核苷酸或已共價共軛標記(諸如生物素)之核苷酸而標示。經標示之寡核苷酸可被用來作為探針以偵測核酸之存在。寡核苷酸(其一或二者可經標示)可被用來作為PCR引子，以用於選殖(clone)核酸之全長或片段，或用於偵測核酸之存在。寡核苷酸亦可被用來與DNA分子形成三螺旋體。通常，寡核苷酸係經合成製備，較佳地在核酸合成儀上合成製備。因此，寡核苷酸可以非天然存在之磷酯鍵類似物(諸如硫酯鍵等)而製備。

“引子”係指與標靶核酸序列雜交以產生雙股核 酸區之寡核苷酸，該雙股核酸區可在適當之條件下作為DNA合成之起始點。該等引子可被用於聚合酶連鎖反 應。

“聚合酶連鎖反應”之縮寫為PCR，係指經酵素 之作用擴增特定核酸序列之試管內方法。PCR涉及溫度周期之重複循環，每個周期包含三個階段：使模板核酸變性以分開標的分子之股、使單股PCR寡核苷酸引子與模板核酸黏合、及藉由DNA聚合酶使黏合引子延伸。PCR提供檢測標的分子存在與否，以及在定量或半定量條件下測定該標的分子在核酸起始池內之相對量之方法。

“反轉錄聚合酶連鎖反應”之縮寫為RT-PCR， 意指經酵素之作用自RNA分子產製標的cDNA分子，接著如上述之經酵素之作用擴增在該標的cDNA分子內之特定核酸序列之試管內方法。RT-PCR亦提供檢測標的分子存在與否，以及在定量或半定量條件下測定該標的分子在核酸起始池內之相對量之方法。

DNA“編碼序列”係指當被置於適當調節序列之 控制下在細胞內、試管內(in vitro)或活體內(in vivo)被轉錄及轉譯成多肽之雙股DNA序列。“適當之調節序列”係指位於編碼序列上游(5’非編碼序列)、編碼序列之內或編碼序列下游(3’非編碼序列)之核苷酸序列，該序列影響該相關編碼序列之轉錄、RNA加工或穩定性、或轉譯。調節序列可包括而未限於啟動子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化辨識序列、RNA加工位點、效應子結合位點(effector binding site)及莖環(stem-loop)結構。編碼序列之邊界由在5’(胺基)端之起始密碼子及在3’(羧基)端之轉譯 終止密碼子決定。編碼序列可包括但不限於原核序列、來自mRNA之cDNA、基因體DNA序列及甚至合成性DNA序列。若該編碼序列係意欲用於真核細胞內表現，聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列通常將位在該編碼序列之3’端。

“開放閱讀框”之縮寫為ORF，且意指一段核酸 序列(不論是DNA、cDNA或RNA)，其包含轉譯起始信號或起始密碼子(諸如ATG或AUG)及終止密碼子，且可能可被轉譯成多肽序列。

本文中所使用之用語“頭對頭”描述二個多核苷 酸序列彼此之關係的方向性。當一個多核苷酸之編碼股的5’端係與另一多核苷酸之編碼股的5’端相鄰，該二個多核苷酸係以頭對頭之方向性排列，藉以使各多核苷酸之轉錄方向朝著遠離另一多核苷酸之5’端前進。用語“頭對頭”可簡寫為(5’)-對-(5’)，亦可以符號(←→)或(3’←5’5’→3’)表示。

本文中所使用之用語“尾對尾”描述二個多核苷 酸序列彼此之關係的方向性。當一個多核苷酸之編碼股的3’端係與另一多核苷酸之編碼股的3’端相鄰，該二個多核苷酸係以尾對尾之方向性排列，藉以使各多核苷酸之轉錄方向朝著另一多核苷酸前進。用語“尾對尾”可簡寫為(3’)-對-(3’)，亦可以符號(→←)或(5’→3’3’←5’)表示。

此處使用之用語“頭對尾”描述二個多核苷酸序 列彼此之關係的方向性。當一個多核苷酸之編碼股的5’端係與另一多核苷酸之編碼股的3’端相鄰，該二個多核苷酸 係以頭對尾之方向性排列，藉以使各多核苷酸之轉錄方向朝著與另一多核苷酸相同之方向前進。用語“頭對尾”可簡寫為(5’)-對-(3’)，亦可以符號(→→)或(5’→3’5’→3’)表示。

用語“下游”係指位於參考核苷酸序列3’之核苷 酸序列。特別是，下游核苷酸序列通常與在轉錄起始點之後的序列相關。舉例來說，基因之轉譯起始密碼子係位於轉錄起始位點之下游。

用語“上游”係指位於參考核苷酸序列5’之核苷 酸序列。特別是，上游核苷酸序列通常與位於編碼序列之5’側或轉錄起始點之序列相關。舉例來說，大部分啟動子係位於轉錄起始點之上游。

用語“限制內切酶”及“限制酵素”可交換使用， 係指在雙股DNA之內與特定核苷酸序列結合且在該特定核苷酸序列之內切割之酵素。

“同源性重組”係指將外來DNA序列插入另一 DNA分子內，例如將載體插入染色體內。較佳地，該載體以特定染色體位點為標的以進行同源性重組。以特定同源性重組而言，該載體將包含足夠長度之與染色體序列同源之區，以允許互補結合及使載體納入染色體內。同源性之區域越長及序列類似性之程度越高可增加同源重組之效率。

該領域中已知之一些方法可被用於增殖本發明 之多核苷酸。一旦適當之宿主系統及生長條件被建立後， 重組表現載體可被大量增殖及製備。如本文中所述者，可使用之表現載體包括但不限於下列載體或彼等之衍生物：人或動物病毒諸如牛痘病毒、腺病毒及腺相關病毒(adeno-associated virus)(AAV)；昆蟲病毒諸如桿狀病毒；酵母菌載體；噬菌體載體(例如λ)；及質體及黏質體DNA載體等。

“載體”係指任何用於選殖及/或轉移核酸至宿主 細胞內之載具。載體可為複製子，該複製子可與另一DNA片段接附以促成該接附區段之複製。“複製子”係指任何功能為活體內DNA複製之自主單位(即能夠自行控制複製)之基因元件(例如質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。用語“載體”包括在試管內、活體外或活體內用於將核酸導入細胞內之病毒及非病毒載具。許多本技術領域中已知之載體可被用於操縱核酸、將反應元件及啟動子納入基因內等。可能的載體例如包括但不限於質體或經改質之病毒，包括例如噬菌體諸如λ衍生物，或質體諸如pBR322或pUC質體衍生物，或Bluescript載體。舉例來說，欲將對應反應元件及啟動子之DNA片段插入適當之載體中，可藉由使適當之DNA片段與具有互補黏性端之選擇載體連接加以完成。或者，該等DNA分子之末端可能經酵素修飾或可能藉由連接核苷酸序列(連接子)至該DNA末端以產生任何位點。該等載體可能經工程化以含有可選擇之標誌基因，藉此篩選已將該標誌納入細胞基因體內之細胞。該等標誌允許辨識及/或篩選該納入及表現 由該標誌所編碼之蛋白質之宿主細胞。

病毒載體(特別是反轉錄病毒載體)已被用於各 種細胞內之基因遞送應用，及被用於活動物個體。可被使用之病毒載體包括但不限於反轉錄病毒、腺相關病毒(adeno-associated virus)(AAV)、痘病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、單純皰疹病毒、EB(Epstein-Barr)病毒、腺病毒、雙生病毒及花椰菜花葉病毒載體。非病毒載體包括而未限於質體、脂質體、帶電脂質(細胞轉染素)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。除了核酸之外，載體亦可包含一或多個調節區，及/或可用於選擇、測量及監測核酸轉移結果(轉移至何種組織、表現期間等)之可選擇標誌。

用語“質體”係指通常攜帶並非細胞中心代謝之 部分的基因之染色體外元件，且通常呈環狀雙股DNA分子之形式。該等元件可自主性地複製源自任何來源之序列、基因體嵌入序列、噬菌體或核苷酸序列、線性、環狀或超螺旋之單股或雙股DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已被接合或重組成獨特之建構體，該建構體能夠將經選擇之基因產物的啟動子片段及DNA序列與適當之3’非轉譯序列引入細胞內。

“選殖(cloning)載體”係指“複製子”，其為依序 複製且包含複製起點之單位長度之核酸(較佳為DNA)，諸如質體、噬菌體或黏質體，選殖載體可與另一核酸區段接附以促成該接附區段之複製。選殖載體可於一種細胞類型中複製，並於另一種細胞類型中表現(“穿梭載體”)。

載體可經由該領域已知之方法導入所欲之宿主 細胞內，例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE聚葡糖、磷酸鈣沉澱、脂轉染(溶體融合)、粒子轟擊、使用基因槍或DNA載體轉運蛋白(見例如Wu et al.,1992,J.Biol.Chem.267：963-967；Wu and Wu,1988,J.Biol.Chem.263：14621-14624；及Hartmut et al.,加拿大專利申請案第2,012,311號，1990年3月15日申請)。

本發明之多核苷酸亦可藉由脂轉染 (lipofection)被導入活體內。在過去十年內，越來越常使用脂質體於試管內包封及轉染核酸。經過設計以減少經脂質體調介之轉染所遭遇之困難及危險的合成性陽離子脂質可被用於製備脂質體，以供活體內轉染編碼標誌之基因(Felgner et al.,1987.PNAS 84：7413；Mackey,et al.,1988.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：8027-8031；及Ulmer et al.,1993.Science 259：1745-1748)。使用陽離子脂質可增進帶負電核酸之包封，亦可促進與帶負電細胞膜之融合(Felgner and Ringold,1989.Science 337：387-388)。 特別適用於轉移核酸之脂質化合物及組成物係描述於國際專利公開WO95/18863及WO96/17823、及美國專利第5,459,127號。利用脂轉染以導入外源性基因至活體內之特定器官具有某些實際好處。一部分之優點在於脂質體對於特定細胞之分子靶向性。很明顯的，引導對特定細胞類型之轉染將特別適用於具有細胞異質性之組織，諸如胰、肝、腎及腦。脂質可與其他分子化學偶合以達靶向性之目 的(Mackey,et al.,1988，同上)。經標靶之肽(例如荷爾蒙或神經傳遞物)及蛋白質諸如抗體或非肽分子可與脂質體化學偶合。

其他分子亦可用於促進核酸於活體內之轉染， 諸如陽離子寡肽(例如WO95/21931)、衍生自DNA結合蛋白之肽(例如WO96/25508)或陽離子聚合物(例如WO95/21931)。

也可於活體內導入呈裸DNA質體之載體(見美 國專利第5,693,622、5,589,466及5,580,859號)。經受體調介DNA遞送方法亦可被使用(Curiel et al.,1992.Hum.Gene Ther.3：147-154；及Wu and Wu,1987.J.Biol.Chem.262：4429-4432)。

用語“轉染”係指細胞之攝取外源性或異源性 RNA或DNA。當外源性或異源性RNA或DNA被導入細胞內時，該細胞係經該等RNA或DNA之“轉染”。當該經轉染之RNA或DNA導致細胞之表型改變，該細胞被外源性或異源性RNA或DNA“轉形”。轉形RNA或DNA可被整合(共價連接)至組成細胞之基因體之染色體DNA。

“轉形”係指將核酸分子轉移至宿主有機體之基 因體內，導致基因穩定性繼承。包含該轉形核酸分子之宿主有機體被稱為“基因轉殖”或“重組”或“轉形”有機體。

用語“基因區域”係指核酸分子或核苷酸序列之 區域，其包含編碼多肽之基因。

此外，包含根據本發明之多核苷酸重組載體可 包括一或多個供在期望進行擴增或表現之細胞宿主中複製之用的起點、標誌或可選擇之標誌。

用語“可選擇之標誌”意指識別因子，通常為抗 生素或化學抗性基因，該標誌能根據該標誌基因之效果被選擇，即對抗生素之抗性、對除草劑之抗性、比色標誌、酵素、螢光標誌及該類似物，其中該效果係用於追蹤所關注之核酸的繼承性及/或識別已繼承所關注之核酸的細胞或有機體。本技術領域中已知及使用之可選擇之標誌基因實例包括：提供對安比西林、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙氨磷除草劑、磺醯胺及該類似物之抗性的基因；及用來作為表型標誌之基因，即花青苷調節基因、異戊烯轉移酶基因及該類似物。可選擇之標誌基因亦可被視為報導基因。

用語“報導基因”意指編碼識別因子之核酸，該 識別因子能根據該報導基因之效果被識別，其中該效果係用於追蹤所關注之核酸的繼承性、識別已繼承所關注之核酸的細胞或有機體，及/或測量基因表現誘導或轉錄。本技術領域中已知及使用之報導基因實例包括而未限於：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡萄糖醛酸苷酶(Gus)及該類似物。

“啟動子”係指能控制編碼序列或功能性RNA之 表現的DNA序列。一般來說，編碼序列係位於啟動子序列之3’端。啟動子可整體衍生自天然基因，或可由源自天 然中所發現之不同啟動子的不同元件所組成，或甚至包含合成性DNA區段。熟習本技術領域者了解，不同的啟動子可能引導基因在不同的組織或細胞類型中表現，或在不同的發育階段表現，或因應不同的環境或生理條件表現。 造成基因在大部分時間及大部分細胞類型中表現之啟動子通常被稱為“組成性啟動子(constitutive promoter)”。造成基因在特定細胞類型中表現之啟動子通常被稱為“細胞特異性啟動子”或“組織特異性啟動子”。造成基因在特定發育或細胞分化階段表現之啟動子通常被稱為“發育特異性啟動子”或“細胞分化特異性啟動子”。在以可誘導啟動子之劑、生物性分子、化學物、配體、光或之類似物暴露或處理細胞之後被誘導且造成基因表現之啟動子通常被稱為“誘導性啟動子”或“調節性啟動子”。另外知道的是，由於在大部分情況中，調節序列之確切邊界並未被完全定義，因此不同長度之DNA片段可能具有相同之啟動子活性。

“啟動子序列”係在細胞內能夠結合RNA聚合酶 並起始下游(3’方向)編碼序列轉錄之DNA調節區域。為界定本發明之目的，啟動子序列以彼之3’端的轉錄起始位點為界，延伸至上游(5’方向)以包括啟動在背景值以上可偵測之量之轉錄所需之最小數量之鹼基或元件。在該啟動子序列之內可發現轉錄起始位點(方便地以例如核酸酶S1之定位定義)，和負責與RNA聚合酶結合之蛋白質結合結構域(共通序列)。

當RNA聚合酶將細胞內之編碼序列轉錄成 mRNA時，該編碼序列係在轉錄及轉譯控制序列之“控制下”，該mRNA接著經RNA反式剪切(若該編碼序列包含內含子)及轉譯成為由該編碼序列所編碼之蛋白質。

“轉錄及轉譯控制序列”係DNA調節序列，諸如 啟動子、增強子、終止子及該類似序列，其提供在宿主細胞內表現編碼序列。在真核細胞中，聚腺苷酸化信號係控制序列。

用語“反應元件”係指一或多種順式作用之 DNA元件，該元件授予經由與該第一嵌合基因之DNA-結合結構域交互作用所調介之啟動子的反應性。此DNA元件在彼之序列中可為迴文(完美或不完美)或由序列模體或被不等數量之核苷酸分開之半位點構成。該等半位點可為類似或相同的，經排列為正向或反向重複，或為單一半位點或串聯鄰近半位點之多聚體。依將納入反應元件之細胞或有機體之性質而定，該反應元件可包含分離自不同有機體之最小啟動子。在配體存在或不存在下，第一雜合蛋白之DNA結合結構域與反應元件之DNA序列結合，以在此反應元件之調節下啟動或抑制下游基因之轉錄。

用語“可操作性連接”係指核酸序列與單一核酸 片段相連以致使一者之功能受到另一者之影響。舉例來說，當啟動子能影響編碼序列之表現時(即編碼序列係在啟動子之轉錄控制之下)，該啟動子係與該編碼序列可操作性連接。編碼序列可與調節序列以同義或反義之方向可操作性連接。

此處所使用之用語“表現”係指轉錄及穩定累積 源自核酸或多核苷酸之同義(mRNA)或反義RNA。表現亦可指將mRNA轉譯成蛋白質或多肽。

用語“卡匣”、“表現卡匣”及“基因表現卡匣”係 指可在特定限制位點或藉由同源重組被插入核酸或多核苷酸之內的DNA區段。該DNA區段包含編碼所關注之多肽的多核苷酸，且該卡匣及限制位點係經設計以確保該卡匣被插入適當之閱讀框以供轉錄及轉譯。“轉形卡匣”係指特定載體，其包含編碼所關注之多肽的多核苷酸，且除了該多核苷酸以外還具有促進特定宿主細胞轉形之元件。本發明之卡匣、表現卡匣、基因表現卡匣及轉形卡匣亦可包含允許編碼所關注之多肽的多核苷酸於宿主細胞內增進表現之元件。這些元件包括但不限於：啟動子、最小啟動子、增強子、反應元件、終止子序列、聚腺苷酸化序列及該類似序列。

用語“調節”意指誘導、減少或抑制核酸或基因 表現，分別產生蛋白質或多肽製造之誘導、減少或抑制。

根據本發明之質體或載體可進一步包含至少一個適用於驅動宿主細胞中基因表現之啟動子。用語“表現載體”係指經設計而在轉形至宿主後能夠表現被插入之核酸序列之載體、質體或載具。經選殖之基因(即經插入之核酸序列)通常被置於控制元件之控制下，諸如啟動子、最小啟動子、增強子或該類似元件。可用於驅動核酸於所欲宿主細胞內之表現之起始控制區或啟動子為數眾多，且 為熟習本技術領域者所熟悉。基本上，任何能驅動這些基因之啟動子係適用於本發明，其包括但不限於：病毒啟動子、細菌啟動子、動物啟動子、哺乳動物啟動子、合成性啟動子、組成性啟動子、組織特異性啟動子、發育特異性啟動子、誘導性啟動子、光調節性啟動子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、鹼性磷酸酶啟動子(可用於啤酒釀母菌內表現)；AOX1啟動子(可用於畢赤酵母內表現)；b-內醯胺酶、lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、及trc啟動子(可用於在大腸桿菌內表現)；光調節性-、種子特異性-、花粉特異性-、卵巢特異性-、致病機轉或疾病相關性-、花菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)35S、最小CMV 35S、木薯葉脈嵌紋病毒(cassava vein mosaic virus)(CsVMV)、葉綠素a/b結合蛋白、核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶、莖特異性、根特異性、幾丁質酶、壓力誘導性、水稻東格魯(tungro)桿狀病毒、植物超啟動子、馬鈴薯白胺酸胺肽酶、硝酸還原酶、甘露鹼合成酶、胭脂胺酸合成酶、泛素、玉米蛋白、及花青素啟動子(可用於在植物細胞內表現)；該領域已知之動物及哺乳動物啟動子包括但不限於SV40早期(SV40e)啟動子區、勞斯肉瘤病毒(RSV)之3’長終端重複(LTR)所包含之啟動子、腺病毒(Ad)之E1A或主要晚期啟動子(MLP)基因之啟動子、巨細胞病毒(CMV)早期啟動子、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)啟動子、桿狀病毒IE1啟 動子、延長因子1α(EF1)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、泛素(Ubc)啟動子、白蛋白啟動子、小鼠金屬硫蛋白-L啟動子及轉錄控制區之調節序列、普遍型啟動子(HPRT、波形蛋白、α-肌動蛋白、微管蛋白及該類似物)、中間絲(肌間線蛋白、神經絲、角質素、GFAP及該類似物)之啟動子、(MDR、CFTR或因子VIII型及該類似物)之治療基因之啟動子、致病機轉或疾病相關啟動子，及展現組織特異性且已被用於基因轉殖動物之啟動子，諸如在胰腺泡細胞內具活性之彈性蛋白酶I基因控制區；在胰β細胞內具活性之胰島素基因控制區、在淋巴樣細胞內具活性之免疫球蛋白基因控制區、在睪丸、乳房、淋巴樣及肥胖細胞內具活性之小鼠乳房腫瘤病毒控制區；在肝臟中具活性之白蛋白基因、Apo AI及Apo AII控制區、在肝臟中具活性之α-胎兒蛋白基因控制區、在肝臟中具活性之α1-抗胰蛋白酶基因控制區、在骨髓細胞內具活性之β-球蛋白基因控制區、在腦之寡突細胞內具活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區、在骨骼肌中具活性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區、及在下視丘中具活性之促性腺釋放激素基因控制區、丙酮酸激酶啟動子、絨毛蛋白啟動子、脂肪酸結合小腸蛋白之啟動子、平滑肌細胞α-肌動蛋白之啟動子及該類似物。此外，這些表現序列可能藉由加入增強子或調節序列及該類似物加以修飾。

可用於本發明之實施態樣中之增強子包括但不 限於：SV40增強子、巨細胞病毒(CMV)增強子、延長因 子1(EF1)增強子、酵母菌增強子、病毒基因增強子及該類似物。

終止控制區(即終止子或聚腺苷酸化序列)亦可 衍生自各種對偏好之宿主為天然之基因。隨意地，終止位點不是必要但是最好包含。在本發明之某些實施態樣中，該終止控制區可包含或衍生自合成性序列、合成性聚腺苷酸化信號、SV40晚期聚腺苷酸化信號、SV40聚腺苷酸化信號、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號、病毒終止序列或該類似物。

用語“3’非編碼序列”或“3’非轉譯區(UTR)”係 指位於編碼序列下游(3’)之DNA序列，可包含聚腺苷酸化\[poly(A)]辨認序列及其他編碼能夠影響mRNA加工或基因表現之調節信號之序列。聚腺苷酸化信號之特徵通常為影響聚腺苷酸序列添加至mRNA前驅物之3’端。

“調節區”係指調節第二核酸序列表現之核酸序 列。調節區可包括本來就負責表現特定核酸(同源區)之序列，或包括不同來源但負責表現不同蛋白質或甚至合成性蛋白質(異源區)之序列。特別是，該等序列可為原核性、真核性或病毒性基因之序列或衍生序列，其以特定或非特定方式及誘導性或非誘導性方式刺激或抑制基因之轉錄。 調節區包括而未限於複製起點、RNA剪切位點、啟動子、增強子、轉錄終止序列、及引導該多肽進入標的細胞之分泌途徑之信號序列。

“異源性來源”之調節區係指不是與經表現之核 酸天然相連之調節區。異源性調節區包含而未限於來自不同物種之調節區、來自不同基因之調節區、雜交調節序列及不發生於天然中但由本技術領域中具有通常知識者所設計之調節序列。

“RNA轉錄物”係指由RNA聚合酶催化之DNA 序列轉錄所產生之產物。當RNA轉錄物係DNA序列之完美互補複本時，較佳者為初級轉錄物或其可能為源自轉錄後加工該初級轉錄物之RNA序列，被稱為成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”係指沒有內含子且可被細胞轉譯成蛋白質之RNA。“cDNA”係指與mRNA互補且源自該mRNA之雙股DNA。“同義RNA”係指包括mRNA因此可被細胞轉譯成蛋白質之RNA轉錄物。“反義RNA”係指與所有或部分之標的初級轉錄物或mRNA互補且阻斷標的基因之表現之RNA轉錄物。反義RNA可能與特定基因轉錄物之任何部分互補，例如5’非編碼序列、3’非編碼序列或編碼序列。 “功能性RNA”係指反義RNA、核糖核酸酵素RNA(ribozyme RNA)或其他不被轉譯但對細胞程序有所影響之RNA。

“多肽”係由共價連接之胺基酸殘基構成之聚合 性化合物。胺基酸具有下列一般結構：

胺基酸依側鏈R分類為七個群組：(1)脂族側 鏈、(2)含有羥基(OH)之側鏈、(3)含有硫原子之側鏈、(4)含有酸性或醯胺基團之側鏈、(5)含有鹼性基團之側鏈、(6)含有芳環之側鏈、及(7)脯胺酸，其為亞胺酸，其中側鏈與胺基稠合。本發明之多肽較佳為包含至少約14個胺基酸。

“經分離之多肽”或“經分離之蛋白質”係指實質 上不含該些在彼之天然狀態下與之正常相關之化合物(例如其他蛋白質或多肽、核酸、碳水化合物、脂質)之多肽或蛋白質。“經分離”不代表排除與其他化合物之人工或合成性混合物，或不影響生物活性之雜質存在，這可能是因為例如純化不完全、添加穩定劑或化合成為醫藥上可接受之製劑。

根據本發明之多肽的“片段”應理解為意指胺基 酸序列相較於參照多肽之胺基酸序列為短之多肽，且該多肽相較於這些參照多肽之所有部分包含完全相同之胺基酸序列。當適當時，該等片段可能被包括於更大多肽之內以形成更大多肽之一部分。根據本發明之多肽之該等片段可具有至少2-300個胺基酸之長度。

“異源性蛋白質”係指天然中不會於該細胞中製 造之蛋白質。

“成熟蛋白質”係指經轉譯後加工之多肽；即任 何存在於初級轉譯產物中之引導肽(pre-peptide)、前導肽(propeptide)已被移除者。“前驅物”蛋白質係指mRNA轉譯之初級產物，即引導肽(pre-peptide)及前導肽 (propeptide)仍存在。引導肽(pre-peptide)及前導肽(propeptide)可為、但不限於胞內定位信號。

用語“信號肽”係指在該分泌成熟蛋白質前的胺 端多肽。該信號肽會自成熟蛋白質切除且因此不存在於成熟蛋白質。信號肽具有引導並移位(translocating)分泌蛋白跨細胞膜之功能。信號肽又被稱為信號蛋白。

“信號序列”被包括在欲表現在細胞表面上之蛋 白質之編碼序列開始處。此序列編碼信號肽(成熟多肽之N端)，其引導宿主細胞移位該多肽。用語“移位信號序列”用於本文中係指此類信號序列。移位位信號序列可發現與各種天然真核生物及原核生物蛋白質相關聯，且常在這兩種有機體中具功能性。

用語“同源性”係指二個多核苷酸或二個多肽部 分(moiety)之間一致性之百分比。來自一個部分之序列與另一序列之間的對應性可由該領域已知之技術測定。舉例來說，同源性可藉由直接比較二個多肽分子間之序列資訊加以決定，其藉由排比該序列資訊並利用易於使用之電腦程式進行。或者，可藉由在同源區之間形成穩定雙股之條件下使多核苷酸雜交，然後經單股特異性核酸酶消化後測定該經消化之片段的大小加以決定同源性。

此處所使用之所有文法形式及拼寫差異之用語 “同源”係指具有“共同演化來源”之蛋白質之間的關係，包括來自超家族(例如免疫球蛋白超家族)之蛋白質及來自不同物種之同源蛋白(例如肌球蛋白輕鏈等)(Reeck et al., 1987,Cell 50：667)。該等蛋白質(及彼等之編碼基因)具有序列同源性，因為彼等具有高度序列相似性。然而，在一般用法及本申請案中，當以諸如“高度地”之副詞修飾用語“同源”時，用語“同源”可指序列相似性而非共同演化來源。

因此，所有文法形式之用語“序列相似性”係指 可能共同或非共同演化來源之蛋白質的核酸或胺基酸序列之間的一致性或對應性程度(見Reeck et al.,1987,Cell 50：667)。

在特定實施態樣中，當二個DNA序列之定義 長度中至少約50%(較佳為至少約75%、且更佳為約90%或95%)的核苷酸匹配，該等DNA序列係“實質上同源”或“實質上類似”。

實質上同源之序列可利用序列資料庫中可用之 標準軟體比較序列加以識別，或在例如特定系統所定義之嚴苛度條件下進行南方雜交實驗加以識別。定義適當之雜交條件係屬該領域之技藝。見例如Sambrook et al.,1989，同上。

此處所使用之“實質上類似”係指其中一或多個 核苷酸鹼基之改變導致取代一或多個胺基酸，但不影響由該DNA序列所編碼之蛋白質的功能特性之核酸片段。“實質上類似”亦指其中一或多個核苷酸鹼基之改變不影響該核酸片段藉由反義或共同抑制技術以調介基因表現改變之能力的核酸片段。“實質上類似”亦指本發明之核酸片段之 修飾，諸如刪除或插入一或多個不實質影響該形成之轉錄物之功能特性的核苷酸鹼基。因此應了解本發明不只包含該特定例示性序列。每種提議之修飾及測定該編碼產物是否保留生物活性皆在該領域之例行技藝範圍內。

又，熟習本技術領域者會理解，涵蓋在本發明 之實質上類似之序列亦藉由在嚴苛條件(0.1X SSC、0.1% SDS、65℃，且以2X SSC、0.1% SDS再接以0.1X SSC、0.1% SDS清洗)下彼等與本文中所例示之序列雜交之能力而界定。本發明之實質上類似核酸片段為DNA序列為與本文中所報導之核酸片段之DNA序列至少70%一致性之核酸片段。本發明之實質上類似核酸片段包括與本文中所報導之核酸片段之DNA序列至少80%一致性之核酸片段。在某些實施態樣中，核酸片段係與本文中所報導之核酸片段之DNA序列有至少90%一致性、至少95%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、或至少99%一致性。在某些實施態樣中，本發明之實質上類似核苷酸序列可編碼任何本案中所述之多肽序列(例如scIL-12多肽)，儘管與本文中所述之特定多核苷酸序列比較有任何核苷酸序列差異存在。

當二個胺基酸序列有超過約40%之胺基酸相 同，或超過60%之胺基酸類似(功能一致)，該二個胺基酸序列係「實質上同源」或「實質上類似」。較佳地，該類似或同源之序列係藉由使用例如GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7, Madison,Wisconsin)排列(pileup)程式加以排比鑑識。

此處所使用之用語「對應」係指類似或同源性 序列，不論確切位置是否與測量類似性或同源性之分子相同或不同。核酸或胺基酸序列排比可能包括間隔。因此，用語「對應」係指序列類似性，而非胺基酸殘基或核苷酸鹼基之編號。

“顯著部分”之胺基酸或核苷酸序列包含足夠之 多肽之胺基酸序列或基因之核苷酸序列，得以由該領域之技藝人士手動評估該序列，或藉由使用演算法諸如BLAST(基礎局部排比搜尋工具(Basic Local Alignment Search Tool)；Altschul,S.F.,et al.,(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；亦參見www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行電腦自動化序列比較及識別以推定辨識該多肽或基因。一般來說，需要十或更多個連續胺基酸或三十或更多個核苷酸之序列以推定辨識一多肽或核酸序列與已知蛋白質或基因之同源性。另外就核苷酸序列而言，包含20至30個連續核苷酸之基因特異性寡核苷酸探針可被用於基因辨識(例如南方雜交)及分離(例如細菌菌落或噬菌體噬斑之原位雜交)之序列依賴性方法。此外，含12至15個鹼基之短寡核苷酸可被用來作為PCR中之擴增引子，以獲得包含該引子之特定核酸片段。因此，“顯著部分”之核苷酸序列包含足夠序列以特異性辨識及/或分離包含該序列之核酸片段。

該領域已知之用語“一致性百分比”係指二或多 個多肽序列或二或多個多核苷酸序列之間之關係，其係藉由比較序列決定。在該領域中，“一致性”亦指多肽或多核苷酸序列之間序列相關性之程度，視情況亦可由該等序列之間的匹配狀況決定。“一致性”及“相似性”可輕易地由已知之方法計算，包括但不限於下列描述者：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,New York(1991)。測定一致性之較佳方法係經設計以給予測試序列間之最佳匹配。測定一致性及相似性之方法被編篡於公眾可用之電腦程式中。序列排比及一致性百分比計算可利用LASERGENE生物資訊電腦套組之Megalign程式(DNASTAR Inc.,Madison,WI)進行。序列之多重排比可利用Clustal排比方法及預設參數(缺口罰分=10，缺口長度罰分=10)進行(Higgins and Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)。使用Clustal方法進行兩兩排比之預設參數可選自：KTUPLE 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5及DIAGONALS SAVED=5。

用語“序列分析軟體”係指任何可用於分析核苷 酸或胺基酸序列之電腦演算法或軟體程式。“序列分析軟體”可自商業途徑獲得或自行開發。典型的序列分析軟體包括但不限於GCG程式套組(Wisconsin Package Version 9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403-410(1990))、及DNASTAR(DNASTAR,Inc.1228 S.Park St.Madison,WI 53715 USA)。在本案之情境中，應了解當使用序列分析軟體進行分析時，該分析之結果將基於該參照程式之“預設數值”，除非另外說明。此處所使用之“預設數值”將代表在首次啟用該軟體時原本內建之任何數值或參數組。

“合成基因”可使用熟習本技術領域者已知之程 序自化學合成之寡核苷酸建構單元(building block)組合。這些建構單元經連接及黏合以形成基因區段，其之後經酵素組合以構築整個基因。就DNA之序列而言，“化學合成”指該等成份核苷酸係於試管內組成。DNA之手動化學合成可利用發展成熟之方法完成，或利用多種商用機器之一進行自動化化學合成。因此，基因可根據最佳化之核苷酸序列以反應宿主細胞之密碼子偏性，而修整以達最佳基因表現。技藝人士了解若密碼子之使用偏向宿主喜好之密碼子，將可能成功地表現基因。較佳密碼子之決定可根據可取得序列資訊之宿主細胞來源之基因調查。或者，或除了最佳化以反映密碼子偏性之外，最佳化亦可包括依據特定宿主細胞而最佳化核苷酸序列，其中進行最佳化以最 大化轉錄速率或量、轉錄物半生期、以及轉譯速率或量。 此最佳化可依據特定宿主細胞透過經驗判定而進行。

用語「基因開關」係指與啟動子相關之反應元 件與以配體依賴性轉錄因子為基底之系統的組合，該以配體依賴性轉錄因子為基底之系統在一或多種配體存在下，可調控與該反應元件及啟動子相關聯之基因的表現。用語「編碼基因開關之多核苷酸」係指與啟動子相關之反應元件與編碼以配體依賴性轉錄因子為基底之系統的多核苷酸之組合，該以配體依賴性轉錄因子為基底之系統在一或多種配體存在下，可調控與該反應元件及啟動子相關聯之基因的表現。

用語“IL-12活性”及“IL-12生物活性”係指任何 熟知之IL-12生物活性，且包括而不限於刺激初始T細胞分化成Th1細胞、刺激T細胞的生長及功能、刺激來自T細胞及自然殺手(NK)細胞的干擾素-γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的產生、刺激經IL-4調介之IFN-γ抑制的減少、刺激NK細胞及CD8⁺細胞毒性T淋巴球的細胞毒性活性之增強、刺激IL-12R-β1及IL-12R-β2之表現、透過MHC I及II分子之調升而促進腫瘤抗原之呈現、以及刺激抗血管生成活性。例示性IL-12活性分析包括γ干擾素誘導分析(Gamma Interferon Induction Assay)(參見實施例3及美國專利5,457,038)。其他分析為本技術領域中已知者，例如但不限於NK細胞自發性細胞毒性分析(NK Cell Spontaneous Cytotoxicity Assay)、ADCC分析、共細胞分 裂效果分析(Co-Mitogenic Effect Assay)、及GM-CSF誘導分析(例如，如美國專利5,457,038的實施例8中所揭示者，其以引用方式併入本文中)。

在較佳實施態樣中，本發明之scIL-12多肽保 留至少一種IL-12生物活性。在某些實施態樣中，本發明之scIL-12多肽保留超過一種IL-12生物活性。在某些實施態樣中，本發明之scIL-12多肽保留至少一種、至少二種、至少三種、至少四種、至少五種或至少六種上述引用之IL-12生物活性。在某些實施態樣中，本發明之scIL-12多肽之IL-12生物活性係與IL-12的異二聚體p35/p40(野生型)型比較(分析比對)。在某些實施態樣中，本發明之scIL-12多肽相較於IL-12的異二聚體p35/p40(野生型)型保留至少約50%、至少約75%、至少約85%、至少約90%、至少約100%、至少約50%、至少約75%、至少約85%、至少約90%、至少約100%、或更多的IL-12生物活性。

此處所使用之用語疾病「治療(treating或 treatment)」係指為了緩和疾病之徵象或症狀而執行計畫，該計畫可包括投予一或多種藥物或經試管內工程化之細胞至哺乳動物(人或非人)。因此，「治療」不應一定被解讀為需要完全緩和徵象或症狀，不要求治癒，且特別包括僅對個體具邊際效應之計畫。

如本文中所使用，“免疫細胞”包括樹突細胞、 巨噬細胞、嗜中性細胞、肥大細胞、嗜酸性細胞、嗜鹼性 細胞、自然殺手細胞及淋巴球細胞(例如B及T細胞)。

如本文中所使用，用語“幹細胞”包括胚幹細 胞、成人幹細胞及經誘導之多潛能幹細胞。幹細胞可自任何適當來源獲得，包括骨髓、脂肪細胞、及血液(包括但不限於臍帶血及經血)。幹細胞之實例包括但不限於間質幹細胞(mesenchymal stem cell)及造血幹細胞。

如本文中所使用，用語“樹突細胞”及“DC”係可 交換使用。同樣地，用語“自然殺手細胞”及“NK細胞”係可交換使用。

編碼單鏈IL-12多肽之多核苷酸

本發明提供新穎編碼本發明之單鏈介白素-12(scIL-12)多肽之多核苷酸，包括全長且成熟scIL-12多肽。

根據本發明之特定實施態樣，係提供編碼新穎scIL-12多肽之核酸序列。特定言之，本發明提供編碼scIL-12多肽之多核苷酸，其自N端至C端包含：(i)第一IL-12 p40結構域(p40N)，(ii)隨意之第一胜肽連接子，(iii)IL-12 p35結構域，(iv)隨意第二胜肽連接子，及(v)第二IL-12 p40結構域(p40C)。

在某些實施態樣中，由本發明之多核苷酸所編碼之第一IL-12 p40結構域(在本文中亦稱為p40N)係IL- 12 p40次單元之N端片段。用於本發明中之IL-12 p40多核苷酸包括SEQ ID NO：1之人IL-12 p40核酸序列及SEQ ID NO：5之鼠IL-12 p40核酸序列。此外，編碼IL-12 p40次單元之多核苷酸的非限定性實例可在公眾序列資料庫中獲得，其包括但不限於Genbank Accession登錄號AF180563.1(人)、NM_002187.2(人)、NG_009618.1(人)、NM_001077413.1(貓)、AF091134.1(狗)、NM_008352.2(小鼠)、NM_001159424.1(小鼠)、及NM_008351.2(小鼠)。

本發明之多核苷酸所編碼及適合作為第一IL- 12 p40結構域(p40N)之IL-12 p40的N端片段包括但不限於包含下列之多肽或由下列多肽組成：SEQ ID NO：2的第1至288、1至289、1至290、1至291、1至292、1至293、1至294、1至295、1至296、1至297、及1至298個胺基酸。本發明之多核苷酸所編碼及適合作為第一IL-12 p40結構域(p40N)之較佳IL-12 p40的N端片段包含SEQ ID NO：2的第1至293個胺基酸之多肽或由SEQ ID NO：2的第1至293個胺基酸之多肽組成。

本發明之多核苷酸所編碼及適合作為第一IL- 12 p40結構域(p40N)之IL-12 p40的N端片段可缺少訊號序列。應了解的是，信號肽的特定截切點可有1、2、3或更多個殘基的差異。因此，在另外實施態樣中，由本發明之多核苷酸所編碼之第一IL-12 p40結構域(p40N)包含下列之片段、或由下列片段組成：以SEQ ID NO：2的殘基 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28開始且以SEQ ID NO：2的殘基288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、或298結束之SEQ ID NO：2片段。在一個實施態樣中，由本發明之多核苷酸所編碼之第一IL-12 p40結構域(p40N)包含SEQ ID NO：2的胺基酸殘基23至293，或由SEQ ID NO：2的胺基酸殘基23至293組成。

隨意之第一胜肽連接子(ii)可為允許scIL-12多 肽折疊成功能性蛋白質之任何適合的胜肽連接子。在某些實施態樣中，由本發明之多核苷酸所編碼之隨意之第一胜肽連接子由10或更少個胺基酸組成。在特定實施態樣中，該第一胜肽連接子由1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸組成。在特定實施態樣中，該第一胜肽連接子包含選自下列之一或多個胺基酸之任何序列及組合：甘胺酸(Gly)；絲胺酸(Ser)；丙胺酸(Ala)；蘇胺酸(Thr)；及脯胺酸(Pro)。在較佳實施態樣中，第一胜肽連接子係選自下列胜肽Thr-Pro-Ser(SEQ ID NO：41)及Ser-Gly-Pro-Ala-Pro(SEQ ID NO：42)，以及在Thr-Pro-Ser(SEQ ID NO：41)及Ser-Gly-Pro-Ala-Pro(SEQ ID NO：42)中具有一個胺基酸取代之胜肽。在某些實施態樣中，該第一胜肽連接子係不存在。

在某些實施態樣中，由本發明之多核苷酸所編 碼之IL-12 p35結構域(iii)係成熟IL-12 p35次單元，其缺少信號肽。用於本發明中之IL-12 p35多核苷酸包括SEQ ID NO：3之人IL-12 p35核酸序列及SEQ ID NO：7之鼠IL-12 p35核酸序列。此外，編碼IL-12 p35次單元之多核苷酸的非限定性實例可在公眾序列資料庫中獲得，其包括但不限於AF101062.1(人)、NM_000882.3(人)、NG_033022.1(人)、NM_001159424.1(小鼠)、NM_008351.2(小鼠)、NM_001009833(貓)、NM_001082511.1(馬)、NM_001003293.1(狗)。

應了解的是，信號肽的特定截切點可有1、 2、3或更多個殘基的差異。因此，由本發明之多核苷酸所編碼之IL-12 p35結構域包含預測成熟序列，其包含下列者、或由下列組成：以SEQ ID NO：4的殘基57至253，及成熟序列，其包含下列者、或由下列組成：SEQ ID NO：4的第52至253、53至253、54至253、55至253、56至253、58至253、59至253、60至253、61至263及62至253個胺基酸。

由本發明之多核苷酸所編碼之適合的IL-12 p35結構域可為在C端截斷了一或多個胺基酸殘基。因此，在另外實施態樣中，由本發明之多核苷酸所編碼之IL-12 p35結構域包含下列之片段、或由下列片段組成：以SEQ ID NO：4的殘基52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、或62開始且以SEQ ID NO：4的殘基247、248、249、250、251、252、或253結束之SEQ ID NO：4片段。

隨意之第二胜肽連接子(iv)可為允許scIL-12 多肽折疊成功能性蛋白質之任何適合的胜肽連接子。在某些實施態樣中，由本發明之多核苷酸所編碼之隨意之第二胜肽連接子由10或更少個胺基酸組成。在特定實施態樣中，該第二胜肽連接子由1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸組成。在特定實施態樣中，該第二胜肽連接子包含選自下列之一或多個胺基酸之任何序列及組合：甘胺酸(Gly)；絲胺酸(Ser)；丙胺酸(Ala)；蘇胺酸(Thr)；及脯胺酸(Pro)。在較佳實施態樣中，該第二胜肽連接子係選自下列胜肽Thr-Pro-Ser(SEQ ID NO：41)及Ser-Gly-Pro-Ala-Pro(SEQ ID NO：42)，以及在Thr-Pro-Ser(SEQ ID NO：41)及Ser-Gly-Pro-Ala-Pro(SEQ ID NO：42)中具有一個胺基酸取代之胜肽。在某些實施態樣中，該第二胜肽連接子係不存在。在較佳實施態樣中，該第一及第二胜肽連接子由經合併之10、9、8、7或更少個胺基酸殘基組成。

在某些實施態樣中，由本發明之多核苷酸所編 碼之第二IL-12 p40結構域(在本文中亦稱為p40C)係IL-12 p40次單元之C端片段。本發明之多核苷酸所編碼及適合作為第二IL-12 p40結構域(p40C)之IL-12 p40的C端片段包含下列者、或由下列者組成：SEQ ID NO：2的第289至328、290至328、291至328、292至328、293至328、294至328、295至328、296至328、297至328、298至328、及299至328個胺基酸。

由本發明之多核苷酸所編碼之適合的第二IL- 12 p40結構域(p40C)可為在C端截斷了一或多個胺基酸殘基。因此，在另外實施態樣中，由本發明之多核苷酸所編碼之第二IL-12 p40結構域(p40C)包含下列之片段、或由下列片段組成：以SEQ ID NO：2的殘基289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、或299開始且以SEQ ID NO：2的殘基322、323、324、325、326、327、或328結束之SEQ ID NO：2片段。

編碼本發明之較佳scIL-12多肽的多核苷酸之 全長序列在本文中以SEQ ID NO：9呈現。該全長序列編碼預測信號肽在SEQ ID NO：9的第1至66個核酸，且成熟scIL-12多肽在SEQ ID NO：9的第67至1599個核酸。

因此，本發明之第一標的關於一種編碼新穎 scIL-12多肽之經分離之多核苷酸。在特定實施態樣中，經分離之多核苷酸包含選自由SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：9的第67至1599個核酸所組成的群組之核酸序列。 在特定實施態樣中，該經分離之多核苷酸另包含允許多肽在宿主細胞中表現之區域。

本發明亦關於一種編碼scIL-12多肽之經分離 之多核苷酸，該scIL-12多肽包含選自由SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：10的第23至533個胺基酸所組成的群組之胺基酸序列。

本發明亦提供編碼本發明之scIL-12多肽之變 異體的多核苷酸。在較佳實施態樣中，本發明之多核苷酸編碼與SEQ ID NO：10之全長或成熟胺基酸序列至少 80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性之scIL-12變異體多肽，其中變異體多肽展現至少一種IL-12活性，諸如誘導IFN-γ自NK細胞分泌。此等IL-12活性可容易地使用本技術領域中已知之分析法測定，諸如美國專利5,457,038的實施例8中所述之分析法，其以引用方式併入本文中。

由於核苷酸編碼序列之簡併性，其他編碼與揭 示在本文中之scIL-12多核苷酸實質上相同之胺基酸序列(包括含有單一胺基酸變異之胺基酸序列)之多核苷酸，可用於實施本發明。這些包括但不限於等位基因、來自其他物種之同源性基因、及包含所有或部分scIL-12多核苷酸之核苷酸序列(其藉由在序列內以編碼相同胺基酸殘基之不同密碼子取代而更改，由此製造靜默(silent)改變)。同樣地，本發明之scIL-12衍生物包括但不限於包含(初級胺基酸序列)所有或部分scIL-12多肽胺基酸序列，包括功能性相同胺基酸殘基取代序列中之殘基而產生保守性胺基酸取代者。舉例而言，序列中的一或多個胺基酸殘基可由另一作用上為功能性相同之類似極性胺基酸取代，產生靜默改變。序列中胺基酸取代者可選自該胺基酸所屬之分類的其他成員。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。含有芳環結構之胺基酸為苯丙胺酸、色胺酸、及酪胺酸。該極性中性之胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸、及麩醯胺 酸。帶正電(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。 帶負電(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。此等改變可藉由各種本技術領域中已知之方法而製造(參見Sambrook et al.,1989，同上)且預期不影響以聚丙醯胺凝膠電泳所測定之表觀分子量或等電點。

本發明亦關於一種經分離之由根據本發明之多核苷酸所編碼之scIL-12多肽。

單鏈IL-12多肽

本發明提供新穎scIL-12多肽，包括全長且成熟scIL-12多肽。

因此，本發明關於經分離之scIL-12多肽。在特定實施態樣中，本發明提供一種scIL-12多肽，其自N端至C端包含：(i)第一IL-12 p40結構域(p40N)，(ii)隨意之第一胜肽連接子，(iii)IL-12 p35結構域，(iv)隨意第二胜肽連接子，及(v)第二IL-12 p40結構域(p40C)。

在某些實施態樣中，該第一IL-12 p40結構域(p40N)係p40次單元之N端片段。用於本發明中之IL-12 p40多肽包括SEQ ID NO：2之人IL-12 p40胺基酸序列及SEQ ID NO：6之鼠IL-12 p40胺基酸序列。此外，IL-12 p40次單元的非限定性實例可在公眾序列資料庫中獲得， 其包括但不限於Genbank Accession登錄號P29460.1(人)、AAD56386.1(人)、NP_005526.1(人)、NP_714912.1(人)、Q28268.1(狗)、NP_001003292.1(狗)、NP_032378.1(小鼠)、NP_001152896.1(小鼠)、NP_032377.1(小鼠)。

適合作為第一IL-12 p40結構域(p40N)之IL-12 p40的N端片段包括但不限於包含下列之多肽或由下列多肽組成：SEQ ID NO：2的第1至288、1至289、1至290、1至291、1至292、1至293、1至294、1至295、1至296、1至297、及1至298個胺基酸。較佳的第一IL-12 p40結構域(p40N)包含SEQ ID NO：2的第1至293個胺基酸或由SEQ ID NO：2的第1至293個胺基酸組成。

適合作為第一IL-12 p40結構域(p40N)之IL-12 p40的N端片段可缺少訊號序列。因此，在另外實施態樣中，第一IL-12 p40結構域(p40N)包含下列之片段、或由下列片段組成：以SEQ ID NO：2的殘基18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28開始且以SEQ ID NO：2的殘基288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、或298結束之SEQ ID NO：2片段。在一個實施態樣中，第一IL-12 p40結構域(p40N)包含SEQ ID NO：2的胺基酸殘基23至293或由SEQ ID NO：2的胺基酸殘基23至293組成。

隨意之第一胜肽連接子(ii)可為允許scIL-12多 肽折疊成功能性蛋白質之任何適合的胜肽連接子。在某些 實施態樣中，隨意之第一胜肽連接子由10或更少個胺基酸組成。在特定實施態樣中，該第一胜肽連接子由1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸組成。在特定實施態樣中，該第一胜肽連接子包含選自下列之一或多個胺基酸之任何序列及組合：甘胺酸(Gly)；絲胺酸(Ser)；丙胺酸(Ala)；蘇胺酸(Thr)；及脯胺酸(Pro)。在較佳實施態樣中，第一胜肽連接子係選自下列胜肽Thr-Pro-Ser(SEQ ID NO：41)及Ser-Gly-Pro-Ala-Pro(SEQ ID NO：42)，以及在Thr-Pro-Ser(SEQ ID NO：41)及Ser-Gly-Pro-Ala-Pro(SEQ ID NO：42)中具有一個胺基酸取代之胜肽。在某些實施態樣中，該第一胜肽連接子係不存在。

在某些實施態樣中，IL-12 p35結構域(iii)係成熟IL-12 p35次單元，其缺少信號肽。用於本發明中之IL-12 p35多核苷酸包括SEQ ID NO：4之人IL-12 p35胺基酸序列及SEQ ID NO：8之鼠IL-12 p35胺基酸序列。此外，IL-12 p35次單元的非限定性實例可在公眾序列資料庫中獲得，其包括但不限於Genbank Accession登錄號AAB32758.1(貓)、NP_001003293(狗)、NP_001075980.1(馬)、NP_000873.2(人)、AAD56385.1(人)、NP_001152896.1(小鼠)、及NP_032377.1(小鼠)。

應了解的是，信號肽的特定截切點可有1、2、3或更多個殘基的差異。因此，在某些實施態樣中，本發明之成熟p35多肽包括預測成熟序列，其由下列組成：以SEQ ID NO：4的殘基57至253，及成熟序列，其 由下列組成：SEQ ID NO：4的第52至253、53至253、54至253、55至253、56至253、58至253、59至253、60至253、61至263及62至253個胺基酸。

適合的IL-12 p35結構域可為在C端截斷了一 或多個胺基酸殘基。因此，在另外實施態樣中，IL-12 p35結構域包含下列之片段、或由下列片段組成：以SEQ ID NO：4的殘基52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、或62開始且以SEQ ID NO：4的殘基247、248、249、250、251、252、或253結束之SEQ ID NO：4片段。

隨意之第二胜肽連接子(iv)可為允許scIL-12 多肽折疊成功能性蛋白質之任何適合的胜肽連接子。在某些實施態樣中，隨意之第二胜肽連接子由10或更少個胺基酸組成。在特定實施態樣中，該第二胜肽連接子由1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸組成。在特定實施態樣中，該第二胜肽連接子包含選自下列之一或多個胺基酸之任何序列及組合：甘胺酸(Gly)；絲胺酸(Ser)；丙胺酸(Ala)；蘇胺酸(Thr)；及脯胺酸(Pro)。在較佳實施態樣中，該第二胜肽連接子係選自下列胜肽Thr-Pro-Ser(SEQ ID NO：41)及Ser-Gly-Pro-Ala-Pro(SEQ ID NO：42)，以及在Thr-Pro-Ser(SEQ ID NO：41)及Ser-Gly-Pro-Ala-Pro(SEQ ID NO：42)中具有一個胺基酸取代之胜肽。 在某些實施態樣中，該第二胜肽連接子係不存在。在較佳實施態樣中，該第一及第二胜肽連接子由經合併之10或 更少個胺基酸殘基組成。

在某些實施態樣中，該第二IL-12 p40結構域 (p40C)係IL-12 p40次單元之C端片段。適合作為第二IL-12 p40結構域(p40C)之p40的C端片段包含下列者、或由下列者組成：SEQ ID NO：2的第289至328、290至329、291至328、292至328、293至328、294至328、295至328、296至328、297至328、298至328、及299至328個胺基酸。

適合的第二IL-12 p40結構域(p40C)可為在C 端截斷了一或多個胺基酸殘基。因此，在另外實施態樣中，第二IL-12 p40結構域(p40C)包含下列之片段、或由下列片段組成：以SEQ ID NO：2的殘基289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、或299開始且以SEQ ID NO：2的殘基322、323、324、325、326、327、或328結束之SEQ ID NO：2片段。

本發明之代表性scIL-12多肽之全長序列在本 文中以SEQ ID NO：10呈現。該全長序列編碼含有預測信號肽在SEQ ID NO：10的第1至22個胺基酸，且成熟scIL-12多肽在SEQ ID NO：10的第23至533個胺基酸。

在另一特定實施態樣中，scIL-12多肽由包含 選自由SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：9的第67至1599個核酸所組成的群組之核酸序列之多核苷酸所編碼。

因此，本發明之第一標的關於一種經分離之 scIL-12多肽。在特定實施態樣中，經分離之多核苷酸包 含選自由SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：10的第23至533個胺基酸所組成的群組之胺基酸序列。

熟習本技術領域者可藉由利用本發明及如本文 所述之遺傳密碼簡併性或非普遍性(non-universality)製造其他多核苷酸以編碼本發明之多肽。

本發明之另外實施態樣包括scIL-12多肽之功 能性片段、或包含本發明之scIL-12多肽的融合蛋白(經融合至包含異源或通常非連續性之蛋白質結構域之第二多肽)。較佳的是，該第二多肽係諸如抗體之靶向性多肽，包括單鏈抗體或抗體片段。因此，本發明提供一種scIL-12多肽，其N-或C端融合至第二多肽(較佳為抗體、抗體片段、或單鏈抗體)。

本發明亦提供本發明之scIL-12多肽之變異 體。在某些實施態樣中，scIL-12變異體多肽係與SEQ ID NO：10之全長或成熟胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性，其中變異體多肽展現至少一種IL-12活性，諸如誘導IFN-γ自NK細胞分泌。此等IL-12活性可容易地使用本技術領域中已知之分析法測定，諸如美國專利5,457,038的實施例8中所述之分析法，其以引用方式併入本文中。

本發明亦關於包含根據本發明之經分離之多肽 的組成物。

組成物

本發明亦關於包含根據本發明之scIL-12多核苷酸或多肽的組成物。此等組成物可包含如上文所界定之scIL-12多肽或編碼scIL-12多肽之多核苷酸及可接受之載體或媒液。本發明之組成物特別適用於用於治療投與之生物材料調製劑。因此，在一個實施態樣中，組成物包含編碼scIL-12多肽之多核苷酸。在另一實施態樣中，組成物包含根據本發明之scIL-12多肽。

用語“可接受的”係指當投與時細胞或有機體為生理上可耐受的分子整體及組成物。該用語“載體”係指連同組成物投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒液。此等載體可以是無菌液體，諸如水及油，其包括石油、動物、植物或合成源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。可接受之載體的實例為鹽水、緩衝鹽水、等張鹽水(例如磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、或氯化鎂、或此等鹽類之混合物)、林格氏液、右旋糖、水、無菌水、甘油、乙醇、及彼等之組合。1,3-丁二醇及無菌不揮發油係方便利用作為溶劑或懸浮介質。可利用任何無刺激性不揮發油，包括合成之單-或二甘油酯。諸如十八烯酸之脂肪酸亦可用於製備可注射劑。較佳為利用水或水溶液鹽水溶液及水性右旋糖及甘油溶液作為載體，特別可用於可注射溶液。適合的醫藥載體係描述於E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”。本發明之醫藥組成物可經調配以供下列之目的：局部、口 服、非經腸胃、鼻內、靜脈內、肌內、腫瘤內、皮下、眼內等等的投與。

較佳的是，該組成物包含可接受之媒液以供可 注射調製劑之用。此媒液特別可為無菌的等張含鹽溶液(例如磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、或氯化鎂、或此等鹽類之混合物)、或乾燥(特別為經凍乾)之組成物，在適當時加入經消毒之水或生理食鹽水以形成可注射溶液。該較佳無菌可注射製劑可為於無毒、非經腸胃可接受之溶劑或稀釋劑中的溶液或懸浮液。

在又另一實施態樣中，組成物包含scIL-12多 肽或編碼該多肽之多核苷酸，其可於控制釋放系統中投遞。舉例而言，該多核苷酸或多肽可使用靜脈內輸注、可植入式滲透泵、經皮貼片、脂質體、或其他投與模式而投與。其他控制釋放系統於Langer之回顧論文中討論[Science 249：1527-1533(1990)]。

表現單鏈IL-12多肽

以scIL-12多肽之序列及編碼彼等之多核苷酸，可製備大量scIL-12多肽。藉由在細胞中適當表現載體，可達到高效率生產。之後，可使用標準純化方法，諸如硫酸銨沈澱、管柱層析術、電泳、離心、結晶及其他者。參見Methods in Enzymology各冊之典型上用於蛋白質純化之技術。或者，在一些實施態樣中，高效率生產係非必要，但在謹慎工程化的表現系統中存在已知的誘導蛋 白質係相當具有價值的。典型上，該表現系統將為細胞，但亦可構築試管內表現系統。

編碼scIL-12、或彼之片段、衍生物或類似 物、或彼之功能上具活性之衍生物(包括嵌合蛋白)之多核苷酸可插入適當表現載體，即包含必要元件以供轉錄及轉譯經插入之蛋白質編碼序列之用的載體。本發明之多核苷酸在表現載體中係可操作地與轉錄控制序列連接。表現載體較佳為亦包括複製起點。

本發明之經分離之多核苷酸可插入至任何適當 的選殖載體。可使用許多本技術領域中已知之載體-宿主系統。可能載體包括但不限於、質體或經改質之病毒，但該載體系統必須與所使用之宿主細胞相容。載體的實例包括但不限於大腸桿菌、噬菌體(諸如λ衍生物)、或質體諸如pBR322衍生物或pUC質體衍生物，例如pGEX載體、pmal-c、pFLAG等等。舉例來說，插入選殖載體可藉由將多核苷酸與具有互補黏性端之選擇載體連接而完成。然而，若於選殖載體中所使用之互補限制位點不存在可供多核苷酸片段之用者，該多核苷酸分子之末端可經酵素改質。或者，任何所欲之位點可藉由連接核苷酸序列(連接子)至DNA末端而製造；這些經連接之連接子可包含特定化學性合成寡核苷酸，其編碼限制內切酶辨識序列。較佳的是，該經選殖之基因係含在穿梭載體質體上，其在選殖細胞(例如大腸桿菌)中複製放大，且純化以供後續插入至適當的表現細胞系之用(若此為所欲者)。舉例而言，穿梭 載體為可在超過一種有機體中複製之載體，藉由將來自大腸桿菌質體之序列與來自酵母菌2μ質體序列連接而製備，以在大腸桿菌及釀酒酵母菌中複製。

此外，本發明關於一種表現載體，其包含根據 本發明之多核苷酸，其可操作地連接至轉錄調節元件。在一個實施態樣中，該多核苷酸係與表現控制序列可操作地連接，以允許scIL-12多肽在表現勝任宿主細胞中表現。 該表現控制序列可包含在欲進行表現的宿主細胞中具功能之啟動子。該載體可為質體DNA分子或病毒載體。在某些實施態樣中，病毒載體包括而未限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(adeno-associated virus)(AAV)、疱疹病毒、及牛痘病毒。本發明進一步關於複製缺陷性重組病毒，其包含彼之基因體、根據本發明之多核苷酸。因此，本發明亦關於一種經分離之宿主細胞，其包含此表現載體，其中轉錄調節元件在該宿主細胞中運作。

該所欲之基因將插入至任何廣泛選擇之表現載體。適當載體及細胞系的選擇取決於所欲之產物的限制。典型的表現載體係描述於Sambrook等人(1989)中。適合的細胞系可選自寄存單位，諸如ATCC。參見ATCC Catalogue of Cell Lines and Hybridomas(6th ed.)(1988)；ATCC Cell Lines,Viruses,and Antisera，各者以引用方式併入本文中。該載體藉由例如Sambrook et al.(1989)中所述之標準轉形或轉染程序導入所欲之細胞。

融合蛋白典型上藉由重組核酸方法或藉由合成多肽方 法所製。用於核酸操作之技術通常例如描述於Sambrook et al.(1989),Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory，其以引用方式併入本文中。用於合成多肽之技術描述於例如Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85：2149-2156(1963)。

一旦特定重組DNA分子經鑑別且分離，任何 本技術領域中已知的多重方法可使用以增殖彼。一旦適當之宿主系統及生長條件被建立後，重組表現載體可被大量增殖及製備。如先前所述者，可使用之表現載體包括但不限於下列載體或彼等之衍生物：人或動物病毒諸如牛痘病毒、腺病毒及腺相關病毒(adeno-associated virus)(AAV)；昆蟲病毒諸如桿狀病毒；酵母菌載體；噬菌體載體(例如λ)；及質體及黏質體DNA載體等。

此外，宿主細胞株可經選擇，其以特定所欲之 方式調節插入序列之表現、或改變及加工基因產物。不同宿主細胞具有特徵及特定機制以供蛋白質的轉譯及轉譯後加工及修飾。適當細胞系或宿主系統可經選擇以確保被表現之外來蛋白質的所欲之修飾及加工。在酵母菌中之表現可製造生物活性產物。在真核細胞中表現可增加該“天然”折疊之可能性。再者，在哺乳動物細胞中之表現可提供用於重建或構成scIL-12活性之工具。又，不同載體/宿主表現系統可影響加工反應(諸如蛋白分解截切)至不同程度。

載體經由該領域已知之方法導入所欲之宿主細 胞內，例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、 DEAE聚葡糖、磷酸鈣沉澱、脂轉染(溶體融合)、粒子轟擊、使用基因槍或DNA載體轉運蛋白(見例如Wu et al.,1992,J.Biol.Chem.267：963-967；Wu and Wu,1988,J.Biol.Chem.263：14621-14624；Hartmut et al.,加拿大專利申請案第2,012,311號，1990年3月15日申請)。

可溶形式之蛋白質的獲得，可藉由收集培養 液，或例如藉由以清潔劑處理而溶解包涵體，且若需要時，音波處理或如上述之其他機械方法。該經溶解或可溶性蛋白質可使用各種技術而分離，諸如聚丙醯胺凝膠電泳(PAGE)、等電聚焦、2維凝膠電泳、層析術(例如離子交換、親和性、免疫親和性、及粒度分級管柱層析術)、離心、差分溶解度、免疫沈澱、或藉由任何蛋白質純化之其他標準技術。

包含scIL-12聚核苷酸之載體及基因表現卡匣

本發明亦關於一種載體，其包含編碼根據本發明之scIL-12多肽的多核苷酸。本發明亦提供一種基因表現卡匣，其包含編碼根據本發明之scIL-12多肽的多核苷酸。本發明之經適當併入載體或基因表現卡匣中之多核苷酸及包含彼等之組成物可用於增強免疫系統功能(例如作為疫苗佐劑)及與其他免疫調節劑及/或小分子藥物併用以治療感染及癌症。它們可被使用以供在任何種類之細胞或組織中試管內或活體內轉送及表現基因。又，轉形可靶向化(轉送至特定組織，特別是可藉由載體之選擇而決定， 且藉由特定啟動子選擇而表現)。本發明之多核苷酸及載體本發明係有利地用於活體內製造本發明之scIL-12多肽。

編碼本發明之scIL-12多肽的多核苷酸可用於 質體載體中。較佳的是，表現控制序列可操作地連接至該scIL-12多核苷酸編碼序列，以供表現scIL-12多肽。表現控制序列可為任何在能夠轉形或轉染宿主細胞之載體中之增強子、反應元件、或啟動子系統。一旦該載體經併入適當宿主，該宿主取決於用途將維持在適合高量表現多核苷酸之條件下。

序列經可操作地連接至表現控制序列(即經定 位以確保表現控制序列功能)之後，多核苷酸通常會於宿主內表現。這些表現載體典型上可在宿主有機體中以游離基因體(episome)或宿主染色體DNA整體部分複製。通常，表現載體含有選擇標誌，例如四環黴素或新黴素，以允許偵測經所欲之DNA序列轉形之細胞(參見例如美國專利4,704,362，其以引用方式併入本文中)。

大腸桿菌係一種原核生物宿主，其可用於選殖 本發明之多核苷酸。其他適用之微生物宿主包括而未限於桿菌，如枯草桿菌，及其他腸桿菌科，諸如沙門桿菌屬、鋸桿菌、及各種假單胞菌屬菌種。

可使用其他真核細胞，包括而未限於酵母菌細 胞、昆蟲組織培養細胞、鳥類細胞等。較佳的是，使用哺乳動物組織細胞培養以製造本發明之多肽(參見 Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.(1987)，其以引用方式併入本文中).

表現載體亦可包括而未限於：表現控制序列，諸如複製起點、啟動子、增強子、反應元件、及必要加工資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪切位點、聚腺苷酸化位點、及轉錄終止子序列。較佳的是，該增強子或啟動子為天然上與編碼IL-12次單元p40及p35之基因相關聯者，儘管可理解的是在許多例子中其他者為相當或更適當。在進一步實施態樣中，表現控制序列係源自病毒(諸如SV40、腺病毒、牛乳突狀瘤病毒等)之增強子或啟動子。

包含本發明之多核苷酸之載體可藉由熟知方法(取決於細胞宿主型而各異)轉送至宿主細胞中。舉例而言，氯化鈣轉染常用於原核生物細胞，而磷酸鈣處理可使用於其他細胞宿主。(通常參見Sambrook et al.(1989),Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.),Cold Spring Harbor Press，其以引用方式併入本文中)。該用語“轉形細胞”意指亦包括該轉形細胞之後代。

可能的宿主-載體系統包括但不限於經病毒感染之哺乳動物細胞系統(例如牛痘病毒、腺病毒、腺相關病毒(adeno-associated virus)等等)；經病毒感染之昆蟲細胞系統(例如桿狀病毒)；微生物，諸如含有酵母菌載體之酵母菌；或以噬菌體、DNA、質體DNA、或黏質體DNA轉形之細菌。該載體之表現元件的強度及特異性各異。取 決於所利用之宿主-載體系統，可使用許多適合的轉錄及轉譯元件中之任一者。

本發明之重組scIL-12蛋白質、或彼之功能性 片段、衍生物、嵌合構築體、或類似物，在編碼序列藉由重組嵌入之後可為染色體表現。就此方面，許多擴增放大系統之任何者均可使用以達到高量穩定基因表現(見Sambrook et al.,1989,同上)。

含有包含scIL-12多核苷酸之重組載體的細胞 培養於適當細胞培養基中，在提供細胞表現scIL-12多肽表現條件下。可使用任何先前描述用於將DNA片段插入選殖載體之方法，以構築含有由適當轉錄/轉譯控制信號及蛋白質編碼序列組成之基因表現載體。這些方法可包括試管內重組DNA和合成技術及活體內重組(基因重組)。

多核苷酸編碼scIL-12多肽可藉由可操作地連 接至任何調節區域(即本技術領域中已知之啟動子/增強子元件)並受其控制，但這些調節元件必須在選擇用於表現之宿主細胞中具功能性。該調節區域可包含啟動子區域以供在宿主細胞中的功能性轉錄，以及位於所關注基因的3’之區域，且其指定轉錄終止及聚腺苷酸化位點信號。所有這些元素構成表現卡匣。

包含編碼本發明之scIL-12多肽之多核苷酸的 表現載體可藉由五個一般方式辨識：(a)PCR擴增所欲之質體DNA或特定mRNA、(b)核酸雜交、(c)選擇標誌基因功能存在或不存在、(d)以適當限制內切酶分析、及(e) 插入序列之表現。在第一個方式中，核酸可經PCR擴增以供偵檢經擴增之產物。在第二個方式中，插入表現載體之外來基因的存在可藉由使用包含與插入之標誌基因同源之序列的探針來核酸雜交而偵測。在第三個方式中，重組載體/宿主系統可基於某些由外來基因插入載體所造成之“篩選標誌”基因功能(例如β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、抗生素抗性、轉形表型、桿狀病毒的包含體(inclusion body)形成等等)的存在或不存在而辨識及篩選。在另一實施例中，若該編碼scIL-12多肽之核酸插在載體的“篩選標誌”基因序列內，包含scIL-12核酸插入之重組體可藉由缺少該基因功能而辨識出。在第四個方式中，重組表現載體藉由以適當限制酵素消化而辨識。在第五個方式中，重組表現載體可藉由分析該重組體所表現之基因產物活性、生化、或免疫特性而辨識，惟經表現之蛋白質假設為功能性活性構形。

各種宿主/表現載體組合可用於表現此發明之 DNA序列。例如，可用的表現載體可由染色體、非染色體及合成DNA序列之區段組成。適合的載體包括但不限於SV40衍生物及已知的細菌質體，例如大腸桿菌質體col El、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith et al.,1988,Gene 67：31-40)、pMB9及彼等之衍生物、諸如RP4之質體；噬菌體DNA，例如各種噬菌體1衍生物，例如NM989、及其他噬菌體DNA，例如M13及絲狀噬菌體單股DNA；酵母菌質體，諸如該2m質體或其衍生物；可 用於真核細胞之載體，如可用於昆蟲或哺乳動物細胞之載體；源自質體及噬菌體DNA組合之載體，諸如經修改以利用噬菌體DNA或其他表現控制序列之質體等等。

本發明亦提供一種基因表現卡匣，其能夠在宿 主細胞中表現，其中該基因表現卡匣包含編碼根據本發明之scIL-12多肽的多核苷酸。因此，申請人之發明亦提供可用於scIL-12表現系統中之新穎基因表現卡匣。

本發明之基因表現卡匣可包括基因開關，以允 許藉由加入或移除特定配體而調控基因表現。在一個實施態樣中，該基因開關係一種其中基因表現之量取決於配體之存在量的基因開關。可用於本發明之基因開關之配體依賴性轉錄因子複合物之實例包括但不限於由彼等之個別配體(糖皮質素、雌激素、黃體激素、類視色素、蛻皮激素及彼等之類似物或擬似物)所活化之核受體超家族之成員；由四環素活化之rTTA；以生物素為基礎之開關系統；FKBP/雷帕黴素(rapamycin)開關系統；茴香酸酯(cumate)開關系統；核糖開關(riboswitch)系統等等。

在本發明之一個態樣中，基因開關為以EcR為 基礎之基因開關。此等系統的實例包括而未限制，該系統描述於下列中：PCT/US2001/009050(WO 2001/070816)；美國專利7,091,038；7,776,587；7,807,417；8,202,718；PCT/US2001/030608(WO 2002/029075)；美國專利8,105,825；8,168,426；PCT/US2002/005235(WO 2002/066613)；美國專利申請號10/468,200(美國公開號 20120167239)；PCT/US2002/005706(WO 2002/066614)；美國專利7,531,326；8,236,556；8,598,409；PCT/US2002/005090(WO 2002/066612)；美國專利申請號10/468,193(美國公開號20060100416)；PCT/US2002/005234(WO 2003/027266)；美國專利7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067；PCT/US2002/005708(WO 2002/066615)；美國專利申請號10/468,192(美國公開號20110212528)；PCT/US2002/005026(WO 2003/027289)；美國專利7,563,879；8,021,878；8,497,093；PCT/US2005/015089(WO 2005/108617)；美國專利7,935,510；8,076,454；PCT/US2008/011270(WO 2009/045370)；美國專利申請號12/241,018(美國公開號20090136465)；PCT/US2008/011563(WO 2009/048560)；美國專利申請號12/247,738(美國公開號20090123441)；PCT/US2009/005510(WO 2010/042189)；美國專利申請號13/123,129(美國公開號20110268766)；PCT/US2011/029682(WO 2011/119773)；美國專利申請號13/636,473(美國公開號20130195800)；PCT/US2012/027515(WO 2012/122025)；及美國專利申請號14/001,943(美國公開號[等待中])，各者全部以引用方式併入。

在本發明之另一態樣中，該基因開關係以 FK506結合蛋白(FKBP)與FKBP雷帕黴素相關蛋白(FRAP)之異二聚化為基底，且由雷帕黴素或彼之非免疫抑制性類似物調節。該等系統之實例包括但不限於ARGENT^TM Transcriptional Technology(ARIAD Pharmaceuticals,Cambridge,Mass.)及美國專利6,015,709、6,117,680、6,479,653、6,187,757及6,649,595所描述之系統。

在本發明之另一態樣中，本發明之基因表現卡 匣併入茴香酸酯開關系統，其透過CymR抑制子(repressor)高親和性結合茴香酸酯操作子序列而作用。 (SparQ^TM Cumate Switch,System Biosciences,Inc.)該抑制係透過加入茴香酸酯(一種結合至CymR的無毒性小分子)而減輕。此系統具有動態誘導性，可精細地調節且係可逆及可誘導的。

在本發明之另一態樣中，本發明之基因表現卡 匣併入核糖開關，其係信使RNA分子之調節區段，會結合效應子，產生mRNA所編碼之蛋白質的製造之改變。含有核糖開關之mRNA係直接涉及在反應其效應子分子之濃度而調控其自身活性。效應子可為源自嘌呤/嘧啶、胺基酸、維生素、或其他小分子輔助因子之代謝物。這些效應子作為用於核糖開關感應子(sensor)或適配體(aptamer)。 Breaker,RR.Mol Cell.(2011)43(6)：867-79。

在本發明之另一態樣中，本發明之基因表現卡匣併入以生物素為基礎之基因開關系統，其中細菌抑制子蛋白質TetR融合至卵白素，其與融合至VP16之合成性生物素化信號AVITAG交互作用以活化基因表現。AVITAG胜肽的生物素化係藉由細菌生物素連接酶BirA而調控，由此能進行配體反應性(ligand responsiveness)。 Weber et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104,2643-2648；Weber et al.(2009)Metabolic Engineering,11(2)：117-124。

其他適用於本發明之基因開關系統為本技術領 域中所熟知，其包括但不限於Auslander and Fussenegger,Trends in Biotechnology(2012),31(3)：155-168中所述者，其以引用方式併入本文中。

用於基因開關系統之配體之實例包括但不限於 蛻皮類固醇(ecdysteroid)，諸如蛻皮激素、20-羥基蛻皮激素、松固酮A(ponasterone A)、米樂固酮A(muristerone A)及該類似物、9-順-視網酸、視網酸之合成性類似物、N,N’-二醯基肼諸如該些於美國專利6,013,836、5,117,057、5,530,028及5,378,726及美國公開申請案2005/0209283及2006/0020146中所揭示者；美國專利公開申請案2004/0171651所描述之噁二唑啉；二苯甲醯基烷基氰基肼，諸如歐洲專利申請案461,809所揭示者；N-烷基-N,N’-二芳醯基肼，諸如美國專利第5,225,443號所揭示者；N-醯基-N-烷羰基肼，諸如歐洲專利申請案第234,994號所揭示者；N-芳醯基-N-烷基-N’-芳醯基肼，諸如美國專利4,985,461所描述者；醯胺基酮，諸如美國專利公開申請案2004/0049037所描述者；其各以引用方式併入本文中，且其他類似物質包括3,5-二-三級丁基-4-羥基-N-異丁基-苯甲醯胺、8-O-乙醯哈巴苷(8-O-acetylharpagide)、氧基固醇(oxysterol)、22(R)羥基膽固 醇、24(S)羥基膽固醇、25-環氧基膽固醇、T0901317、5-α-6-α-環氧基膽固醇-3-硫酸鹽(ECHS)、7-酮膽固醇-3-硫酸鹽、法尼醇(framesol)、膽汁酸、1,1-雙膦酸酯、青春激素III等等。可用於本發明之二醯基肼配體之實例包括RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N’-(2-甲基-3-甲氧基-苄醯基)-醯肼)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苄酸N-(1-三級丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苄醯基)-醯肼)及RG-115830(3,5-二甲基-苄酸N-(1-三級丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)。參見例如美國專利申請號12/155,111、及PCT申請號PCT/US2008/006757，兩者全部以引用方式併入本文中。

單鏈IL-12多肽之抗體

根據本發明，製造重組性或藉由化學合成所製造之scIL-12多肽及彼之片段或其他衍生物或類似物(包括融合蛋白)，可使用作為抗原或免疫原，以產製抗體。較佳的是，該抗體特定言之會結合scIL-12多肽，但不結合天然IL-12多肽。較佳的是，該抗體特異性結合scIL-12多肽，但不結合天然IL-12多肽。

在另一實施態樣中，本發明關於一種抗體，其特異性結合包含如上述之根據本發明之scIL-12多肽片段之抗原性胜肽。該抗體可為多株或單株，且可藉由試管內或活體內技術所製造。

本發明之抗體結合至特定scIL-12多肽具特異 性。因此，可製造定性或定量測定這些或同源性多肽之存在的試劑。或者，這些抗體可使用以分離或純化scIL-12多肽。

為製造多株抗體，選擇適當標的免疫系統，典 型上為小鼠或兔。將實質上經純化之抗原以適合該動物之方法及其他免疫學家熟知之參數所決定之方式呈現至該免疫系統。典型注射位點為爪墊、肌內、腹膜內、或皮內。 當然，可以另一物種可取代小鼠或鼠。

免疫反應通常以免疫分析來分析。通常此等免 疫分析涉及一些抗原來源的純化，例如，藉由相同細胞製造，且以與抗原相同方式製造。該免疫分析可為放射免疫分析、酶聯分析(ELISA)、螢光分析、或許多其他選擇之任一者，大部分功能性相同，但在特定條件下可展現優點。

具有高親和性之單株抗體典型上係藉由例如下 列中所述之標準程序所製：Harlow and Lane(1988),Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory；或Goding(1986),Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(2d ed)Academic Press,New York，彼等以引用方式併入本文中。簡言之，將選擇適當動物，並依照所欲之免疫化操作程序。在適當的一段時間後，將動物之脾切下，且典型上在適當選擇條件下將個別的脾細胞融合至經永生化之骨髓瘤細胞。之後，分別將細胞分離株化，且測試各株的上清液是否製造對抗原的所欲 之區域具特異性之適當抗體。

其他適合的技術涉及淋巴球於試管內暴露至抗 原性多肽或篩選噬菌體或類似載體中之抗體庫。參見Huse et al.,(1989)“Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda,”Science 246：1275-1281，其以引用方式併入本文中。

本發明之多肽及抗體可在有修飾或未有修飾下 而使用。通常，多肽及抗體會藉由共價或非共價結合提供可偵測信號之物質而標示。各種標記及共軛化技術為已知者且廣泛地報導於科學性及專利文獻中。適合的標記包括而不限於放射性核種、酵素、基質、輔因子、抑制劑、螢光、化學發光、磁性顆粒等等。教示使用此等標記之專利包括美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241。又，可製造重組免疫球蛋白，參見Cabilly的美國專利4,816,567。

當分子可與免疫系統中的抗原識別分子(如免 疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體)特異性相互作用時，其是“抗原性”分子。抗原性多肽含有至少約5個、且較佳為至少約10個胺基酸。分子的抗原性部分可為對抗體或T細胞受體辨識為免疫顯性(immunodominant)的部分，或也可以為用於藉由將抗原性部分共軛至載體分子以供免疫化作用而產生對分子之抗體之部分。抗原性分子本身不需要 是致免疫性的，即能夠不需載體而引起免疫反應。

此等抗體包括但不限於多株、單株、嵌合、單 鏈、Fab片段、及Fab表現庫。本發明之scIL-12抗體可為交叉反應性，例如彼等可辨識源自不同物種之scIL-12多肽。多株抗體具有較大交叉反應性之可能性。或者，本發明之抗體可對scIL-12多肽之單一型(例如人scIL-12多肽)具特異性。較佳的是，此等抗體對人scIL-12具特異性。

各種本技術領域中已知之程序可用於製造多株 抗體。對於抗體的製造，各種宿主動物可藉由注射scIL-12多肽或彼之衍生物(例如片段或融合蛋白)而免疫化，動物包括但不限於兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等等。在一個實施態樣中，scIL-12多肽或彼之片段可經共軛至致免疫性載體，例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔帽貝血藍素(KLH)。各種佐劑可用以增加免疫反應，其取決於宿主物種，佐劑包括但不限於弗氏佐劑(完全及不完全)、礦物凝膠，諸如氫氧化鋁、表面活性物質，諸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、多價陰離子、胜肽、油乳化劑、鑰孔帽貝血藍素、二硝基酚、及可能可用之人佐劑，諸如BCG(卡介苗)及小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。

對於製備抗scIL-12多肽之單株抗體，或彼等 之片段、類比、或衍生物，可使用任何藉由連續培養細胞系供製造抗體分子之技術。這些包括但不限於原由Kohler and Milstein[Nature 256：495-497(1975)]所開發之融合瘤 技術、和三體雜交瘤(trioma)技術、人B-細胞融合瘤技術[Kozbor et al.,Immunology Today 4：72 1983)；Cote et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030(1983)]、及EBV-融合瘤技術，以製造人單株抗體[Cole et al.,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96(1985)]。在本發明之另外實施態樣中，單株抗體可於無菌動物中被製造[International Patent Publication No.WO 89/12690，1989年12月28日公開]。 事實上，根據本發明，可使用為藉由剪接(splicing)來自小鼠的scIL-12多肽特異性抗體分子基因連同來自人的適當生物活性之抗體分子基因製造“嵌合抗體”[Morrison et al.,J.Bacteriol.159：870(1984)；Neuberger et al.,Nature 312：604-608(1984)；Takeda et al.,Nature 314：452-454(1985)]所開發之技術；此等抗體在此發明之範圍內。此等人或人化嵌合抗體較佳為用於治療人的疾病或失調(於下文討論)，因為相較於異種基因抗體，人或人化抗體本身較不可能誘發免疫反應、特別是過敏反應。

根據本發明，描述用以製造單鏈Fv(scFv)抗體 之技術[U.S.Patent Nos.5,476,786 and 5,132,405 to Huston；U.S.Patent 4,946,778]可經適配以製造scIL-12多肽特異性單鏈抗體。本發明之另外實施態樣利用描述用以構築Fab表現庫之技術[Huse et al.,Science 246：1275-1281(1989)]以允許快速且容易鑑定對scIL-12多肽、或彼之衍生物、或類似物具有所欲之特異性之單株Fab片段。

含有抗體分子之遺傳性型(idiotype)的抗體片段 可藉由已知技術產生。舉例而言，此等片段包括但不限於：F(ab’)₂片段，其可藉由胃蛋白酶消化抗體分子而製造；Fab’片段，其可藉由還原F(ab’)₂片段的雙硫鍵而產生，而Fab片段可以木瓜酶及還原劑處理抗體分子而產生。

在製造抗體中，篩選所欲之抗體可藉由本技術 領域中已知技術達成，例如放射免疫分析、ELISA(酵素連接免疫吸附分析)、“三明治”免疫分析、免疫放射量分析、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、原位免疫分析(例如使用膠態、酵素或放射性同位素標記)、西方印漬、沈澱反應、凝集分析(例如凝膠凝集分析、血球凝集分析)、補體固定分析、免疫螢光分析、蛋白質A分析、及免疫電泳分析等等。在一個實施態樣中，抗體結合係藉由偵測初級抗體上的標記而偵測。在另一實施態樣中，該初級抗體係藉由偵測二級抗體或試劑與初級抗體之結合而偵測。在進一步實施態樣中，該第二抗體經標示。許多用於在免疫分析中偵測結合之方法為本技術領域中已知者，且在本發明之範圍內。舉例而言，欲篩選辨識scIL-12多肽特定抗原決定區之抗體，可分析所產生之融合瘤是否有與含有此抗原決定區之scIL-12多肽片段結合之產物。

使用任何上述之偵檢技術或本技術領域中已知 者，前述之抗體可用於本技術領域中已知相關於scIL-12多肽的定位及活性之方法，例如西方印漬、scIL-12多肽 原位顯像、測量彼之在適當生理樣品的量等等。

單鏈IL-12多核苷酸及多肽之使用

本發明之scIL-12多肽及多核苷酸具有各種用途。舉例而言，本發明之多核苷酸及多肽可用於治療刺激免疫功能可能有益的疾病。在特定實施態樣中，本發明之scIL-12多肽及多核苷酸可用於治療疾病狀態以增強γ干擾素的存在；治療病毒、細菌、原生動物、及寄生蟲感染；及治療增生性失調，例如癌。本發明之scIL-12多核苷酸及多肽可用於作為疫苗佐劑。

誘發IFN-γ製造之方法

本發明之scIL-12多肽及多核苷酸組成物可用於需要IFN-γ之病患誘發IFN-γ的製造。受益於IFN-γ誘發的病理狀態可源於疾病、輻射能或藥物曝露、及例如包括但不限於白血球減少症、細菌及病毒傳染、貧血、B細胞或T細胞不足，包括骨髓移植後免疫細胞或造血細胞不足。

治療感染之方法

根據本發明之ScIL-12多肽及多核苷酸組成物可用於治療病毒感染，其包括而未限於HIV、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、狂犬病病毒、脊髓灰白質炎病毒、流感病毒、腦膜炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、德國麻 疹、百日咳、腦炎病毒、乳頭狀瘤病毒、黃熱病毒、呼吸系融合細胞病毒、小病毒、屈公病病毒、出血熱病毒、克留氏菌屬、及疱疹病毒，特別是水痘病毒、細胞巨大病毒及EB(Epstein-Barr)病毒感染，及其他者。

根據本發明之scIL-12多肽及多核苷酸組成物 可用於治療細菌感染，其包括而未限於痳瘋、結核病、耶氏桿菌、傷寒熱、肺炎球菌性細菌感染、破傷風及炭疽，及其他者。

根據本發明之ScIL-12多肽及多核苷酸組成物 可用於治療寄生蟲感染，例如但不限於萊什曼病(leishmaniasis)及瘧疾，及其他者；以及原生動物感染，例如但不限於克魯氏錐蟲(T.cruzii)或蠕蟲，諸如住血吸蟲屬。

作為疫苗佐劑之使用方法

該scIL-12多肽及多核苷酸組成物可用於作為疫苗佐劑。“佐劑”意指當連同免疫原或抗原投與時增強免疫反應之物質。

根據本發明之ScIL-12多肽及多核苷酸組成物可用於增強對病毒(其包括而未限於HIV、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、狂犬病病毒、脊髓灰白質炎病毒、流感病毒、腦膜炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、德國麻疹、百日咳、腦炎病毒、乳頭狀瘤病毒、黃熱病毒、呼吸系融合細胞病毒、小病毒、屈公病病毒、出血熱病毒、克留氏 菌屬、及疱疹病毒，特別是水痘病毒、細胞巨大病毒及EB(Epstein-Barr)病毒)疫苗之免疫反應。

根據本發明之ScIL-12多肽及多核苷酸組成物 可用於增強對細菌疫苗(例如但不限於抗痳瘋、結核病、耶氏桿菌、傷寒熱、肺炎球菌性細菌感染、破傷風及炭疽之疫苗，及其他者)之免疫反應。

同樣地，根據本發明之多肽及多核苷酸可用於 增強對抗寄生蟲感染(諸如萊什曼病及瘧疾，及其他者)之疫苗及抗原生動物感染(例如克魯氏錐蟲)或蠕蟲(例如住血吸蟲屬)之疫苗之免疫反應。

根據本發明之ScIL-12多肽及多核苷酸組成物 亦可用於增強對治療性癌症疫苗之免疫反應。癌症疫苗可包含表現在癌細胞表面上之抗原。此抗原可天然存在於癌細胞上。或者，癌細胞可於活體外操作並以選定之抗原轉染，該抗原接著當導入病患中時即表現。可藉由本發明之多核苷酸及多肽而增強之癌症疫苗之非限制實例包括思普樂塞-T(Sipuleucel-T)(Provenge®)。

調製及投與疫苗佐劑之方法為本技術領域中已 知者，例如美國專利5,571,515，其以引用方式併入本文中。

治療癌之方法

根據本發明之scIL-12多肽及多核苷酸組成物可用以治療癌。可由根據本發明治療之癌的非限制實例包 括而未限於：乳癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮膚癌、胰癌、結腸癌、黑色素瘤、惡性黑色素瘤、卵巢癌、腦癌、原發性腦癌(primary brain carcinoma)、頭頸癌(head-neck cancer)、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭或頸上皮癌(head or neck carcinoma)、乳房上皮癌(breast carcinoma)、卵巢上皮癌、肺上皮癌、小細胞肺上皮癌、威爾姆斯瘤(Wilms’ tumor)、子宮頸癌、睪丸癌、膀胱上皮癌、胰腺癌(pancreatic carcinoma)、胃癌、結腸上皮癌(colon carcinoma)、前列腺上皮癌(prostatic carcinoma)、生殖泌尿上皮癌(genitourinary carcinoma)、甲狀腺癌、食道癌、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、腎上腺癌、腎細胞癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、惡性胰島瘤、惡性類癌上皮癌、絨毛膜癌、蕈狀肉芽腫(mycosis fungoides)、惡性高血鈣症、子宮頸增生(cervical hyperplasia)、白血病、急性淋巴球白血病、慢性淋巴球白血病、急性骨髓性白血病、慢性顆粒球性白血病(chronic granulocytic leukemia)、髮樣細胞白血病(hairy cell leukemia)、神經胚細胞瘤、橫紋肌肉瘤、卡波西氏肉瘤、真性紅血球增生症(polycythemia vera)、自發性血小板增多症(essential thrombocytosis)、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、軟組織肉瘤、間皮瘤、骨原性肉瘤、原發性巨球蛋白血症、及視網膜母細胞瘤等等。

本發明提供治療癌之方法，其包含將治療有效量之本發明之scIL-12多肽投與至病患。在某些實施態樣 中，該scIL-12多肽係腫瘤內投與。

本發明亦提供治療癌之方法，其包含將足以製 造治療有效劑量之scIL-12多肽之量的本發明之scIL-12多核苷酸投與至病患。在某些實施態樣中，該scIL-12多肽係腫瘤內投與。在另外實施態樣中，該scIL-12多核苷酸含括在表現載體中。在較佳實施態樣中，該表現載體係腺病毒載體或腺相關病毒(AAV)載體。

於癌之治療、預防、緩解及/或治癒中，本發 明之scIL-12多核苷酸及多肽可與一或多種治療劑及/或程序合併投與。

在特定實施態樣中，本發明之scIL-12多核苷 酸及多肽可與一或多種可用於治療癌症之化學治療劑合併投與，該化學治療劑包含但不限於烷化劑；氮芥子氣(鹽酸甲氮芥(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、依弗醯胺(ifosfamide)、黴法蘭(melphalan)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)；亞硝基脲類(雙氯乙基亞硝脲(carmustine)(BCNU)、環己亞硝脲(lomustine)(CCNU)、甲基環己亞硝脲(semustine)(甲基-CCNU)、伸乙亞胺/甲基三聚氰胺、三伸乙基三聚氰胺(TEM)、三伸乙基硫代磷醯胺(沙奧特帕(thiotepa))、六甲基三聚氰胺(HMM，六甲蜜胺(altretamine)))；磺酸烷基酯(二甲磺酸丁酯(busulfan))；三類(達卡巴仁(dacarbazine)(DTIC)；葉酸類似物(胺甲喋呤(methotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate)、愛寧達(Pemetrexed))；嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟去氧尿苷、吉 西他濱(gemcitabine)、胞嘧啶阿拉伯醣(AraC、阿糖胞苷(cytarabine))、5-氮雜胞苷、2,2’-二氟去氧胞苷)；嘌呤類似物(例如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、2-去氧柯福黴素(2-deoxycoformycin，噴司他丁(coformycin))、赤羥壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine，EHNA)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)及2-氯去氧腺苷(克拉曲濱(cladribine)、2-CdA))；第I型拓樸異構酶抑制劑(喜樹鹼、托普樂肯、抗癌妥(irinotecan))；生物反應調節劑(IL-2,G-CSF,GM-CSF)；分化劑(視網酸衍生物、荷爾蒙及拮抗劑)；腎上腺皮質類固醇/拮抗劑(強體松及等效物、地塞米松(dexamethasone)、胺麩精)；黃體素(例如羥助孕酮己酸酯(hydroxyprogesterone caproate)、乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate))；雌激素(乙烯雌酚(diethylstilbestrol)、乙烯雌二醇/等效物)；抗雌激素(他莫昔芬(tamoxifen))；雄性激素(丙酸睪固酮、氟甲睪酮(fluoxymesterone)/等效物)；抗雄性激素(氟他胺(flutamide)、促性腺激素釋放激素類似物及柳菩林(leuprolide)；非類固醇抗雄性激素(氟他胺)；天然產物；抗有絲分裂藥物；紫杉烷(Taxane)(太平洋紫杉醇、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、長春鹼(VLB)、長春新鹼(vincristine)、長春瑞濱(vinorelbine)、Taxotere(歐洲紫杉醇)、雌二醇氮芥(estramustine)、雌二醇氮芥磷酸鹽)；表鬼臼毒素(Epipodophylotoxins)(依妥普賽(etoposide)、坦 尼坡賽(teniposide))；抗生素(放線菌素D、道諾黴素(daunomycin)(紅比黴素(rubido-mycin))、艾黴素(doxorubicin)(阿黴素(adria-mycin))、米托蒽醌(mitoxantrone)、艾達黴素(idarubicin)、博來黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin，光輝黴素(mithramycin))、絲裂黴素C(mitomycin C)、放線菌素(dactinomycin)、阿非科林(aphidicolin))；酵素(L-天冬醯胺酸酶、L-精胺酸酶)；放射線致敏劑(甲硝唑、迷索硝唑(misonidazole)、去甲迷索達唑(desmethylmisonidazole)、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、RSU 1069、EO9、RB 6145、SR4233、菸鹼醯胺、5-溴去氧尿苷、5-碘去氧尿苷、溴去氧胞苷)；鉑配位錯合物(順鉑、卡鉑、益樂鉑(oxaliplatin))、蒽醌、邁杜蔥酮(mitoxantrone)；經取代脲(羥基脲)；氧氮磷(oxazaphosphorine)(環磷醯胺(cyclophosphamide)；依弗醯胺(ifosfamide)；曲磷胺(trofosfamide)；馬磷醯胺(mafosfamide)(NSC 345842)、格魯佛醯胺(glufosfamide)(D19575，β-D-葡苷基異磷醯胺芥子氣(beta-D-glucosylisophosphoramide mustard))、S-(-)-溴磷醯胺(S-(-)-溴磷醯胺)(CBM-11)、NSC 612567(醛基磷醯胺全氫噻(aldophosphamide perhydrothiazine)；NSC 613060(醛基磷醯胺四氫噻唑(aldophosphamide thiazolidine)；異磷醯胺芥子氣；帕依弗醯胺離胺酸(palifosfamide lysine)；甲肼衍生物(N-甲肼(MIH)、丙卡巴肼(procarbazine))；腎上 腺皮質抑制劑(米托坦(mitotane)(o,p’-DDD)、胺鲁米特(ainoglutethimide))；細胞介素(干擾素(α、β、γ)、介白素-2)；光敏感劑(血紫素衍生物、光螢素(Photofrin)、苯并紫質衍生物、Npe6、錫本紫質(tin etioporphyrin)(SnET2)、去鎂葉綠素酸-a、細菌葉綠素-a、萘酞青類(naphthalocyanines)、酞青素、鋅酞青素)；及輻射(X射線、紫外光、γ輻射、可見光、紅外輻射、微波輻射)。

投與模式

scIL-12多肽及多核苷酸可全身性或局部性(例如在疾病或失調位點)投與至個體。全身性投與可藉由任何適合方法，其包括皮下及靜脈內。局部投與可藉由任何適合方法，其包括而未限於腹膜內、脊髓內、室內(intraventricularly)、或藉由直接注射至組織或器官內，諸如腫瘤內注射劑。

在某些實施態樣中，scIL-12多核苷酸表現係藉由配體可誘導之基因開關系統而控制，諸如描述於例如下列中者：PCT/US2001/009050(WO 2001/070816)；美國專利7,091,038；7,776,587；7,807,417；8,202,718；PCT/US2001/030608(WO 2002/029075)；美國專利8,105,825；8,168,426；PCT/US2002/005235(WO 2002/066613)；美國專利申請號10/468,200(美國公開號20120167239)；PCT/US2002/005706(WO 2002/066614)；美國專利7,531,326；8,236,556；8,598,409；PCT/US2002/005090(WO 2002/ 066612)；美國專利申請號10/468,193(美國公開號20060100416)；PCT/US2002/005234(WO 2003/027266)；美國專利7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067；PCT/US2002/005708(WO 2002/066615)；美國專利申請號10/468,192(美國公開號20110212528)；PCT/US2002/005026(WO 2003/027289)；美國專利7,563,879；8,021,878；8,497,093；PCT/US2005/015089(WO 2005/108617)；美國專利7,935,510；8,076,454；PCT/US2008/011270(WO 2009/045370)；及美國專利申請號12/241,018(美國公開號20090136465)。在這些實施態樣中，一旦scIL-12多核苷酸在基因開關控制下已導入至個體，可投與活化配體以誘導本發明之scIL-12多肽之表現。可藉由任何適合方法(全身性(例如口服、靜脈內)或局部(例如腹膜內、脊髓內、室內、直接注射至疾病或失調正在發生之組織或器官，包括腫瘤內))投與配體。最佳配體投與時機可使用僅為例行之技術依各細胞類型及疾病或失調而判定。

在某些實施態樣中，scIL-12多核苷酸係經導 入試管內工程化細胞，諸如免疫細胞(例如樹突細胞、T細胞、自然殺手細胞)或幹細胞(例如間質幹細胞、子宮內膜幹細胞、子宮內膜再生細胞(ERC)、胚幹細胞)，該等試管內工程化細胞條件性表現scIL-12多肽在基因開關控制下，其可藉由活化配體而活化。此等方法例如於下列中詳述：PCT/US2008/011563(WO 2009/048560)；美國專利申請號12/247,738(美國公開號20090123441)； PCT/US2009/005510(WO 2010/042189)；美國專利申請號13/123,129(美國公開號20110268766)；PCT/US2011/029682(WO 2011/119773)；美國專利申請號13/636,473(美國公開號20130195800)；PCT/US2012/027515(WO 2012/122025)；及美國專利申請號14/001,943(美國公開號[等待中])。

在一個實施態樣中，免疫細胞或幹細胞係經包 含scIL-12多核苷酸之腺病毒載體或腺相關病毒(adeno-associated virus)載體轉染以製造試管內工程化細胞。

在一個實施態樣中，試管內工程化細胞或幹細 胞係自體細胞。在一個實施態樣中，試管內工程化細胞或幹細胞係同種異體的(allogeneic)。

本發明之一個實施態樣提供用於治療腫瘤之方 法，其依序包含下列步驟：1)將一群含有在基因開關之控制下的scIL-12載體之試管內工程化免疫細胞或幹細胞腫瘤內投與哺乳動物中；及2)將治療有效量之活化配體投與至該哺乳動物。

在某些實施態樣中，該哺乳動物係人。在其他 實施態樣中，該哺乳動物係狗、貓、或馬。

在一個實施態樣中，該活化配體係在與包含試 管內工程化細胞或載體(例如腺病毒或腺相關病毒)之組成物於實質上相同之時間投與，例如投與該細胞或該載體組成物的一小時前或後。在另一實施態樣中，活化配體係投與試管內工程化免疫細胞或幹細胞、或載體後的在或少於 約24小時投與。在又另一實施態樣中，活化配體係試管內工程化免疫細胞或幹細胞、或載體後的在或少於約48小時投與。在另一實施態樣中，該配體係RG-115932。在另一實施態樣中，該配體係以約1至50mg/kg/day之劑量而投與。在另一實施態樣中，該配體係以約30mg/kg/day之劑量而投與。在另一實施態樣中，該配體係每天投與共7至28天。在另一實施態樣中，該配體係每天投與共14天。在另一實施態樣中，大約1×10⁶至1×10⁸細胞係經投予。在另一實施態樣中，大約1×10⁷細胞係經投予。

本發明提供實質上純的多肽、彼等之生物活性 片段及編碼彼等之重組多核苷酸，本發明亦提供包含各彼等之細胞。藉由本領域中所熟知的適當之導入技術，可製造包含彼等之細胞。參見例如Sambrook et al.(1989)。

宿主細胞及非人有機體

本發明之另一態樣涉及scIL-12多肽編碼本發明之scIL-12多肽的經分離之多核苷酸之細胞。在特定實施態樣中，本發明關於一種經分離之宿主細胞，其包含編碼根據本發明之scIL-12多肽的多核苷酸之載體。本發明亦關於一種經分離之宿主細胞，其包含根據本發明之表現載體。在另一特定實施態樣中，本發明關於一種經分離之宿主細胞，其包含編碼根據本發明之scIL-12多肽的多核苷酸之基因表現卡匣。在另一特定實施態樣中，本發明關於一種經分離之宿主細胞，其經以包含編碼本發明之 scIL-12多肽之多核苷酸的基因表現調控系統轉染。在又另一實施態樣中，本發明關於一種用於製造scIL-12多肽之方法，其中該方法包含將包含編碼本發明scIL-12多肽之多核苷酸的經分離之宿主細胞在允許表現編碼scIL-12多肽之多核苷酸的條件下培養在培養基中，及自培養物中分離scIL-12多肽。

在一實施態樣中，經分離之宿主細胞係原核宿 主細胞或真核宿主細胞。在一實施態樣中，經分離之宿主細胞係無脊椎動物宿主細胞或脊椎動物宿主細胞。較佳的是，經分離之宿主細胞係選自由下列所組成的群組：細菌細胞、真菌細胞、酵母菌細胞、線蟲細胞、昆蟲細胞、魚細胞、植物細胞、禽細胞、動物細胞、及哺乳動物細胞。 舉例而言但未有限制，經分離之宿主細胞可為酵母菌細胞、線蟲細胞、昆蟲細胞、植物細胞、斑馬魚細胞、雞細胞、倉鼠細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、兔細胞、貓細胞、狗細胞、牛細胞、山羊細胞、乳牛細胞、豬細胞、馬細胞、綿羊細胞、非人的靈長類動物細胞(例如類人猿細胞、猴細胞、黑猩猩細胞)、或人細胞。

宿主細胞的實例包括但不限於真菌或酵母菌物 種，諸如麴菌屬、木黴屬(Trichoderma)、酵母菌屬、畢赤酵母菌屬、念珠菌屬、漢遜氏酵母菌屬(Hansenula)，或細菌物種，諸如集胞藻屬(Synechocystis)、聚球藻屬(Synechococcus)、沙門桿菌屬、芽孢桿菌屬、不動菌屬(Acinetobacter)、赤球菌屬(Rhodococcus)、鏈黴菌屬、艾 氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、甲基菌屬(Methylobacter)、產鹼桿菌屬(Alcaligenes)、集胞藻屬、念球藻屬(Anabaena)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)及克留氏菌屬者；動物；及哺乳動物宿主細胞。

在一實施態樣中，經分離之宿主細胞係選自由 酵母菌屬、畢赤酵母菌屬及念珠菌屬所組成的群組之酵母菌細胞的宿主細胞。

在另一實施態樣中，經分離之宿主細胞係優雅 隱桿線蟲(Caenorhabdus elegans)之線蟲細胞。

在另一實施態樣中，經分離之宿主細胞係選自 由下列所組成的群組之哺乳動物細胞：倉鼠細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、兔細胞、貓細胞、狗細胞、牛細胞、山羊細胞、乳牛細胞、豬細胞、馬細胞、綿羊細胞、非人的靈長類動物細胞(例如猴細胞、黑猩猩細胞)、及人細胞。

宿主細胞轉形係本技術領域中已熟知者，且可 藉由各種方法達成，該等方法包括但不限於電穿孔、病毒感染、質體/載體轉染、非病毒載體所調介之轉染、農桿菌屬所調介之轉形、粒子轟擊等等。所欲之基因產物之表現涉及將經轉形之宿主細胞於適合條件下培養並誘導轉形基因的表現。在原核及真核細胞中的培養條件及基因表現操作程序係本技術領域中已熟知者(參見實施例的一般方法一節)。可收獲細胞並根據針對基因產物之操作程序將基因產物分離。

此外，宿主細胞株可經選擇，其以特定所欲之 方式調節經轉染之多核苷酸之表現、或改變及加工多肽產物。不同宿主細胞具有特徵及特定機制以供蛋白質的轉譯及轉譯後加工及修飾[例如醣苷化、(例如信號序列之)截切]。適當細胞系或宿主系統可經選擇以確保被表現之外來蛋白質的所欲之修飾及加工。舉例而言，在細菌系統中之表現可用以製造未經醣苷化之核心蛋白質產物。然而，表現於細菌中之多肽可未經適當折疊。在酵母菌中之表現可製造經醣苷化之產物。在真核細胞中表現可增加異源蛋白質之“天然”醣苷化及折疊之可能性。再者，在哺乳動物細胞中之表現可提供用於重建或構成多肽活性之工具。 又，不同載體/宿主表現系統可影響加工反應(諸如蛋白分解截切)至不同程度。

申請人之發明亦關於一種包含根據本發明之經 分離之宿主細胞之非人之有機體。在特定實施態樣中，該非人之有機體係原核有機體或真核有機體。在另一特定實施態樣中，非人之有機體係無脊椎動物有機體或脊椎動物有機體。

在某些實施態樣中，非人之有機體係選自由下 列所組成的群組：細菌、真菌、酵母菌、線蟲、昆蟲、魚、植物、鳥、動物、及哺乳動物。更佳的是，非人有機體係酵母菌、線蟲、昆蟲、植物、斑馬魚、雞、倉鼠、小鼠、大鼠、兔、貓、狗、牛、山羊、乳牛、豬、馬、綿羊、或非人靈長類動物(諸如猿猴、猴、或黑猩猩)。

本發明可參照下列提供作為本發明之例示的非 限定性實例而有更佳的了解。

圖1. 顯示p40-p35單鏈建構(圖1A)、p35-p40單鏈建構(圖1B)、及ap40N-p35-p40C插入建構(圖1C)之示意圖。這些設計之構築及示性於實施例中詳述。

圖2. 人scIL-12設計之表現量，以p70 ELISA測定(見實施例2)。

圖3. 經scIL-12刺激之IFN-γ製造，以by ELISA測量(見實施例3)。

一般分子生物學技術

根據本發明，可利用習知分子生物學、微生物學、及本技術領域內之重組DNA技術。此等技術在文獻中有充分的說明。例如參見Green &Sambrook,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Fourth Edition(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(在本文中為“Green &Sambrook,2012”)；DNA Cloning：A Practical Approach,Volumes I and II,Second Edition(D.M.Glover and B.D.Hames,eds.1995)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization [B.D.Hames & S.J.Higgins eds. (1985)]；Transcription And Translation [B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.(1984)]；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications [R.I.Freshney(2010)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press,(1986)]；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning,Second Edition(1988)；F.M.Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(2013)。

習知選殖載具包括pBR322及pUC型質體及 M13系列噬菌體。這些可商業上獲得(例如Life Technologies Corporation；Promega Corporation)。

對於連接(ligation)，DNA片段可藉由瓊脂糖 或丙烯醯胺凝膠電泳根據彼等之大小而分離、以酚或以酚/氯仿混合物萃取、以乙醇沈澱，並接著於噬菌體T4 DNA連接酶(New England Biolabs,Inc.)的存在下根據供應商建議而培育。

5’的突出端之填滿可以大腸桿菌DNA聚合酶I 的Klenow片段(New England Biolabs,Inc.)根據供應商說明書來進行。3’突出端的破壞係在噬菌體T4 DNA聚合酶(New England Biolabs,Inc.)的存在下根據該製造商的建議而進行。5’突出端的破壞係以S1核酸酶藉由經控制之處理而進行。

藉由合成寡去氧核苷酸的試管內突變可根據 Taylor等人所開發之方法[Nucleic Acids Res.13(1985) 8749-8764]使用商用套組(諸如Life Technologies Corp.及Agilent Technologies,Inc.所配銷者)而進行。

以PCR[聚合酶催化鏈鎖反應，Saiki R.K.et al.,Science 230(1985)1350-1354；Mullis K.B.and Faloona F.A.,Meth.Enzym.155(1987)335-350]酵素擴增DNA片段技術可使用“DNA熱循環儀”(Life Technologies Corp.)根據製造商之說明書而進行。

核苷酸序列之檢定可藉由Sanger等人[Proc. Natl.Acad.Sci.USA,74(1977)5463-5467]所開發之方法、使用商用套組(諸如GE Healthcare及Life Technologies Corp所配銷者)而進行。

質體DNA可藉由Qiagen Plasmid Purification System並根據製造商之說明書而純化。

實施例1：scIL-12融合蛋白的設計

單鏈IL-12分子經設計以具有繪示於圖1之二種建構中之一種：(1)p40-連接子-p35建構(圖1A)含有全長p40次單元(包括野生型信號肽)，其經由胜肽連接子融合至成熟p35次單元(無信號肽)；(2)p40-連接子-p40建構(圖1B)含有全長p35次單元(包括野生型信號肽)，其經由胜肽連接子融合至成熟p40次單元(無信號肽)；(3)p40N-p35-p40C插入建構(圖1C)，其自N-至C 端包含：(i)第一IL-12 p40結構域(p40N)，(ii)隨意之第一胜肽連接子，(iii)IL-12 p35結構域，(iv)隨意第二胜肽連接子，及(v)第二IL-12 p40結構域(p40C)。

特定的人scIL-12構築體總結於表1中。在說明欄中以數字所指明之胺基酸殘基係指分別示於SEQ ID NO：2及4中之全長人p40或p35次單元胺基酸編號。舉例而言，scIL-12構築體ID 1481273的核酸及胺基酸序列分別對應SEQ ID NO：9及10，係p40N-p35-p40C插入建構；且經設計以自N-至C端含有第一p40結構域(p40N)(由SEQ ID NO：2的第1至293個胺基酸所組成)、第一連接子序列TPS(Thr-Pro-Ser；SEQ ID NO：41)、成熟p35序列(由SEQ ID NO：4的第57至253個胺基酸組成、第二胜肽連接子序列GPAPTS(Gly-Pro-Ala-Pro-Thr-Ser；SEQ ID NO：42)、及第二p40結構域(p40C)(由SEQ ID NO：2的第294至328個胺基酸組成)。

構築體ID 1481272(SEQ ID NO：11及12)亦為p40N-p35-40C插入建構，但該p35插入發生在p40次單元的胺基酸殘基259及260之間。

剩餘的scIL-12設計(構築體ID 1480533至1480546)代表具有各種如表1中所指示之連接子的p40-p35或p35-p40單鏈IL-12分子。

亦設計了平行的小鼠構築體，其使用小鼠p40 及p35序列(SEQ ID NO：5-8)而非人IL-12序列。

本發明之實施態樣包括而未限於上面表1中所 指示之scIL-12構築體。本發明之scIL-12構築體可包含、或可未含信號肽序列(不論有或未有信號肽的合成、或由於在試管內或活體內表現後於分泌形式中多肽截切及轉譯後加工會發生)。舉例而言，但不限於、相對於本發明之scIL-12構築體No.1481273(p40N_(1-293)-TPS-p35_(57-253)-GPAPTS- P40C_(294-328))實施態樣，亦包括此未有信號肽之多肽序列(例如p40N_(23-293)-TPS-p35_(57-253)-GPAPTS-p40C_(294-328))。同樣地，未有限制下，本發明之實施態樣包括任何示於表1中之剩餘scIL-12構築體且未有信號肽。

實施例2：ScIL-12融合蛋白於CHO細胞中的表現

構築含有人或鼠scIL-12(於所有情況中，選殖於NheI及ClaI位點之間)及源自人GAPDH之5’UTR元件、合成性3’UTR元件及在組成性CMV啟動子控制下的轉基因表現之載體。使用標準高通量轉染方法，將編碼人或小鼠scIL-12構築體之載體暫時性轉染至CHO-K1細胞(ATCC Accession CCL-61)內(三重複)。簡言之，CHO-K1細胞經胰蛋白酶處理、計數並再懸浮(120,000細胞/ml)於全生長培養基(F12-Ham(Sigma)+L-麩醯胺酸(Gibco)+10%FBS(Atlanta Biologicals))中。將一百五十(150)微升的細胞懸浮液加至96孔細胞培養盤(Corning)。質體DNA製備於無菌水中(100ng/μl)且以DNA對Fugene 6比例為3：1之下與Fugene 6試劑(Promega)形成複合物。將五(5)微升的DNA/Fugene 6複合物加至含有細胞之96孔盤。接著將細胞於37℃下培育48小時。培育後，收集培養物上清液，並冷凍於-80℃，待ELISA分析使用。陽性對照組包括表現二鏈IL-12(p35-IRES-p40及p40-IRES-p35，於圖2中分別標示為長條A及D)之載體。將來自經轉染之培養物上清液以R&D Systems Reagent Diluent+ 10%經調理 CHO-K1培養基稀釋為1：10、1：100、及1：1000。

scIL-12之表現根據製造商說明書以ELISA分 析程序偵測。R&D Systems，產品目錄#DY419(小鼠IL-12 ELISA)及#DY1270(人IL-12 ELISA)。每種載體以九個樣品分析。

在所評估之36個載體中有20個偵測到人scIL-12表現，範圍在500pg/mL至900ng/mL。見圖2。於36個測試之載體中有18個偵測到小鼠scIL-12表現。小鼠scIL-12表現量範圍在385pg/mL至1.8μg/mL(數據未顯示)。對於人及小鼠構築體，p40-連接子-p35建構展現表現量高於p35-連接子-p40建構二鏈(雙順反子)IL-12，顯示相較於p35-連接子-p40單鏈建構及二鏈IL-12，具有p40-連接子-p35布局(topology)的scIL-12具有增強之表現、折疊及/或異二聚體組合。

令人驚訝地，具有如下建構之人scIL-12構築體ID 1481273：p40N_{(1 to 293)}-TPS-p35_(57-253)-GPAPTS-p40C_{(294 to 328)}

產生scIL-12蛋白質表現量類似二鏈(雙順反子)載體(p40-IRES-p35及p35-IRES-p40)及單鏈p35-連接子-p40建構所製造的量，儘管未如同p40-linker-p35建構的高量。見圖2。對於小鼠scIL-12設計，有觀察到類似表現型態。具有p40N_(1-259)-GS-p35_(57-253)-PQTPGP-p40C_(260-328)建構的構築體ID 1481272未發現表現可偵測之蛋白質。

實施例3：scIL-12刺激NK細胞製造IFN-γ

自然殺手(NK)細胞於反應IL-12曝露而分泌干擾素γ(IFN-γ)。因此，於生物分析中測量NK-92細胞(ATCC存取號CRL-2407)(一種人的自然殺手細胞系)的IFN-γ之製造，偵測本發明之scIL-12設計的功能性活性。

根據製造商說明書，使用建議之培養基來培養NK-92細胞(Alpha Minimum Essential培養基且未有核糖核苷及去氧核糖核苷，具有2mM的L-麩醯胺酸；1.5g/L的碳酸氫鈉；0.2mM的肌醇；0.1mM的2-巰乙醇；0.02mM的葉酸；100-200U/ml的重組IL-2；調整至最終濃度為12.5%的馬血清及12.5%的胎牛血清)。該NK-92細胞在用於分析前24-48小時經次培養。於分析當天，NK-92細胞藉由以Trypan Blue染色計數且種至96孔盤(每孔5x10⁴細胞)。在實施例2中所獲得之CHO-K1/scIL-12培養物上清液以NK-92全生長培養基稀釋為1：5，並加至NK-92細胞。對照組包括下列之培養物上清液：來自未經轉染之CHO-K1細胞(在圖3中標示為“未經轉染(mock)”)及來自經以未表現IL-12之質體所轉染之CHO-K1細胞作為陰性對照組；以及陽性對照組，其由商業上可獲得之重組人IL-12(R&D Systems)組成，其以1250ng/ml或125ng/ml(在圖3中分別為左及右邊陽性對照組長條)測試。48小時後，收集NK-92細胞培養物上清液，並以R&D Systems Reagent Diluent稀釋為1：10、1：100、及1：1000。 培養基中的IFN-γ係使用R&D Systems Human IFN-gamma Duoset ELISA套組(產品目錄#DY285)測定。每種載體以九個樣品分析。

在NK-92中，人scIL-12蛋白質刺激人IFN-γ製造。人類IFN-γ表現量範圍在600pg/mL至33ng/mL。參見圖3。針對小鼠scIL-12構築體，觀察到類似IFN-γ量。

令人驚訝地，scIL-12構築體ID 1481273展現相對低的蛋白質表現量(參見實施例2)，證實在NK-92生物分析中重組二鏈IL-12及p40-p35單鏈構築體相同活性，顯示構築體ID 1481273以分子基礎上會更具活性。

<110> 英翠克頌公司

<120> 編碼單鏈IL-12之核酸、多肽及彼等之用途

<130> 2584.140TW01

<140> To Be Assigned

<141> Herewith

<150> 61/917,495

<151> 2013-12-18

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 987

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 328

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 762

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 253

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 1008

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 335

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 648

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 7

<210> 8

<211> 215

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 8

<210> 9

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1481273

<400> 9

<210> 10

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1481273

<400> 10

<210> 11

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1481272

<400> 11

<210> 12

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1481272

<400> 12

<210> 13

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480533

<400> 13

<210> 14

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480533

<400> 14

<210> 15

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480534

<400> 15

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<211> 541

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480534

<400> 16

<210> 17

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480535

<400> 17

<210> 18

<211> 542

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480535

<400> 18

<210> 19

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480536

<400> 19

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<211> 540

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480536

<400> 20

<210> 21

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480537

<400> 21

<210> 22

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480537

<400> 22

<210> 23

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480538

<400> 23

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480538

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<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480539

<400> 25

<210> 26

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480539

<400> 26

<210> 27

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480540

<400> 27

<210> 28

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480540

<400> 28

<210> 29

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480541

<400> 29

<210> 30

<211> 544

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480541

<400> 30

<210> 31

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480542

<400> 31

<210> 32

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480542

<400> 32

<210> 33

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480543

<400> 33

<210> 34

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480543

<400> 34

<210> 35

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480544

<400> 35

<210> 36

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480544

<400> 36

<210> 37

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480545

<400> 37

<210> 38

<211> 550

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480545

<400> 38

<210> 39

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480546

<400> 39

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<211> 546

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 融合蛋白構築ID 1480546

<400> 40

<210> 41

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成連接子

<400> 41

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成連接子

<400> 42

Claims (41)

1. 一種單鏈IL-12多肽，其從N端至C端包含：i.第一IL-12 p40結構域(p40N)，ii.隨意之第一胜肽連接子，iii.IL-12 p35結構域，iv.隨意第二胜肽連接子，及v.第二IL-12 p40結構域(p40C)；其中該第一IL-12 p40結構域(p40N)係p40次單元之N端片段；該IL-12 p35結構域係成熟p35次單元或彼之片段；且該第二IL-12 p40結構域(p40C)係p40次單元之C端片段。
2. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其包含N端訊息胜肽結構域。
3. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中該多肽不包含第一胜肽連接子、不包含第二胜肽連接子、或不包含第一胜肽連接子且不包含第二胜肽連接子。
4. 如請求項2之單鏈IL-12多肽，其中該多肽不包含第一胜肽連接子、不包含第二胜肽連接子、或不包含第一胜肽連接子且不包含第二胜肽連接子。
5. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：10的第23至533個胺基酸之多肽序列具有至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、或至少99%一致性之胺基酸序列。
6. 如請求項5之單鏈IL-12多肽，其包含SEQ ID NO：10的第23至533個胺基酸。
7. 如請求項2之單鏈IL-12多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：10之多肽序列具有至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、或至少99%一致性之胺基酸序列。
8. 如請求項7之單鏈IL-12多肽，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列。
9. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中該第一及第二胜肽連接子各包含選自由下列所組成的群組之胺基酸殘基數：a)0個胺基酸；b)1個胺基酸；c)2個胺基酸；d)3個胺基酸；e)4個胺基酸；f)5個胺基酸；g)6個胺基酸；h)7個胺基酸；i)8個胺基酸；j)9個胺基酸；及k)10個胺基酸。
10. 如請求項9之單鏈IL-12多肽，其中在該第一或 第二胜肽連接子中、或在兩者胜肽連接子中之胺基酸殘基包含任何一或多個選自由下列所組成的群組之胺基酸的組合：a)甘胺酸(Gly)；b)絲胺酸(Ser)；c)丙胺酸(Ala)；d)蘇胺酸(Thr)；及e)脯胺酸(Pro)。
11. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中該第一及第二胜肽連接子各選自Thr-Pro-Ser(SEQ ID NO：41)及Ser-Gly-Pro-Ala-Pro(SEQ ID NO：42)。
12. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中p40N包含與SEQ ID NO：2的第18至288個胺基酸、第18至298個胺基酸、第28至288個胺基酸、或第28至298個胺基酸具有至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、或至少99%一致性之多肽序列。
13. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中p40N包含SEQ ID NO：2之多肽序列之片段。
14. 如請求項13之單鏈IL-12多肽，其中p40N包含SEQ ID NO：2之多肽序列之片段，其中該片段之第一殘基開始於選自由下列所組成的群組之位置：a)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基18；b)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基19； c)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基20；d)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基21；e)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基22；f)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基23；g)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基24；h)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基25；i)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基26；j)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基27；及k)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基28，且，其中該片段最後的殘基結束於選自由下列所組成的群組之位置：l)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基288；m)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基289；n)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基290；o)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基291；p)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基292；q)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基293；r)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基294；s)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基295；t)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基296；u)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基297；及v)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基298。
15. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中p35包含與SEQ ID NO：4的第52至247個胺基酸、第52至253個胺 基酸、第62至247個胺基酸、或第62至253個胺基酸具有至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、或至少99%一致性之多肽序列。
16. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中p35包含SEQ ID NO：4之多肽序列之片段。
17. 如請求項16之單鏈IL-12多肽，其中p35包含SEQ ID NO：4之多肽序列之片段，其中該片段之第一殘基開始於選自由下列所組成的群組之位置：a)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基52；b)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基53；c)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基54；d)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基55；e)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基56；f)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基57；g)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基58；h)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基59；i)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基60；j)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基61；及k)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基62，且，其中該片段最後的殘基結束於選自由下列所組成的群組之位置：l)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基247；m)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基248； n)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基249；o)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基250；p)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基251；q)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基252；及r)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基253。
18. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中p40C包含與SEQ ID NO：2的第289至322個胺基酸、第289至328個胺基酸、第299至322個胺基酸、或第299至328個胺基酸具有至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、或至少99%一致性之多肽序列。
19. 如請求項1之單鏈IL-12多肽，其中p40C包含SEQ ID NO：2之多肽序列之片段。
20. 如請求項19之單鏈IL-12多肽，其中p40C包含SEQ ID NO：2之多肽序列之片段，其中該p40C片段之第一殘基開始於選自由下列所組成的群組之位置：a)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基289；b)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基290；c)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基291；d)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基292；e)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基293；f)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基294；g)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基295；h)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基296； i)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基297；j)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基298；及k)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基299，且，其中該片段最後的殘基結束於選自由下列所組成的群組之位置：l)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基322；m)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基323；n)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基324；o)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基325；p)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基326；q)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基327；及r)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基328。
21. 一種多核苷酸，其包含編碼如請求項1至20中任一項之單鏈IL-12多肽序列之核酸序列。
22. 如請求項21之多核苷酸，其中該多核苷酸包含與SEQ ID NO：9之第67至1599個核苷酸具有至少80%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、或至少99%一致性之核酸序列。
23. 如請求項22之多核苷酸，其中該多核苷酸包含SEQ ID NO：9之第67至1599個核酸。
24. 一種載體，其包含如請求項21至23中任一項之多核苷酸。
25. 如請求項24之載體，其中該載體另包含能夠調 控該單鏈IL-12多肽表現之基因開關。
26. 如請求項25之載體，其中該基因開關為以EcR為基礎之基因開關。
27. 如請求項24至26中任一項之載體，其中該載體為腺病毒、腺相關病毒(adeno-associated virus)、反轉錄病毒、或慢病毒(lentivirus)。
28. 一種經分離之宿主細胞或非人有機體，其經如請求項24至27中任一項之載體轉形或轉染。
29. 如請求項28之經分離之宿主細胞，其中該宿主細胞係免疫細胞或幹細胞。
30. 如請求項29之經分離之宿主細胞，其中該免疫細胞係樹突細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞、肥大細胞、嗜酸性細胞、嗜鹼性細胞、自然殺手細胞、或淋巴球細胞。
31. 如請求項30之經分離之宿主細胞，其中該淋巴球細胞係T細胞。
32. 如請求項29之經分離之宿主細胞，其中該幹細胞係間質幹細胞(mesenchymal stem cell)、子宮內膜幹細胞(endometrial stem cell)、或胚幹細胞。
33. 如請求項32之經分離之宿主細胞，其中該子宮內膜幹細胞係子宮內膜再生細胞(endometrial regenerative cell)(ERC)。
34. 一種治療病患之方法，其包含投與有效量的如請求項1至20中任一項之單鏈IL-12多肽。
35. 一種治療病患之方法，其包含投與有效量的如請 求項21至23中任一項之多核苷酸。
36. 一種治療病患之方法，其包含投與有效量的如請求項24至27中任一項之載體。
37. 一種治療病患之方法，其包含投與有效量的如請求項28至33中任一項之宿主細胞。
38. 一種藥物，其包含如請求項1至20中任一項之多肽、如請求項21至23中任一項之多核苷酸、如請求項24至27中任一項之載體、或如請求項28至33中任一項之經分離之宿主細胞。
39. 如請求項38之藥物，其中該藥物係以有效增強需要彼之病患的免疫反應之量而投與。
40. 如請求項38之藥物，其中該藥物可用於治療選自由下列所組成的群組之病況：癌症、感染性疾病、及免疫系統失調。
41. 如請求項40之藥物，其中該癌係選自由下列所組成的群組：乳癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮膚癌、胰癌、結腸癌、黑色素瘤、惡性黑色素瘤、卵巢癌、腦癌、原發性腦癌(primary brain carcinoma)、頭頸癌(head-neck cancer)、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭或頸上皮癌(head or neck carcinoma)、乳房上皮癌(breast carcinoma)、卵巢上皮癌、肺上皮癌、小細胞肺上皮癌、威爾姆斯瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸癌、膀胱上皮癌、胰腺癌(pancreatic carcinoma)、胃癌、結腸上皮癌(colon carcinoma)、前列腺上皮癌 (prostatic carcinoma)、生殖泌尿上皮癌(genitourinary carcinoma)、甲狀腺癌、食道癌、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、腎上腺癌、腎細胞癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、惡性胰島瘤、惡性類癌上皮癌、絨毛膜癌、蕈狀肉芽腫(mycosis fungoides)、惡性高血鈣症、子宮頸增生(cervical hyperplasia)、白血病、急性淋巴球白血病、慢性淋巴球白血病、急性骨髓性白血病、慢性顆粒球性白血病(chronic granulocytic leukemia)、髮樣細胞白血病(hairy cell leukemia)、神經胚細胞瘤、橫紋肌肉瘤、卡波西氏肉瘤、真性紅血球增生症(polycythemia vera)、自發性血小板增多症(essential thrombocytosis)、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、軟組織肉瘤、間皮瘤、骨原性肉瘤、原發性巨球蛋白血症、及視網膜母細胞瘤。