TW201718652A - 能夠結合ｂ７－ｈ３和ｃｄ３的雙特異性單價雙抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及B7-H3 x CD3雙特異性單價雙抗體，尤其涉及B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其能夠同時結合至B7-H3和CD3。本發明也涉及包含這類雙特異性單價Fc雙抗體的藥物組合物。本發明另外涉及這類雙抗體在治療癌症和其他疾病和病況中的應用的方法。

Description

能夠結合B7-H3和CD3的雙特異性單價雙抗體及其用途
本發明涉及雙特異性單價雙抗體，其具有對B7-H3的表位特異性的一個結合位點和對CD3的表位特異性的一個結合位點(即，“B7-H3 x CD3雙特異性單價雙抗體”)。最優選地，這類B7-H3 x CD3雙特異性單價雙抗體包括三條多肽鏈，並且具有對B7-H3的表位特異性的一個結合位點和對CD3的表位特異性的一個結合位點，並且另外包括免疫球蛋白Fc結構域(即，“B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”)。本發明的雙特異性單價Fc雙抗體能夠同時結合B7-H3和CD3。本發明涉及包含這類雙特異性單價Fc雙抗體的藥物組合物。本發明另外涉及這類雙抗體在治療癌症和其他疾病和病況中的應用的方法。
B7 超家族和 B7-H3
腫瘤的生長和轉移很大程度上取決於它們逃避宿主免疫監視和戰勝宿主防禦的能力。大部分腫瘤表達可被宿主免疫系統不同程度識別的抗原，但是在許多情況下，由於效應T細胞的無效啟動而引起不充分的免疫應答(Khawli, L.A.等 (2008) “Cytokine, Chemokine, and Co -Stimulatory Fusion Proteins for Immunotherapy of Solid Tumors ,” Exper. Pharmacol. 181:291-328)。
B7-H3是免疫球蛋白分子的B7超家族的成員。B7超家族的成員具有免疫球蛋白-V樣結構域和免疫球蛋白-C樣結構域(例如，分別IgV和IgC) (Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7 -CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。B7-超家族成員的IgV和IgC結構域各自由單外顯子編碼，另外的外顯子編碼前導序列、跨膜和細胞質結構域。細胞質結構域是短的，長度範圍是19至62個氨基酸殘基並且可由多個外顯子編碼(Collins, M.等 (2005) “The B7 Family Of Immune -Regulatory Ligands ,” Genome Biol. 6:223.1-223.7)。預測B7超家族的成員在細胞表面形成連續的(back-to-back)、非共價的同源二聚體，並且就B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)而言，已經發現了這類二聚體。B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)展示具有對於刺激性CD28受體和抑制性CTLA-4 (CD152)受體的雙特異性(Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7 -CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。
B7-H3 (CD276)是獨特的，因為主要的人形式包含兩個細胞外串聯IgV-IgC結構域(即，IgV-IgC-IgV-IgC) (Collins, M.等 (2005) “The B7 Family Of Immune -Regulatory Ligands ,” Genome Biol. 6:223.1-223.7)。儘管起初認為僅僅包括2個Ig結構域(IgV-IgC) (Chapoval, A.等 (2001) “B7 -H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN -γ Production ,” Nature Immunol. 2:269-274；Sun, M.等 (2002) “Characterization of Mouse and Human B7 -H3 Genes ,” J. Immunol. 168:6294-6297)，但是已經發現四免疫球蛋白細胞外結構域變體(“4Ig-B7-H3”)是更常見的人形式的蛋白質(Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7 -CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。但是，天然鼠科形式是2Ig，並且其和人4Ig形式展示類似的功能(Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7 -H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。4Ig-B7-H3分子抑制天然殺傷細胞介導的癌症細胞的裂解(Castriconi, R.等(2004) “Identification Of 4Ig -B7 -H3 As A Neuroblastoma -Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell -Mediated Lysis ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645)。已經發現2Ig形式的人B7-H3，通過結合啟動的T細胞上推定的受體而促進T細胞啟動和IFN-γ產生(Chapoval, A.等 (2001) “B7 -H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN -γ Production ,” Nature Immunol. 2:269-274；Xu, H.等 (2009) “MicroRNA miR -29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7 -H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors ,” Cancer Res. 69(15):5275-6281)。當在腫瘤細胞上表達時，B7-H4和B7-H3都是免疫功能的有效抑制劑(Flies, D.B.等 (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity ,” J. Immunother. 30(3):251-260)。
B7-H3的作用模式是複雜的，因為蛋白質介導T細胞共刺激和共抑制二者(Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7 -H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278；Martin-Orozco, N.等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti -Tumor Immunity ,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298；Subudhi, S.K.等 (2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition ,” J. Mol. Med. 83:193-202)。B7-H3結合TREM樣轉錄體2 (TLT-2)並且共刺激T細胞啟動，而且也結合仍未確定的受體(一種或多種)，以介導T細胞的共抑制。另外，通過與未知受體(一種或多種)的相互作用，B7-H3是天然殺傷細胞和成骨細胞的抑制劑(Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7 -H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。可通過與主要信號傳導途徑的成員的相互作用進行抑制，通過所述傳導途徑，T細胞受體(TCR)調節基因轉錄(例如，NFTA、NF-κB或AP-1因數)。
B7-H3共刺激CD4+和CD8+ T細胞增殖。B7-H3也刺激IFN-γ產生和CD8+裂解活性(Chapoval, A.等 (2001) “B7 -H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN -γ Production ,” Nature Immunol. 2:269-274；Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7 -CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。但是，蛋白質也可能通過NFAT (啟動的T細胞的核因數)、NF-κB (核因數κ B)和AP-1 (活化因數蛋白質-1)因數起作用，以抑制T細胞啟動(Yi. K.H.等 (2009) “FineTuning Immune Response Through B7 -H3 And B7 -H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151)。還認為，B7-H3在體內抑制Th1、Th2或Th17 (Prasad, D.V.等 (2004) “Murine B7 -H3 Is A Negative Regulator Of T Cells ,” J. Immunol. 173:2500-2506；Fukushima, A.等 (2007) “B7 -H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice ,” Immunol. Lett. 113:52-57；Yi. K.H.等 (2009) “FineTuning The Immune Response Through B7 -H3 And B7 -H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151)。若干獨立研究已經證明，人惡性腫瘤細胞展示顯著增加的B7-H3蛋白質的表達，並且該增加的表達與增加的疾病嚴重程度相關(Zang, X.等 (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition ,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279)，提示B7-H3被腫瘤用作免疫逃避途徑(Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7 -H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。
阻斷B7分子結合T細胞受體(例如，CD28)的能力的分子抑制免疫系統，並且已經被建議作為自身免疫性疾病的療法(Linsley, P.S.等 (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28 -Mediated Co -Stimulation ,” Immunolog. Rev. 229:307-321)。用抗4Ig-B7-H3抗體治療的表達4Ig-B7-H3的成神經細胞瘤細胞對NK細胞更敏感。但是，不清楚該活性是否可僅僅歸因於針對4Ig-B7-H3形式的抗體，因為所有報導的針對4Ig-B7-H3而產生的抗體也結合兩個Ig樣形式的B7-H3 (Steinberger, P.等 (2004) “Molecular Characterization of Human 4Ig -B7 -H3, a Member of the B7 Family with Four Ig -Like Domains ,” J. Immunol. 172(4): 2352-2359；和Castriconi等 (2004) “Identification Of 4Ig -B7 -H3 As A Neuroblastoma -Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell -Mediated Lysis ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645)。
B7-H3不在靜息B或T細胞、單核細胞或樹突細胞上表達，但是其在樹突細胞上通過IFN-γ被誘導和在單核細胞上通過GM-CSF被誘導(Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7 -CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。還未充分表徵結合B7-H3的受體(一種或多種)。早期的工作提示，一種這樣的受體需要在啟動之後在T細胞上被快速和暫態上調(Loke, P.等 (2004) “Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells .” Arthritis Res. Ther. 6:208-214)。最近，在髓樣細胞上表達的TREM樣轉錄體2 (TLT-2或TREML2)受體(King, R.G.等 (2006) “Trem -Like Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/Granuloid And B Lymphoid Lineage And Is Up -Regulated In Response To Inflammation ,” J. Immunol. 176:6012-6021；Klesney-Tait, J.等 (2006) “The TREM Receptor Family And Signal Integration ,” Nat. Immunol. 7:1266-1273；Yi. K.H.等 (2009) “FineTuning The Immune Response Through B7 -H3 And B7 -H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151)已經被證明能夠結合B7-H3，從而尤其能夠共刺激CD8+ T細胞的啟動已經顯示能夠結合B7-H3，並且從而共刺激尤其CD8+ T細胞的啟動(Zang, X.等 (2003) “B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 100:10388-10392；Hashiguchi, M.等 (2008) “Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cell -Like Transcript 2 (TLT -2) Is A Counter -Receptor For B7 -H3 And Enhances T Cell Responses ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10495-10500；Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7 -H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。
除了其在成神經細胞瘤細胞上的表達，也已知人B7-H3在各種其他癌症細胞(例如，胃癌、卵巢癌和非小細胞肺癌)上表達。在腫瘤細胞系中已經免疫組織學檢測到B7-H3蛋白質表達(Chapoval, A.等 (2001) “B7 -H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN -γ Production ,” Nature Immunol. 2:269-274；Saatian, B.等 (2004) “Expression Of Genes For B7 -H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation ,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225；Castriconi等 (2004) “Identification Of 4Ig -B7 -H3 As A Neuroblastoma -Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell -Mediated Lysis ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645)；Sun, M.等 (2002) “Characterization of Mouse and Human B7 -H3 Genes ,” J. Immunol. 168:6294-6297)。已經在心臟、腎、睾丸、肺、肝、胰腺、前列腺、結腸和成骨細胞細胞中發現B7-H3的mRNA表達 (Collins, M.等 (2005) “The B7 Family Of Immune -Regulatory Ligands ,” Genome Biol. 6:223.1-223.7)。在蛋白質水準，在人的肝、肺、膀胱、睾丸、前列腺、乳腺、胎盤和淋巴器官中發現B7-H3 (Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7 -H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。
II. CD3
CD3是由四條不同的鏈組成的T細胞共受體(Wucherpfennig, K.W.等 (2010) “Structural Biology Of The T cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; 1-14頁；Chetty, R.等 (1994) “CD3: Structure, Function, And Role Of Immunostaining InClinical Practice ,” J. Pathol. 173(4):303-307；Guy, C.S.等 (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex ,” Immunol. Rev. 232(1):7-21)。
在哺乳動物中，複合物包含CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈。這些鏈與稱為T細胞受體(TCR)的分子締合，以便在T淋巴細胞中產生啟動信號(Smith-Garvin, J.E.等 (2009) “T Cell Activation ,” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619)。在沒有CD3的情況下，TCR不能適當組裝並且降解(Thomas, S.等 (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2):170-177)。發現CD3結合所有成熟的T細胞的膜，並且幾乎不與其他細胞類型結合(見，Janeway, C.A.等 (2005)在以下中: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease,” 第六版, Garland Science Publishing, NY, pp. 214-216；Sun, Z. J.等 (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer ,” Cell 105(7):913-923；Kuhns, M.S.等 (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex ,” Immunity. 2006 Feb、24(2):133-139)。
T細胞上T細胞受體(TCR)複合物的恒定的CD3ε信號傳導組分已經被用作靶，以促使在T細胞和腫瘤細胞之間形成免疫學突觸。CD3和腫瘤抗原的共接合(co-engagement)啟動了T細胞，引起表達腫瘤抗原的腫瘤細胞的裂解(Baeuerle等 (2011) “Bispecific T Cell Engager For Cancer Therapy ,” In: Bispecific Antibodies, Kontermann, R.E. (Ed.) Springer-Verlag；2011:273-287)。該方法允許雙特異性抗體以對腫瘤細胞的高特異性與T細胞小室(compartment)全面相互作用並且廣泛適用于大量的細胞表面腫瘤抗原。
III.抗體和其他結合分子
抗體 是免疫球蛋白分子，通過位於免疫球蛋白分子的可變區中的至少一個表位結合位點，其能夠特異性結合分子，比如碳水化合物、多核苷酸、脂質，多肽等(“抗原”)的靶區域(“表位”)。如本文所使用，該術語不僅僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且也包括其突變體、天然存在的變體、包括具有必要的特異性的表位結合位元點的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體和嵌合抗體，以及包括具有必要特異性的表位結合位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾的結構。
完整的未修飾抗體(例如，IgG抗體)結合抗原的表位的能力取決於免疫球蛋白“輕”和“重”多肽鏈上可變結構域的存在(即，分別為VL和VH結構域，統稱為“可變區”)。每個VH和VL均包括三個互補決定區(CDR)結構域和四個FR結構域，其以下述順序從氨基-末端至羧基-末端被佈置：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDR的氨基酸序列決定了抗體是否能夠結合特定的表位。抗體輕鏈與抗體重鏈的相互作用，尤其地，各存在於不同的多肽上的它們的VL和VH結構域的相互作用形成抗體的表位結合位點之一。相比之下，scFv構建體包括包含在單多肽鏈中抗體的VL和VH結構域，其中結構域被足夠長度的柔性連接體分開，以允許兩個結構域自組裝成功能性表位結合位點。在由於連接體不夠長(例如，小於約12個氨基酸殘基的連接體)而致使VL和VH結構域的自組裝不可能的情況下，兩個scFv分子可彼此相互作用而形成二價“雙抗體”分子，其中一個分子的VL與另一分子的VH締合(見Marvin等的評論 (2005) “Recombinant Approaches To IgG -Like Bispecific Antibodies ,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658)。
天然抗體能夠僅僅結合一個表位種類(即，單特異性的)，儘管它們可結合該種類的多個拷貝(即，展示二價或多價)。已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(見，例如，PCT公佈號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分使用連接體肽，以將另外的結合結構域(例如scFv、VL、VH等)與抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合或在抗體核心內融合，或將多個抗體結合部分彼此融合(例如兩個Fab片段或scFv)。可選的形式使用連接體肽，以將結合蛋白質(例如，scFv、VL、VH等)與二聚化結構域比如CH2-CH3結構域或可選的多肽融合(WO 2005/070966、WO 2006/107786AWO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，這類方法涉及折中和權衡。例如，PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了使用連接體可造成治療情形中的問題，並且教導了三特異性抗體，其中CL和CH1結構域從他們各自的天然位置被轉換並且VL和VH結構域已經被多樣化(WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允許它們結合大於一種抗原。因此，這些文獻中公開的分子用結合特異性換取了結合另外的抗原種類的能力。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域，以包含融合蛋白加合物，其包括結合結構域。文獻記載了CH2結構域在介導效應功能中可能僅僅起到最小的作用。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc區域已經用另外的VL和VH結構域取代，以便形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體，其單獨的鏈包含scFv結構域。PCT公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子，其作為單多肽鏈被合成，然後經歷蛋白酶解，以產生異源二聚化結構。因此，在這些文獻中公開的分子用所有或部分介導效應功能的能力換取結合另外的抗原種類的能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或官能團至抗體或抗體部分(例如，添加雙抗體至抗體的輕鏈，或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈，或添加異源融合蛋白或使多個Fab結構域彼此連接)。因此，這些文獻中公開的分子用天然抗體結構換取結合另外的抗原種類的能力。
現有技術已經另外注意到產生在能夠結合兩個或多個不同表位種類(即，除了雙價或多價之外顯示雙特異性或多特異性)方面不同于天然抗體的雙抗體的能力(見，例如，Holliger等 (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, ” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Hollinger等)；US 2004/0220388 (Mertens等)；Alt等 (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D.等 (2005) “A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin -Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等)；Olafsen, T.等 (2004) “Covalent Disulfide -Linked Anti -CEA Diabody Allows Site -Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications ,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27；Wu, A.等 (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti -CD20 Single Chain Fv -Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange ,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等 (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A.等 (2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。
尤其地，已經描述了穩定、共價結合的異源二聚化非單特異性雙抗體(見，例如，Chichili, G.R.等 (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates ,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Johnson, S.等 (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv -Based Dual -Affinity Re -Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B -Cell Depletion ,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449；Veri, M.C.等 (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Moore, P.A.等 (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B -Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；美國專利號8,044,180、8,133,982、8,187,593、8,193,318、8,530,627、8,669,349、8,778,339、8,784,808、8,795,667、8,802,091、8,802,093、8,946,387、8,968,730和8,993,730；美國專利公開號2009/0060910、2010/0174053、2011/0081347、2011/0097323、2011/0117089、2012/0009186、2012/0034221、2012/0141476、2012/0294796、2013/0149236、2013/0295121、2014/0017237和2014/0099318；歐洲專利文獻號EP 1868650、EP 2158221、EP 2247304、EP 2252631、EP 2282770、EP 2328934、EP 2376109、EP 2542256、EP 2601216、EP 2714079、EP 2714733、EP 2786762、EP 2839842、EP 2840091；和PCT公開號WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/027797、WO 2010/033279、WO 2010/080538、WO 2011/109400、WO 2012/018687、WO 2012/162067、WO 2012/162068、WO 2014/159940、WO 2015/021089、WO 2015/026892和WO 2015/026894)。
儘管這樣的成功，但是通過仔細考慮和放置在多肽鏈中使用的結構域，可進一步改進針對治療性用途而優化的穩定的、功能性異源二聚化的、非單特異性雙抗體的產生。因此，本發明涉及提供特異性多肽，所述特異性多肽尤其被設計來經共價結合形成穩定和治療有用的、能夠同時結合B7-H3和CD3異源二聚化雙抗體和異源二聚化Fc雙抗體。
本發明涉及雙特異性單價雙抗體，其具有對B7-H3的表位特異性的一個結合位點和對CD3的表位特異性針一個結合位點(即，“B7-H3 x CD3雙特異性單價雙抗體”)。最優選地，這類B7-H3 x CD3雙特異性單價雙抗體包括三條多肽鏈，並且具有對B7-H3的表位特異性的一個結合位點和對CD3的表位特異性的一個結合位點，並且另外包括免疫球蛋白Fc結構域(即，“B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”)。本發明的雙特異性單價Fc雙抗體能夠同時結合B7-H3和CD3。本發明涉及包含這類雙特異性單價Fc雙抗體的藥物組合物。本發明另外涉及這類雙抗體在治療癌症和其他疾病和病況中的應用的方法。
本發明尤其涉及B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體。本發明的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體包括以異源二聚化方式彼此締合的多肽鏈，以形成對B7-H3的表位特異性的一個結合位點和對CD3的表位特異性的一個結合位點。本發明的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體因此是單價的，在於它們能夠結合僅僅B7-H3的表位元的一個拷貝和僅僅結合CD3的表位元的一個拷貝，但是是雙特異性的，在於單個雙抗體能夠同時結合B7-H3的表位和結合CD3的表位。
本發明優選的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體包括三條多肽鏈(“第一”、“第二”和“第三”多肽鏈)，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合並且第一和第三多肽鏈彼此共價結合。
詳細地，本發明提供了B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中雙特異性單價Fc雙抗體能夠特異性結合B7-H3的表位和結合CD3的表位，並且具有IgG Fc結構域，其中雙特異性單價Fc雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合並且第一和第三多肽鏈彼此共價結合，以及其中： I.第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： A.結構域IA，其包括： (1)亞結構域(IA1)，其包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )或能夠結合CD3的VL結構域(VLCD3 )和 (2)亞結構域(IA2)，其包括能夠結合B7-H3的VH結構域(VHB7-H3 )或能夠結合CD3的VH結構域(VHCD3 ) 其中亞結構域IA1和IA2通過具有12個或更少的氨基酸殘基的多肽連接體彼此分開，並且被協同選擇，以便： (a)亞結構域IA1包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )並且選擇亞結構域IA2，以包括能夠結合CD3的VH結構域(VHCD3 )；或 (b)亞結構域IA1包括能夠結合CD3的VL結構域(VLCD3 )並且選擇亞結構域IA2，以包括能夠結合B7-H3的VH結構域(VHB7-H3 )；和 B.任選存在的結構域IB，其包括與異源二聚體促進結構域連接的多肽連接體； C.結構域IC，其包括與抗體的CH2-CH3結構域連接的多肽連接體； II.第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： A.結構域IIA，其包括： (1)亞結構域(IIA1)，其包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )或能夠結合CD3的VL結構域(VLCD3 )和 (2)亞結構域(IIA2)，其包括能夠結合B7-H3的VH結構域(VHB7-H3 )或能夠結合CD3的VH結構域(VHCD3 ) 其中亞結構域IIA1和IIA2通過具有12個或更少的氨基酸殘基的多肽連接體彼此分開，並且被協同選擇，以便： (a)當亞結構域IA1包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )時，選擇亞結構域IIA1，以包括能夠結合CD3的VL結構域(VLCD3 )並且選擇亞結構域IIA2，以包括夠結合B7-H3的VH結構域能(VHB7-H3 )；和 (b)當亞結構域IA1包括能夠結合CD3的VL結構域(VLCD3 )時，選擇亞結構域IIA1，以包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )和選擇亞結構域IIA2，以包括能夠結合CD3的VH結構域(VHCD3 )； B.任選存在的結構域IIB，其包括與異源二聚體促進結構域連接的多肽連接體； III.第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括結構域IIIC，其包括與抗體的CH2-CH3結構域連接的多肽連接體； 其中： (A) (1)存在任選存在的結構域IB和任選存在的結構域IIB中的至少一個，並且其中存在的結構域IB或IIB具有正或負電荷；或 (2)存在任選存在的結構域IB和任選存在的結構域IIB兩者，其中： (i)結構域1B和結構域IIB之一具有帶正電荷的異源二聚體促進結構域，並且結構域1B和結構域IIB的另一個具有帶負電荷的異源二聚體促進結構域；或 (ii)結構域1B和結構域IIB之一具有包括氨基酸序列GVEPKSC (SEQ ID NO:6 )或VEPKSC (SEQ IDNO:7 )的異源二聚體促進結構域，並且結構域1B和結構域IIB的另一個具有包括氨基酸序列GFNRGEC (SEQ ID NO:8 )或FNRGEC (SEQ ID NO:9 )的異源二聚體促進結構域； (B) VLB7-H3 和VHB7-H3 相互作用形成能夠結合B7-H3的表位元的表位元結合結構域，和VLCD3 和VHCD3 形成能夠結合CD3的表位元的表位元結合結構域；和 (C)第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域形成能夠結合Fc受體的Fc結構域。
本發明進一步涉及這類B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的實施方式，所述雙抗體能夠與人和靈長類B7-H3和CD3交叉反應。
本發明尤其涉及這類B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的實施方式，其中： (A)第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:53 ，第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:55 ，和第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 ；或 (B)第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:59 ，第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:60 和第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 ；或 (C)第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:61 ，第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:62 ，和第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 (D)第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:63 ，第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:64 ，和第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 。
本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體優選地在採用選自以下的靶人類腫瘤細胞系的試驗中能夠使用人T細胞介導對靶腫瘤細胞的重定向殺傷：A498 (腎癌)，JIMT-1/Luc (乳腺癌)，A375 (黑素瘤)、22Rv1 (前列腺癌)，Detroit562 (鼻咽癌)，DU145 (前列腺癌)；BxPC3 (胰腺癌)，SKMES-1 (肺癌)，和U87 (惡性膠質瘤)，並且使用純化的人原代T細胞作為效應細胞，效應細胞與T細胞之比是1:1、5:1或10:1。在這樣的試驗中，使用乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗或通過螢光素酶試驗測量靶腫瘤細胞殺傷，在乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗中定量測量細胞死亡後從細胞釋放的LDH的酶活性，在螢光素酶試驗中，螢光素酶相對光單位(RLU)是指示靶細胞的相對生活力的讀數，所述靶細胞已經被工程化成表達綠色螢光蛋白(GFP)和螢光素酶報告基因。觀察到的這種重定向殺傷的EC50 是約1.5 μg/mL或更少、約1.0μg/mL或更少、約500ng/mL或更少、約300ng/mL或更少、約200ng/mL或更少、約100ng/mL或更少、約50ng/mL或更少。
本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體優選地能夠在共混異種移植物(co-mix xenograft)仲介導對人腫瘤生長的抑制，其中在所述共混異種移植物中，這類分子連同比例為5:1的22Rv1 (人前列腺癌)或A498 (人腎癌)腫瘤細胞和啟動的人T細胞一起被引入到NOD/SCID小鼠中。另外，或可選地，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體在雌性NSG B2m-/-小鼠的異種移植模型中能夠介導對人腫瘤生長的抑制和/或展示抗腫瘤活性，所述雌性NSG B2m-/-小鼠： (A)在第-1天通過腹腔內(IP)注射植入人PBMC (1 x 107 )並且在第0天經皮內(ID)植入Detroit (人鼻咽癌腫瘤細胞(5 x 106 ))，並且在第20、22、23、26、28、30、33、35和37天施用雙抗體；或 (B)在第0天經皮內(ID)植入A498 (人腎癌腫瘤細胞(5 x 106 ))，並且通過腹腔內(IP)注射在第13天植入人PBMC (1 x 107 )以及在第33、35、36、39、41、43、46、48和50天施用雙抗體。
優選地，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體在以如下濃度被提供時能夠在這類異種移植模型中抑制腫瘤生長：濃度大於約1.0 mg/kg、濃度為約1 mg/kg、濃度為約0.5 mg/kg、濃度為約0.25 mg/kg、濃度為約0.1 mg/kg、濃度為約0.05 mg/kg、濃度為約0.02 mg/kg、濃度為約0.01 mg/kg，或濃度為約0.005 mg/kg，或濃度小於0.005 mg/kg。
本發明另外提供任何上述B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體作為藥物的用途。
本發明另外提供任何上述B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體在治療與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況中的用途，或在治療特徵在於表達B7-H3的疾病或病況的方法中的用途，尤其地，其中與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況是癌症，更具體地，其中所述癌症選自：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、惡性膠質瘤、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎細胞癌、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌症、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。
本發明涉及雙特異性單價雙抗體，其具有對B7-H3的表位特異性的一個結合位點和對CD3的表位特異性的一個結合位點(即，“B7-H3 x CD3雙特異性單價雙抗體”)。最優選地，這類B7-H3 x CD3雙特異性單價雙抗體包括三條多肽鏈並且具有對B7-H3的表位特異性的一個結合位點和對CD3的表位特異性的一個結合位點並且另外包括免疫球蛋白Fc結構域(即，“B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體”)。本發明的雙特異性單價Fc雙抗體能夠同時結合B7-H3和CD3。本發明涉及包含這類雙特異性單價Fc雙抗體的藥物組合物。本發明另外涉及這類雙抗體在治療癌症和其他疾病和病況中的應用的方法。 I.抗體和其他結合分子 A.抗體
如本文所使用，術語“抗體 ”包括具有能夠免疫特異性結合表位(“表位結合位點”)的免疫球蛋白可變結構域的任何分子。因此，該術語不僅僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且也包括其突變體、天然存在的變體、包括這類表位結合位點的融合蛋白、人源化抗體和嵌合抗體，和能夠免疫特異性結合表位的免疫球蛋白分子的任何其他修飾的結構。遍及本申請，抗體的輕鏈和重鏈的恒定區的氨基酸殘基的編號是根據如Kabat等 (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242中的EU索引。如本文所使用，“抗體的表位結合片段”旨在表示抗體的能夠免疫特異性結合表位元的部分。如本文所使用，這樣的術語包括片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2 Fv)和單鏈(scFv)，以及雙抗體的表位元結合結構域。
術語“單克隆抗體 ”指能夠免疫特異性結合表位的均質(homogenous )抗體群。就抗體的來源或製備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、在轉基因動物中產生等)而言，術語“單克隆抗體”不旨在是限制性的。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等的方法或其改良：Kohler, G.等 (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,” Nature 256:495-497。典型地，在小鼠、大鼠或兔子中產生單克隆抗體。通過用免疫原性量的細胞、細胞提取物或包含期望的表位的蛋白質製品免疫動物來產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養的細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)，然後將它們用作免疫原。細胞它們本身或聯合非變性佐劑，比如Ribi可用作免疫原。一般而言，在用作免疫原時，細胞應保持完整並且優選地有活性。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑，例如，弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂，因此，其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序，並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中，並且，可然後擴展和冷凍宿主細胞，用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用于基因操作，以產生本發明的雙特異性分子以及嵌合抗體、人源化抗體或犬源化(caninized)抗體，以改善抗體的親和力或其他特徵。人源化抗體的一般原理涉及保留抗體的表位元結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。人源化單克隆抗體有四個一般步驟。這些是：(1)確定起始抗體的輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和/或預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即，決定在人源化或犬源化期間使用哪個抗體框架區域(一種或多種)；(3)應用實際的人源化或犬源化方法/技術；和(4)人源化或犬源化抗體的轉染和表達(見，例如，美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415)。
如本文所使用，如果相對於可選的表位，抗體或其表位結合片段更經常、更快速，以更長的持久性和/或更大的親和力或親合力與另一分子的區域(即，表位)反應或締合，則認為抗體或其表位結合片段“免疫特異性 ”結合該表位。通過該定義也理解，例如，免疫特異性結合第一靶的抗體或其表位結合片段可能特異性或優先結合第二靶或可能不特異性或優先結合第二靶。 B.雙特異性抗體、多特異性雙抗體和DART®雙抗體
非單特異性“雙抗體 ”的供應提供了相對於抗體的顯著優勢：共連接(co-ligate)和共定位表達不同的表位的細胞的能力。因此，雙特異性雙抗體具有廣泛的應用範圍，包括治療和免疫診斷。在各種應用中，雙特異性在設計和工程化雙抗體方面允許大的靈活性，提供對多聚抗原的增強的親合力、不同抗原的交聯和對特定細胞類型的導向靶向，這取決於兩個靶抗原的存在。由於它們的二價、低離解速率和從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體，為~50 kDa或以下)，本領域中已知的雙抗體分子在腫瘤成像領域還顯示特別的用途(Fitzgerald等 (1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221)。尤其重要的是不同細胞的共連接，例如，細胞毒素T細胞與腫瘤細胞的交聯(Staerz等 (1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631；和Holliger等 (1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305)，從而將T細胞共定位至腫瘤細胞的位點。
替代將這類雙抗體靶向以結合至T細胞，可以將雙抗體表位元結合結構域引導至B細胞，比如CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD40和CD74的表面決定子(Moore, P.A.等 (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B -Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Cheson, B.D.等 (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B -Cell Non -Hodgkin’s Lymphoma ,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626；Castillo, J.等 (2008) “Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies ,” Exp. Hematol. 36(7):755-768)。在許多研究中，也發現結合效應細胞決定子，例如Fcγ受體(FcγR)，的雙抗體啟動效應細胞(Holliger等 (1996)“Specific KillingOf Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Holliger等 (1999)“Carcinoembryonic Antigen (CEA) -Specific T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti -CD3 x Anti -CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti -CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068)。通常，通過使結合抗原的抗體經Fc結構域-FcγR相互作用而與效應細胞結合，引發效應細胞啟動；因此，在這方面，雙抗體分子可展示Ig樣功能，不依賴於它們是否包括Fc結構域(例如，如本領域已知的或本文示例的任何效應功能試驗(例如，ADCC試驗)所驗證的)。通過交聯腫瘤和效應細胞，雙抗體不僅僅使效應細胞接近腫瘤細胞，而且導致有效的腫瘤殺傷(見例如，Cao等 (2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197)。
但是，上述優勢是以高成本為代價的。形成此類非單特異性雙抗體需要成功裝配兩個或更多個獨特且不同的多肽(即，這種形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化形成雙抗體)。該事實與通過相同多肽鏈的同源二聚化形成的單特異性雙抗體形成對比。因為必須提供至少兩條不同的多肽(即，兩個多肽種類)以便形成非單特異性雙抗體，和因為這種多肽的同源二聚化導致失活的分子(Takemura, S.等 (2000) “Construction Of A 雙抗體(Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)，所以這種多肽的產生必須以解決相同種類的多肽之間共價結合的方式完成 (即，從而使它們的同源二聚化最小化) (Takemura, S.等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)。因此，本領域教導了這類多肽的非共價締合(見，例如，Olafsen等 (2004)“Covalent Disulfide -Linked Anti -CEA Diabody Allows Site -Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等 (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Lu, D.等( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin -Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
但是，本領域已經認識到，包括非共價結合的多肽的雙特異性雙抗體不穩定並且容易解離成非功能單多肽鏈單體(見，例如，Lu, D.等( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin -Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
然而，在面對該挑戰時，本領域已經成功開發了穩定的、共價結合的異源二聚化非單特異性雙抗體，稱為DART® ( 雙 - 親和力重定向試劑 ( D ual-A ffinityR e-T argeting Reagents ) )雙抗體，見，例如，Chichili, G.R.等 (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates ,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Johnson, S.等 (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv -Based Dual -Affinity Re -Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B -Cell Depletion ,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449；Veri, M.C.等 (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Moore, P.A.等 (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B -Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；美國專利號8,044,180、8,133,982、8,187,593、8,193,318、8,530,627、8,669,349、8,778,339、8,784,808、8,795,667、8,802,091、8,802,093、8,946,387、8,968,730和8,993,730；美國專利公開號2009/0060910、2010/0174053、2011/0081347、2011/0097323、2011/0117089、2012/0009186、2012/0034221、2012/0141476、2012/0294796、2013/0149236、2013/0295121、2014/0017237和2014/0099318；歐洲專利文獻號EP 1868650、EP 2158221、EP 2247304、EP 2252631、EP 2282770、EP 2328934、EP 2376109、EP 2542256、EP 2601216、EP 2714079、EP 2714733、EP 2786762、EP 2839842、EP 2840091；和PCT公開號WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/027797、WO 2010/033279、WO 2010/080538、WO 2011/109400、WO 2012/018687、WO 2012/162067、WO 2012/162068、WO 2014/159940、WO 2015/021089、WO 2015/026892；和WO 2015/026894)。這類雙抗體包括兩條或更多條共價複合的多肽並且涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化至採用的多肽種類的每一個中。例如，將半胱氨酸殘基添加至這類構建體的C-末端已經被證明允許多肽鏈之間的二硫鍵結合，使所得異源二聚體穩定，而不干擾二價分子的結合特徵。
最簡單的DART® 雙抗體包括兩條多肽鏈，其每個包括三個結構域(圖 1 )。第一多肽鏈包括(i)包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區域的結構域(VL1)，(ii)包括 第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區域的第二結構域(VH2)，和(iii)第三結構域，其用於促進與第二多肽鏈的異源二聚化(“異源二聚體促進結構域 ”)並且共價結合雙抗體的第一多肽與第二多肽鏈。第二多肽鏈包含互補的第一結構域(VL2結構域)、互補的第二結構域(VH1結構域)和與第一多肽鏈的第三結構域複合的第三結構域，以便促進與第一多肽鏈的異源二聚化(“異源二聚體促進結構域 ”)和共價結合。這類分子是穩定的、有效的並且具有同時結合兩個或更多個抗原的能力。它們能夠促進對表達靶抗原的細胞的重定向的T細胞介導的殺傷。在一個實施方式中，第一和第二多肽鏈的第三結構域各自包含半胱氨酸(“C ”)殘基，其用於經二硫鍵將多肽結合在一起。多肽鏈中的一條或兩條的第三結構域可另外具有CH2-CH3結構域的序列，以便雙抗體多肽的複合形成能夠結合細胞(比如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜鹼性細胞和肥大細胞)的Fc受體的Fc結構域。已經描述了這類分子的許多變型(見，例如，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。
本發明優選的具有Fc的DART® 雙抗體包括三條多肽鏈，其在圖 s2A-2B 中描述。這類雙抗體的第一多肽鏈包含四個結構域：(i)包含VL1的結構域，(ii)包含VH2的結構域，(iii)促進與雙抗體的第二多肽鏈異源二聚化(“異源二聚體促進結構域 ”)和共價結合的結構域，和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。這類DART®雙抗體的第二多肽包含：(i)包含VL2的結構域，(ii)包含VH1的結構域和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈異源二聚化(“異源二聚體促進結構域 ”)和共價結合的結構域。這類DART®雙抗體的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，這類DART®雙抗體的第一和第二多肽鏈締合在一起而形成能夠結合第一表位(1)的VL1/VH1結合位點，以及能夠結合第二表位(2)的VL2/VH2結合位點。本發明優選的具有Fc的DART® 雙抗體是B7-H3x CD3雙特異性單價雙抗體，其能夠結合“第一表位”(可以是CD3或B7-H3)和“第二表位”(當第一表位是CD3時，其是B7-H3，和當第一表位是B7-H3時，其是CD3)。第一和第二多肽通過涉及它們各自的連接體和/或第三結構域中的半胱氨酸殘基的一個或多個二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合，以形成經二硫鍵穩定化的Fc結構域。這類雙抗體具有增強的效力。本發明優選的具有Fc的DARTs®雙抗體可具有兩個取向的任意一個(表 1 )： II.本發明優選的B7-H3x CD3雙特異性單價雙抗體
本發明尤其涉及這類具有Fc的DARTs®雙抗體，其能夠同時結合B7-H3和CD3，並且因此是B7-H3x CD3雙特異性單價DART®雙抗體，並且本發明涉及這類分子在治療癌症和其他疾病和病況中的用途。儘管非優化的B7-H3x CD3雙特異性單價雙抗體是完全有功能的，與通過密碼子優化的基因表達中獲得的改善類似(見，例如，Grosjean, H.等 (1982) “Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon -Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes ” Gene 18(3):199-209)，但進一步通過修飾或改善它們的序列而增強B7-H3x CD3雙特異性單價雙抗體的穩定性和/或功能是可能的。
優選地，如圖 2A 中顯示，這樣的三條多肽鏈的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包含N-末端、能夠結合“第一”抗原(CD3或B7-H3)的表位元的輕鏈可變結構域(VL ) (VL1 )、能夠結合“第二”抗原(B7-H3，如果第一抗原是CD3；CD3，如果第一抗原是B7-H3 )的表位元的重鏈可變結構域(VH ) (VH2 )、異源二聚體促進結構域和C-末端。間插連接體肽(連接體 1 )將輕鏈可變結構域(VL1 )與重鏈可變結構域(VH2 )分開。優選地，重鏈可變結構域(VL2 )通過間插連接體肽(連接體 2 )連接至異源二聚體促進結構域。在優選的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體實施方式中，異源二聚體促進結構域的C-末端通過間插連接體肽(連接體 3 )或通過間插間隔體-連接體肽(間隔體 - 連接體 3 )連接至Fc區域的CH2-CH3結構域(“Fc 結構域 ”)。最優選地，三條多肽鏈的第一多肽鏈因此在N-末端至C-末端方向上包含VL1-連接體1-VH2-連接體2-異源二聚體促進結構域-間隔體-連接體3-Fc結構域。
可選地，如圖 2B 中顯示，這樣的三條多肽鏈中的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包含N-末端、連接體3、Fc區域的CH2-CH3結構域(“Fc 結構域 ”)、具有例如氨基酸序列：APSSS (SEQ ID NO:51 )或氨基酸序列APSSSPME (SEQ ID NO:52 )的間插間隔體肽(連接體 4 )、能夠結合“第一”抗原(CD3或B7-H3)的表位元的輕鏈可變結構域 (VL ) (VL1 )、能夠結合“第二”抗原(B7-H3，如果第一抗原是CD3；CD3，如果第一抗原是B7-H3)的表位元的重鏈可變結構域 (VH ) (VH2 )、異源二聚體促進結構域和C-末端。間插連接體肽(連接體 1 )將輕鏈可變結構域(VL1 )與重鏈可變結構域(VH2 )分開。優選地，重鏈可變結構域(VH2 )通過間插連接體肽(連接體 2 )連接至異源二聚體促進結構域。最優選地，在這樣的可選的取向中，三條多肽鏈的第一多肽鏈因此在N-末端至C-末端方向上包含：連接體3-Fc結構域-連接體4-VL1-連接體1-VH2-連接體2-異源二聚體促進結構域。
優選地，對於這樣的兩個優選的取向的任意一個，這樣的三條多肽鏈的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包含N-末端、能夠結合“第二”抗原的表位元的輕鏈可變結構域(VL ) (VL2 )、能夠結合“第一”抗原的表位元的重鏈可變結構域(VH ) (VH1 )、異源二聚體促進結構域和C-末端。間插連接體肽(連接體 1 )將輕鏈可變結構域(VL2 )與重鏈可變結構域(VH1 )分開。優選地，重鏈可變結構域(VH1 )通過間插連接體肽(連接體 2 )連接至異源二聚體促進結構域。最優選地，因此，三條多肽鏈的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包含：VL1-連接體1-VH2-連接體2-異源二聚體促進結構域。
優選地，對於這樣的兩個優選的取向的任意一個，這樣的三條多肽鏈的第三多肽鏈包含連接體肽(連接體 3 )和Fc區域的CH2-CH3結構域(“Fc結構域”)。因為第三鏈多肽鏈不包括VL結構域或VH結構域，因此第三多肽鏈在本發明的兩個或更多個不同B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體之間可以是相同的。
協同選擇第一多肽鏈的輕鏈可變結構域(VL1 )，以便使其與第二多肽鏈的重鏈可變結構域(VH1 )相互作用，從而形成有功能的表位結合位點，其能夠免疫特異性結合第一抗原(即，B7-H3或CD3)的表位。同樣地，協同選擇第二多肽鏈的輕鏈可變結構域(VL2 )，以便使其與第一多肽鏈的重鏈可變結構域(VH2 )相互作用，從而形成有功能的表位結合位點，其能夠免疫特異性結合第二抗原(即，B7-H3或CD3)的表位。因此，協同輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的選擇，使得兩條多肽鏈總體包括能夠結合B7-H3和CD3的表位結合位點。 A.優選的連接體
最優選地，分開多肽鏈的這類VL和VH結構域的連接體 1 的長度被選擇，以基本上或完全防止這類VL和VH結構域彼此結合(例如，長度為12個或更少氨基酸殘基)。因此，第一多肽鏈的VL1 和VH2 結構域基本上或完全不能彼此結合，並且不形成能夠基本上結合第一或第二抗原的表位結合位點。同樣地，第二多肽鏈的VL2 和VH1 結構域基本上或完全不能彼此結合，並且不形成能夠基本上結合第一或第二抗原的表位結合位點。優選的間插間隔體肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO:1 )：GGGSGGGG。
連接體 2 的目的是將多肽鏈的VH結構域與該多肽鏈的任選存在的異源二聚體促進結構域分開。各種連接體的任何一種可用於連接體 2 的目的。這類連接體 2 的優選序列具有氨基酸序列：GGCGGG(SEQ ID NO:2 )，其具有可用於經二硫鍵共價彼此結合第一和第二多肽鏈的半胱氨酸殘基；或ASTKG (SEQ ID NO:3 )，其源自IgG CH1結構域。因為連接體2 ，ASTKG (SEQ ID NO:3 )不具有這樣的半胱氨酸，這類連接體 2 的使用優選地與包含半胱氨酸的異源二聚體促進結構域，比如SEQ ID NO:12 的E-螺旋或SEQ ID NO:13 的K-螺旋，的使用結合(見下麵)。
連接體 3 的目的是將多肽鏈的異源二聚體促進結構域與該多肽鏈的Fc結構域分開。各種連接體的任何一種可用於連接體 3 的目的。這類連接體 3 的優選序列具有氨基酸序列：DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:4 )。間隔體 - 連接體 3 的優選序列具有氨基酸序列：GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:5 )。 B.優選的異源二聚體促進結構域
第一和第二多肽鏈的異源二聚體的形成可通過包括“異源二聚體促進結構域 ”來驅動。這類結構域包括在一條多肽鏈上的GVEPKSC (SEQ ID NO:6 )或VEPKSC (SEQ IDNO:7 )和在另一條多肽鏈上的GFNRGEC (SEQ ID NO:8 )或FNRGEC (SEQ ID NO:9 ) (US2007/0004909)。
但是，更優選地，本發明的異源二聚體促進結構域由一個、兩個、三個或四個串聯重複的、具有相反電荷的螺旋結構域形成，所述螺旋結構域包括具有至少六個、至少七個或至少八個帶電的氨基酸殘基的序列(Apostolovic, B.等 (2008) “pH -Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil ,” Biomacromolecules 9:3173–3180；Arndt, K.M.等 (2001) “Helix -stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled -coil Domain ,” J. Molec. Biol. 312:221-228；Arndt, K.M.等 (2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils ,” Structure 10:1235-1248；Boucher, C.等 (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled–Coil Interactions ,” Analytical Biochemistry 399:138-140；Cachia, P.J.等 (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross -Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy ,” J. Mol. Recognit. 17:540-557；De Crescenzo, G.D.等 (2003) “Real -Time Monitoring of the Interactions of Two -Stranded de novo Designed Coiled -Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding ,” Biochemistry 42:1754-1763；Fernandez-Rodriquez, J.等 (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled -Coil Tag ,” Protein Science 21:511-519；Ghosh, T.S.等 (2009) “End -To -End And End -To -Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures ,” Acta Crystallographica D65:1032-1041；Grigoryan, G.等 (2008) “Structural Specificity In Coiled -Coil Interactions ,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483；Litowski, J.R.等 (2002) “Designing Heterodimeric Two -Stranded α -Helical Coiled -Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α -Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity ,” J. Biol. Chem. 277:37272-37279；Steinkruger, J.D.等 (2012) “The d′ --d --d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′ --a --a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled -coil Dimer Motif ,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626–2633；Straussman, R.等 (2007) “Kinking the Coiled Coil – Negatively Charged Residues at the Coiled -coil Interface ,” J. Molec. Biol. 366:1232-1242；Tripet, B.等 (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C -terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance ,” J. Molec. Biol. 323:345–362；Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled -Coil Structures And Assemblies ,” Adv. Prot. Chem. 70:79-112；Zeng, Y.等 (2008) “A Ligand -Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism ,” J. Gene Med. 10:355-367)。
這樣的重複的螺旋結構域可以是準確的重複或可具有取代。例如，一條多肽鏈的異源二聚體促進結構域可包括帶負電的氨基酸殘基的序列並且另一多肽鏈的異源二聚體促進結構域可包括帶負電的氨基酸殘基的序列。尤其地，實施方式螺旋結構域包括八個帶負電的氨基酸殘基或八個帶正電的殘基。哪個螺旋被提供至第一或第二多肽鏈是不重要的，只要帶相反電荷的螺旋用於另一多肽鏈。但是，本發明優選的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一多肽鏈具有帶負電的螺旋。帶正電的螺旋結構域的帶正電的氨基酸可以是賴氨酸、精氨酸、組氨酸等並且優選地是賴氨酸。帶負電的螺旋的帶負電的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等，並且優選地是谷氨酸。
本發明的B7-H3 x CD3雙特異性單價DART®雙抗體可僅僅具有單異源二聚體促進結構域(即，第一多肽鏈或第二多肽鏈，但不是兩者，包含異源二聚體促進結構域。這類單異源二聚體促進結構域的存在通過阻礙是同源二聚體的雙抗體的(這類分子缺少任何異源二聚體促進結構域，或具有兩個排斥的(相同電荷的)異源二聚體促進結構域)形成而促進了異源二聚化。但是，優選地，本發明雙抗體的第一和第二多肽鏈均包含異源二聚體促進結構域。
在優選的實施方式中，異源二聚體促進結構域之一包括四個串聯的“E-螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO:10 ： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸殘基在pH 7形成負電荷，而另一個異源二聚體促進結構域包括四個串聯的“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:11 ： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)，其賴氨酸殘基在pH 7形成正電荷。這類帶電結構域的存在促進了第一和第二多肽之間的締合，並且因此促進了異源二聚化。在另一優選的實施方式中，使用這樣的異源二聚體促進結構域：其中SEQ ID NO:10 的 四個串聯的“E-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾，以包含半胱氨酸殘基： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:12 )。類似地，在另一優選的實施方式中，使用這樣的異源二聚體促進結構域：其中SEQ ID NO:11 的四個串聯的“K-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾，以包含半胱氨酸殘基： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:13 )。 C.多肽鏈的共價結合
工程化本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，從而它們的第一和第二多肽鏈經沿著它們的長度設置的一個或多個半胱氨酸殘基而彼此共價結合。這類半胱氨酸殘基可被引入到分開多肽的VL和VH結構域的間插連接體中。可選地，連接體 2 可包含半胱氨酸殘基。另外，或可選地，連接體 3 可包含半胱氨酸殘基，如在SEQ ID NO:4 或SEQ ID NO:5 中。最優選地，異源二聚體促進結構域的一個或多個螺旋結構域將被取代，以包含半胱氨酸殘基，如在SEQ ID NO:12 或SEQ ID NO:13 中。 D.優選的Fc結構域
本發明優選的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可以是完整的Fc區域(例如，完整的IgG Fc區域)或僅僅是完整的Fc區域的片段。儘管本發明優選的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可具有結合一個或多個Fc受體(例如，FcγR)的能力，但更優選地，這類Fc結構域被修飾，以導致與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的結合(相對於野生型Fc區域展示的結合)，或被修飾，以基本上消除這類Fc結構域結合這類受體(一種或多種)的能力。因此，本發明優選的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可包括完整Fc區域的一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域，或可包括變異的CH2和/或變異的CH3序列(其可包括，例如，相對於完整Fc區域的CH2或CH3結構域的一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc結構域可包括非Fc多肽部分，或可包括非天然產生的完整Fc區域的部分，或可包括非天然存在的取向的CH2和/或CH3結構域(比如，例如，兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或在N-末端至C-末端方向上，與CH2結構域連接的CH3結構域等)。
在優選的實施方式中，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第三多肽鏈各自包括CH2-CH3結構域，其複合在一起而形成免疫球蛋白(IgG) Fc結構域。人IgG1的示例性CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:14 )： 231    240        250        260        270        280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD        290        300       310         320        330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA        340        350       360        370         380 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE        390        400       410         420        430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE        440     447 ALHNHYTQKS LSLSPG K
IgG重鏈的恒定區中殘基的編號是EU索引的編號，如在Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. Public Health Service, NH1, MD (1991)中，其通過引用明確併入本文。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗體的編號。在抗體恒定區內的許多不同位置處已經觀察到多態性(例如，Fc位置，包括但不限於270、272、312、315、356和358位，如Kabat中闡釋的EU索引編號)，因此呈現的序列和現有技術序列之間的可存在稍微的不同。已經良好表徵了人免疫球蛋白的多態形式。目前，已知18種Gm同種異型(allotype)：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc, 等, “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation. ” Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990)；Lefranc, G. 等, 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體考慮，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型、異同種異型(isoallotype)或單倍型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、異同種異型或單倍型。此外，在一些表達系統中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上面加粗的)可在翻譯後去除。因此，CH3結構域的C-末端殘基是本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體中的任選的氨基酸殘基。下面提供了包括SEQ ID NO:14 的C-末端殘基的示例性B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體。本發明也具體包括缺少SEQ ID NO:14 的C-末端賴氨酸殘基的這類構建體。
第一和第三多肽鏈的CH2和/或CH3結構域可都包括SEQ ID NO:14 或其變體。
尤其地，優選地，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域展示對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上不)結合(相對於野生型Fc區域(SEQ ID NO:14 )展示的結合)。能夠介導這樣的改變的結合的Fc變體和突變體形式是本領域熟知的並且包括在234和235位的氨基酸取代、在265位的取代或在297位的取代，其中所述編號是如Kabat中EU索引的編號(見，例如，美國專利號5,624,821，通過引用併入本文)。在優選的實施方式中，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括在234位用丙氨酸的取代和235位用丙氨酸的取代，其中所述編號是如Kabat中EU索引的編號。
第一和第三多肽鏈的CH2和/或CH3結構域不需要序列相同，並且有利地被修飾，以促進兩條多肽鏈之間的複合。例如，氨基酸取代(優選以包括形成“杵(knob)”的大側基的氨基酸例如色氨酸取代)可被引入CH2或CH3結構域中，以便空間干擾將防止與類似的突變結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域——即“臼(hole)”(例如，用甘氨酸取代)——配對。這樣的突變組可被工程化到構成雙特異性單價Fc雙抗體分子的任意多肽對中，並且進一步地，被工程化到所述多肽鏈對的任何部分中。蛋白質工程化以相對于同源二聚化利於異源二聚化的方法在本領域中是悉知的，尤其就工程化免疫球蛋白樣分子而言，並且包括在本文中(見例如， Ridgway等 (1996)“‘Knobs -Into -Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621, Atwell等 (1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie等 (2005)“A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；其中每篇文獻通過引用以其整體併入本文)。優選地，杵被工程化至第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中並且臼被工程化至第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此，杵有助於防止第一多肽鏈的兩個分子經它們的CH2和/或CH3結構域同源二聚化。因為第三多肽鏈優選地包含臼取代，因此，其具有與第一多肽鏈異源二聚化以及本身同源二聚化的能力(但是，這樣的同源二聚化不形成具有表位結合位點的分子)。通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366W而產生優選的杵。通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366S、L368A和Y407V而產生優選的臼。為了有助於從包括第一、第二和第三多肽鏈的最終的雙特異性單價Fc雙抗體純化第三多肽鏈同源二聚體，優選地通過在435位的氨基酸取代(H435R)來突變第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白質A結合位點。因此，第三多肽鏈同源二聚體不結合蛋白質A，而雙特異性單價Fc雙抗體保持其經第一多肽鏈上的蛋白質結合位點而結合蛋白質A的能力。
本發明的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一多肽鏈的CH2和CH3結構域的優選的序列具有“攜帶杵的 ”序列(SEQ ID NO:15 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL Y SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN H YTQKS  LSLSPGK
本發明的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的優選的序列具有“攜帶臼的 ”序列(SEQ ID NO:16 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPGK
如將注意到的，SEQ ID NO:15 和SEQ ID NO:16 的CH2-CH3結構域包括在234位用丙氨酸的取代和235位用丙氨酸的取代，並且因此形成這樣的Fc結構域：其展示對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上不)結合(相對於野生型Fc區域(SEQ ID NO:14 )展示的結合。此外，本發明具體包括缺少SEQ ID NO:14 、SEQ ID NO:15 和/或SEQ ID NO:16 的C-末端賴氨酸殘基的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體構建體。
優選地第一多肽鏈具有“攜帶杵的”CH2-CH3序列，比如SEQ ID NO:15 的序列。但是，如將認識到，“攜帶臼的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:16 )可用於第一多肽鏈中，在該情況下“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:15 )將用於第三多肽鏈中。 E.優選的B7-H3可變結構域
任何抗B7-H3抗體的抗原結合結構域可根據本發明使用。下面提供了對於人B7-H7免疫特異性的示例性抗體(命名為“B7-H3 mAb A ”、“B7-H3 mAb B ”和“B7-H3 mAb C ”)。 1. B7-H3 mAb A
B7-H3 mAb A的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:17 )顯示在下方(CDRL 殘基加底線顯示)： DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKALIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FG QGTKLEIK B7-H3 mAb A的CDRL 1:(SEQ ID NO:18 ) KASQNVDTNVA B7-H3 mAb A的CDRL 2:(SEQ ID NO:19 ) SASYRYS B7-H3 mAb A的CDRL 3:(SEQ ID NO:20 ) QQYNNYPFT
B7-H3 mAb A的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:21) 顯示在下方(CDRH殘基加底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGR GR ENIYYGSRLD  Y WGQGTTVTVSS B7-H3 mAb A的CDRH 1:(SEQ ID NO:22 ) SFGMH B7-H3 mAb A的CDRH 2:(SEQ ID NO:23 ) YISSDSSAIYYADTVKG B7-H3 mAb A的CDRH 3:(SEQ ID NO:24 ) GRENIYYGSRLDY 2. B7-H3 mAb B
B7-H3 mAb B的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:25 )顯示在下方(CDRH 殘基加底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK B7-H3 mAb B的CDRL 1:(SEQ ID NO:26 ) RASQDISNYLN B7-H3 mAb B的CDRL 2:(SEQ ID NO:27 ) YTSRLHS B7-H3 mAb B的CDRL 3:(SEQ ID NO:28 ) QQGNTLPPT
B7-H3 mAb B的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:29 )顯示在下方(CDRH 殘基加底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQAPGQGLEWMG T IYPGDGDTRY TQKFKG RVTITADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV WGQGTTVTVSS B7-H3 mAb B的CDRH 1:(SEQ ID NO:30 ) SYWMQ B7-H3 mAb B的CDRH 2:(SEQ ID NO:31 ) TIYPGDGDTRYTQKFKG B7-H3 mAb B的CDRH 3:(SEQ ID NO:32 ) RGIPRLWYFDV 3. B7-H3 mAb C
B7-H3 mAb C的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:33 )顯示在下方(CDRL 殘基加底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQSIS SYLN WYQQKPGKAPKLLIY Y TSRLQS GVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGGGTKLEIK B7-H3 mAb C的CDRL 1:(SEQ ID NO:34 ) RASQSISSYLN B7-H3 mAb C的CDRL 2:(SEQ ID NO:35 ) YTSRLQS B7-H3 mAb C的CDRL 3:(SEQ ID NO:36 ) QQGNTLPPT
B7-H3 mAb C的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:37 )顯示在下方(CDRH 殘基加底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQAPGQGLEWMG T IYPGGGDTRY TQKFQG RVTITADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV WGQGTTVTVSS B7-H3 mAb C的CDRH 1:(SEQ ID NO:38 ) SYWMQ B7-H3 mAb C的CDRH 2:(SEQ ID NO:39 ) TIYPGGGDTRYTQKFQG B7-H3 mAb C的CDRH 3:(SEQ ID NO:40 ) RGIPRLWYFDV F.優選的CD3可變結構域
任何抗CD3抗體的抗原結合結構域可根據本發明使用。下面提供了對於人CD3免疫特異性的示例性抗體(命名為“CD3 mAb A )。
CD3 mAb A的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:41 )顯示在下方(CDRL 殘基加底線顯示)： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG CD3 mAb A的CDRL 1:(SEQ ID NO:42 ) RSSTGAVTTSNYAN CD3 mAb A的CDRL 2:(SEQ ID NO:43 ) GTNKRAP CD3 mAb A的CDRL 3:(SEQ ID NO:44 ) ALWYSNLWV
CD3 mAb A的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:45 )顯示在下方(CDRH 殘基加底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQAPGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVKD RFTISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTLVTVSS CD3 mAb A的CDRH 1:(SEQ ID NO:46 ) TYAMN CD3 mAb A的CDRH 2:(SEQ ID NO:47 ) RIRSKYNNYATYYADSVKD CD3 mAb A的CDRH 3:(SEQ ID NO:48 ) HGNFGNSYVSWFAY
在某些實施方式中，CD3 mAb A的VH結構域包括在Kabat 65位的天冬氨酸至甘氨酸取代(D65G 取代，對應於SEQ ID NO:45的殘基68)，以便CDRH 2的氨基酸序列是：RIRSKYNNYATYYADSVK G (SEQ ID NO:49 )。具有D65G 取代的CD3 mAb A的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:50 )顯示在下方(取代的殘基加底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVK G RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS  WFAYWGQGTL  VTVSS II.示例性B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體
本發明提供了能夠同時和特異性結合B7-H3和結合CD3的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體。如上所示，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體包括三條多肽鏈。下面提供了能夠結合B7-H3和結合CD3的四個示例性B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(命名為“DART-A ”、“DART-B ”、“DART-C ”和“DART-D ”)的多肽鏈。 A. DART-A
DART-A 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合B7-H3的單克隆抗體的VL結構域(VLB7-H3 B7-H3 mAb A) (SEQ ID NO:17 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VHCD3 CD3 mAb A) (SEQ ID NO:45 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:2 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:10 ))、間插連接體肽(間隔體 - 連接體 3 ；GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:5 ))、“攜帶杵的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:15 )和C-末端。
因此，DART-A 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:17 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:45 ─ SEQ ID NO:2 ─ SEQ ID NO:10 ─ SEQ ID NO:5 ─ SEQ ID NO:15 。
DART-A 的第一多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:53 )： DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
編碼這類多肽的示例性多核苷酸是(SEQ ID NO:54 )： gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaaggata gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa
DART-A 的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VLCD3 CD3 mAb A) (SEQ ID NO:41 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合B7-H3的單克隆抗體的VH結構域(VHB7-H3 B7-H3 mAb A) (SEQ ID NO:21 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:2 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:11 )和C-末端。
因此，DART-A 的第二多肽包括：SEQ ID NO:41 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:2 ─ SEQ ID NO:11 。
DART-A 的第二多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:55 )： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SDSSAIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRDEDTA VYYCGRGREN IYYGSRLDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
編碼這類多肽的示例性多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:56 )： caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggcgg aggcgaggtg cagctggtcg agtctggcgg aggactggtg cagcctggcg gctccctgag actgtcttgc gccgcctccg gcttcacctt ctccagcttc ggcatgcact gggtccgcca ggctccaggc aagggactgg aatgggtggc ctacatctcc tccgactcct ccgccatcta ctacgccgac accgtgaagg gcaggttcac catctcccgg gacaacgcca agaactccct gtacctgcag atgaactccc tgcgggacga ggacaccgcc gtgtactact gcggcagagg ccgggagaat atctactacg gctcccggct ggattattgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag ag
DART-A 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽(連接體 3 ；DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:4 ))、“攜帶臼的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:16 )和C-末端。
因此，DART-A 的第三多肽包括：SEQ ID NO:4 ─SEQ ID NO:16 。
DART-A 的第三多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:57 )： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
編碼這類多肽的優選的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:58 )： gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgagttg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcgt cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a A. DART-B
DART-B 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合B7-H3的單克隆抗體的VL結構域(VLB7-H3 B7-H3 mAb B) (SEQ ID NO:25 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VHCD3 CD3 mAb A) (SEQID NO:45 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:2 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:10 ))、間插連接體肽(間隔體 - 連接體 3 ；GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:5 ))、“攜帶杵的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:15 )和C-末端。
因此，DART-B 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:25 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:45 ─ SEQ ID NO:2 ─ SEQ ID NO:10 ─ SEQ ID NO:5 ─ SEQ ID NO:15 。
DART-B 的第一多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:59 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
DART-B 的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VLCD3 CD3 mAb A) (SEQ ID NO:41 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合B7-H3的單克隆抗體的VH結構域(VHB7-H3 B7-H3 mAb B) (SEQ ID NO:29 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:2 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:11 )和C-末端。
因此，DART-B 的第二多肽包括：SEQ ID NO:41 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:2 ─ SEQ ID NO:11 。
DART-B 的第二多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:60 )： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ KFKGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
DART-B 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽(連接體3 ；DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:4 ))、“攜帶臼的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:16 )和C-末端。
因此，DART-B 的第三多肽包括：SEQ ID NO:4 ─SEQ ID NO:16 並且具有與上面提供的DART-A 的第三多肽相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:57 )。 B. DART-C
DART-C 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合B7-H3的單克隆抗體的VL結構域(VLB7-H3 B7-H3 mAb C) (SEQ ID NO:33 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VHCD3 CD3 mAb A，其具有D65G 取代) (SEQ ID NO:50 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:2 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:10 ))、間插連接體肽(間隔體 - 連接體 3 ；GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:5 ))、“攜帶杵的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:15 )和C-末端。
因此，DART-C 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:33 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:2 ─ SEQ ID NO:10 ─ SEQ ID NO:5 ─ SEQ ID NO:15 。
DART-C 的第一多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:61 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
DART-C 的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VLCD3 CD3 mAb C) (SEQ ID NO:41 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合B7-H3的單克隆抗體的VH結構域(VHB7-H3 B7-H3 mAb B) (SEQ ID NO:37 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:2 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:11 )和C-末端。
因此，DART-C 的第二多肽包括：SEQ ID NO:41 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:2 ─ SEQ ID NO:11 。
DART-C 的第二多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:62 )： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGGGDTRYTQ KFQGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
DART-C 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽(連接體 3 ；DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:4 ))、“攜帶臼的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:16 )和C-末端。
因此，DART-C 的第三多肽包括：SEQ ID NO:4 ─SEQ ID NO:16 並且具有與上面提供的DART-A 第三多肽相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:57 )。 C. DART-D
示例性DART-D 的第一和第二多肽鏈的一般結構與DART- A、DART-B 和DART-C 的相同，除了DART-D 包括缺少半胱氨酸殘基的可選的連接體 2 ，並且包括包含半胱氨酸的異源二聚體促進結構域。DART-D 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合B7-H3的單克隆抗體的VL結構域(VLB7-H3 B7-H3 mAb C) (SEQ ID NO:33 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VHCD3 CD3 mAb A，其具有D65G 取代) (SEQ ID NO:50 )、間插連接體肽(連接體 2 ；ASTKG(SEQ ID NO:3 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:12 ))、間插連接體肽(間隔體 - 連接體 3 ；GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:5 ))、“攜帶杵的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:15 )和C-末端。
因此，DART-D 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:33 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:12 ─ SEQ ID NO:5 ─ SEQ ID NO:15 。
DART-D 的第一多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:63 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
DART-D 的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VLCD3 CD3 mAb C) (SEQ ID NO:41 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合B7-H3的單克隆抗體的VH結構域(VHB7-H3 B7-H3 mAb B) (SEQ ID NO:37 )、間插連接體肽(連接體 2 ；ASTKG(SEQ ID NO:3 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:13 )和C-末端。
因此，DART-C 的第二多肽包括：SEQ ID NO:41 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:13 。
DART-D 的第二多肽的氨基酸序列是(SEQ ID NO:64 )： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGGGDTRYTQ KFQGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSAS TKGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
儘管第一和第二多肽鏈併入了不同的連接體和異源二聚體促進結構域，但是DART-D 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽(連接體 3 ；DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:4 ))、“攜帶臼的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:16 )和C-末端。
因此，DART-D 的第三多肽包括：SEQ ID NO:4 ─SEQ ID NO:16 並且具有與上面提供的DART-A 的第三多肽相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:57 )。 III.對照DART®雙抗體
為了更有意義地證明本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的特性，構建了能夠結合螢光素和CD3的對照雙特異性單價Fc雙抗體(命名為“對照 DART” )。
用於形成對照 DART® 雙抗體的抗螢光素抗體是抗體4-4-20 (Gruber, M.等 (1994) “Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli ,” J. Immunol. 152(11):5368-5374；Bedzyk, W.D.等 (1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti -Fluorescein Idiotype Family ,” J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569)用於對照雙抗體。抗螢光素抗體4-4-20的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的氨基酸序列如下：
抗螢光素抗體4-4-20的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:65 )顯示在下方(CDRH 殘基加底線顯示)： DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLR W YLQKPGQSPK VLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP W TFGGGTKLE IK
抗螢光素抗體4-4-20的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:66 )顯示在下方(CDRH 殘基加底線顯示)： EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWM NWVRQS PEKGLEWVA Q IRNKPYNYET YYSDSVKG RF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDY WGQ GTSVTVSS
對照 DART 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合螢光素的單克隆抗體的VL結構域(VLFluor 4-4-20) (SEQ ID NO:65 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VHCD3 CD3 mAb A，其具有D65G 取代) (SEQ ID NO:50 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG(SEQ ID NO:2 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:10 ))、間插連接體肽(間隔體 - 連接體 3 ；GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:5 ))、“攜帶杵的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:15 )和C-末端。
因此，對照 DART 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:65 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:2 ─ SEQ ID NO:10 ─ SEQ ID NO:5 ─ SEQ ID NO:15 。
對照 DART 的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:67 )： DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
對照 DART 的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VLCD3 CD3 mAb A) (SEQ ID NO:37 )、間插連接體肽(連接體 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:1 ))、能夠結合螢光素的單克隆抗體的VH結構域(VHfluor 4-4-20) (SEQ ID NO:65 )、間插連接體肽(連接體 2 ；GGCGGG(SEQ ID NO:2 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:11 )和C-末端。
因此，對照 DART 的第二多肽鏈包括：SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:1 ─ SEQ ID NO:65 ─ SEQ ID NO:2 ─ SEQ ID NO:11 。
對照 DART 的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:68 )： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KLDETGGGLV QPGRPMKLSC VASGFTFSDY WMNWVRQSPE KGLEWVAQIR NKPYNYETYY SDSVKGRFTI SRDDSKSSVY LQMNNLRVED MGIYYCTGSY YGMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE
對照 DART 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽(連接體 3 ；DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:4 ))、“攜帶臼的 ”Fc結構域(SEQ ID NO:16 )和C-末端。
因此，對照 DART 的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO:4 ─SEQ ID NO:16 並且具有與上面提供的DART-A 的第三多肽相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:57 )。 IV.藥物組合物
本發明的組合物包括原料藥組合物(bulk drug composition)，其可用於製備藥學組合物(例如，不純或非無菌組合物)，和可用於製備單位劑型的藥學組合物(即，適於施用給受試者或患者的組合物)。這樣的組合物包括本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，或這樣的劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地，本發明的組合物包括預防或治療有效量的本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和藥學上可接受的載體。
本發明也包括這樣的藥物組合物：其包括本發明的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和有效刺激免疫應答的一種或多種另外的分子(例如，免疫檢查點抑制劑)和/或聯合對於至少一種特定的癌症抗原是特異性的、特異性結合癌症抗原的一種或多種另外的分子(例如，腫瘤特異性單克隆抗體或雙抗體)以及藥學上可接受的載體。如本文所使用，術語“癌症抗原”表示在腫瘤細胞的表面上特徵性表達的抗原。癌症抗原的例子包括：A33 (結直腸癌抗原；Almqvist, Y. 2006,Nucl Med Biol . Nov;33(8):991-998)；B1 (Egloff, A.M.等 2006,Cancer Res . 66(1):6-9)；BAGE (Bodey, B. 2002Expert Opin Biol Ther . 2(6):577-84)；β-聯蛋白(Prange W.等 2003J Pathol. 201(2):250-9)；CA125 (Bast, R.C. Jr.等 2005Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81)；CD5 (Calin, G.A.等 2006Semin Oncol . 33(2):167-73；CD19 (Troussard, X.等 1998Hematol Cell Ther . 40(4):139-48)；CD20 (Thomas, D.A.等 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36)；CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18；8(3):E532-51)；CD23 (Rosati, S.等 2005Curr Top Microbiol Immunol . 5；294:91-107)；CD25 (Troussard, X.等 1998Hematol Cell Ther . 40(4):139-48)；CD27 (Bataille, R. 2006Haematologica 91(9):1234-40)；CD28 (Bataille, R. 2006Haematologica 91(9):1234-40)；CD36 (Ge, Y. 2005Lab Hematol . 11(1):31-7)；CD40 /CD154 (Messmer, D.等 2005Ann N Y Acad Sci . 1062:51-60)；CD45 (Jurcic, J.G. 2005Curr Oncol Rep . 7(5):339-46)；CD56 (Bataille, R. 2006Haematologica 91(9):1234-40)；CD79a /CD79b (Troussard, X.等 1998Hematol Cell Ther . 40(4):139-48；Chu, P.G.等 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106)；CD103 (Troussard, X.等 1998Hematol Cell Ther . 40(4):139-48)；CDK4 (Lee, Y.M.等 2006Cell Cycle 5(18):2110-4)；CEA (胚胎抗原；Mathelin, C. 2006Gynecol Obstet Fertil . 34(7-8):638-46；Tellez-Avila, F.I.等 2005Rev Invest Clin . 57(6):814-9)；CTLA4 (Peggs, K.S.等 2006Curr Opin Immunol. 18(2):206-13)；EGF-R (表皮生長因數受體；Adenis, A.等 2003Bull Cancer . 90 Spec No:S228-32)；Erb (ErbB1；ErbB3；ErbB4；Zhou, H.等 2002Oncogene 21(57):8732-40；Rimon, E.等 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38)；GAGE (GAGE-1；GAGE-2；Akcakanat, A.等 2006Int J Cancer . 118(1):123-8)；GD2 /GD3 /GM2 (Livingston, P.O.等 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-25)；gp100 (Lotem, M.等 2006J Immunother. 29(6):616-27)；HER-2/neu (Kumar, Pal S等 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91)；人乳頭瘤病毒 -E6/ 人乳頭瘤病毒 -E7 (DiMaio, D.等 2006Adv Virus Res . 66:125-59；KSA (17-1A) (Ragupathi, G. 2005Cancer Treat Res . 123:157-80)；MAGE (MAGE-1；MAGE-3；(Bodey, B. 2002Expert Opin Biol Ther . 2(6):577-84)；MART (Kounalakis, N.等 2005Curr Oncol Rep . 7(5):377-82；MUC-1 (Mathelin, C. 2006Gynecol Obstet Fertil . 34(7-8):638-46)；MUM-1 (Castelli, C.等 2000J Cell Physiol . 182(3):323-31)；N- 乙醯葡糖氨基轉移酶 (Dennis, J.W. 1999Biochim Biophys Acta . 6；1473(1):21-34)；p15 (Gil, J.等 2006Nat Rev Mol Cell Biol . 7(9):667-77)；PSA (前列腺特異性抗原；Cracco, C.M.等 2005Minerva Urol Nefrol . 57(4):301-11)；PSMA (Ragupathi, G. 2005Cancer Treat Res . 123:157-80)；sTn (Holmberg, L.A. 2001Expert Opin Biol Ther . 1(5):881-91)；TNF- 受體 (TNF-α受體，TNF-ß受體；或TNF-γ受體；van Horssen, R.等 2006Oncologist . 11(4):397-408；Gardnerova, M.等 2000Curr Drug Targets . 1(4):327-64)；VEGF 受體(O’Dwyer. P.J. 2006Oncologist . 11(9):992-8)；ADAM-9 (美國專利公開號2006/0172350；PCT公開號WO 06/084075)；ALCAM (PCT公開號WO 03/093443)；羧肽酶 M (美國專利公開號2006/0166291)；CD46 (美國專利號7,148,038；PCT公開號WO 03/032814)；細胞角蛋白 8 (PCT公開號WO 03/024191)；肝配蛋白受體 (尤其是EphA2 (美國專利號7,569,672；PCT公開號WO 06/084226)；整聯蛋白 α-V-β-6 (PCT公開號WO 03/087340)；JAM-3 (PCT公開號WO 06/084078)；KID3 (PCT公開號WO 05/028498)；KID31 (PCT公開號WO 06/076584)；LUCA-2 (美國專利公開號2006/0172349；PCT公開號WO 06/083852)；致癌蛋白 M (致癌蛋白受體β ) (美國專利號7,572,896；PCT公開號WO 06/084092)；PIPA (美國專利號7,405,061；PCT公開號WO 04/043239)；ROR1 (美國專利號5,843,749)；和運鐵蛋白受體 (美國專利號7,572,895；PCT公開號WO 05/121179)。
在具體的實施方式中，術語“藥學上可接受的”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥學載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥學組合物時，水性載體，比如鹽水溶液、水性右旋糖和甘油溶液是優選的。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，組合物也可以含有小量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。
一般而言，本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥學級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物，則可以提供一安瓿注射用無菌水或鹽水，以便可以在施用前混合所述成分。
可以將本發明的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽以及用陽離子形成的鹽，所述陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子，並且所述陽離子例如來自氫氧化納、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的陽離子。
本發明也提供了藥學包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述一個或多個容器包含本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，單獨地或與其他劑，優選藥學上可接受的載體一起。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可包括在藥物包裝或試劑盒中。本發明也提供了這樣的藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器(一個或多個)關聯的可以是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的佈告(notice)，所述佈告反映了管理機構許可用於人類施用的製造、使用或銷售。
試劑盒可包括本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包括可用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑；和/或試劑盒可進一步包括結合一種或多種癌症抗原的一種或多種細胞毒性抗體。在某些實施方式中，其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中，預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。 V.施用方法
通過向受試者施用有效量的本發明的分子或包括本發明的分子的藥學組合物，可以提供本發明的組合物用來治療、預防和緩解與癌症或其他疾病或病症相關的一種或多種症狀。在優選的方面，這類組合物基本上是純的(即，基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
各種送遞系統是已知的，並且可以用於施用本發明的分子和組合物，例如封裝於脂質體中、微粒、微膠囊、能表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(見，例如，Wu等(1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, ” J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。
施用本發明的分子的方法包括但不限於腸胃外施用(例如皮內、肌肉、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方式中，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚被覆(lining) (例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。另外，也可以應用肺給藥，例如通過使用吸入器或噴霧器，並且與霧化劑一起配製。見，例如，美國專利號6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT申請號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其每一篇通過引用以其整體併入本文。
本發明也使得本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體包裝在密封容器中，比如指示分子的數量的安瓿或小袋中。在一個實施方式中，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以用例如水或鹽水重構至適當濃度，用於施用於受試者。優選地，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體作為凍幹無菌粉提供於密封容器中。
本發明的凍幹的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體應在它們的初始容器中儲存在2°C和8°C之間，並且分子應該在重構之後12小時內，優選地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內施用。在可選的實施方式中，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，本發明液體形式的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體提供在密封容器中。
可通過標準臨床技術確定本發明的組合物有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的量。製劑中採用的精確劑量還將取決於施用的路徑和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線推斷。
如本文所使用，在一個實施方式中，藥物組合物的“有效量 ”是足以實現有益或期望的結果的量，所述結果包括但不限於臨床結果，比如減少源自疾病的症狀、減弱疾病的症狀(例如，癌細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而提高遭受疾的患者的生命品質，降低治療疾病需要的其他藥物治療的劑量、比如經靶向和/或內化增強另一藥物的作用、延遲疾病的進展，和/或延長個體的生存。
可在一次或多次施用中施加這樣的有效量。為了本發明的目的，有效量的藥物、化合物或藥物組合物是足夠減少病毒存在的增殖(或影響)和直接或間接減少和/或延遲疾病(例如癌症)的發展的量。在一些實施方式中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可聯合或不聯合另一藥物、化合物或藥物組合物實現。因此，“有效量”可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮，並且如聯合一種或多種其他劑，可實現或實現期望的結果，則單劑可視為以有效量施用。儘管個體的需要不同，但是測定每種組分的有效量的最佳範圍是本領域技術人員已知的。
對於本發明包括的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，向患者施用的劑量優選地基於接受受試者的體重(kg)來確定。施用的劑量通常是至少約0.01 μg/kg、至少約0.05 μg/kg、至少約0.1 μg/kg、至少約0.2 μg/kg、至少約0.5 μg/kg、至少約1 μg/kg、至少約2 μg/kg、至少約3 μg/kg、至少約5 μg/kg、至少約10 μg/kg、至少約20 μg/kg、至少約30 μg/kg、至少約50 μg/kg、至少約0.1 mg/kg、至少約0.15 mg/kg、至少約0.2 mg/kg、至少約0.5 mg/kg、至少約1.0 mg/kg受試者的體重或更多。
用本發明的治療或預防有效量的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體治療受試者可包括單治療，或優選地，可包括涉及相同或不同劑量的一系列治療。例如，受試者可用本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體治療，每週一次或每兩週一次，持續約2至約120周，或大於120周。應該認識到，用於治療的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的有效劑量在特定的治療期間可增加或減少。
優選地，使用治療方案的療程施用B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，所述治療方案包括一個或多個劑量(其可保持不變，或可回應受試者對治療的應答而增加或減少，其中治療方案是在2周、3周、4周、6周、8周或大於8周內施用。典型地，有1、2、3、4、5或大於5個治療療程。每個治療療程可以與任何之前的方案相同或不同。
在某些實施方式中，劑量方案包括第一個6周迴圈，其中B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體每兩週一次施用至受試者(即，每隔一週一次)，隨後是一個或多個8周迴圈，其中B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體每兩週一次施用至受試者。在某些實施方式中，第一個6周迴圈之後是一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或大於十四個8周迴圈。
在具體的實施方式中，施用至受試者的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的劑量是至少約0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、1.3 μg/kg、3 μg/kg、10 μg/kg、30 μg/kg或100 μg/kg受試者的體重。基於患者在基線時的體重施用計算的劑量。但是，體重由基線或確定的穩定狀態( plateau)重量的顯著(≥ 10%)改變將提示重新計算施用的劑量。
通過修飾比如，例如，脂質化來增強B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的吸收和組織滲透，可降低或改變本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的施用的劑量和頻率。
對於用作單劑療法，可計算向患者施用的本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的劑量。可選地，本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體可與其他治療組合物聯合使用，以便向患者施用的劑量小於當所述分子用作單劑療法時的劑量。
本發明的藥物組合物可被局部施用至需要治療的區域；這可通過例如，但不限於下述方式實現：局部注入、通過注射、或通過植入物的手段，所述植入物是多孔的、非多孔的或膠狀材料，包括膜，比如矽橡膠膜或纖維。優選地，當施用本發明的分子時，必須注意使用不吸收該分子的材料。
本發明的組合物可在泡狀體(vesicle)，尤其是脂質體中遞送(見Langer (1990)“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)；Treat等, 在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein和Fidler (編輯), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989)中；Lopez-Berestein, 同上, pp. 3 17-327)。
本發明的組合物可以在控釋或緩釋系統中遞送。本領域技術人員已知的任何技術均可用於產生包括本發明的一種或多種B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的緩釋製劑。見，例如，美國專利號4,526,938；PCT公開WO 91/05548；PCT公開WO 96/20698；Ning等(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained‑Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179‑189；Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‑Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‑760，其每一篇通過引用以其整體併入本文。在一個實施方式中，泵可用於控釋系統(見Langer,上文 ；Sefton, (1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240；Buchwald等(1980)“Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516；和Saudek等(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med. 321:574-579)。在另一實施方式中，聚合材料可用于實現分子的控釋(見例如，Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Levy等(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science 228:190-192；During等(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356；Howard等(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105-112)；美國專利號5,679,377、美國專利號5,916,597、美國專利號5,912,015、美國專利號5,989,463、美國專利號5,128,326、PCT公開號WO 99/15154和PCT公開號WO 99/20253)。緩釋製劑中所用的聚合物的實例包括但不限於聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoester)。控釋系統可接近治療靶(例如，肺)佈置，因此僅僅需要全身劑量的一部分(見，例如，Goodson, 在以下中：Medical Applications of Controlled Release,上文 , vol. 2，pp. 115-138 (1984))。根據Dunn等 (見U.S. 5,945,155)，使用可用作控釋移植物的聚合物組合物。該特定方法基於聚合物系統中生物活性材料原位控釋的治療效果。移植可通常發生于患者身體內需要治療的任何地方。可使用非聚合物持續遞送系統，由此受試者身體內的非聚合物移植物被用作藥物遞送系統。一旦移植到身體中，移植物的有機溶劑會從組合物中消散、分散或滲漏到周圍組織流中，並且非聚合物材料會逐漸凝結或沉澱，形成固體微孔基質(見美國5,888,533)。
Langer的綜述中討論了控釋系統(1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)。可以使用本領域技術人員已知的任何技術來生產包含本發明的一種或多種治療劑的緩釋製劑。見，例如美國專利號4,526,938；國際公開號WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained‑Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179‑189；Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‑Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760，其每一篇文獻通過引用以其整體併入本文。
在本發明的組合物是編碼本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的核酸的情況下，核酸可被體內施用，以通過如下方式促進其編碼的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的表達：將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用其從而其成為細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic), Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑包被，或通過與已知進入核的同源框樣肽聯合施用(見例如，Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad.Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868)等。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表達。
用治療或預防有效量的本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體治療受試者可包括單治療，或優選地，可包括一系列治療。在優選的實施例中，用這類雙抗體治療受試者每週一次、每兩週一次(即，每隔一週一次)或每三週一次，持續約1至52周。本發明的藥物組合物可每天施用一次、每天施用兩次或每天施用三次。可選地，藥物組合物可每週施用一次、每週兩次、每兩週一次、每月一次、每六週一次、每兩個月一次、每年兩次或每年一次。也將認識到，用於治療的分子的有效劑量可隨著具體治療的療程而增加或降低。 VI. 本發明組合物的用途
本發明的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體具有共定位T細胞至表達B7-H3的細胞的能力，並且因此可用於治療任何與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況。因此，不受限制，包括這類分子的藥物組合物可用於診斷或治療癌症，包括特徵在於存在癌症細胞的癌症，所述癌症細胞包括但不限於下述的癌症的細胞：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、惡性膠質瘤、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎細胞癌、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌症、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症或子宮癌。
尤其地，本發明的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體可用於治療頭頸的磷狀細胞癌(SCCHN)、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、惡性膠質瘤、腎癌、肺癌，包括非小細胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎細胞癌和兒童的小圓藍細胞腫瘤(small round blue cell tumor)，包括成神經細胞瘤和橫紋肌肉瘤，其每種高度表達B7-H3。
本發明的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體可另外用於製造用於治療上述病況的藥物。
現已大體上描述了本發明，通過參考下述實施方式，其將更容易理解，所述實施方式通過示例的方式提供，不旨在限制本發明，除非指出。 本發明的實施方式
下面提供本發明某些實施方式的非限制性例子。
實施方式 1： 一種B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中所述雙特異性單價Fc雙抗體能夠特異性結合B7-H3的表位和結合CD3的表位元，並且具有IgG Fc結構域，其中所述雙特異性單價Fc雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合並且第一和第三多肽鏈彼此共價結合，和其中： I.第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： A.結構域IA，其包括： (1)亞結構域(IA1)，其包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )或結合CD3的VL結構域(VLCD3 )；和 (2)亞結構域(IA2)，其包括能夠結合B7-H3的VH結構域(VHB7-H3 )或結合CD3的VH結構域(VHCD3 )； 其中亞結構域IA1和IA2通過具有12個或更少的氨基酸殘基的多肽連接體彼此分開，並且被協同選擇，以便： (a)亞結構域IA1包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )和選擇亞結構域IA2，以包括能夠結合CD3的VH結構域(VHCD3 )；或 (b)亞結構域IA1包括能夠結合CD3的VL結構域(VLCD3 )和選擇亞結構域IA2，以包括能夠結合B7-H3的VH結構域(VHB7-H3 )；和 B.任選存在的結構域IB，其包括與異源二聚體促進結構域連接的多肽連接體； C.結構域IC，其包括與抗體的CH2-CH3結構域連接的多肽連接體； II.第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： A.結構域IIA，其包括： (1)亞結構域(IIA1)，其包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )或結合CD3的VL結構域(VLCD3 )和 (2)亞結構域(IIA2)，其包括能夠結合B7-H3的VH結構域(VHB7-H3 )或結合CD3的VH結構域(VHCD3 ) 其中亞結構域IIA1和IIA2通過具有12個或更少的氨基酸殘基的多肽連接體彼此分開，並且被協同選擇，以便： (a)當亞結構域IA1包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )時，選擇亞結構域IIA1，以包括能夠結合CD3的VL結構域(VLCD3 )和選擇亞結構域IIA2，以包括能夠結合B7-H3的VH結構域(VHB7-H3 )；和 (b)當亞結構域IA1包括能夠結合CD3的VL結構域(VLCD3 )時，則選擇亞結構域IIA1，以包括能夠結合B7-H3的VL結構域(VLB7-H3 )和選擇亞結構域IIA2，以包括能夠結合CD3的VH結構域(VHCD3 )； B.任選存在的結構域IIB，其包括與異源二聚體促進結構域連接的多肽連接體； III.第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括結構域IIIC，其包括與抗體的CH2-CH3結構域連接的多肽連接體； 其中： (A) (1)存在任選存在的結構域IB和任選存在的結構域IIB的至少一個，和其中存在的結構域IB或IIB具有正或負電荷；或 (2)存在任選存在的結構域IB和任選存在的結構域IIB兩者，其中： (i)結構域1B和結構域IIB之一具有帶正電荷的異源二聚體促進結構域，並且結構域1B和結構域IIB的另一個具有帶負電荷的異源二聚體促進結構域；或 (ii)結構域1B和結構域IIB之一具有包括氨基酸序列GVEPKSC (SEQ ID NO:6 )或VEPKSC (SEQ IDNO:7 )的異源二聚體促進結構域，並且結構域1B和結構域IIB的另一個具有包括氨基酸序列GFNRGEC (SEQ ID NO:8 )或FNRGEC (SEQ ID NO:9 )的異源二聚體促進結構域； (B) VLB7-H3 和VHB7-H3 相互作用形成能夠結合B7-H3的表位元的表位元結合結構域，和VLCD3 和VHCD3 形成能夠結合CD3的表位元的表位元結合結構域；和 (C)第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域形成能夠結合Fc受體的Fc結構域。
實施方式 2： 實施方式1所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其能夠與人和靈長類B7-H3和CD3交叉反應。
實施方式 3： 實施方式1或2所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中： (A) (1)結構域IB和IIB各自包括半胱氨酸殘基，其經二硫鍵將第一多肽鏈與第二多肽鏈共價結合；和 (2)結構域IC和IIIC各自包括半胱氨酸殘基，其經二硫鍵將第一多肽鏈與第三多肽鏈共價結合；或 (B) (1)多肽連接體，其將結構域IA2和IB分開，並且結構域IIA2和IIB各自包括半胱氨酸殘基，其經二硫鍵將第一多肽鏈與第二多肽鏈共價結合；和 (2)結構域IC和IIIC各自包括半胱氨酸殘基，其經二硫鍵將第一多肽鏈與第三多肽鏈共價結合。
實施方式 4： 實施方式1-3任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中： (A) VLB7-H3 具有氨基酸序列SEQ ID NO:17 和VHB7-H3 具有氨基酸序列SEQ ID NO:21 ；或 (B) VLB7-H3 具有氨基酸序列SEQ ID NO:25 和VHB7-H3 具有氨基酸序列SEQ ID NO:29 ；或 (C) VLB7-H3 具有氨基酸序列SEQ ID NO:33 和VHB7-H3 具有氨基酸序列SEQ ID NO:37 。
實施方式 5： 實施方式1-4任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中VLCD3 具有氨基酸序列SEQ ID NO:41 和VHCD3 具有氨基酸序列SEQ ID NO:45 或50 。
實施方式 6： 實施方式1-5任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中： (A)結構域IC的CH2-CH3結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:15 和結構域IIIC的CH2-CH3結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:16 ；或 (B)結構域IC的CH2-CH3結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:16 和結構域IIIC的CH2-CH3結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:15 。
實施方式 7: 實施方式1-6任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中： (A)將亞結構域IA1和IA2分開的多肽連接體具有氨基酸序列SEQ ID NO:1 ；和/或 (B)將亞結構域IIA1和IIA2分開的多肽連接體具有氨基酸序列SEQ ID NO:1 。
實施方式 8： 實施方式1-7任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中： (A)結構域IB的異源二聚體促進結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:10 和結構域IIB的異源二聚體促進結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:11 ；或 (B)結構域IB的異源二聚體促進結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:11 和結構域IIB的異源二聚體促進結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:10 ；或 (C)結構域IB的異源二聚體促進結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:12 和結構域IIB的異源二聚體促進結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:13 ；或 (D)結構域IB的異源二聚體促進結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:13 和結構域IIB的異源二聚體促進結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:12 。
實施方式 9： 實施方式1-8任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中： (A)將結構域IB和IA分開的多肽連接體具有氨基酸序列SEQ ID NO:2 或3 ；和/或 (B)將亞結構域IIB和IIA分開的多肽連接體具有氨基酸序列SEQ ID NO:2 或SEQ ID NO:3 。
實施方式 10： 實施方式1-9任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中結構域IC進一步包括多肽連接體，其將CH2-CH3結構域與結構域IB分開，並且其中結構域IIIC進一步包括在CH2-CH3結構域的N-末端的多肽連接體。
實施方式11： 實施方式10所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中結構域IC和IIC的多肽連接體具有氨基酸序列SEQ ID NO:4 或5 。
實施方式 12： 實施方式1-11任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中： (A)第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:53 ，第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:55 ，並且第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 ；或 (B)第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:59 ，第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:60 並且第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 ；或 (C)第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:61 ，第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:62 ，並且第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 ；或 (D)第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:63 ，第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:64 ，並且第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 。
實施方式 13： 實施方式1-12任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其能夠在採用選自下述的靶人類腫瘤細胞系的試驗中使用人T細胞介導對靶腫瘤細胞的重定向殺傷：A498 (腎癌)、JIMT-1/Luc (乳腺癌)、A375 (黑素瘤)、22Rv1 (前列腺癌)、Detroit562 (鼻咽癌)、DU145 (前列腺癌)；BxPC3 (胰腺癌)、SKMES-1 (肺癌)和U87 (惡性膠質瘤)，並且使用純化的人原代T細胞作為效應細胞，效應細胞與T細胞之比是1:1、5:1或10:1，其中觀察到的這種重定向殺傷的EC50是約1.5 μg/mL或更少、約1.0 μg/mL或更少、約500 ng/mL或更少、約300 ng/mL或更少、約200 ng/mL或更少、約100 ng/mL或更少、約50 ng/mL或更少。
實施方式14： 實施方式13所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中使用乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗測量靶腫瘤細胞殺傷，在所述試驗中定量測量細胞死亡後從細胞釋放的LDH的酶活性，或通過螢光素酶試驗測量靶腫瘤細胞殺傷，其中螢光素酶相對光單位(RLU)是指示Raji/GF靶細胞的相對生活力的讀數，所述靶細胞已經被工程化，以表達綠色螢光蛋白(GFP)和螢光素酶報告基因。
實施方式 15： 實施方式1-14任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其能夠在共混異種移植物仲介導對人腫瘤生長的抑制，其中這類分子連同22Rv1 (人前列腺癌)或A498 (人腎癌)腫瘤細胞和啟動的人T細胞以5:1的比例被引入到NOD/SCID小鼠中。
實施方式16： 實施方式1-15任一項所述的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其能夠在雌性NSG B2m-/-小鼠中的異種移植模型仲介導對人腫瘤生長的抑制和/或展示抗腫瘤活性，所述雌性NSG B2m-/-小鼠： (A)在第-1天通過腹腔內(IP)注射而植入人PBMC (1 x 107 )和在第0天皮內(ID)植入Detroit (人鼻咽癌腫瘤細胞(5 x 106 )，並且在第20、22、23、26、28、30、33、35和37天施用雙抗體；或 (B)在第0天皮內(ID)植入A498 (人腎癌腫瘤細胞(5 x 106 )，和在第13天通過腹腔內(IP)注射而植入人PBMC (1 x 107 )，並且在第33、35、36、39、41、43、46、48和50天施用雙抗體。
實施方式17： 實施方式15或16所述的B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中當以大於約0.5 mg/kg的濃度、以約0.5 mg/kg的濃度，以約0.2 mg/kg的濃度、以約0.1 mg/kg的濃度、以約0.05 mg/kg的濃度、以約0.02 mg/kg的濃度、以約0.01 mg/kg的濃度，或以約0.005 mg/kg的濃度，或以小於0.005 mg/kg的濃度提供時，所述B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體抑制腫瘤生長和/或展示抗腫瘤活性。
實施方式18： 實施方式1-17任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其用作藥物。
實施方式19： 一種藥物組合物，其包含實施方式1-17任一項所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和生理學上可接受的載體。
實施方式20： 實施方式19所述的藥物組合物在治療與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況中的用途。
實施方式 21： 實施方式20所述的用途，其中所述與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況是癌症。
實施方式 22： 實施方式21所述的用途，其中所述癌症的特徵在於存在選自下述的細胞的癌症細胞：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、惡性膠質瘤、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎細胞癌、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌症、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。
實施方式23： 實施方式22所述的用途，其中所述癌症選自：膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、惡性膠質瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸的鱗狀細胞癌(SCCHN)。
實施方式24： 實施方式21-23任一項所述的用途，其中B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體每兩週一次施用至受試者(即，每隔一週一次)。
實施方式25： 實施方式24所述的用途，其中B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體以0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、1.3 μg/kg、3 μg/kg、10 μg/kg、30 μg/kg、或100 μg/kg受試者的基線體重的劑量被施用。
現已大體上描述了本發明，通過參考下述實施例，其將更容易被理解，所述實施例通過示例方式提供，而不旨在限制本發明，除非具體指出。 實施例
下述實施例闡釋了組合物在本發明的診斷或治療方法中的各種方法。實施例旨在是闡釋性的，而決不限制本發明的範圍。 實施例1結合親和力
通過BIACORETM 分析來評估若干示例性B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(DART-A 、DART-B 和DART-C) 與人或食蟹猴B7-H3的結合亲和力。BIACORETM 分析測量解離速率(dissociation off-rate)kd。抗體和其靶之間的結合親和力(KD)是根據式：KD = [kd]/[ka]的對於締合(結合速率，ka)和解離(解離速率，kd)的動力學常數的函數。BIACORE™分析使用表面等離子體共振，以直接測量這些動力學參數。
通過表面等離子體共振(SPR)技術(BIAcore)分析的DART-A、DART-B和DART-C與人和食蟹猴B7-H3的結合的結果顯示在表 2 中。 n.d.——未進行-BIAcore分析
DART-A的結合親和力對於人和食蟹猴B7-H3是類似的(分別為KD = 24.6 nM和30.2 nM)。DART-B對於人B7-H3的結合親和力是對於食蟹猴B7-H3的親和力的三倍以內(分別為KD = 3.2 nM和8.9 nM)。但是，相比DART-A，DART-B對於人B7-H3具有約8倍的親和力(分別為KD = 3.2 nM和24.6 nM)。類似地，相比DART-A，DART-C對於人B7-H3具有約15倍的親和力。DART-D包括與DART-C相同B7-H3結合結構域，並且預期對於B7-H3具有相同的結合親和力。在其他研究中，顯示DART-C和DART-D的B7-H3結合結構域結合食蟹猴B7-H3。對於人和食蟹猴CD3的結合親和力(KD)幾乎相同(~14 nM)。鑒於對於人和食蟹猴B7-H3類似的結合親和力，食蟹猴是用於毒理學評估的相關物種。 實施例2腫瘤細胞系上 B7-H3 表達的 FACS 分析
評估源自不同人組織腫瘤類型的一組腫瘤細胞系的B7-H3表達，以便鑒定適當的靶細胞系，用於評估示例性B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的生物學活性。圖 3 顯示了在各種癌症細胞系上檢測的抗B7-H3-PE抗體結合的FACS柱狀圖。基於抗B7-H3-PE抗體結合的螢光強度，確認了九個細胞系對於B7-H3表達是陽性的，並且顯示一定範圍的B7-H3表達水準。具有最高B7-H3表達的細胞系是：A498 (腎癌) (圖 3A )、JIMT-1/Luc (乳腺癌) (圖 3B )和A375 (黑素瘤) (圖 3C )；中等B7-H3表達：22Rv1 (前列腺癌) (圖 3D )、Detroit562 (鼻咽癌) (圖 3E )和DU145 (前列腺癌) (圖 3F )；和低B7-H3表達：BxPC3 (胰腺癌) (圖 1G )、SKMES-1 (肺癌) (圖 3H )和U87 (惡性膠質瘤) (圖 3I )。利用使用的抗B7-H3-PE抗體，Raji細胞(已知對於B7-H3表達是陰性的B-淋巴瘤細胞系)未顯示任何螢光(圖 3J )。在評估的細胞系組上的B7-H3表達的範圍提供了表徵B7-H3 X CD3雙特異性單價Fc雙抗體(例如，DART-A)對於以各種水準的靶密度和源自不同人組織的腫瘤細胞系的生物學活性的基礎。 實施例3與 B7-H3 陽性癌症細胞系和表達 CD3 的 T 細胞的結合
檢測示例性B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體它們的雙特異性結合能力。通過FACS分析評估四種表達B7-H3的腫瘤細胞系(A948、JIMT-1/Luc、Detroit562和22Rv1)和人原代T細胞的DART-A細胞表面結合。因為DART-A結合CD3，不使用CD3作為T細胞的標記物，取而代之地，使用CD4和CD8的組合作為T細胞標記物。因此，在該研究中，當使用原代人白細胞時，組合的CD4+加CD8+設門的(gated)事件表示T細胞群體。
在用10 µg/mL的DART-A孵育之後，使用識別DART-A蛋白質的E-螺旋/K-螺旋(EK)異源二聚體促進結構域的抗EK-螺旋抗體檢測靶癌症細胞系和T細胞上結合細胞的DART-A。DART-A顯示對表達人B7-H3的腫瘤細胞(圖 4A-4D )和表達CD3的T細胞(圖 4E )的結合。在類似的研究中，發現DART-B、DART-C和DART-D也具有雙特異性結合能力。 實施例4以純化的人 T 細胞作為效應細胞對多種靶癌症細胞系的 CTL 活性
在確認與表達CD3的T細胞和表達B7-H3的腫瘤細胞二者的結合之後(見實施例 3 )，使用9種人腫瘤細胞系(A498、JIMT-1/Luc、A375、U87，DU145、BxPC-3、SKMES-1、Detroit562和22Rv1)作為靶細胞和正常人T細胞作為效應細胞，體外評估B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體-介導的對表達B7-H3的靶細胞的重定向T細胞殺傷。使用定量測量LDH的酶活性的LDH釋放試驗測定細胞毒性，LDH是在細胞死亡後從細胞釋放的一種穩定的細胞溶質酶。因為LDH試驗測量來自包含靶細胞和效應細胞的孔的上清液中的LDH活性，因此存在來自效應細胞死亡的干擾的可能性。因此，為了確認在LDH釋放試驗中測量的細胞毒性對B7-H3 xCD3雙特異性單價Fc雙抗體-介導的對靶細胞的重定向殺傷是特異性的，還利用發光(LUM)試驗評估細胞毒性。在該試驗形式中，測量被轉染和選擇來穩定表達螢光素酶基因的靶細胞(JIMT-1/Luc細胞)的螢光素酶活性，並且用於計算在試驗結束時殘留的有生活力的靶細胞。FITC x CD3雙特異性單價Fc雙抗體(命名為“對照 DART ”)在這些研究中用作對照蛋白質。FITC x CD3雙特異性單價Fc雙抗體是一種抗螢光素(FITC) x抗CD3雙抗體蛋白，其中抗CD3結合組分與B7-H3 xCD3雙特異性單價Fc雙抗體中的相同，但是抗FITC組分代表不相干的結合靶。因此，FITC xCD3雙特異性單價Fc雙抗體將接合(engage)T細胞上的CD3，但是預期不將它們與靶細胞共接合。使用GraphPad Prism 6軟體，通過將資料擬合至3-參數sigmoidal劑量回應函數的曲線測定EC50值。
使用純化的人T細胞作為效應細胞(E:T細胞比= 5:1)，DART-A介導對表達B7-H3的靶細胞有效的、特異性的、重定向殺傷。利用代表性供體T細胞，對靶細胞的DART-A劑量依賴性殺傷顯示在圖 5A-5J 中，並且EC50值和最大細胞毒性百分數(Emax)呈現在表 3 中。在評估的9種靶細胞系中觀察到範圍從47至1275 ng/mL的DART-A EC50濃度，其中JIMT-1/Luc是最敏感的細胞系(EC50 = 47 ng/mL)。使用特異性測量存活的JIMT-1/Luc靶細胞的LUM試驗觀察到幾乎全部的腫瘤細胞殺傷(見圖 5C )。DART-A活性一般與B7-H3表達相關，因為對於具有更高B7-H3表達的靶細胞系觀察到更低的EC50值。在評估的最高濃度(10,000 ng/mL)，用對照DART觀察到最小活性或沒有觀察到活性。B7-H3陰性CHO細胞(圖 5K )或Raji細胞(圖 5L )中在存在DART-A的情況下沒有觀察到細胞毒性，確認了DART-A活性對於表達B7-H3的靶細胞的特異性。
使用許多不同靶細胞系，包括A498和JIMT-1，用DART-C和DART-D進行類似的研究，表明這兩種分子具有類似的最大裂解水準(Emax)，但是在介導重定向細胞殺傷方面，其效力平均是DART-A的20倍。也使用許多不同的靶細胞系包括A498、THP-1和DU145測試了DART-B，其效力平均是DART-A的6倍。 實施例5DART-A 在不同效應細胞 : 靶細胞 (E:T) 比的 CTL 活性
為了證明E:T細胞比與B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體-介導的重定向殺傷的關係，以10:1 (圖 6A 和 6B )、5:1 (圖 6C 和 6D )和1:1 (圖 6E 和 6F )的E:T細胞比，在使用A498 (圖 6A ， 6C 和 6E )和A375 (圖 6B ， 6D 和 6F )靶細胞和純化的人T細胞作為效應細胞的LDH試驗中，進一步評估DART-A的CTL活性。DART-A在10:1 (圖 6A 和 6B )的E:T細胞比顯示最高的效力(EC50)和最大的細胞毒性百分數(Emax)，並且效力和最大細胞毒性隨著E:T細胞比的下降而降低(圖 6A-6F 和表 4 )。但是，甚至在評估的最低E:T細胞比(1:1)觀察到了特異性活性，儘管程度較低 (圖 6E 和 6F 和表 4 )。 實施例6B7-H3 x CD3 雙特異性單價 Fc 雙抗體 - 介導的 T 細胞啟動取決於靶細胞接合 (engagement)
在人T細胞中(單獨地或在存在表達B7-H3的靶細胞(A498)的情況下)以10:1的E:T細胞比，評估B7-H3 xCD3雙特異性單價Fc雙抗體誘導的T細胞啟動的水準。使用DART-A的這些研究的結果顯示在圖 7 中。流式細胞術分析揭示，在存在表達B7-H3的靶細胞(圖 7B-7D )的情況下，CD4+ (圖 7B 和 7D )和CD8+ (圖 7C 和 7E ) T細胞亞組上CD25 (圖 7B 和 7C )和CD69 (圖 7D 和 7E ) T細胞啟動標記物通過DART-A以劑量依賴性方式上調。DART-A-介導的T細胞啟動與靶細胞的細胞毒性相關(圖 7A )。
在使用DART-A或對照DART的所有評估的濃度，在不存在表達B7-H3的靶細胞(圖 7B-7E )的情況下，僅僅用T細胞沒有觀察到T細胞啟動。這些資料提示，B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體比如DART-A介導的T細胞啟動依賴於效應細胞—靶細胞共接合。此外，在CTL試驗中，當單獨的T細胞與DART-A (圖 7B-7E )或對照DART 孵育時，沒有觀察到細胞毒性。相反，在存在靶細胞的情況下觀察到顯著的DART-A-介導的細胞毒性 (圖 7A )。在使用DART-B、DART-C或DART-D進行的類似的研究中發現了相當的結果。 實施例7當靶細胞共接合時， B7-H3 x CD3 雙特異性單價 Fc 雙抗體 - 介導的 T 細胞增殖
先前已經報導了與雙特異性抗體誘導的CTL活性相關的T細胞擴展(expansion)(Klinger M等 (2012) “Immunopharmacologic Response Of Patients With B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia To Continuous Infusion Of T Cell-Engaging CD19/CD3-Bispecific BiTE Antibody Blinatumomab ,” Blood 119(26):6226-6233)。因此，在觀察到用 B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的治療導致伴隨T細胞啟動標記物增加的靶細胞的劑量依賴性消耗之後，評估用靶細胞和B7-H3 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體培養的T細胞的擴展。為了這樣做，用CFSE標記人PBMC並且與A498靶細胞以 10:1的E:T細胞比在存在濃度為10 μg/mL的DART-A或對照DART的情況下共培養72或96小時。由於每次細胞分裂使後代細胞中包含的染料的水準減半，因此通過經FACS分析測量CFSE隨著時間推移的水準而監測CFSE標記的T細胞的增殖。圖 8A (72小時)和圖 8B (96小時)顯示，在存在DART-A或對照DART和靶細胞的情況下開始共培養之後孵育之後的CFSE-染色曲線。DART-A的存在導致CFSE標記的T細胞的增殖，其中在孵育72小時之後增殖的百分數是約45% (圖 8A )和96小時之後是約73% (圖 8B )。相反，在存在對照DART的情況下沒有觀察到CFSE標記的T細胞的增殖(圖 8A 和 8B )。 實施例8與人和食蟹猴表達 B7-H3 的 CHO 細胞的結合和重定向殺傷的表徵
為了確認DART-A與食蟹猴B7-H3的交叉反應能力，通過流式細胞術評估用人B7-H3 (huB7-H3-CHO) (圖 9A )或食蟹猴B7-H3 (cyno-B7-H3-CHO) (圖 9B ) 轉染的CHO細胞的DART-A結合。從10μg/mL開始，用5倍降低濃度的DART-A或對照DART蛋白質處理細胞，並且使用抗EK-螺旋抗體檢測結合細胞的DART-A。圖 9A 和9B 分別顯示了DART-A與表達人B7-H3的和表達食蟹猴B7-H3的CHO細胞的濃度依賴性結合。
為了使用表達人B7-H3或食蟹猴B7-H3的CHO細胞評估B7-H3 xCD3雙特異性單價Fc雙抗體-介導的重定向殺傷，用不同濃度的 DART-A在存在人T細胞的情況下以5:1的E:T細胞比孵育細胞。如圖 9C 和9D 中顯示，對於表達食蟹猴(圖 9C )和人(圖 9D ) B7-H3的CHO細胞，都觀察到了有效的DART-A-介導的殺傷。 實施例9以食蟹猴 PBMC 作為效應細胞， B7-H3 X CD3 雙特異性單價 Fc 雙抗體 - 介導的對靶細胞的重定向殺傷
通過流式細胞術評估與食蟹猴T細胞的DART-A結合，其中DART-A的結合描繪在設門的CD4+和CD8+ T細胞群體中。與食蟹猴T細胞(圖 10A )的DART-A結合和與人T細胞(圖 10B )的結合類似。
在確認了DART-A與食蟹猴T細胞的交叉反應性之後，使用食蟹猴PBMC評估DART-A-介導的離體CTL活性。將DART-A或對照DART添加至與表達B7-H3的靶細胞(JIMT-1/Luc (圖 11A 和11B )或A498 (圖 11C ))混合的食蟹猴PBMC中，E:T細胞比是30:1，並且孵育24小時。如圖 11A-11C 中顯示，使用食蟹猴PBMC作為針對表達人B7-H3的靶細胞系的效應細胞觀察到劑量依賴性DART-A-介導的離體細胞毒性。 實施例1022Rv1 人前列腺癌的共混異種移植模型
根據RosetteSep T細胞分離試劑盒(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)中提供的製造商的方案，從肝素化全血分離人T細胞。隨後通過將細胞暴露於抗CD3 (OKT-3；1 µg/mL)和抗CD28 (66 µg/mL)抗體或暴露於抗CD3/CD28  Dynabeads  (1:1比例) 達48小時的時間而啟動純化的T細胞。刺激之後，使細胞在具有10% FBS和1%青黴素/鏈黴素的RPMI 1640培養基中在存在IL2 (7.6 ng/mL)的情況下生長多達3周。
將人T細胞(1 x 106 )和22Rv1腫瘤細胞(5 x 106 )組合，並且在再懸浮在200 µL的Ham’s F12培養基中之後，在第0天皮下(SC)注射。在22Rv1腫瘤細胞和T細胞植入之後，用媒介對照(●)、對照DART (0.5 mg/kg) (○)或DART-A以4種不同的劑量水準(0.004 (♦)、0.02 (▼)、0.1 (▲)或0.5 (■) mg/kg) IV處理小鼠，每天一次，持續 4天，從腫瘤細胞植入的當天開始(第0、1、2和3天)。
如圖 12 中所顯示，在第0天至3天以0.1 (▲)或0.5 (■) mg/kg的劑量水準每天一次用DART-A經IV治療之後，22Rv1腫瘤細胞的生長被延遲和抑制。儘管在0.02 mg/kg (▼) DART-A劑量水準，腫瘤生長被部分抑制，但是未達到顯著水準。在0.004 mg/kg (♦) DART-A劑量水準沒有記錄到腫瘤生長的抑制。 實施例11A498 人腎癌的共混異種移植模型
如上分離和製備人T細胞。將人T細胞(1 x 106 )和A498腫瘤細胞(5 x 106 )組合，並且在再懸浮在200 µL的Ham’s F12 培養基中之後，在第0天SC注入。在A498腫瘤細胞和T細胞植入之後，用媒介對照(●)、對照DART (0.5 mg/kg) (○)或DART-A以 4種不同的劑量水準(0.004 (♦)、0.02 (▼)、0.1 (▲)或0.5 (■) mg/kg)每天一次IV處理小鼠，持續4天，從腫瘤細胞植入當天開始(第0、1、2和3天)。
如圖 13 中所顯示，在存在啟動的人T細胞的情況下，甚至在對照動物中，在第0天注入的A498腫瘤細胞顯示一些初始腫瘤收縮(，是腫瘤適應體內環境的結果。但是，在稍後的時間點，在接收媒介對照(●)和對照DART (○)以及在第0、1、2和3天用0.004 (♦)或0.02 (▼) mg/kg DART-A每天治療一次的動物中，記錄到了活躍的腫瘤生長，與對照動物相比沒有腫瘤生長的抑制。在以0.1 (▲)或0.5 (■) mg/kg劑量水準的DART-A進行IV治療之後，腫瘤生長被延遲和抑制。 實施例12人 PBMC- 重構小鼠中建立的 A498 人腎癌模型
為了評估DART-A對NSG B2m-/-小鼠中建立的腫瘤異種移植物的活性，採用人效應細胞-重構的模型。該模型也提供這樣的環境：其中抗腫瘤活性取決於通過DART-A向建立的腫瘤募集植入的人T細胞。
雌性NSG B2m-/-小鼠(Jackson Laboratory)用於建立的腫瘤研究(n = 7-8/組)。採用I類MHC表達受損的β-2微球蛋白(B2m)敲除小鼠，以便延遲和最小化與移植人外周血液單核細胞(PBMC)相關的移植物抗宿主疾病(GVHD)的發生和嚴重程度。但是，應注意，這些小鼠中B2m表達的缺失也與FcRn的受損表達相關 (Israel, E.J.等 (1996) “Increased clearance of IgG in mice that lack beta 2-microglobulin: possible protective role of FcRn ,” Immunology 89: 573–578)。因此，預期DART-A在這些小鼠中的半衰期比在野生型小鼠或靈長類中的半衰期更短。基於之前在該小鼠品系中用包括人Fc區域的分子的研究，採用每2至4天一次的給藥頻率，以確保在這些研究中的充分暴露。
根據製造商的方案，使用Ficoll-Paque從肝素化全血中分離人PBMC。將A498腫瘤細胞(5 x 106 活力細胞)再懸浮在100 µL的Ham’s F12中，並且在第0天皮內(ID)注入，隨後在第13天腹腔內(IP)注射(200 µL，鹽水)人PBMC (1 x 107 活力細胞)。關於腫瘤細胞植入，PBMC接種的時機與腫瘤細胞的生長速度相關，並且憑經驗確定，以便獲得最佳的人效應細胞重構以及在隨機化和治療啟動時約150-300 mm3 的腫瘤尺寸。治療週期是在第33、35、36、39、41、43、46、48和50天，總共9個IV施用的劑量，包括媒介對照、對照DART (1 mg/kg)，或4種不同劑量水準的DART-A (0.001、0.01、0.1或1 mg/kg)。
在治療啟動前的第32天，A498腫瘤已經達到平均約250 mm3 的體積(圖 14 )。在接受1 mg/kg (■) DART-A的組中，腫瘤體積從在第32天的242 ± 19 mm3 退化至第39天的106 ± 35 mm3 。在接受0.1 mg/kg (▲) DART-A的組中，腫瘤體積減少較小(249 ± 25至181 ± 87 mm3 )，而在0.01 mg/kg (▼) 組中，在相同的間隔(第32天至第39天)記憶體在白細胞淤積的階段。在1 mg/kg (■) DART-A組中，5/7的動物中腫瘤生長繼續退化，但是在研究結束時(第53天)，在剩餘的2個動物中復發。研究結束時，在0.1 (▲)和0.01 (▼) mg/kg組中，腫瘤生長分別在5/7和4/7動物中保持退化。腫瘤生長的發展對於所有用 0.001 (♦) mg/kg DART-A治療的動物是明顯的。用媒介對照(●)或對照DART (○)沒有記錄到對腫瘤生長的作用。
人PBMC-重構的小鼠中的A498人腎癌模型也用於評估以0.02、0.1或0.5 mg/kg給與的DART-B、對照DART (0.5 mg/kg)或媒介對照的活性。用DART-B治療的動物在所有劑量均顯示實質性的腫瘤生長的抑制，而用媒介對照或對照DART沒有記錄到對腫瘤生長的作用。 實施例13人 PBMC- 重構的小鼠中建立的 Detroit562 人鼻咽癌模型
如上述製備人PBMC。將Detroit562腫瘤細胞(5 x 106 活力細胞)再懸浮在100 µL的Ham’s F12中，並且在第0天ID注入。在NSG B2m-/-小鼠中，在腫瘤細胞植入前一天，第-1天，通過IP注射 (200 µL，鹽水)植入人PBMC (1 x 107 活力細胞)。治療週期是在第20、22、23、26、28、30、33、35和37天，總共9個IV施用的劑量，並且包括媒介對照、對照DART (0.5 mg/kg)，或4種不同劑量水準(0.1、0.25、0.5或1 mg/kg)的DART-A。
在治療啟動之前第19天，Detroit562腫瘤已經達到約150 mm3 的腫瘤體積 (圖 15 )。以1 (■)、0.5 (▲)和0.25 (▼) mg/kg劑量水準接受DART-A的組中的腫瘤的尺寸在治療期間下降，其中對於0.25 (▼) mg/kg組，在第27天達到最低點(106 ± 21 mm3 ) (圖 15 )。對於1 (■)和0.5 (▲) mg/kg組，在研究的最後一天，第37天，觀察到最大的腫瘤減小，其中平均腫瘤體積分別是32 ± 6和47 ± 7 mm3 (圖 15 )。在0.1 (♦) mg/kg DART-A組中，對於最大腫瘤體積(258 ± 37 mm3 )觀察到降低的腫瘤生長，其與研究結束時(第37天)對照DART (○) (347 ± 36 mm3 )和媒介(390 ± 42 mm3 )組的相比降低(圖 15 )。 實施例14人 PBMC- 重構的小鼠給藥研究中建立的 Detroit562 人鼻咽癌模型
為了評估DART-A對MHCl1-/-小鼠中建立的腫瘤異種移植物的活性，採用人效應細胞-重構的模型。該模型也提供這樣的環境：其中抗腫瘤活性取決於通過DART-A向建立的腫瘤募集植入的人T細胞。在這些研究中，檢驗每週一次和每兩週一次(即，每隔一週一次)給藥方案。
如上述製備人PBMC。將Detroit562腫瘤細胞(5 x 106 活力細胞)再懸浮在50 µL的Ham’s F12培養基中，並且與50 μL的基質膠組合，並且然後在第0天皮內(ID)注入。在第0天，在 MHCl1-/-小鼠中，通過IP注射(200 µL，Ham’s F12培養基)植入人PBMC (1 x 107 活力細胞)。治療週期在第15天啟動。在第15、22、29、36和43天，組I小鼠被施用DART-A (0.5 mg/kg)，每週一次(Q1W)，總共5個IV施用的劑量。在第15、29和43天，組II小鼠被施用DART-A (0.5 mg/kg)，每兩週一次(Q2W)，總共3個IV施用的劑量。媒介對照動物每週一次給藥。
在治療啟動之前的第14天，Detroit562腫瘤的範圍是200.49 ± 15.58 mm3 至287.5 ± 48.79 mm3 。與媒介處理的動物(●) (圖 16A 和16B )相比，組I和II (▲)中的DART-A處理的動物中腫瘤的尺寸在治療期間下降。在組I中，DART-A處理的動物，在第45天，對於[最大]腫瘤體積(24.3 ± 9.5 mm3 )觀察到降低的腫瘤生長，其與用媒介處理的動物在第31天(801.9 ± 155.5 mm3 )的相比降低(圖 16A )。在組II中，DART-A處理的動物，對於[最大]腫瘤體積(47.6 ± 28.5 mm3 )觀察到降低的腫瘤生長，其與用媒介處理的動物在第31天(801.9 ± 155.5 mm3 )的相比降低(圖 16B )。 實施例15食蟹猴中的毒代動力學研究
在食蟹猴中進行DART-A、DART-B、DART-C或DART-D的三個非GLP的初步探索性給藥研究。在一個劑量遞增研究中，兩組食蟹猴(n = 2/組；1M/1F)被施用0.5 mg/kg的一個劑量，然後被施用三個每週一次劑量的1.0 mg/kg的DART-A或DART-B。對於任一組均沒有明顯的發現，儘管在輸注之後觀察到了IL-6水準暫態增加。沒有與增加的細胞因數水準相關的明顯臨床觀察。在研究過程期間檢驗DART-A和DART-B的血清濃度(圖 17 )。如圖 17 中顯示，兩種分子都展示可接受的藥代動力學曲線。DART-A的血清水準在研究期間顯示較少的變化。
在單劑量研究中，兩組食蟹猴(n = 2/組；1M/1F)被施用一個劑量的0.5 mg/kg的DART-D，或一個劑量的0.5 mg/kg，然後三個每週一次劑量的1.0 mg/kg的對照DART。用0.5 mg/kg的DART-D處理的兩組動物展示異常的臨床信號。在進一步的研究中，四組食蟹猴(n = 2/組；1M/1F)被施用四個每週一次劑量的0.075、0.15或0.3 mg/kg的DART-D，或被施用四個每週一次劑量的0.5 mg/kg的DART-C。在這些研究中，所有劑量均是耐受的。但是，在0.15和0.3 mg/kg的DART-D，和0.5 mg/kg的DART-C，對於血小板水準存在明顯的暫態作用。
本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，達到如同具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的相同程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步修改，並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理並且包括與本公開的偏離的本發明的任何變型、用途或改變，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且如可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。
無
圖 1 圖解了包括兩條多肽鏈的共價締合的雙特異性單價雙抗體的結構，其不包括Fc區域。多肽鏈經在半胱氨酸(“C”)殘基之間形成的二硫鍵彼此共價締合。
圖 2A 和 2B 闡釋了本發明的三鏈雙特異性單價Fc雙抗體的第一、第二和第三多肽鏈的兩種形式的結構(形式1，圖 2A ；形式2，圖 2B )。多肽鏈經在半胱氨酸(“C”)殘基之間形成的二硫鍵彼此共價締合。
圖 3A-3J 顯示了A498 (腎癌) (圖 3A )、JIMT-1/Luc (乳腺癌) (圖 3B )、A375 (黑素瘤) (圖 3C )、22Rv1 (前列腺癌) (圖 1D )、Detroit562 (鼻咽癌) (圖 1E )、DU145 (前列腺癌) (圖 3F )、BxPC-3 (胰腺癌) (圖 3G )、SKMES-1 (肺癌) (圖 3H )、U87 (惡性膠質瘤) (圖 3I )和Raji (B-淋巴瘤) (圖 3J )細胞系的FACS柱狀圖。虛線表示用同種型對照PE標記的抗體染色的細胞和實線表示用抗B7-H3-PE抗體染色的細胞。
圖 4A-4E 顯示在表達B7-H3的靶癌症細胞系(圖 4A-4D )或人原代T細胞(圖 4E )上的抗EK-螺旋抗體螢光的FACS柱狀圖。將濃度為10 µg/mL的DART-A添加至表達B7-H3的癌症細胞系(A498 (圖 4A )、JIMT-1/Luc (圖 4B )、Detroit562 (圖 4C )或22Rv1 (圖 4D ))或人原代T細胞(圖 4E )，並且孵育30分鐘。在進一步用與APC-鏈黴抗生物素混合的綴合生物素的抗EK-螺旋抗體孵育之後，通過FACS分析細胞的DART-A細胞表面結合。實線表示細胞上的DART-A結合曲線。來自綴合生物素的抗EK-螺旋抗體的細胞上的非特異性染色通過虛線顯示。
圖 5A-5L 顯示對於表達B7-H3的細胞系(A498 (圖 5A )、JIMT-1/Luc (圖 5B-5C )、A375 (圖 5D )、U87 (圖 5E )、DU145 (圖 5F )、BxPC-3 (圖 5G )、SKMES-1 (圖 5H )、Detroit562 (圖 5I )和22Rv1 (圖 5J ))和B7-H3陰性細胞系(CHO (圖 5K )和Raji (圖 5L ))，DART-A-介導的細胞毒性的劑量回應曲線。以5:1的效應細胞:靶細胞(E:T)比，將DART-A或對照DART與不同的腫瘤細胞系和原代人T細胞體外一起孵育約24小時。使用LDH釋放試驗評估所有細胞系的細胞毒性百分數(圖 5A-5B 和5D-5L )。另外，使用LUM試驗測量對於JIMT-1/Luc細胞系的細胞毒性(圖 5C )。顯示了來自使用來自多個供體的T細胞的多個實驗的代表性資料。DART-A ： ● ；對照 DART ： ■ 。
圖 6A-6F 顯示了以10:1 (圖 6A 和 6B )、5:1 (圖 6C 和 6D )和1:1 (圖 6E 和 6F )的E:T比，DART-A-介導對A498細胞(圖 6A ， 6C 和 6E )和A375細胞(圖 6B ， 6D 和 6F )的重定向殺傷。通過LDH試驗測定細胞毒性。DART-A ： ● ；對照 DART ： ■ 。
圖 7A-7E 顯示了DART-A-介導的重定向靶細胞殺傷的劑量回應曲線(圖 7A )和在用純化的T細胞作為效應細胞和A498作為靶細胞以10:1的E:T細胞比孵育24小時之後，在CD4+ (圖 7B 和 7D )和CD8+ (圖 7C 和 7E ) T細胞上的T細胞啟動標記物CD25 (圖 7B 和 7C )和CD69 (圖 7D 和 7E )的誘導。DART-A ： ● ；對照 DART ： ■ 。 T 細胞 + A498 細胞： ▼ ；僅 T 細胞 ▲ 。
圖 8A-8B 顯示了在存在B7-H3陽性靶細胞的情況下DART-A-介導的T細胞增殖。在CFSE標記的人原代T細胞與A498靶細胞以10:1的E:T比在存在10 µg/mL的DART-A (粗線)或對照 DART (填充的細線)的情況下共培養72小時(圖 8A )或96小時(圖 8B )之後，通過FACS分析評估人原代T細胞的增殖。
圖 9A-9D 顯示了在用作為效應細胞的純化的人原代T細胞和表達B7-H3的CHO靶細胞以5:1的E:T細胞比孵育24小時之後，DART-A有效結合人(圖 9A )和食蟹猴(圖 9B )的表達B7-H3的CHO細胞並介導對人(圖 9C )和食蟹猴(圖 9D )的表達B7-H3的CHO細胞的重定向殺傷。使用LDH試驗測量細胞毒性。DART-A ： ● ；對照 DART ： ■ 。
圖 10A-10B 顯示了DART-A能夠結合食蟹猴和人原代T細胞。將10 µg/mL的DART-A添加至食蟹猴(圖 10A )或人(圖 10B ) PBMC並且將細胞在4℃孵育30分鐘，隨後用與APC-鏈黴抗生物素混合的綴合生物素的抗EK-螺旋抗體進行第二次孵育。通過FACS分析細胞在設門的總體組合的CD4+和CD8+細胞上的DART-A T細胞表面結合(粗線)。由細線/具有陰影的細線顯示在來自綴合生物素的抗EK-螺旋二抗的細胞上的非特異性染色。
圖 11A-11C 顯示，以30:1的E:T比使用食蟹猴PBMC，B7-H3陽性靶細胞系JIMT-1/Luc (圖 11A 和 11B )和A498 (圖 11C )的DART-A-介導的重定向殺傷。使用LUM試驗(圖 11A )或LDH試驗(圖 11B 和 11C )測量細胞毒性。DART-A ： ● ；對照 DART ： ■ 。
圖 12 顯示了在植入22Rv1腫瘤細胞的小鼠中在存在啟動的人T細胞的情況下DART-A對腫瘤生長的抑制。雌性NOD/SCID小鼠(n = 8/組)在第0天被SC植入與啟動的人T細胞(1 x 106 )共混合的22Rv1腫瘤細胞(5 x 106 )，隨後在第0、1、2和3天用媒介對照(●)、對照DART (○)或DART-A以0.5 mg/kg (■)，0.1 mg/kg (▲)，0.02 mg/kg (▼)或0.004 mg/kg (♦)治療總共4個IV施用的劑量。腫瘤體積顯示為組平均數± SEM。
圖 13 顯示了在植入A498腫瘤細胞的小鼠中在存在啟動的人T細胞的情況下DART-A對腫瘤生長的抑制。雌性NOD/SCID小鼠(n = 8/組)在第0天被SC 植入與啟動的人T細胞(1 x 106 )共混合的A498腫瘤細胞(5 x 106 )，隨後在第0、1、2和3天用媒介對照(●)、0.5 mg/kg的對照DART (○)或0.5 mg/kg (■)、0.1 mg/kg (▲)、0.02 mg/kg (▼)或0.004 mg/kg (♦)的DART-A治療總共IV施用的4個劑量。腫瘤體積顯示為組平均數± SEM。
圖 14顯示了DART-A在植入A498腫瘤細胞並且用人效應細胞重構的NSG B2m-/-小鼠中的抗腫瘤活性。雌性NSG B2m-/-小鼠(n = 7/組)在第0天被ID植入A498腫瘤細胞(5 x 106 細胞)，隨後在第13天被IP植入人PBMC (1 x 107 )。然後，用媒介對照(●)、0.5 mg/kg的對照DART (○)或1 mg/kg (■)、0.1 mg/kg (▲)、0.01 mg/kg (▼)或0.001 mg/kg (♦)的DART-A在第33、35、36、39、41、43、46、48和50天治療組。腫瘤體積顯示為組平均數± SEM。
圖 15 顯示了DART-A在植入Detroit562腫瘤細胞並且用人效應細胞重構的NSG B2m-/-小鼠中的抗腫瘤活性。雌性NSG B2m-/-小鼠(n = 8/組)在第0天被ID植入Detroit562腫瘤細胞(5 x 106 細胞)，而在第-1天被IP植入人PBMC (1 x 107 )。隨後，用媒介對照(●)、0.5 mg/kg的對照DART (○)或1 mg/kg (■)、0.5 mg/kg (▲)、0.25 mg/kg (▼)或0.1 mg/kg (♦)的DART-A在第20、22、23、26、28、30、33、35和37天治療組，達IV施用的總共9個劑量。腫瘤體積顯示為組平均數± SEM。
圖 16A-16B 顯示了DART-A在植入Detroit562腫瘤細胞並且用人效應細胞重構的NSG MHCl1-/-小鼠中的抗腫瘤活性。在第0天，MHCl1-/-小鼠(n = 7/媒介對照；7/組I；和5/組II)被ID植入Detroit562腫瘤細胞(5 x 106 細胞)並且被IP植入人PBMC (1 x 107 細胞)。隨後，用媒介對照(●)或0.5 mg/kg (▲)的DART-A治療組。組I (圖 16A )接受在第15、22、29、36和43天IV施用的5個劑量。組II (圖 16B )接受在第15、29和43天IV施用的3個劑量。腫瘤體積顯示為組平均數± SEM。
圖 17 顯示了DART-A和DART-B在食蟹猴中的藥物代謝動力學曲線。食蟹猴組(n = 2/組；1M/1F)被施用0.5 mg/kg的一個劑量，然後，被施用三個每週1.0 mg/kg劑量的DART-A或DART-B，總共IV施用的四個劑量。將研究期間四個測試動物中的每一個的DART-A (實線)和DART-B (虛線)的血清濃度繪圖。

Claims (24)

  1. 一種能夠特異性結合B7-H3和結合CD3的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中所述雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物，並且其中： (A)所述第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:53 ； (B)所述第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:55 ；和 (C)所述第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 。
  2. 一種藥物組合物，其包括請求項1所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和生理學上可接受的載體。
  3. 如請求項1所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體或請求項2所述的藥物組合物在治療與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況中的用途。
  4. 如請求項3所述的用途，其中所述與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況是癌症。
  5. 如請求項4所述的用途，其中所述癌症選自：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、惡性膠質瘤、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎細胞癌、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌症、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。
  6. 如請求項5所述的用途，其中所述癌症選自：膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、惡性膠質瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸的鱗狀細胞癌(SCCHN)。
  7. 一種能夠特異性結合B7-H3和結合CD3的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中所述雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物，並且其中： (A)所述第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:59 ； (B)所述第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:60 ；和 (C)所述第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 。
  8. 一種藥物組合物，其包括請求項7所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和生理學上可接受的載體。
  9. 如請求項7所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體或請求項8所述的藥物組合物在治療與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況中的用途。
  10. 如請求項9所述的用途，其中所述與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況是癌症。
  11. 如請求項10所述的用途，其中所述癌症選自：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、惡性膠質瘤、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎細胞癌、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌症、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。
  12. 如請求項11所述的用途，其中所述癌症選自：膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、惡性膠質瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸的鱗狀細胞癌(SCCHN)。
  13. 一種能夠特異性結合B7-H3和結合CD3的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中所述雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物，並且其中： (A)所述第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:61 ； (B)所述第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:62 ；和 (C)所述第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 。
  14. 一種藥物組合物，其包括請求項15所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和生理學上可接受的載體。
  15. 如請求項13所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體或請求項14所述的藥物組合物在治療與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況中的用途。
  16. 如請求項15所述的用途，其中所述與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況是癌症。
  17. 如請求項16所述的用途，其中所述癌症選自：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、惡性膠質瘤、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎細胞癌、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌症、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。
  18. 如請求項17所述的用途，其中所述癌症選自：膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、惡性膠質瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸的鱗狀細胞癌(SCCHN)。
  19. 一種能夠特異性結合B7-H3和結合CD3的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體，其中所述雙抗體包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物，並且其中： (A)所述第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:63 ； (B)所述第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:64 ；和 (C)所述第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:57 。
  20. 一種藥物組合物，其包括請求項19所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體和生理學上可接受的載體。
  21. 如請求項19所述的B7-H3x CD3雙特異性單價Fc雙抗體或請求項20所述的藥物組合物在治療與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況中的用途。
  22. 如請求項21所述的用途，其中所述與B7-H3的表達相關或特徵在於B7-H3的表達的疾病或病況是癌症。
  23. 如請求項22所述的用途，其中所述癌症選自：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、惡性膠質瘤、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎細胞癌、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌症、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。
  24. 如請求項23所述的用途，其中所述癌症選自：膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、惡性膠質瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸的鱗狀細胞癌(SCCHN)。
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