TW201620931A - 具有抗ｃ型肝炎病毒的感染抑制活性的抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供具有C型肝炎病毒(HCV)感染抑制活性的抗C型肝炎病毒E2蛋白質抗體或抗原結合性抗體片段。本發明還提供具有特定之可變區之具有C型肝炎病毒(HCV)感染抑制活性且顯示脫逸突變株(escape mutant)出現抑制性的抗C型肝炎病毒E2蛋白質抗體或抗原結合性抗體片段。

Description

具有抗C型肝炎病毒的感染抑制活性的抗體
本發明係關於具有抗C型肝炎病毒的感染抑制活性的抗體及其片段。
C型肝炎病毒(Hepatitis C virus：以下，亦有記載為HCV的情形)係被分類為黃病毒科肝炎病毒(Hepacivirus)屬的RNA病毒，被鑑定為非A非B肝炎之主要原因病毒(非專利文獻1)。
HCV雖主要藉由輸血而感染，但現今因高感度的HCV的檢測方法已被建立，輸血所致的新HCV感染患者正劇烈減少。另一方面，包含肝炎目前亦尚未顯現化的病毒帶原者的HCV保有者，推測於日本有高達200萬人以上，全世界有高達1億7000萬人以上。主要原因為因HCV感染所引起的肝炎之慢性化率為70~80%的高百分比，或藥劑治療未顯示充分的效果。因HCV感染所引起的慢性肝炎，即，C型慢性肝炎係有之後二十幾年的經過中到達肝硬化，最後則惡化成肝癌的可能性。雖然病狀進行至肝硬化的C型慢性肝炎患者係可藉由活體肝移植來治療，但已知於活體肝移植後約半數會復發肝炎，而現狀並無預防肝炎復發的手段(非專利文獻2)。
為了防止活體肝移植後之肝炎復發，正冀望以病毒的感染抑制或排除作為目的的抗體醫藥之開發。由於一般認為HCV感染之最初過程的HCV對細胞表面的結合係HCV之外套膜蛋白質(envelope protein)負責，故已進行了製作抗HCV外套膜蛋白質的抗體的研究。然而，由於雖然在C型肝炎患者之10%左右於血清中可觀察到抗HCV外套膜蛋白質抗體，但藉由抗HCV外套膜蛋白質抗體之出現而C型肝炎自然治癒者，為其中之約10%(非專利文獻3)，所以可被認定為藉由抗HCV外套膜蛋白質抗體而治癒的患者係不超過C型肝炎患者全體之少數的1%左右。這被推測係因抗HCV外套膜蛋白質的抗體產生被抑制或被抑制的機構存在(非專利文獻4)。又，亦已進行混合了自複數個抗HCV抗體陽性C型慢性肝炎患者之血漿所獲得的免疫球蛋白的製劑之檢討。然而，已知來自患者的抗HCV抗體混合製劑，即使是在活體肝移植時起就投予的情形，亦不會抑制血漿中HCV量(非專利文獻5)。
另一方面，非專利文獻4中已揭示使於哺乳動物中表現的HCV之外套膜蛋白質之一者的E2蛋白質，會特異性地結合在存在於人類細胞表面的CD81。基於此實驗結果，已嘗試自C型肝炎患者單離出顯示抑制E2蛋白質與CD81結合的NOB(結合之中和作用，Neutralisation of binding)活性的抗體。作為其代表例，而使用噬菌體顯示(phage display)法，從自感染了基因型1a之HCV的C型慢性肝炎患者的骨髓淋巴球所製作的 抗體基因庫，單離出呈現NOB活性的抗體(專利文獻1)。再者，已從自感染了基因型1b之HCV的C型肝炎患者之末梢B細胞所製作的融合瘤，單離出呈現NOB活性的抗體(非專利文獻6、專利文獻2)。然而，亦有報告呈現NOB活性的抗體係未必為會抑制感染者(非專利文獻7)。
又，在使用抗HCV抗體作為抗體醫藥之際，擔憂經由病毒基因體突變而獲得了對HCV感染抑制抗體之抑制活性之耐性的病毒突變株，即，脫逸突變株之出現。抗HCV抗體之投予所致的HCV之脫逸突變株的出現已於使用黑猩猩的實驗中被證實(非專利文獻8)。
非專利文獻9中係暗示對基因型2a之HCV具有感染抑制活性的抗HCV抗體會抑制脫逸突變株之出現，但實際上暗示脫逸突變株之出現的資料亦已被揭示(專利文獻3)。又，由於專利文獻3中並未顯示此等抗體之抗基因型1b之HCV的感染抑制活性，又，對所揭示的基因型1b之HCV的結合活性弱，故認為此等抗體沒有對基因型1b之HCV的充分之感染抑制活性。再者，專利文獻3中，關於此等抗體對基因型2a以外之基因型之HCV是否亦抑制脫逸突變株之出現尚不清楚。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 國際公開第2003/064473號
專利文獻2 國際公開第2004/005316號
專利文獻3 國際公開第2013/033319號
非專利文獻
非專利文獻1 Choo等人，Science，1989年，第244卷，p.359-362
非專利文獻2 Gane等人，Liver Transplantation，2003年，第9卷，ps28-s34
非專利文獻3 Matsuura等人，J.Virol.，1992年，第66卷，p.1425-1431
非專利文獻4 Gerlach等人，Gastroenterology，1999年，第117卷，p.933-941
非專利文獻5 Davis等人，Liver Transplantation，2005年，第11卷，p.941-949
非專利文獻6 Hadlock等人，J.Virol.，2000年，第74卷，p.10407-10416
非專利文獻7 Burioni等人，J.Virol.，2002年，第76卷，p.11775-11779
非專利文獻8 Morin等人，Plos Pathogens，2012年，第8卷，e1002895
非專利文獻9 Keck等人，Plos Pathogens，2012年，第8卷，e1002653
[發明概要]
對不限於特定基因型之HCV的複數個基因型之HCV具有感染抑制活性的抗HCV抗體，不僅對感 染複數個基因型之HCV的患者具有效果，因成為對象的患者的範圍廣泛，故特別有用於作為醫藥。因此，冀望對複數個基因型之HCV具有高感染抑制活性的抗HCV抗體。再者，正冀望強力抑制干擾素及利巴韋林(ribavirin)治療所難治性之基因型1b之HCV之感染的抗體。
又，脫逸突變株之出現係成為將抗HCV抗體開發作為醫藥之際的大的阻礙。因此，冀望呈現難以誘導脫逸突變株出現的脫逸突變株出現抑制性之抗HCV抗體。
所以，本發明之目的係提供抑制複數個基因型之HCV之感染的抗HCV抗體。再者，本發明之另一目的係提供呈現HCV之脫逸突變株出現抑制性的抗HCV抗體。
本發明者們為了解決上述課題而不斷專心研究的結果，發現了對複數個基因型之HCV具有高感染抑制活性的抗HCV抗體，還進一步達成發現了呈現脫逸突變株出現抑制性的HCV抗體。
即，本發明係提供以下各者。
(1)一種抗C型肝炎病毒E2蛋白質抗體或抗原結合性抗體片段，其具有C型肝炎病毒(HCV)感染抑制活性。
(2)如上述(1)記載之抗體或抗原結合性抗體片段，其呈現脫逸突變株出現抑制性。
(3)如上述(1)或(2)記載之抗體或抗原結合性抗體片段，其中前述抗體或抗原結合性抗體片段係包含以下之(a)或(b)之重鏈可變區： (a)包含序列識別號5所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號6所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號7所示的胺基酸序列所構成的CDR3的重鏈可變區；(b)包含序列識別號2所示的胺基酸序列的重鏈可變區。
(4)如上述(3)記載之抗體或抗原結合性抗體片段，其進一步包含輕鏈可變區。
(5)如上述(1)~(4)中任一項記載之抗體或抗原結合性抗體片段，其中前述抗體或抗原結合性抗體片段係包含以下之(c)~(f)之任一者之輕鏈可變區：(c)包含序列識別號8所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號9所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號10所示的胺基酸序列所構成的CDR3的輕鏈可變區；(d)包含序列識別號23所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號24所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號25所示的胺基酸序列所構成的CDR3的輕鏈可變區；(e)包含序列識別號4所示的胺基酸序列的輕鏈可變區；(f)包含序列識別號22所示的胺基酸序列的輕鏈可變區。
(6)一種抗體或抗原結合性抗體片段，其辨識與上述(5)記載之抗體或抗原結合性抗體片段相同的立體結構抗原決定位。
(7)如(1)記載之抗體或抗原結合性抗體片段，其包含以下之(g)或(h)記載之重鏈可變區及以下之(i)或(j)記載之輕鏈可變區：(g)包含序列識別號15所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號16所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號17所示的胺基酸序列所構成的CDR3的重鏈可變區；(h)包含序列識別號12所示的胺基酸序列的重鏈可變區；(i)包含序列識別號18所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號19所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號20所示的胺基酸序列所構成的CDR3的輕鏈可變區；(j)包含序列識別號14所示的胺基酸序列的輕鏈可變區。
(8)如上述(1)~(7)中任一項記載之抗體或抗原結合性抗體片段，其中前述抗體或抗原結合性抗體片段為IgG、Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體、dsFv、(scFv)2、或單域(single domain)抗體。
(9)如上述(1)~(8)中任一項記載之抗體或抗原結合性抗體片段，其中前述抗體為人類抗體或人化抗體。
(10)如上述(1)~(9)中任一項記載之抗體或抗原結合性抗體片段，其中前述抗體或抗原結合性抗體片段係經化學修飾。
(11)一種核酸，其編碼如上述(1)~(9)中任一項記載之抗體或抗原結合性抗體片段。
(12)一種核酸，其編碼包含序列識別號5所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號6所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號7所示的胺基酸序列所構成的CDR3的重鏈可變區。
(13)一種載體，其包含如上述(11)或(12)記載之核酸。
(14)一種宿主細胞，其導入有上述(13)記載之載體。
(15)一種抗C型肝炎病毒E2蛋白質抗體或抗原結合性抗體片段之製造方法，其包含培養上述(14)記載之宿主細胞的步驟、及回收表現的抗體或抗原結合性抗體片段的步驟。
(16)一種醫藥，其含有如上述(1)~(10)中任一項記載之抗體或抗原結合性抗體片段作為有效成分。
(17)如上述(16)記載之醫藥，其係C型肝炎之治療劑或預防劑。
(18)如上述(17)記載之醫藥，其係用以於肝臓移植中使用的C型肝炎之預防劑。
(19)一種C型肝炎病毒檢測用試藥，其含有如上述(1)~(10)中任一項記載之抗體或抗原結合性抗體片段。
(20)一種C型肝炎病毒感染之治療或預防法，其包含將如上述(1)~(10)中任一項記載之抗體或抗原結合性抗體片段投予至對象者。
本發明之抗體或其抗原結合性片段係對複數個基因型之HCV具有HCV感染抑制活性。
第1圖顯示編碼抗體噬菌體e2d066及抗體噬菌體e2d081所提示的VH區之鹼基序列(上半段)及其VH區之胺基酸序列(下半段)的圖。FR1、FR2、FR3、及FR4係框架區。CDR1、CDR2、及CDR3係互補決定區(complementarity-determining region；CDR)。
第2圖顯示編碼抗體噬菌體e2d066所提示的VL區之鹼基序列(上半段)及其VL區之胺基酸序列(下半段)。
第3圖顯示編碼抗體噬菌體e2d073所提示的VH區之鹼基序列(上半段)及其VH區之胺基酸序列(下半段)。
第4圖顯示編碼抗體噬菌體e2d073所提示的VL區之鹼基序列(上半段)及其VL區之胺基酸序列(下半段)。
第5圖顯示編碼抗體噬菌體e2d081所提示的VL區之鹼基序列(上半段)及其VL區之胺基酸序列(下半段)。
第6圖顯示本發明之IgG抗體抗基因型2a之HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)之HCV感染抑制活性。
第7圖顯示本發明之scFv抗基因型2a之HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)之HCV感染抑制活性。
第8圖顯示本發明之IgG抗體抗基因型3a之HCVcc(S310/JFH-1 HCVcc)之HCV感染抑制活性。
第9圖顯示本發明之scFv抗基因型3a之HCVcc(S310/JFH-1 HCVcc)之HCV感染抑制活性。
第10圖顯示本發明之IgG抗體抗基因型1b之HCVcc(TH/JFH-1 HCVcc)之HCV感染抑制活性。
第11圖顯示本發明之scFv抗基因型1b之HCVcc(TH/JFH-1 HCVcc)之HCV感染抑制活性。
第12圖顯示本發明之IgG抗體抗基因型1a之HCVcc(H77/JFH-1 HCVcc)之HCV感染抑制活性。
第13圖顯示本發明之scFv抗基因型1a之HCVcc(H77/JFH-1 HCVcc)之HCV感染抑制活性。
第14圖顯示本發明之IgG抗體對未變性E2蛋白質(第14圖A)及變性E2蛋白質(第14圖B)之結合性(抗原決定位解析)。就E2蛋白質而言，係使用TH E2-Fc蛋白質。
第15圖顯示本發明之IgG抗體對直鏈狀胜肽(由E2蛋白質胺基酸序列內之12個胺基酸殘基所構成)之結合性(抗原決定位解析)。第15圖A：e2d066 IgG、第15圖B：e2d073 IgG、第15圖C：e2d081 IgG、第15圖D：MBL-HCV1(IgG)。
第16圖顯示對於生物素化e2d066 IgG之對E2蛋白質(TH E2Fc蛋白質)的結合之其他抗體的競合抑制作用(抗原決定位解析)。
第17圖顯示對於生物素化e2d066 IgG之對E2蛋白質(TH E2Fc蛋白質)的結合之其他抗體的競合抑制作用(抗原決定位解析)。
第18圖顯示本發明之抗體及其他抗體對基因型2a之J6CF株(第18圖A)之E2蛋白質、或基因型1b之TH株(第18圖B)之E2蛋白質之結合性。
第19圖顯示基因型2a之HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)感染後之藉由e2d066 IgG處置的感染擴大抑制作用。
[用以實施發明之形態]
本發明係關於一種抗C型肝炎病毒E2蛋白質抗體或抗原結合性抗體片段，其具有抗複數個基因型之C型肝炎病毒(HCV)的感染抑制活性。
本發明還關於一種抗C型肝炎病毒E2蛋白質抗體或抗原結合性抗體片段，其呈現抗複數個基因型之C型肝炎病毒(HCV)的感染抑制活性、及脫逸突變株出現抑制性。本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係較佳為對於複數個基因型之HCV之脫逸突變株呈現出現抑制性。
通常，病毒之增殖係於中和抗體存在下會一旦被抑制，但會有再增殖起來的情形。將如此地增殖起來的病毒說是對於此抗體具有中和抵抗性(neutralization-resistance)，而將此病毒稱為脫逸突變株。此再增殖係於中和抗體之存在下，於病毒之外套膜蛋白質產生突變，中和抗體變得無法與外套膜蛋白質結合的結果。亦已知即使於中和抗體存在下，在其抗體所結合的病毒之外套膜蛋白質中之抗原決定位不會產生突變，難以誘導脫逸突變株之出現的抗體。於本案說明書， 將如此之抗體定義為呈現「脫逸突變株出現抑制性」的抗體。本發明之抗體或抗原結合性片段係較歷來之抗體更難以使突變在病毒之外套膜蛋白質中之抗原決定位產生，難以誘導脫逸突變株之出現。
本發明關聯之抗體或抗原結合性抗體片段係較佳為與立體結構抗原決定位結合，且顯示脫逸突變株出現抑制性者。
C型肝炎病毒(HCV)係被轉譯為10種類之病毒蛋白質(核蛋白質、E1蛋白質、E2蛋白質、p7蛋白質、NS2蛋白質、NS3蛋白質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白質、NS5A蛋白質及NS5B蛋白質)以此順序而連結的1個之前驅物蛋白質(聚合蛋白(polyprotein))，之後，10種類之成熟的病毒蛋白質(核蛋白質、E1蛋白質、E2蛋白質、p7蛋白質、NS2蛋白質、NS3蛋白質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白質、NS5A蛋白質及NS5B蛋白質)係藉由細胞內及病毒之蛋白酶(protease)，而自前驅物蛋白質分別生成。C型肝炎病毒(HCV)其實體係作為病毒粒子而存在。HCV之病毒粒子(HCV粒子)係於由HCV之結構蛋白質(核蛋白質、E1蛋白質、E2蛋白質及p7蛋白質)所構成的病毒之殼之內部含有HCV基因體。於本案說明書，C型肝炎病毒(HCV)與HCV粒子係以相同意義來使用。
於本案說明書，C型肝炎病毒(HCV)之病毒蛋白質中之胺基酸殘基的位置(亦稱為胺基酸殘基編號或胺基酸編號)係以HCV之前驅物蛋白質作為基準，以 將前驅物蛋白質之N末端的胺基酸(起始甲硫胺酸)作為第1號時之編號來表示。例如，基因型1b之TH株之E2蛋白質係於第384號之胺基酸殘基開始，而結束於第717號之胺基酸殘基。
立體結構抗原決定位(亦稱為結構抗原決定位)與由在一級結構上連續的胺基酸殘基所構成的直鏈狀抗原決定位不同，係取決於由在一級結構上相離的不連續性之胺基酸殘基所構成之蛋白質之高次結構的抗原決定位。構成立體結構抗原決定位的不連續性之胺基酸殘基亦有部分性的連續之情形。本發明關聯之抗體或抗原結合性抗體片段會辨識立體結構抗原決定位係可藉由與經還原劑及熱處理等而變性的E2蛋白質之結合性的消失或結合性的降低而確認。
E2蛋白質係參與與存在於宿主細胞表面的受體(HCV受體)之結合的外套膜蛋白質，而C型肝炎病毒(HCV)係藉由此HCV受體而感染宿主細胞。CD81係已被鑑定為此HCV受體之一，已被報告為HCV之感染上必須的因子之一(Akazawa等人，J.Virol.，2007年，第81卷，p.5036-5045)。
抗體(完全抗體)係一般而言亦稱為免疫球蛋白(Ig)的蛋白質，且其結構係將包含2股之重鏈(H鏈)及2股之輕鏈(L鏈)的雜四聚物作為最小單位，而其1個或2個以上集結而成的蛋白質。典型上而言，各自之輕鏈係藉由1個雙硫共價鍵而與重鏈連結，但於各種之免疫球蛋白同型(isotype)中，重鏈間之雙硫鍵的數目會變 動。各自之重鏈及輕鏈還亦具有鏈內雙硫鍵。各自之重鏈係具有重鏈可變區(以下，VH區)，且恆定區(IgG之情形，CH區：CH1、CH2、CH3)係接續於其。各自之輕鏈係具有輕鏈可變區(以下，VL區)，且具有1個恆定區(以下，CL區)。CL區係與重鏈最初的恆定區CH1並列，且VL區係與VH區並列。抗體之可變區(Fv)係具有被稱為互補決定區(以下，CDR)之顯示特定之可變性而對抗體賦予結合特異性的區域。可變區係除了CDR，亦具有被稱為框架區(以下，FR)之相對而言被保存的部分。完全的重鏈及輕鏈之可變區係包含藉由各自3個之CDR(CDR1、CDR2、CDR3)而被連結的4個之FR(FR1、FR2、FR3、FR4)，且由胺基末端至羧基末端，以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4之順序被配置。完全抗體係可為例如IgG、IgM、IgA。
本發明之抗C型肝炎病毒E2蛋白質抗體(完全抗體)係具有：造成對C型肝炎病毒E2蛋白質之特異的結合性的重鏈可變區及輕鏈可變區、以及恆定區(CL、CH1及Fc)。
本發明關聯之抗原結合性抗體片段係指含有完全抗體之一部分的成分，且保持該抗體之抗C型肝炎病毒E2蛋白質的抗原結合性的蛋白質。本發明關聯之抗原結合性抗體片段係對於HCV保持感染抑制活性。一般而言，由於抗原結合性抗體片段與完全抗體(免疫球蛋白分子)相比，分子量小，故細胞浸透性優異，還具有所謂因可使用微生物生產而可比較便宜地製造的優點。
就抗原結合性抗體片段之例而言，可列舉由Fab(VH、VL、CL及CH1所構成的抗體片段；將IgG抗體以木瓜酵素處理而可獲得)、F(ab)’2(由在鉸鏈區以雙硫鍵所交聯的2個Fab片段所構成的抗體片段；將IgG抗體以胃蛋白酶處理而可獲得)、Fab’、Fv、單鏈抗體(scFv等)、dsFv、(scFv)2、雙價抗體(diabody)、微抗體(minibody)等，但並未限定於此等。單鏈抗體中包含scFv，scFv(single chain Fv)係典型上而言可變區(Fv)的VH區與VL區以連接物(linker)而被連結為單鏈的抗體。dsFv(disulfide-stabilized Fv)係為了安定化而透過在框架區所導入的鏈內雙硫鍵而Fv之VH區與VL區被連結的抗體。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係可為，例如：化學性地合成者(合成抗體)、藉由基因重組技術而製作者(重組抗體)、人類抗體、人化抗體、重鏈及輕鏈可變區透過連接物或導入的雙硫鍵等而連結者(單鏈抗體或雙價抗體等)、多重特異性抗體(例如雙重特異性抗體)、嵌合抗體等。重組抗體典型而言係使用被轉染於宿主細胞中的重組表現載體而被表現的抗體或抗原結合性抗體片段。本發明關聯之抗體或抗原結合性抗體片段可為多株抗體，但較佳為單株抗體。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之一實施形態係包含VH區，該VH區包含具有序列識別號5所示的胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號6所示的胺基酸序列的CDR2、及具有序列識別號7所示的胺基酸序 列的CDR3。較佳為此VH區係包含序列識別號2所示的胺基酸序列。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段亦可為包含VH區，且不包含VL區的單域抗體(亦稱為免疫球蛋白VH域片段(Immunoglobulin VH Domain Fragment))。這例如僅由VH區所構成的抗體片段。例如包含VH區而該VH區包含具有序列識別號5所示的胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號6所示的胺基酸序列的CDR2、及具有序列識別號7所示的胺基酸序列的CDR3，且不包含VL區的單域抗體，可列舉例如：僅由該VH區所構成的抗體片段。
又本發明之抗體或抗原結合性抗體片段亦可為包含VH區而該VH區包含具有序列識別號5所示的胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號6所示的胺基酸序列的CDR2、及具有序列識別號7所示的胺基酸序列的CDR3，且包含VL區的抗體。VL區(輕鏈可變區)係只要對HCV之特異的結合性無實質影響，則未特別限定，可為來自任意抗體(較佳為來自人類抗體)之序列。
就本發明之抗體或抗原結合性抗體片段所具有的VL區之較佳例而言，可列舉例如，包含具有序列識別號8所示的胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號9所示的胺基酸序列的CDR2、及具有序列識別號10所示的胺基酸序列的CDR3的VL區。作為此VL區可列舉例如，包含序列識別號4所示的胺基酸序列者。
作為上述之VL區之其他較佳例，亦可列舉包含由序列識別號23所示的胺基酸序列所構成的CDR1、由序列識別號24所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及由序列識別號25所示的胺基酸序列所構成的CDR3的VL區。作為此VL區可列舉例如，包含序列識別號22所示的胺基酸序列者。
作為本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之具體例，可列舉包含含有序列識別號2所示的胺基酸序列的VH區、及含有序列識別號4所示的胺基酸序列的VL區者。作為本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之具體例，可列舉包含含有序列識別號2所示的胺基酸序列的VH區、及含有序列識別號22所示的胺基酸序列的VL區者。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段還可為與上述之抗體或抗原結合性抗體片段辨識相同之立體結構抗原決定位的抗體或抗原結合性抗體片段。例如，本發明之抗體或抗原結合性抗體片段亦包含與下列抗體或抗原結合性抗體片段辨識相同之立體結構抗原決定位者，該抗體或抗原結合性抗體片段包含VH區且包含VL區，該VH區包含具有序列識別號5所示的胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號6所示的胺基酸序列的CDR2、及具有序列識別號7所示的胺基酸序列的CDR3(較佳為包含序列識別號2所示的胺基酸序列的VH區)，該VL區包含具有序列識別號8所示的胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號9所示的胺基酸序列的 CDR2、及具有序列識別號10所示的胺基酸序列的CDR3(較佳為包含序列識別號4所示的胺基酸序列的VL區)、或包含序列識別號23所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號24所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號25所示的胺基酸序列所構成的CDR3的VL區(較佳為包含序列識別號22所示的胺基酸序列的VL區)。
如以上之本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係具有對於複數個基因型(較佳為包含基因型1a、1b、2a、及3a)之C型肝炎病毒(HCV)的感染抑制活性，且呈現脫逸突變株出現抑制性。於較佳實施形態，本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係具有對於2以上之基因型、較佳為基因型1a、基因型1b、基因型2a及基因型3a之HCV具有高感染抑制活性。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之其他實施形態係可包含VH區及VL區，該VH區包含具有序列識別號15所示的胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號16所示的胺基酸序列的CDR2、及具有序列識別號17所示的胺基酸序列的CDR3，該VL區包含具有序列識別號18所示的胺基酸序列的CDR1、具有序列識別號19所示的胺基酸序列的CDR2、及具有序列識別號20所示的胺基酸序列的CDR3。此VH區較佳為包含序列識別號12所示的胺基酸序列者。此VL區較佳為包含序列識別號14所示的胺基酸序列者為較佳。此等抗體係對於複數個基因型之HCV具有高的感染抑制活性。作為如此之本 發明的抗體或抗原結合性抗體片段之具體例，可列舉包含含有序列識別號12所示的胺基酸序列的VH區、及含有序列識別號14所示的胺基酸序列的VL區者。如此之本發明的抗體或抗原結合性抗體片段係具有對於複數個基因型(包含基因型1b及2a)之C型肝炎病毒(HCV)的感染抑制活性。
CDR係決定抗體之特異性的區域。本發明之抗體及抗原結合性抗體片段所具有的CDR以外的區域(例如，完全抗體的情形，為重鏈及輕鏈之各FR及各恆定區)之胺基酸序列，係只要對於對HCV的特異的結合性無實質影響者，並不被特別限定，亦可為來自其他抗體的序列。在此，其他抗體亦包含來自人類以外之生物的抗體，但由減輕副作用的觀點，係較佳為來自人類者。即，本發明之抗體及抗原結合性抗體片段係較佳為CDR以外的區域為包含來自人類抗體之對應胺基酸序列。因本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之CDR係來自人類抗體，所以若構成本發明之抗體或抗原結合性抗體片段的其他區域係來自人類抗體，則因成為僅以人類抗體之胺基酸序列所構成的抗體或抗原結合性抗體片段，故更佳。本發明之抗體及抗原結合性抗體片段的輕鏈可具有包含序列識別號38~40之任一者所示的胺基酸序列的CL區(恆定區)。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段可為屬於任一免疫球蛋白分子之任意之聚集，例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及IgY、或任意之子集，例如IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等者，但較佳為IgG。本發明之抗體的輕鏈可為λ鏈、或κ鏈之任一者。
本發明之抗體可為在具有包含如上述之重鏈可變區(VH區)的重鏈及包含如上述之輕鏈可變區(VL區)的輕鏈之同時，具有恆定區的完全抗體。就為完全抗體之本發明的抗體之較佳例而言，可列舉具有由序列識別號26所示的胺基酸序列所構成之重鏈及由序列識別號27所示的胺基酸序列所構成之輕鏈的抗體(對應實施例記載之e2d066 IgG)、具有由序列識別號30所示的胺基酸序列所構成之重鏈及由序列識別號31所示的胺基酸序列所構成之輕鏈的抗體(對應實施例記載之e2d081 IgG)、及具有由序列識別號28所示的胺基酸序列所構成之重鏈及由序列識別號29所示的胺基酸序列所構成之輕鏈的抗體(對應實施例記載之e2d073 IgG)。
又本發明之抗體或抗原結合性抗體片段亦包含與下列抗體辨識相同立體結構抗原決定位的抗體，該等抗體為具有由序列識別號26所示的胺基酸序列所構成之重鏈及由序列識別號27所示的胺基酸序列所構成之輕鏈的抗體(對應實施例記載之e2d066 IgG)、或具有由序列識別號30所示的胺基酸序列所構成之重鏈及由序列識別號31所示的胺基酸序列所構成之輕鏈的抗體(對應實施例記載之e2d081 IgG)。
本發明之抗原結合性抗體片段係具有如上述之重鏈可變區(VH區)與如上述之輕鏈可變區(VL區)的單鏈抗體，例如亦較佳為scFv。單鏈抗體亦稱為一鏈抗 體，係意指至少包含VH區及VL區(亦可進一步包含CL區)，且彼等被連結為單鏈的抗體片段。scFv典型上而言係構成Fv的VH區1個與VL區1個以連接物所連結的抗體。惟，本說明書中，除了VH區與VL區外，亦將進一步包含CL區者稱為scFv。作為本發明關聯之scFv之具體例，可列舉包含VH區、連接物、以及VL區及CL區(VLCL區)之由序列識別號32所示的胺基酸序列所構成的抗體片段(對應實施例記載之e2d066 scFv)、由序列識別號34所示的胺基酸序列所構成的抗體片段(對應實施例記載之e2d081 scFv)、及由序列識別號33所示的胺基酸序列所構成的抗體片段(對應實施例記載之e2d073 scFv)。
本發明之抗體及抗原結合性抗體片段係只要於人體內不具有免疫原性，則亦可包含非來自人類免疫球蛋白之胺基酸序列的序列(例如，人為性地加以突變的序列)。本發明之抗體及抗原結合性抗體片段亦可為例如，針對上述所記載之構成完全抗體的胺基酸序列，FR或恆定區中之胺基酸經其他胺基酸所取代者。該種之胺基酸之取代係較佳為1~5個胺基酸，更佳為1或2個胺基酸的取代。具有該種胺基酸取代的抗體較佳為與未取代抗體機能上同等者。因此，胺基酸取代係冀望為保存性的胺基酸取代，此係電荷、側鏈、極性、芳香族性等之性質類似之胺基酸間的取代。性質類似之胺基酸係可分類為例如，鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸、組胺酸)、酸性胺基酸(天冬胺酸、麩胺酸)、無電荷極性胺基酸(甘 胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸)、無極性胺基酸(白胺酸、異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、甲硫胺酸)、分枝鏈胺基酸(蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、芳香族胺基酸(苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、組胺酸)等。亦可藉由對框架區內之胺基酸殘基的半胱胺酸之胺基酸取代來導入雙硫鍵，藉此製作更加安定化之抗體及抗原結合性抗體片段(dsFv等)，如此之抗體及抗原結合性抗體片段亦包含於本發明之範圍。在此，「機能上同等」係意指具有胺基酸取代的抗體係具有與取代前之抗體相同之生物學上或生化學上的活性，尤其具有HCV感染抑制活性。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段能夠以例如如下列的方法製作。
可將編碼抗體或抗體片段的核酸(基因)併入1個或複數個適當載體中，將其導入宿主細胞(例如，哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞等)，使用基因重組技術而使產生(P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997年，WILEY；P.Shepherd及C.Dean.,Monoclonal Antibodies.,2000年，OXFORD UNIVERSITY PRESS；J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies：principles and practice.,1993年，ACADEMIC PRESS)。又，編碼抗體或抗體片段的DNA係可使用例如，基因重組技術(Sambrook等人，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，1989年，COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS)或DNA合成機而製作。
具體而言，例如，在製作完全抗體的情形，係將編碼抗體之可變區的DNA與編碼人類IgG之恆定區的DNA連結，並將其併入表現載體即可。或者，亦可將編碼抗體之可變區的DNA，併入含有編碼抗體之恆定區的DNA的表現載體。彼等之DNA係於表現載體中之表現控制區，例如，加強子、啟動子之控制下併入者為較佳。其次，可藉由獲得的表現載體將宿主細胞轉形，並藉由將其培養，而使抗體產生。此等之表現載體係可單獨或組合2種以上使用。
將獲得的DNA與編碼人類抗體之恆定區的DNA連結，接著併入表現載體，而藉由將其導入宿主細胞使其表現，可獲得完全抗體(參照歐洲專利申請案公開第EP239400號、國際公開第1996/02576號)。就透過CDR而連結的人類抗體之FR而言，可選擇使用互補決定區不妨礙形成與下述實施例記載之e2d066或e2d081之完全抗體相同結構的抗原結合部位者。又，可置換為各式各樣來自人類抗體的FR(參照國際公開第1999/51743號)。
本發明之抗原結合性抗體片段亦可使用周知之方法，例如完全抗體之酵素消化或基因重組技術來製作。本發明之抗原結合性抗體片段只要維持與抗原之結合活性的話，亦可與其他蛋白質融合。例如，將含VH的H鏈片段、與含VL的L鏈片段透過適當的連接物而連結，並藉由使其於宿主細胞中表現，或藉由使培養細胞中自各別的載體所表現的H鏈蛋白質與L鏈蛋白質會合，而可製作scFv、或Fab等之抗原結合性抗體片段。
例如，亦可藉由在噬菌體顯示法中，將插入了VH及VL的噬菌體質體(phagemid)於大腸菌轉形，而製作本發明之抗原結合性抗體片段。具體而言，係可藉由使VH及VL各自以PCR法放大，將VL插入噬菌體質體載體中而於大腸菌轉形，並進行VL陽性之噬菌體質體之純化，其次，將VH插入VL陽性之噬菌體質體中，使於大腸菌表現的2階段選殖法，而製作本發明之抗原結合性抗體片段。又，使VH與VL各自以PCR法放大後連結，並將其連接物併入噬菌體質體，藉此而藉由將大腸菌轉形所致的VL-VH組合法亦可製作本發明之抗原結合性抗體片段。
scFv之調製係能夠例如如下列的方式而進行。藉由基因重組技術，於經單離之編碼VH及VL的各自cDNA之間(或，編碼VH及VLCL的各自cDNA之間)插入編碼連接物的DNA，並將所獲得之編碼一條鏈抗體的重組DNA插入表現載體，將其導入宿主細胞使其表現，藉此而可製作scFv。
於本發明之scFv中，將VH區與VL區連結的連接物係只要不抑制連結在其兩端的VH及VL之表現、或VH與VL之結合者，並未特別限制。連接物胜肽之長度係通常為1~100個胺基酸，較佳為1~50個胺基酸，更佳為1~30個胺基酸，特佳為12~18個胺基酸(例如15個胺基酸)。於本發明中，可而合適地使用稱為(GGGGS)3之包含15個胺基酸的多胜肽(序列識別號35)(Kim等人，Protein Engineering Design and Selection,2007年，20(9)卷，p.425-432)作為連接物(又，G表示甘胺酸，S表示絲胺酸)。用於編碼可變區之DNA的調製，例如，可將設計為使CDR與人類抗體之FR連結的鹼基序列，從以在末端部具有重疊部分的方法而製作的數個寡核苷酸藉由PCR法來合成。
於FR之選擇係可採用例如二種方法。第1種方法係使用NEWM、REI等三次元結構已為人所知之人類抗體框架的方法(Riechmann L.等人，Nature,1988年，第332卷，p.323-327；Tempst,PR等人，Protein Engineering,1994年，第7卷、p.1501-1507；Ellis JH.等人，J.Immunol.,1995年，第155卷，p.925-937)。第2種方法係選擇人類抗體之FR中最共通地被使用之胺基酸的方法(Sato K.et al.,Mol Immunol.,1994年，31卷，p.371-381；Kobinger F.et al.,Protein Engineering,1993年，6卷，p.971-980；Kettleborough CA.et al.,Protein Engineering,1991年，第4卷，p.773-783)。本發明中，此等任一種之方法皆可使用。
又，作為用以調製與某多肽機能上相同的多肽之本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知的方法，已知有於多肽導入突變的方法。例如，若為本發明所屬技術領域中具通常知識者，可使用部位特異性突變誘導法(Hashimoto-Gotoh T.等人，Gene、1995年，第152卷，p.271-275；Zoller MJ.and Smith M,Methods Enzymol.1983年，第100卷，p.468-500；Kramer W.等人，Nucleic Acids Res.1984年，第12 卷，p.9441-9456；Kramer W.and Fritz HJ.,Methods Enzymol.1987年，第154卷，p.350-367；Kunkel TA.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1985年，第82卷，p.488-492；Kunkel,Methods Enzymol.,1988年，第85卷，p.2763-2766)等，藉由於編碼本發明之抗體及抗原結合性抗體片段的指定核酸上導入適當突變，而調製與該抗體及抗原結合性抗體片段機能上相同的抗體及抗原結合性抗體片段。實施部位特異性突變誘導的套組亦已被市售，可利用於本發明之抗體及抗原結合性抗體片段之製作。
本發明之抗體及抗原結合性抗體片段亦可為經化學性修飾(化學修飾)者。即，本發明之抗體及抗原結合性抗體片段係包含經化學修飾的抗體及抗原結合性抗體片段。此化學修飾係只要本發明之抗體及抗原結合性抗體片段可具有對HCV的特異結合性，可為任意者，例如可為機能上之修飾或標識。作為如此化學修飾，可列舉例如糖基化、乙醯基化、甲醯基化、醯胺化、磷酸化、及PEG化(聚乙二醇)等。又化學修飾可為例如，藉由螢光色素(FITC、若丹明(rhodamin)、德克薩斯紅(Texas Red)、Cy3、Cy5)、螢光蛋白質(例如，PE、APC、GFP)、酵素(例如，辣根過氧化酵素(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶(alkaline Phosphatase)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase))、或生物素或(鏈黴)抗生物素蛋白(avidin)的修飾。此等修飾係可使用本技術領域中周知之任意方法來進行。
本發明亦提供編碼本發明之抗體或抗原結合性抗體片段的核酸。例如，編碼本發明之抗體或抗原結合性抗體片段的核酸，係可為包含編碼序列識別號1所示的VH區的鹼基序列與編碼序列識別號3所示的VL區的鹼基序列者，亦可進一步包含編碼序列識別號38所示的胺基酸序列所構成的CL區的鹼基序列。編碼本發明之抗體或抗原結合性抗體片段的核酸還可為包含編碼序列識別號11所示的VH區的鹼基序列與編碼序列識別號13所示的VL區的鹼基序列者，亦可進一步包含編碼由序列識別號39所示的胺基酸序列所構成的CL區的鹼基序列。編碼本發明之抗體或抗原結合性抗體片段的核酸還可包含編碼序列識別號1所示的VH區的鹼基序列與編碼序列識別號21所示的VL區的鹼基序列者，亦可進一步包含編碼由序列識別號40所示的胺基酸序列所構成的CL區的鹼基序列。本發明亦提供編碼包含由序列識別號5所示的胺基酸序列所構成的CDR1、由序列識別號6所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及由序列識別號7所示的胺基酸序列所構成的CDR3的重鏈可變區的核酸。本發明還亦提供含有編碼本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之核酸的載體、及導入該載體的宿主細胞。
宿主細胞係指導入載體的對象細胞，可為例如細菌細胞、哺乳動物細胞(人類細胞等)、真菌細胞(酵母細胞等)、昆蟲細胞等。導入了載體的宿主細胞藉由突然突變或環境之影響等，而可能成為呈現與導入載體之當初的細胞並非完全相同的形質(表現型)的細胞，如此之細胞的後代亦包含於該「宿主細胞」。
本發明亦提供一種抗C型肝炎病毒E2蛋白質抗體或抗原結合性抗體片段抗體之製造方法，其包含培養導入了含有編碼本發明之抗體或抗原結合性抗體片段的核酸之載體的宿主細胞的步驟；及回收於該培養中所表現的抗體或抗原結合性抗體片段抗體的步驟。更具體而言，係只要於本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之表現自該載體被誘導的條件下培養宿主細胞，並自其培養物回收目的之抗體或抗原結合性抗體片段即可。回收的抗體或抗原結合性抗體片段係可藉由周知之方法加以純化。
以下，作為本發明之抗體之製造方法的更具體之例子，而記載有關人化IgG抗體之製造方法，但亦能夠與該方法同樣地進行而取得其他抗體。
人化IgG抗體之製造所使用的表現用載體(人化抗體表現用載體)係併入了編碼人類抗體之重鏈恆定區及人類抗體之輕鏈恆定區的基因之表現載體。此載體係可藉由於表現載體將編碼人類抗體之重鏈恆定區及人類抗體之輕鏈恆定區的基因各自選殖而構築。
人類抗體之恆定區係可為任意之人類抗體之重鏈及輕鏈恆定區，可列舉例如人類抗體之重鏈之IgG1亞型之恆定區及人類抗體之輕鏈之κ群之恆定區等。編碼人類抗體之重鏈及輕鏈恆定區的基因可為包含外顯子與內含子的染色體DNA，亦可為cDNA。
就用以製作人化抗體表現用載體而使用的動物細胞用表現載體而言，只要是可併入並表現編碼人類 抗體之恆定區的基因者即可，可使用任意者。可列舉例如，pAGE107(Cytotechnology,3,133(1990年))、pAGE103(J.Biochem.,101,1307(1987年))、pHSG274(Gene,27,223(1984年))、pKCR(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78,1527(1981年))、pSG1βd2-4(Cytotechnology,4,173(1990年))等。就在動物細胞用表現載體中所使用的啟動子與加強子而言，可列舉SV40之初期啟動子與加強子(J.Biochem.,101,1307(1987年))、莫洛尼氏鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)之LTR(Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987年))、免疫球蛋白重鏈之啟動子(Cell,41,479(1985年))與加強子(Cell,33,717(1983年))等。
人化抗體表現用載體係可為抗體重鏈及輕鏈於各別載體上存在的型式或於相同載體上存在的型式(以下，標記為串聯型)之任一者，但由人化抗體表現用載體之構築之容易度、對動物細胞導入之容易度、於動物細胞內的抗體重鏈及輕鏈之表現量的平衡為均衡等觀點，串聯型之人化抗體表現用載體為較佳(J.Immunol.Methods,167,271(1994年))。就串聯型之人化抗體表現用載體而言，可列舉pKANTEX93(Mol.Immunol.,37,1035(2000年))、pEE18(Hybridoma,17,559(1998年))等。
所構築的人化抗體表現用載體係可使用於人類型嵌合抗體及人類型CDR移植抗體之動物細胞中的表現。
人化抗體之安定的生產可藉由將人化抗體表現載體導入適當之動物細胞而獲得安定地生產人類型嵌 合抗體及人類型CDR移植抗體(以下，同時稱為人化抗體)的轉形株而得以實現。就對動物細胞之人化抗體表現載體的導入法而言，可列舉電穿孔法(特開平2-257891；Cytotechnology,3,133(1990年))等。就導入人化抗體表現載體的動物細胞而言，只要是可使人化抗體生產的動物細胞，則可使用任意之細胞。具體而言，可列舉小鼠骨髓瘤細胞之NSO細胞、SP2/0細胞、中國倉鼠卵巢細胞CHO/dhfr-細胞、CHO/DG44細胞、大鼠骨髓瘤YB2/0細胞、IR983F細胞、來自敘利亞倉鼠腎臓的BHK細胞、人類骨髓瘤細胞之Namalwa細胞等，但較佳可列舉中國倉鼠卵巢細胞CHO/DG44細胞、大鼠骨髓瘤YB2/0細胞等。
人化抗體表現載體之導入後，安定地生產人化抗體的轉形株係可依據特開平2-257891所揭示的方法，而藉由包含G418 sulfate(以下，標記為G418；Sigma-Aldrich)、或嘌呤黴素(Puromycin)(Sigma-Aldrich,P8833)等之藥劑的動物細胞培養用培養基來選擇。就動物細胞培養用培養基而言，可使用RPMI 1640培養基(日水製藥)、GIT培養基(日本製藥)、EX-CELL302培養基(SAFC Biosciences)、IMDM培養基(Thermo Fisher Scientific)、Hybridoma-SFM培養基(Thermo Fisher Scientific)、EX-CELL CD CHO Fusion(NICHIREI BIOSCIENCES：14365C)、或於此等培養基中添加胎牛血清(以下，標記為FCS)等之各種添加物的培養基等。可藉由將獲得的轉形株於培養基中培 養，而於培養上清液中使人化抗體生產蓄積。培養上清液中之人化抗體之生產量及抗原結合活性可藉由酵素免疫抗體法(以下，標記為ELISA法；Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 14,1998年、或Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press Limited,1996年)等測定。又，關於轉形株，可依據特開平2-257891所揭示的方法，利用DHFR基因放大系統等而使人化抗體之生產量上升。
人化抗體係可自轉形株之培養上清液，使用蛋白質A管柱來純化(Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 8,1988年、或Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press Limited,1996年)。又，於人化抗體之純化，係可使用其他通常於蛋白質之純化所使用的純化方法。例如，可將膠體過濾、離子交換層析及超過濾等組合而進行來純化。純化的人化抗體之重鏈、輕鏈或抗體分子全體之分子量係可藉由聚丙烯醯胺膠體電泳(以下，標記為SDS-PAGE；Nature,227,680(1970年))，西方氏墨漬法(Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 12,1988年、或Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,AcademicPress Limited,1996年)等來測定。
以上，例示了將動物細胞作為宿主的抗體之製造方法，但如上述，於酵母、昆蟲細胞、植物細胞、 或非人類動物個體或是植物個體中，亦可藉由與動物細胞相同之方法來製造抗體。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係對複數個基因型之HCV具有高感染抑制活性。本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係較佳為對於2個以上之基因型之HCV，例如，選自包含基因型1a、1b、2a、3a、4a、5a、及6a的群組的2個以上之基因型之HCV，尤其是包含基因型1b及2a的2個以上之基因型之HCV具有感染抑制活性。又就基因型1a之HCV而言，有H77株、HCV-1株、HCV-H株、J1株等；就基因型1b之HCV而言，有TH株、con1株、HCV-J株、JT株、BK株等；就基因型2a之HCV而言，有J6CF株、JFH-1株、JFH-2株、JCH-1株等；就基因型3a之HCV而言，有S310株、E-b1株；就基因型4a之HCV而言，有ED43；就基因型5a之HCV而言，有EUH1480；就基因型6a之HCV而言，有EUK2等。
於本發明中「HCV感染」係指在HCV粒子結合於宿主細胞之細胞表面時開始，於宿主細胞內增殖後，至被釋放至細胞外為止的過程。據此，於本發明中「HCV感染抑制活性」係指藉由阻礙或抑制HCV感染之前述一連串的過程中的至少一者，而阻止在體內或細胞集團中之HCV感染之進行的活性。本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之HCV感染抑制活性，係藉由阻礙HCV結合於宿主細胞之細胞表面之病毒受體結合的路徑及/或HCV基因體侵入宿主細胞內的路徑所致者為較佳。 又，「HCV粒子」係指由HCV外套膜蛋白質與被其所包封的HCV基因體所構成的HCV本身或HCV樣結構物。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之HCV感染抑制活性，係可藉由例如，測定使對培養細胞具有感染性的嵌合HCV粒子感染HCV感受性細胞(例如，Huh-7細胞)之際的抑制活性來評價。對培養細胞具有感染性的嵌合HCV粒子之製作，係可藉由下列方式製作，例如，將某基因型之HCV基因體之結構基因的Core蛋白質、E1蛋白質、E2蛋白質及p7蛋白質之編碼序列，與於培養細胞內高效率地自律複製之基因型2a的HCV株JFH-1之結構基因重組，導入培養細胞，並將其培養而使HCV粒子產生。藉由使用此嵌合HCV粒子，而可評價對於各式各樣的基因型HCV的感染抑制活性。此基本技術係記載於例如，Wakita等人，Nature Medicine,2005年，第11卷，p.791-796；Lindenbach等人，Science、2005年，第309卷，p.623-626；Pietschmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2007年，第103卷，p.7408-7413。
HCV感染抑制活性之評價，具體而言，可藉由下列方法進行，例如，於應評價HCV感染抑制活性的抗體之存在下及不存在下，培養HCV粒子與HCV感受性細胞(例如，Huh-7細胞)之混合物、或培養使感染HCV粒子的HCV感染細胞，並檢測被釋放於所獲得的培養物中之HCV基因體RNA或HCV粒子的方法。於此，檢測係一般而言可藉由測定(例如定量)培養物中之HCV 基因體RNA或HCV粒子之量來進行。此情形，在培養物中HCV基因體RNA及HCV粒子不存在、或者較抗體不存在下為少的情形，可評價為該抗體具有對於HCV的感染抑制活性。
作為HCV感染抑制活性之評價法，更具體而言，可列舉例如以下之方法。首先，混合包含抗體的樣品與HCV粒子，於37℃使反應1小時(混合樣品)。其次，於前日於96孔盤上以5×103個/孔培養的Huh-7細胞中添加混合樣品50μL，於37℃培養2.5小時。去除培養液，並以PBS將細胞洗淨後，再次添加新鮮培養基而繼續培養。48小時後，去除培養液，並以PBS洗淨1次後，添加100μL之ISOGEN(NIPPON GENE)，自細胞調製RNA。將RNA定量後，藉由定量性RT-PCR而測定HCV基因體RNA量。藉由HCV基因體RNA之定量性RT-PCR的檢測，係依據Takeuchi等人之方法(Gastroenterology,1999年，第116卷，p.636-642)，藉由檢測HCV基因體RNA之5’非轉譯區之RNA而進行即可。可自藉由測定所獲得的HCV基因體RNA量，而算出HCV感染抑制活性。
作為HCV感染抑制活性之評價法，亦可列舉以下之方法。將包含抗體的樣品與HCV粒子混合，並於室溫使反應30分鐘(混合樣品)。其次，於前日於48孔盤上以2×104個/孔培養的Huh-7細胞中添加混合樣品100μL，並於37℃培養3小時。去除培養液，並以PBS將細胞洗淨後，再次添加新鮮培養基而繼續培養。72小 時培養後，去除培養液，並以PBS將細胞洗淨後，以100μL/孔添加被動溶解緩衝液(Passive lysis buffer)(Promega)，而製作細胞溶解液。將回收的細胞溶解液中所含的HCV核蛋白質，使用Lumipulse®G1200(Fujirebio,Ortho-Clinical Diagnostics)定量。可由藉由測定所獲得的HCV核蛋白質之莫耳濃度，而算出HCV感染抑制活性。
於一實施形態，本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係顯示HCV之脫逸突變株出現抑制性。脫逸突變株係指藉由HCV之病毒基因體突變，而對感染抑制抗體之抑制活性獲得耐性的病毒突變株，脫逸突變株出現抑制性係指使脫逸突變株之出現之誘導率降低、或不會誘導脫逸突變株之出現的性質。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段會呈現脫逸突變株出現抑制性，係藉由依據Meital等人之方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2008年，第105卷，p.19450-19455)，重複於評價對象之抗體之存在下，使HCV粒子感染細胞而培養後，將回收的培養上清液與抗體再度混合而使非感染細胞感染的作業，最終地測定培養上清液中所含的HCV之感染力價，而能夠評價(藉由反覆繼代感染之評價)。具體而言，例如，將各基因型之HCV與JFH-1之嵌合HCV粒子與人類抗HCV抗體混合，而於37℃使反應1小時(混合樣品)。其次，於接種於12孔盤的非感染Huh-7細胞中添加混合樣品而使感染。感染3日後繼代於6孔盤，並於繼代後第3日及第 6日回收培養上清液。藉由HCV之感染力價測定來確認回收的培養上清液中含有嵌合HCV粒子，並將確認感染力價後之回收的培養上清液(於第3日或第6日回收的培養上清液)與抗體再度混合，使非感染細胞被新感染，將此重複8次(繼代感染之反覆次數：總計8次)。測定最後所獲得的培養上清液中所含的HCV之感染力價，可算出感染抑制濃度IC50。在即使經由8次反覆繼代感染，亦未發生感染抑制濃度IC50之顯著增加，且未發生感染抑制活性的大幅降低之情形(例如，感染抑制濃度IC501μg/mL以下)，係可判斷為呈現脫逸突變株出現抑制性。
又，Meital等人之文獻(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2008年，第105卷，p.19450-19455)中，以上述之反覆繼代感染來評價了AP33抗體的結果，顯示重複了3次繼代感染的情形雖未出現脫逸突變株，但重複了5次的情形則出現脫逸突變株。由此結果認為AP33抗體並非呈現脫逸突變株出現抑制性的抗體。又，Keck等人之文獻(Plos Pathogens,2012年，第8卷，e1002653)係記載著：以上述之反復繼代感染來評價的結果，相對於CBH-2抗體係重複3次繼代感染即出現脫逸突變株，HC-84.1抗體及HC-84.25抗體則是在各自重複了4次及5次繼代感染的情形，顯示脫逸突變體之出現被抑制，由此結果，HC-84.1抗體及HC-84.25抗體係呈現脫逸突變株出現抑制性的抗體。惟，關於此等抗體，於國際公開第2013/033319號中有報告：在以與藉由上述反覆繼代感染之評價為不同的評價方法，具體而言與Meital等人之方 法係病毒量與抗體處置濃度不同，將反覆感染之條件自感染抑制活性IC50值之濃度開始的方法來評價的情形，為了於反覆感染之過程將病毒量維持為一定的濃度，必要的抗體量係增加(即IC50值上升)，亦即暗示脫逸突變株之出現的資料(國際公開第2013/033319號)。據此，基於周知情報，較佳地是以上述之反覆繼代感染來評價的結果，在即使重複4~5次繼代感染亦抑制脫逸突變株之出現的情形，可判斷為呈現脫逸突變株出現抑制性。更佳地是以上述之反覆繼代感染來評價的結果，即使重複8次繼代感染亦未出現脫逸突變體的情形，可判斷為顯示脫逸突變株出現抑制性。
脫逸突變株出現抑制性無(或低的)周知之抗HCV抗體，係因重複4~5次上述之繼代感染的過程中脫逸突變株發生，而被認為感染抑制活性之大幅降低。又，脫逸突變株之出現，係藉由解析上述之反覆感染培養期間中或最後所獲得的培養上清液中所含的HCV之鹼基序列，並特定突變的胺基酸殘基而得以確認。
作為一例，與立體結構抗原決定位結合之本發明之抗體或抗原結合性抗體片段，係較佳為呈現脫逸突變株出現抑制性。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係特異性地結合HCV之E2蛋白質。於一實施形態，本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係特別特異性地辨識(結合)HCV之E2蛋白質之結構抗原決定位(立體結構抗原決定位)。
由於本發明之抗體或抗原結合性抗體片段係對複數個基因型之HCV具有高感染抑制活性，而可作為醫藥，尤其是C型肝炎之治療劑或預防劑使用。本發明亦提供含有本發明之抗體或抗原結合性抗體片段作為有效成分的醫藥，尤其是C型肝炎之治療劑或預防劑。
本發明之醫藥亦可為含有醫藥上可容許的載體的醫藥組成物。「醫藥上可容許的載體」係指於製劑技術領域中通常可使用的溶劑及/或添加劑。
於醫藥上可容許的溶劑，可列舉例如水、醫藥上可容許的有機劑(例如，乙醇、丙二醇、乙氧基化異硬脂醇、聚氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯類)。此等係冀望經殺菌，且較佳因為應必要被調整為與血液等張。
又，於醫藥上可容許的添加劑可列舉膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、羧基甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、褐藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧基甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯樹膠、酪蛋白、洋菜、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人類血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、可容許作為醫藥添加物的界面活性劑等。
醫藥上可容許的添加劑係除此之外，亦可因應必要而含有賦形劑、結合劑、崩解劑、填充劑、乳化劑、流動添加調節劑、潤滑劑、矯味矯臭劑、溶解輔助劑(可溶化劑)、懸浮劑、稀釋劑、界面活性劑、安定劑、 吸收促進劑、增量劑、賦濕劑、保濕劑(例如，甘油、澱粉)、吸附劑、崩解抑制劑、包衣劑、著色劑、保存劑、抗氧化劑、香料、風味劑、甘味劑、緩衝劑等。
溶劑及添加劑可因應劑型而單獨或適當組合使用。例如，作為注射用製劑使用的情形，可使用將經純化的抗體，溶解於溶劑(例如，生理食鹽水、緩衝液、葡萄糖溶液)，並於其中添加吸附防止劑(例如，Tween80、Tween20、明膠、人類血清白蛋白)者。或者，亦可為用以在使用前溶解並使成為再構成的劑型而經凍結乾燥者。例如，可為了凍結乾燥而使用賦形劑(例如，甘露醇、葡萄糖等之糖醇、糖類)。
本發明之醫藥可依據常法而製劑化。關於製劑化，例如，請參考Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段或醫藥係可以經口投予、組織內投予(例如，皮下投予、肌肉內投予、靜脈內投予)、局部投予(例如，經皮投予)或經直腸的投予來投予。劑型係形適合投予方法之形態為較佳。例如，組織內投予之情形，透過血流之注射為較佳，此情形之劑型典型而言為液體。
注射之情形，注入部位並未特別限定。可列舉例如靜脈內、動脈內、肝臓內、肌肉內、關節內、骨髓內、髓腔內、心室內、經皮、皮下、皮內、腹腔內、鼻腔內、腸內或舌下等。較佳為靜脈內注射或動脈內注射等之對血管內的注射。因透過血流而使本發明之醫藥 立刻遍布至全身係可能的，又侵襲性比較低，且對於患者等之對象者的負担小。或者，亦可於肝臓內或肝門脈注射。此係由於可使本發明之醫藥直接地作用於HCV局部存在的部位。
將本發明之抗體或抗原結合性抗體片段或醫藥投予對象者(患者等)的情形，於一投予單位，使本發明之抗體或抗原結合性抗體片段可發揮HCV感染抑制活性的有效量被含有為較佳。「有效量」係指在有效成分發揮其機能上之必要量，即，本發明中，在抑制HCV感染上之必要量，且對投予的對象者幾乎或完全不會賦予有害副作用的量。此有效量可能依對象者(患者等)之情報、劑型及投予路徑等之各式各樣的條件而變化。「對象者(患者等)之情報」係指疾病之進行度或是重症度、全身之健康狀態、年齡、體重、性別、飲食生活、藥劑感受性、併用醫藥之有無及對治療的耐性等。本發明之醫藥之最終的投予量及有效量係因應各個對象者之情報等，而依據醫師的判斷而被決定。在獲得HCV感染抑制效果上，本發明之醫藥之大量投予為必要的情形，為了減輕對於對象者的負担，亦可分成數次投予。
將本發明之醫藥投予對象者的情形，有效成分的本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之投予量，係每一次體重每1kg，於0.001mg~1000mg之範圍內選擇。或者，可選擇每對象者為0.01~100000mg/body之投予量，但並非受限於此等投予量者。又，就上述投予時期而言，不論是疾病之臨床症狀發生的前後皆可投予。
作為具體的投予量之一例，例如，對於C型肝炎發症初期，而不需併用其他醫藥的人類成人男子(體重60kg)投予的情形，每一日之上述醫藥之有效量係通常為1~2000mg，較佳為1~1000mg，更佳為1~500mg之範圍。亦可因應對象者之情報或投予路徑等，而投予低於前述範圍或超過前述範圍的用量。
成為本發明之抗體或抗原結合性抗體片段或醫藥之投予對象的對象者並未限定，但較佳為人類等之靈長類、家畜、寵物、實驗(試驗)動物等之哺乳動物，人類等之靈長類為特佳。對象者係可為罹患C型肝炎者，或者可為未罹患但有罹患的風險者。對象者可為將接受肝臓移植的慢性C型肝炎患者，亦可為將接受有輸血必要的手術的患者。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段或醫藥係能對任意之C型肝炎有效，但較佳為對慢性C型肝炎或重症C型肝炎有效，又，各種基因型之HCV(例如1a、1b、2a、3a、4a、5a、或6a)，例如對因基因型1a、2a、3a或1b之HCV所引起的C型肝炎特別有效。本發明之抗體或抗原結合性抗體片段或醫藥亦可抑制在HCV一旦感染的活體內之細胞程度的感染擴大(HCV對其他細胞的傳播)。因此，本發明亦關於一種C型肝炎病毒感染之治療或預防法，其包含將本發明之抗體或抗原結合性抗體片段或醫藥投予對象者。
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段或醫藥係可適合地作為用以於肝臓移植使用的C型肝炎之預防 劑使用。例如，為了慢性C型肝炎患者之活體肝移植時之C型肝炎復發預防，於肝臓移植前、肝臓移植中或肝臓移植後投予為較佳。
本發明之醫藥，為了其治療或是預防效果之補足或增強、或者投予量之減少，與其他藥劑適量配合或併用而使用亦無妨。就併用的藥劑而言，可列舉既存之抗病毒劑，例如，干擾素、利巴韋林等。
又，本發明之抗體或抗原結合性抗體片段亦可作為在樣品中之HCV之檢測使用的HCV檢測用試藥而使用。本發明亦關於使用了本發明之抗體或抗原結合性抗體片段的樣品中之HCV之檢測方法。
樣品係指可能含有HCV(HCV粒子或其外套膜蛋白質)的各式各樣的樣品。例如，培養細胞、培養細胞破砕液、培養液上清液、或來自對象者之樣品，例如人類樣品。人類樣品係指自人類採取的組織(例如，術後採取組織)、或血液、血清、血漿、尿、髓液、唾液、淋巴液、精液等之體液等之所有來自人類的活體樣品，較佳為血液、血清、血漿或尿。又，不僅是液體樣品，亦可為固體樣品。例如，亦可為臓器移植而來的捐贈者臓器、或組織切片標本等。
HCV之檢測係可藉由ELISA法、EIA法、螢光免疫測定法、放射免疫測定法或是發光免疫測定法等之使用標識抗體的周知之免疫學的檢測方法、表面電漿共振法(SPR法)或石英晶體微量天平(quartz crystal microbalance)測定法(QCM法)來實施，但藉由使用標識抗體的免疫學的檢測方法來實施為較佳。
ELISA法亦稱為酵素免疫吸附分析法，將樣品中所含的微量之標的抗原，使用經酵素標識的抗體或抗原，利用該酵素之作用而將抗原抗體反應以發色濃度或螢光強度來檢測，定量標的抗原的方法。例如，將本發明之抗體或抗原結合性抗體片段固定於固相擔體，酵素性地檢測該抗體等與樣品中之HCV的免疫學的反應之方法。關於ELISA法之測定方法，請參照周知之方法(石川榮治等人編「酵素免疫測定法」，1987年，第3版，醫學書院等)。就固相擔體而言，可使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、乳膠、明膠、瓊脂糖、纖維素、瓊脂糖凝膠(Sepharose)、玻璃、金屬、陶瓷或磁性體等之材質所構成的珠、微量盤、試驗管、棒或試驗片等之形狀之不溶性擔體。本發明之抗體或抗原結合性抗體片段之對固相擔體的固定可依據物理性吸附法、化學性結合法或此等之併用的方法等周知方法使結合而藉以達成。
就標識本發明之抗體或抗原結合性抗體片段的標識物質而言，例如在ELISA法的情形，係可使用過氧化物酶POD)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫分解酶(catalase)、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酵素、澱粉酶或生物素-抗生物素蛋白複合體等，於螢光免疫測定法的情形，係可使用螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate)、四甲基若丹明異硫氰酸鹽、取代若丹明異硫氰酸鹽、二氯三異硫氰酸鹽、Alexa480或 AlexaFluor488等，而於放射免疫測定法的情形，可使用氚、碘125(125I)或碘131(131I)等，但並未限於此。又，發光免疫測定法係可使用NADH-FMNH2-螢光酶系、發光胺(luminol)-過氧化氫-POD系、吖啶鎓酯系或二氧雜丁環(dioxetane)化合物系等。標識抗原與抗體之結合法於ELISA法的情形，可使用戊二醛法、順丁烯二醯亞胺法、吡啶基二硫化物法或過碘酸法等之周知之方法，於放射免疫測定法的情形，可使用氯胺T(chloramine T)法、鮑爾通-亨特(Bolton-Hunter)法等之周知之方法。
又，上述之免疫學的測定方法係免疫比濁法、乳膠凝集反應、乳膠比濁法、紅血球凝集反應或將粒子凝集反應等之免疫複合體凝集物之生成藉由光學的方法測量其穿透光、散射光、或亦可藉由目視測量的測定法實施。於該情形，可使用磷酸緩衝液、甘胺酸緩衝液、Tris緩衝液或Good’s緩衝液等作為溶劑，亦可進一步使含有聚乙二醇等之反應促進劑或非特異的反應抑制劑。
作為HCV檢測方法之具體例，關於應用於ELISA三明治法的情形，於以下舉例而簡單地說明。首先，將本發明之抗體於不溶性擔體上固相化。又，固相化的抗體只要是特異性地辨識HCV者即可，可為1種類亦可為數種類。其次，於固相化抗體之表面，使可能含有HCV的樣品作用，使固相化抗體與HCV之複合體於擔體之表面上形成。之後，藉由使用洗淨液充分洗淨，而使樣品中存在的HCV以外之未結合的物質被去除。再 者，可製作特異性地辨識HCV的其他抗HCV標識體，並使此標識抗體作用於結合了固相化抗體與HCV之複合體的擔體，使用洗淨液充分洗淨後，藉由利用標識而檢測，以檢測樣品中存在的HCV。
又，亦可事先混合標識抗體與含HCV的樣品而形成抗原抗體複合體後，使對於固相化抗體作用。若將固相化的抗體作生物素標識，則可將生物素化固相化抗體、含HCV的樣品、施予生物素以外之標識的抗體全部混合而形成抗原抗體複合體後，使抗生物素蛋白對固相化之擔體作用，而藉以利用生物素化以外之標識來檢測抗原抗體複合體。
再者，上述之免疫學的測定方法係亦可使用免疫色層分析用測試條。免疫色層分析用測試條係指由例如包含容易吸收樣品的材料的樣品收容部、含有本發明之診斷藥的試藥部、樣品與診斷藥之反應物移動的展開部、將經展開的反應物呈色的標識部、經呈色的反應物會展開的提示部等所構成。市售的妊娠診斷藥等係具有與此相同的形態。本測定方法之原理係如以下所示。首先，若對樣品收容部給予樣品，則樣品收容部係吸收樣品而使樣品到達至試藥部。接著，於試藥部，樣品中之HCV與抗體進行抗原抗體反應，反應複合體於展開部移動而到達標識部。於標識部，則會發生上述反應複合體與標識二次抗體之反應，若與此標識二次抗體之反應物展開至提示部，則變得可觀察到呈色。上述免疫色層分析用測試條因侵襲性極低，係對使用者完全不會給予 苦痛或因試藥使用所致的危險性者，故可於家庭中的監測使用，且成為能夠將該結果於各醫療機關層級詳查、治療(外科性的切除等)，並與轉移、復發預防連結。又，如此之測試條於可廉價地大量生產之點亦為便利的。
[實施例]
以下列舉實施例而更具體說明本發明。
(實施例1)抗體噬菌體庫之篩選
以下之人類抗HCV抗體之篩選，係使用Chan等人，J.Gen.Virol,1996年，第77卷，p.2531-2539；Bugli等人，J.Virol,2001年，第75卷，p.9986-9990；及Jostock等人，J.Immunol.Methods,2004年，第289卷，p.65-80所記載之一般的噬菌體顯示法。
1.抗體噬菌體庫之製作
以下記載的抗體噬菌體庫之製作，係依據Gejima等人，Human antibodies,(2002)，第11卷，p.121-129所充分地記載的方法進行。
將來自人類慢性C型肝炎患者之編碼抗體基因的mRNA單離，並藉由RT-PCR來合成cDNA。由cDNA以PCR法將VH區基因與VLCL區基因(VL區基因及CL區基因)各自個別地放大。將經放大的VH區基因與VLCL區基因，併入含有編碼(GGGGS)3(序列識別號35)等之連接物胜肽序列的連接物DNA之噬菌體質體載體pTZ19R，以VH區基因、連接物、VL區基因、CL區基因之順序，調製scFv基因。將經調製的scFv基因，利用限制酶位HindIII，併入為噬菌體質體載體pTZ19R， 而構築scFv基因庫。將此scFv基因庫轉形於TG-1(SupF)等之大腸菌後，使輔助者噬菌體M13K07重感染，而調製scFv噬菌體庫。經製作的抗體噬菌體係提示人類抗體之VH區與VLCL區以連接物結合的胜肽之噬菌體。
2.篩選所使用的HCV之E2蛋白質之製作
篩選所使用的HCV之E2蛋白質之調製，係使用Drosophila Expression System(Thermo Fisher Scientific)來進行。此方法係充分地記載於Krey等人，PLOS PATHOGENS，第6卷，e1000762。
將HCV之TH株(基因型1b，Wakita,T.等人，J.Biol.Chem.,1994年，第269卷，p.14205-14210；國際公開第2006/022422號)之編碼E2蛋白質(胺基酸編號384-711；不含跨膜區域)的DNA、或JFH-1株(基因型2a，國際公開第2004/104198號)之編碼E2蛋白質(胺基酸編號384-714；不含跨膜區域)的DNA，各自使用S2細胞表現載體pMT/BiP/V5-His(Thermo Fisher Scientific)之限制酶位BglII及XbaI而插入。
轉染係藉由磷酸鈣沉澱法來進行。以如下方式製作了轉染用溶液。將於HCV之E2蛋白質編碼基因重組插入片段的pMT/BiP/V5-His 19μg、選擇用質體載體pCoHygro 1μg、2M CaCl2 36μL混合，以純水稀釋至300μL。將此混合溶液緩緩滴加至HEPES-Buffered Saline(HBS；50mmol/L HEPES、1.5mmol/L Na2HPO4、280mmol/L NaCl、pH7.1)，一邊溫和地作成漩渦，一邊充分混合，製作轉染用溶液。
於6孔盤中接種1×106細胞/mL之S2細胞2mL，於28℃培養12小時左右，使成為2~4×106細胞/mL。將上述之轉染用溶液於室溫靜置30分鐘後，於接種S2細胞的6孔盤中全面均等地滴加，之後於28℃培養24小時。24小時後，交換培養基(Shneider’s Drosophila Medium、10%FBS、盤尼西林(50units/mL)、鏈黴素(50μg/mL)、300μg/mL潮黴素B(Hygromycin B))，每3~4日一邊交換培養基一邊繼代培養。進行選擇培養約3週而作成安定細胞株。
E2蛋白質之表現誘導係於2×106個之S2細胞(225cm2培養瓶每1個40mL)中添加CuSO4(最終濃度0.5mmol/L)而培養5日。回收培養液，藉由離心(2000rpm、5分)去除細胞而獲得培養上清液。將培養上清液使用His標誌蛋白質純化用色層分析擔體(Ni-NTA agarose)純化，獲得HCV之TH株(基因型1b)E2蛋白質或HCV之JFH-1株(基因型2a)之E2蛋白質。
3.與HCV之E2蛋白質結合的抗體噬菌體之篩選
以下記載的抗體噬菌體之篩選係根據Gejima等人，Human antibodies,(2002)，第11卷，p.121-129所充分地記載的方法來進行。
使上述2.項所製作的HCV之E2蛋白質(TH株(基因型1b)E2蛋白質或JFH-1株(基因型2a)之E2蛋白質)，結合於免疫管等之塑膠表面或磁性珠表面，並添加上述1.項所製作的scFv噬菌體庫而使反應後，以含有0.1%Tween20的PBS洗淨而移除非特異性的噬菌體。特 異性地結合的噬菌體係以0.1mol/L甘胺酸-HCl(pH2.2)溶出，使感染大腸菌而放大。重複此操作3次，藉以濃縮並取得對HCV E2蛋白質(TH株(基因型1b)E2蛋白質或JFH-1株(基因型2a)之E2蛋白質)特異性的噬菌體。
4.所選擇的抗體噬菌體之可變區
將於上述3.項所選擇的3種類之抗體噬菌體(e2d066、e2d073、及e2d081)其提示的胜肽中之VH區及VL區之鹼基序列，藉由通常方法加以解析。又，關於CL區之鹼基序列，亦藉由通常方法加以解析。
(1)抗體噬菌體e2d066
將抗體噬菌體e2d066所提示的編碼VH區之鹼基序列表示為序列識別號1，將其胺基酸序列表示為序列識別號2(第1圖)，將編碼VL區的鹼基序列表示為序列識別號3，將其胺基酸序列表示為序列識別號4(第2圖)。又，將抗體噬菌體e2d066所提示的VH區之CDR1、CDR2、CDR3之胺基酸序列各自表示為序列識別號5、序列識別號6、序列識別號7，VL區之CDR1、CDR2、CDR3之胺基酸序列各自表示為序列識別號8、序列識別號9、序列識別號10。又，將CL區之胺基酸序列表示為序列識別號38。
(2)抗體噬菌體e2d073
將抗體噬菌體e2d073所提示的編碼VH區的鹼基序列表示為序列識別號11，將其胺基酸序列表示為序列識別號12(第3圖)，將編碼VL區的鹼基序列表示為序列識別號13，將其胺基酸序列表示為序列識別號 14(第4圖)。又，將抗體噬菌體e2d073所提示的VH區之CDR1、CDR2、CDR3之胺基酸序列各自表示為序列識別號15、序列識別號16、序列識別號17，將VL區之CDR1、CDR2、CDR3之胺基酸序列各自表示為序列識別號18、序列識別號19、序列識別號20。又，將CL區之胺基酸序列示表為序列識別號39。
(3)抗體噬菌體e2d081
編碼抗體噬菌體e2d081所提示的VH區的鹼基序列係與編碼抗體噬菌體e2d066所提示的VH區的鹼基序列相同。即，將編碼抗體噬菌體e2d081所提示的VH區的鹼基序列表示為序列識別號1，將其胺基酸序列表示為序列識別號2(第1圖)，將VH區之CDR1、CDR2、CDR3之胺基酸序列各自表示為序列識別號5、序列識別號6、序列識別號7。又，將編碼抗體噬菌體e2d081所提示的VL區的鹼基序列表示為序列識別號21，將其胺基酸序列表示為序列識別號22(第5圖)，將VL區之CDR1、CDR2、CDR3各自表示為序列識別號23、序列識別號24、序列識別號25。又，將CL區之胺基酸序列表示為序列識別號40。
於第1~5圖顯示編碼VH區或VL區的鹼基序列(上半段)及其胺基酸序列(下半段)，及與VH區或VL區之FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4之對應。又，第1圖係顯示抗體噬菌體e2d066及抗體噬菌體e2d081所提示的VH區，第2圖示顯示抗體噬菌體e2d066所提示的VL區，第3圖係顯示抗體噬菌體e2d073 所提示的VH區，第4圖係顯示抗體噬菌體e2d073所提示的VL區，第5圖係顯示抗體噬菌體e2d081所提示的VL區。
又，於表1顯示抗體噬菌體(e2d066、e2d073、e2d081)所提示的CDR。
(實施例2)scFv之製作
根據所選擇的3種類之抗體噬菌體(e2d066、e2d073、及e2d081)之VH區、以及VL區及CL區(VLCL區)之鹼基序列與胺基酸序列，藉由通常方法製作將各自之VH區與VLCL區以連接物結合的scFv。作為連接物，使用(GGGGS)3(序列識別號35)，藉由通常方法將連接物連結於VH區之C末端與VL區之N末端。將包含e2d066之VH區(序列識別號2)、VL區(序列識別號4)及CL區(序列識別號38)(VLCL區)以及連接物(序列識別號35)的scFv(稱為e2d066 scFv)之胺基酸序列表示為序列識別號 32。將包含e2d073之VH區(序列識別號12)、VL區(序列識別號14)及CL(序列識別號39)(VLCL區)以及連接物(序列識別號35)的scFv(稱為e2d073 scFv)之胺基酸序列表示為序列識別號33。將包含e2d081之VH區(序列識別號2)、VL區(序列識別號22)及CL區(序列識別號40)(VLCL區)以及連接物(序列識別號35)的scFv(稱為e2d081 scFv)之胺基酸序列表示為序列識別號34。
具體而言，係將此等之噬菌體質體DNA(所選擇的抗體噬菌體)以限制酶SalI消化後，使自己再結合而轉變為蛋白質A融合型抗體(scFv-PP型抗體)，並使用其將大腸菌DH12STM轉形。轉形後，以25mL之2×YTGA於30℃培養整夜。於1L之2×YTA混合此培養液10mL而培養3小時後，添加1mL之1mol/L IPTG並於30℃培養20小時。將培養液供作4℃、8000rpm、10分鐘之離心處理，並回收上清液。於所回收的上清液中緩緩添加313g之硫酸銨而於室溫攪拌30分鐘後，供作4℃、8500rpm、30分鐘之離心處理。將沉渣懸浮於20mL之包含完全蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)的PBS。接著對PBS於4℃整夜透析後，供作4℃、10000rpm、10分鐘之離心處理。回收上清液，將其添加於填充有2mL之IgG瓊脂糖凝膠(GE Healthcare)的管柱，於室溫使以自然滴下而通過管柱內。以300mL之PBS將管柱洗淨後，以8mL之0.2mol/L甘胺酸(pH3.0)進行溶出。溶出液以2mol/LTris調整pH為7.0後，置入透析濃縮用管(Millipore、Amicon Ultra-15、4℃、4500rpm旋轉)，對PBS進行透 析，並濃縮。之後進行SDS-PAGE，並算出蛋白質濃度。
(實施例3)IgG抗體之製作
根據所選擇的3種類之抗體噬菌體(e2d066、e2d073、及e2d081)之VH區及VL區之鹼基序列與胺基酸序列，藉由通常方法製作包含VH區與VL區的IgG抗體。
具體而言，係將scFv抗體之VH及VLCL基因作為模板，使用H鏈與L鏈放大用引子，而進行PCR。各自將VH之放大產物與預先含有人類IgG1恆定區的構築載體連接，VLCL與L鏈用構築載體連接，並將其連結而獲得含有IgG型抗體基因的質體DNA。
將此質體DNA以限制酶消化，直線化，將經直線化的質體40μg以250V．800μF之條件，以電穿孔而導入細胞數1×107之CHO-K1細胞。導入後立即懸浮於含有10%FBS的Ham-F12培養基(和光純藥工業：087-08335+MBL268-1)，並於37℃、5%CO2培養箱中開始培養。
24小時後，以最終濃度成為10μg/mL之方式添加嘌呤黴素(Sigma-Aldrich、P8833)，並開始選擇。於約10日至14日後確認所選擇的選殖株，將細胞以PBS20mL洗淨，以0.05%胰蛋白酶-EDTA(和光純藥工業：264-16935)1mL處理後，添加5mL之Ham-F12，自平盤剝離且回收，並測定細胞數。按照其結果而以0.2細胞/200μL/孔(96孔盤5個)的條件進行限界稀釋。培養14日後，以使用了各孔之培養上清液的ELISA，選擇高表 現IgG型抗體的細胞。將所選擇的細胞於無血清培養基EX-CELL CD CHO Fusion(NICHIREI BIOSCIENCES：14365C)馴化，以初期細胞數2×105個培養10日，並回收上清液。
將rProteinA Sepharose Fast Flow(GE Healthcare：17-1279-02)1mL填充於管柱，添加培養上清液，以流速1滴/2秒送液，使表現蛋白質(IgG)與管柱結合。將10mL之PBS以流速1滴/2秒送液，洗淨非吸附成分後，將10mL之溶出緩衝液(0.2mol/L甘胺酸、pH3)以流速1滴/秒送液，回收溶出液。在藉由以Amicon Ultra-15離心式過濾器單元10(Millipore：UFC901096)離心至1mL的超過濾濃縮之同時進行溶液置換(PBS)，並以SDS-PAGE算出抗體蛋白質之濃度。
將獲得的含e2d066之VH區(序列識別號2)與VL區(序列識別號4)的IgG抗體(稱為e2d066 IgG)之重鏈全長之胺基酸序列表示為序列識別號26，輕鏈全長之胺基酸序列表示為序列識別號27。將獲得的含e2d073之VH區(序列識別號12)與VL區(序列識別號14)的IgG抗體(稱為e2d073 IgG)之重鏈全長之胺基酸序列表示為序列識別號28，輕鏈全長之胺基酸序列表示為序列識別號29。將獲得的含e2d081之VH區(序列識別號2)與VL區(序列識別號22)的IgG抗體(稱為e2d081 IgG)之重鏈全長之胺基酸序列表示為序列識別號30，輕鏈全長之胺基酸序列表示為序列識別號31。
(實施例4)scFv及IgG抗體之感染抑制活性 1.各基因型嵌合HCV粒子(HCVcc)之製作 (1)J6/JFH-1嵌合HCV粒子(J6/JFH-1 HCVcc)之產生
J6/JFH-1嵌合HCV粒子(J6/JFH-1 HCVcc)係依據國際公開第2011/052735號記載之方法，如以下方式製作。
依據Wakita，T.et al.,Nat.Med.,2005年、第11卷、p.791-796及國際公開第2004/104198號記載之方法來製作將HCV JFH-1株(基因型2a)之基因體RNA全區域反轉錄而獲得的cDNA(基因體cDNA)選殖於pUC19質體之T7 RNA啟動子序列下游的質體DNA(pJFH-1)。將此pJFH-1以EcoRI消化後，再以BclI部分消化，調製切除了自EcoRI部位至最初之BclI部位的片段(約2840bp)之質體DNA片段，並將其純化。
另一方面，依據國際公開第2006/022422號記載之方法來製作將HCV J6CF株(基因型2a)之基因體cDNA(GenBank存取編號AF177036；Yanagi,M.et al.,Virology、1999年、第262卷、p.250-263)選殖於pUC19質體之T7 RNA啟動子序列下游的質體DNA(pJ6CF)。將此pJ6CF以EcoRI及BclI部分消化，並純化所獲得的約2840bp之片段，將其與上述之切除切除了EcoRI-BclI的pJFH-1片段連結，獲得重組質體DNA(pJ6/JFH-1)。此pJ6/JFH-1中被選殖化的DNA，係使J6CF株基因體cDNA之5’非轉譯區、編碼核蛋白質、E1蛋白質、E2蛋白質及p7蛋白質之各蛋白質的序列、編碼自NS2蛋白質之N 末端至第16位之胺基酸殘基的區域的序列、以及編碼JFH-1株基因體cDNA之NS2蛋白質之自第17位的胺基酸殘基至C末端的領域的序列、編碼NS3蛋白質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白質、NS5A蛋白質、NS5B蛋白質之各蛋白質的序列及3’非轉譯區，以上述順序連結的HCV嵌合基因體cDNA。
藉由將所製作的pJ6/JFH-1以XbaI切斷後，添加Mung Bean Nuclease 20U(總反應液量50μL)而於30℃培養30分鐘，使XbaI切斷末端平滑化後，進行酚/氯仿萃取及乙醇沉澱。將此切斷的質體作為模板，而使用MEGAscript T7套組(Thermo Fisher Scientific)來合成RNA(參照國際公開第2006/022422號)。將如此進行而合成的J6/JFH-1嵌合基因體RNA用於以下之細胞導入。將3×106個之Huh-7細胞與5μg之J6/JFH-1嵌合基因體RNA懸浮於Cytomix溶液(120mmol/L KCl、0.15mmol/LCaCl2、10mmol/L K2HPO4/KH2PO4、25mmol/L HEPES、2mmol/L EGTA、5mmol/L MgCl2、20mmol/L ATP、50mmol/L麩胱甘肽；400μL)，移至4mm透光管後，使用Gene Pulser(BioRad Laboratories)，於260V、950μF，進行對於Huh-7細胞之J6/JFH-1嵌合基因體RNA的電穿孔。之後，將導入基因體RNA的Huh-7細胞接種於直徑10cm之培養皿，進行繼代培養。於繼代時，係使用HCV抗原ELISA試驗套組(Ortho-Clinical Diagnostics)來定量培養上清液中所含的HCV之核蛋白質加以，進行HCV粒子產生之確認。選擇核蛋白質之量多的，亦即HCV 粒子產生之活性高的培養上清液，並保存作為J6/JFH-1嵌合HCV粒子之病毒原料(J6/JFH-1病毒原料)。
對於以10% FCS-DMEM培養基(含1% MEM非必須胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉)培養的直徑10cm之培養皿中之Huh-7細胞，添加100μL左右於上述所獲得的J6/JFH-1病毒原料(4×104ffu/mL(群落形成單位/mL，focus forming units/mL))，使HCV粒子感染Huh-7細胞。以細胞不會融合的方式適當地繼代，自225cm2培養瓶之1個，進行擴大培養成4個、12個。其次，自其中之225cm2培養瓶8個將細胞剝離，並接種於CellStack(商標)5段2個(Corning)，而培養基係以成為650mL/個的方式添加。藉由將自殘餘之4個培養瓶獲得的細胞接種於12個培養瓶，而病毒粒子產生係效率良好地繼續。
繼代翌日丟棄培養上清液，而添加650mL之2% FCS-DMEM培養基(含1% MEM非必須胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉)。於培養基交換3日後回收培養上清液，並通過0.45μm過濾器後，保存於超低溫冷凍庫。又，於培養上清液回收後之CellStack添加2% FBS-DMEM培養基(含1% MEM非必須胺基酸溶液、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉)650mL，再繼續培養。此2日後，進行相同的作業，並回收培養上清液。再者，再1次重複相同的作業。自 在此所回收的培養上清液，以下列記載之方法純化嵌合HCV粒子(HCVcc)。
(2)J6/JFH-1嵌合HCV粒子(J6/JFH-1 HCVcc)之純化
所產生的病毒粒子係使用以下3階段之步驟純化。
(A)濃縮及透析過濾
利用中空絲濾筒Hollow Fiber Cartridge(GE Healthcare：500kDa截斷，模型編號UFP-500-C-8A，以下作為「Hollow Fiber」)，將含有於上述(1)所獲得之HCV粒子的培養上清液濃縮為60倍。
(B)密度梯度超離心
於Ultra-clear 25×89mm離心管(Beckman coulter：目錄編號344058)中添加經冷卻之含60%蔗糖的TNE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA)3mL，將7mL之含20%蔗糖的TNE緩衝液重疊成複層。再者，於含20%蔗糖的TNE緩衝液之上，將25mL之樣品重疊成複層。使用SW-28(Beckman coulter)，以28,000回轉於4℃進行超離心4小時。
使用25G注射針(Terumo)於管的底面開孔，於此獲得1mL之劃份12管。針對各劃份之溶液測定比重，並確認形成有蔗糖之密度梯度。自比重大者，回收第3個、第4個、第5個之各劃份，而用於濃縮及緩衝液置換。
(C)濃縮及緩衝液置換
在將溶出劃份使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(排除分子量：100kDa、Millipore)及TNE緩 衝液來進行緩衝液置換之同時，進行濃縮。將如此進行所獲得的濃縮液作為含有感染性HCV粒子的病毒液(J6/JFH-1 HCVcc)，而使用於以下之實施例。
(3)其他基因型之嵌合HCV粒子(HCVcc)之製作
關於其他之基因型之嵌合HCV粒子之製作，H77株(基因型1a)與JFH-1株之嵌合HCV粒子(H77/JFH-1 HCVcc)係參照Lindenbach等人，SCIENCE、2005年、第309卷、p.623-626；TH株(基因型1b)與JFH-1株之嵌合HCV粒子(TH/JFH-1 HCVcc)係參照國際公開第2009/014216號及國際公開第2009/131203號；S310-A株(基因型3a)與JFH-1株之嵌合HCV粒子(S310/JFH-1 HCVcc)係參照國際公開第2013/031956號，而製作。此等之嵌合HCV粒子(HCVcc)亦已詳細地被記載於Pietschmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA、2006年、第103卷、p.7408-7413之文獻，基本上依據此文獻來製作，並以與J6/JFH-1 HCVcc之製作(產生及純化)相同之方法來純化。
H77/JFH-1 HCVcc之製作所使用的嵌合基因體RNA，係使JFH-1株之5’非轉譯區、編碼H77株之核蛋白質、E1蛋白質、E2蛋白質、p7蛋白質及NS2蛋白質之各蛋白質的序列、以及編碼JFH-1株之NS3蛋白質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白質、NS5A蛋白質、NS5B蛋白質之各蛋白質的序列及3’非轉譯區以上述之順序連結的HCV嵌合基因體RNA。
TH/JFH-1 HCVcc之製作所使用的嵌合基因體RNA，係使JFH-1株之5’非轉譯區、編碼TH株之核蛋白質、E1蛋白質、E2蛋白質及p7蛋白質之各蛋白質的序列、編碼NS2蛋白質之自N末端至第33位之胺基酸殘基的區域的序列、以及編碼JFH-1株之NS2蛋白質之自第34位之胺基酸殘基至C末端的區域的序列、編碼NS3蛋白質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白質、NS5A蛋白質、NS5B蛋白質之各蛋白質的序列及3’非轉譯區以上述之順序連結的HCV嵌合基因體RNA。將TH/JFH-1 HCVcc之前驅物蛋白質之胺基酸序列表示為序列識別號41。
S310/JFH-1 HCVcc之製作所使用的嵌合基因體RNA，係使JFH-1株之5’非轉譯區、編碼S310株之核蛋白質、E1蛋白質、E2蛋白質、p7蛋白質及NS2蛋白質之各蛋白質的序列(相當於胺基酸編號1-1032)、以及編碼JFH-1株之NS3蛋白質、NS4A蛋白質、NS4B蛋白質、NS5A蛋白質、NS5B蛋白質之各蛋白質的序列(相當於胺基酸編號1031-3034)及3’非轉譯區，以上述之順序連結的HCV嵌合基因體RNA。
如此地，於此所製作的各基因型嵌合HCV粒子(HCVcc)其結構基因部分係來自JFH-1株以外之HCV株之基因體RNA。各基因型嵌合HCV粒子(HCVcc)之細胞感染時之表現型係於J6/JFH-1 HCVcc為基因型2a，於H77/JFH-1 HCVcc為基因型1a，於S310/JFH-1 HCVcc為基因型3a，於TH/JFH-1 HCVcc為基因型1b。
2.感染抑制活性之測定
對於以PBS稀釋之已知的人類抗E2蛋白質抗體MBL-HCV1(Broering等人，J.Viol.、2009年、第83卷、p.12473-12482)、本發明之scFv或IgG抗體，以成為感染多重度(Multiplicity of infection；moi)=0.1之方式，添加含有各基因型嵌合HCV粒子(HCVcc)(J6/JFH-1 HCVcc(基因型2a)、H77/JFH-1 HCVcc(基因型1a)、S310/JFH-1 HCVcc(基因型3a)、TH/JFH-1 HCVcc(基因型1b))的PBS稀釋液，使於室溫反應30分鐘，而製作抗體-HCVcc混合液。
之後，將接種Huh-7細胞(2×104細胞/孔；10% FCS-DMEM培養基(含1% MEM非必須胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉))並培養的48孔盤之培養上清液去除，以100μL/孔添加抗體-HCVcc混合液，於37℃、5%CO2培養箱培養3小時。於3小時後，去除培養上清液，並置換為D-MEM 500μL，而於37℃、5%CO2培養箱進一步培養72小時。培養後去除D-MEM，並將細胞以PBS洗淨後，以100μL/孔添加被動溶解緩衝液(Passive lysis buffer(Promega))，而製作細胞溶解液，並回收於螺絲帽管。所回收的細胞溶解液所含的HCV核蛋白質係使用Lumipulse®G1200(Fujirebio、Ortho-Clinical Diagnostics)定量。由藉由測定所獲得的HCV之核蛋白質之莫耳濃度(核蛋白質量)，算出各抗體(scFv或IgG抗 體)之HCVcc感染抑制活性。具體而言，係將未添加抗體而使嵌合HCV粒子(HCVcc)感染的細胞中之HCV核蛋白質量(對照值：圖中之橫軸「0μg/mL」)當作100%時的在各抗體之存在下添加了HCVcc的細胞中之HCV核蛋白質量的比率(%)作為該抗體之感染抑制活性之評價值。即，細胞中之核蛋白質量(相對於對照組的%)越少，則表示各抗體之感染抑制活性越高。
將IgG抗體及scFv對基因型2a之HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的感染抑制活性各自顯示於第6圖及第7圖，將IgG抗體及scFv對基因型3a之HCVcc(S310/JFH-1 HCVcc)的感染抑制活性各自顯示於第8圖及第9圖，將IgG抗體及scFv對基因型1b之HCVcc(TH/JFH-1 HCVcc)的感染抑制活性各自顯示於第10圖及第11圖，將IgG抗體及scFv對基因型1a之HCVcc(H77/JFH-1 HCVcc)的感染抑制活性各自顯示於第12圖及第13圖。縱軸係表示感染抑制活性。橫軸係表示使作用的各抗體及其濃度(對細胞添加後之最終濃度)。
又，將MBL-HCV1抗體、本發明之IgG抗體及scFv對各基因型之HCVcc的感染抑制活性IC50值示於表2。
由此結果顯示，如上述而製作的本發明之scFv(e2d066 scFv、e2d073 scFv、及e2d081 scFv)及IgG抗體(e2d066 IgG、e2d073 IgG、e2d081 IgG)皆對於複數個基因型嵌合HCV粒子(HCVcc)具有強感染抑制活性。尤其，含e2d066之VH區(序列識別號2)與VL區(序列識別號4)的e2d066 IgG抗體及scFv、以及含e2d081之VH區(序列識別號2)與VL區(序列識別號22)的e2d081 IgG抗體及scFv係顯示對於基因型1a、1b、2a及3a之HCV的感染抑制活性，又對於基因型2a(J6/JFH-1 HCVcc)及基因型1b(TH/JFH-1 HCVcc)，顯示較已知有感染抑制活性之抗細胞受體的抗體之抗CD81抗體(Emmanuel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2004年，第101卷，p.7270-7274)及MBL-HCV1抗體為更高的感染抑制活性。此係顯示本發明之抗體及抗原結合性抗體片段因具有抑制HCV之感染本身的效果，而具有肝臓移植患者中的HCV之再感染(C型肝炎復發)等之預防效果，係顯示可使用於用以於肝臓移植中使用的C型肝炎之預防劑， 尤其是慢性C型肝炎患者之活體肝移植時之C型肝炎復發預防。
(實施例5)IgG抗體之脫逸突變株出現抑制性之評價
關於各IgG抗體(e2d066 IgG、e2d073 IgG或e2d081 IgG)，評價脫逸突變株出現抑制性。
脫逸突變株出現抑制性之評價方法係依據充分地記載於Meital等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、2008年、第105卷、p.19450-19455的方法來進行。
將經以PBS稀釋的IgG抗體及J6/JFH-1 HCVcc混合，使於37℃反應1小時，而製作抗體-HCVcc混合液。
之後，於接種於12孔盤的Huh-7細胞(培養基：10% FCS-DMEM(含1% MEM非必須胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉))中，添加抗體-HCVcc混合液，並使HCVcc感染細胞。於感染3日後繼代於6孔盤，並於繼代後第3日及第6日回收培養上清液。藉由感染力價測定(與以下記載之「最後回收的培養上清液中所含的J6/JFH-1 HCVcc之感染力價」之測定方法相同的方法)，確認在所回收之培養上清液中含J6/JFH-1 HCVcc。將確認感染力價後之培養上清液(於第3日或第6日回收的培養上清液)於下次的感染使用。
將確認感染力價後之回收的培養上清液(含藉由感染培養所產生的J6/JFH-1 HCVcc)，再度與IgG抗體混合，將該混合液添加於非感染之Huh-7細胞，使細胞感染HCVcc。將此重複8次(HCVcc之繼代感染之重複次數：共8次)。
將最後回收的培養上清液中所含的J6/JFH-1 HCVcc(以下，稱為J6/JFH-1 HCVcc-8W)之感染力價以如下方式測定。於感染力價測定之前日，以Huh-7細胞成為1×104細胞/孔的方式而接種於塗布有聚-D-離胺酸的(poly-D-Lysine-coated)96孔盤(Corning)。將J6/JFH-1 HCVcc-8W添加於各孔，於37℃培養72小時。培養後，去除培養上清液，以PBS洗淨細胞後，將細胞以甲醇於-20℃處裡並固定20分鐘。將經固定的細胞以Block ACE溶液(DS PHARMA BIOMEDICAL)阻斷1小時，以PBS洗淨後，以成為10μg/mL的方式添加抗core抗體(2H9；Wakita，T.et al.、Nat.Med.、2005年、第11卷、p.791-796)，而於室溫培養1小時。去除上清液而將細胞洗淨後，添加Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG(Molecular Probes)而於室溫培養1小時。將細胞洗淨後，於各孔添加50μL之PBS，以螢光顯微鏡觀察細胞。感染力價係計數發出螢光的細胞數，並表示為群落形成單位/mL(focus forming units/mL(ffu/mL)。
進行IgG抗體對於J6/JFH-1 HCVcc-8W、或作為比較對照之親株J6/JFH-1 HCVcc之感染抑制活性測定，並進行脫逸突變株之檢測。首先，於60μL之J6/JFH-1 HCVcc-8W或J6/JFH-1 HCVcc(各自為100ffu)中，添加同容量之經稀釋的IgG抗體，並於37℃培養1小時，而製作抗體-HCVcc混合液。去除預先接種於8孔腔室玻片(Chamber Slide)(Thermo Fisher Scientific)之各孔的Huh-7細胞之培養上清液，並添加100μL之抗體-HCVcc 混合液，而於37℃培養24小時。之後，去除培養上清液，並於各孔添加200μL之10% FCS-DMEM培養基(含1% MEM非必須胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉)，而進一步培養48小時。培養後，以與上述之感染力價測定相同的手法，使螢光標識抗體對各孔之細胞作用，計數發出螢光的細胞數而測定感染力價。將未添加抗體而使感染J6/JFH-1 HCVcc-8W或J6/JFH-1 HCVcc的細胞之感染力價當作100%，而算出添加各抗體-HCVcc混合液的細胞之感染力價%後，以IC50(μg/mL)來表示50%感染抑制濃度。IC50之值越低，則表示各抗體所致的感染抑制活性越高。
將結果示於表3。表中之「J6/JFH-1 HCVcc」係表示相對於親株J6/JFH-1 HCVcc之各抗體的感染抑制濃度IC50，「J6/JFH-1 HCVcc-8W」係表示各抗體對J6/JFH-1 HCVcc-8W的感染抑制濃度IC50。
如表3所示，已知人類抗E2蛋白質抗體MBL-HCV1(Broering等人，J.Viol.、2009年、第83卷、p.12473-12482)以與上述相同之方法評價的結果，即使是100μg/mL之濃度，亦無法認定對J6/JFH-1 HCVcc-8W的感染抑制活性，顯示有脫逸突變株出現。
相對於此，e2d066 IgG及e2d081 IgG之對J6/JFH-1 HCVcc-8W的感染抑制活性相較於對J6/JFH-1 HCVcc的感染抑制活性，係同等程度或僅些微減少。即，關於e2d066 IgG及e2d081 IgG，即使經過8次反復繼代感染，脫逸突變株之出現亦被抑制，並顯示彼等抗體呈現脫逸突變株出現抑制性。尤其，e2d066 IgG因無法認定脫逸突變株的出現，係顯示呈現非常強的脫逸突變株出現抑制性。
e2d066 IgG與e2d081 IgG之VH區之胺基酸序列係相同(序列識別號2)。因此顯示，此VH區(序列識別號2)(尤其，包含序列識別號5所示的CDR1、序列識別號6所示的CDR2、及序列識別號7所示的CDR3之VH區)係有助於脫逸突變株出現抑制性的可能性。
(實施例6)抗原決定位解析
為了判定各IgG抗體(e2d066 IgG、e2d073 IgG及e2d081 IgG)是否辨識立體結構抗原決定位，而試驗是否辨識變性E2蛋白質。可與變性E2蛋白質結合的抗體為會辨識E2蛋白質之直鏈狀抗原決定位的抗體，無法與變性E2蛋白質結合的抗體可說是會辨識E2蛋白質之立體結構抗原決定位的抗體。
又，作為對照組抗體，針對會辨識HCV E2蛋白質之直鏈狀抗原決定位的MBL-HCV1抗體、會辨識立體結構抗原決定位的AR3A抗體(國際公開第2010/047830號)，亦同樣地解析。
1.TH E2-Fc蛋白質(於TH株之E2蛋白質上附加人類IgG之Fc蛋白質的融合蛋白質)之製作
以國際公開第2010/038789號記載之方法製作。
以TH株(基因型1b)之基因體RNA之cDNA(Wakita，T.等人，J.Biol.Chem.、1994年、第269卷、p.14205-14210、國際公開第2006/022422號)作為模板，以PCR法放大在將TH株之前驅物蛋白質之N末端的起始甲硫胺酸做為第1號的情形之編碼包含相當於第384號~第717號的領域的蛋白質(相當於E2蛋白質)的基因。將所放大的DNA片段於pCR-TOPO(Thermo Fisher Scientific)中選殖。將編碼E2蛋白質的基因片段以HindIII及BamHI消化而切出，並以讀框吻合的方式插入p3×FLAG-CMV-13(Sigma-Aldrich)之訊息胜肽序列的下游的HindIII部位與BamHI部位之間。將此載體命名為CMV-13-THE2。將CMV-13-THE2以SacI及BamHI消化，並將編碼訊息胜肽序列與E2蛋白質的DNA片段各自以瓊脂糖膠體電泳分離，以GeneElute(Sigma-Aldrich)純化。之後，於表現包含小鼠IL-7受體-人類免疫球蛋白Fc功能域的嵌合蛋白質之載體CDM-mIL7R-Ig(Sudo等人，Proc Natl.Acad Sci USA、1993年、第90卷、p.9125~9129)的SacI部位與BamHI部位之間，以讀框吻合的方式插入編碼上述訊息胜肽序列與E2蛋白質的各自之DNA片段，而獲得表現被附加有人類免疫球蛋白之Fc功能域的抗原E2蛋白質(以下，TH E2Fc蛋白質)之載體CDM-THE2Fc。
將載體CDM-THE2Fc，藉由DEAE葡聚糖法轉染於COS1細胞，使TH E2Fc蛋白質表現。使用結合有Protein-A的擔體Prosep-A(Millipore)，自導入CDM-THE2Fc的細胞之培養上清液來將TH E2Fc蛋白質純化。
2.各抗體之生物素化
將各抗體(e2d066 IgG、e2d073 IgG、e2d081 IgG、AR3A抗體、MBL-HCV1抗體)生物素化。生物素化係使用EZ-Link(註冊商標)Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Fisher Scientific)，而依據所附手冊進行。於以PBS稀釋為0.1mg/mL的IgG抗體100μL中，添加2.4μL之20mmol/L之Sulfo-NHS-LC-Biotin，混合並靜置於冰中2小時。其次，以Zeba(商標)旋轉脫鹽管柱(Thermo Fisher Scientific)脫鹽，去除未反應之生物素，而調製生物素化抗體。
3.抗原決定位解析
使TH E2-Fc蛋白質，藉由以含有2%SDS、5%2ME的50mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，95℃加熱處理3分鐘而變性。
將未變性之TH E2-Fc蛋白質、及經變性的TH E2-Fc蛋白質各自以PBS稀釋為0.5μg/mL，並於免疫盤(Thermo Fisher Scientific)之各孔中各添加50μL，於4℃靜置一晚，藉此而將各蛋白質於盤上固相化。去除蛋白質溶液，並將依據所附手冊而調製的Blocking One溶液(Nacalai tesque)各添加200μL於各孔，進行阻斷。
其次，將生物素化抗體以PBS3倍階段地稀釋，於上述之經固相化的盤之各孔中各添加50μL，使於室溫反應1小時。反應結束後，以含有0.05%Tween20的PBS洗淨後，將以含有0.05%Tween20的PBS3000倍稀釋的抗生物素蛋白-HRP(GE Healthcare)各添加50μL於各孔，並於室溫使反應1小時。反應結束後，以含有0.05%Tween20的PBS洗淨，以ELISA POD基質TMB溶液(Nacalai tesque)使顯色後，以1mol/L硫酸使反應停止，並以微量盤讀取器測定吸光度(450nm)。
將該結果示於第14圖。第14圖A係顯示各IgG抗體對未變性之TH E2-Fc蛋白質的結合性，第14圖B係顯示各IgG抗體對經變性之TH E2-Fc蛋白質的結合性。圖之縱軸係表示吸光度(450nm)，橫軸係表示生物素化抗體之稀釋倍率。
e2d066 IgG、e2d073 IgG及e2d081 IgG、以及AR3A抗體，係未與經變性之TH E2-Fc蛋白質結合，但MBL-HCV1抗體係對變性及未變性之TH E2-Fc蛋白質的任一者皆反應(第14圖)。
因此暗示，e2d066 IgG、e2d073 IgG及e2d081 IgG與MBL-HCV1抗體並不同，係辨識立體結構抗原決定位。
(實施例7)直鏈狀胜肽所致的抗原決定位解析
根據實施例6，暗示e2d066 IgG、e2d073 IgG及e2d081 IgG會辨識立體結構抗原決定位。所以，使用包含12個胺基酸殘基的直鏈狀胜肽群來確認此等之抗體會辨識立體結構抗原決定位。
針對相當於TH株之E2蛋白質的胺基酸序列(序列識別號36)(在將TH株之前驅物蛋白質之N末端之起始甲硫胺酸當作第1號的情形，相當於第384號~第717號為止的胺基酸序列)，合成包含將12個連續的胺基酸自N末端每3個地移動而設計的胺基酸序列的胜肽群(胜肽編號1~82)。各胜肽之N末端係生物素化，且使C末端為甘胺酸醯胺。
將各胜肽溶解於DMSO後，以成為0.01nmol/μL的方式溶解於PBS。將此胜肽溶液50μL添加於鏈黴抗生物素蛋白塗布盤(Thermo Fisher Scientific)之各孔，並於室溫使反應2小時。去除胜肽溶液，將依據所附手冊調製的Blocking One溶液(Nacalai tesque)於各孔添加200μL，於4℃靜置一晚，藉此而進行阻斷。
去除阻斷溶液，以含0.05%Tween20的PBS洗淨4次後，於各孔各添加以含有0.05%Tween20的PBS稀釋為1μg/mL的各抗體50μL，於室溫使反應1.5小時。反應結束後，去除抗體溶液，以含0.05%Tween20的PBS洗淨4次，接著以50μL/孔添加以含有0.05%Tween20的PBS稀釋為5000倍的HRP標識抗人類IgG山羊抗體(GE Healthcare)，並於室溫使反應1小時。反應後，去除抗體溶液，以含有0.05%Tween20的PBS洗淨5次。洗淨後，以過氧化酶顯色套組使顯色，並測定450nm之吸光度，藉以檢測與胜肽結合的抗體。
其結果，MBL-HCV1抗體雖與胜肽QLINTNGSWHIN(序列識別號37)結合(第15圖D)，但 e2d066 IgG、e2d073 IgG及e2d081 IgG則未與任一之胜肽結合(第15圖A、B及C)。由以上顯示，MBL-HCV1抗體會辨識直鏈狀抗原決定位，e2d066 IgG、e2d073 IgG及e2d081 IgG會辨識立體結構抗原決定位。
(實施例8)競合ELISA所致的抗原決定位之比較
針對會辨識立體結構抗原決定位的e2d066 IgG，是否與會辨識立體結構抗原決定位的e2d073 IgG、e2d081 IgG及AR3A抗體辨識相同的抗原決定位，藉由競合ELISA進行檢討。
作為對照組抗體，使用會辨識立體結構抗原決定位的中和抗體AR3A、會辨識直鏈狀抗原決定位QLINTNGSWHIN(序列識別號37)(TH株之E2蛋白質之第412號之Q至第423號之N為止)的中和抗體MBL-HCV1、及會辨識直鏈狀抗原決定位(第522號之D~第534號之N為止)的非中和抗體8D10-3(國際公開第2010/038789號)。
於各抗體(自20μg/mL作3倍階段稀釋)中等量添加生物素化的e2d066 IgG(記載於實施例6之2.項)並攪拌後，添加於將TH E2-Fc蛋白質(記載於上述之實施例6)固相化(0.5μg/孔)的ELISA盤(Thermo Fisher Scientific)中。1小時後，以含有0.05%Tween20的PBS洗淨後，添加3000倍稀釋的抗生物素蛋白-HRP(GE Healthcare)而使反應。1小時後，以含有0.05% Tween20的PBS洗淨後，以ELISA POD基質TMB溶液(Nacalai tesque)使顯色後，以1mol/L硫酸使反應停止，並以微量盤讀取器測定吸光度(450nm)。
將結果示於第16圖。圖之縱軸表示吸光度(450nm)，橫軸表示各抗體之濃度。
生物素化的e2d066 IgG之對TH E2-Fc蛋白質的結合，係藉由e2d066 IgG及e2d081 IgG而抗體之濃度依賴性地被抑制。因此顯示，e2d066 IgG及e2d081 IgG係會辨識相同抗原決定位。
另一方面，由於e2d073 IgG、AR3A抗體、MBL-HCV1抗體及8D10-3抗體由於未抑制生物素化的e2d066 IgG之對TH E2-Fc蛋白質的結合，故顯示與e2d066 IgG係抗原決定位不同。
e2d066 IgG與e2d081 IgG之VH區之胺基酸序列係相同(序列識別號2)。因此顯示，此VH區(胺基酸序列(序列識別號2))，尤其包含序列識別號5所示的CDR1、序列識別號6所示的CDR2、及序列識別號7所示的CDR3的VH區，係有助於辨識相同之抗原決定位的可能性。
其次根據Krey等人之文獻(PLOS Pathogens，e1003364，2013)製作被暗示顯示脫逸突變株出現抑制性的HC-84.1抗體(國際公開第2013/033319號)，針對與e2d066之抗原決定位的異同，以與上述相同的方法檢討。於將e2d066 IgG、e2d081 IgG、HC-84.1抗體、MBL-HCV1抗體及AR3A抗體由20μg/mL作3倍階段稀釋的樣品中，等量添加生物素化的e2d066 IgG(記載於實施例6之2.項)並攪拌後，添加於將TH E2-Fc蛋白質(記載於上述之實施例6)固相化(0.5μg/孔)的ELISA盤(Thermo Fisher Scienrific)中。1小時後，以含有 0.05%Tween20的PBS洗淨後，添加3000倍稀釋的抗生物素蛋白-HRP(GE Healthcare)而使反應。1小時後，以含有0.05% Tween20的PBS洗淨後，以ELISA POD基質TMB溶液(Nacalai tesque)使顯色後，以1mol/L硫酸使反應停止，並以微量盤讀取器測定吸光度(450nm)。
將結果示於第17圖。圖之縱軸表示吸光度(450nm)，橫軸表示各抗體之濃度。生物素化的e2d066 IgG之對TH E2-Fc蛋白質的結合係藉由e2d066 IgG及e2d081 IgG而抗體之濃度依賴性地被抑制。
另一方面，HC-84.1抗體、AR3A抗體及MBL-HCV1抗體由於未抑制生物素化的e2d066 IgG對TH E2-Fc蛋白質的結合，而顯示HC-84.1抗體之抗原決定位亦與e2d066 IgG不同。
(實施例9)各種單株抗體之對E2蛋白質的結合性比較
比較e2d066 IgG、e2d081 IgG、HC-84.1抗體、MBL-HCV1抗體及AR3A抗體之對J6CF E2-Fc、TH E2-Fc蛋白質的結合性。添加將各種單株抗體由30μg/mL進行10倍階段稀釋之樣品於將J6CF E2-Fc或TH E2-Fc蛋白質(記載於上述之實施例6)固相化(0.5μg/孔)的ELISA盤(Thermo Fisher Scientific)中。1小時後，以含有0.05%Tween20的PBS洗淨後，添加經5000倍稀釋的山羊抗人類IgG F(ab’)2-HRP(Thermo Fisher Scientific)而使反應。1小時後，以含有0.05% Tween20的PBS洗淨後，以ELISA POD基質TMB溶液(Nacalai tesque)使顯色後，以1mol/L硫酸使反應停止，並以微量盤讀取器測定吸光度(450nm)。
將其結果示於第18圖。e2d066 IgG、e2d081 IgG係對基因型2a之J6CF株、基因型1b之TH株之E2蛋白質，顯示較HC-84.1抗體、MBL-HCV1抗體及AR3A抗體更高的結合性。
(實施例10)IgG抗體對C型肝炎病毒(HCV)感染擴大之抑制效果
藉由對於感染基因型2a之HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的細胞，進行e2d066 IgG之處理，而評價e2d066 IgG抗HCV感染擴大的作用。作為比較，亦針對抗NS3蛋白質之蛋白酶活性之抑制劑特拉匹佛(telaprevir)(VX-950)及干擾素-α(IFN-α)進行評價。
於評價之前日，於12孔盤接種Huh-7細胞(4×104細胞/孔；10% FCS-DMEM培養基(含1%MEM非必須胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉))而培養。將上述實施例4之1.項所製作的基因型2a之HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)以PBS調製為moi=0.03後，添加於Huh-7細胞後，將Huh-7細胞於37℃、5%CO2培養箱中培養4小時。
4小時後去除培養上清液，置換為各自含e2d066 IgG、特拉匹佛(VX-950)及IFN-α的D-MEM 置換，並於37℃、5%CO2培養箱再培養96小時。又，將置換為不含抗體．藥劑的D-MEM而同樣地培養的細胞設置作為對照(第19圖中之橫軸「無處置」)。培養後，回收細胞培養上清液。將所回收的細胞培養上清液液中所含的HCV核蛋白質使用Lumipulse®G1200(Fujirebio、Ortho-Clinical Diagnostics)定量。
將結果示於第19圖。縱軸係表示細胞培養上清液中之HCV核蛋白質濃度(pmol/L)，該值越低則表示感染抑制活性越高。橫軸係由左表示「無處置」、使作用的抗體e2d066 IgG、藥劑特拉匹佛、IFN-α以及該等之濃度(對細胞添加後之最終濃度)。
藉由e2d066 IgG之處置，與對照(「無處置」)比較，細胞培養上清液中之HCV核蛋白質濃度係顯示顯著之低值，其效果係與特拉匹佛(VX-950)及IFN-α所致的效果為同等以上。即，e2d066 IgG具有抑制HCV感染後之細胞中的HCV產生的效果或抑制由HCV感染細胞向周邊之HCV未感染細胞的感染的效果。
因此顯示，本發明之抗體及抗原結合性抗體於可抑制HCV對細胞的感染本身的同時，亦可於HCV之感染成立後抑制HCV之感染擴大。顯示由於本發明之抗體及抗原結合性抗體具有抑制HCV之感染本身的效果，而具有肝臓移植患者中的HCV之再感染(C型肝炎復發)等之預防效果，又顯示由於具有HCV之感染成立後之HCV感染擴大抑制效果，而具有HCV持續感染者中的治療效果，即，C型肝炎之治療效果。
[產業上之利用可能性]
本發明之抗體或抗原結合性抗體片段因具有高HCV感染抑制活性及HCV感染擴大抑制效果，而可期待使用於C型肝炎之治療藥或預防藥，尤其是慢性C型肝炎患者之活體肝移植時之肝炎復發預防。
[序列表非格式化文字]
序列識別號1：編碼e2d066(及e2d081)之VH區的鹼基序列
序列識別號2：e2d066(及e2d081)之VH區之胺基酸序列
序列識別號3：編碼e2d066之VL區的鹼基序列
序列識別號4：e2d066之VL區之胺基酸序列
序列識別號5：e2d066(及e2d081)之VH區之CDR1之胺基酸序列
序列識別號6：e2d066(及e2d081)之VH區之CDR2之胺基酸序列
序列識別號7：e2d066(及e2d081)之VH區之CDR3之胺基酸序列
序列識別號8：e2d066之VL區之CDR1之胺基酸序列
序列識別號9：e2d066之VL區之CDR2之胺基酸序列
序列識別號10：e2d066之VL區之CDR3之胺基酸序列
序列識別號11：編碼e2d073之VH區的鹼基序列
序列識別號12：e2d073之VH區之胺基酸序列
序列識別號13：編碼e2d073之VL區的鹼基序列
序列識別號14：e2d073之VL區之胺基酸序列
序列識別號15：e2d073之VH區之CDR1之胺基酸序列
序列識別號16：e2d073之VH區之CDR2之胺基酸序列
序列識別號17：e2d073之VH區之CDR3之胺基酸序列
序列識別號18：e2d073之VL區之CDR1之胺基酸序列
序列識別號19：e2d073之VL區之CDR2之胺基酸序列
序列識別號20：e2d073之VL區之CDR3之胺基酸序列
序列識別號21：編碼e2d081之VL區的鹼基序列
序列識別號22：e2d081之VL區之胺基酸序列
序列識別號23：e2d081之VL區之CDR1之胺基酸序列
序列識別號24：e2d081之VL區之CDR2之胺基酸序列
序列識別號25：e2d081之VL區之CDR3之胺基酸序列
序列識別號26：e2d066之IgG抗體(e2d066 IgG)重鏈全長之胺基酸序列
序列識別號27：e2d066之IgG抗體(e2d066 IgG)輕鏈全長之胺基酸序列
序列識別號28：e2d073之IgG抗體(e2d073 IgG)重鏈全長之胺基酸序列
序列識別號29：e2d073之IgG抗體(e2d073 IgG)輕鏈全長之胺基酸序列
序列識別號30：e2d081之IgG抗體(e2d081 IgG)重鏈全長之胺基酸序列
序列識別號31：e2d081之IgG抗體(e2d081 IgG)輕鏈全長之胺基酸序列
序列識別號32：e2d066 scFv全長之胺基酸序列
序列識別號33：e2d073 scFv全長之胺基酸序列
序列識別號34：e2d081 scFv全長之胺基酸序列
序列識別號35：連接物之胺基酸序列
序列識別號36：TH株之E2蛋白質之胺基酸序列
序列識別號37：來自TH E2蛋白質的胜肽之胺基酸序列
序列識別號38：e2d066之CL區之胺基酸序列
序列識別號39：e2d073之CL區之胺基酸序列
序列識別號40：e2d081之CL區之胺基酸序列
序列識別號41：TH株與JFH-1株之嵌合HCV粒子(TH/JFH-1 HCVcc)之前驅物蛋白質之胺基酸序列
<110> 日本國立感染症研究所抗體研究所、東麗工業股份有限公司
<120> 具有抗C型肝炎病毒的感染抑制活性的抗體
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<213> 人工
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<220>
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<213> 人工
<220>
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<221> CDS
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<223> e2d073 VH CDR2之胺基酸序列
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<213> 人工
<220>
<223> e2d073 VH CDR3之胺基酸序列
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<223> e2d073 VL CDR1之胺基酸序列
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> e2d081 VL區之DNA序列
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> e2d081 VL區之胺基酸序列
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> e2d081 VL CDR1之胺基酸序列
<400> 23
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> e2d081 VL CDR2之胺基酸序列
<400> 24
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<223> e2d081 VL CDR3之胺基酸序列
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<212> PRT
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<220>
<223> e2d066 IgG抗體之完整重鏈之胺基酸序列
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<212> PRT
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<223> e2d066 IgG抗體之完整輕鏈之胺基酸序列
<400> 27
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<212> PRT
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<220>
<223> e2d073 IgG抗體之完整重鏈之胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> e2d073 IgG抗體之完整輕鏈之胺基酸序列
<400> 29
<210> 30
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> e2d081 IgG抗體之完整重鏈之胺基酸序列
<400> 30
<210> 31
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> e2d081 IgG抗體之完整輕鏈之胺基酸序列
<400> 31
<210> 32
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 全部e2d066 scFv抗體之胺基酸序列
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<210> 33
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 全部e2d073 scFv抗體之胺基酸序列
<400> 33
<210> 34
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 全部e2d081 scFv抗體之胺基酸序列
<400> 34
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 連結物之胺基酸序列
<400> 35
<210> 36
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TH株之E2蛋白質之胺基酸序列
<400> 36
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TH E2蛋白質-衍生的胜肽之胺基酸序列
<400> 37
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<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> e2d066 CL區之胺基酸序列
<400> 38
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> e2d073 CL區之胺基酸序列
<400> 39
<210> 40
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> e2d081 CL區之胺基酸序列
<400> 40
<210> 41
<211> 3030
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TH株及JFH-1株之嵌合HCV粒之先驅物蛋白質(TH/JFH-1 HCVcc)
<400> 41

Claims (12)

  1. 一種抗C型肝炎病毒E2蛋白質抗體或抗原結合性抗體片段，其具有C型肝炎病毒(HCV)感染抑制活性。
  2. 如請求項1之抗體或抗原結合性抗體片段，其顯示脫逸突變株(escape mutant)出現抑制性。
  3. 如請求項1或2之抗體或抗原結合性抗體片段，其中該抗體或抗原結合性抗體片段係包含以下之(a)或(b)之重鏈可變區：(a)包含序列識別號5所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號6所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號7所示的胺基酸序列所構成的CDR3的重鏈可變區；(b)包含序列識別號2所示的胺基酸序列的重鏈可變區。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體或抗原結合性抗體片段，其中該抗體或抗原結合性抗體片段係包含以下之(c)~(f)之任一者之輕鏈可變區：(c)包含序列識別號8所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號9所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號10所示的胺基酸序列所構成的CDR3的輕鏈可變區；(d)包含序列識別號23所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號24所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號25所示的胺基酸序列所構成的CDR3的輕鏈可變區； (e)包含序列識別號4所示的胺基酸序列的輕鏈可變區；(f)包含序列識別號22所示的胺基酸序列的輕鏈可變區。
  5. 一種抗體或抗原結合性抗體片段，其辨識與如請求項4之抗體或抗原結合性抗體片段相同的立體結構抗原決定位。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗原結合性抗體片段，其中該抗體或該抗原結合性抗體片段為IgG、Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體、dsFv、(scFv)2、或單域抗體。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體或抗原結合性抗體片段，其中該抗體為人類抗體或人化抗體。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體或抗原結合性抗體片段，其中該抗體或抗原結合性抗體片段係經化學修飾。
  9. 一種核酸，其編碼如請求項1至7中任一項之抗體或抗原結合性抗體片段。
  10. 一種核酸，其編碼包含序列識別號5所示的胺基酸序列所構成的CDR1、序列識別號6所示的胺基酸序列所構成的CDR2、及序列識別號7所示的胺基酸序列所構成的CDR3的重鏈可變區。
  11. 一種醫藥，其含有如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合性抗體片段作為有效成分。
  12. 如請求項11之醫藥，其係C型肝炎之治療劑或預防劑。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030180284A1 (en) * 1998-11-05 2003-09-25 Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational and linear epitopes
CA2601400A1 (en) * 2005-03-19 2006-09-28 Medical Research Council Improvements in or relating to treatment and prevention of viral infections
WO2007143701A2 (en) * 2006-06-06 2007-12-13 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies that potently neutralize hepatitis c virus (hcv) of diverse genotypes
CA2694397A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Japan As Represented By Director-General Of National Institute Of Infect Ious Diseases Antibody having inhibitory activity on infection with hepatitis c virus (hcv) and use thereof
WO2010035292A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-01 Natimab Therapeutics S.R.L. The use of a human monoclonal anti-hcv antibody as a medicament for the therapeutic treatment and prevention of hcv infections
WO2010047830A2 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 The Scripps Research Institute Agents for hcv treatment
WO2011052735A1 (ja) * 2009-10-30 2011-05-05 東レ株式会社 C型肝炎ウイルス（hcv）に対して感染阻害活性を有する抗体及びその用途
WO2013033319A2 (en) * 2011-08-30 2013-03-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University A cluster of neutralizing antibodies to hepatitis c virus

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