TW201726175A - 新穎抗密連蛋白（ｃｌａｕｄｉｎ）抗體及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供新穎抗CLDN抗體及抗體藥物結合物(ADC)，包括其衍生物，及使用其治療增生性病症之方法。

Description

新穎抗密連蛋白(CLAUDIN)抗體及使用方法
本申請案大體上關於新穎抗密連蛋白(抗CLDN)抗體或其免疫反應性片段及包含其之組合物，包括抗體藥物結合物，其用於治療、診斷或預防癌症及其任何復發或轉移。本發明之所選實施例提供此類抗CLDN抗體或抗體藥物結合物用於治療癌症的用途，包含降低致瘤細胞頻率。
密連蛋白為包含緊密連接之主要結構蛋白的膜主體蛋白，緊密連接為諸如上皮細胞或內皮細胞層中所見之極化細胞類型中之最頂端細胞-細胞黏著連接。緊密連接係由多股網狀蛋白質組成，該多股網狀蛋白質在細胞周圍形成連續密封，為溶質及水在旁細胞空間中之輸送提供物理屏障，但該物理屏障可調節。人類中之蛋白質之密連蛋白家族包含至少23名成員，大小在22-34kDa範圍內。雖然密連蛋白對正常組織之功能及穩定很重要，但腫瘤細胞經常展現異常的緊密連接功能。此可能與由於腫瘤細胞之反分化所致的密連蛋白之失調表現及/或定位或迅速生長的癌組織有效吸收血管形成異常之腫瘤塊內之營養物的要求有關(Morin,2005,PMID：16266975)。個別密連蛋白家族成員可在某些癌症類型中上調，但在其他癌症類型中下調。密連蛋白可為抗體藥物結合物(ADC)之尤佳標靶，因為已知密連蛋白經歷內飲作用，一些密連蛋白之轉換時間相對於其他膜蛋白 而言較短(Van Itallie等人，2004,PMID：15366421)，所以密連蛋白表現在癌細胞中失調且腫瘤細胞中之緊密連接結構在癌細胞中遭到破壞。此等性質可以為抗體結合贅生組織而非正常組織中之密連蛋白提供更多機會。雖然對個別密連蛋白具有特異性的抗體可為適用的，但亦可能多反應性密連蛋白抗體藥物結合物更可能促進將細胞毒素傳遞至更廣泛的患者群體。
諸如化學療法及放射線療法之習知癌症治療性治療常常無效且手術切除術不能提供可行的臨床替代方案。在患者經歷第一線治療且隨後復發的彼等情況中，當前標準照護療法的侷限性特別明顯。在此等情況下，頻繁產生難治性腫瘤，此等腫瘤往往具侵襲性及不可治癒性。因此仍非常需要開發目標性更強且更有力的增生性病症療法。本發明解決了此類需要。
在一廣泛態樣中，本發明提供特異性結合至人類CLDN決定子之經分離抗體及對應的抗體藥物或診斷結合物或其組合物。在某些實施例中，CLDN決定子為表現於腫瘤細胞上的CLDN蛋白質，而在其他實施例中，CLDN決定子表現於腫瘤起始細胞上。在其他實施例中，本發明之抗體或ADC結合至CLDN蛋白質且與結合至人類CLDN蛋白質上之抗原決定基的抗體競爭結合。
本發明之所選態樣係針對抗體藥物結合物(ADC)，其包含特異性結合至蛋白質之密連蛋白(CLDN)家族中之一或多者的抗體。在某些實施例中，本發明ADC包含式M-[L-D]n，其中：M包含抗CLDN抗體；L包含視情況存在之連接子；D包含選自由以下組成之群的吡咯并苯并二氮呯(PBD)彈頭：
；且n包含1至20之整數。
在某些態樣中，本發明ADC包含抗CLDN抗體，其為單株抗體。在另一實施例中，包含本發明ADC之抗CLDN抗體係選自由以下組成之群：嵌合抗體、CDR移植抗體、人類化抗體、人類抗體、靈長類化抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、雙功能抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段及ScFv片段；或其免疫反應性 片段。在另一實施例中，ADC所包含的抗CLDN抗體為內化抗體。在另一實施例中，本發明ADC結合至癌症幹細胞。
在某些態樣中，本發明ADC包含抗CLDN抗體，該抗CLDN抗體包含如下抗體或與如下抗體競爭結合至人類CLDN蛋白質：包含如SEQ ID NO：21所闡述之輕鏈可變區(VL)及如SEQ ID NO：23所闡述之重鏈可變區(VH)(SC27.1)：或如SEQ ID NO：25所闡述之VL及如SEQ ID NO：27所闡述之VH(SC27.22)；或如SEQ ID NO：29所闡述之VL及如SEQ ID NO：31所闡述之VH(SC27.103)；或如SEQ ID NO：33所闡述之VL及如SEQ ID NO：35所闡述之VH(SC27.104)；或如SEQ ID NO：37所闡述之VL及如SEQ ID NO：39所闡述之VH(SC27.105)；或如SEQ ID NO：41所闡述之VL及如SEQ ID NO：43所闡述之VH(SC27.106)；或如SEQ ID NO：45所闡述之VL及如SEQ ID NO：47所闡述之VH(SC27.108)；或如SEQ ID NO：49所闡述之VL及如SEQ ID NO：51所闡述之VH(SC27.201)；或如SEQ ID NO：53所闡述之VL及如SEQ ID NO：55所闡述之VH(SC27.203)；或如SEQ ID NO：57所闡述之VL及如SEQ ID NO：59所闡述之VH(SC27.204)的抗體。
在其他態樣中，本發明ADC包含抗CLDN抗體，該抗CLDN抗體包含如下抗體或與如下抗體競爭結合至人類CLDN蛋白質：包含如SEQ ID NO：61所闡述之輕鏈可變區(VL)及如SEQ ID NO：63所闡述之重鏈可變區(VH)(hSC27.1)；或如SEQ ID NO：65所闡述之VL及如SEQ ID NO：67所闡述之VH(hSC27.22)；或如SEQ ID NO：69所闡述之VL及如SEQ ID NO：71所闡述之VH(hSC27.108)；或如SEQ ID NO：73所闡述之VL及如SEQ ID NO：75所闡述之VH(hSC27.204)；或如SEQ ID NO：73所闡述之 VL及如SEQ ID NO：77所闡述之VH(hSC27.204v2)的抗體。
在一些實施例中，本發明ADC包含抗CLDN抗體，該抗CLDN抗體包含如下抗體或與如下抗體競爭結合至人類CLDN蛋白質：包含具有三個互補決定區(CDRL)之VL及具有三個互補決定區(CDRH)之VH的抗體(hSC27.204v2)，該三個CDRL為具有SEQ ID NO：109之CDRL1、具有SEQ ID NO：110之CDRL2及具有SEQ ID NO：111之CDRL3，該三個CDRH為具有SEQ ID NO：112之CDRH1、具有SEQ ID NO：115之CDRH2及具有SEQ ID NO：114之CDRH3。
在其他實施例中，本發明ADC包含抗CLDN抗體，該抗CLDN抗體包含如下抗體或與如下抗體競爭結合至人類CLDN蛋白質：包含具有SEQ ID NO：78之輕鏈及具有SEQ ID NO：79之重鏈的抗體(hSC27.1)；或包含具有SEQ ID NO：80之輕鏈及具有SEQ ID NO：81之重鏈的抗體(hSC27.22)；或包含具有SEQ ID NO：80之輕鏈及具有SEQ ID NO：82之重鏈的抗體(hSC27.22ss1)；或包含具有SEQ ID NO：83之輕鏈及具有SEQ ID NO：84之重鏈的抗體(hSC27.108)；或包含具有SEQ ID NO：83之輕鏈及具有SEQ ID NO：85之重鏈的抗體(hSC27.108ssl)；或包含具有SEQ ID NO：86之輕鏈及具有SEQ ID NO：87之重鏈的抗體(hSC27.204)；或包含具有SEQ ID NO：86之輕鏈及具有SEQ ID NO：88之重鏈的抗體(hSC27.204v2)；或包含具有SEQ ID NO：86之輕鏈及具有SEQ ID NO：89之重鏈的抗體(hSC27.204v2ss1)。
本發明之某些實施例包括包含如本文中所揭示之ADC的醫藥組合物。本發明之其他實施例包含一種治療癌症之方法，該癌症例如卵巢癌(例如卵巢漿液癌或卵巢子宮內膜樣腺癌)或肺癌(例如肺鱗狀細胞癌)或子 宮內膜癌(例如子宮體子宮內膜癌)，該方法包含向有需要之個體投與包含本發明ADC中之任一者的醫藥組合物。本發明之另一實施例為用本發明ADC中之一者及至少一種其他治療部分治療癌症的方法。
在另一態樣中，本發明包含一種減少腫瘤細胞群體中之癌症幹細胞的方法，其中該方法包含使包含癌症幹細胞及除癌症幹細胞外之腫瘤細胞的腫瘤細胞群體與本發明之抗CLDN ADC接觸，藉此降低癌症幹細胞之頻率。
在另一實施例中，本發明包含一種將細胞毒素傳遞至細胞的方法，該方法包含使該細胞與本發明ADC中之任一者接觸。
在類似情況下，本發明亦提供適用於診斷、監測或治療CLDN相關病症(諸如癌症)的套組或裝置及相關方法。為此目的，本發明較佳提供一種適用於偵測、診斷或治療CLDN相關病症的製品，該製品包含含有CLDN ADC及使用該CLDN ADC治療、監測或診斷CLDN相關病症之說明材料的容器，或提供針對其的給藥方案。在所選實施例中，裝置及相關方法將包含接觸至少一個循環腫瘤細胞的步驟。在其他實施例中，所揭示之套組將包含說明書、標籤、插頁、閱讀器或其類似物，其指示套組或裝置係用於診斷、監測或治療CLDN相關癌症或提供針對其的給藥方案。
前文為發明內容且因此必然含有細節的簡化、概括及省略；因此，熟習此項技術者將瞭解，此發明內容僅具說明性且不希望以任何方式進行限制。本文所述方法、組合物及/或裝置及/或其他標的物的其他態樣、特徵及優勢顯而易見於本文所闡述之教示內容中。提供發明內容係為了以簡化形式引入一系列概念，此等概念進一步描述於下文實施方式中。
圖1A及圖1B顯示CLDN蛋白質之間的序列關係。圖1A為使用比對演算法及源自23個人類CLDN基因之蛋白質序列產生的樹枝狀圖，示出了CLDN6與CLDN9之間的密切序列關係；圖1B為CLDN6蛋白質與CLDN9蛋白質之胺基酸序列比對，示出了一致保守殘基(豎直雜湊)及拓撲域之重疊(細胞質殘基，小寫字母；跨膜螺旋，加框的大寫字母；細胞外殘基，粗體大寫字母)。
圖2A至圖2H提供小鼠及人類化抗CLDN抗體之胺基酸及核酸序列。圖2A及圖2B顯示例示性小鼠及人類化抗CLDN抗體及hSC27.204之變異體(SEQ ID NO：21-77，奇數)的輕鏈(圖2A)及重鏈(圖2B)可變區胺基酸序列。圖2C顯示此類例示性小鼠及人類化抗CLDN抗體及hSC27.204之變異體(SEQ ID NO：20-76，偶數)的相同輕鏈及重鏈可變區的核酸序列。圖2D顯示人類化抗體hSC27.1、hSC27.22、hSC27.108及hSC27.204、以及hSC27.22、hSC27.108及hSC27.204之變異體(SEQ ID NO：78-89)的全長輕鏈及重鏈之胺基酸序列。圖2E至圖2H顯示抗CLDN抗體SC27.1(圖2E)、SC27.22(圖2F)、SC27.108(圖2G)及SC27.204(圖2H)之輕鏈及重鏈可變區的胺基酸序列，帶有註釋，其中CDR係使用Kabat、Chothia、ABM及接觸方法闡述。
圖3A顯示如藉由流動式細胞測量術所偵測的抗CLDN抗體SC27.1及SC27.22結合過度表現人類CLDN4、CLDN6及CLDN9之HEK293T細胞的能力，其中結果顯示為平均螢光強度變化(△MFI)及直方圖，其中黑色實線表示與螢光減一(fluorescence minus one；FMO)同型對照(灰色填充)對比的、指定抗體與過度表現指定CLDN蛋白質之細胞的結合。
圖3B顯示如藉由流動式細胞測量術所偵測的抗CLDN抗體結合過度 表現CLDN4、CLDN6及CLDN9之HEK293T細胞的能力，其中結果顯示為結合至各細胞株之各抗體的平均螢光強度(MFI)。
圖3C顯示如藉由一定量之抗體對比固定數量之表現相關抗原之細胞的滴定所測定，例示性抗CLDN抗體對CLDN6及CLDN9之表觀結合親和力。
圖4A顯示抗CLDN抗體SC27.1及SC27.22能夠內化至過度表現人類CLDN4、CLDN6及CLDN9之細胞中且介導皂草素(saporin)細胞毒素之傳遞。
圖4B顯示各種抗體於CLDN4、CLDN6及CLDN9之表觀IC50。
圖5A及圖5B顯示抗CLDN ADC活體內減小卵巢及肺腫瘤之體積的能力。
圖6A顯示CLDN4、CLDN6及CLDN9蛋白質在人類CSC中之表現(黑色實線)對比非致瘤(虛線)卵巢、胰臟及肺腫瘤細胞群體及FMO同型對照(灰色填充)。
圖6B顯示移植有CLDN+(實心圓圈)或CLDN-(空心圓圈)卵巢腫瘤細胞之小鼠中的腫瘤生長，其中相較於CLDN-卵巢腫瘤細胞，CLDN+腫瘤細胞展現增強的致瘤性。
圖7顯示限制稀釋法分析之結果；經抗CLDN ADC SC27.22PBD1處理之腫瘤顯示腫瘤起始細胞減少量為經對照ADC IgG1PBD1處理之腫瘤的大約4倍。
圖8A至圖8D分別顯示CLDN6(圖8A)及CLDN9(圖8B)在一系列源自癌症基因組圖譜(Cancer Genome Atlas)之腫瘤及正常組織中之相對mRNA表現；而圖8C顯示CLDN家族成員在按腫瘤分期細分的子宮體子宮 內膜癌中之相對mRNA表現且圖8D顯示III期及IV期子宮體子宮內膜癌中CLDN6之相對mRNA表現對比激素受體表現。
交叉參考之申請案
本申請案主張2015年12月4日申請之美國臨時申請案第62/263,542號及2016年11月28日申請之美國臨時申請案第62/427,027號之優先權，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式、經由EFS網提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於2016年12月1日，名為sc2704WOO1_S69697_1330WO_SEQL_120116.txt且大小為114,404個位元組。
本發明可以許多不同形式實施。本文中揭示本發明的非限制性、說明性實施例，該等實施例舉例說明本發明原理。本文所用之任何章節標題僅出於組織目的且不應理解為限制所述標的物。出於本發明之目的，除非另外說明，否則所有鑑別序列之寄存編號可見於NCBI參考序列(RefSeq)資料庫及/或NCBI GenBank®存檔序列資料庫中。
已出乎意料地發現，CLDN表現為多種腫瘤類型之生物標記物且此相關性可用於治療此類腫瘤。亦出乎意料地發現，CLDN表現與致瘤細胞相關且因而可有效地用於抑制或消除此類細胞。更詳細地描述於下文中的致瘤細胞已知可對許多習知療法展現耐藥性。與先前技術之教示內容相比，所揭示之化合物及方法可有效地克服此固有耐藥性。
因此，尤其值得注意的是，CLDN結合物(諸如本文中所揭示之彼等 物)可有利地用於治療及/或預防所選增生性(例如贅生性)病症或其進展或復發。應瞭解，雖然本發明之較佳實施例將在下文展開廣泛論述，尤其在特定的結構域或區域或抗原決定基方面或在包含神經內分泌特徵之癌症幹細胞或腫瘤及其與所揭示之抗體藥物結合物相互作用的背景下展開廣泛論述，但熟習此項技術者應瞭解，本發明之範疇不受此類例示性實施例限制。實情為，本發明的最廣闊實施例及隨附申請專利範圍廣泛地且明確地關於抗CLDN抗體及結合物，包括本文揭示的彼等物，及其用於治療及/或預防多種CLDN相關或介導性病症(包括贅生性或細胞增殖性病症)的用途，不論任何特定的作用機制或特異性靶向的腫瘤、細胞或分子組分。
I. 密連蛋白(CLDN)生理學
密連蛋白為包含緊密連接之主要結構蛋白的膜主體蛋白，緊密連接為諸如上皮細胞或內皮細胞層中所見之極化細胞類型中之最頂端細胞-細胞黏著連接。緊密連接係由多股網狀蛋白質組成，該多股網狀蛋白質在細胞周圍形成連續密封，為溶質及水在旁細胞空間中之輸送提供物理屏障，但該物理屏障可調節。人類中之蛋白質之密連蛋白家族包含至少23名成員，大小在22-34kDa範圍內。所有密連蛋白皆具有四跨膜蛋白拓撲，其中蛋白質末端均位於細胞膜之細胞內表面上，從而形成兩個細胞外(EC)環EC1及EC2。EC環介導頭對頭同嗜相互作用，且對於某些密連蛋白組合而言，EC環介導異嗜相互作用，從而形成緊密連接。特異性密連蛋白-密連蛋白相互作用及密連蛋白EC序列為離子選擇性及緊密連接強度的關鍵決定因素(例如參見Nakano等人，2009,PMID：19696885)。通常，EC1的大小為約50-60個胺基酸，在較大的W-X(17-22)-W-X(2)-C-X(8-10)-C基元內含有保守二硫鍵，且含有多個參與離子通道形成之帶電殘基(Turksen及 Troy,2004,PMID：15159449)。EC2比EC1小，為大約25個胺基酸。由於其螺旋-轉角-螺旋構形，已提出EC2有助於在相對的細胞膜上形成密連蛋白二聚物或多聚物，但兩個環中之突變會干擾複合物形成。視所涉及的具體密連蛋白而定，活體外密連蛋白-密連蛋白複合物之大小可在二聚物至六聚物範圍內(Krause等人，2008,PMID：18036336)。個別密連蛋白顯示一系列組織特異性表現模式，以及由發育調節的表現，如藉由PCR分析所測定(Krause等人，2008,PMID：18036336；Turksen,2011,PMID：21526417)。
序列分析可用以構築密連蛋白家族成員之譜系樹，指出蛋白質序列之親緣關係及程度(圖1A)。舉例而言，可以看出，CLDN6與CLDN9蛋白質密切相關，其基因在染色體位置16p3.3中處於相鄰的頭對頭位置，說明其為祖先基因複製。此等相似性可能解釋此等家族成員異型相互作用之能力。類似地，根據序列分析，CLDN3及CLDN4蛋白質密切相關，且可發現其基因在染色體位置7r11.23前後排列。在某些家族成員之間EC1或EC2環中之高同源性(例如圖1B)提供了研發可與各種密連蛋白家族成員發生多重反應的抗體的機會。
CLDN6亦稱為斯卡林(skullin)，為由發育調節的密連蛋白。代表性CLDN6蛋白質直系同源物包括(但不限於)人類(NP_067018)、黑猩猩(XP_523276)、恆河猴(NP_001180762)、小鼠(NP_061247)及大鼠(NP_001095834)。在人類中，CLDN6基因由2個外顯子組成，跨度為約3.5kBp，在染色體位置16p13.3處。CLDN6基因座之轉錄產生成熟1.4kB mRNA轉錄物(NM_021195)，其編碼219個胺基酸的蛋白質(NP_061247)。CLDN6在註定用於上皮細胞的ES細胞衍生物中(Turksen 及Troy,2001,PMID：11668606)、在胎皮中(Morita等人，2002,PMID：12060405)及在表層之上基部水準中(Turkson及Troy,2002,PMID：11923212)表現。其亦在發育中的小鼠腎臟中表現(Abuazza等人，2006,PMID：16774906)，但在成年腎臟中未偵測到(Reyes等人，2002,PMID：12110008)。CLDN6與CLDN1及CLDN9一起，亦為C型肝炎病毒之共同受體(Zheng等人，2007,PMID：17804490)。
CLDN9為與CLDN6最密切相關的家族成員。代表性CLDN9蛋白質直系同源物包括(但不限於)人類(NP_066192)、黑猩猩(XP_003314989)、恆河猴(NP_001180758)、小鼠(NP_064689)及大鼠(NP_001011889)。在人類中，CLDN9基因由單個外顯子組成，跨度為約2.1kBp，在染色體基因座16p13.3處。無內含子的CLDN9基因座之轉錄產生2.1kB mRNA轉錄物(NM_020982)，其編碼217個胺基酸的蛋白質(NP_0066192)。CLDN9在內耳(Kitarjiri等人，2004,PMID：14698084；Nankano等人，2009,PMID：19696885)、角膜(Ban等人，2003,PMID：12742348)、肝臟(Zheng等人，2007,PMID：17804490)及發育中的腎臟(Abuazza等人，2006,PMID：16774906)之各種結構中表現。與其在耳蝸中之表現一致，表現含誤義突變之CLDN9蛋白質之動物顯示聽覺缺陷，此可能歸因於伴隨著對於聲音偵測中所參與的毛細胞之去極化至關重要的離子電流之擾動，旁細胞K+滲透性更改。CLDN9在內耳細胞中之表現特異性定位於在由其他密連蛋白形成之較頂端緊密連接股下面的亞域，說明正常組織中並非所有密連蛋白皆發現於最頂端且可及的緊密連接中(Nankano等人，2009,PMID：19696885)。與耳蝸中之結果相反，表現誤義CLDN9之小鼠未顯示出肝臟或腎臟缺陷跡象(Nankano等人，2009,PMID：19696885)。
CLDN4亦稱為產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)腸毒素受體，此係歸因於其對此負責食物中毒及其他胃腸疾病之毒素的高結合親和力。代表性CLDN4蛋白質直系同源物包括(但不限於)人類(NP_001296)、黑猩猩(XP_519142)、恆河猴(NP_001181493)、小鼠(NP_034033)及大鼠(NP_001012022)。在人類中，無內含子CLDN4基因之跨度為約1.82kBp，在染色體位置17q11.23處。CLDN4基因座之轉錄產生1.82kB mRNA轉錄物(NM_001305)，其編碼209個胺基酸的蛋白質(NP_001296)。與CLDN4結合由胃腸病原體產生之毒素的能力一致，可以在整個腸胃道中以及在前列腺、膀胱、乳房及肺中偵測到CDLN4表現(Rahner等人，2001,PMID：11159882；Tamagawa等人，2003,PMID：12861044；Wang等人，2003,PMID：12600828；Nichols等人，2004,PMID：14983936)。
雖然密連蛋白對正常組織之功能及穩定很重要，但腫瘤細胞經常展現異常的緊密連接功能。此可能與由於腫瘤細胞之反分化所致的密連蛋白之失調表現及/或定位或迅速生長的癌組織有效吸收血管形成異常之腫瘤塊內之營養物的要求有關(Morin,2005,PMID：16266975)。個別密連蛋白家族成員可在某些癌症類型中上調，但在其他癌症類型中下調。舉例而言，CLDN3及CLDN4表現在某些胰臟癌、乳癌及卵巢癌中升高，但可低於其他乳癌(例如，“低密連蛋白”癌)中。密連蛋白可為抗體藥物結合物(ADC)之尤佳標靶，因為已知密連蛋白經歷內飲作用，一些密連蛋白之轉換時間相對於其他膜蛋白而言較短(Van Itallie等人，2004,PMID：15366421)，所以密連蛋白表現在癌細胞中失調且腫瘤細胞中之緊密連接結構在癌細胞中遭到破壞。此等性質可以為抗體結合贅生組織而非正常組 織中之密連蛋白提供更多機會。雖然對個別密連蛋白具有特異性的抗體可為適用的，但亦可能多反應性密連蛋白抗體更可能促進將有效負載傳遞至更廣泛的患者群體。特定言之，多反應性密連蛋白抗體由於較高的聚集抗原密度，所以可以允許更有效地靶向表現多個密連蛋白之細胞，降低具有任何個別密連蛋白之低抗原表現量的腫瘤細胞逃逸的可能性，且如在以下表現實例中可以看出，單一ADC的治療適應症之數目擴大。
II. 癌症幹細胞
根據本發明模型，腫瘤包含非致瘤細胞及致瘤細胞。非致瘤細胞不具有自我更新能力且不能可再現地形成腫瘤，即使以過量的細胞數目移植至免疫功能不全小鼠中亦如此。致瘤細胞在本文中亦稱為「腫瘤起始細胞」(TIC)，其通常構成腫瘤細胞群體中0.01-10%的分率，具有形成腫瘤的能力。對於造血惡性病而言，TIC可以非常稀少，在1：104至1：107範圍內，尤其在急性骨髓惡性病(AML)中；或者非常豐富，例如在B細胞系的淋巴瘤中。致瘤細胞涵蓋腫瘤永生化細胞(TPC)與腫瘤祖細胞(TProg)，腫瘤永生化細胞(TPC)可互換地稱為癌症幹細胞(CSC)。
CSC與支持正常組織中之細胞層次的正常幹細胞一樣，能夠無限地自我複製，同時維持多譜系分化的能力。就此而言，CSC能夠產生致瘤後代與非致瘤後代且能夠完整地再現親代腫瘤之非均質細胞組成，如少數的經分離CSC連續分離及移植至免疫功能不全小鼠中所證明。證據表明，除非消除此等「種子細胞(seed cell)」，否則腫瘤很有可能轉移或復發，導致疾病復發及最終進展。
TProg與CSC一樣，具有促進初始移植中之腫瘤生長的能力。然而，不同於CSC，其不能再現親代腫瘤之細胞非均質性且在隨後移植中再引發 腫瘤發生時不太有效，原因為TProg通常僅能夠發生有限次數的細胞分裂，如少數的高度純化TProg連續移植至免疫功能不全小鼠中所證明。TProg可進一步分成早期TProg及晚期TProg，此可根據表型(例如細胞表面標記物)及其再現腫瘤細胞架構的不同能力來區分。雖然兩者均不能以與CSC相同的程度再現腫瘤，但早期TProg再現親代腫瘤特徵的能力大於晚期TProg。儘管存在前述不同，但已顯示，一些TProg群體可在罕見的情形下獲得通常歸因於CSC之自我更新能力且自身可變成CSC。
相比於以下各者，CSC展現較高致瘤性且往往相對較為靜息：(i)TProg(早期TProg與晚期TProg)；及(ii)非致瘤細胞，諸如終末分化腫瘤細胞及腫瘤浸潤性細胞，例如纖維母細胞/基質、內皮及造血細胞，其可來源於CSC且通常包含腫瘤塊。由於習知療法及方案大部分設計成使腫瘤塊消退及攻擊快速增殖性細胞，因此CSC對習知療法及方案的耐藥性大於更快速增殖的TProg及其他塊體腫瘤細胞群體，諸如非致瘤細胞。可使CSC對習知療法產生相對耐化學性的其他特徵為耐多藥性轉運蛋白之表現增強、DNA修補機制及抗細胞凋亡基因表現的增強。旨在使患有晚期贅瘤之患者中產生持續反應之標準治療方案的失敗涉及此類CSC特性，原因在於標準化學療法不能有效地靶向實際上促進持續腫瘤生長及復發的CSC。
已出人意料地發現，CLDN表現以使得其對治療敏感之方式與各種致瘤細胞亞群相關，如本文所闡述。本發明提供抗CLDN抗體，其可特別適用於靶向致瘤細胞且可用於靜默、致敏、中和、降低頻率、阻斷、廢止、干擾、減少、阻礙、限制、控制、耗乏、緩和、介導、減輕、再程式化、消除、殺死或以其他方式抑制(統稱為「抑制」)致瘤細胞，藉此促進增生 性病症(例如癌症)之治療、管理及/或預防。有利地，本發明之抗CLDN抗體可選擇成其在投與至個體後較佳降低致瘤細胞之頻率或致瘤性，不論CLDN決定子之形式如何(例如表型或基因型)。致瘤細胞頻率的降低可作為以下結果而發生：(i)抑制或根除致瘤細胞；(ii)控制致瘤細胞的生長、擴增或復發；(iii)中斷致瘤細胞的起始、繁殖、維持或增殖；或(iv)以其他方式阻礙致瘤細胞的存活、再生及/或轉移。在一些實施例中，致瘤細胞的抑制可作為一或多種生理學路徑變化的結果而發生。路徑的變化，不論係藉由致瘤細胞的抑制或消除、其潛在性的修改(例如誘導性分化或小生境破壞)或以其他方式干擾致瘤細胞影響腫瘤環境或其他細胞的能力，均允許藉由抑制腫瘤形成、腫瘤維持及/或轉移及復發而使CLDN相關病症得到更有效的治療。此外應瞭解，所揭示之抗體的相同特徵使得其在治療已證明對標準治療方案具耐藥性或難治性的復發性腫瘤時特別有效。
可用於評估致瘤細胞頻率降低的方法包括(但不限於)細胞學或免疫組織化學分析，較佳為活體外或活體內限制稀釋法分析(Dylla等人，2008,PMID：PMC2413402及Hoey等人，2009,PMID：19664991)。
活體外限制稀釋法分析可藉由在促進群落形成之固體培養基上培養經分級分離或未經分級分離之腫瘤細胞(例如分別來自經處理之腫瘤及未處理之腫瘤)且對生長的群落計數及表徵來進行。或者，腫瘤細胞可在含有液體培養基之孔盤上連續稀釋且各孔可在接種之後的任何時間、但較佳為接種之後超過10天，根據群落形成呈陽性或陰性來評分。
活體內限制稀釋法如下進行：將來自未處理對照或來自暴露於所選治療劑之腫瘤的腫瘤細胞經連續稀釋而移植於免疫功能不全小鼠中且隨後根據腫瘤形成呈陽性或陰性來對各小鼠評分。評分可在所植入腫瘤可偵測 的任何時間進行，但較佳在移植之後的60天或超過60天進行。測定致瘤細胞頻率之限制稀釋法實驗的結果分析較佳使用泊松分佈統計學(Poisson distribution statistics)進行或評估預定義之決定性事件的頻率，諸如活體內產生或不產生腫瘤的能力(Fazekas等人，1982,PMID：7040548)。
亦可利用流動式細胞測量術及免疫組織化學測定致瘤細胞頻率。兩種技術均使用一或多種抗體或試劑結合此項技術中所識別之已知可富集致瘤細胞的細胞表面蛋白質或標記物(參見WO 2012/031280)。如此項技術中所知，亦可使用流動式細胞測量術(例如螢光活化細胞分選(FACS))表徵、分離、純化、富集或分選各種細胞群體，包括致瘤細胞。流動式細胞測量術係藉由使其中懸浮有混合細胞群體之液流傳遞通過能夠每秒量測多達數千粒子之物理及/或化學特徵的電子偵測設備來量測致瘤細胞含量。免疫組織化學提供其他資訊，其藉由用結合至致瘤細胞標記物的經標記抗體或試劑給組織樣品染色而實現原位(例如組織切片中)致瘤細胞的可視化。
因而，本發明抗體可經由諸如流動式細胞測量術、磁性活化細胞分選(MACS)、雷射介導性切片或FACS之方法而適用於鑑別、表徵、監測、分離、切片或富集致瘤細胞群體或亞群。FACS為用於根據特定細胞表面標記物、以超過99.5%之純度分離細胞亞群的可靠方法。用於表徵及操縱致瘤細胞(包括CSC)的其他相容技術可見於例如U.S.P.N.12/686,359、12/669,136及12/757,649中。
以下所列為已與CSC群體結合且已用於分離或表徵CSC的標記物：ABCA1、ABCA3、ABCB5、ABCG2、ADAM9、ADCY9、ADORA2A、ALDH、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、 C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD117、CD123、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD33、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CD96、CEACAM6、CELSR1、CLEC12A、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、核心蛋白聚糖(decorin)、easyh1、easyh2、EDG3、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、HAVCR2、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、NANOG、NB84、NES、NID2、NMA、NPC1、OSM、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、SMARCA3、SMARCD3、SMARCE1、SMARCA5、SOX1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、TFRC、TRKA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1及CTNNB1。參見例如Schulenburg等人，2010,PMID：20185329；U.S.P.N.7,632,678及U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416及2011/0020221。
類似地，與某些腫瘤類型之CSC結合的細胞表面表型之非限制性實例包括CD44hiCD24低、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38-、 CD44+CD24-、CD46hiCD324+CD66c-、CD133+CD34+CD10-CD19-、CD138-CD34-CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1 hiCD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及此項技術中已知的其他CSC表面表型。參見例如Schulenburg等人，2010，同上文獻；Visvader等人，2008,PMID：18784658；及U.S.P.N.2008/0138313。就本發明而言，包含實體腫瘤中之CD46hiCD324+表型及白血病中之CD34+CD38-的CSC製劑備受關注。
「陽性」、「低」及「陰性」表現量當其應用於標記物或標記物表型時定義如下。具有陰性表現(亦即「-」)的細胞在本文中定義為表現小於或等於同型對照抗體在完全抗體染色混合物存在下、在螢光通道中所觀測到之表現之95%的彼等細胞，該完全抗體染色混合物用於標記存在於其他螢光發射通道中所關注之其他蛋白質。熟習此項技術者將瞭解，用於定義陰性事件的此程序稱為「螢光減一」或「FMO」染色。表現大於使用同型對照抗體、使用上述FMO染色程序所觀測到之表現之95%的細胞在本文中定義為「陽性」(亦即「+」)。如本文所定義，存在廣泛定義為「陽性」的各種細胞群體。若抗原表現平均觀測值大於如上文所述使用同型對照抗體、使用FMO染色所測定的95%，則細胞定義為呈陽性。若平均表現觀測值大於藉由FMO染色所測定的95%且在95%之一個標準差內，則該等陽性細胞可稱為低表現細胞(亦即「lo」)。或者，若平均表現觀測值大於藉由FMO染色所測定的95%且比95%高出超過一個標準差，則該等陽性細胞可稱為高表現細胞(亦即「hi」)。在其他實施例中，較佳可使用99%作為陰性FMO染色與陽性FMO染色之間的分界點且在一些實施例中，百分比可大於99%。
CD46hiCD324+或CD34+CD38-標記物表型及上文剛剛舉例說明的彼等物可聯合標準流動式細胞測量術分析及細胞分選技術使用以表徵、分離、純化或富集TIC及/或TPC細胞或細胞群體以便進一步分析。
本發明抗體降低致瘤細胞頻率的能力因此可使用上述技術及標記物測定。在一些情況下，抗CLDN抗體可使致瘤細胞頻率降低10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其他實施例中，致瘤細胞頻率降低可為約40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些實施例中，所揭示之化合物可使致瘤細胞頻率降低70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。應瞭解，致瘤細胞頻率之任何降低可能引起贅瘤之致瘤性、持久性、復發性及侵襲性的相應降低。
III. 抗體 A. 抗體結構
抗體及其變異體及衍生物(包括公認命名及編號系統)例如在Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology(第6版)，W.B.Saunders Company；或Murphey等人(2011),Janeway's Immunobiology(第8版)，Garland Science中已有廣泛描述。
「抗體」或「完整抗體」通常指Y形四聚蛋白質，其包含藉由共價二硫鍵及非共價相互作用結合在一起的兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L)多肽鏈。各輕鏈由一個可變域(VL)及一個恆定域(CL)組成。各重鏈包含一個可變域(VH)及恆定區，在IgG、IgA及IgD抗體的情況下，恆定區包含三個域，稱為CH1、CH2及CH3(IgM及IgE具有第四域CH4)。在IgG、IgA及IgD類別中，CH1及CH2域藉由彈性鉸鏈區隔開，彈性鉸鏈區為長度可變(在各種IgG子類中為約10至約60個胺基酸)之富含脯胺酸及半胱胺酸的區 段。輕鏈與重鏈中之可變域藉由約12個或更多個胺基酸之「J」區與恆定域連接且重鏈亦具有約10個額外胺基酸之「D」區。各類抗體進一步包含由成對半胱胺酸殘基形成的鏈間及鏈內二硫鍵。
如本文所用，術語「抗體」包括多株抗體(polyclonal antibodies)、多株抗體(multiclonal antibodies)、單株抗體、嵌合抗體、人類化及靈長類化抗體、CDR移植抗體、人類抗體(包括重組產生的人類抗體)、重組產生的抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體；合成抗體，包括突變蛋白質及其變異體；免疫特異性抗體片段，諸如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段、單鏈片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物及其他修飾，及任何其他免疫反應性分子，只要其展現與決定子的優先締合或結合。此外，除非上下文限制條件另有指示，否則該術語進一步包含抗體的所有類別(亦即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有子類(亦即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。對應於抗體之不同類別的重鏈恆定域通常分別藉由相應小寫希臘字母α、δ、ε、γ及μ指示。來自任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可基於其恆定域的胺基酸序列而歸為兩種明顯不同類型之一，稱為kappa(κ)及lambda(λ)。
抗體可變域在胺基酸組成方面在不同抗體中顯示出相當大的差異且主要負責抗原識別及結合。各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得完整IgG抗體具有兩個結合位點(亦即其為二價的)。VH及VL域包含三個極端可變區，稱為高變區，或更通常稱為互補決定區(CDR)，該等可變區由四個不大變化的區域(稱為構架區(FR))框住且隔開。VH與VL區之間的非共價結合形成Fv片段(「可變片段」)，其含有抗體之兩個抗原結合 位點之一。
除非另外指出，否則如本文所用，可以根據以下所提供之方案之一將胺基酸分配至各域、構架區及CDR：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版)，美國健康及人類服務部(US Dept.of Health and Human Services),PHS,NIH,NIH出版號91-3242；Chothia等人，1987,PMID：3681981；Chothia等人，1989,PMID：2687698；MacCallum等人，1996,PMID：8876650；或Dubel編(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies，第3版，Wily-VCH Verlag GmbH and Co；或AbM(Oxford Molecular/MSI藥典)。如此項技術中所熟知，可變區殘基編號通常如Chothia或Kabat所闡述。如自Abysis網站資料庫(見下文)獲得之包含如根據Kabat、Chothia、MacCallum(亦稱為接觸)及AbM所定義之CDR的胺基酸殘基闡述於下表1中。應注意，MacCallum使用Chothia編號系統。
抗體序列中之可變區及CDR可根據此項技術中已開發的通用規則(如上文所述，諸如Kabat編號系統)或藉由將序列針對已知可變區之資料庫比對來鑑別。用於鑑別此等區域之方法描述於Kontermann及Dubel編，Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001及Dinarello等人，Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken, NJ,2000中。抗體序列之例示性資料庫描述於「Abysis」網站www.bioinf.org.uk/abs(由A.C.Martin,Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London,London,England維護)及VBASE2網站www.vbase2.org(如Retter等人，Nucl.Acids Res.,33(資料庫期刊)：D671-D674(2005)中所述)中，且可經由此等網站存取。
較佳使用Abysis資料庫分析序列，該資料庫整合了來自Kabat、IMGT及蛋白質資料庫(PDB)的序列資料及來自PDB的結構資料。參見Andrew C.R.Martin之著作章節Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.Antibody Engineering Lab Manual(Duebel,S.及Kontermann編，R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13：978-3540413547，亦可在網站bioinforg.uk/abs上獲得)。Abysis資料庫網站進一步包括已開發的用於鑑別可根據本文中之教示內容使用的CDR的通用規則。本文隨附的圖2E至圖2H在SC27.1、SC27.22及SC27.108及SC27.204鼠抗體之例示性重鏈及輕鏈可變區之註釋中顯示此類分析的結果。除非另外指明，否則本文所闡述之所有CDR均根據Abysis資料庫網站、根據Kabat等人獲得。
就本發明中所論述之重鏈恆定區胺基酸位置而言，編號係根據首次描述於Edelman等人，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1)：78-85中的Eu索引進行，其描述骨髓瘤蛋白質Eu(據報導為第一個定序的人類IgG1)之胺基酸序列。Edelman之Eu索引亦闡述於Kabat等人，1991(同上文獻)。因此，術語「如Kabat中所闡述之Eu索引」或「Kabat之Eu索引」或「Eu索引」或「Eu編號」在重鏈之情況下係指基於Edelman等人之人類IgG1 Eu抗體的殘基編號系統，如Kabat等人，1991(同上文獻)中所闡述。 輕鏈恆定區胺基酸序列所用的編號系統類似地闡述於Kabat等人，(同上文獻)中。與本發明相容的例示性κ輕鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO：4所闡述且與本發明相容的例示性λ輕鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO：7所闡述。類似地，與本發明相容的例示性IgG1重鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO：1所闡述。
所揭示之恆定區序列或其變異體或衍生物可使用標準分子生物學技術與所揭示之重鏈及輕鏈可變區可操作地聯結，以提供本身可使用或併入本發明之抗CLDN ADC中的全長抗體。
免疫球蛋白分子中存在兩種類型的二硫橋或二硫鍵：鏈間二硫鍵及鏈內二硫鍵。如此項技術中所熟知，鏈間二硫鍵的位置及數目根據免疫球蛋白類別及物種而變化。雖然本發明不限於抗體的任何特定類別或子類，但出於說明之目的，本發明通篇中將使用IgG1免疫球蛋白。在野生型IgG1分子中，存在十二個鏈內二硫鍵(四個位於各重鏈上且兩個位於各輕鏈上)及四個鏈間二硫鍵。鏈內二硫鍵一般受到某種程度的保護且相對於鏈間鍵而言不易發生還原。反之，鏈間二硫鍵位於免疫球蛋白表面上，溶劑易接近且通常相對容易發生還原。重鏈之間存在兩個鏈間二硫鍵且各重鏈與其相應輕鏈之間存在一個鏈間二硫鍵。已證明鏈間二硫鍵並非鏈結合必不可少的。IgG1鉸鏈區在重鏈中含有半胱胺酸，其形成鏈間二硫鍵，從而提供結構支撐以及促進Fab移動的彈性。重鏈/重鏈IgG1鏈間二硫鍵位於殘基C226及C229(Eu編號)，而IgG1之輕鏈與重鏈(重鏈/輕鏈)之間的IgG1鏈間二硫鍵係在κ或λ輕鏈之C214與重鏈之上部鉸鏈區中之C220之間形成。
B. 抗體產生及製造
本發明抗體可使用此項技術中已知之多種方法製備。
1. 在宿主動物中產生多株抗體
在各種宿主動物中產生多株抗體在此項技術中為熟知的(參見例如Harlow及Lane(編)(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press；及Harlow等人(1989)Antibodies,NY,Cold Spring Harbor Press)。為產生多株抗體，具有免疫能力的動物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、非人類靈長類動物等)經抗原性蛋白質或包含抗原性蛋白質的細胞或製劑免疫。一段時間之後，藉由將動物放血或處死來獲得含有多株抗體之血清。可以自動物獲得的形式使用血清或可部分地或完全地純化抗體以提供免疫球蛋白部分或經分離抗體製劑。
就此而言，本發明抗體可由誘導具有免疫能力的動物中產生免疫反應的任何CLDN決定子產生。如本文所用，「決定子」或「標靶」意謂與特定細胞、細胞群體或組織可鑑別地關聯或特異性地存在於特定細胞、細胞群體或組織中或特異性地存在於特定細胞、細胞群體或組織上的任何可偵測特性、性質、標記物或因子。決定子或標靶可具有形態、功能或生物化學性質且較佳具有表型。在較佳實施例中，決定子為特定細胞類型或細胞在某些條件下(例如在細胞週期之特定時刻期間或特定小生境下之細胞)差異表現(過度表現或表現不足)的蛋白質。出於本發明之目的，決定子較佳差異表現於異常癌細胞上且可以包含CLDN蛋白質，或其剪接變異體、同功異型物、同源物或家族成員、或其特定域、區域或抗原決定基中之任一者。「抗原」、「免疫原性決定子」、「抗原決定子」或「免疫原」意謂當引入具有免疫能力的動物中時可刺激免疫反應且由免疫反應產生的抗體識別的任何CLDN蛋白質或其任何片段、區域或域。本文中所涵蓋之CLDN 決定子的存在或不存在可用於鑑別細胞、細胞亞群或組織(例如腫瘤、致瘤細胞或CSC)。
可使用任何形式的抗原或含有抗原的細胞或製劑產生對CLDN決定子具有特異性的抗體。如本文所闡述，術語「抗原」係在寬泛的意義上使用且可以包含所選標靶的任何免疫原性片段或決定子，包括單個抗原決定基、多個抗原決定基、單個域或多個域，或完整細胞外域(ECD)或蛋白質。抗原可為經分離之全長蛋白質、細胞表面蛋白質(例如經由在表面上表現抗原之至少一部分的細胞免疫)，或可溶蛋白質(例如僅經由蛋白質之ECD部分免疫)或蛋白質構築體(例如Fc-抗原)。可在經基因修飾之細胞中產生抗原。可單獨或與此項技術中已知的一或多種免疫原性增強佐劑組合使用任何前述抗原。編碼抗原的DNA可為基因組DNA或非基因組DNA(例如cDNA)且可編碼足以引起免疫原性反應的ECD之至少一部分。可使用將表現抗原之細胞轉型的任何載體，包括(但不限於)腺病毒載體、慢病毒載體、質體及非病毒載體，諸如陽離子脂質。
2. 單株抗體
在所選實施例中，本發明涵蓋單株抗體之使用。如此項技術中已知，術語「單株抗體」或「mAb」係指自大體上均勻的抗體群體獲得的抗體，亦即構成該群體之個別抗體除了可能少量存在的可能突變(例如天然存在的突變)之外其他方面相同。
單株抗體可使用此項技術中已知之各種技術製備，包括融合瘤技術、重組技術、噬菌體呈現技術、轉殖基因動物(例如XenoMouse®)或其某種組合。舉例而言，可以使用融合瘤及生化及基因工程改造技術產生單株抗體，諸如更詳細地描述於以下中：An,Zhigiang(編)Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic,John Wiley and Sons，第1版2009；Shire等人(編)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC，第1版2010；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。特異性結合至決定子之多種單株抗體產生之後，可經由各種篩選方法、基於例如其對決定子的親和力或內化速率來選擇特別有效的抗體。如本文所述產生的抗體可用作「源」抗體且進一步經修飾以例如改良對標靶的親和力、改良其在細胞培養物中的產生、降低活體內免疫原性、產生多特異性構築體等。單株抗體製造及篩選之更詳細說明闡述於下文及所附實例中。
3. 人類抗體
「抗體」係指具有與人類所產生之抗體對應的胺基酸序列及/或使用用於製造下述人類抗體的任何技術製得的抗體。
可使用此項技術中已知之各種技術來產生人類抗體。一種技術為噬菌體呈現，其中在噬菌體上合成(較佳人類)抗體文庫，利用相關抗原或其抗體結合部分篩選文庫，且分離出結合抗原的噬菌體，利用其可獲得免疫反應性片段。用於製備及篩選此類文庫的方法為此項技術中熟知的且用於產生噬菌體呈現文庫的套組可市購(例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌體呈現套組，目錄號240612)。亦存在可用於產生及篩選抗體呈現文庫的其他方法及試劑(參見例如U.S.P.N.5,223,409；PCT公開案第WO 92/18619號、第WO 91/17271號、第WO 92/20791號、第WO 92/15679號、第WO 93/01288號、第WO 92/01047號、第WO 92/09690號；及Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991))。
在一個實施例中，重組人類抗體可藉由篩選如上所製備之重組組合抗體文庫來分離。在一個實施例中，文庫為scFv噬菌體呈現文庫，該文庫係使用自B細胞分離之mRNA所製備的人類VL及VH cDNA產生。
藉由初始文庫(天然的或合成的)產生的抗體可以具有中等親和力(約106至107M-1之Ka)，但亦可藉由構築第二文庫及自第二文庫再選擇來活體外模擬親和力成熟，如此項技術中所述。舉例而言，可藉由使用易錯聚合酶活體外隨機引入突變(Leung等人，Technique,1：11-15(1989)中所報導)。另外，親和力成熟可如下進行：使所選個別Fv純系中的一或多個CDR發生隨機突變，例如使用PCR，使用攜帶跨越相關CDR之隨機序列的引子，且篩選較高親和力純系。WO 9607754描述一種誘導免疫球蛋白輕鏈之CDR發生突變以產生輕鏈基因文庫的方法。另一種有效方法為將藉由噬菌體呈現所選的VH或VL域與獲自未免疫供體之天然存在之V域變異體之譜系重組且在數輪鏈改組中篩選較高親和力，如Marks等人，Biotechnol.,10：779-783(1992)中所述。此技術允許產生解離常數KD(koff/kon)為約10-9M或更小的抗體及抗體片段。
在其他實施例中，可採用類似程序，使用包含真核細胞(例如酵母)的文庫，該等真核細胞在其表面上表現結合對。參見例如U.S.P.N.7,700,302及U.S.S.N.12/404,059。在一個實施例中，人類抗體係選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人Nature Biotechnology 14：309-314(1996)；Sheets等人Proc.Natl.Acad.Sci. USA 95：6157-6162(1998))。在其他實施例中，可自諸如酵母之真核細胞中產生的組合抗體文庫分離出人類結合對。參見例如U.S.P.N.7,700,302。此類技術有利地允許篩選大量候選調節劑且對候選序列提供相對容易的操縱(例如根據親和力成熟或重組改組)。
人類抗體亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物中來製備，該等轉殖基因動物例如內源性免疫球蛋白基因已部分地或完全地不活化且已引入人類免疫球蛋白基因的小鼠。攻擊後，觀察到有人類抗體產生，其在所有方面與在人類中所見極其類似，包括基因重排、組裝及抗體譜系。此方法描述於例如關於XenoMouse®技術的U.S.P.N.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016及U.S.P.N.6,075,181及6,150,584；及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)中。或者，可經由產生針對靶抗原之抗體之人類B淋巴細胞之不朽化來製備人類抗體(此類B淋巴細胞可自罹患贅生性病症之個體回收或可能已活體外免疫)。參見例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol,147(1)：86-95(1991)；及U.S.P.N.5,750,373。
無論來源如何，應瞭解人類抗體序列可使用此項技術已知的分子工程改造技術製造且引入表現系統及宿主細胞中，如本文所述。此類非天然重組產生的人類抗體(及本發明組合物)與本發明之教示內容完全相容且明確屬於本發明之範疇內。在某些選擇態樣中，本發明的CLDN ADC將包含重組產生的人類抗體充當細胞結合劑。
4. 衍生抗體：
如上文所述產生、選擇且分離源抗體之後，可進一步更改源抗體以 提供具有改良之醫藥特徵的抗CLDN抗體。源抗體較佳使用已知分子工程改造技術修飾或更改以提供具有所要治療特性的衍生抗體。
5. 嵌合及人類化抗體
本發明之所選實施例包含免疫特異性結合至CLDN且可視為「源」抗體的鼠單株抗體。在所選實施例中，本發明抗體可衍生自此類「源」抗體，視情況對源抗體之恆定區及/或結合抗原決定基之胺基酸序列進行修飾。在某些實施例中，若源抗體中之所選胺基酸經由缺失、突變、取代、整合或組合發生更改，則抗體「衍生」自該源抗體。在另一實施例中，「衍生」抗體為源抗體之片段(例如一或多個CDR或域或完整重鏈及輕鏈可變區)與受體抗體序列組合或併入受者抗體序列中以提供衍生抗體(例如嵌合、CDR移植或人類化抗體)的抗體。此等「衍生」抗體可使用來自產抗體細胞的遺傳物質及如下所述的標準分子生物技術產生，諸如改良決定子的親和力；改良抗體穩定性；改良細胞培養物中的產生及產量；減少活體內免疫原性；降低毒性；促進活性部分結合；或產生多特異性抗體。此類抗體亦可經由化學方式或轉譯後修飾法修飾成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)而自源抗體衍生。
在一個實施例中，本發明抗體包含由已共價連接之來自至少兩種不同物種或類別之抗體之蛋白質區段衍生的嵌合抗體。術語「嵌合」抗體係針對重鏈及/或輕鏈之一部分與來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之對應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與來自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之對應序列一致或同源的構築體，以及此類抗體之片段(U.S.P.N.4,816,567)。在一些實施例中，本發明之嵌合抗體可包含可操作地連接至人類輕鏈及重鏈恆定區之所選鼠類重鏈及輕鏈可變 區的全部或大部分。在其他所選實施例中，抗CLDN抗體可「衍生」自本文所揭示之小鼠抗體且包含小於完整的重鏈及輕鏈可變區。
在其他實施例中，本發明之嵌合抗體為「CDR移植」抗體，其中CDR(如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定義)衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類，而抗體之其餘部分基本上衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體。用於人類時，可將一或多個所選嚙齒動物CDR(例如小鼠CDR)移植至人類受者抗體中，替換人類抗體之天然存在之CDR中之一或多者。此等構築體一般具有提供全部強度之人類抗體功能的優點，例如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，同時減少個體對抗體的不合需要之免疫反應。在一個實施例中，CDR移植抗體將包含一或多個併入人類構架序列中之自小鼠獲得的CDR。
與CDR移植抗體類似的為「人類化」抗體。如本文所用，「人類化」抗體為包含一或多個衍生自一或多種非人類抗體(供者抗體或源抗體)之胺基酸序列(例如CDR序列)的人類抗體(受者抗體)。在某些實施例中，可將「回復突變」引入人類化抗體中，其中接受者人類抗體之可變區之一或多個FR中的殘基經來自非人類物種供者抗體的相應殘基替換。此類回復突變可有助於維持所移植CDR之適當三維組態且藉此改良親和力及抗體穩定性。可以使用來自各種供者物種之抗體，包括(但不限於)小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物。此外，人類化抗體可包含未發現於受者抗體中或供者抗體中的新殘基，例如用於進一步改進抗體效能。包含來自源抗體之鼠類組分及來自受者抗體之人類組分的與本發明相容之CDR移植及人類化抗體可如下文實例中所述提供。
可使用此項技術中公認的各種技術確定使用哪些人類序列作為受者抗體來提供本發明之人類化構築體。相容性人類生殖系序列及判定其作為受者序列之適用性的方法的彙編揭示於例如Dubel及Reichert(編)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today 16：237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J 14：4628-4638中。亦可使用V-BASE目錄(VBASE2-Retter等人，Nucleic Acid Res.33；671-674,2005)鑑別相容性受者序列，V-BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之全面目錄(由Tomlinson,I.A.等人彙編，MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK)。另外，例如U.S.P.N.6,300,064中所述之共同人類構架序列亦可證實為相容性受者序列，可根據本發明之教示內容使用。一般而言，基於與鼠源構架序列之同源性以及對源抗體及受者抗體之CDR典型結構之分析來選擇人類構架受者序列。隨後可使用此項技術中公認之技術合成所衍生抗體之重鏈及輕鏈可變區的衍生序列。
舉例而言，CDR移植及人類化抗體以及相關方法描述於U.S.P.N.6,180,370及5,693,762中。關於其他細節，參見例如Jones等人，1986,(PMID：3713831)；及U.S.P.N.6,982,321及7,087,409。
CDR移植或人類化抗體可變區與人類受者可變區的序列一致性或同源性可如本文中所論述加以測定且照此量測時，較佳共用至少60%或65%序列一致性，更佳至少70%、75%、80%、85%或90%序列一致性，甚至更佳至少93%、95%、98%或99%序列一致性。不一致的殘基位置較佳因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經側鏈(R基)之 化學性質(例如電荷或疏水性)類似之另一胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守胺基酸取代基本上不改變蛋白質之功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列彼此因保守取代而不同的情況下，可上調序列一致性或相似度百分比以根據保守取代性質加以校正。
應瞭解，如所附圖2A及圖2B中提供的帶註釋的CDR及構架序列係使用專有的Abysis資料庫、根據Kabat等人加以定義。然而，如本文中所論述及圖2E至圖2H中所示，熟習此項技術者可根據Chothia等人、ABM或MacCallum等人以及Kabat等人所提供之定義容易地鑑別CDR。因而，包含一或多個根據任一前述系統獲得之CDR的抗CLDN人類化抗體明確涵蓋於本發明範疇內。
4.2. 位點特異性抗體
本發明抗體可經工程改造以促進與細胞毒素或其他抗癌劑的結合(如下文更詳細論述)。就細胞毒素於抗體上之位置及藥物與抗體之比(DAR)而言，抗體藥物結合物(ADC)製劑包含均質ADC分子群體為有利的。熟習此項技術者根據本發明可容易製造如本文所述的位點特異性工程改造構築體。如本文所用，「位點特異性抗體」或「位點特異性構築體」意謂如下抗體或其免疫反應性片段，其中重鏈或輕鏈中之至少一個胺基酸缺失、更改或取代(較佳經另一胺基酸取代)，得到至少一個游離半胱胺酸。類似地，「位點特異性結合物」應意謂包含位點特異性抗體及至少一種與不成對或游離半胱胺酸結合的細胞毒素或其他化合物(例如報導分子)的ADC。在某些實施例中，不成對半胱胺酸殘基將包含不成對鏈內半胱胺酸殘基。在其他實施例中，游離半胱胺酸殘基將包含不成對鏈間半胱胺酸殘基。在其他實施例中，游離半胱胺酸可經工程改造至抗體胺基酸序列中(例如 CH3域中)。在任何情況下，位點特異性抗體皆可具有多種同型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；且在彼等類別內，抗體可具有多種子類，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。對於IgG構築體而言，抗體輕鏈可包含各自併入有C214的κ或λ同型，在所選實施例中，C214可因IgG1重鏈中缺乏C220殘基而為不成對的。
因此，除非上下文另有指示，否則如本文所用，術語「游離半胱胺酸」或「不成對半胱胺酸」可互換使用且應意謂抗體之任何半胱胺酸(或含硫醇)成分(例如半胱胺酸殘基)，不論天然存在或使用分子工程改造技術特定地併入所選殘基位置，在生理學條件下，其不為天然存在(或「原生」)之二硫鍵的一部分。在某些所選實施例中，游離半胱胺酸可包含天然存在之半胱胺酸，其原生鏈間或鏈內二硫橋搭配物已經取代、消除或以其他方式發生使得天然存在之二硫橋在生理條件下分裂的更改，藉此呈現適用於位點特異性結合的不成對半胱胺酸。在其他較佳實施例中，游離或不成對半胱胺酸將包含選擇性地定位於抗體重鏈或輕鏈胺基酸序列內之預定位點的半胱胺酸殘基。應瞭解，在結合之前，游離或不成對半胱胺酸可以如下形式與另一半胱胺酸或硫醇基存在於相同或不同分子上：硫醇(還原的半胱胺酸)、封端的半胱胺酸(經氧化)，或非原生分子內或分子間二硫鍵(經氧化)的一部分，此視系統的氧化態而定。如下文更詳細地論述，適當地經工程改造之抗體構築體的輕度還原將提供可供位點特異性結合使用的硫醇。因此，在尤其較佳的實施例中，游離或不成對半胱胺酸(不論天然存在或併入)經歷選擇性還原及後續結合，得到均質DAR組合物。
應瞭解，所揭示之經工程改造結合物製劑所展現的有利特性至少部分地基於特異性指導結合及在結合位置及組合物之絕對DAR方面極大地 限制所製造結合物的能力加以預測。不同於大部分習知ADC製劑，本發明完全無需依賴於抗體之部分或全部還原來提供隨機結合位點及相對不受控制的DAR物質產生。實情為，在某些態樣中，本發明較佳藉由工程改造靶向抗體以使天然存在(亦即「原生」)之鏈間或鏈內二硫橋鍵中之一或多者分裂或將半胱胺酸殘基引入任何位置來提供一或多個預定的不成對(或游離)半胱胺酸位點。為此目的，應瞭解，在所選實施例中，半胱胺酸殘基可沿著抗體(或其免疫反應性片段)重鏈或輕鏈的任何位置併入或使用標準分子工程改造技術與其附接。在其他較佳實施例，可與非原生半胱胺酸(其則將包含游離半胱胺酸)之引入組合實現原生二硫鍵分裂，該非原生半胱胺酸到時可用作結合位點。
在某些實施例中，經工程改造之抗體包含鏈內或鏈間半胱胺酸殘基中之至少一個胺基酸缺失或取代。如本文所用，「鏈間半胱胺酸殘基」意謂參與抗體輕鏈與重鏈之間或抗體之兩條重鏈之間之原生二硫鍵的半胱胺酸殘基，而「鏈內半胱胺酸殘基」為與同一重鏈或輕鏈中之另一半胱胺酸天然成對的半胱胺酸殘基。在一個實施例中，缺失或經取代的鏈間半胱胺酸殘基參與輕鏈與重鏈之間二硫鍵的形成。在另一實施例中，缺失或經取代的半胱胺酸殘基參與兩條重鏈之間的二硫鍵。在一典型實施例中，由於抗體之互補結構，其中輕鏈與重鏈之VH及CH1域成對且其中一條重鏈之CH2及CH3域與互補重鏈之CH2及CH3域成對，因此輕鏈或重鏈中之單一半胱胺酸的突變或缺失使得經工程改造之抗體中產生兩個不成對的半胱胺酸殘基。
在一些實施例中，鏈間半胱胺酸殘基缺失。在其他實施例中，鏈間半胱胺酸經另一胺基酸(例如天然存在之胺基酸)取代。舉例而言，胺基酸 取代可使得鏈間半胱胺酸經中性殘基(例如絲胺酸、蘇胺酸或甘胺酸)或親水性殘基(例如甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)置換。在所選實施例中，鏈間半胱胺酸經絲胺酸置換。
在本發明所涵蓋的一些實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基位於輕鏈(κ或λ)上，藉此在重鏈上留下游離半胱胺酸。在其他實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基位於重鏈上，從而在輕鏈恆定區上留下游離半胱胺酸。組裝後，應瞭解，完整抗體之輕鏈或重鏈中之單一半胱胺酸的缺失或取代產生具有兩個不成對半胱胺酸殘基的位點特異性抗體。
在一個實施例中，IgG輕鏈(κ或λ)之位置214的半胱胺酸(C214)缺失或經取代。在另一實施例中，IgG重鏈上之位置220的半胱胺酸(C220)缺失或經取代。在其他實施例中，重鏈上之位置226或位置229的半胱胺酸缺失或經取代。在一個實施例中，重鏈上之C220經絲胺酸(C220S)取代，在輕鏈中得到所要的游離半胱胺酸。在另一實施例中，輕鏈中之C214經絲胺酸(C214S)取代，在重鏈中得到所要的游離半胱胺酸。此類位點特異性構築體更詳細地描述於下文實例中。相容位點特異性構築體的概述隨即顯示於下表2中，其中編號通常根據如Kabat中所闡述之EU索引，WT表示無更改的「野生型」或原生恆定區序列且delta(△)表示胺基酸殘基的缺失(例如C214△表示位置214處的半胱胺酸殘基已缺失)。
與本發明之位點特異性構築體相容的例示性經工程改造輕鏈及重鏈恆定區緊接著闡述於下文中，其中SEQ ID NO：2及3分別包含C220S IgG1及C220△IgG1重鏈恆定區，SEQ ID NO：5及6分別包含C214S及C214△κ輕鏈恆定區且SEQ ID NO：8及9分別包含例示性C214S及C214△λ輕鏈恆定區。在各情況下，更改或缺失之胺基酸(連同側接殘基)的位點加底線。
(SEQ ID NO：2)
(SEQ ID NO：3)
(SEQ ID NO：5)
(SEQ ID NO：6)
(SEQ ID NO：8)
(SEQ ID NO：9)
如上文所論述，重鏈及輕鏈變異體中的每一者可操作地與所揭示之重鏈及輕鏈可變區(或其衍生物，諸如人類化或CDR移植構築體)結合，得 到如本文所揭示的位點特異性抗CLDN抗體。此類經工程改造之抗體與所揭示之ADC的用途特別相容。
就引入或添加半胱胺酸殘基以提供游離半胱胺酸(相較於原生二硫鍵分裂)而言，抗體或抗體片段上的相容性位置可容易由熟習此項技術者辨別。因此，在所選實施例中，可將半胱胺酸引入CH1域、CH2域或CH3域或其任何組合中，此視所要DAR、抗體構築體、所選有效負載及抗體標靶而定。在其他較佳實施例中，可將半胱胺酸引入κ或λ CL域中且在尤其較佳的實施例中，引入CL域之C端區域中。在各情況下，鄰近半胱胺酸插入位點的其他胺基酸殘基可加以更改、移除或取代，以促進分子穩定性、結合效率或在有效負載連接後為有效負載提供保護環境。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之任何可達位點。藉由半胱胺酸取代此類表面殘基，從而使反應性硫醇基定位於抗體上之容易接近位點且可如本文中進一步所述選擇性還原。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可達位點處。藉由半胱胺酸取代彼等殘基，從而使反應性硫醇基定位於抗體之可達位點且可用於選擇性結合抗體。在某些實施例中，以下殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(Eu編號)；及重鏈Fc區之S400(Eu編號)。其他取代位置及製造相容性位點特異性抗體之方法闡述於U.S.P.N.7,521,541中，該文獻全文併入本文中。
如本文所揭示用於產生具有定義之位點及化學計量之藥物負載的抗體藥物結合物的策略廣泛適用於所有抗CLDN抗體，因為其主要涉及對抗體之保守恆定域進行的工程改造。由於抗體之各類別及子類之胺基酸序列及原生二硫橋已有大量文獻記載，因此熟習此項技術者無需過度實驗便可 容易製得不同抗體之經工程改造構築體，且相應地，此類構築體明確地涵蓋於本發明範疇內。對於包含如本發明中所闡述之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之全部或一部分的位點特異性構築體而言，這一點尤其正確。
4.3. 恆定區修飾及經更改之糖基化
本發明的所選實施例亦可包含恆定區(亦即Fc區)之取代或修飾，包括(但不限於)胺基酸殘基取代、突變及/或修飾，其使得化合物具有包括(但不限於)以下之較佳特徵：經更改之藥物動力學、延長之血清半衰期、提高之結合親和力、降低之免疫原性、增加之產量、Fc配位體與Fc受體(FcR)之結合更改、增強或降低之ADCC或CDC、經更改之糖基化及/或二硫鍵及經修改之結合特異性。
具有改良之Fc效應功能的化合物可經由例如Fc域與Fc受體(例如FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之間的相互作用中所涉及之胺基酸殘基的改變來產生，從而可增強細胞毒性及/或更改藥物動力學，諸如延長血清半衰期(參見例如Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。
在所選實施例中，活體內半衰期延長的抗體可以藉由修飾(例如，取代、缺失或添加)經鑑定參與Fc域與FcRn受體之間的相互作用的胺基酸殘基產生(參見例如國際公開案第WO 97/34631號；第WO 04/029207號；U.S.P.N.6,737,056及U.S.P.N.2003/0190311)。關於此類實施例，Fc變異體在哺乳動物(較佳為人類)中的半衰期可為大於5天、大於10天、大於15天、較佳大於20天、大於25天、大於30天、大於35天、大於40天、大於45天、大於2個月、大於3個月、大於4個月，或大於5個月。半衰期延長 使得血清效價較高，從而降低抗體投與頻率及/或降低所投與之抗體的濃度。可例如在轉殖基因小鼠或表現人類FcRn之經轉染人類細胞株中或在投與含變異Fc區之多肽的靈長類動物中分析人類FcRn高親和力結合多肽對人類FcRn的活體內結合及血清半衰期。WO 2000/42072描述與FcRn之結合改良或減弱之抗體變異體。亦參見例如Shields等人J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
在其他實施例中，Fc更改可引起ADCC或CDC活性增強或降低。如此項技術中所知，CDC係指靶細胞在補體存在下溶解，且ADCC係指一種細胞毒性形式，其中結合至某些細胞毒性細胞(例如自然殺手細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上所存在之FcR的分泌型Ig使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至攜有抗原的靶細胞且隨後以細胞毒素殺死靶細胞。在本發明之上下文中，抗體變異體具有「更改」之FcR結合親和力，相較於親本或未修飾之抗體或相較於包含原生序列FcR的抗體，抗體變異體的結合增強或減弱。顯示結合減弱的此類變異體可具有極小或不明顯的結合，例如相較於原生序列為0-20%之與FcR之結合，例如如藉由此項技術中熟知的技術所測定。在其他實施例中，相較於原生免疫球蛋白Fc域，變異體將展現增強的結合。應瞭解，此等類型的Fc變異體可有利地用於增強所揭示之抗體的有效抗贅生特性。在又其他實施例中，此類更改引起結合親和力增強、免疫原性降低、產量增加、糖基化及/或二硫鍵更改(例如用於結合位點)、結合特異性修改、吞噬增加；及/或細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。
其他實施例包含一或多個經工程改造之糖型，例如共價連接至蛋白質(例如，Fc域中)的包含更改的糖基化模式或更改的碳水化合物組成的位 點特異性抗體。參見例如Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740。經工程改造之糖型可適用於多種目的，包括(但不限於)增強或降低效應功能、提高抗體對標靶之親和力或促進抗體產生。在期望降低效應功能的某些實施例中，分子可經工程改造以表現去糖基化形式。可促使消除一或多個可變區構架糖基化位點，從而消除該位點之糖基化的取代為熟知的(參見例如U.S.P.N.5,714,350及6,350,861)。反之，藉由工程改造一或多個其他糖基化位點可賦予含Fc分子增強的效應功能或改良之結合。
其他實施例包括具有已更改之糖基化組成的Fc變異體，諸如海藻糖基殘基之量減少的低海藻糖基化抗體或二等分GlcNAc結構增加之抗體。此類經更改之糖基化模式已證明會提高抗體之ADCC能力。經工程改造之糖型可藉由熟習此項技術者已知的任何方法產生，例如藉由使用經工程改造或變異型表現株系、藉由與一或多種酶(例如N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(GnTIII))共表現、藉由在不同生物體或來自不同生物體之細胞株中表現包含Fc區的分子或藉由在包含Fc區的分子已表現之後修飾碳水化合物(參見例如WO 2012/117002)。
4.4. 片段
不論選擇何種形式之抗體(例如嵌合、人類化等)來實施本發明，均應瞭解可根據本文中之教示內容使用其免疫反應性片段本身或將其免疫反應性片段作為抗體藥物結合物的一部分使用。「抗體片段」包含完整抗體之至少一部分。如本文所用，術語抗體分子之「片段」包括抗體之抗原結合片段，且術語「抗原結合片段」係指免疫球蛋白或抗體之多肽片段，其免疫特異性地結合所選抗原或其免疫原性決定子或與所選抗原或其免疫原性 決定子反應或與衍生出片段的完整抗體競爭特異性抗原結合。
例示性位點特異性片段包括：可變輕鏈片段(VL)、可變重鏈片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單域抗體片段、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成的多特異性抗體。另外，活性位點特異性片段包含抗體之一部分，該部分保持與抗原/受質或受體相互作用且以類似於完整抗體之方式對其進行修飾(但效率在某種程度上降低)的能力。此類抗體片段可進一步加以工程改造以包含如本文所述的一或多個游離半胱胺酸。
在其他實施例中，抗體片段為包含Fc區且保持至少一種當存在於完整抗體中時通常與Fc區相關之生物學功能的片段，該等生物學功能諸如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合。在一個實施例中，抗體片段為活體內半衰期基本上類似於完整抗體的單價抗體。舉例而言，此類抗體片段可包含連接至Fc序列的抗原結合臂，該Fc序列包含至少一個能夠賦予該片段活體內穩定性的游離半胱胺酸。
如熟習此項技術者充分認識到，片段可藉由分子工程改造或經由化學或酶處理(諸如番木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)完整或整個抗體或抗體鏈或藉由重組方式獲得。關於抗體片段之更詳細說明，參見例如Fundamental Immunology,W.E.Paul編，Raven Press,N.Y.(1999)。
4.5. 多價構築體
在其他實施例中，本發明之抗體及結合物可為單價或多價的(例如二價、三價等)。如本文所用，術語「價數」係指與抗體相關之潛在標靶結合位點的數目。各標靶結合位點特異性結合一個靶分子或靶分子上的特定位置或基因座。當抗體為單價時，分子之各結合位點將特異性結合至單一 抗原位置或抗原決定基。當抗體包含超過一個標靶結合位點(多價)時，各標靶結合位點可特異性結合相同或不同分子(例如可結合至不同配位體或不同抗原，或同一抗原上的不同抗原決定基或位置)。參見例如U.S.P.N.2009/0130105。
在一個實施例中，抗體為雙特異性抗體，其中兩條鏈具有不同特異性，如Millstein等人，1983,Nature,305：537-539中所述。其他實施例包括具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體。其他更複雜的相容多特異性構築體及其製造方法闡述於U.S.P.N.2009/0155255以及WO 94/04690；Suresh等人，1986,Methods in Enzymology,121：210；及WO96/27011中。
多價抗體可免疫特異性結合至所要靶分子之不同抗原決定基或可免疫特異性地結合至靶分子以及異質抗原決定基，諸如異質多肽或固體載體物質。雖然所選實施例可僅結合兩種抗原(亦即雙特異性抗體)，但本發明亦涵蓋具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體。雙特異性抗體亦包括交聯或「異結合」抗體。舉例而言，異結合物中之抗體之一可與抗生素蛋白偶合，另一抗體與生物素偶合。舉例而言，已提出此類抗體使免疫系統細胞靶向非所需細胞(U.S.P.N.4,676,980)及治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。異結合抗體可使用任何適宜的交聯方法製造。適合交聯劑為此項技術中熟知的，且與多種交聯技術一起揭示於U.S.P.N.4,676,980中。
在其他實施例中，使用一般技術者熟知之方法，使具有所要結合特異性(抗體-抗原結合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合，免疫球蛋白恆定域序列諸如包含鉸鏈、CH2及/或CH3區之至少一部分的 免疫球蛋白重鏈恆定域。
5. 抗體之重組產生
抗體及其片段可使用由產抗體細胞獲得之遺傳物質及重組技術產生或修飾(參見例如Dubel及Reichert(編)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Sambrook及Russell(編)(2000)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.；及U.S.P.N.7,709,611)。
本發明之另一態樣係關於編碼本發明抗體的核酸分子。核酸可存在於全細胞、細胞溶胞物中或以部分純化或基本上純的形式存在。核酸當藉由標準技術與其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離時為「經分離」或基本上純的，標準技術包括鹼性/SDS處理、CsCl聚束、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知的其他技術。本發明核酸可為例如DNA(例如基因組DNA、cDNA)、RNA及其人工變異體(例如肽核酸)(不論單股或雙股或RNA、RNA)，且可含或可不含內含子。在所選實施例中，核酸為cDNA分子。
本發明核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由融合瘤(例如如下文實例中所述製備之融合瘤)表現的抗體而言，可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼抗體輕鏈及重鏈的cDNA。對於自免疫球蛋白基因文庫獲得(例如使用噬菌體呈現技術)之抗體，可自文庫恢復編碼抗體之核酸。
編碼VH及VL區段的DNA片段可藉由標準重組DNA技術進一步操縱，例如將可變區基因轉變為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質(諸如抗體恆定區或彈性連接子)之另一DNA片段。如本文所用，術語「可操作地連接」意謂兩個DNA片段以使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框的方式連接。
可以藉由使編碼VH之DNA可操作地連接(或可操作地關聯)至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3，在IgG1之情況下)之另一DNA分子，將編碼VH區之經分離DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因序列在此項技術中已知(參見例如Kabat等人(1991)(同上文獻))且涵蓋此等區域之DNA片段可以藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG4恆定區。下文緊接著闡述與本發明相容的例示性κ輕鏈恆定區胺基酸序列： (SEQ ID NO：4)。
下文緊接著闡述與本發明相容的例示性λ輕鏈恆定區胺基酸序列： (SEQ ID NO：7)
類似地，下文緊接著闡述與本發明相容的例示性IgG1重鏈恆定區胺基酸序列： (SEQ ID NO：1)。
對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可以可操作地連接至僅編碼 重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
編碼VL區之經分離DNA可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子而轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因序列在此項技術中已知(參見例如Kabat等人(1991)(同上文獻))且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳為κ恆定區。
本文中涵蓋展現與本發明多肽之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」的某些多肽(例如抗原或抗體)。舉例而言，衍生的人類化抗體VH或VL域可展現與源(例如鼠類)或受者(例如人類)VH或VL域之序列相似性。「同源」多肽可展現65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性。在其他實施例中，「同源」多肽可展現93%、95%或98%序列一致性。如本文所用，兩個胺基酸序列之間的同源百分比相當於兩個序列之間的一致性百分比。在考慮了為達成兩個序列之最佳比對而需引入之空隙的數目及各空隙之長度的情況下，兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共有之一致位置之數目的函數(亦即同源性%=一致位置之數目/位置之總數目×100)。如下文非限制性實例中所述，序列比較及測定兩個序列之間的一致性百分比可使用數學演算法完成。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17(1988))之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權數殘基表、空隙長度罰分12及空隙罰分4來確定。另外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))演算法(其已併入GCG軟體套件(可在www.gcg.com獲得)中之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或 PAM250矩陣，及空隙權數16、14、12、10、8、6或4及長度權數1、2、3、4、5或6來確定。
另外地或可替代地，本發明之蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以對公共資料庫進行搜尋，例如鑑別相關序列。此等搜尋可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之XBLAST程式(2.0版)進行。BLAST蛋白質搜尋可使用XBLAST程式、評分=50、字長=3進行，獲得與本發明抗體分子同源的胺基酸序列。為實現空隙比對以達成比較目的，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用空隙BLAST。在使用BLAST及空隙BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。
不一致的殘基位置可因保守胺基酸取代或因非保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經側鏈之化學性質(例如電荷或疏水性)類似之另一胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守胺基酸取代基本上不改變蛋白質之功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列彼此因保守取代而不同的情況下，可上調序列一致性或相似度百分比以根據保守取代性質加以校正。在經非保守胺基酸取代的情況下，在實施例中，展現序列一致性的多肽將保留本發明多肽(例如抗體)的所要功能或活性。
本文中亦涵蓋展現與本發明核酸之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」的核酸。「同源序列」意謂展現至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性的核酸分子序列。在其他實施例中，核酸之「同源序列」與參考核酸可展現93%、95%或98%的序列一致性。
本發明亦提供包含上述此類核酸的載體，其可以可操作地連接至啟動子(參見例如WO 86/05807；WO 89/01036；及U.S.P.N.5,122,464)； 及真核分泌路徑中之其他轉錄調節及加工控制元件。本發明亦提供含有彼等載體的宿主細胞及宿主表現系統。
如本文所用，術語「宿主表現系統」包括可經工程改造以產生本發明之核酸或多肽及抗體的任何種類的細胞系統。此類宿主表現系統包括(但不限於)經重組噬菌體DNA或質體DNA轉型或轉染的微生物(例如大腸桿菌(E.coli)或枯草桿菌(B.subtilis))；經重組酵母表現載體轉染的酵母(例如酵母屬(Saccharomyces))；或含有重組表現構築體的哺乳動物細胞(例如COS、CHO-S、HEK293T、3T3細胞)，該等重組表現構築體含有來源於哺乳動物細胞或病毒之基因組的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子)。宿主細胞可經兩種表現載體共轉染，例如編碼重鏈衍生之多肽的第一載體及編碼輕鏈衍生之多肽的第二載體。
哺乳動物細胞轉型方法在此項技術中已熟知。參見例如U.S.P.N.4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。宿主細胞亦可經工程改造以便產生具有不同特徵的抗原結合分子(例如經修飾之糖型或具有GnTIII活性的蛋白質)。
為長期高產量產生重組蛋白質，穩定表現為較佳的。因此，穩定表現所選抗體的細胞株可使用此項技術所公認之標準技術加以工程改造且形成本發明之一部分。可以用藉由適當表現控制元件(例如啟動子或增強子序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制的DNA及可選標記物轉型宿主細胞，而非使用含有病毒複製起點之表現載體。可使用此項技術中熟知的任一種選擇系統，包括在所選條件下提供增強表現之有效途徑的麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)。GS系統完整或部分地論述於EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997及EP 0 338 841及U.S.P.N.5,591,639 及5,879,936中。用於開發穩定細胞株的另一相容性表現系統為FreedomTM CHO-S套組(Life Technologies)。
已藉由重組表現或所揭示之任何其他技術產生本發明抗體後，其可藉由此項技術中已知之方法純化或分離，從而對其進行鑑別及自其天然環境中分離及/或回收且與會干擾抗體或相關ADC之診斷或治療性用途的污染物分離。經分離抗體包括原位存在於重組細胞內的抗體。
此等經分離製劑可使用此項技術中公認的各種技術加以純化，諸如離子交換及尺寸排阻層析、透析、透濾及親和層析，尤其是蛋白質A或蛋白質G親和層析。相容性方法更充分地論述於下文實例中。
6. 產生後選擇
不管如何獲得，產抗體細胞(例如融合瘤、酵母群落等)可加以選擇、選殖且針對所要特徵進行進一步篩選，所要特徵包括例如穩定生長、高抗體產量及所要抗體特徵，諸如對相關抗原之高親和力。融合瘤可以在細胞培養物中活體外擴增或在同基因型免疫功能不全動物中活體內擴增。選擇、選殖及擴增融合瘤及/或群落之方法已為一般技術者熟知。鑑別出所要抗體之後，可使用此項技術中公認的通用分子生物學及生物化學技術分離、操縱及表現相關遺傳物質。
藉由初始文庫(天然或合成)產生的抗體可具有中等親和力(Ka為約106至107M-1)。為增強親和力，可以藉由構築抗體文庫(例如，藉由使用易錯聚合酶活體外引入隨機突變)且自彼等二級文庫再選擇對抗原具有高親和力之抗體(例如藉由使用噬菌體或酵母呈現術)來活體外模擬親和力成熟。WO 9607754描述一種誘導免疫球蛋白輕鏈之CDR發生突變以產生輕鏈基因文庫的方法。
可以使用各種技術來選擇抗體，該等技術包括(但不限於)噬菌體或酵母呈現術，其中在噬菌體或酵母上合成人類組合抗體或scFv片段之文庫，利用相關抗原或其抗體結合部分篩選文庫，且分離出結合抗原的噬菌體或酵母，自其可以獲得抗體或免疫反應性片段(Vaughan等人，1996,PMID：9630891；Sheets等人，1998,PMID：9600934；Boder等人，1997,PMID：9181578；Pepper等人，2008,PMID：18336206)。用於產生噬菌體或酵母呈現文庫之套組可在市面上購得。亦存在可用於產生及篩選抗體呈現文庫的其他方法及試劑(參見U.S.P.N.5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，1991,PMID：1896445)。該等技術有利地允許篩選大量候選抗體且提供相對容易的序列操縱(例如藉由重組改組)。
IV. 抗體特徵
在某些實施例中，產抗體細胞(例如融合瘤或酵母群落)可加以選擇、選殖且針對有利特性進行進一步篩選，該等有利性質包括例如穩定生長、高抗體產量及如下文更詳細論述的所要位點特異性抗體特徵。在其他情況下，可藉由選擇用於接種動物的特定抗原(例如特異性CLDN同功異型物)或靶抗原之免疫反應性片段來賦予抗體特徵。在其他實施例中，所選抗體可如上文所述經工程改造以增強或改進免疫化學特徵，諸如親和力或藥物動力學。
A. 中和抗體
在某些實施例中，抗體或抗體結合物將包含「中和」抗體或其衍生物或片段。亦即，本發明可包含結合特異性域或抗原決定基且能夠阻斷、 降低或抑制CLDN6之生物活性的抗體分子。更一般而言，術語「中和抗體」係指與靶分子或配位體結合或相互作用且阻止靶分子與諸如受體或受質之結合搭配物結合或締合，從而中斷原本將由該等分子之相互作用引起的生物反應的抗體。
應瞭解，此項技術中已知之競爭性結合分析可用於評估抗體或其免疫功能片段或衍生物的結合及特異性。就本發明而言，如例如藉由靶分子活性或在活體外競爭性結合分析中所量測，當過量的抗體使得與CLDN結合的結合搭配物之數量減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多時，抗體或片段將保持抑制或減少CLDN與結合搭配物或受質之結合。例如在CLDN抗體之情況下，中和抗體或拮抗劑較佳將使得靶分子活性改變至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多。應瞭解，此經調節之活性可直接使用此項技術中公認之技術量測或可根據改變之活性對下游的影響(例如瘤形成或細胞存活)來量測。
B. 內化抗體
在某些實施例中，抗體可包含內化抗體，以便抗體結合至決定子且內化(隨著任何所結合之醫藥活性部分一起)至所選靶細胞(包括致瘤細胞)中。內化之抗體分子數目可足以殺死表現抗原之細胞，尤其是表現抗原之致瘤細胞。視抗體或(在一些情況下)抗體藥物結合物之效能而定，單一抗體分子吸收於細胞中可足以殺死抗體所結合的靶細胞。就本發明而言，有證據表明所表現之CLDN蛋白質的大部分仍與致瘤細胞表面結合，從而允許所揭示之抗體或ADC定位及內化。在所選實施例中，此類抗體將與內化後殺死細胞的一或多種藥物締合或結合。在一些實施例中，本發明 ADC將包含內化位點特異性ADC。
如本文所用，「內化」的抗體為結合至相關決定子後由靶細胞吸收(與任何所結合之細胞毒素一起)的抗體。所內化之此類ADC的數目較佳足以殺死表現決定子之細胞，尤其是表現決定子之癌症幹細胞。視細胞毒素或ADC整體上之效能而定，在一些情況下，少數抗體分子吸收至細胞中足以殺死抗體所結合的靶細胞。舉例而言，某些藥物(諸如PBD或卡奇黴素(ealicheamicin))如此強效，以致於與抗體結合之少量毒素分子的內化即足以殺死靶細胞。抗體結合至哺乳動物細胞後是否內化可藉由此項技術中公認的各種分析(例如皂草素分析，諸如Mab-Zap及Fab-Zap；Advanced Targeting Systems)來確定，包括下文實例中所述的彼等分析。偵測抗體是否內化至細胞中的方法亦描述於U.S.P.N.7,619,068中。
C. 耗乏性抗體(depleting antibody)
在其他實施例中，本發明抗體為耗乏性抗體。術語「耗乏性」抗體係指較佳結合至細胞表面上或附近的抗原且誘導、促進或引起細胞死亡(例如藉由CDC、ADCC或引入細胞毒性劑)的抗體。在實施例中，所選耗乏性抗體將與細胞毒素結合。
較佳地，耗乏性抗體將能殺死所定義細胞群體中至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%之CLDN表現細胞。如本文所用，術語「表觀IC50」係指與毒素連接之初級抗體殺死50%表現由初級抗體識別之抗原的細胞的濃度。毒素可以直接結合至初級抗體，或可經由識別初級抗體之二級抗體或抗體片段與初級抗體締合，且該二級抗體或抗體片段直接結合至毒素。較佳地，耗乏性抗體之IC50將小於5μM、小於1μM、小於100nM、小於50nM、小於30nM、 小於20nM、小於10nM、小於5nM、小於2nM或小於1nM。在一些實施例中，細胞群體可包含經富集、切片、純化或分離之致瘤細胞，包括癌症幹細胞。在其他實施例中，細胞群體可包含全腫瘤樣品或包含癌症幹細胞的非均質腫瘤提取物。可使用標準生物化學技術，根據本文中之教示內容來監測及量化致瘤細胞之耗乏。
D. 結合親和力
本文中揭示對特異性決定子(例如CLDN)具有高結合親和力的抗體。術語「KD」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數。當解離常數KD(koff/kon)為10-7M時，本發明抗體可免疫特異性地結合其靶抗原。當KD 5×10-9M時，抗體以高親和力特異性結合抗原，且當KD 5×10-10M時，抗體以非常高的親和力特異性結合抗原。在本發明之一個實施例中，抗體具有10-9M之KD及約1×10-4/sec之解離速率。在本發明之一個實施例中，解離速率為<1×10-5/sec。在本發明之其他實施例中，抗體將以約10-7M與10-10M之間的KD結合至決定子，且在又一實施例中，其將以KD 2×10-10M結合。本發明之其他所選實施例包含具有以下KD(koff/kon)之抗體：小於10-6M、小於5×10-6M、小於10-7M、小於5×10-7M、小於10-8M、小於5×10-8M、小於10-9M、小於5×10-9M、小於10-10M、小於5×10-10M、小於10-11M、小於5×10-11M、小於10-12M、小於5×10-12M、小於10-13M、小於5×10-13M、小於10-14M、小於5×10-14M、小於10-15M或小於5×10-15M。
在某些實施例中，免疫特異性結合至例如CLDN之決定子的本發明抗體可具有以下結合速率常數或k on (或k a) 率(抗體+抗原(Ag)k on←抗體-Ag)：至少105M-1s-1、至少2×105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、 至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1或至少108M-1s-1。
在另一實施例中，免疫特異性結合至例如CLDN之決定子的本發明抗體可具有以下解離速率常數或k off (或k d) 率(抗體+抗原(Ag)k off←抗體-Ag)：小於10-1s-1、小於5×10-1s-1、小於10-2s-1、小於5×10-2s-1、小於10-3s-1、小於5×10-3s-1、小於10-4s-1、小於5×104s-1、小於10-5s-1、小於5×10-5s-1、小於10-6s-1、小於5×10-6s-1、小於10-7s-1、小於5×10-7s-1、小於10-8s-1、小於5×10-8s-1、小於10-9s-1、小於5×10-9s-1或小於10-10s-1。
結合親和力可使用此項技術中已知的各種技術測定，例如表面電漿子共振、生物層干涉法、雙重極化干涉法、靜態光散射、動態光散射、等溫滴定熱量測定法、ELISA、分析型超離心法及流動式細胞測量術。
如本文所用，術語「表觀結合親和力」係指當抗原在細胞表面上過度表現時，抗體與其靶抗原之表觀結合。抗體對抗原之表觀結合親和力在本文中描述為「表觀EC50」，其為與過度表現抗原之細胞發生50%最大結合時的抗體濃度。在一個實施例中，若兩個抗體之表觀EC50值彼此相差不超過45%、不超過40%、不超過35%、不超過30%、不超過25%、不超過20%、不超過10%或不超過5%，則兩個抗體可以稱為對抗原具有「基本上相同」的表觀結合親和力，且置信度>99%。在另一實施例中，若結合多個靶抗原(例如對一或多個CLDN蛋白質具有多反應性)的抗體對各抗原之表觀EC50值彼此相差不超過45%、不超過40%、不超過35%、不超過30%、不超過25%、不超過20%、不超過10%或不超過5%，則該抗體可以稱為對多個抗原具有「基本上相同」的表觀結合親和力，且置信度>99%。因為用於測定抗體對抗原之表觀結合親和力的分析通常利用過度表現抗原且在假定平衡或接近平衡條件下暴露於抗體中之細胞，所以表觀 EC50值反映的是親合力(avidity)，或多個表觀結合親和力之組合或累積強度。因此，在相關實施例中，若兩個抗體對表現抗原之靶細胞株的表觀結合親和力(用表觀EC50值表示)彼此相差不超過45%、不超過40%、不超過35%、不超過30%、不超過25%、不超過20%、不超過10%或不超過5%，則該兩個抗體將共享對該細胞株之基本上相同的親合力，且置信度>99%。類似地，若結合多個靶抗原(例如，對一或多個CLDN蛋白質具有多反應性)之抗體對各抗原之表觀EC50值彼此相差不超過45%、不超過40%、不超過35%、不超過30%、不超過25%、不超過20%、不超過10%或不超過5%，則該抗體可以稱為對多個抗原具有基本上相同的親合力，且置信度>99%。
E. 分組(Binning)及抗原決定基定位
如本文所用，術語「分組」係指用於根據抗體之抗原結合特徵及其是否彼此競爭而將抗體分入「框組(bin)」中的方法。框組之初始判定可以藉由抗原決定基定位及如本文所述之其他技術進一步改進及確認。然而，應瞭解，按經驗將抗體分配至個別框組可提供可以指示所揭示抗體之治療潛能的資訊。
可以藉由使用此項技術中已知且本文實例中所闡述之方法判定所選參考抗體(或其片段)是否與第二測試抗體競爭結合(亦即，在同一框組中)。在一個實施例中，參考抗體在飽和條件下與CLDN抗原結合且隨後使用標準免疫化學技術測定二級抗體或測試抗體與CLDN結合之能力。若測試抗體能夠與參考抗CLDN抗體基本上同時結合至CLDN，則二級抗體或測試抗體與初級抗體或參考抗體結合至不同抗原決定基。然而，若測試抗體不能夠基本上同時結合至CLDN，則測試抗體結合至與由初級抗體所 結合之抗原決定基相同的抗原決定基、重疊的抗原決定基或緊密相鄰(至少在空間上如此)的抗原決定基。亦即，測試抗體與參考抗體競爭抗原結合且處於同一框組內。
術語「競爭」或「競爭性抗體」當在所揭示之抗體的情況下使用時意謂如藉由某一分析所測定的抗體之間的競爭，在該分析中，所測試之測試抗體或免疫功能片段抑制參考抗體與共同抗原之特異性結合。通常，此類分析涉及使用結合至固體表面或細胞的經純化抗原(例如CLDN或其域或片段)、未標記測試抗體及經標記參考抗體。競爭性抑制係藉由在測試抗體存在下測定結合至固體表面或細胞之標記的量來量測。通常，當競爭性抗體過量存在時，其將使得參考抗體與共同抗原的特異性結合遭到至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之抑制。在一些情況下，結合遭到至少80%、85%、90%、95%或97%或更大的抑制。反之，當結合參考抗體時，其較佳使得隨後添加之測試抗體(亦即抗CLDN抗體)之結合遭到至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之抑制。在一些情況下，測試抗體之結合遭到至少80%、85%、90%、95%或97%或更大的抑制。
一般而言，分組或競爭性結合可使用此項技術中公認的各種技術來測定，諸如免疫分析，諸如西方墨點法、放射免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固著分析、免疫放射分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析。該等免疫分析在此項技術中為常規且熟知的(參見Ausubel等人編，(1994)Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.,New York)。另外，可以使用交 叉阻斷分析(參見例如WO 2003/48731；及Harlow等人(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow及David Lane)。
用於測定競爭性抑制(且因此為「框組」)的其他技術包括：使用例如BIAcoreTM 2000系統(GE Healthcare)的表面電漿子共振；使用例如ForteBio® Octet RED(ForteBio)的生物層干涉法；或使用例如FACSCanto II(BD Biosciences)或多工LUMINEXTM偵測分析(Luminex)的流動式細胞測量術珠粒陣列。
Luminex為基於珠粒的免疫分析平台，其能夠實現大規模多工抗體配對。該分析比較抗體對針對靶抗原的同時結合模式。抗體對中之一個抗體(捕捉mAb)結合至Luminex珠粒，其中各捕捉mAb結合至不同顏色之珠粒。另一抗體(偵測mAb)結合至螢光信號(例如藻紅素(PE))。該分析係分析抗體對抗原的同時結合(配對)且將具有類似配對概況之抗體歸類在一起。偵測mAb與捕捉mAb之概況類似表示此兩種抗體結合至相同或密切相關的抗原決定基。在一個實施例中，配對概況可使用皮爾森相關係數(Pearson correlation coefficients)來確定以鑑別與所測試之抗體群組中之任何特定抗體最密切相關的抗體。在實施例中，若抗體對之皮爾森相關係數為至少0.9，則將確定測試/偵測mAb與參考/捕捉mAb在同一框組中。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.8、0.85、0.87或0.89。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析自Luminex分析獲得之資料的其他方法描述於U.S.P.N.8,568,992中。Luminex同時分析100種(或更多種)不同類型珠粒之能力使得抗原及/或抗體表面幾乎不受限制，從而改良生物感測 分析中之處理量及抗體抗原決定基譜分析之解析度(Miller等人，2011,PMID：21223970)。
類似地，包含表面電漿子共振的分組技術與本發明相容。如本文所用，「表面電漿子共振」係指允許藉由偵測生物感測器基質內之蛋白質濃度變化來分析即時特異性相互作用的光學現象。若所選抗體彼此間競爭結合至所定義抗原，則其可容易使用市售設備(諸如BIAcoreTM 2000系統)測定。
在其他實施例中，可用於確定測試抗體是否與參考抗體「競爭」結合的技術為「生物層干涉法」，一種光學分析技術，其分析自兩個表面反射之白光的干涉圖案：生物感測器尖端上所固著之蛋白質層，及內部參考層。結合至生物感測器尖端之分子的數目的任何變化導致可即時量測之干涉圖案的改變。此類生物層干涉法分析可使用ForteBio® Octet RED機器如下執行。參考抗體(Ab1)捕捉於抗小鼠捕捉晶片上，隨後使用高濃度的非結合抗體阻斷晶片且收集基線。隨後用特異性抗體(Ab1)捕捉單體性重組靶蛋白且將尖端浸漬於具有相同抗體(Ab1)作為對照的孔中或具有不同測試抗體(Ab2)的孔中。若未發生進一步結合(如藉由與對照Ab1比較結合程度所確定)，則確定Ab1與Ab2為「競爭性」抗體。若觀測到Ab2存在額外結合，則確定Ab1與Ab2彼此間無競爭。可擴大此製程，在代表獨特框組的96孔盤中使用全列抗體，從而篩選獨特抗體之大型文庫。在一些實施例中，若參考抗體使得測試抗體與共同抗原之特異性結合遭到至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之抑制，則測試抗體將與參考抗體相競爭。在其他實施例中，結合遭到至少80%、85%、90%、95%或97%或更大的抑制。
在定義包含一組競爭性抗體的框組之後，可進行進一步表徵以確定該組抗體所結合之抗原上的特定域或抗原決定基。域層面的抗原決定基定位可使用Cochran等人，2004,PMID：15099763所述之方案的修改來進行。精細抗原決定基定位為確定抗原上包含抗體所結合之決定子的抗原決定基之特定胺基酸的方法。本文中揭示的抗體可根據其所結合之離散抗原決定基來表徵。「抗原決定基」為抗體或免疫反應性片段所特異性結合之決定子的部分。免疫特異性結合可基於如上文所述的結合親和力或藉由抗體對其在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之靶抗原的優先識別(例如在競爭分析中)來證實及定義。「線性抗原決定基」係由抗原中允許抗體發生免疫特異性結合之鄰接胺基酸形成。即使抗原變性時，優先結合線性抗原決定基的能力亦通常得以維持。反之，「構形抗原決定基」通常包含抗原之胺基酸序列中之非鄰接胺基酸，但在抗原之二級、三級或四級結構之情況下，足夠靠近以同時被單一抗體結合。當具有構形抗原決定基的抗原變性時，抗體通常將不再識別抗原。抗原決定基(鄰接或非鄰接)在獨特的空間構形中典型地包括至少3個且更通常至少5個或8-10個或12-20個胺基酸。
在某些實施例中，精細抗原決定基定位可使用噬菌體或酵母呈現術來進行。其他相容性抗原決定基定位技術包括丙胺酸掃描突變體、肽墨點法(Reineke,2004,PMID：14970513)，或肽裂解分析。另外，可採用諸如抗原決定基切除、抗原決定基提取及化學修飾抗原之方法(Tomer,2000,PMID：10752610)，使用酶，諸如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、內切蛋白酶Glu-C、內切蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)；化學試劑，諸如丁二醯亞胺基酯及其衍生物、含有一級胺的化合物、肼及碳醯肼、游離胺基酸 等。在另一實施例中，可使用修飾輔助譜分析(Modification-Assisted Profiling)，亦稱為基於抗原結構之抗體譜分析(ASAP)，根據各抗體針對化學或酶促修飾之抗原表面之結合概況的相似性，對大量針對相同抗原的單株抗體進行分類(U.S.P.N.2004/0101920)。
抗原上之所要抗原決定基確定之後，可能產生針對該抗原決定基的其他抗體，例如使用本文所述之技術，用包含所選抗原決定基的肽進行免疫。
V. 抗體結合物
在一些實施例中，本發明抗體可與醫藥活性或診斷部分結合以形成「抗體藥物結合物」(ADC)或「抗體結合物」。術語「結合物」係廣泛地使用且意謂任何醫藥活性部分或診斷部分與本發明抗體的共價或非共價結合，不論結合方法如何。在某些實施例中，經由抗體之離胺酸或半胱胺酸殘基實現結合。在一些實施例中，醫藥活性或診斷部分可經由一或多個位點特異性游離半胱胺酸結合至抗體。所揭示之ADC可用於治療及診斷目的。
本發明ADC可用於將細胞毒素或其他有效負載傳遞至標靶位置(例如表現CLDN之致瘤細胞)。如本文所闡述，術語「藥物」或「彈頭」可互換使用且意謂生物學活性或可偵測分子或藥物，包括如下文所述的抗癌劑或細胞毒素。「有效負載」可包含「藥物」或「彈頭」與視情況存在之連接子化合物的組合。結合物上之彈頭可包含活體內代謝為活性劑的肽、蛋白質或前藥；聚合物、核酸分子、小分子、結合劑、模擬劑、合成藥物、無機分子、有機分子及放射性同位素。在一較佳實施例中，所揭示之ADC將所結合的有效負載在相對無反應、無毒狀態下導引至靶點，隨後 釋放且活化彈頭(例如如本文所揭示的PBDS 1-5)。彈頭的此靶向釋放較佳經由有效負載的穩定結合(例如經由抗體上的一或多個半胱胺酸)及ADC製劑的相對均勻組成達成，從而將過度結合的毒性ADC物質減到最少。在與經設計以在彈頭已傳遞至腫瘤位點之後基本上釋放彈頭的藥物連接子偶聯的情況下，本發明結合物可大體上降低不合需要的非特異性毒性。此有利地使得活性細胞毒素在腫瘤位點的含量相對較高，同時最小化非靶向細胞及組織的暴露，從而提供增強的治療指數。
應瞭解，雖然本發明之一些實施例包含併有治療性部分(例如細胞毒素)的有效負載，但併有診斷劑及生物相容性調節劑的其他有效負載可受益於由所揭示之結合物提供的靶向釋放。因此，除非上下文另有指示，否則與例示性治療性有效負載有關的任何揭示內容亦適用於包含診斷劑或生物相容性調節劑的有效負載，如本文中所論述。所選有效負載可共價或非共價連接至抗體且展現不同的化學計量莫耳比，此至少部分地視達成結合所用的方法而定。
本發明結合物通常可由下式表示：Ab-[L-D]n，或其醫藥學上可接受之鹽，其中：a)Ab包含抗CLDN抗體；b)L包含視情況存在之連接子；c)D包含藥物；且d)n為整數約1至約20。
熟習此項技術者將瞭解，根據前述式之結合物可使用多種不同連接子及藥物製得且結合方法將根據組分之選擇而變化。因而，與所揭示抗體之反應性殘基(例如半胱胺酸或離胺酸)結合的任何藥物或藥物連接子化合 物與本文中之教示內容相容。類似地，允許所選藥物與抗體結合(包括位點特異性結合)的任何反應條件屬於本發明範疇內。儘管上述內容如此，但本發明之一些實施例包含使用穩定劑與輕度還原劑之組合來使藥物或藥物連接子與游離半胱胺酸發生選擇性結合，如本文所述。此類反應條件傾向於使得製劑更均勻、非特異性結合及污染物更少且相應地毒性更低。
A. 彈頭 1. 治療劑
本發明抗體可與醫藥活性部分結合、鍵聯或融合或以其他方式結合，該醫藥活性部分為治療部分或藥物，諸如抗癌劑，包括(但不限於)細胞毒性劑(細胞毒素)、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射冶療劑、靶向抗癌劑、生物反應調節劑、癌症疫苗、細胞激素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。
例示性抗癌劑或細胞毒素(包括其同源物及衍生物)包含1-去氫睪固酮(1-dehydrotestosterone)、安麯黴素(anthramycins)、放線菌素D(actinomycin D)、博萊黴素(bleomycin)、卡奇黴素(包括N-乙醯基卡奇黴素)、秋水仙鹼(colchicin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、更生黴素(dactinomycin)(原名放線菌素)、二羥基炭疽桿菌素(dihydroxy anthracin)、二酮、多卡米辛(duocarmycin)、吐根素(emetine)、表柔比星(epirubicin)、溴化乙錠(ethidium bromide)、依託泊苷(etoposide)、糖皮質激素(glucocorticoids)、短桿菌素D(gramicidin D)、利多卡因(lidocaine)、類美登素(maytansinoids)(諸如DM-1及DM-4(Immunogen))、苯并二氮呯衍生物(Immunogen)、光神黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、太平 洋紫杉醇(paclitaxel)、普魯卡因(procaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、替尼泊苷(tenoposide)、四卡因(tetracaine)，及上述任一者的醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
其他相容性細胞毒素包含海兔毒素(dolastatin)及奧瑞他汀(auristatin)，包括單甲基奧瑞他汀E(MMAE)及單甲基奧瑞他汀F(MMAF)(Seattle Genetics)；瓢菌素(amanitin)，諸如α-瓢菌素、β-瓢菌素、γ-瓢菌素或ε-瓢菌素(Heidelberg Pharma)；DNA小溝結合劑，諸如多卡米辛衍生物(Syntarga)；烷基化劑，諸如經修飾或二聚吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)(PBD)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)及順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑；剪接抑制劑，諸如米亞黴素(meayamycin)類似物或衍生物(例如如U.S.P.N.7,825,267中所闡述的FR901464)；管結合劑，諸如埃坡黴素(epothilone)類似物及妥布賴森(tubulysins)、太平洋紫杉醇及DNA損傷劑，諸如卡奇黴素及埃斯波黴素(esperamicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)及5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine)；抗有絲分裂劑，諸如長春鹼(vinblastine)及長春新鹼(vincristine)；及蒽環黴素(anthracycline)，諸如道諾黴素(daunorubicin)(原名柔紅黴素(daunomycin))及小紅莓(doxorubicin)，及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
在所選實施例中，本發明抗體可與抗CD3結合分子結合以募集細胞毒性T細胞且使其靶向致瘤細胞(BiTE技術；參見例如Fuhrmann等人(2010)Annual Meeting of AACR摘要第5625號)。
在其他實施例中，本發明ADC可包含使用適當連接子結合的包含治療放射性同位素之細胞毒素。可與此類實施例相容的例示性放射性同位素包括(但不限於)碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、銅(62Cu、64Cu、67Cu)、硫(35S)、鐳(223R)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In)、鉍(212Bi、213Bi)、鎝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Sn、76Br、211At及225Ac。其他放射性核素亦可用作診斷劑及治療劑，尤其是60至4,000keV之能量範圍內的彼等物。
在其他所選實施例中，本發明ADC將與細胞毒性苯并二氮呯衍生物彈頭結合。可與所揭示之抗體結合的相容性苯并二氮呯衍生物(及視情況存在之連接子)描述於例如U.S.P.N.8,426,402及PCT申請WO2012/128868及WO2014/031566中。如同PBD，咸信相容性苯并二氮呯衍生物結合於DNA之小溝中且抑制核酸合成。此類化合物據報導具有強效抗腫瘤特性且因而特別適用於本發明ADC中。
在一些實施例中，本發明ADC可包含PBD及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或其衍生物作為彈頭。PBD為藉由共價結合至DNA小溝及抑制核酸合成來發揮抗腫瘤活性的烷基化劑。PBD已顯示具有強效抗腫瘤特性，同時展現最小的骨髓抑制。與本發明相容的PBD可使用若干類型 的連接子(例如包含順丁烯二醯亞胺基部分及游離硫氫基的肽基連接子)連接至抗體，且在某些實施例中，呈二聚形式(亦即PBD二聚物)。可結合至所揭示抗體的相容性PBD(及視情況存在之連接子)描述於例如U.S.P.N.6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157以及PCT申請WO2011/130613、WO2011/128650、WO2011/130616、WO2014/057073及WO2014/057074中。下文緊接著更詳細地論述與本發明相容之PBD化合物的實例。
就本發明而言，PBD已顯示具有強效抗腫瘤特性，同時展現最小骨髓抑制。與本發明相容的PBD可使用若干類型連接子中的任一者(例如包含順丁烯二醯亞胺基部分及游離硫氫基的肽基連接子)連接至CLDN靶向劑且在某些實施例中，呈二聚形式(亦即PBD二聚物)。PBD具有通式結構：
其在取代基之數目、類型及位置方面，在其芳族A環及吡咯并C環方面及在C環之飽和度方面不同。在B環中，在N10-C11位置存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))，或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，該位置為負責DNA烷基化的親電子中心。當由C環朝向A環查看時，所有已知天然產物在對掌性C11a位置處均具有(S)組態，其為該等天然產物提供右手螺旋(right-handed twist)。此與B型DNA的小溝一起給予其適當的等螺旋性(isohelicity)三維形狀，在結合位點處產生適貼配合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986))。其在小溝中形成加合物之能力使其能夠干擾DNA加工且充當細胞毒性劑。如上文所提及，為增強其效力，PBD往往以二聚形式使用，其可與如本文所述的抗CLDN抗體結合。
在本發明之某些實施例中，可與所揭示之調節劑結合的相容PBD描述於U.S.P.N.2011/0256157中。此揭示內容提供據顯示具有某些有利性質的PBD二聚物(亦即包含兩個PBD部分之PBD二聚物)。就此而言，本發明之所選ADC包含具有式(AB)或(AC)之PBD毒素：
其中：點線表示C1與C2或C2與C3之間視情況存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基；其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基； R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R10為連接至CLDN抗體或其片段或衍生物的連接子，如本文所述；Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或在Q為O之情況下，R11可為SO3M，其中M為金屬陽離子；X選自O、S或N(H)且在所選實施例中包含O；R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe，及/或芳環，例如苯或吡啶，該等環視情況經取代)；R及R'各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且視情況就基團NRR'而言，R及R'與其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；且其中R2"、R6"、R7"、R9"、X"、Q"及R11"(當存在時)如分別根據R2、R6、R7、R9、X、Q及R11所定義，且RC為封端基團。
下文緊接著更詳細地描述包含前述結構的所選實施例。
雙鍵
在一個實施例中，C1與C2之間及C2與C3之間不存在雙鍵。
在一個實施例中，虛線表示C2與C3之間視情況存在雙鍵，如下文所示：
在一個實施例中，當R2為C5-20芳基或C1-12烷基時，C2與C3之間存在雙鍵。在一較佳實施例中，R2包含甲基。
在一個實施例中，虛線表示C1與C2之間視情況存在雙鍵，如下文所示：
在一個實施例中，當R2為C5-20芳基或C1-12烷基時，C1與C2之間存在雙鍵。在一較佳實施例中，R2包含甲基。
R 2
在一個實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基。
在一個實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR。
在一個實施例中，R2獨立地選自H、=O、=CH2、R、=CH-RD及=C(RD)2。
在一個實施例中，R2獨立地為H。
在一個實施例中，R2獨立地為R，其中R包含CH3。
在一個實施例中，R2獨立地為=O。
在一個實施例中，R2獨立地為=CH2。
在一個實施例中，R2獨立地為=CH-RD。在PBD化合物內，基團=CH-RD可以具有下文所示的任一組態：
在一個實施例中，組態為組態(I)。
在一個實施例中，R2獨立地為=C(RD)2。
在一個實施例中，R2獨立地為=CF2。
在一個實施例中，R2獨立地為R。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C1-12烷基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-7芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C8-10芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之苯基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之萘基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之吡啶基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。
在一個實施例中，R2具有一個至三個取代基，其中1個及2個更佳，且經單取代之基團最佳。取代基可在任何位置。
在R2為C5-7芳基的情況下，單一取代基較佳位於與化合物之其餘部分之鍵結不相鄰的環原子上，亦即其對於化合物之其餘部分之鍵結而言較佳為β或γ。因此，在C5-7芳基為苯基的情況下，取代基較佳位於間位或對位，且更佳位於對位。
在一個實施例中，R2係選自：
其中星號表示連接點。
在R2為C8-10芳基(例如喹啉基或異喹啉基)的情況下，其可在喹啉或異喹啉環的任何位置攜有任意數目個取代基。在一些實施例中，其具有一個、兩個或三個取代基，且此等取代基可位於近側環及遠側環或兩者上(若超過一個取代基)。
在一個實施例中，在R2視情況經取代之情況下，取代基係選自下文取代基章節中所給出的彼等取代基。
在R視情況經取代之情況下，取代基較佳選自：鹵基、羥基、醚、甲醯基、醯基、羧基、酯、醯氧基、胺基、醯胺基、醯基醯胺基、胺基羰基氧基、脲基、硝基、氰基及硫醚。
在一個實施例中，在R或R2視情況經取代之情況下，取代基係選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR'、NO2、鹵基、CO2R、COR、CONH2、CONHR及CONRR'。
在R2為C1-12烷基的情況下，視情況存在之取代基可另外包括C3-20雜環基及C5-20芳基。
在R2為C3-20雜環基的情況下，視情況存在之取代基可另外包括C1-12烷基及C5-20芳基。
在R2為C5-20芳基的情況下，視情況存在之取代基可另外包括C3-20雜環基及C1-12烷基。
應瞭解，術語「烷基」涵蓋子類烯基及炔基以及環烷基。因此，在R2為視情況經取代之C1-12烷基的情況下，應瞭解烷基視情況含有一或多個碳-碳雙鍵或參鍵，其可形成所結合系統的一部分。在一個實施例中，視 情況經取代之C1-12烷基含有至少一個碳-碳雙鍵或參鍵，且此鍵與存在於C1與C2之間或C2與C3之間的雙鍵結合。在一個實施例中，C1-12烷基為選自飽和C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基及C3-12環烷基的基團。
若R2上的取代基為鹵基，則其較佳為F或Cl，更佳為Cl。
若R2上的取代基為醚，則其在一些實施例中可為烷氧基，例如C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)或其在一些實施例中可為C5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。
若R2上的取代基為C1-7烷基，則其較佳可為C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
若R2上的取代基為C3-7雜環基，則其在一些實施例中可為含氮C6雜環基，例如嗎啉基、硫代嗎啉基、哌啶基、哌嗪基。此等基團可經由氮原子鍵結至PBD部分之其餘部分。此等基團可進一步經例如C1-4烷基取代。
若R2上的取代基為雙氧基-C1-3伸烷基，則此較佳為雙氧基-亞甲基或雙氧基-伸乙基。
R2之尤其較佳取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-噻吩基。
尤其較佳之經取代R2基團包括(但不限於)4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-雙氧基亞甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、異喹啉-3-基及異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。
在一個實施例中，R2為鹵基或二鹵基。在一個實施例中，R2為-F或-F2，該等取代基分別以(III)及(IV)說明於下文：
R D
在一個實施例中，RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基。
在一個實施例中，RD獨立地為R。
在一個實施例中，RD獨立地為鹵基。
R 6
在一個實施例中，R6獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地選自H、OH、OR、SH、NH2、NO2及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地選自H及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地為H。
在一個實施例中，R6及R7一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2。
R 7
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基。
在一個實施例中，R7獨立地為OR。
在一個實施例中，R7獨立地為OR7A，其中R7A獨立地為視情況經取代之C1-6烷基。
在一個實施例中，R7A獨立地為視情況經取代之飽和C1-6烷基。
在一個實施例中，R7A獨立地為視情況經取代之C2-4烯基。
在一個實施例中，R7A獨立地為Me。
在一個實施例中，R7A獨立地為CH2Ph。
在一個實施例中，R7A獨立地為烯丙基。
在一個實施例中，化合物為二聚物，其中各單體的R7基團一起形成連接單體的二聚物橋，其具有式X-R"-X。
R 9
在一個實施例中，R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施例中，R9獨立地為H。
在一個實施例中，R9獨立地為R或OR。
R 10
較佳地，相容連接子(諸如本文所述的彼等物)在R10位置(亦即N10)使CLDN抗體經由共價鍵連接至PBD藥物部分。
Q
在某些實施例中，Q獨立地選自O、S及NH。
在一個實施例中，Q獨立地為O。
在一個實施例中，Q獨立地為S。
在一個實施例中，Q獨立地為NH。
R 11
在所選實施例中，R11為H或R，或在Q為O之情況下，可為SO3M，其中M為金屬陽離子。陽離子可為Na+。
在某些實施例中，R11為H。
在某些實施例中，R11為R。
在某些實施例中，在Q為O之情況下，R11為SO3M，其中M為金屬陽離子。陽離子可為Na+。
在某些實施例中，在Q為O之情況下，R11為H。
在某些實施例中，在Q為O之情況下，R11為R。
X
在一個實施例中，X選自O、S或N(H)。
較佳地，X為O。
R"
R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子，例如O、S、N(H)、NMe，及/或芳環，例如苯或吡啶，該等環視情況經取代。
在一個實施例中，R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子及/或芳環，例如苯或吡啶。
在一個實施例中，伸烷基視情況雜有一或多個選自O、S及NMe之雜原子及/或芳環，該等環視情況經取代。
在一個實施例中，芳環為C5-20伸芳基，其中伸芳基係關於藉由自芳族化合物之兩個芳環原子移除兩個氫原子而獲得的二價部分，該部分具有5至20個環原子。
在一個實施例中，R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子，例如O、S、N(H)、NMe，及/或芳環，例如苯或吡啶，該等環視情況經NH2取代。
在一個實施例中，R"為C3-12伸烷基。
在一個實施例中，R"選自C3、C5、C7、C9及C11伸烷基。
在一個實施例中，R"選自C3、C5及C7伸烷基。
在一個實施例中，R"選自C3及C5伸烷基。
在一個實施例中，R"為C3伸烷基。
在一個實施例中，R"為C5伸烷基。
上列伸烷基可視情況雜有一或多個雜原子及/或芳環，例如苯或吡啶，該等環視情況經取代。
上列伸烷基可視情況雜有一或多個雜原子及/或芳環，例如苯或吡啶。
上列伸烷基可為未經取代之直鏈脂族伸烷基。
R及R'
在一個實施例中，R獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基。
在一個實施例中，R獨立地為視情況經取代之C1-12烷基。
在一個實施例中，R獨立地為視情況經取代之C3-20雜環基。
在一個實施例中，R獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
上文關於R2所述的為關於較佳烷基及芳基及視情況存在之取代基之身分及數目的各種實施例。針對R2所述之適用於R的偏好適當時適用於所有其他基團R，例如其中R6、R7、R8或R9為R。
R之偏好亦適用於R'。
在本發明的一些實施例中，提供一種具有取代基-NRR'的化合物。在一個實施例中，R及R'與其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環。該環可含有其他雜原子，例如N、O或S。
在一個實施例中，雜環本身經基團R取代。在存在另一個N雜原子的情況下，取代基可位於N雜原子上。
除前述PBD之外，某些二聚PBD已顯示尤其具有活性且可結合本發明使用。為此目的，本發明之抗體藥物結合物(亦即如本文所揭示的ADC 1-6)可包含下文緊接著按PBD 1-5闡述的PBD化合物。應注意，下文PBD 1-5包含在連接子(諸如本文中更詳細描述的彼等物)分離之後所釋放的細胞毒性彈頭。PBD 1-5中的每一者作為藥物-連接子化合物組分的合成極詳細地呈現於WO 2014/130879中，該文獻關於此類合成的內容以引用的方式併入本文中。鑒於WO 2014/130879，可包含本發明ADC之所選彈頭的細胞毒性化合物可容易地產生且如本文所闡述般採用。因此，下文緊接著闡述與連接子分離後可自所揭示之ADC釋放的所選PBD化合物：
應瞭解，前述二聚PBD彈頭中之每一者較佳在經靶細胞內化且摧毀連接子之後釋放。如下文更詳細地描述，某些連接子將包含可能併有自我分解部分的可裂解連接子，其允許活性PBD彈頭釋放而不保留連接子之任何部分。釋放之後，PBD彈頭隨後與靶細胞DNA結合且交聯。此類結合明顯地阻斷標靶癌細胞分裂而不使其DNA螺旋變形，從而潛在地避免突然出現之耐藥性的常見現象。在其他較佳實施例中，彈頭可經由不包含自我分解部分的可裂解連接子連接至CLDN靶向部分。
根據本發明，此類化合物在腫瘤位點的傳遞及釋放可以證明在臨床上可有效治療或管理增生性病症。就化合物而言，應瞭解所揭示之PBD中的每一者在各C環中具有兩個sp2中心，其可允許在DNA小溝中的結合強於(且因此毒性大於)各C環中具有僅一個sp2中心的化合物。因此，所揭示之PBD當用於如本文所闡述之CLDN ADC中時可以證明可特別有效地治療增生性病症。
前文提供與本發明相容的例示性PBD化合物且對於根據本文中的教示內容可成功併入抗CLDN結合物中的其他PBD決不意欲具限制性。實情為，可與如本文所述之抗體結合且闡述於下文實例中的任何PBD與所揭示之結合物相容且明確屬於本發明的邊界及界限內。
除前述藥劑之外，本發明抗體亦可與生物反應調節劑結合。在某些實施例中，生物反應調節劑將包含介白素2、干擾素，或各種類型的群落刺激因子(例如CSF、GM-CSF、G-CSF)。
更一般而言，相關藥物部分可為具有所要生物活性的多肽。此類蛋白質可包括例如毒素，諸如相思子毒素(abrin)、蓖麻毒素(ricin)A、豹蛙酶(Onconase)(或其他細胞毒性RNA酶)、綠膿桿菌外毒素、霍亂毒素、白喉毒素；細胞凋亡劑，諸如腫瘤壞死因子，例如TNF-α或TNF-β；α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化因子、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO 97/34911)、Fas配位體(Takahashi等人，1994,PMID：7826947)及VEGI(WO 99/23105)、血栓劑、抗血管生成劑(例如血管生長抑素或內皮生長抑素)、淋巴激素(例如介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-6(IL-6))、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)，及顆粒球群落刺激因子(G-CSF)，或生長因子，例如生長激素(GH)。
2. 診斷劑或偵測劑
在其他實施例中，本發明抗體或其片段或衍生物係與診斷劑或可偵測劑、標記物或報導子結合，其可為例如生物分子(例如肽或核苷酸)、小分子、螢光團或放射性同位素。經標記之抗體可適用於監測過度增生性病症之發展或進展，或作為臨床測試程序的一部分用於測定特定療法(包括所揭示之抗體)(亦即治療診斷劑)的功效或確定未來治療過程。此類標記物或報導子亦可適用於純化所選抗體；用於抗體分析(例如抗原決定基結合或抗體分組)，分離或分開致瘤細胞；或用於臨床前程序或毒理學研究。
此類診斷、分析及/或偵測可藉由使抗體與可偵測物質偶合來完成，可偵測物質包括(但不限於)各種酶，包含例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌 素/生物素及抗生素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)傘酮(umbellifetone)、螢光素、螢光素異硫氰酸酯、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質，諸如(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光物質，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In)、鎝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、89Zr、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；正電子發射金屬(使用各種正電子發射斷層攝影術)、非放射性順磁金屬離子，及經放射性標記或與特定放射性同位素結合的分子。在此類實施例中，適當偵測方法在此項技術中已熟知且容易自許多市售來源獲得。
在其他實施例中，抗體或其片段可與標記物序列或化合物(諸如肽或螢光團)融合或結合以促進純化或診斷或分析程序，諸如免疫組織化學、生物層干涉法、表面電漿子共振、流動式細胞測量術、競爭性ELISA、FAC等。在一些實施例中，標記物尤其包含組胺酸標籤，諸如由pQE載體(Qiagen)提供之組胺酸標籤，其中大部分可市購。適用於純化的其他肽標籤包括(但不限於)紅血球凝集素「HA」標籤，其對應於來源於流感紅血球凝集素蛋白質的抗原決定基(Wilson等人，1984,Cell 37：767)；及「flag」標籤(U.S.P.N.4,703,004)。
3. 生物相容性調節劑
在所選實施例中，本發明抗體可與生物相容性調節劑結合，生物相 容性調節劑可用於視需要調整、更改、改良或緩和抗體特徵。舉例而言，活體內半衰期延長的抗體或融合構築體可藉由連接分子量相對較高之聚合物分子(諸如市售聚乙二醇(PEG)或類似生物相容性聚合物)來產生。熟習此項技術者將瞭解，PEG可以多種不同的分子量及分子組態獲得，該等分子量及分子組態可經選擇以賦予抗體特定的特性(例如可定製半衰期)。PEG可利用或不利用多官能性連接子、經由PEG與該等抗體或抗體片段之N端或C端的結合或經由存在於離胺酸殘基上的ε-胺基而連接至抗體或抗體片段或衍生物。可使用使生物活性損失最小化之線性或分支聚合物衍生作用。結合度可藉由SDS-PAGE及質譜密切監測以確保PEG分子與抗體分子之最佳結合。未反應之PEG可藉由例如尺寸排阻或離子交換層析與抗體-PEG結合物分離。所揭示之抗體可以類似方式與白蛋白結合以便使抗體或抗體片段在活體內更穩定或具有更長的活體內半衰期。該等技藝在此項技術中已熟知，參見例如WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137；及EP 0 413,622。其他生物相容性結合物對於一般技術者而言顯而易見且可容易根據本文中之教示內容加以鑑別。
B. 連接子化合物
如上文所指示，與本發明相容的有效負載包含一或多個彈頭且視情況包含使彈頭與抗體靶向劑結合的連接子。多種連接子化合物可用於本發明抗體與相關彈頭之結合。連接子僅需與抗體上的反應性殘基(較佳為半胱胺酸或離胺酸)及所選藥物化合物共價結合。因此，與所選抗體殘基反應且可用於提供本發明之相對穩定結合物(位點特異性或其他方式)的任何連接子與本文中之教示內容相容。
相容性連接子可有利地結合至經還原之半胱胺酸及離胺酸，其為親 核的。涉及經還原之半胱胺酸及離胺酸的結合反應包括(但不限於)硫醇-順丁烯二醯亞胺、硫醇-鹵基(鹵化醯基)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基碸、硫醇-雙碸、硫醇-硫代磺酸酯、硫醇-吡啶基二硫化物及硫醇-對氟反應。如本文中進一步論述，硫醇-順丁烯二醯亞胺生物結合因其反應速率快且結合條件溫和而為使用最廣泛之方法之一。使用此方法的一個問題為可能發生逆邁克爾反應(retro-Michael reaction)及經順丁烯二醯亞胺基連接之有效負載發生損耗或自抗體轉移至血漿中的其他蛋白質，諸如人類血清白蛋白。然而，在一些實施例中，使用選擇性還原及如下文實例所闡述之位點特異性抗體可用於穩定結合物且減少此非所要轉移。硫醇-鹵化醯基反應得到不會發生逆邁克爾反應且因此更穩定的生物結合物。然而，硫醇-鹵化物反應通常具有比基於順丁烯二醯亞胺之結合慢的反應速率且因此在提供非所要藥物與抗體之比方面不太有效。硫醇-吡啶基二硫化物反應為另一種常用的生物結合途徑。吡啶基二硫化物與游離硫醇發生快速交換，產生混合二硫化物且釋放吡啶-2-硫酮。混合二硫化物可在還原性細胞環境中裂解，釋放出有效負載。受到較多關注的其他生物結合方法為硫醇-乙烯基碸及硫醇-雙碸反應，其中之每一者與本文中之教示內容相容且明確地包括於本發明之範疇內。
在所選實施例中，相容性連接子將賦予ADC在細胞外環境中的穩定性，防止ADC分子聚集且保持ADC自由溶於水性介質中且呈單體狀態。在轉運或傳遞至細胞中之前，ADC較佳為穩定的且保持完整，亦即抗體保持連接至藥物部分。雖然連接子在靶細胞外部為穩定的，但可將其設計成以一定的有效速率在細胞內部裂解或降解。因此，有效連接子將：(i)維持抗體之特異性結合特性；(ii)允許結合物或藥物部分之細胞內傳遞； (iii)保持穩定及完整，亦即不裂解或降解，直至結合物已傳遞或轉運至其靶向位點；及(iv)維持藥物部分之細胞毒性、細胞殺死效應或細胞抑制效應(在一些情況下，包括任何旁觀者效應)。ADC穩定性可藉由標準分析技術量測，諸如HPLC/UPLC、質譜、HPLC，及分離/分析技術LC/MS及LC/MS/MS。如上文所闡述，抗體與藥物部分之共價連接就反應性含義而言需要連接子具有兩個反應性官能基，亦即二價。適用於連接兩個或更多個功能性或生物學活性部分(諸如MMAE及抗體)的二價連接試劑已知，且已描述提供與本文中之教示相容之所得結合物的方法。
與本發明相容的連接子可大體上分類為可裂解連接子及不可裂解連接子。可裂解連接子可以包括酸不穩定連接子(例如肟及腙)、蛋白酶可裂解連接子及二硫化物連接子，內化至靶細胞中且在細胞內部按內體-溶酶體路徑裂解。細胞毒素之釋放及活化依賴於促進酸不穩定化學鍵聯(諸如腙或肟)之裂解的內體/溶酶體酸性隔室。若溶酶體特異性蛋白酶裂解位點經工程改造至連接子中，則細胞毒素將接近其細胞內標靶釋放。或者，含有混合二硫化物的連接子提供當細胞毒性有效負載在細胞之還原環境中、而非在血流之富氧環境中選擇性裂解時，細胞毒性有效負載藉以在細胞內釋放的途徑。藉助於對比，含有醯胺連接之聚乙二醇或烷基間隔基的相容性不可裂解連接子在ADC在靶細胞內溶酶體降解期間釋放毒性有效負載。在一些方面，連接子之選擇將視結合物中所用之特定藥物、特定適應症及抗體標靶而定。
因此，本發明之某些實施例包含可藉由存在於細胞內環境中(例如溶酶體或內體或胞膜窖內部)的裂解劑裂解的連接子。連接子可為例如由細胞內肽酶或蛋白酶裂解之肽基連接子，該酶包括(但不限於)溶酶體或內體 蛋白酶。在一些實施例中，肽基連接子為至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長。裂解劑可包括組織蛋白酶B及D及纖維蛋白溶酶，已知其各自可使二肽藥物衍生物水解，從而使活性藥物釋放於靶細胞內部。由於已發現組織蛋白酶B高度表現於癌組織中，因此可藉由硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶B裂解的例示性肽基連接子為包含Phe-Leu的肽。此類連接子之其他實例描述於U.S.P.N.6,214,345中。在特定實施例中，可藉由細胞內蛋白酶裂解的肽基連接子為Val-Cit連接子、Val-Ala連接子或Phe-Lys連接子。使用細胞內蛋白水解釋放治療劑的一個優點為該藥劑在結合時通常毒性降低且結合物之血清穩定性相對較高。
在其他實施例中，可裂解連接子具有pH敏感性。pH敏感性連接子在酸性條件下通常為可水解的。舉例而言，可使用可在溶酶體中水解的酸不穩定連接子(例如腙、肟、半卡腙、硫半卡巴肼、順烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或其類似者)(參見例如U.S.P.N.5,122,368、5,824,805、5,622,929)。此類連接子在中性pH條件(諸如血液中之彼等條件)下相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0(其為溶酶體之近似pH)時不穩定(例如可裂解)。
在又其他實施例中，連接子在還原條件下可裂解(例如二硫化物連接子)。多種二硫化物連接子在此項技術中已知，包括例如可使用SATA(N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基硫基乙酸酯)、SPDP(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)及SMPT(N-丁二醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)形成的彼等物。在又其他特定實施例中，連接子為丙二酸酯連接子(Johnson等人，1995,Anticancer Res.15：1387-93)、順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基連 接子(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3'-N-醯胺類似物(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在本發明的某些態樣中，所選連接子將包含下式之化合物：
其中星號表示與藥物的連接點，CBA(亦即細胞結合劑)包含抗CLDN抗體，L1包含連接單元且視情況包含可裂解連接單元，A為使L1與抗體上之反應性殘基連接的連接基(視情況包含間隔基)，L2較佳為共價鍵及U，其可存在或可不存在，可包含促進連接子與彈頭在腫瘤位點澈底分離的自我分解單元的全部或一部分。
在一些實施例(諸如U.S.P.N.2011/0256157中所述的實施例)中，相容連接子可包含：
其中星號表示與藥物的連接點，CBA(亦即細胞結合劑)包含抗CLDN抗體，L1包含連接子且視情況包含可裂解連接子，A為使L1與抗體上之反應性殘基連接的連接基(視情況包含間隔基)且L2為共價鍵或連同-OC(=O)-一起形成自我分解部分。
應瞭解，L1及L2(存在時)之性質可廣泛變化。此等基團係根據其裂解特徵加以選擇，裂解特徵可根據結合物所傳遞之位點處的條件來指定。較佳為藉由酶作用裂解的彼等連接子，然而亦可使用藉由改變pH(例如酸或鹼不穩定)、溫度或照射後(例如對光不穩定)可裂解的連接子。在還原或氧化條件下可裂解的連接子亦可用於本發明。
在某些實施例中，L1可包含鄰接胺基酸序列。胺基酸序列可為酶促裂解之靶受質，從而允許藥物釋放。
在一個實施例中，L1可藉由酶作用裂解。在一個實施例中，酶為酯酶或肽酶。
在另一實施例中，L1為組織蛋白酶不穩定連接子。
在一個實施例中，L1包含二肽。二肽可表示為-NH-X1-X2-CO-，其中-NH-及-CO-分別表示胺基酸基團X1及X2之N端及C端。二肽中之胺基酸可為天然胺基酸之任何組合。在連接子為組織蛋白酶不穩定連接子的情況下，二肽可為組織蛋白酶介導性裂解之作用位點。
另外，對於具有羧基或胺基側鏈官能基的彼等胺基酸基團(分別例如Glu及Lys)而言，CO及NH可表示彼側鏈官能基。
在一個實施例中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團-X1-X2-係選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-及-Trp-Cit-，其中Cit為瓜胺酸。
二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團-X1-X2-較佳選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-及-Val-Cit-。
二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團-X1-X2-最佳為-Phe-Lys-或-Val-Ala-或Val-Cit。在某些所選實施例中，二肽將包含-Val-Ala-。
在一個實施例中，L2係以共價鍵形式存在。
在一個實施例中，L2存在且連同-C(=O)O-一起形成自我分解型連接子。在一個實施例中，L2為酶促活性之受質，從而允許彈頭釋放。
在一個實施例中，在L1藉由酶之作用可裂解且存在L2的情況下，酶使L1與L2之間的鍵裂解。
L1及L2當存在時，可藉由選自以下之鍵連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
連接至L2之L1之胺基可為胺基酸之N端或可衍生自胺基酸側鏈(例如離胺酸胺基酸側鏈)之胺基。
連接至L2之L1之羧基可為胺基酸之C端或可衍生自胺基酸側鏈(例如麩胺酸胺基酸側鏈)之羧基。
連接至L2之L1之羥基可衍生自胺基酸側鏈(例如絲胺酸胺基酸側鏈)之羥基。
術語「胺基酸側鏈」包括發現於以下中之彼等基團；(i)天然存在之胺基酸，諸如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸；(ii)次要胺基酸，諸如鳥胺酸及瓜胺酸；(iii)非天然胺基酸、β-胺基酸、天然存在之胺基酸之合成類似物及衍生物；及(iv)所有對映異構體、非對映異構體、經異構性增濃、同位素標記(例如2H、3H、14C、15N)、保護之形式及其外消旋混合物。
在一個實施例中，-C(=O)O-與L2一起形成以下基團：
其中星號表示與藥物或細胞毒性劑位置的連接點，波浪線表示與連接子L1的連接點，Y為-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，且n為0至3。伸苯基環視情況經一個、兩個或三個取代基取代。在一個實施例 中，伸苯基視情況經鹵基、NO2、烷基或羥基烷基取代。
在一個實施例中，Y為NH。
在一個實施例中，n為0或1。n較佳為0。
在Y為NH且n為0的情況下，自我分解型連接子可稱為對胺基苯甲基羰基連接子(PABC)。
在其他實施例中，連接子可包括自我分解型連接子與二肽，其一起形成基團-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-。在其他所選實施例中，連接子可包含基團-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其說明如下：
其中星號表示與所選細胞毒性部分的連接點，且波浪線表示與連接子之其餘部分(例如間隔基-抗體結合區段)的連接點，連接子之其餘部分可與抗體結合。二肽發生酶促裂解後，當遠端位點活化時，自我分解型連接子將允許經保護之化合物(亦即細胞毒素)發生澈底的釋放，此釋放係沿著下文所示之路線進行：
其中星號表示與所選細胞毒性部分的連接點且其中L*為連接子其餘部分之活化形式，其包含現在裂解之肽基單元。彈頭之澈底釋放確保其維持所要毒性活性。
在一個實施例中，A為共價鍵。因此，L1與抗體直接連接。舉例而 言，在L1包含鄰接胺基酸序列的情況下，序列N端可直接連接至抗體殘基。
在另一實施例中，A為間隔基團。因此，L1與抗體間接連接。
在某些實施例中，L1及A可藉由選自以下之鍵連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
如下文更詳細地論述，本發明之藥物連接子較佳連接至半胱胺酸上之反應性硫醇親核體，包括游離半胱胺酸。為此目的，抗體之半胱胺酸可藉由用各種還原劑(諸如DTT或TCEP或如本文所闡述之溫和還原劑)處理而具備與連接子試劑結合的反應性。在其他實施例中，本發明之藥物連接子較佳連接至離胺酸。
連接子較佳含有親電子官能基以便與抗體上的親核官能基發生反應。抗體上的親核基團包括(但不限於)：(i)N端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體發生糖基化。胺、硫醇及羥基具親核性且能夠與連接子部分及連接子試劑上的親電子基團反應形成共價鍵，包括：(i)順丁烯二醯亞胺基團；(ii)活化二硫化物；(iii)活性酯，諸如NHS(N-羥基丁二醯亞胺)酯、HOBt(N-羥基苯并三唑)酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(iv)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(v)醛、酮及羧基。
下文緊接著說明與本發明相容的例示性官能基：
在一些實施例中，半胱胺酸(包括位點特異性抗體之游離半胱胺酸)與藥物-連接子部分之間的連接係經由存在於連接子上的硫醇殘基及末端順丁烯二醯亞胺基團。在此類實施例中，抗體與藥物-連接子之間的連接可為：
其中星號表示與藥物-連接子之其餘部分的連接點且波浪線表示與抗體其餘部分的連接點。在該等實施例中，S原子較佳可源自位點特異性游離半胱胺酸。
就其他相容性連接子而言，結合部分可包含可與抗體上之活化殘基反應以得到所要結合物的末端溴或碘乙醯胺。在任何情況下，熟習此項技術者可根據本發明容易使所揭示之藥物-連接子化合物中之每一者與相容性抗CLDN抗體(包括位點特異性抗體)結合。
根據本發明，本發明提供製造相容性抗體藥物結合物的方法，包含使抗CLDN抗體與選自由以下組成之群的藥物-連接子化合物結合：
出於本申請案的目的，DL用作「藥物-連接子」之縮寫且將包含如上文所闡述的藥物連接子1至6(亦即DL1、DL2、DL3、DL4、DL5及DL6)。應注意，DL1及DL6包含相同的彈頭及相同的二肽亞單元，但連接基間隔基不同。因此，連接子裂解後，DL1與DL6均釋放PBD1。
應瞭解，經連接子附接的末端順丁烯二醯亞胺基部分(DL1-DL4及DL6)或碘乙醯胺部分(DL5)可使用此項技術中公認的技術與所選CLDN抗體上的游離硫氫基結合。上述化合物的合成途徑闡述於WO2014/130879中，該文獻關於前述DL化合物的合成以引用的方式明確併入本文中，而使此類PBD連接子組合結合的特定方法闡述於下文實例中。
因此，在所選態樣中，本發明係關於與所揭示之DL部分結合的CLDN抗體以提供CLDN免疫結合物，下文緊接著在ADC 1-6中大體上闡述該等CLDN免疫結合物。因此，在某些態樣中，本發明係關於選自由以下組成之群的抗體藥物結合物：
其中Ab包含抗CLDN抗體或其免疫反應性片段。
在某些態樣中，本發明之CLDN PBD ADC將包含如隨附實例中所闡述的抗CLDN抗體或其免疫反應性片段。在一特定實施例中，ADC 3將包含hSC27.204v2ss1(例如，hSC27.204v2ss1 PBD3)。在其他態樣中，本發明之CLDN PBD ADC將包含併入有細胞結合劑hSC27.204v2ss1的ADC 1或ADC 6(例如，hSC27.204v2ss1 PBD1)。
C. 結合
應瞭解，可以使用多種熟知反應將藥物部分及/或連接子連接至所選抗體。舉例而言，利用半胱胺酸之硫氫基的各種反應均可用於結合所要部分。一些實施例將包含含有一或多個游離半胱胺酸之抗體的結合，如下文所詳細論述。在其他實施例中，本發明ADC可經由藥物與所選抗體中存在之離胺酸殘基之暴露於溶劑中之胺基的結合來產生。其他實施例包含將N端蘇胺酸及絲胺酸殘基活化，隨後可利用其將所揭示之有效負載連接至抗體。所選結合方法較佳經定製以使連接至抗體之藥物數目最佳化且提供相對較高的治療指數。
用於使治療性化合物與半胱胺酸殘基結合的各種方法在此項技術中已知且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。半胱胺酸殘基在鹼性條件下將發生去質子化，產生可與軟親電子劑(諸如順丁烯二醯亞胺及碘乙醯胺)反應的硫醇鹽親核試劑。一般而言，用於此類結合的試劑可直接與半胱胺酸硫醇反應形成所結合之蛋白質或與連接子-藥物反應形成連接子-藥物中間物。在連接子的情況下，使用有機化學反應、條件及試劑的若干途徑已為熟習此項技術者所知，包括：(1)使本發明蛋白質之半胱胺酸基團與連接子試劑反應，經由共價鍵形成蛋白質-連接子中間物，隨後與活化化合物反應；及(2)使化合物之親核基團與連接子試劑反應，經由共價鍵形成藥物-連接子中間物，隨後與本發明蛋白質之半胱胺酸基團反應。如熟習此項技術者根據前述內容將顯而易知，雙官能(或二價)連接子適用於本發明。舉例而言，雙官能連接子可包含用於與半胱胺酸殘基共價鍵聯的硫醇修飾基團及至少一個用於與化合物共價或非共價鍵聯的連接部分(例 如第二硫醇修飾部分)。
結合之前，抗體可藉由用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP)之還原劑處理而具備與連接子試劑結合的反應性。在其他實施例中，其他親核基團可經由離胺酸與試劑之反應引入抗體中，從而將胺轉化為硫醇，該等試劑包括(但不限於)2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑(Traut's reagent))、SATA、SATP或SAT(PEG)4。
就此類結合而言，半胱胺酸硫醇或離胺酸胺基具有親核性且能夠與包括以下之連接子試劑或化合物-連接子中間物或藥物上的親電子基團反應形成共價鍵：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團；及(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，經由硫化物交換。化合物或連接子上的親核基團包括(但不限於)胺、硫醇、經基、醯肼、肟、肼、硫半卡巴腙、肼甲酸酯及芳基醯肼基團，其能夠與連接子部分及連接子試劑上的親電子基團反應形成共價鍵。
結合試劑通常包括順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯基、碘乙醯胺丁二醯亞胺酯、異硫氰酸酯、磺醯氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯及胺基磷酸酯，然而亦可使用其他官能基。在某些實施例中，方法包括例如使用順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或鹵乙醯基/烷基鹵化物、氮丙啶、丙烯醯基衍生物與半胱胺酸之硫醇反應以產生可與化合物反應的硫醚。游離硫醇與活化吡啶基二硫化物之二硫化物交換亦適用於產生結合物(例如使用5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB))。較佳使用順丁烯二醯亞胺。
如上文所指示，離胺酸亦可用作用於達成結合的反應性殘基，如本文所闡述。通常經由胺反應性丁二醯亞胺基酯靶向親核性離胺酸殘基。為 獲得最佳數目個去質子化離胺酸殘基，水溶液pH必須低於離胺酸銨基之pKa(其為約10.5)，因此典型的反應pH為約8及9。偶合反應之常見試劑為NHS酯，其與親核性離胺酸經由離胺酸醯化機制發生反應。經歷類似反應的其他相容性試劑包含異氰酸酯及異硫氰酸酯，其亦可結合本文中之教示內容使用以得到ADC。離胺酸一旦活化，即可使用多種前述鍵聯基團使彈頭共價結合至抗體。
用於使化合物與蘇胺酸或絲胺酸殘基(較佳為N端殘基)結合的方法在此項技術中亦已知。舉例而言，方法已有描述，其中自絲胺酸或蘇胺酸之1,2-胺基醇衍生得到羰基前驅物，其可藉由過碘酸鹽氧化而選擇性地且快速地轉化成醛形式。醛與待連接至本發明蛋白質之化合物中之半胱胺酸的1,2-胺基硫醇反應形成穩定噻唑啶產物。此方法特別適用於在N端絲胺酸或蘇胺酸殘基處標記蛋白質。
在一些實施例中，可藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多個游離半胱胺酸殘基(例如製備包含一或多個游離非原生半胱胺酸胺基酸殘基的抗體)而將反應性硫醇基引入所選抗體(或其片段)中。此類位點特異性抗體或經工程改造之抗體允許結合物製劑展現增強的穩定性及基本上均質性，此至少部分地歸因於經工程改造之游離半胱胺酸位點及/或本文所闡述之新穎結合程序的提供。不同於完全或部分地還原鏈內或鏈間抗體二硫鍵中之每一者以提供結合位點(且與本發明完全相容)的習知結合方法，本發明另外提供所製備之某些游離半胱胺酸位點之選擇性還原及藥物-連接子與其之連接。
就此而言，應瞭解，藉由經工程改造之位點及選擇性還原促進的結合特異性允許在所要位置存在高百分比的定點結合。顯然，此等結合位點 中之一些(諸如存在於輕鏈恆定區之末端區域中的彼等位點)通常難以有效地結合，原因在於其傾向於與其他游離半胱胺酸發生交叉反應。然而，經由分子工程改造及選擇性還原所得游離半胱胺酸，可獲得有效的結合率，從而大大減少非所需的高DAR污染物及非特異性毒性。更一般而言，經工程改造之構築體及所揭示之包含選擇性還原的新穎結合方法提供具有改良之藥物動力學及/或藥效學且潛在地具有改良之治療指數的ADC製劑。
在某些實施例中，位點特異性構築體呈遞游離半胱胺酸，其還原時包含具有親核性且能夠與連接子部分(諸如上文所揭示之彼等物)上之親電子基團反應形成共價鍵的硫醇基。如上文所論述，本發明抗體可具有可還原的不成對鏈間或鏈內半胱胺酸或所引入的非原生半胱胺酸，亦即提供此類親核基團的半胱胺酸。因此，在某些實施例中，經還原之游離半胱胺酸之游離硫氫基與所揭示之藥物-連接子之末端順丁烯二醯亞胺基或鹵乙醯胺基的反應將提供所要結合。在此等情況下，抗體之游離半胱胺酸可藉由用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP)之還原劑處理而具備與連接子試劑結合的反應性。各游離半胱胺酸因此在理論上呈遞反應性硫醇親核試劑。雖然此類試劑與本發明特別相容，但應瞭解，位點特異性抗體的結合可使用熟習此項技術者通常已知之各種反應、條件及試劑實現。
另外，已發現可選擇性還原經工程改造之抗體之游離半胱胺酸以提供增強的定點結合且使得非所需、潛在毒性污染物減少。更特定言之，已發現諸如精胺酸之「穩定劑」可調節蛋白質的分子內及分子間相互作用且可連同所選還原劑(較佳為相對溫和的還原劑)一起使用以選擇性還原游離半胱胺酸及促進位點特異性結合，如本文所闡述。如本文所用，術語「選擇性還原」或「選擇性地還原」可互換使用且應意謂游離半胱胺酸還原且 基本上不會使經工程改造之抗體中所存在的原生二硫鍵分裂。在所選實施例中，此選擇性還原可藉由使用某些還原劑或某些還原劑濃度來實現。在其他實施例中，選擇性還原經工程改造之構築體將包含使用穩定劑與還原劑(包括溫和還原劑)之組合。應瞭解，術語「選擇性結合」應意謂已在如本文所述之細胞毒素存在下選擇性地還原的經工程改造之抗體之結合。就此而言，此類穩定劑(例如精胺酸)與所選還原劑之組合使用可明顯地改良位點特異性結合效率，如根據抗體重鏈及輕鏈之結合程度及製劑中之DAR分佈所測定。相容性抗體構築體及選擇性結合技術及試劑廣泛揭示於WO2015/031698中，該文獻關於此類方法及構築體的內容特別併入本文中。
雖然不希望受任何特定理論束縛，但此類穩定劑可用來調節靜電微環境及/或調節所要結合位點發生的構形變化，從而允許相對溫和的還原劑(其基本上不會還原整個原生二硫鍵)促進在所要游離半胱胺酸位點發生結合。已知此類藥劑(例如某些胺基酸)可形成鹽橋(經由氫鍵結及靜電相互作用)且可以賦予穩定作用的方式調節蛋白質-蛋白質相互作用，從而可引起有利的構形變化及/或減少不利的蛋白質-蛋白質相互作用。此外，此類藥劑可用來在還原之後抑制非所要分子內(及分子間)半胱胺酸-半胱胺酸鍵之形成，從而促進所要的結合反應，其中經工程改造之位點特異性半胱胺酸結合至藥物(較佳經由連接子)。由於選擇性還原條件未能使完整的原生二硫鍵發生顯著還原，因此隨後的結合反應自然驅向於游離半胱胺酸上反應性相對較低的硫醇(例如較佳為每個抗體2個游離硫醇)。如先前所提及，此類技術可用於大大減少非特異性結合程度及相應非所需DAR物質在根據本發明所製得之結合物製劑中的含量。
在所選實施例中，與本發明相容的穩定劑通常將包含含有至少一個具有鹼性pKa之部分的化合物。在某些實施例中，該部分將包含一級胺，而在其他實施例中，胺部分將包含二級胺。在其他實施例中，胺部分將包含三級胺或鈲基團。在其他所選實施例中，胺部分將包含胺基酸，而在其他相容性實施例中，胺部分將包含胺基酸側鏈。在其他實施例中，胺部分將包含蛋白型胺基酸。在其他實施例中，胺部分包含非蛋白型胺基酸。在一些實施例中，相容性穩定劑可包含精胺酸、離胺酸、脯胺酸及半胱胺酸。在某些較佳實施例中，穩定劑將包含精胺酸。另外，相容性穩定劑可包括具有鹼性pKa的胍及含氮雜環。
在某些實施例中，相容性穩定劑包含含有至少一個具有大於約7.5之pKa之胺部分的化合物；在其他實施例中，該胺部分具有大於約8.0之pKa；在又其他實施例中，該胺部分具有大於約8.5之pKa且在其他實施例中，穩定劑包含pKa大於約9.0的胺部分。其他實施例將包含胺部分之pKa大於約9.5的穩定劑；而某些其他實施例將包含展現至少一個具有大於約10.0之pKa之胺部分的穩定劑。在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約10.5之胺部分的化合物；在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約11.0之胺部分的化合物；而在其他實施例中，穩定劑將包含pKa大於約11.5的胺部分。在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約12.0之胺部分的化合物；而在其他實施例中，穩定劑將包含pKa大於約12.5的胺部分。熟習此項技術者將瞭解，相關pKa可容易使用標準技術計算或測定且用於確定使用所選化合物作為穩定劑的適用性。
所揭示之穩定劑當與某些還原劑組合時顯示可特別有效地使結合靶向游離的位點特異性半胱胺酸。出於本發明的目的，相容性還原劑可包括 產生經還原之游離位點特異性半胱胺酸用於結合而不會使經工程改造抗體之原生二硫鍵發生顯著分裂的任何化合物。在較佳由所選穩定劑與還原劑之組合提供之此類條件下，經活化之藥物連接子基本上限於結合至所要游離位點特異性半胱胺酸位點。相對溫和的還原劑或在相對較低濃度下使用以提供溫和條件的還原劑尤其較佳。如本文所用，術語「溫和還原劑」或「溫和還原條件」應意謂藉由在游離半胱胺酸位點提供硫醇而不會使經工程改造抗體中所存在之原生二硫鍵發生實質上分裂的還原劑(視情況在穩定劑存在下)所實現的任何藥劑或狀態。亦即，溫和還原劑或條件(較佳與穩定劑組合)能夠有效地減少游離半胱胺酸(提供硫醇)而不會使蛋白質原生二硫鍵顯著分裂。所要的還原條件可由多種基於硫氫基之化合物提供，其為選擇性結合建立適當環境。在實施例中，溫和還原劑可包含具有一或多個游離硫醇的化合物，而在一些實施例中，溫和還原劑將包含具有單一游離硫醇的化合物。與本發明之選擇性還原技術相容之還原劑的非限制性實例包含麩胱甘肽、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸、2-胺基乙烷-1-硫醇及2-羥基乙烷-1-硫醇。
應瞭解，上文所述的選擇性還原方法特別有效地使結合靶向游離半胱胺酸。就此而言，與位點特異性抗體中之所要靶點結合的程度(本文中定義為「結合效率」)可藉由此項技術中所接受的各種技術測定。藥物與抗體之位點特異性結合的效率可藉由評估標靶結合位點(例如各輕鏈C端上的游離半胱胺酸)相對於所有其他結合位點上之結合百分比來測定。在某些實施例中，本文中的方法提供藥物與包含游離半胱胺酸之抗體的有效結合。在一些實施例中，結合效率為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少 50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或更高，如藉由標靶結合相對於所有其他結合位點的百分比所量測。
進一步將瞭解，能夠結合的經工程改造之抗體可含有包含硫氫基的游離半胱胺酸殘基，該等硫氫基在抗體產生或儲存時經封端(blocked/capped)。此類封端包括與硫氫基相互作用且防止或抑制結合物形成的小分子、蛋白質、肽、離子及其他物質。在一些情況下，未結合的經工程改造抗體可包含結合相同或不同抗體上之其他游離半胱胺酸的游離半胱胺酸。如本文中所論述，此類交叉反應可能在製造程序期間產生各種污染物。在一些實施例中，經工程改造之抗體可能需要在結合反應之前去除封端。在特定實施例中，本文中抗體經去除封端且呈現能夠結合的游離硫氫基。在特定實施例中，本文中抗體進行去除封端的反應，其不會使天然存在之二硫鍵發生分裂或重排。應瞭解，在大多數情況下，去除封端的反應將在正常還原反應(還原或選擇性還原)期間發生。
D. DAR分佈及純化
在所選實施例中，與本發明相容的結合及純化方法有利地提供產生包含窄DAR分佈之相對均勻的ADC製劑的能力。就此而言，根據藥物與經工程改造之抗體之間的化學計量比且根據毒素位置，所揭示之構築體(例如位點特異性構築體)及/或選擇性結合使得ADC物質在樣品內達成均質性。如上文所簡述，術語「藥物與抗體之比」或「DAR」係指藥物與抗體之莫耳比。在某些實施例中，結合物製劑根據其DAR分佈可為基本上均勻的，此意謂在ADC製劑內，具有特定DAR(例如DAR為2或4)的位點特異性ADC為主要物質，根據負載位點(亦即在游離半胱胺酸上)，其亦 為均勻的。在本發明之其他某些實施例中，可能經由使用位點特異性抗體及/或選擇性還原及結合達成所要均質性。在其他實施例中，所要均質性可經由使用位點特異性構築體與選擇性還原之組合來達成。在又其他實施例中，相容製劑可使用分析型或製備型層析技術純化，以得到所要均質性。在此等實施例中之每一者中，ADC樣品之均質性可使用此項技術中已知的各種技術分析，包括(但不限於)質譜、HPLC(例如尺寸排阻HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛細管電泳。
就ADC製劑之純化而言，應瞭解可使用標準醫藥製備方法獲得所要純度。如本文中所論述，諸如逆相(RP)層析及疏水性相互作用層析(HIC)之液相層析方法可根據藥物負載值分離混合物中的化合物。在一些情況下，亦可使用離子交換(IEC)或混合模式層析(MMC)分離具有特定藥物負載的物質。
所揭示之ADC及其製劑可包含各種化學計量莫耳比的藥物及抗體部分，此視抗體組態而定且至少部分地視用於達成結合的方法而定。在某些實施例中，每個ADC的藥物負載可包含1至20個彈頭(亦即n為1至20)。其他所選實施例可包含藥物負載為1至15個彈頭的ADC。在其他實施例中，ADC可包含1至12個彈頭或更佳1至10個彈頭。在一些實施例中，ADC將包含1至8個彈頭。
雖然理論藥物負載量可能相對較高，但諸如游離半胱胺酸交叉反應性及彈頭疏水性之實際限制傾向於限制包含此類DAR之均質製劑之產生，原因在於聚集物及其他污染物。亦即，較高藥物負載量(例如>8或10)會引起某些抗體-藥物結合物之聚集、不可溶性、毒性或細胞滲透性損失，此視有效負載而定。鑒於此類問題，由本發明提供之藥物負載量較佳 在每結合物1至8個藥物的範圍內，亦即其中1、2、3、4、5、6、7或8個藥物共價連接至各抗體(例如，就IgG1而言，視二硫鍵之數目而定，其他抗體可具有不同的負載容量)。本發明組合物的DAR較佳為約2、4或6且在一些實施例中，DAR包含約2。
儘管本發明所提供之均質性程度相對較高，但所揭示之組合物實際上包含結合物與一系列藥物化合物(在IgG1的情況下，潛在地為1至8個)之混合物。因而，所揭示之ADC組合物包括結合物之混合物，其中大部分組成性抗體共價連接至一或多個藥物部分且(儘管經工程改造之構築體及選擇性還原可提供相對結合物特異性)，其中藥物部分可藉由各種硫醇基連接至抗體。亦即，結合之後，本發明之ADC組合物將包含各種濃度之具有不同藥物負載量(例如每個IgG1抗體1至8個藥物)之結合物(連同主要由游離半胱胺酸交叉反應性引起之某些反應污染物一起)的混合物。然而，使用選擇性還原及製造後純化，可將結合物組合物驅向某一點，其中其主要含有單一的主要的所要ADC物質(例如藥物負載量為2)及含量相對較低之其他ADC物質(例如藥物負載量為1、4、6等)。平均DAR值表示整個組合物(亦即所有ADC物質合在一起)之藥物負載量之加權平均值。由於所用量化方法的固有不確定性及難以在商業背景下完全移除非主要的ADC物質，因此可接受之DAR值或規格往往以平均值、範圍或分佈來呈現(亦即平均DAR為2 +/- 0.5)。在醫藥背景下較佳使用包含該範圍(亦即1.5至2.5)內之平均DAR量測值的組合物。
因此，在一些實施例中，本發明將包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8(各+/-0.5)的組合物。在其他實施例中，本發明將包含2、4、6或8 +/- 0.5的平均DAR。最後，在所選實施例中，本發明將包含2 +/- 0.5或 4 +/- 0.5之平均DAR。應瞭解，在一些實施例中，該範圍或偏差可小於0.4。因此，在其他實施例中，組合物將包含1、2、3、4、5、6、7或8(各+/- 0.3)之平均DAR；2、4、6或8 +/- 0.3之平均DAR；甚至更佳為2或4 +/- 0.3之平均DAR，或甚至2 +/- 0.3之平均DAR。在其他實施例中，IgG1結合物組合物較佳包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8(各+/- 0.4)且非主要ADC物質含量相對較低(亦即小於30%)的組合物。在其他實施例中，ADC組合物將包含2、4、6或8(各+/- 0.4)之平均DAR且非主要ADC物質的含量相對較低(<30%)。在一些實施例中，ADC組合物將包含2 +/- 0.4之平均DAR且非主要ADC物質之含量相對較低(<30%)。在又其他實施例中，主要ADC物質(例如DAR為2或DAR為4)當相對於組合物中存在的所有其他DAR物質量測時，將以大於50%之濃度、以大於55%之濃度、以大於60%之濃度、以大於大於65%之濃度、以大於70%之濃度、以大於75%之濃度、以大於80%之濃度、以大於85%之濃度、以大於90%之濃度、以大於93%之濃度、以大於95%之濃度或甚至以大於97%之濃度存在。
如下文實例中所詳述，結合反應所得之ADC製劑中的單位抗體藥物分佈可藉由習知方式表徵，諸如UV-Vis分光光度法、逆相HPLC、HIC、質譜法、ELISA及電泳。亦可根據單位抗體藥物數來確定量化ADC分佈。可藉由ELISA測定特定ADC製劑中之單位抗體藥物平均值。然而，單位抗體藥物之分佈值無法根據抗體-抗原結合及ELISA偵測極限來辨別。此外，用於偵測抗體-藥物結合物的ELISA分析並不判定藥物部分與抗體之連接處，諸如重鏈或輕鏈片段或特定胺基酸殘基。
VI. 醫藥製劑及治療用途 A. 調配物及投藥途徑
本發明之抗體或ADC可使用此項技術中公認之技術、以各種方式調配。在一些實施例中，本發明之治療組合物可純淨投與或與最少量之附加組分一起投與，而其他可視情況調配成含有適合的醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包含此項技術中熟知之賦形劑、媒劑、佐劑及稀釋劑且可以獲自用於醫藥製劑之商業來源(參見例如Gennaro(2003)Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons：Drugfacts Plus，第20版，Mack Publishing；Ansel等人(2004)Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippencott Williams and Wilkins；Kibbe等人(2000)Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Pharmaceutical Press)。
醫藥學上可接受之適合載劑包含相對呈惰性且可促進抗體投與或可有助於將活性化合物加工成醫藥學上針對傳遞至作用位點最佳化之製劑的物質。
此類醫藥學上可接受之載劑包括可更改調配物之形式、稠度、黏度、pH、張力、穩定性、容積滲透濃度、藥物動力學、蛋白質聚集或溶解度的藥劑且包括緩衝劑、濕潤劑、乳化劑、稀釋劑、囊封劑及皮膚穿透增強劑。載劑之某些非限制性實例包括鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、精胺酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨糖醇、聚葡萄糖、羧甲基纖維素鈉及其組合。全身性投與之抗體可根據經腸、非經腸或局部投藥來調配。實際上，所有三種類型的調配物可同時使用以達成活性成分的全身性投與。賦形劑以及用於非經腸及經腸藥物傳遞之調配物闡述於Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2000)第20版Mack Publishing中。
適用於經腸投與的調配物包括硬或軟明膠膠囊、丸劑、錠劑(包括包衣錠劑)、酏劑、懸浮液、糖漿或吸入劑及其控制釋放形式。
適於非經腸投與(例如藉由注射)之調配物包括水性或非水性、等張性、無熱原質、無菌液體(例如溶液、懸浮液)，其中活性成分溶解、懸浮或以其他方式提供(例如在脂質體或其他微粒中)。此類液體可另外含有醫藥學上可接受之其他載劑，諸如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑及使得調配物與預期接受者之血液(或其他相關體液)等張的溶質。賦形劑之實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油及其類似物。適用於此類調配物中之醫藥學上可接受之等張性載劑的實例包括氯化鈉注射液、林格氏溶液(Ringer's Solution)或乳酸化林格氏注射液。
用於非經腸投與(例如靜脈內注射)的相容性調配物可包含濃度為約10μg/mL至約100μg/mL的ADC或抗體。在某些所選實施例中，抗體或ADC濃度將包含20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1mg/mL。在其他實施例中，ADC濃度將包含2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。
本發明之化合物及組合物可藉由多種途徑向有需要的個體活體內投與，包括(但不限於)經口、靜脈內、動脈內、皮下、非經腸、鼻內、肌肉 內、心內、腦室內、氣管內、經頰、經直腸、腹膜內、皮內、局部、經皮及鞘內，或另外藉由植入或吸入。本發明組合物可調配成呈固體、半固體、液體或氣態形式的製劑；包括(但不限於)錠劑、膠囊、散劑、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑及氣霧劑。適當調配物及投藥途徑可根據預定應用及治療方案選擇。
B. 劑量及給藥方案
特定給藥方案(亦即劑量、時間安排及重複次數)將視特定個體以及經驗考慮因素而定，諸如藥物動力學(例如半衰期、清除率等)。投藥頻率可由熟習此項技術者(諸如主治醫師)根據如下考慮因素確定：所治療病狀及病狀的嚴重程度、所治療個體之年齡及一般健康狀態及其類似因素。可根據所選組合物及給藥方案之功效評估來調整治療過程中之投藥頻率。此類評估可根據特定疾病、病症或病狀之標記物來進行。在個體患有癌症的實施例中，此等評估包括經由觸診或目視觀測來直接量測腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤大小；如藉由直接腫瘤活組織檢查及顯微鏡下檢查腫瘤樣品評估所得之改良；量測間接腫瘤標記物(例如用於前列腺癌之PSA)或根據本文所述方法鑑別的抗原；增殖性或致瘤細胞的數目減少、此類贅生性細胞之減少得以維持；贅生性細胞之增殖減少；或轉移之形成延遲。
本發明之CLDN抗體或ADC可以多種範圍投與。此等範圍包括每劑量每公斤體重約5μg至每公斤體重約100mg；每劑量每公斤體重約50μg至每公斤體重約5mg；每劑量每公斤體重約100μg至每公斤體重約10mg。其他範圍包括每劑量每公斤體重約100μg至每公斤體重約20mg及每劑量每公斤體重約0.5mg至每公斤體重約20mg。在某些實施例中，劑量 為每公斤體重至少約100μg、每公斤體重至少約250μg、每公斤體重至少約750μg、每公斤體重至少約3mg、每公斤體重至少約5mg、每公斤體重至少約10mg。
在所選實施例中，CLDN ADC將以約0.001mg/kg至約1g/kg之劑量投與(較佳靜脈內投與)。在某些實施例中，ADC可按以下濃度投與：0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.16mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg或1g/kg。根據本文中之教示內容，熟習此項技術者可根據臨床前動物研究、臨床觀測結果及標準醫學及生物化學技術及量測結果容易地確定各種CLDN ADC的適當劑量。
可根據體表面積(BSA)計算來預測其他給藥方案，如U.S.P.N.14/509809中所揭示。正如所熟知，BSA係使用患者身高及體重來計算且提供如藉由他或她的體表面積所表示之個體體型之量度。
抗CLDN抗體或ADC可按特定時程投與。一般而言，向個體投與有效劑量之CLDN結合物一或多次。更特定言之，向個體投與有效劑量之ADC，一月一次、一月超過一次或一月少於一次。在某些實施例中，可多次投與有效劑量之CLDN抗體或ADC，包括持續至少一個月、至少六個月、至少一年、至少兩年時間或數年時間。在其他實施例中，所揭示之抗 體或ADC投與之間隔時間可為數日(2、3、4、5、6或7日)、數週(1、2、3、4、5、6、7或8週)或數月(1、2、3、4、5、6、7或8個月)或甚至一年或數年。
在一些實施例中，涉及所結合抗體的治療過程將包含在數週或數月期間所選藥品之多次給藥。更特定言之，本發明之抗體或ADC可每天、每兩天、每四天、每週、每十天、每兩週、每三週、每個月、每六週、每兩個月、每十週或每三個月投與一次。就此而言，應瞭解可根據患者反應及臨床實務來改變劑量或調整間隔時間。本發明亦涵蓋不連續投藥或分成數次部分投藥的日劑量。本發明組合物及抗癌劑可互換地隔日或隔週輪流投與；或可進行一系列抗體治療，隨後為抗癌劑療法之一或多次治療。在任何情況下，如一般技術者所瞭解，化學治療劑的適當劑量通常大約為臨床療法中已使用的彼等劑量，其中化學治療劑單獨或與其他化學治療劑組合投與。
在某些實施例中，本發明提供用於治療癌症之抗CLDN抗體藥物結合物，其中該治療可包含投與有效量之抗CLDN抗體藥物結合物(CLDN ADC)，至少每週一次(QW)、至少每兩週一次(Q2W)、至少每三週一次(Q3W)、至少每四周一次(Q4W)、至少每五週一次(Q5W)、至少每六週一次(Q6W)、至少每七週一次(Q7W)、至少每八週一次(Q8W)、至少每九週一次(Q9W)或至少每十週一次(Q10W)。在所選實施例中，CLDN ADC將至少每兩週(Q2W)、至少每三週(Q3W)、至少每四週一次(Q4W)、至少每五週一次(Q5W)或至少每六週一次(Q6W)地投與。在其他所選實施例中，CLDN ADC將以約0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg或0.8mg/kg之劑量投與。所 選實施例將包含藉由單次投與CLDN ADC來治療患者。某些其他實施例將包含按指定時間間隔(亦即Q2W、Q3W、Q4W、Q5W、Q6W等)治療患者，持續兩個週期(×2)、持續三個週期(×3)、持續四個週期(×4)、持續五個週期(×5)或持續六個週期(×6)。在其他實施例中，可完成初始CLDN ADC治療(x個週期)且不進行進一步CLDN ADC治療，直至癌症顯示進展跡象(在進展時治療)。在其他實施例中，可完成初始CLDN ADC治療(x個週期)，且隨後對患者進行維持療法(例如，0.1mg/kg CLDN ADC Q6W，無限期地)。
在本發明之一些態樣中，CLDN ADC將包含PBD。在又其他態樣中，靜脈內投與CLDN ADC。在某些其他態樣中，待治療之癌症包含小細胞肺癌(SCLC)或大細胞神經內分泌癌(LCNEC)。在其他所選態樣中，待治療之癌症患者包含第二線患者(亦即，先前經治療之患者)。在其他實施例中，待治療之癌症患者包含第三線患者(亦即，先前已治療兩次之患者)。
本發明之某些較佳實施例包含每3週用0.2mg/kg CLDN ADC治療患者，持續3個週期(0.2mg/kg Q3W×3)。在所選實施例中，待以0.2mg/kg Q3W×3治療之患者患有SCLC。在其他實施例中，待以0.2mg/kg Q3W×3治療之患者患有LCNEC。在一些態樣中，患者之癌症尚未經過治療。在某些態樣中，患者將包含第二線患者。在其他實施例中，患者將包含第三線患者。在其他態樣中，在0.2mg/kg Q3W×3治療週期之後治療有進展的患者。在又其他態樣中，患者在0.2mg/kg Q3W×3治療週期之後轉為CLDN ADC維持療法。
本發明之某些其他較佳實施例包含每6週用0.3mg/kg CLDN ADC治 療患者，持續2個週期(0.3mg/kg Q6W×2)。如下文在實例中所示，此類方案可為特別有效的(展現有效治療指數)，因為本發明CLDN ADC之半衰期相對較長。在所選實施例中，待以0.3mg/kg Q6W×2治療之患者患有SCLC。在其他實施例中，待以0.3mg/kg Q6W×2治療之患者患有LCNEC。在一些態樣中，患者之癌症尚未經過治療。在某些態樣中，患者將包含第二線患者。在其他實施例中，患者將包含第三線患者。在其他態樣中，在0.3mg/kg Q6W×2治療週期之後治療有進展的患者。在又其他態樣中，患者在0.3mg/kg Q6W×2治療週期之後轉為CLDN ADC維持療法。
在其他實施例中，本發明之CLDN ADC可在任一週期中以不同劑量投與。舉例而言，可以相對較高劑量(例如，0.5mg/kg)投與藥物(亦即，負載或藥物負載)，隨後在四週後(Q4W)投與較低劑量之CLDN ADC(例如，0.2mg/kg)作為同一週期之一部分。此類週期可再次重複(2×、3×等)或延遲直至進展(在進展時治療)或繼之以CLDN ADC維持(例如，0.1mg/kg Q4W，無限期)。
在另一實施例中，本發明之CLDN抗體或ADC可在維持療法中用於降低或消除疾病初始呈現之後的腫瘤復發機率。無論第一治療係與CLDN ADC或另一化學治療劑一起，均可使用此類維持療法。較佳地，病症已經過治療且初始腫瘤塊已消除、減小或以其他方式得到改善，因此患者無症狀或處於緩解狀態。在這種時候，可向個體投與醫藥學上有效量之所揭示之ADC一或多次，即使使用標準診斷程序存在極少疾病病症或無疾病病症。
在另一較佳實施例中，本發明抗體可在預防上使用或作為輔助療法 用於在減積程序之後預防腫瘤轉移或降低腫瘤轉移之可能性。如本發明所用，「減積程序」意謂減少或改善腫瘤或腫瘤增殖的任何程序、技術或方法。例示性減積程序包括(但不限於)手術、放射治療(亦即放射束)、化學療法、免疫療法或消融。在熟習此項技術者根據本發明容易確定的適當時間，可投與所揭示之ADC，如藉由減少腫瘤轉移的臨床、診斷或治療診斷程序所表明。
然而，本發明之其他實施例包含將所揭示之ADC投與無症狀、但處於患上癌症之風險中的個體。亦即，本發明ADC可在真正的預防意義上使用且給予已檢查或測試且具有一或多個指定風險因素(例如基因組適應症、家族史、活體內或活體外測試結果等)、但尚未出現贅瘤的患者。
亦可憑經驗確定所揭示之治療組合物在已投藥一或多次之個體中的劑量及療法。舉例而言，可將遞增劑量之如本文所述製造之治療組合物給予個體。在所選實施例中，可分別根據憑經驗確定或所觀測到之副作用或毒性來逐漸增加或降低或減少劑量。為評估所選組合物之功效，可如先前所述沿用特定疾病、病症或病狀之標記物。對於癌症而言，此等評估包括經由觸診或目視觀測來直接量測腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤大小；如藉由直接腫瘤活組織檢查及顯微鏡下檢查腫瘤樣品評估所得之改良；量測間接腫瘤標記物(例如用於前列腺癌之PSA)或根據本文所述方法鑑別的致瘤抗原；疼痛或麻痹減少；與腫瘤相關之言語、視力、呼吸或其他失能改善；食慾增加；或生活品質提高，如藉由所接受之測試或存活期延長所量測。對於熟習此項技術者顯而易見的是，劑量將視以下而變化：個體、贅生性病狀類型、贅生性病狀階段、個體之贅生性病狀是否開始轉移至其他位置，及所用的以往療法及並行療法。
C. 組合療法
CLDN蛋白質表現於上皮細胞之緊密連接中，其中認為CLDN蛋白質建立旁細胞屏障，控制分子在上皮細胞之間的細胞間隙中之流動。使用抗CLDN抗體可破壞上皮細胞之緊密連接且由此改良對原本將不能夠穿透癌細胞之療法的利用。因此，與本發明之抗CLDN抗體及ADC組合使用各種療法可適用於預防或治療癌症及防止癌症轉移或復發。如本文所用，「組合療法」意謂投與包含至少一種抗CLDN抗體或ADC與至少一種治療部分(例如抗癌劑)之組合，其中該組合在治療癌症時相對於以下而言較佳具有治療協同作用或改良可量測的治療作用：(i)單獨使用的抗CLDN抗體或ADC；或(ii)單獨使用的治療部分；或(iii)治療部分與另一治療部分組合使用而未添加抗CLDN抗體或ADC。如本文所用，術語「治療協同作用」意謂抗CLDN抗體或ADC與一或多個治療部分組合的治療作用大於抗CLDN抗體或ADC與一或多種治療部分組合之相加作用。
藉由與對照或基線量測結果進行比較來量化所揭示之組合的所要結果。如本文所用，諸如「改良」、「提高」或「減少」之相對性術語表示相對於對照而言的值，對照諸如同一個體在本文所述之治療起始前的量測值；或在不存在本文所述之抗CLDN抗體或ADC、但存在其他治療部分(諸如標準照護療法)的情況下，對照個體(或多個對照個體)的量測值。代表性對照個體為所罹患癌症形式與所治療個體相同、年齡與所治療個體大致相同(以確保所治療個體與對照個體之疾病階段類似)的個體。
回應於療法的變化或改善通常具有統計顯著性。如本文所用，術語「顯著性」或「顯著」係指在兩個或更多個實體之間存在非隨機關聯之機率的統計學分析。為確定關係是否「顯著」或具有「顯著性」，可計算「p 值」。低於使用者定義之截止點的p值視為顯著。p值小於或等於0.1、小於0.05、小於0.01、小於0.005或小於0.001可視為顯著。
協同治療作用可為比單一治療部分或抗CLDN抗體或ADC所引起之治療作用或所指定組合中之抗CLDN抗體或ADC或單一治療部分所引起之治療作用的總和大至少約兩倍的作用，或大至少約五倍，或大至少約十倍，或大至少約二十倍，或大至少約五十倍，或大至少約一百倍。協同治療作用亦可觀測為治療作用相較於單一治療部分或抗CLDN抗體或ADC所引起之治療作用或所指定組合中之抗CLDN抗體或ADC或單一治療部分所引起之治療作用的總和提高至少10%，或至少20%，或至少30%，或至少40%，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少100%或更高。協同作用亦為當治療劑組合使用時允許治療劑之劑量降低的作用。
在實施組合療法時，抗CLDN抗體或ADC及治療部分可以單一組合物或以兩種或更多種不同組合物使用相同或不同投與途徑同時投與個體。或者，抗CLDN抗體或ADC治療可先於或後於治療部分治療，例如數分鐘至數週範圍內之時間間隔。在一個實施例中，治療部分與抗體或ADC彼此間在約5分鐘至約兩週內投與。在其他實施例中，抗體與治療部分之投與之間可以間隔數天(2、3、4、5、6或7)、數週(1、2、3、4、5、6、7或8)或數月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
組合療法可按各種時程投與，諸如每天一次、兩次或三次、每兩天一次、每三天一次、每週一次、每兩週一次、每個月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每六個月一次，直至病狀得到治療、緩解或治癒，或可連續投與。抗體與治療部分可隔日或隔週輪流投與；或可給予一系列抗 CLDN抗體或ADC治療，隨後為其他治療部分之一或多個治療。在一個實施例中，抗CLDN抗體或ADC係與一或多個治療部分組合投與較短的治療週期。在其他實施例中，組合治療投與較長的治療週期。組合療法可經由任何途徑投與。
在所選實施例中，本發明的化合物及組合物可聯合諸如PD-1抑制劑或PDL-1抑制劑之檢查點抑制劑使用。PD-1連同其配位體PD-L1一起為抗腫瘤T淋巴細胞反應之負調節劑。在一個實施例中，組合療法可包含將抗CLDN抗體或ADC與抗PD-1抗體(例如派立珠單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、皮立珠單抗(pidilizumab))及視情況選用之一或多個其他治療部分一起投與。在另一實施例中，組合療法可包含將抗CLDN抗體或ADC與抗PD-L1抗體(例如艾維路單抗(avelumab)、阿特唑單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab))及視情況選用之一或多個其他治療部分一起投與。在又另一實施例中，組合療法可包含將抗CLDN抗體或ADC與抗PD-1抗體或抗PD-L1一起投與，投與給在用檢查點抑制劑及/或靶向BRAF組合療法(例如維羅非尼(vemurafenib)或達拉非尼(dabrafinib))治療之後繼續進展的患者。
1. 卵巢癌
大部分卵巢癌患者發病時具有普遍疾病。雖然超過80%之此等女性受益於第一線療法(其由侵襲性腫瘤減積及與鉑-紫杉烷療法之組合療法組成)，但自診斷起15個月之中值，幾乎在所有此等患者中發生腫瘤復發(Hennessy、Coleman及Markman,2009)。卵巢癌之年死亡率為發病率之約65%。在包括紫杉烷在內之當代試驗之前，藉由鉑基組合療法，經次佳減積之III期及IV期患者顯示低於10%之5年存活率。藉由靜脈內紫杉烷及 腹膜內鉑加紫杉烷之組合，經最佳減積之III期及IV期患者達成66個月之中值存活期(Armstrong等人，2006)。
經診斷患有卵巢上皮癌、輸卵管癌及原發性腹膜癌的患者中約80%將在基於鉑及基於紫杉烷之第一線化學療法之後復發。在含鉑療法完成6個月內發生的臨床復發視為鉑難治性或耐鉑性復發。使用蒽環黴素、紫杉烷、拓朴替康(topotecau)、依託泊苷及吉西他濱(gemcitabine)作為此等復發之單一藥劑；然而，反應率適中(19-27%)。在2期研究中，拓朴替康作為單一藥劑產生在13%至16.3%範圍之間的總反應率(「ORR」)。在耐鉑性患者群體中，每週一次拓朴替康與每週兩次貝伐單抗(bevacizumab)組合顯示25%之ORR率。諸如貝伐單抗及奧拉帕尼(olaparib)之靶向療法可用於先前未經貝伐單抗治療之患者及分別針對有害的BRCA1或BRCA2突變的腫瘤測試呈陽性的患者。在2期研究中，在復發性或耐鉑性疾病中，單一藥劑貝伐單抗產生在16%至21%範圍之間的ORR。相較於單獨化學療法30.9%之ORR率，貝伐單抗加化學療法展現6.7個月之中值無進展存活期(「PFS」)。療法之間的OS不存在統計學上顯著之差異。在2期研究中，在患有耐鉑性BRCA1及2生殖系卵巢癌的患者中，單一藥劑奧拉帕尼產生34%之反應率及7.9個月之反應持續時間。奧拉帕尼當前推薦給已接受3線或更多次化學療法且具有生殖系BRCA突變的晚期卵巢癌患者。
因此在一些實施例中，抗CLDN ADC可與各種第一線癌症治療組合使用。在一個實施例中，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及細胞毒性劑及視情況選用之一或多個其他治療部分，細胞毒性劑諸如異環磷醯胺(ifosfamide)、絲裂黴素C(mytomycin C)、長春地辛(vindesine)、長春鹼、依託泊苷、伊立替康(ironitecan)、吉西他濱、紫杉烷、長春瑞濱 (vinorelbine)、甲胺喋呤及培美曲塞(pemetrexed)。
在另一實施例中，例如在治療卵巢癌時，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及貝伐單抗及視情況選用之一或多個其他治療部分(例如吉西他濱及/或鉑類似物)。
在另一實施例中，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及鉑基藥物(例如卡鉑(carboplatin)或順鉑(cisplatin))及視情況選用之一或多個其他治療部分(例如長春瑞濱；吉西他濱；紫杉烷，諸如多西他賽(docetaxel)或太平洋紫杉醇；伊立替康；或培美曲塞)。
2. 乳癌
本發明ADC可用以治療乳癌。在一個態樣中，本發明包含一種治療乳癌(例如TNBC)之方法，其包含投與醫藥組合物，該醫藥組合物包含抗CLDN ADC以及本文所揭示之另一治療部分。在一個實施例中，例如在治療BR-ERPR、BR-ER或BR-PR癌症時，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及一或多種描述為「激素療法」的治療部分。如本文所用，「激素療法」係指例如他莫昔芬(tamoxifen)；促性腺素或促黃體釋放激素(GnRH或LHRH)；依維莫司(everolimus)及依西美坦(exemestane)；托瑞米芬(toremifene)；或芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)或氟維司群(fulvestrant))。
在另一實施例中，例如在治療BR-HER2時，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及曲妥珠單抗(trastuzumab)或阿多-曲妥珠單抗恩他新(ado-trastuzumab emtansine)及視情況選用之一或多個其他治療部分(例如帕妥珠單抗(pertuzumab)及/或多西他賽)。
在一些實施例中，例如在治療轉移性乳癌時，組合療法包含使用抗 CLDN抗體或ADC及紫杉烷(例如多西他賽或太平洋紫杉醇)及視情況選用之其他治療部分，例如蒽環黴素(例如小紅莓或表柔比星)及/或艾日布林(eribulin)。
在另一實施例中，例如在治療轉移性或復發性乳癌或BRCA突變型乳癌時，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及甲地孕酮(megestrol)及視情況選用之其他治療部分。
在其他實施例中，例如在治療BR-TNBC時，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑(例如BMN-673、奧拉帕尼(olaparib)、如卡帕瑞(rucaparib)及維利帕尼(veliparib))及視情況選用之其他治療部分。
在另一實施例中，例如在治療乳癌時，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及環磷醯胺及視情況選用之其他治療部分(例如小紅莓、紫杉烷、表柔比星、5-FU及/或甲胺喋呤)。
3. 肺癌
本發明ADC可用以治療乳癌。在一個態樣中，本發明包含一種治療肺癌(例如肺鱗狀細胞癌或肺腺癌)之方法，其包含投與醫藥組合物，該醫藥組合物包含抗CLDN ADC以及本文所揭示之另一治療部分。在另一實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC的組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及阿法替尼(afatinib)及視情況選用之一或多個其他治療部分(例如埃羅替尼(erlotinib)及/或貝伐單抗)。
在另一實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC的組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及埃羅替尼及視情況選用之一或多個其他治療部分(例如貝伐單抗)。
在另一實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC的組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及色瑞替尼(ceritinib)及視情況選用之一或多個其他治療部分。
在另一實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC的組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及克卓替尼(crizotinib)及視情況選用之一或多個其他治療部分。
在另一實施例中，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及貝伐單抗及視情況選用之一或多個其他治療部分(例如紫杉烷，諸如多西他賽或太平洋紫杉醇；及/或鉑類似物)。
在一個實施例中，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及鉑基藥物(例如卡鉑或順鉑)類似物及視情況選用之一或多個其他治療部分(例如紫杉烷，諸如多西他賽及太平洋紫杉醇)。
在一個實施例中，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及鉑基藥物(例如卡鉑或順鉑)類似物及視情況選用之一或多個其他治療部分(例如紫杉烷，諸如多西他賽及太平洋紫杉醇，及/或吉西他濱及/或小紅莓)。
在一特定實施例中，用於治療耐鉑性腫瘤的組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及小紅莓及/或依託泊苷及/或吉西他濱及/或長春瑞濱及/或異環磷醯胺及/或甲醯四氫葉酸調節之5-氟尿嘧啶及/或貝伐單抗及/或他莫昔芬；及視情況選用之一或多個其他治療部分。
在另一實施例中，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及PARP抑制劑及視情況選用之一或多個其他治療部分。
在另一實施例中，組合療法包含使用抗CLDN抗體或ADC及貝伐單抗及視情況選用之環磷醯胺。
組合療法可包含抗CLDN抗體或ADC及對包含突變型或異常表現之基因或蛋白質(例如BRAF V600E)之腫瘤(例如黑色素瘤)有效的化學治療部分。
T淋巴細胞(例如細胞毒性淋巴細胞(CTL))在宿主中起防禦惡性腫瘤的重要作用。CTL藉由抗原呈遞細胞呈遞腫瘤相關抗原而活化。特定活性免疫療法為一種可用於增強T淋巴細胞對癌症之反應的方法，其藉由用來源於已知癌症相關抗原的肽接種患者而達成。在一個實施例中，組合療法可包含抗CLDN抗體或ADC及針對癌症相關抗原(例如黑色素細胞譜系特異性抗原酪胺酸酶、gp100、Melan-A/MART-1或gp75)的疫苗。在其他實施例中，組合療法可包含投與抗CLDN抗體或ADC且活體外擴增、活化及授受性再引入自體CTL或自然殺手細胞。CTL活化亦可藉由增強抗原呈遞細胞呈遞腫瘤抗原的策略來促進。顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)促進樹突狀細胞之募集及樹突狀細胞交叉致敏之活化。在一個實施例中，組合療法可包含分離抗原呈遞細胞；用刺激性細胞激素(例如GM-CSF)活化此類細胞；用腫瘤相關抗原致敏；且隨後將抗原呈遞細胞授受性再引入患者中，且使用抗CLDN抗體或ADC及視情況選用之一或多個不同治療部分。
本發明亦提供抗CLDN抗體或ADC與放射線療法之組合。如本文所用，術語「放射線療法」意謂局部誘導腫瘤細胞內發生DNA損傷的任何機制，諸如γ照射、X射線、UV照射、微波、電子發射及其類似機制。亦涵蓋使用放射性同位素定向傳遞至腫瘤細胞的組合療法，且其可組合使用或以本文中揭示之抗CLDN抗體之結合物形式使用。典型地，在約1至約2週之一段時間內脈衝投與放射線療法。視情況，放射線療法可以單一劑量 投與或以多個劑量依序投與。
在其他實施例中，抗CLDN抗體或ADC可與一或多種下述抗癌劑組合使用。
D. 抗癌劑
如本文所用，術語「抗癌劑」或「化學治療劑」為「治療部分」之一個子類，「治療部分」又為描述為「醫藥活性部分」之藥劑之子類。更特定言之，「抗癌劑」意謂可用於治療細胞增殖性病症(諸如癌症)的任何藥劑，且包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射線療法及放射冶療劑、靶向抗癌劑、生物反應調節劑、治療抗體、癌症疫苗、細胞激素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。應瞭解，在如上文所論述的所選實施例中，此類抗癌劑可包含結合物且可在投與前與抗體結合。在某些實施例中，所揭示之抗癌劑連接至抗體以提供如本文所揭示的ADC。
術語「細胞毒性劑」(亦可為抗癌劑)意謂對細胞具有毒性且降低或抑制細胞功能及/或引起細胞毀壞的物質。典型地，該物質為來源於活有機體的天然存在之分子(或以合成方式製備的天然產物)。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)細菌(例如白喉毒素、假單胞菌內毒素及外毒素、葡萄球菌腸毒素A)、真菌(例如α-帚麴菌素(α-sarcin)、侷限麴菌素(restrictocin))、植物(例如相思子毒素、蓖麻毒素、莫迪素(modeccin)、槲寄生素(viscumin)、商陸抗病毒蛋白質、皂草素、白樹素(gelonin)、苦瓜蛋白(momoridin)、天花粉素(trichosanthin)、大麥毒素、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、康乃馨(dianthin)蛋白質、美洲商陸(Phytolacca mericana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑 制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、有絲分裂素(mitegellin)、侷限麴菌素、酚黴素(phenomycin)、新黴素(neomycin)及單端孢黴烯(tricothecenes))或動物(例如細胞毒性RNA酶，諸如細胞外胰臟RNA酶；DNA酶I，包括其片段及/或變異體)之小分子毒素或酶促活性毒素。
抗癌劑可包括抑制或設計成抑制癌細胞或可能癌變或產生致瘤後代之細胞(例如致瘤細胞)的任何化學藥劑。此類化學藥劑往往針對細胞生長或分裂所需的細胞內過程，且因此對通常快速生長及分裂的癌細胞特別有效。舉例而言，長春新鹼使微管解聚合且因此抑制細胞進入有絲分裂。此類藥劑往往且往往最有效地以組合方式投與，例如調配物CHOP。此外，在所選實施例中，此類抗癌劑可與所揭示之抗體結合，得到ADC。
可與本發明抗體組合使用(或結合)之抗癌劑的實例包括(但不限於)烷基化劑、磺酸烷基酯、阿那曲唑、瓢菌素、氮丙啶(aziridine)、乙烯亞胺及甲基三聚氰胺、多聚乙醯(acetogenin)、喜樹鹼(camptothecin)、BEZ-235、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑素(bryostatin)、卡利斯他汀(callystatin)、CC-1065、色瑞替尼、克卓替尼、念珠藻環-肽(cryptophycin)、海兔毒素、多卡米辛、艾榴素(eleutherobin)、埃羅替尼、水鬼蕉鹼(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海綿抑素(spongistatin)、氮芥(nitrogen mustard)、抗生素、烯二炔達內黴素(enediyne dynemicin)、雙膦酸鹽(bisphosphonate)、埃斯波黴素、色素蛋白烯二炔抗生素發色團(chromoprotein enediyne antiobiotic chromophore)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素、放線菌素C (cactinomycin)、康弗醯胺(canfosfamide)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、環磷醯胺、更生黴素、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓、表柔比星、依索比星(esorubicin)、依西美坦、氟尿嘧啶、氟維司群、吉非替尼(gefitinib)、艾達黴素(idarubicin)、拉帕替尼(lapatinib)、來曲唑、洛那法尼(lonafarnib)、麻西羅黴素(marcellomycin)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、絲裂黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、帕佐泮尼(pazopanib)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、雷帕黴素(rapamycin)、羅多比星(rodorubicin)、索拉非尼(sorafenib)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、替泊啶(tepodina)、替吡法尼(tipifarnib)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凡德他尼(vandetanib)、伏羅唑(vorozole)、XL-147、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗腎上腺、葉酸補充劑，諸如亞葉酸、乙醯葡醛酯、醛磷醯胺糖苷、胺基乙醯丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、倍思塔布(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、艾達曲克(edatraxate)、得弗伐胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾弗鳥胺酸(elfornithine)、依利醋銨(elliptinium acetate)、埃坡黴素、依託格魯(etoglucid)、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖(lentinan)、羅尼達寧(lonidainine)、類美登素(maytansinoids)、丙脒腙(mitoguazone)、米托蒽醌、莫哌達醇 (mopidanmol)、硝拉維林(nitraerine)、噴司他汀(pentostatin)、凡那明(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-乙基醯肼、丙卡巴肼(procarbazine)、多醣複合物、雷佐生(razoxane)；根瘤菌素((rhizoxin)；SF-1126、西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；新月毒素(trichothecene)(T-2毒素)、黏液黴素A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌毒素(anguidine)；烏拉坦(urethan)；長春地辛；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)；環磷醯胺；噻替派(thiotepa)；類紫杉醇、苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物、長春鹼；鉑；依託泊苷；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素；胺基喋呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康、拓撲異構酶(topoisomerase)抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸；類視黃素；卡培他濱(capecitabine)；康柏斯達汀(combretastatin)；甲醯四氫葉酸；奧沙利鉑(oxaliplatin)；XL518、減少細胞增殖之PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A之抑制劑；及以上各者中的任一者之醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。此定義中亦包括用來調節或抑制對腫瘤之激素作用的抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體抗體；抑制芳香酶的芳香酶抑制劑(芳香酶調節腎上腺產生雌激素)，及抗雄激素；以及曲沙他濱 (troxacitabine)(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑及HER2表現抑制劑；疫苗、PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞濱及埃斯波黴素；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
抗癌劑包含商業上或臨床上可獲得的化合物，諸如埃羅替尼(TARCEVA®，Genentech/OSI Pharm.)、多西他賽(TAXOTERE®，Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS號51-21-8)、吉西他濱(GEMZAR®，Lilly)、PD-0325901(CAS號391210-10-9，Pfizer)、順鉑(順二胺二氯鉑(II)，CAS號15663-27-1)、卡鉑(CAS號41575-94-4)、太平洋紫杉醇(TAXOL®，Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN®，Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS號85622-93-1，TEMODAR®、TEMODAL®，Schering Plough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺，NOLVADEX®、ISTUBAL®、VALODEX®)及小紅莓(ADRIAMYCIN®)。其他商業上或臨床上可獲得的抗癌劑包含奧沙利鉑(ELOXATIN®，Sanofi)、硼替佐米(VELCADE®，Millennium Pharm.)、舒癌特(sutent)(SUNITINIB®，SU11248,Pfizer)、來曲唑(FEMARA®，Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(GLEEVEC®，Novartis)、XL-518(Mek抑制劑，Exelixis,WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制劑，AZD6244，Array BioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147(PI3K抑 制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟維司群(FASLODEX®，AstraZeneca)、甲醯四氫葉酸(醛葉酸)、雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus)，RAPAMUNE®,Wyeth)、拉帕替尼(TYKERB®，GSK572016,Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SARASARTM，SCH 66336,Schering Plough)、索拉非尼(NEXAVAR®，BAY43-9006,Bayer Labs)、吉非替尼(IRESSA®，AstraZeneca)、伊立替康(CAMPTOSAR®，CPT-11,Pfizer)、替吡法尼(ZARNESTRATM，Johnson & Johnson)、ABRAXANETM(不含克列莫佛(Cremophor))、太平洋紫杉醇之經白蛋白工程改造之奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Il)、凡德他尼(rINN，ZD6474，ZACTIMA®,AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、替西羅莫司(temsirolimus)(TORISEL®，Wyeth)、帕佐泮尼(GlaxoSmithKline)、康弗醯胺(TELCYTA®，Telik)、噻替派及環磷醯胺(CYTOXAN®、NEOSAR®)、長春瑞濱(NAVELBINE®)、卡培他濱(XELODA®，Roche)、他莫昔芬(包括NOLVADEX®；檸檬酸他莫昔芬)、FARESTON®(檸檬酸托瑞米芬)、MEGASE®(乙酸甲地孕酮)、AROMASIN®(依西美坦；Pfizer)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR®(伏羅唑)、FEMARA®(來曲唑；Novartis)及ARIMIDEX®(阿那曲唑；AstraZeneca)。
術語「醫藥學上可接受之鹽」或「鹽」意謂分子或大分子之有機鹽或無機鹽。酸加成鹽可經由胺基形成。例示性鹽包括(但不限於)硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸 鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽(tannate)、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、丁二酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、葡糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(亦即1,1'-亞甲基-雙(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。醫藥學上可接受之鹽可涉及包括另一個分子，諸如乙酸根離子、丁二酸根離子或其他相對離子。相對離子可為使母化合物上之電荷穩定之任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽的結構中可具有超過一個帶電原子。在多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽之一部分的情況下，該鹽可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。
「醫藥學上可接受之溶劑合物」或「溶劑合物」係指一或多個溶劑分子與分子或大分子之締合物。形成醫藥學上可接受之溶劑合物之溶劑的實例包括(但不限於)水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺。
在其他實施例中，本發明之抗體或ADC可與當前臨床試驗中或市售之多種抗體(或免疫治療劑)中之任一者組合使用。所揭示之抗體可與選自由以下組成之群的抗體組合使用；阿巴伏單抗(abagovomab)、阿達木單抗(adecatumumab)、阿托珠單抗(afutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿瑪西單抗(amatuximab)、麻安莫單抗(anatumomab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿特唑單抗(atezolizumab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比伐珠單抗(bivatuzumab)、布林莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、 卡托莫西單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他土珠(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、昔瓦土單抗(clivatuzumab)、康納木單抗(conatumumab)、達土木單抗(daratumumab)、德珠單抗(drozitumab)、杜里土單抗(duligotumab)、杜西吉土單抗(dusigitumab)、地莫單抗(detumomab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛圖單抗(dalotuzumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩斯土昔單抗(ensituximab)、鄂托默單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、伐吐珠單抗(farletuzumab)、費拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、非吉單抗(figitumumab)、法蘭土單抗(flanvotumab)、浮土西單抗(futuximab)、加尼圖單抗(ganitumab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、吉瑞昔單抗(girentuximab)、格雷巴土木單抗(glembatumumab)、異貝莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、伊姆加土珠單抗(imgatuzumab)、因達西單抗(indatuximab)、伊諾妥珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛瓦土珠單抗(lorvotuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、瑪帕單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫昔土莫單抗(moxetumomab)、納納土單抗(narnatumab)、那莫單抗(naptumomab)、萊西單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼沃單抗(nivolumab)、諾伐木單抗 (nofetumomabn)、歐比托珠單抗(obinutuzumab)、奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、奧拉單抗(olaratumab)、奧拉帕尼、奧那組單抗(onartuzumab)、奧普珠單抗(oportuzumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕薩珠單抗(parsatuzumab)、帕特里土單抗(patritumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、潘妥莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、皮立珠單抗(pidilizumab)、平妥單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、拉克莫單抗(racotumomab)、拉德瑞單抗(radretumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、里樂木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、司美替尼(selumetinib)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、思圖昔單抗(siltuximab)、辛圖珠單抗(simtuzumab)、索利托單抗(solitomab)、他卡珠單抗(tacatuzumab)、他普莫單抗(taplitumomab)、泰納莫單抗(tenatumomab)、泰普洛單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、土庫珠單抗(tucotuzumab)、尤必昔單抗(ublituximab)、維托珠單抗(veltuzumab)、沃爾希珠單抗(vorsetuzumab)、伏妥莫單抗(votumumab)、紮魯姆單抗(zalutumumab)、CC49、3F8、MDX-1105及MEDI4736及其組合。
其他實施例包含使用核准用於癌症療法的抗體，包括(但不限於)利妥昔單抗、吉妥單抗奧唑甘辛(ozogamcin)、阿侖單抗、異貝莫單抗泰澤坦(tiuxetan)、托西莫單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、帕替塗單抗(patitumumab)、奧伐木單抗、伊匹單抗及貝倫妥單抗維多汀(vedotin)。 熟習此項技術者將能夠容易鑑別與本文中之教示內容相容的其他抗癌劑。
E. 放射線療法
本發明亦提供抗體或ADC與放射線療法(亦即，誘導腫瘤細胞內之DNA發生局部損傷的任何機制，諸如γ照射、X射線、UV照射、微波、電子發射及其類似者)之組合。亦涵蓋使用放射性同位素定向傳遞至腫瘤細胞的組合療法，且所揭示之抗體或ADC可聯合靶向抗癌劑或其他靶向方式使用。典型地，在約1至約2週之一段時間內脈衝投與放射線療法。放射線療法可投與患有頭頸癌之個體約6至7週。視情況，放射線療法可以單一劑量投與或以多個劑量依序投與。
VII. 適應症
本發明提供本發明之抗體及ADC用於診斷、治療診斷、治療及/或預防各種病症的用途，該等病症包括贅生性、發炎性、血管生成及免疫病症及由病原體引起的病症。在某些實施例中，所治療之疾病包含贅生性病狀，包含實體腫瘤。在其他實施例中，所治療之疾病包含血液科惡性疾病。在某些實施例中，本發明之抗體或ADC用於治療表現CLDN決定子的腫瘤或致瘤細胞。較佳地，所治療之「個體」或「患者」為人類，然而如本文所用，該等術語明確地包含任何哺乳動物物種。
應瞭解，本發明之化合物及組合物可用於在疾病之各個階段及個體治療週期之不同時刻對個體進行治療。因此，在某些實施例中，本發明之抗體及ADC將用作前線療法且投與先前尚未針對癌性病狀加以治療的個體。在其他實施例中，本發明的抗體及ADC將用於治療第二線及第三線患者(亦即，先前已針對相同病狀分別治療一次或兩次的彼等個體)。其他實施例將包含治療已針對相同或相關病狀用所揭示之CLDN ADC或用不 同治療劑治療三次或更多次的第四線或第四線以上之患者(例如胃癌或結腸直腸癌患者)。在其他實施例中，本發明之化合物及組合物將用於治療先前已經(本發明之抗體或ADC或其他抗癌劑)治療且已復發或確定難以用先前療法治療的個體。在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可用於治療患有復發性腫瘤的個體。
在某些實施例中，本發明之化合物及組合物將作為單一藥劑或以組合形式用作前線或誘導療法且投與先前尚未針對癌症病狀加以治療的個體。在其他實施例中，本發明之化合物及組合物將在鞏固或維持療法期間作為單一藥劑或以組合形式使用。在其他實施例中，本發明之化合物及組合物將用於治療先前已經(本發明之抗體或ADC或其他抗癌劑)治療且已復發或確定難以用先前療法治療的個體。在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可用於治療患有復發性腫瘤的個體。在其他實施例中，本發明之化合物及組合物將用作調理療法的一部分，作好接受自體或同種異體造血幹細胞移植的準備，其中以骨髓、臍帶血或動員周邊血液作為幹細胞源。
更一般而言，根據本發明進行治療的贅生性病狀可為良性或惡性病狀；實體腫瘤或血液科惡性疾病；且可選自下組，該組包括(但不限於)：腎上腺腫瘤、AIDS相關癌症、肺泡軟組織肉瘤、星形細胞腫瘤、自主神經節腫瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌及移行細胞癌)、囊胚病症、骨癌(釉質瘤、動脈瘤骨頭囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦癌及脊髓癌、轉移性腦瘤、乳癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌瘤、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、上皮細胞病症、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良、骨纖維性結構 不良、膽囊癌及膽管癌、胃癌、胃腸疾病、妊娠滋養細胞疾病、生殖細胞腫瘤、腺病症、頭頸癌、下丘腦癌、腸癌、胰島細胞瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、腎癌(腎母細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤樣腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤樣腫瘤、肝癌(肝母細胞瘤、肝細胞癌瘤)、淋巴瘤、肺癌(小細胞癌瘤、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等)、巨噬細胞病症、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、脊膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、神經母細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳頭狀甲狀腺癌瘤、副甲狀腺腫瘤、兒科癌症、周邊神經鞘腫瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑色素瘤、罕見血液科病症、腎轉移性癌症、橫紋肌樣腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、基質病症、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症及子宮癌(子宮頸癌瘤、子宮內膜癌瘤及平滑肌瘤)。
在某些實施例中，本發明之化合物及組合物將用作前線療法且投與先前未針對癌性病狀加以治療的個體。在其他實施例中，本發明之化合物及組合物將用於治療先前已經(本發明之抗體或ADC或其他抗癌劑)治療且已復發或確定難以用先前療法治療的個體。在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可用於治療患有復發性腫瘤的個體。
在某些實施例中，增生性病症將包含實體腫瘤，包括(但不限於)腎上腺、肝臟、腎臟、膀胱、乳房、胃、卵巢、子宮內膜、子宮頸、子宮、食道、結腸直腸、前列腺、胰臟、肺(小細胞與非小細胞)、甲狀腺的癌瘤、肉瘤、神經膠母細胞瘤，及各種頭頸腫瘤。在其他實施例中且如下文實例中所示，所揭示之ADC在治療小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌 (NSCLC)(例如鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌)時特別有效。在一個實施例中，肺癌對於鉑基藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑、拓朴替康)及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽(larotaxel)或卡巴他賽(cabazitaxel))具有難治性、復發性或耐藥性。在另一實施例中，待治療之個體罹患大細胞神經內分泌癌瘤(LCNEC)。在所選實施例中，抗體及ADC可投與展現侷限期疾病或廣泛期疾病的患者。在其他實施例中，所揭示之結合抗體將投與難治性患者(亦即疾病在初始治療期間或在完成初始治療過程之後不久復發的患者)；敏感患者(亦即在初步治療之後復發長於2至3個月的患者)；或對鉑基藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽或卡巴他賽)展現耐藥性的患者。在某些較佳實施例中，本發明之CLDN ADC可投與前線患者。在其他實施例中，本發明之CLDN ADC可投與第二線患者。在其他實施例中，本發明之CLDN ADC可投與第三線患者。
A. 婦科癌症
在某些實施例中，本發明ADC用於治療婦科癌症，尤其是卵巢癌或子宮內膜癌。在美國，卵巢癌代表所診斷之所有新癌症病例之1.3%，估計在2015年有21,290個新病例及14,180例死亡。上皮性卵巢癌為最常見的婦科惡性疾病之一，且為女性癌症死亡之第五大常見病因，其中所有病例中50%發生在年齡超過65歲之女性中。不到40%之上皮性卵巢癌患者得到治癒。雖然不太常見，但輸卵管癌及原發性腹膜癌類似於卵巢上皮性癌且以相同方式分期及治療。
卵巢癌之主要亞型包括高度及低度漿液性、子宮內膜樣、透明細胞及黏液性。源自非典型子宮內膜異位或交界性漿液腫瘤的透明細胞、低度 子宮內膜樣、黏液性及低度漿液性癌瘤的特徵在於K-Ras、B-Raf、ERBB2、CTNNB1、PTEN、ARID1A及HNF1中之特異性突變且具有中等至有利的預後。高度漿液癌瘤佔所有卵巢癌診斷之約70%，且大部分患者在診斷時具有晚期疾病(III期與IV期)且具有不良預後。認為此等腫瘤源自輸卵管末端有毛緣的上皮細胞，在遺傳上不穩定，且幾乎全與TP53突變及/或功能障礙有關，導致p53蛋白之累積或完全丟失。BRCA1及2生殖系及體細胞突變與高度漿液腫瘤有關且分別發生在約15%及6%之卵巢癌病例中。
在美國，子宮體子宮內膜癌為最常見的婦科惡性疾病，佔所有女性癌症之約6%，且估計在2016年有60,050個新病例及10,470例死亡。此類型之婦科惡性疾病始於子宮內襯子宮內膜中。其最常發生於60歲及超過60歲之女性中。幾乎70%之子宮內膜癌在早期便可診斷出，此時癌症未延伸超出子宮。已擴散超出子宮之後期腫瘤倘若表現適當受體，則可用激素療法治療此等腫瘤。子宮體子宮內膜癌瘤之子組與漿液性卵巢癌共用遺傳特徵，包括TP53頻繁突變、DNA甲基化幾乎無變化及大量複本數更改。
因此在其他實施例中，本發明包含治療卵巢癌之方法，例如高度及低度漿液性、子宮內膜樣、透明細胞及黏液性卵巢癌，該方法包含投與包含本文所揭示之抗CLDN ADC的醫藥組合物。在其他實施例中，本發明包含一種治療子宮內膜癌、尤其是後期(例如III期及IV期)子宮內膜癌之方法。
B. 肺癌
在其他實施例中，所揭示之抗體及ADC在治療肺癌時尤其有效，肺癌包括以下亞型：小細胞肺癌及非小細胞肺癌(例如鱗狀細胞、腺癌)。
在一些實施例中，所揭示之ADC可用於治療小細胞肺癌。就此類實施例而言，所結合之抗體可投與展現侷限期疾病的患者。在其他實施例中，所揭示之ADC將投與展現廣泛期疾病的患者。在其他較佳實施例中，所揭示之ADC將投與難治性患者(亦即在初始治療過程中復發或在完成初始治療過程之後不久復發的彼等患者)或復發性小細胞肺癌患者。又其他實施例包含將所揭示之ADC投與敏感患者(亦即初步治療之後復發長於2-3個月的彼等患者)。在各種情況下，應瞭解相容ADC可與其他抗癌劑組合使用，此視所選給藥方案及臨床診斷而定。本發明之抗CLDN ADC亦可用於治療在一次或兩次治療之後具有進行性疾病的SCLC患者(亦即第二線或第三線SCLC患者)。在一些實施例中，所揭示之ADC可用於治療小細胞肺癌。就此類實施例而言，所結合之抗體可投與展現侷限期疾病的患者。在其他實施例中，所揭示之ADC將投與展現廣泛期疾病的患者。在其他較佳實施例中，所揭示之ADC將投與難治性患者(亦即在初始治療過程中復發或在完成初始治療過程之後不久復發的彼等患者)或復發性小細胞肺癌患者。又其他實施例包含將所揭示之ADC投與敏感患者(亦即初步治療之後復發長於2-3個月的彼等患者)。在各種情況下，應瞭解相容ADC可與其他抗癌劑組合使用，此視所選給藥方案及臨床診斷而定。本發明之抗CLDN ADC亦可用於治療在一次或兩次治療之後具有進行性疾病的SCLC患者(亦即第二線或第三線SCLC患者)。
C. 乳癌
在其他實施例中，所揭示之抗體及ADC在治療乳癌時尤其有效，乳癌例如基底樣、子宮內膜、雌激素受體陽性及/或孕酮受體陽性、三陰性乳癌。ADC可投與展現侷限期疾病或廣泛期疾病的患者。在其他實施例 中，所揭示之ADC將投與難治性患者或復發性乳癌患者。其他實施例包含向患有乳癌之敏感患者投與所揭示之ADC。在各種情況下，應瞭解相容性抗CLDN ADC可與其他抗癌劑組合使用，此視所選給藥方案及臨床診斷而定。
VIII. 製品
本發明包括包含一或多個容器或貯器的醫藥包及套組，其中容器可包含一或多個劑量的本發明抗體或ADC。此類套組或藥包可具有診斷或治療性質。在某些實施例中，藥包或套組含有單位劑量，此意謂預定量之包含例如本發明之抗體或ADC、含有或不含一或多種其他藥劑及視情況選用之一或多種抗癌劑的組合物。在某些其他實施例中，藥包或套組含有可偵測量之抗CLDN抗體或ADC、含有或不含相關報導分子及視情況選用之一或多種用於偵測、量化及/或可視化癌細胞的其他藥劑。
在任何情況下，本發明套組通常將在適合容器或貯器中包含本發明之抗體或ADC、醫藥學上可接受之調配物及視情況存在於同一或不同容器中之一或多種抗癌劑。套組亦可含有其他醫藥學上可接受之調配物或裝置，用於診斷或組合療法。診斷裝置或儀器之實例包括可用於偵測、監測、量化或分析與增生性病症相關之細胞或標記物的彼等物(關於此類標記物之清單，參見上文)。在一些實施例中，裝置可用於活體內或活體外偵測、監測及/或量化循環腫瘤細胞(參見例如WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含致瘤細胞。為將本發明之抗體或ADC與抗癌劑或診斷劑組合，本發明所涵蓋之套組亦可含有適當試劑(參見例如U.S.P.N.7,422,739)。
當套組中的組分係以一或多種液體溶液提供時，該液體溶液可為非 水溶液，但典型地，水溶液較佳，無菌水溶液尤其較佳。套組中之調配物亦可以乾粉或凍乾形式提供，其可經添加適當液體而復原。復原所用的液體可包含於另一容器中。此類液體可包含無菌的醫藥學上可接受之緩衝劑或其他稀釋劑，諸如抑菌注射用水、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液或右旋糖溶液。在套組包含本發明之抗體或ADC與其他療法或藥劑之組合的情況下，溶液可以莫耳當量組合或以其中一種組分超過其他組分之方式加以預混合。或者，本發明之抗體或ADC及視情況選用之抗癌劑或其他藥劑(例如類固醇)在投與患者之前可分別維持於不同容器中。
在某些較佳實施例中，包含本發明組合物的前述套組將包含指明套組內容物可用於治療、預防及/或診斷癌症的標籤、標記物、藥品說明書、條碼及/或讀本。在其他較佳實施例中，套組可包含指明套組內容物可根據某種劑量或給藥方案投與以治療罹患癌症之個體的標籤、標記物、藥品說明書、條碼及/或讀本。在一尤其較佳的態樣中，標籤、標記物、藥品說明書、條碼及/或讀本指明套組內容物可用於治療、預防及/或診斷血液科惡性疾病(例如AML)或提供用於治療該疾病之劑量或給藥方案。在其他尤其較佳的態樣中，標籤、標記物、藥品說明書、條碼及/或讀本指明套組內容物可用於治療、預防及/或診斷肺癌(例如腺癌)或提供治療肺癌的給藥方案。
適合的容器或貯器包括例如瓶子、小瓶、注射器、輸液袋(靜脈內輸液袋)等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或醫藥學相容之塑膠。在某些實施例中，貯器可包含無菌接取口。舉例而言，容器可為具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
在一些實施例中，套組可以含有藉以將抗體及視情況存在之任何組 分投與患者的構件，例如一或多個針或針筒(預裝填或空的)、滴眼管、移液管或其他此類類似裝置，由此可將調配物注射或引入個體中或施加於身體之病變區域。本發明之套組通常亦包括用於包含小瓶或其類似物及受到嚴密約束之其他組件的用於市售之構件，諸如放置且固持所要小瓶及其他設備的吹塑模製塑膠容器。
IX. 雜項
除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語將具有一般技術者通常瞭解之含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。另外，本說明書及所附申請專利範圍中提供的範圍包括端點與介於端點之間的所有點。因此，2.0至3.0之範圍包括2.0、3.0及介於2.0與3.0之間的所有點。
一般而言，本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳及化學技術為此項技術中熟知及常用的技術。本文中結合此類技術使用的命名法亦常用於此項技術中。除非另外指明，否則本發明之方法及技術通常根據此項技術中熟知之習知方法且如本發明通篇中所引用之各種參考文獻所述進行。
X. 參考文獻
本文中所引用之所有專利、專利申請案及公開案及以電子方式可獲得之材料的完整揭示內容(包括例如提交於例如GenBank及RefSeq中的核苷酸序列，及提交於例如SwissProt、PIR、PRF、PBD中之胺基酸序列，及GenBank及RefSeq之帶註釋編碼區的翻譯)以引用的方式併入本文中，不論是否與特定參考文獻相關使用片語「以引用的方式併入」。前述詳細說明及下述實例僅為了清楚理解而示出。應理解其不存在不必要的限制。 本發明不限於所示及所述的確切細節。由申請專利範圍限定的本發明包括對於熟習此項技術者而言顯而易見的變化形式。本文所用之任何章節標題僅出於組織目的且不應理解為限制所述標的物。
實例
因此，上文大體上描述之本發明參考以下實例將更容易瞭解，該等實例係為了說明而提供且不希望限制本發明。該等實例不打算表示下述實驗為所進行之所有實驗或唯一實驗。除非另外指示，否則份數為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度以攝氏度為單位，且壓力為大氣壓或近大氣壓。
清單概述
表3提供本文中所包括的胺基酸及核酸序列之概述。
腫瘤細胞株概述
PDX腫瘤細胞類型係由縮寫指示，繼縮寫之後為表示特定腫瘤細胞株的編號。所測試樣品的繼代次數係由附加於樣品命名的p0-p#指示，其中p0指示直接自患者腫瘤獲得的未繼代樣品且p#指示測試之前，腫瘤已經由小鼠繼代的次數。如本文所用，腫瘤類型及亞型之縮寫顯示於如下表4中：表4
實例1 重組CLDN蛋白質的選殖及表現以及過度表現細胞表面CLDN蛋白質之細胞株的工程改造
人類密連蛋白(CLDN)基因家族包含23種已知基因。為推導密連蛋白蛋白質序列之間的關係，使用Vector NTI軟體套件之AlignX程式比對來自23種人類CLDN基因之30個密連蛋白蛋白質序列。此比對之結果在圖1A中描繪為樹枝狀圖。觀察該圖，顯示CLDN6與CLDN9之序列關係非常密切，在樹枝狀圖之同一個分枝上彼此鄰接出現，而CLDN4為次緊密相關的CLDN蛋白質序列。胺基酸序列本身之檢查顯示，人類CLDN6蛋白質與人類CLDN9蛋白質序列非常密切相關(圖1B)。進一步檢查揭示，CLDN6及CLDN9蛋白質之細胞外域(ECD)(粗體，圖1B)高度保守，而羧基端細胞質域為此等蛋白質之最發散部分(小寫字母，殘基181-220，圖1B)。基於此等蛋白質序列關係，假設用全長人類CLDN6抗原免疫將產生多個識別人類CLDN6 ECD之抗體，該等抗體亦將與人類CLDN9 ECD交叉反應。
編碼人類CLDN6、CLDN4及CLDN9蛋白質之DNA片段
為產生本發明中關於人類CLDN6(hCLDN6)蛋白質所需的所有分子及細胞材料，合成(IDT)編碼與NCBI蛋白質寄存號NP_067018一致的蛋白質的經密碼子最佳化之DNA片段。此DNA純系用於表現成熟hCLDN6蛋白質或其片段之構築體的所有後續工程改造。類似地，購買編碼就人類CLDN4(hCLDN4)而言與NCBI蛋白質寄存號NP_001296一致或就人類 CLDN9(hCLDN9)而言與NCBI蛋白質寄存號NP_066192一致的蛋白質的經密碼子最佳化之DNA片段，且將其用於表現hCLDN4或hCLDN9蛋白質或其片段之構築體的所有後續工程改造。
細胞株工程改造
使用此項技術中之技術，使用慢病毒載體轉導HEK293T或3T3細胞株，構築經工程改造之過度表現以上列出之各種CLDN蛋白質的細胞株。首先，使用以上所述之商業上合成的DNA片段作為模板，使用PCR擴增編碼相關蛋白質(例如hCLDN6、hCLDN9或hCLDN4)之DNA片段。隨後，將個別PCR產物次選殖至慢病毒表現載體pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP(System Biosciences)之多選殖位點(MCS)中，產生一套慢病毒載體。所得pCDH-EF1-CLDN-T2A-GFP載體中之T2A序列促進肽鍵縮合之核糖體跳過(ribosomal skipping)，引起兩種獨立蛋白質之表現：在T2A肽上游編碼之特異性CLDN蛋白質的高水準表現，及在T2A肽下游編碼之GFP標記蛋白的共表現。使用熟習此項技術者熟知的標準慢病毒轉導技術，使用此套慢病毒載體產生過度表現個別CLDN蛋白質的單獨穩定的HEK293T或3T3細胞株。使用高表現HEK293T次純系，用FACS選擇CLDN陽性細胞，其對GFP而言亦為強陽性。
實例2 抗CLDN抗體的產生
出於產生識別CLDN蛋白質之抗體的目的，進行兩次免疫。在第一次免疫中，給小鼠接種過度表現hCLDN6之HEK293T細胞或3T3細胞(如實例1所述產生)。在第一次免疫中，給六隻小鼠(以下品系各兩隻：Balb/c、CD-1、FVB)接種100萬個經相等體積之佐劑乳化的hCLDN6-HEK293T細 胞。在第二次免疫中，給六隻小鼠(以下品系各兩隻：Balb/c、CD-1、FVB)接種過度表現CLDN6之3T3細胞。在各情況下初始接種之後，給小鼠注射各別接種物，每週兩次，持續七週。
將小鼠處死且解剖引流淋巴結(膕、腹股溝及內側髂)且將其用作產抗體細胞之來源。使用BTX Hybrimmune型系統(BTX Harvard Apparatus)，藉由細胞電融合法將單一細胞懸浮液中之B細胞(305×106個細胞)與非分泌型P3x63Ag8.653骨髓瘤細胞(ATCC #CRL-1580)以1：1之比率融合。將細胞再懸浮於如下融合瘤選擇培養基中：DMEM培養基(Cellgro)，補充有偶氮絲胺酸(Sigma)、15%胎兒純系I血清(Hyclone)、10% BM condimed(Roche Applied Sciences)、1mM丙酮酸鈉、4mM L-麩醯胺酸、100IU青黴素-鏈黴素、50μM 2-巰基乙醇及100μM次黃嘌呤，且在三個T225燒瓶中培養，每個燒瓶90mL選擇培養基。將燒瓶在含有5% CO2及95%空氣的37℃含濕氣培育箱中置放6天。文庫在6小瓶CryoStor CS10緩衝劑(BioLife Solutions)中冷凍下來，其中每小瓶約15×106個活細胞，且儲存在液氮中。
將文庫中之一個小瓶在37℃下解凍且向90mL以上所述之融合瘤選擇培養基中添加經冷凍融合瘤細胞，且將其置放在T150燒瓶中。將細胞在含有5% CO2及95%空氣的37℃含濕氣培育箱中培養隔夜。第二天，自燒瓶收集融合瘤細胞且將細胞以每孔一個細胞塗鋪(使用FACSAria I細胞分選儀)於48 Falcon 96孔U形底培養盤中之200μL補充融合瘤選擇培養基中。融合瘤培養10天且使用流動式細胞測量術篩選上清液中對hCLDN6、hCLDN4或hCLDN9蛋白質具有特異性的抗體。流動式細胞測量術如下進行：將每孔1×105個HEK293T細胞與100μL融合瘤上清液一起培育30分 鐘，該等HEK293T細胞經編碼hCLDN6、hCLDN4或hCLDN9之慢病毒載體穩定轉導。細胞用PBS/2% FCS洗滌，且隨後與每個樣品50μL於PBS/2% FCS中1：200稀釋之特異性二級抗體經DyeLight 649標記之山羊抗小鼠IgG Fc片段一起培育。15分鐘後，培育細胞用PBS/2% FCS洗滌兩次且再懸浮於PBS/2% FCS與DAPI(用於偵測死細胞)中，且藉由流動式細胞測量術分析超過經同型對照抗體染色之細胞之螢光的螢光。將針對CLDN抗原中之一或多者的抗體測試呈陽性的所選融合瘤擱置一旁用於進一步表徵。將剩餘未使用的融合瘤文庫細胞在液氮中冷凍以備將來的文庫測試及篩選。
實例3 抗CLDN抗體之定序
如以上實例2中所述產生抗CLDN抗體，且隨後如下定序。使用RNeasy Miniprep套組(Qiagen)，根據製造商說明書自所選融合瘤細胞中純化總RNA。每個樣品使用介於104個與105個之間的細胞。經所分離之RNA樣品儲存在-80℃下直至使用。使用兩種5'引子混合物擴增各融合瘤之Ig重鏈可變區，該等混合物包含86個經設計以靶向完整小鼠VH譜系的小鼠特異性前導序列引子以及對所有小鼠Ig同型具有特異性的3'小鼠Cγ引子。類似地，含有64個經設計以擴增VK小鼠家族中之每一者之5' VK前導序列的兩種引子混合物係與對小鼠κ恆定區具有特異性的單一反向引子組合使用以便對κ輕鏈進行擴增及定序。如下使用Qiagen一步式RT-PCR套組，自100ng總RNA擴增VH及VL轉錄物。各融合瘤進行總共四次RT-PCR反應：VK輕鏈發生兩次反應且VH重鏈發生兩次反應。PCR反應混合物包括1.5μL RNA、0.4μL 100μM重鏈或κ輕鏈引子(藉由IDT定製合 成)、5μL 5×RT-PCR緩衝液、1μL dNTP及0.6μL含有逆轉錄酶及DNA聚合酶的酶混合物。熱循環程式包括以下步驟：RT步驟，50℃ 60分鐘，95℃ 15分鐘，繼之以35個循環(94.5℃ 30秒，57℃ 30秒，72℃ 1分鐘)，且在72℃下最後培育10分鐘。使用如上所述相同的特異性可變區引子，對所提取的PCR產物進行定序。將PCR產物傳送至用於PCR純化及定序服務的外部定序供應商(MCLAB)。
圖2A及圖2B顯示例示性小鼠及人類化(下文實例4中所述)抗CLDN抗體(SEQ ID NO：21-77，奇數)以及hSC27.22、hSC27.108及hSC27.204之變異體(如下文實例5中進一步所述)的輕鏈(圖2A)及重鏈(圖2B)可變區胺基酸序列。圖2C提供小鼠及人類化輕鏈及重鏈可變區核酸序列(SEQ ID NO：20-76，偶數)。綜合而言，圖2A及圖2B提供小鼠及人類化抗CLDN抗體之帶註釋的VH及VL序列，該等抗體稱為SC27.1、SC27.22、SC27.103、SC27.104、SC27.105、SC27.106、SC27.108、SC27.201、SC27.203、SC27.204、hSC27.1、hSC27.22、hSC27.108、hSC27.204及hSC27.204v2。給胺基酸序列加註釋以鑑別根據Kabat定義之構架區(亦即FR1-FR4)及互補決定區(亦即圖2A中之CDRL1-CDRL3或圖2B中之CDRH1-CDRH3)。圖2E至圖2H顯示抗CLDN抗體SC27.1(圖2E)、SC27.22(圖2F)、SC27.108(圖2G)及SC27.204(圖2H)之輕鏈及重鏈可變區的帶註釋的胺基酸序列(根據Kabat等人編號)，其中CDR係使用Kabat、Chothia、ABM及接觸方法獲得。使用可提供CDR及FR名稱的Abysis資料庫專有版分析可變區序列。雖然圖2A及圖2B中之CDR係根據Kabat等人闡述，但熟習此項技術者應瞭解，CDR及FR名稱亦可根據Chothia、MacCallum或任何其他公認的命名系統定義。
各特定抗體之SEQ ID NO為連續奇數。因此，單克隆抗CLDN抗體SC27.1之VL及VH分別包含胺基酸SEQ ID NO：21及23；且SC27.22包含SEQ ID NO：25及27等。各抗體胺基酸序列的相應核酸序列包括於圖2C中且其SEQ ID NO緊靠著相應胺基酸SEQ ID NO之前。因此，舉例而言，SC27.1抗體之VL及VH核酸序列之SEQ ID NO分別為SEQ ID NO：20及22。
實例4 嵌合及人類化抗CLDN抗體的產生
使用此項技術中公認的技術如下產生嵌合抗CLDN抗體。自產生抗CLDN抗體之融合瘤提取總RNA且PCR擴增RNA。由本發明抗CLDN抗體之核酸序列獲得關於小鼠抗體VH及VL鏈之V、D及J基因區段的資料(關於核酸序列，參見圖2C)。使用以下限制位點設計專用於抗體VH及VL鏈之構架序列的引子組：用於VH片段的AgeI及XhoI，及用於VL片段的XmaI及DraIII。用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen)純化PCR產物，隨後用限制酶消化用於VH片段的AgeI及XhoI及用於VL片段的XmaI及DraIII。純化VH及VL消化的PCR產物且將其分別與IgH或IgK表現載體連接。用200U T4-DNA連接酶(New England Biolabs)、7.5μL經消化及純化之基因特異性PCR產物及25ng線性化載體DNA，以10μL總體積進行連接反應。在42℃下經由熱衝擊用3μL連接產物轉型勝任型大腸桿菌DH10B細菌(Life Technologies)且將其以100μg/mL之濃度塗鋪至安比西林(ampicillin)盤上。在所擴增之連接產物之純化及消化之後，將VH片段選殖至包含HuIgG1之pEE6.4表現載體(Lonza)(pEE6.4HuIgG1)之AgeI-XhoI限制位點中且將VL片段選殖至包含人類κ輕鏈恆定區之pEE12.4表現 載體(Lonza)(pEE12.4Hu-κ)之XmaI-DraIII限制位點中。
嵌合抗體係藉由用pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ表現載體共轉染HEK293T或CHO-S細胞來表現。在轉染之前，在150mm培養盤中在標準條件下在補充有10%熱不活化FCS、100μg/mL鏈黴素及100U/mL青黴素G之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)中培養HEK293T細胞。關於短暫性轉染，細胞生長至80%匯合度。向含10μL HEK293T轉染試劑之1.5mL Opti-MEM中添加pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ載體DNA各2.5μg。混合物在室溫下培育30分鐘且添加至細胞中。轉染後三至六天收集上清液。關於CHO-S細胞，向含15μg PEI轉染試劑之400μL Opti-MEM中添加pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ載體DNA各2.5μg。混合物在室溫下培育10分鐘且添加至細胞中。轉染後三至六天收集上清液。含有重組嵌合抗體之培養上清液藉由在800×g下離心10分鐘而將其中的細胞碎片清除且儲存在4℃下。用蛋白質A珠粒純化重組嵌合抗體。
使用專屬電腦輔助式CDR移植方法(Abysis資料庫，UCL Business)及標準分子工程改造技術，按以下使鼠類抗CLDN抗體人類化。可變區之人類構架區係根據人類生殖系抗體序列之構架序列及CDR典型結構與相關小鼠抗體之構架序列及CDR之間的最高同源性來設計。出於分析的目的，根據Kabat編號指派各CDR域之胺基酸。可變區一經選擇，則其利用合成基因區段產生(Integrated DNA Technologies)。在一些情況下，可變區經密碼子最佳化且藉由DNA 2.0(Menlo Park,CA)產生。使用上文針對嵌合抗體所述之分子方法選殖及表現人類化抗體。
人類化抗體之VL及VH胺基酸序列係源自相應小鼠抗體之VL及VH序 列(例如，hSC27.1係源自鼠SC27.1)。人類化抗體hSC27.1、hSC27.22或hSC17.108之輕鏈或重鏈可變區中不存在構架改變或回復突變。然而，如下表5中所示，源自SC27.204之人類化構築體(亦即，hSC27.204及hSC27.204v2)的重鏈構架中存在兩個殘基改變。
除構架改變之外，產生hSC27.204之變異體以提高分子穩定性。變異抗體稱為hSC27.204v2，與hSC27.204(SEQ ID NO：73)共用相同輕鏈，但重鏈不同。更特定言之，hSC27.204v2(SEQ ID NO：77)之重鏈可變區包括在hSC27.204重鏈可變區(SEQ ID NO：75)之CDRH2(SEQ ID NO：115)中的保守突變N58Q。關於hSC27.204 VH序列(SEQ ID NO：75)及hSC27.204v2 VH序列(SEQ ID NO：77)，此殘基位置在圖2B中加底線。
除上述人類化構築體之外，根據本文中之教示內容構築hSC27.22、hSC27.108及hSC27.204v2之位點特異性變異體(稱為hSC27.22ss1、hSC27.108ss1及hSC27.204v2ss1)以供使用。此等位點特異性變異體更詳細地描述於下文實例5中。
下表5顯示根據Kabat等人編號的人類化抗CLDN抗體及其變異體之概述。在各情況下，檢查人類化抗體之結合親和力以確保其大體上等效於相應小鼠抗體。圖2A描繪例示性人類化抗體及其變異體之VL的鄰接胺基酸序列。圖2B描繪例示性人類化抗體及其變異體之VH的鄰接胺基酸序列。抗CLDN人類化抗體之輕鏈及重鏈可變區的核酸序列提供於圖2C中。
實例5 位點特異性抗CLDN抗體之產生
構築包含原生輕鏈(LC)恆定區及突變重鏈(HC)恆定區的經工程改造之人類IgG1/κ抗CLDN位點特異性抗體，其中HC之上部鉸鏈區中與LC中之半胱胺酸214(C214)形成鏈間二硫鍵的半胱胺酸220(C220)經絲胺酸(C220S)取代。在組裝時，HC與LC形成包含兩個適於與治療劑結合之游離半胱胺酸的抗體。除非另外說明，否則恆定區殘基之所有編號均根據如Kabat等人中所闡述之EU編號方案進行。
將VH核酸選殖至在HC之恆定區中含有C220S突變的表現載體上。編碼hSC27.22、hSC27.108或hSC27.204v2之突變型C220S HC的載體與編碼hSC27.22、hSC27.108或hSC27.204之原生IgG1 κ LC的載體在CHO-S細胞中共轉染，且使用哺乳動物短暫表現系統表現。含有C220S突變體的經工程改造之抗CLDN位點特異性抗體分別稱為hSC27.22ss1、hSC27.108ss1或hSC27.204v2ss1。
hSC27.22ss1、hSC27.108ss1及hSC27.204v2ss1位點特異性抗體之全長重鏈的胺基酸序列示出在圖2D中(分別為SEQ ID NO：82、85及89)。 hSC27.22ss1之LC的胺基酸序列與hSC27.22(SEQ ID NO：80)的一致，hSC27.108ss1之LC的胺基酸序列與hSC27.108(SEQ ID NO：83)的一致，且hSC27.204v2ss1之LC的胺基酸序列與hSC27.204及hSC27.204v2抗體(SEQ ID NO：86)的一致。因此，位點特異性抗體分別包含如SEQ ID NO：80及SEQ ID NO：82(hSC27.22ss1)、SEQ ID NO：83及SEQ ID NO：85(hSC27.108ss1)以及SEQ ID NO：86及SEQ ID NO：89(hSC27.204v2ss1)中所闡述的輕鏈及重鏈。
藉由SDS-PAGE表徵經工程改造之抗CLDN位點特異性抗體以證實已產生正確突變體。SDS-PAGE係在存在及不存在諸如DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑的情況下，在得自Life Technologies的預澆鑄10% Tris-甘胺酸微型凝膠上進行。在電泳之後，用膠態庫馬斯溶液(coomassie solution)給凝膠染色(資料未示出)。在還原條件下，觀察到對應於游離LC及游離HC的兩個色帶。此圖案為IgG分子在還原條件下的典型圖案。在非還原條件下，色帶圖案不同於原生IgG分子，表示HC與LC之間不存在二硫鍵。觀察到對應於HC-HC二聚物的約98kD色帶。另外，觀察到對應於游離LC的暗色帶及對應於LC-LC二聚物的約48kD主色帶。由於各LC之C端存在游離半胱胺酸，因此預期形成一定量的LC-LC物質。
實例6 製備抗CLDN6抗體-藥物結合物
經由含游離硫氫基的末端順丁烯二醯亞胺基部分將四個鼠類抗CLDN抗體(SC27.22、SC27.103、SC27.105及SC27.108)及三個人類化位點特異性抗CLDN抗體(hSC27.22ss1、hSC27.108ss1及hSC27.204v2ss1)結合至吡咯并苯并二氮呯(PBD1，呈DL6形式)，產生抗體藥物結合物 (ADC)，稱為SC27.22PBD1、SC27.103PBD1、SC27.105PBD1、SC27.108PBD1、hSC27.22ss1PBD1、hSC27.108ss1PBD1及hSC27.204v2ss1PBD1。
如下製備鼠類抗CLDN ADC。抗CLDN抗體之半胱胺酸鍵經由在室溫下每莫耳抗體添加含預定莫耳數之參(2-羧基乙基)-膦(TCEP)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及5mM EDTA部分還原90分鐘。所得經部分還原的製劑隨後在室溫下經由順丁烯二醯亞胺連接子與PBD1(PBD1之結構提供於本說明書上文中)結合最少30分鐘。隨後使用10mM於水中製備的儲備溶液，經由添加相較於連接子-藥物而言過量的N-乙醯基半胱胺酸(NAC)來淬滅反應。最少20分鐘淬滅時間之後，經由添加0.5M乙酸將pH調整至6.0。藉由使用30kDa膜透濾將ADC製劑之緩衝液更換為透濾緩衝液。經透濾之抗CLDN ADC隨後用蔗糖及聚山梨醇酯-20調配至目標最終濃度。分析所得抗CLDN ADC的蛋白質濃度(藉由量測UV)、聚集度(SEC)、藥物與抗體之比率(DAR)(藉由逆相HPLC(RP-HPLC))及活性(活體外細胞毒性)。
使用經修改之部分還原方法結合位點特異性人類化抗CLDN ADC。所要產物為一種ADC，其最大程度地結合至各LC恆定區之不成對半胱胺酸(C214)上，且使藥物與抗體之比率(DAR)大於2(DAR>2)的ADC最小化、同時使DAR為2(DAR=2)的ADC最大化。為進一步改良結合特異性，抗體在與連接子-藥物結合之前使用包含穩定劑(例如L-精胺酸)及溫和還原劑(例如麩胱甘肽)的方法選擇性還原，隨後進行透濾及調配步驟。
各抗體之製劑在室溫下、於具有預定濃度之還原麩胱甘肽(GSH)、含有1M L-精胺酸/5mM EDTA的緩衝液(pH 8.0)中維持最少兩小時而得到 部分還原。隨後使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)，將所有製劑之緩衝液更換為20mM Tris/3.2mM EDTA pH 7.0緩衝液，移除還原緩衝液。所得經部分還原的製劑隨後在室溫下經由順丁烯二醯亞胺連接子與PBD1(PBD1之結構提供於本說明書上文中)結合最少30分鐘。隨後使用於水中製備的10mM儲備溶液，經由添加相較於連接子-藥物而言過量的NAC來淬滅反應。最少20分鐘淬滅時間之後，經由添加0.5M乙酸將pH調整至6.0。藉由使用30kDa膜透濾將ADC製劑之緩衝液更換為透濾緩衝液。經透濾之抗CLDN ADC隨後用蔗糖及聚山梨醇酯-20調配至目標最終濃度。分析所得抗CLDN ADC的蛋白質濃度(藉由量測UV)、聚集度(SEC)、藥物與抗體之比率(DAR)(藉由逆相HPLC(RP-HPLC))及活性(活體外細胞毒性)。
實例7 抗CLDN抗體及ADC之特徵
使用各種方法，在同型、親和力及與其他CLDN家族成員之交叉反應性方面表徵實例2及4中產生的抗CLDN抗體。
使用流動式細胞測量術表徵如實例2中所述產生的鼠類抗體以判定其是否與CLDN家族成員交叉反應，分析進行如下：用編碼如實例1中所述的hCLDN6、hCLDN9或hCLDN4之慢病毒載體穩定地轉導HEK293T細胞。經上述表現構築體穩定轉導的1×105個HEK293T細胞在4℃下與稀釋至10μg/ml的抗CLDN抗體一起在最終體積50μl之PBS/2% FCS中培育30分鐘。培育後，用200μL PBS/2% FCS洗滌細胞，藉由離心成粒，丟棄上清液，且每樣品將細胞集結粒再懸浮於在PBS/2% FCS中1：200稀釋的50μL經DyeLight 649標記之山羊抗小鼠IgG Fc片段特異性二級抗體中。在4 ℃下培育15分鐘後，如先前所述用PBS/2% FCS洗滌細胞且成粒兩次，且將其再懸浮於含2μg/mL 4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)的100μL PBS/2% FCS中。藉由流動式細胞測量術分析樣品且用DyeLight 649評估活細胞超過經同型對照抗體染色之細胞之螢光的螢光。
以上所述之流動式細胞測量術分析可鑑別多個抗CLDN抗體。關於抗體與特異性過度表現指定CLDN家族成員之細胞株的結合，對比使用螢光減一(FMO)同型對照(灰色填充)(圖3A)測定的信號，基於幾何平均螢光強度變化(△MFI)測定交叉反應性。因此，兩個hCLDN6結合抗體SC27.1及SC27.22可以描述為密連蛋白多反應性抗體，因為其在此分析中與人類CLDN家族之三個成員hCLDN6、hCLDN4及hCLDN9交叉反應。SC27.1及SC27.22抗體亦結合至CLDN4及CLDN9之小鼠及大鼠直系同源物(資料未示出)。
為測試各種其他小鼠抗體與CLDN家族成員結合之能力，使用過度表現人類CLDN4、CLDN6或CLND9的細胞株進行流動式細胞測量術，該等細胞株已與10μg/mL經純化之初級抗CLDN抗體或小鼠IgG2b對照抗體一起培育，隨後與Alexa 647抗小鼠二級抗體一起培育。如圖3B中所示，所有抗體結合至CLDN6，然而一些為CLDN6特異性的(例如SC27.102、SC27.105及SC27.108)，而其他為多反應性的且結合至CLDN6及CLDN9(例如SC27.103及SC27.204)，或結合至CLDN6及CLDN4(例如SC27.104)。因此，獲得本發明抗體之廣泛範圍之多反應性結合概況。
為比較多反應性抗CLDN抗體於CLDN6及CLDN9之表觀結合親和力，用人類化抗CLDN抗體hSC27.22之連續稀釋液進行流動式細胞測量術。將抗體連續稀釋至濃度在50pg/ml至100μg/ml範圍內且添加至含有 過度表現CLDN6或CLDN9之HEK293T細胞的96孔盤中，且在冰上保持一小時。添加二級抗人類抗體(Jackson ImmunoResearch目錄號109-605-098)且在暗處培育一小時。細胞在PBS中洗滌兩次，之後添加Fixable Viability染料(eBioscience目錄號65-0863-14)，持續10分鐘。再次用PBS洗滌之後，用多聚甲醛(PFA)固定細胞且在BD FACS Canto II流式細胞儀上根據製造商之說明書讀數。使用螢光微球體(Bangs Laboratories)，根據製造商之說明書標準化MFI值。使用關於抗體與CLDN6或CLDN9表現細胞之結合所觀察到的標準化最大MFI值，使用以下等式將資料轉換成各過度表現細胞之最大結合分率：最大結合分率=(所觀察到之標準化MFI/最大標準化MFI)。隨後使用四參數可變斜率曲線擬合log(抑制劑)對比GraphPad Prism軟體套件(La Jolla,CA)中所供應的反應模型，計算hSC27.22與各細胞株之結合的表觀EC50值。圖3C顯示，人類化多反應性抗CLDN6抗體hSC27.22於CLDN6之表觀EC50與於CLDN9之表觀EC50大體上相同(表觀EC50 CLDN6-3.45μg/mL(擬合優度r2=0.9987，99%，信賴界：2.51-4.75μg/mL)；表觀EC50 CLDN9-4.66μg/mL(擬合優度r2=0.9998，99%，信賴界：4.09-5.31μg/mL))。
實例8 抗CLDN抗體有助於細胞毒性劑之活體外傳遞
為判定抗CLDN抗體是否能夠內化且介導細胞毒性劑於活腫瘤細胞之傳遞，使用所選抗CLDN抗體及與二級抗小鼠抗體FAB片段連接之皂草素進行活體外細胞殺死分析。皂草素為一種植物毒素，其使核糖體去活化，藉此抑制蛋白質合成且導致細胞死亡。皂草素僅在細胞內部具有細胞毒性，在細胞內部，其近接核糖體，但不能獨立地內化。因此，此等分析中 皂草素介導之細胞毒性指示抗小鼠FAB-皂草素結合物僅在抗CLDN抗體之結合及內化時內化至靶細胞中的能力。
將過度表現hCLDN6、hCLDN4或hCLDN9之HEK293T細胞及HEK293T細胞的單細胞懸浮液以500個細胞/孔塗鋪至BD組織培養盤(BD Biosciences)中。一天後，向培養液中添加250pM經純化之SC27.1、SC27.22或同型對照(mIgG1)抗體及固定濃度之2nM抗小鼠IgG FAB-皂草素結合物(Advanced Targeting Systems)。在抗體處理後，培育HEK293T細胞72小時。培育之後，使用CellTiter-Glo®(Promega)，根據製造商說明書對活細胞計數。使用含有僅用二級FAB-皂草素結合物培育之細胞的培養物所得的原始發光計數設定為100%參考值且所有其他計數均相應地計算。濃度為250pM的抗CLDN抗體SC27.1及SC27.22均可有效地殺死過度表現hCLDN6及hCLDN9之HEK293T細胞(圖4A)，然而相同濃度之小鼠IgG1同型對照抗體(mIgG1)不能。初始HEK293T細胞無法藉由該處理有效地殺死，然而過度表現hCLDN4之HEK293T細胞可藉由SC27.1有效地殺死，但無法藉由所測試劑量之SC27.22處理殺死。水平虛線表示觀察不到細胞毒性時的水準。
為測定其他抗體於CLDN4、CLDN6或CLDN9之表觀IC50，藉由抗體滴定重複上一段中所述的實驗，濃度範圍為0.15nM至1000nM(圖4B)。藉由如上所述之CellTiter-Glo®計數在各抗體濃度下觀察到之細胞殺死百分比，且將曲線與所得資料擬合以便計算抗體對各細胞株之殺死活性的表觀IC50。表觀IC50>2000nM之抗體視為無法殺死特定細胞株且在圖4B中表示為「NK」。對照小鼠IgG1抗體亦無法殺死所測試細胞株中之任一者。雖然此細胞毒性分析係經由所結合抗原之內化而非提供抗體結合親 和力之直接量測結果來量度各種抗體介導細胞毒素之傳遞的能力，但圖4B中所示之抗體之表觀IC50一般非常符合圖3B中呈現的單點流動式細胞測量術資料。舉例而言，在兩個實驗中，SC27.108均顯示為CLDN6特異性的(表觀IC50=100nM)。類似地，藉由流動式細胞測量術，SC27.103與CLDN6顯示強結合且與CLDN9顯示中等結合，其符合於CLDN6之IC50值為58nM且於CLDN9之IC50值為466nM。然而，亦清楚，超過背景的可偵測結合並非總是導致可偵測殺死(例如，SC27.104結合至CLDN9(參見圖3B)，但不能夠有效地內化且殺死過度表現CLDN9之細胞(參見圖4B)；然而SC27.201結合CLDN9(參見圖3B)且能夠內化至表現CLDN9之細胞中並殺死彼等細胞(參見圖4B))。
總之，以上結果證明多反應性抗CLDN抗體介導內化之能力及其傳遞細胞毒性有效負載之能力，支持抗CLDN抗體可具有作為ADC之靶向部分的治療效用的假設。
實例9 人類化抗CLDN抗體藥物結合物抑制活體內腫瘤生長
測試如上文實例6中所述產生的抗CLDN ADC，以證明其抑制免疫缺乏小鼠之OV及LU-Ad腫瘤生長的能力。
使用此項技術中公認的技術，使表現CLDN之PDX腫瘤株(例如OV91、OV78及LU134)皮下生長於雌性NOD/SCID小鼠之側腹中。腫瘤體積及小鼠體重每週監測一次或兩次。當腫瘤體積達到150-250mm3時，將小鼠隨機分派至處理組。給攜帶OV91腫瘤之小鼠注射單一劑量之2mg/kg SC27.1.PBD1或SC27.22.PBD1，或抗半抗原對照小鼠IgG1PBD1。給攜帶OV78腫瘤之小鼠注射單一劑量之1.6mg/kg hSC27.204v2ss1PBD1或抗半抗原對照IgG1PBD1。給攜帶LU-Ad腫瘤之小鼠注射單一劑量之2mg/kg SC27.22.PBD1或抗半抗原小鼠IgG1PBD1對照。
處理之後，監測腫瘤體積及小鼠體重直至腫瘤超過800mm3或小鼠生病。經抗CLDN ADC處理的小鼠未展現在攜帶腫瘤之免疫缺乏NOD/SCID小鼠中通常所見之不良健康影響之外的任何不良健康影響。抗CLDN ADC之投與在攜帶OV91腫瘤之小鼠(圖5A)中持續超過150天且於攜帶LU134腫瘤之小鼠(圖5B)而言超過60天的顯著腫瘤抑制，然而對照ADC IgG1PBD1之投與不會引起腫瘤體積減小。在攜帶OV78腫瘤之小鼠中投與抗CLDN ADC顯示腫瘤進展相對於媒劑顯著延遲約120天且相對於同型對照顯著延遲約90天。
抗CLDN ADC特異性殺死表現CLDN之腫瘤細胞且長時間活體內顯著抑制腫瘤生長的能力進一步證實抗CLDN ADC於治療性治療癌症且尤其是OV及LU癌症的用途。
實例10 癌症幹細胞群體中CLDN表現之富集
腫瘤細胞大體上可分成兩種類型的細胞亞群：非致瘤細胞(NTG)及腫瘤起始細胞或致瘤細胞。致瘤細胞當植入免疫功能不全小鼠中時具有形成腫瘤的能力，而非致瘤細胞則不能。癌症幹細胞(CSC)為致瘤細胞之子組且能夠無限地自我複製，同時維持多譜系分化的能力。
為判定本發明之抗CLDN抗體是否能夠偵測致瘤CSC群體，將PDX腫瘤解離成單細胞懸浮液且使用選擇性標記物CD46hiCD324+如下富集CSC腫瘤細胞亞群(參見WO 2012/031280)。
將PDX腫瘤單細胞懸浮液與以下抗體一起培育：抗CLDN SC27.1；抗人類EPCAM；抗人類CD46；抗人類CD324；及抗小鼠CD45及H-2kD抗體。隨後使用BD FACS Canto II流式細胞儀，藉由流動式細胞測量術評估腫瘤細胞的染色。OV-S(例如OV44及OV54MET)、OV-PS(例如OV91MET)、PA、LU-Ad(例如LU135)及LU-Sq(例如LU22)PDX腫瘤之人類EPCAM+CD46hiCD324+ CSC腫瘤細胞亞群顯示抗CLDN SC27.1抗體染色陽性，而NTG細胞(CD46lo/-及/或CD324-)顯示抗CLDN抗體染色明顯較少(圖6A)。採用同型對照抗體及FMO對照，按此項技術中之標準實踐確認染色特異性。表6A中所示為概述在CSC及NTG細胞表面上觀察到的抗CLDN抗體之差示染色的表格，其中表現計數為指定抗CLDN抗體與同型對照之間針對各別腫瘤細胞亞群的幾何平均螢光強度變化(△MFI)。此等資料證實hCLDN蛋白質於CSC上之表現。
為確定腫瘤中的CLDN表現是否與增強的致瘤性相關，進行以下研究。使人類OV PDX腫瘤樣品(OV91MET)在免疫功能不全小鼠中生長且在腫瘤達到800-2,000mm3之後切除。使用此項技術中公認的酶消化技術，將腫瘤解離成單細胞懸浮液(參見例如U.S.P.N.2007/0292414)。用小鼠抗CD45或抗H2kD抗體及用抗ESA抗體給人類OV PDX腫瘤細胞染色以區分人類腫瘤細胞與小鼠細胞。亦用抗CLDN抗體(SC27.22)給腫瘤染色，且隨後使用FACSAriaTM流式細胞儀(BD Biosciences)分選。將人類OV PDX腫瘤細胞分離成CLDN+及CLDN-亞群。向五隻免疫功能不全的雌性NOD/SCID小鼠皮下注射200個CLDN+ OV腫瘤細胞；且向五隻小鼠注射200個CLDN- OV腫瘤細胞。每週一次量測腫瘤體積，持續四個月。
圖6B顯示CLDN+(實心圓圈)腫瘤細胞能夠活體內功能性復原腫瘤， 而CLDN-腫瘤(空心圓圈)則不能。因此，表現CLDN之腫瘤細胞的致瘤性遠大於不表現CLDN之腫瘤細胞，表明CLDN蛋白質可以將致瘤亞群在功能上限定在人類腫瘤內，且支持以下概念：所選抗CLDN ADC可用以靶向腫瘤細胞之致瘤亞群，其可導致顯著的腫瘤消退且預防腫瘤復發。
實例11 藉由抗CLDN抗體-藥物結合物降低癌症幹細胞頻率
如實例10中所證明，CLDN表現係與癌症幹細胞相關。因此，為證明用抗CLDN ADC處理可降低已知具有抗藥性且有助於腫瘤復發及轉移的癌症幹細胞(CSC)之頻率，如下所述進行活體內限制稀釋法分析(LDA)。
LU187腫瘤皮下生長於免疫缺乏小鼠中。當平均腫瘤體積的大小為150mm3-250mm3時，將小鼠隨機分成兩組。一組腹膜內注射與藥物結合的人類IgG1作為陰性對照；且另一組注射2mg/kg抗CLDN SC27.22PBD1或抗半抗原小鼠IgG1PBD1對照。給藥後一週，使各組中的兩隻代表性小鼠安樂死且收集其腫瘤且分散成單細胞懸浮液。隨後收集各處理組之腫瘤細胞，合併且解聚。細胞用偵測小鼠細胞的結合有FITC之抗小鼠H2kD及抗小鼠CD45抗體；偵測人類細胞的EpCAM；及偵測死細胞的DAPI標記。隨後藉由FACS，使用BD FACS Canto II流式細胞儀分選所得懸浮液且分離並收集活的人類腫瘤細胞。
給四組小鼠注射1250、375、115或35個自經抗CLDN ADC處理之腫瘤分選的人類活細胞。作為陰性對照，給四組小鼠移植1000、300、100或30個自經對照IgG1 ADC處理之腫瘤分選的人類活細胞。每週一次量測接受者小鼠中之腫瘤，且在腫瘤達到1500mm3之前使個別小鼠安樂死。 按陽性或陰性腫瘤生長給接受者小鼠評分。陽性腫瘤生長定義為腫瘤生長超過100mm3。使用泊松分佈統計學(L-Calc軟體，Stemcell Technologies)計算各群體中之CSC頻率。如圖7中可以看出，CLDN與腫瘤起始細胞相關；經抗CLDN ADC SC27.22PBD1處理之腫瘤顯示腫瘤起始細胞相較於經對照ADC處理之腫瘤減少約4倍。
實例12 來自癌症基因組圖譜之原發性腫瘤的CLDN表現概況
使用腫瘤及正規樣品之大型公開可用的資料集，該資料集稱為癌症基因組圖譜(TCGA，國家癌症研究院(National Cancer Institute))，證實CLDN6及CLDN9家族成員之mRNA在各種腫瘤中之過度表現。自TCGA資料端口(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp)下載來自IlluminaHiSeq_RNASeqV2平台之3級外顯子表現資料且解析以聚集各單一基因之個別外顯子的讀數，以便針對各樣品中之各基因，每千鹼基外顯子每一百萬映射讀數(RPKM)產生單值讀數。隨後使用Tableau軟體呈現累積資料。有關CLDN6及CLDN9之經解析資料分別顯示於圖8A及圖8B中，其中各樣品表示為單點，且黑色水平線表示指定正常組織或腫瘤亞型內扣除資料點之四分位數界限。圖8A顯示，相較於所有其他正常組織，CLDN6表現在OV腫瘤中升高，OV腫瘤歸為卵巢漿液性囊腺癌亞型。另外，相較於正常肺樣品，CLDN6在大量LU-Ad樣品及大量乳房侵襲性癌瘤腫瘤(BRCA)中升高。CLDN9可以看到與CLDN6所觀察到的過度表現模式類似的過度表現模式(圖8B)。此外，此等資料表明，CLDN6及CLDN9表現量指示各種腫瘤中之腫瘤形成且強化其作為潛在治療標靶之選擇。
亦可在TCGA資料集內所含之子宮體子宮內膜癌(UTEC)的子組中見到CLDN6之mRNA之過度表現(圖8C)。雖然CLDN6及CLDN9均顯示腫瘤樣品相對於正常子宮組織而言表現升高，但CLDN6清楚地顯示在後期UTEC中進行性升高。另外，CLDN6表現在丟失孕酮受體表現且因此可能對激素療法無反應的相同晚期腫瘤中似乎升高(圖8D)。總之，此等資料表明，卵巢癌、子宮子宮內膜癌、非小細胞肺癌(腺癌及鱗狀亞型)及乳癌可為適合施用靶向CLDN蛋白質之抗體藥物的適應症。
熟習此項技術者應進一步瞭解，本發明可以在不脫離其精神或核心屬性的情況下按其他特定形式實施。因為本發明之以上說明僅揭示其例示性實施例，所以應理解，在本發明之範疇內涵蓋其他變化形式。因此，本發明不限於已在本文中詳細描述的特定實施例。實際上，作為本發明之範疇及內容之指示，應該參考隨附申請專利範圍。
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<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.22輕鏈可變區
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<210> 25
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.22輕鏈可變區
<400> 25
<210> 26
<211> 366
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.22重鏈可變區
<400> 26
<210> 27
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.22重鏈可變區
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<211> 354
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
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<213> 小家鼠
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<221> MISC_FEATURE
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<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> DNA
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.105輕鏈可變區
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<220<
<221> MISC_FEATURE
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
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<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.106重鏈可變區
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<211> 324
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.108輕鏈可變區
<400> 44
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<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.108輕鏈可變區
<400> 45
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<211> 378
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.108重鏈可變區
<400> 46
<210> 47
<211> 126
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.108重鏈可變區
<400> 47
<210> 48
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.201輕鏈可變區
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<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.201輕鏈可變區
<400> 49
<210> 50
<211> 360
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.201重鏈可變區
<400> 50
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.201重鏈可變區
<400> 51
<210> 52
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.203輕鏈可變區
<400> 52
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.203輕鏈可變區
<400> 53
<210> 54
<211> 360
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.203重鏈可變區
<400> 54
<210> 55
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.203重鏈可變區
<400> 55
<210> 56
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.204輕鏈可變區
<400> 56
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.204輕鏈可變區
<400> 57
<210> 58
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> SC27.204重鏈可變區
<400> 58
<210> 59
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SC27.204重鏈可變區
<400> 59
<210> 60
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1輕鏈可變區
<400> 60
<210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1輕鏈可變區
<400> 61
<210> 62
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1重鏈可變區
<400> 62
<210> 63
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1重鏈可變區
<400> 63
<210> 64
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22輕鏈可變區
<400> 64
<210> 65
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22輕鏈可變區
<400> 65
<210> 66
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22重鏈可變區
<400> 66
<210> 67
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22重鏈可變區
<400> 67
<210> 68
<211> 324
<212> DNA
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<220>
<223> hSC27.108輕鏈可變區
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<212> PRT
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<220>
<223> hSC27.108輕鏈可變區
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<210> 70
<211> 378
<212> DNA
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> hSC27.204輕鏈可變區
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204輕鏈可變區
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<212> DNA
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<220>
<223> hSC27.204重鏈可變區
<400> 74
<210> 75
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204重鏈可變區
<400> 75
<210> 76
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204v2重鏈可變區
<400> 76
<210> 77
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204v2重鏈可變區
<400> 77
<210> 78
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1輕鏈
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<210> 79
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1重鏈
<400> 79
<210> 80
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22輕鏈
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22重鏈
<400> 81
<210> 82
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22ss1重鏈
<400> 82
<210> 83
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.108輕鏈
<400> 83
<210> 84
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.108重鏈
<400> 84
<210> 85
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.108ss1重鏈
<400> 85
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204輕鏈
<400> 86
<210> 87
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204重鏈
<400> 87
<210> 88
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204v2重鏈
<400> 88
<210> 89
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204v2ss1重鏈
<400> 89
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1 CDRL1
<400> 90
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1 CDRL2
<400> 91
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1 CDRL3
<400> 92
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1 CDRH1
<400> 93
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1 CDRH2
<400> 94
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.1 CDRH3
<400> 95
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22 CDRL1
<400> 96
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22 CDRL2
<400> 97
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22 CDRL3
<400> 98
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22 CDRH1
<400> 99
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22 CDRH2
<400> 100
<210> 101
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.22 CDRH3
<400> 101
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.108 CDRL1
<400> 102
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.108 CDRL2
<400> 103
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.108 CDRL3
<400> 104
<210> 105
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.108 CDRH1
<400> 105
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.108 CDRH2
<400> 106
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.108 CDRH3
<400> 107
<210> 108
<400> 108 000
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204 CDRL1
<400> 109
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204 CDRL2
<400> 110
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204 CDRL3
<400> 111
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204 CDRH1
<400> 112
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204 CDRH2
<400> 113
<210> 114
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204 CDRH3
<400> 114
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC27.204v2 CDRH2
<400> 115

Claims (30)

  1. 一種抗體藥物結合物，其包含與細胞毒性劑可操作地連接的抗CLDN抗體。
  2. 一種式M-[L-D]n之抗體藥物結合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中：M包含抗CLDN抗體；L包含視情況存在之連接子；D包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)彈頭，其中D係選自由以下組成之群： ；且n為1至20之整數。
  3. 如請求項1或2之抗體藥物結合物，其包含抗CLDN抗體，該抗CLDN抗體為單株抗體。
  4. 如請求項1或2之抗體藥物結合物，其中該抗CLDN抗體係選自由以下組成之群：嵌合抗體、CDR移植抗體、人類化抗體、人類抗體、靈長類化抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、雙功能抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段及ScFv片段；或其免疫反應性片段。
  5. 如請求項1或2之抗體藥物結合物，其中該抗CLDN抗體為位點特異性抗體。
  6. 如請求項1或2之抗體藥物結合物，其包含抗CLDN抗體，該抗CLDN抗體包含如下抗體或與如下抗體競爭結合至人類CLDN蛋白質：包含如SEQ ID NO：21所闡述之輕鏈可變區(VL)及如SEQ ID NO：23所闡述之重鏈可變區(VH)(SC27.1)；或如SEQ ID NO：25所闡述之VL及如SEQ ID NO：27所闡述之VH(SC27.22)；或如SEQ ID NO：45所闡述之VL及如SEQ ID NO：47所闡述之VH(SC27.108)；或如SEQ ID NO：57所闡述之VL及如SEQ ID NO：59所闡述之VH(SC27.204)的抗體。
  7. 如請求項1或2之抗體藥物結合物，其包含抗CLDN抗體，該抗CLDN抗體包含如下抗體或與如下抗體競爭結合至人類CLDN蛋白質：包含如SEQ ID NO：61所闡述之輕鏈可變區(VL)及如SEQ ID NO：63所闡述之重鏈可變區(VH)(hSC27.1)；或如SEQ ID NO：65所闡述之VL及如SEQ ID NO：67所闡述之VH(hSC27.22)；或如SEQ ID NO：69所闡述之VL及如SEQ ID NO：71所闡述之VH(hSC27.108)；或如SEQ ID NO：73所闡述之 VL及如SEQ ID NO：75所闡述之VH(hSC27.204)；或如SEQ ID NO：73所闡述之VL及如SEQ ID NO：77所闡述之VH(hSC27.204v2)的抗體。
  8. 如請求項1或2之抗體藥物結合物，其包含抗CLDN抗體，該抗CLDN抗體包含如下抗體或與如下抗體競爭結合至人類CLDN蛋白質：包含具有三個互補決定區(CDRL)之VL及具有三個互補決定區(CDRH)之VH的抗體，該三個CDRL為具有SEQ ID NO：109之CDRL1、具有SEQ ID NO：110之CDRL2及具有SEQ ID NO：111之CDRL3，該三個CDRH為具有SEQ ID NO：112之CDRH1、具有SEQ ID NO：115之CDRH2及具有SEQ ID NO：114之CDRH3。
  9. 如請求項1或2之抗體藥物結合物，其包含抗CLDN抗體，該抗CLDN抗體包含如下抗體或與如下抗體競爭結合至人類CLDN蛋白質：包含具有SEQ ID NO：78之輕鏈及具有SEQ ID NO：79之重鏈的抗體(hSC27.1)；或包含具有SEQ ID NO：80之輕鏈及具有SEQ ID NO：81之重鏈的抗體(hSC27.22)；或包含具有SEQ ID NO：80之輕鏈及具有SEQ ID NO：82之重鏈的抗體(hSC27.22ss1)；或包含具有SEQ ID NO：83之輕鏈及具有SEQ ID NO：84之重鏈的抗體(hSC27.108)；或包含具有SEQ ID NO：83之輕鏈及具有SEQ ID NO：85之重鏈的抗體(hSC27.108ss1)；或包含具有SEQ ID NO：86之輕鏈及具有SEQ ID NO：87之重鏈的抗體(hSC27.204)；或包含具有SEQ ID NO：86之輕鏈及具有SEQ ID NO：88之重鏈的抗體(hSC27.204v2)；或包含具有SEQ ID NO：86之輕鏈及具有SEQ ID NO：89之重鏈的抗體(hSC27.204v2ss1)。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗體藥物結合物，其結合至癌症幹細胞。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之ADC。
  12. 一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與如請求項11之醫藥組合物。
  13. 如請求項12之方法，其中該癌症係選自子宮內膜癌、卵巢癌、乳癌及肺癌。
  14. 如請求項12之方法，其中該癌症為卵巢漿液癌。
  15. 如請求項12之方法，其中該癌症為卵巢子宮內膜樣腺癌。
  16. 如請求項12之方法，其中該癌症為子宮體子宮內膜癌。
  17. 如請求項12之方法，其中該癌症為肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。
  18. 如請求項12之方法，其中該癌症為三陰性乳癌。
  19. 如請求項12至18中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與至少一種其他治療部分。
  20. 一種減少腫瘤細胞群體中之癌症幹細胞的方法，其中該方法包含使包含癌症幹細胞及除癌症幹細胞外之腫瘤細胞的腫瘤細胞群體與如請求項1至10中任一項之ADC接觸，藉此降低癌症幹細胞之頻率。
  21. 一種將細胞毒素傳遞至細胞的方法，其包含使該細胞與如請求項1至10中任一項之ADC接觸。
  22. 一種產生如請求項1或2之ADC的方法，其包含使抗CLDN抗體(Ab)與藥物(D)結合的步驟。
  23. 如請求項22之方法，其中該抗體包含位點特異性抗體。
  24. 如請求項22之方法，其中D包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)彈頭，其中D係選自由以下組成之群：
  25. 如請求項22之方法，其中該ADC包含含有藥物(D)之PBD有效負載，其中該有效負載係選自由以下組成之群：
  26. 一種套組，其包含：一或多個含有如請求項11之醫藥組合物的容器；及與該一或多個容器相關的標籤或藥品說明書，其指明該組合物係用於治療患有癌症之個體。
  27. 一種套組，其包含：一或多個含有如請求項11之醫藥組合物的容器；及與一或多個容器相關的標籤或藥品說明書，其指明用於患有癌症之個體的給藥方案。
  28. 一種抗體藥物結合物，其係選自由以下組成之群： 其中Ab包含抗CLDN抗體或其免疫反應性片段。
  29. 一種抗體藥物結合物，其具有下式： 其中Ab包含hSC27.204v2ss1(SEQ ID NO：86及89)。
  30. 一種抗體藥物結合物，其具有下式： 其中Ab包含hSC27.204v2ss1(SEQ ID NO：86及89)。
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