TW201718854A - 供ｐ２１基因調控之ＲＮＡ干擾劑 - Google Patents
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Abstract
本發明提供使用RNA干擾之用於調節人類p21表現之化合物、組成物及方法。該RNA干擾分子可用於預防或治療諸如惡性腫瘤之疾病的方法中。所提供者係一系列具有一或多個經修飾或化學修飾的核苷酸之siRNA結構。有利的結構包括位於種子區(seed region)之具有2'-去氧核苷酸的之siRNA及其他核苷酸修飾。
Description
本發明關於由基於核酸分子所組成之生物藥劑和治療劑的領域。更具體而言，本發明關於利用用於調控人類p21表現之RNA干擾(RNAi)的化合物和組成物。
本申請案包括以2015年12月23日所建立之ASCII檔案(命名為ND5123591WO_SL.txt)電子提交的序列表，其大小為31,127byte，且在此將其以整體引用方式併入本文。
p21蛋白是以CDKN1A基因編碼且屬於CIP/KIP家族的細胞周期調節蛋白。此蛋白藉由結合至周期蛋白-CDK複合體(cyclin-CDK complex)抑制該複合體的作用而具有在G1期和G2/M期抑制細胞周期進行的功能。具體地，p21基因經由p53(一種腫瘤抑制基因)
而活化。據報導，由於DNA損傷或等等因素使p53活化，p53活化p21，使得細胞周期在G1期和G2/M期停滯。
p21過度表現在多種人類癌症，包括前列腺癌、子宮頸癌、乳癌和鱗狀細胞瘤，而且在許多情況下，p21的向上調節(up-regulation)與腫瘤級數、侵入性和攻擊性成正相關。見，例如，Chang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,Vol.97,No.8,pp.4291-96。況且，p21的向上調節已經被報導與多種形式的癌症(包括腦、前列腺、卵巢、乳和食道細胞癌)的致腫瘤性和預後差有關。見，例如，Winters等人，Breast Cancer Research,2003,Vol.5,No.6,pp.R242-R249。且，該疾病可以是與年齡相關的疾病，包括動脈硬化、阿茲海默症、類澱粉沉著症和關節炎。見，例如，Chang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,Vol.97,No.8,pp.4291-96。
對用於調控與癌症相關的基因之表現的組成物及方法有迫切需要。用於抑制p21表現的治療劑需要高度有效的siRNA序列和結構。
所需要的是用於調控p21表現的siRNA序列、化合物和結構，與用於治療疾病(例如惡性腫瘤)的用途。
本發明關於使用RNA干擾以調控人類p21表現之化合物、組成物和方法。
在一些實施方案中，本發明提供用於p21之RNA干擾基因靜默的分子。
在進一步的實施方案中，本發明的結構、分子和組成物可以用於預防或治療與p21相關之疾病，或改善與p21相關之病況或病症的症狀(包括惡性腫瘤)之方法。
本發明的實施方案包括以下內容：用於抑制p21表現的核酸分子包含正義股和反義股，其中該等股形成雙股螺旋區(duplex region)。核酸分子可以具有一或多個在該雙股螺旋區經修飾或化學修飾的核苷酸。
在一些實施方案中，核酸分子可以具有經修飾或化學修飾的核苷酸，其為2'-去氧核苷酸、2'-O-烷基取代的核苷酸、2'-去氧-2'-氟代核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、鎖核苷酸或彼等之任意組合。
更具體而言，核酸siRNA分子可具有在多個位置具去氧核苷酸的反義股，該，該多個位置為下列者之一：從反義股5'端起算的位置4、6和8之各者；從反義股5'端起算的位置3、5和7之各者；從反義股5'端起算的位置1、3、5和7之各者；從反義股5'端起算的位置3至8之各者；或
從反義股5'端起算的位置5至8之各者。
在某些實施方案中，核酸siRNA分子可在雙股螺旋區具有一或多個2'-去氧-2'-氟代核苷酸。
本發明進一步提供了核酸分子，其可以低於50pM之IC 50抑制p21 mRNA的表現。
在某些實施方案中，在單次投予核酸siRNA分子之後，該分子可抑制體內至少25%之p21 mRNA的表現量(level)。
本發明的實施方案進一步提供含有核酸分子和醫藥上可接受之載劑(carrier)的醫藥組成物。在一些實施方案中，該載劑可以是脂質分子或微脂體。本發明還提供了包含該核酸siRNA分子之任一者的載體或細胞。
本發明亦設想藉由將含有該核酸siRNA分子之任一者的組成物投予至所需個體以用於治療疾病的方法。例如，該疾病可以是惡性腫瘤、癌症、細胞表現突變KRAS所引起之癌症、肉瘤或癌等。
本發明關於用於調控p21表現之基於核酸之治療劑的化合物、組成物和方法。
在一些實施方案中，本發明提供RNA干擾活性分子，以及可靜默p21表現的結構和組成物。
本揭示內容的結構和組成物可用於預防或治療多種疾病，諸如惡性腫瘤。
在進一步的實施方案中，本發明提供了用於遞送和吸收本發明的一種或多種治療性RNAi分子的組成物，以及其使用方法。本發明之基於RNA的組成物可用於預防或治療惡性腫瘤(諸如癌症)的方法中。
本發明的治療性組成物包括對RNA干擾具有活性的核酸分子。該治療性核酸分子可以靶向CDKN1A(P21)使基因靜默。
在各種不同的實施方案中，本發明提供了一系列可具有如小干擾RNA(siRNA)之活性並能調節或靜默p21表現之分子。
本發明的siRNA可用於預防或治療惡性腫瘤。
本發明的實施方案進一步提供用於遞送本發明之siRNA至需要預防或治療惡性腫瘤的個體之媒液(vehicle)、配方或脂質奈米粒子配方。本發明另外設想用於將作為治療劑的siRNA投予至哺乳動物的方法。
藉由將化合物或組成物投予至所需個體，本發明的治療性分子和組成物可用於對預防或治療與p21相關之疾病的RNA干擾。
本發明之方法可利用本發明之化合物以供預防或治療惡性腫瘤。惡性腫瘤可以呈現在各種疾病中，例如，高度表現的p21的癌症、肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉
瘤、骨肉瘤、癌、腦腫瘤、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、闌尾癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、肛門癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌、白血病、惡性淋巴瘤、上皮惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤。
在某些實施方案中，本發明之治療性分子的組合可用於靜默或抑制p21基因表現。
本發明提供了一系列的RNAi分子，其中每個分子具有多核苷酸正義股和多核苷酸反義股；分子之每股的長度為15至30個核苷酸；反義股之15至30個核苷酸的連續區域與編碼p21的mRNA序列互補；且至少一部分的正義股與少一部分的反義股互補，且該分子具有長度從15至30個核苷酸的雙股螺旋區。
本發明的RNAi分子可具有與編碼p21之mRNA序列互補之反義股的從15至30個核苷酸之連續區域，其位於該分子之雙股螺旋區。
在一些實施方案中，RNAi分子可以具有與編碼p21之mRNA序列互補之反義股的從15至30個核苷酸之連續區域。
本發明的實施方案可進一步提供所需哺乳動物之用於預防、治療或改善惡性腫瘤的一或多種症狀，或降低發展惡性腫瘤的風險，或延緩發生惡性腫瘤之方法。
p21存在於包括人類的各種動物中。人類CDKN1A(P21)的序列資訊得自於：NM_000389.4、NM_078467.2、NM_001291549.1、NM_001220778.1、NM_001220777.1(NP_001207707.1、NP_001278478.1、NP_001207706.1、NP_510867.1、NP_000380.1)。
標的人類p21之mRNA揭示在GenBank登錄號NM_000389.4(CDKN1A)，且長度為2175個鹼基對。
一個所屬技術領域中具有通常知識者將理解，所報告的序列可隨時間而改變，並且可相應地併入本文之核酸分子所需要的任何改變。
本發明的實施方案可提供使用小核酸分子以供基因靜默p21表現的組成物和方法。核酸分子的實例包括RNA干擾活性分子(RNAi分子)、短干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、和短髮夾RNA(shRNA)分子、以及DNA導引性RNA(DNA-directed RNA)(ddRNA)、與Piwi蛋白相互作用的RNA(Piwi-interacting RNA)(piRNA)和重複相關性siRNA(repeat associated siRNA)(rasiRNA)。這些分子能夠介導抗p21基因表現之RNA干擾。
本文所揭示之組成物和方法亦可用於治療個體之各種惡性腫瘤。
本發明之核酸分子和方法可用於向下調節編
碼的p21之基因的表現。
本發明之組成物和方法可包括一種或多種核酸分子，其獨立地或組合地，能夠調控或調節p21蛋白和/或編碼p21蛋白之基因、有關於維持和/或發展與p21相關之疾病、病況或病症(諸如惡性腫瘤)的蛋白和/或編碼p21之基因的表現。
參照p21的示例性序列描述本發明之組成物和方法。所屬技術領域中具有通常知識者將理解本發明的各種態樣和實施方案係關於任何與p21相關之基因、序列或變異型(諸如同源基因和轉錄變異型)及多型性(包括與任何P21基因有關之單核苷酸多態性(SNP))。
在一些實施方案中，本發明的組成物和方法可提供向下調節p21基因表現之雙股短干擾核酸(siRNA)分子，例如人類CDKN1A。
本發明的RNAi分子可例如使用互補序列或藉由併入可以提供額外標的序列之非典型鹼基對(non-canonical base pair)，例如失配(mismatch)和/或擺動鹼基對(wobble base pair)，而靶向至p21和任何同源序列。
在識別出失配的情況下，非典型鹼基對，例如失配和/或擺動鹼基，可用於產生靶向多於一種基因序列的核酸分子。
例如，非典型鹼基對，諸如UU和CC鹼基對，可用於產生能夠靶向享有序列同源性之不同p21標的
序列的核酸分子。因此，RNAi分子可以靶向至同源基因之間保守的核苷酸序列，且單一RNAi分子可用來抑制多於一種基因的表現。
在一些態樣中，本發明的組成物和方法包括抗p21 mRNA的活性RNAi分子，其中該RNAi分子包括與編碼p21序列的任何mRNA互補的序列。
在一些實施方案中，本揭示內容的RNAi分子可具有抗p21RNA的活性，其中，該RNAi分子包括與具有變異型(variant)p21編碼序列(例如，本技術領域已知與惡性腫瘤相關之突變p21基因)之RNA互補的序列。
在進一步的實施方案中，本發明之RNAi分子可包括可與p21基因的核苷酸序列相互作用並介導p21基因表現靜默的核苷酸序列。
用於抑制p21基因表現的核酸分子可具有正義股和反義股，其中該股形成雙股螺旋區。該核酸分子可以具有一或多個在該雙股螺旋區經修飾或化學修飾(包括在本技術領域中已知的這些修改)的核苷酸。在siRNA之突出(overhang)的任何核苷酸也可經修飾或化學修飾。
在一些實施方案中，較佳的經修飾或化學修飾的核苷酸係2'-去氧核苷酸。在另外的實施方案中，該經修飾或化學修飾的核苷酸可包括2'-O-烷基取代的核苷酸、2'-去氧-2'-氟代核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、鎖核苷
酸或彼等之任何組合。
在某些實施方案中，較佳的結構可具有在多個位置含去氧核苷酸之反義股，該多個位置為下列者之一：從反義股5'端起算的位置4、6和8之各者；從反義股5'端起算的位置3、5和7之各者；從反義股5'端起算的位置1、3、5和7之各者；從反義股5'端起算的位置3至8之各者；及從反義股5'端起算的位置5至8之各者。這些結構之任一者可與在雙股螺旋區的一或多個2'-去氧-2'-氟代核苷酸組合。
本發明之核酸分子可以低於約200pM之優異IC 50抑制p21 mRNA的表現。此外，該核酸分子在單次投予後可抑制體內至少25%之p21 mRNA的表現量。
本發明設想醫藥組成物，其可含有一或多個本文所述之siRNA，與醫藥上可接受的載劑組合。可使用任何合適的載劑，包括本技術領域中已知者，以及脂質分子、奈米粒子或微脂體，其中任一者可包覆該siRNA分子。
本發明揭示用於治療可與p21表現相關之疾病的方法，此方法包括將含有一或多種siRNA的組成物投予至所需個體。待治療的疾病可包括惡性腫瘤、癌症、細胞表現突變KRAS所引起之癌症、肉瘤和癌等。
靶向至p21 mRNA之本發明RNAi分子的實例係顯示於表1中。
表1之索引：大寫字母A、G、C和U分別是指核糖-A(ribo-A)、核糖-G(ribo-G)、核糖-C(ribo-
C)和核糖-U(ribo-U)。小寫字母a、g、c、t分別代表2'-去氧-A、2'-去氧-G、2'-去氧-C和胸腺嘧啶。mU是2'-甲氧基-U。
靶向至p21 mRNA之本發明RNAi分子的實例係顯示於表2中。
表2之索引：大寫字母A、G、C和U分別是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小寫字母a、u、g、c、t分別是指2'-去氧-A、2'-去氧-U、2'-去氧-G、2'-去氧-C和去氧胸腺嘧啶(dT=T=t)。底線是指2'-OMe取代，例如，U。N為A、C、G、U、U、a、c、g、u、t，或修飾、倒置、或化學修飾的核苷酸。
在一些實施方案中，本發明提供一系列的核
酸分子，其中a)該分子具有多核苷酸正義股和多核苷酸反義股；b)該分子每股的長度為15至30個核苷酸；c)反義股之15至30個核苷酸的連續區域與編碼p21的mRNA序列互補；以及d)至少一部分的正義股與至少一部分的反義股互補，且該分子具有長度從15至30個核苷酸的雙股螺旋區。
在一些實施方案中，核酸分子可具有與編碼p21的mRNA序列互補且位於該分子的雙股螺旋區之反義股的15至30個核苷酸的之連續區域。
在另外的實施方案中，核酸分子可具有與編碼p21的mRNA序列互補之反義股的15至30個核苷酸之連續區域。
在進一步的態樣中，本發明的核酸分子可具有長度為18至22個核苷酸之每股分子。核酸分子可具有長度為19個核苷酸的雙股螺旋區。
在某些實施方案中，核酸分子可具有連接為單股且以環在一端連接而形成雙股螺旋區之多核苷酸正義股和多核苷酸反義股。
本發明的核酸分子可具有平端(blunt end)，且可以具有一或多個3'突出。
本發明的核酸分子可以是有基因靜默活性的RNAi分子，例如，有基因靜默活性之dsRNA，有基因靜默活性之siRNA、小分子RNA(micro- RNA)或shRNA、以及DNA導引性RNA(ddRNA)、與Piwi蛋白
相互作用的RNA(piRNA)和重複相關性siRNA(rasiRNA)。
本發明提供一系列具有抑制p21表現活性的核酸分子。在一些實施方案中，核酸分子可具有低於100pM之弱化(knockdown)p21的IC 50。
在另外的實施方案中，核酸分子可具有低於50pM之弱化p21的IC 50。
本發明還設想含有一或多個本發明的核酸分子和醫藥上可接受之載劑的組成物。該載劑可為脂質分子或微脂體。
藉由將化合物或組成物投予至所需個體，本發明的化合物和組成物可用在與p21相關之疾病的預防或治療方法中。
在另外的態樣中，本發明包括與p21表現相關之疾病的治療方法，藉由將含有一或多種本發明之核酸分子的組成物投予至所需個體。該疾病可為惡性腫瘤，其可呈現在諸如與p21表現相關之癌症等的疾病中。
本發明之方法可利用本發明之化合物以供預防或治療惡性腫瘤。惡性腫瘤可以呈現在各種疾病中，例如，與p21表現相關之癌症、細胞表現突變KRAS所引起之癌症、肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、癌、腦腫瘤、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸
癌、闌尾癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌、白血病、惡性淋巴瘤、上皮惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤。
本發明的實施方案含括經修飾或化學修飾的siRNA分子，以提供用於治療用途的增強性能，如增加基因靜默的活性和效力。本發明提供經修飾或化學修飾之siRNA分子，其可具有增加的血清穩定性以及降低的脫靶效應(off target effect)，而不喪失siRNA分子對於基因調控和基因靜默的活性和效力。在一些態樣中，本發明提供具有修飾或化學修飾之siRNA在各種組合中，其增強siRNA的穩定性和功效。
如本文中所使用的，術語經修飾和化學修飾是指在天然存在的核苷酸結構或siRNA核酸結構中所進行的改變，其含括具有一或多個核苷酸類似物、改變的核苷酸、非標準核苷酸、非天然存在的核苷酸及彼等之組合的siRNA。
在一些實施方案中，siRNA中經修飾或化學修飾結構的數目可包括siRNA分子之所有的結構部件和/或所有核苷酸。
經修飾和化學修飾siRNA的實例包括具有核苷酸糖基的修飾、核苷酸之核鹼基(nucleobase)的修
飾、核酸主鏈或鍵的修飾、核苷酸結構或在siRNA股末端核苷酸的修飾，及彼等之組合的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括在糖的2'碳具有取代基的修飾之siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有在股之5'端、3'端或兩端之修飾的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有在股之間產生互補性失配之修飾的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有5'-丙胺端、5'-磷酸化端、3'-嘌呤黴素(3'-puromycin)端或3'-生物素端基的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有2'-氟取代的核糖核苷酸、2'-OMe取代的核糖核苷酸、2'-去氧核糖核苷酸、2'-胺基取代的核糖核苷酸、2'-硫代取代的核糖核苷酸的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有一或多個5-鹵尿苷、5-鹵胞苷、5-甲基胞苷、核糖胸苷、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、4-硫代尿苷或5-胺基烯丙基尿苷的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有一或多個硫代磷酸酯基(phosphorothioate group)的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有一或多個2'-氟取代的核糖核苷酸、2'-氟尿苷、2'-氟胞
苷、2'-去氧核糖核苷酸、2'-去氧腺苷或2'-去氧鳥苷的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有一或多個硫代磷酸酯鍵的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有一或多個亞烷基二醇鍵、氧-烷硫基鍵或氧羰基氧鍵的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有一或多個去氧無鹼基(deoxyabasic group)、肌苷、N3-甲基-尿苷、N6,N6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核糖核苷和利巴韋林(ribavirin)的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有一或多個3'或5'倒置末端基團的siRNA。
經修飾和化學修飾之siRNA的實例包括具有一或多個5-(2-胺基)丙基尿苷、5-溴尿苷、腺苷、8-溴鳥苷、7-脫氮腺苷或N6-甲基腺苷的siRNA。
本發明的實施方案可提供可以用於向下調節或抑制p21和/或p21蛋白表現的RNAi分子。
在一些實施方案中，本發明之RNAi分子可用來向下調節或抑制CDKN1A和/從可與疾病或病況(諸如惡性腫瘤)相關聯之CDKN1A單倍型多型性所產生的p21蛋白之表現。
監測p21蛋白或mRNA量可用於表徵基因靜默，並且用於確定本發明的化合物和組成物的功效。
本揭示內容的RNAi分子可以單獨使用，或與其它的siRNA組合使用，以調控一或多個基因的表現。
本揭示內容之RNAi分子可以單獨、或組合、或與其他已知藥物結合的方式使用，以用於預防或治療疾病、或改善與p21相關之病況或病症的症狀，包括惡性腫瘤。
本發明之RNAi分子可用來以序列專一性的方式調控或抑制p21的表現。
本揭示內容之RNAi分子可包括與p21 mRNA至少部分互補之一連串連續核苷酸的引導股(guide strand)。
在某些態樣中，惡性腫瘤可以藉由使用本發明RNAi分子之RNA干擾來治療。
惡性腫瘤的治療可表徵在合適之基於細胞的模式，以及離體(ex vivo)或在體內動物模式中。
惡性腫瘤的治療可藉由受影響器官或組織的非侵入性醫療掃描來表徵。
本發明的實施方案可包括在所需個體中預防、治療或改善p21相關疾病或病況之症狀的方法。
在一些實施方案中，在個體中預防、治療或改善惡性腫瘤症狀的方法可包括將本發明的RNAi分子投予至該個體，以調控該個體或生物體中CDKN1A基因
(p21)的表現。
在一些實施方案中，本發明設想藉由將細胞或生物體與本發明之RNAi分子接觸，以在細胞或生物體中向下調節CDKN1A基因(p21)表現之方法。
本發明的實施方案含括按照上述實例所修飾或化學修飾之表1和2的siRNA分子。
RNA干擾(RNAi)是指由短干擾RNA(siRNA)所介導之在動物中的序列專一性後轉錄基因靜默。見，例如，Zamore等人，Cell,2000,Vol.101,pp.25-33；Fire等人，Nature,1998,Vol.391,pp.806811；Sharp,Genes & Development,1999,Vol.13,pp.139-141。
在細胞中的RNAi反應可以由雙股RNA(dsRNA)觸發，雖然尚未完全了解其機制。在細胞中的某些dsRNA可以經歷切丁酶(Dicer)酵素(核糖核酸酶III酵素)的作用。見，例如，Zamore等人，Cell,2000,Vol.101,pp.25-33；Hammond等人，Nature,2000,Vol.404,pp.293-296。切丁酶可以將該dsRNA處理成為較短片段的dsRNA，其為siRNA。
一般而言，siRNA的長度可為約21至約23個核苷酸，並且包括長度約19個核苷酸的鹼基對雙股螺旋區。
RNAi涉及所謂RNA誘導靜默複合體
(RISC)的核酸內切酶複合體。siRNA具有反義股或引導股，其進入該RISC複合體並介導具有與siRNA雙股螺旋的反義股互補的之序列的單股RNA標的之切割。siRNA的另一股是隨從股(passenger strand)。標的RNA的切割發生在與該siRNA雙股螺旋之反義股互補區域的中間，見例如，Elbashir等人，Genes & Development,2001,Vol.15,pp.188-200。
如本文中所使用的，術語「正義股」是指與至少一部分之siRNA分子的相應反義股部分或完全互補之siRNA分子的核苷酸序列。siRNA分子的正義股可包括與標的核酸序列具有同源性之核酸序列。
如本文中所使用的，術語「反義股」是指與至少一部分之標的核酸序列部分或完全互補之siRNA分子的核苷酸序列。siRNA分子的反義股可包括與siRNA分子的相應正義股的至少一部分互補之核酸序列。
RNAi分子可以序列專一性的方式藉由介導RNA干擾而向下調節或弱化基因的表現。見，例如，Zamore等人，Cell,2000,Vol.101,pp.25-33；Elbashir等人，Nature,2001,Vol.411,pp.494-498；Kreutzer等人，WO2000/044895；Zernicka-Goetz等人，WO2001/36646；Fire等人，WO1999/032619；Plaetinck等人，WO2000/01846；Mello等人，WO2001/029058。
如本文中所使用的，關於基因表現之術語「抑制」、「向下調節」或「減少」是指該基因的表現、
或編碼一或多種蛋白之mRNA分子的量、或一或多種編碼的蛋白活性被減少至低於在沒有本發明的RNAi分子或siRNA的情況下所觀察者。例如，表現量、mRNA量或編碼的蛋白質活性水平可以被降低至少1%、或至少10%、或至少20%、或至少50%、或至少90%或高於在不存在本發明之RNAi分子或siRNA的情況下所觀察者。
RNAi分子也可用於弱化病毒基因表現，並因此影響病毒複製。
RNAi分子可以由單獨的多核苷酸股所製成：正義股或隨從股(passenger strand)和反義股或引導股(guide strand)。該引導股和隨從股至少部分互補。該引導股和隨從股可形成具有約15至約49個鹼基對的雙股螺旋區。
在一些實施方案中，siRNA的雙股螺旋區可具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個鹼基對。
在某些實施方案中，RNAi分子可以在RISC複合體中具有活性，其雙股螺旋區的長度對RISC有活性。
在另外的實施方案中，RNAi分子可具有作為切丁酶受質的活性，以轉化為在RISC複合體中具活性的RNAi分子。
在一些態樣中，RNAi分子可以在長分子的相
對端具有互補的引導和隨從序列部分，使得該分子可形成具有互補序列部分的雙股螺旋區，且該些股藉由核苷酸或非核苷酸連接體在雙股螺旋區的一端連接。例如，髮夾結構或莖和環結構。與該些股交互作用的連接體(linker)可為共價鍵或非共價交互作用。
本揭示內容的RNAi分子可包括將核酸正義區連接至核酸反義區之核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸連接體。核苷酸連接體可為長度是2個核苷酸的連接體，例如長度為約3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。該核苷酸連接體可為核酸適配體(aptamer)。本文所使用的「適配體」或「核酸適配體」是指專一性結合至標的分子的核酸分子，其中該核酸分子具有包括被天然環境中之標的分子所辨識之序列的序列。或者，適配體可以是結合至標的分子的核酸分子，其中該標的分子不與核酸天然結合。例如，適配體可用於結合至蛋白質的配體結合域(ligand-binding domain)，從而防止天然存在的配體與蛋白質的交互作用。參見，例如，Gold等人，Annu Rev Biochem,1995,Vol.64,pp.763-797；Brody等人，J.Biotechnol.,2000,Vol.74,pp.5-13；Hermann等人，Science,2000,Vol.287,pp.820-825。
非核苷酸連接體的實例包括無鹼基核苷酸(abasic nucleotide)、聚醚、聚胺、聚醯胺、胜肽、碳水化合物、脂質、聚烴或其它聚合的化合物，例如聚乙二醇，諸如具有從2至100個乙二醇單元的聚乙二醇。一些
實例被描述於Seela等人，Nucleic Acids Research,1987,Vol.15,pp.3113-3129；Cload等人，J.Am.Chem.Soc.,1991,Vol.113,pp.6324-6326；Jaeschke等人，Tetrahedron Lett.,1993,Vol.34,pp.301；Arnold等人，WO1989/002439；Usman等人，WO1995/006731；Dudycz等人，WO1995/011910及Ferentz等人，J.Am.Chem.Soc.,1991,Vol.113,pp.4000-4002。
RNAi分子可在雙股螺旋區中具有一或多個突出。非鹼基配對的突出單股區可具有1至8個核苷酸或更長的長度。突出可為3'-端突出，其中一股的3'-端具有1至8個核苷酸的單股區。突出可為5'-端突出，其中一股的5'-端具有1至8個核苷酸的單股區。
RNAi分子的突出可具有相同的長度，或者可以是不同的長度。
RNAi分子可具有其中該雙股螺旋區端沒有突出的一或多個平端，且該些股與雙股螺旋區的端部鹼基配對。
本揭示內容的RNAi分子可具有一或多個平端、或可具有一或多個突出、或可具有一平端和一突出端的組合。
RNAi分子之一股的5'-端可在平端或可在突出。RNAi分子之一股的3'-端可在平端或可在突出。
RNAi分子之一股的5'-端可在平端，而3'-端在突出。RNAi分子之一股的3'-端可在平端，而5'-端在
突出。
在一些實施方案中，RNAi分子的兩端為平端。
在另外的實施方案中，RNAi分子的兩端具有突出。
在5'-和3'-端的突出可以具有不同的長度。
在某些實施方案中，RNAi分子可具有平端，其中反義股的5'-端和正義股的3'-端不具有任何突出核苷酸。
在另外的實施方案中，RNAi分子可具有平端，其中反義股的3'-端和正義股的5'-端不具有任何突出核苷酸。
RNAi分子可能在雙股螺旋區的鹼基配對中具有失配。
在RNAi分子之突出的任何核苷酸可為去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
一或多個去氧核糖核苷酸可以是在5'-端，其中RNAi分子另一股的3'-端可以不具有突出，或者可以不具有去氧核糖核苷酸突出。
一或多個去氧核糖核苷酸可以是在3'-端，其中RNAi分子另一股的5'-端可以不具有突出，或者可以不具有去氧核糖核苷酸突出。
在一些實施方案中，RNAi分子之一或多個，或者全部的突出核苷酸可為2'-去氧核糖核苷酸。
在一些態樣中，RNAi分子可具有適合作為切丁酶受質的長度，其可以被加工，以產生RISC活性RNAi分子。見，例如，Rossi等人，US2005/0244858。
雙股螺旋RNA(dsRNA)是切丁酶受質，其可具有足以使其被切丁酶加工以產生活性RNAi分子的長度，且可另外包括一或多種下列的性質：(i)切丁酶受質dsRNA可以是不對稱的，例如，具有反義股上的3'突出，和(ii)切丁酶受質dsRNA可在正義股上具有經修飾的3'端，以引導切丁酶結合dsRNA的定向並將dsRNA加工成活性RNAi分子。
在某些實施方案中，在切丁酶受質dsRNA中最長股的長度可為24至30個核苷酸。
切丁酶受質dsRNA可以是對稱或不對稱的。
在一些實施方案中，切丁酶受質dsRNA可具有22至28個核苷酸的正義股和24至30個核苷酸的反義股。
在某些實施方案中，切丁酶受質dsRNA可在反義股的3'端上具有突出。
在另外的實施方案中，切丁酶受質dsRNA可具有長度為25個核苷酸的正義股，和長度為27個核苷酸的反義股，具有2個鹼基的3'-突出。該突出的長度可以是1、2或3個核苷酸。該正義股亦可具有5'磷酸。
不對稱的切丁酶受質dsRNA可在正義股的3'-端具有兩個去氧核糖核苷酸，代替兩個核糖核苷酸。
切丁酶受質dsRNA之正義股的長度可以是從約22至約30、或從約22至約28；或從約24至約30；或從約25至約30；或從約26至約30；或從約26至約29；或從約27至約28個核苷酸。
切丁酶受質dsRNA之正義股的長度可以是22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。
在某些實施方案中，切丁酶受質dsRNA可具有長度為至少約25個核苷酸且長度不長於約30個核苷酸的正義股和反義股。
在某些實施方案中，切丁酶受質dsRNA可具有長度為26至29個核苷酸的正義股和反義股。
在某些實施方案中，切丁酶受質dsRNA可具有長度為27個核苷酸的正義股和反義股。
切丁酶受質dsRNA的正義股和反義股可以如平端具相同的長度，或是如具有突出而具不同長度，或者可具有一平端和一突出。
切丁酶受質dsRNA可具有長度為19、20、21、22、23、24、25、26或27個核苷酸的雙股螺旋區。
切丁酶受質dsRNA的反義股可具有在生物條件下(諸如在真核細胞的細胞質中)黏合(anneal)到至少一部分正義股序列的任何序列。
具有正義股和反義股的切丁酶受質可由第三
結構連接，諸如連接基團或連接寡核苷酸。該連接體連接dsRNA的兩股，例如，從而在黏合時形成髮夾。
切丁酶受質的正義股和反義股通常是互補的，但可能在鹼基配對中有失配。
在一些實施方案中，切丁酶受質dsRNA可以是不對稱的，使得正義股具有22至28個核苷酸，且反義股具有24至30個核苷酸。
切丁酶受質dsRNA之一股，特別是反義股，的區域可具有至少19個核苷酸的序列長度，其中這些核苷酸在與反義股之3'端相鄰的21-核苷酸區域中，並且與由標的基因產生的RNA核苷酸序列充分互補。
切丁酶受質dsRNA之反義股可在5'-端具有1至9個核糖核苷酸，以得到22至28個核苷酸的長度。當反義股具有21個核苷酸的長度時，接著可將1至7個核糖核苷酸、或2至5個核糖核苷酸、或4個核糖核苷酸添加至3'-端。所添加的核糖核苷酸可具有任何序列。
切丁酶受質dsRNA的正義股可具有24至30個核苷酸。正義股可與反義股實質上互補，以在生物條件下黏合至該反義股。
藉由直接施用分子或以與載劑或稀釋劑結合的分子可將本發明之核酸分子和RNAi分子遞送至細胞或組織。
本發明之核酸分子和RNAi分子可藉由直接施用該些分子與用於協助、促進或有利於進入細胞之載劑或稀釋劑或任何其他遞送媒液(例如，病毒序列、病毒材料、或脂質或微脂體配方)而遞送或投予至細胞、組織、器官或個體。
本發明之核酸分子和RNAi分子可與陽離子脂質複合、包裝在微脂體內或以其他方式遞送至標的細胞或組織。核酸或核酸複合體可透過直接皮膚施用、經皮施用、或注射而在體外或體內局部投予至相關組織。
遞送系統可包括，例如，水性和非水性凝膠、乳霜、乳劑、微乳劑、微脂體、軟膏、水性和非水性溶液、洗劑、氣溶膠、烴類基劑和粉末，並且可含有賦形劑，諸如，增溶劑和滲透增進劑。
本揭示內容的組成物和方法可包括表現載體，其包括以允許核酸分子表現的方式編碼本發明之至少一個RNAi分子的核酸序列。
可從插入到DNA或RNA載體的轉錄單位表現本發明之核酸分子和RNAi分子。重組載體可為DNA質體或病毒載體。可使用供暫時表現(transient expression)核酸分子的病毒載體。
例如，載體可含有編碼雙股螺旋RNAi分子之雙股或自互補而形成RNAi分子之單核酸分子的序列。表現載體可包括編碼兩個或更多個核酸分子的核酸序列。
核酸分子可由真核啟動子啟動而在細胞內表
現。熟習該技術領域人士瞭解任何核酸可在合適的DNA/RNA載體中而在真核細胞中表現。
在一些態樣中，可使用病毒構築體(construct)將表現構築體導入細胞，以供轉錄由表現構築體所編碼的dsRNA構築體。
可藉由靜脈內、肌肉內、或腹膜內注射、或口服或者藉由吸入或其它本技術領域中已知的方法將脂質配方投予至動物。
用於投予寡核苷酸之醫藥上可接受的配方為已知的，並且可以被使用。
在轉染前一天，以每孔2×103個細胞用100μl之含有10%FBS的DMEM(HyClone Cat.# SH30243.01)將細胞平鋪種在96孔盤中，且在含有5%CO2空氣的潮濕氣氛之37℃培養箱中培養。轉染前，將培養基換為90μl之含有2%FBS的Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Life Technologies Cat.# 31985-070)。將0.2μl的Lipofectamine RNAiMax(Life Technologies Cat.# 13778-100)與4.8μl的Opti-MEM I在室溫下混合5分鐘。將1μl的siRNA與4μl的Opti-MEM I和LF2000溶液混合，然後輕輕混勻，不要劇烈震盪(vortex)。在室溫下等待5分鐘。將該混合物在室溫下培養10分鐘，以使RNA-RNAiMax複合體形成。將10μl的RNA-RNAiMax複合體添加至孔，並用手輕輕搖動
該盤。將細胞在含有5%CO2空氣的潮濕氣氛之37℃培養箱中培養2小時。將培養基換成含有2% FBS之新鮮-MEM I Reduced Serum Medium(Life Technologies Cat.# 31985-070)。轉染後24小時，用冰冷的PBS洗滌細胞一次。在室溫下以50μl的Cell-to-Ct裂解緩衝液(Lysis Buffer)(Life Technologies Cat.# 4391851 C)將細胞裂解5-30分鐘。添加5μl的終止溶液(Stop solution)並且在室溫下培養2分鐘。立即用TAQMAN以RT-qPCR測量mRNA量。或者，可將樣本在-80℃冷凍，並在稍後的時間進行分析。
用於篩選測量之陽性對照組為具有如下列正義股和反義股配對之分子。
SEQ ID NO：85正義股：UCCUAAGAGUGCUGGGCAUdTdT
SEQ ID NO：86反義股：AUGCCCAGCACUCUUAGGAdTdT。
將0.2mg/ml的siRNA以10%的人血清在37℃下培養。在某些時間點(0、5、15和30分鐘)，將200μl的樣品的等分並以200μl的萃取溶劑(氯仿：苯酚：異戊醇=24：25：1)進行萃取。將樣品劇烈震盪混合並以13,000rpm在室溫(RT)下離心10分鐘，然後將上層溶液轉移並以0.45μm過濾器將其進行過濾。將濾液轉移到300μl HPLC注射小瓶中。對於LCMS，移動相為
MPA：在水中之100mM HFIP+7mM TEA、MPB：50%甲醇+50%乙腈。管柱：Waters Acquity OST 2.1 x 50mm,1.7μm。
實例1：發現靶向p21之本發明siRNA在體外具有基因靜默活性。發現用於基因弱化之p21siRNA的劑量依賴性活性而展現低於約3皮莫耳(pM)和低至1pM的IC 50。
在A549細胞株中進行體外轉染，以確定siRNA的弱化功效。以表1的siRNA觀察到對p21 mRNA的劑量依賴性弱化，如表3所示。
如表3所示，表1中p21 siRNA的活性是在0.3-10pM的範圍，其適用於多種用途，包括作為在體內所使用的藥物試劑。
實例2：具有位於siRNA反義股種子區的去氧核苷酸之本發明p21 siRNA的結構提供了出乎意料且有利地增加了基因弱化活性。
在A549細胞株中進行體外轉染，以確定基於結構1735’之p21 siRNA(SEQ ID NO：57和71)的弱化功效。以基於結構1735’之p21 siRNA觀察到p21 mRNA的
劑量依賴性弱化，如表4所示。
如表4中所示，相較於在雙股螺旋區不具有去氧核苷酸之p21 siRNA，基於在反義股種子區具3個去氧核苷酸之結構1735’的p21 siRNA之活性令人驚訝且出乎意料地增加高達300倍。
這些數據顯示，相較於在雙股螺旋區不具有去氧核苷酸的p21 siRNA，在反義股種子區具有去氧核苷酸之結構的p21 siRNA令人驚訝地提供了增加的基因弱化活性。
表4所示之在反義股種子區具3個去氧核苷酸之p21 siRNA的活性在0.001至0.1pM的範圍，其特別適合於許多用途，包括作為在體內使用的藥物試劑。
本文所描述的實施方案不具限制性，且熟習該技術領域人士可易於理解本文所述之修飾的具體組合可以在無需過度實驗而朝向識別具改善RNAi活性之核酸分子的情況下進行試驗。
基於所有目的，將本文所具體提及的所有出版物、專利和文獻以整體引用方式併入本文。
可以理解的是本發明並不限定於所述的特定方法、準則、材料和試劑，因為這些可以變化。也應當理解，本文所使用的術語僅用於描述特定的實施方案，且不欲限制本發明的範圍。熟習該技術領域人士將顯而易見可以在不偏離說明之範圍與精神的情況下對本文所揭示之說明進行不同的替代和修改，且這些實施方案皆在本說明和所附申請專利範圍的之範圍內。
必須注意，如本文和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式「一」、「一個」和「該」包括複數引用，除非上下文另有清楚說明。同樣地，術語「一」(或「一個」)、「一或多個」和「至少一個」在本文中可以互換使用。也應當注意，術語「包含」(comprise)、「包含」(comprising)、「含有」、「包括」和「具有」可以互換使用，且應被寬泛且沒有限制性地閱讀。
本文數值範圍的描述僅欲作為對落在該範圍內之每個個別數值分別提及的縮寫方法，除非本文另有指明，且將每個個別數值併入說明書中，如同它在本文中被分別列舉一般。對於馬庫西群組，熟習該技術領域之人士將認知到此種描述包括馬庫西群組之個別成員以及該些成員的亞組。
無需進一步詳細說明，據信熟習該技術領域之人士可根據上面的說明將本發明做最大限度的利用。因
此，下面的具體實施方案，應解釋為僅具說明性，並且不以任何方式限制本揭示內容的其餘部分。
所有本說明書中所揭示的特徵可以任何組合方式進行組合。在本說明書中所揭示的每個特徵可被具有相同、等效或類似目的之替代性特徵所代替。
<110> 日東電工股份有限公司(NITTO DENKO CORPORATION)
<120> 供P21基因調控之RNA干擾劑
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<400> 33
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 34
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 35
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 36
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 37
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 38
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 40
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
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<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
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<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 47
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 48
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性
寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 49
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 50
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 51
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 52
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 53
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 54
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 55
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-甲氧基-核苷酸
<400> 56
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> a,c,t,g,u，未知或其他
<400> 57
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
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<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 58
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (14)..(15)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
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<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (14)..(15)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
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<223> 2'-OMe-核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 61
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 62
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 63
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 64
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 65
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 66
<210> 67
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 67
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 2OMe核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 68
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 69
<210> 70
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 70
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> a,c,t,g,u，未知或其他
<400> 71
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 72
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 73
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性
寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 74
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性
寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 75
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性
寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-去氧-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 76
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-去氧-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 77
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-去氧-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-去氧-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 78
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 81
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 82
<210> 83
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 83
<210> 84
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-OMe-核苷酸
<400> 84
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<400> 85
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成性寡核苷酸
<220>
<223> 經結合之DNA/RNA分子之說明：合成性寡核苷酸
<400> 86
Claims (25)
- 一種用於抑制p21表現之核酸分子，其包含正義股(sense strand)和反義股(antisense strand)，其中該等股形成雙股螺旋區(duplex region)，且其中該反義股係SEQ ID NO：57和該正義股係SEQ ID NO：71。
- 如請求項1之核酸分子，其中在該雙股螺旋區的一或多個核苷酸係經修飾或化學修飾。
- 如請求項2之核酸分子，其中該經修飾或化學修飾之核苷酸係2'-去氧核苷酸、2'-O-烷基取代的核苷酸、2'-去氧-2'-氟代核苷酸(2'-deoxy-2'-fluoro substituted nucleotide)、硫代磷酸酯核苷酸(phosphorothioate nucleotide)、鎖核苷酸(locked nucleotide)或彼等之任何組合。
- 如請求項2之核酸分子，其中該反義股在多個位置具有去氧核苷酸，該多個位置為下列者之一：從反義股5'端起算的位置4、6和8之各者；從反義股5'端起算的位置3、5和7之各者；從反義股5'端起算的位置1、3、5和7之各者；從反義股5'端起算的位置3至8之各者；或從反義股5'端起算的位置5至8之各者。
- 如請求項4之核酸分子，其中該分子在雙股螺旋區具有一或多個2'-去氧-2'-氟代核苷酸。
- 如請求項2之核酸分子，其中該反義股係SEQ ID NO：59且該正義股係SEQ ID NO：73。
- 如請求項2之核酸分子，其中該反義股係SEQ ID NO：58且該正義股係SEQ ID NO：72。
- 如請求項2之核酸分子，其中該反義股係SEQ ID NO：60且該正義股係SEQ ID NO：74。
- 如請求項1至8中任一項之核酸分子，其中該分子以低於50pM之IC 50抑制p21 mRNA的表現。
- 如請求項1至8中任一項之核酸分子，其中該分子的單次投予抑制體內至少25%之p21 mRNA的表現量。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至8中任一項之核酸分子和醫藥上可接受之載劑(carrier)。
- 如請求項11之醫藥組成物，其中該載劑包含脂質分子或微脂體。
- 一種載體或細胞，其包含如請求項1至8中任一項之核酸分子。
- 一種如請求項1至8中任一項之核酸分子用於抑制細胞中p21表現的用途。
- 一種用於抑制p21表現之核酸分子，其包含正義股和反義股，其中該股形成雙股螺旋區，且其中該反義股係SEQ ID NO：28和該正義股係SEQ ID NO：56。
- 如請求項15之核酸分子，其中在該雙股螺旋區的一或多個核苷酸係經修飾或化學修飾。
- 如請求項16之核酸分子，其中該經修飾或化學修飾之核苷酸係2'-去氧核苷酸、2'-O-烷基取代的核苷酸、2'-去氧-2'-氟代核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、鎖核苷酸或 彼等之任何組合。
- 如請求項16之核酸分子，其中該反義股在多個位置具有去氧核苷酸，該多個位置為下列者之一：從反義股5'端起算的位置4、6和8之各者；從反義股5'端起算的位置3、5和7之各者；從反義股5'端起算的位置1、3、5和7之各者；從反義股5'端起算的位置3至8之各者；或從反義股5'端起算的位置5至8之各者。
- 如請求項18之核酸分子，其中該分子在雙股螺旋區具有一或多個2'-去氧-2'-氟代核苷酸。
- 如請求項15至19中任一項之核酸分子，其中該分子以低於100pM之IC 50抑制p21 mRNA的表現。
- 如請求項15至19中任一項之核酸分子，其中該分子的單次投予抑制體內至少25%之p21 mRNA的表現量。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項15至19中任一項之核酸分子和醫藥上可接受之載劑。
- 如請求項22之醫藥組成物，其中該載劑為脂質分子或微脂體。
- 一種載體或細胞，其包含如請求項15至19中任一項之核酸分子。
- 一種如請求項15至19中任一項之核酸分子用於抑制細胞中p21表現的用途。
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| TW105120009A TW201718854A (zh) | 2015-06-24 | 2016-06-24 | 供ｐ２１基因調控之ＲＮＡ干擾劑 |
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2016
- 2016-06-24 TW TW105120009A patent/TW201718854A/zh unknown
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