TW201738562A - 體外病原體檢驗技術 - Google Patents

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彼得Ｊ 史丘恩
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傑若恩Ｋ 梅迪馬
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Abstract

本發明屬於製藥工業領域且說明了用於測試包含至少一種活性物質的組合物中外來物質的方法，所述方法包括步驟：a)將針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體與包含至少一種活性物質的組合物接觸，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列，其中抗體結合於活性物質，以及b)在步驟a)之後確定組合物中外來物質存在與否。進一步地，本發明說明了通過施行所述方法而生產藥物組合物的方法、多聚核苷酸構建物用於測試待測組合物中活性物質或任何外來或傳染性物質存在與否的用途。本發明還涉及在流感疫苗領域中作為有用的物質的具體的多聚核苷酸或多聚核苷酸構建物，以及包含多聚核苷酸和/或多聚核苷酸構建物的非-人生物體、轉基因動物或微生物體。本發明還針對分部套盒。

Description

體外病原體檢驗技術 發明領域
本發明屬於製藥工業領域且涉及用於在包含至少一種活性物質的組合物中測試外來物質的方法，並涉及通過施行所述方法生產藥物組合物的過程。進一步地，本發明還涉及多聚核苷酸構建物用於測試待測組合物中活性物質或任何外來或傳染性物質存在與否的用途。此外，本發明涉及多聚核苷酸、包含特定多聚核苷酸的多聚核苷酸構建物，以及包含這些多聚核苷酸或多聚核苷酸構建物的用於病毒(顯著地涉及流感病毒)抗原製備領域的宿主細胞。還提供包含這些多聚核苷酸和/或多聚核苷酸構建物的非-人生物體、轉基因動物或微生物體。進一步地，其涉及對由所述多聚核苷酸編碼的多肽具有特異性的抗體以及用於生產所述抗體的方法，還涉及針對多聚核苷酸構建物表達產物而產生的抗體用於純化活性物質的用途。本發明還針對分部套盒。
發明背景
在製藥工業領域，有需要生產無污染物如外來或 偶發物質的組合物，因為這些可能導致不想要的副作用。此需要在疫苗領域尤其具有挑戰性。不存在外來或偶發物質還可能是受規章約束的問題。
為保證組合物不含有污染物，可測試各自的組合物是否含有這些污染物。
通常，這些測試能基於例如檢測組合物中存在的可能的外來物質，可選地，任選地外來物質在先前已經有擴增。
在此方面，WO 0172964 A2描述了定量PCR方法，其用於對生物-衍生材料的樣品中活的偶發物質同時進行檢測和定量。所述方法包括使用定量多聚酶鏈式反應(PCR)測量樣品中多聚核苷酸的量，在允許物質複製的條件下孵育，孵育時間段後使用定量PCR測量樣品中多聚核苷酸的量以及比較孵育時間段前後樣品中存在的多聚核苷酸的量。多聚核苷酸的量的增加表示樣品中有活的物質。
WO 2007/100397 A2參考對樣品中偶發污染物病毒的存在與否鑒別和確定，包括將來自樣品的核酸與至少一個引物對接觸以及通過質譜法確定擴增產物的分子量。
另一個可能性是在偶發物質測試之前中和待測組合物中存在的活性物質。在中和活性物質之後，將被中和的組合物加到特定細胞系中，或在動物模型中進行測試。如果此細胞系顯示出病原性效應，則此組合物含有偶發物質。
在此上下文中，US 2004/0005546 A1提供用於檢 測包含呼腸孤病毒的組合物中的偶發物質的方法，通過使用特異性切割呼腸孤病毒基因組的核酶使病毒失活。將編碼此核酶的質粒引入對呼腸孤病毒感染易感的細胞。轉染的細胞通過表達此核酶能夠使呼腸孤病毒失活並因此不受該病毒感染。核酶-表達細胞然後接受含有呼腸孤病毒的組合物，由呼腸孤病毒製備物引起的任何病原性效應表示有偶發物質的存在。WO 03072811 A2本質上參考了相同的原則。
組合物中活性物質的中和還可通過使用對此活性物質特異的抗體而實現，例如在歐洲藥典中2.6.16.章描述的。例如，如果活性物質為疫苗病毒抗原，此疫苗病毒抗原能被含有特異性結合於此抗原的抗體的抗血清所中和。為製備抗血清，使用在來自不同於用於疫苗生產的種屬的細胞培養物或其他系統(例如受精卵)中生產的，且不含外來物質的免疫抗原。
然而，儘管有上文描述的用於施行外來物質測試的方法，仍然需要改進的測試方法，尤其需要用於對非-特異的感染性污染物進行可能的鑒定的非-特異性測試方法，還需要進行合適測試的有用工具，並因此需要麼藥物組合物的改善的生產系統，尤其是在疫苗領域。
發明概要
本發明涉及以下方面、主題及優選的實施方式，其分別單獨考慮或組合考慮，有助於解決本發明的目標：
(1)用於在包含至少一種活性物質的組合物中測試外來物質的方法，所述方法包括：a)將針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體與包含至少一種活性物質的組合物接觸，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列，其中抗體結合於活性物質，以及b)在步驟a)之後確定組合物中外來物質存在與否。
優選地，抗體特異性結合於活性物質。
(2)用於在包含至少一種活性物質的組合物中測試外來物質的方法，所述方法包括：a)提供針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列，b)將此抗體與包含至少一種活性物質的組合物接觸，其中抗體結合於活性物質，以及c)在步驟b)之後確定組合物中外來物質存在與否。
(3)用於在包含至少一種活性物質得組合物中測試外來物質的方法，所述方法包括：a)提供通過用多聚核苷酸構建物免疫受試者而產生的抗體，b)將所述抗體與包含至少一種活性物質的組合物接觸，其中抗體結合於活性物質，以及c)在步驟b)之後確定組合物中外來物質存在與否。
(4)根據專案(1)-(3)中任何一項的方法，其中活性 物質在專案(1)中步驟b)或專案(2)和(3)中步驟(c)之前通過與抗體結合，優選地特異性結合而被中和或失活。
換言之，活性物質在確定組合物中外來物質存在與否的步驟之前通過與抗體結合而被中和或失活。
(5)根據專案(1)-(3)中任何一項的方法，其中確定組合物中外來物質存在與否的步驟包括：a)使用已經用多聚核苷酸構建物接種過(優選地，免疫過)的非-人動物，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列，以及用待測組合物接種所述的動物，b)在特定時間段後評估活動物百分比，其中在所述時間段內，在接種的動物中至少80%存活並不顯示感染跡象的情況下，認為組合物不含有外來物質，在所述時間段內，在接種的動物中少於80%存活和/或至少一隻動物顯示感染跡象的情況下，認為組合物含有外來物質。
(6)根據專案(1)-(4)中任何一項的方法，其中確定組合物中外來物質存在與否的步驟包括：a)用含有被中和或失活的活性物質的、待測組合物接種非-人動物，b在特定時間段後評估活動物百分比，其中在所述時間段內，在接種的動物中至少80%存活並不顯示感染跡象的情況下，認為組合物不含有外來物質，在所述時間段內，在接種的動物中少於80%存活和/或至少 一隻動物顯示感染跡象的情況下，認為組合物含有外來物質。
確定待測組合物中外來物質存在與否的步驟可以例如兩種方式施行：一個可能性是在用組合物接種測試生物體(例如，非-人動物)之前中和待測組合物中存在的活性物質(見例如項目(6))。此中和在體外施行，即，不在測試生物體本身內進行。組合物被中和之後，用待測組合物接種測試生物體在。另一個可能性(見例如項目(5))是中和步驟在原位(例如，在測試生物體本身內)施行。這是通過用多聚核苷酸構建物對測試生物體進行活性免疫而實現的，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列。通過這種做法，測試生物體產生針對活性物質的至少一部分的抗體。一旦用待測組合物(以及含有未中和的活性物質的組合物)接種測試生物體，這些抗體反過來就能中和活性物質。因此，確定待測組合物中外來物質存在與否可在相同測試生物體中施行，沒有任何在體外進行活性物質中和的需要。這顯著地減少了施行測試方法需要的時間、所需的測試生物體的數量並進一步增加測試的強健性以及安全性。
(7)根據專案(5)或(6)的方法，其中非-人動物選自由成年小鼠、乳小鼠和豚鼠，其中活動物百分比以及感染跡象的發生在至少7-10天的時間段之後進行評估，可選地，在接種動物為成年小鼠的情況下在用待測組合物接種後21天的時間段後，在接種動物為乳小鼠的情況下在用待 測組合物接種後14天的時間段後，在接種動物為豚鼠的情況下在用待測組合物接種後至少42天的時間段後。
(8)根據專案(5)-(7)中任何一項的方法，其中接種待測組合物是在腦內和/或腹膜內施行的。
(9)根據前述專案中任何一項的方法，其中確定待測組合物中外來物質存在與否的步驟根據管理要求，優選地根據歐洲藥典，2005，2.6.16章的要求而施行。
(10)根據前述專案中任何一項的方法，其中待測組合物為從其中生產活性物質的細胞培養物樣品，或從所述細胞培養物中衍生的產物。
進一步地，備選地，待測組合物有可能分別為種子病毒(seed virus)，或含有種子病毒的組合物。在本發明意義之內的種子病毒為預期用於生產抗原或疫苗的病毒。例如，種子病毒進行遺傳性改變以使其安全，且能夠在細胞培養物或蛋中生長。
(11)根據專案(1)-(10)中任何一項的方法，其中組合物為藥物組合物，優選地為疫苗製備物或其中間產物。
(12)根據專案(1)-(11)中任何一項的方法，其中活性物質為抗原，優選地為滅活或減毒病毒，更優選地為病毒抗原，如裂解病毒抗原、亞病毒抗原或病毒體，或者活性物質包含病毒的至少一種組分或病毒顆粒，優選地活性物質為流感病毒顆粒。
(13)根據專案(1)-(12)中任何一項的方法，其 中活性物質為多聚核苷酸序列編碼的抗原。
(14)根據前述專案中任何一項的方法，其中抗體通過用多聚核苷酸構建物免疫受試者而提供。
(15)根據前述專案中任何一項的方法，其中抗體及活性物質不是衍生自使用相同的多聚核苷酸構建物。
(16)根據專案(15)的方法，其中多聚核苷酸構建物在至少一種結構和/或功能性元件上有差異。
(17)根據專案(15)或(16)的方法，其中多聚核苷酸構建物在其編碼的多肽方面有差異。
(18)根據前述專案中任何一項的方法，其中抗體用於測試作為外來物質的病毒，例如選自肺炎病毒亞科(Pneumovirinae)，例如肺病毒(Pneumovirus)屬，包括呼吸道合胞體病毒(RSV)；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)家族的麻疹病毒(Morbilliviruse)，例如麻疹病病毒；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)的腸道病毒(Enteroviruse)，如柯薩奇(Coxsackie)病毒(例如柯薩奇B5，埃柯病毒，A-D型腸道病毒和鼻病毒)；哺乳動物呼腸病毒科(Reoviridae)，具體而言是正呼腸病毒(例如哺乳動物呼腸病毒如1、2、3型呼腸病毒)和輪狀病毒；逆轉錄病毒科(Retroviridae)成員，例如正逆轉錄病毒亞科(Orthoretrovirinae)(如逆轉錄酶病毒)，副黏液病毒科家族的偏肺病毒(Metapneumoviruse)如人偏肺病毒(HMPV)或1、2、3、4型副流感病毒；副黏液病毒科家族的腮腺炎病毒屬(Rubulaviruses)，如腮腺炎病毒；披膜病毒科(Togaviridae)，如風疹病毒(Rubellavirus)；冠狀病毒科 (Coronaviridae)，如SARS冠狀病毒及其他人冠狀病毒，如冠狀病毒OC43、229E、NL63和HKU1；小核糖核酸病毒科家族的鼻病毒，例如如鼻病毒M-株；水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，也稱為2型人皰疹病毒(HHV3)；多瘤病毒科(Polyomaviridae)，如SV-40多瘤病毒、BK多瘤病毒和JC多瘤病毒；豬圓環病毒；豬小核糖核酸病毒，如豬水皰病病毒(SVDV)和捷申-泰法(Teschen-Talfan)病毒；細小病毒科(Parvoviridae)成員，例如犬細小病毒(CPV)，博卡病毒或豬細小病毒；副流感病毒(PIV)；正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)成員，包括A和B型流感病毒；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)成員，包括PIV-I、PIV-2和PIV-3；皰疹病毒科(Herpesviridae)，如1、2型單純性皰疹病毒，6、7、8型人單純性皰疹病毒，巨細胞病毒和EB病毒；腺病毒科(Adenoviridae)，例如腺病毒，包括人、猿、鳥腺病毒，如1型鳥腺病毒；鳥圓環病毒；鳥呼腸病毒科，具體而言是正呼腸病毒，如鳥呼腸孤病毒；乳頭狀瘤病毒科(Papillomaviridae)成員，包括人乳頭狀瘤病毒；黃病毒科(Flaviviridae)成員，如西尼羅河病毒；以及雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae)，例如傳染性法式囊病毒(也稱為甘布羅鎮病毒)，及/或其中抗體用於測試作為外來物質的細菌，例如衣原體(Chlamydia)，包括沙眼衣原體(C.trachomatis)、肺炎衣原體(C.pneumoniae)和鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)；以及支原體(Mycoplasma)。
(19)根據前述專案中任何一項的方法，其中多 聚核苷酸構建物包含HA(血凝素)和/或NA(神經氨酸酶)編碼序列。
在一個優選的實施方式中，多聚核苷酸構建物單獨地或相互組合地包含任何這些HA和/或NA編碼序列。多聚核苷酸構建物還可能只包含這些序列的多個部分。優選地，多聚核苷酸構建物單獨地或相互組合地包含編碼H1、H2、H3、H5、H6、H7、N1、N2、N3或N7(優選地單獨編碼H5)的序列的完整序列或一部分。在一個進一步優選的實施方式中，多聚核苷酸構建物包含編碼H1N1、H2N2、H3N2、H6N1、H7N3或H7N7的序列或序列的一部分，優選地包含編碼H5N1的序列或序列的一部分。
(20)根據前述專案中任何一項(尤其是根據專案(14))的方法，其中包含多聚核苷酸構建物(編碼活性物質的至少一部分的序列)是密碼子優化的，具體而言是通過對用於用多聚核苷酸構建物免疫的受試者的密碼子優化。
(21)根據前述專案中任何一項的方法，其中活性物質包含流感抗原，並且多聚核苷酸構建物包含具有與SEQ ID NO：1或2所示核酸至少90%，優選地至少95%，更優選地至少98%的序列同一性的序列。
(22)根據前述專案中任何一項的方法，其中活性物質包含流感抗原，此多聚核苷酸構建物包含如SEQ ID NO：1或2中描述的序列。
(23)用包含多聚核苷酸構建物(編碼活性物質的至少一部分的序列)產生特異性針對所述活性物質的抗 體用於測試任何以下條件的用途：i)待測組合物中活性物質的存在與否，ii)組合物中任何外來或傳染性物質的存在與否，其中抗體通過用多聚核苷酸構建物免疫受試者而提供，其中活性物質被所述抗體中和或失活。
(24)根據專案(23)的用途，其中活性物質顯示感染活性，組合物缺少任何感染性表示抗體中和或失活的活性物質且不存在進一步的傳染性物質。
(25)根據專案(23)或(24)的用途，其中活性物質為抗原，優選地為病毒顆粒，或活性物質包含病毒顆粒的至少一種組分，具體而言其中所述病毒顆粒為流感病毒顆粒。
(26)根據專案(23)-(25)的用途，其中對組合物的測試為陽性或陰性對照測試。
(27)根據專案(23)-(26)的用途，其中對組合物的測試為對外來物質的測試。
(28)用於生產藥物組合物，具體而言為疫苗的方法，包括在生產方法中至少一個時間點：a1)施行根據專案(1)-(22)中任何一項的方法；或a2)施行根據專案(23)-(27)中任何一項的用途；以及，可選地，b)通過移除和/或失活外來物質的處理而處理藥物組合物，具體而言是疫苗或其中間產物的步驟，和/或處理從中衍生藥物組合物或疫苗的細胞培養物的步驟。
(29)專案(28)的方法，其中在已經確定病原物質的情況下，步驟b)的處理具體地適合於移除和/或失活所述病原性外來物質。
(30)針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體用於純化所述活性物質的用途，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列，其中抗體特異性結合於活性物質，其中抗體和活性物質不是衍生自使用相同的多聚核苷酸構建物。
(31)根據專案(30)的用途，其中所使用的抗體如項目(14)-(22)中定義。
(32)根據專案(30)或(31)的用途，其中抗體包含結合於固相的親和標籤。
(33)多聚核苷酸，其包含具有與SEQ ID NO：1或2所示的核酸至少90%，優選地至少95%，更優選地至少98%的序列同一性的序列。
(34)根據專案(33)的多聚核苷酸，其中此多聚核苷酸具有如SEQ ID NO：1或2中描述的序列。
(35)包含根據專案(33)或(34)的多聚核苷酸的多聚核苷酸構建物。
(36)包含項目(33)或(34)的多聚核苷酸或項目(35)的多聚核苷酸構建物的宿主細胞。
(37)根據專案(36)的宿主細胞，其中宿主細胞為細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、藻類細胞或昆蟲細胞，優選地為細菌細胞或真菌細胞，最優選地為 細菌細胞。
(38)根據專案(36)或(37)的宿主細胞，其中宿主細胞為大腸桿菌(Escherichia coli)細胞、鏈黴菌屬(Streptomyces)細胞、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)細胞，優選地為大腸桿菌細胞。
(39)非-人生物體、轉基因動物或微生物體，其含有根據專案(33)或(34)的多聚核苷酸或根據專案(35)的多聚核苷酸構建物。
(40)對由根據專案(33)或(34)的多聚核苷酸編碼的多肽特異性的抗體。
(41)用於生產根據專案(40)的抗體的方法，其包括：a)提供根據專案(35)的多聚核苷酸構建物，以及b)用所述多聚核苷酸構建物免疫合適的受試者，優選地為合適的動物，如小鼠、大鼠或兔，更優選地為兔。
(42)分部套盒用於測試組合物中外來物質的用途，試劑盒包括a)多聚核苷酸構建物，其包含編碼活性物質的至少一部分的序列，以及c)宿主細胞
(43)分部套盒，包括a)包含編碼具有與SEQ ID NO：1或2所示的核酸至少90%，優選地至少95%，更優選地至少98%的序列同 一性的活性物質的至少一部分的序列的多聚核苷酸構建物，或包含如SEQ ID NO：1或2中描述的序列的構建物，以及b)宿主細胞。
第1圖顯示了密碼子優化的血凝素抗原(HA；SEQ ID NO：1)的核苷酸序列。第一個和最後一個三核苷酸(下劃線)分別代表了起始和終止密碼子。
第2圖顯示了密碼子優化的神經氨酸酶抗原(NA；SEQ ID NO：2)的核苷酸序列。第一個和最後一個三核苷酸(下劃線)分別代表了起始和終止密碼子。
第3圖顯示pCMV-HA的DNA構建物圖譜，包含編碼HA的密碼子優化的序列。
第4圖顯示pCMV-NA的DNA構建物圖譜，包含編碼NA的密碼子優化的序列。
第5圖顯示pCMV-HA的整個質粒DNA序列。用於質粒構建的限制性酶加上下劃線，CODA演算法優化的HA基因序列以粗體表示。
第6圖顯示pCMV-NA的整個質粒DNA序列。用於質粒構建的限制性酶加上下劃線，CODA演算法優化的NA基因序列以粗體表示。
較佳實施例之詳細說明
現在通過優選的實施方式和實施例更詳細地描 述本發明，其僅僅為闡述性目的而提供，不應被理解為以任何方式限制本發明的範圍。
本發明提供了有效、快速、可靠的方法用於檢測組合物中的污染物，通過使用特異性結合於組合物中存在的活性物質的抗體，條件是所述的抗體是針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列。據發現，已經通過重組多聚核苷酸構建物用於免疫而製備的抗體對於測試外來或偶發物質之前中和或失活活性物質尤其有利且有用。這些抗體尤其適合於測試含有蛋白質性物質如活性物質的組合物中的外來物質。由於待用於製備抗體的多聚核苷酸構建物為通過合成製備的並包含編碼指定活性物質中存在的氨基酸序列的至少一部分的多聚核苷酸，此多聚核苷酸構建物編碼待中和或失活的靶標的同源序列，但在測試期間將抗體加到組合物中時沒有被外來或偶發物質所污染。與此相反，使用通過用抗體(其是通過用給定活性物質本身被免疫的動物而產生的)的其他免疫學外來物質測試可能很好地導致特異於組合物中存在的外來物質的抗體形成，這樣產生了假陰性結果的風險。這種在動物中這些抗體的不想要的產生可例如通過從在其中生產活性物質的細胞培養物系統所產生的污染物誘導。然而，結果是，不像根據本發明使用多聚核苷酸構建物免疫用於抗體的生產，隨後對外來物質有特異性的抗體會在測試過程中中和外來物質，從而導致分析中的錯誤。根據本發明的方法允許避 免或至少減少特異於污染物的抗體形成。因此，例如，可避免假陰性外來物質測試結果。進一步地，降低發生交叉反應性的風險。此外，多聚核苷酸構建物能在適當的測試系統中直接測試，以顯示污染性外來物質不存在，例如構建物可通過PCR或歐洲藥典2.6.16.中描述的方法就廣泛的一系列潛在污染物直接進行測試。
具體而言，已經發現通過用編碼例如病毒抗原(如流感病毒抗原)的多聚核苷酸構建物直接免疫受試者，可能迅速產生特異性結合於此流感病毒抗原的抗體，目標是隨後的測試主要地不對流感病毒本身回應。因此，通過使用根據本發明的方法，不再需要產生特異性的抗體，例如，通過用野生型病毒或在疫苗製備過程中獲得的病毒顆粒本身被免疫的動物，這顯著減少了要用於後續測試階段的抗體-產生所需要的時間。此外，不再需要依賴於交叉-反應株的鑒別和培養，因為(潛在的)流行性或季節性流感病毒株一經鑒別就能製備出多聚核苷酸構建物。這在流行性或季節性流感爆發的情況下尤其有用，因為需要將流行性或季節性疫苗快速投放市場。通過應用根據本發明的方法，針對這些流感抗原的特異性抗體能迅速產生並用於測試及可選的流感疫苗製備物過程中進一步處理目的。因此，本發明減少了疫苗投放前置時間。由於所產生的抗體還能用於品質測試，疫苗或其中間產物接受如外來物質測試，本發明還產生改善的疫苗品質。此外，通過應用本發明的教導，可能在外來物質已經被檢測之後通過將此批次經過特殊處 理以失活或去除檢測到的偶發物質而進一步使用昂貴的生產批次。
總而言之，通過應用根據本發明的方法，可實現所測試組合物的改善的品質和安全性以及偶發物質測試的改善的支出。因此，所測試組合物投放前置時間能夠減少。
在一個具體的方面，本發明涉及用於測試包含至少一種活性物質的組合物中外來物質的方法，所述方法包括以下步驟a)將針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體與包含至少一種活性物質的組合物接觸，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列，其中抗體結合於活性物質，以及b)在步驟a)之後確定組合物中外來物質存在與否。
在本法意義之內，術語“外來物質”或“偶發物質”涉及待測組合物中可能存在的污染物。偶發或外來物質為不預期包括在組合物中並會對含有此組合物產品屬性有不利影響的物質。例如，如果組合物構成藥物製備物或將為此使用，偶發物質會例如為傳染性物質(病原體)，即能夠傳染人或動物的物質。這種傳染性物質可為微生物體，例如，細菌、真菌、藻類、病毒或其部分。病毒常常能夠在用於生物學製品生產的系統如細胞培養物中生長。進一步地，組合物還可為宿主DNA污染物。
用於生物學製品生產，具體而言用於生產病毒顆粒的典型細胞系，為哺乳動物細胞系，包括MDCK、CHO、 BHK、Vero、MRC-5、PER.C6、WI-38等等。可能無意中感染這些細胞並因此顯示了根據本發明的待測試的潛在外來或偶發物質的感染性病毒和細菌的實例包括例如選自由以下的病毒：肺炎病毒亞科，例如肺病毒屬，包括呼吸道合胞體病毒(RSV)；副黏液病毒科家族的麻疹病毒，例如麻疹病病毒；小核糖核酸病毒科的腸道病毒，如柯薩奇病毒(例如柯薩奇B5，埃柯病毒，A-D型腸道病毒和鼻病毒)；哺乳動物呼腸病毒科，具體而言是正呼腸病毒(例如哺乳動物呼腸病毒如1、2、3型呼腸病毒)和輪狀病毒；逆轉錄病毒科成員，例如正逆轉錄病毒亞科(如逆轉錄酶病毒)，副黏液病毒科家族的偏肺病毒如人偏肺病毒(HMPV)或1、2、3、4型副流感病毒；副黏液病毒科家族的腮腺炎病毒屬，如腮腺炎病毒；披膜病毒科，如風疹病毒；冠狀病毒科，如SARS冠狀病毒及其他人冠狀病毒，如冠狀病毒OC43、229E、NL63和HKU1；小核糖核酸病毒科家族的鼻病毒，例如如鼻病毒M-株；水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，也稱為2型人皰疹病毒(HHV3)；多瘤病毒科，如SV-40多瘤病毒、BK多瘤病毒和JC多瘤病毒；豬圓環病毒；豬小核糖核酸病毒，如豬水皰病病毒(SVDV)和捷申-泰法病毒；細小病毒科成員，例如犬細小病毒(CPV)，博卡病毒或豬細小病毒；副流感病毒(PIV)；正黏液病毒科成員，包括A和B型流感病毒；副黏液病毒科成員，包括PIV-I、PIV-2和PIV-3；皰疹病毒科，如1、2型單純性皰疹病毒，6、7、8型人單純性皰疹病毒，巨細胞病毒和EB病毒；腺病毒科，例如腺病毒，包括人、猿、 鳥腺病毒，如1型鳥腺病毒；鳥圓環病毒；鳥呼腸病毒科，具體而言是正呼腸病毒，如鳥呼腸孤病毒；乳頭狀瘤病毒科成員，包括人乳頭狀瘤病毒；黃病毒科成員，如西尼羅河病毒；以及雙核糖核酸病毒科，例如傳染性法式囊病毒，及/或其中抗體用於測試作為外來物質的細菌，例如衣原體，包括沙眼衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體；以及支原體。
通過應用根據本發明的方法，組合物中外來或偶發物質的存在各自可以以有效、迅捷、可靠的方式進行測試。這種待測試的組合物可為任何滿足特定品質要求的組合物或其上游樣品。這些組合物可用於測試試劑盒例如用於在任何人或動物的體液或樣品中檢測疾病或傳染性物質。根據本發明的方法還適合於測試用於任何實驗室用途(如分析或製備目的)的組合物。在本發明意義之內的進一步待測試組合物可為例如從中產生活性物質的細胞培養物樣品，或者其分離-或純化產品或任何中間產物。這些樣品可取自任何過程步驟。組合物還可為衍生自此細胞培養物的產品。再一次地，此產品可為在任何階段衍生自細胞培養物的產品，這意味著此產品可為終產品的前體或終產品本身，或任何二者之間的產品。進一步地，備選地，待測組合物可能分別為種子病毒，或含有種子病毒的組合物。種子病毒在本發明意義內為預期用於生產抗原或疫苗的病毒。
本發明意義之內的其他組合物為藥物組合物。優 選地，組合物為藥物組合物。藥物組合物可用在身體之內或之上，以預防、診斷、減輕、處理或治癒人或動物的疾病。優選地，這種藥物組合物為疫苗製備物或其中間產物。在藥物組合物為疫苗製備物的情況下，還可能測試疫苗批次的特定樣品。其他待測組合物為例如任何來自最終產生藥物或疫苗產品的過程階段中的樣品，例如，來自從中衍生活性物質的細胞培養物的樣品或任何中間產物。
由於具有偶發物質的污染物可在製備過程中的任何時間發生或合適地進行測試，根據本發明的方法可在所述組合物製備中的任何階段施行。
待測組合物包含至少一種活性物質。活性物質在本發明的意義之內指的是任何化學或生物學材料或化合物，其為組合物中有效成分。在藥物組合物的情況下，活性物質可以為藥物化合物，如生物製藥藥物，尤其是表達的多肽。優選地，活性物質為抗原，優選地，抗原為失活或減毒的病毒，更優選地，抗原為病毒抗原。這些病毒抗原的實例為例如病毒顆粒，如部分破壞的病毒顆粒如裂解病毒抗原、純化的包膜抗原如亞基病毒抗原或病毒體。病毒體為具有合適平均直徑的單層磷脂雙層囊泡，例如範圍為從大約70nm-大約150nm。本質上，病毒體代表重構的空病毒包膜，去除了包括來源病毒的遺傳物質的核殼體。病毒體不能夠複製但是是純的融合-活性囊泡，其含有插入磷脂雙分子層膜中的功能性病毒包膜糖蛋白如流感病毒血凝素(HA)及神經氨酸酶(NA)。還優選地是，活性物質包含病 毒或病毒顆粒至少的一種組分，優選地活性物質為流感病毒顆粒。
由於根據本發明的方法在生產流行性疫苗領域中尤其有用，根據一個優選的實施方式，活性物質為衍生自在流感疫苗中存在的流感病毒顆粒的抗原或疫苗組分。這些流感疫苗可基於任何合適的流感株。流感疫苗通常包括來自流感A、B和C病毒株中至少一種的抗原，優選地來自流感A或B中的至少一株。建議的用於疫苗的株可隨季節變化。還可能疫苗基於超過一種合適的流感株。例如，流感疫苗可包括兩種流感A株及一種流感B株。進一步地可能疫苗不僅為單-，還可以是雙-，三-或多價疫苗，優選地疫苗為三價疫苗。包含活性物質優選地為衍生自流感病毒顆粒的抗原或疫苗組分的流感疫苗可通過任何對本領域技術人員已知的技術製備。例如，疫苗可通過使用編碼活性物質或活性物質的部分的多聚核苷酸構建物或通過用活的病毒製備物感染蛋或細胞而製備。優選地，通過用活的病毒製備物感染蛋或細胞而製備疫苗。在疫苗的製備基於細胞的情況下，使用能夠接納生長病毒的細胞，例如哺乳動物細胞如MDCK(Madin-Darby狗腎細胞)，CHO(中國倉鼠卵巢細胞)，BHK(倉鼠嬰腎細胞)，Vero(衍生自非洲綠猴腎上皮細胞的細胞)，MRC-5(次級人肺成纖維細胞)，PER.C6(衍生自人胚胎視網膜細胞的細胞)，WI-38(來自人胎兒肺組織的細胞)等等。通常，病毒或活病毒製備物分別注射入細胞，並在其中擴增。然後移除、收集、純化並失活細胞外 壁。在基於蛋的製備中，通常病毒或活病毒製備物分別注射入蛋並在胚胎周圍液體中積累。胚胎被感染，這樣病毒可擴增。在特定時間段之後，病毒經收集、純化並進行化學失活。此病毒或病毒部分被用於生產疫苗。
如本文使用的，術語“多聚核苷酸”應理解為指雙鏈或單鏈核酸分子，例如，DNA，cDNA，基因組DNA、RNA和/或mRNA分子等等。核酸分子可作為編碼鏈或互補鏈存在。多聚核苷酸可為天然來源或通過基因技術或化學過程及合成方法產生，或可能從其衍生而來。優選地，多聚核苷酸序列編碼作為活性物質的抗原。
根據本發明的方法，在步驟a)中，將針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體與包含至少一種活性物質的組合物接觸，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列，其中抗體特異性結合於活性物質，例如，通過形成抗原-抗體複合物。
在下文中，詳細描述了本發明中使用的抗體。其衍生自多聚核苷酸構建物或載體。術語“多聚核苷酸構建物”或“載體”分別指用於將外來多聚核苷酸(或插入片段，分別地)引入宿主細胞或宿主生物體中的分子。多聚核苷酸構建物包含如上文描述的多聚核苷酸，優選地多聚核苷酸構建物或載體是DNA或RNA序列，更優選地是DNA序列。多聚核苷酸構建物分別包含多聚核苷酸序列，或插入片段，其編碼一種或多種(多)肽或蛋白質。此多聚核苷酸或插入片段分別可為雙鏈或單鏈核酸分子，例如，DNA、 cDNA、基因組DNA、RNA和/或mRNA分子等等。核酸分子可以以編碼鏈或互補鏈存在。多聚核苷酸可為天然來源或通過基因技術或化學過程或合成手段產生，或可能由其衍生而來。優選地，多聚核苷酸序列編碼代表活性物質的至少一部分的(多)肽或蛋白質。
在本發明的意義之內，表述“針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體”指的是抗體是通過用多聚核苷酸構建物免疫合適的生物體或通過在細胞或細胞系統中產生抗體而獲得的抗體。所產生的獲自此特定免疫的抗體，可選地為分離的抗體，(可選地特異性)結合於(多)肽，其由多聚核苷酸構建物所包含的序列編碼，其中(多)肽代表活性物質的至少一部分。
優選地，根據本發明，多聚核苷酸構建物或載體分別包含a)啟動子區域，b)多聚核苷酸或插入片段，分別地，如本文公開的，其可操作性地連接至啟動子區域，以及c)可選地，可操作性連接於其上的調控序列，其以轉錄、終止和/或多聚腺苷酸化信號而起作用，增強子序列和/或編碼先導信號的序列，和/或確保有效的核糖體結合的序列，例如Kozak保守序列。合適的啟動子和/或調控序列是分子生物學領域技術人員熟知的。在任何情況下，本領域技術人員可在文獻中找到合適的啟動子和/或調控序列，例如在相關科學雜誌和基因資料庫中，或可將其從任何理想的生物體中分離出來，使用標準方法如在Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Press，(2000)中描述的。
適合於根據本發明使用的多聚核苷酸構建物的多聚核苷酸序列或插入片段，分別地，可由本領域技術人員基於編碼形成活性物質的至少一部分的多肽的序列而確定。在病毒抗原作為活性物質的情況下，編碼此病毒抗原的核苷酸序列通常是已知的，例如在通過“逆向遺傳學”手段(見例如Neumann等人，“Reverse Genetics of Influen za Virus”，Minireview，Virology 287，243-250，2001，其中引用的參考文獻以及之後的逆向遺傳學技術)製備病毒或疫苗的情況下。編碼合適多肽的整個多聚核苷酸序列或其片段可由本領域技術人員選擇並引入多聚核苷酸構建物。合適的多肽是能夠在被免疫的受試者中引發有效抗體應答的多肽。合適的多肽可在例如本領域技術人員已知資料庫中找到，如PubMed資料庫(例如http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/145284465？ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Sequence.SequenceResultsPanel.Sequence_RVDocSum及http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)。優選地，多肽包含一種或多種抗原決定簇(表位)。還可能的是多聚核苷酸構建物含有的多肽不僅編碼一種活性物質或活性物質的一部分，還編碼一種或多種其他活性物質或其他活性物質的多個部分。還可能使用分別包含不同多聚核苷酸和插入片段的不同多聚核苷酸構建物。然而，這可能取決於組合物中存在的不同活性物質的 存在和數量。因此，如果存在不同類型活性物質，便製備不同類型多聚核苷酸構建物，每種類型包含編碼代表至少一種類型活性物質的一部分的多肽的序列。
優選地，用於本發明的多聚核苷酸構建物或載體是表達載體。表達載體是能夠控制其含有的基因表達(即，轉錄和翻譯)的載體。甚至更優選地，載體為哺乳動物質粒表達載體。這種載體的一個實例為質粒(p)pCMV。優選地，用於本發明之內的載體含有以下特徵：a)巨細胞病毒(CMV)啟動子，b)Kozak保守序列，其被置於ATG起始密碼子之前以保證有效的核糖體結合和因此蛋白質翻譯的最高水準，以及c)轉錄終止信號、poly(A)信號，其置於編碼代表活性物質的至少一部分的(多)肽或蛋白質的序列末端以保證合適的轉錄終止。編碼序列(即，多聚核苷酸)可亞克隆到載體中合適限制性位點處。所得的質粒(多聚核苷酸構建物或載體，分別地，優選地為DNA構建物或載體)然後可用於轉化合適的宿主細胞，如細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞或昆蟲細胞，優選地為細菌細胞如大腸桿菌細胞。轉化的宿主細胞在合適的培養基中培養然後被收集、裂解，並回收質粒。對於先前提到的步驟的合適操作流程可在例如Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Press，(2000)，Davis，等人，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier(1986)，及Ausubel，等人，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience(1988)中找到。
為表徵所產生的質粒多聚核苷酸，在一般限制性分析中，凝膠電泳以及進一步的生化和分子生物學方法可用作分析方法。這些方法以及用於產生上文描述的多聚核苷酸構建物的方法都是熟知的，已經發表了許多關於重組多聚核苷酸方法的論述，包括Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Press，(2000)，Davis，等人，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier(1986)，及Ausubel，等人，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience(1988)。
宿主細胞的轉化可用於擴增表達載體。擴增的表達載體能在之後反過來用於例如如下文描述的，免疫受試者。
為產生特異性結合於存在於待測組合物中的活性物質的抗體或抗血清，在本發明一個優選的實施方式中，用分別包含多聚核苷酸或插入片段的多聚核苷酸構建物免疫受試者，所述多聚核苷酸或插入片段編碼活性物質的至少一部分。用所述多聚核苷酸構建物直接免疫合適的受試者導致針對所述表達產物的抗體更迅速的產生，例如，可避免在用活性物質(例如，(多)肽)本身施行免疫的情況下可能必需的工序。這些否則便是需要的工序可為例如費勁的(多)肽純化。根據本發明的省時間、迅捷的方法在活性物質為病毒抗原、病毒顆粒、病毒體或前面提到的任何部分的情況中尤其有利，因為可更迅速地提供對安全、高 品質疫苗的測試。這在流感的流行性或季節性爆發的情況下尤其有利，因為需要將流行性或季節性疫苗快速投放市場。通過應用根據本發明的方法，針對並同源於這些流感抗原的當前流行性或季節性株的特異性抗體能迅速產生並用於產生流感疫苗製備物。類似的情況可應用於其他疫苗製備物。進一步地，由於免疫可用合成的多聚核苷酸施行，合適動物被污染物免疫的風險基本被減少。因此，產生針對這些污染物的抗體的風險得以避免，或至少減少，由此避免了例如假陰性外來物質測試結果。這會顯著地增強所測試組合物的安全性和品質。
受試者還可用兩種或多種不同類型多聚核苷酸構建物進行免疫，每種類型帶有不同多聚核苷酸。被免疫的受試者為非-人受試者，如合適的動物，例如綿羊、山羊、兔、大鼠、小鼠、狗或豚鼠，優選地為兔、小鼠、豚鼠或大鼠，更優選地為兔。合適的動物的免疫可依照熟知的標準步驟施行。通常，可選地純化的多聚核苷酸構建物優選地通過大量的遞送方法被引入動物組織中，如使用標準皮下注射針注射鹽水中的多聚核苷酸構建物、基因槍遞送或氣動注射(pneumatic injection)。此外，遞送可通過局部應用的方法施行，或者可施行細胞轉染劑-介導的遞送。被免疫的動物之後產生特異於至少部分或整個表達的(多)肽或蛋白質的抗體。所產生的抗體存在於被免疫的受試者的血液中，並可通過技術人員熟知的標準步驟進行回收。還可能從被免疫的受試者中所收集的血液中製備血清樣品。抗 體可以為單克隆的或多克隆的，這取決於表達的(多)肽或蛋白質的性質。術語“單克隆抗體”在本發明的意義之內指的是具有相同抗原特異性的抗體，即，均對相同表位(抗原決定簇)特異的抗體。其意味著，如果表達的(多)肽對應於單個表位，那麼抗體在本發明術語之內為“單克隆抗體”。在表達的(多)肽或蛋白質包含超過一種表位元的情況下，由被免疫的動物產生的特異性抗體在本發明術語之內為“多克隆抗體”。
在特定時間段之後，例如在免疫後多至100天，通常多至70天或多至50天，優選地大約70天，由被免疫的動物產生的抗體可根據本領域技術人員熟知的方法獲得。優選地，對動物進行抽血並獲得含有抗體的血清樣品。在一個優選的實施方式中，要用於步驟a)的抗體可簡單地為獲自被免疫的動物的血清樣品。
在步驟b)之前，活性物質優選地通過抗體結合而被中和或失活。優選地，此結合為特異的。
術語“特異性結合”在本發明意義之內指的是根據本發明的抗體顯示出對於存在於待測組合物中的活性物質的特異性，並且，因此選擇性地結合於所述活性物質但不結合於潛在存在於待測組合物中的外來物質。在本發明一個優選的實施方式中，根據本發明的抗體專門地結合於所述活性物質而完全不結合於潛在存在的外來物質。在活性物質為如上文描述的抗原的情況下，抗體對活性物質的特異性結合還可能為交叉-反應，這意味著根據本發明的 抗體顯示出交叉-反應性。術語“交叉反應性”在本發明意義之內指的是特定抗體與兩種或多種具有共同或高度同源性的表位的抗原反應的能力。例如兩種或多種活性物質，或兩種或多種抗原，分別存在於待測組合物的情況就是這樣。
被中和的活性物質在本發明意義之內為與此特異性抗體相互反應的活性物質，例如，與特異性抗體形成複合物，因此其基本上不能再有任何作用。在一個優選的實施方式中，被中和的活性物質是完全失效的。失效的活性物質在本發明意義之內為例如不能施行其功能，如其藥學功能。還可能為當與活性物質-敏感性檢測細胞系接觸時或當施用於測試動物時，失效的活性物質不再能夠引起病原性效應。通過以上提到的各種測量，確保了偶發物質測試至少主要地不與活性物質本身產生應答。
在本發明一個優選的實施方式中，特異性抗體與病毒抗原或病毒顆粒，或者病毒抗原或病毒顆粒的只要一個組分反應，並因此破壞或抑制了其病原性，例如，其感染性和/或毒力。所述特異性抗體的中和效力可選地可在進行步驟b)之前進行測試。可進行本領域技術人員熟知的中和測試。這種中和測試的一個實例為將獲得的特異性抗體或含此特異抗體的血清和與特異性抗體交叉-反應的參考株混合。反應的參考株可隨後接著種於對參考株的感染敏感的檢測細胞系中，如Vero、MRC-5或MDCK細胞系。然後觀察這些檢測細胞系一段合適的時間，例如大約14天， 並檢查病原性效應的存在。另一個測試抗體中和效力的可能是測試通過測試蛋模型中的感染性而測試被中和的製備物的感染性(此測試在例如歐洲藥典2.6.16章中有所描述)。病原性效應為對於細胞生長或維持不利的作用，具體而言是與微生物和/或病毒感染相關的作用。病原性效應包括但不限於致細胞病變效應(CPE)、細胞破裂、生長抑制、蛋白質合成抑制或凋亡。CPE是細胞結構的可觀察變化，其可以隨細胞類型而變化，引起死亡，並且能根據本領域建立的知識進行確定。例如，一些病毒感染的最常見效應為形態學變化，如細胞變圓及脫離基質、細胞裂解、合胞體形成及內涵體形成。中和活性通過CPE減少和血凝素抑制，或者減少的紅細胞向被感染細胞的血球吸附而表徵。中和活性還通過對細胞上清進行血凝測試而表徵。
然而，這些中和測試為參考測試。這意味著一旦抗體中和效力對給定開發的系統進行顯示，此中和測試不必對此系統持續施行。
如果未發現測試的血清或抗體，分別地具有足夠的中和活性，可以分別進行關於載體設計、用於免疫的種屬、此DNA構建物或載體的施用劑量和途徑、免疫和血液收集日程以及中和效力測試的形式的進一步的優化。“足夠的中和效力”在本發明意義之內指的是抗體/活性物質複合物在施行合適的中和測試時不能引起可檢測的效應。
根據本發明的方法，步驟b)中分別確定外來或偶發物質的存在與否。這些測試可在成年小鼠、乳小鼠、豚 鼠中根據管理要求施行，例如根據歐洲藥典2005，2.6.16章(病毒種批)的要求。對於在鳥類組織中繁殖的病毒，鳥類病毒的測試如歐洲藥典2005，2.6.16章中所描述的而施行(病毒種批和病毒收集)。
進一步地，此構建物還可用於在如歐洲藥典，2005，2.6.16章(2.6.16.)描述的用待測組合物接種之前的動物測試系統的活性免疫。這會使得先前的種病毒中和不再需要，不會改變動物測試模型對污染物質應答的能力。這會進一步增加測試系統的穩健性，減少根據2.6.16在測試框架中使用的動物的數量，並顯著地減少依從2.6.16所需的時間.
優選地，在本發明上述實施方式中，抗體和活性物質不是使用相同多聚核苷酸(優選地DNA)構建物衍生而來的。多聚核苷酸構建物可用於不同的目的：產生針對活性物質的抗體用於根據本發明偶發物質測試，或生產製備性規模的活性物質，這意味著用於生產活性物質，例如病毒抗原或病毒顆粒的多聚核苷酸構建物不是用於產生中和或失活此活性物質的特異性抗體。
在本發明之內，詞句“不是衍生自使用相同多聚核苷酸構建物”指的是多聚核苷酸構建物在至少一種結構和/或功能性組分上有差異，例如，有關整個構建物的特定部分或已經在一個不同的系統中製備。例如，對技術人員已知的是多聚核苷酸構建物或載體，分別可在其含有的功能性元件方面有差異，取決於其預期為何種用途。如果載 體為例如，僅僅用於在合適的宿主細胞中分別擴增多聚核苷酸或插入片段，其應當至少包含允許載體和所包含的插入片段在宿主細胞中半-獨立複製的複製起點(ori)。此外，這些載體可能含有其他功能性元件，如多克隆位點(MCS)，其包括核苷酸突出用於插入片段的插入，或限制性酶共有位點，其允許多聚核苷酸的插入。如果需要插入片段的轉錄，那麼載體應當另外含有啟動子序列。然而，這些載體通常缺乏多聚核苷酸表達必須的功能性序列。在需要多聚核苷酸表達以引起增強的針對所表達多肽的抗體產生的情況下，載體另外包含多聚腺苷酸化序列，其在轉錄的前-mRNA末端產生多聚腺苷酸尾巴，保護mRNA不受核酸外切酶降解並確保轉錄及翻譯終止。進一步地，此多聚腺苷酸尾巴穩定mRNA的生產。此外，有利的是只有最短長度的不翻譯區(UTR)或完全沒有UTR，因為UTR含有可能有礙轉錄或翻譯的特異特徵。此外，這些載體還應當在mRNA中包含Kozak序列，其組裝核糖體以轉錄mRNA。
在存在於待測組合物中的活性物質為通過使用多聚核苷酸構建物產生的病毒抗原或病毒顆粒的情況下，從而病毒抗原或病毒顆粒如下產生：通過優選地不同於用於免疫合適的動物(即用於產生步驟a)的抗體，其優選地特異結合於用於免疫的多聚核苷酸構建物所包含的多聚核苷酸序列的表達產物)的多聚核苷酸構建物的多聚核苷酸構建物。例如，這些多聚核苷酸構建物可能在多聚腺苷酸序列、不翻譯區或啟動子區的存在上有差異，更優選地是在 多聚腺苷酸序列的存在上有差異。
如果另外地，用於生產活性物質的多聚核苷酸構建物不僅編碼此活性物質的序列，還編碼污染物的序列，那麼在用此多聚核苷酸構建物免疫受試者時，此污染物編碼序列與活性物質編碼序列在所述受試者中表達。這樣，被免疫的受試者會產生不僅對活性物質，而且對污染性(多)肽有特異性的抗體。因此，這些污染物-特異性抗體能中和污染物，因此導致假陰性測試結果。
然而，通過使用不同的多聚核苷酸構建物，在外來物質測試中避免了假陰性測試結果，因為沒有產生針對此污染性多肽的抗體。如上文描述的，所述多聚核苷酸構建物可在結構和/或功能性元件上有差異，取決於其預期用於何種目的：根據本發明，在多聚核苷酸用於產生特異性抗體情況下，優選地使用表達載體，因為需要在被免疫的受試者中表達編碼活性物質的至少一部分的多聚核苷酸。備選地，還可能是多聚核苷酸構建物在其各自編碼的多聚核苷酸方面相異：通過應用本發明，例如，用於免疫受試者的表達載體不必需攜帶編碼整個活性物質的多聚核苷酸序列。為在被免疫的受試者中產生特異性抗體，表達載體只攜帶編碼活性物質一部分，例如編碼活性物質的一個或多個保守區域的多聚核苷酸序列也是合適的。
進一步地，在本發明的一個優選的實施方式中，編碼活性物質的至少一部分的多聚核苷酸序列可進行密碼子優化，具體而言根據用於用多聚核苷酸構建物免疫的受 試者進行密碼子優化(見下文)。通過施行上文概述的修飾--使用不同結構和/或功能性元件、表達只編碼例如活性物質的一部分的多聚核苷酸序列及多聚核苷酸序列的密碼子優化--另外表達編碼污染物的序列的風險幾乎不存在。如果待測組合物要滿足高品質要求，例如用於藥物組合物如疫苗，這尤其有利。此外，上文-提到的多聚核苷酸修飾可能另外產生顯著改善的表達速率，因此產生增強的抗體生產，及因此增強的中和能力。
在一個進一步優選的實施方式中，多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列進行了密碼子優化，尤其根據用於用多聚核苷酸構建物免疫的受試者進行密碼子優化。如本領域技術人員已知的，各個特定氨基酸最少被一個密碼子，最多被六個密碼子編碼。之前的研究已經顯示編碼細胞的多肽的基因中密碼子的使用在種屬之間是有偏好的(Kanaya，S，Y.Yamada，Y.Kudo和T.Ikemura(1999)，“Studies of codon usage and tRNA genes at 18 unicellular organisms and quantification of Bacillus subtilis tRNAs：gene expression level and species-specific diversity of codon usage based on multivariate analysis.”，Gene 238：143-155)。遺傳密碼的簡並性為本領域技術人員提供了根據靶宿主細胞的密碼子偏好調整多聚核苷酸序列的可能性以及其他，這樣優化了所需要的本發明的抗原結合多肽的表達。本領域技術人員已知如何根據用多聚核苷酸構建物免疫的靶宿主細胞或生物體的密碼子偏好調整多 聚核苷酸序列。例如，如果被免疫的生物體為合適的動物如兔、綿羊、山羊、大鼠或小鼠時，多聚核苷酸序列可根據各動物的密碼子偏好調整。有一些針對生物體-特異性密碼子使用和生物體-特異性密碼子對使用而優化各基因設計的軟體工具(演算法)，例如CODA基因組的“Protein Translation Engineering® technologies”。
在本發明一個進一步優選的實施方式中，抗體用於中和或失活給定的活性物質，接著作為外來物質的病毒和/或細菌進行測試。這些測試的病毒和/或細菌能夠例如選自：肺炎病毒亞科，例如肺病毒屬，包括呼吸道合胞體病毒(RSV)；副黏液病毒科家族的麻疹病毒，例如麻疹病病毒；小核糖核酸病毒科的腸道病毒，如柯薩奇病毒(例如柯薩奇B5，埃柯病毒，A-D型腸道病毒和鼻病毒)；哺乳動物呼腸病毒科，具體而言是正呼腸病毒(例如哺乳動物呼腸病毒如1、2、3型呼腸病毒)和輪狀病毒；逆轉錄病毒科成員，例如正逆轉錄病毒亞科(如逆轉錄酶病毒)，副黏液病毒科家族的偏肺病毒如人偏肺病毒(HMPV)或1、2、3、4型副流感病毒；副黏液病毒科家族的腮腺炎病毒屬，如腮腺炎病毒；披膜病毒科，如風疹病毒；冠狀病毒科，如SARS冠狀病毒及其他人冠狀病毒，如冠狀病毒OC43、229E、NL63和HKU1；小核糖核酸病毒科家族的鼻病毒，例如如鼻病毒M-株；水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，也稱為2型人皰疹病毒(HHV3)；多瘤病毒科，如SV-40多瘤病毒、BK多瘤病毒和JC多瘤病毒；豬圓環病毒；豬小核糖核酸病毒，如豬水皰 病病毒(SVDV)和捷申-泰法病毒；細小病毒科成員，例如犬細小病毒(CPV)，博卡病毒或豬細小病毒；副流感病毒(PIV)；正黏液病毒科成員，包括A和B型流感病毒；副黏液病毒科成員，包括PIV-I、PIV-2和PIV-3；皰疹病毒科，如1、2型單純性皰疹病毒，6、7、8型人單純性皰疹病毒，巨細胞病毒和EB病毒；腺病毒科，例如腺病毒，包括人、猿、鳥腺病毒，如1型鳥腺病毒；鳥圓環病毒；鳥呼腸病毒科，具體而言是正呼腸病毒，如鳥呼腸孤病毒；乳頭狀瘤病毒科成員，包括人乳頭狀瘤病毒；黃病毒科成員，如西尼羅河病毒；以及雙核糖核酸病毒科，例如傳染性法式囊病毒，及/或其中抗體用於測試作為外來物質的細菌，例如衣原體，包括沙眼衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體；以及支原體。
在根據本發明一個進一步優選的實施方式中，在多聚核苷酸構建物中包含的多肽含有血凝素(HA)和/或神經氨酸酶(NA)編碼序列。血凝素可在例如流感病毒的表面上找到。其為抗原性糖蛋白，負責病毒結合於正感染的細胞。迄今，已知至少16種不同的流感HA抗原。這些亞型即所謂H1至H16。NA為切割神經氨酸的糖苷連接的酶。迄今，至少已知九種流感神經氨酸酶亞型。這些亞型可在例如本領域技術人員已知的資料庫，如PubMed資料庫中找到(例如http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccorc和http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1452 84465？ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Sequence.Sequence_ResultsPanel.Sequence_RVDocSum)。在一個優選的實施方式中，多聚核苷酸構建物單獨或相互組合包含任何這些HA和/或NA編碼序列。也可能多聚核苷酸構建物只含有這些序列的部分。優選地，多聚核苷酸構建物單獨或相互組合包含編碼H1、H2、H3、H5、H6、H7、N1、N2、N3或N7的序列的完整序列或一部分，優選地是H5。在一個進一步優選的實施方式中，多聚核苷酸構建物包含編碼H1N1、H2N2、H3N2、H6N1、H7N3或H7N7的序列或序列的部分，優選地包含編碼H5N1的序列或序列的部分。
在根據本發明的一個進一步優選的實施方式中，活性物質包含流感抗原，多聚核苷酸構建物包含具有與SEQ ID NO：1或2所示的核酸例如至少90%，優選地例如至少95%，最優選地例如100%的序列同一性的多聚核苷酸序列。這些多聚核苷酸序列進行密碼子優化以進行有效的表達，並由此在哺乳動物受試者中進行流感抗原的基於DNA載體的免疫概念，優選地對於流感HA和NA編碼序列中任何一種或二者，更優選地是分別與H5和N1相關的序列。多聚核苷酸構建物可還包括例如與上文提到的核苷酸序列(SEQ ID NO：1或2中顯示的核酸)的互補鏈雜交的多聚核苷酸序列，或為上文提到核苷酸序列的簡並物。術語“相雜交”或“雜交”描述了這樣的過程，通過此過程單鏈多聚核苷酸與互補多聚核苷酸鏈進行堿基-配對。在本發明的上下文中，術語“雜交”指的是在常規雜交條件下，尤其 在嚴謹的條件下，例如如Sambrook等人(2000)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY中描述的條件下的雜交。合適的嚴謹的條件包括溫度為35攝氏度-65攝氏度，0.9摩爾鹽溶液。嚴謹的雜交條件可包括以下條件：雜交緩衝液：7% SDS
250mM NaCl
250mM K-磷酸緩衝液pH 7.0
1mM EDTA
雜交溫度：58攝氏度-60攝氏度
雜交時間：過夜
洗滌緩衝液：(I)2 x SSC，0.1% SDS
(II)0.2 x SSC，0.1% SDS
洗滌溫度和時間：55攝氏度-60攝氏度下各自2x30min
上文描述的、具有與SEQ ID NO：1或2所示的核酸例如至少90%，優選地例如至少95%，最優選地例如100%的序列同一性的多聚核苷酸還包括此多聚核苷酸序列的片段、衍生物、類似物或部分。片段、衍生物、類似物或部分可能也都是天然發生的變異或突變，其中這些突變可能天然發生或通過例如靶向誘變而引入。此外，這些變異能進一步包括合成序列。
術語“片段”應當理解為多聚核苷酸序列的部分，其足夠長以編碼所描述的多肽之一。術語“衍生物”在此上下文中指的是與上文描述的多聚核苷酸序列在一個或數個位置不同的序列，但與這些序列有高度同源性。這裏同源性指的是至少40%的序列同一性，優選地為至少60%或70%的同一性，優選地至少80%、82%、84%、86%或88%的同一性，尤其優選地具有至少90%、92%、94%、96%或98%的同一性。從上文描述的核苷酸序列的變異是例如通過刪除、置換、插入或重組引起的。
為確定兩條氨基酸或核苷酸序列之間的同源(=同一性)性百分比，比對這兩條序列，比較在每個位置上的氨基酸或核苷酸。如果序列中一個位置被相同氨基酸或相同核苷酸所佔據，則分子在此位置為同源的(=同一的)。這兩條序列之間的同源性百分比為同一的共同位置的數量的函數(即，同源性=位置總數量中的同一的位置的數量x100)。
同源性是在總氨基酸或核苷酸序列區域中計算的。為了比較不同序列，大量基於不同演算法的程式對本領域技術人員可得。Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的演算法提供了尤其可靠的結果。對於序列比對和比較，可使用程式“PileUp”(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，5 1989：151 153)或“Gap”和“BestFit”[Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)以及Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))，包括在GCG套裝軟體內[Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)]。上文提到的序列同源性值作為百分比可通過“Gap”程式的方式在總序列區域上確定，作出以下調整：缺口加權：50，長度加權：3，平均匹配：10.000，平均錯配：0.000。這些調整能用作序列同源性分析的標準調整。
本發明還涉及含有編碼活性物質的至少一部分的序列的多聚核苷酸構建物用於產生特異性針對所述活性物質的抗體以測試以下任何條件的用途：
i)待測組合物中活性物質的存在與否
ii)組合物中任何外來或傳染性物質的存在與否，其中通過用所述多聚核苷酸構建物免疫受試者提供抗體，且其中活性物質被所述的抗體中和或失活。
根據本發明的多聚核苷酸構建物的用途允許提供對含有活性物質的組合物進行快速、有效並可靠的測試。通過使用由用多聚核苷酸構建物免疫受試者而提供的抗體，避免了用活性物質本身免疫受試者時可能出現的污染物。因此，使用發明的多聚核苷酸構建物避免了假陰性的測試結果。此外，能加快在各自的測試中使用的抗體的產生。這樣，測試變得更快速。這在如果待測組合物中的活性物質由病毒顆粒構成或衍生自病毒顆粒時尤其有利，因為疫苗投放的前置時間可能顯著減少。這對於基於細胞培養技術生產的疫苗尤其重要。
通常，通過使用包含編碼活性物質的至少一部分 的序列的多聚核苷酸構建物來產生特異性針對所述活性物質的抗體，組合物沒有任何活性表示抗體失活或中和了活性物質，且沒有進一步的抗原存在於待測組合物中。
對待測組合物之內給定活性物質沒有任何活性反應意味著組合物中存在的活性物質已經通過抗體與活性物質的特異性結合而被中和或失活了。被中和的活性物質與特異性抗體相互作用，例如，與抗體形成複合物，因此基本上不能再有任何效果，優選地，被中和的活性物質為完全失效的。失效的活性物質在本發明的意義之內為例如不再能施行其功能，如其藥學或免疫學功能。還可能是失活的活性物質在與活性物質-敏感性檢測細胞系接觸時不再能引起病原效應。抗體的中和效力可如上文描述的而測試。然而，被發現有活性的組合物仍然含有活性物質，因此，是有效的。
上文描述了多聚核苷酸構建物、活性物質、待測組合物和外來或傳染性物質，以及對合適受試者的免疫及活性物質的中和。優選地，活性物質為抗原，更優選地為病毒抗原或病毒顆粒，或者，活性物質包含病毒或病毒顆粒的至少一種組分，優選地，活性物質為流感病毒顆粒。優選地，待測組合物為來自從中生產活性物質的細胞培養物的樣品，或來自此細胞培養物的產物，還優選地待測組合物為藥物組合物，優選地為疫苗製備物或其中間產物。還優選地，待測組合物分別為種子病毒或含有種子病毒的組合物。
進一步優選地，外來或傳染性物質為如上文描述的病毒。
通過使用含有編碼活性物質的至少一部分的序列的多聚核苷酸構建物以產生特異性針對所述活性物質的抗體，例如可施行(陰性或陽性)對照測試。在這樣的對照測試中，具體而言關於活性物質(抗體針對的部分)是否在組合物中存在對組合物進行測試。為此，將通過用多聚核苷酸構建物免疫合適的受試者而提供的抗體與待測組合物接觸。所測試組合物在加入特異性抗體後不再顯示任何活性的情況下，此活性物質存在於該組合物中。可選地，在將待測組合物與此特異性抗體接觸之前，抗體的中和效力可如上文描述的進行測試。
在一個進一步優選的實施方式中，通過使用含有編碼活性物質的至少一部分的序列的多聚核苷酸構建物以產生特異性針對所述活性物質的抗體，例如可進行外源物質的測試。外源物質測試可如上文描述的施行。
本發明還涉及生產藥物組合具體而言為疫苗的過程，其中在生產過程中至少一個時間點施行根據如上文描述的用於測試組合物中外來物質的方法。外來物質測試可分別在藥物組合物生產或製備過程中任何階段施行。優選地測試可在種批或病毒收穫物上施行，更優選地測試在種批上施行。進一步地，還可一次施行或重複施行，例如，在細胞培養的開始和/或結束時或二者之間施行。外源物質測試還可在現成的疫苗製備物上施行，包括例如從一個產 品批次中測試一個或多個樣品。
可選地，施行處理藥物組合物(具體而言是疫苗或其中間產物)和/或從中衍生藥物組合物或疫苗的細胞培養物的步驟，這樣外來物質被移除和/或失活。適合於從各組合物或細胞培養物中移除外來物質的方法是本領域技術人員已知的，且包括化學和/或物理失活或移除方法，例如，過濾方法、吸附方法、化學處理例如甲醛或β-丙內酯，物理處理如加熱和/或電磁輻射(例如UV-C處理或γ射線輻射)，或諸如此類。本發明使用的方法其進一步的益處在於，一旦證實外來物質的存在，即能特異性調整外來物質移除步驟以移除和/或失活所述的外來物質。例如，如果存在於待測組合物中的外來物質被(可選地)鑒定，可使用特異性移除和/或失活方法，這些已知可以特別地移除和/或失活所述的外來物質。通過移除和/或失活所述外來物質，例如可避免丟棄全部組合物批次，因此節約時間和金錢。
進一步地，本發明涉及針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體的用途，所述多聚核苷酸構建物包含編碼活性物質的至少一部分的序列，其中抗體特異性結合於活性物質，用於純化所述活性物質，並且其中抗體和活性物質不是衍生自使用相同的多聚核苷酸構建物。術語“針對多聚核苷酸構建物的表達產物而產生的抗體”和“抗體和活性物質不是衍生自使用相同的多聚核苷酸構建物”在上文有所描述。如本文使用的，術語“純化”包括但不限於，親和純化，其通過利用蛋白質與其他已經固定 在固相支持物(例如，柱子)上的蛋白質(如抗體，如本文描述所產生)的親和力保留在柱子上而純化蛋白質並將其分離(例如，不同抗原的分離)。優選地，活性物質為病毒抗原，具體而言為流感抗原。使用根據本發明的抗體使得能夠快速、高度特異性地純化源自或代表需要純化的病毒株的病毒，因為用於純化的抗體是針對此病毒株的表達產物特異性產生的。
優選地，用於純化活性物質的抗體為如上文定義的抗體。進一步優選地是用於純化目的的抗體另外包括結合於固相的親和標籤。
進一步地，本發明涉及包含具有與SEQ ID NO：1或2所示的核酸例如至少90%，優選地例如至少95%的序列同一性的序列的多聚核苷酸。最優選地，多聚核苷酸具有如SEQ ID NO：1或2所示的序列。有關所述多聚核苷酸，參考上文的描述。
本發明還涉及包含具有與SEQ ID NO：1或2所示的核酸例如至少90%，優選地例如至少95%的序列同一性的序列的多聚核苷酸構建物。最優選地，多聚核苷酸構建物具有如SEQ ID NO：1或2中描述的序列。關於所述的多聚核苷酸，參考上文的描述。多聚核苷酸構建物也在上文有所描述。
本發明另一個方面提供原核或真核宿主細胞，其包含如上文所述的根據本發明的多聚核苷酸或包含所述多聚核苷酸的多聚核苷酸構建物。優選地，宿主細胞是用上 文-描述的本發明多聚核苷酸構建物進行穩定或暫態轉化。關於轉化步驟，注意到轉化可根據標準操作流程施行。然而，參考的是Sambrook等人(2000)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY。本發明另一個方面提供非-人生物體、轉基因動物及轉基因微生物體，其分別含有本發明的上文-描述的多聚核苷酸或上文-描述的載體或多聚核苷酸構建物。
優選地，本發明的宿主細胞或動物或微生物體表達併合成本發明的抗原-結合多肽。
這些宿主細胞可以為任何原核或真核細胞，優選地為微生物細胞，更優選地為細菌、酵母、真菌和藻類細胞。在微生物細胞中特別優選地為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)細胞、鏈黴菌屬(Streptomyces)細胞、畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)細胞，最優選地為大腸埃希氏菌細胞。
進一步地，本發明提供特異於由根據本發明的多聚核苷酸編碼的多肽的抗體，以及生產所述抗體的方法，其中方法包括以下步驟：a)提供本發明的多聚核苷酸構建物，以及b)用所述的多聚核苷酸構建物免疫合適的受試者，優選地為合適的非-人動物如小鼠、大鼠、山羊、綿羊、豚鼠或兔，更優選地為兔。
多聚核苷酸構建物及對合適受試者的免疫在上 文描述。這些抗體可通過技術人員已知的任何標準步驟進行回收。這些抗體可例如用於中和或純化特定抗原。
進一步地，本發明還涉及用於測試組合物中外來物質的分部套盒的用途，所述試劑盒包括a)含有編碼活性物質的至少一部分的序列的多聚核苷酸構建物，以及c)宿主細胞
關於術語外來物質、多聚核苷酸構建物、活性物質和宿主細胞，以及關於用於測試外來物質的方法，參考上文描述。
在一個進一步的實施方式中，本發明還涉及分部套盒，包括a)包含具有與SEQ ID NO：1或2所示的核酸至少90%，優選地至少95%，更優選地至少98%的序列同一性的序列的多聚核苷酸構建物，或包含如SEQ ID NO：1或2中描述的序列的多聚核苷酸構建物，以及b)宿主細胞。
關於術語活性物質、多聚核苷酸構建物和宿主細胞，參考上文描述。
包含具有與SEQ ID NO：1或2所示的核酸至少90%，優選地至少95%，更優選地至少98%的序列同一性的序列的多聚核苷酸構建物，或包含如SEQ ID NO：1或2中描述的序列的多聚核苷酸構建物用於轉化合適的宿主細胞，如細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞 或昆蟲細胞，優選地為細菌細胞如大腸桿菌細胞。轉化的宿主細胞在合適的培養基中培養，然後收集並裂解，並且回收多聚核苷酸構建物。如上文描述的，擴增的多聚核苷酸構建物然後用於免疫受試者。免疫的受試者反過來產生針對多聚核苷酸構建物的表達產物的抗體，例如在這種情況下針對為活性物質的至少一部分的蛋白質。抗體然後可用於測試包含至少一種活性物質的組合物中的外來物質，其中活性物質至少部分地由如下序列編碼，所述序列具有與SEQ ID NO：1或2所示序列至少90%，優選地至少95%，更優選地至少98%的序列同一性，或其中活性物質至少部分地由如SEQ ID NO：1或2中描述的序列編碼。
關於在組合物中測試所述外來物質的方法，參考上文描述。
以下附圖及實施例更詳細地闡述了本發明，然而其只為闡述性目的提出，不應理解為會以任何方式限制本發明的範圍。
實施例 1. 編碼HA和NA的多聚核苷酸及DNA構建物的製備
分別從流感病毒A/Viet Nam/1194/2004(H5N1)的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)蛋白質的已知序列製備DNA載體(編碼HA和NA的序列分別在PubMed資料庫中公開，見http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/145284463？ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.BEntrez.Sequence.Sequence_ResultsPanel.Sequence RVDocSum，和http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/145284406？ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Sequence.Sequence_ResultsPanel.Sequence_RVDocSum)。
如例如Roth，D.A.等人，“Translational Engineering and Synthetic Biology”，Landes Bioscience，2007中描述的，對HA和NA編碼序列進行電腦優化。具體地，HA和NA編碼序列的密碼子使用和密碼子-對使用根據家兔(Oryctolagus cuniculus)而優化。在上文說明書中描述的合理的同源性變異範圍之內，同樣地可對其他要通過所提供的HA和NA編碼序列免疫的受試者施行密碼子優化。上游5’非翻譯區也被優化以避免可能阻礙翻譯起始的不想要的二級RNA結構。將用CODA演算法優化的HA和NA基因組裝並克隆到pCMV載體中，所述載體可從大量供應者商購得到，如Clontech Laboratories，Inc.。兩種pCMV構建物都有以下特徵：- 巨細胞病毒(CMV)啟動子驅動的哺乳動物表達載體，其用於生產高水準RNA轉錄物，- 置於ATG起始密碼子前的Kozak共有序列以確保有效的核糖體結合，以及因此的最高水準的蛋白質翻譯，- 轉錄終止信號，poly(A)信號被置於基因末端以確保合適的轉錄終止。
使用限制性酶(Nhe I和Xba I)將CODA演算法優化的HA和NA基因亞-克隆至CMV啟動子驅動的載體中，分別命名為pCMV-HA和pCMV-NA。通過限制性酶消化和 DNA測序證實正確的序列。載體圖譜和DNA序列列於第3-6圖。
DNA構建物分開轉染入大腸桿菌細胞，從中製備主細胞庫(Master Cell Bank，MCB)。根據技術人員已知的標準方法就無菌性、噬菌體、質粒標誌物保持以及質粒鑒別測試MCB。
2. 質粒生產
從大腸桿菌培養物中進行大批量質粒生產，隨後進行質粒分離、純化和鑒定。根據技術人員已知的標準方法就DNA完整性、OD 260/280比、瓊脂糖凝膠分析、限制性分析、DNA序列、污染性蛋白質、內毒素測試純化的大批量質粒。
3. 動物的免疫及抗血清的產生
隨後通過免疫2組各6隻兔產生抗血清。在研究第0、28和56天用0.5ml DNA材料(即質粒)接種每隻兔。每次劑量由1.0mg總DNA構成。一組兔用單價HA DNA免疫，另一組兔用HA和NA DNA的二價1：1混合物免疫。在第0、28、35、42和56天從所有動物中收集免疫前、後的血液樣品。在研究第70天，放血處死所有動物。所有兔皆為健康、活力並在整個觀察期沒有任何臨床象徵顯示劑量或測試樣品相關問題。所有兔為健康，並在整個研究階段存活，並且不顯示任何對抗原的不利反應。
獲得的含有所產生的抗體的血液可被激發，以例如獲得含有特異性中和抗體的血清樣品，或獲得特異於質 粒/載體表達產物的分離的抗體。
4. 中和測試
可以從收集的血液中製備血清樣品，並施行針對流行參考株NIBRG-14的工作種子病毒(Working Seed Virus，WSV)的中和效力測試。NIBRG-14為用於疫苗製備的重組A/Viet Nam/1194/2004-樣株系；該株系可獲自NIBSC(見http：//www.nibsc.ac.uk/和http：//www.nibsc.ac.uk/flu_site/pandemic.html)。這些血清中和測試可如下文進行：將2倍稀釋的WSV與12個最終兔血的一系列四組3倍稀釋液混合。這些血清稀釋液可在分開的燒瓶中製備，並在燒瓶中輕輕搖晃溶液以均質化和包被瓶邊緣。可直接在血清稀釋液中用槍頭吹吸WSV，所得的稀釋液可輕柔地均質化。然後，可將稀釋液轉移到新的乾淨燒瓶中，並通過搖晃板上輕柔搖晃在37℃孵育2小時。
接種細胞前一天，準備含有每種細胞系的75cm2燒瓶：6瓶用於中和的WSV，一瓶用於陽性和抑制對照，一瓶用於陰性對照。
陽性對照
陽性對照對應於接種大約1000 TCID50(“組織培養感染劑量”；會在50%細胞培養物中產生病理學變化的病原性物質的量)的人副流感3病毒。一個陽性對照可在第0天接種並用作第14天血細胞吸附和/或血凝測試的陽性對照。
抑制對照
靶標細胞可與待測樣品一同接種，先以大約1000 TCID50的人副流感3病毒入侵。
陰性對照
用於陰性對照，特異於各細胞系的稀釋液培養基可每瓶接種。此對照可在與待測樣品相同條件下進行處理。
接種
反應的，即潛在地被中和的WSV稀釋液可隨後接種在三個檢測細胞系上(Vero細胞(獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATTC)CCL-81；Yasumunra Y.等人，1962)，MRC-5細胞(獲自ATCC CCL-171；Jacobs J.P.等人，1970)和MDCK細胞(ECACC 84121903；S.H.Darby，1958))。3ml每種溶液(稀釋液培養基，待測樣品)可接種在用於潛在地被中和的WSV和對照的各自培養瓶中。37℃ +/- 2℃下70分鐘+/- 10分鐘後，可移除接種體。然後加入存活培養基以獲得20ml的終體積。培養瓶可在5+/-0.5% CO2下置於37℃ +/- 2℃。
接種的細胞在倒置顯微鏡下有規律地觀察14天，並就細胞病理效應(CPE)的存在和血凝活性進行檢查。中和效力可通過觀察CPE，通過血細胞吸附測試和通過血凝測試而檢測。
4.1 CPE觀察
細胞可在測試期間在倒置顯微鏡下有規律地觀察。
4.2 血細胞吸附測試
血細胞吸附測試可在測試期末進行(第14天)。單層細胞可用PBS緩衝液洗滌一次或兩次。接著，將於PBS中製備的含有0.4%三種類型(人、Hartley豚鼠和公雞)紅細胞的溶液加入各孔。紅細胞吸附是病毒感染特異性的，並且當一種紅細胞類型固定於細胞上時為陽性的。在於5℃ +/- 3℃下孵育大約30分鐘之後，對細胞進行顯微鏡檢查。在第二次觀察之前，平板可接著在37℃ +/- 2℃下再孵育大約30分鐘。
4.3 血凝測試
第14天，可在用於血細胞吸附血凝測試的燒瓶中的細胞培養物上清上進行血凝測試。上清可通過低速離心回收和澄清。澄清的上清可接著置於6孔板。然後將於PBS中製備的含有0.25%三種類型(人、Hartley豚鼠和公雞)紅細胞的溶液加入各孔。在於5℃ +/- 3℃下孵育大約30分鐘之後，對細胞進行顯微鏡檢查。在第二次觀察之前，6孔板可接著在37℃ +/- 2℃下再孵育大約30分鐘。
使用特定細胞系，觀察到不存在病毒CPE且不存在特異性血細胞吸附和/或血凝活性，認為測試樣品沒有病毒污染物。
此外，可根據相同步驟測試48份過渡血液，除了只使用一種細胞系(MDCK)。結果可與使用失活重組A/Viet Nam/1203/2004-樣病毒(一種已知在雪貂中誘導針對A/Viet Nam/1194/2004的交叉反應抗體的病毒株)接種兔之後製備 的血清獲得的結果進行比較。
4.4 母雞受精卵
根據歐洲藥典第6版，2.6.16章，可使用母雞受精蛋施行血凝測試。
簡言之，可使用SPF(無特定病原體)蛋(蛋來源：Couvoir de Cerveloup，400，domaine de Cerveloup 38210 Vourey，France)，其從收到直至被孵育，一直保存在12℃ +/- 3℃下。孵育可在37℃ +/- 2℃、環境70%濕度下進行。
樣品製備
WSV可以用兔或綿羊抗血清進行中和。可在水性溶液中加入1%以避免細菌對蛋的污染。然後，可將樣品用合適的注射針注射入蛋。
卵的預-孵育
在收到時，預-孵育之前，可粗略觀察蛋，丟棄損壞的卵。然後，卵可在37℃下預-孵育9-11天。在預-孵育期末，可在冷光下觀察這些蛋以避免加熱，丟棄未受精蛋或沒有活的胚胎的蛋。
接種
對於分析待測樣品(潛在被中和的WSV)，可在孵育9-11天後經尿囊途徑接種30顆蛋，並且對於測試對照，可接種25顆蛋。
作為陰性對照，蛋可以用補充有抗生素的PBS(例如10顆蛋)，單獨未稀釋的抗血清(例如5顆蛋)，及單獨兩種類型綿羊抗血清(例如每種類型5顆蛋)進行接種。
作為血凝測試的陽性對照，可使用仙台病毒(未稀釋)。
可按如下方法進行接種： 在蛋殼消毒之後，可在殼上打孔，0.5ml待測樣品可經尿囊途徑接種於55顆蛋。可填充蛋殼的孔，蛋在37℃ +/-2℃下孵育7天。
在孵育末期，可在觀察後收集活胚胎中的尿囊液體。在觀察到死亡胚胎的情況下，可將各胚胎的液體分別儲存於<-70℃與5℃ +/-3℃之間(防止細菌污染)用於進一步研究。
血凝測試
在孵育期末，可按如下方法進行血凝測試：液體可通過離心(2500g，10分鐘)進行澄清，並將200μl液體分配到四個96孔板中(50μl每孔)以進行血凝測試。簡言之，在兩塊96孔板的孔中加入50μl含0.5%紅血球(豚鼠；購自Charles River Laboratory，France)的溶液，在另外兩塊96孔板的孔中加入50μl含0.5%紅細胞(母雞)的溶液。一半平板在5℃ +/-3℃下孵育，另一半則孵育於室溫下。在兩小時孵育後，檢查平板的血凝活性。
如果在從接種的蛋中收集的液體中沒有特異性血凝活性，則認為待測樣品沒有病毒污染。
5. 測試偶發/外來物質
中和血清然後可用於外來物質測試。這些測試可根據管理要求(歐洲藥典2.6.16章)施行。這些測試可在成年 小鼠、乳小鼠和豚鼠中根據管理要求，例如，根據歐洲藥典，2005，2.6.16章(病毒種批)施行。關於可在乳小鼠中施行的測試，注意到乳小鼠也可以在1-2天大時用待測組合物進行接種。對於在鳥組織中繁殖的病毒，如歐洲藥典2005，2.6.16章(病毒種批和病毒收集)中描述的施行鳥病毒測試。
5.1 成年小鼠：CD1小鼠
三組例如10隻成年CD1小鼠(15-20g，例如購自Charles River Laboratory)可至少適應新環境48小時。一組可以接受中和的血清(腦內(Ic)注射30μl，腹膜內注射(IP)500μl)，一組保留以防觀察期內發生死亡，一組可用作陰性對照。
可在測試期有規律地觀察小鼠(一天一次或兩次)。
如果在觀察期末(21天)80%來自接受中和的樣品組的小鼠存活，則在待測樣品中沒有病毒存在。
5.2 CD1乳小鼠
30隻1-2天大的小鼠(購自例如Charles River Laboratory)用中和的血清進行接種，10隻小鼠用作陰性對照。每隻乳小鼠接受10μl Ic.和100μl IP待測血清。可在測試期內有規律地觀察小鼠(一天一次或兩次)。
如果在觀察期末(14天)80%來自接受中和的樣品組的小鼠存活，則在待測樣品中沒有病毒存在。
5.3 Hartley豚鼠
9隻豚鼠中(350-450g，購自例如Charles River Laboratory，France)，5隻動物的一組可IP注射5000μl的待測樣品。4隻動物可作為陰性對照在42天的測試期內觀察。
如果在測試期沒有病毒感染的跡象(即，死亡或肉眼可見的病理)被檢測到，則沒有病毒存在於待測樣品中。
<110> 亞培生物股份有限公司(ABBOTT BIOLOGICALS B.V.)
<120> 外來物質測試
<130> WK 1280
<160> 4
<170> PatentIn版本3.3
<210> 1
<211> 1698
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 密碼子優化的血凝素(HA)抗原
<400> 1
<210> 2
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 密碼子優化的神經氨酸酶(HA)抗原
<400> 2
<210> 3
<211> 5687
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pCMV-HA的完整質粒DHA序列
<400> 3
<210> 4
<211> 5339
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pCMV-HA的完整質粒DHA序列
<400> 4

Claims (5)

  1. 一種用多聚核苷酸構建物以產生特異性地針對活性物質的抗體供用於測試任何以下條件的用途，該多聚核苷酸構建物包含編碼該活性物質的至少一部分的序列：i)待測組合物中活性物質的存在與否，ii)組合物中任何外來或傳染性物質的存在與否，其中該抗體係已經藉由以該多聚核苷酸構建物免疫受試者而提供，並且其中該活性物質被該抗體中和或失活。
  2. 一種用於生產藥物組合物的方法，包括在生產方法中至少一個時間點施行如請求項1中之用途。
  3. 一種針對多聚核苷酸構建物之表達產物而產生之抗體用於純化活性物質的用途，該多聚核苷酸構建物包含編碼該活性物質的至少一部分的序列，其中該抗體特異性地結合至該活性物質，其中該抗體和該活性物質不是衍生自使用相同的多聚核苷酸構建物。
  4. 一種部件套組用於測試組合物中外來物質的用途，該套組包括a)一多聚核苷酸構建物，其包含編碼一活性物質的至少一部分的序列，以及c)一宿主細胞。
  5. 一種部件套組，包括：a)一多聚核苷酸構建物，其包含編碼具有與SEQ ID NO：1或2所示之核酸至少90%的序列同一性的活性物質的至少一部分的序列，或包含如SEQ ID NO：1或2中描述的序列，以及b)一宿主細胞。
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