TW201723171A

TW201723171A - 基於李斯特菌屬之免疫原性組成物及其於癌症預防與治療中之使用方法

Info

Publication number: TW201723171A
Application number: TW105130023A
Authority: TW
Inventors: 羅伯特佩提; 麥可賓矽歐塔; 凱爾派瑞
Original assignee: 艾法西斯公司
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2016-09-14
Publication date: 2017-07-01
Also published as: EP3350332A1; WO2017048850A1; US20180305702A1

Abstract

本文揭示重組李斯特菌屬菌株，其包含編碼兩種或多於兩種異源抗原之核苷酸，該等異源抗原各自與截短LLO、N端ActA或PEST序列融合；該等菌株之製備方法；及誘導免疫反應、及治療、抑制或遏制癌症或腫瘤之方法，該等方法包含投與該等菌株。

Description

基於李斯特菌屬之免疫原性組成物及其於癌症預防與治療中之使用方法

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2015年9月15日申請之美國申請案第62/218,896號之權益，出於所有目的其以全文引用的方式併入本文中。

序列表之引用經由EFS網以正文檔案形式提交

檔案483708SEQLIST.txt中書寫之序列表為556kb，在2016年9月14日產生，且以引用的方式併入本文中。

大量臨床前證據及早期臨床試驗資料表明，免疫系統之抗腫瘤能力可用以治療具有確立的癌症之患者。疫苗策略利用與各種類型之癌症相關之腫瘤抗原。用活疫苗(諸如表現腫瘤相關抗原之病毒或細菌載體)免疫為一種引發對抗腫瘤的強CTL反應之策略。

單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)為革蘭氏陽性(gram positive)兼性胞內細菌，其主要歸因於李斯特菌溶胞素-O(listeriolysin-O，LLO)之造孔活性而直接進入抗原呈現細胞(諸如巨噬細胞及樹突狀細胞)之細胞質。LLO在由細胞吞噬後由Lm分泌且穿過吞噬溶菌體膜，使得細菌可逃脫液泡且進入細胞質。LLO經由MHC I類分子極高效地呈現至免疫系統。此外，Lm衍生肽亦可經由吞噬溶菌體進行MHC II類呈現。

癌症為一種複雜疾病且組合治療方法更可能成功。必須靶向腫瘤細胞以及支持腫瘤生長之微環境以最大化治療功效。大多數免疫療法聚焦於單一抗原以靶向腫瘤細胞，且因此其對抗人類癌症顯示有限的成功。能夠同時靶向一或多種標靶(諸如腫瘤細胞及腫瘤微環境)之單一治療劑將具有優於其他免疫治療方法之優勢，尤其在其產生協同抗腫瘤效應時。

在一個態樣中，本發明係關於一種在個體中引發抗腫瘤或抗癌免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與有效量之包括含有重組核酸分子之重組李斯特菌屬菌株之免疫原性組成物的步驟，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，其中該融合多肽包含與異源抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，且其中該李斯特菌屬表現該融合多肽，因此在該個體中引發抗腫瘤或抗癌免疫反應。

在一個態樣中，本發明係關於一種免疫原性組成物，其包括含有重組核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，其中該融合多肽包含與內皮因子序列或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該李斯特菌屬菌株在編碼D-丙胺酸消旋酶(dal)及D-胺基酸轉移酶(dat)基因之內源性基因中及在編碼ActA之致病性基因(actA)中包含突變。

在另一態樣中，該李斯特菌屬中之該重組核酸分子包含第二開讀框。在另一態樣中，該第二開讀框編碼第二融合多肽，其中該融合多肽包含與異源抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，且其中該李斯特菌屬表現該第二融合多肽。

在另一態樣中，該異源抗原係選自前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性抗原(PSA；KLK3)、激酶錨定蛋白4(AKAP4)、HPV E7、Hepsin(HPN/TMPRSS1)、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR/OR51E2)、T細胞受體γ-鏈交替閱讀框蛋白(TARP)、存活素(Birc5)、哺乳動物允用同源物(ENAH；hMENA)、POTE旁系同源物、O-GlcNAc轉移酶(OGT)、KLK7、分離蛋白-1(SCRN1)、纖維母細胞活化蛋白(FAP)、基質金屬肽酶7(MMP7)、乳脂球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、威爾姆斯腫瘤1(Wilms Tumor1，WT1)、干擾素刺激基因15泛素樣修飾因子(ISG15；G1P2)、頂體酶結合蛋白(ACRBP；OY-TES-1)、血管舒緩素相關肽酶4(KLK4/前列腺酶)。

在一個態樣中，本發明進一步係關於一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其免疫原性片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼融合多肽之第二開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性膜抗原(PSMA)或其免疫原性片段。

在另一態樣中，本發明進一步係關於一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其免疫原性片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼融合多肽之第二開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之存活素抗原或其免疫原性片段。

在一個態樣中，本發明係關於一種在個體中誘導抗腫瘤免疫反應之方法，其包含向該個體投與本文所揭示之重組李斯特菌屬。在一相關態樣中，該免疫反應允許治療、遏制或抑制個體中之癌症。

在一個態樣中，本發明係關於一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR)抗原或其免疫原性片段及hepsin抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。在一相關態樣中，本發明係關於一種免疫原性組成物，其包含該重組李斯特菌屬菌株。在一相關態樣中，本發明係關於一種在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向該個體投與該重組李斯特菌屬菌株或向該個體投與該免疫原性組成物。在一相關態樣中，本發明係關於一種預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法，其包含向該個體投與該重組李斯特菌屬菌株或該免疫原性組成物。

在一個態樣中，本發明係關於一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段及存活素抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或 PEST胺基酸序列。在一相關態樣中，本發明係關於一種免疫原性組成物，其包含該重組李斯特菌屬菌株。在一相關態樣中，本發明係關於一種在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向該個體投與該重組李斯特菌屬菌株或向該個體投與該免疫原性組成物。在一相關態樣中，本發明係關於一種預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法，其包含向該個體投與該重組李斯特菌屬菌株或該免疫原性組成物。

在一個態樣中，本發明係關於一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段及PSMA抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。在一相關態樣中，本發明係關於一種免疫原性組成物，其包含該重組李斯特菌屬菌株。在一相關態樣中，本發明係關於一種在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向該個體投與該重組李斯特菌屬菌株或向該個體投與該免疫原性組成物。在一相關態樣中，本發明係關於一種預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法，其包含向該個體投與該重組李斯特菌屬菌株或該免疫原性組成物。

本發明之其他特徵及優勢將自以下實施方式之實例及圖式變得顯而易知。然而，應瞭解，實施方式及特定實例雖然指示本發明之較佳具體例，但僅以說明方式給出，因為熟習此項技術者將由此實施方式而變得顯而易知本發明之精神及範疇內的各種改變及修改。

圖1.(A)klk3整合及actA缺失之後Lmdd-143及LmddA-143之染色體區的示意性圖示；(B)klk3基因整合至Lmdd及LmddA染色體中。使用klk3特異性引子自各構築體製備染色體DNA的PCR擴增對應於klk3基因的714bp之條帶，缺乏野生型蛋白質之分泌信號序列。

圖2.(A)pADV134質體之圖譜。(B)使來自LmddA-134培養物上清液之蛋白質沈澱，在SDS-PAGE中分離，且藉由西方墨點法使用抗-E7單株抗體偵測LLO-E7蛋白質。抗原表現卡匣由hly啟動子、截短LLO之ORF及人類PSA基因(klk3)組成。(C)pADV142質體之圖譜。(D)西方墨點法展示使用抗-PSA及抗-LLO抗體的LLO-PSA融合蛋白之表現。

圖3.單價及二價質體之示意性圖示。指示用於抗原1(XhoI及SpeI)及抗原2(XbaI及SacI或BglII)選殖之限制位點。黑色箭頭表示轉錄方向。p15 ori及RepR係指大腸桿菌(E.coli)及李斯特菌屬複製起點。tLLO為截短李斯特菌溶胞素O蛋白。桿菌屬(Bacillus)-dal基因編碼D-丙胺酸消旋酶，該消旋酶補充Lm Δ dal dat菌株中之D-丙胺酸合成。

圖4.(A)在具有及不具有選擇壓力(D-丙胺酸)的情況下培養時LmddA-LLO-PSA之活體外質體穩定性。首先列出菌株及培養條件且隨後列出用於CFU測定之培養盤。(B)LmddA-LLO-PSA活體內清除率及此期間的可能質體損失之評定。細菌靜脈內注射且在指示時間點時自脾分離。在BHI及BHI+D-丙胺酸培養盤上測定CFU。

圖5.(A)在C57BL/6小鼠中投與10⁸ CFU之後菌株LmddA-LLO-PSA之活體內清除率。藉由在BHI/str培養盤上塗佈來測定CFU數目。此方法之偵測極限為100 CFU。(B)使用10403S、LmddA-LLO-PSA及XFL7菌株之J774細胞的細胞感染分析。

圖6.(A)追加劑量之後第6天時，未處理小鼠及LmddA-LLO-PSA免疫接種小鼠之脾細胞中的PSA四聚物特異性細胞。(B)使用PSA肽刺激未處理小鼠及LmddA-LLO-PSA免疫接種小鼠5小時之脾細胞中IFN-γ之胞內細胞激素染色。使用基於卡斯蛋白酶之分析法(C)及基於銪之分析法(D)，在不同效應子/標靶比率下，來自LmddA-LLO-PSA免疫接種小鼠及未處理小鼠的活體外刺激之效應T細胞對用PSA肽脈衝之EL4細胞的特異性溶解。在PSA肽存在下或無肽存在下刺激24小時後獲得的未處理及免疫接種脾細胞中之IFNγ斑點數目(E)。

圖7.免疫接種LmddA-142誘導Tramp-C1-PSA(TPSA)腫瘤之消退。在第7天、第14天及第21天，小鼠留置未經處理(n=8)(A)或腹膜內經LmddA-142(每隻小鼠1×10⁸ CFU)(n=8)(B)或Lm-LLO-PSA(n=8)(C)免疫接種。量測各個別腫瘤之腫瘤尺寸且值表示為以毫米為單位的平均直徑。各線表示個別小鼠。

圖8.(A)未處理小鼠及用Lm對照菌株或Lm-ddA-LLO-PSA(LmddA-142)免疫接種之小鼠的脾臟及浸潤T-PSA-23腫瘤中的PSA-四聚物⁺CD8⁺T細胞的分析。(B)未處理小鼠及用Lm對照菌株或Lm-ddA-LLO-PSA免疫接種之小鼠的脾臟及浸潤T-PSA-23腫瘤中的CD4⁺調節性T細胞(定義為CD25⁺FoxP3⁺)的分析。

圖9.(A)klk3整合及actA缺失之後Lmdd-143及LmddA-143之染色體區的示意性圖示；(B)klk3基因整合至Lmdd及LmddA染色體中。使用klk3特異性引子自各構築體製備染色體DNA的PCR擴增對應於klk3基因的760bp之條帶。

圖10.(A)Lmdd-143及LmddA-143分泌LLO-PSA蛋白質。使來自細菌培養物上清液之蛋白質沈澱，在SDS-PAGE中分離且藉由西方墨點法使用抗-LLO及抗-PSA抗體偵測LLO及LLO-PSA蛋白質；(B)藉由Lmdd-143及LmddA-143產生之LLO保留溶血活性。綿羊紅血球與細菌培養物上清液之連續稀釋液一起培育且藉由590nm下的吸光度量測溶血活性；(C)Lmdd-143及LmddA-143在巨噬細胞樣J774細胞內部生長。J774細胞與細菌一起培育1小時，隨後建它黴素(gentamicin)處理以殺死胞外細菌。藉由塗佈在指示時間點獲得的J774溶解物之連續稀釋液量測胞內生長。Lm10403S在此等實驗中用作對照。

圖11.用Lmdd-143及LmddA-143免疫接種小鼠誘導PSA特異性免疫反應。C57BL/6小鼠用1×10⁸ CFU Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142以1週時間間隔免疫接種兩次，且在7天後採集脾臟。在莫能菌素(monensin)存在下用1μM PSA_65-74肽刺激脾細胞5小時。細胞針對CD8、CD3、CD62L及胞內IFN-γ染色且在FACS Calibur細胞計數器中分析。

圖12.設計三種基於先前繪製且預測之HLA-A2抗原決定基之位置表現獨特HMW-MAA片段的基於Lm之疫苗(A)。Lm-tLLO-HMW-MMA_2160-2258(亦稱為Lm-LLO-HMW-MAA-C)菌株分泌對應於tLLO-HMW-MAA_2160-2258融合蛋白之約62kDa條帶(B)。C57BL/6小鼠(n=15)皮下經B16F10細胞接種，且在第3天、第10天及第17天腹膜內經Lm-tLLO-HMW-MAA_2160-2258免疫接種(n=8)或留置未經處理(n=7)。BALB/c小鼠(n=16)皮下經RENCA細胞接種，且在第3天、第10天及第17天腹膜內經Lm-HMW-MAA-C(n=8)或等效劑量之對照Lm疫苗免疫接種。經Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫接種之小鼠阻礙確立的腫瘤之生長(C)。FVB/N小鼠(n=13)皮下經NT-2腫瘤細胞接種，且在第7天、第14天及第21天腹膜內經Lm-HMW-MAA-C(n=5)或等效劑量之對照Lm疫苗(n=8)免疫接種。用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫接種小鼠顯著削弱不經工程改造以表現HMW-MAA之腫瘤(諸如B16F10、RENCA及NT-2)之生長(D)。量測各個別腫瘤之腫瘤尺寸且值表示為以毫米為單位的平均直徑±SEM。*，P0.05，曼-惠特尼測試(Mann-Whitney test)。

圖13.用Lm-HMW-MAA-C免疫接種促進腫瘤由CD8⁺T細胞浸潤且減少血管中外被細胞之數目。(A)NT-2腫瘤經移出且切片用於免疫螢光法。對染色組編號(1-3)且在右側指示各染斑。連續組織經針對HMW-MAA小鼠同源物AN2之泛血管標記物抗-CD31或抗-NG2抗體結合針對可能的TIL之抗-CD8α染色。第3組展示用作核標記物的用於以上抗體及DAPI染色之同型對照。分析總共5個腫瘤，且展示各組之單一代表性圖像。血管周圍的CD8⁺細胞由箭頭指示。(B)連續切片藉由使用抗-NG2及抗-α-平滑肌細胞-肌動蛋白(α-SMA)抗體針對外被細胞染色。此等兩種抗體之雙重染色/共定位(合併圖像中之黃色)指示外被細胞染色(上)。外被細胞共定位係使用Image Pro軟體定量且共定位對象之數目展示於圖中(下)。分析總共3個腫瘤，且展示各組之單一代表性圖像。*，P0.05，曼-惠特尼測試。圖中展示平均值±SEM。

圖14.(A)LmddA244G/168表現染色體LLO-cHer2之李斯特菌屬菌株藉由在染色體基因與溫度敏感性李斯特菌屬穿梭質體之間進行雙重對偶基因同源重組以產生LmddA-cHer2之方法構築(稱為LmddA244G)。此外，為產生二價菌株，LmddA244G用含有針對融合蛋白tLLO- HMC的表現卡匣之質體(pAdv168)(B)轉型，產生菌株LmddA244G/168。LmddA菌株用含有針對tLLO-cHer2融合蛋白的表現卡匣之質體pAdv164轉型以產生LmddA164疫苗。LmddA主鏈用含有針對tLLO-HMC(HMW-MAA或CSPG4之C端處之2160-2258胺基酸殘基)融合蛋白的表現卡匣之質體pAv168轉型以產生LmddA168疫苗。(C)此外，藉由西方墨點法分別使用抗-LLO及抗-FLAG抗體偵測LmddA244G/168、LLO-ChHer2及tLLO-HMC中兩種融合蛋白之表現及分泌。

圖15.LmddA244G-168之溶血活性係使用綿羊紅血球定量。A當與10403S相比時觀測到二價免疫療法LmddA244G-168之溶血活性的1.5倍降低。B.二價及單價免疫療法兩者於J774細胞株中之胞內生長。LmddA244G-168之胞內生長類似於單價免疫療法LmddA164及LmddA168。

圖16.A.植入確立的NT2腫瘤，在第6天、第13天及第20天用單一療法及二價治療處理。未處理組為未經處理之小鼠。B.不同處理及未經處理之未處理組中之無腫瘤小鼠百分比。C.LmddA244G-168處理之後確立的NT2腫瘤之體積。

圖17.A.投與表現嵌合體Her2之單價(LmddA164)以及二價免疫療法(LmddA244G-168)之後小鼠中Her2特異性免疫反應之產生。Her2特異性免疫反應在基於ELIspot之分析法中使用FvB IC1肽抗原決定基- RLLQETELV評估(Seavey等人2009,Clin Cancer Res.2009年2月1日；15(3)：924-32)。B.投與表現HMW-MAA-C之單價(LmddA168)以及二價免疫療法(LmddA244G-168)之後小鼠中HMW-MAA-C特異性免疫反應之產生。Her2特異性免疫反應在基於ELISA之分析法中使用親和力純化之HMA-MAA-C蛋白片段評估。

圖18.在腫瘤消退研究之第27天腫瘤抗-CD3抗體之免疫組織化學(IHC)染色。NT2腫瘤在第0天植入且在第6天、第13天及第20天經不同免疫療法免疫接種，(左上圖)未經處理之未處理組；(右上圖)單免疫療法(LmddA164)；(左下圖)單免疫療法(LmddA168)；及(右下圖)二價免疫療法(LmddA244G-168)。

圖19.在腫瘤消退研究之第27天腫瘤抗-CD8抗體之免疫組織化學(IHC)染色。NT2腫瘤在第0天植入且在第6天、第13天及第20天經不同免疫療法免疫接種，(左上圖)未經處理之未處理組；(右上圖)單免疫療法(LmddA164)；(左下圖)單免疫療法(LmddA168)；及(右下圖)二價免疫療法(LmddA244G-168)。

圖20.在腫瘤消退研究之第27天腫瘤抗-CD4抗體之免疫組織化學(IHC)染色。NT2腫瘤在第0天植入且在第6天、第13天及第20天經不同免疫療法免疫接種，(左上圖)未經處理之未處理組；(右上圖)單免疫療法(LmddA164)；(左下圖)單免疫療法(LmddA168)；及(右下圖)二價免疫療法(LmddA244G-168)。

圖21.在腫瘤消退研究之第27天腫瘤抗-CD31抗體之免疫組織化學(IHC)染色。NT2腫瘤在第0天植入且在第6天、第13天及第20天經不同免疫療法免疫接種，(左上圖)未經處理之未處理組；(右上圖)單免疫療法(LmddA164)；(左下圖)單免疫療法(LmddA168)；及(右下圖)二價免疫療法(LmddA244G-168)。

圖22.展示以下腫瘤量測天數時個別小鼠及腫瘤尺寸的圖：在投與各種基於李斯特菌屬之構築體後第11天、第18天及第21天。

圖23.確立的4T1腫瘤在第3天及第10天用單一療法及二價治療處理。未處理組為未經處理之小鼠。

圖24.確立的4T1腫瘤在第1天、第8天及第15天用單一療法及二價療法處理。未處理組為未經處理之小鼠。

圖25.確立的NT2腫瘤用單一療法、二價療法或連續單一療法處理。未處理組為未經處理之小鼠。

圖26.用SIINFEKL袖珍基因(LmddA324)、PSA-存活素-SIINFEKL-His及PSA-PSMA-SIINFEKL-His表現Lm初次免疫接種之後D^bPSA_65-73 dextramer陽性CD8⁺T細胞之百分比。

圖27.用SIINFEKL袖珍基因(LmddA324)、PSA-存活素-SIINFEKL-His及PSA-PSMA-SIINFEKL-His表現Lm初次免疫接種之後K^bOVA_257-264 dextramer陽性CD8⁺T細胞之百分比。

圖28.用SIINFEKL袖珍基因(LmddA324)、PSA-存活素-SIINFEKL-His及PSA-PSMA-SIINFEKL-His表現Lm二次(初加兩次追加)免疫接種之後D^bPSA_65-73 dextramer陽性CD8⁺T細胞之百分比。

圖29.用SIINFEKL袖珍基因(LmddA324)、PSA-存活素-SIINFEKL-His及PSA-PSMA-SIINFEKL-His表現Lm二次(初加兩次追加)免疫接種之後K^bOVA_257-264 dextramer陽性CD8⁺T細胞之百分比。

圖30.展示三種PSA 2.0 Lm構築體及SIINFEKL袖珍基因表現Lm作為陽性對照的表面K^b-SIINFEKL表現水準之假色圖。K^b-SIINFEKL陽性細胞之相對百分比展示於各圖之右上角中。假色圖經用於感染之特異性Lm構築體標記。

圖31為標記有tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTM--HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS融合蛋白表現卡匣及其他特徵的pAdv2142之示意性圖譜。

圖32A及32B展示推定轉型體中pAdv2142之存在的群落PCR。圖32A展示推定MB2159+pAdv2142轉型體之群落PCR。所測試之全部七種推定殖株均產生預期對應於pAdv2142之PSA-存活素-PSGRΔTMs-HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS區之存在的約3kb PCR產物條帶。軌跡：(1)梯型標示；(2)推定殖株1號；(3)推定殖株2號；(4)推定殖株3號；(5)推定殖株4號；(6)推定殖株5號；(7)推定殖株6號；(8)推定殖株7 號。圖32B展示推定LmddA+pAdv2142轉型體之群落PCR。所測試之全部八種推定殖株均產生預期對應於pAdv2142之PSA-存活素-PSGRΔTMs-HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS區之存在的約3kb PCR產物條帶。軌跡：(1)梯型標示；(2-5)無關PCR反應；(6)推定殖株1號；(7)推定殖株2號；(8)推定殖株3號；(9)推定殖株4號；(10)推定殖株5號；(11)推定殖株6號；(12)推定殖株7號；及(13)推定殖株13號。

圖33展示ADXS31-2142感染DC2.4細胞之活體外SIINFEKL呈現。DC2.4樹突狀細胞經所指示菌株在20之MOI下感染。在感染後一小時，洗滌宿主細胞，且將組織培養基置換為含有建它黴素之新鮮培養基以殺死胞外細菌。在感染後五小時，收集宿主細胞，且將其用Alexa647結合25D-1.16抗體染色。然後藉由流式細胞術評定Alexa647⁺ DC2.4細胞之百分比。儘管經非SIINFEKL表現Lm菌株感染之DC2.4細胞不會產生可觀的Alexa647⁺群體(左圖，0.37%之DC2.4)，但ADXS31-2142感染DC2.4細胞產生顯著Alexa647⁺群體(右圖，14.6%之DC2.4細胞)。

應瞭解，為說明之簡單及清晰起見，圖式中所示之元件未必按比例繪製。舉例而言，為清楚起見，可相對於其他元件放大一些元件之尺寸。另外，在認為適當時，可在圖中重複參考編號以指示對應或類似元件。

在以下實施方式中，闡述許多具體細節以便提供對本發明之透徹瞭解。然而，熟習此項技術者應瞭解，本發明可在無如本文具體化之此等特定細節下實踐。在其他情況下，未詳細描述熟知方法、程序及組件，以免混淆本發明。

在一個態樣中，本文揭示一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與兩種或多於兩種異源抗原或其免疫原性片段(諸如前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR)抗原(例如，PSGRΔTM)或其免疫原性片段、hepsin抗原(例如，hepsinΔTM)或其免疫原性片段、前列腺特異性膜抗原(PSMA)抗原(例如，PSMAΔTM)或其抗原片段及AKAP4抗原或其免疫原性片段中之兩者或多於兩者)融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。或者，本文揭示一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段及一或多種額外異源抗原或其免疫原性片段(諸如存活素抗原或其免疫原性片段、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR)抗原(例如，PSGRΔTM)或其免疫原性片段、hepsin抗原(例如，hepsinΔTM)或其免疫原性片段、前列腺特異性膜抗原 (PSMA)抗原(例如，PSMAΔTM)或其抗原片段及AKAP4抗原或其免疫原性片段中之一或多者)融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。

作為一實例，該種重組李斯特菌屬菌株可包含核酸分子，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與PSA抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段、PSGR抗原(例如，PSGRΔTM)或其免疫原性片段及hepsin抗原(例如，hepsinΔTM)或其免疫原性片段融合之截短LLO(tLLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列(參見例如，SEQ ID NO：145中所闡述之核酸序列或SEQ ID NO：183中所闡述之胺基酸序列)。

作為另一實例，該種重組李斯特菌屬菌株可包含核酸分子，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與PSA抗原或其免疫原性片段及存活素抗原或其免疫原性片段融合之tLLO、截短ActA或PEST胺基酸序列(參見例如，SEQ ID NO：92或93中所闡述之核酸序列或SEQ ID NO：117或118中所闡述之胺基酸序列)。作為又一實例，該種重組李斯特菌屬菌株可包含核酸分子，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與PSA抗原或其免疫原性片段及PSMA抗原(例如，PSMAΔTM)或其免疫原性片段融合之tLLO、截短ActA或PEST胺基酸序列(參見例如，SEQ ID NO：94中所闡述之核酸序列或SEQ ID NO：119中所闡述之胺基酸序列)。

在其他非限制性實例中，該融合多肽包含與PSA抗原或其免疫原性片段及PSGR抗原(例如，PSGRΔTM)或其免疫原性片段融合之tLLO、截短ActA或PEST胺基酸序列(參見例如，SEQ ID NO：138或139中所闡述之核酸序列或SEQ ID NO：176或177中所闡述之胺基酸序列)。在其他非限制性實例中，該融合多肽包含與PSA抗原或其免疫原性片段及hepsin抗原(例如，hepsinΔTM)或其免疫原性片段融合之tLLO、截短ActA或PEST胺基酸序列(參見例如，SEQ ID NO：140中所闡述之核酸序列或SEQ ID NO：178中所闡述之胺基酸序列)。在其他非限制性實例中，該融合多肽包含與PSA抗原或其免疫原性片段及AKAP4抗原或其免疫原性片段融合之tLLO、截短ActA或PEST胺基酸序列(參見例如，SEQ ID NO：141中所闡述之核酸序列或SEQ ID NO：179中所闡述之胺基酸序列)。在其他非限制性實例中，該融合多肽包含與PSA抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段及PSGR抗原(例如，PSGRΔTM)或其免疫原性片段融合之tLLO、截短ActA或PEST胺基酸序列(參見例如，SEQ ID NO：142中所闡述之核酸序列或SEQ ID NO：180中所闡述之胺基酸序列)。在其他非限制性實例中，該融合多肽包含與PSA抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段及hepsin抗原(例如，hepsinΔTM)或其免疫原性片段融合之tLLO、截短ActA或PEST胺基酸序列(參見例如，SEQ ID NO：143中所闡述之核酸序列或SEQ ID NO：181中所闡述之胺基酸序列)。在其他非限制性實例中，該融合多肽包含與PSA抗原或其免疫原性片段、PSGR(例如，PSGRΔTM)抗原或其免疫原性片段及hepsin抗原(例如，hepsinΔTM)或其免疫原性片段融合之tLLO、截短ActA或PEST胺基酸序列(參見例如，SEQ ID NO：144中所闡述之核酸序列或SEQ ID NO：182中所闡述之胺基酸序列)。

適合LLO、截短LLO、ActA、截短ActA及PEST胺基酸序列之實例揭示於本文別處。LLO蛋白或截短LLO蛋白之一些實例闡述於SEQ ID NO：4、7、21-24、107及158中。編碼LLO蛋白或截短LLO蛋白之核酸序列之實例闡述於SEQ ID NO：82及120中。ActA蛋白或截短ActA蛋白之一些實例闡述於SEQ ID NO：38、40及41中。編碼ActA蛋白或截短ActA蛋白之核酸之一些實例闡述於SEQ ID NO：39及43中。PEST序列之一些實例闡述於SEQ ID NO：12-20中。LLO蛋白或片段、ActA蛋白或片段及PEST序列及編碼該等LLO蛋白或片段、ActA蛋白或片段及PEST序列之核酸的其他實例揭示於本文別處。

PSA為絲胺酸蛋白酶之亞群之一部分且以中等至高水準表現於前列腺癌中。例示性PSA抗原或其片段包含與SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：159具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。該等PSA抗原或其片段可包括PSA之特異性T細胞抗原決定基之不規則突變及誘導性點突變。PSA抗原或其片段之其他實例包括SEQ ID NO：45-47、49、51、53、55、57、59、61-64及66。編碼PSA抗原或其片段之核酸之實例包括SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、65、83、121及193。PSA抗原或其片段及編碼該等PSA抗原或其片段之核酸之其他實例揭示於本文別處。

存活素為參與細胞週期進程之細胞凋亡抑制劑之家族的成員。其表現於前列腺癌中且亦表現於乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌、肺癌、胰臟癌、腎癌、淋巴瘤及神經母細胞瘤中。癌症組織中之過度表現與不良預後相關。例示性存活素抗原或其片段包含與SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：160具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。該等存活素抗原或其片段可包括存活素之特異性T細胞抗原決定基之不規則突變及誘導性點突變。編碼存活素抗原或其片段之核酸之實例包括SEQ ID NO：84、122及194。存活素抗原或其片段及編碼該等存活素抗原或其片段之核酸之其他實例揭示於本文別處。

PSGR為包括7個跨膜跨越結構域之膜蛋白且以比於正常前列腺或良性前列腺增生中高的水準表現於前列腺癌中。作為一個實例，PSGR抗原或其免疫原性片段可為PSGR之跨膜區已移除之PSGRΔ跨膜結構域(ΔTM)抗原。例示性PSGR抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：162或SEQ ID NO：161具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。該等PSGR抗原或其片段可包括PSGR之特異性T細胞抗原決定基之不規則突變及誘導性點突變。編碼存活素抗原或其片段之核酸之實例包括SEQ ID NO：123、124、195及196。PSGR抗原或其片段及編碼該等PSGR抗原或其片段之核酸之其他實例揭示於本文別處。

Hepsin為顯著過度表現於前列腺癌中但亦擴增於肉瘤、卵巢癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腺樣囊性癌、乳癌、子宮癌及結腸癌中之II型跨膜絲胺酸蛋白酶。其促進前列腺癌轉移，尤其至骨髓。hepsin之水準與高格里森分數(Gleason score)相關且指示不良臨床結果。作為一個實例，hepsin抗原或其免疫原性片段可為hepsin之跨膜區已移除之hepsinΔ跨膜結構域(ΔTM)抗原。例示性hepsin抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：164或 SEQ ID NO：163具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。該等hepsin抗原或其片段可包括hepsin之特異性T細胞抗原決定基之不規則突變及誘導性點突變。編碼存活素抗原或其片段之核酸之實例包括SEQ ID NO：125、126、197及198。hepsin抗原或其片段及編碼該等hepsin抗原或其片段之核酸之其他實例揭示於本文別處。

PSMA為過度表現於前列腺癌中之II型跨膜蛋白。作為一個實例，PSMA抗原或其免疫原性片段可為PSMA之跨膜區已移除之PSMAΔ跨膜結構域(ΔTM)抗原。例示性PSMA抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：111具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。該等PSMA抗原或其片段可包括PSMA之特異性T細胞抗原決定基之不規則突變及誘導性點突變。編碼PSMA抗原或其片段之核酸之實例包括SEQ ID NO：85及86。PSMA抗原或其片段及編碼該等PSMA抗原或其片段之核酸之其他實例揭示於本文別處。

AKAP4為癌-睾抗原家族之成員且表現於前列腺癌中以及NSCLC、卵巢癌、子宮頸癌、乳癌及多發性骨髓瘤中。例示性存活素抗原或其片段包含與SEQ ID NO：165具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。該等AKAP4抗原或其片段可包括AKAP4之特異性T細胞抗原決定基之不規則突變及誘導性點突變。編碼存活素抗原或其片段之核酸之實例包括SEQ ID NO：127。AKAP4抗原或其片段及編碼該等AKAP4抗原或其片段之核酸之其他實例揭示於本文別處。

PSA抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段及兩種或多於兩種抗原或其免疫原性片段在融合蛋白中可呈任何次序。舉例而言，在包含PSA抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段、PSGR抗原或其免疫原性片段及hepsin抗原或其免疫原性片段之融合蛋白中，PSA抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段、PSGR抗原或其免疫原性片段及hepsin抗原或其免疫原性片段可在融合多肽中呈任何次序。作為一個實例，PSA抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段、PSGR抗原或其免疫原性片段及hepsin抗原或其免疫原性片段自N端至C端可呈以下次序：PSA-存活素-PSGR(例如，PSGRΔTM)-hepsin(例如，hepsinΔTM)。類似地，截短LLO(tLLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列可位於融合蛋白內任何位置(例如，N端、C端或內部)且可與抗原或抗原片段中之任一者融合。作為一個實例，融合蛋白自N端至C端可包含：tLLO-PSA-存活素-PSGR(例如，PSGRΔTM)-hepsin(例如，hepsinΔTM)。

tLLO、截短ActA或PEST胺基酸序列可直接與抗原或抗原片段融合或可經由連接子與抗原或抗原片段融合。類似地，抗原或抗原片段可直接與彼此融合或可間接經由連接子融合。例示性連接子闡述於SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：166中。編碼連接子之核酸之實例闡述於SEQ ID NO：87及128中。舉例而言，PSA或其免疫原性片段可藉由第一連接子連接至存活素或其免疫原性片段，存活素或其免疫原性片段可經由第二連接子連接至PSGR(例如，PSGRΔTM)或其免疫原性片段，且PSGR(例如，PSGRΔTM)或其免疫原性片段可經由第三連接子連接至hepsin(例如，hepsinΔTM)或其免疫原性片段。該種融合蛋白之一實例包含與SEQ ID NO：175之殘基1-973或SEQ ID NO：183之殘基1-1414具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。融合蛋白之其他實例包含SEQ ID NO：114-119及168-183中之任一者中闡述之序列。編碼融合蛋白之核酸之實例包括包含SEQ ID NO：89-94、130-145及200中之任一者中闡述之序列的核酸。融合蛋白及其編碼該等融合蛋白之核酸的其他實例揭示於本文別處。

一些融合蛋白進一步包含標籤，諸如C端標籤或N端標籤。該等標籤可包括例如聚組胺酸(His)標籤、SIINFEKL-S-6xHis標籤、FLAG標籤、SIINFEKL-S-Flag標籤、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)或此項技術中已知或本文別處所揭示之任何其他標籤。

在一個實例中，核酸分子為SEQ ID NO：202中闡述之序列至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%。

核酸分子可呈任何形式。在一個實例中，核酸分子可操作地整合至如本文別處更詳細地描述之李斯特菌屬基因組中。在另一實例中，核酸分子在如本文別處更詳細地描述之質體中。舉例而言，該種質體可在不存在抗生素選擇下穩定維持於重組李斯特菌屬菌株中。因此，在一些情況下，質體不賦予重組李斯特菌屬菌株以抗生素抗性。

融合多肽可自能夠驅動於李斯特菌屬菌株中之表現的任何啟動子表現。適合啟動子之實例包括hly啟動子、prfA啟動子、actA啟動子或p60啟動子。在一個具體例中，啟動子為hly啟動子。其他適合啟動子揭示於本文別處。

較佳地，李斯特菌屬菌株經減毒。該種減毒李斯特菌屬菌株可包含例如一或多種內源性基因中之突變。該等突變可包含一或多種內源性基因之失活、截短、缺失、置換或破壞或任何其他類型之突變。減毒李斯特菌屬菌株之不同方式更詳細地揭示於本文別處。舉例而言，減毒李斯特菌屬菌株可包含actA致病性基因、內源性prfA基因、內源性D-丙胺酸消旋酶(Dal)及D-胺基酸轉移酶(Dat)基因中之突變或其組合。在一個實例中，減毒李斯特菌屬菌株包含actA致病性基因、D-丙胺酸消旋酶(Dal)基因及D-胺基酸轉移酶(Dat)基因中之突變。

在一些情況下，核酸分子可包含第二開讀框。作為一實例，第二開讀框可編碼代謝酶。或者，李斯特菌屬菌株可包含第二核酸分子，該核酸分子包含編碼代謝酶之開讀框。各種類型的編碼代謝酶之核酸更詳細地揭示於本文別處。舉例而言，李斯特菌屬菌株可為營養缺陷型李斯特菌屬菌株，且代謝酶可補充該營養缺陷型李斯特菌屬菌株之營養缺陷。代謝酶之實例更詳細地揭示於本文別處。舉例而言，代謝酶可為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。在一個實例中，李斯特菌屬菌株為包含actA致病性基因、D-丙胺酸消旋酶(Dal)基因及D-胺基酸轉移酶 (Dat)基因中之突變的減毒李斯特菌屬菌株，且核酸分子包含編碼丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶之第二開讀框或李斯特菌屬菌株包含編碼丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶之第二核酸分子。Dal基因之一實例闡述於SEQ ID NO：68中，且Dat基因之一實例闡述於SEQ ID NO：70中。Dal蛋白質之一實例闡述於SEQ ID NO：69中，且Dat蛋白質之一實例闡述於SEQ ID NO：71中。

李斯特菌屬菌株可為任何類型之李斯特菌屬菌株，其實例揭示於本文別處。較佳地，李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。類似地，較佳李斯特菌屬菌株為營養缺陷型李斯特菌屬菌株。視情況，李斯特菌屬菌株能夠逃脫吞噬溶菌體。視情況，李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。

本文所揭示之李斯特菌屬菌株中任一者可用於免疫原性組成物中。該等免疫原性組成物可進一步包含佐劑。佐劑之實例包括顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。其他適合佐劑揭示於本文別處。

本文所揭示之李斯特菌屬菌株中任一者及免疫原性組成物中任一者可用於在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法中，該等方法包含向該個體投與該李斯特菌屬菌株或該免疫原性組成物。類似地，本文所揭示之李斯特菌屬菌株中任一者及免疫原性組成物中任一者可用於預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法中，該等方法包含向該個體投與該李斯特菌屬菌株或該免疫原性組成物。腫瘤或癌症之實例包括PSA表現腫瘤或癌症、存活素表現腫瘤或癌症、PSGR表現腫瘤或癌症或hepsin表現腫瘤或癌症，諸如前列腺腫瘤或癌症。投藥之劑量及方法之實例更詳細地揭示於本文別處。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中引發抗腫瘤或抗癌免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與有效量之包含包括重組核酸分子之重組李斯特菌屬菌株之免疫原性組成物的步驟，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，其中該融合多肽包含與異源抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，且其中該李斯特菌屬表現該融合多肽，因此在該個體中引發抗腫瘤或抗癌免疫反應。

在一個具體例中，本文揭示一種免疫原性組成物，其包含包括重組核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，其中該融合多肽包含與內皮因子序列或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該李斯特菌屬菌株在編碼D-丙胺酸消旋酶(dal)及D-胺基酸轉移酶(dat)基因之內源性基因中及在編碼ActA之致病性基因(actA)中包含突變。

在另一態樣中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株中之重組核酸分子包含第二開讀框。在另一態樣中，該第二開讀框編碼第二融合多肽，其中該融合多肽包含與異源抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，且其中該李斯特菌屬表現該第二融合多肽。

在另一具體例中，本文揭示一種包含二價表現游離基因體或質體之重組李斯特菌屬菌株，該二價表現游離基因體或質體包含編碼第一及第二融合多肽之第一及第二核苷酸分子，其中該第一及該第二多肽各自包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列融合之異源抗原。在另一具體例中，該融合多肽或融合多肽中之各融合搭配物中的每一者在該核酸分子內於開讀框中編碼。

在一個具體例中，本文揭示一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其免疫原性片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼融合多肽之第二開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性膜抗原(PSMA)或其免疫原性片段。

在另一具體例中，本文揭示一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其免疫原性片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼融合多肽之第二開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之存活素抗原或其免疫原性片段。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中誘導抗腫瘤免疫反應之方法，其包含向該個體投與本文所揭示之重組李斯特菌屬的步驟。在另一具體例中，該免疫反應允許治療、遏制或抑制個體中之癌症。

在一個具體例中，本文揭示一種包含編碼第一及第二多肽之第一核苷酸分子及第二核苷酸分子之重組李斯特菌屬菌株，其中該第一及該第二多肽各自包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列融合之異源抗原，其中該第一核苷酸分子在染色體外游離基因體或染色體外質體中，且其中該第二核苷酸分子整合至李斯特菌屬基因組中。

在另一具體例中，本文揭示一種包含二價表現游離基因體或質體之重組李斯特菌屬菌株，該二價表現游離基因體或質體包含編碼第一及第二融合多肽之核苷酸分子，其中該第一及該第二多肽各自包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列融合之異源抗原。

在另一具體例中，本文揭示一種包含第一及第二核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，其中該第一核酸分子編碼重組多肽，該重組多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)融合之碳酸酐酶9(CA9)抗原或其功能片段，且其中該第二核酸分子編碼與內源性LLO融合之嵌合HER(cHER2)蛋白。

在另一具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含第一核酸分子，該第一核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其功能片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼融合多肽之第二開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之存活素抗原。

在另一具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含第一核酸分子，該第一核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其功能片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼融合多肽之第二開讀框，該融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性膜抗原(PSMA)。

在另一具體例中，本發明揭示一種增加基於李斯特菌屬之免疫療法之功效的方法，該方法包含向患有腫瘤之個體依序或同時投與兩種或多於兩種重組李斯特菌屬菌株。在一相關態樣中，依序或同時投與之李斯特菌屬菌株各自包含核酸分子，該核酸分子編碼重組多肽，該重組多肽包含與含PEST多肽融合之異源抗原。在另一相關態樣中，異源抗原為嵌合HER(cHER2)、CA9、PSA或HMW-MAA-C。在另一具體例中，增加基於李斯特菌屬之免疫療法之功效的方法由於投與其而增強抗原特異性免疫反應。

在一個具體例中，本文揭示一種產生包含二價表現質體之重組李斯特菌屬菌株的方法，該二價表現質體包含編碼第一及第二融合多肽之第一及第二核苷酸分子或包含編碼第一及第二融合多肽之核苷酸分子，其中該第一及該第二融合多肽各自包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之異源抗原，該方法包含以下步驟：a)獲得質體；b)在該質體中重組地融合該第一與第二核苷酸分子；c)將該重組李斯特菌屬轉型至該質體中；及d)藉由在有利於蛋白質表現之條件下培養該李斯特菌屬使該融合蛋白表現；因此產生重組李斯特菌屬菌株。

在另一具體例中，本文揭示一種產生包含二價表現質體之重組李斯特菌屬菌株的方法，該二價表現質體包含編碼第一及第二融合多肽之第一及第二核苷酸分子或包含編碼第一及第二融合多肽之核苷酸分子，其中該第一及該第二多肽各自包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之異源抗原，該方法包含以下步驟：a)獲得質體；b)在該質體中重組地融合該第一與第二核苷酸分子；及c)將該重組李斯特菌屬轉型至該質體中；因此產生重組李斯特菌屬菌株。

在另一具體例中，本文揭示一種包含二價附加型表現載體之重組李斯特菌屬菌株，該載體包含編碼異源抗原性多肽或其功能片段之第一及至少第二核酸分子，其中該第一及該第二核酸分子各自在具有截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列之開讀框中編碼該異源抗原性多肽或其功能片段。

應瞭解，當關於核苷酸分子、質體或載體時，術語「二價」或「多價」可涵蓋表現兩種(二價)、三種(多價)或多於三種(多價)各自獨立地與N端或截短LLO、N端ActA或PEST序列或PEST肽融合的異源抗原之核苷酸分子、核酸、DNA序列、質體及其類似物。在另一具體例中，二價質體編碼兩種異源抗原。在另一具體例中，二價質體編碼兩種不同異源抗原。在另一具體例中，術語「二價」在本文中與「雙重」可互換地使用。在另一具體例中，多價質體編碼三種或多於三種不同異源抗原。

應瞭解，當關於重組李斯特菌屬菌株時，術語「二價」或「多價」可涵蓋能夠表現兩種(二價)或多於兩種(多價)異源抗原之李斯特菌屬菌株。應瞭解，當關於重組李斯特菌屬菌株時，術語「二價」或「多價」可涵蓋表現兩種(二價)或多於兩種(多價)異源抗原之李斯特菌屬菌株。在一個具體例中，二價李斯特菌屬菌株包含自染色體外質體或附加型載體表現兩種異源抗原之二價質體。在另一具體例中，二價李斯特菌屬菌株自基因組表現一種異源抗原(在異源抗原整合至李斯特菌屬基因組中之後)，且自存在於該李斯特菌屬菌株之細胞質中之質體表現另一異源抗原。在另一具體例中，多價李斯特菌屬菌株自質體表現三種或多於三種異源抗原。在另一具體例中，多價李斯特菌屬菌株表現三種異源抗原，一種自基因組表現(在異源抗原整合至李斯特菌屬基因組中之後)且兩種自存在於李斯特菌屬菌株之細胞質中之質體表現。在另一具體例中，多價李斯特菌屬菌株表現三種異源抗原，兩種自基因組表現(在異源抗原整合至李斯特菌屬基因組中之後)且一種自存在於李斯特菌屬菌株之細胞質中之質體表現。熟練技術人員將充分瞭解，多價李斯特菌屬菌株包含表現總計三種或多於三種異源抗原之能力，其中至少一種自基因組或質體表現(呈任何所要組合，亦即，3種自質體及1種自基因組表現，2種自質體及2種自基因組表現，1種自質體及3種自基因組表現，等)。

在另一具體例中，二價李斯特菌屬菌株在與內源性LLO基因序列的融合蛋白之情形下自基因組表現一種異源抗原(在異源抗原整合至李斯特菌屬基因組中之LLO基因的框中之後)，且在與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列的融合蛋白之情形下自存在於該李斯特菌屬菌株之細胞質中之質體表現另一異源抗原。在另一具體例中，多價李斯特菌屬菌株自質體表現三種異源抗原，全部在與含PEST之多肽的融合蛋白之情形下。在另一具體例中，多價李斯特菌屬菌株表現三種異源抗原，一種自基因組表現(在異源抗原整合至李斯特菌屬基因組中之內源性LLO基因序列中之後)，且在截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列之情形下兩種異源抗原自存在於李斯特菌屬菌株之細胞質中之質體表現。在另一具體例中，多價李斯特菌屬菌株表現三種異源抗原，兩種自基因組表現(在異源抗原整合至李斯特菌屬基因組中之內源性LLO基因序列中之後)且一種自存在於李斯特菌屬菌株之細胞質中之質體表現，全部在與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列的融合蛋白之情形下。熟練技術人員將充分瞭解，多價李斯特菌屬菌株包含表現總計三種或多於三種異源抗原之能力，其中至少一種自基因組或質體表現(呈任何所要組合，亦即，3種自質體及1種自基因組表現，2種自質體及2種自基因組表現，1種自質體及3種自基因組表現，等)，全部在與截短李斯特菌溶胞素 O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列的融合蛋白之情形下。

在一個具體例中，本文揭示一種包含袖珍基因核酸構築體之重組李斯特菌屬菌株，該袖珍基因核酸構築體包含編碼嵌合蛋白質之開讀框，其中該嵌合蛋白質包含(i)細菌分泌信號序列；(ii)泛素(Ub)蛋白質；(iii)肽；且其中i.-iii.中之該信號序列、該泛素及該肽自胺基端至羧基端以串聯次序可操作地連接。

在一個具體例中，本文揭示一種重組減毒之李斯特菌屬菌株，其包含：(a)核酸分子，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，其中該融合多肽包含與一或多種異源抗原融合之免疫原性多肽或其片段；或(b)袖珍基因核酸構築體，其包含編碼嵌合蛋白質之一或多個開讀框，其中該嵌合蛋白質包含：(i)細菌分泌信號序列，(ii)泛素(Ub)蛋白質，(iii)一或多種抗原性肽；且其中(i)-(iii)中之該信號序列、該泛素及一或多種抗原性肽自胺基端至羧基端可操作地連接或串聯排列。

在一個具體例中，李斯特菌屬進一步包含兩個或多於兩個由夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)核糖體結合位點核酸序列連接之開讀框。

在另一具體例中，重組李斯特菌屬進一步包含一至四個開讀框，該等開讀框在各開讀框之間由夏因-達爾加諾核糖體結合位點核酸序列連接。在另一具體例中，各開讀框包含不同抗原肽。

在另一具體例中，本文揭示一種在患有腫瘤或癌症之個體中引發抗腫瘤或抗癌反應之方法，該方法包含向該個體投與本文所揭示之包含袖珍基因核酸構築體之重組李斯特菌屬的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種治療個體中之腫瘤或癌症的方法，該方法包含向該個體投與本文所揭示之包含袖珍基因核酸構築體之重組李斯特菌屬的步驟。

熟練技術人員將瞭解，術語「核酸」及其文法相當詞可指一分子，其可包括(但不限於)原核序列、真核mRNA、來自真核mRNA之cDNA、來自真核(例如，哺乳動物)DNA之基因組DNA序列、及甚至合成DNA序列。該術語亦指包括DNA及RNA之任何已知鹼基類似物的序列。

熟練技術人員將瞭解，術語「癌症」及「腫瘤」可全部具有相同含義及品質。

在另一具體例中，本文揭示用於誘導對抗腫瘤抗原之免疫反應的組成物及方法。在另一具體例中，腫瘤抗原為異源抗原。在另一具體例中，腫瘤抗原為自身抗原。在另一具體例中，本文提供用於誘導對抗感染性疾病抗原之免疫反應的組成物及方法。在另一具體例中，感染性疾病抗原為異源抗原。在另一具體例中，本發明之組成物及方法係用於對抗腫瘤或癌症之疫苗接種。

在又另一具體例中，本發明之組成物及方法防止治療後逃逸突變之發生。在另一具體例中，本文提供用於向罹患腫瘤或癌症之個體提供無進展存活之組成物及方法。在另一具體例中，本文揭示用於免疫接種一個體對抗癌症或腫瘤的組成物及方法。在另一具體例中，本文揭示用於免疫接種一個體對抗癌症或腫瘤的組成物及方法。在另一具體例中，癌症為腫瘤轉移。

在一個具體例中，本文揭示一種重組減毒之李斯特菌屬菌株，其包含編碼嵌合蛋白質之核酸構築體。在另一具體例中，核酸構築體為重組核酸構築體。在另一具體例中，本文揭示一種包含重組核酸構築體的重組減毒之李斯特菌屬菌株，該重組核酸構築體包含編碼細菌分泌信號序列(SS)、泛素(Ub)蛋白質及肽序列之開讀框。在另一具體例中，核酸構築體編碼包含細菌分泌信號序列、泛素蛋白質及肽序列之嵌合蛋白質。在另一具體例中，細菌分泌信號序列為李斯特菌屬信號序列。在一個具體例中，嵌合蛋白質依以下方式(SS-Ub-肽)排列。

在一個具體例中，本文所揭示之袖珍基因核酸構築體包含對應於肽部分之羧基端的密碼子，接著為兩個終止密碼子以確保蛋白質合成之終止。

在一個具體例中，本文提供一種重組減毒之李斯特菌屬菌株，其包含編碼嵌合蛋白質之核酸構築體。在另一具體例中，核酸構築體為重組核酸構築體。在另一具體例中，本文提供一種重組減毒之李斯特菌屬菌株，其包含含有編碼細菌分泌信號序列(SS)、泛素(Ub)蛋白質及肽序列之開讀框的重組核酸構築體。在另一具體例中，核酸構築體編碼包含細菌分泌信號序列、泛素蛋白質及肽序列之嵌合蛋白質。在一個具體例中，嵌合蛋白質依以下方式(SS-Ub-肽)排列，其中各組件可操作地彼此連接，在胺基端處開始於信號序列且在羧基端處終止於肽序列。

在一個具體例中，袖珍基因核酸構築體包含對應於肽部分之羧基端的密碼子，接著為兩個終止密碼子以確保蛋白質合成之終止。

在一個具體例中，本發明之嵌合蛋白質係合成，在另一具體例中，係使用重組DNA方法合成。在一個具體例中，此涉及產生編碼嵌合蛋白質之DNA序列，在特定啟動子/調節元體控制之下，將DNA置於表現卡匣(諸如本發明之質體)內，及表現蛋白質。在另一具體例中，本發明之編碼嵌合蛋白質(例如，SS-Ub-肽)之DNA係藉任何適合方法製備，包括例如，適當序列之選殖及限制，或藉由下列方法直接化學合成，諸如Narang等人之磷酸三酯方法(1979,Meth.Enzymol.68：90-99)；Brown等人之磷酸二酯方法(1979,Meth.Enzymol 68：109-151)；Beaucage等人之亞磷酸二乙酯一醯胺方法(1981,Tetra.Lett.,22：151859-1862)；及美國專利第4,458,066號之固體載體方法。

在另一具體例中，本發明之編碼嵌合蛋白質或重組蛋白質之DNA係使用DNA擴增法(諸如聚合酶連鎖反應(PCR))選殖。在另一具體例中，化學合成係用來產生單股寡核苷酸。在各種具體例中，此種單股寡核苷酸藉與互補序列雜交，或藉使用單股作模板與DNA聚合酶聚合而轉成雙股DNA。熟習此項技術者將瞭解，雖然DNA之化學合成受限於約100鹼基之序列，但藉接合較短序列可獲得更長的序列。在另一具體例中，子序列經選殖，及適當子序列使用適當限制酶裂解。然後該等片段經接合而產生所要DNA序列。

在一個具體例中，本文揭示之編碼嵌合蛋白質的核酸序列轉型入多種宿主細胞，包括大腸桿菌、其他細菌性宿主(諸如李斯特菌屬)、酵母、及各種高等真核細胞(諸如COS、CHO及HeLa細胞株)、及骨髓瘤細胞株。對各宿主，本文提供之編碼嵌合蛋白質的核酸序列可操作地連接至適當表現控制序列。啟動子/調節序列係於本文中容後詳述。在另一具體例中，本文所提供之編碼嵌合蛋白質的質體進一步包含額外啟動子調節元體，以及核糖體結合位點及轉錄終止信號。用於真核細胞，控制序列將包括衍生自例如免疫球蛋白基因、SV40、細胞巨病毒等的啟動子及強化子，及多腺苷酸化序列。在另一個具體例中，該等序列包括剪接給予者序列及接受者序列。

在一個具體例中，本文所揭示之袖珍基因核酸構築體或包含其之質體包含允許編碼至少一個如本文所提供之嵌合蛋白質的至少一個核糖體結合位點及至少一個轉錄終止信號，各自包含不同的肽抗原。在一個具體例中，本文所提供之質體包含允許編碼1至4個如本文所提供之嵌合蛋白質的1至4個核糖體結合核糖體結合位點及 1至4個轉錄終止信號，各自包含不同的肽抗原。在一個具體例中，本文所提供之質體包含允許編碼5至10個如本文所提供之嵌合蛋白質的5至10個核糖體結合核糖體結合位點及5至10個轉錄終止信號，各自包含不同的肽抗原。在一個具體例中，本文所提供之質體包含允許編碼11至20個如本文所提供之嵌合蛋白質的11至20個核糖體結合核糖體結合位點及11至20個轉錄終止信號，各自包含不同的肽抗原。在一個具體例中，本文所提供之質體包含允許編碼21至30個如本文所提供之嵌合蛋白質的21至30個核糖體結合核糖體結合位點及21至30個轉錄終止信號，各自包含不同的肽抗原。在另一具體例中，核糖體結合位點為夏因-達爾加諾核糖體結合位點。

在一個具體例中，術語「可操作地連接」意謂轉錄及轉譯調節核酸以起始轉錄之方式相對於任何編碼序列定位。一般而言，此將意謂啟動子及轉錄起始或開始序列定位於編碼區之5'。在另一具體例中，術語「可操作地連接」係指並列位置，其中如此描述之組件係呈允許其以其預期方式發揮作用的關係。「可操作地連接」至編碼序列的控制序列之接合方式使得在與該等控制序列可相容的條件下達成編碼序列之表現。在另一具體例中，術語「可操作地連接」係指在一轉錄單元中數個開讀框的接合各自編碼蛋白質或肽，因而導致如預期發揮功能的嵌合蛋白質或多肽的表現。

在一個具體例中，「開讀框」或「ORF」為含有可潛在地編碼蛋白質之鹼基序列的生物體基因組的一部分。在另一具體例中，ORF之開始及終止末端不同等於mRNA之末端，但其通常含於mRNA內。在一個具體例中，ORF位於基因之開始編碼序列(起始密碼子)與停止密碼子序列(終止密碼子)之間。因此，舉個實施例，可操作地整合至基因組內具有內源性多肽之開讀框的核酸分子為整合至基因組內在與內源性多肽相同開讀框中的核酸分子。

在一個具體例中，本發明提供包含連接序列之融合多肽。熟練技術人員將瞭解，「連接子序列」可涵蓋聯結兩個異源性多肽的胺基酸序列、或其片段或其結構域。一般而言，連接子為共價連接多肽形成融合多肽之胺基酸序列。連接子通常包括自呈現載體移除報導基因之後從剩餘的重組信號轉譯的胺基酸，以產生包含由開讀框編碼之胺基酸序列及呈現蛋白的融合蛋白。如熟習此項技術者所瞭解，連接子可包含額外胺基酸，諸如甘胺酸及其他中性小胺基酸。

本文揭示之重組或嵌合蛋白質或融合多肽可藉任何適合方法製備，包括例如，經由下文討論之方法，適當序列之選殖及限制或直接化學合成。另外，子序列可經選殖，及使用適當限制酶裂解適當子序列。然後該等片段可經接合來生產期望的DNA序列。在一個具體例中，編碼抗原的DNA可使用DNA擴增法，例如聚合酶連鎖反應(PCR)生產。首先，在新終端任一側上的原生DNA之區段係經分開擴增。一個已擴增序列的5'端編碼肽連接子，而另一個已擴增序列的3'端亦編碼肽連接子。因第一片段的5'端係與第二片段的3'端互補，故兩個片段(在部分純化後，例如於LMP瓊脂上部分純化後)可用作為第三PCR反應中的重疊模板。已擴增序列將含有密碼子，在開放位點的羧基側上的區段(現在形成胺基序列)，及在開放位點的胺基側上的區段(現在形成羧基序列)。抗原接合入質體內。

熟練技術人員應理解，術語「多肽」及「蛋白質」全部具有用於其於本文中之預期使用目的的相同含義及資質。

在一個具體例中，本文揭示之融合多肽或嵌合蛋白質藉由本文揭示之重組李斯特菌屬表現及分泌。在另一具體例中，本文揭示之融合多肽或嵌合蛋白質包含C端SIINFEKL-S-6xHIS標籤。在另一具體例中，本文所揭示之融合多肽或嵌合蛋白質包含FLAG標籤或SIINFEKL-S-FLAG標籤(例如，C端或N端FLAG標籤或C端或N端SIINFEKL-S-FLAG標籤)。在另一具體例中，本文揭示之融合多肽或嵌合蛋白質藉由本文揭示之重組李斯特菌屬表現及分泌。在另一具體例中，使用特異性結合於聚組胺酸(His)標籤之蛋白質、分子或抗體(或其片段)偵測到本文揭示之抗原或多肽(融合物或嵌合)的分泌。在另一具體例中，本文揭示之融合多肽或嵌合蛋白質藉由本文揭示之重組李斯特菌屬表現及分泌。在另一具體例中，使用結合 SIINFEKL-S-6xHIS標籤之抗體、蛋白質或分子偵測到本文揭示之抗原或多肽(融合物或嵌合)的分泌。在另一具體例中，本文揭示之嵌合蛋白質之融合多肽包含此項技術中已知之任何其他標籤，包括(但不限於)幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)及麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、硫氧還蛋白(TRX)及聚(NANP)。

術語「抗原」、「抗原肽」、「抗原性多肽」、「抗原片段」於本文中可互換使用且，如熟練技術人員將瞭解，可涵蓋如下多肽或肽(包括重組肽)，其負載至宿主細胞表面上的MHC I類及/或II類分子上且呈現於其上，且可由宿主之免疫細胞辨識或偵測，藉此導致對抗多肽、肽或呈現其之細胞的免疫反應之安裝。類似地，免疫反應亦可擴延至宿主內之其他細胞，包括表現相同多肽或肽之生病細胞(諸如腫瘤或癌症細胞)。

在一個具體例中，抗原可為外來的，亦即對宿主為異源的且於本文中稱為「異源抗原」。在另一具體例中，異源抗原對重組地表現該抗原的本文所揭示之李斯特菌屬菌株為異源的。在另一具體例中，異源抗原對宿主及重組地表現該抗原的本文所揭示之李斯特菌屬菌株為異源的。在另一具體例中，抗原為自身抗原，其為存在於宿主中，但宿主因為免疫耐受性而不會引起對其之免疫反應的抗原。熟練技術人員將瞭解，異源抗原以及自身抗原可涵蓋腫瘤抗原、腫瘤相關抗原、或血管生成性抗原。此外，異源抗原可涵蓋感染性疾病抗原。

在一個具體例中，術語「重組李斯特菌屬」及「活減毒之李斯特菌屬」在本文中可互換使用且係指表現本文具體化的與截短LLO、截短ActA或PEST序列融合之抗原之至少一種融合蛋白的包含至少一個減毒突變、缺失或失活之李斯特菌屬。在另一具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬為重組單核球增多性李斯特菌。

熟練技術人員亦將瞭解，關於蛋白質、肽或多肽的術語「其抗原性部分」、「其片段」及「其免疫原性部分」於本文中可互換使用且可涵蓋包含一結構域或區段之蛋白質、多肽、肽(包括其重組形式)，該結構域或區段當單獨存在，或如本文所述，於融合蛋白之情形下存在於，或在一些具體例中，由宿主可偵測時導致免疫反應之發動。

如熟練技術人員將瞭解，術語「核酸」、「核苷酸」、「核酸分子」、「寡核苷酸」或「核苷酸分子」在本文中可互換使用且可涵蓋一串至少兩個鹼基-糖-磷酸酯組合。在一個具體例中，該等術語包括DNA及RNA。熟練技術人員亦將瞭解，該等術語可涵蓋核酸聚合物之單體單元。舉例而言，RNA可呈tRNA(轉移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖體RNA)、mRNA(信使RNA)、反義RNA、小抑制RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)及核糖核酸酶形式。已描述siRNA及miRNA之用途(Caudy AA等人，Genes & Devel 16：2491-96及其中引用之參考文獻)。DNA可呈質體DNA、病毒 DNA、線性DNA或染色體DNA或此等基團之衍生物形式。另外，此等形式之DNA及RNA可呈單股、雙股、三股或四股。該等術語亦可涵蓋可含有其他類型之主鏈但鹼基相同之人工核酸。硫代磷酸酯核酸及PNA之用途為熟習此項技術者已知且描述於例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9：353-57；及Raz NK等人Biochem Biophys Res Commun.297：1075-84中。核酸之產生及使用為熟習此項技術者已知，且描述於例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook及Russell編輯及Methods in Enzymology：Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio及G.C.Fareed。

術語「胺基酸」理解為包括20種天然存在之胺基酸；通常經活體內轉譯後修飾之彼等胺基酸，包括例如羥基脯胺酸、磷酸絲胺酸及磷酸蘇胺酸；及其他非尋常胺基酸，包括(但不限於)2-胺基己二酸、羥基離胺酸、異鎖鏈素、正纈胺酸、正白胺酸及鳥胺酸。此外，術語「胺基酸」可包括D-胺基酸及L-胺基酸兩者。

熟練技術人員應瞭解，術語「開讀框」或「ORF」可涵蓋含有可潛在地編碼蛋白質之鹼基序列的生物體基因組的一部分。在另一具體例中，ORF之開始及終止末端不同等於mRNA之末端，但其通常含於mRNA內。在一個具體例中，ORF位於基因之開始編碼序列(起始密碼子)與停止密碼子序列(終止密碼子)之間。因此，在一個具體例中，可操作地整合至基因組中具有內源性多肽之開讀框的核酸分子為整合至基因組中與內源性多肽相同開讀框中的核酸分子。

熟練技術人員應瞭解，術語「內源性」可涵蓋在參考生物體內發育或起源或由參考生物體內之原因而出現的項目。例如，內源性係指原生的。

熟練技術人員亦將瞭解，術語「片段」可涵蓋比全長蛋白質或多肽短或包含較少胺基酸之蛋白質或多肽。在一個具體例中，片段為N端片段。在另一具體例中，LLO片段為C端片段。在又另一具體例中，片段為蛋白質或肽之序列內區段。熟練技術人員應理解，如本文所揭示之片段為功能片段，其可涵蓋免疫原性片段。在一個具體例中，片段具有多於5個胺基酸。在另一具體例中，片段具有10-20個胺基酸、20-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-350個胺基酸或350-500個胺基酸。

在一替代性具體例中，術語「片段」係指比全長核酸短或包含較少核苷酸之核酸。在一個具體例中，片段為5'端片段。在另一具體例中，片段為3'端片段。在又另一具體例中，片段編碼蛋白質之序列內區段。在一個具體例中，片段具有多於5個核苷酸。在另一具體例中，片段具有10-20個核苷酸、20-50個核苷酸、50-100個核苷酸、100-200個核苷酸、200-350個核苷酸、350-500個或500-1000個核苷酸。熟練技術人員應瞭解，在本發明之意義內，術語「功能性」可涵蓋蛋白質、肽、核酸、其片段或變異體展現生物活性之固有能力。當如本文所揭示使用時，該種生物活性可涵蓋具有引發免疫反應之潛力，其說明可用作融合蛋白之一部分。該種生物功能可涵蓋其與相互作用搭配物(例如，膜相關受體)結合之特性或其三聚特性。在本發明之功能片段及功能變異體的情況下，此等生物學功能可實際上在例如其特異性或選擇性方面進行變化，但保持基本生物功能。

熟練技術人員應瞭解，術語「片段」或「功能片段」可涵蓋一免疫原性片段，其當單獨或作為包含表現該免疫原性片段之重組李斯特菌屬菌株的醫藥組成物之一部分向個體投與時能夠引發免疫反應。在另一具體例中，功能片段將為熟習此項技術者理解且如本文進一步提供之生物活性。

在一個具體例中，本文揭示一種多價質體，其遞送至少兩種抗原。在另一具體例中，質體為雙重或二價質體。在另一具體例中，雙重、二價或多價質體本質上為附加型的，因為其保持在染色體外。在另一具體例中，雙重或多價質體包含用於整合至李斯特菌屬染色體中之序列。

在一個具體例中，本文揭示一種多價重組李斯特菌屬菌株質體，其表現至少兩種各自與截短LLO、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之抗原。在另一具體例中，重組李斯特菌屬為雙重或二價李斯特菌屬。

在另一具體例中，本文所揭示之質體之重組核酸主鏈包含SEQ ID NO：1。

在一個具體例中，二價質體主鏈包含編碼至少兩種抗原之至少兩個核酸序列。在另一具體例中，二價質體主鏈包含具有編碼至少兩種抗原之至少兩個開讀框的核酸序列。在另一具體例中，二價質體主鏈包含具有編碼兩種抗原之兩個開讀框的核酸序列。在另一具體例中，多價質體主鏈包含具有編碼至少三種抗原之至少三個開讀框的核酸序列。

在另一具體例中，多價質體主鏈包含具有編碼至少三種抗原之至少三個開讀框的至少三個核酸序列。在另一具體例中，多價質體主鏈包含具有編碼三種抗原之三個開讀框的核酸序列。在另一具體例中，多價質體主鏈包含具有編碼三種抗原之三個開讀框的三個核酸序列。

在一個具體例中，由本文所揭示之二價李斯特菌屬菌株編碼之抗原包括CA9、嵌合HER2(cHER2)及HMW-MAA或其片段(參看本文之實施例11-16)。在另一具體例中，HMW-MAA片段為HMW-MAA-C(HMC)。

在一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株LmddA244G包含核酸序列，該核酸序列包含編碼與內源性核酸融合的cHER2之開讀框、包含編碼LLO蛋白之開讀框(參看SEQ ID NO：2)，其中位置1594-2850處之序列表示編碼cHER2之核酸序列，位置1-1587處之序列表示編碼內源性LLO蛋白之序列，且位置1588-1593處之「gtcgac」序列表示用以使腫瘤抗原與內源性LLO接合之Sal I限制位點。在一個具體例中，內源性LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：2之同源物。在另一具體例中，內源性LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：2之變異體。在另一具體例中，內源性LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：2之異構體。

在一個具體例中，cHER2與內源性LLO之間的融合物之胺基酸序列包含SEQ ID NO：3。在一個具體例中，內源性LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：3之同源物。在另一具體例中，內源性LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：3之變異體。在另一具體例中，內源性LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：3之異構體。

在一個具體例中，內源性LLO蛋白之胺基酸序列包含SEQ ID NO：4。

在一個具體例中，LmddA164包含核酸序列，該核酸序列包含編碼與cHER2融合的tLLO之開讀框，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：5，其中位置1330至2586處之序列編碼cHER2，位置1至1323處之序列編碼tLLO，且位置1324-1329處之「ctcgag」序列表示用以使腫瘤抗原與質體中之截短LLO接合之Xho I限制位點。在另一具體例中，質體pAdv168包含SEQ ID NO：5。在一個具體例中，截短LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：5之同源物。在另一具體例中，截短LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：5之變異體。在另一具體例中，截短LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：5之異構體。

在一個具體例中，與cHER2融合的tLLO之胺基酸序列包含SEQ ID NO：6。在一個具體例中，截短LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：6之同源物。在另一具體例中，截短LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：6之變異體。在另一具體例中，截短LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：6之異構體。

在一個具體例中，截短LLO(tLLO)之胺基酸序列包含SEQ ID NO：7。

在一個具體例中，LmddA168包含核酸序列，該核酸序列包含編碼與HMW-MAA-C(HMC)融合的tLLO之開讀框，包含SEQ ID NO：8，其中位置1330-1647處之序列編碼HMC，位置1-1323處之序列編碼tLLO，且位置1324-1329處之「ctcgag」序列表示用以使腫瘤抗原與質體中之截短LLO接合之Xho I限制位點。在另一具體例中，質體pAdv168包含SEQ ID NO：8。在一個具體例中，截短LLO-HMC融合物為SEQ ID NO：8之同源物。在另一具體例中，截短LLO-HMC融合物為SEQ ID NO：8之變異體。在另一具體例中，截短LLO-HMC融合物為SEQ ID NO：8之異構體。

在一個具體例中，與HMC抗原融合的tLLO之胺基酸序列包含SEQ ID NO：9。在一個具體例中，截短LLO-HMC融合物為SEQ ID NO：9之同源物。在另一具體例中，截短LLO-HMC融合物為SEQ ID NO：9之變異體。在另一具體例中，截短LLO-HMC融合物為SEQ ID NO：9之異構體。

在一個具體例中，HMC之序列包含SEQ ID NO：10。

在一個具體例中，抗原對攜有該質體之細菌宿主為異源抗原。在另一具體例中，抗原對攜有該質體之李斯特菌屬宿主為異源抗原。

在另一具體例中，編碼質體主鏈及至少兩種異源抗原之重組附加型核酸序列包含SEQ ID NO：11。在另一具體例中，編碼質體主鏈及至少兩種異源抗原之重組附加型核酸序列由SEQ ID NO：11組成。

在一個具體例中，本文揭示一種免疫治療組成物，其包含重組李斯特菌屬菌株，其中該李斯特菌屬進一步包含本文所揭示之二價或多價質體及佐劑、細胞激素、趨化激素或其組合。在一個具體例中，本文揭示一種疫苗，其包含重組李斯特菌屬菌株，其中該李斯特菌屬進一步包含本文所揭示之二價或多價質體及佐劑、細胞激素、趨化激素或其組合。在另一具體例中，本文揭示一種醫藥調配物，其包含重組李斯特菌屬菌株，其中該李斯特菌屬進一步包含本文所揭示之二價或多價質體及佐劑、細胞激素、趨化激素或其組合。

在本發明之一個具體例中，本文揭示一種包含第一及第二核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子各自編碼異源抗原性多肽或其片段，其中該第一核酸分子整合至具有內源性LLO基因的開讀框中之李斯特菌屬基因組中，且其中該第二核酸分子存在於該重組李斯特菌屬菌株內之附加型表現載體或質體中。

在一個具體例中，本發明提供一種包含第一及第二核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子各自編碼與截短LLO、截短或N端ActA蛋白或PEST序列融合之異源抗原性多肽。

在一個具體例中，第一核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中作為具有編碼LLO蛋白、ActA蛋白或PEST序列的內源性核酸序列之開讀框。在一個具體例中，第一核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中作為具有編碼LLO的核酸序列之開讀框。在另一具體例中，第一核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中作為具有編碼ActA的核酸序列之開讀框。在一個具體例中，整合不消除LLO之功能。在另一具體例中，整合不消除ActA之功能。在一個具體例中，LLO或ActA之功能為其原生功能。

在一個具體例中，LLO功能為使得生物體可逃脫吞噬溶菌體，而在另一具體例中，LLO功能為增強其融合的多肽之免疫原性。在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬保持LLO功能，該功能在一個具體例中為溶血性功能，且在另一具體例中為抗原性功能。LLO之其他功能在此項技術中已知，評估LLO功能之方法及分析法亦在此項技術中已知。

在一個具體例中，本發明之重組李斯特菌屬具有野生型致病性，而在另一具體例中，本發明之重組李斯特菌屬具有減毒之致病性。在另一具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬為非致病性的。在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬的致病性足以逃脫吞噬溶菌體且進入胞溶質。在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬表現融合抗原-LLO蛋白。因此，在一個具體例中，第一核酸分子整合至李斯特菌屬基因組中不破壞結構，在另一具體例中，亦不破壞內源性LLO基因、ActA基因或含PEST之基因的功能。在一個具體例中，第一核酸分子整合至李斯特菌屬基因組中不破壞該李斯特菌屬逃脫吞噬溶菌體之能力。

在另一具體例中，第二核酸整合至基因組中，而第一核酸自質體表現。在另一具體例中，第二核酸分子可操作地整合至具有包含PEST序列之內源性多肽的開讀框中之具有該第一核酸分子之李斯特菌屬基因組中。因此，在一個具體例中，第一及第二核酸分子與編碼LLO蛋白之核酸序列同框整合，而在另一具體例中，其與編碼ActA蛋白之核酸序列同框整合。在另一具體例中，第二核酸分子在不同於第一核酸分子之整合位點的位點可操作地整合至具有編碼多肽(包含PEST序列)的核酸序列之開讀框中之李斯特菌屬基因組中。在一個具體例中，第一核酸分子與編碼LLO蛋白之核酸序列同框整合，而第二核酸分子與編碼ActA蛋白之核酸序列同框整合，而在另一具體例中，第一核酸分子與編碼ActA蛋白之核酸序列同框整合，而第二核酸分子與編碼LLO蛋白之核酸序列同框整合。

在另一具體例中，本發明提供一種重組李斯特菌屬菌株，其包含編碼第一異源抗原性多肽或其片段之第一核酸分子及編碼第二異源抗原性多肽或其片段之第二核酸分子，其中該第一核酸分子整合至李斯特菌屬基因組中使得第一異源抗原性多肽及LLO、ActA或PEST序列表現為融合蛋白。在一個具體例中，第一異源抗原性多肽及LLO、ActA或PEST序列在單一開讀框中轉譯，而在另一具體例中，第一異源抗原性多肽及LLO、ActA或PEST序列在單獨地轉譯之後融合。

在一個具體例中，李斯特菌屬基因組包含內源性ActA基因之缺失，其在一個具體例中為致病性因子。在一個具體例中，該種缺失提供更減毒且因此更安全之李斯特菌屬菌株供人類使用。根據此具體例，抗原性多肽與李斯特菌屬染色體中之LLO同框整合。在另一具體例中，整合之核酸分子整合至ActA基因座中。在另一具體例中，編碼ActA之染色體核酸經編碼抗原之核酸分子置換。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株包含內源性actA基因之失活。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株包含內源性actA基因之截短。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株包含內源性actA基因之非功能性置換。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株包含內源性actA基因之取代。上文所提及之修飾全部屬於視為內源性actA基因之「突變」者之範疇內。

在另一具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株包含內源性dal/dat及actA基因之突變、缺失或失活，且該種李斯特菌屬菌株在本文中稱為「LmddA」菌株。

在另一具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株包含內源性dal/dat/actA及prfA基因之突變、缺失或失活。

在一個具體例中，本文所揭示之二價或多價質體包含複製控制區。在一個具體例中，編碼本文所揭示之二價或多價質體之重組核酸分子包含複製控制區。在另一具體例中，質體控制區調節重組核酸分子之複製。

在另一具體例中，質體控制區包含編碼轉錄抑制因子之開讀框，該轉錄抑制因子抑制異源抗原自第一或至少第二核酸分子之表現。在另一具體例中，質體控制區包含編碼轉錄誘導因子之開讀框，該轉錄誘導因子誘導異源抗原自第一或至少第二核酸分子之表現。在另一具體例中，質體控制區包含編碼轉錄抑制因子之開讀框，該轉錄抑制因子抑制異源抗原自第一、第二或第三核酸分子之表現。在另一具體例中，質體控制區包含編碼轉錄誘導因子之開讀框，該轉錄誘導因子誘導異源抗原自第一、第二或第三核酸分子之表現。

在另一具體例中，質體複製調節區使得能夠調節外源性異源抗原自由本文所揭示之李斯特菌屬或質體包含的重組核酸分子之第一或至少第二開讀框中的每一者之表現。在另一具體例中，質體複製調節區使得能夠調節外源性異源抗原自第一、第二或第三開讀框中的每一者之表現。

在一個具體例中，量測細菌(諸如李斯特菌屬)中之代謝負荷係藉由本發明作出時此項技術中已知之任何方式實現，包括(但不限於)量測疫苗菌株之生長速率、光密度讀數、群落形成單位(CFU)塗佈及其類似物。在另一具體例中，細菌細胞上之代謝負荷係藉由量測細菌細胞之活力測定。量測細菌活力之方法在此項技術中容易已知及可用，其中一些包括(但不限於)用於活力計數之細菌塗佈、量測ATP及流式細胞術。在ATP染色中，偵測係基於使用螢光素酶反應量測來自活細胞之ATP之量，其中細胞中之ATP之量與細胞活力相關。關於流式細胞測量術，此方法可以亦為此項技術中已知之各種方式使用，例如在利用活力染料之使用之後，該等染料由活細菌細胞排除且由死細菌細胞吸收或吸附。熟練技術人員將容易理解，此項技術中已知用於量測細菌活力之此等及任何其他方法均可用於本發明中。應理解，熟練技術人員將能夠將本發明作出時此項技術中可用之知識實施用於量測疫苗菌株之生長速率或標記基因由疫苗菌株之表現，其使得能夠測定表現多種異源抗原或其功能片段的疫苗菌株之代謝負荷。

在另一具體例中，整合之核酸分子整合至李斯特菌屬染色體中。

在一個具體例中，該第一核酸分子為經設計用於位點特異性同源重組至李斯特菌屬基因組中之載體。在另一具體例中，構築體或異源基因使用同源重組整合至李斯特菌屬染色體中。

用於同源重組之技術為此項技術中所熟知，且描述於例如Frankel, FR, Hegde, S, Lieberman, J及Y Paterson. Induction of a cell-mediated immune response to HIV gag using Listeria monocytogenes as a live vaccine vector. J. Immunol. 155: 4766 - 4774. 1995；Mata, M, Yao, Z, Zubair, A, Syres, K及Y Paterson, Evaluation of a recombinant Listeria monocytogenes expressing an HIV protein that protects mice against viral challenge. Vaccine 19:1435-45, 2001；Boyer, JD, Robinson, TM, Maciag, PC, Peng, X, Johnson, RS, Pavlakis, G, Lewis, MG, Shen, A, Siliciano, R, Brown, CR, Weiner, D及Y Paterson. DNA prime Listeria boost induces a cellular immune response to SIV antigens in the Rhesus Macaque model that is capable of limited suppression of SIV239 viral replication. Virology. 333: 88-101, 2005中。在另一具體例中，同源重組如美國專利第6,855,320號中所述進行。在另一具體例中，溫度敏感性質體用於選擇重組體。

在另一具體例中，構築體或異源基因使用轉座子插入整合至李斯特菌屬染色體中。用於轉座子插入之技術為此項技術中所熟知，且在DP-L967之構築中尤其由Sun等人(Infection and Immunity 1990,58：3770-3778)描述。在一個具體例中，轉座子突變誘發具有可形成穩定基因組插入突變體之優勢。在另一具體例中，基因組中外源基因已藉由轉座子突變誘發插入之位置為未知的。

在另一具體例中，構築體或異源基因使用噬菌體整合位點整合至李斯特菌屬染色體中(Lauer P,Chow MY等人，Construction,characterization,and use of two LM site-specific phage integration vectors.J Bacteriol 2002；184(15)：4177-86)。在另一具體例中，細菌噬菌體(例如U153或PSA李斯特菌噬菌體)之整合酶基因及連接位點用以將異源基因插入至相應連接位點，該位點可為基因組中之任何適當位點(例如arg tRNA基因之comK或3'端)。在另一具體例中，內源性原噬菌體在整合構築體或異源基因之前自所利用的連接位點固化。在另一具體例中，此方法產生單複本整合體。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之第一核酸序列可操作地連接至啟動子/調節序列。在另一具體例中，第二核酸序列可操作地連接至啟動子/調節序列。在另一具體例中，本文所揭示之核酸序列中的每一者可操作地連接至啟動子/調節序列。在一個具體例中，啟動子/調節序列存在於包含該核酸序列之附加型質體上。在一個具體例中，內源性李斯特菌屬啟動子/調節序列控制本發明之方法及組成物之核酸序列的表現。

在一個具體例中，本文所揭示之融合多肽自hly啟動子、prfA啟動子、actA啟動子或p60啟動子或此項技術中已知之任何其他適合啟動子表現。在另一具體例中，本文所揭示之核酸序列可操作地連接至驅動編碼肽於李斯特菌屬菌株中之表現的啟動子、調節序列或其組合。適用於驅動基因之組成性表現的啟動子、調節序列及其組合為此項技術中所熟知，且包括(但不限於)例如李斯特菌屬之P_hlyA、P_actA、hly及p60啟動子、鏈球菌屬(Streptococcus)bac啟動子、灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus)sgiA啟動子及蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)phaZ啟動子。在另一具體例中，編碼如本文所揭示之肽的核酸之誘導型及組織特異性表現藉由將編碼肽之核酸置於誘導型或組織特異性啟動子/調節序列控制下來實現。適用於其目的之組織特異性或誘導型調節序列、啟動子及其組合的實例包括(但不限於)MMTV LTR誘導型啟動子及SV40晚期強化子/啟動子。在另一具體例中，使用回應於誘導劑(諸如金屬、糖皮質激素及其類似物)誘導之啟動子。因此，應瞭解，本發明包括使用任何啟動子或調節序列，其已知或未知且能夠驅動與其可操作地連接之所要蛋白質的表現。在一個具體例中，調節序列為啟動子，而在另一具體例中，調節序列為強化子，而在另一具體例中，調節序列為遏制子，而在另一具體例中，調節序列為抑制因子，而在另一具體例中，調節序列為靜止子。

在一個具體例中，用於整合至李斯特菌屬基因組之核酸構築體含有整合位點。在一個具體例中，位點為PhSA(來自Scott A之噬菌體)attPP'整合位點。在另一具體例中，PhSA為單核球增多性李斯特菌菌株ScottA之原噬菌體(Loessner,M.J.,I.B.Krause,T.Henle及S.Scherer.1994.Structural proteins and DNA characteristics of 14 Listeria typing bacteriophages.J.Gen.Virol.75：701--710，以引用的方式併入本文中)，該菌株為在人類李斯特菌病(listeriosis)之傳染期間分離之血清型4b菌株。在另一具體例中，位點為此項技術中已知之任何另一整合位點。

在另一具體例中，核酸構築體含有整合酶基因。在另一具體例中，整合酶基因為PhSA整合酶基因。在另一具體例中，整合酶基因為此項技術中已知之任何其他整合酶基因。

在一個具體例中，核酸構築體為質體。在另一具體例中，核酸構築體為穿梭質體。在另一具體例中，核酸構築體為整合載體。在另一具體例中，核酸構築體為位點特異性整合載體。在另一具體例中，核酸構築體為此項技術中已知之任何其他類型的核酸構築體。

在另一具體例中，本文所揭示之方法及組成物之整合載體為噬菌體載體。在另一具體例中，整合載體為位點特異性整合載體。在另一具體例中，載體進一步包含attPP'位點。

在另一具體例中，整合載體為U153載體。在另一具體例中，整合載體為A118載體。在另一具體例中，整合載體為PhSA載體。

在另一具體例中，載體為A511載體(例如Genbank寄存編號：X91069)。在另一具體例中，載體為A006載體。在另一具體例中，載體為B545載體。在另一具體例中，載體為B053載體。在另一具體例中，載體為A020載體。在另一具體例中，載體為A500載體(例如Genbank寄存編號：X85009)。在另一具體例中，載體為B051載體。在另一具體例中，載體為B052載體。在另一具體例中，載體為B054載體。在另一具體例中，載體為B055載體。在另一具體例中，載體為B056載體。在另一具體例中，載體為B101載體。在另一具體例中，載體為B110載體。在另一具體例中，載體為B111載體。在另一具體例中，載體為A153載體。在另一具體例中，載體為D441載體。在另一具體例中，載體為A538載體。在另一具體例中，載體為B653載體。在另一具體例中，載體為A513載體。在另一具體例中，載體為A507載體。在另一具體例中，載體為A502載體。在另一具體例中，載體為A505載體。在另一具體例中，載體為A519載體。在另一具體例中，載體為B604載體。在另一具體例中，載體為C703載體。在另一具體例中，載體為B025載體。在另一具體例中，載體為A528載體。在另一具體例中，載體為B024載體。在另一具體例中，載體為B012載體。在另一具體例中，載體為B035載體。在另一具體例中，載體為 C707載體。

在另一具體例中，載體為A005載體。在另一具體例中，載體為A620載體。在另一具體例中，載體為A640載體。在另一具體例中，載體為B021載體。在另一具體例中，載體為HSO47載體。在另一具體例中，載體為H10G載體。在另一具體例中，載體為H8/73載體。在另一具體例中，載體為H19載體。在另一具體例中，載體為H21載體。在另一具體例中，載體為H43載體。在另一具體例中，載體為H46載體。在另一具體例中，載體為H107載體。在另一具體例中，載體為H108載體。在另一具體例中，載體為H110載體。在另一具體例中，載體為H163/84載體。在另一具體例中，載體為H312載體。在另一具體例中，載體為H340載體。在另一具體例中，載體為H387載體。在另一具體例中，載體為H391/73載體。在另一具體例中，載體為H684/74載體。在另一具體例中，載體為H924A載體。在另一具體例中，載體為fMLUP5載體。在另一具體例中，載體為syn(=P35)載體。在另一具體例中，載體為00241載體。在另一具體例中，載體為00611載體。在另一具體例中，載體為02971A載體。在另一具體例中，載體為02971C載體。在另一具體例中，載體為5/476載體。在另一具體例中，載體為5/911載體。在另一具體例中，載體為5/939載體。在另一具體例中，載體為5/11302載體。在另一具體例中，載體為5/11605載體。在另一具體例中，載體為 5/11704載體。在另一具體例中，載體為184載體。在另一具體例中，載體為575載體。在另一具體例中，載體為633載體。在另一具體例中，載體為699/694載體。在另一具體例中，載體為744載體。在另一具體例中，載體為900載體。在另一具體例中，載體為1090載體。在另一具體例中，載體為1317載體。在另一具體例中，載體為1444載體。在另一具體例中，載體為1652載體。在另一具體例中，載體為1806載體。在另一具體例中，載體為1807載體。在另一具體例中，載體為1921/959載體。在另一具體例中，載體為1921/11367載體。在另一具體例中，載體為1921/11500載體。在另一具體例中，載體為1921/11566載體。在另一具體例中，載體為1921/12460載體。在另一具體例中，載體為1921/12582載體。在另一具體例中，載體為1967載體。在另一具體例中，載體為2389載體。在另一具體例中，載體為2425載體。在另一具體例中，載體為2671載體。在另一具體例中，載體為2685載體。在另一具體例中，載體為3274載體。在另一具體例中，載體為3550載體。在另一具體例中，載體為3551載體。在另一具體例中，載體為3552載體。在另一具體例中，載體為4276載體。在另一具體例中，載體為4277載體。在另一具體例中，載體為4292載體。在另一具體例中，載體為4477載體。在另一具體例中，載體為5337載體。在另一具體例中，載體為5348/11363載體。在另一具體例中，載體為5348/11646載體。在另一具體例中，載體為5348/12430載體。在另一具體例中，載體為5348/12434載體。在另一具體例中，載體為10072載體。在另一具體例中，載體為11355C載體。在另一具體例中，載體為11711A載體。在另一具體例中，載體為12029載體。在另一具體例中，載體為12981載體。在另一具體例中，載體為13441載體。在另一具體例中，載體為90666載體。在另一具體例中，載體為90816載體。在另一具體例中，載體為93253載體。在另一具體例中，載體為907515載體。在另一具體例中，載體為910716載體。在另一具體例中，載體為NN-李斯特菌屬載體。在另一具體例中，載體為O1761載體。在另一具體例中，載體為4211載體。在另一具體例中，載體為4286載體。在另一具體例中，整合載體為能夠感染李斯特菌屬的在此項技術中已知之任何其他位點特異性整合載體。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之整合載體或質體不賦予李斯特菌屬疫苗菌株以抗生素抗性。在另一具體例中，整合載體或質體不含有抗生素抗性基因。

在另一具體例中，本發明提供一種編碼重組多肽之重組核酸。在一個具體例中，核酸包含與編碼本文所揭示之重組多肽之核酸共用至少80%同源性的序列。在另一具體例中，核酸包含與編碼本文所揭示之重組多肽之核酸共用至少85%同源性的序列。在另一具體例中，核酸包含與編碼本文所揭示之重組多肽之核酸共用至少90%同源性的序列。在另一具體例中，核酸包含與編碼本文所揭示之重組多肽之核酸共用至少95%同源性的序列。在另一具體例中，核酸包含與編碼本文所揭示之重組多肽之核酸共用至少97%同源性的序列。在另一具體例中，核酸包含與編碼本文所揭示之重組多肽之核酸共用至少99%同源性的序列。

在一個具體例中，本文揭示一種產生包含編碼兩種獨特異源抗原之二價質體之重組李斯特菌屬菌株的方法。在另一具體例中，質體為編碼3種或多於3種獨特異源抗原之多價質體。在另一具體例中，質體為編碼4種或多於4種獨特異源抗原之多價質體。在另一具體例中，質體為編碼5種或多於5種獨特異源抗原之多價質體。

在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬表現至少一種由本文所揭示之質體編碼之抗原。

在一個具體例中，揭示一種產生表現兩種獨特異源抗原之重組李斯特菌屬菌株的方法。在另一具體例中，重組李斯特菌屬表現至少3種或多於3種獨特異源抗原。在另一具體例中，重組李斯特菌屬表現4種或多於4種獨特異源抗原。在另一具體例中，重組李斯特菌屬表現5種或多於5種獨特異源抗原。

在另一具體例中，產生重組李斯特菌屬之方法包含用包含二價或多價質體之核酸使該重組李斯特菌屬轉型。在一個具體例中，質體為保持在染色體外之附加型質體。在另一具體例中，質體為整合質體。在又一具體例中，本文所揭示之方法包含在有利於蛋白質表現之條件下表現本文所揭示之抗原及融合蛋白。

熟練技術人員應瞭解，本文所揭示之核酸包含可在本文所揭示之方法中用於產生本文所揭示之組成物中任一者的DNA載體、RNA載體、質體(染色體外及/或整合)等。

在另一具體例中，重組李斯特菌屬菌株可表現多於兩種抗原，其中一些自一或多種整合至李斯特菌屬染色體中之核酸分子表現，且其中一些經由存在於重組李斯特菌屬菌株中之一或多種附加型表現質體或載體中表現。因此，如上文所揭示，在一個具體例中，如本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含兩種或多於兩種附加型表現質體，其中之每一者表現至少一種獨特抗原性多肽。在一個具體例中，抗原中之一或多者表現為與LLO之融合蛋白，該LLO在一個具體例中為非溶血性LLO或截短LLO。在一個具體例中，如本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株藉由引發對兩種各別抗原之免疫反應而靶向腫瘤，該等抗原由兩種不同細胞類型表現，其在一個具體例中為細胞表面抗原及抗血管生成多肽；而在另一具體例中，如本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株藉由引發對兩種不同抗原之免疫反應而靶向腫瘤，該等抗原由相同細胞類型表現。在另一具體例中，如本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株藉由引發對兩種如本文所揭示或如此項技術中已知之不同抗原的免疫反應而靶向腫瘤。

在一個具體例中，本文所揭示之異源抗原與局部組織環境相關，該環境進一步與癌症之發展或轉移相關。在另一具體例中，本文所揭示之異源抗原與腫瘤免疫逃避或癌症抗性相關。在另一具體例中，本文所揭示之異源抗原為血管生成抗原。

在一個具體例中，本文所揭示之組成物及方法之第一抗原係針對特異性細胞表面抗原或腫瘤標靶，且第二抗原係針對血管生成抗原或腫瘤微環境。在另一具體例中，本發明之組成物及方法之第一及第二抗原為由腫瘤細胞表現之多肽，或在另一具體例中為表現於腫瘤微環境中之多肽。在另一具體例中，本發明之組成物及方法之第一抗原為由腫瘤表現之多肽，且本發明之組成物及方法之第二抗原為受體標靶、NO合成酶、Arg-1或此項技術中已知之其他酶。

在一個具體例中，本文揭示一種產生表現兩種抗原之重組李斯特菌屬菌株的方法，在一個具體例中，該方法包含將編碼第一抗原之第一核酸及編碼第二抗原之第二核酸遺傳性融合至具有包含PEST序列之原生多肽的開讀框中之李斯特菌屬基因組中。在另一具體例中，表現該等第一及第二抗原係在有利於於該重組李斯特菌屬菌株中的抗原性表現之條件下產生。

在一個具體例中，如本文所揭示之組成物及方法之重組李斯特菌屬菌株包含包括編碼異源抗原之第二核酸分子的附加型表現載體。在另一具體例中，編碼異源抗原之第二核酸分子存在於具有截短LLO、截短ActA或PEST胺基酸序列之開讀框中的該附加型表現載體中。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之附加型表現載體包含與編碼PEST胺基酸序列之核酸序列同框融合之抗原。在一個具體例中，抗原為HMW-MAA，且在另一具體例中為HMW-MAA片段。在另一具體例中，PEST類AA序列為KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO：12)。在另一具體例中，PEST樣序列為KENSISSMAPPASPPASPK(SEQ ID NO：13)。在另一具體例中，抗原與包括本文列舉之PEST類AA序列之一的任何LLO序列之融合物可增強對抗HMW-MAA的細胞介導之免疫。

在另一具體例中，PEST類AA序列為來自李斯特菌屬ActA蛋白之PEST樣序列。在另一具體例中，PEST樣序列為KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO：14)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO：15)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO：16)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO：17)。在另一具體例中，PEST樣序列來自由lso基因編碼之斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)細胞溶素。在另一具體例中，PEST樣序列為RSEVTISPAETPESPPATP(SEQ ID NO：18)。在另一具體例中，PEST樣序列來自鏈球菌屬之鏈球菌溶血素O蛋白。在另一具體例中，PEST樣序列來自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)鏈球菌溶血素O，例如在AA 35-51處之KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：19)。在另一具體例中，PEST樣序列來自似馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)鏈球菌溶血素O，例如在AA 38-54處之KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：20)。在另一具體例中，PEST樣序列具有選自SEQ ID NO：14-20之序列。在另一具體例中，PEST樣序列具有選自SEQ ID NO：12-20之序列。在另一具體例中，PEST樣序列為衍生自原核生物體之另一PEST樣AA序列。在另一具體例中，PEST序列為此項技術中已知之任何其他PEST序列，包括(但不限於)以全文引用之方式併入本文中的美國專利公開案第2014/0186387號中所揭示之PEST序列。

PEST樣序列之鑑別為此項技術中所熟知，且描述於例如Rogers S等人(Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins：the PEST hypothesis.Science 1986；234(4774)：364-8，以引用的方式併入本文中)及Rechsteiner M等人(PEST sequences and regulation by proteolysis.Trends Biochem Sci 1996；21(7)：267-71，以引用的方式併入本文中)中。在另一具體例中，「PEST樣序列」係指富含脯胺酸(P)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)殘基之區。在另一具體例中，PEST樣序列由一或多個含有若干帶正電胺基酸之群集側接。在另一具體例中，PEST樣序列介導含有其之蛋白質之快速胞內降解。在另一具體例中，PEST樣序列擬合Rogers等人中所揭示之算法。在另一具體例中，PEST樣序列擬合Rechsteiner等人中所揭示之算法。在另一具體例中，PEST樣序列含有一或多個內部磷酸化位點，且此等位點處之磷酸化先於蛋白質降解。在一個具體例中，在本文中稱為PEST樣序列之序列為PEST序列。

在一個具體例中，原核生物體之PEST樣序列根據如下方法鑑別，諸如例如Rechsteiner及Rogers(1996,Trends Biochem.Sci.21：267-271)關於LM及Rogers S等人(Science 1986；234(4774)：364-8)所描述。或者，來自其他原核生物體之PEST樣AA序列亦可基於此方法鑑別。預期PEST樣AA序列之其他原核生物體包括(但不限於)其他李斯特菌屬。在一個具體例中，PEST樣序列擬合Rogers等人中所揭示之算法。在另一具體例中，PEST樣序列擬合Rechsteiner等人中所揭示之算法。在另一具體例中，PEST樣序列係使用PEST尋找程式鑑別。

在另一具體例中，PEST基元之鑑別藉由以下方式實現：初始掃描規定蛋白質序列內帶正電之胺基酸R、H及K。對帶正電之側接序列之間的全部胺基酸計數，且進一步僅考慮含有多個等於或高於窗口大小參數之胺基酸的彼等基元。在另一具體例中，PEST樣序列必須含有至少1個P、1個D或E及至少1個S或T。

在另一具體例中，PEST基元之品質藉助於基於關鍵胺基酸之局部增濃以及基元之疏水性的評分參數優化。D、E、P、S及T之增濃以質量百分比(w/w)為單位表示，且針對1當量D或E、1當量P及1當量S或T校正。在另一具體例中，疏水性之計算原則上遵循J.Kyte及R.F.Doolittle(Kyte,J及Dootlittle,RF.J.Mol.Biol.157,105(1982)，以引用的方式併入本文中)之方法。為了簡化計算，將最初介於精胺酸-4.5至異白胺酸+4.5之Kyte-Doolittle親水性指數使用以下線性轉化而轉換成正整數，此得到精胺酸0至異白胺酸90之值。

親水性指數=10*Kyte-Doolittle親水性指數+45。

在另一具體例中，潛在PEST基元之疏水性經計算為各胺基酸種類之莫耳百分比與疏水性指數的乘積之總和。所要PEST分數以局部增濃項與疏水性項的如由以下方程式表示之組合之形式獲得：PEST分數=0.55*DEPST-0.5*疏水性指數。

在另一具體例中，「PEST序列」、「PEST樣序列」、「PEST胺基酸序列」或「PEST樣序列肽」在此處可互換使用，且係指使用以上算法具有至少+5之分數之肽。在另一具體例中，該術語係指具有至少6之分數之肽。在另一具體例中，肽具有至少7之分數。在另一具體例中，分數為至少8。在另一具體例中，分數為至少9。在另一具體例中，分數為至少10。在另一具體例中，分數為至少11。在另一具體例中，分數為至少12。在另一具體例中，分數為至少13。在另一具體例中，分數為至少14。在另一具體例中，分數為至少15。在另一具體例中，分數為至少16。在另一具體例中，分數為至少17。在另一具體例中，分數為至少18。在另一具體例中，分數為至少19。在另一具體例中，分數為至少20。在另一具體例中，分數為至少21。在另一具體例中，分數為至少22。在另一具體例中，分數為至少22。在另一具體例中，分數為至少24。在另一具體例中，分數為至少24。在另一具體例中，分數為至少25。在另一具體例中，分數為至少26。在另一具體例中，分數為至少27。在另一具體例中，分數為至少28。在另一具體例中，分數為至少29。在另一具體例中，分數為至少30。在另一具體例中，分數為至少32。在另一具體例中，分數為至少35。在另一具體例中，分數為至少38。在另一具體例中，分數為至少40。在另一具體例中，分數為至少45。各可能性代表如本文揭示之方法及組成物之各別具體例。

在另一具體例中，PEST序列使用此項技術中已知之任何其他方法或算法鑑別，例如，CaSPredictor(Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,Alves J,Belizario JE.Bioinformatics.2005年6月；21增刊1：i169-76)。在另一具體例中，使用以下方法：藉由將值1指定給胺基酸Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln計算適當長度之各延伸部(例如30-35胺基酸延伸部)之PEST指數。PEST殘基中之每一者的係數值(CV)為1，且其他胺基酸(非PEST)中之每一者的係數值為0。

鑑別PEST序列之各方法代表如本文所揭示之各別具體例。

在另一具體例中，PEST序列為此項技術中已知之任何其他PEST序列。

在一個具體例中，本發明提供在一個具體例中由李斯特菌屬表現之融合蛋白。在一個具體例中，該等融合蛋白包含與tLLO、截短ActA或PEST序列之融合物。熟練技術人員應理解，術語「PEST序列」可涵蓋其中蛋白質片段包含具有除了PEST序列外之周圍序列之PEST序列的情況。在另一具體例中，蛋白質片段由PEST序列組成。因此，在另一具體例中，「融合物」係指在其相應末端處連接在一起或一者嵌於另一者內之兩種肽或蛋白質片段。熟練技術人員應瞭解，術語「融合」亦可涵蓋藉由共價鍵可操作連接。在一個具體例中，該術語涵蓋(核酸序列或其開讀框的)重組融合。在另一具體例中，該術語涵蓋化學結合。

在另一具體例中，如本文所揭示之組成物及方法之重組李斯特菌屬菌株包含在一個具體例中為溶血性之全長LLO多肽。

在另一具體例中，重組李斯特菌屬菌株包含非溶血性LLO多肽。在另一具體例中，多肽為LLO片段。在另一具體例中，多肽為完整LLO蛋白。在另一具體例中，多肽為此項技術中已知之任何LLO蛋白或其片段。

在另一具體例中，LLO蛋白片段用於如本文所揭示之組成物及方法中。在一個具體例中，截短LLO蛋白由表現多肽的如本文所揭示之附加型表現載體編碼，該多肽在一個具體例中為抗原，在另一具體例中為血管生成因子，或在另一具體例中為抗原及血管生成因子兩者。在另一具體例中，LLO片段為N端片段。

在一個具體例中，術語「N端LLO蛋白」及「截短LLO(tLLO)」在本文中可互換使用。

在另一具體例中，N端LLO片段具有SEQ ID NO：21中闡述之序列。在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之LLO AA序列包含SEQ ID NO：21中闡述之序列。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：21之同源物。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：21之變異體。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：21之片段。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：21之同功異型物。

在另一具體例中，LLO片段具有SEQ ID NO：22中闡述之序列。在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之LLO AA序列包含SEQ ID NO：22中闡述之序列。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：22之同源物。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：22之變異體。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：22之片段。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：22之同功異型物。

在一個具體例中，用於如本文所揭示之組成物及方法中之LLO蛋白包含SEQ ID NO：23(GenBank寄存編號P13128；核酸序列闡述於GenBank寄存編號X15127中)中闡述之序列。對應於此序列的前蛋白之前25AA為信號序列且當由細菌分泌時自LLO裂解。因此，在此具體例中，全長活性LLO蛋白為504個殘基長。在另一具體例中，上述LLO片段用作併入如本文所揭示之疫苗中之LLO片段來源。在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之LLO AA序列包含SEQ ID NO：23中闡述之序列。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：23之同源物。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：23之變異體。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：23之片段。在另一具體例中，LLO AA序列為本文所揭示之SEQ ID NO：23之同功異型物。

在另一具體例中，用於如本文所揭示之組成物及方法中之LLO蛋白具有SEQ ID NO：24中闡述之序列。在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之LLO AA序列包含SEQ ID NO：24中闡述之序列。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：24之同源物。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：24之變異體。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：24之片段。在另一具體例中，LLO AA序列為SEQ ID NO：24 之同功異型物。各可能性代表如本文提供之各別具體例。

在一個具體例中，如本文所揭示之組成物及方法之LLO多肽的胺基酸序列來自如以下GenBank寄存編號中所闡述之單核球增多性李斯特菌10403S菌株：ZP_01942330、EBA21833，或由如以下GenBank寄存編號中所闡述之核酸序列編碼：NZ_AARZ01000015或AARZ01000015.1。在另一具體例中，用於如本文所揭示之組成物及方法之LLO序列來自單核球增多性李斯特菌，其在一個具體例中為4b F2365菌株(在一個具體例中，Genbank寄存編號：YP_012823)、EGD-e菌株(在一個具體例中，Genbank寄存編號：NP_463733)或此項技術中已知之任何其他單核球增多性李斯特菌菌株。

在另一具體例中，用於如本文所揭示之組成物及方法之LLO序列來自黃桿菌目(Flavobacteriales)細菌HTCC2170(在一個具體例中，Genbank寄存編號：ZP_01106747或EAR01433；在一個具體例中，由Genbank寄存編號：NZ_AAOC01000003編碼)。在一個具體例中，與其他物種中之LLO同源之蛋白質可用於如本文所揭示之組成物及方法中，該等蛋白質諸如蜂房桿菌溶素(alveolysin)，其在一個具體例中見於蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)中(在一個具體例中，Genbank寄存編號：P23564或AAA22224；在一個具體例中，由Genbank寄存編號：M62709編碼)。其他該等同源蛋白質為此項技術中已知。

各LLO蛋白及LLO片段代表如本文所揭示之方法及組成物之各別具體例。

在另一具體例中，來自其他物種之LLO之同源物(包括已知溶素或其片段)可用以產生LLO與如本文所揭示之組成物及方法之抗原的融合蛋白，該抗原在一個具體例中為HMW-MAA，且在另一具體例中為HMW-MAA之片段。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之LLO片段為PEST樣結構域。在另一具體例中，包含PEST序列之LLO片段用作如本文所揭示之組成物之一部分或用於如本文所揭示之方法中。

在另一具體例中，LLO片段在羧基端不含有活化結構域。在另一具體例中，LLO片段不包括半胱胺酸484。在另一具體例中，LLO片段為非溶血性片段。在另一具體例中，LLO片段藉由活化結構域之缺失或突變而被賦予非溶血性。在另一具體例中，LLO片段藉由半胱胺酸484之缺失或突變而被賦予非溶血性。在另一具體例中，LLO序列藉由在另一個位置的缺失或突變而被賦予非溶血性。

在另一具體例中，LLO片段由LLO蛋白約前441個AA組成。在另一具體例中，LLO片段包含529 AA全長LLO蛋白之約前400-441個AA。在另一具體例中，LLO片段對應於本文所揭示之LLO蛋白之AA 1-441。在另一具體例中，LLO片段由LLO約前420個AA組成。在另一具體例中，LLO片段對應於本文所揭示之LLO蛋白之AA 1-420。在另一具體例中，LLO片段由LLO之約AA 20-442組成。在另一具體例中，LLO片段對應於本文所揭示之LLO蛋白之AA 20-442。在另一具體例中，不具有包含半胱胺酸484之活化結構域且尤其不具有半胱胺酸484的任何ΔLLO適用於如本文所揭示之方法及組成物。

在另一具體例中，LLO片段對應於LLO蛋白之前400個AA。在另一具體例中，LLO片段對應於LLO蛋白之前300個AA。在另一具體例中，LLO片段對應於LLO蛋白之前200個AA。在另一具體例中，LLO片段對應於LLO蛋白之前100個AA。在另一具體例中，LLO片段對應於LLO蛋白之前50個AA，其在一個具體例中包含一或多個PEST樣序列。

在另一具體例中，LLO片段為非溶血性LLO。在另一具體例中，非溶血性LLO包含一或多個PEST樣序列。

在另一具體例中，LLO片段含有對應於上述AA範圍中之一者的同源LLO蛋白之殘基。在另一具體例中，殘基數目無需與上文列舉之殘基數目精確對應；例如在同源LLO蛋白相對於本文所用之LLO蛋白具有插入或缺失時。

在另一具體例中，如本文揭示的方法及組成物之重組李斯特菌屬菌株，其包含可操作地整合至李斯特菌屬基因組中作為具有內源性ActA序列之開讀框的核酸分子。在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物的重組李斯特菌屬菌株包含游離型表現載體，該附加型表現載體包含編碼包含抗原與ActA或截短ActA融合之融合蛋白的核酸分子。在一個具體例中，抗原在actA啟動子及ActA信號序列控制下表現及分泌且其表現為與ActA(截短ActA或tActA)之1-233個胺基酸的融合物。在另一具體例中，截短ActA由如美國專利第7,655,238號中所述的野生型ActA蛋白之前390個胺基酸組成，該案以全文引用的方式併入本文中。在另一具體例中，截短ActA為ActA-N100或其經修飾型式(稱為ActA-N100*)，其中PEST基元已缺失且含有非保守QDNKR取代，如美國專利公開案第2014/0186387號中所述。在一個具體例中，抗原為HMW-MAA，而在另一具體例中，其為HMW-MAA之免疫原性片段。

在一個具體例中，本發明提供一種重組多肽，其包含與本文所揭示之異源抗原融合或與其片段融合之LLO蛋白的N端片段。在另一具體例中，本發明之方法及組成物的Her-2嵌合蛋白質為人類Her-2嵌合蛋白質。在另一具體例中，Her-2蛋白質為小鼠Her-2嵌合蛋白質。在另一具體例中，Her-2蛋白質為大鼠Her-2嵌合蛋白質。在另一具體例中，Her-2蛋白質為靈長類動物Her-2嵌合蛋白質。在另一具體例中，Her-2蛋白質為此項技術中已知的任何其他動物物種之Her-2嵌合蛋白質或其組合。各可能性代表本發明之各別具體例。

在另一具體例中，Her-2蛋白質為稱為「HER-2/neu」、「Erbb2」、「v-erb-b2」、「c-erb-b2」、「neu」或「cNeu」之蛋白質。各可能性代表本發明之各別具體例。

在一個具體例中，Her2-neu嵌合蛋白質具有顯示致癌基因之MHC-I類抗原決定基群集的Her2/neu抗原之兩個胞外及一個胞內片段，其中在另一具體例中，嵌合蛋白質具有Her2/neu抗原之3個H2Dq及至少17個映射人MHC-I類抗原決定基(片段EC1、EC2及IC1)，如以全文引用之方式併入本文中的美國專利申請案第12/945,386號中所描述。在另一具體例中，Her2-neu嵌合蛋白質與單核球增多性李斯特菌李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白質之前441個胺基酸融合且由單核球增多性李斯特菌減毒之營養缺陷型菌株LmddA表現及分泌。在另一具體例中，Her2-neu嵌合蛋白質與單核球增多性李斯特菌李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白之前441個胺基酸融合，且自本文所揭示之重組李斯特菌屬之染色體表現，而另一抗原自存在於本文所揭示之重組李斯特菌屬內之質體表現。在另一具體例中，Her2-neu嵌合蛋白質與單核球增多性李斯特菌李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白之前441個胺基酸融合，且自本文所揭示之重組李斯特菌屬之質體表現，而另一抗原自本文所揭示之重組李斯特菌屬之染色體表現。在另一具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬為單核球增多性李斯特菌減毒之營養缺陷型菌株LmddA。

在另一具體例中，Her-2嵌合蛋白質由包含SEQ ID NO：25之核酸序列編碼。

在另一具體例中，Her-2嵌合蛋白質(cHER2)包含SEQ ID NO：26。

在一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物之HER2嵌合蛋白質或其片段不包括其信號序列。在另一具體例中，因為信號序列具有高疏水性，所以省略信號序列使HER2片段能夠在李斯特菌屬中成功地表現。

在另一具體例中，本發明之方法及組成物的HER2嵌合蛋白質之片段不包括其跨膜結構域(TM)。在一個具體例中，因為TM具有高疏水性，所以省略TM使HER2片段能夠在李斯特菌屬中成功地表現。

在一個具體例中，人Her2/neu基因之核酸序列為SEQ ID NO：27中闡述之序列。

在另一具體例中，編碼建構至嵌合體中之人類her2/neu EC1片段之核酸序列跨越人類EC1區之120-510bp且闡述於SEQ ID NO：28中。

在一個具體例中，完整EC1人類her2/neu片段跨越人類her2/neu基因之58-979bp且闡述於SEQ ID NO：29中。

在另一具體例中，編碼建構至嵌合體中之人類her2/neu EC2片段之核酸序列跨越人類her2/neu EC2片段之1077-1554bp且包括50bp延伸部分且闡述於SEQ ID NO：30中。

在一個具體例中，完整EC2人類her2/neu片段跨越人類her2/neu基因之907-1504bp且闡述於SEQ ID NO：31中。

在另一具體例中，編碼建構至嵌合體中之人類her2/neu IC1片段的核酸序列闡述於SEQ ID NO：32中。

在另一具體例中，編碼完整人類her2/neu IC1片段之核酸序列跨越人類her2/neu基因之2034-3243且闡述於SEQ ID NO：33中。

在一個具體例中，本發明提供一種重組多肽，其包含與碳酸酐酶9(或碳酸酐酶IX)蛋白質融合或與其片段融合之LLO蛋白的N端片段。在一個具體例中，本發明提供一種重組多肽，其由與碳酸酐酶9融合或與其片段融合之LLO蛋白的N端片段組成。

在另一具體例中，本發明之方法及組成物之碳酸酐酶9蛋白為人碳酸酐酶9蛋白。在另一具體例中，碳酸酐酶9蛋白為小鼠碳酸酐酶9蛋白。在另一具體例中，碳酸酐酶9蛋白為大鼠碳酸酐酶9蛋白。在另一具體例中，碳酸酐酶9蛋白為靈長類動物碳酸酐酶9蛋白。在另一具體例中，碳酸酐酶9蛋白為此項技術中已知的任何其他動物物種之碳酸酐酶9蛋白或其組合。

在一個具體例中，術語「碳酸酐酶9」、「碳酸酐酶IX」及「CA9」在本文中可互換使用。

在一個具體例中，人CA9基因之核酸序列為 SEQ ID NO：34中闡述之序列。在一個具體例中，CA9核酸序列為SEQ ID NO：34之同源物。在另一具體例中，CA9核酸序列為SEQ ID NO：34之變異體。在另一具體例中，CA9核酸序列為SEQ ID NO：34之片段。在另一具體例中，CA9核酸序列為此項技術中已知之任何序列，包括(但不限於)以下GenBank寄存編號中闡述之序列：NM_001216.2、XM_006716867.1、XM_006716868.1及X66839.1。

在一個具體例中，由本文所揭示之人CA9基因編碼之胺基酸序列為SEQ ID NO：35中闡述之序列。在一個具體例中，CA9胺基酸序列為SEQ ID NO：35之同源物。在另一具體例中，CA9胺基酸序列為SEQ ID NO：35之變異體。在另一具體例中，CA9胺基酸序列為SEQ ID NO：35之異構體。在另一具體例中，CA9胺基酸序列為SEQ ID NO：35之片段。在另一具體例中，CA9胺基酸序列為此項技術中已知之任何序列，包括(但不限於)以下GenBank寄存編號中闡述之序列：NP_001207.2、XP_006716930.1、XP_006716931.1及CAA47315.1。

在另一具體例中，編碼截短LLO-CA9融合物之核酸序列包含SEQ ID NO：36，其中位置1330-2487處之序列編碼cHER2，位置1-1323處之序列編碼tLLO，且位置1324-1329處之「ctcgag」序列表示用以使腫瘤抗原與質體中之截短LLO接合之Xho I限制位點。在一個具體例中，截短LLO-CA9融合物為SEQ ID NO：36之同源物。在另一具體例中，截短LLO-CA9融合物為SEQ ID NO：36之變異體。在另一具體例中，截短LLO-CA9融合物為SEQ ID NO：36之異構體。

在一個具體例中，包含tLLO與CA9融合之胺基酸序列包含SEQ ID NO：37。在一個具體例中，截短LLO-CA9融合物為SEQ ID NO：37之同源物。在另一具體例中，截短LLO-CA9融合物為SEQ ID NO：37之變異體。在另一具體例中，截短LLO-CA9融合物為SEQ ID NO：37之異構體。

在另一具體例中，本文所揭示之LmddA菌株包含突變。

在一個具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之抗原與ActA蛋白融合，該ActA蛋白在一個具體例中為ActA蛋白之N端片段，其包含或其組成在一個具體例中為ActA之前390個AA，在另一具體例中為ActA之前418個AA，在另一具體例中為ActA之前50個AA，在另一具體例中為ActA之前100個AA，其在一個具體例中包含諸如SEQ ID NO：2中提供之序列的PEST序列。在另一具體例中，用於如本文所揭示之方法及組成物中的ActA蛋白之N端片段包含或其組成為ActA之前150個AA，在另一具體例中為ActA之前約200個AA，其在一個具體例中包含2個如本文所述之PEST序列。在另一具體例中，用於如本文所揭示之方法及組成物中的ActA蛋白之N端片段包含或其組成為ActA之前250個AA，在另一具體例中為ActA之前300個AA。在另一具體例中，ActA片段含有對應於上述AA範圍中之一者的同源ActA蛋白之殘基。在另一具體例中，殘基數目無需與上文列舉之殘基數目精確對應；例如若同源ActA蛋白相對於本文所用之ActA蛋白具有插入或缺失，則殘基數目可據此調整，如對於熟練技術人員使用此項技術中熟知的序列比對工具(諸如NCBI BLAST)將為慣例。

在另一具體例中，ActA蛋白之N端部分包含1、2、3或4個PEST序列，其在一個具體例中為本文具體提及之PEST序列、或如本文所述之其同源物、或如使用本文所述之方法及算法或藉由使用此項技術中已知之替代性方法可確定之其他PEST序列。

在一個具體例中，術語「N端ActA」及「截短ActA」在本文中可互換使用。

在一個具體例中，用於如本文所揭示之方法及組成物中的ActA蛋白之N端片段在另一具體例中具有SEQ ID NO：38中闡述之序列。在另一具體例中，ActA片段包含SEQ ID NO：38中闡述之序列。在另一具體例中，ActA片段為此項技術中已知之任何其他ActA片段。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：38之同源物。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：38之變異體。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：38之同功異型物。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：38之片段。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：38之同源物之片段。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：38之變異體之片段。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：38之同功異型物之片段。

在另一具體例中，編碼ActA蛋白之片段的重組核苷酸包含SEQ ID NO：39中闡述之序列。在另一具體例中，重組核苷酸具有SEQ ID NO：39。在另一具體例中，重組核苷酸包含編碼ActA蛋白之片段的任何其他序列。

在另一具體例中，用於如本文所揭示之方法及組成物中的ActA蛋白之N端片段具有SEQ ID NO：40中闡述之序列，其在一個具體例中為來自單核球增多性李斯特菌菌株10403S之ActA的前390個AA。在另一具體例中，ActA片段包含SEQ ID NO：40中闡述之序列。在另一具體例中，ActA片段為此項技術中已知之任何其他ActA片段。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：40之同源物。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：40之變異體。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：40之同功異型物。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：40之片段。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：40之同源物之片段。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：40之變異體之片段。在另一具體例中，ActA蛋白為SEQ ID NO：40之同功異型物之片段。

在另一具體例中，截短ActA蛋白包含SEQ ID NO：41中闡述之序列。

在另一具體例中，本文所揭示之截短ActA序列進一步在N端與hly信號肽融合。在另一具體例中，與hly信號肽融合之截短ActA包含SEQ ID NO：42。在另一具體例中，如SEQ ID NO：42中闡述之截短ActA稱為LA229。

在另一具體例中，編碼ActA蛋白之片段的重組核苷酸包含SEQ ID NO：43中闡述之序列，其在一個具體例中為編碼單核球增多性李斯特菌10403S菌株中之ActA的前1170個核苷酸。在另一具體例中，重組核苷酸具有SEQ ID NO：43中闡述之序列。在另一具體例中，重組核苷酸包含編碼ActA蛋白之片段的任何其他序列。

在另一具體例中，ActA片段為此項技術中已知之另一ActA片段，其在一個具體例中為包含PEST序列之任何片段。因此，在一個具體例中，ActA片段為ActA序列之胺基酸1-100。在另一具體例中，ActA片段為ActA序列之胺基酸1-200。在另一具體例中，ActA片段為ActA序列之胺基酸200-300。在另一具體例中，ActA片段為ActA序列之胺基酸300-400。在另一具體例中，ActA片段為ActA序列之胺基酸1-300。在另一具體例中，如本文所揭示之重組核苷酸包含編碼ActA蛋白之片段的任何其他序列。在另一具體例中，重組核苷酸包含編碼完整ActA蛋白之任何其他序列。

在一個具體例中，用於如本文所揭示之組成物及方法的ActA序列來自單核球增多性李斯特菌，其在一個具體例中為EGD菌株、10403S菌株(Genbank寄存編號：DQ054585)、NICPBP 54002菌株(Genbank寄存編號：EU394959)、S3菌株(Genbank寄存編號：EU394960)、NCTC 5348菌株(Genbank寄存編號：EU394961)、NICPBP 54006菌株(Genbank寄存編號：EU394962)、M7菌株(Genbank寄存編號：EU394963)、S19菌株(Genbank寄存編號：EU394964)或此項技術中已知之任何其他單核球增多性李斯特菌菌株。

在一個具體例中，菌株LmddΔactA中之缺失actA區的序列如SEQ ID NO：44中所闡述。在一個具體例中，位置583-753處之序列含有存在於LmddΔactA菌株中之actA序列元件。在一個具體例中，位置658-663處之序列gtcgac表示N-T及C-T序列之接合位點。

在一個具體例中，如本文所揭示之組成物及方法之重組李斯特菌屬菌株包含編碼高分子量-黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)或在另一具體例中HMW-MAA之片段的第一或第二核酸分子。

在一個具體例中，HMW-MAA亦稱為黑色素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)，且在另一具體例中為2322個殘基之膜結合蛋白。在一個具體例中，HMW-MAA表現於超過90%的以手術方式移除之良性痣及黑色素瘤病變上，且亦表現於基底細胞癌、神經脊來源腫瘤(例如星形細胞瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤及肉瘤)、兒童白血病及小葉乳癌病變中。在另一具體例中，HMW-MAA高度表現於活化外被細胞及腫瘤血管生成血管中之外被細胞兩者上，其在另一具體例中與活體內新血管生成相關。在另一具體例中，用表現HMW-MAA之片段(殘基2160至2258)的如本文所揭示之重組李斯特菌屬免疫接種小鼠削弱不經工程改造以表現HMW-MAA之腫瘤的生長(圖9D)。在另一具體例中，用表現HMW-MAA之片段(殘基2160至2258)的重組李斯特菌屬免疫接種小鼠減少腫瘤血管中外被細胞之數目。在另一具體例中，用表現HMW-MAA之片段(殘基2160至2258)的重組李斯特菌屬免疫接種小鼠導致CD8⁺ T細胞在血管周圍浸潤且浸潤至腫瘤中。

在一個具體例中，HMW-MAA之鼠類同源物(稱為NG2或AN2)與HMW-MAA具有80%同源性以及類似表現模式及功能。在另一具體例中，HMW-MAA高度表現於活化外被細胞及腫瘤血管生成血管中之外被細胞兩者上。在一個具體例中，活化外被細胞與活體內新血管生成相關。在一個具體例中，活化外被細胞參與血管生成。在另一具體例中，血管生成對於腫瘤之存活為重要的。在另一具體例中，腫瘤血管生成血管中之外被細胞與活體內新血管生成相關。在另一具體例中，活化外被細胞為血管發育、穩定、成熟及重塑中之重要細胞。因此，在一個具體例中，除其作為腫瘤相關抗原之作用之外，HMW-MAA亦為針對使用免疫治療方法的抗血管生成之潛在通用標靶。如本文(實施例8)所述，使用對抗此抗原的基於Lm之疫苗獲得之結果已支持此可能性。

在另一具體例中，本文所揭示之方法及組成物的抗原之一表現於活化外被細胞中。在另一具體例中，抗原中之至少一者表現於活化外被細胞中。

在另一具體例中，衍生出如本文所揭示之HMW-MAA片段的HMW-MAA蛋白為人HMW-MAA蛋白。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白為小鼠蛋白。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白為大鼠蛋白。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白為靈長類動物蛋白。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白來自此項技術中已知之任何其他物種。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白為黑色素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)。在另一具體例中，AN2蛋白用於如本文所揭示之方法及組成物中。在另一具體例中，NG2蛋白用於如本文所揭示之方法及組成物中。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之HMW-MAA蛋白具有具備選自NM_001897及X96753之寄存編號的GenBank條目中闡述之AA序列。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白由以上Genbank條目之一中闡述之核苷酸序列編碼。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白包含以上Genbank條目之一中闡述之序列。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白為以上Genbank條目之一中闡述之序列的同源物。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白為以上Genbank條目之一中闡述之序列的變異體。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白為以上Genbank條目之一中闡述之序列的片段。在另一具體例中，HMW-MAA蛋白為本文所揭示的以上GenBank條目之一中闡述之序列的同功異型物。

在另一具體例中，用於本發明中之HMW-MAA片段包含AA 360-554。在另一具體例中，片段基本上由AA 360-554組成。在另一具體例中，片段由AA 360-554組成。在另一具體例中，片段包含AA 701-1130。在另一具體例中，片段基本上由AA 701-1130組成。在另一具體例中，片段由AA 701-1130組成。在另一具體例中，片段包含AA 2160-2258。在另一具體例中，片段基本上由2160-2258組成。在另一具體例中，片段由2160-2258組成。

在另一具體例中，如本文所揭示之組成物及方法之重組李斯特菌屬包含編碼重組多肽之質體，該重組多肽在一個具體例中為血管生成性的，且在另一具體例中為抗原性的。在一個具體例中，多肽為HMW-MAA，且在另一具體例中，多肽為HMW-MAA片段。在另一具體例中，質體進一步編碼非HMW-MAA肽。在一個具體例中，非HMW-MAA肽增強多肽之免疫原性。在一個具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之HMW-MAA片段與非HMW-MAA AA序列融合。在另一具體例中，HMW-MAA片段嵌入於非HMW-MAA AA序列內。在另一具體例中，HMW-MAA衍生肽併入至本文所揭示之LLO片段、ActA蛋白或片段或PEST樣序列中。

在一個具體例中，非HMW-MAA肽為李斯特菌溶胞素(LLO)多肽。在另一具體例中，非HMW-MAA肽為ActA多肽。在另一具體例中，非HMW-MAA肽為PEST樣多肽。在一個具體例中，與LLO、ActA、PEST樣序列及其片段之融合增強抗原的細胞介導之免疫原性。在一個具體例中，與LLO、ActA、PEST樣序列及其片段之融合增強多種表現系統中之抗原的細胞介導之免疫原性。在另一具體例中，非HMW-MAA肽為此項技術中已知或本文所揭示之任何其他免疫原性非HMW-MAA肽。

在一個具體例中，如本文所揭示之組成物及方法的重組李斯特菌屬菌株表現由腫瘤細胞表現之異源抗原。在一個具體例中，如本文所揭示之組成物及方法之重組李斯特菌屬菌株包含編碼前列腺特異性抗原(PSA)之第一或第二核酸分子，該抗原在一個具體例中為由前列腺腫瘤高度表現之前列腺癌標記物，該等前列腺腫瘤在一個具體例中為美國男性的最常見類型之癌症且在另一具體例中為美國男性的癌症相關死亡之第二大原因。在一個具體例中，PSA為前列腺上皮細胞分泌之血管舒緩素絲胺酸蛋白酶(KLK3)，其在一個具體例中廣泛用作前列腺癌之標記物。

在一個具體例中，如本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含編碼KLK3蛋白之核酸分子。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：45(GenBank寄存編號CAA32915)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：45之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：45之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：45之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：45之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：46中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：46之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：46之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：46之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：46之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：47(GenBank寄存編號AAA59995.1)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：47之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：47之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：47之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：47之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白由具有SEQ ID NO：48(GenBank寄存編號X14810)中闡述之序列的核苷酸分子編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：48之殘基401..446、1688..1847、3477..3763、3907..4043及5413..5568編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：48之同源物編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：48之變異體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：48之異構體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：48之片段編碼。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：49(GenBank寄存編號NP_001025218)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：49之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：49之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：49之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：49之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白由具有SEQ ID NO：50(GenBank寄存編號NM_001030047)中闡述之序列的核苷酸分子編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：50之殘基42-758編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：50之同源物編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：50之變異體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：50之異構體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：50之片段編碼。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：51(GenBank寄存編號NP_001025221)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：51之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：51之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白之序列包含SEQ ID NO：51。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：51 之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：51之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白由具有SEQ ID NO：52(GenBank寄存編號NM_001030050)中闡述之序列的核苷酸分子編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：52之殘基42-758編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：52之同源物編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：52之變異體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：52之異構體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：52之片段編碼。

在另一具體例中，為KLK3肽之來源的KLK3蛋白具有SEQ ID NO：53(GenBank寄存編號NP_001025220)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：53之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：53之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：53之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：53之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白由具有SEQ ID NO：54(GenBank寄存編號NM_001030049)中闡述之序列的核苷酸分子編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：54之殘基42-758編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：54之同源物編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：54之變異體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：54之異構體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：54之片段編碼。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：55(GenBank寄存編號NP_001025219)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：55之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：55之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：55之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：55之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白由具有SEQ ID NO：56(GenBank寄存編號NM_001030048)中闡述之序列的核苷酸分子編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：56之殘基42-758編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：56之同源物編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：56之變異體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：56之異構體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：56之片段編碼。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：57(GenBank寄存編號NP_001639)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：57之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：57之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：57。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：57之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白由具有SEQ ID NO：58(GenBank寄存編號NM_001648)中闡述之序列的核苷酸分子編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：58之殘基42-827編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：58之同源物編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：58之變異體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：58之異構體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：58之片段編碼。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：59(GenBank寄存編號AAX29407.1)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：59之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：59之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：59之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白之序列包含SEQ ID NO：59。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：59之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白由具有SEQ ID NO：60(GenBank寄存編號BC056665)中闡述之序列的核苷酸分子編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：60之殘基47-832編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：60之同源物編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：60之變異體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：60之異構體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：60之片段編碼。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：61(GenBank寄存編號AJ459782)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：61之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：61之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：61之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：61之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：62(GenBank寄存編號AJ512346)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：62之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：62之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：62之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白之序列包含SEQ ID NO：62。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：62之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：63(GenBank寄存編號AJ459784)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：63之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：63之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白之序列包含SEQ ID NO：63。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：63之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：63之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有SEQ ID NO：64(GenBank寄存編號AJ459783)中闡述之序列。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：64之同源物。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：64之變異體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：64之異構體。在另一具體例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：64之片段。

在另一具體例中，KLK3蛋白由具有SEQ ID NO：65(GenBank寄存編號X07730)中闡述之序列的核苷酸分子編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：65之殘基67-1088編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：65之同源物編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：65之變異體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：65之異構體編碼。在另一具體例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：65之片段編碼。

在另一具體例中，KLK3蛋白由以下GenBank寄存編號之一中闡述之序列編碼：BC005307、AJ310938、AJ310937、AF335478、AF335477、M27274及M26663。在另一具體例中，KLK3蛋白由以上Genbank寄存編號之一中闡述之序列編碼。各可能性代表如本文提供之方法及組成物之各別具體例。

在另一具體例中，KLK3蛋白由以下GenBank寄存編號之一中闡述之序列編碼：NM_001030050、NM_001030049、NM_001030048、NM_001030047、NM_001648、AJ459782、AJ512346或AJ459784。各可能性代表如本文所揭示之方法及組成物之各別具體例。在一個具體例中，KLK3蛋白由本文所述之序列中任一者的變化形式編碼，其中序列不具有SEQ ID NO：66中闡述之序列。

在另一具體例中，KLK3蛋白具有包含以下GenBank寄存編號之一中闡述之序列的序列：X13943、X13942、X13940、X13941及X13944。

在另一具體例中，KLK3蛋白為此項技術中已知之任何其他KLK3蛋白。

在另一具體例中，KLK3肽為此項技術中已知之任何其他KLK3肽。在另一具體例中，KLK3肽為此項技術中已知的任何其他KLK3肽之片段。各類型之KLK3肽代表如本文所揭示之方法及組成物之各別具體例。

在另一具體例中，「KLK3肽」係指全長KLK3蛋白。在另一具體例中，該術語係指KLK3蛋白之片段。在另一具體例中，該術語係指不具有KLK3信號肽之KLK3蛋白的片段。在另一具體例中，該術語係指含有除KLK3信號肽之外的整個KLK3序列之KLK3蛋白。在另一具體例中，「KLK3信號序列」係指自然界中在KLK3蛋白上發現之任何信號序列。在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物的KLK3蛋白不含有任何信號序列。

在另一具體例中，為用於本文所揭示之方法及組成物的KLK3肽之來源的血管舒緩素相關肽酶3(KLK3蛋白)為PSA蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為P-30抗原蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為γ-精漿蛋白蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為血管舒緩素3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為精子素酶蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為精子素蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為此項技術中已知的任何其他類型之KLK3蛋白。

在另一具體例中，KLK3蛋白為剪接變異體1 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為剪接變異體2 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為剪接變異體3 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為轉錄變異體1 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為轉錄變異體2 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為轉錄變異體3 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為轉錄變異體4 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為轉錄變異體5 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為轉錄變異體6 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為剪接變異體RP5 KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為此項技術中已知之任何其他剪接變異體KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為此項技術中已知之任何其他轉錄變異體KLK3蛋白。

在另一具體例中，KLK3蛋白為成熟KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為原KLK3蛋白。在另一具體例中，已自本文所揭示之方法及組成物的成熟KLK3蛋白移除前導序列。

在另一具體例中，為如本文所揭示之方法及組成物之KLK3肽來源的KLK3蛋白為人類KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為靈長類動物KLK3蛋白。在另一具體例中，KLK3蛋白為此項技術中已知的任何其他物種之KLK3蛋白。在另一具體例中，以上KLK3蛋白之一在此項技術中稱為「KLK3蛋白」。

在另一具體例中，KLK3-LLO融合物提供於美國專利第9,012,141號中，該案以全文引用的方式併入本文中。在另一具體例中，所關注之抗原為HPV-E7。在另一具體例中，抗原為HPV-E6。在另一具體例中，抗原為Her-2/neu。在另一具體例中，抗原為NY-ESO-1。在另一具體例中，抗原為端粒酶(TERT)。在另一具體例中，抗原為角質層胰蛋白酶(SCCE)及其變異體。在另一具體例中，抗原為CEA。在另一具體例中，抗原為LMP-1。在另一具體例中，抗原為p53。在另一具體例中，抗原為碳酸酐酶IX(CAIX)。在另一具體例中，抗原為前列腺特異性膜抗原(PSMA)。在另一具體例中，抗原為前列腺幹細胞抗原(PSCA)。在另一具體例中，抗原為HMW-MAA。在另一具體例中，抗原為WT-1。在另一具體例中，抗原為HIV-1 Gag。在另一具體例中，抗原為蛋白酶3。在另一具體例中，抗原為酪胺酸酶相關蛋白2。在另一具體例中，抗原為PSA(前列腺特異性抗原)。在另一具體例中，抗原係選自人類乳頭狀瘤病毒E7(HPV-E7)、HPV-E6、Her-2、NY-ESO-1、端粒酶(TERT)、血管舒緩素相關肽酶7(SCCE；KLK7)、HMW-MAA、WT-1、HIV-1 Gag、 CEA、LMP-1、p53、SMA、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、蛋白酶3、酪胺酸酶相關蛋白2、存活素(BIRC5)、Muc1、前列腺特異性抗原(PSA；KLK3)、激酶錨定蛋白4(AKAP4)、Hepsin(HPN/TMPRSS1)、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR/OR51E2)、T細胞受體γ-鏈交替閱讀框蛋白(TARP)、哺乳動物允用同源物(ENAH；hMENA)、POTE旁系同源物、O-GlcNAc轉移酶(OGT)、KLK7、分離蛋白-1(SCRN1)、纖維母細胞活化蛋白(FAP)、基質金屬肽酶7(MMP7)、乳脂球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、威爾姆斯腫瘤1(WT1)、干擾素刺激基因15泛素樣修飾因子(ISG15；G1P2)、頂體酶結合蛋白(ACRBP；OY-TES-1)、血管舒緩素相關肽酶4(KLK4/前列腺酶)或其組合。

在一個具體例中，E7蛋白包含SEQ ID NO：67。

在另一具體例中，抗原為腫瘤相關抗原，其在一個具體例中為以下腫瘤抗原之一：MAGE(黑色素瘤相關抗原E)蛋白，例如MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4，酪胺酸酶；碳酸酐酶9(CA9)，突變ras蛋白；突變p53蛋白；p97黑色素瘤抗原，與晚期癌症有關之ras肽或p53肽；與子宮頸癌有關之HPV 16/18抗原、與乳癌有關之KLH抗原、與結腸直腸癌有關之CEA(癌胚抗原)、gp100、間皮素、EGFRvIII、與黑色素瘤有關之MART1抗原或與前列腺癌有關之PSA抗原。在另一具體例中，用於本文所揭示之組成物及方法的抗原為黑色素瘤相關抗原，其在一個具體例中為TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪胺酸酶、HSP-70、β-HCG或其組合。

在一個具體例中，本文所揭示之重組核酸可編碼兩種充當腫瘤標靶之各別抗原，其在一個具體例中為前列腺特異性抗原(PSA)及前列腺癌幹細胞(PSMA)抗原。在一個具體例中，本文所揭示之重組核酸分子編碼兩種充當腫瘤標靶之各別抗原，其在一個具體例中為PSA及存活素。在另一具體例中，本文所揭示之重組核酸分子編碼兩種充當腫瘤標靶之各別抗原，其在一個具體例中為cHer2及CA9。在一個具體例中，本文所揭示之由李斯特菌屬表現的兩種或多於兩種抗原之各個別抗原補充或協同免疫反應。

在另一具體例中，本文所揭示之異源抗原為影響血管生長之血管生成抗原。在一個具體例中，本文所揭示之重組核酸可編碼兩種各自包含與本文所揭示之含PEST之肽融合的影響血管生長之血管生成抗原的多肽。在一個具體例中，血管生成抗原為此項技術中已知之任何血管生成抗原，包括(但不限於)EGFR-III及其相關家族成員、VEGFR及其相關家族成員、HMW-MAA。在一個具體例中，本文所揭示之異源抗原可充當腫瘤抗原及血管生成因子兩者。在一個具體例中，異源抗原為腫瘤抗原。在另一具體例中，異源抗原為ARG-1或NOS或組合之功能或表現之抑制劑。在一個具體例中，NOS之抑制劑為N^G- 單-甲基-L-精胺酸(L-NMMA)、N^G-硝基-L-精胺酸甲酯(L-NAME)、7-NI、L-NIL或L-NIO。在一個具體例中，N-ω-硝基-L-精胺酸(一種氧化氮合成酶抑制劑及L-精胺酸競爭性抑制劑)可由核酸編碼。在一個具體例中，第二核酸可編碼抑制ARG-1或NOS之功能或表現的mRNA。

在一個具體例中，由本發明之李斯特菌屬表現之異源抗原可為神經肽生長因子拮抗劑，其在一個具體例中為[D-Arg1,D-Phe5,D-Trp7,9,Leu11]物質P、[Arg6,D-Trp7,9,NmePhe8]物質P(6-11)。此等及相關具體例為熟習此項技術者所瞭解。

在其他具體例中，抗原衍生自真菌病原體、細菌、寄生蟲、蠕蟲或病毒。在其他具體例中，抗原係選自破傷風類毒素、來自流感病毒之紅血球凝集素分子、白喉類毒素、HIV gp120、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰島素肽B、馬鈴薯粉痂菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌屬(vibriose)抗原、沙門氏菌屬(Salmonella)抗原、肺炎球菌屬(pneumococcus)抗原、呼吸道合胞病毒抗原、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)外膜蛋白、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶、奈瑟氏腦膜炎菌(Neisseria meningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)菌毛蛋白、來自HPV-16、-18、-31、-33、-35或-45型人類乳頭狀瘤病毒之人類乳頭狀瘤病毒抗原E1及E2或其組合。

在其他具體例中，抗原與以下疾病之一有關：霍亂、白喉、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、A型肝炎、 B型肝炎、流感、麻疹、腦膜炎、流行性腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、脊髓灰質炎、狂犬病、風疹、破傷風、肺結核、傷寒、水痘-帶狀疱疹、百日咳3(whooping cough3)、黃熱病、來自艾迪森氏病之免疫原及抗原、過敏、全身性過敏反應、布魯頓氏症候群(Bruton's syndrome)、癌症(包括實體腫瘤及血源性腫瘤)、濕疹、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、多發性肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、後天性免疫不全症候群、移植排斥(諸如腎臟、心臟、胰臟、肺臟、骨骼及肝臟移植)、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、多內分泌自體免疫疾病、肝炎、顯微鏡下多動脈炎、結節性多動脈炎、天疱瘡、原發性膽汁性肝硬化、惡性貧血、腹腔病、抗體介導之腎炎、絲球體腎炎、風濕疾病、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、血清反應陰性脊椎性關節炎、鼻炎、休格連氏症候群(sjogren's syndrome)、全身性硬化症、硬化性膽管炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、疱疹樣皮炎(dermatitis herpetiformis)、牛皮癬、白斑病、多發性硬化症、腦脊髓炎、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、重症肌無力、蘭伯特-伊頓症候群(Lambert-Eaton syndrome)、鞏膜、鞏膜外層、葡萄膜炎、慢性黏膜皮膚念珠菌病、風疹、嬰兒臨時性低丙種球蛋白血症、骨髓瘤、X連鎖高IgM症候群、維斯科特-奧爾德里奇症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、共濟失調毛細管擴張、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫血小板減少症、自體免疫嗜中性白細胞減少症、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、澱粉樣變性、慢性淋巴球性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、瘧疾環子孢子蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原及李斯特菌病。

在另一具體例中，由本文所揭示之方法及組成物誘導之免疫反應為T細胞反應。在另一具體例中，免疫反應包含T細胞反應。在另一具體例中，反應為CD8+ T細胞反應。在另一具體例中，反應包含CD8⁺ T細胞反應。

在一個具體例中，如本文所揭示之組成物及方法之重組李斯特菌屬包含血管生成多肽。在另一具體例中，針對癌症療法之抗血管生成方法為極有前景的，且在一個具體例中，一種類型之該抗血管生成療法靶向外被細胞。在另一具體例中，血管內皮細胞及外被細胞上之分子標靶為抗腫瘤療法之重要標靶。在另一具體例中，血小板衍生生長因子受體(PDGF-B/PDGFR-β)信號傳導對於向新形成之血管募集外被細胞為重要的。因此，在一個具體例中，本文所揭示之血管生成多肽抑制參與外被細胞信號傳導之分子，其在一個具體例中為PDGFR-β。

在一個具體例中，本發明之組成物包含血管生成因子或其免疫原性片段，其中在一個具體例中，免疫原性片段包含一或多個由宿主免疫系統識別之抗原決定基。在一個具體例中，血管生成因子為參與新血管形成之分子。在一個具體例中，血管生成因子為VEGFR2。在另一具體例中，本發明之血管生成因子為血管生成素；血管生成素-1；Del-1；纖維母細胞生長因子：酸性(aFGF)及鹼性(bFGF)；卵泡抑素；顆粒球群落刺激因子(G-CSF)；肝細胞生長因子(HGF)/分散因子(SF)；介白素-8(IL-8)；瘦素；中期因子；胎盤生長因子；血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)；血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)；多效生長因子(PTN)；前顆粒蛋白；增殖蛋白；轉型生長因子-α(TGF-α)；轉型生長因子-β(TGF-β)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；血管內皮生長因子(VEGF)/血管通透因子(VPF)。在另一具體例中，血管生成因子為血管生成蛋白。在一個具體例中，生長因子為血管生成蛋白。在一個具體例中，用於本發明之組成物及方法的血管生成蛋白為纖維母細胞生長因子(FGF)；VEGF；VEGFR及神經纖毛蛋白1(NRP-1)；血管生成素1(Ang1)及Tie2；血小板衍生生長因子(PDGF；BB-同質二元體)及PDGFR；轉型生長因子-β(TGF-β)、內皮因子及TGF-β受體；單核細胞趨化性蛋白-1(MCP-1)；整合素αVβ3、αVβ5及α5β1；VE-鈣黏蛋白及CD31；蝶素(ephrin)；胞質素原活化劑；胞質素原活化劑抑制劑-1；氧化氮合成酶(NOS)及COX-2；AC133；或Id1/Id3。在一個具體例中，用於本發明之組成物及方法的血管生成蛋白為血管生成素，其在一個具體例中為血管生成素1、血管生成素3、血管生成素4或血管生成素6。在一個具體例中，內皮因子亦稱為CD105； EDG；HHT1；ORW；或ORW1。在一個具體例中，內皮因子為TGF-β共受體。

可用於本發明之標靶抗原之實例包括(但不限於)：威爾姆斯腫瘤-1相關蛋白(Wt-1)，包括同功異型物A、B、C及D；MHC I類鏈相關蛋白A(MICA)；MHC I類鏈相關蛋白B(MICB)；胃泌素及其肽；胃泌素/CCK-2受體(CCK-B)；磷脂醯肌醇蛋白-3；毛狀蛋白樣蛋白；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；前列腺之六跨膜上皮抗原(STEAP)；前列腺癌抗原-1(PCTA-1)；前列腺腫瘤誘導基因-1(PTI-1)；與G蛋白偶聯受體具有同源性之前列腺特異性基因；前列腺酶；睾丸癌抗原；SCP-1；SSX-1、SSX-2、SSX-4；GAGE；CT7；CT8；CT10；LAGE-1；GAGE-3/6、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8；BAGE；NT-SAR-35；CA-125；HIP1R；LMNA；KIAA1416；Seb4D；KNSL6；TRIP4；MDB2；HCAC5；基因之DAM家族；RCAS1；RU2；CAMEL；結腸癌相關抗原，例如，NY-CO-8、NY-CO-13、NY-CO-9、NY-CO-16、NY-CO-20、NY-CO-38、NY-CO-45、NY-CO-9/HDAC5；NY-CO-41/MBD2；NY-CO-42/TRIP4；NY-CO-95/KIAA1416；KNSL6；seb4D；N-乙醯基葡糖轉胺酶V(GnT-V)；突變之伸長因子2(ELF2M)；HOM-MEL-40/SSX-2；BRDT；SAGE；HAGE；RAGE；突變之普遍黑色素瘤(MUM-1)；MUM-2 Arg-Gly突變；MUM-3；黑色素瘤之LDLR/FUT 融合蛋白抗原；NY-REN系列之腎癌抗原；NY-BR系列之乳癌抗原，例如，NY-BR-62、NY-BR-75、NY-BR-85；BRCA-1、BRCA-2；DEK/CAN融合蛋白；Ras，包括具有密碼子12、13、59或61中之突變，例如，突變G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、A59T、Q61H；K-RAS；H-RAS；N-RAS；BRAF；黑色素瘤抗原，包括HST-2；MDM-2；甲基-CpG結合蛋白(MeCP2；MBD2)；NA88-A；組蛋白去乙醯基酶；親環蛋白B(CYP-B)；CA15-3；CA27.29；HsP70；GAGE/PAGE家族；運動素-2；TATA元件調節因子1；腫瘤蛋白D53；NY α-胎蛋白(AFP)；SART1；SART2；SART3；ART4；優先表現之黑色素瘤抗原(PRAME)；CAP1-6D強化子促效劑肽；cdk4；cdk6；p16(INK4)；Rb蛋白；TEL；AML1；TEL/AML1；端粒酶(TERT)；707-AP；磷脂結合蛋白，例如，磷脂結合蛋白II；CML-66；CLM-28；BLC2、BCL6；CD10蛋白；CDC27；精子蛋白17(SP17)；14-3-3 ζ；MEMD；KIAA0471；TC21；酪胺酸酶相關蛋白1及2(TRP-1、TRP-2)；Gp-100/pmel-17；TARP；Nkx3.1；黑皮質素-1受體(MC1R)；MUC-1、MUC-2；ETV6/AML1；E-鈣黏蛋白；環加氧酶-2(COX-2)；EphA2；及傳染性疾病相關抗原，其全部列於美國專利公開案第2014/0186387號中，該案以引用的方式併入本文中。

在一個具體例中，如本文所揭示之癌症疫苗產生能夠浸潤腫瘤、毀滅腫瘤細胞且根除該疾病之效應T 細胞。在一個具體例中，天然存在之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)與若干腫瘤(諸如結腸、卵巢及黑色素瘤)中之較佳預後相關。在結腸癌中，不具有微小轉移跡象之腫瘤具有增加之免疫細胞浸潤及Th1表現圖譜，其與改良之患者存活相關。此外，腫瘤由T細胞之浸潤已與免疫治療方法在臨床前及人類試驗兩者中之成功相關。在一個具體例中，淋巴細胞向腫瘤位點中之浸潤視腫瘤血管之內皮細胞中之黏附分子通常藉由促炎性細胞激素(諸如IFN-γ、TNF-α及IL-1)的上調而定。若干黏附分子已牽涉於淋巴細胞向腫瘤中之浸潤過程中，包括細胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管內皮細胞黏附分子1(V-CAM-1)、血管黏附蛋白1(VAP-1)及E-選擇素。然而，此等細胞黏附分子於腫瘤血管中通常下調。因此，在一個具體例中，如本文所揭示之癌症疫苗增加TIL、上調黏附分子(在一個具體例中，為ICAM-1、V-CAM-1、VAP-1、E-選擇素或其組合)、上調促炎性細胞激素(在一個具體例中，為IFN-γ、TNF-α、IL-1或其組合)或其組合。

在一個具體例中，如本文所揭示之組成物及方法提供抗血管生成療法，其在一個具體例中可改良免疫療法策略。在一個具體例中，如本文所揭示之組成物及方法藉由上調腫瘤血管中之黏附分子及增強白細胞-血管相互作用而避開活體內內皮細胞失能，此增加腫瘤浸潤性白細胞(諸如CD8⁺T細胞)之數目。有趣地，增強之抗腫瘤保護與增加之活化CD4⁺及CD8⁺腫瘤浸潤性T細胞數目及 VEGF阻斷後腫瘤中顯著減少之調節性T細胞數目相關。

在一個具體例中，與腫瘤相關抗原同時遞送抗血管生成抗原至受如本文所述之腫瘤折磨之宿主將在影響腫瘤生長中具有協同效應且具有更有效的治療功效。

在另一具體例中，經由疫苗接種靶向外被細胞將導致細胞毒性T淋巴細胞(CTL)浸潤、外被細胞破壞、血管不穩定及血管炎症，其在另一具體例中與內皮細胞中對於淋巴細胞黏附及反式遷移重要的黏附分子之上調相關，最終改良淋巴細胞浸潤腫瘤組織之能力。在另一具體例中，同時遞送腫瘤特異性抗原產生能夠侵入腫瘤位點且殺死腫瘤細胞之淋巴細胞。

在一個具體例中，血小板衍生生長因子受體(PDGF-B/PDGFR-β)信號傳導對於向新形成之血管募集外被細胞為重要的。在另一具體例中，抑制VEGFR-2及PDGFR-β同時誘導內皮細胞細胞凋亡及腫瘤血管(在一個具體例中，約40%腫瘤血管)消退。

在另一具體例中，該重組李斯特菌屬菌株為營養缺陷型李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，該營養缺陷型李斯特菌屬菌株為dal/dat突變體。在另一具體例中，核酸分子穩定維持在缺乏抗生素選擇之重組細菌菌株中。

在一個具體例中，適用作疫苗載體之營養缺陷型突變體可以多種方式產生。在另一具體例中，D-丙胺酸營養缺陷型突變體在一個具體例中可經由破壞dal基因及dat基因兩者以產生需要外源地添加D-丙胺酸供生長的減毒之營養缺陷型李斯特菌屬菌株而產生。

在一個具體例中，可例如以熟習此項技術者熟知的許多方式產生缺乏D-丙胺酸之李斯特菌屬AA菌株，該等方式包括缺失突變誘發、插入突變誘發及導致產生讀框轉移突變的突變誘發、引起蛋白質提前終止之突變或影響基因表現之調節序列突變。在另一具體例中，可使用重組DNA技術或使用利用突變誘發化學物質或輻射且隨後選擇突變體的傳統突變誘發技術實現突變誘發。在另一具體例中，缺失突變體為較佳，因為伴隨營養缺陷型表型逆轉機率低。在另一具體例中，可在簡單實驗室培養分析法中測試根據本文呈現之方案產生的D-丙胺酸之突變體在無D-丙胺酸存在下生長的能力。在另一具體例中，選擇不能在無此化合物存在下生長的彼等突變體進行進一步研究。

在另一具體例中，除上述D-丙胺酸相關基因之外，如本文所揭示合成代謝酶所涉及之其他基因可用作李斯特菌屬突變誘發之標靶。

在一個具體例中，該營養缺陷型李斯特菌屬菌株包含具有補充該營養缺陷型李斯特菌屬菌株之營養缺陷性之代謝酶的附加型表現載體。在另一具體例中，構築體以附加型方式含於李斯特菌屬菌株中。在另一具體例中，外來抗原由重組李斯特菌屬菌株所具有之載體表現。在另一具體例中，該附加型表現質體載體無抗生素抗性標記物。在一個具體例中，如本文所揭示之方法及組成物的抗原與包含PEST序列之多肽遺傳性融合。在另一具體例中，該包含PEST序列之內源性多肽為LLO。在另一具體例中，該包含PEST序列之內源性多肽為ActA。

在另一具體例中，代謝酶補充重組菌菌株之染色體的剩餘部分中缺乏之內源性代謝基因。在一個具體例中，內源性代謝基因在染色體中突變。在另一具體例中，染色體缺失內源性代謝基因。在另一具體例中，該代謝酶為胺基酸代謝酶。在另一具體例中，該代謝酶催化用於該重組李斯特菌屬菌株中細胞壁合成之胺基酸的形成。在另一具體例中，該代謝酶為丙胺酸消旋酶。在另一具體例中，該代謝酶為D-胺基酸轉移酶。

在另一具體例中，代謝酶催化用於細胞壁合成之胺基酸(AA)的形成。在另一具體例中，代謝酶催化用於細胞壁合成之AA的合成。在另一具體例中，代謝酶參與用於細胞壁合成之AA的合成。在另一具體例中，AA用於細胞壁生物發生。

在另一具體例中，代謝酶為用於D-麩胺酸(一種細胞壁組分)之合成酶。

在另一具體例中，代謝酶由丙胺酸消旋酶基因(dal)基因編碼。在另一具體例中，dal基因編碼丙胺酸消旋酶，該酶催化反應L-丙胺酸D-丙胺酸。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之dal基因由SEQ ID NO：68(GenBank寄存編號： AF038438)中闡述之序列編碼。在另一具體例中，編碼dal之核苷酸為SEQ ID NO：68之同源物。在另一具體例中，編碼dal之核苷酸為SEQ ID NO：68之變異體。在另一具體例中，編碼dal之核苷酸為SEQ ID NO：68之片段。在另一具體例中，dal蛋白由此項技術中已知之任何其他dal基因編碼。

在另一具體例中，dal蛋白具有SEQ ID NO：69(GenBank寄存編號：AF038428)中闡述之序列。在另一具體例中，dal蛋白為SEQ ID NO：69之同源物。在另一具體例中，dal蛋白為SEQ ID NO：69之變異體。在另一具體例中，dal蛋白為SEQ ID NO：69之異構體。在另一具體例中，dal蛋白為SEQ ID NO：69之片段。在另一具體例中，dal蛋白為SEQ ID NO：69之同源物之片段。在另一具體例中，dal蛋白為SEQ ID NO：69之變異體之片段。在另一具體例中，dal蛋白為SEQ ID NO：69之異構體之片段。

在另一具體例中，dal蛋白為此項技術中已知之任何其他李斯特菌屬dal蛋白。在另一具體例中，dal蛋白為此項技術中已知之任何其他革蘭氏陽性dal蛋白。在另一具體例中，dal蛋白為此項技術中已知之任何其他dal蛋白。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之dal蛋白保持其酶活性。在另一具體例中，dal蛋白保持90%野生型活性。在另一具體例中，dal蛋白保持 80%野生型活性。在另一具體例中，dal蛋白保持70%野生型活性。在另一具體例中，dal蛋白保持60%野生型活性。在另一具體例中，dal蛋白保持50%野生型活性。在另一具體例中，dal蛋白保持40%野生型活性。在另一具體例中，dal蛋白保持30%野生型活性。在另一具體例中，dal蛋白保持20%野生型活性。在另一具體例中，dal蛋白保持10%野生型活性。在另一具體例中，dal蛋白保持5%野生型活性。

在另一具體例中，代謝酶由D-胺基酸胺基轉移酶基因(dat)編碼。D-麩胺酸合成部分地受dat基因控制，該基因參與D-glu+pyr向α-酮戊二酸酯+D-ala之轉化及逆反應。

在另一具體例中，用於本發明中之dat基因具有Genbank寄存編號AF038439中闡述之序列。在另一具體例中，dat基因為此項技術中已知之任何另一dat基因。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之dat基因由SEQ ID NO：70(GenBank寄存編號：AF038439)中闡述之序列編碼。在另一具體例中，編碼dat之核苷酸為SEQ ID NO：70之同源物。在另一具體例中，編碼dat之核苷酸為SEQ ID NO：70之變異體。在另一具體例中，編碼dat之核苷酸為SEQ ID NO：70之片段。在另一具體例中，dat蛋白由此項技術中已知之任何其他dat基因編碼。

在另一具體例中，dat蛋白具有SEQ ID NO：71(GenBank寄存編號：AF038439)中闡述之序列。在另一具體例中，dat蛋白為SEQ ID NO：71之同源物。在另一具體例中，dat蛋白為SEQ ID NO：71之變異體。在另一具體例中，dat蛋白為SEQ ID NO：71之異構體。在另一具體例中，dat蛋白為SEQ ID NO：71之片段。在另一具體例中，dat蛋白為SEQ ID NO：71之同源物之片段。在另一具體例中，dat蛋白為SEQ ID NO：71之變異體之片段。在另一具體例中，dat蛋白為SEQ ID NO：71之異構體之片段。

在另一具體例中，dat蛋白為此項技術中已知之任何其他李斯特菌屬dat蛋白。在另一具體例中，dat蛋白為此項技術中已知之任何其他革蘭氏陽性dat蛋白。在另一具體例中，dat蛋白為此項技術中已知之任何其他dat蛋白。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之dat蛋白保持其酶活性。在另一具體例中，dat蛋白保持90%野生型活性。在另一具體例中，dat蛋白保持80%野生型活性。在另一具體例中，dat蛋白保持70%野生型活性。在另一具體例中，dat蛋白保持60%野生型活性。在另一具體例中，dat蛋白保持50%野生型活性。在另一具體例中，dat蛋白保持40%野生型活性。在另一具體例中，dat蛋白保持30%野生型活性。在另一具體例中，dat蛋白保持20%野生型活性。在另一具體例中，dat 蛋白保持10%野生型活性。在另一具體例中，dat蛋白保持5%野生型活性。

在另一具體例中，代謝酶由dga編碼。D-麩胺酸合成亦部分地受dga基因控制，且D-麩胺酸合成之營養缺陷型突變體將不會在不存在D-麩胺酸下生長(Pucci等人，1995,J Bacteriol.177：336-342)。在另一具體例中，重組李斯特菌屬對於D-麩胺酸為營養缺陷的。另一實例包括參與二胺基庚二酸合成之基因。該等合成基因編碼β-半醛脫氫酶，且當失活時使得突變體對於此合成路徑為營養缺陷的(Sizemore等人，1995,Science 270：299-302)。在另一具體例中，dga蛋白為此項技術中已知之任何其他李斯特菌屬dga蛋白。在另一具體例中，dga蛋白為此項技術中已知之任何其他革蘭氏陽性dga蛋白。

在另一具體例中，代謝酶由alr(丙胺酸消旋酶)基因編碼。在另一具體例中，代謝酶為參與丙胺酸合成的此項技術中已知之任何其他酶。在另一具體例中，代謝酶為參與L-丙胺酸合成的此項技術中已知之任何其他酶。在另一具體例中，代謝酶為參與D-丙胺酸合成的此項技術中已知之任何其他酶。在另一具體例中，重組李斯特菌屬對於D-丙胺酸為營養缺陷的。對於丙胺酸合成為營養缺陷的細菌為此項技術中所熟知，且描述於例如大腸桿菌(Strych等人，2002,J.Bacteriol.184：4321-4325)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)(Tauch等人，2002,J.Biotechnol 99：79-91)及單核球增多性李斯特菌 (Frankel等人，美國專利6,099,848))、乳球菌屬(Lactococcus species)及乳桿菌屬(Lactobacillus species)(Bron等人，2002,Appl Environ Microbiol,68：5663-70)中。在另一具體例中，此項技術中已知之任何D-丙胺酸合成基因均失活。

在另一具體例中，代謝酶為胺基酸胺基轉移酶。

在另一具體例中，代謝酶由serC(一種磷酸絲胺酸轉胺酶)編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與細胞壁構成性二胺基庚二酸之合成的asd(天冬胺酸β-半醛脫氫酶)編碼。在另一具體例中，代謝酶由gsaB-麩胺酸-1-半醛轉胺酶編碼，該轉胺酶催化5-胺基乙醯丙酸酯自(S)-4-胺基-5-側氧基戊酸酯之形成。在另一具體例中，代謝酶由HemL編碼，該HemL催化5-胺基乙醯丙酸酯自(S)-4-胺基-5-側氧基戊酸酯之形成。在另一具體例中，代謝酶由aspB(一種天冬胺酸轉胺酶)編碼，該轉胺酶催化草醯乙酸酯(oxalozcetate)及L-麩胺酸酯自L-天冬胺酸酯及2-酮戊二酸酯之形成。在另一具體例中，代謝酶由參與精胺酸生物合成之argF-1編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與胺基酸生物合成之aroE編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與3-脫氫奎尼酸酯生物合成之aroB編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與胺基酸生物合成之aroD編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與胺基酸生物合成之aroC編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與組胺酸生物合成之 hisB編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與組胺酸生物合成之hisD編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與組胺酸生物合成之hisG編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與甲硫胺酸生物合成之metX編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與脯胺酸生物合成之proB編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與精胺酸生物合成之argR編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與精胺酸生物合成之argJ編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與硫胺素生物合成之thiI編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與色胺酸生物合成之LMOf2365_1652編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與色胺酸生物合成之aroA編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與纈胺酸及異白胺酸生物合成之ilvD編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與纈胺酸及異白胺酸生物合成之ilvC編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與白胺酸生物合成之leuA編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與離胺酸生物合成之dapF編碼。在另一具體例中，代謝酶由參與蘇胺酸生物合成之thrB(均為GenBank寄存編號NC_002973)編碼。

在另一具體例中，代謝酶為tRNA合成酶。在另一具體例中，代謝酶由trpS基因編碼，該基因編碼色胺醯基tRNA合成酶。在另一具體例中，代謝酶為此項技術中已知之任何其他tRNA合成酶。

在另一具體例中，本文所揭示之LmddA菌株包含dal/dat及actA染色體基因之突變、缺失或失活。

在另一具體例中，如本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。在另一具體例中，繼代使菌株作為疫苗載體之功效最大。在另一具體例中，繼代使李斯特菌屬菌株之免疫原性穩定。在另一具體例中，繼代使李斯特菌屬菌株之致病性穩定。在另一具體例中，繼代提高李斯特菌屬菌株之免疫原性。在另一具體例中，繼代提高李斯特菌屬菌株之致病性。在另一具體例中，繼代移除李斯特菌屬菌株之不穩定亞菌株。在另一具體例中，繼代降低李斯特菌屬菌株之不穩定亞菌株的發生率。在另一具體例中，繼代使菌株減毒，或在另一具體例中使得菌株致病性較小。用於經動物宿主繼代重組李斯特菌屬菌株之方法為此項技術中所熟知，且描述於例如美國專利申請案第10/541,614號中。各可能性代表如本文提供之方法及組成物之各別具體例。

在另一具體例中，如本文所揭示之方法及組成物的重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株為重組斯氏李斯特菌菌株。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株為重組格氏李斯特菌(Listeria grayi)菌株。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株為重組依氏李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株為重組默氏李斯特菌(Listeria murrayi)菌株。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株為重組威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。在另一具體例中，李斯特菌屬菌株為此項技術中已知的任何其他李斯特菌屬之重組菌株。在另一具體例中，適用於如本文所揭示之方法及組成物之李斯特菌屬蛋白質的序列來自上述菌株中任一者。

在一個具體例中，如本文所揭示之單核球增多性李斯特菌菌株為EGD菌株、10403S菌株、NICPBP 54002菌株、S3菌株、NCTC 5348菌株、NICPBP 54006菌株、M7菌株、S19菌株或此項技術中已知之另一單核球增多性李斯特菌菌株。

在另一具體例中，重組李斯特菌屬菌株為疫苗菌株，其在一個具體例中為細菌疫苗菌株。

在另一具體例中，用於本發明之方法中的重組李斯特菌屬菌株已儲存於冷凍細胞庫中。在另一具體例中，重組李斯特菌屬菌株已儲存於凍乾細胞庫中。各可能性代表本發明之各別具體例。

在另一具體例中，本發明之方法及組成物之細胞庫為主細胞庫。在另一具體例中，細胞庫為工作細胞庫。在另一具體例中，細胞庫為良好作業規範(GMP)細胞庫。在另一具體例中，細胞庫意欲用於製造臨床級材料。在另一具體例中，細胞庫符合監管規範以便人類使用。在另一具體例中，細胞庫為此項技術中已知的任何其他類型之細胞庫。各可能性代表本發明之各別具體例。

在另一具體例中，「良好作業規範」由美國聯邦法規法典(the United States Code of Federal Regulations)之(21 CFR 210-211)定義。在另一具體例中，「良好作業規範」由用於製造臨床級材料或用於人類消費之其他標準定義；例如除美國以外的國家之標準。各可能性代表本發明之各別具體例。

在另一具體例中，用於本發明之方法中的重組李斯特菌屬菌株來自一批疫苗劑量。

在另一具體例中，用於本發明之方法中的重組李斯特菌屬菌株來自藉由本文所揭示之方法製造的冷凍儲備液。

在另一具體例中，用於本發明之方法中的重組李斯特菌屬菌株來自藉由本文所揭示之方法製造的凍乾儲備液。

在另一具體例中，本發明之細胞庫、冷凍儲備液或疫苗劑量批次在解凍時展現大於90%之活力。在另一具體例中，在低溫保存儲存或冷凍儲存24小時之後解凍。在另一具體例中，儲存持續2天。在另一具體例中，儲存持續3天。在另一具體例中，儲存持續4天。在另一具體例中，儲存持續1週。在另一具體例中，儲存持續2週。在另一具體例中，儲存持續3週。在另一具體例中，儲存持續1個月。在另一具體例中，儲存持續2個月。在另一具體例中，儲存持續3個月。在另一具體例中，儲存持續5個月。在另一具體例中，儲存持續6個月。在另一具體例中，儲存持續9個月。在另一具體例中，儲存持續1年。各可能性代表本發明之各別具體例。

在另一具體例中，本發明之細胞庫、冷凍儲備液或疫苗劑量批次藉由一種方法冷凍保存，該方法包含使李斯特菌屬菌株之培養物於營養培養基中生長，將培養物冷凍於包含甘油之溶液中，且在低於-20℃下儲存李斯特菌菌株。在另一具體例中，溫度為約-70℃。在另一具體例中，溫度為約^-70-^-80℃。

在本發明之方法及組成物之另一具體例中，培養物(例如用以製造一批李斯特菌屬疫苗劑量之李斯特菌屬疫苗菌株的培養物)接種自細胞庫。在另一具體例中，培養物接種自冷凍儲備液。在另一具體例中，培養物接種自起子培養物。在另一具體例中，培養物接種自群落。在另一具體例中，培養物在生長對數中期接種。在另一具體例中，培養物在大致生長對數中期接種。在另一具體例中，培養物在另一生長期接種。

在本發明之方法及組成物之另一具體例中，用於冷凍之溶液含有2-20%之量的甘油。在另一具體例中，該量為2%。在另一具體例中，該量為20%。在另一具體例中，該量為1%。在另一具體例中，該量為1.5%。在另一具體例中，該量為3%。在另一具體例中，該量為4%。在另一具體例中，該量為5%。在另一具體例中，該量為2%。在另一具體例中，該量為2%。在另一具體例中，該量為7%。在另一具體例中，該量為9%。在另一具體例中，該量為10%。在另一具體例中，該量為12%。在另一具體例中，該量為14%。在另一具體例中，該量為16%。在另一具體例中，該量為18%。在另一具體例中，該量為222%。在另一具體例中，該量為25%。在另一具體例中，該量為30%。在另一具體例中，該量為35%。在另一具體例中，該量為40%。各可能性代表本發明之各別具體例。

在另一具體例中，用於冷凍之溶液含有另一依數添加劑或具有抗冷凍特性之添加劑替代甘油。在另一具體例中，除甘油之外，用於冷凍之溶液含有另一依數添加劑或具有抗冷凍特性之添加劑。在另一具體例中，添加劑為甘露糖醇。在另一具體例中，添加劑為DMSO。在另一具體例中，添加劑為蔗糖。在另一具體例中，添加劑為此項技術中已知的任何其他依數添加劑或具有抗冷凍特性之添加劑。

在一個具體例中，疫苗為由於暴露於組成物而引發針對組成物中之抗原或多肽之免疫反應的組成物。在另一具體例中，疫苗另外包含佐劑、細胞激素、趨化激素或其組合。在另一具體例中，疫苗或組成物另外包含抗原呈現細胞(APC)，其在一個具體例中為自體的，而在另一具體例中其對個體為同種異體的。

在一個具體例中，「疫苗」為由於暴露於組成物而在宿主中引發針對組成物中之抗原或多肽之免疫反應的組成物。在一個具體例中，免疫反應為針對特定抗原或針對抗原上之特定抗原決定基。在一個具體例中，疫苗可為肽疫苗，在另一具體例中，為DNA疫苗。在另一具體例中，疫苗可含於細胞內且在另一具體例中由細胞遞送，該細胞在一個具體例中為細菌細胞，在一個具體例中為李斯特菌屬。在一個具體例中，疫苗可防止個體感染或患上疾病或病況，其中在另一具體例中，疫苗對於患有疾病或病況之個體可為治療性的。在一個具體例中，本發明之疫苗包含本發明組成物及佐劑、細胞激素、趨化激素或其組合。

在另一具體例中，本文提供一種免疫原性組成物，其包含本發明之重組李斯特菌屬。在另一具體例中，本發明之方法及組成物之免疫原性組成物包含本發明之重組疫苗載體。在另一具體例中，免疫原性組成物包含本發明之質體。在另一具體例中，免疫原性組成物包含佐劑。在一個具體例中，本發明之載體可作為疫苗組成物之一部分投與。各可能性代表本發明之各別具體例。

在另一具體例中，本發明之疫苗用佐劑遞送。在一個具體例中，佐劑有利於主要Th1介導之免疫反應。在另一具體例中，佐劑有利於Th1型免疫反應。在另一具體例中，佐劑有利於Th1介導之免疫反應。在另一具體例中，相對於抗體介導之反應，佐劑有利於細胞介導之免疫反應。在另一具體例中，佐劑為此項技術中已知的任何其他類型之佐劑。在另一具體例中，免疫原性組成物誘導對抗標靶蛋白之T細胞免疫反應的形成。

在另一具體例中，佐劑為MPL。在另一具體例中，佐劑為QS21。在另一具體例中，佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白或編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子。在另一具體例中，佐劑為TLR促效劑。在另一具體例中，佐劑為TLR4促效劑。在另一具體例中，佐劑為單磷醯基脂質A。在另一具體例中，佐劑為TLR9促效劑。在另一具體例中，佐劑為Resiquimod®。在另一具體例中，佐劑為咪喹莫特(imiquimod)。在另一具體例中，佐劑為CpG寡核苷酸。在另一具體例中，佐劑為細胞激素或編碼其之核酸。在另一具體例中，佐劑為趨化激素或編碼其之核酸。在另一具體例中，佐劑為IL-12或編碼其之核酸。在另一具體例中，佐劑為IL-6或編碼其之核酸。在另一具體例中，佐劑為脂多醣。在另一具體例中，佐劑如Fundamental Immunology，第5版(2003年8月)：William E.Paul(編輯)；Lippincott Williams & Wilkins Publishers；第43章：Vaccines,GJV Nossal中所描述，該文獻以引用的方式併入本文中。在另一具體例中，佐劑為此項技術中已知之任何其他佐劑。各可能性代表如本文所揭示之方法及組成物之各別具體例。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中誘導針對抗原之免疫反應的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。在一個具體例中，本文揭示一種在個體中誘導針對抗原之抗血管生成免疫反應的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，該重組李斯特菌屬菌株包含第一及第二核酸分子。在另一具體例中，各該核酸分子編碼異源抗原。在又一具體例中，該第一核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中作為具有包含PEST序列之內源性多肽的開讀框。

在一個具體例中，本文揭示一種治療、遏制、或抑制個體中之至少一種癌症的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，該重組李斯特菌屬菌株包含第一及第二核酸分子。在另一具體例中，各該核酸分子編碼異源抗原。在又一具體例中，該第一核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中作為具有編碼包含PEST序列之內源性多肽之核酸序列的開讀框。在另一具體例中，該等抗原中之至少一者由該等癌細胞之至少一種細胞表現。

在一個具體例中，本文揭示一種延遲個體中之癌症發作的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，本文揭示一種延遲個體中之癌症進展的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，本文揭示一種延長個體中之癌症緩解的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，本文揭示一種減小個體中之現有腫瘤之尺寸的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，本文揭示一種防止個體中之現有腫瘤生長的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，本文揭示一種防止個體中之新或額外腫瘤生長的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。

在一個具體例中，可在已知易患特定癌症或腫瘤之特定群體中預防癌症或腫瘤。在一個具體例中，該易感性可能因環境因素所致，諸如抽菸，其在一個具體例中可能造成一族群患有肺癌，而在另一具體例中，該易感性可能因遺傳因素所致，例如帶有BRCA 1/2突變之族群在一個具體例中可能對乳癌易感，且在另一具體例中可能對卵巢癌易感。在另一具體例中，如業界所已知，染色體8q24、染色體17q12、及染色體17q24.3上的一或多個突變可能增加對攝護腺癌易感性。促成癌症易感性的其他遺傳因素及環境因素為業界所已知。

在一個具體例中，重組李斯特菌屬菌株以1×10⁶-1×10⁷ CFU之劑量向個體投與。在另一具體例中，重組李斯特菌菌株以1×10⁷-1×10⁸ CFU之劑量向個體投與。在一個具體例中，重組李斯特菌屬菌株以1×10⁸-3.31×10¹⁰ CFU之劑量向個體投與。在一個具體例中，重組李斯特菌屬菌株以1×10⁹-3.31×10¹⁰ CFU之劑量向個體投與。在另一具體例中，劑量為5-500×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為7-500×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為10-500×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為20-500×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為30-500×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為50-500×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為70-500×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為100-500×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為150-500×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為5-300×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為5-200×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為5-15×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為5-100×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為5-70×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為5-50×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為5-30×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為5-20×10⁸ CFU。在另一具體例中，劑量為1-30×10⁹ CFU。在另一具體例中，劑量為1-20×10⁹ CFU。在另一具體例中，劑量為2-30×10⁹ CFU。在另一具體例中，劑量為1-10×10⁹ CFU。在另一具體例中，劑量為2-10×10⁹ CFU。在另一具體例中，劑量為3-10×10⁹ CFU。在另一具體例中，劑量為2-7×10⁹ CFU。在另一具體例中，劑量為2-5×10⁹ CFU。在另一具體例中，劑量為3-5×10⁹ CFU。

在另一具體例中，劑量為1×10⁷個生物體。在另一具體例中，劑量為1.5×10⁷個生物體。在另一具體例中，劑量為2×10⁸個生物體。在另一具體例中，劑量為3×10⁷個生物體。在另一具體例中，劑量為4×10⁷個生物體。在另一具體例中，劑量為5×10⁷個生物體。在另一具體例中，劑量為6×10⁷個生物體。在另一具體例中，劑量為7×10⁷個生物體。在另一具體例中，劑量為8×10⁷個生物體。在另一具體例中，劑量為10×10⁷個生物體。在另一具體例中，劑量為1.5×10⁸個生物體。在另一具體例中，劑量為2×10⁸個生物體。在另一具體例中，劑量為2.5×10⁸個生物體。在另一具體例中，劑量為3×10⁸個生物體。在另一具體例中，劑量為3.3×10⁸個生物體。在另一具體例中，劑量為4×10⁸個生物體。在另一具體例中，劑量為5×10⁸個生物體。各劑量及劑量範圍代表本發明之各別具體例。

在另一具體例中，劑量為1×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為1.5×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為2×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為3×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為4×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為5×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為6×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為7×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為8×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為10×10⁹個生物體。在另一具體例中，劑量為1.5×10¹⁰個生物體。在另一具體例中，劑量為2×10¹⁰個生物體。在另一具體例中，劑量為2.5×10¹⁰個生物體。在另一具體例中，劑量為3×10¹⁰個生物體。在另一具體例中，劑量為3.3×10¹⁰個生物體。在另一具體例中，劑量為4×10¹⁰個生物體。在另一具體例中，劑量為5×10¹⁰個生物體。各劑量及劑量範圍代表本發明之各別具體例。

熟練技術人員應瞭解，術語「追加」可涵蓋向個體投與額外疫苗或免疫原性組成物或重組李斯特菌屬菌株劑量。在本發明之方法的另一具體例中，投與2次追加(或總計3次接種)。在另一具體例中，投與3次追加。在另一具體例中，投與4次追加。在另一具體例中，投與5次追加。在另一具體例中，投與6次追加。在另一具體例中，投與超過6次追加。

在另一具體例中，本發明之方法進一步包含向人類個體追加如本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株之步驟。在另一具體例中，用於追加劑接種之重組李斯特菌屬菌株與起始「初」接種所用之菌株相同。在另一具體例中，追加劑菌株與初菌株不同。在另一具體例中，初接種及追加接種使用相同劑量。在另一具體例中，追加劑使用較大劑量。在另一具體例中，追加劑使用較小劑量。在另一具體例中，本發明之方法進一步包含向個體投與追加劑疫苗接種之步驟。在一個具體例中，追加劑疫苗接種在單次初疫苗接種之後。在另一具體例中，在初疫苗接種之後投與單次追加劑疫苗接種。在另一具體例中，在初疫苗接種之後投與兩次追加劑疫苗接種。在另一具體例中，在初疫苗接種之後投與三次追加劑疫苗接種。在一個具體例中，初疫苗與追加疫苗之間的週期由熟練技術人員以實驗方式測定。在另一具體例中，初疫苗與追加疫苗之間的週期為1週，在另一具體例中，其為2週，在另一具體例中，其為3週，在另一具體例中，其為4週，在另一具體例中，其為5週，在另一具體例中，其為6-8週，在又一具體例中，在初疫苗之後8-10週投與追加疫苗。

在另一具體例中，本發明之方法進一步包含向人類個體追加本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，本發明之方法包含投與加強劑量之包含本文揭示之重組李斯特菌屬菌株的免疫原性組成物之步驟。在另一具體例中，追加劑量為該免疫原性組成物之替代形式。在另一具體例中，本發明之方法進一步包含向個體投與追加劑免疫原性組成物之步驟。在一個具體例中，在單次初劑量之該免疫原性組成物之後為追加劑量。在另一具體例中，在初劑量之後投與單次追加劑量。在另一具體例中，在初劑量之後投與兩次追加劑量。在另一具體例中，在初劑量之後投與三次追加劑量。在一個具體例中，包含本文揭示之重組李斯特菌屬的免疫原性組成物之初劑量與追加劑量之間的週期由熟練技術人員以實驗方式測定。在另一具體例中，劑量由熟練技術人員以實驗方式測定。在另一具體例中，初劑量與追加劑量之間的週期為1週，在另一具體例中，其為2週，在另一具體例中，其為3週，在另一具體例中，其為4週，在另一具體例中，其為5週，在另一具體例中，其為6-8週，在另一具體例中，追加劑量在免疫原性組成物的初劑量之後8-10週投與。

異源「初追加」策略已有效提高免疫反應及針對許多病原體提供保護。Schneider等人，Immunol.Rev.170：29-38(1999)；Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2：239-50(2002)；Gonzalo,R.M.等人，Vaccine 20：1226-31(2002)；Tanghe,A.,Infect.Immun.69：3041-7(2001)。在初注射與追加注射中提供不同形式之抗原似乎使對抗原之免疫反應最大化。DNA疫苗初打，隨後用佐劑中之蛋白質追加或病毒載體遞送編碼抗原之DNA似乎分別為提高抗原特異性抗體及CD4+ T細胞反應或CD8+ T細胞反應的最有效方式。Shiver J.W.等人，Nature 415：331-5(2002)；Gilbert,S.C.等人，Vaccine 20：1039-45(2002)； Billaut-Mulot,O.等人，Vaccine 19：95-102(2000)；Sin,J.I.等人，DNA Cell Biol.18：771-9(1999)。來自猴疫苗接種研究之近期資料表明向編碼HIV gag抗原之DNA添加CRL1005泊洛沙姆(poloxamer)(12kDa，5% POE)會提高用HIV gag DNA初打，隨後用表現HIV gag之腺病毒載體(Ad5-gag)追加對猴進行疫苗接種時的T細胞反應。DNA/泊洛沙姆初打，接種Ad5-gag追加之細胞免疫反應大於用DNA(無泊洛沙姆)初打，接種Ad5-gag追加或僅Ad5-gag誘導之反應。Shiver,J.W.等人Nature 415：331-5(2002)。美國專利申請公開案第US 2002/0165172 A1號描述同時投與編碼抗原之免疫原性部分之載體構築體與包含抗原之免疫原性部分的蛋白質，以使產生免疫反應。文獻限於B型肝炎抗原及HIV抗原。此外，美國專利第6,500,432號係針對藉由同時投與聚核苷酸及所關注之多肽提高核酸疫苗接種之免疫反應的方法。根據專利，同時投與意謂在同一免疫反應期間(較佳彼此在0-10或3-7天內)投與聚核苷酸及多肽。專利涵蓋之抗原尤其包括肝炎(全部形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰質炎(polio)、流感、寄生蟲(例如來自瘧原蟲屬)及病原菌(包括(但不限於)結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、衣原體(Chlamydia)、志賀桿菌屬(Shigella)、伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)、腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenic E.coli)、傷寒沙氏桿菌(S.typhosa)、幽門螺旋桿菌(H.pylori)、霍亂弧菌(V.cholerae)、百日咳鮑特菌(B.pertussis)等)之抗原。上述全部參考文獻以全文引用的方式併入本文中。

在一個具體例中，第一或第二核酸分子編碼前列腺特異性抗原(PSA)，且該方法用於治療、抑制或遏制前列腺癌。在另一具體例中，第一或第二核酸分子編碼PSA，且該方法用於治療、抑制或遏制卵巢癌。在另一具體例中，第一或第二核酸分子編碼PSA，且該方法治療、抑制或遏制前列腺癌之轉移，該轉移在一個具體例中包含轉移至骨骼，且在另一具體例中包含轉移至其他器官。在另一具體例中，第一或第二核酸分子編碼PSA，且該方法用於治療、抑制或遏制前列腺癌轉移至骨骼。在又一具體例中，該方法用於治療、抑制或遏制前列腺癌轉移至其他器官。在另一具體例中，第一或第二核酸分子編碼PSA，且該方法用於治療、抑制或遏制乳癌。在另一具體例中，第一或第二核酸分子編碼PSA，且該方法用於治療、抑制或遏制卵巢癌及乳癌兩者。

在另一具體例中，為如本文所揭示之方法及組成物之標靶的癌症為黑色素瘤。在另一具體例中，癌症為肉瘤。在另一具體例中，癌症為惡性腫癌。在另一具體例中，癌症為間皮瘤(例如惡性間皮瘤)。在另一具體例中，癌症為神經膠質瘤。在另一具體例中，癌症為生殖細胞腫瘤。在另一具體例中，癌症為絨膜癌。

在另一具體例中，癌症為胰臟癌。在另一具體例中，癌症為卵巢癌。在另一具體例中，癌症為胃癌。在另一具體例中，癌症為胰臟之癌性病變在另一具體例中，癌症為肺腺癌。在另一具體例中，癌症為結腸直腸腺癌。在另一具體例中，癌症為肺鱗狀腺癌。在另一具體例中，癌症為胃腺癌。在另一具體例中，癌症為卵巢表面上皮細胞贅瘤(例如其良性、增生或惡性變體)。在另一具體例中，癌症為口腔鱗狀細胞癌。在另一具體例中，癌症為非小細胞肺癌。在另一具體例中，癌症為子宮內膜癌。在另一具體例中，癌症為膀胱癌。在另一具體例中，癌症為頭頸部癌。在另一具體例中，癌症為前列腺癌。

在另一具體例中，癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)。在另一具體例中，癌症為結腸癌。在另一具體例中，癌症為肺癌。在另一具體例中，癌症為卵巢癌。在另一具體例中，癌症為子宮癌。在另一具體例中，癌症為甲狀腺癌。在另一具體例中，癌症為肝細胞癌。在另一具體例中，癌症為甲狀腺癌。在另一具體例中，癌症為肝癌。在另一具體例中，癌症為腎癌。在另一具體例中，癌症為卡堡氏癌(kaposis)。在另一具體例中，癌症為肉瘤。在另一具體例中，癌症為另一惡性腫瘤或肉瘤。

在一個具體例中，如本文所揭示之組成物及方法可用以治療與如上文所述癌症中任一者相關或由其產生之實體腫瘤。在另一具體例中，腫瘤為威爾姆斯腫瘤。在另一具體例中，腫瘤為促結締組織增生小型圓形細胞腫瘤。

在另一具體例中，本發明提供一種阻礙個體中之實體腫瘤之血管生成的方法，其包含向該個體投與包含編碼異源抗原之重組李斯特菌屬之組成物。在另一具體例中，抗原為HMW-MAA。在另一具體例中，抗原為纖維母細胞生長因子(FGF)。在另一具體例中，抗原為血管內皮生長因子(VEGF)。在另一具體例中，抗原為參與血管生成的此項技術中已知之任何其他抗原。在另一具體例中，如本文所揭示的阻礙個體中之實體腫瘤之血管生成的方法及組成物包含向該個體投與包含編碼兩種異源抗原之重組李斯特菌屬的組成物。在另一具體例中，如本文所揭示的阻礙個體中之實體腫瘤之血管生成的方法及組成物包含向該個體投與包含兩種重組李斯特菌屬菌株之混合物之組成物，其中各菌株編碼不同異源抗原。在又一具體例中，如本文所揭示的阻礙個體中之實體腫瘤之血管生成的方法及組成物包含向該個體投與包含編碼第一異源抗原之重組李斯特菌屬菌株之組成物，繼而向該個體投與包含編碼第二異源抗原之重組李斯特菌屬菌株之組成物。在另一具體例中，兩種異源抗原之一為HMW-MAA。在另一具體例中，抗原為參與血管生成的此項技術中已知之任何其他抗原。

用於評估前列腺癌疫苗之功效的方法為此項技術中所熟知，且描述於例如Dzojic H等人(Adenovirus-mediated CD40 ligand therapy induces tumor cell apoptosis and systemic immunity in the TRAMP-C2 mouse prostate cancer model.Prostate.2006年6月1日；66(8)：831-8)、 Naruishi K等人(Adenoviral vector-mediated RTVP-1 gene-modified tumor cell-based vaccine suppresses the development of experimental prostate cancer.Cancer Gene Ther.2006年7月；13(7)：658-63)、Sehgal I等人(Cancer Cell Int.2006年8月23日；6：21)及Heinrich JE等人(Vaccination against prostate cancer using a live tissue factor deficient cell line in Lobund-Wistar rats.Cancer Immunol Immunother 2007；56(5)：725-30)中。

在另一具體例中，用以測試如本文所揭示之方法及組成物的前列腺癌模型為TPSA23(衍生自穩定表現PSA之TRAMP-C1細胞株)小鼠模型。在另一具體例中，前列腺癌模型為178-2 BMA細胞模型。在另一具體例中，前列腺癌模型為PAIII腺癌細胞模型。在另一具體例中，前列腺癌模型為PC-3M模型。在另一具體例中，前列腺癌模型為此項技術中已知之任何其他前列腺癌模型。

在另一具體例中，於人類個體中測試疫苗，且使用此項技術中熟知之方法監測功效，例如直接量測CD4⁺及CD8⁺ T細胞反應，或例如藉由測定腫瘤轉移之數目或尺寸量測疾病進展，或監測疾病症狀(咳嗽、胸部疼痛、體重減輕等)。用於評估前列腺癌疫苗於人類個體中之功效的方法為此項技術中所熟知，且描述於例如Uenaka A等人(T cell immunomonitoring and tumor responses in patients immunized with a complex of cholesterol-bearing hydrophobized pullulan(CHP)and NY- ESO-1 protein.Cancer Immun.2007年4月19日；7：9)及Thomas-Kaskel AK等人(Vaccination of advanced prostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival.Int J Cancer.2006年11月15日；119(10)：2428-34)中。

在另一具體例中，本發明提供一種治療個體中之良性前列腺增生(BPH)的方法。在另一具體例中，本發明提供一種治療個體中之前列腺上皮內瘤形成(PIN)的方法。

在另一具體例中，本文揭示一種重組李斯特菌屬菌株，其包含可操作地整合至李斯特菌屬基因組中之核酸分子。在另一具體例中，該核酸分子編碼(a)包含PEST序列之內源性多肽及(b)包含開讀框中之抗原之多肽。

在一個具體例中，本文揭示一種治療、遏制或抑制個體中之至少一種癌症的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，該重組李斯特菌屬菌株包含第一及第二核酸分子。在另一具體例中，各該核酸分子編碼異源抗原。在另一具體例中，該第一核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中作為具有包含PEST序列之原生多肽之開讀框，且其中該抗原由該腫瘤之至少一個細胞表現。

在一個具體例中，「抗原」於本文用以指當置放得與生物體接觸時自生物體產生可偵測免疫反應之物質。抗原可為脂質、肽、蛋白質、碳水化合物、核酸或其組合及變化形式。

在一個具體例中，「變異體」係指與大部分群體不同但又充分類似於視為其中之一的共同模式之胺基酸或核酸序列(或在其他具體例中，生物體或組織)，例如剪接變異體。

在一個具體例中，「同功異型物」係指分子(例如蛋白質)之與相同蛋白質之另一同功異型物或形式相比僅具有微小差異的形式。在一個具體例中，同功異型物可由不同但相關基因產生，或在另一具體例中，可藉由替代性剪接由相同基因產生。在另一具體例中，同功異型物由單核苷酸多形現象引起。

在一個具體例中，「片段」係指比全長蛋白質或多肽短或包含較少胺基酸之蛋白質或多肽。在一個替代性具體例中，片段係指比全長核酸短或包含較少核苷酸之核酸。在另一具體例中，片段為N端片段。在另一具體例中，片段為C端片段。在一個具體例中，片段為蛋白質、肽或核酸之序列內區段。在一個具體例中，片段為功能性片段。在另一具體例中，片段為免疫原性片段。在一個具體例中，一個片段有10-20個核酸或胺基酸，而在另一具體例中，一個片段有多於5個核酸或胺基酸，而在另一具體例中，一個片段有100-200個核酸或胺基酸，而在另一具體例中，一個片段有100-500個核酸或胺基酸，而在另一具體例中，一個片段有50-200個核酸或胺基酸，而在另一具體例中，一個片段有10-250個核酸或胺基酸。

在一個具體例中，「免疫原性」或「免疫原性的」在本文用以指蛋白質、肽、核酸、抗原或生物體當向動物投與該蛋白質、肽、核酸、抗原或生物體時在該動物中引起免疫反應之先天能力。因此，在一個具體例中，「增強免疫原性」係指增加蛋白質、肽、核酸、抗原或生物體當向動物投與該蛋白質、肽、核酸、抗原或生物體時在該動物中引起免疫反應之能力。在一個具體例中，蛋白質、肽、核酸、抗原或生物體提引出免疫反應的能力提昇可藉下列方式測量：對蛋白質、肽、核酸、抗原或生物體之抗體數目較大；對抗原或生物體之抗體較為多樣化；蛋白質、肽、核酸、抗原或生物體特異性T細胞之數目較多；對蛋白質、肽、核酸、抗原或生物體之胞毒性較大或助手T細胞反應較大；及其類。

在一個具體例中，「同源物」係指與特定核酸或胺基酸序列共有一定百分比之序列一致性的核酸或胺基酸序列。在一個具體例中，適用於如本文所揭示之組成物及方法中的序列可為本文所描述或此項技術中已知的特定LLO序列或其N端片段、ActA序列或其N端片段或PEST-樣序列之同源物。在另一具體例中，適用於如本文所揭示之組成物及方法中的序列可為抗原性多肽之同源物，在一個具體例中，該抗原性多肽為CA9、cHER2或 HMW-MAA或其功能片段。在一個具體例中，本發明的多肽之同源物及在一個具體例中，編碼該種同源物之核酸維持親本多肽之功能特徵。舉例而言，在一個具體例中，本發明的抗原性多肽之同源物維持親本多肽之抗原特徵。在另一具體例中，適用於如本文所揭示之組成物及方法中的序列可為本文所描述之任何序列的同源物。在一個具體例中，同源物與特定序列共有至少70%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少72%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少75%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少78%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少80%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少82%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少83%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少85%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少87%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少88%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少90%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少92%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少93%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少95%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少96%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少97%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少98%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有至少99%一致性。在另一具體例中，同源物與特定序列共有100%一致性。

在一個具體例中，應理解，如本文所揭示及/或如本文所描述之序列中之任一者的同源物視為本發明之一部分。

在一個具體例中，在本發明之含義內，「功能」在本文用以指蛋白質、肽、核酸、片段或其變異體展現生物活性或功能之先天能力。在一個具體例中，此類生物功能為其與相互相用搭配物(例如膜相關受體)結合之特性，且在另一具體例中，其三聚特性。在本發明之功能片段及功能變異體的情況下，此等生物學功能可實際上在例如其特異性或選擇性方面進行變化，但保持基本生物功能。

在一個具體例中，「治療」係指治療性處理及預防性措施或預防措施兩者，其中目的為防止或減輕如本文描述之標靶病理病況或病症。因此，在一個具體例中，處理可包括直接影響或治癒、遏制、抑制、預防、減低疾病、病症或病況的嚴重度，延遲其起始，減輕其相關症狀，或其組合。因此，在一個具體例中，「治療」尤其係指延遲進展，促進緩解，誘導緩解，擴大緩解，加速緩解，增加對替代療法的功能，或減少對替代療法的抗性，或其組合。在一個具體例中，「預防」或「防止」尤其係指延遲症狀的出現，預防疾病的復發，減低復發事件的數目或頻率，增加症候事件間的延遲，或其組合。在一個具體例中，「遏制」或「抑制」尤其係指減輕症狀之嚴重度，減輕急性事件之嚴重度，減少症狀之數目，減低疾病相關症狀之發生率，減少症狀之延遲，改善症狀，減少繼發症狀，減少繼發感染，延長病人存活時間或其組合。

在一個具體例中，症狀為原發性的，而在另一具體例中，症狀為繼發性的。在一個具體例中，「原發性」係指一種症狀為特定疾病或病症的直接結果，而在一個具體例中，「繼發性」係指衍生自原發性起因或結果導致的症狀。在一個具體例中，用於本發明之化合物治療原發性或繼發性症狀或繼發性併發症。在另一具體例中，「症狀」可為疾病或病理狀況的任何表癥。

在一些具體例中，術語「包含」係指包括其他重組多肽、胺基酸序列或核酸序列，以及包括可為此項技術中已知之其他多肽、胺基酸序列或核酸序列，其在一個具體例中可包含抗原或李斯特菌屬多肽、胺基酸序列或核酸序列。在一些具體例中，術語「基本上由......組成」係指具有特異性重組多肽、胺基酸序列或核酸序列或其片段的適用於如本文所揭示之方法的組成物。然而，可包括不直接參與重組多肽之效用的其他多肽、胺基酸序列或核酸序列。在一些具體例中，術語「由......組成」係指在如本文所述之任何形式或具體例中具有如本文所揭示之特定重組多肽、胺基酸序列或核酸序列或片段、或重組多肽、胺基酸序列或核酸序列或片段之組合的適用於如本文所揭示之方法的組成物。

在一個具體例中，適用於如本文所揭示之方法的組成物係靜脈內投與。在另一具體例中，疫苗係經口投與，而在另一具體例中，疫苗係非經腸(例如，皮下、肌肉內及其類似方式)投與。

此外，在另一具體例中，組成物或疫苗係以栓劑(例如直腸栓劑或尿道栓劑)形式投與。此外，在另一具體例中，醫藥組成物係藉由皮下植入集結粒投與。在另一具體例中，集結粒提供藥劑經一段時間之控制釋放。在又一具體例中，醫藥組成物係以膠囊形式投與。

在一個具體例中，投藥途徑可為非經腸。在另一具體例中，途徑可為眼內、結膜、局部、經皮、皮內、皮下、腹膜內、靜脈內、動脈內、經陰道、經直腸、瘤內、癌旁、經黏膜、肌肉內、血管內、室內、顱內、吸入(氣霧劑)、經鼻抽吸(噴霧)、鼻內(滴劑)、舌下、經口、氣霧劑或栓劑或其組合。對於藉由吸入鼻內投與或施用，在適當載劑存在下混合及霧化或噴霧的化合物之溶液或懸浮液為適合的。該種氣霧劑可包含本文所述之任何藥劑。在一個具體例中，如本文所闡述之組成物可呈適用於顱內投與之形式，顱內投與在一個具體例中為鞘內及腦室內投與。在一個具體例中，投藥方案將由熟練臨床醫師基於諸如以下之因素確定：所治療病況之確切性質、病況嚴重度、患者之年齡及一般身體情況、體重及個別患者之反應等。

在一個具體例中，特別適合之非經腸施用為可注射之無菌溶液(較佳油性或水性溶液)以及懸浮液、乳液或植入物(包括栓劑及灌腸劑)。安瓿為適宜單位劑量。該種栓劑可包含本文所述之任何藥劑。

在一個具體例中，可調配持續或定向釋放組成物，例如，其中活性化合物受可差異降解的塗層(例如，藉由微囊封裝)、多個塗層等保護之脂質體或彼等。該等組成物可經調配用於即刻或緩慢釋放。亦有可能凍乾新化合物且將獲得之凍乾物例如用於製備注射用產品。

在一個具體例中，對於液體調配物，醫藥學上可接受之載劑可為水性或非水性溶液、懸浮液、乳液或油。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括生理食鹽水及緩衝介質。油之實例為石油、動物、植物或合成來源之油，例如花生油、大豆油、礦物油、橄欖油、葵花油及魚肝油。

在一個具體例中，本發明之組成物為醫藥學上可接受的。在一個具體例中，術語「醫藥學上可接受的」係指安全且向所要投藥途徑適當遞送有效量之至少一種用於本發明之化合物的任何調配物。此術語亦指使用緩衝調配物，其中根據化合物之穩定性及投藥途徑，pH維持在範圍介於pH 4.0至pH 9.0之特定所要值下。

在一個具體例中，本發明之方法的或用於本發明之方法中的組成物可單獨或在組成物內投與。在另一具體例中，可使用本發明之組成物與習知賦形劑的混雜物，該等賦形劑亦即不會與活性化合物有害地反應之適用於非經腸、經腸(例如，經口)或局部施用的醫藥學上可接受之有機或無機載劑物質。在一個具體例中，適合醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)水、鹽溶液、醇、阿拉伯膠、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(諸如乳糖、直鏈澱粉或澱粉)、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、白色石蠟、甘油、海藻酸鹽、玻尿酸、膠原蛋白、香料油、脂肪酸單酸甘油酯及二酸甘油酯、異戊四醇脂肪酸酯、羥基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮等。在另一具體例中，醫藥製劑可經滅菌且必要時與不會與活性化合物有害地反應之輔助劑混合，該等輔助劑例如，潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、影響滲透壓力之鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳族物質及其類似物。在另一具體例中，其亦可在必要時與其他活性劑(例如，維生素)組合。

在一個具體例中，用於如本文所揭示之方法及組成物的組成物可與載劑/稀釋劑一起投與。固體載劑/稀釋劑包括(但不限於)膠、澱粉(例如，玉米澱粉、預膠凝化澱粉)、糖(例如，乳糖、甘露糖醇、蔗糖、右旋糖)、纖維素材料(例如，微晶纖維素)、丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯)、碳酸鈣、氧化鎂、滑石或其混合物。

在一個具體例中，如本文所揭示之方法及組成物之組成物可包含本發明之組成物及一或多種有效預防或治療癌症之額外化合物。在一些具體例中，額外化合物可包含適用於化學療法中之化合物，其在一個具體例中為順鉑(Cisplatin)。在另一具體例中，異環磷醯胺(Ifosfamide)、氟尿嘧啶或5-FU、伊立替康(Irinotecan)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(紫杉醇(Taxol))、多烯紫杉醇(Docetaxel)、吉西他濱(Gemcitabine)、拓撲替康(Topotecan)或其組合可與如本文所揭示適用於如本文所揭示之方法的組成物一起投與。在另一具體例中，安吖啶(Amsacrine)、博萊黴素(Bleomycin)、白消安(Busulfan)、卡培他濱(Capecitabine)、卡鉑(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、氯芥苯丁酸(Chlorambucil)、順鉑、克拉屈濱(Cladribine)、氯法拉濱(Clofarabine)、克里沙納塔斯蛋白酶(Crisantaspase)、環磷醯胺、阿糖胞苷(Cytarabine)、達卡巴嗪(Dacarbazine)、放線菌素(Dactinomycin)、道諾黴素(Daunorubicin)、多烯紫杉醇、小紅莓(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、依託泊苷(Etoposide)、氟達拉濱(Fludarabine)、氟尿嘧啶、吉西他濱、Gliadel植入物、羥基脲、艾達黴素(Idarubicin)、異環磷醯胺、伊立替康、甲醯四氫葉酸(Leucovorin)、脂質體小紅莓、脂質體道諾黴素、洛莫司汀(Lomustine)、美法侖(Melphalan)、巰基嘌呤、美司鈉(Mesna)、甲胺喋呤(Methotrexate)、絲裂黴素(Mitomycin)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、培美曲唑(Pemetrexed)、噴司他汀(Pentostatin)、丙卡巴肼(Procarbazine)、雷替曲塞(Raltitrexed)、沙鉑 (Satraplatin)、鏈佐星(Streptozocin)、替加氟(Tegafur)-尿嘧啶、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、噻替派(Thiotepa)、硫鳥嘌呤、拓撲替康、曲奧舒凡(Treosulfan)、長春鹼(Vinblastine)、長春新鹼(Vincristine)、長春地辛(Vindesine)、長春瑞濱(Vinorelbine)或其組合可與如本文所揭示適用於如本文所揭示之方法的組成物一起投與。

在另一具體例中，如本文所揭示之融合蛋白藉由如下過程製備，其包含次選殖適當序列，繼而表現所得核苷酸。在另一具體例中，子序列經選殖，及適當子序列使用適當限制酶裂解。在另一具體例中，然後該等片段接合而產生所要DNA序列。在另一具體例中，編碼融合蛋白之DNA使用DNA擴增方法，例如聚合酶連鎖反應(PCR)來產生。首先，在新終端任一側上的原生DNA之區段係經分開擴增。一個已擴增序列的5'端編碼肽連接子，而另一個已擴增序列的3'端亦編碼肽連接子。因第一片段的5'端係與第二片段的3'端互補，故兩個片段(在部分純化後，例如於LMP瓊脂上部分純化後)可用作為第三PCR反應中的重疊模板。已擴增序列將含有密碼子，在開放位點的羧基側上的區段(現在形成胺基序列)，及在開放位點的胺基側上的區段(現在形成羧基序列)。然後插入序列接合至質體中。在另一具體例中，類似策略用以產生蛋白質，其中HMW-MAA片段嵌入於異源肽內。

在一個具體例中，本發明亦提供一種重組李斯特菌屬，其包含編碼包含與含PEST之序列融合的異源抗原或其片段之多肽之核酸分子，其中該核酸分子於該李斯特菌屬中為附加型的。

在一個具體例中，本文揭示一種能夠表現及分泌兩種獨特異源抗原之重組李斯特菌屬。在另一具體例中，第一及第二抗原為獨特的。在另一具體例中，該等第一及第二抗原係同時表現。在另一具體例中，該等第一或第二抗原係在相同水準下表現。在另一具體例中，該等第一或第二抗原係區別地表現。

在另一具體例中，基因或蛋白質表現藉由為此項技術中所熟知之方法測定，該等方法在另一具體例中包含即時PCR、北方墨點法(northern blotting)、免疫墨點法等。在另一具體例中，該第一或第二抗原之表現受誘導型系統控制，而在另一具體例中，該第一或第二抗原之表現受組成型啟動子控制。在另一具體例中，誘導型表現系統為此項技術中所熟知。

在一個具體例中，本文揭示一種製備能夠表現及分泌兩種同時靶向腫瘤細胞及血管生成之獨特異源抗原之重組李斯特菌屬的方法。在另一具體例中，該製備該重組李斯特菌屬之方法包含以下步驟：使第一抗原遺傳性融合至可操作地連接至編碼包含PEST序列之第一多肽或其片段之開讀框的基因組中，及用編碼可操作地連接至編碼包含PEST序列之第二多肽或其片段之開讀框的第二抗原之附加型表現載體轉型該重組李斯特菌屬。在另一具體例中，該製備該重組李斯特菌屬之方法包含以下步驟：使第一抗原遺傳性融合至可操作地連接至編碼包含PEST序列之第一多肽或其片段之開讀框的基因組中，及遺傳性融合可操作地連接至編碼包含PEST序列之第二多肽或其片段之開讀框的第二抗原。

用於轉型細菌之方法為此項技術中所熟知，且包括基於氯化鈣勝任細胞之方法、電穿孔方法、細菌噬菌體介導之轉導、化學及物理轉型技術(de Boer等人，1989,Cell 56：641-649；Miller等人，1995,FASEB J.,9：190-199；Sambrook等人1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；Ausubel等人，1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York；Gerhardt等人編，1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society for Microbiology,Washington,DC；Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。在另一具體例中，如本文所揭示之李斯特菌屬疫苗菌株藉由電穿孔經轉型。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中誘導針對抗原之免疫反應的方法，其包含向該個體投與重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株包含第一及第二核酸分子，各該核酸分子編碼異源抗原性多肽或其片段，其中該第一核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中作為具有編碼包含PEST序列之內源性多肽之核酸的開讀框。

在另一具體例中，本文揭示一種抑制癌症發作之方法，該方法包含投與表現兩種特異性地表現於該癌症中之獨特異源抗原之重組李斯特菌屬組成物的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種治療患有腫瘤或癌症之個體的方法，該方法包含投與包含表現兩種或多於兩種特異性地表現於該腫瘤上之獨特異源抗原的本文所揭示之重組李斯特菌屬之醫藥組成物或調配物的步驟。

在另一具體例中，表現兩種或多於兩種與含PEST之序列(諸如N端LLO、N端ActA或PEST序列或肽)融合之異源抗原的重組李斯特菌屬靶向兩種或多於兩種不同腫瘤或癌症、或患有該等腫瘤或癌症之個體中之轉移、或轉移。

在另一具體例中，本文揭示一種在個體中減緩與癌症相關之症狀的方法，該方法包含投與表現兩種或多於兩種特異性地表現於該癌症中之獨特異源抗原之重組李斯特菌屬組成物的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種保護個體免遭癌症之方法，該方法包含投與表現兩種特異性地表現於該癌症中之獨特異源抗原之重組李斯特菌屬組成物的步驟。

在另一具體例中，本文揭示一種延遲癌症發作之方法，該方法包含投與表現兩種或多於兩種特異性地表現於該癌症中之獨特異源抗原之重組李斯特菌屬組成物的步驟。在另一具體例中，本文揭示一種治療轉移性癌症之方法，該方法包含投與表現兩種或多於兩種特異性地表現於該癌症中之獨特異源抗原之重組李斯特菌屬組成物的步驟。在另一具體例中，本文揭示一種預防轉移性癌症或微小轉移之方法，該方法包含投與表現兩種或多於兩種特異性地表現於該癌症中之獨特異源抗原之重組李斯特菌屬組成物的步驟。在另一具體例中，重組李斯特菌屬組成物係經口或非經腸投與。

在另一具體例中，包含本文所揭示之重組李斯特菌屬的醫藥組成物係靜脈內、皮下、鼻內、肌肉內投與或注射至腫瘤部位或腫瘤中。

在如本文所揭示之方法及組成物之另一具體例中，「核酸」或「核苷酸」係指一串至少兩個鹼基-糖-磷酸酯組合。在一個具體例中，該術語包括DNA及RNA。在一個具體例中，「核苷酸」係指核酸聚合物之單體單元。在一個具體例中，RNA可呈tRNA(轉移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖體RNA)、mRNA(信使RNA)、反義RNA、小抑制RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)及核糖核酸酶形式。已描述siRNA及miRNA之用途(Caudy AA等人，Genes & Devel 16：2491-96及其中引用之參考文獻)。DNA可呈質體DNA、病毒DNA、線性DNA或染色體DNA或此等基團之衍生物形式。另外，此等形式之DNA及RNA可呈單股、雙股、三股或四股。在另一具體例中，該術語亦包括可含有其他類型之主鏈但鹼基相同之人工核酸。在一個具體例中，人工核酸為PNA(肽核酸)。PNA含有肽主鏈及核苷酸鹼基且在一個具體例中能夠結合DNA與RNA分子兩者。在另一具體例中，核苷酸經氧雜環丁烷修飾。在另一具體例中，核苷酸藉由用一個硫代磷酸酯鍵置換一或多個磷酸二酯鍵來修飾。在另一具體例中，人工核酸含有此項技術中已知之原生核酸之磷酸酯主鏈的任何其他變異體。硫代磷酸酯核酸及PNA之用途為熟習此項技術者已知且描述於例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9：353-57；及Raz NK等人Biochem Biophys Res Commun.297：1075-84中。核酸之產生及使用為熟習此項技術者已知，且描述於例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook及Russell編輯及Methods in Enzymology：Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio及G.C.Fareed。各核酸衍生物代表如本文所揭示之各別具體例。

在另一具體例中，術語「多肽」、「肽」及「重組肽」係指任何長度之肽或多肽。在另一具體例中，如本文所揭示之之肽或重組肽具有上文對HMW-MAA片段所列舉的長度中之一者。各可能性代表如本文所揭示之方法及組成物之各別具體例。在一個具體例中，術語「肽」係指原生肽(降解產物、以合成方式合成之肽或重組肽)及/或肽模擬物(通常為以合成方式合成之肽)，諸如為肽類似物之類肽及半類肽，舉例而言，其可具有使該等肽在身體中更穩定或更能滲透至細胞中之修飾。此類修飾包含(但不限於)N端修飾、C端修飾、肽鍵修飾(包括(但不限於)CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH)、主鏈修飾以及殘基修飾。用於製備肽模擬化合物之方法為在此項技術中所熟知，且例如說明於Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.，第17.2章，F.Choplin Pergamon Press(1992)中，其以引用的方式併入，如同本文充分闡述一般。在此方面之其他細節在下文揭示。

在一個具體例中，「抗原性多肽」在本文用以指如上文所描述的非宿主原有且當存在於宿主中或(在另一具體例中)由宿主偵測到時引起免疫反應安裝之多肽、肽或重組肽。

在一個具體例中，術語「寡核苷酸」與術語「核酸」可互換，且可指可包括(但不限於)以下各者之分子：原核序列、真核mRNA、來自真核mRNA之cDNA、來自真核(例如哺乳動物)DNA之基因組DNA序列及甚至合成DNA序列。該術語亦指包括DNA及RNA之任何已知鹼基類似物的序列。

在另一具體例中，「穩定維持」係指在缺乏選擇(例如抗生素選擇)達10代下維持核酸分子或質體而無可偵測之喪失。在另一具體例中，週期為15代。在另一具體例中，週期為20代。在另一具體例中，週期為25代。在另一具體例中，週期為30代。在另一具體例中，週期為40代。在另一具體例中，週期為50代。在另一具體例中，週期為60代。在另一具體例中，週期為80代。在另一具體例中，週期為100代。在另一具體例中，週期為150代。在另一具體例中，週期為200代。在另一具體例中，週期為300代。在另一具體例中，週期為500代。在另一具體例中，週期超過500代。在另一具體例中，核酸分子或質體活體外(例如在培養物中)穩定維持。在另一具體例中，核酸分子或質體活體內穩定維持。在另一具體例中，核酸分子或質體活體外及活體內皆穩定維持。

在一個具體例中，術語「胺基酸」理解為包括20種天然存在之胺基酸；通常經活體內轉譯後修飾之彼等胺基酸，包括例如羥基脯胺酸、磷酸絲胺酸及磷酸蘇胺酸；及其他非尋常胺基酸，包括(但不限於)2-胺基己二酸、羥基離胺酸、異鎖鏈素、正纈胺酸、正白胺酸及鳥胺酸。此外，術語「胺基酸」可包括D-胺基酸及L-胺基酸兩者。

術語「核酸」或「核酸序列」係指單或雙股形式之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。該術語涵蓋含有天然核苷酸之出於所要目的具有與參考核酸類似或改良之結合特性之已知類似物的核酸(亦即寡核苷酸)。該術語亦包括以類似於天然存在之核苷酸之方式或在出於所要目的比其提高之速率下代謝的核酸。該術語亦涵蓋具有合成主鏈之核酸樣結構。由本發明提供之DNA主鏈類似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯、烷基磷酸三酯、胺基磺酸酯、3'-硫縮醛、亞甲基(甲基亞胺基)、3'-N-胺基甲酸酯、嗎啉基胺基甲酸酯及肽核酸(PNA)；參見例如，Oligonucleotides and Analogues,a Practical Approach,F.Eckstein編，IRL Press at Oxford University Press(1991)；Antisense Strategies,Annals of the New York Academy of Sciences，第600卷，Baserga及Denhardt編(NYAS 1992)；Mulligan(1993)J.Med.Chem.36：1923-1937；Antisense Research and Applications(1993,CRC Press)。PNA含有非離子主鏈，諸如N-(2-胺基乙基)甘胺酸單元。硫代磷酸酯鍵描述於例如WO 97/03211；WO 96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appi.Pharmacol.144：189-197中。由該術語涵蓋之其他合成主鏈包括甲基-膦酸酯鍵或交替甲基膦酸酯及磷酸二酯鍵(Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698)及苯甲基膦酸酯鍵(Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.6：153-156)。術語核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸引子、探針及擴增產物互換使用。

在如本文所揭示之方法及組成物的一個具體例中，術語「重組位點」或「定點重組位點」係指核酸分子中由介導側接重組位點之核酸區段的交換或切除之重組酶識別(在一些情況下，在相關蛋白質一起)的鹼基序列。重組酶及相關蛋白質統稱為「重組蛋白」，參見例如Landy,A.,(Current Opinion in Genetics & Development)3：699-707；1993。

「噬菌體表現載體」或「噬菌粒」係指任何基於噬菌體之重組表現系統，其用於在任何細胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)中活體外或活體內組成性或誘導性表現如本文所揭示之方法及組成物的核酸序列之目的。噬菌體表現載體通常可在細菌細胞中再生且在適當條件下產生噬菌體粒子。該術語包括線性或圓形表現系統且涵蓋保持附加型或整合至宿主細胞基因組中的兩種基於噬菌體之表現載體。

熟練技術人員應瞭解，術語「可操作地連接」可意謂，轉錄及轉譯調節核酸以起始轉錄之方式相對於任何編碼序列定位。一般而言，此將意謂啟動子及轉錄起始或開始序列定位於編碼區之5'。

熟練技術人員應理解，術語「開讀框」或「ORF」可涵蓋含有可潛在地編碼蛋白質之鹼基序列的生物體基因組之一部分。在另一具體例中，ORF之開始及終止末端不同等於mRNA之末端，但其通常含於mRNA內。在一個具體例中，ORF位於基因之開始編碼序列(起始密碼子)與停止密碼子序列(終止密碼子)之間。因此，在一個具體例中，可操作地整合至基因組中具有內源性多肽之開讀框的核酸分子為整合至基因組中與內源性多肽相同開讀框中的核酸分子。

在一個具體例中，本發明提供包含連接序列之融合多肽。在一個具體例中，「連接序列」係指接合兩種異源多肽之胺基酸序列或其片段或結構域。一般而言，如本文中所使用，連接子為共價連接多肽形成融合多肽之胺基酸序列。連接子通常包括自呈現載體移除報導基因之後從剩餘的重組信號轉譯的胺基酸，以產生包含由開讀框編碼之胺基酸序列及呈現蛋白的融合蛋白。如熟習此項技術者所瞭解，連接子可包含額外胺基酸，諸如甘胺酸及其他中性小胺基酸。

在一個具體例中，本文所揭示之「內源性」描述已在參考生物體內出現或起源或由參考生物體內之原因出現之物件。在另一具體例中，內源性係指原生的。

在另一具體例中，本發明之方法進一步包含向個體追加本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株。在另一具體例中，本發明之方法包含投與追加劑量的包含本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株之疫苗的步驟。

在一個具體例中，「融合」係指藉由共價鍵可操作地連接。在一個具體例中，該術語包括重組融合(核酸序列或其開讀框)。在另一具體例中，該術語包括化學結合。

在一個具體例中，「轉型」係指工程改造細菌細胞以接受質體或其他異源DNA分子。在另一具體例中，「轉型」係指工程改造細菌細胞以表現質體之基因或其他異源DNA分子。各可能性代表如本文提供之方法及組成物之各別具體例。

在另一具體例中，結合用於將遺傳物質及/或質體引入細菌中。結合方法為此項技術中所熟知，且描述於例如Nikodinovic J等人(A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation.Plasmid.2006年11月；56(3)：223-7)及Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35)：12554-9)中。

在另一具體例中，「代謝酶」係指合成宿主細菌所需營養所涉及的酶。在另一具體例中，該術語係指合成宿主細菌所需營養所需的酶。在另一具體例中，該術語係指合成宿主細菌所利用營養所涉及的酶。在另一具體例中，該術語係指合成宿主細菌持續生長所需之營養所涉及的酶。在另一具體例中，合成營養需要該酶。

熟練技術人員將瞭解，術語「減毒」可涵蓋細菌在動物體引發疾病的能力縮減。換言之，減毒之李斯特菌屬菌株之病原性特徵已相較於野生型李斯特菌屬減少，但減毒之李斯特菌屬能夠在培養物中生長及維持。舉例而言，用減毒之李斯特菌屬靜脈內接種Balb/c小鼠，50%接種動物存活之致死劑量(LD50)較佳比野生型李斯特菌屬之LD50增加至少約10倍、更佳至少約100倍、更佳至少約1,000倍、甚至更佳至少約10,000倍且最佳至少約100,000倍。減毒之李斯特菌屬菌株因此為不殺死投與其之動物的菌株，或為僅當所投與細菌之數目極大地大於殺死同一動物所需的野生型非減毒細菌之數目時殺死動物的菌株。減毒細菌亦應理解為意謂在通用環境中不能複製之細菌，因為該環境中不存在其生長所需的營養。因此，細菌限於在提供所需營養之受控環境中複製。因此本發明之減毒菌株為環境安全的，因為其不能在無控制下複製。

在一個具體例中，如本文所述，本文所揭示之李斯特菌屬表現異源多肽，在另一具體例中，如本文所述，如本文所揭示之李斯特菌屬分泌異源多肽，且在另一具體例中，如本文所述，如本文所揭示之李斯特菌屬表現並分泌異源多肽。在另一具體例中，如本文所揭示之李斯特菌屬包含異源多肽，且在另一具體例中包含編碼異源多肽之核酸。

在一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株可用於製備本文所述之疫苗或免疫療法。在一個具體例中，如本文所揭示之李斯特菌屬菌株可用於製備肽疫苗。用於製備肽疫苗之方法為此項技術中所熟知，且描述於例如EP1408048、美國專利申請案第20070154953號及OGASAWARA等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA第89卷，第8995-8999頁，1992年10月)中。在一個具體例中，肽演化技術用以產生具有較高免疫原性之抗原。用於肽演化之技術為此項技術中所熟知，且描述於例如美國專利6773900中。

在一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物的疫苗可單獨或與醫藥學上可接受之載劑組合向宿主脊椎動物、較佳哺乳動物且更佳人類投與。在另一具體例中，疫苗以有效誘導針對李斯特菌屬菌株自身或李斯特菌屬已經修飾以表現之異源抗原之免疫反應的量投與。在另一具體例中，待投與之疫苗的量可由熟習此項技術者在擁有本發明時常規地確定。在另一具體例中，醫藥學上可接受之載劑可包括(但不限於)無菌蒸餾水、鹽水、磷酸鹽緩衝溶液或碳酸氫鹽緩衝溶液。在另一具體例中，所選擇的醫藥學上可接受之載劑及待使用之載劑的量將視數種因素而定，包括投與模式、李斯特菌屬之菌株及接種疫苗者之年齡及疾病病況。在另一具體例中，疫苗之投與可藉由經口途徑，或其可為非經腸、鼻內、肌內、血管內、直腸內、腹膜內或多種熟知投與途徑中之任一者。在另一具體例中，投與途徑可根據待治療之感染物或腫瘤的類型來選擇。

在一個具體例中，本發明提供一種重組李斯特菌屬菌株，其包含編碼異源抗原性多肽或其片段之核酸分子，其中該核酸分子可操作地整合至具有內源性含PEST基因之開讀框中的李斯特菌屬基因組中。

如本文所用之術語「約」，就定量術語而言，意謂加或減5%，或在另一具體例中，加或減10%，或在另一具體例中，加或減15%，或在另一具體例中，加或減20%。

在一個具體例中，術語「個體」係指需要關於病況或其後遺症之療法或易患病況或其後遺症的哺乳動物(包括人類)。個體可包括狗、貓、豬、母牛、綿羊、山羊、馬、大鼠及小鼠及人類。在一個具體例中，術語「個體」不排除在全部方面均健康且不具有或展示疾病或病症之跡象的個體。

在一個具體例中，本文揭示套組，其包含包括本文所揭示之重組李斯特菌屬的醫藥組成物或調配物。

序列之簡要說明

隨附序列表中列出之核苷酸及胺基酸序列係使用核苷酸鹼基之標準字母縮寫及胺基酸之三字碼展示。核苷酸序列遵循在序列之5'端開始且正向行進(亦即，在各線中自左至右)至3'端之標準公約。僅展示各核苷酸序列之一條股，但互補股理解為藉由對所呈現股之任何參考而包括在內。胺基酸序列遵循在序列之胺基端開始且正向行進(亦即，在各線中自左至右)至羧基端之標準公約。

具體例之清單

本文揭示之標的物包括(但不限於)以下具體例：

1.一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR)抗原或其免疫原性片段及hepsin抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。

2.如具體例1之重組李斯特菌屬菌株，其中該PSGR抗原或其免疫原性片段為PSGRΔ跨膜結構域(ΔTM)抗原，且該hepsin抗原或其免疫原性片段為hepsinΔTM抗原。

3.如具體例2之重組李斯特菌屬菌株，其中該PSA抗原或其免疫原性片段、該存活素抗原或其免疫原性片段、該PSGRΔTM抗原或其免疫原性片段及該hepsinΔTM抗原或其免疫原性片段自N端至C端呈以下次序：PSA-存活素-PSGRΔTM--hepsinΔTM。

4.如具體例3之重組李斯特菌屬菌株，其中該截短LLO(tLLO)、該截短ActA或該PEST胺基酸序列與該PSA抗原或其免疫原性片段融合。

5.如具體例4之重組李斯特菌屬菌株，其中該融合多肽自N端至C端包含：tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTM--hepsinΔTM。

6.如具體例3至5中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該PSA或其免疫原性片段藉由第一連接子連接至該存活素或其免疫原性片段，該存活素或其免疫原性片段經由第二連接子連接至該PSGRΔTM或其免疫原性片段，且該PSGRΔTM或其免疫原性片段經由第三連接子連接至該hepsinΔTM或其免疫原性片段。

7.如具體例1至6中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該PSA或其免疫原性片段包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：108具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

8.如具體例1至7中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該存活素抗原或其免疫原性片段包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：109具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

9.如具體例1至8中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該PSGR抗原或其免疫原性片段包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：162具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

10.如具體例1至9中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該hepsin抗原或其免疫原性片段包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：164具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

11.如具體例1至10中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該融合多肽包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：175之殘基1-973或SEQ ID NO：183之殘基1-1414具有至少85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

12.如具體例1至11中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中。

13.如具體例1至11中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸分子在質體中。

14.如具體例13之重組李斯特菌屬菌株，其中在缺乏抗生素選擇下該質體穩定維持於該重組李斯特菌屬菌株中。

15.如具體例13或14之重組李斯特菌屬菌株，其中該質體不賦予該重組李斯特菌屬菌株以抗生素抗性。

16.如具體例1至15中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株經減毒。

17.如具體例16之重組李斯特菌屬菌株，其中該減毒之李斯特菌屬菌株包含一或多種內源性基因中之突變。

18.如具體例17之重組李斯特菌屬菌株，其中該一或多種內源性基因包含actA致病性基因。

19.如具體例17之重組李斯特菌屬菌株，其中該一或多種內源性基因包含內源性prfA基因。

20.如具體例17或18之重組李斯特菌屬菌株，其中該一或多種內源性基因包含D-丙胺酸消旋酶(Dal)及D-胺基酸轉移酶(Dat)基因。

21.如具體例17至20中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該突變包含該一或多種內源性基因之失活、截短、缺失、置換或破壞。

22.如具體例1至21中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸分子包含第二開讀框。

23.如具體例22之重組李斯特菌屬菌株，其中該第二開讀框編碼代謝酶。

24.如具體例23之重組李斯特菌屬菌株，其中該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。

25.如具體例1至24中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該融合多肽自hly啟動子、prfA啟動子、actA啟動子或p60啟動子、較佳hly啟動子表現，或其中該核酸分子與SEQ ID NO：202中闡述之序列至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致。

26.如具體例1至25中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。

27.如具體例1至26中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。

28.如具體例1至27中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株為營養缺陷型李斯特菌屬菌株。

29.如具體例1至28中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株能夠逃脫吞噬溶菌體。

30.一種免疫原性組成物，其包含如具體例1至29中任一項之重組李斯特菌屬菌株。

31.如具體例30之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含佐劑。

32.如具體例31之免疫原性組成物，其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。

33.一種在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向該個體投與如具體例1至29中任一者之重組李斯特菌屬菌株或如具體例30至32中任一者之免疫原性組成物。

34.一種預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法，其包含向該個體投與如具體例1至29中任一者之重組李斯特菌屬菌株或如具體例30至32中任一者之免疫原性組成物。

35.如具體例33或34之方法，其中該腫瘤或癌症為PSA表現腫瘤或癌症、存活素表現腫瘤或癌症、 PSGR表現腫瘤或癌症或hepsin表現腫瘤或癌症。

36.如具體例35之方法，其中該腫瘤或癌症為PSA表現腫瘤或癌症、存活素表現腫瘤或癌症、PSGR表現腫瘤或癌症及hepsin表現腫瘤或癌症。

37.如具體例33至36中任一者之方法，其中該腫瘤或癌症為前列腺腫瘤或癌症。

38.一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段及存活素抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。

39.如具體例38之重組李斯特菌屬菌株，其中該PSA或其免疫原性片段包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：108具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

40.如具體例38或39之重組李斯特菌屬菌株，其中該存活素抗原或其免疫原性片段包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：109具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、 99.8%、99.9%或100%序列一致性。

41.如具體例38至40中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該融合多肽包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：115之殘基1-382或SEQ ID NO：117之殘基1-825具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

42.一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段及前列腺特異性膜抗原(PSMA)抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。

43.如具體例42之重組李斯特菌屬菌株，其中該PSA或其免疫原性片段包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：108具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

44.如具體例42或43之重組李斯特菌屬菌株，其中該PSMA或其免疫原性片段包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：111具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

45.如具體例42至44中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該融合多肽包含一胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO：116之殘基1-967或SEQ ID NO：119之殘基1-1410具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性。

46.如具體例38至45中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中。

47.如具體例38至45中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸分子在質體中。

48.如具體例47之重組李斯特菌屬菌株，其中在缺乏抗生素選擇下該質體穩定維持於該重組李斯特菌屬菌株中。

49.如具體例47或48之重組李斯特菌屬菌株，其中該質體不賦予該重組李斯特菌屬菌株以抗生素抗性。

50.如具體例38至49中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株經減毒。

51.如具體例50之重組李斯特菌屬菌株，其中該減毒之李斯特菌屬菌株包含一或多種內源性基因中之突變。

52.如具體例51之重組李斯特菌屬菌株，其中該一或多種內源性基因包含actA致病性基因。

53.如具體例51之重組李斯特菌屬菌株，其中該一或多種內源性基因包含內源性prfA基因。

54.如具體例51或52之重組李斯特菌屬菌株，其中該一或多種內源性基因包含D-丙胺酸消旋酶(Dal)及D-胺基酸轉移酶(Dat)基因。

55.如具體例51至54中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該突變包含該一或多種內源性基因之失活、截短、缺失、置換或破壞。

56.如具體例38至55中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸分子包含第二開讀框。

57.如具體例56之重組李斯特菌屬菌株，其中該第二開讀框編碼代謝酶。

58.如具體例57之重組李斯特菌屬菌株，其中該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。

59.如具體例38至58中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該融合多肽自hly啟動子、prfA啟動子、actA啟動子或p60啟動子表現。

60.如具體例38至59中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。

61.如具體例38至60中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。

62.如具體例38至61中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株為營養缺陷型李斯特菌屬菌株。

63.如具體例38至62中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株能夠逃脫吞噬溶菌體。

64.一種免疫原性組成物，其包含如具體例38至63中任一項之重組李斯特菌屬菌株。

65.如具體例64之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含佐劑。

66.如具體例65之免疫原性組成物，其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。

67.一種在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向該個體投與如具體例38至63中任一者之重組李斯特菌屬菌株或如具體例64至66中任一者之免疫原性組成物。

68.一種預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法，其包含向該個體投與如具體例38至63中任一者之重組李斯特菌屬菌株或如具體例64至66中任一者之免疫原性組成物。

69.如具體例67或68之方法，其中該腫瘤或癌症為PSA表現腫瘤或癌症、存活素表現腫瘤或癌症、PSGR表現腫瘤或癌症或hepsin表現腫瘤或癌症。

70.如具體例69之方法，其中該腫瘤或癌症為PSA表現腫瘤或癌症、存活素表現腫瘤或癌症、PSGR表現腫瘤或癌症及hepsin表現腫瘤或癌症。

71.如具體例67至70中任一者之方法，其中該腫瘤或癌症為前列腺腫瘤或癌症。

72.一種在個體中引發抗腫瘤或抗癌免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量之包含包括重組核酸分子之重組李斯特菌屬菌株的免疫原性組成物，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，其中該融合多肽包含與第一異源抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，且其中該重組李斯特菌屬菌株表現該融合多肽，因此在該個體中引發抗腫瘤或抗癌免疫反應。

73.如具體例72之方法，其中該重組李斯特菌屬菌株中之該重組核酸分子包含第二開讀框。

74.如具體例73之方法，其中該第二開讀框編碼第二融合多肽，該融合多肽包含與第二異源抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，且其中該李斯特菌屬表現該第二融合多肽。

75.如具體例72至74中任一項之方法，其中該第一異源抗原或該第二異源抗原係選自前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性抗原(PSA；KLK3)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PAP、Nkx3.1、Ssx2、激酶錨定蛋白4(AKAP4)、HPV E7、Hepsin(HPN/TMPRSS1)、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR/OR51E2)、T細胞受體γ-鏈交替閱讀框蛋白(TARP)、存活素(Birc5)、哺乳動物允用同源物(ENAH；hMENA)、POTE旁系同源物、O-GlcNAc轉移酶(OGT)、KLK7、分離蛋白-1(SCRN1)、纖維母細胞活化蛋白(FAP)、基質金屬肽酶7(MMP7)、乳脂球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、威爾姆斯腫瘤1(WT1)、干擾素刺激基因15泛素樣修飾因子(ISG15；G1P2)、頂體酶結合蛋白(ACRBP；OY-TES-1)及血管舒緩素相關肽酶4(KLK4/前列腺酶)。

76.如具體例75之方法，其中該HPV E7包含SEQ ID NO：67、基本上由SEQ ID NO：67組成或由SEQ ID NO：67組成。

77.如具體例72至76中任一者之方法，其中該重組核酸分子在該重組李斯特菌屬菌株中之質體中。

78.如具體例77之方法，其中該質體為整合質體。

79.如具體例77之方法，其中該質體為附加型質體。

80.如具體例79之方法，其中在缺乏抗生素選擇下該質體穩定維持於該重組李斯特菌屬菌株中。

81.如具體例77至80中任一者之方法，其中該質體不賦予該重組李斯特菌屬菌株以抗生素抗性。

82.如具體例72至81中任一者之方法，其中該重組李斯特菌屬菌株經減毒。

83.如具體例82之方法，其中該減毒之重組李斯特菌屬菌株包含一或多種內源性基因中之突變。

84.如具體例83之方法，其中該一或多種內源性基因包含actA致病性基因。

85.如具體例83之方法，其中該一或多種內源性基因包含內源性prfA基因。

86.如具體例83或84之方法，其中該一或多種內源性基因包含D-丙胺酸消旋酶(Dal)及D-胺基酸轉移酶(Dat)基因。

87.如具體例83至86中任一項之方法，其中該突變包含該一或多種內源性基因之失活、截短、缺失、置換或破壞。

88.如具體例73及77至87中任一項之方法，其中該第二開讀框編碼代謝酶。

89.如具體例88之方法，其中由該第二開讀框編碼之該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。

90.如具體例72至87中任一項之方法，其中該重組核酸分子進一步包含第三開讀框。

91.如具體例90之方法，其中該第三開讀框編碼代謝酶。

92.如具體例91之方法，其中由該第三開讀框編碼之該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。

93.如具體例72至92中任一者之方法，其中該第一融合多肽自hly啟動子、prfA啟動子、actA啟動子或p60啟動子表現。

94.如具體例72至93中任一者之方法，其中該重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。

95.如具體例72至94中任一者之方法，其中該重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。

96.如具體例72至95中任一者之方法，其中該投與誘導抗原決定基擴散至額外腫瘤相關抗原。

97.如具體例72至96中任一者之方法，其中該腫瘤或該癌症包含乳房腫瘤或癌症、胃腫瘤或癌症、卵巢腫瘤或癌症、腦腫瘤或癌症、子宮頸腫瘤或癌症、子宮內膜腫瘤或癌症、神經膠母細胞瘤、肺癌、膀胱腫瘤或癌症、胰臟腫瘤或癌症、黑色素瘤、結腸直腸腫瘤或癌症或其任何組合。

98.如具體例72至97中任一者之方法，其中該腫瘤或該癌症為轉移。

99.如具體例72至98中任一者之方法，其中該方法允許預防該個體中之腫瘤或癌症之復發，或抑制該個體中之腫瘤或癌症之轉移，或其任何組合。

100.如具體例72至99中任一項之方法，其中該方法允許治療患有腫瘤或罹患癌症之個體。

101.如具體例72至100中任一者之方法，其中該免疫原性組成物進一步包含佐劑。

102.如具體例101之方法，其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。

103.如具體例100至102中任一者之方法，其中該治療減少或中斷該腫瘤或該癌症之生長。

104.如具體例100至102中任一者之方法，其中該治療減少或中斷該腫瘤或該癌症之轉移。

105.如具體例100至102中任一者之方法，其中該治療在該個體中引發且維持抗腫瘤或抗癌免疫反應。

106.如具體例100至102中任一者之方法，其中該治療延長該個體之存活時間。

107.一種免疫原性組成物，其包含包括重組核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼第一融合多肽之第一開讀框，其中該第一融合多肽包含與內皮因子序列或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素 O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該李斯特菌屬菌株包含內源性D-丙胺酸消旋酶(dal)、D-胺基酸轉移酶(dat)及ActA(actA)基因中之突變。

108.如具體例107之免疫原性組成物，其中該李斯特菌屬中之該重組核酸分子包含第二開讀框。

109.如具體例108之免疫原性組成物，其中該第二開讀框編碼第二融合多肽，其中該第二融合多肽包含與異源抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，且其中該重組李斯特菌屬菌株表現該第二融合多肽。

110.如具體例109之免疫原性組成物，其中該異源抗原係選自前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性抗原(PSA；KLK3)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PAP、Nkx3.1、Ssx2、激酶錨定蛋白4(AKAP4)、HPV E7、Hepsin(HPN/TMPRSS1)、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR/OR51E2)、T細胞受體γ-鏈交替閱讀框蛋白(TARP)、存活素(Birc5)、哺乳動物允用同源物(ENAH；hMENA)、POTE旁系同源物、O-GlcNAc轉移酶(OGT)、KLK7、分離蛋白-1(SCRN1)、纖維母細胞活化蛋白(FAP)、基質金屬肽酶7(MMP7)、乳脂球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、威爾姆斯腫瘤1(WT1)、干擾素刺激基因15泛素樣修飾因子(ISG15；G1P2)、頂體酶結合蛋白(ACRBP；OY-TES-1)及血管舒緩素相關肽酶4(KLK4/前列腺酶)。

111.如具體例110之免疫原性組成物，其中該HPV E7包含SEQ ID NO：67、基本上由SEQ ID NO：67組成或由SEQ ID NO：67組成。

112.如具體例107至111中任一者之免疫原性組成物，其中該重組核酸分子在該重組李斯特菌屬菌株中之質體中。

113.如具體例112之免疫原性組成物，其中該質體為整合質體。

114.如具體例113之免疫原性組成物，其中該質體為附加型質體。

115.如具體例112至114中任一者之免疫原性組成物，其中在缺乏抗生素選擇下該質體穩定維持於該重組李斯特菌屬菌株中。

116.如具體例112至115中任一者之免疫原性組成物，其中該質體不賦予該重組李斯特菌屬菌株以抗生素抗性。

117.如具體例107至116中任一者之免疫原性組成物，其中該重組李斯特菌屬菌株經減毒。

118.如具體例117之免疫原性組成物，其中該減毒之李斯特菌屬菌株包含一或多種內源性基因中之突變。

119.如具體例118之免疫原性組成物，其中該一或多種內源性基因包含actA致病性基因。

120.如具體例118之免疫原性組成物，其中該一或多種內源性基因包含內源性prfA基因。

121.如具體例118或119之免疫原性組成物，其中該一或多種內源性基因包含D-丙胺酸消旋酶(Dal)及D-胺基酸轉移酶(Dat)基因。

122.如具體例118至121中任一者之免疫原性組成物，其中該突變包含該一或多種內源性基因之失活、截短、缺失、置換或破壞。

123.如具體例108及112至121中任一者之免疫原性組成物，其中該第二開讀框編碼代謝酶。

124.如具體例123之免疫原性組成物，其中該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。

125.如具體例107至122中任一者之免疫原性組成物，其中該重組核酸分子進一步包含第三開讀框。

126.如具體例125之免疫原性組成物，其中該第三開讀框編碼代謝酶。

127.如具體例126之免疫原性組成物，其中該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。

128.如具體例107至127中任一者之免疫原性組成物，其中該第一融合多肽自hly啟動子、prfA啟動子、actA啟動子或p60啟動子表現。

129.如具體例107至128中任一者之免疫原性組成物，其中該重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。

130.如具體例107至129中任一者之免疫原性組成物，其中該重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。

131.如具體例107至130中任一者之免疫原性組成物，其中該組成物進一步包含佐劑。

132.如具體例131之免疫原性組成物，其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。

133.一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼第一融合多肽之第一開讀框，該第一融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其免疫原性片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼第二融合多肽之第二開讀框，該第二融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之存活素抗原或其免疫原性片段。

134.一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼第一融合多肽之第一開讀框，該第一融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其免疫原性片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼第二融合多肽之第二開讀框，該第二融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性膜抗原(PSMA)或其免疫原性片段。

135.如具體例133或134之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中。

136.如具體例133或134之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸分子在質體中。

137.如具體例136之重組李斯特菌屬菌株，其中在缺乏抗生素選擇下該質體穩定維持於該重組李斯特菌屬菌株中。

138.如具體例136或137之重組李斯特菌屬菌株，其中該質體不賦予該重組李斯特菌屬以抗生素抗性。

139.如具體例133至138中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株經減毒。

140.如具體例139之重組李斯特菌屬菌株，其中該減毒之李斯特菌屬菌株包含一或多種內源性基因中之突變。

141.如具體例140之重組李斯特菌屬菌株，其中該一或多種內源性基因包含actA致病性基因。

142.如具體例140之重組李斯特菌屬菌株，其中該一或多種內源性基因包含內源性prfA基因。

143.如具體例140或141之重組李斯特菌屬菌株，其中該一或多種內源性基因包含D-丙胺酸消旋酶(Dal)及D-胺基酸轉移酶(Dat)基因。

144.如具體例140至143中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該突變包含該一或多種內源性基因之失活、截短、缺失、置換或破壞。

145.如具體例133至144中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸進一步包含第三開讀框。

146.如具體例145之重組李斯特菌屬菌株，其中該第三開讀框編碼代謝酶。

147.如具體例146之重組李斯特菌屬菌株，其中該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。

148.如具體例133至147中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該第一融合多肽及/或該第二融合多肽自hly啟動子、prfA啟動子、actA啟動子或p60啟動子表現。

149.如具體例133至148中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。

150.如具體例133至149中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。

151.如具體例133至150中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株為營養缺陷型李斯特菌屬菌株。

152.如具體例133至151中任一者之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株能夠逃脫吞噬溶菌體。

153.一種免疫原性組成物，其包含如具體例133至152中任一者之重組李斯特菌屬菌株。

154.如具體例153之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含佐劑。

155.如具體例154之免疫原性組成物，其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。

156.一種在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與如具體例133至152中任一者之重組李斯特菌屬菌株或如具體例153至155中任一項之免疫原性組成物。

157.如具體例156之方法，其中該腫瘤或癌症為PSA表現及/或存活素表現腫瘤或癌症。

158.如具體例156之方法，其中該腫瘤或癌症PSA表現及/或PSMA表現腫瘤或癌症。

159.一種預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法，該方法包含向該個體投與如具體例133至152中任一者之重組李斯特菌屬菌株或如具體例153至155中任一者之免疫原性組成物的步驟。

上文或下文引用之所有專利申請、網站、其他公開案、寄存編號及其類似物以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的，其引用程度如同各個別物件特別且個別地指示為以引用的方式併入一般。若在不同時間序列之不同版本與寄存編號相關，則意謂在本申請案之有效申請日時與寄存編號相關之版本。有效申請日意指若適用，早於提及寄存編號之優先權申請案之實際申請日或申請日。同樣，若在不同時間公開公開案、網站或其類似物之不同版本，則除非另外指明，否則意謂在本申請案之有效申請日時最近公開之版本。除非另外特別指示，否則本發明之任何特徵、步驟、元件、具體例或態樣可與任何其他組合使用。儘管出於清楚及理解之目的已藉助於說明及實施例相當詳細地描述本發明，但顯而易見可在所附申請專利範圍之範疇內實踐某些變化及修改。

為了更全面說明本發明之較佳具體例，呈現以下實施例。然而，其絕不應詮釋為限制本發明之廣義範圍。

實施例

開發分泌與tLLO融合之PSA的重組Lm(Lm-LLO-PSA)。此菌株引起與前列腺癌小鼠模型中腫瘤消退有關之強效PSA特異性免疫反應，其中tLLO-PSA之表現源自基於pGG55之質體(表1)，其賦予載體以抗生素抗性。吾人最近基於pADV142質體研發出PSA疫苗之新菌株，其不具有抗生素抗性標記且稱為LmddA-142(表1)。此新菌株比Lm-LLO-PSA減毒10倍。另外，LmddA-142比Lm-LLO-PSA略微更具免疫原性且顯著更有效消退PSA表現腫瘤。

質體pAdv142之序列(6523bp)為SEQ ID NO：72中闡述之序列。此質體在2-20-08時在Genewiz facility自大腸桿菌菌株定序。

實施例1：構築減毒之李斯特菌屬菌株-LmddΔΔactA及將人類klk3基因同框插入Lmdd及Lmdda菌株中之hly基因

菌株Lm dal dat(Lmdd)藉由毒性因子ActA之不可逆缺失而減毒。構築Lmdaldat(Lmdd)背景中同框缺失actA以避免對下游基因表現的任何極性作用。Lmdal datΔΔactA在N端含有前19個胺基酸且在C端含有28個胺基酸殘基，缺失ActA之591個胺基酸。

藉由擴增對應於actA之上游(657bp-寡之Adv 271/272)及下游(625bp-寡之Adv 273/274)部分的染色體區且藉由PCR接合產生actA缺失突變體。用於此擴增之引子序列在表2中給出。actA之上游及下游DNA區在EcoRI/PstI限制位點選殖至pNEB193中且自此質體，EcoRI/PstI進一步選殖至溫度敏感性質體pKSV7中，產生ΔΔactA/pKSV7(pAdv120)。

使用外部結合於actA缺失區之引子，檢驗基因自其染色體位置之缺失，該等引子在圖1中展示為引子3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc，SEQ ID NO：77)及引子4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg；SEQ ID NO：78)。對自 Lmdd及LmddΔΔactA分離之染色體DNA進行PCR分析。Lmdd染色體DNA中用兩組不同引子對1/2及3/4擴增後的DNA片段之尺寸預期為3.0Kb及3.4Kb。另一方面，使用引子對1/2及3/4用於LmddΔactA之PCR的預期尺寸為1.2Kb及1.6Kb。因此，圖1中之PCR分析證實，Lmdd actA菌株中缺失ΔactA之1.8kb區。亦對PCR產物進行DNA定序以證實菌株LmddΔΔactA中含有actA之區的缺失。

實施例2：構築用於Lm載體之抗原遞送的抗生素非依賴性附加型表現系統

用於Lm載體之抗原遞送的抗生素非依賴性附加型表現系統(pAdv142)為無抗生素之質體pTV3的下一代(Verch等人，Infect Immun,2004.72(11)：6418-25，以引用的方式併入本文中)。用於致病性基因轉錄活化因子之基因prfA自pTV3缺失，因為李斯特菌屬菌株Lmdd在染色體中含有prfA基因之複本。另外，NheI/PacI限制位點之p60-李斯特菌屬dal之卡匣置換為p60-枯草桿菌(Bacillus subtilis)dal，產生質體pAdv134(圖2A)。李斯特菌屬與芽孢桿菌dal基因之相似性為約30%，實際上消除質體與Lmdd染色體中之dal基因的剩餘片段之間重組的機會。質體pAdv134含有抗原表現卡匣tLLO-E7。LmddA菌株用pADV134質體轉型且藉由西方墨點法證實LLO-E7蛋白自所選殖株之表現(圖2B)。源自10403S野生型菌株之 Lmdd系統缺乏抗生素抗性標記物，但具有Lmdd鏈黴素抗性。

另外，pAdv134用XhoI/XmaI限制以選殖人類PSA，klk3，產生質體pAdv142。新質體pAdv142(圖2C，表1)含有在李斯特菌屬p60啟動子控制下的芽孢桿菌dal(B-Dal)。穿梭質體pAdv142在無外源性D-丙胺酸存在下補充大腸桿菌ala drx MB2159以及單核球增多性李斯特菌菌株Lmdd的生長。質體pAdv142中之抗原表現卡匣由hly啟動子及LLO-PSA融合蛋白組成(圖2C)。

質體pAdv142轉型至李斯特菌屬背景菌株LmddactA菌株，產生Lm-ddA-LLO-PSA。LLO-PSA融合蛋白藉由菌株Lm-ddA-LLO-PSA之表現及分泌藉由西方墨點法使用抗-LLO及抗-PSA抗體證實(圖2D)。兩次活體內繼代後，菌株Lm-ddA-LLO-PSA穩定表現及分泌LLO-PSA融合蛋白。

實施例3：菌株LmddA-LLO-PSA之活體外及活體內穩定性

藉由在選擇性壓力存在或不存在下培養LmddA-LLO-PSA李斯特菌屬菌株八天檢驗質體之活體外穩定性。菌株LmddA-LLO-PSA之選擇性壓力為D-丙胺酸。因此，菌株LmddA-LLO-PSA在腦心輸注液(BHI)及BHI+100μmg/ml D-丙胺酸中繼代。在塗佈於選擇性(BHI)及非選擇性(BHI+D-丙胺酸)培養基上之後測定每天之 CFU。預期質體損失將導致塗佈於非選擇性培養基(BHI+D-丙胺酸)上之後CFU較高。如圖4A中所描繪，選擇性及非選擇性培養基中的CFU數目之間無差異。此表明當實驗終止時，質體pAdv142穩定至少50代。

藉由在C57BL/6小鼠中靜脈內注射5×10⁷ CFU LmddA-LLO-PSA測定質體活體內維持。在24小時及48小時自在PBS中均質化之脾臟分離有活力之細菌。在BHI培養盤及BHI+100μmg/ml D-丙胺酸上測定各時間點的各樣品之CFU。將脾細胞塗佈於選擇性及非選擇性培養基之後，在24小時後回收群落。因為此菌株高度減毒，所以24小時內活體內清除細菌負荷。選擇性及非選擇性培養盤上未偵測到顯著CFU差異，指示全部經分離細菌中重組質體穩定存在(圖4B)。

實施例4：菌株LmddA-142(LmddA--PSA)之活體內繼代、致病性及清除率

LmddA-142為分泌附加型表現之tLLO-PSA融合蛋白的重組李斯特菌屬菌株。為確定安全劑量，小鼠用多種劑量之LmddA-LLO-PSA免疫接種且測定毒性作用。LmddA-LLO-PSA引起最小毒性作用(資料未圖示)。結果表明小鼠良好耐受LmddA-LLO-PSA之10⁸ CFU之劑量。致病性研究指示菌株LmddA-LLO-PSA高度減毒。

測定在C57BL/6小鼠中腹膜內投與安全劑量10⁸ CFU後LmddA-LLO-PSA的活體內清除率。第2天後，經LmddA-LLO-PSA免疫接種之小鼠的肝臟及脾臟中不存在可偵測之群落。因為此菌株高度減毒，所以其在48小時內完全活體內清除(圖5A)。

為測定LmddA-LLO-PSA之減毒是否會減弱菌株LmddA-LLO-PSA感染巨噬細胞及胞內生長之能力，吾人進行細胞感染分析法。諸如J774A.1之小鼠巨噬細胞樣細胞株用李斯特菌屬構築體活體外感染且定量胞內生長。陽性對照菌株野生型李斯特菌屬菌株10403S胞內生長，且prfA突變體陰性對照XFL7無法逃脫吞噬溶菌體且因此在J774細胞中不生長。LmddA-LLO-PSA之胞質內生長比10403S緩慢，因為此菌株失去自細胞擴散至細胞的能力(圖5B)。結果表明LmddA-LLO-PSA能夠感染巨噬細胞及在細胞質內生長。

實施例5：菌株-LmddA-LLO-PSA於C57BL/6小鼠中之免疫原性

使用PSA四聚體染色測定C57BL/6小鼠中由構築體LmddA-LLO-PSA引起之PSA特異性免疫反應。小鼠以一週時間間隔用LmddA-LLO-PSA免疫接種兩次且在追加後第6天脾細胞針對PSA四聚體染色。用PSA特異性四聚體染色脾細胞顯示LmddA-LLO-PSA引起23% PSA四聚體⁺ CD8⁺ CD62L^低細胞(圖6A)。

使用胞內細胞激素染色檢驗PSA特異性T細胞在用PSA肽刺激5小時後分泌IFN-γ之功能性能力。 LmddA-LLO-PSA組相較於未處理之小鼠，用PSA肽刺激之CD8⁺ CD62L^低IFN-γ分泌細胞之百分比提高200倍(圖6B)，表明LmddA-LLO-PSA菌株極具免疫原性且在脾臟中對PSA引起高水準之功能活性PSA CD8+ T細胞反應。

為測定用LmddA-LLO-PSA免疫接種小鼠後針對PSA產生的細胞毒性T細胞之功能活性，吾人在活體外分析法中測試PSA特異性CTL溶解用H-2D^b肽脈衝之細胞EL4細胞的能力。使用基於FACS之卡斯蛋白酶分析法(圖6C)及銪釋放(圖6D)量測細胞溶解。用LmddA-LLO-PSA免疫接種之小鼠的脾細胞含有對呈現PSA肽作為標靶抗原之細胞具有高細胞溶解活性的CTL。

進行Elispot來測定效應T細胞在用抗原刺激24小時後分泌IFN-γ之能力。使用ELISpot，吾人觀測到來自用特異性肽刺激之LmddA-LLO-PSA免疫接種之小鼠的脾細胞中之IFN-γ斑點數相較於未處理之小鼠的脾細胞提高20倍(圖6E)。

實施例6：用LmddA-142菌株免疫接種誘導表現PSA之腫瘤消退及腫瘤由PSA特異性CTL浸潤

使用經工程改造以表現PSA之前列腺腺癌細胞株測定構築體LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)之治療功效(Tramp-C1-PSA(TPSA)；Shahabi等人，2008)。向小鼠皮下植入2×10⁶個TPSA細胞。當腫瘤在腫瘤接種後第6天達到4-6mm可觸尺寸時，小鼠以一週時間間隔用10⁸ CFU LmddA-142、10⁷ CFU Lm-LLO-PSA(陽性對照)免疫接種三次或未經處理。未處理之小鼠逐漸產生腫瘤(圖7A)。用LmddA-142免疫接種之小鼠直至第35天均無腫瘤且8隻小鼠中之3隻逐漸產生腫瘤，其相較於未處理之小鼠以緩慢得多之速率生長(圖7B)。八隻小鼠中之五隻至第70天保持無腫瘤。正如所料，Lm-LLO-PSA接種小鼠比未處理之對照腫瘤少且比對照中腫瘤出現得慢(圖7C)。因此，構築體LmddA-LLO-PSA可消退TPSA細胞株形成之60%腫瘤且減緩其他小鼠中之腫瘤生長。仍無腫瘤之治癒小鼠在第68天用TPSA腫瘤再攻擊。

相較於未處理之組中的無結果(圖7A)，用LmddA-142免疫接種小鼠可控制7天形成之經工程改造以在超過60%實驗動物中表現PSA之Tramp-C1腫瘤的生長且誘發其消退(圖7B)。LmddA-142使用高度減毒之載體(LmddA)及質體pADV142構築(表1)。

另外，研究LmddA-LLO-PSA構築體產生的PSA特異性CD8淋巴細胞浸潤腫瘤之能力。用腫瘤與基質膠之混合物皮下植入小鼠，隨後以七天時間間隔用未處理或對照(Lm-LLO-E7)李斯特菌屬或LmddA-LLO-PSA免疫接種兩次。在第21天切除腫瘤且分析腫瘤中浸潤之CD8⁺CD62L^低PSA^四聚體+及CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺調節性T細胞群體。

觀測到極低數目之CD8⁺CD62L^低PSA^四聚體+腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)對未處理及Lm-LLO-E7對照免疫接種小鼠中存在的PSA具有特異性。然而，用LmddA-LLO-PSA免疫接種之小鼠中PSA特異性CD8⁺CD62L^低PSA^四聚體+TIL百分比增加10-30倍(圖7A)。有趣地，脾臟中之CD8⁺CD62L^低PSA^四聚體+細胞群體比腫瘤中低7.5倍(圖8A)。

另外，測定未經處理之小鼠及李斯特菌屬免疫接種小鼠之腫瘤中CD4⁺/CD25⁺/Foxp3⁺T調節性細胞(reg)之存在。有趣地，用李斯特菌屬免疫接種導致腫瘤而非脾臟中之CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T-reg數目顯著降低(圖8B)。然而，構築體LmddA-LLO-PSA對降低腫瘤中之CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T-reg之頻率的影響比未處理及Lm-LLO-E7免疫接種組強(圖7B)。

因此，LmddA-142疫苗可誘發能夠浸潤腫瘤部位之PSA特異性CD8⁺T細胞(圖8A)。有趣地，用LmddA-142免疫接種與腫瘤中之調節性T細胞數目減少有關(圖7B)，可能形成對高效抗腫瘤CTL活性更有利的環境。

實施例7：儘管PSA融合，但Lmdd-143及LmddA-143分泌功能性LLO

Lmdd-143及LmddA-143含有全長人類klk3基因，其編碼PSA蛋白質，該蛋白質經同源重組下游物插入且與染色體中之hly基因同框。此等構築體使用pKSV7質體(Smith及Youngman,Biochimie.1992；74(7-8)第 705-711頁)藉由同源重組製得，所述質體具有溫度敏感複製子，攜帶hly-klk3-mpl重組卡匣。因為第二重組事件之後切除質體，所以失去用於整合選擇之抗生素抗性標記物。此外，LmddA-143菌株中之actA基因缺失(圖9A)。在兩個構築體中藉由PCR(圖9B)及定序(資料未展示)檢驗klk3與hly同框插入至染色體中。

此等染色體構築體之一個重要態樣為LLO-PSA之產生將不會完全消除LLO之功能，LLO之功能為李斯特菌屬自吞噬體逃脫、胞溶質侵犯及單核球增多性李斯特菌產生之高效免疫性所需。Lmdd-143及LmddA-143培養物上清液分泌之蛋白質的西方墨點分析揭露對應於LLO-PSA融合蛋白之約81kDa條帶及約60kDa條帶(此為LLO之預期尺寸)(圖10A)，表明LLO自LLO-PSA融合物裂解或仍作為單個蛋白質由單核球增多性李斯特菌產生，而不管染色體中之融合基因。Lmdd-143及LmddA-143分泌之LLO相較於野生型單核球增多性李斯特菌10403S保持50%溶血活性(圖10B)。與此等結果一致，Lmdd-143及LmddA-143均能夠在巨噬細胞樣J774細胞株中胞內複製(圖10C)。

實施例8：Lmdd-143及LmddA-143均引起針對PSA抗原的細胞介導之免疫反應

顯示Lmdd-143及LmddA-143皆能夠分泌與LLO融合的PSA之後，吾人研究此等菌株是否可活體內引起PSA特異性免疫反應。C57BL/6小鼠未經處理或用Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142免疫接種兩次。藉由用PSA_65-74肽刺激脾細胞及針對IFN-γ胞內染色來量測PSA特異性CD8⁺T細胞反應。如圖11中示出，染色體及基於質體之載體誘導的免疫反應類似。

實施例9：分泌LLO-HMW-MAA融合蛋白之重組Lm菌株產生廣泛抗腫瘤反應

設計三種基於先前映射且預測之HLA-A2抗原決定基之位置表現獨特HMW-MAA片段的基於Lm之疫苗(圖12A)。Lm-tLLO-HMW-MMA_2160-2258(亦稱為Lm-LLO-HMW-MAA-C)係基於無毒Lm XFL-7菌株及基於pGG55之質體。此菌株分泌對應於tLLO-HMW-MAA_2160-2258融合蛋白之約62kDa條帶(圖12B)。tLLO-HMW-MAA_2160-2258之分泌相對較弱，很可能歸因於此片段之高疏水性，其對應於HMW-MAA跨膜結構域。使用經全長HMW-MAA基因轉染之B16F10黑色素瘤細胞，吾人觀測到多達62.5%的經Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫接種之小鼠可妨礙確立的腫瘤之生長(圖12C)。此結果顯示，HMW-MAA可用作疫苗接種策略中之標靶抗原。有趣地，吾人亦觀測到，用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫接種小鼠顯著削弱衍生自獨特小鼠菌株的不經工程改造以表現HMW-MAA之腫瘤(諸如B16F10、RENCA及NT-2)之生長(圖12D)。在NT-2腫瘤模型(其為表現大鼠HER-2/neu蛋白之乳腺癌細胞株且衍生自FVB/N轉殖基因小鼠)中，在腫瘤接種之後7天用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫接種不僅削弱腫瘤生長而且在5隻小鼠中之1隻小鼠中誘導腫瘤消退(圖12D)。

實施例10：用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫接種小鼠誘導腫瘤基質由CD8⁺ T細胞之浸潤及腫瘤血管中外被細胞覆蓋率之顯著降低

儘管NT-2細胞不表現HMW-MAA同源物NG2，但用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫接種FVB/N小鼠顯著削弱NT-2腫瘤之生長且最終導致腫瘤消退(圖12D)。此腫瘤模型用以藉由免疫螢光法評估腫瘤部位中之CD8⁺ T細胞及外被細胞。針對CD8對NT-2腫瘤切片染色展示CD8⁺ T細胞浸潤至經Lm-LLO-HMW-MAA-C疫苗免疫接種之小鼠中的腫瘤及周圍血管中，但於經對照疫苗免疫接種之小鼠中不浸潤(圖13A)。亦藉由用αSMA及NG2(HMW-MAA之鼠類同源物)抗體雙重染色分析NT-2腫瘤中之外被細胞。來自三個獨立NT-2腫瘤之資料分析展示經Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫接種之小鼠中的外被細胞之數目與對照相比顯著減小(P0.05)(圖13B)。當分析限於針對不為疫苗靶向之αSMA染色的細胞時，獲得類似結果(資料未示出)。因此，Lm-LLO-HMW-MAA-C疫苗接種藉由靶向外被細胞影響腫瘤部位中之血管形成。

實施例11：藉由同時表現及分泌LLO-PSA及tLLO-HMW-MAA_2160-2258融合蛋白開發具有增加的抗腫瘤活性之重組單核球增多性李斯特菌載體，引發對兩種異源抗原之免疫反應材料及方法：

構築pADV168質體. 藉由用XhoI及XmaI限制性核酸內切酶雙重消化自pCR2.1-HMW-MAA_2160-2258質體切下HMW-MAA-C片段。將此片段選殖於已經XhoI及XmaI消化以切除E7基因之pADV134質體中。將pADV168質體(圖14B)電穿孔至電勝任細胞dal^(-)dat^(-)大腸桿菌菌株MB2159中，且針對RFLP及序列分析篩選陽性殖株。

構築Lmdd-143/168、LmddA-143/168及對照菌株LmddA-168、Lmdd-143/134及LmddA-143/134.Lmdd、Lmdd-143及LmddA-143經pADV168(圖14B)或pADV134質體轉型。將轉型體選擇至補充有鏈黴素(250μg/ml)及不具有D-丙胺酸(BHI培養基)之腦心輸注瓊脂培養盤上。藉由西方墨點法使用抗-LLO、抗-PSA或抗-E7抗體，針對細菌培養物上清液中之LLO-、tLLO-HMW-MAA_2160-2258及tLLO-E7分泌，篩選個別殖株。針對活體外及活體內毒性，評估自各菌株選擇之殖株。將各菌株活體內繼代兩次以選擇最穩定之重組殖株。簡言之，使自各構築體選擇之殖株生長，且以1×10⁸ CFU/小鼠腹膜內注射至一組4隻小鼠。在第1天及第3天收集脾臟，將其均質化且塗佈於BHI-瓊脂培養盤上。在第一次繼代之後，選擇來自各菌株之一個群落且第二次進行活體內繼代。為了防止載體進一步減毒至削弱其活力之水準，產生兩種具有獨特減毒水準的載體中之構築體(Lmdd-143/168、LmddA-143/168)。

構築經工程改造以表現並分泌兩種呈融合蛋白形式的抗原之李斯特菌屬菌株，LmddA244G。使抗原Her2嵌合體與基因組李斯特菌溶胞素O遺傳性融合(圖14A)，且使第二抗原HMW-MAA-C(HMC)與質體中之截短李斯特菌溶胞素O融合。藉由西方墨點法分別使用抗-LLO及抗-FLAG抗體偵測融合蛋白LLO-ChHer2及tLLO-HMC之分泌(參見圖14C)。

溶血性分析。為測定基因組LLO導致吞噬溶菌體逃脫之能力，使用對照野生型10403S之分泌上清液及LmddA244G-168及綿羊紅血球作為標靶細胞，進行溶血性分析。

J774細胞中之活體外胞內複製。使用鼠類巨噬細胞樣J774細胞株進行活體外胞內生長分析。簡言之，使J774細胞在不具有抗生素之培養基中用單疫苗(LmddA164及LmddA168--各自由用pADV164轉型個別李斯特菌屬菌株及用pADV168轉型另一李斯特菌屬菌株產生，以分別獲得LmddA164及LmddA168--參見圖14B)或二價免疫療法之一以1：1之MOI感染1小時。在感染後1小時，將細胞用10μg/ml建它黴素處理以殺死胞外細菌。以規則時間間隔收集樣品，且將細胞用水溶解以定量胞內CFU之數目。將溶解物之十倍連續稀釋液一式兩份塗佈於BHI培養盤上，且對各樣品中之群落形成單位(CFU)計數。

活體內毒性研究。向四隻C57BL/6小鼠之各組(7週大)腹膜內注射兩個不同劑量(1×10⁸及1×10⁹ CFU/劑量)之Lmdd-143/168、LmddA-143/168、LmddA-168、Lmdd-143/134或LmddA-143/134菌株。追蹤小鼠2週以進行存活及LD₅₀估算。基於關於其他基於Lm的疫苗之先前經驗，>1×10⁸之LD₅₀構成可接受值。

結果

在成功地構築pADV168質體後，針對正確HMW-MAA序列之存在，對其測序。此等新菌株中之此質體表現並分泌對各構築體具有特異性之LLO融合蛋白。此等菌株高度減毒，對於缺乏actA之(LmddA)菌株，LD50為至少1×10⁸ CFU且很可能高於1×10⁹ CFU，該等菌株缺乏actA基因及因此細胞至細胞擴散之能力。

產生重組Lm(LmddA-cHer2/HMC)。此Lm菌株表現並分泌嵌合Her2(cHer2)蛋白染色體地為與基因組李斯特菌溶胞素O(LLO)之融合物，及表現並分泌HMW-MAA_2160-2258之片段(又名HMW-MAAC或HMC)(使用質體)為與截短LLO(tLLO)之融合物，以靶向腫瘤細胞及腫瘤血管，同時稱為LmddA244G-168。藉由西方墨點法使用抗-FLAG及抗-LLO特異性抗體偵測兩種融合蛋白tLLO-HMC及LLO-cHer2自LmddA244G-168之表現及分泌(圖14B)。此外，使疫苗LmddA244G-168在小鼠中活體內繼代兩次，以穩定LmddA-244G之毒性及證實其保留重組融合蛋白之表現(圖14B)。疫苗LmddA244G-168保留其在兩次活體內小鼠繼代之後表現並分泌兩種融合蛋白tLLO-HMC及LLO-cHer2之能力。

菌株LmddA244G-168將染色體LLO表現為融合蛋白LLO-cHer2，其可影響LLO之功能性能力以導致吞噬溶菌體逃脫。為確定此，使用對照野生型10403S及LmddA244G-168之分泌上清液及綿羊紅血球作為標靶細胞進行溶血性分析。如圖15A中所指示，LmddA244G-168之溶血性能力當與野生型高度毒性Lm菌株10403S相比時降低1.5倍。

另外，為檢驗融合蛋白LLO-cHer2之表現是否不對LmddA-cHer2/HMC感染巨噬細胞及其胞內生長之能力造成任何不利影響，使用小鼠巨噬細胞樣細胞J774進行細胞感染分析。如圖15B中規定之結果顯示，表現單一或雙重抗原的不同基於李斯特菌屬之免疫療法之胞內生長特性類似，表明共同表現兩種抗原不造成LmddA244G-168呈現標靶胞內蛋白質用於免疫反應的能力之任何變化。

實施例12：偵測在用Lmdd-244G/168免疫接種後引發之免疫反應及抗腫瘤效應

使用標準方法在小鼠中研究在用Lmdd-244G-168菌株免疫接種後針對cHer2及HMW-MAA之免疫反應，諸如偵測對抗此等抗原之IFN-γ產生。在NT2乳房腫瘤模型中測試雙重表現載體之治療功效。

IFN-γ ELISpot. 吾人評估二價免疫療法在FvB小鼠中產生特異於兩種抗原Her2及HMW-MAA的免疫反應之能力。將小鼠(3隻/組)在第0天用不同免疫療法免疫接種且在第14天追加，該等免疫療法諸如LmddA134(Lm-對照)、LmddA164及LmddA244G/168。偵測在第21天收集之脾臟中的Her2/neu特異性免疫反應。根據套組說明書進行IFN-γ ELispot分析，且用對胞內區(RLLQETELV)(SEQ ID NO：79)具有特異性之肽抗原決定基刺激脾細胞。

IFN-γ ELISA. 藉由用HMA-MAA-C蛋白刺激細胞2天測定經免疫接種小鼠之脾細胞中HMW-MAA-C特異性免疫反應的產生。藉由ELISA偵測IFN-γ釋放，ELISA使用小鼠干擾素-γ ELISA套組進行。

抗腫瘤功效. 使用小鼠NT2乳房腫瘤模型檢驗抗腫瘤功效。在第0天向FvB小鼠植入1×10⁶個NT2細胞，且將右側腹上之確立的腫瘤在第6天開始用不同免疫療法以一週時間間隔處理進行三次免疫接種。一週兩次監測腫瘤直至研究結束。在腫瘤直徑大於1.5cm時處死小鼠。

結果

隨後，使用小鼠NT2乳房腫瘤模型檢驗LmddA244G之抗腫瘤治療功效。將在右側腹上攜有確立的NT2腫瘤之FvB小鼠用表現單抗原LmddA164(ChHer2)、LmddA168(HMC)之不同免疫療法或二價免疫療法LmddA244G-168以一週時間間隔處理進行三次免疫接種。如圖16A及16C中所指示，用單及二價免疫療法兩者處理均導致NT2腫瘤減小。然而，在用二價免疫療法處理後觀測到更強的對NT2腫瘤生長控制之影響。對各組中無腫瘤小鼠百分比之額外分析證實，當與單免疫療法(小於40%)處理組相比時，用二價免疫療法處理產生最大無腫瘤小鼠百分比(70%)。此等觀測結果支持，使用單核球增多性李斯特菌作為用於療法之載體同時靶向兩種抗原導致抗腫瘤功效增加。

評估二價免疫療法在FvB小鼠中產生特異於兩種抗原Her2及HMW-MAA的免疫反應之能力。將小鼠在第0天用不同免疫療法免疫接種且在第14天追加，該等免疫療法諸如LmddA134(無關對照)、LmddA164及LmddA244G/168。使用基於ELISpot之分析使用對胞內區具有特異性之肽抗原決定基偵測Her2/neu特異性免疫反應。表現Her2之單及二價免疫療法兩者均產生使用基於ELISpot之分析所偵測為相當的免疫反應水準(參見圖17)。

使用ELISA偵測經免疫接種小鼠之脾細胞中的HMW-MAA-C特異性免疫反應之產生。腫瘤抗原自Lm使用基於單一複本(單免疫療法)或多複本(二價免疫療法)之表現的表現產生相當水準的抗原特異性免疫反應(參見圖17)。

實施例13：用Lmdd-143/168或LmddA-143/168免疫接種導致外被細胞破壞、內皮細胞中之黏附分子上調及對PSA具有特異性之TIL的浸潤增加

表徵在用Lmdd-143/168或LmddA-143/168免疫接種後誘導之腫瘤浸潤性淋巴細胞及內皮細胞-黏附分子。藉由免疫螢光法分析經Lmdd-143/168或LmddA-143/168免疫接種之小鼠的腫瘤，以研究黏附分子由內皮細胞之表現、血管密度及腫瘤血管中之外被細胞覆蓋率以及腫瘤由免疫細胞(包括CD8及CD4 T細胞)之浸潤。藉由四聚體分析及功能測試表徵對PSA抗原具有特異性之TIL。

分析腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。將嵌入於基質膠中之TPSA23細胞s.c接種於小鼠(n=3隻/組)中，該等小鼠在第7天及第14天經Lmdd-143/168或LmddA-143/168免疫接種，視何種根據在抗腫瘤研究中獲得之結果更有效而定。為了比較，將小鼠用LmddA-142、LmddA-168、對照Lm疫苗免疫接種或保持未經處理。在第21天，將腫瘤以手術方式切下，在冰冷PBS中洗滌，且用刮刀絞碎。將腫瘤用分散酶處理以溶解基質膠及釋放單細胞用於分析。用PSA65-74 H-2Db四聚體-PE及抗-小鼠CD8-FITC、CD3-PerCP-Cy5.5及CD62L-APC抗體對PSA特異性CD8⁺ T細胞染色。為分析腫瘤中之調節性T細胞，用CD4-FITC、CD3-PerCP-Cy5.5及CD25-APC對TIL染色，且隨後滲透用於FoxP3染色(抗-FoxP3-PE，MiltenyBiotec)。藉由FACS Calibur細胞計數器及CellQuestPro軟體(BD Biosciences)分析細胞。

免疫螢光法。在腫瘤接種後21天，將嵌入於基質膠中之TPSA23腫瘤以手術方式切下，且將碎片立即冷凍保存於OCT冷凍培養基中。將腫瘤碎片冷凍切成8-10μ μm厚之切片。在免疫螢光法中，將樣品解凍且使用4%福爾馬林固定。在阻斷之後，將切片在潮濕腔室中在37℃下用抗體於阻斷溶液中染色1小時。根據製造商說明書進行DAPI(Invitrogen)染色。對於胞內染色(αSMA)，在PBS/0.1% Tween/1% BSA溶液中進行培育。將載片使用具有抗褪色劑之安裝液(Biomeda)蓋片，設定24小時且保持在4℃下直至使用Spot Image軟體(2006)及Olympus BX51系列螢光顯微鏡成像。藉由免疫螢光法評估CD8、CD4、FoxP3、αSMA、NG2、CD31、ICAM-1、VCAM-1及VAP-1。

統計學分析：應用非參數曼-惠特尼及克魯斯卡爾-沃利斯(Kruskal-Wallis)測試來比較不同處理組之中的腫瘤尺寸。在最後時間點將腫瘤尺寸與各組(8隻小鼠) 中小鼠之最高數比較。小於0.05之p值在此等分析中視為統計顯著。

結果

用Lmdd-143/168及LmddA-143/168免疫接種攜有TPSA23之小鼠導致對PSA具有特異性之效應TIL之數目較高且亦降低腫瘤血管之外被細胞覆蓋率。此外，細胞黏附標記物在經免疫接種小鼠中顯著上調。

與單價處理組相比，使用抗-CD3及抗-CD8染色觀測到用二價免疫療法處理的腫瘤中之T細胞浸潤增加(圖18-19)。

另外，LMddA168及LmddA244-168處理組兩者之腫瘤中的CD4⁺T細胞浸潤增加。此外，在LmddA168及LmddA244G-168處理組中觀測到血管由抗-CD31之染色減少(圖21)。

實施例14：雙重cHER2-CA9李斯特菌屬疫苗對植入Balb/c小鼠之乳腺中的4T1腫瘤之生長之抗腫瘤功效實驗細節：

產生重組Lm(LmddA-cHer2/CA9)。此Lm菌株表現並分泌嵌合Her2(cHer2)蛋白染色體地為與基因組李斯特菌溶胞素O(LLO)之融合物，及表現並分泌人碳酸酐酶9(CA9)之片段(使用質體)為與截短LLO(tLLO)之融合物，以多重地靶向腫瘤細胞。

疫苗效價：

LmddA-PSA--6.5×10⁸

LmddA-CA9--1.4×10¹⁰

LmddA-cHER2--1.05×10¹⁰

雙重cHer2-CA9(LmddA)--1.5×10⁹

實驗方案：

使4T1細胞生長於含有10% FBS、2mM L-Glu、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、1mM丙酮酸鈉及10mM HEPES之RPMI中。在注射當天，將細胞用胰蛋白酶處理，然後於PBS中洗滌2次。對細胞計數，且以7×10³細胞/50μl再懸浮。

將腫瘤植入小鼠中的每一者之乳腺中。每組有16隻小鼠。3天後對小鼠接種疫苗。在第4天，處死各組中之4隻小鼠且檢驗腫瘤生長。在第10天，向小鼠追加各疫苗。在第11天，處死各組中之4隻小鼠且量測腫瘤。在第18天，處死各組中之4-5隻小鼠且量測腫瘤。在第21天，處死各組中之剩餘小鼠且量測腫瘤。

結果

在第4天，腫瘤幾乎不可觸，因此未進行量測。

表4中之數目顯示，雙重疫苗(表現兩種異源抗原之重組李斯特菌屬)最初(第11天)對腫瘤塊具有大的影響(圖21)。被處死之小鼠中有兩隻不具有腫瘤，且其餘小於對照且約為單CA9及cHER2疫苗接種小鼠之尺寸。截至第18天，可量測若干組中的一些小鼠中之多個腫瘤。PBS及PSA對照小鼠之腫瘤比單CA9及cHER2或雙重疫苗組大得多。雙重疫苗組具有一個具有大的腫瘤負荷之離群值，否則的話該組之平均值將為最小。實驗提早終止，因為若干組中之小鼠看起來病得厲害且已死亡。然而，在最後量測時，雙重疫苗組中之小鼠具有最小腫瘤(圖21)。此可歸因於在早期可見的腫瘤生長之控制水準。

總之，雙重疫苗於4T1模型中展示之初始腫瘤控制水準高於用單疫苗或對照小鼠實現之水準，因為雙重疫苗組在實驗結束時具有最小腫瘤負荷(參見圖22及23)。

實施例15：雙重cHER2-HMW-MAA李斯特菌屬疫苗對植入Balb/c小鼠之乳腺中的4T1腫瘤之生長之抗腫瘤功效實驗細節：

產生重組Lm(LmddA-cHer2/HMW-MAA)。此Lm菌株表現並分泌嵌合Her2(cHer2)蛋白染色體地為與基因組李斯特菌溶胞素O(LLO)之融合物，及表現並分泌高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)(使用質體)為與截短LLO(tLLO)之融合物，以多重地靶向腫瘤細胞。

疫苗效價：

LmddA-PSA--6.5×10⁸

LmddA-HMW-MMA--1.4×10¹⁰

LmddA-cHER2--1.05×10¹⁰

雙重cHer2-HMW-MMA(LmddA)--1.5×10⁹

實驗方案：

將腫瘤植入小鼠中的每一者之乳腺中。每組有16隻小鼠。3天後對小鼠接種疫苗。在第8天，處死各組中之4隻小鼠且檢驗腫瘤生長。在第8天，向小鼠追加各疫苗。在第15天，處死各組中之4隻小鼠且量測腫瘤。在第15天，再向小鼠追加各疫苗。在第15天、第21天、第28天及第35天，處死各組中之4-5隻小鼠且量測腫瘤。在第42天，處死各組中之剩餘小鼠且量測腫瘤。

結果

結果概述於圖24中。該圖顯示，雙重疫苗(表現兩種異源抗原之重組李斯特菌屬)對腫瘤體積具有大的影響(圖24)。接受二價療法之小鼠的腫瘤體積小於對照及單HMW-MMA及cHER2疫苗接種小鼠兩者。PBS及PSA對照小鼠之腫瘤在體積方面與單HMW-MMA及cHER2組相當。

總之，雙重疫苗於4T1模型中展示之初始腫瘤控制水準高於用單疫苗或對照小鼠實現之水準，因為雙重疫苗組在實驗結束時具有最小腫瘤負荷(參見圖24)。

實施例16：雙重及連續cHER2-HMW-MAA李斯特菌屬疫苗對NT2乳房腫瘤模型之生長的抗腫瘤功效之比較研究實驗細節：

使用小鼠NT2乳房腫瘤模型檢驗抗腫瘤功效。在第0天向FvB小鼠植入1×10⁶個NT2細胞，且將右側腹上之確立的腫瘤在第6天開始用不同免疫療法以一週時間間隔處理進行三次免疫接種。一週兩次監測腫瘤直至研究結束。在腫瘤直徑大於1.5cm時處死小鼠。

結果

使用小鼠NT2乳房腫瘤模型檢驗不同李斯特菌屬疫苗方案之抗腫瘤治療功效。將在右側腹上攜有確立的NT2腫瘤之FvB小鼠用表現單抗原LmddA164(ChHer2)、LmddA168(HMC)之不同免疫療法或同時投與的表現兩種抗原之療法組合(二價療法)以一週時間間隔處理進行五次1×10⁸免疫接種(參見表6)。另外，用表現單抗原LmddA164(ChHer2)、LmddA168(HMC)之不同免疫療法、同時投與的表現兩種抗原之療法組合(二價療法)、或連續投與各單抗原之組合(cHer2繼而HMW-MAA)進行組合相較於連續療法。在後者中，投與3個每週一次劑量之LmddA164(ChHer2)，繼而投與3個每週一次劑量之LmddA168(HMC)(參見表6)。結果概述於圖25中。如圖 25中所指示，全部方案均導致NT2腫瘤體積之大致等效減小。此等觀測結果顯示，同時或連續投與兩種單價構築體在控制腫瘤生長方面至少與二價構築體相當(圖25)。

實施例17：在用PSA-SVN、PSA-PSMA及SIINFEKL袖珍基因免疫接種之後在C57BL/6小鼠中產生PSA及SIINFEKL特異性反應方法菌株構築：

由Genewiz,Inc.(South Plainfield,NJ)合成DNA序列XhoI位點-PSA-存活素-XmaI位點、XhoI位點-PSA-存活素-標籤-XmaI位點及XhoI位點-PSA-PSMA-標籤-XmaI位點，且將其在載體質體pUC57-Kan中裝運至Advaxis。PSA之標靶序列闡述於SEQ ID NO：83(SEQ ID NO：108中之胺基酸序列)中，存活素之標靶序列闡述於SEQ ID NO：84(SEQ ID NO：109中之胺基酸序列)中，且PSMA之標靶序列闡述於SEQ ID NO：85(SEQ ID NO：110中之胺基酸序列)或SEQ ID NO：86(在跨膜結構域序列缺失時)(SEQ ID NO：111中之胺基酸序列)中。編碼PSA-抗原(例如，存活素或PSMA)融合蛋白之DNA序列之實例闡述於SEQ ID NO：89-91(SEQ ID NO：114-116中闡述之胺基酸序列)中。用以連接PSA編碼及存活素編碼或PSMA編碼序列之例示性連接子闡述於SEQ ID NO：87(SEQ ID NO：112中之胺基酸序列)中，且例示性SIINFEKL-6xHis 標籤闡述於SEQ ID NO：88(SEQ ID NO：113中之胺基酸序列)中。將各載體質體轉型至化學勝任Top10大腸桿菌(Invitrogen)中用於儲存及允許大量質體製備。根據製造商說明書使用QIAGEN Plasmid Midi套組(Qiagen)純化各載體質體。為了分離XhoI位點-PSA-存活素-XmaI位點、XhoI位點-PSA-存活素-標籤-XmaI位點及XhoI位點-PSA-PSMA-標籤-XmaI插入序列，將各載體質體各限制酶用XhoI及XmaI(New England Biolabs)消化隔夜，且藉由瓊脂糖凝膠電泳法及凝膠提取法根據製造商說明書使用GENECLEAN套組(MPBio)回收。使用T4 DNA接合酶(New England Biolabs)使XhoI位點-PSA-存活素-XmaI位點、XhoI位點-PSA-存活素-標籤-XmaI位點及XhoI位點-PSA-PSMA-標籤-XmaI位點插入序列接合至類似地切割之pAdv134中，以分別產生pAdv134-PSA-存活素、pAdv134-PSA-存活素-標籤及pAdv134-PSA-PSMA-標籤。然後藉由DNA測序證實質體插入序列。pAdv134序列闡述於SEQ ID NO：95中。具有編碼PSA-抗原融合蛋白之DNA序列的例示性pAdv134序列闡述於SEQ ID NO：96-98中。用於此實施例中之引子序列闡述於SEQ ID NO：99-106中。

然後將pAdv134-PSA-存活素、pAdv134-PSA-存活素-標籤及pAdv134-PSA-PSMA-標籤電穿孔至LmddA中，以分別產生菌株LmddA-PSA-存活素、LmddA-PSA-存活素-標籤及LmddA-PSA-PSMA-標籤。然後藉由DC4 SIINFEKL呈現分析證實自菌株LmddA-PSA-存活素-標籤及LmddA-PSA-PSMA-標籤之加SIINFEKL標籤的tLLO-融合蛋白表現。編碼tLLO-PSA-抗原融合蛋白之例示性DNA序列闡述於SEQ ID NO：92-94(SEQ ID NOS：117-119中之胺基酸序列)中。tLLO編碼序列闡述於SEQ ID NO：82(SEQ ID NO：107中闡述之胺基酸序列)中。然後使LmddA-PSA-存活素、LmddA-PSA-存活素-標籤及LmddA-PSA-PSMA-標籤小鼠活體內繼代兩次，且然後再證實自菌株LmddA-PSA-存活素-標籤及LmddA-PSA-PSMA-標籤之加SIINFEKL標籤的tLLO-融合蛋白表現。

PSA免疫原性研究

此分析檢驗經兩種不同PSA-加SIINFEKL標籤的構築體免疫接種之小鼠中的PSA及SIINFEKL特異性免疫性產生。包括SIINFEKL袖珍基因作為陽性對照。藉由dextramer(Immudex)染色使用針對C57BL/6小鼠之已知T細胞抗原決定基H-2 D^b PSA_65-73(HCIRNKSVI)及H-2 K^b OVA_257-264(SIINFEKL)偵測PSA及SIINFEKL特異性免疫反應。免疫接種時程及菌株之細節在表7及8中給出。

初次免疫接種之後的結果

將三組5隻C57BL/6小鼠/組用表現SIINFEKL袖珍基因之LmddA、PSA-存活素-SIINFEKL-His或PSA-PSMA-SIINFEKL-His靜脈內免疫接種。在免疫接種之後第8天收集脾細胞。針對對H-2 D^b PSA_65-73(HCIRNKSVI)(SEQ ID NO：80)及H-2 K^b OVA_257-264 (SIINFEKL)(SEQ ID NO：81)之反應，藉由dextramer染色篩選脾細胞。圖26及27中分別展示在初次免疫接種之後對PSA及SIINFEKL肽之CD8⁺ T細胞反應。

將額外三組5隻C57BL/6小鼠/組用表現SIINFEKL袖珍基因之LmddA、PSA-存活素-SIINFEKL-His或PSA-PSMA-SIINFEKL-His靜脈內免疫接種，繼而在初次免疫接種之後以兩週時間間隔進行兩次追加劑免疫接種。在第二次、最後一次追加劑免疫接種之後第7天收集脾細胞。針對對H-2 D^b PSA_65-73(HCIRNKSVI)及H-2 K^b OVA_257-264(SIINFEKL)之反應，藉由dextramer染色篩選脾細胞。圖28及29中分別展示在初次免疫接種之後對PSA及SIINFEKL肽之CD8⁺ T細胞反應。

在用PSA-存活素及PSA-PSMA構築體兩者單一初次免疫接種之後，在小鼠中產生對D^b限制PSA_65-73肽之可量測的CD8⁺ T細胞反應(圖26)。追加劑免疫接種導致經免疫接種小鼠之脾臟中的CD8⁺ T細胞百分比增加，PSA-PSMA免疫接種小鼠中觀測到之相對增加與經較短PSA-存活素Lm免疫接種之小鼠相比更大(圖28)。

在小鼠中在初次免疫接種任一含PSA之Lm載體之後，對K^b OVA_257-264肽之T細胞反應大於對PSA_65-73肽之反應(圖26及27)。在二次免疫接種任一含PSA之Lm菌株之後，對K^b OVA_257-264肽之二次反應增加的程度與對PSA_65-73肽可見之增加相比顯著更大(圖27及29)。包括經OVA_257-264袖珍基因構築體免疫接種之小鼠組作為對K^b限制OVA_257-264肽之反應的陽性對照。

與此實施例相關之序列闡述於SEQ ID NO：80-119中。

實施例18：使用活體外基於細胞之分析法量測表現PSA及另一腫瘤相關抗原的含OVA_257-264(SIINFEKL)之李斯特菌屬菌株構築體(PSA 2.0構築體)之表現、處理及呈現菌株構築

由Genewiz,Inc.(South Plainfield,NJ)合成編碼8種經設計XhoI位點-PSA(SEQ ID NO：121；編碼之胺基酸序列：SEQ ID NO：159)加抗原(例如存活素(SEQ ID NO：122；編碼之胺基酸序列：SEQ ID NO：160)或AKAP4(SEQ ID NO：127；編碼之胺基酸序列：SEQ ID NO：165)或Hepsin(SEQ ID NO：125、126；編碼之胺基酸序列：SEQ ID NO：163、164)或PSGR(SEQ ID NO：123、124；編碼之胺基酸序列SEQ ID NO：161、162))-XmaI位點之DNA序列，且將其在載體質體pUC57-Kan中裝運至Advaxis。編碼PSA-抗原融合物之DNA序列之實例闡述於SEQ ID NO：130-137(SEQ ID NO：168-175中闡述之胺基酸序列)中。使PSA連接至另一抗原或連接兩種抗原之例示性連接子序列闡述於SEQ ID NO：128(SEQ ID NO：166中闡述之胺基酸序列)中。例示性SIINFEKL-6xHis標籤編碼序列闡述於SEQ ID NO：129(SEQ ID NO：167中闡述之胺基酸序列)中。將各載體質體轉型至化學勝任 Top10大腸桿菌(Invitrogen)中用於儲存及允許大量質體製備。將合成之插入序列經由同源重組使用In-Fusion Cloning套組(Clontech)選殖至pAdv134中，以產生8種獨特的pAdv134-PSA-抗原標靶質體。將此等質體轉染至LmddA中以產生8種獨特的LmddA構築體，且然後藉由SIINFEKL呈現分析法評估tLLO-PSA-抗原標靶-標籤融合蛋白表現。編碼tLLO-PSA-抗原融合蛋白之DNA序列之實例闡述於SEQ ID NO：138-145(SEQ ID NO：176-183中闡述之胺基酸序列)中。例示性tLLO編碼序列闡述於SEQ ID NO：120(SEQ ID NO：158中闡述之胺基酸序列)中。將表現該等構築體之菌株活體內經小鼠繼代兩次，且再驗證蛋白質表現以產生最終免疫療法菌株。用於此實施例中之引子序列闡述於SEQ ID NO：146-157中。

SIINFEKL呈現分析法

開發此分析法以允許快速活體外測定抗原由Lm之分泌及抗原由感染細胞之MHC I類呈現。簡言之，將鼠類樹突樣細胞株(DC2.4)用適當Lm菌株以20之MOI感染。在1小時之後添加建它黴素以殺死不由DC2.4細胞吸收之任何胞外細菌。將細胞再在37℃下培育4-5小時。然後將細胞用Alexa Fluor 647結合25D-1.16抗體染色。25D-1.16抗體僅結合至呈現OVA_257-264 SIINFEKL肽之細胞表面MHC I類K^b分子。在此分析法中，僅經分泌含SIINFEKL肽基元之蛋白質之Lm感染的彼等細胞對於用 25D-1.16抗體染色為陽性。K^b-SIINFEKL之表面染色為線性的，且因此用作Lm感染細胞中之抗原表現的半定量量測。

在此分析法中，DC2.4經四種PSA表現Lm載體感染。一種構築體具有在羧基端不具有SIINFEKL部分之PSA-存活素。包括此構築體作為陰性對照。表現PSA-存活素-SIINFEKL或PSA-PSMA-SIINFEKL之兩種Lm構築體用以使用25D-1.16抗體系統評估抗原表現。包括僅表現不具有PSA 2.0相關部分之最小SIINFEKL肽之Lm菌株作為陽性對照。此等四種構築體之結果展示於圖30中。25D-1.16之染色展示於Y軸上。表現表面K^b-SIINFEKL之細胞之相對百分比展示於假色圖之右上角中。三種含SIINFEKL的構築體之K^b-SIINFEKL陽性群體之平均螢光強度(MFI)值如下：

K^b-SIINFEKL陰性群體之平均MFI值為300。

與此實施例相關之序列闡述於SEQ ID NO：120-183中。

實施例19：構築ADXS31-2142(PSA 2.0) 1.引言.

ADXS31-2142免疫療法係基於Lm Δ dal dat actA(LmddA)，其表現四種人類抗原(前列腺特異性抗原(PSA)、存活素、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR)ΔTM(跨膜結構域)及Hepsin ΔTM)，與李斯特菌屬李斯特菌溶胞素O之截短片段(tLLO)及C端SIINFEKL-6xHIS抗原決定基標籤融合用於下游表徵。主鏈菌株LmddA之描述提供於先前實施例中。

2.方法.

2.1.構築pAdv2142質體. 藉由修飾先前實施例中描述之質體pAdv134構築質體pAdv2142。Wallecha,A.,Construction of an attenuated Listeria monocytogenes-based vaccine expressing human prostate specific antigen(PSA)ADXS31-142.,RPT-RD-0012011.第18頁。使引子對Adv710/Adv711黏接及純化以產生多選殖位點(MCS)插入序列(表9)。然後將pAdv134及MCS插入序列XhoI/XmaI限制消化，將所得約5.6kb pAdv134片段及MCS限制產物純化及接合以產生質體pAdv134-MCS(SEQ ID NO：192；殘基2418-2423處之XbaI限制位點，及殘基2448-2453處之XmaI限制位點)。然後藉由使用引子Adv16對tLLO-MCS接合進行DNA測序來證實MCS插入序列插入至pAdv134-MCS中。

化學合成編碼含有四種抗原性標靶PSA、存活素、PSGRΔTMs(亦即，跨膜結構域經移除之PSGR)及HepsinΔTM(亦即，跨膜結構域經移除之hepsin)、具有C端SIINFEKL-6xHIS標籤之融合蛋白的插入序列，且將其提供於載體質體pUC57kan中。插入序列之核酸序列闡述於SEQ ID NO：200(殘基1-6處之XbaI位點，殘基2983-2988處之XmaI位點)中。載體質體pUC57kan中的插入序列之核酸序列闡述於SEQ ID NO：201(殘基419-424處之XbaI位點，殘基3401-3406處之XmaI位點，及殘基419-3406處之插入序列)中。關於抗原性標靶及融合插入DNA序列，亦參見SEQ ID NO：192-202。將質體pAdv134-MCS及pUC57 kan-插入序列baI/XmaI限制消化，然後將所得約5.6kb pAdv134-MCS片段及約2.9kb pUC57 kan-插入序列限制產物純化及接合以產生質體pAdv2142(SEQ ID NO：202)。藉由使用構築體/插入序列接合特異性及插入序列特異性引子進行DNA測序來證實pAdv2142(SEQ ID NO：202之殘基1077-5399)中所要tLLO-PSA/存活素/PSGRΔTMs/HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS抗原性融合蛋白表現卡匣之產生(表10)。

2.2.構築ADXS31-2142免疫療法. 為了產生PSA/存活素/PSGR/Hepsin靶向單核球增多性李斯特菌免疫療法菌株，將質體pAdv2142經由電穿孔轉型至單核球增多性李斯特菌菌株LmddA中，且將轉型體選擇至BHI-鏈黴素瓊脂培養盤上以產生菌株ADXS31-2142。然後藉由群落PCR用引子對Adv16/Adv295證實pAdv2142由ADXS31-2142之成功維持，產生預期的約3kb條帶。另外證實菌株ADXS31-2142中質體之tLLO-PSA/存活素/PSGRΔTMs/HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS抗原性融合蛋白區之序列。

2.3.活體外評估ADXS31-2142免疫原性. 為了評估免疫原性，將2×10⁶個DC2.4鼠類樹突狀細胞用 ADXS31-2142以20之感染倍率感染。在感染後一小時，洗滌宿主細胞，且添加含有建它黴素之組織培養基以殺死全部胞外細菌。在感染後五小時，收集宿主細胞，將其用Alexa 647結合25D1-1.16抗體染色，以測定呈現與I類MHC複合的SIINFEKL抗原決定基之細胞群體，藉由流式細胞術相較於經對照細菌菌株感染之DC2.4細胞評定Alexa647陽性宿主細胞之百分比。

3.結果

3.1.構築無抗生素質體pAdv2142. 為了產生經改良之前列腺癌靶向Lm免疫療法菌株，需要編碼除PSA之外的抗原性標靶之tLLO-抗原融合蛋白表現質體併入Lm菌株LmddA中。選擇存活素、PGSR及Hepsin作為額外抗原性標靶蛋白，因為如同PSA，相較於正常組織其亦區別地表現於前列腺癌中。化學合成編碼由獨特XbaI及XmaI限制位點側接之PSA-存活素-PSGRΔTMs-HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS蛋白質插入序列的DNA序列，且將其接合至pAdv134-MCS中之此等限制位點中以產生pAdv2142(圖31)。藉由使用引子對Adv16/Adv295對推定MB2159+pAdv2142轉型體進行群落PCR(圖32A)來驗證pAdv2142中插入序列之適當插入，陽性轉型體群落產生預期尺寸為約3kb之PCR產物，對應於PSA-存活素-PSGRΔTM--HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS插入序列。然後藉由DNA測序證實正確tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTM-- HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS ORF。在pAdv2142中，tLLO-PSA存活素-PSGRΔTM--HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS融合蛋白之表現在Lm hly啟動子之控制下。包括C端SIINFEKL-6xHISepitope標籤允許藉由量測在活體外DC2.4樹突狀細胞感染期間之SIINFEKL抗原決定基呈現或藉由對TCA沈澱之細菌培養物上清液進行抗-6xHIS西方墨點法，來評定tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTM--HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS融合蛋白表現。pAdv2142質體之額外組件包括用於D-丙胺酸營養缺陷型大腸桿菌菌株MB2159及Lm菌株LmddA中之質體選擇的組成型dalbs表現卡匣，分別用於維持大腸桿菌及Lm中之質體的革蘭氏陰性複製起點(p15 ori)及革蘭氏陽性複製起點(RepR)。

為產生PSA/存活素/PSGR/Hepsin靶向免疫療法菌株，將pAdv2142轉型至電勝任LmddA中。然後藉由使用引子對Adv16/Adv295進行群落PCR來鑑別陽性LmddA+pAdv2142轉型體(圖32B)，且選擇陽性殖株且將其命名為ADXS31-2142。對來自自ADXS31-2142再純化之pAdv2142質體的PSA-存活素-PSGRΔTM--HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS插入序列再測序證實存在正確序列，表明tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTM--HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS融合蛋白表現卡匣在此菌株中遺傳穩定。

3.2 tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTM--HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS融合蛋白由ADXS31-2142之活體外表現 /分泌.藉由活體外感染/流式細胞術分析法證實tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTMs-HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS融合蛋白由ADXS31-2142之表現及分泌。在抗原性蛋白中包括八個胺基酸SIINFEKL部分允許將此抗原決定基用作完整蛋白質之表現、分泌、蛋白酶體處理及呈現的替代物。市售25D-1.16抗體特異性地偵測結合至鼠類H-2K^B之SIINFEKL肽。Porgador,A.等人，Localization,quantitation,and in situ detection of specific peptide-MHC class I complexes using a monoclonal antibody.Immunity,1997.6(6)：第715-26頁。將SIINFEKL部分置於抗原性蛋白之C端處確保，完整蛋白質必須由細菌表現及分泌且可用於宿主細胞抗原呈現以實現25D-1.16抗體結合至ADXS31-2142感染宿主細胞。然後可藉由用ADXS31-2142活體外感染H-2K^b表現樹突狀細胞株及用Alexa647結合25D-1.16抗體對受感染宿主細胞染色，藉由流式細胞術量測tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTMs-HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS融合蛋白表現及分泌。吾人在經ADXS31-2142感染之DC2.4細胞中觀測到陽性25D-1.16信號，但在經非SIINFEKL表現對照菌株感染之DC2.4細胞中未觀測到(圖33)。此表明，ADXS31-2142成功地表現並分泌tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTMs-HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS融合蛋白至宿主細胞胞溶質中且免疫原性上勝任。

除了能夠藉由以上活體外SIINFEKL呈現分析法測試tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTMs-HepsinΔTM-SIINFEKL-6xHIS蛋白表現/分泌之外，亦可藉由使用對抗若干蛋白質區之抗體對TCA沈澱之ADXS31-2142培養物上清液進行西方墨點分析來評定抗原性融合蛋白表現及分泌。雖然未測試，但在用抗-LLO、抗-PSA、抗-存活素及抗-6xHIS抗體探測的ADXS31-2142培養物上清液之西方墨點法之後，將預期約157kDa之條帶。

已參考附圖描述本發明之具體例，應理解，本發明不限於確切具體例，且各種變化及修改可由熟習此項技術者在不偏離本發明之如所附申請專利範圍如定義的範疇或精神之情況下於其中實現。

<110> Advaxis, Inc.

<120> 基於李斯特菌屬之免疫原性組成物及其於癌症預防與治療中之使用方法

<130> 062384/483708

<150> US 62/218,896

<151> 2015-09-15

<160> 202

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 6733

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

<210> 2

<211> 2850

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

<210> 3

<211> 950

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

<210> 4

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

<210> 5

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

<210> 6

<211> 862

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

<210> 7

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

<210> 8

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

<210> 9

<211> 549

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

<210> 11

<211> 8317

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

<210> 12

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

<210> 13

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

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<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 18

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

<210> 21

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

<210> 22

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 22

<210> 23

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 23

<210> 24

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 24

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 25

<210> 26

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 26

<210> 27

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 27

<210> 28

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 28

<210> 29

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 29

<210> 30

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 30

<210> 31

<211> 597

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 31

<210> 32

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 32

<210> 33

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

<210> 34

<211> 1158

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

<210> 35

<211> 386

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 35

<210> 36

<211> 2487

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 36

<210> 37

<211> 829

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 37

<210> 38

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 38

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 39

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<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 40

<210> 41

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 41

<210> 42

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 42

<210> 43

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 43

<210> 44

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 44

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 45

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 46

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<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 47

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 48

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 49

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 50

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 51

<210> 52

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 52

<210> 53

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 53

<210> 54

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 54

<210> 55

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 55

<210> 56

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 56

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 57

<210> 58

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 58

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 59

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 60

<210> 61

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 61

<210> 62

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 62

<210> 63

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 63

<210> 64

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 64

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 65

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<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 66

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 67

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 68

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 69

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 70

<210> 71

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 71

<210> 72

<211> 6523

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 72

<210> 73

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 73

<210> 74

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 74

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 75

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 76

<210> 77

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 77

<210> 78

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 78

<210> 79

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 79

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 80

<210> 81

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 81

<210> 82

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 82

<210> 83

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 83

<210> 84

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 84

<210> 85

<211> 2250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 85

<210> 86

<211> 2178

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 86

<210> 87

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 87

<210> 88

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 88

<210> 89

<211> 1152

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 89

<210> 90

<211> 1203

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 90

<210> 91

<211> 2958

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 91

<210> 92

<211> 2481

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 92

<210> 93

<211> 2532

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 93

<210> 94

<211> 4287

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 94

<210> 95

<211> 6138

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 95

<210> 96

<211> 6961

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 96

<210> 97

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 97

<210> 98

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 98

<210> 99

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 99

<210> 100

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 100

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 101

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 102

<210> 103

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 103

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 104

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 105

<210> 106

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 106

<210> 107

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 107

<210> 108

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 108

<210> 109

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 109

<210> 110

<211> 750

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 110

<210> 111

<211> 726

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 111

<210> 112

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 112

<210> 113

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 113

<210> 114

<211> 382

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 114

<210> 115

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 115

<210> 116

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 116

<210> 117

<211> 825

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 117

<210> 118

<211> 842

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 118

<210> 119

<211> 1427

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 119

<210> 120

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 120

<210> 121

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 121

<210> 122

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 122

<210> 123

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 123

<210> 124

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 124

<210> 125

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 125

<210> 126

<211> 1194

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 126

<210> 127

<211> 2562

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 127

<210> 128

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 128

<210> 129

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 129

<210> 130

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 130

<210> 131

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 131

<210> 132

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 132

<210> 133

<211> 3342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 133

<210> 134

<211> 1770

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 134

<210> 135

<211> 2409

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 135

<210> 136

<211> 2541

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 136

<210> 137

<211> 2976

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 137

<210> 138

<211> 3063

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 138

<210> 139

<211> 2658

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 139

<210> 140

<211> 3297

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 140

<210> 141

<211> 4665

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 141

<210> 142

<211> 3093

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 142

<210> 143

<211> 3732

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 143

<210> 144

<211> 3864

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 144

<210> 145

<211> 4299

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 145

<210> 146

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 146

<210> 147

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 147

<210> 148

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 148

<210> 149

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 149

<210> 150

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 150

<210> 151

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 151

<210> 152

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 152

<210> 153

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 153

<210> 154

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 154

<210> 155

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 155

<210> 156

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 156

<210> 157

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 157

<210> 158

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 158

<210> 159

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 159

<210> 160

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 160

<210> 161

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 161

<210> 162

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 162

<210> 163

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 163

<210> 164

<211> 398

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 164

<210> 165

<211> 854

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 165

<210> 166

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 166

<210> 167

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 167

<210> 168

<211> 578

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 168

<210> 169

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 169

<210> 170

<211> 656

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 170

<210> 171

<211> 1112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 171

<210> 172

<211> 588

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 172

<210> 173

<211> 801

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 173

<210> 174

<211> 845

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 174

<210> 175

<211> 990

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 175

<210> 176

<211> 1019

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 176

<210> 177

<211> 884

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 177

<210> 178

<211> 1097

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 178

<210> 179

<211> 1553

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 179

<210> 180

<211> 1029

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 180

<210> 181

<211> 1242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 181

<210> 182

<211> 1286

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 182

<210> 183

<211> 1431

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 183

<210> 184

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 184

<210> 185

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 185

<210> 186

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 186

<210> 187

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 187

<210> 188

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 188

<210> 189

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 189

<210> 190

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 190

<210> 191

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 191

<210> 192

<211> 5851

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 192

<210> 193

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 193

<210> 194

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 194

<210> 195

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 195

<210> 196

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 196

<210> 197

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 197

<210> 198

<211> 1194

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 198

<210> 199

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 199

<210> 200

<211> 2988

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 200

<210> 201

<211> 5635

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 201

<210> 202

<211> 8798

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 202

Claims

一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬(Listeria)菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段、存活素抗原或其免疫原性片段、前列腺特異性G蛋白偶聯受體(PSGR)抗原或其免疫原性片段及hepsin抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。
如請求項1之重組李斯特菌屬菌株，其中，該PSGR抗原或其免疫原性片段為PSGRΔ跨膜結構域(ΔTM)抗原，且該hepsin抗原或其免疫原性片段為hepsinΔTM抗原。
如請求項2之重組李斯特菌屬菌株，其中，該PSA抗原或其免疫原性片段、該存活素抗原或其免疫原性片段、該PSGRΔTM抗原或其免疫原性片段及該hepsinΔTM抗原或其免疫原性片段自N端至C端呈以下次序：PSA-存活素-PSGRΔTM--hepsinΔTM。
如請求項3之重組李斯特菌屬菌株，其中，該截短LLO(tLLO)、該截短ActA或該PEST胺基酸序列與該PSA抗原或其免疫原性片段融合。
如請求項4之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽自N端至C端包含：tLLO-PSA-存活素-PSGRΔTM--hepsinΔTM。
如請求項3至5中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該PSA或其免疫原性片段藉由第一連接子連接至該存活素或其免疫原性片段，該存活素或其免疫原性片段經由第二連接子連接至該PSGRΔTM或其免疫原性片段，且該PSGRΔTM或其免疫原性片段經由第三連接子連接至該hepsinΔTM或其免疫原性片段。
如請求項1至6中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該PSA抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：108具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至7中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該存活素抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：109具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至8中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該PSGR抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：162具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至9中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該hepsin抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：164具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至10中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽包含與SEQ ID NO：175之殘基1-973或SEQ ID NO：183之殘基1-1414具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至11中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中。
如請求項1至11中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸分子在質體中。
如請求項13之重組李斯特菌屬菌株，其中，在缺乏抗生素選擇下該質體穩定維持於該重組李斯特菌屬菌株中。
如請求項13或14之重組李斯特菌屬菌株，其中，該質體不賦予該重組李斯特菌屬菌株以抗生素抗性。
如請求項1至15中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株經減毒。
如請求項16之重組李斯特菌屬菌株，其中，該減毒之李斯特菌屬菌株包含一或多種內源性基因中之突變。
如請求項17之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含actA致病性基因。
如請求項17之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含內源性prfA基因。
如請求項17或18之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含D-丙胺酸消旋酶(Dal)及D-胺基酸轉移酶(Dat)基因。
如請求項17至20中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該突變包含該一或多種內源性基因之失活、截短、缺失、置換或破壞。
如請求項1至21中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸分子包含第二開讀框。
如請求項22之重組李斯特菌屬菌株，其中，該第二開讀框編碼代謝酶。
如請求項23之重組李斯特菌屬菌株，其中，該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
如請求項1至24中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽自hly啟動子、prfA啟動子、actA啟動子或p60啟動子表現。
如請求項25之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽自hly啟動子表現。
如前述請求項中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸分子與SEQ ID NO：202中闡述之序列至少90%一致。
如請求項1至27中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。
如請求項1至28中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。
如請求項1至29中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株為營養缺陷型李斯特菌屬菌株。
如請求項1至30中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株能夠逃脫吞噬溶菌體。
一種免疫原性組成物，其包含請求項1至31中任一項之重組李斯特菌屬菌株。
如請求項32之免疫原性組成物，其中，該免疫原性組成物進一步包含佐劑。
如請求項33之免疫原性組成物，其中，該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
一種在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向該個體投與請求項1至31中任一項之重組李斯特菌屬菌株或請求項32至34中任一項之免疫原性組成物。
一種預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法，其包含向該個體投與請求項1至31中任一項之重組李斯特菌屬菌株或請求項32至34中任一項之免疫原性組成物。
如請求項35或36之方法，其中，該腫瘤或癌症為PSA表現腫瘤或癌症、存活素表現腫瘤或癌症、PSGR表現腫瘤或癌症或hepsin表現腫瘤或癌症。
如請求項37之方法，其中，該腫瘤或癌症為PSA表現腫瘤或癌症、存活素表現腫瘤或癌症、PSGR表現腫瘤或癌症及hepsin表現腫瘤或癌症。
如請求項35至38中任一項之方法，其中，該腫瘤或癌症為前列腺腫瘤或癌症。
一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段及存活素抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。
如請求項40之重組李斯特菌屬菌株，其中，該PSA抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：108具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項40或41之重組李斯特菌屬菌株，其中，該存活素抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：109具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項40至42中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽包含與SEQ ID NO：115之殘基1-382或SEQ ID NO：117之殘基1-825具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，該融合多肽包含與前列腺特異性抗原(PSA)抗原或其免疫原性片段及前列腺特異性膜抗原(PSMA)抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列。
如請求項44之重組李斯特菌屬菌株，其中，該PSA抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：108具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項44或45之重組李斯特菌屬菌株，其中，該PSMA抗原或其免疫原性片段包含與SEQ ID NO：111具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項44至46中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中該融合多肽包含與SEQ ID NO：116之殘基1-967或SEQ ID NO：119之殘基1-1410具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項40至47中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸分子可操作地整合至李斯特菌屬基因組中。
如請求項40至47中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸分子在質體中。
如請求項49之重組李斯特菌屬菌株，其中，在缺乏抗生素選擇下該質體穩定維持於該重組李斯特菌屬菌株中。
如請求項49或50之重組李斯特菌屬菌株，其中，該質體不賦予該重組李斯特菌屬菌株以抗生素抗性。
如請求項40至51中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株經減毒。
如請求項52之重組李斯特菌屬菌株，其中，該減毒之李斯特菌屬菌株包含一或多種內源性基因中之突變。
如請求項53之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含actA致病性基因。
如請求項53之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含內源性prfA基因。
如請求項53或54之重組李斯特菌屬菌株，其中，該一或多種內源性基因包含D-丙胺酸消旋酶(Dal)及D-胺基酸轉移酶(Dat)基因。
如請求項53至56中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該突變包含該一或多種內源性基因之失活、截短、缺失、置換或破壞。
如請求項40至57中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該核酸分子包含第二開讀框。
如請求項58之重組李斯特菌屬菌株，其中，該第二開讀框編碼代謝酶。
如請求項59之重組李斯特菌屬菌株，其中，該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
如請求項40至60中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該融合多肽自hly啟動子、prfA啟動子、actA啟動子或p60啟動子表現。
如請求項40至61中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。
如請求項40至62中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。
如請求項40至63中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中，該重組李斯特菌屬菌株為營養缺陷型李斯特菌屬菌株。
如請求項40至64中任一項之重組李斯特菌屬菌株，其中該重組李斯特菌屬菌株能夠逃脫吞噬溶菌體。
一種免疫原性組成物，其包含請求項40至65中任一項之重組李斯特菌屬菌株。
如請求項66之免疫原性組成物，其中，該免疫原性組成物進一步包含佐劑。
如請求項67之免疫原性組成物，其中，該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
一種在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向該個體投與請求項40至65中任一項之重組李斯特菌屬菌株或請求項66至68中任一項之免疫原性組成物。
一種預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法，其包含向該個體投與請求項40至65中任一項之重組李斯特菌屬菌株或請求項66至68中任一項之免疫原性組成物。
如請求項69或70之方法，其中，該腫瘤或癌症為PSA表現腫瘤或癌症、存活素表現腫瘤或癌症、PSGR表現腫瘤或癌症或hepsin表現腫瘤或癌症。
如請求項71之方法，其中，該腫瘤或癌症為PSA表現腫瘤或癌症、存活素表現腫瘤或癌症、PSGR表現腫瘤或癌症及hepsin表現腫瘤或癌症。
如請求項69至72中任一項之方法，其中，該腫瘤或癌症為前列腺腫瘤或癌症。
一種在個體中引發抗腫瘤或抗癌免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量之包含包括重組核酸分子之重組李斯特菌屬菌株的免疫原性組成物，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，其中該融合多肽包含與第一異源抗原或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，且其中該重組李斯特菌屬菌株表現該融合多肽，因此在該個體中引發抗腫瘤或抗癌免疫反應。
一種免疫原性組成物，其包含包括重組核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼第一融合多肽之第一開讀框，其中該第一融合多肽包含與內皮因子序列或其免疫原性片段融合之截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該李斯特菌屬菌株包含內源性D-丙胺酸消旋酶(dal)、D-胺基酸轉移酶(dat)及ActA(actA)基因中之突變。
一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼第一融合多肽之第一開讀框，該第一融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其免疫原性片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼第二融合多肽之第二開讀框，該第二融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之存活素抗原或其免疫原性片段。
一種包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，該核酸分子包含編碼第一融合多肽之第一開讀框，該第一融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性(PSA)抗原或其免疫原性片段，且其中該核酸分子進一步包含編碼第二融合多肽之第二開讀框，該第二融合多肽包含與截短李斯特菌溶胞素O(LLO)、截短ActA或PEST胺基酸序列融合之前列腺特異性膜抗原(PSMA)或其免疫原性片段。
一種免疫原性組成物，其包含請求項76或77之重組李斯特菌屬菌株。
一種在個體中誘導對抗腫瘤或癌症之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與請求項76或77之重組李斯特菌屬菌株或請求項78之免疫原性組成物。
一種預防或治療個體中之腫瘤或癌症的方法，該方法包含向該個體投與請求項76或77之重組李斯特菌屬菌株或請求項78之免疫原性組成物的步驟。