TW201710493A - 去細胞軟骨移植物及其製備方法與用途 - Google Patents
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Abstract
在此揭示一種製備去細胞軟骨移植物的方法。所述方法包含以下步驟：將從動物取得的軟骨基質，以鹼、滅菌和去細胞處理步驟進行處理後，製成去細胞軟骨移植物。依據本發明方法所製備的軟骨移植物可完全去除軟骨基質上的細胞物質，同時仍能保留軟骨基質中膠原蛋白纖維的孔隙率和完整性，因此，依據本發明方法所製備的軟骨移植物適合作為異種移植物，用以供宿主細胞生長。在此亦揭示一種治療患有骨軟骨疾病之個體的方法，本方法是將去細胞軟骨移植物移植至該個體的病灶處。
Description
本發明是有關於去細胞軟骨移植物的領域，特別是改善製備去細胞軟骨移植物的方法，所述去細胞軟骨移植物是適合作為細胞生長的生物性支架，因此，本發明去細胞軟骨移植物可作為治療骨軟骨疾病的異種移植物。
軟骨組織損傷經常發生於活動量大的人身上和老年族群，通常是由急性或反覆性的損傷或老化所導致的。現今治療方案包含休息、利用微關節顯微手術清除軟骨損傷區域，以及利用其他手術治療（例如，微裂術(microfracture)、鑽孔術(drilling)和磨損法(abrasion)）。這些治療方案只能暫時性緩解症狀，特別是當患者在經處置後，仍保持與損傷前相同的活動量時。舉例而言，慢性膝關節軟骨損傷可能使關節軟骨的損壞更為嚴重，最終需置換全膝關節。此外，骨軟骨疾病或損傷仍面臨其他困境，且前尚無有效的醫療程序和方法能夠治療。再者，除了上述老化、損傷和/或疾病所導致的軟骨受損外，因整形或整容手術過程需修復或增加軟骨組織，如，隆鼻手術、臉部左右不對稱的矯正手術、眼瞼周圍的矯正手術和臉部整形手術等，使得整形或整容手術所需的軟骨移植物需求量也在持續攀升中。
市面上的工程軟骨是以接種水凝膠或天然或合成的聚合物所形成，以該些方式製成的工程軟骨無法擁有與天然軟骨相同的機械特性，此係因天然軟骨最主要的成分是膠原蛋白，其具有較高的機械強度。為了克服工程軟骨機械強度不足的缺陷，在製備過程中往往透過添加交聯劑（如，戊二醛）來改善水凝膠或聚合物支架的機械強度。然而，大部分的交聯劑對人類具有毒性，故使用上有限制。
本發明的優勢在於提供一種改良的軟骨移植物，可用於矯正手術或治療上述的損傷。本發明改良的軟骨移植物不僅擁有天然支架的機械強度和構型，能有效的將軟骨恢復至損傷前的狀態，且不會引起其他併發症(如，免疫原性的問題)；另外，本發明的軟骨移植物很容易製造，且製備成本低廉。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容之一態樣是一種提供製備去細胞軟骨移植物的方法，所述去細胞軟骨移植物適用於整形手術(如，隆鼻手術、臉部矯正手術等)，或治療骨軟骨疾病。所述方法包含以下步驟： (1) 切割一動物的軟骨以產生一軟骨基質； (2) 以一種鹼來處理步驟(1)的軟骨基質； (3) 將步驟(2)中經鹼處理的軟骨基質進行滅菌處理；以及 (4) 去除步驟(3)中經滅菌的軟骨基質之細胞，以製得該去細胞軟骨移植物。
再者，依據本揭示內容的實施方式，在步驟(1)中，所述軟骨是取自於一哺乳動物，且所述軟骨是鼻軟骨、肋軟骨、耳軟骨或膝關節軟骨。
依據本揭示內容的實施方式，在步驟(2)中，該鹼處理步驟包含在室溫下以氫氧化鈉處理該軟骨基質3至24小時。
依據本揭示內容的實施方式，在步驟(3)中，以一滅菌劑處理該經鹼處理的軟骨基質，其中該滅菌劑選自於以下所組成的群組中：醇類、氧化劑、放射線、酚化合物和四級銨化合物。
在某些實施方式中，於步驟(3)，是以一醇類來處理該經鹼處理的軟骨基質，所述醇類是乙醇或異丙醇。
在其他實施方式中，於步驟(3)，是以一氧化劑來處理該經鹼處理軟骨基質，所述氧化劑是過氧化氫。
在又一實施方式中，於步驟(3)，是以一放射線來處理該經鹼處理軟骨基質，所述放射線是伽馬射線。
在其他實施方式中，於步驟(3)，是以一酚化合物來處理該經鹼處理軟骨基質，所述酚化合物是對羥苯甲酸酯、苯甲酸或水楊酸。
在又一實施方式中，於步驟(3)，是以一四級銨化合物來處理該經鹼處理軟骨基質，所述四級銨化合物是氯化苄烷銨、氯化烷基二甲苄銨、二癸基二甲基氯化銨或氯化銨。
依據本揭示內容的實施方式，於步驟(4)，所述去細胞步驟包含，以一超臨界流體(SCF)於壓力約150-350巴和溫度30-50°C下，處理該步驟(3)中經滅菌的軟骨基質20分鐘至5天。
所述SCF是超臨界二氧化碳(scCO2
)、超臨界一氧化氮(scN2
O)、 超臨界水(scH2
O)、超臨界烷類、超臨界烯類、超臨界醇類或超臨界丙酮。在一實施例中，所述SCF是scCO2
。在其他實施例中，SCF是scN2O。
依據一較佳的實施方式，所述去細胞步驟是於溫度37℃、壓力350巴下，處理100分鐘。
製備完成的軟骨移植物主要是由膠原蛋白所構成，保留了其天然結構和構型，故施用於(如，移植)個體後可作為能供細胞生長的三維支架。再者，所述軟骨移植物為去細胞的軟骨移植物，意即該移植物上並無任何殘留的細胞物質，因此，實質上所述軟骨移植物乃是無免疫原性，不會誘導宿主產生任何的免疫反應。此外，本發明軟骨移植物的機械特性優於天然軟骨，相較於天然軟骨和/或工程軟骨，本發明軟骨移植物為較佳的異種移植物。
再者，本揭示內容第二態樣是提供以本方法製備的軟骨移植物。本揭示內容的軟骨移植物可作為整形手術或治療由老化、損傷或疾病引起軟骨缺損的異種移植物。所述整形手術的實例包含，但不限於，隆鼻、臉部左右不對稱的矯正手術、眼瞼周圍的矯正手術或臉部整形手術等。
本揭示內容的第三態樣是提供一種治療骨軟骨疾病的方法。所述方法包含施用本發明去細胞軟骨移植物至一個體的治療部位(如，病灶處)。
所述骨軟骨疾病可以是先天性缺陷、骨折、半月板損傷或缺損、骨/脊柱變形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨發育不全和脊柱側彎、骨質疏鬆症、牙周病、牙骨質流失、骨軟化、佝僂病、囊狀纖維性骨炎、腎性骨失養症、脊柱融合、椎間盤重建或切除、柏哲德變形性骨炎、半月板損傷、類風濕性關節炎、骨關節炎，以及創傷性或手術性軟骨損傷。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
所述「去細胞(acellular)」一詞是指一移植物上無任何殘留的細胞物質，例如，生物活性細胞和/或其碎片。再者，所述「去細胞軟骨移植物(acellular cartilage graft)」是指所述軟骨移植物是取自於動物(如，哺乳類)的軟骨，且所述軟骨移植物實質上不具有任何細胞物質。在一實施例中，所述軟骨是取自於豬的鼻軟骨。在其他實施例中，所述軟骨是取自於豬的膝軟骨。在又一實施例中，所述軟骨是取自於豬的肋軟骨。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已儘可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0。5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
廣義而言，本揭示內容是有關於一種揭示製備一去細胞軟骨移植物，其適用於整容或整形手術，或者是用來治療骨軟骨疾病，即，將本發明方法所製備的去細胞軟骨移植物移植至軟骨病灶處；另，所述治療骨軟骨疾病包含修復或回復受損性(damaged)、損傷性(injured)、創傷性(traumatized)或老化(aged)軟骨和/或修復軟骨缺損。
本揭示內容的一態樣是關於一種製備去細胞軟骨移植物的方法，所述方法可保留膠原蛋白的機械強度，以及其天然結構和構型，因此，當本發明去細胞軟骨移植物被移植至宿主身上，以進行組織重建或治療骨軟骨疾病時，能提供宿主組織細胞一可供細胞生長的最佳微環境。再者，以本發明方法所製成的軟骨移植物已完全移除其上的細胞物質，因此，本發明方法所製成的軟骨移植物實質上是非免疫原性的移植物，在移植後不會誘導宿主產生免疫反應。
再者，本發明方法至少包含以下步驟： (1) 切割一動物的軟骨以產生多個軟骨基質； (2) 以一種鹼來處理步驟(1)所產生之多個軟骨基質； (3) 將步驟(2)中經鹼處理的多個軟骨基質進行滅菌處理；以及 (4) 去除步驟(3)中任一該經滅菌的多個軟骨基質上之細胞，以製得該去細胞軟骨移植物。
為了製備合適的去細胞軟骨移植物，可以從非人類動物上取下一完整的鼻軟骨、肋軟骨、耳軟骨或膝軟骨，較佳是以經濟動物作為軟骨的來源。舉例而言，可作為供應軟骨來源的經濟動物包含，但不限於、豬、牛、乳牛、公牛、綿羊、山羊、驢、兔、鴨、鵝或雞。作為軟骨移植物來源的軟骨，較佳是取自於現宰動物，且立即置於無菌等滲透溶液或其他保存溶液中。將收集到的軟骨接著切割至適當的尺寸和形狀，以製備成盤狀、條狀、顆粒和錐狀的軟骨基質。在某些實施例中，每一軟骨基質的形狀為盤狀，且直徑為約8-12公釐，較佳的直徑為約11公釐。在其他實施例中，每一軟骨基質的形狀為條狀，長度為約6公分、寬度為約10公釐，且厚度為約2-5公釐。一般而言，所述軟骨移植物的尺寸和形狀非為本揭示內容的關鍵，只要所述軟骨移植物的尺寸和形狀與治療部位形狀相符即可。
將切塊的軟骨基質分別施以步驟(2)和(3)的處理，即步驟(2)的鹼處理和步驟(3)進行滅菌。適合本發明方法使用的鹼試劑包含，但不限於，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、尿素、硫化鈉和硫代乙酸鈣等。在較佳的實施方式中，所述軟骨基質是在室溫下以氫氧化鈉溶液處理3小時。滅菌處理的步驟則是以滅菌劑處理所述軟骨基質使其無菌，其中滅菌劑可以是氧化劑、酚化合物、四級銨化合物、抗生素和放射線。舉例而言，適用於本發明方法滅菌劑包含，但不限於，醇類、異丙醇、重碳酸鈉、過氧化氫、醋酸、乙磺醯胺、對羥苯甲酸酯、苯甲酸、水楊酸、氯化苄烷銨、氯化烷基二甲苄銨、二癸基二甲基氯化銨、氯化胺、X-光、伽瑪放射線和紫外光。在某些實施方式中，是以過氧化氫溶液處理所述軟骨基質。再者，於執行每一步驟後皆以大量的水沖洗軟骨基質移除其中水溶性物質後，再進行下一步驟。
接著，除去步驟(3)中該經鹼處理及經滅菌的軟骨基質上的細胞。去細胞之目的在於，移除軟骨組織上的細胞物質，且可保留膠原蛋白的物理及生物化學特性，使其可作為組織支架(如，一異種移植物)。此外，在步驟(4)中，將步驟(3)中該經滅菌的軟骨基質，於壓力約150-500巴下以一超臨界流體(SCF)進行處理，所述壓力例如100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490和500 巴； 較佳為約150–350 巴，例如，150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340和350 巴。再者，步驟(4)是在溫度為30-50℃之間進行的，例如，30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃；較佳的溫度是35-45℃之間，例如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45；處理時間為約20分鐘至5天，例如約20、30、40、50和60分鐘； 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24小時；2、3、4、和5天。在某些實施例中，步驟(3)經滅菌的軟骨基質以SCF處理約1至24小時。在其他實施例中，所述步驟(3)中經滅菌的軟骨基質係以SCF處理約2至5天。
SCF可以是任一種超臨界二氧化碳 (scCO2
)、超臨界一氧化氮(scN2
O)、超臨界水(scH2
O)、超臨界烷類、超臨界烯類、超臨界醇類或超臨界丙酮。在一實施例中，所述SCF是scCO2
，scCO2
的超臨界條件是溫度37℃、壓力為350 巴，因此，去除生物物質時是在接近個體體溫(即，37℃)的溫度下執行的。在另一較佳的實施方式，所述SCF是scN2
O。
在一非必要的實施方式中，所述SCF係連同一共溶劑一併施用至步驟(3)中該經滅菌的軟骨基質上。所述共溶劑可以是C1-4醇，
其包含，但不限於，乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、仲丁醇、叔丁醇和環丁醇。在某些較佳的實施方式中，所述共溶劑是乙醇，且和SCF一併施用，其中共溶劑和SCF的體積比為1:20至1:4，例如，1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5和1:4。在一較佳的實施方式中，所述乙醇和SCF是以體積比約1:19施用。在其他實施方式，所述乙醇和SCF是以體積比約1:10施用。在又一實施方式中，所述乙醇和SCF是以體積比約1:4施用。在一最佳的實施方式中，所述乙醇和SCF是同時施用，且乙醇和SCF是以體積比約1:10。
依據本揭示內容的實施方式，所述步驟(4)該經SCF處理的軟骨移植物實質上已完全去除其上的細胞物質，不需額外以酵素消化處理(如，以蛋白酶和/或糖苷酶消化)來去除可能作為異種移植物免疫排斥來源的抗原表面碳水化合物部分。依據本揭示內容的實施方式，以本方法所製備的軟骨移植物已完全去除核酸和非膠原之蛋白。
再者，步驟(4)中該經SCF處理的軟骨移植物是由膠原蛋白纖維所構成，且保留機械強度和膠原蛋白纖維的完整性，因此，本發明所製備出的軟骨移植物適合作為生物性支架，供宿主細胞生長。依據本揭示內容的實施方式，本發明軟骨移植物保留膠原蛋白天然結構和構型，且能夠支持纖維母細胞生長。
需要注意的是本發明不同於先前技術所揭示的方法，本發明不採用一般常用的高張鹽溶液、脫水和/或冷凍處理等步驟，來製備軟骨移植物，此不僅簡化處理步驟且使製備過程更加容易，同時能夠維持本發明軟骨移植物中膠原蛋白纖維的完整性和/或機械強度。再者，本發明方法不同於先前技術在於本方法不使用交聯劑(cross-linking agent)(如，戊二醛、甲醛和其他類似物)使軟骨移植物的蛋白交聯，因此，可降低或減少軟骨移植物的毒性和免疫原性。
依據本揭示內容可任選的實施方式，所述經SCF處理的軟骨移植物可以利用任何目前已知的方法(如，以前述的滅菌劑處理)進行滅菌，且存放於乾燥且無菌的狀態下備用。在某些實施方式中，軟骨移植物是以伽馬射線照射進行滅菌，放射線照射強度為10-60 kGy，如，10、20、30、40、50和 60 kGy。在較佳的實施方式中，所述軟骨移植物是以伽馬射線照射進行滅菌，放射線照射強度為10-30 kGy，如，10、15、20、25和30 kGy。
本發明所製備的去細胞軟骨移植物適用於整容或整形手術，或者是用來治療骨軟骨疾病，即，將本發明方法所製備的去細胞軟骨移植物移植至軟骨病灶處。所述治療骨軟骨疾病包含修復或回復受損性、損傷性、創傷性或老化軟骨和/或修復軟骨缺損。
因此，本發明另一態樣是提供一種治療患有骨軟骨疾病個體的方法。所述方法包含以下步驟：施用本發明軟骨移植物至一個體的治療部位 (如、病灶處)。舉例而言、所述骨軟骨疾病包含，但不限於，先天性缺陷、骨折、半月板損傷或缺損、骨/脊柱變形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨發育不全和脊柱側彎、骨質疏鬆症、牙周病、牙骨質流失、骨軟化、佝僂病、囊狀纖維性骨炎、腎性骨失養症、脊柱融合、椎間盤重建或切除、柏哲德變形性骨炎、半月板損傷、類風濕性關節炎、骨關節炎、或者是創傷性或手術性軟骨損傷。可以預見的是當移植本發明經SCF處理的軟骨移植物至病灶處後，相鄰的軟骨細胞會被活化且遷徙至軟骨移植物上的孔洞結構處，細胞會開始生長直到病灶處受損的軟骨被取代，且本發明SCF處理的軟骨移植物最終會被降解，不會殘留毒性殘留物於個體體內。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
材料和方法
細胞培養
NIH-3T3纖維母細胞培養於高濃度葡萄糖DMEM(含10%胎牛血清 (FBS)、100 單位/毫升之盤林西林和100毫克/毫升之鏈黴素)中，置於37oC、5% CO2，潮濕環境下培養。
分離軟骨細胞
從豬關節軟骨上分離軟骨細胞。所述軟骨以培養基沖洗，再轉移至消化培養基(DMEM、10% FBS、1%P/S、0.1 毫克/毫升之鏈黴素)(含H型膠原蛋白)，在37°C下，培養24小時。離心(300×g，5分鐘)收集細胞。
H & E染色
切片的軟骨組織置於二甲苯(xylene)中浸漬10分鐘，以去除石蠟，重複此步驟一次。去除石蠟的組織通過梯度濃度的酒精溶液進行脫水，其中酒精的濃度分別為100%至95%、85%和75%。在進行脫水的步驟中，組織樣本於各濃度的酒精溶液內僅放置2分鐘後，再以大量去離子水潤洗。於脫水後，組織以蘇木素(hematoxylin)染色3-5分鐘，接著，以去離子水和75%酒精清洗。經蘇木素染色的軟骨再以1% 伊紅Y(Eosin Y)染色30秒，再依序以去離子水、95%和100% 醇類清洗。
愛爾新藍(Alcian blue)染色
依據「H & E染色」一節所揭示的步驟將軟骨組織切片去除石蠟和脫水。接著，樣本以愛爾新藍染色30分鐘，再以自來水沖洗2分鐘，並以去離子水潤洗。經愛爾新藍染色的軟骨樣本以核固紅溶液(nuclear fast red solution)複染5分鐘，再以自然水清洗1分鐘。所述軟骨樣本接著依序通過95% 酒精，和100%酒精(二次，每次2分鐘)，接著以樹脂封固劑固定。
3T3細胞在軟骨移植物上的生長
當3T3細胞生長至80%滿(confluent)時，接著利用酵素處理收集細胞(0.25%胰蛋白酶溶於1 mM EDTA)，離心500xg，5分鐘。將收集的細胞懸浮至培養基中，最終濃度為2x106
細胞/毫升。本發明經SCF處理的軟骨移植物以培養基預潤，進行隔夜培養，接著將其置於低附著24-孔盤 (Corning)。將一半的細胞懸浮液(200微升)移至每一經SCF處理的軟骨移植物之一側，置於培養箱中培養2小時，確保細胞已吸附至表面。依照前述的步驟，剩餘的細胞懸浮液置於經SCF處理軟骨移植物的另一側（即，尚未接觸細胞的那側）。每一接種細胞的軟骨移植物培養於2毫升之培養基中，培養7天，再以10%福馬林固定以進行以下分析。
初代軟骨細胞(primary chondrocytes)在軟骨移植物上的生長(Recellularization)
所述軟骨移植物置於24孔盤(200毫克/孔)中，接著將新鮮分離的軟骨細胞接種至軟骨移植物上。在每個培養孔中，培養基內的最終細胞數量為1.2 x 107
細胞。培養基一週替換三次。於培養2週後，收集軟骨移植物，接著以10％福馬林固定再進行分析。
抗壓強度測定
軟骨樣本置於PBS溶液中至少16小時進行復水，接著基於樣本形狀的不同，分別測量樣本的高度和/或直徑；若軟骨樣本為條狀，則測量其長度；另，若軟骨樣本為盤狀則測量其直徑。本試驗是利用Lloyd機器 (LRX Instrument，England)測量抗壓強度。每一試驗一開始的預載量為2N，以及負載速度為0.18公釐/分鐘，當負載過程中樣本的高度和/或直徑降低65%時中止試驗。
實施例
1
製備軟骨移植物及其特性分析
1.1
製備去細胞軟骨移植物
將豬關節滅菌後取下軟骨。以水清洗軟骨後，依序實際使用需求，將其切成符合需求的尺寸和形狀。
首先，於室溫下，將軟骨基質浸置於氫氧化鈉溶液中(1N) 3小時， 接著，置於過氧化氫溶液 (5%)中，4℃，48小時。於各溶液處理後，以大量清水清洗軟骨基質，以確實移除殘留溶液。
接著，所述軟骨基質以scCO2處理，處理條件為350巴，37℃，處理100分鐘，以完全去除殘留的細胞物質，並產生去細胞軟骨移植物；再以伽馬射線 (30 kGy)照射所述軟骨移植物後，將其儲存於乾燥且無菌的環境下備用。
1.2
實施例
1.1
之軟骨移植物的特性分析
於SCF處理前，可在軟骨腔隙中觀察到殘留的細胞物質，即，在軟骨中的小空間內含有軟骨細胞 (圖1，(A))；然而，在不同壓力下以SCF處理後，可觀察到腔隙中殘留的細胞物質已完全消失(圖1，(B)、(C)和D)，此一結果確認，SCF處理能夠有效去除軟骨上細胞物質的方法。經SCF處理後的軟骨最終再以H&E染色、DAPI和愛爾新藍染色確認，其中無細胞核(圖2)或酸性多醣類(如，軟骨中的糖胺聚醣)(圖3)可被染出。綜合圖1至圖3的結果可以確認，本發明經SCF處理的軟骨移植物上並未殘留任何細胞物質(如，細胞核或碳水化合物)。
再者，經SCF處理的軟骨移植物上的孔洞可相對完整地被保留下來(圖 4
)，其可用以支持3T3細胞及初代軟骨細胞於軟骨移植物上生長，細胞生長實驗結果可觀察到初代軟骨細胞不僅會遷徙至實施例1.1之軟骨移植物的孔洞上，還會嵌入至其中的腔隙(未揭示)。
實施例1.1中經SCF處理的軟骨移植物的機械特性優於天然軟骨，在抗壓強度測定中，與天然軟骨相比，實施例1.1中經SCF處理的軟骨移植物能夠抵抗至少二倍的壓力(圖5)。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
圖1是依據本揭示內容一實施方式所闡示之本發明軟骨移植物經H&E染色，且於放大倍率20,000x下所拍攝的照片，其中(A)是SCF處理前所拍攝的照片，以及經SCF在不同壓力下分別為(B)150巴、(C) 200巴，和(D) 350巴處理後所拍攝的照片； 圖2是依據本揭示內容一實施方式所闡示之本發明軟骨移植物經SCF處理前(A)和SCF處理後(B)，以H&E和DPAI染色的照片；
圖3是依據本揭示內容一實施方式所闡示之本發明軟骨移植物經SCF處理前(A) SCF處理後(B)，以愛爾新藍染色的照片； 圖4是依據本揭示內容一實施方式所闡示之本發明經SCF處理之軟骨移植物在掃瞄式電子顯微鏡(scanning electronic microscopy, SEM)於(A) 500k、(B) 1000k和(C) 2,000k下所拍攝的照片；以及 圖5是依據本揭示內容一實施方式所闡示之直條圖，其繪示實施例1.1本發明經SCF處理的軟骨移植物和天然軟骨移植物之抗壓強度，其中(A)是應力負荷(stress load)，以及(B)是楊氏模數(Young’s modulus)。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。
Claims (15)
- 一種製備去細胞軟骨移植物的方法，包含： (1) 切割一動物的軟骨以產生多個軟骨基質； (2) 以一種鹼來處理步驟(1)之該些軟骨基質； (3) 將步驟(2)中經鹼處理的該些軟骨基質進行滅菌處理；以及 (4) 去除步驟(3)中經滅菌的該些軟骨基質之細胞，以製得該去細胞軟骨移植物。
- 如請求項1所述之方法，其中該軟骨是取自豬的一鼻軟骨、一肋軟骨、一耳軟骨或一膝軟骨。
- 如請求項2所述之方法，其中各該去細胞軟骨移植物的外形是盤狀、條狀、椎狀或顆粒。
- 如請求項1所述之方法，其中該步驟(2)之鹼處理步驟包含在室溫下以氫氧化鈉處理該軟骨基質3至24小時。
- 如請求項1所述之方法，其中該步驟(3)之滅菌處理的步驟包含以一滅菌劑處理該軟骨基質，其中該滅菌劑選自於以下所組成的群組中：一醇類(alcohol)、一氧化劑(oxidizing agent)、一放射線(radiation)、一酚化合物(phenolic compound)和一四級銨化合物(quaternary ammonium compound)。
- 如請求項5所述之方法，其中該醇類是乙醇(ethanol)或異丙醇(isopropanol)。
- 如請求項5所述之方法，其中該氧化劑是過氧化氫(hydrogen peroxide)。
- 如請求項5所述之方法，其中該酚化合物是對羥苯甲酸酯(paraben)、苯甲酸(benzoic acid)或水楊酸(salicylic acid)。
- 如請求項5所述之方法，其中該四級銨化合物是氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)、氯化烷基二甲苄銨(alkyldimethylbenzylammonium chloride)、二癸基二甲基氯化銨(didecyldimethylammonium chloride,)和氯化銨(ammonium chloride.)。
- 如請求項1所述之方法，其中在該步驟(4)中，將該步驟(3)中經滅菌的軟骨基質，以一超臨界流體(SCF)於壓力150-350巴和溫度30-50°C下，處理100分鐘。
- 如請求項10所述之方法，其中該SCF是一超臨界二氧化碳 (supercritical carbon dioxide, scCO2 )、一超臨界一氧化氮(supercritical nitrous oxide, scN2 O)、一超臨界水(supercritical water, scH2 O)、一超臨界烷類(supercritical alkane)，一超臨界烯類(supercritical alkene)，一超臨界醇類(supercritical alcohol)或一超臨界丙酮(supercritical acetone)。
- 如請求項11所述之方法，其中該SCF是scCO2 ，該溫度是37°C且該壓力是350巴。
- 如請求項12所述之方法，其中該去細胞軟骨移植物可承受的壓力為一天然軟骨的兩倍。
- 一種治療患有骨軟骨疾病個體的方法，包含施用如請求項1-13任一項所述方法製得的該去細胞軟骨移植物至該個體的一病灶處。
- 如請求項14所述之方法，其中該骨軟骨疾病是先天性缺陷(congenital defect)、骨折(bone fracture)、半月板損傷或缺損(meniscal injury or defect)、骨/脊柱變形(bone/spinal deformation)、骨肉瘤(osteosarcoma)、骨髓瘤(myeloma)、骨發育不全和脊柱側彎(bone dysplasia and scoliosis)、骨質疏鬆症(osteoporosis)、牙周病(periodontal disease)、牙骨質流失(dental bone loss)、骨軟化(osteomalacia)、佝僂病(rickets)、囊狀纖維性骨炎(fibrous osteitis)、腎性骨失養症(renal bone dystrophy)、脊柱融合(spinal fusion)、椎間盤重建或切除(spinal disc重建 or removal)、柏哲德變形性骨炎(Paget's disease of bone)、半月板損傷(meniscal injuries)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、骨關節炎(osteoarthritis)、或創傷性或手術性軟骨損傷(traumatic or surgical injury to cartilage)。
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