TW201729832A

TW201729832A - 使用特異性結合ｃｄ３８之抗體免疫調節及治療固態腫瘤

Info

Publication number: TW201729832A
Application number: TW105134914A
Authority: TW
Inventors: 塔翰唐阿瑪迪; 堤內克卡司內夫; 漢克諾克豪斯特; 圖那木堤斯; 艾咪薩瑟; 拉魯卡維羅納
Original assignee: 健生生物科技公司
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2017-09-01
Also published as: TWI742008B

Abstract

本發明係關於用特異性結合CD38的抗體免疫調節劑及治療患有固態腫瘤之病患的方法。

Description

使用特異性結合CD38之抗體免疫調節及治療固態腫瘤

【相關申請案之交互參照】

本申請案主張2016年6月24日申請之美國申請案第15/191808號、2016年6月24日申請之國際申請案第US16/39165號、2016年5月4日申請之美國臨時申請案第62/331,489號、2015年12月4日申請之美國臨時申請案第62/263,307號、及2015年11月4日申請之美國臨時申請案第62/250,566號、以及2015年11月2日申請之美國臨時申請案第62/249,546號之權益，其全部內容以引用的方式併入本文中。

本發明係關於用特異性結合CD38之抗體免疫調節及治療固態腫瘤之方法。

免疫系統係受共刺激及共抑制配位體及受體之網路嚴密控制。這些分子為T細胞活化提供二級訊號，且提供正訊號及負訊號之平衡網路，以最大化針對感染及腫瘤之免疫反應，同時限制對自身的免疫性(Wang等人，(Epub Mar.7,2011)J Exp Med 208(3)：577-92；Lepenies等人，(2008)Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 8：279-288)。

治療固態腫瘤之免疫檢查點療法(其靶向T細胞中之共抑制途徑以促進抗瘤免疫反應)在核准抗CTLA-4及抗PD-1抗體 YERVOY^®(伊匹單抗(ipilimumab))、KEYTRUDA^®(派立珠單抗(pembrolizumab))、及OPDIVO^®(尼沃魯單抗(nivolumab))之情況下導致了癌症病患之臨床照護的進步。儘管抗PD-1/PD-L1抗體展示了促進患有多種固態腫瘤之病患之臨床反應，但是反應率仍然相當低，其在經預治療的病患中係15%至20%(Swaika等人，(2015)Mol Immunol doi：10.1016/j.molimm.2015.02.009)。

儘管自然殺手細胞(NK)、樹突細胞(DC)、及效應T細胞能夠驅動強力的抗瘤反應，但腫瘤細胞時常誘導免疫抑制性微環境，其有利於免疫抑制性免疫細胞群之發展，諸如骨髓衍生抑制細胞(MDSC)、調節T細胞(Treg)、或調節B細胞(Breg)，其等導致癌症病患及實驗腫瘤模型中之腫瘤免疫耐受性及免疫療法方案之失敗。

因此，仍需要發展新的癌症免疫療法，其等誘導針對腫瘤之適應性免疫反應或靶向免疫抑制性免疫細胞。

本發明提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種用於治療患有調節T細胞(Treg)媒介之疾病的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種用於治療患有骨髓衍生抑制細胞(MDSC)媒介之疾病的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種用於治療患有調節B細胞(Breg)媒介之疾病的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種抑制調節T細胞(Treg)之活性的方法，其包含使該Treg接觸特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種抑制骨髓衍生抑制細胞(MDSC)之活性的方法，其包含使該MDSC接觸特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種抑制調節B細胞(Breg)之活性的方法，其包含使該Breg接觸特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種增強病患之免疫反應的方法，其包含向該病患投予特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含藉由向該病患投予特異性結合CD38之抗體來減少該病患中Treg細胞之數目。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含藉由向該病患投予特異性結合CD38之抗體來減少該病患中骨髓衍生抑制細胞(MDSC)之數目。

本發明亦提供一種抑制免疫抑制細胞之活性的方法，其包含使該免疫抑制細胞接觸特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種治療患有病毒感染之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予特異性結合CD38之抗體。

圖1顯示，病患中淋巴球數目之中位數係對以8mg/kg(上方線)或16mg/kg(下方線)劑量的DARZALEX^TM(達拉單抗)治療反應隨時間推移而增加，並在治療結束後淋巴球數目返回至基期。研究：SIRIUS。X軸指示時間，其係以治療週期及在各治療週期內之給藥天數表示(C1D1：第1週期第1天；C1D4：第1週期第4天等等)。SCR：基期；EOT：治療結束；WK：週；POST-WK：在治療後之指定週數；post-PD FU：進展後之追蹤(follow-up)。以灰色陰影強調的範圍指示反應者之各訪視之數據點的四分位數間距(IQR)係25至27%。

圖2顯示針對各個別病患(淺灰色線)經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患之周邊血液中CD3⁺ T細胞之絕對計數自基期的變化百分比(%)。研究：SIRIUS(MMY2002)。X軸指示時間，其係以治療週期及在各治療週期內之給藥天數表示(C1D1：第1週期第1天；C1D4：第1週期第4天等等)。WK：週；POST-WK：在治療後之指定週數；POST-PD FU：進展後之追蹤。黑色線顯示所有病患之中位數變化%。

圖3顯示針對各個別病患(淺灰色線)經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患之周邊血液中CD4⁺ T細胞之絕對計數自基期的變化百分比(%)。研究：SIRIUS。X軸指示時間，其係以治療週期及在各治療週期內之給藥天數表示(C1D1：第1週期第1天；C1D4：第1週期第4天等等)。WK：週；POST-TMT：治療後。黑色線顯示所有病患之中位數變化%。

圖4顯示針對各個別病患(淺灰色線)經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患之周邊血液中CD8⁺ T細胞之絕對計數自基期的變化百分比(%)。研究：SIRIUS。X軸指示時間，其係以治療週期及在各治療週期內之給藥天數表示(C1D1：第1週期，第1天；C1D4：第1週期第4天等等)。WK：週；Pre-PD FU：進展前之追蹤；Post-PD FU：進展後之追蹤。黑色線顯示所有病患之中位數變化%。

圖5顯示骨髓抽出物中CD45⁺CD3⁺細胞之數目(測量為淋巴球之百分比)在以劑量8mg/kg或16mg/kg的DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間隨時間推移而增加。該圖表包括如所指示的反應者及無反應者。研究：SIRIUS。X軸指示時間，其係以治療週期及在各治療週期內之給藥天數表示(C2D22：第2週期第22天；等等)。SCR：基期；Post-PD FU1：進展後之追蹤。以灰色陰影強調的範圍指示針對以8mg/kg給藥的無反應者、以16mg/kg給藥的反應者、或以16mg/kg給藥的無反應者，各訪視之數據點的四分位數間距(IQR)分別係25至27%。NR：無反應者；R：反應者。

圖6顯示骨髓抽出物中CD45⁺CD3⁺ CD8⁺細胞之數目(呈淋巴球之百分比測量)在以劑量8mg/kg或16mg/kg的DARZALEX^TM (達拉單抗)治療期間隨時間推移而增加。該圖表包括如所指示的反應者及無反應者。研究：SIRIUS。X軸指示時間，其係以治療週期及在各治療週期內之給藥天數表示(C2D22：第2週期第22天等等)。SCR：基期；Post-PD FU1：進展後之追蹤。以灰色陰影強調的範圍指示針對以8mg/kg給藥的無反應者、以16mg/kg給藥的反應者、或以16mg/kg給藥的無反應者，各訪視之數據點的四分位數間距(IQR)分別係25至27%。NR：無反應者；R：反應者。

圖7A顯示在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間，以所有治療病患之中位數值所表示的周邊血液中CD8⁺/Treg及CD8⁺/CD4⁺細胞之比率增加。時間點：C1D1：第1週期第1天；C3D1：第3週期第1天；C4D1：第4週期第1天。研究：SIRIUS。SRC：基期。

圖7B顯示在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間，以所有經治療病患之中位數值所表示的骨髓抽出物中CD8⁺/Treg細胞之比率隨時間推移而增加。時間點：C1D1：第1週期第1天；C3D1：第3週期第1天；C4D1：第4週期第1天。研究：SIRIUS。

圖8A顯示當相較於無反應者時，反應者之CD8⁺ T細胞純系性增加，如使用特定純系細胞之豐度變化(CIA)%所測量。研究：GEN501 17病患子集。

圖8B顯示DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之前之於之後，個別病患中CD8⁺ T細胞純系性之倍數變化。反應者係經星號指示。純系性係測量為特定純系細胞之豐度變化(CIA)倍數。研究：GEN501 17病患子集。

圖8C顯示當相較於無反應者(B組)時，反應者(A組)在TCR貯庫中總擴增較大，其係使用CIA(豐度變化)測量。P=0.037。研究：GEN501 17病患子集。

圖8D顯示反應者及無反應者中各擴增T細胞殖株之絕對豐度變化(CIA)之和。反應者(A組)與無反應者(B組)之間的P=0.035。研究：GEN501 17病患子集。

圖8E顯示反應者(A組)及無反應者(B組)中之單個細胞殖株的最大CIA。研究：GEN501 17病患子集。

圖8F顯示當相較於無反應者(B組)時，反應者(A組)之單一殖株之最大擴增較大，其係使用最大CIA%測量。P=0.0477。研究：GEN501 17病患子集。

圖9A顯示在基期、或在治療2週、4週、或8週、或復發後，無反應者(NR，黑色方形)及對DARZALEX^TM(達拉單抗)具有至少最小反應之病患(MR，白色方形)的周邊血液中之CD8⁺初始細胞(nave cell)的百分比(%)。研究：GEN501 17病患子集。**p=1.82×10^-4。

圖9B顯示在基期、或在治療2週、4週、或8週、或復發後，無反應者(NR，黑色方形)及對DARZALEX^TM(達拉單抗)具有至少最小反應之病患(MR，白色方形)的周邊血液中之CD8⁺中央記憶細胞(Tem)之百分比。研究：GEN501 17病患子集。*p=4.88×10^-2。

圖9C顯示在基期、或在治療第1、4、或8週、或復發後，周邊血液中HLA I類限制性CD8⁺ T細胞之增加百分比。研究：GEN501 17病患子集。

圖9D顯示在基期或治療中，CD38在周邊血液之CD8⁺初始T細胞及CD8⁺中央記憶細胞(Tem)中以低水平表現。研究：GEN501 17病患子集。MFI：平均螢光強度。

圖10A顯示FACS分析之分佈圖，其顯示在基期，多發性骨髓瘤病患中Treg(CD3⁺ CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim)之頻率(上分佈圖，P4細胞群)及CD38⁺ Treg在Treg群內之頻率(下分佈圖，P5細胞群)。研究：GEN501 17病患子集。

圖10B顯示FACS分析之分佈圖，其顯示在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之後，多發性骨髓瘤病患中Treg(CD3⁺ CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim)之頻率(上分佈圖，P4細胞群)及CD38⁺ Treg在Treg群內之頻率(下分佈圖，P5細胞群)。 DARZALEX^TM(達拉單抗)治療使CD38⁺ Treg損耗。研究：GEN501 17病患子集。

圖10C顯示在基期、或在1週、4週、8週、復發之後、或在6個月治療結束(EOT)時，經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患中CD38^高CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim Treg之頻率。CD38^高Treg之頻率隨著DARZALEX^TM(達拉單抗)治療減少，並在EOT時返回至基期。Y軸：CD3⁺ T細胞之CD38^高CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim Treg的%。研究：GEN501 17病患子集。

圖10D顯示在基期、在治療1週、4週、及8週，反應者及無反應者中之CD8⁺/Treg細胞比率。在治療第8週時，反應者之於無反應者之CD8⁺/Treg細胞比率顯著地較高(p=0.00955)。研究：GEN501 17病患子集。

圖10E顯示當相較於CD38^- Treg或陰性對照時，在CD38⁺ Treg存在下更有效地抑制效應細胞的增生。誤差條代表標準誤差。星號標示顯著變化。樣本係自多個健康供體獲得。透過羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)之稀釋評估細胞增生。

圖11顯示骨髓衍生抑制細胞(MDSC)存在於多發性骨髓瘤病患中(上圖表，加框的細胞)，且約一半的細胞表現CD38(中間圖表，加框的細胞)。CD38高MDSC群於經一次DARZALEX^TM(達拉單抗)輸液治療的病患中損耗(下圖表，加框的細胞)。研究：GEN501 17病患子集。

圖12顯示當相較於基期時，在經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療1週、4週、或8週之後，病患中之CD38高MDSC(CD11b⁺HLADR^-CD14^-CD33⁺CD15⁺)之數目減少，並在治療結束(EOT)後返回至接近基期。復發病患仍展示CD38高MDSC減少。黑色方形：無反應者；白色方形：對DARZALEX^TM(達拉單抗)治療具有至少最小反應的病患。垂直線指示各組中之中位數值。病患2、4、15、16、及17展示出高的最初CD38高MDSC群。研究：GEN501 17病患子集。

圖13顯示具最高CD38高MDSC的病患(病患2、4、15、16、及17)具有最高的無進展存活期(PFS)。這些病患對DARZALEX^TM(達拉單抗)治療具有部分反應(PR)或最小反應(MR)。SD：疾病穩定；PD：疾病進展。X軸顯示各個別編號病患之PFS。

圖14顯示MDSC對DARZALEX^TM(達拉單抗)誘導之ADCC敏感。道迪細胞(Daudi cell)在測定中用作目標細胞之陽性對照。測量細胞裂解%。

圖15A顯示在治療之第1週、第4週、及第8週時，CD38⁺ Breg在經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患中損耗。

圖15B顯示CD38⁺ Breg在刺激後分泌IL-10。

圖16A顯示在基期及在治療期間的指定時間，透過具有VGPR的經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患之PBMC中CMV、EBV、及流感病毒特異性(CEF)IFN-γ的產生所測量之抗病毒反應。OD：光學密度。白色條：陰性對照；黑色條：添加CEF；短劃條：僅同種異體PBMC。星號指示統計學顯著的變化。Pre 4,8,10=治療之第4、8、或10週。

圖16B顯示在基期及在治療期間的指定時間，透過具有CR的經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患之PBMC中CMV、EBV、及流感病毒特異性(CEF)IFN-γ的產生所測量之抗病毒反應。OD：光學密度。白色條：陰性對照；黑色條：添加CEF；短劃條：僅同種異體PBMC。星號指示統計學顯著的變化。Pre 4,8,10=治療之第4、8、或10週。

圖16C顯示在基期及在治療期間的指定時間，透過具有PD的經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患之PBMC中CMV、EBV、及流感病毒特異性(CEF)IFN-γ的產生所測量之抗病毒反應。OD：光學密度。白色條：陰性對照；黑色條：添加CEF；短劃條：僅同種異體PBMC。Ns：不顯著。Pre 4,8=治療之第4或8週。

圖16D顯示在基期及在治療期間的指定時間，透過具有MR的經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患之PBMC中CMV、EBV、及流感病毒特異性(CEF)IFN-γ的產生所測量之抗病毒反應。OD：光學密度。白色條：陰性對照；黑色條：添加CEF；短劃條：僅同種異體PBMC。Ns：不顯著。Pre 4,8=治療之第4或8週。

圖16E顯示在基期及在治療期間所指定的時間，具有VGPR的經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患之PBMC中增生病毒反應性T細胞之百分比(%)。白色條：陰性對照；黑色條：添加CEF。星號指示統計學顯著的變化。Pre 4,8,10=治療之第4、8、或10週。

圖16F顯示在基期及在治療期間所指定的時間，具有CR的經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患之PBMC中增生病毒反應性T細胞之百分比(%)。白色條：陰性對照；黑色條：添加CEF。星號指示統計學顯著的變化。Pre 4,8,10=治療之第4、8、或10週。

圖17A顯示FACS分析之分佈圖，其顯示CD38在健康供體之自然殺手細胞(NK)、單核球、B細胞、及T細胞上的表現水平。

圖17B顯示FACS分析之分佈圖，其顯示CD38在多發性骨髓瘤病患之漿細胞、自然殺手細胞(NK)、單核球、B細胞、及T細胞上的表現水平。

圖17C顯示復發性及難治性多發性骨髓瘤病患之CD38+ Treg、Breg、NK、B細胞、及T細胞中CD38之平均螢光強度(MFI)的比較。當相較於CD38+Treg、Bregs、及NK細胞時，CD38以較低水平表現於B細胞及T細胞中。

圖18顯示PD-L1蛋白隨時間推移在反應者(R)之PBMC樣本中下調且在無反應者(NR)中上調。SD：疾病穩定。C1D1：第1週期第1天；C3D1：第3週期第1天。Y軸顯示log2蛋白濃度值。

於本說明書及隨附的申請專利範圍中，除非內文另有明確說明，否則單數形式的「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合、及類似者。

「CD38」係指人類CD38蛋白(同義字：ADP核糖基環化酶1、cADPr水解酶1、環ADP核糖水解酶1)。人類CD38具有GenBank登錄號NP_001766及SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。熟知的是，CD38係一種II型單次跨膜蛋白，其具有：胺基酸殘基1至21，其等代表胞質域；胺基酸殘基22至42，其等代表跨膜域；及殘基43至300，其等代表CD38之胞外域。

SEQ ID NO：1

本文中所用之「抗體(antibody)」係以廣義的方式意指並包括免疫球蛋白(immunoglobulin)分子，其包括單株抗體(包括鼠類、人類、人化(humanized)、及嵌合單株抗體)、抗體片段、雙特異性或多特異性抗體、二聚體、四聚體、或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體、以及任何其他包含具有所需特異性之抗原結合部位(antigen binding site)的免疫球蛋白之修飾組態。

免疫球蛋白可分派為五大類，即IgA、IgD、IgE、IgG及、IgM，取決於重鏈恆定域(constant domain)胺基酸序列。IgA及IgG被進一步細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可分派為兩種截然不同類型(即kappa(κ)及lambda(λ))之一者，視其等恆定域的胺基酸序列而定。

「抗體片段(Antibody fragment)」係指免疫球蛋白分子的一個部分，其保留重鏈及/或輕鏈抗原結合部位，諸如重鏈互補決定區(HCDR)1、2、及3、輕鏈互補決定區(LCDR)1、2、及3、重鏈可變區(VH)、或輕鏈可變區(VL)。抗體片段包括Fab片段，即由VL、VH、CL、及CH1域所組成之單價片段；F(ab)₂片段，即二價片段，包含在絞鏈區域(hinge region)藉由二硫橋連結的兩個Fab片段；Fd片段，由VH及CH1域所組成；Fv片段，由抗體單臂的VL及VH域所組成；域抗體(dAb)片段(Ward等人，Nature 341：544-6,1989)，其係由VH域所組成。VH及VL域可經工程改造並經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域會進行分子內配對，或者在VH及VL域係由分開之單鏈抗體建構體所表現之情況下則會進行分子間配對，以形成單價抗原結合部位，諸如單鏈Fv(scFv)或雙價抗體(diabody)；例如描述於PCT國際公開第WO1998/44001號、第WO1988/01649號、第WO1994/13804號、及第WO1992/01047號中者。這些抗體片段係使用所屬技術領域中具有通常知識者所知悉的熟知技術而獲得，且該些片段係經篩選具有如全長抗體相同方式之效用。

「經單離之抗體(isolated antibody)」係指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體或抗體片段(例如，特異性結合CD38的經單離之抗體實質上不含特異性結合人類CD38以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合CD38的經單離之抗體可能會與其他抗原有交叉反應，諸如人類CD38的異種同源物，諸如食蟹獼猴(Macaca fascicularis,cynomolgus)CD38。在雙特異性抗體之情況下，雙特異性抗體特異性結合兩種感興趣的抗原，且實質上不含特異性結合非為兩種感興趣抗原之抗原的抗體。此外，經單離之抗體可實質上不含其他細胞材料和/或化學物。「經單離之抗體」涵蓋經單離至較高純度的抗體，諸如係80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%純的抗體。

「特異性結合(specific binding,specific bind)」或「結合(bind)」係指抗體以大於其他抗原的親和力結合至一抗原或該抗原內之表位。通常，抗體以約1×10^-8M或更小(例如約1×10^-9M或更小、約1×10^-10M或更小、約1×10^-11M或更小、或約1×10^-12M或更小)的平衡解離常數(K_D)，結合至抗原或抗原內之表位，通常係以其結合至非特異性抗原(例如，BSA、酪蛋白)之K_D小至少一百倍的K_D結合。解離常數可使用標準程序來測量。然而，特異性結合至抗原或抗原內之表位的抗體可能對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物(homolog))，該猴例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis,cynomolgus,cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes,chimpanzee,chimp)、或狨(Callithrix jacchus,common marmoset,marmoset)。儘管單特異性抗體特異性結合一種抗原或一種表位，但雙特異性抗體特異性結合兩種不同抗原或兩種不同表位。

抗體可變區係由被三個「抗原結合部位(antigen binding site)」中斷的「架構(framework)」區所組成。該等抗原結合部位係使用各種用語定義：互補決定區(CDR)(三個在VH(HCDR1,HCDR2,HCDR3)且三個在VL(LCDR1,LCDR2,LCDR3))係基於序列變異性(Wu及Kabat(1970)J Exp Med 132：211-50；Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)；「高度變異區(Hypervariable region)」、「HVR」、或「HV」(三個在VH(H1,H2,H3)且三個在VL(L1,L2,L3))係指如Chothia及Lesk所定義般在結構上係高度變異(hypervariable)之抗體可變域中的區域(Chothia及Lesk(1987)Mol Biol 196：901-17)。其他用語包括「IMGT-CDR」(Lefranc等人，(2003)Dev Comparat Immunol 27：55-77)及「特異性決定殘基用途(Specificity Determining Residue Usage)」(SDRU)(Almagro(2004)Mol Recognit 17：132-43)。國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics,IMGT)數據庫(http：//www_imgt_org)提供了標準化編號及抗原結合部位的定義。CDR、HV、及IMGT描繪之間的對應性係描述於Lefranc等人，(2003)Dev Comparat Immunol 27：55-77中。

本文中所用之「Chothia殘基(Chothia residue)」為根據Al-Lazikani所編號的抗體VL及VH殘基(Al-Lazikani等人，(1997)J Mol Biol 273：927-48)。

「架構(framwork)」或「架構序列(framwork sequence)」為可變區中被定義為抗原結合部位以外的其餘序列。因為抗原結合部位可用如上所述之各種用語來定義，架構之確切胺基酸序列取決於如何定義抗原結合部位。

「人化抗體(humanized antibody)」係指抗原結合部位係衍生自非人類物種且可變區架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人化抗體可在架構區中包括取代，所以該架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或生殖系基因序列的確切複本。

「人類抗體(human antibody)」係指具有重鏈及輕鏈可變區的抗體，其中架構及抗原結合部位兩者皆衍生自人源序列。若該抗體含有恆定區，則該恆定區亦衍生自人源序列。

人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重或輕鏈可變區，其中該抗體的可變區係獲自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統。該等系統包括經呈現在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫(gene library)、及基因轉殖非人類動物(諸如帶有人類免疫球蛋白基因座的小鼠)。「人類抗體」在與人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因比較時可能含有胺基酸差異，此係因於例如天然發生之體細胞突變、或在架構或抗原結合部位中刻意引入取代、或兩者。通常，「人類抗體」係在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性。在一些情況下，「人類抗體」可能含有自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296：57-86中所述，或合併至經呈現在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫中的合成HCDR3，例如Shi等人，(2010)J Mol Biol 397：385-96及國際專利公開第WO2009/085462號中所述。

衍生自人類免疫球蛋白序列的人類抗體可使用諸如合併有合成CDR及/或合成架構之噬菌體呈現(phage display)的系統來產生，或者可在體外進行突變誘發以改良抗體性質，從而得到在體內人類抗體生殖系貯庫(repertoire)內不會天然存在的抗體。

抗原結合部位衍生自非人類物種的抗體不包括在人類抗體的定義中。

「重組抗體(recombinant antibody)」包括所有藉由重組手段製備、表現、創建、或單離之抗體。諸如自基因轉殖或染色體轉殖有人類免疫球蛋白基因的動物(例如小鼠或大鼠)或由其製備的融合瘤(於以下進一步描述)單離之抗體；自經轉形(transform)以表現抗體之宿主細胞單離之抗體；自重組、組合抗體庫單離之抗體；及藉由任何涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的其他手段製備、表現、創建、或單離之抗體；或在體外使用Fab臂交換所產生的抗體諸如雙特異性抗體。

「單株抗體(monoclonal antibody)」係指由單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組成物對特定表位呈現出單一結合特異性及親和力，或者在雙特異性單株抗體的情況下，對兩個不同的表位有雙結合特異性。「單株抗體」因此係指在各重鏈及各輕鏈中具有單一胺基酸組成之抗體群，除了可能熟知的變更，諸如自抗體重鏈移除C端離胺酸。在抗體群內，單株抗體可具有異質性醣基化。單株抗體可係單特異性或多特異性，或單價、二價、或多價。雙特異性抗體係包括在用語單株抗體中。

「表位(epitope)」意指與抗體特異性結合的抗原部分。表位經常係由分子部分(諸如胺基酸或多醣側鏈)之化學活性(諸如極性、非極性、或疏水性)表面分組(grouping)所組成，並且可具有特定三維結構特性，以及特定電荷特性。表位可由形成構形空間單元之鄰接(contiguous)及/或非鄰接(noncontiguous)胺基酸所構成。針對非鄰接表位，來自抗原線性序列之相異部分的胺基酸會透過蛋白質分子的摺疊而在3維空間中緊密靠近。

「變異體(variant)」係指藉由一或多個修改(例如取代、插入、或刪除)而不同於參考多肽或參考多核苷酸的多肽或多核苷酸。

「組合(in combination with)」意指二或更多種治療劑一起以混合物形式投予至對象，同時以單劑投予或以任何順序以單劑依序投予。一般而言，各藥劑將以一劑量及/或按照針對該藥劑所判定之時間表投予。

「治療(treat或treatment)」係指治療性處理，其中目的係在於減緩(減輕)非所欲的生理變化或疾病，諸如腫瘤或腫瘤細胞的發展或蔓延，或在治療過程中提供有益或所欲的臨床結果。有益或所欲的臨床結果包括症狀的減輕、疾病程度的減小、疾病狀態的穩定化(即，不惡化)、疾病進程的延緩或減慢、不發生轉移、疾病狀態的改善或緩和、及緩解(無論部分或完全)，無論是可偵測或不可偵測的。「治療」亦可意指相較於未接受治療之對象的預期存活期，延長存活期。那些需要治療的對象包括那些已經患有非所欲的生理變化或疾病的對象，以及那些易患有該生理變化或疾病的對象。

「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指達到所欲治療成果所需之劑量及時間的有效量。治療有效量可根據不同因素而異，諸如對象之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在對象中引發所欲反應的能力。有效治療劑或治療劑組合的例示性指標包括例如病患幸福感的改善、腫瘤負荷的減少、腫瘤生長的減緩或停止、及/或癌細胞未轉移至身體的其他位置。

「抑制生長(inhibit growth)」(例如，提及腫瘤細胞時)係指當相較於在治療劑或治療藥品之組合不存在的情況下相同腫瘤細胞或腫瘤組織之生長的降低或延緩時，當與治療劑或治療劑或藥品之組合接觸時，在體外或體內的腫瘤細胞生長或腫瘤組織有可測量的降低或延緩。在體外或體內的腫瘤細胞或腫瘤組織之生長的抑制可係至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、或100%。

「調節T細胞(regulatory T cell)」、或「Tregs」、或「Treg」係指調節(一或多種)其他T細胞及/或其他免疫細胞之活性(經常藉由抑制其等活性)之T淋巴球。Treg可係CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim T細胞。應瞭解，Treg可不完全限於此表型，且可表現Foxp3。

「效應T細胞(effector T cell)」、或「Teffs_」、或「Teff」係指執行免疫反應之功能的T淋巴球，諸如殺滅腫瘤細胞及/或活化抗瘤免疫反應，其可導致腫瘤細胞自身體清除。Teff可係CD3⁺與CD4⁺或CD8⁺。Teff可分泌、含有、或表現諸如IFN-γ、顆粒酶B、及ICOS之標誌。應瞭解，Teffs可不完全限於這些表型。

「Treg之功能(Function of Tregs)」或「Treg功能(Treg function)」係指Treg之抑制性功能，其係關於宿主免疫反應之調節及/或自體免疫之預防。Treg之功能可係抑制由CD8⁺ T細胞、自然殺手(NK)細胞、MØ細胞、B細胞、或樹突細胞(DC)所引發之抗瘤反應，或抑制效應T細胞之增生。

「抑制Treg之功能(Inhibit function of Tregs)」或「抑制Treg功能(inhibit Treg function)」係指降低在體外或在動物或人類對象體內的Treg之功能的水平，其可藉由所屬技術領域中已知的習知技術判定。Treg之功能的水平可降低例如至少約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%。「抑制Treg之功能」包括減少Treg之數目，例如藉由經由抗體效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC))來殺滅Treg。

「骨髓衍生抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell)」、或「MDSCs」、或「MDSC」係指為造血譜系且表現巨噬細胞/單核球標誌CD11b及顆粒球標誌Gr-1/Ly-6G之特化細胞群。MDSC之表型可係例如CD11b⁺HLA-DR^-CD14^-CD33⁺CD15⁺。MDSC表現成熟抗原呈遞細胞標誌MHC II類及F480之低或不可偵測的表現。MDSC係骨髓譜系之未成熟細胞，且可進一步分化成若干細胞型，包括巨噬細胞、嗜中性球、樹突細胞、單核球、或顆粒球。MDSC可天然地發現於人類及動物之正常成人骨髓中或正常造血之部位(諸如脾)中。

「抑制MDSC之功能(Inhibit function of MDSCs)」或「抑制MDSC功能(inhibit MDSC function)」係指降低在體外或在動物或人類對象體內的MDSC之功能的水平，其可藉由所屬技術領域中已知的習知技術判定。MDSC之功能的水平可降低例如至少約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%。「抑制MDSC之功能」包括減少MDSC之數目，例如藉由經由抗體效應功能(諸如ADCC)來殺滅MDSC。MDSC可藉由各種機制(諸如活性氧化物過氧化亞硝酸鹽的產生、因高水平精胺酸酶所致的精胺酸酶代謝的增加、及氧化亞氮合成酶的增加)抑制T細胞反應諸如增生、純系擴增、或細胞介素產生。MDSC可對IFN-γ及若干細胞介素(諸如IL-4及IL-13)反應。IFN-γ可活化MDSC，其誘導一氧化氮合成酶2(NOS2)之活性。可替代地，Th2細胞介素諸如介白素-4(IL-4)及IL-13可活化MDSC，其可引起誘導精胺酸酶-1(ARG1)之活性。藉由NOS2或ARG1代謝L-精胺酸可引起抑制T細胞的增生，且兩種酶的活性一起可透過產生活性氮氧化物而導致T細胞的細胞凋亡。

「Treg相關疾病(Treg related disease)」係指關係到T調節細胞(Treg)之疾病或病症。Treg相關疾病可由Treg功能(例如，抑制抗瘤反應或抑制效應T細胞增生)造成。Treg媒介之疾病可係癌症。「Treg相關疾病」及「Treg媒介之疾病(Treg mediated disease)」在本文中可互換使用。

「增強效應T細胞之反應(Enhance response of effector T cells)」或「增強T細胞之反應(enhance T cell responses)」係指在體外或在動物或人類對象體內增強或刺激效應T細胞以具有持續的或放大的生物功能，或更新或再活化耗盡的或非活性的T細胞。例示性T細胞反應係增生、γ-干擾素自CD 8⁺ T細胞分泌、抗原反應性、或純系擴增。測量此增強之方式對於所屬技術領域中具有通常知識者係已知的。

「MDSC相關疾病(MDSC related disease)」係指關係到骨髓衍生抑制細胞(MDSC)之疾病或病症。MDSC相關疾病可由MDSC功能(例如，抑制抗瘤反應或效應T細胞增生)造成。MDSC媒介之疾病可係癌症。「MDSC相關疾病」及「MDSC媒介之疾病(Treg mediated disease)」在本文中可互換使用。

「調節B細胞(Regulatory B cell)」、或「Breg」、或「Bregs」係指抑制免疫反應之B淋巴球。Breg可係CD19⁺CD24⁺CD38⁺細胞，且可藉由抑制由Breg所分泌之IL-10所媒介之T細胞增生來抑制免疫反應。應瞭解，存在其他Breg子集，且描述於例如Ding等人，(2015)Human Immunology 76：615-621中。

「Breg相關疾病(Breg related disease)」係指關係到調節B細胞之疾病或病症。Breg相關疾病可由例如Breg媒介之抗瘤反應的抑制或效應T細胞增生造成。Breg媒介之疾病可係癌症。「Breg相關疾病」及「Breg媒介之疾病(Breg mediated disease)」在本文中可互換使用。

「病患(Patient)」包括任何人類或非人類動物(nonhuman animal)。「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、爬蟲類、等等。「病患」及「對象(subject)」在本文中可互換使用。

本發明提供一種用特異性結合CD38之抗體治療患有固態腫瘤之病患的方法，不管腫瘤細胞是否表現CD38。本發明進一步提供用於治療患有調節T細胞(Treg)、骨髓衍生抑制細胞(MDSC)、或調節B細胞(Breg)媒介之疾病之病患的方法。本發明進一步提供用於調節Treg、MDSC、或Breg活性以治療固態腫瘤的方法，該等固態腫瘤係CD38陽性及/或與這些免疫抑制性細胞之高水平相關聯。

本發明係至少部分地基於以下發現，即抗CD38抗體DARZALEX^TM(達拉單抗(daratumumab))在病患中具有免疫調節活性，其減少免疫抑制性Treg、MDSC、及Breg之數目，增加CD8⁺ T細胞之數目及CD8⁺對Treg之比率，促進CD8⁺中央記憶細胞形成，及增加T細胞純系性。

臨床上正評估DARZALEX^TM(達拉單抗)及其他抗CD38抗體治療血基質惡性腫瘤及漿細胞病症之功效，包括多發性骨髓瘤，其係藉由該抗體藉由抗體效應功能(諸如ADCC、CDC、ACDP、及細胞凋亡)消除CD38-陽性細胞之能力，但是其等在促進適應性免疫反應中之免疫調節活性尚未被認識。其他免疫調節抗體(抗PD1、抗CTLA4)透過靶向免疫系統之抑制抗瘤反應的組分起作用。例如，抗PD1抗體已被展示增加T細胞增生，刺激抗原特異性記憶反應，且部分減輕在體外Treg媒介之效應T細胞的抑制(例如參見，美國專利第8,779,105號)。兩種抗PD-1抗體目前被核准用於黑色素瘤的治療，OPDIVO®(尼沃魯單抗(nivolumab))及KEYTRUDA®(派立珠單抗(pembrolizumab))，且這些抗體處於各種固態腫瘤之臨床開發中，諸如非小細胞肺癌、前列腺癌、頭部及頸部癌、胃腸癌、胃癌、前列腺癌、輸卵管癌、卵巢癌、胰腺癌、乳癌及腦癌、腎癌、膀胱癌、尿道癌、食管癌、及結腸直腸癌。抗CTLA-4抗體YERVOY®(伊匹單抗(ipilimumab))已被核准用於黑色素瘤的治療。YERVOY®(伊匹單抗)及另一個抗CTLA-4抗體(曲美木單抗(tremelimumab))亦正開發用於前列腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、胃腸癌、胃癌、結腸直腸癌、腎癌、食管癌、及泌尿生殖癌。

不希望受任何特定理論束縛，基於用本文所述之DARZALEX^TM(達拉單抗)觀察到之免疫調節效應，DARZALEX^TM(達拉單抗)及其他抗CD38抗體可能在固態腫瘤之治療中係有效的。因在經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之病患中觀察到免疫反應之一般活化，患有CD38-陰性固態腫瘤之病患可能同樣會對抗CD38抗體療法反應。

本發明提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有調節T細胞(Treg)媒介之疾病之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該Treg媒介之疾病的時間。

本發明亦提供一種治療患有骨髓衍生抑制細胞(MDSC)媒介之疾病之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該MDSC媒介之疾病的時間。

本發明亦提供一種治療患有調節B細胞(Breg)媒介之疾病之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該Breg媒介之疾病的時間。

本發明亦提供一種抑制調節T細胞(Treg)之活性的方法，其包含使該調節T細胞接觸特異性結合CD38之抗體。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含藉由向該病患投予特異性結合CD38之抗體來減少該病患中調節T細胞(Treg)之數目。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含藉由向該病患投予特異性結合CD38之抗體來減少該病患中調節B細胞(Breg)之數目。

本發明亦提供一種增強病患之免疫反應的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予特異性結合CD38之抗體達一段足以增強該免疫反應的時間。

在一些實施例中，該病患患有病毒感染。

本發明亦提供一種治療患有病毒感染之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該病毒感染的時間。

在一些實施例中，該免疫反應係效應T細胞(Teff)反應。

在一些實施例中，該Teff反應係由CD4⁺ T細胞或CD8⁺ T細胞媒介。

在一些實施例中，該Teff反應係由CD4⁺ T細胞媒介。

在一些實施例中，該Teff反應係由CD8⁺ T細胞媒介。

在一些實施例中，該Teff反應係CD8⁺ T細胞之數目的增加、CD8⁺ T細胞增生的增加、T細胞純系擴增的增加、CD8⁺記憶細胞形成的增加、抗原依賴性抗體產生的增加、或細胞介素、趨化介素、或介白素產生的增加。

T細胞之增生可例如藉由使用氚化胸苷測量DNA合成之速率，或測量體外干擾素-γ(IFN-γ)之產生，或使用已知方法測量病患樣本之細胞群中T細胞之絕對數目或百分比來評估。

純系擴增可藉由例如使用已知方法定序T細胞池之TCR來評估。

記憶細胞之形成可藉由使用例如FACS測量初始(nave)T細胞(CD45RO^-/CD62L⁺)對記憶T細胞(CD45RO⁺/CD62L^高)之比率來評估。

細胞介素、趨化介素、或介白素之產生(諸如干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18、及IL-23、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4的產生)可使用標準方法諸如ELISA或ELLISPOT測定評估。

抗原特異性抗體之產生可使用標準方法(諸如ELISA或放射免疫測定(RIA))從衍生自病患之樣本評估。

「增加(increase或increasing)」各種Teff反應之含義係易於理解的。在測試樣本中或在對象中當相較於對照時，舉例而言，例如在經抗CD38抗體治療的病患中當相較於治療之前的相同病患時，或在對抗CD38抗體治療作出反應之病患或病患之群組中當相較於對相同治療未作出反應之病患或病患之群組中，增加可係增加至少約5%、至少約10%、25%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、或更多。通常，增加係統計學顯著的。

類似地，「減少(reduce或reducing)」或「降低(decreasing或decrease)」Treg、MDSC、及/或Breg之數目之含義係易於理解的。在測試樣本中或在對象中當相較於對照時，舉例而言，例如在經抗CD38抗體治療的病患中當相較於治療之前的相同病患時，或在對抗CD38抗體治療作出反應之病患或病患之群組中當相較於對相同治療未作出反應之病患或病患之群組中，降低可係至少約10%、25%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、或更多。一般而言，降低係統計學顯著的。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體抑制免疫抑制細胞之功能。

在一些實施例中，免疫抑制細胞係調節T細胞(Treg)、骨髓衍生抑制細胞(MDSC)、或調節B細胞(Breg)。

在一些實施例中，Treg係CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim T細胞。

在一些實施例中，CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim細胞表現Foxp3。

在一些實施例中，CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim T細胞表現CD38。

Treg功能，諸如其等抑制Teff細胞之能力，可使用已知方法評估，諸如評估混合淋巴球反應(MLR)中Treg抑制Teff增生之能力。

Treg功能可藉由例如透過直接殺滅Treg或Treg之亞群(諸如CD38⁺ Treg)減少Treg當相較於Teff時的相對數目(例如增加CD8⁺/Treg細胞之比率)來抑制。

在一些實施例中，Treg功能係藉由殺滅Treg細胞來抑制。

在一些實施例中，Treg殺滅係藉由抗體誘導之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、或特異性結合CD38之抗體所誘導的細胞凋亡來媒介。

在一些實施例中，Treg殺滅係藉由ADCC媒介。

在一些實施例中，CD38⁺ Treg係被殺滅的。

在一些實施例中，1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、或60%的Treg係被殺滅的。

由於CD38僅在Treg及MDSC之一部分中表現，所以預期治療患有固態腫瘤之病患將不會導致Treg及MDSC之全身性損耗，因此可能提供改善的安全概況。

在一些實施例中，MDSC係CD11b⁺HLA-DR^-CD14^- CD33⁺CD15⁺細胞。

在一些實施例中，CD11b⁺HLA-DR^-CD14^-CD33⁺CD15⁺ MDSC表現CD38。

MDSC功能可例如藉由透過直接殺滅該等細胞減少MDSC之數目來抑制。

在一些實施例中，MDSC功能係藉由殺滅CD38⁺ MDSC來抑制。

在一些實施例中，MDSC殺滅係藉由抗體誘導之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、或特異性結合CD38之抗體所誘導的細胞凋亡來媒介。

在一些實施例中，MDSC殺滅係藉由ADCC媒介。

在一些實施例中，1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、或60%的MDSC係被殺滅的。

在一些實施例中，Breg係CD19⁺CD24⁺CD38⁺細胞。

Breg功能可例如藉由透過直接殺滅Breg減少Breg之數目來抑制。

在一些實施例中，Breg功能係藉由殺滅CD38⁺ Breg來抑制。

在一些實施例中，Breg殺滅係藉由抗體誘導之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、或特異性結合CD38之抗體所誘導的細胞凋亡來媒介。

在一些實施例中，Breg殺滅係藉由ADCC媒介。

在一些實施例中，1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、或60%的Breg係被殺滅的。

Treg在維持周邊身耐受性中起關鍵作用。天然發生之CD4⁺CD25^hi Treg係產生於胸腺中，並表現Foxp3，其係用於建立及維持Treg譜系鑑別及抑制功能所需的轉錄因子。Treg可聚積在疾病部位(例如在腫瘤內)，在該處其等抑制腫瘤抗原特異性T細胞之效應功能，導致抗瘤反應不足。腫瘤浸潤Foxp3⁺ Treg之增加的密度與各種固態腫瘤(包括胰腺癌、卵巢癌、及肝細胞癌)中之不良預後相關聯。Treg之損耗導致鼠類模型中之抗瘤免疫及腫瘤排斥增強，但亦可導致自體免疫疾病之發展。

骨髓衍生抑制細胞(MDSC)係在不同分化階段之早期骨髓前驅細胞、未成熟顆粒球、巨噬細胞、及樹突細胞之異質性族群。其等大量聚積於癌症病患中，且其等具有強力的免疫抑制性功能，抑制自然殺手細胞(NK)及自然殺手T細胞(NKT)兩者之細胞毒性活性、及由CD8⁺ T細胞媒介之適應性免疫反應。儘管NK細胞抑制之機制目前未被很好地理解，但MDSC媒介之T細胞抑制係由多個途徑負責，包括精胺酸酶1/ARG1之產生及一氧化氮合成酶2(NOS2)之上調。ARG1及NOS2代謝L-精胺酸，且係一起或分開地阻斷T細胞CD3ζ鏈之轉譯，抑制T細胞增生，及促進T細胞凋亡。此外，MDSC分泌免疫抑制性細胞介素並誘導調節T細胞發展。

MDSC係由促發炎細胞介素誘導，且在感染性及發炎性病理狀態中發現數目增加。其等聚積於荷瘤小鼠之血液、骨髓、及次級淋巴器官中，且其等在腫瘤微環境中的存在表明在促進腫瘤相關之免疫抑制中起致病作用。

MDSC已描述於患有結腸癌、黑色素瘤、肝細胞癌、頭部及頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、胰腺癌、及乳癌之病患中(Mandruzzato等人，(2009)J Immunol 182：6562-6568；Liu等人，(2009)J Cancer Res Clin Oncol 136：35-45；Ko等人，(2009)Clin Cancer Res 15：2148-2157；Morse等人，(2009)Expert Opin Biol Ther 9：331-339；Diaz-Montero等人，(2009)Cancer Immunol Immunother 58：49-59；Corzo等人，(2009)J Immunol 182：5693-5701)。在癌症病患中，Diaz等人(Diaz-Montero等人，(2009)Cancer Immunol Immunother 58：49-59)提出MDSC之聚積與更加嚴重的疾病及不良的預後相關。

腫瘤浸潤Breg已在固態腫瘤中鑑定出，且Breg可藉由各種機制促進腫瘤生長及轉移，諸如抑制CD8⁺ T細胞及NK細胞之抗瘤活性，如例如Ding等人，(2015)Human Immunology 76：615-62中所述。

「抗體依賴性細胞毒性」、「抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性」、或「ADCC」是一種誘導細胞死亡的機制，其取決於抗體包覆的目標細胞與具有裂解活性的效應細胞(諸如自然殺手細胞、單核球、巨噬細胞、及嗜中性球)之間經由效應細胞上表現的Fcγ受體(FcγR)的相互作用。例如，NK細胞表現FcγRIIIa，而單核球表現FcγRI、FcγRII、及FcvRIIIa。抗體包覆的目標細胞(諸如CD38表現細胞)的死亡會發生是由於效應細胞活性，其係透過分泌膜孔形成蛋白(membrane pore-forming protein)及蛋白酶。為了評估特異性結合CD38之抗體的ADCC活性，可將該抗體加入至CD38表現細胞與免疫效應細胞的組合，該等免疫效應細胞可被抗原抗體複合物活化而導致目標細胞的細胞裂解。細胞裂解一般是透過從裂解細胞中釋放的標記(例如放射性基質、螢光染料、或天然的細胞內蛋白質)來偵測。用於該等測定之例示性效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及NK細胞。例示性目標細胞包括表現CD38之Treg或MDSC。在一例示性測定中，將目標細胞以20μCi的⁵¹Cr標記2小時並徹底清洗。可將該等目標細胞的細胞濃度調整至1×10⁶細胞/ml，並加入各種濃度的抗 CD38抗體。以效應：目標細胞比率為40：1加入目標細胞以開始測定。於37℃培養3小時後，以離心停止測定，並在閃爍計數器中測量從裂解細胞中釋放出的⁵¹Cr。細胞毒性百分比可計算為加入3%過氯酸至目標細胞中可誘導的最大裂解百分比。

「抗體依賴性細胞吞噬作用」(「ADCP」)係指一種透過吞噬細胞(諸如巨噬細胞或樹突細胞)內化(internalization)以消滅抗體包覆的目標細胞的機制。ADCP可藉由使用表現CD38之Treg或MDSC作為目標細胞(其等經工程改造以表現GFP或其他標記分子)來評估。效應：目標細胞比率可為例如4：1。可將效應細胞與目標細胞在抗CD38抗體存在或不存在的情況下一起培養4小時。培養後，可使用細胞剝離液(accutase)將細胞分離。巨噬細胞可用偶接螢光標記的抗CD11b及抗CD14抗體來鑑定，且吞噬作用百分比可基於在該等CD11⁺CD14⁺巨噬細胞中的GFP螢光%使用標準方法判定。

「補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity)」或「CDC」係指一種誘導細胞死亡的機制，其中與目標結合之抗體的Fc效應域結合並活化補體成分C1q，其轉而再活化補體級聯反應而引起目標細胞死亡。補體的活化亦可導致補體成分沉積在該目標細胞表面上，藉由結合白血球上的補體受體(例如CR3)而促進ADCC。

單株抗體誘導ADCC之能力可藉由工程改造其寡醣成分來增強。人類IgG1或IgG3係在Asn297處經N-醣基化並且大部分聚醣係呈熟知之雙觸角(biantennary)G0、G0F、G1、G1F、G2、或G2F形式。由未經工程改造之CHO細胞所生產之抗體通常具有約至少85%之聚醣海藻糖(glycan fucose)含量。自附接至Fc區之雙觸角複合型寡醣移除核心海藻糖經由改善FcγRIIIa結合且不改變抗原結合或CDC活性來增強抗體之ADCC。該等mAb可使用已報導會引起成功表現相對高量去海藻糖基化(defucosylated)抗體(帶有雙觸角複合型之Fc寡醣)的不同方法來達成，諸如控制培育滲透壓(Konno等人，(2012)Cytotechnology 64：249-65)、應用變異體CHO株Lec13作為宿主細胞系(Shields等人，(2002)J Biol Chem 277：26733-26740)、應用變異體CHO株EB66作為宿主細胞系(Olivier等人，(2010)MAbs 2(4),Epub ahead of print；PMID：20562582)、應用大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系(Shinkawa等人，(2003)J Biol Chem 278：3466-3473)、引入專門針對α1,6-岩藻糖基轉移酶(1,6-fucosyltrasferase,FUT8)基因之短小干擾RNA(Mori等人，(2004)Biotechnol Bioeng 88：901-908)、或共表現β-1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III)及高基氏α-甘露糖苷酶II(Golgi α-mannosidase II)或基夫鹼(kifunensine)(一種強效α-甘露糖苷酶I抑制劑)(Ferrara等人，(2006)J Biol Chem 281：5032-5036；Ferrara等人，(2006)Biotechnol Bioeng 93：851-861；Xhou等人，(2008)Biotechnol Bioeng 99：652-65)。由在本發明之方法中，以及在以下每一個編號實施例的一些實施例中所使用的抗CD38抗體所引發的ADCC亦可藉由在抗體Fc中的某些取代來增強。例示性取代例如為在胺基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378、或430處之取代(殘基編號根據EU索引)，如美國專利第6,737,056號中所述。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體包含在抗體Fc中的一個取代。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體包含在抗體Fc中胺基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378、或430處的一個取代(殘基編號根據EU索引)。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體具有雙觸角聚醣結構，其海藻糖含量係約介於0%至約15%之間，例如15%、14%、13%、12%、11% 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體具有雙觸角聚醣結構，其海藻糖含量係約50%、40%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11% 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%。

Fc中的取代及減少的海藻糖含量可增強該特異性結合CD38之抗體的ADCC活性。

「海藻糖含量(Fucose content)」意指Asn297處糖鏈中海藻糖單醣的量。海藻糖的相對量係含海藻糖的結構相對於所有醣類結構的百分比。這些可藉由多種方法來表徵及定量，例如：1)使用經N-醣苷酶F處理過的樣本(例如複合、雜合、及寡與高甘露糖(oligo-and high-mannose)結構)的MALD1-TOF，如在國際專利公開號WO2008/077546中所述；2)酶促釋放Asn297聚醣，隨後衍生化並藉由HPLC(UPLC)以螢光偵測及/或HPLC-MS(UPLC-MS)來偵測/定量；3)天然或還原mAb的完整蛋白質分析，將Asn297聚醣以Endo S或其他會在第一與第二GlcNAc單醣之間切割而留下連接至第一GlcNAc的海藻糖的酵素處理或不經處理；4)以酶消化法(enzymatic digestion)(例如胰蛋白酶或內肽酶Lys-C)將mAb消化成構成分(constituent)肽，隨後以HPLC-MS(UPLC-MS)分離、偵測及定量；或5)用PNGase F在Asn 297處進行特異性酶促去醣基化(specific enzymatic deglycosylation)以將mAb寡醣自mAb蛋白分離。該等釋放出的寡醣可用螢光團標記，藉由各種互補的技術分離和鑑定，該等技術允許：藉由基質輔助雷射脫附遊離(MALDI)質譜術比較實驗質量與理論質量以精細表徵聚醣結構、藉由離子交換HPLC(GlycoSep C)判定唾液酸化(sialylation)程度、藉由正相HPLC(GlycoSep N)根據親水性標準(hydrophilicity criteria)分離及定量寡醣形式、及藉由高效毛細管電泳-雷射誘導螢光(HPCE-LIF)分離及定量寡醣。

本文中所使用之「低海藻糖(Low fucose)」或「低海藻糖含量(low fucose content)」係指抗體的海藻糖含量為約0%至15%。

本文中使用之「正常海藻糖(Normal fucose)」或「正常海藻糖含量(normal fucose content)」係指抗體的海藻糖含量約超過50%，通常約超過60%、70%、80%、或超過85%。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體可藉由細胞凋亡來誘導Treg、MDSC、及/或Breg之殺滅。評估細胞凋亡的方法係熟知的，且包括例如使用標準方法進行膜聯蛋白IV(annexin IV)染色。在本發明之方法中所使用之抗CD38抗體可在約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%的細胞中誘導細胞凋亡。

在一些實施例中，Teff或免疫抑制細胞存在於骨髓中或周邊血液中。

在一些實施例中，Teff或免疫抑制細胞存在於骨髓中。

在一些實施例中，Teff或免疫抑制細胞存在於周邊血液中。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體增加CD8⁺ T細胞對Treg之比率。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體增加CD8⁺中央記憶細胞對CD8⁺初始細胞之比率。CD8⁺中央記憶細胞可鑑定為CD45RO⁺/CD62L^+高細胞。CD8⁺初始細胞可鑑定為CD45RO-/CD62L⁺細胞。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體係非促效性抗體。

特異性結合CD38之非促效性抗體係指在結合至CD38之後，當相較於由同型對照抗體或僅有介質所誘導的增生時，不會誘導體外周邊血液單核細胞樣本之顯著增生的抗體。

在一些實施例中，特異性結合CD38之非促效性抗體以統計學不顯著的方式誘導周邊血液單核細胞(PBMC)之增生。PBMC增生可藉由自健康供體單離之PBMC並於200μl RPMI中在測試抗體存在或不存在之情況下以1×10⁵個細胞/孔於平底96孔盤中培育該等細胞來評估。於37℃培養4天後，可添加30μl ³H-胸苷(16.7μCi/ml)，且可繼續培育過夜。³H-胸苷併入可使用Packard Cobra加馬計數器(Packard Instruments,Meriden,DT,USA)，根據製造商之說明評估。數據可計算為從若干供體獲得之PBMC的平均cpm(±SEM)。介於在測試抗體存在或不存在之情況下所培育之樣本間的統計學顯著性或不顯著性係使用標準方法來計算。

可用於本發明之方法中的例示性抗CD38抗體係DARZALEX^TM(達拉單抗)。DARZALEX^TM(達拉單抗)包含分別顯示於SEQ ID NO：4及5的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)胺基酸序列、分別為SEQ ID NO：6、7、及8的重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、及HCDR3、及分別為SEQ ID NO：9、10、及11的輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2、及LCDR3，且係IgG1/κ亞型並描述於美國專利第7,829,693號中。DARZALEX^TM(達拉單抗)的重鏈胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：12，且輕鏈胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：13。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體與包含SEQ ID NO：4之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：5之輕鏈可變區(VL)的抗體競爭結合至CD38。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體至少結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區。

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2 SKRNIQFSCKNIYR

SEQ ID NO：3 EKVQTLEAWVIHGG

SEQ ID NO：4

SEQ ID NO：5

SEQ ID NO：6 SFAMS

SEQ ID NO：7 AISGSGGGTYYADSVKG

SEQ ID NO：8 DKILWFGEPVFDY

SEQ ID NO：9 RASQSVSSYLA

SEQ ID NO：10 DASNRAT

SEQ ID NO：11 QQRSNWPPTF

SEQ ID NO：12

SEQ ID NO：13

可使用熟知的體外方法來評估抗體與參考抗體(諸如具有SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL的DARZALEX^TM(達拉單抗))對CD38的競爭結合。在一例示性方法中，可將重組表現CD38的CHO細胞與未標記的參考抗體於4℃培養15分鐘，然後與過量的螢光標記測試抗體於4℃培養45分鐘。於PBS/BSA中清洗後，可藉由流動式細胞測量術(flow cytometry)使用標準方法來測量螢光。在另一例示性方法中，可將人類CD38的細胞外部分塗覆在ELISA盤的表面上。可將過量的未標記參考抗體加入約15分鐘，且隨後可加入經生物素化的測試抗體。在PBS/Tween中清洗後，可使用共軛辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)的鏈黴親和素(streptavidin)來偵測該測試生物素化抗體的結合並使用標準方法來偵測訊號。在該等競爭性測定(competition assay)中，顯而易見的是參考抗體可係標記的且該測試抗體可係未標記的。當參考抗體抑制測試抗體結合至CD38，或測試抗體抑制參考抗體結合至CD38達至少80%，例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%時，測試抗體與參考抗體競爭。該測試抗體的表位可進一步藉由例如胜肽圖譜技術(peptide mapping)或氫/氘保護測定使用已知方法來定義，或者藉由晶體結構判定來定義。

結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區的抗體可例如藉由下列產生：使用標準方法及本文中所述之方法利用具有顯示於SEQ ID NO：2及3中之胺基酸序列的胜肽免疫小鼠，且使用例如ELISA或突變誘發研究以定性用於結合至胜肽的所得抗體。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予抗CD38抗體，其結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區。本發明之方法中所使用之抗體的表位包括具有顯示於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之序列的殘基中的一些或全部。在一些實施例中，抗體表位包含人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區中至少一個胺基酸及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區中至少一個胺基酸。在一些實施例中，抗體表位包含人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區中至少兩個胺基酸及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區中至少兩個胺基酸。在一些實施例中，抗體表位包含人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區中至少三個胺基酸及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區中至少三個胺基酸。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體包含分別為SEQ ID NO：6、7、及8之HCDR1、HCDR2、及HCDR3胺基酸序列。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體包含分別為SEQ ID NO：9、10、及11之LCDR1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體包含分別為SEQ ID NO：6、7、8、9、10、及11之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體包含VH與VL，該VH係與SEQ ID NO：4具有95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性，且該VL係與SEQ ID NO：5具有95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體包含SEQ ID NO：12之重鏈及SEQ ID NO：13之輕鏈。

可用於本發明之任何實施例中的其他例示性抗CD38抗體係：mAb003，其包含分別為SEQ ID NO：14及15的VH及VL序列並描述於美國專利第7,829,693號中。mAb003的該VH及該VL可被表示為IgG1/κ。

SEQ ID NO：14

SEQ ID NO：15 mAb024，其包含分別為SEQ ID NO：16及17的VH及VL序列並描述於美國專利第7,829,693號中。mAb024的該VH及該VL可被表示為IgG1/κ。

SEQ ID NO：16

SEQ ID NO：17

MOR-202(MOR-03087)，其包含分別為SEQ ID NO：18及19的VH及VL序列並描述於美國專利第8,088,896號中。MOR-202的該VH及該VL可被表示為IgG1/κ。

SEQ ID NO：18

SEQ ID NO：19 伊沙妥昔單抗(Isatuximab)；其包含分別為SEQ ID NO：20及21的VH及VL序列並描述於美國專利第8,153,765號中。伊沙妥昔單抗之VH及VL可被表示為IgG1/κ。

SEQ ID NO 20：

SEQ ID NO：21：

可用於本發明之方法中的其他例示性抗CD38抗體包括描述於國際專利公開號WO05/103083、國際專利公開號WO06/125640、國際專利公開號WO07/042309、國際專利公開號WO08/047242、或國際專利公開號WO14/178820中者。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該固態腫瘤的時間，該抗體包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該固態腫瘤的時間，該抗體包含SEQ ID NO：14之VH及SEQ ID NO：15之VL。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該固態腫瘤的時間，該抗體包含SEQ ID NO：16之VH及SEQ ID NO：17之VL。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該固態腫瘤的時間，該抗體包含SEQ ID NO：18之VH及SEQ ID NO：19之VL。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該固態腫瘤的時間，該抗體包含SEQ ID NO：20之VH及SEQ ID NO：21之VL。

在一些實施例中，固態腫瘤係黑色素瘤。

在一些實施例中，固態腫瘤係肺癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係鱗狀非小細胞肺癌(NSCLC)。

在一些實施例中，固態腫瘤係非鱗狀NSCLC。

在一些實施例中，固態腫瘤係肺腺癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係腎細胞癌(RCC)(例如，腎臟透明細胞癌或腎臟乳突細胞癌)、或其轉移性病變。

在一些實施例中，固態腫瘤係間皮瘤。

在一些實施例中，固態腫瘤係鼻咽癌(NPC)。

在一些實施例中，固態腫瘤係結腸直腸癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係前列腺癌或去勢抗性前列腺癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係胃癌(stomach cancer)。

在一些實施例中，固態腫瘤係卵巢癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係胃癌(gastric cancer)。

在一些實施例中，固態腫瘤係肝癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係胰腺癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係甲狀腺癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係頭部及頸部鱗狀細胞癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係食道或胃腸道癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係乳癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係輸卵管癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係腦癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係尿道癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係泌尿生殖癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係子宮內膜異位。

在一些實施例中，固態腫瘤係子宮頸癌。

在一些實施例中，固態腫瘤係癌症之轉移性病變。

在一些實施例中，固態腫瘤缺乏可偵測的CD38表現。

當相較於對照，例如使用熟知方法以抗CD38抗體偵測的表現之於以同型對照抗體偵測的表現時，當固態腫瘤組織中或單離自固態腫瘤之細胞上的CD38表現係統計學不顯著的時候，固態腫瘤缺乏可偵測的CD38表現。

本發明之方法中所使用之抗CD38抗體亦可重新選自例如噬菌體呈現庫，其中噬菌體係經工程改造以表現人類免疫球蛋白或其部分，諸如Fab、單鏈抗體(scFv)、或未配對或配對抗體可變區(Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296：57-86；Krebs等人，(2001)J Immunol Meth 254：67-84；Vaughan等人，(1996)Nature Biotechnology 14：309-314；Sheets等人，(1998)PITAS(USA)95：6157-6162；Hoogenboom及Winter，(1991)J Mol Biol 227：381；Marks等人，(1991)J Mol Biol 222：581)。CD38結合可變域可自例如噬菌體呈現庫(表現抗體重鏈及輕鏈可變區)單離為具有噬菌體pIX外殼蛋白的融合蛋白，如描述於Shi等人，(2010)J Mol Biol 397：385-96及國際專利公開號WO09/085462中。抗體庫可用對於人類CD38細胞外域之結合進行篩選，所獲得之陽性殖株進一步表徵，自殖株溶解物(lysate)單離出Fab，且隨後選殖為全長抗體。此種用於單離人類抗體之噬菌體呈現法已於本領域中建立。參見例如：美國專利第5,223,409號、美國專利第5,403,484號、美國專利第5,571,698號、美國專利第5,427,908號、美國專利第5,580,717號、美國專利第5,969,108號、美國專利第6,172,197號、美國專利第5,885,793號、美國專利第6,521,404號、美國專利第6,544,731號、美國專利第6,555,313號、美國專利第6,582,915號、及美國專利第6,593,081號。

在一些實施例中，抗CD38抗體係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。

該抗體的Fc部份可媒介抗體的效應功能(effector function)，諸如抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、或補體依賴性細胞毒性(CDC)。該功能可藉由Fc效應域(effector domain)與具有吞噬或裂解活性的免疫細胞上Fc受體的結合來媒介，或藉由Fc效應域與補體系統成分的結合來媒介。通常，由與Fc結合的細胞或補體成分所媒介的效應會導致目標細胞(例如CD38表現細胞)的抑制或損耗(depletion)。人類IgG同型IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4在效應功能上顯示出差別能力。ADCC可由IgG1及IgG3媒介，ADCP可由IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4媒介，且CDC可由IgG1及IgG3媒介。

與包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL的抗體實質上同一的抗體可在本發明之方法中使用。本文中所使用之用語「實質上同一(substantially identical)」意指所比較的兩個抗體VH或VL胺基酸序列係同一或具有「無實質差異(insubstantial differences)」。無實質差異係在抗體重鏈或輕鏈中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個不會對抗體性能產生不利影響的胺基酸取代。同一性百分比可例如藉由使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen,Carlsbad,CA)之AlignX模組的預設設定進行成對比對來判定。本發明的蛋白質序列可被用作查詢序列(query sequence)來執行針對公開或專利數據庫的檢索以(例如)鑑定相關序列。用來執行該等檢索之例示性程式係XBLAST或BLASTP程式(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)，或使用預設設定的GenomeQuest^TM (GenomeQuest,Westborough,MA)套件。可對特異性結合CD38的抗體進行的例示性取代係例如以具有類似電荷、疏水性、或立體化學特性的胺基酸進行的保守型取代(conservative substitution)。亦可進行保守型取代以改良抗體性質(例如穩定性或親和力)，或改良抗體的效應功能。例如可對該抗CD38抗體的重鏈或輕鏈中進行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個胺基酸取代。此外，該VH或VL中的任何天然殘基亦可經丙胺酸取代，如先前已針對丙胺酸掃描式突變誘發(alanine scanning mutagenesis)所描述者(MacLennan等人，Acta Physiol Scand Suppl 643：55-67,1998；Sasaki等人，Adv Biophys 35：1-24,1998)。所欲之胺基酸取代可在此等取代係所欲時由所屬領域中具有通常知識者判定。胺基酸取代可例如藉由PCR突變誘發(美國專利第4,683,195號)來進行。變異體庫可使用熟知方法來產生，例如使用隨機(NNK)或非隨機密碼子(例如DVK密碼子)，其編碼11種胺基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)，然後篩選變異體庫以找出具有所欲性質之變異體。所產生的變異體可使用本文所述之方法體外測試其等與CD38的結合、其等誘導ADCC、ADCP、或細胞凋亡、或調節CD38酶活性的能力。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體可以一範圍之親和力(K_D)結合人類CD38。在根據本發明之一實施例中，以及在以下每一個編號實施例的一些實施例中，特異性結合CD38之抗體以高親和力結合至CD38，例如K_D等於或小於約10^-7M，諸如但不限於，1至9.9(或其中任何範圍或值，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、或9)x 10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、10^-13M、10^-14M、10^-15M、或其中任何範圍或值，如藉由表面電漿共振或Kinexa方法所判定，如所屬技術領域中具有通常知識者所實踐。一例示性親和力係等於或小於1×10^-8M。另一例示性親和力係等於或小於1×10^-9M。

在一些實施例中，特異性結合CD38之抗體係雙特異性抗體。現有的抗CD38抗體之VL及/或VH區或如本文所述重新鑑定之VL及VH區可被工程改造至雙特異性全長抗體中。該等雙特異性抗體可藉由調節介於單特異性抗體重鏈間的CH3相互作用來製造以形成雙特異性抗體，其係使用諸如在以下文獻中所述之技術：美國專利第7,695,936號；國際專利公開號WO04/111233；美國專利公開號US2010/0015133；美國專利公開號US2007/0287170；國際專利公開號WO2008/119353；美國專利公開號US2009/0182127；美國專利公開號US2010/0286374；美國專利公開號US2011/0123532；國際專利公開號WO2011/131746；國際專利公開號WO2011/143545；或美國專利公開號US2012/0149876。可合併本發明之抗體之VL及/或VH區的另外雙特異性結構係例如雙可變域免疫球蛋白(國際專利公開號WO2009/134776)、或包括各種二聚化域以連接具有不同特異性的兩個抗體臂的結構，諸如白胺酸拉鍊(leucine zipper)或膠原蛋白二聚化域(國際專利公開號WO2012/022811、美國專利第5,932,448號；美國專利第6,833,441號)。

例如，雙特異性抗體可在無細胞環境中體外產生，此係藉由在兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入非對稱突變，且在還原條件中(以讓雙硫鍵異構化)以兩個親體單特異性同二聚體抗體形成該雙特異性異二聚體抗體，其係根據描述於國際專利公開號WO2011/131746中之方法。在該等方法中，第一單特異性雙價抗體(例如，抗CD38抗體)及第二單特異性雙價抗體係經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代；該等抗體係在足以讓絞鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復為非還原性(non-reducing)。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol,DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇及參(2-羧乙基)膦。例如，可使用在至少20℃之溫度且有至少25mM之2-MEA存在下或於至少0.5mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下(例如在7.0之pH下或在7.4之pH下)培養至少90分鐘。

可在該雙特異性抗體之第一重鏈中及在第二重鏈中使用的例示性CH3突變係K409R及/或F405L。

本發明之方法可用來治療屬於任何分類之動物病患。此等動物之實例包括哺乳動物，諸如人類、鼠、犬、貓、及農畜(farm animal)。

投予/醫藥組成物

特異性結合CD38之抗體可以本發明之方法以合適的醫藥組成物之形式提供，該等醫藥組成物包含特異性結合CD38之抗體及醫藥上可接受之載劑。該載劑可係與特異性結合CD38之抗體一起投予之稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。此等媒劑可為液體如水及油，包括來自石油、動物、蔬菜、或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、及類似者。例如，可使用0.4%鹽水及0.3%甘胺酸。這些溶液係無菌且一般不含顆粒物質。其等可藉由習知、熟知的滅菌技術(例如過濾)來滅菌。該等組成物可含有如用以接近生理條件所需之醫藥上可接受的輔助物質，諸如pH調整及緩衝劑、穩定劑、增稠劑、潤滑劑、及著色劑等。在此類醫藥配方中特異性結合CD38之抗體的濃度可有廣泛變化，即從以重量計小於約0.5%，常達以重量計至少約1%至多達以重量計15或20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%，並且將主要基於所需劑量、流體體積、黏度等，根據所選擇之特定投予模式來選擇。合適的媒劑及調配物(包含其他的人類蛋白質，例如人類血清白蛋白)，舉例而言，係被描述於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21^st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092中，請特別參見pp.958-989。

在本發明之方法中的特異性結合CD38的抗體之投予模式可係任何合適之路徑，諸如腸胃外投予，例如皮內、肌肉內、腹膜內(intraperitoneal)、靜脈內或皮下、肺臟、經黏膜(口腔、鼻腔、陰道內、直腸)、或技藝人士所瞭解以及在所屬技術領域中所熟知之其他手段。特異性結合CD38的抗體可使用已知方法瘤內投予至淋巴結引流部位，用以局部遞送至腫瘤中。

特異性結合CD38的抗體可藉由任何合適的路徑投予至病患，例如非經腸道(parentally)投予(其藉由靜脈(i.v.)輸液或推注注射(bolus injection))、肌內或皮下或腹膜內。i.v.輸液可在例如15、30、60、90、120、180、240分鐘內給予，或者在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小時內給予。

給予病患之劑量係足以減輕或至少部分遏止所要治療之疾病(「治療有效量」)並且有時可係0.005mg至約100mg/kg，例如約0.05mg至約30mg/kg或約5mg至約25mg/kg、或約4mg/kg、約8mg/kg、約16mg/kg、或約24mg/kg，或者例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10mg/kg，但可甚至更高，例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、或100mg/kg。

亦可給予固定單位劑量，例如50、100、200、500、或1000mg，或者劑量可基於病患之表面積，例如500、400、300、250、200、或100mg/m²。經常可投予介於1與8次間的劑量(例如1、2、3、4、5、6、7、或8次)，但亦可給予9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多次劑量。

本發明之方法中之特異性結合CD38之抗體的投予可在一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、兩週、三週、一個月、五週、六週、七週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、或更久之後重覆進行。重覆治療過程亦為可能者，如為慢性投予。重覆投予可在相同劑量或在不同劑量下。例如，本發明之方法中之特異性結合CD38之抗體可在8mg/kg或在16mg/kg下以每週間隔投予持續8週，接著在8mg/kg或在16mg/kg下每兩週投予持續另外16週，接著在8mg/kg或在16mg/kg下藉由靜脈輸液每四週投予。

特異性結合CD38之抗體可在本發明之方法中藉由維持療法投予，諸如(例如)一週一次，持續6個月或更長時間。

例如，本發明之方法中之特異性結合CD38的抗體可以約0.1至100mg/kg的量作為日劑量，諸如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90、或100mg/kg，每天提供、於開始治療後的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40天中之至少一天提供、或者可替代地，於開始治療後的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20週中之至少一週提供、或其任何組合，並使用每24、12、8、6、4、或2小時之單次或分次劑量、或其任何組合。

本發明之方法中之特異性結合CD38的抗體亦可預防性投予以減少發展癌症之風險、延緩癌症進展事件之開始發生、及/或當癌症處於緩解時減少復發之風險。這可能在已知存在有腫瘤但因其他生物因素而很難定位腫瘤的病患中特別有用。

本發明之方法中之特異性結合CD38之抗體可凍乾貯存，並在使用前於合適的載劑中重構。此技術已顯示對於習知蛋白質製劑為有效者並且可使用熟知之凍乾及重構技術。

本發明之方法中之特異性結合CD38之抗體可與第二治療劑組合投予。

在本發明之方法中，特異性結合CD38之抗體可與化學治療藥品或所屬技術領域中具有通常知識者已知的其他抗癌治療劑中之任何一或多者一起投予。化學治療劑係可用於治療癌症的化學化合物，且包括生長抑制劑或其他細胞毒性劑，並包括烷化劑、抗代謝藥、抗微管抑制劑、拓樸異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)、受體酪胺酸激酶抑制劑、血管生成抑制劑、及類似者。化學治療劑之實例包括：烷化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN®)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridine)，諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)、及烏瑞替派(uredopa)；乙烯亞胺(ethylenimine)及甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基密胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphaoramide)、及三羥甲基密胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustard)，諸如氮芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸雙氯乙基甲胺氧化物(mechlorethamine oxide hydrochloride)、黴法蘭(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲類(nitrosureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌黴素(actinomycin)、氨茴黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素(cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、更生黴素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達魯比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥，諸如胺甲喋呤(methotrexate)及5-FU；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如環胞苷(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄性激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；貝塔布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；亞胺醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹丹莫(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；胺甲酸酯；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；格塞圖辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派(thiotepa)；類紫杉醇或紫杉烷家族之成員，諸如紫杉醇(TAXOL®)、剋癌易(docetaxel,TAXOTERE®)、及其類似物；氮芥苯丁酸(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物，諸如順氯氨鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(vinblastine)；鉑；依妥普賽(etoposide,VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；邁杜蔥酮(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾安托(novantrone)；坦尼坡賽(teniposide)；道紅鏈絲菌素(daunomycin)；胺蝶呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)；受體酪胺酸激酶抑制劑及/或血管生成抑制劑，包括NEXAVAR®(索拉非尼(sorafenib))、SUTENT®(舒尼替尼(sunitinib))、VOTRIENT^TM(帕唑帕尼(pazopanib))、PALLADIA^TM(托西尼布(toceranib))、ZACTIMA^TM(凡德他尼(vandetanib))、RECENTIN®(西地尼布(cediranib))、瑞格非尼(regorafenib)(BAY 73-4506)、阿西替尼(axitinib)(AG013736)、來他替尼(lestaurtinib)(CEP-701)、TARCEVA®(厄洛替尼(erlotinib))、IRESSA^TM(吉非替尼(gefitinib))、Gilotrif^®(阿法替尼(afatinib))、TYKERB®(拉帕替尼(lapatinib))、來那替尼(neratinib)、及類似者、以及上述中任一者之醫藥上可接受之鹽、酸、或衍生物。此定義中亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤作用之抗激素劑，諸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、奧那司酮(onapristone)、及FARESTON®(托瑞米芬(toremifene))；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、及戈舍瑞林(goserelin)；及上述中任一者之醫藥上可接受之鹽、酸、或衍生物。如那些在Wiemann等人，1985，在Medical Oncology(Calabresi等人，eds.)中，Chapter 10,McMillan Publishing中所揭露的其他習知細胞毒性化合物亦可適用於本發明之方法。

可與本發明之方法中之特異性結合CD38之抗體組合使用的例示性藥劑包括酪胺酸激酶抑制劑及標靶抗癌療法，諸如IRESSA^TM(吉非替尼)及Tarceva^®(厄洛替尼)、以及HER2、HER3、HER4、或VEGF之其他拮抗劑。例示性HER2拮抗劑包括CP-724-714、HERCEPTIN^TM(曲妥珠單抗(trastuzumab))、OMNITARG^TM(帕妥珠單抗(pertuzumab))、TAK-165、TYKERB®(拉帕替尼)(EGFR及HER2抑制劑)、及GW-282974。例示性HER3拮抗劑包括抗Her3抗體(參見例如，美國專利公開號2004/0197332)。例示性HER4拮抗劑包括抗HER4 siRNA(參見例如，Maatta等人，Mol Biol Cell 17：67-79,2006)。例示性VEGF拮抗劑係Avastin^TM(貝伐單抗(bevacizumab))。

可與本發明之方法中之特異性結合CD38之抗體組合使用的例示性藥劑包括用於固態腫瘤之標準照護藥品、或免疫檢查點抑制劑。

本發明之方法中之第二治療劑可係免疫檢查點抑制劑。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗LAG3抗體、抗TIM3抗體、或抗CTLA-4抗體。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係拮抗性抗PD-1抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體、拮抗性抗LAG3抗體、或拮抗性抗TIM3抗體。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-L1抗體。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-L2抗體。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗LAG3抗體。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗TIM3抗體。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗CTLA-4抗體。

任何拮抗性抗PD-1抗體均可用於本發明之方法中。可使用之例示性抗PD-1抗體係OPVIDO®(尼沃魯單抗)及KEYTRUDA®(派立珠單抗)。OPVIDO®(尼沃魯單抗)係描述於例如美國專利第8,008,449號中(抗體5C4)且包含SEQ ID NO：24之VH及SEQ ID NO：25之VL。KEYTRUDA®(派立珠單抗)係描述於例如美國專利第8,354,509號中且包含SEQ ID NO：22之VH及SEQ ID NO：23之VL。尼沃魯單抗及派立珠單抗之胺基酸序列亦可透過CAS登錄取得。可使用之另外的PD-1抗體係描述於美國專利第7,332,582號、美國專利公開號2014/0044738、國際專利公開號WO2014/17966、及美國專利公開號2014/0356363中。

「拮抗劑(Antagonist)」係指當結合至細胞蛋白質時抑制至少一種該蛋白質之天然配位體所誘導之反應或活性的分子。一分子，當至少一種反應或活性受到的抑制比該至少一種反應或活性在不存在拮抗劑之情況下(例如，陰性對照)受到的抑制多至少約30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%時，或當相較於在不存在拮抗劑之情況下的抑制，抑制係統計學顯著的時，係拮抗劑。拮抗劑可係抗體、可溶性配位體、小分子、DNA、或RNA諸如siRNA。例如藉由PD-1結合至其受體PD-L1或PD-L2所誘導之典型反應或活性可係抗原特異性CD4⁺或CD8⁺細胞增生的減少或T細胞之干擾素-γ(IFN-γ)產生的減少，其導致抑制針對例如腫瘤的免疫反應。藉由TIM-3結合至其受體(諸如半乳糖凝集素-9)所誘導之典型反應或活性可係抗原特異性CD4⁺或CD8⁺細胞增生的減少、T細胞之IFN-γ產生的減少、或CD4⁺或CD8⁺細胞上之CD137表面表現的減少，其導致抑制針對例如腫瘤的免疫反應。因此，特異性結合PD-1的拮抗性PD-1抗體、拮抗性PD-L2、特異性結合TIM-3的拮抗性抗體藉由對於抑制劑途徑加以抑制來誘導免疫反應。

SEQ ID NO：22

SEQ ID NO：23

SEQ ID NO：24

SEQ ID NO：25

增強免疫反應的抗PD-L1抗體可用於本發明之方法中(例如拮抗性抗PD-L1抗體)。可使用之例示性抗PD-L1抗體係德瓦魯單抗(durvalumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、及艾維路單抗(avelumab)、以及描述於例如美國專利公開號2009/0055944、美國專利第美國專利第8,552,154號、美國專利第8,217,149號、及美國專利第8,779,108號中者。

德瓦魯單抗包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：27之VL。

阿替珠單抗包含SEQ ID NO：28之VH及SEQ ID NO：29之VL。

艾維路單抗包含SEQ ID NO：30之VH及SEQ ID NO：31之VL。

SEQ ID NO：26

SEQ ID NO：27

SEQ ID NO：28

SEQ ID NO：29

SEQ ID NO：30

SEQ ID NO：31

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-1抗體(其包含SEQ ID NO：24之VH及SEQ ID NO：25之VL)之組合達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-1抗體(其包含SEQ ID NO：22之VH及SEQ ID NO：23之VL)之組合達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-L1抗體(其包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：27之VL)之組合達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-L1抗體(其包含SEQ ID NO：28之VH及SEQ ID NO：29之VL)之組合達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-L1抗體(其包含SEQ ID NO：30之VH及SEQ ID NO：31之VL)之組合達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

本發明亦提供一種增強病患之免疫反應的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-1抗體(其包含SEQ ID NO：24之VH及SEQ ID NO：25之VL)之組合達一段足以增強免疫反應的時間。

本發明亦提供一種增強病患之免疫反應的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-1抗體(其包含SEQ ID NO：22之VH及SEQ ID NO：23之VL)之組合達一段足以增強免疫反應的時間。

本發明亦提供一種增強病患之免疫反應的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-L1抗體(其包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：27之VL)之組合達一段足以增強免疫反應的時間。

本發明亦提供一種增強病患之免疫反應的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-L1抗體(其包含SEQ ID NO：28之VH及SEQ ID NO：29之VL)之組合達一段足以增強免疫反應的時間。

本發明亦提供一種增強病患之免疫反應的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體 (其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-L1抗體(其包含SEQ ID NO：30之VH及SEQ ID NO：31之VL)之組合達一段足以增強免疫反應的時間。

本發明亦提供一種治療患有結腸直腸癌之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體與拮抗性抗PID-1抗體之組合達一段足以治療該結腸直腸癌的時間。

本發明亦提供一種治療患有結腸直腸癌之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體與拮抗性抗PD-L1抗體之組合達一段足以治療該結腸直腸癌的時間。

本發明亦提供一種治療患有結腸直腸癌之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體與拮抗性抗PD-L2抗體之組合達一段足以治療該結腸直腸癌的時間。

本發明亦提供一種治療患有肺癌之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體與拮抗性抗PD-1抗體之組合達一段足以治療該肺癌的時間。

本發明亦提供一種治療患有肺癌之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體與拮抗性抗PD-L1抗體之組合達一段足以治療該肺癌的時間。

本發明亦提供一種治療患有肺癌之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體與拮抗性抗PD-L2抗體之組合達一段足以治療該肺癌的時間。

本發明亦提供一種治療患有前列腺癌之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體與拮抗性抗PD-1抗體之組合達一段足以治療該前列腺癌的時間。

本發明亦提供一種治療患有前列腺癌之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體與拮抗性抗PD-L1抗體之組合達一段足以治療該前列腺癌的時間。

本發明亦提供一種治療患有前列腺癌之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體與拮抗性抗PD-L2抗體之組合達一段足以治療該前列腺癌的時間。

增強免疫反應的抗LAG-3抗體可用於本發明之方法中。可使用之例示性抗LAG-3抗體係描述於例如國際專利公開號WO2010/019570中者。

增強免疫反應的抗CTLA-4抗體可用於本發明之方法中。可使用之例示性抗CTLA-4抗體係伊匹單抗。

可用於本發明之方法中之抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗LAG3、抗TIM3、及抗CTLA-4抗體亦可使用本文中所述之方法重新產生。

在一些實施例中，可使用包含SEQ ID NO：32之VH及SEQ ID NO：33之VL的抗PD1抗體。

在一些實施例中，可使用包含SEQ ID NO：34之VH及SEQ ID NO：35之VL的抗PD1抗體。

在一些實施例中，可使用包含SEQ ID NO：36之VH及SEQ ID NO：37之VL的抗TIM-3抗體。

在一些實施例中，可使用包含SEQ ID NO：38之VH及SEQ ID NO：39之VL的抗TIM-3抗體。

SEQ ID NO：32

SEQ ID NO：33

SEQ ID NO：34

SEQ ID NO：35

SEQ ID NO：36

SEQ ID NO：37

SEQ ID NO：38

SEQ ID NO：39

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-1抗體(其包含SEQ ID NO：32之VH及SEQ ID NO：33之VL)之組合達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗PD-1抗體(其包含SEQ ID NO：34之VH及SEQ ID NO：35之VL)之組合達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗TIM-3抗體(其包含SEQ ID NO：36之VH及SEQ ID NO：37之VL)之組合達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體(其包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL)與抗TIM-3抗體(其包含SEQ ID NO：38之VH及SEQ ID NO：39之VL)之組合達一段足以治療該固態腫瘤的時間。

在本發明之方法中，特異性結合CD38之抗體與第二治療劑之組合可在任何習知時段內投予。例如，特異性結合CD38之抗體及第二治療劑可在同一天，且甚至以同一靜脈輸液投予至病患。然而，特異性結合CD38之抗體及第二治療劑亦可在交替的日子、或交替的週或月、等等投予。在一些方法中，特異性結合CD38之抗體及第二治療劑可在足夠接近的時間投予，使其等在可偵測的水平下同時存在(例如，在血清中)於經治療的病患中。在一些方法中，以特異性結合CD38之抗體(其在一段時間內由數個劑量組成)治療之整個過程係在以第二治療劑(其由數個劑量組成)治療之過程之前或之後。介於投予特異性結合CD38之抗體與第二治療劑之間可使用1、2、或若干天或週之恢復期。

特異性結合CD38之抗體或特異性結合CD38之抗體與第二治療劑之組合可與任何形式的放射療法(包括體外放射(external beam radiation)，強度調控放射療法(IMRT)、聚焦放射、及任何形式的放射手術(包括γ刀(Gamma Knife)、射波刀(Cyberknife)、直線加速器(Linac)、及間質放射(例如植入的放射性種粒、GliaSite氣球)))、及/或與手術一起施用。

可使用的聚焦放射法包括立體定位放射手術、分次立體定位放射手術、及強度調控放射療法(IMRT)。顯而易見的是，立體定位放射手術涉及精確地遞送輻射至腫瘤組織(例如腦腫瘤)，同時避開周圍的非腫瘤、正常組織。使用立體定位放射手術所施加的輻射劑量可能會變化，通常為1Gy至約30Gy，且可包含中間範圍，包括例如1至5、10、15、20、25、高至30Gy的劑量。因為非侵入性固定裝置的緣故，立體定位放射不需要在單次治療中被遞送。治療計劃可以日復一日確實地重複，藉此使多個分次輻射劑量得以被遞送。當用來在一段時間內治療腫瘤時，該放射手術被稱為「分次立體定位放射手術(fractionated stereotactic radiosurgery)」或FSR。相比之下，立體定位放射手術係指單次治療(one-session treatment)。分次立體定位放射手術可能導致高治療比率，即腫瘤細胞殺滅率高且對正常組織低影響。腫瘤及正常組織對高單次劑量輻射之於多次小劑量輻射的反應不同。單次大劑量輻射比起若干次小劑量輻射可能會殺滅更多的正常組織。因此，多次小劑量輻射可以殺滅更多的腫瘤細胞而不傷害正常組織。使用分次立體定位放射所施加的輻射劑量可能會在1Gy至約50Gy的範圍內變化，且可包含中間範圍，包括例如1至5、10、15、20、25、30、40、直到50Gy的低分次劑量。也可使用強度調控放射療法(IMRT)。IMRT係高精度三維順形放射療法(3DCRT)的進階模式，其使用電腦控制的直線加速器以遞送精確的輻射劑量至惡性腫瘤或腫瘤內的特定範圍。在3DCRT中，使用多葉式準直儀(MLC)將每個輻射束的輪廓成形為適合目標的輪廓(來自射束透視(beam's eye view, BEV)觀點)，藉此產生若干光束。IMRT以多個小量來調節該輻射束的強度，使輻射劑量得以更精確地符合腫瘤的三維(3-D)形狀。因此，IMRT使更高的輻射劑量能集中到腫瘤內的區域，同時盡量減少對周圍正常關鍵結構的劑量。IMRT提高了使治療量符合凹腫瘤形狀的能力，例如，當腫瘤係纏繞在諸如脊髓或主要器官或血管的脆弱結構上。

包含特異性結合CD38之抗體及玻尿酸酶的醫藥組成物之皮下投予

特異性結合CD38之抗體可以醫藥組成物之形式皮下投予，該醫藥組成物包含特異性結合CD38之抗體及玻尿酸酶。

特異性結合CD38之抗體在皮下投予之醫藥組成物中的濃度可係約20mg/ml。

皮下投予之醫藥組成物可包含介於約1,200mg至1,800mg之間的特異性結合CD38之抗體。

皮下投予之醫藥組成物可包含約1,200mg的特異性結合CD38之抗體。

皮下投予之醫藥組成物可包含約1,600mg的特異性結合CD38之抗體。

皮下投予之醫藥組成物可包含約1,800mg的特異性結合CD38之抗體。

皮下投予之醫藥組成物可包含介於約30,000U至45,000U之間的玻尿酸酶。

皮下投予之醫藥組成物可包含約1,200mg的特異性結合CD38之抗體及約30,000U的玻尿酸酶。

皮下投予之醫藥組成物可包含約1,800mg的特異性結合CD38之抗體及約45,000U的玻尿酸酶。

皮下投予之醫藥組成物可包含約1,600mg的特異性結合CD38之抗體及約30,000U的玻尿酸酶。

皮下投予之醫藥組成物可包含約1,600mg的特異性結合CD38之抗體及約45,000U的玻尿酸酶。

皮下投予之醫藥組成物可包含玻尿酸酶rHuPH20，其具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列。

rHuPH20係重組玻尿酸酶(HYLENEX®重組體)，且描述於國際專利公開號WO2004/078140中。

玻尿酸酶係降解玻尿酸(EC 3.2.1.35)的酶，並減低在細胞外基質中玻尿酸之黏度，從而增加組織滲透性。

SEQ ID NO：40

包含特異性結合CD38之抗體及玻尿酸酶的醫藥組成物之投予可在一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、兩週、三週、四週、五週、六週、七週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、或更久之後重覆進行。重覆治療過程亦為可能者，如為慢性投予。重覆投予可在相同劑量或在不同劑量下。例如，包含特異性結合CD38之抗體及玻尿酸酶之醫藥組成物可每週投予一次持續八週，接著兩週投予一次持續16週，接著四週投予一次。待投予之醫藥組成物可包含約1,200mg的特異性結合CD38之抗體及約30,000U的玻尿酸酶，其中特異性結合CD38之抗體在醫藥組成物中之濃度係約20mg/ml。待投予之醫藥組成物可包含約1,800mg的特異性結合CD38 之抗體及約45,000U的玻尿酸酶。待投予之醫藥組成物可包含約1,600mg的特異性結合CD38之抗體及約30,000U的玻尿酸酶。待投予之醫藥組成物可包含約1,600mg的特異性結合CD38之抗體及約45,000U的玻尿酸酶。

包含特異性結合CD38之抗體及玻尿酸酶之醫藥組成物可皮下投予至腹部區域。

包含特異性結合CD38之抗體及玻尿酸酶之醫藥組成物可以約80ml、90ml、100ml、110ml、或120ml之總體積投予。

投予時，可將20mg/ml的特異性結合CD38之抗體(於25mM乙酸鈉、60mM氯化鈉、140mM D-甘露醇、0.04%聚山梨醇酯20，pH 5.5)與rHuPH20(1.0mg/mL(75-150kU/mL)，於10mM L-組胺酸、130mM NaCl、10mM L-甲硫胺酸、0.02%聚山梨醇酯80，pH 6.5)混合，之後將該混合物投予至對象。

雖然已用一般術語描述了本發明，本發明之實施例將進一步揭露於下列實例中，但其不應被解釋為限制權利要求的範圍。

實例1。一般材料及方法 樣本收集及處理

緊接在第一輸液之前的基期及在治療期間內指明的時間點，將周邊血液及骨髓抽出物收集於肝素化管(heparinized tube)中。大部分樣本係當其等到達中央實驗室時，在收集後24至48小時，使用即時流動式細胞測量術評估。周邊血液單核細胞(PBMC)係獲自全血，藉由密度梯度離心來單離，且冷凍儲存直至分析。針對T細胞活化、純系性、及CD38⁺ Treg抑制測定，使用冷凍PBMC樣本，同時對治療前及治療後之樣本進行分析。

在BARC全球中心實驗室(BARC global central laboratory)，對這些樣本進行流動式細胞測量分析，使用預先驗證的免疫分型測定來評估NK細胞、T細胞、B細胞、骨髓瘤細胞(CD138⁺)、及CD38表現。簡言之，將血液樣本及骨髓樣本利用下列多螢光染料抗體組染色：細胞譜系組：PerCPCy5.5α-CD19(純系 HIB19；Becton Dickinson[BD])、APCα-CD24(SN3；eBioscience)、PC7α-CD3(UCHT-1；Beckman Coulter)、V500α-CD16(3G8；BD)、及PEα-CD56(MY；BD)；調節T細胞(T_reg)組：APCα-CD25(2A3；BD)、PEα-CD127(HIL-7R-M21；BD)、APC-H7α-HLA-DR(G46-6；BD)、及PerCPα-CD4(L200；BD)；初始(naive)/記憶T細胞組：APC-H7α-CD4(RPA-T4；BD)、PerCP-Cy5.5α-CD8(RPA-T4 BD)、PEα-CD62L(SK11；BD)、及APCα-CD45RA(HI100；BD)。CD38表現係使用Alexa 647標記之抗體mAb 003評估，其描述於美國專利第7,829,693號中，具有SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之VH及VL序列。血液樣本係使用不同的裂解-清洗方法製備。利用各種抗體對骨髓抽出物樣本進行膜或細胞內染色。Becton Dickinson FACS裂解溶液用於裂解周邊血液樣本中之紅血球，且來自Invitrogen之Fix與Perm細胞滲透試劑用於骨髓抽出物樣本之細胞內染色。染色樣本係在FACS Canto II流動式細胞測量儀上獲得，且數據係使用FacsDiva軟體分析。在所測試之所有時間點判定免疫細胞群在血液樣本中的絕對計數及淋巴球在骨髓樣本中之百分比。

T細胞受體(TCR)定序

T細胞多樣性係藉由使用PBMC樣本之基因體DNA進行TCR重排之深度定序(deep sequencing)以評估CD8⁺ T細胞純系性來分析。TCR定序係使用Adaptive Biotechnologies市售的Immunoseq^TM測定進行，且分析係使用預審的多重聚合酶連鎖反應(PCR)測定(TR2015CRO-V-019)進行，其等係由正向引子及反向引子所構成，該等正向引子及反向引子直接靶向可變(V)基因(正向引子)及連接(J)基因(反向引子)之家族。各V及J基因引子係作為引導對(priming pair)以放大體細胞重組TCR，且各引子含有特定的通用DNA序列。在最初的PCR放大之後，將各放大物用正向引子及反向引子放大第二次，該等正向引子及反向引子含有通用序列及Illumina的DNA定序所需的轉接序列(adaptor sequence)。

T細胞對病毒抗原及同種異體抗原的反應

將病患PBMC接種於96孔盤上(2×10⁵個細胞/孔)，且用下列刺激5天：23種主要組織相容性基因複合體(MHC)I類限制性病毒胜肽之混合物(cocktail)，其係來自人類巨細胞病毒(CMV)、艾司坦-巴爾病毒(EBV)、及流感病毒(2μg/ml；CEF胜肽池；PANATecs^®)；或相等數目的來自健康供體的25-Gy照射之同種異體PBMC。未經刺激之PBMC及經抗CD3/CD28塗覆珠粒刺激之PBMC分別充當陰性對照及陽性對照。在第5天，藉由三明治酶聯免疫吸附測定(ELISA；人類IFN γ ELISA Ready-SET-Go；eBioscience)測量無細胞上清液之干擾素γ(IFN-γ)，且其充當T細胞活化之替代標誌。

調節T細胞(Treg)對效應細胞功能的抑制：羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)稀釋測定

將健康供體之PBMC用PerCP-Cy5.5α-CD3(SK7；BD)、KOα-CD45,(J33；Beckman Coulter)、V450α-CD4(SK3；BD)、PEα-CD25(M-A251,BD)、PE Cy7α-CD127(HIL-7R-M21；BD)、及APCα-CD38(HB-7；BD)標記並藉由FACS Aria(BD)分選。將經分選之效應細胞用羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE；eBioscience)標記，並用抗CD3/CD28塗覆珠粒在CD38⁺Treg或CD38^- Treg(Treg對效應細胞之比率係1：1)存在或不存在的情況下，於RPMI加10%胎牛血清中刺激。72小時後，進行流動式細胞測量術，且將CFSE之稀釋百分比用作T細胞增生之替代。

骨髓衍生抑制細胞(MDSC)表型及DARZALEX ^TM (達拉單抗)媒介之ADCC

將三個正常健康供體之PBMC與骨髓瘤細胞系(RPMI8226,U266,H929)共培育六天，並評估顆粒球性MDSC(G-MDSC)之產生(CD11b⁺CD14^-HLA^-DR^-CD15⁺CD33⁺)，如Gorgun等人，Blood 121：2975-87,2013中所述。G-MDSC不存在於正常健康 PBMC中，然而在與所有三個骨髓瘤細胞系共培育之後，G-MDSC以總PBMC群之5至25%存在(數據未顯示)。針對G-MDSC之流動式細胞測量評估的圈選(gating)策略包括以CD11b⁺作為第一圈選，接著進行CD14^-及HLA^-DR^-圈選，然後接著進行CD15⁺及CD33⁺圈選。G-MDSC經細胞分選且評估CD38表現水平及對DARZALEX^TM(達拉單抗)媒介之ADCC的敏感度。為了評估DARZALEX^TM(達拉單抗)對MDSC之ADCC/CDC的效應，將含有補體或同型對照之血清加至ADCC測定中。

初始及記憶T細胞分析

自病患獲得肝素化周邊血液樣本，之後各自輸液DARZALEX^TM(達拉單抗)。將周邊血液單核細胞(PBMC)藉由Ficoll-Hypaque密度梯度離心來單離，並儲存在液態氮中之冷凍保存(cryopreservation)培養基(添加10%人類血清及10%二甲亞碸之RPMI)。針對FACS分析，將PBMC解凍，且將2×10⁶個細胞/組再懸浮於具有0.05%疊氮化物及0.1% HAS之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。

數據分析

所有數據分析及關聯圖表之產生僅使用R軟體進行(R：A Language and Environment for Statistical Computing,R Development Core Team,R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria,2011,ISBN 3-900051-07-0 http_//_www_R-project_org/)。所有具有可評估反應的經治療之對象均包括在數據分析中。通篇一致地，反應者定義為按照IRC具有sCR、VGPR、及PR之最佳反應的對象，且無反應者定義為按照IRC具有MR、SD、及PD之最佳反應的對象。

不同的統計學比較包括：(i)反應者與無反應者之間的基期水平，(ii)反應者及無反應者的基期之於治療中，(iii)反應者與無反應者之間的變化百分比，(iv)基期之於治療中的比率變化。各比較首先包括利用夏皮羅-威爾克(Shapiro-Wilk)檢定之常態性檢定(Royston (1995)Remark AS R94：A remark on Algorithm AS 181：The W test for normality.Applied Statistics,44,547-551)。發現到，幾乎所有數據都不具有常態分佈。差異水平檢定包括進行非參數威爾卡森等級和檢定(Wilcox rank sum test)(Hollander及Wolfe(1973)，Nonparametric Statistical Methods.New York：John Wiley & Sons.Pages 27-33(單樣本)，68-75(雙樣本))及在博克斯-卡克斯(Box Cox)轉換之後的t檢定(Weisberg,S.(2014)Applied Linear Regression,Fourth Edition,Wiley Wiley,Chapter 7)。針對博克斯-卡克斯轉換，將小數(1e-07)加至等於0的值。在所有情況下，兩個檢定一致。除非另外指示，否則威爾卡森等級和檢定p-值係顯示於本說明書通篇的表中。當測試反應者及無反應者之基期之於治療中的差異時，每個對象進行雙組配對測試，在所有其他情況下，進行雙組非配對測試。

因為針對不同的給藥排程，分析各種淋巴球群之樣本不是在同一時間點取得的，所以進行族群模型化。模型擬合係對訪視之等級進行。對總體及活化NK細胞的族群模型化涉及擬合折棒模型(broken stick model)(Lutz等人，「Statistical model to estimate a threshold dose and its confidence limits for the analysis of sublinear dose-response relationships,exemplified for mutagenicity data.」Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 678.2(2009)：118-122.)。將具有隨機截距及斜率之線性混合效應模型對B細胞、T細胞亞群、及白血球、單核球、嗜中性球、及淋巴球病患族群之數據進行擬合(Bates等人，(2014)。「lme4：Linear mixed-effects models using Eigen and S4.」ArXiv e-print；提交至Journal of Statistical Software,http：_//_arxiv_org/abs/_1406.5823)。此線性混合模型化係對治療開始後的相對日子進行(ADY)。此線性混合模型擬合係對經對數轉換的反應變數進行。在反應變數值等於0之情況下，將0.1加至所有反應變數值以允許在對數尺度下的模型化。

實例2.研究54767414MMY2002設計(SIRIUS)

研究54767414MMY2002(SIRIUS)之目標族群係患有晚期多發性骨髓瘤之病患，其等之前接受過至少3種療法，包括蛋白酶體抑制劑(PI)及免疫調節藥品(IMiD)，或其等對於PI及IMiD而言係雙重難治。主要終點/最終分析之反應評估係基於獨立評審委員會(independent review committee,IRC)及電腦化演算法之評估，其使用2011 IMWG準則(臨床研究報告：一項開放標籤、多中心、第2期試驗，其探究在患有多發性骨髓瘤之對象中DARZALEXTM(達拉單抗)的功效及安全性，該等對象之前已接受至少3種療法(包括蛋白酶體抑制劑及IMiD)或該等對象對於蛋白酶體抑制劑及IMiD而言係雙重難治(EDMS-ERI-92399922；de Weers等人，(2011)J Immunol 186(3)：1840-1848))。

這些評估包括：總體反應率(ORR)、反應持續時間、反應時間及最佳反應、臨床受益率、進展時間(TTP)、無進展存活期(PFS)、及總體存活期(OS)。

此研究中，總計124個對象經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療(de Weers等人，(2011)J Immunol 186(3)：1840-1848)。18個對象係以8mg/kg治療，且106個對象係以16mg/kg治療。給藥排程係如下：A組：DARZALEX^TM(達拉單抗)16mg/kg：週期1及週期2：第1、8、15、及22天(每週)，週期3至週期6：第1及15天(每隔一週)，週期7+：第1天(每4週)。各週期係4週。

B組：DARZALEX^TM(達拉單抗)8mg/kg：週期1+：第1天(每4週)。

研究之主要目標係判定DARZALEX^TM(達拉單抗)之2個治療方案的功效，如藉由ORR(CR+PR)所測量，在患有多發性骨髓瘤的對象中，該等對象之前已接受至少3種療法，包括PI及IMiD，或該等對象之疾病對於PI及IMiD而言係雙重難治(臨床研究報告：一項開放標籤、多中心、第2期試驗，其探究在患有多發性骨髓瘤之對象中DARZALEX^TM(達拉單抗)的功效及安全性，該等對象之前已接受至少3種療法(包括蛋白酶體抑制劑及IMiD)或該等對象對於蛋白酶體抑制劑及IMiD而言係雙重難治。EDMS-ERI-92399922)。

此研究之次級目標包括評估DARZALEX^TM(達拉單抗)之安全性及耐受性、展示功效之額外量度(例如，臨床受益、TTP、PFS、及OS)連同評估藥物動力學、免疫原性、藥效動力學、以及探究預示對DARZALEX^TM(達拉單抗)之反應的生物標誌。額外研究相關的資訊可得自臨床研究規程(臨床研究報告：一項開放標籤、多中心、第2期試驗，其探究在患有多發性骨髓瘤之對象中DARZALEX^TM(達拉單抗)的功效及安全性，該等對象之前已接受至少3種療法(包括蛋白酶體抑制劑及IMiD)或該等對象對於蛋白酶體抑制劑及IMiD而言係雙重難治。EDMS-ERI-92399922)。

在第1部分之第1階段中，8mg/kg組中1個對象(6%)有反應，且在16mg/kg組中5個對象(31%)有反應。因此，在第1部分之第2階段及第2部分中，僅16mg/kg組擴增。

在16mg/kg組中，基於IRC評估，31個對象達成PR或更好的反應；ORR係29%(95% CI：21%,39%)。三個對象(3%)達成sCR，且13個對象(12%)達成VGPR或更好。

實例3.DARZALEX ^TM (達拉單抗)在登記54767414MMY2002研究(SIRIUS)之病患中對T細胞擴增及活性之效應

CD38表現在多種免疫細胞及造血細胞上。藉由流動式細胞測量術進行廣泛的免疫剖析，以檢驗DARZALEX^TM(達拉單抗)對免疫細胞子集的效應及這些細胞的基期水平與臨床反應的關聯。在基期及DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之後藉由流動式細胞測量術評估周邊血液及骨髓抽出物中之各種細胞群，包括T細胞(CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、及調節T細胞(Treg))、B細胞(CD19⁺)、NK細胞、單核球(CD14⁺)、白血球、及嗜中性球，以監測反應者及無反應者中這些細胞群之變化。

淋巴球、白血球、單核球、及嗜中性球

研究反應者及無反應者中周邊血液中之白血球、淋巴球、單核球、及嗜中性球計數。在以8mg/kg及16mg/kg劑量之病患中均發現總淋巴球隨著DARZALEX^TM(達拉單抗)治療而增加(圖1)。線性混合效應模型化揭示每100天在對數尺度下增加0.8×10⁶個細胞/μL(CI=0.06,0.11)。發現單核球及白血球之略微增加，其係於各100天在對數尺度下分別顯著增加0.03×10⁶個細胞/μL(CI=0.01,0.04)及0.03×10⁶個細胞/μL(CI=0.01,0.05)。儘管注意到在一些病患中嗜中性球減少，但是嗜中性球計數中位數與基期一致，且變化不顯著。

比較反應組之間這些細胞群之各者的基期水平。使用威爾卡森符號等級檢定(Wilcoxon signed-rank test)並未發現跨反應組的這些細胞類型之任一者的基期水平不同的證據(表1)。

NK細胞

總NK細胞(CD16⁺CD56⁺)及活化NK細胞(CD16⁺CD56^dim)在DARZALEXTM(達拉單抗)治療之情況下隨著時間推移而減少(數據未顯示)。

B細胞

在反應者及無反應者中測量周邊血液或骨髓抽出物中之B細胞(CD45⁺CD3^-CD19⁺)在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間隨時間推移的絕對計數。B細胞在全血中略微增加，且在骨髓抽出物中維持不變。周邊血液中之B細胞的線性混合模型化揭示，在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之過程內於各100天在對數尺度下最小增加0.1×10⁶個細胞/μL[CI=0.04,0.16]。在達拉單抗治療期間骨髓抽出物中之B細胞(CD45⁺CD3^-CD19⁺/淋巴球)之百分比在反應者或無反應者中皆沒有變化(分別係p=0.1及0.4)。另外，在反應者與無反應者之間，沒有發現在基期之B細胞計數不同的證據(p=0.5)。

T細胞注意到淋巴球在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之情況下增加(圖1)，即使B細胞僅顯示最小增加(參見上文)。為了進一步調查，研究周邊血液及骨髓兩者中之各種T細胞群(CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T細胞、調節T細胞)。

在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之後，周邊血液中之CD3⁺、CD4⁺、及CD8⁺ T細胞增加(淋巴球之絕對計數/μl及百分比兩者)。圖2顯示隨時間推移每個病患的周邊血液中之CD3⁺ T細胞(CD45⁺CD3⁺)之絕對計數自基期的變化百分比。圖中之黑色線顯示所有病患之絕對計數中位數×10⁶個細胞/μL。圖中僅包括多於2次觀察的訪視。圖3顯示隨時間推移每個病患的周邊血液中之CD4⁺ T細胞(CD45⁺CD3⁺CD4⁺)之絕對計數自基期的變化%。圖中之黑色線顯示所有病患之中位數。圖中僅包括多於2次觀察的訪視。圖4顯示隨時間推移每個病患的周邊血液中之CD8⁺ T細胞(CD45⁺CD3⁺CD8⁺)之絕對計數自基期的變化%。圖中之黑色線顯示所有病患之中位數。圖中僅包括多於2次觀察的訪視。對周邊血液中之絕對計數的線性混合模型化揭示，平均來說，總T細胞(CD45⁺CD3⁺)在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之後係於各100天在對數尺度下增加0.13×10⁶個細胞/μl (CI=0.1,0.15)。發現CD8⁺ T細胞於各100天在對數尺度下顯著增加0.16×10⁶個細胞/μl(CI=0.13,0.19)。發現CD4⁺細胞於各100天在對數尺度下中等增加0.11×10⁶個細胞/μl(CI=0.09,0.13)。

對於T細胞亞群之各者，反應者顯示絕對計數自基期的最大變化百分比高於無反應者(CD3⁺ p=3.2993e-05；CD4⁺ p=3.486e-05；CD8⁺ p=2.7172e-05；調節T細胞p=0.002)。表2顯示威爾卡森符號等級檢定結果，用以比較反應者與無反應者之間周邊血液中之各T細胞亞群之絕對計數自基期的變化百分比。

類似地在骨髓中，發現反應者及無反應者之總T細胞(呈淋巴球之百分比的CD45⁺CD3⁺)及CD8⁺ T細胞(呈淋巴球之百分比的CD45⁺CD3⁺CD8⁺)在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間皆顯著地增加(CD3⁺反應者p=3.8147e-06，無反應者p=9.8225e-05；CD8⁺反應者p=3.8147e-06，無反應者p=0.0003)。骨髓中之CD4⁺ T細胞中位數在任一臨床反應組中皆沒有變化。表3顯示呈骨髓中淋巴球%之各種T細胞的威爾卡森符號等級檢定結果。圖5顯示在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間CD45⁺CD3⁺細胞隨時間推移的百分比(%)(反應者及無反應者均包括在圖表中)。圖6顯示在 DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間CD45⁺CD3⁺CD8⁺細胞隨時間推移的%(反應者及無反應者均包括在圖表中)。

儘管反應者及無反應者均展示周邊血液及骨髓中之T細胞增加，但是反應者具有最大的自基期的變化百分比。為了區別在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之前，是反應者還是無反應者具有不同水平的CD3⁺、CD4⁺、及CD8⁺ T細胞，比較周邊血液中各亞組之基期測量值。

根據威爾卡森符號等級檢定，在周邊血液中之基期的絕對T細胞計數(表4)或骨髓中之自總淋巴球的T細胞百分比中(表5)，反應者與無反應者之間不具有統計學顯著的差異。

T調節細胞

Treg細胞係鑑定為樣本中之CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim細胞群。評估經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患中周邊血液及骨髓中隨時間推移的CD8⁺ T細胞對Treg之比率。周邊血液及骨髓中之比率均增加。圖7A顯示每個時間點所有病患之周邊血液中CD8⁺/Treg及CD8^+/CD4⁺細胞比率之中位數值。圖7B顯示每個時間點所有病患之骨髓中CD8⁺/Treg及CD8⁺/CD4⁺ T細胞比率之中位數值。根據威爾卡森符號等級檢定，周邊血液中隨治療時間推移(表6)及骨髓(表7)中之CD8⁺Treg及CD8⁺/CD4⁺的絕對計數比率之變化係顯著的。

在SIRIUS及GEN501研究(實例6)之組合數據分析中，周邊血液中之CD8⁺/CD4⁺及CD8⁺/Treg細胞之比率中位數在第8週(CD8⁺/CD4⁺之p=5.1×10^-5，且CD8⁺/Treg之p=1.8×10^-7)及在第16週(CD8⁺/CD4⁺之p=0.00017，且CD8⁺/Treg之p=4.1×10^-7)係增加的。類似地，在骨髓中，CD8⁺/CD4⁺及CD8⁺/Treg細胞之比率中位數在治療中(第12+1週週期)相較於基期係增加的(CD8⁺/CD4⁺之p=0.00016，且CD8⁺/Treg之p=2.8×10^-7)。反應者與無反應者之間未觀察到顯著差異。

實例4.研究設計(GEN501)

研究GEN501(NCT00572488)評估雙重難治MM病患中作為單一療法的DARZALEX^TM(達拉單抗)。樣本單離、處理、及統計分析係如實例1及實例2中所述。該研究已描述於Lokhorst等人，N Eng J Med 373：1207-19,2005中。

簡言之，研究GEN501係DARZALEXTM(達拉單抗)在患有MM的對象中之首次應用於人類(first-in-human)的臨床研究。其係第1/2期劑量逐步升高的安全性研究，該研究分成2個部分。第1部分係開放標籤劑量逐步升高的研究；第2部分係開放標籤以多個分群的單臂研究，其係基於第1部分中所確立之劑量水平。

在第1部分中，評估DARZALEX^TM(達拉單抗)之10個劑量水平：0.005、0.05、0.10、0.50、1、2、4、8、16、及24mg/kg。兩個最低劑量分群各配給1(+3)個對象，且標準3(+3)個對象配給應用至剩餘8個劑量分群。第2部分係開放標籤單研究，其包括兩個劑量水平，8mg/kg及16mg/kg。第1部分包括32個對象，且第2部分包括72個對象。

實例5. DARZALEX ^TM (達拉單抗)治療誘導病患中之T細胞純系性

鑒於在MY2002研究中在周邊血液及骨髓中注意到的CD8⁺ T細胞之擴增，使用Immunoseq^TM測定進行T細胞受體(TCR)之高通量次世代定序，以判定擴增CD8⁺ T細胞是否在本質上係純系的，其係適應性免疫反應之指示。對登記GEN501研究之對象之總計17個病患樣本進行評估(反應者n=6，即，PR；無反應者n=11，即，MR、SD、PD)。

TCR定序揭示，DARZALEX^TM(達拉單抗)治療顯著地增加病患之純系性。圖8A顯示DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之前之於之後的T細胞純系性之間的相關性(p=0.0056)。圖8B顯示個體病患中之純系性之倍數變化。反應者係以星標出。此數據表明，在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之情況下所注意到的T細胞擴增可在本質上係純系的。

當相較於無反應者時，反應者在TCR貯庫中具有較大的總擴增(如藉由豐度變化所測量；CIA)。圖8C顯示個別病患之CIA%。A組：反應者，B組：無反應者。於反應者與無反應者之間觀察到統計學顯著的差異(p=0.037)。圖8D顯示反應者及無反應者中各擴增T細胞殖株之絕對豐度變化(CIA)之和。圖8E顯示各個別病患之最大CIA%。A組：反應者，B組：無反應者。於反應者與無反應者之間觀察到統計學顯著的差異(p=0.048)。圖8F顯示反應者(A組)及無反應者(B組)中之單個細胞殖株的最大CIA。

CIA係藉由使用費雪精確檢定(Fisher’s exact test)(DeWit等人J.Virol.2015)鑑定介於兩個樣本之間的純系豐度之顯著差異且對各擴增殖株之絕對豐度變化求和來獲得。

實例6.DARZALEX ^TM (達拉單抗)在登記GEN501研究之病患中的免疫調節效應

評估登記GEN501之反應者及無反應者中的各種T及B細胞群。

淋巴球

類似於SIRIUS(MMY2002)研究，在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間，周邊血液及骨髓中之淋巴球均增加。此增加係歸因於CD4⁺及CD8⁺細胞兩者的數目增加。

CD8 ⁺ 中央記憶細胞

在登記GEN 501研究之17個病患之子集中研究經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患中隨時間推移之CD8⁺ T細胞表型。使用標準規程，來自病患之CD8⁺細胞被鑑定為初始(CD45RO-/CD62L⁺)(T_N)細胞或中央記憶(T_CM)(CD45RO⁺/CD62L^+高)細胞。

圖9A顯示CD8⁺初始細胞之%(CD8⁺細胞之%)，且圖9B顯示CD8⁺中央記憶細胞之%。DARZALEX^TM(達拉單抗)治療顯著地降低初始CD8⁺ T細胞之量(第8週之p=1.82×10^-4)，且增加CD8⁺記憶T細胞之量(第8週之p=4.88×10^-2)。這表明，初始細胞毒性T細胞轉變成記憶T細胞，其可針對特定抗原被活化。白色方形指示至少達成最小反應(MR)之病患，且黑色方形指示疾病穩定或疾病進展之病患。對治療有反應的病患中，CD8⁺初始T細胞之顯著地較大的降低係明顯的(數據未顯示)。圖9C顯示，DARZALEX^TM(達拉單抗)治療增加HLA I類-限制性T細胞之百分比，該等細胞部分驅動病毒特異性及同種反應性T細胞反應。圖9D顯示，擴增效應記憶T細胞表現低水平的CD38。重要的是要注意，這些T細胞呈現正常且甚至增加的針對病毒胜肽及同種抗原的功能活性(參見實例8)。根據這些功能結果，我們推斷，在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間存在針對病毒及同種抗原的經歷抗原之T細胞的擴增、或活性改善。這些數據表明，不同於調節細胞子集，效應T細胞不需要CD38表現以適當地起作用並擴增。

CD38陽性調節T細胞

細胞毒性T細胞之穩健擴增及活性增加之觀察，連同指示若干免疫抑制性細胞子集表現CD38的最近文獻一起，促進檢驗DARZALEX^TM(達拉單抗)對調節細胞群調節T細胞(Treg)、骨髓衍生抑制細胞(MDSC)、及調節B細胞(Breg)的效應。

使用標準規程單離調節T細胞(Treg)(CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim)。使用流動式細胞測量術分析Treg之頻率。

在Treg活化之前，周邊Treg之亞群(10%+10%)表現高水平的CD38。圖10A，上圖顯示在基期時Treg在CD3⁺CD4⁺細胞群(P4細胞群)中之頻率。圖10A，下圖顯示表現高CD38之Treg之子集(P5細胞群)。這些CD38⁺ Treg對DARZALEX^TM(達拉單抗)治療高度敏感，且在DARZALEX^TM(達拉單抗)之第一劑量之後展現出顯著的且幾乎即時的衰退(病患n=17；第1週之於基期P=8.88×10^-16)。DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之後Treg之頻率顯示於圖10B，上圖(P4細胞群)中。圖10B，下圖顯示，在第一(1^st)DARZALEX^TM(達拉單抗)輸液之後，CD38^高Treg(P5細胞)係最顯著損耗的Treg群。這些CD38⁺ Treg在整個DARZALEX^TM(達拉單抗)治療中係維持損耗的(在第1、4、及8週之於基期分別係p=8.88×10^-16、1.11×10^-15、及1.50×10^-11)。圖10C顯示在基期、第1週、第4週、第8週、復發、及治療結束(EOT)6個月後的總CD3⁺細胞之CD38^高Treg之%。CD38^高Treg在該時間點恢復至基期。對治療有反應與沒有反應之病患之間的CD38⁺ Treg之變化係類似的，然而，顯示對DARZALEX^TM(達拉單抗)治療有反應的病患在第8週的CD8⁺ T細胞：Treg比率顯著地較高(P=0.00955；圖10D)。

為了評估CD38⁺ Treg之損耗與DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之可能的生物相關性，對自體CD3⁺ T細胞上的CD38⁺ Treg之於CD38^- Treg的抑制能力進行評估。在利用多個健康供體的樣本進行的一系列實驗中，CD38⁺ Treg對T細胞增生的抑制(觀察到9.9%細胞增生)比CD38^- Treg(觀察到53.2%細胞增生)或陰性對照(觀察到74.9%細胞增生)更穩健(圖10E)。

因為MDSC在冷凍PBMC樣本中不易偵測，所以CD38⁺顆粒球性MDSC(CD11b⁺CD14^-HLA-DR^-CD15⁺CD33⁺)係自PBMC體外產生，該等PBMC係從在基期的病患及已接受一次DARZALEX^TM(達拉單抗)輸液的病患而單離。圖11顯示經鑑定之MDSC之流動式細胞測量術分佈圖(圖11，上方分佈圖，加框的細胞群)。大約一半的MDSC表現CD38(圖11，中間圖表；圈起來的P7細胞群)。在經DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患中，CD38^高MDSC係幾乎耗盡的(圖11，下方圖表；圈起來的P7細胞群)。

在無反應者及對治療有至少最小休止(Minimal Repose)的病患中，CD38^高譜系非特異性MDSC在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之情況下隨著時間推移而損耗。圖12顯示，在治療1週、4 週、或8週時，在病患中CD38^高MDSC之百分比減少至接近0%。CD38^高譜系非特異性MDSC在治療結束後返回至基期。

具有在譜系非特異性MDSC內的最大CD38⁺群的病患展示對DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的最佳且最持久的反應。圖13顯示，具有最高百分比的CD38^高MDSC(如圖11中所示)且分類為具有PR或MR之病患的病患2、4、15、16、或17具有至少8個月的無進展存活期(Progression-Free Survival,PFS)。

CD38^高譜系非特異性MDSC亦對體外DARZALEX^TM(達拉單抗)誘導的ADCC敏感。使用來自兩個供體的CD38^高MDSC及道迪細胞作為對照目標細胞進行ADCC測定，其中效應細胞：目標細胞比率係50：1。圖14顯示來自一個供體的實驗之結果。DARZALEX^TM(達拉單抗)誘導MDSC細胞之裂解。

在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的病患(n=16)中測量CD38⁺ Breg，且類似於CD38⁺ Treg，CD38⁺ Breg在DARZALEX^TM(達拉單抗)之第一劑量之後係損耗的(第1週與基期比較，p=0.0018；成對威爾卡森等級檢定)且當病患在治療中時持續係低的(圖15A)。當刺激時，FACS分選之Breg產生IL-10(圖15B)。

總而言之，這些觀察表明，免疫抑制性CD38⁺ MDSC、Breg、及Treg之損耗係DARZALEX^TM(達拉單抗)誘導的T細胞群及純系性之變化的顯著促成機制。

實例7. CD38 ⁺ MDSC細胞存在於癌症病患中

使用流動式細胞測量術研究患有NSCLC或前列腺癌之病患之周邊血液中MDSC(Lin^-CD14^-HLADR^低/-)及其等CD38表現之百分比。

在來自NSCLC及前列腺癌病患之分析樣本中，MDSC之百分比分別係PBMC之介於約10%至37%之間及介於約10%至27%之間。CD38表現在NSCLC病患之PBMC之80至100%的Lin^- CD14⁺HLADR^-/低MDSC中、且在前列腺癌病患的PBMC之70至100%的MDSC中經鑑定。

實例8. DARZALEX ^TM (達拉單抗)增強抗病毒T細胞反應

為了進一步評估DARZALEX^TM(達拉單抗)對T細胞活化及功能性的效應，在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療的具有一定範圍臨床結果之病患(n=7)中，測量反應於病毒及同種抗原中之周邊T細胞的IFN-γ產生。具有PR或更佳反應的病患在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之後，相較於基期展示出反應於病毒及同種抗原的IFN-γ分泌之顯著增加，至少在治療期間的一個時間點係如此，其表明T細胞功能不受低CD38表現而受損(參見實例6，圖9C)。類似於TCR純系性數據，此增加在對DARZALEX^TM(達拉單抗)有反應的病患中，比在那些沒有反應的病患中更加明顯。圖16A顯示具有VGPR的一個代表性病患之抗病毒反應。圖16B顯示具有CR的一個代表性病患之抗病毒反應。圖16C顯示具有PD的一個代表性病患之抗病毒反應。圖16D顯示具有MR的一個代表性病患之抗病毒反應。在圖式中，誤差條代表雙份培育物之平均值之標準誤差。星號標示介於所指比較之間統計學顯著的變化。顯示按照獨立評審委員會標準的最佳反應。與這些結果一致，具有VGPR(圖16E)或CR(圖16F)之病患中之病毒反應性T細胞展示出在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療期間增生能力的增加。

實例9。表現CD38的免疫細胞亞型對DARZALEX ^TM (達拉單抗)的敏感度之機制

GEN501及SIRIUS研究之數據指示，在DARZALEX^TM(達拉單抗)療法下，有一些表現CD38的免疫細胞係損耗的(NK細胞、調節T細胞(Treg)、調節B細胞(Breg)、及骨髓衍生抑制細胞(MDSC))，然而其他表現CD38的免疫細胞之數目卻是增加的(細胞毒性T細胞及輔助T細胞)。

為了解決敏感度之機制，評估健康供體中及GEN501或SIRIUS研究中所登記之多發性骨髓瘤病患中之各種免疫細胞亞群中之CD38的表現水平。圖17A顯示健康供體之免疫細胞中CD38表現之分佈圖，且圖17B顯示多發性骨髓瘤病患之免疫細胞中CD38表現之分佈圖。在健康供體中，CD38表現在NK細胞上係最高，接著係單核球、B細胞、及T細胞。在多發性骨髓瘤病患中，CD38表現在漿細胞上最高，接著係B細胞之一子集、NK細胞、單核球、B細胞、及T細胞。圖17C顯示復發性及難治性骨髓瘤病患之NK細胞、Treg、Breg、B細胞、及T細胞之CD38的平均螢光強度(MFI)的比較，其展示在漿細胞之後，NK細胞表現最高水平的CD38，接著係調節T細胞(Treg)及調節B細胞(Breg)。

除了CD38表現，其他細胞表面蛋白諸如補體抑制蛋白(CIP；CD46,CD55,CD59)亦可能導致對DARZALEX^TM(達拉單抗)的敏感性或抗性。體外評估免疫細胞亞群中之CIP發現到，NK細胞表現非常低水平的CD59及CD55，而其他T細胞群及B細胞群則表現出遠高得多的水平。這也可能導致免疫細胞亞型之DARZALEX^TM(達拉單抗)敏感性之變異性(數據未顯示)。

討論

此研究透過減少CD38⁺免疫抑制性細胞群及伴隨之誘導輔助及細胞毒性T細胞擴增、反應於病毒胜肽的IFN-γ之產生、及TCR純系性之增加而描述先前未知的DARZALEX^TM(達拉單抗)之免疫調節效應，其指示出適應性免疫反應改善。

此研究展示出，MDSC及Breg表現CD38且易受DARZALEX^TM(達拉單抗)治療影響。這些細胞已知存在於腫瘤微環境中，且導致腫瘤生長、免疫逃避(immune evasion)、血管生成、轉移、及抑制性細胞介素之產生。除了這些CD38⁺抑制性細胞子集，亦鑑定出新穎的調節T細胞亞群(CD4⁺CD25⁺CD127^dim)，其亦表現高水平的CD38且展示優異的自體T細胞抑制性能力。這些細胞亦對DARZALEX^TM(達拉單抗)敏感，且在接受治療的病患中，這些細胞顯著地減少。由DARZALEX^TM(達拉單抗)媒介之該些CD38⁺免疫調節細胞的消除，可減少骨髓瘤微環境內的局部免疫抑制，且允許陽性免疫效應細胞擴增並導致抗瘤反應。

實際上，周邊血液中及骨髓內(即，腫瘤)皆觀察到包括了CD4⁺及CD8⁺的廣泛T細胞群之顯著增加。特定CD8⁺亞群經DARZALEX^TM(達拉單抗)療法改變，包括顯著地降低初始T細胞及伴隨的顯著增加之效應記憶CD8⁺ T細胞，其指示效應T細胞向經歷抗原之表型偏移，該表型保留了免疫記憶且可對腫瘤抗原具有反應性。CD8⁺：CD4⁺及CD8⁺：Treg之比率亦在治療之下顯著增加，其展示出陽性免疫調節物之於陰性免疫調節物的偏移。

為了評估擴增CD4⁺及CD8⁺ T細胞在本質上係純系的，檢驗病患子集中之T細胞貯庫。即使在具有SD之最佳反應的病患或有進展的病患中，T細胞純系性也在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之情況下顯著增加。因此，T細胞純系性增加不能簡單地歸因於腫瘤負荷的減少。然而，T細胞純系性的偏差在具有良好臨床反應的病患中較大，且與CD8⁺ T細胞增加相關，其表明在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之下所觀察到的T細胞擴增係抗原驅動的。這在該病患族群中係顯著的，該病患群體經大量預治療(中位數係5個先前療法數)且不預期能夠建立強烈的抗瘤免疫反應。除了TCR純系性增加，對DARZALEX^TM(達拉單抗)具有反應性的病患展示對先前存在的病毒及同種抗原的T細胞反應增加，其表明免疫系統從免疫抑制性狀態回復的救援。

利用DARZALEX^TM(達拉單抗)治療造成免疫抑制性MDSC以及調節T細胞及B細胞的減少。這些減少伴隨有CD4⁺ T輔助細胞及CD8⁺細胞毒性T細胞的擴增。如藉由IFN-γ產生所測量之T細胞純系性及功能性抗病毒反應亦在DARZALEX^TM(達拉單抗)治療之下增加。這些觀察指示，儘管CD38表現低但T細胞仍適當地繼續起作用，且表明T細胞反應增加可能係因為調節細胞之損耗。此外這些T細胞擴增、活性、及純系性變化，在對DARZALEX^TM(達拉單抗)有反應的病患中相較於在那些沒有反應的病患中，可能係更顯著的。從DARZALEX^TM(達拉單抗)療法復發與許多這些變化之逆轉相關聯。這表明透過免疫調節的DARZALEX^TM(達拉單抗)之額外、先前未表徵機制之作用，其可導致臨床反應及DARZALEX^TM(達拉單抗)之功效。

最近，促進抗瘤免疫反應(而非直接靶向癌症)的抗體已在一系列環境中展示功效。抑制CTLA-4及PD-1的抗體促進T細胞擴增且增強T細胞活化，其導致在患有晚期固態腫瘤及血液學惡性腫瘤(諸如霍奇金氏淋巴瘤)之病患中延長的存活期且延緩疾病復發。藉由增強抗癌免疫，這些免疫調節抗體可能不僅誘導臨床反應，且亦預防疾病復發。

實例10。在54767414MMY2002(SIRIUS)第2部分臨床研究中與單劑DARZALEX ^TM (達拉單抗)互換的多發性骨髓瘤對象之血清蛋白體分析 生物標誌樣本收集及處理

將周邊血液樣本收集於標準血清分離管(2.5mL至5mL)中，且將血清試樣等分冷凍運送SomaLogic,Inc(Boulder,CO)以用於多分析物血清蛋白剖析。

血清蛋白剖析係在SomaLogic處使用預先驗證的SOMAscan測定進行，該SOMAscan測定藉由使用以SOMAmer親和力為基礎之分子測量1129種蛋白質分析物。SOMAmer試劑係以單鏈DNA為基礎之蛋白質親和力試劑。該測定使用少量的輸入樣本(150μL血漿)且將蛋白質訊號轉變成SOMAmer訊號，該SOMAmer訊號係藉由客製化DNA微陣列定量。

各SOMAmer含有4個功能部分：

1. 一個獨特蛋白質識別序列

2. 用於捕捉的生物素

3. 光可裂解連接子

4. 用於偵測之螢光分子

該獨特蛋白質識別序列使用DNA且併入模擬胺基酸側鏈的化學修飾核苷酸，其擴增標準適體之多樣性且增強蛋白質-核酸相互作用的特異性及親和力(Gold等人，PLoS One 5：e15004,2010)。適體係藉由SELEX來選擇。SOMAmer試劑係使用呈現原始構形的蛋白質來選擇。因為此類SOMAmer試劑需要完整的三級蛋白質結構來結合。未折疊或變性的推測上非活性蛋白質不為SOMAmer試劑所偵測。

針對樣本類型及稀釋，將SOMAmer試劑之主要混合物分組。在樣本培養之前，將試劑預結合至鏈黴親和素珠粒。蛋白質在平衡期間將樣本中之結合至同源SOMAmer、清洗、用NHS-生物素培養、清洗、然後將珠粒暴露於UV光以裂解該光可裂解連接子。洗出液含有SOMAmer試劑，該等試劑結合至其等的生物素所標記之蛋白質。鏈黴親和素捕捉且後續清洗移除未結合的SOMAmer試劑。在最終洗提中，SOMAmer分子透過變性條件從其等之同源蛋白質釋放。將最終洗出液混成至客製化Agilent DNA微陣列，而SOMAmer分子之螢光團係藉由相對螢光單位(RFU)來定量。RFU與樣本中之蛋白質之量成比例。

在兩個主要批次中測試MMY2002研究之樣本。第一批次的180個樣本含有來自90個對象的成對第1週期第1天(C1D1，基期)及C3D1(第3週期第1天)之血清樣本。將180個樣本一起在3個分開的SomaScan盤上分析。第二批次樣本包括50個C1D1樣本，其包括來自第1批次的35個重複樣本。

數據分析 輸入數據集及定義

具有可評估反應的經治療之對象均包括在數據分析中。在報導全文中，反應者係定義為具有sCR、VGPR、及PR之總體最佳反應(按照IRC，針對MMY2002)的對象，疾病穩定(SD)對象係定義為具有最小反應(MR)或SD的對象，且無反應者係定義為具有疾病進展(PD)之總體最佳反應(按照IRC，針對MMY2002)的對象。

Somalogic數據預處理 批次校準

將第1批及第2批的MMY2002樣本於兩個不同版本的SOMAscan平臺上進行測試。兩個版本間的差異微小，且包括三個SOMAmer序列，該等序列於版本之間有所改變(CTSE：3594-6_1->3594-6_5,FCN1：3613-62_1->3613-62_5,BMPER：3654-27_1->3654-27_4)。該等均自分析移除。

根據SomaLogic之標準盤間校準工作流程，藉由透過計算主混合物(Master-mix)特定整體參考值對7個盤內對照校準物測量值之比率，來定義各SOMAmer之盤寬(plate-wide)校準比例因數，因此校準三個第1批次盤之測量值。將各SOMAmer試劑之盤特定(plate-specific)比例因數同等地應用於盤上的各樣本。

給定第1批次及第2批次之不同的SOMAscan平臺版本，藉由考慮跨批次的35個樣本之重複測量值的比率，利用SomaLogic之標準盤間校準工作流程之修改實施方案，進行系統性批次間變異性校正。針對各SOMAmer，計算35個重複樣本之每一者的第1批次校準後測量值除以第2批次校準前測量值之比率(ri,j)。將這35個比率之中位數用於定義第2批次樣本之修正SOMAmer特定校準比例因數。然後將這些校準比例因數同樣地實施於標準SOMAscan程序。

一旦計算出修正校準比例因數，就繪製分析之各批次的所有比例因數之分佈，以評估離群值之存在狀況。由於再現性不良，因此將9個具有極大或極小校準值(>0.25且<3)的SOMAmer從分析移除。

在MMY2002之批次校準及SOMAmer過濾完成之後，將log2轉換應用於MMY2002之所有蛋白質濃度值，以使數據更合乎常態分佈且改善參數統計檢定之表現。

混雜變數校正

藉由對定中心且成比例的數據集的主成份分析，進行數據集變異數之藉由元變數(meta-variables)所解釋的部分之估計(如人口統計、反應級別、及樣本時間點)及可能混雜因子之鑑定。將簡單的線性模型擬合以鑑定與感興趣的各變數顯著相關聯的最高等級PC。這些關聯之顯著性係使用渥得檢定(Wald test)來判定，且由該模型解釋的PC變異性之部分係藉由擬合之R2估計。針對MMY2002數據，部位ID被發現到與PC1相關，且解釋了數據集變異性之最大部分(7.37%，p-值=3.71×10-9)。為了減少樣本獲得部位相關效應在數據內的影響，利用ComBat28校正部位ID效應。

重複樣本合併

藉由計算各蛋白質之平均值而合併在MMY2002第1批次與第2批次之間重複的35個樣本之數據。

差異蛋白質濃度分析(Differential Protein Concentration Analysis)反應者之於無反應者

對於在DARZALEXTM(達拉單抗)反應者之於無反應者中於基期以及治療中之蛋白質濃度分佈的統計學比較係使用兩個互補的方法進行：(i)威爾卡森等級和檢定(Hollander及Wolfe，Ninparametirc Statistical Methods.New York：John Wiley & Sons.1973.27-33(一個樣本)，68-75(兩個樣本)，對各個別SOMAmer進行，及(ii)Limma分析(Ritchie,M.E.等人，Nucleic Acids Res.2015；20：43(7)：e47)，對所有SOMAmer同時進行。所有p-值係使用針對多假說校正之班傑明-哈克伯格(Benjamini-Hochberg；BH)方法而進行調整(Benjamini及Hochberg，(1995)J.R.Statist.Soc.B.57： 289-300；R：A Language and Environment for Statistical Computing,R Development Core Team,R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria.2011；ISBN 3-900051-07-0)。當調整的p-值<0.05時，拒絕無差異表現之歸零假說。

治療中之於基期

使用三個替代統計學方法來比較基期蛋白質水平之於治療中蛋白質水平：(i)雙向重複測量ANOVA6、(ii)威爾卡森符號等級檢定、及(iii)傅里德曼檢定(Friedman test)(Johnson等人，(2007)Biostatistics 8(1)：118-127)。所有p-值係經調整以控制FDR，該調整係使用針對多假說校正之BH方法(Benjamini及Hochberg，J.R.Statist.Soc.B.57：289-300,1995)。除了治療顯著性，雙向重複測量ANOVA(Chambers等人，Analysis of variance；designed experiments：Chapter 5.Statistical Models in S,Editors J.M Chambers and T.J Hastie.Wadsworth & Brookes/Cole.1992)亦應用於判定各SOMAmer是否發生顯著的時間點：反應級別相互作用。將修改的威爾卡森等級和檢定作為事後測試應用，以明確判定反應者及無反應者是否顯示不同的治療效應，其藉由計算每個對象之治療中蛋白質濃度值與基期蛋白質濃度值間的差異且進行威爾卡森等級和檢定。使用BH方法調整顯著性值，且當調整的p-值<0.05時，拒絕歸零假說。

分級系統訓練

將基期蛋白質水平MMY2002數據用於建立反應預測分級系統。巢套迴路分層的10折交叉驗證方法(10-fold cross-validation approach)重複30次，其使用4個不同的機器學習者：支持向量機(Support Vector Machine,SVM)、隨機森林(Random Forest,RF)、單純貝氏(Naïve Baye；NB)、及j48決策樹。針對各學習者，訓練程序以產生數據集之平衡的10個折開始(外迴路)。這些折之一者提供為測試分群，而剩餘的9個傳至內迴路作為訓練分群。在內迴路內，訓練分群被再次被分成平衡的10個折，其產生訓練內集及測試內集。對這些訓練內集之各者進行學習者訓練，且針對外迴路內之各分群重複此程序30次。各內迴路學習者在預測測試內集時之準確度係用於選擇特徵及最佳化模型參數。一旦各訓練分組之30次(30x)內循環完成，就對各對應的測試分群進行外迴路之表現(使用最佳化的參數及特徵)之評估。然後將整個外循環程序重複30次，針對數據集內之每一樣本產生30次反應預測。獲自此循環方法的AUC、靈敏度、及特異度統計學係最終模型(以完整原始數據集所訓練)對新測試案例之表現的近似值。

MMY2002研究之結果

進行各種比較，包括蛋白質表現中治療誘導的反應依賴性變化。在反應者中顯示隨時間推移表現減小的蛋白質中之一者係PD-L1；然而在無反應者中，PD-L1蛋白質表現隨時間推移而增加。PD-L1在T細胞上的接合引起T細胞功能減少及Treg發展增加。圖18顯示在第1週期及第3週期，反應者、無反應者、及疾病穩定的病患中PD-L1之蛋白質表現概況。

PD-L1與其受體PD-1的接合抑制了抗瘤反應，且驅使T細胞無反應性及耗盡。儘管不希望受任何特定理論束縛，但是在CD38治療之後，PD-L1之下調亦可能導致固態腫瘤之抗瘤免疫反應增強之改善。

<110> 楊森生技公司(Janssen Biotech,Inc.) 他哈坦阿馬迪(Ahmadi,Tahamtan) 丁南科卡司紐(Casneuf,Tineke) 漢克羅侯特(Lokhorst,Henk) 吐納牧提絲(Mutis,Tuna) 愛咪沙奢(Sasser,Amy)

<120> 使用特異性結合CD38之抗體免疫調節及治療固態腫瘤

<130> JBI5067ARNP

<141> 隨同本文

<140> 待指派

<150> 15/191808

<151> 2016-06-24

<150> PCT/US16/39165

<151> 2016-06-24

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<151> 2015-06-24

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之VH

<400> 4

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之VL

<400> 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之HCDR1

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之HCDR2

<400> 7

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之HCDR3

<400> 8

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之LCDR1

<400> 9

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之LCDR2

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之LCDR3

<400> 11

<210> 12

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之重鏈

<400> 12

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之輕鏈

<400> 13

<210> 14

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之VH 003

<400> 14

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之VL 003

<400> 15

<210> 16

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之VH 024

<400> 16

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之VL 024

<400> 17

<210> 18

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之VH MOR202

<400> 18

<210> 19

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38抗體之VL MOR202

<400> 19

<210> 20

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38 mAb之VH伊沙妥昔單抗

<400> 20

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD38 mAb之VL伊沙妥昔單抗

<400> 21

<210> 22

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1 mAb之VH Keytruda

<400> 22

<210> 23

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1 mAb之VL Keytruda

<400> 23

<210> 24

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1 mAb之VH Opdivo

<400> 24

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1 mAb之VL Opdivo

<400> 25

<210> 26

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1 mAb之VH德瓦魯單抗

<400> 26

<210> 27

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1 mAb之VL德瓦魯單抗

<400> 27

<210> 28

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1 mAb之VH阿替珠單抗

<400> 28

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1 mAb之VL阿替珠單抗

<400> 29

<210> 30

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1 mAb之VH艾維路單抗

<400> 30

<210> 31

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1 mAb之VL艾維路單抗

<400> 31

<210> 32

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1 mAb之VH

<400> 32

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1 mAb之VL

<400> 33

<210> 34

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1 mAb之VH

<400> 34

<210> 35

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-1 mAb之VH

<400> 35

<210> 36

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TIM-3 mAb之VH

<400> 36

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TIM-3 mAb之VL

<400> 37

<210> 38

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TIM-3 mAb之VH

<400> 38

<210> 39

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TIM-3 mAb之VL

<400> 39

<210> 40

<211> 509

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組玻尿酸酶

<400> 40

Claims

一種治療患有固態腫瘤之病患的方法，其包含向有彼之需要之該病患投予治療有效量之特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該固態腫瘤的時間。
如請求項1所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體引發該病患之免疫反應。
如請求項2所述之方法，其中該免疫反應係效應T細胞(Teff)反應。
如請求項3所述之方法，其中該Teff反應係由CD4⁺ T細胞或CD8⁺ T細胞媒介。
如請求項4所述之方法，其中該Teff反應係由該等CD8⁺ T細胞媒介。
如請求項3所述之方法，其中該Teff反應係該CD8⁺ T細胞之數目的增加、CD8⁺ T細胞增生的增加、T細胞純系擴增的增加、CD8⁺記憶細胞形成的增加、抗原依賴性抗體產生的增加、細胞介素產生的增加、趨化介素產生的增加、或介白素產生的增加。(由該等細胞)
如請求項1所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體抑制免疫抑制細胞之功能。
如請求項7所述之方法，其中該免疫抑制細胞係調節T細胞(Treg)。
如請求項8所述之方法，其中該Treg係CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dimT細胞。
如請求項9所述之方法，其中該Treg表現CD38。
如請求項10所述之方法，其中該Treg之功能係藉由殺滅該Treg來抑制。
如請求項11所述之方法，其中殺滅該Treg係藉由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)來媒介。
如請求項7所述之方法，其中該免疫抑制細胞係骨髓衍生抑制細胞(MDSC)。
如請求項13所述之方法，其中該MDSC係CD11b⁺HLADR^-CD14^- CD33⁺CD15⁺細胞。
如請求項14所述之方法，其中該CD11b⁺HLADR^-CD14^- CD33⁺CD15⁺細胞表現CD38。
如請求項15所述之方法，其中該MDSC之功能係藉由殺滅該MDSC來抑制。
如請求項16所述之方法，其中殺滅MDSC係藉由ADCC來媒介。
如請求項7所述之方法，其中該免疫抑制細胞係調節B細胞(Breg)。
如請求項18所述之方法，其中該Breg係CD19⁺CD24⁺CD38⁺細胞。
如請求項19所述之方法，其中該Breg功能係藉由殺滅該Breg來抑制。
如請求項20所述之方法，其中殺滅該Breg係藉由ADCC來媒介。
如請求項7所述之方法，其中該免疫抑制細胞存在於骨髓中或於周邊血液中。
如請求項1所述之方法，其中該固態腫瘤係黑色素瘤、肺癌、鱗狀非小細胞肺癌(NSCLC)、非鱗狀NSCLC、結腸直腸癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、胃癌(stomach cancer)、卵巢癌、胃癌(gastric cancer)、肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌、頭部及頸部鱗狀細胞癌、食道或胃腸道癌、乳癌、輸卵管癌、腦癌、尿道癌、泌尿生殖癌、子宮內膜異位、子宮頸癌、或該癌症之轉移性病變。
如請求項23所述之方法，其中該固態腫瘤缺乏可偵測的CD38表現。
如請求項1所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體係非促效性抗體。
如請求項25所述之方法，其中該非促效性抗體以統計學不顯著的方式在體外誘導周邊血液單核細胞之樣本的增生。
如請求項1所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體與包含SEQ ID NO：4之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：5之輕鏈可變區(VL)的抗體競爭結合至CD38。
如請求項27所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體至少結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區。
如請求項28所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含分別係SEQ ID NO：6、7、8、9、10、及11之重鏈互補決定區(HCDR)1、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區(LCDR)1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列。
如請求項29所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL。
如請求項23所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：a)SEQ ID NO：14之VH及SEQ ID NO：15之VL；b)SEQ ID NO：16之VH及SEQ ID NO：17之VL；c)SEQ ID NO：18之VH及SEQ ID NO：19之VL；或d)SEQ ID NO：20之VH及SEQ ID NO：21之VL。
如請求項31所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含：a)該SEQ ID NO：14之VH及該SEQ ID NO：15之VL；b)該SEQ ID NO：16之VH及該SEQ ID NO：17之VL；c)該SEQ ID NO：18之VH及該SEQ ID NO：19之VL；或d)該SEQ ID NO：20之VH及該SEQ ID NO：21之VL。
如請求項1所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體係與第二治療劑組合投予。
如請求項33所述之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑、標靶抗癌療法、用於治療固態腫瘤之標準照護藥品、或免疫檢查點抑制劑。
如請求項34所述之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗LAG3抗體、抗TIM3抗體、或抗CTLA-4抗體。
如請求項35所述之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。
如請求項36所述之方法，其中該抗PD-1抗體包含a)SEQ ID NO：22之VH及SEQ ID NO：23之VL；b)SEQ ID NO：24之VH及SEQ ID NO：25之VL；c)SEQ ID NO：32之VH及SEQ ID NO：33之VL；或d)SEQ ID NO：34之VH及SEQ ID NO：35之VL。
如請求項35所述之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係抗PD-L1抗體。
如請求項38所述之方法，其中該抗PD-L1抗體包含a)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：27之VL；b)SEQ ID NO：28之VH及SEQ ID NO：29之VL；或c)SEQ ID NO：30之VH及SEQ ID NO：31之VL。
如請求項35所述之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係抗PD-L2抗體。
如請求項35所述之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係抗LAG3抗體。
如請求項35所述之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係抗TIM-3抗體。
如請求項42所述之方法，其中該抗TIM-3抗體包含a)SEQ ID NO：36之VH及SEQ ID NO：37之VL；或b)SEQ ID NO：38之VH及SEQ ID NO：39之VL。
如請求項33所述之方法，其中該第二治療劑係同時、依序、或分開投予。
如請求項1所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體係經靜脈內投予。
如請求項1所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體係於醫藥組成物中經皮下投予，該醫藥組成物包含該特異性結合CD38的抗體及玻尿酸酶。
如請求項46所述之方法，其中該玻尿酸酶係SEQ ID NO：40之rHuPH20。
如請求項1所述之方法，其中該病患係以放射療法治療，或已經過放射療法治療。
如請求項1所述之方法，其中該病患已經歷過手術，或將經歷手術。
一種抑制免疫抑制細胞之活性的方法，其包含使該免疫抑制細胞接觸特異性結合CD38之抗體。
如請求項50所述之方法，其中該免疫抑制細胞係Treg。
如請求項51所述之方法，其中該Treg係CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^dim T細胞。
如請求項50所述之方法，其中該免疫抑制細胞係MDSC。
如請求項53所述之方法，其中該MDSC係CD11b⁺HLADR^-CD14^- CD33⁺CD15⁺細胞。
如請求項50所述之方法，其中該免疫抑制細胞係Breg。
如請求項55所述之方法，其中該Breg係CD19⁺CD24⁺CD38⁺細胞。
如請求項50所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體係非促效性抗體。
如請求項57所述之方法，其中該非促效性抗體以統計學不顯著的方式在體外誘導周邊血液單核細胞之樣本的增生。
如請求項58所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體與包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL的抗體競爭結合至CD38。
如請求項59所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體至少結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區。
如請求項60所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含分別係SEQ ID NO：6、7、8、9、10、及11之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列。
如請求項61所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL。
如請求項50所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：a)SEQ ID NO：14之VH及SEQ ID NO：15之VL；b)SEQ ID NO：16之VH及SEQ ID NO：17之VL；c)SEQ ID NO：18之VH及SEQ ID NO：19之VL；或d)SEQ ID NO：20之VH及SEQ ID NO：21之VL。
如請求項63所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含：a)該SEQ ID NO：14之VH及該SEQ ID NO：15之VL；b)該SEQ ID NO：16之VH及該SEQ ID NO：17之VL；c)該SEQ ID NO：18之VH及該SEQ ID NO：19之VL；或d)該SEQ ID NO：20之VH及該SEQ ID NO：21之VL。
一種增強病患之免疫反應的方法，其包含向該病患投予特異性結合CD38之抗體。
如請求項65所述之方法，其中該病患患有癌症或病毒感染。
如請求項65所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體係非促效性抗體。
如請求項67所述之方法，其中該非促效性抗體以統計學不顯著的方式在體外誘導周邊血液單核細胞之樣本的增生。
如請求項68所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體與包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL的抗體競爭結合至CD38。
如請求項69所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體至少結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區。
如請求項70所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含分別係SEQ ID NO：6、7、8、9、10、及11之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列。
如請求項71所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL。
如請求項65所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：a)SEQ ID NO：14之VH及SEQ ID NO：15之VL；b)SEQ ID NO：16之VH及SEQ ID NO：17之VL；c)SEQ ID NO：18之VH及SEQ ID NO：19之VL；或d)SEQ ID NO：20之VH及SEQ ID NO：21之VL。
如請求項73所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含：a)該SEQ ID NO：14之VH及該SEQ ID NO：15之VL；b)該SEQ ID NO：16之VH及該SEQ ID NO：17之VL；c)該SEQ ID NO：18之VH及該SEQ ID NO：19之VL；或d)該SEQ ID NO：20之VH及該SEQ ID NO：21之VL。
一種治療患有病毒感染之病患的方法，其包含向該病患投予特異性結合CD38之抗體達一段足以治療該病毒感染的時間。
如請求項75所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體係非促效性抗體。
如請求項76所述之方法，其中該非促效性抗體以統計學不顯著的方式在體外誘導周邊血液單核細胞之樣本的增生。
如請求項77所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體與包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL的抗體競爭結合至CD38。
如請求項78所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體至少結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區。
如請求項79所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含分別係SEQ ID NO：6、7、8、9、10、及11之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列。
如請求項80所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL。
如請求項75所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：a)SEQ ID NO：14之VH及SEQ ID NO：15之VL；b)SEQ ID NO：16之VH及SEQ ID NO：17之VL；c)SEQ ID NO：18之VH及SEQ ID NO：19之VL；或d)SEQ ID NO：20之VH及SEQ ID NO：21之VL。
如請求項82所述之方法，其中該特異性結合CD38之抗體包含：a)該SEQ ID NO：14之VH及該SEQ ID NO：15之VL；b)該SEQ ID NO：16之VH及該SEQ ID NO：17之VL；c)該SEQ ID NO：18之VH及該SEQ ID NO：19之VL；或d)該SEQ ID NO：20之VH及該SEQ ID NO：21之VL。