TW201827593A - 位點特異性核酸酶結合位點之重構 - Google Patents

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陳偉
史蒂芬 諾瓦克
萊恩 M. 李
山迪普 庫瑪
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美商陶氏農業科學公司
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Abstract

本公開說明係為用於修復位點特異性核酸酶結合位點的方法與組成，其藉由標靶整合和或標靶切除一或多段序列至一細胞。

Description

位點特異性核酸酶結合位點之重構 相關申請案之交叉引用
本發明請求2016年12月14日申請之美國臨時專利申請案第62/433845號之優先權權益，其內容係以全文引用方式併入本文中
電子遞交之以引用方式併入的資料
以全文引用之方式併入的為與本申請案同時提交且識別如下之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表：創建於2017年11月2日之命名為「78591-US-NP-20171004-Sequence-Listing-ST25.txt」的一個14.0KB ASCII(純文字)檔案。
本發明係有關於位點特異性核酸酶結合位點之重構。
生物科技已成為努力達成對於食物製造日益增加之全球需求的挑戰所不可或缺的工具。用於改進農業生產力諸如加強產量或經工程改造之害蟲抗性的傳統方式依賴於突變育種法或藉由轉形將新穎的基因導入作物品種之基因體中。兩種方法本質上皆非特異性且相對無效率。舉例而言，傳統的植物轉形方法傳遞整合至基因體之隨機位置的外源DNA。於是，為了鑑別並隔離具有所期待屬性之基因轉殖品系，必須產生數以千計之獨一無二的隨機整合事件並隨後篩選所期待之個體。因此，傳統植物性狀工程是一種費力、耗時且無法預測的任務。此外，這些整合的隨機天性使其難以預測是否 多效性係因為發生非故意之基因體破壞。因此，具有工程之基因或性狀之植物品系的產生、隔離與表徵分析係為一種具低機率性成功之極度勞力與成本密集的過程。
在哺乳動物細胞中，穩定的基因轉殖法與目標基因插入在基因治療與細胞工程上具有許多潛在應用。然而，目前的策略常常是沒效率且無特異性地將轉殖基因插入至基因體DNA中。無能控制基因體插入的位置會導致在整個群體中轉殖基因表現的高度變化程度肇因於在基因體之內的位點效應。此外，穩定之基因轉殖與轉殖基因之擴增的當前方法通常造成轉殖基因的物理損失、轉殖基因隨時間緘默化、經由整合一基因與一內源基因之內或相鄰之自主啟動子的插入誘變、染色體異常之產生與重組基因產物(由內源基因、插入之轉殖基因或兩者組成)的表達，和/或因需要載體長期抗性以提供穩定的轉殖基因表現因而有來自載體衍生之基因的持久表現而產生載體相關的毒性或體內免疫原性。
標靶基因改造克服生物系統中傳統實行的後勤挑戰，並因此在農業生物技術之基礎植物生物學研究與醫藥治療應用上的應用均為一長期但難以捉摸的目標。然而，除了藉由積極或消極的藥物選擇或事先經工程改造的限制位點之外，近期證實了在生物物種上的標靶基因體改造係為非常困難的。Terada等人(2002)Nat Biotechnol 20(10)：1030；Terada等人(2007)Plant Physiol 144(2)：846；D'Halluin等人(2008)Plant Biotechnology J.6(1)：93。
用於基因體DNA之標靶裂解的方法與組成先前已被描述過。舉例而言，此類標靶裂解事件可被用於誘導標靶誘變、誘導標靶刪除細胞DNA序列以及在一事先決定之染色體基因座上促進標靶重組。參見諸如美國專利發表20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20080182332與20060188987，以及國際專利發表2007/014275，為所有目的其內容係以全文引用方式併入本文中。
然而，仍需要用於標靶整合的組成與方法，包括用於標靶整合至生物體以在植物與其後代建立穩定、可遺傳之基因改造，以及用於標靶整合至哺乳動物細胞為了基因治療和細胞株發展之目的。
本公開說明提供用於製造一修復之位點特異性核酸酶結合位點之方法的方法與組成。於本實施例之方面，本方法包含提供一基因體，該基因體包括一位點特異性核酸酶結合位點之一第一拷貝、一介入聚核苷酸序列以及該位點特異性核酸酶結合位點之一第二拷貝，其中該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝與該位點特異性核酸酶結合位點之第二拷貝係為完全相同的。於本實施例之另一方面，本方法包含引入一位點特異性核酸酶，該位點特異性核酸酶係設計成在該位點特異性核酸酶結合位點結合並裂解。於本實施例之一進一步方面，本方法包含切割該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝。於本實施例之其他方面，本方法包含切割該位點特異性核酸酶結合位點之該第二拷貝。於本實施例之額外方面，本方法包含將該第一切割之位點特異性核酸酶結合位點與該第二切割之位點特異性核酸酶結合位點重新組合。於本實施例之進一步方面，本方法包含製造該修復之位點特異性核酸酶結合位點，其中該修復之位點特異性核酸酶結合位點與該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝係為完全相同的。於本實施例之進一步方面，本方法包含以該位點特異性核酸酶標靶針對該修復之位點特異性核酸酶結合位點。於本實施例之一些方面，本方法包含以該位點特異性核酸酶切割該修復之位點特異性核酸酶結合位點。於本實施例之額外方面，本方法包含引入一供體多核苷酸序列。於本實施例之一些方面，本方法包含在該切割之位點特異性核酸酶結合位點內整合該供體多核苷酸序列。於本實施例之進一步方面，本方法包含製造一包括該供體聚核苷酸序列穩定整合至該基因體內的基因體。
於進一步之實施例中，該位點特異性核酸酶可為鋅指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALEN核酸酶或其任何組合。於本實施例之一些方面，該鋅指核酸酶包括FokI核酸酶。於本實施例之其他方面，該FokI核酸酶包括高保真FokI核酸酶。於其他實施例，該介入聚核苷酸序列係被完全自該基因體移除。於本實施例之進一步方面，該介入核苷酸序列包括一轉殖基因。於該實施例之一些方面，該轉殖基因編碼一可篩選標記。於其他實施例中，該修復之位點特異性核酸酶結合位點係經由NHEJ介導之細胞過程修復。於一些實施例中，該修復之位點特異性核酸酶結合位點於長度上係大於6bp。於額外之實施例中，該位點特異性核酸酶結合位點之第一拷貝係位於該位點特異性核酸酶結合位點之第二拷貝的3,000bp至4,000bp內。於一些實施例中，該修復之位點特異性核酸酶不包括INDEL。於進一步之實施例中，該位點特異性核酸酶結合位點之第一拷貝、該介入聚核苷酸序列與該位點特異性核酸酶結合位點之第二拷貝包括一天然的基因體序列或真核生物之基因體內的基因轉殖序列。於其他實施例中，該介入核苷酸序列包括一編碼轉殖基因或基因表現卡匣的聚核苷酸。於一些實施例中，該位點特異性核酸酶結合位點係為迴文的。於額外之實施例中，該位點特異性核酸酶結合位點係為非迴文的。於進一步之實施例中，該第一位點特異性核酸酶結合位點與該第二位點特異性核酸酶結合位點係以直接重複方向排列。於其他實施例中，該該第一位點特異性核酸酶結合位點與該第二位點特異性核酸酶結合位點係以迴文方向排列。於進一步之實施例中，該修復之位點特異性核酸酶結合位點係被遺傳於後代。
本公開說明提供用於包括修復位點特異性核酸酶結合位點之植物的方法與組成。於一些實施例中，該植物包括一個基因轉殖事件。於其他實施例中，該基因轉殖事件包括一個農藝性狀。於額外之實施例中，該農藝性狀係選自由殺蟲劑抗性性狀、除草劑耐受性性狀、氮利用效率性狀、水分 使用效率性狀、營養品質性狀、DNA結合性狀、小RNA性狀、可篩選標記性狀或其任何組合所組成之群。於該實施例之一方面，該農藝性狀包括除草劑耐受性性狀。舉例而言，該除草劑耐受性性狀包括aad-1編碼序列。於其他實施例中，該基因轉殖植物製造出商品化產物。於本實施例之一些方面，該商品化產物係選自由蛋白質濃縮物、蛋白質分離物、穀物、膳食、麵粉、油或纖維所組成之群。於另一實施例中，該基因轉殖植物係選自由雙子葉植物或單子葉植物所組成之群。於本實施例之一些方面，該單子葉植物係為玉蜀黍(Zea mays)植物。
本公開說明提供用於切除轉殖基因之方法的方法與組成。本方法之一些方面包含切割一位點特異性核酸酶結合位點之一第一拷貝。本方法之其他方面包含切割一位點特異性核酸酶結合位點之一第二拷貝。本方法之進一步方面包含將該第一切割之位點特異性核酸酶結合位點與該第二切割之位點特異性核酸酶結合位點重新組合。本方法之額外方面包含製造一修復之位點特異性核酸酶結合位點，其中該修復之位點特異性核酸酶結合位點與該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝係為完全相同的。本方法之一些方面包含切除該轉殖基因，其中該轉殖基因係位於該位點特異性核酸酶之第一拷貝與該位點特異性核酸酶之第二拷貝之間。本方法之額外方面包含以該位點特異性核酸酶標靶針對該修復之位點特異性核酸酶結合位點。本方法之其他方面包含以該位點特異性核酸酶切割該修復之位點特異性核酸酶結合位點。本方法之進一步方面包含引入一供體多核苷酸序列。本方法之方面包含在該切割之位點特異性核酸酶結合位點內整合該供體多核苷酸序列。本方法之其他方面包含製造一包括該供體聚核苷酸序列穩定整合至該基因體內的基因體。
於進一步之實施例中，該位點特異性核酸酶可為鋅指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALEN核酸酶或其任何組合。於本實施例之一些方面，該 鋅指核酸酶包括FokI核酸酶。於一些實施例中，該供體聚核苷酸序列包括一轉殖基因。
本公開說明提供用於兩個核酸裂解位點之細胞修復之方法的方法與組成。本方法之進一步方面包含切割一位點特異性核酸酶結合位點之一第一拷貝。本方法之其他方面包含切割一位點特異性核酸酶結合位點之一第二拷貝。本方法之一些方面包含將該第一切割之位點特異性核酸酶結合位點與該第二切割之位點特異性核酸酶結合位點重新組合。本方法之額外方面包含製造一修復之位點特異性核酸酶結合位點，其中該修復之位點特異性核酸酶結合位點與該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝係為完全相同的。本方法之進一步方面包含切除一位於該位點特異性核酸酶之第一拷貝與該位點特異性核酸酶之第二拷貝之間的轉殖基因。本方法之其他方面包含以該位點特異性核酸酶標靶針對該修復之位點特異性核酸酶結合位點。本方法之一些方面包含以該位點特異性核酸酶切割該修復之位點特異性核酸酶結合位點。本方法之額外方面包含引入一供體多核苷酸序列。本方法之進一步方面包含在該切割之位點特異性核酸酶結合位點內整合該供體多核苷酸序列。本方法之方面包含製造一包括該供體聚核苷酸序列穩定整合至該基因體內的基因體。
於一些實施例中，該位點特異性核酸酶係為鋅指核酸酶、TALEN核酸酶或CRISPR核酸酶。於一些實施例中，該供體聚核苷酸序列包括一轉殖基因。於進一步之實施例中，該細胞修復係發生於細胞週期之一階段期間。於額外之實施例中，該細胞週期之階段係選自由細胞週期第二期(G2)、細胞週期第一期(G1)、細胞週期DNA合成期(S期)、細胞週期有絲分裂期(M)與其任何組合所組成之群。
本公開說明提供用於將一第一與第二植物雜交以切除一轉殖基因之方法的方法與組成。本方法之進一步方面包含取得一第一植物，其中該 第一植物之基因體包括一位點特異性核酸酶。本方法之額外方面包含取得一第二植物，其中該第二植物之基因體包括一位點特異性核酸酶結合位點之一第一拷貝、該轉殖基因與該位點特異性核酸酶結合位點之一第二拷貝。本方法之一些方面包含將該第一與第二植物雜交。本方法之其他方面包含切割該特異性核酸酶結合位點之第一拷貝。本方法之進一步方面包含切割該位點特異性核酸酶結合位點之第二拷貝。本方法之方面包含將該第一切割之位點特異性核酸酶結合位點與該第二切割之位點特異性核酸酶結合位點重新組合。本方法之一些方面包含製造一修復之位點特異性核酸酶結合位點，其中該修復之位點特異性核酸酶結合位點與該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝係為完全相同的。本方法之進一步方面包含切除位於該位點特異性核酸酶之第一拷貝與該位點特異性核酸酶之第二拷貝之間的轉殖基因。本方法之其他方面包含以該位點特異性核酸酶標靶針對該修復之位點特異性核酸酶結合位點。本方法之一些方面包含以該位點特異性核酸酶切割該修復之位點特異性核酸酶結合位點。本方法之額外方面包含引入一供體多核苷酸序列。本方法之進一步方面包含在該切割之位點特異性核酸酶結合位點內整合該供體多核苷酸序列。本方法之方面包含製造一包括該供體聚核苷酸序列穩定整合至該基因體內的基因體。
於一些實施例中，該位點特異性核酸酶係為鋅指核酸酶、TALEN核酸酶或CRISPR核酸酶。於其他實施例中，本方法造成後代植物之製成，該後代植物包括該修復之位點特異性核酸酶。於進一步之實施例中，該供體聚核苷酸序列包括一轉殖基因。
本公開說明提供用於製造一修復之位點特異性核酸酶結合位點之方法的方法與組成。本方法之進一步方面包含提供一基因體，該基因體包括一位點特異性核酸酶結合位點之一第一拷貝、一介入聚核苷酸序列以及該位點特異性核酸酶結合位點之一第二拷貝，其中該位點特異性核酸酶結合位 點之該第一拷貝與該位點特異性核酸酶結合位點之第二拷貝係為完全相同的。本方法之其他方面包含引入一位點特異性核酸酶，該位點特異性核酸酶係設計成在該位點特異性核酸酶結合位點結合並裂解。本方法之一些方面包含切割該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝。本方法之一些方面包含切割該位點特異性核酸酶結合位點之該第二拷貝。本方法之進一步方面包含將該第一切割之位點特異性核酸酶結合位點與該第二切割之位點特異性核酸酶結合位點重新組合。本方法之額外方面包含製造該修復之位點特異性核酸酶結合位點，其中該修復之位點特異性核酸酶結合位點係可被該位點特異性核酸酶結合並切割。
本公開說明提供用於可操作地連接至一cry34Ab1編碼聚核苷酸之葉綠體導引胜肽序列的方法與組成。於一些實施例中，該葉綠體導引胜肽係為一合成之葉綠體導引胜肽。於其他實施例中，該葉綠體導引胜肽係為一TRAP 4葉綠體導引胜肽。於進一步之實施例中，該葉綠體導引胜肽係為一TRAP 8葉綠體導引胜肽。於額外之實施例中，該葉綠體導引胜肽係為一TRAP 12葉綠體導引胜肽。於一實施例中，該葉綠體導引胜肽序列係可操作地連接至一由SEQ ID NO：19組成之cry34Ab1編碼聚核苷酸。於另一實施例中，該葉綠體導引胜肽序列係可操作地連接至一由SEQ ID NO：20組成之cry34Ab1編碼聚核苷酸。於一進一步之實施例中，該葉綠體導引胜肽序列係可操作地連接至一由SEQ ID NO：21組成之cry34Ab1編碼聚核苷酸。於一實施例中，該可操作地連接至一cry34Ab1編碼聚核苷酸之葉綠體導引胜肽序列包括與SEQ ID NO：19之聚核苷酸序列有至少85%、87.5%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的聚核苷酸。於一實施例中，該可操作地連接至一cry34Ab1編碼聚核苷酸之葉綠體導引胜肽序列包括與SEQ ID NO：20之聚核苷酸序列有至少85%、87.5%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、99.5%或99.9%之序列一致性的聚核苷酸。於一實施例中，該可操作地連接至一cry34Ab1編碼聚核苷酸之葉綠體導引胜肽序列包括與SEQ ID NO：21之聚核苷酸序列有至少85%、87.5%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的聚核苷酸。
序列表
列於伴隨序列表之核酸序列係以核苷酸鹼基之標準縮寫字母顯示，如在37 C.F.R.§ 1.822所定義。所列出之核酸與胺基酸序列定義具有以所述方式排列之核苷酸與胺基酸單體的分子(即分別為聚核苷酸與多肽)。所列出之核酸與胺基酸序列亦各自定義包括以所述方式排列之核苷酸與胺基酸單體的聚核苷酸與多肽的屬系。以基因編碼之重複性來看，當理解包含一編碼序列的一核苷酸序列亦描述了與參考序列組成之聚核苷酸編碼相同之多肽的聚核苷酸的屬系。當進一步理解，胺基酸序列描述了編碼彼多肽之聚核苷酸ORF的屬系。
每一核酸序列只顯示一股，但理解其互補股係被包括在任何參考的顯示的股。鑑於一級核酸序列之互補與反向互補必然由該一級序列揭露，一核酸序列之互補序列與反向互補序列係包含在對核酸序列之任何引用中，除非另外明確表示(或者從序列出現之環境來看是另外的)。此外，如本領域所理解，一RNA股之核苷酸序列係由其所轉錄自之DNA序列所決定 (但尿嘧啶(U)核鹼基取代胸嘧啶(T))，RNA序列係被包含在對編碼該RNA之DNA序列的任何引用中。
圖1係為pDAB105826之質體圖譜的示意圖。
圖2係為pDAB118231之質體圖譜的示意圖。
圖3係為pDAB118232之質體圖譜的示意圖。
圖4係為pDAB118233之質體圖譜的示意圖。
圖5係為藉由事件與類型(即被切除的與未被切除之控制相比較)描述葉組織中AAD-1蛋白質定量的圖。
圖6係為序列比對，其顯示所定序之兩基因轉殖事件內該位點特異性核酸酶結合位點之完美的修復。注意，標示為「pDAB118231、pDAB118232與pDAB118233」之序列係為預期的序列，而「B104[1]/pDAB105826.2.137.1：：pDAB118231.1.21.1=2521」和「B104[1]/pDAB105826.2.137.1：：pDAB118231.1.21.1=2522」和「B104[1]/pDAB105826.2.137.1：：pDAB118232.1.2.1=2524」和「B104[1]/pDAB105826.2.137.1：：pDAB118232.1,2.1=2525」和「B104[1]/pDAB105826.2.137.1：：pDAB118233.1.11.1=2539」和「B104[1]/pDAB105826.2.137.1：：pDAB118233.1.11.1=2541」係為與表6對應之序列事件。如比對中所顯示，被pDAB8291、pDAB8292與pDAB8293之eZFN2結合位點側接之aad-1基因表現卡匣序列係在該eZFN2結合位點被切除且該植物事件之修復之eZFN2結合位點序列與原始的eZFN2結合位點序列相比顯示沒有改變或INDELS。
圖7係為用於基因轉殖大豆製造之構築體的示意圖。
圖8係為pDAB122432之質體圖譜的示意圖。
圖9係為pDAB105984之質體圖譜的示意圖。
圖10係為A.pDAB105988與B.pDAB112797的標靶構築體、Excisor構築體與一假設被切割之產物的示意圖。
圖11係為對來自雜交pDAB105988{19}104/pDAB105988.19.104.3：：pDAB122423.3.84.1之F1植物之子集合描述所感興趣之三個基因：PAT、YFP與ZFN之結果(使用FokI探針/引子測得)的圖。箭號指出有YFP完全切除的事件，以沒有可偵測之qPCR訊號為根據。藉由對YFP可偵測之qPCR訊號之降低，橢圓指出有嵌合切除的事件。
本公開說明係相關於用於在一基因體中製造位點特異性核酸酶結合位點的方法與組成，諸如來自植物、細菌或哺乳動物細胞之基因體。將包含用於一或多個核酸酶(如ZFN)的一插入聚核苷酸標靶整合至該基因體內。典型地，該位點特異性核酸酶結合位點側接一聚核苷酸序列。將插入聚核苷酸標靶整合至基因體內之後，將合適之核酸酶引入至細胞中。於一些實例中，一外源性序列亦被引入用以插入於細胞之基因體內的該細胞中。
於某些實施例中，該位點特異性核酸酶包括一或多個ZFN、CRISPR或TALE。由該位點特異性核酸酶造成之辨識結構域的裂解通常導致該辨識結構域的修飾以包含插入與刪除(如INDELS)，其造成該辨識結構域更改至該位點特異性核酸酶結合位點無法被最初製造雙股斷裂的位點特異性核酸酶再切割的程度。這需要發展用於該被修改之辨識結構域之後續裂解循環之新的位點特異性核酸酶；一個耗時且費用昂貴的企圖。發展產生完美修復被位點特異性核酸酶切割之辨識結構域的方法提供顯著益處。舉例而言，重新組合識別序列之結合位點容許該相同位點特異性核酸酶被再配置成結合並裂解該辨識序列。更重要地，其促成基因轉殖設計的系統性方法，這樣，相同的獨特標靶位置可被使用並再重新使用以將基因切割掉或以用於堆疊在該識別序列鄰近處內的額外基因為標靶。此外，此方法可簡化由依賴位點特異性核酸酶之雙股斷裂所驅動之堆疊至單一基因座的策略。
一般事項
除非另有說明，本文揭示之方法的實踐以及組成的準備與使用採用分子生物學、生物化學、染色質結構與分析、計算化學、細胞培養、DNA重組以及本領域技術範圍內之相關領域的慣用技術。這些技術係被完 整地解說於文獻中。參見諸如Sambrook等人Molecular Cloning：A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Second edition-1989與Third edition-2001；Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987以及週期性更新；METHODS IN ENZYMOLOGY系列，Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999；以及METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker編)Humana Press,Totowa,1999。
定義
在本申請案通篇使用了許多術語。為了對本說明書及申請專利範圍(包括欲給出此類術語之範疇)提供清楚且一致的理解，提供了以下定義。
如本文中所用，除非上下文另外明確且不含糊地指出，否則冠詞「一/一個」及「該」係包含複數個提及物。
術語「核酸」、「聚核苷酸」與「寡核苷酸」係可交換使用且係指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，以線性或環狀構型，且為單或雙股形式。出於本公開說明之目的，這些術語不能被解釋為限制一聚合物的長度。該術語可包含天然核苷酸之已知類似物，以及在鹼基、糖和/或磷酸部份(例如硫代磷酸主鏈)被修飾的核苷酸。一般而言，特定核苷酸之類似物具有相同鹼基配對特異性；即A之類似物與T鹼基配對。
術語「多肽」、「胜肽」與「蛋白質」係可交換使用且係指胺基酸殘基的聚合物。該術語亦應用至一或多個胺基酸係為相對應之天然胺基酸之化學相似物或修飾衍生物的胺基酸聚合物。
「結合」係指巨分子之間(例如一蛋白質與一胺基酸之間)序列特異性、非共價交互作用。並非所有結合交互作用之成份需為序列特異性(例如與DNA主鏈之磷酸殘基接觸)，只要該交互作用作為整體係為序列特異性。此交互作用通常以10-6M-1或更低的解離常數(Kd)為特點。「親和力」係指結合的強度；親和力增加與較低的Kd相關。
一「結合蛋白質」係為一可與另一分子結合的蛋白質。結合蛋白質可結合至諸如DNA分子(DNA結合蛋白質)、RNA分子(RNA結合蛋白質)和/或蛋白質分子(蛋白質結合蛋白質)。就蛋白質結合蛋白質而言，其可結合至其自身(以形成均二聚體、均三聚體，諸如此類)，且/或其可結合至不同蛋白質之一或多個分子。結合蛋白質可具有一種類型以上的結合活性。舉例而言，鋅指蛋白具有DNA結合、RNA結合以及蛋白質結合活性。
「鋅指DNA結合蛋白質」(或結合結構域)為經由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之一種蛋白質或一種較大蛋白質內的結構域，其係為該結合結構域內其結構通過鋅離子配位而被穩定化之胺基酸序列區域。術語鋅指DNA結合蛋白質常常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。
鋅指結合結構域可「經工程改造」以結合至一預定之核苷酸序列。用於工程改造鋅指蛋白之方法的非限制性實例係經設計及選擇。所設計的鋅指蛋白為自然界中不存在的蛋白質，其設計/組成大體上由合理準則產生。設計之合理準則包含應用取代法則及電腦化算法以處理現有ZFP設計及結合資料之資料庫儲存資訊中的資訊。參見諸如美國專利案第6,140,081、6,453,242以及6,534,261號；亦參見WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536以及WO 03/016496。
「被選擇的」鋅指蛋白係為未於自然界發現的蛋白質，其主要從諸如噬菌體顯示、交互作用誘捕或雜交選擇之經驗過程製造。參見諸如US5,789,538、US 5,925,523、US6,007,988、US6,013,453、US 6,200,759、 WO95/19431、WO96/06166、WO98/53057、WO98/54311、WO00/27878、WO01/60970、WO01/88197以及WO02/099084。
「鋅指核酸酶」(ZFN)係通常包括裂解結構域(或裂解半結構域)與一鋅指結合結構域的鋅指蛋白。ZFN可作為蛋白質、作為編碼這些蛋白質之聚核苷酸或是作為多肽與多肽編碼聚核苷酸組合被引入。鋅指核酸酶通常隨著裂解半結構域之聚合後以二聚體蛋白質作用。已描述專性異二聚體ZFN可組合以形成一活性的核酸酶，其中該ZFN單體結合至「左」與「右」辨識結構域。參見例如美國專利公開案第2008/0131962號。鋅指結合結構域可為一典型的(C2H2)鋅指或一非典型的(例如C3H)鋅指。此外，鋅指結合結構域可包括一或多個鋅指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多個鋅指)，且可經工程改造以結合至在該插入位點內之任何序列。在細胞中有此融合蛋白質將導致該融合蛋白質結合至其結合位點並在該插入位點內裂解，此造成外源性序列之整合。
術語「序列」係指任意長度的核苷酸序列，其可為DNA或RNA、可為線性、環狀或分支且可為單股或雙股。術語「供體序列」係指插入至一基因體中的一核苷酸序列。供體序列可為任何長度，例如長度在2和10,000核苷酸之間(或他們之間或之上的任何整數)，較佳的係長度在約100與1,000核苷酸之間(或他們之間的任何整數)，更較佳的係長度在約200與500核苷酸之間。
「同源的、不相同序列」係指一第一序列與一第二序列享有一程度的序列一致性，但其序列並未與該第二序列完全相同。舉例而言，包含突變基因之野生型序列的一聚核苷酸與該突變基因係為同源但不相同的。於某些實施例中，兩序列之間的同源性程度係足以容許他們之間運用常態的細胞機制的同源重組。兩同源但不相同的序列可為任何長度且其非同源性程度可能小至一單一核苷酸(例如藉由標靶同源性重組以修正基因點突變)或大 至10或更多個千鹼基(例如用於將基因插入染色體上事先決定之異位位點)。包括同源之不相同序列的兩聚核苷酸不需是相同的長度。舉例而言，可使用介於20和10,000核苷酸或核苷酸對的外源性聚核苷酸(即供體聚核苷酸)。
用於測定核酸與胺基酸序列一致性的技術係為本領域所已知的。這些技術通常包含測定用於基因之mRNA之核苷酸序列和/或其所編碼之胺基酸序列以及比較這些序列至二級核苷酸或胺基酸序列。基因序列亦能以這種方式測定與比較。一般而言，一致性係指兩聚核苷酸或多肽序列分別地準確的核苷酸對核苷酸或胺基酸對胺基酸對應。兩個或多個序列(聚核苷酸或胺基酸)可藉由測定其百分比一致性相比較。不論是核酸或胺基酸序列，兩序列之百分比一致性係為兩比對之序列之間準確符合的數目除以較短之序列的長度並乘以100。Smith and Waterman,ADVANCES IN APPLIED MATHEMATICS 2：482-489(1981)之局部同源性演算法提供一對核酸序列的近似比對。藉由使用評分矩陣可將此演算法應用至胺基酸序列，該評分矩陣係由Dayhoff,ATLAS OF PROTEIN SEQUENCES AND STRUCTURE,M.O.Dayhoff編，5 suppl.3：353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA所發展，並被Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)正規化。Genetics Computer Group(Madison,WI)在「BestFit」工具應用中提供以此演算法測定序列之百分比一致性的一示例性運用。用於計算序列之間之百分比一致性或相似性的合適程式係普遍為本領域所知，舉例而言，另一比對程式係為BLAST使用其預設參數。聚例而言，BLASTN與BLASTP可用以下預設參數使用：基因編碼(genetic code)=標準(standard)；篩選(filter)=無(none)；股(strand)=兩者(both)；截止值(cutoff)=60；期望值(expect)=10；矩陣(Matrix)=BLOSUM62；描述(Descriptions)=50序列(sequences)；排序依(sort by)=高評分(HIGH SCORE)；資料庫(Databases)=非多餘(non-redundant),GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。可在網路上找到這些程式的詳情。關於此處所述之序列，所期望之序列一致性的程度係大致為80%至100%以及他們之間的任何整數值。通常序列之間的百分比一致性係為至少70-75%，較佳的80-82%，更較佳的85-90%，甚至更較佳的92%，仍是更較佳的95%，以及最較佳的98%序列一致性。
或者，可藉由在容許同源性區域間生成穩定雙鏈的條件下將聚核苷酸雜交、接著以單股特異性核酸酶碎解以及測定被碎解片段的大小，而測定聚核苷酸之間的序列一致性程度。當序列在所設定之分子長度上使用上述方法測定後存有至少約70%-75%、較佳的80-82%，更較佳的85-90%，甚至更較佳的92%，仍是更較佳的95%，以及最較佳的98%序列一致性，兩核酸或兩多肽序列係本質上彼此互為同源的。如本文所用，本質上同源亦指序列對一特定DNA或多肽序列顯示完全的一致性。如為特定系統所設定，可在例如嚴格條件下之Southern雜交實驗中鑑定本質上同源的DNA序列。設定合適的雜交條件係在本領域技術範圍之內。參見例如,Sambrook等人，見前文、NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION：A PRACTICAL APPROACH，編輯B.D.Hames與S.J.Higgins,(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。
兩核酸片段之選擇性雜交可測定如下。兩核酸分子之間的序列一致性程度影響該分子之間雜交事件的效率與強度。部份一致的核酸序列將至少部份地抑制與標靶分子序列完全相同的雜交。序列完全相同之雜交的抑制可使用本領域所熟知之雜交測定法(例如南方墨點法(DNA)、北方墨點法(RNA)、溶液雜交或類似的，參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Second Edition,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)評估。此類測定法可使用多種程度之選擇性進行，例如使用嚴格性從低變化至高的條件。若採用低嚴格性條件，可使用缺乏部份程度之序列一致性的二級探針 (例如與標靶分子有少於約30%序列一致性的探針)評估非特異性結合的缺席，如此，於非特異性結合事件之缺席下，該二級探針將不會與該標靶雜交。
當使用基於雜交的偵測系統，選擇一與參考核酸序列互補之核酸探針，並接著藉由選擇適當的條件該探針與參考序列選擇性地彼此雜交或結合以形成一雙鏈分子。可在中度嚴格雜交條件下與參考序列選擇性地雜交的核酸分子通常在容許偵測長度至少10-14核苷酸與所選擇之核酸探針有至少約70%序列一致性之標靶核酸序列的條件下雜交。嚴格的雜交條件通常容許偵測長度至少10-14核苷酸與所選擇之核酸探針有至少約90-95%序列一致性的標靶核酸序列。當探針與參考序列有特定程度的序列一致性，對探針/參考序列雜交有用的雜交條件可被測定係為本領域所知(參見如NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION：A PRACTICAL APPROACH，編輯B.D.Hames and S.J.Higgins,(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。
用於雜交的條件對本領域技術人員而言係為熟知的。雜交嚴格度係指雜交條件對包含誤配核苷酸之雜交的不利程度，較高嚴格性相關於對誤配雜交耐受性較低。影響雜交嚴格度之因素係為本領域技術人員所熟知且包含但不限於溫度、pH、離子強度以及有機溶劑如甲醯胺和二甲亞碸的濃度。如同本領域技術人員所知，雜交嚴格度隨著溫度升高、離子強度降低以及溶劑濃度降低而增加。
關於用於雜交之嚴格條件，本領域技術人員熟知可運用多種相等的條件以建立一特定嚴格度，其係藉由改變例如以下的因素：序列的長度與性質、各種序列之鹼基組成、鹽與其他雜交溶液成份的濃度、雜交溶液中阻斷劑(例如聚葡萄糖硫酸酯和聚乙二醇)的存在與否、雜交反應溫度與時間參數以及改變洗滌條件。雜交條件之特定組合的選擇係依照本領域之標準 方法(參見如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,Second Edition,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)。
「重組」係指於兩聚核苷酸之間基因資訊的交換程序。出於本公開說明之目的，「同源重組(HR)」係指例如發生於細胞雙股斷裂之修復期間的此類交換的專門形式。這個程序需要核苷酸序列同源性，使用一「供體」分子予一「標靶」分子(即遭受雙股斷裂者)之模板修復，且係眾所周知為「非交叉型基因轉換」或「短徑基因轉換」，因其導致基因資訊從供體轉移至該標靶。不希望拘束於任何特定理論，此轉移可包含形成於破裂標靶與供體間之異雙鏈DNA的誤配更正和/或「合成依賴性股黏合」，其中該供體係用於再合成將成為該標靶之部份和/或相關程序的基因資訊。此專門的HR常常導致標靶分子之序列的改變，使得該供體聚核苷酸之部份或全部序列被合併入該標靶聚核苷酸中。
「重新組合」係指組合兩個結合位點以形成一單一結合位點。於一些實例中，該兩個結合位點係遭收重組以以形成該單一結合位點。
「裂解(cleavage)」係指DNA分子之共價主鏈的破裂。裂解可由多種方法起始包含但不限於磷酸二酯鍵之酵素的或化學的水解。單股裂解與雙股裂解均為可能的，且雙股裂解的發生可視為兩獨特單股裂解事件的結果。DNA裂解可導致產生鈍端或交錯端。於某些實施例中，融合的多肽係用於標靶雙股DNA裂解。
一「裂解結構域」包括一或多個具有DNA裂解催化活性的多肽序列。一裂解結構域可被包含於一單一多肽鏈或者裂解活性可為二或更多多肽之結合的結果。
一裂解半結構域係為一多肽序列，其與一第二多肽(或相同或相異)結合形成具有裂解活性(較佳地是雙股裂解活性)的一複合體。
「染色質」係為包括細胞染色體的核蛋白結構。細胞的染色質包括核酸、主要地DNA以及蛋白質，包括組蛋白與非組蛋白染色體蛋白質。大多數的真核細胞染色質係以核小體形式存在，其中一核小體核心包括與包括組蛋白H2A、H2B、H3與H4各兩個之八聚體結合之約略150鹼基對的DNA，以及在核小體核心之間延伸的連接子DNA(取決於生物體之不同長度)。組蛋白H1之分子通常與該連接子DNA結合。出於本公開說明之目的，術語「染色質」係意味包含所有種類之細胞核蛋白，原核生物與真核生物的都包含。細胞染色質包含染色體的染色質與游離染色質。
一「染色體」係為一包括細胞之基因體的所有或一部份的染色質複合體。細胞之基因體常常以其核型為特徵，其為包括該細胞基因體之所有染色體的集合。細胞之基因體包括一或多個染色體。
一「游離基因體」係為一複製的核酸、核蛋白複合體或包括非為細胞染色體核型一部分之核酸的其他結構。游離基因體之實例包含質體與某些病毒基因體。
一「可進入區域(accessible region)」係為細胞染色質內的一位點，在其中出現於核酸內之標靶位置可被辨識出該標靶位點之外源性分子結合。不希望拘束於任何特定理論，咸信可進入區域係為一未被包裝入核小體結構的區域。任何可進入區域之獨特結構常可藉由其對化學和酵素探針(例如核酸酶)的靈敏度偵測。
一「標靶位點」或「標靶序列」係為設定將被結合分子結合之一部分核酸的核酸序列，提供足以讓結合存在的條件。舉例而言，序列5’-GAATTC-3’係為用於EcoRI限制性核酸內切酶的標靶位點。
「外源性」分子係為不會正規地出現在一細胞中的分子，但可藉由一或多種基因的、生化的或其他方法引入至細胞中。「正規出現在該細胞」係相對於該細胞之特定發育階段與環境條件而定。因此，舉例而言，只 出現於肌肉之胚胎發育期間的分子相對於成體肌肉細胞係為一外源性分子。同樣地，藉由熱休克引入之一分子對於非熱休克細胞而言係為一外源性分子。外源性分子可包括例如一用於任何多肽或其片段之編碼序列、一不作用之外源性分子的可作用版本或正常作用之外源性分子的不作用版本。此外，外源性分子可包括來自其他物種的編碼序列，其在該宿主細胞係為異種同源基因。
除其他事項之外，外源性分子可為一小分子，例如以組合化學程序所產生者，或是一巨分子，諸如蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、醣蛋白、脂蛋白、多醣、以上分子之修飾衍生物或包括一或多個以上分子之任何複合體。核酸包含DNA和RNA，可為單股或雙股；可為線性、分支或環狀；且可為任何長度。核酸包含彼等可形成雙鏈以及三鏈形式之核酸。參見例如美國專利編號5,176,996與5,422,251號。蛋白質包含但不限於DNA-結合蛋白質、轉錄因子、染色質重塑因子、甲基化DNA結合蛋白質、聚合酶、修飾烷酶、去甲基酶、乙醯酶、去乙醯酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓樸異構酶、迴旋酶以及解旋酶。
外源性分子可與內源性分子為相同的分子類型，例如一外源性蛋白質或核酸。舉例而言，一外源性核酸可包括一感染病毒基因體、一被引入細胞之質體或游離基因體或一不正規地出現於細胞內的染色體。用於將外源性分子引入細胞內的方法係為本領域技術人員所知且其包含但不限於脂質介導轉移法(即脂質體，包含中性與陽離子脂質)、電穿孔法、直接注入法、細胞融合法、粒子轟擊法、磷酸鈣共沈澱法、DEAE-聚葡萄醣介導轉移法以及病毒載體介導轉移法。
相比之下，一「內源性」分子係為於特定環境條件下在特定發育階段中正規出現於特定細胞內的分子。舉例而言，一內源性核酸可包括一 染色體、一粒線體之基因體、其他胞器之葉綠體或一自然發生之游離核酸。額外之內源性分子可包含蛋白質，例如轉錄因子與酶。
如本文所用，術語「外源性核酸之產物」包含聚核苷酸與多肽產物兩者，例如轉錄產物(聚核苷酸如RNA)和轉譯產物(多肽)。
一「融合」分子係為一分子，其中二或更多個次單元分子被連接，較佳地是共價性地。該次單元分子可為相同化學類型的分子，或者可為不同化學類型的分子。融合分子之第一類型的實例包含但不限於融合蛋白質(例如一ZFP DNA結合結構域與一裂解結構域之間的一融合)和融合核酸(例如一編碼前述該融合蛋白質之核酸)。融合分子之第二類型的實例包含但不限於一形成三鏈之核酸與一多肽之間的一融合以及一次溝槽結合物與一核酸之間的一融合。
細胞中融合蛋白質之表現可由將該融合蛋白質遞輸至該細胞產生或是藉由將編碼該融合蛋白質之聚核苷酸遞輸至細胞，其中該聚核苷酸係被轉錄，且該轉錄本被轉譯，以生成該融合蛋白質。蛋白質在細胞中之表現亦可包含反式剪接、多肽裂解與多肽接合。用於將聚核苷酸與多肽遞輸至細胞的方法另說明於本公開說明之他處。
出於本公開說明之目的，「基因」包含編碼基因產物(參見下文)之DNA區域，以及調控基因產物之生成的所有DNA區域，無論這類調控序列是否鄰近編碼序列和/或轉錄序列。因此，基因係包含(但不一定限於)啟動子序列、終止子、轉譯調控序列(諸如核糖體結合位點及內部核糖體進入位點)、強化子、靜止子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附接位點及基因座控制區。
「基因表現」係指將包含於基因中之資訊轉換成基因產物。基因產物可為基因之直接轉錄產物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核糖核酸酶、結構性RNA或任何其他類型之RNA)或藉由mRNA轉譯所產 生之蛋白質。基因產物亦包含藉由諸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化及編輯之方法所修飾的RNA，以及藉由例如甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、豆蔻醯化及糖基化所修飾的蛋白質。
基因表現之「調控」係指基因活性的改變。表現之調控可包含但不限於基因活化與基因抑制。
「植物」細胞包含但不限於單子葉或雙子葉植物。單子葉植物之非限制性實例包含穀類植物諸如玉蜀黍、水稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、鳳梨、洋蔥、香蕉和椰子。雙子葉植物之非限制性實例包含菸草、番茄、向日葵、棉花、甜菜、馬鈴薯、萵苣、甜瓜、大豆、芥花(菜籽)和苜蓿。植物細胞可來自該植物之任何部位和/或來自植物發育之任何階段。
一「感興趣之區域」係為細胞染色質之任何區域，諸如一基因或鄰近一基因或之內的非編碼序列，於其中期望結合至一外源性分子。結合可以是為了標靶DNA裂解和/或標靶重組之目的。感興趣之區域可出現於例如染色體、游離基因體、胞器基因體(如粒線體、葉綠體)或感染病毒基因組中。感興趣之區域可在基因之編碼區域之內、在轉錄之非編碼區域(如前導序列、尾隨序列或內含子)之內或在編碼區域之上游或下由之非轉錄區域之內。感興趣之區域長度可小至一單一核苷酸對或上至2,000核苷酸對，或任何整數值之核苷酸對。
術語「操作性的連接」與「操作性地連接」(或「可操作地連接」)可互換使用，參照兩個或更多組件(諸如序列元件)之並列，在其中該組件係被排列成兩組件都可正常作用並容許至少其中一組件可介導至少一個對另一組件施加之功能的可能性。舉例說明，若轉錄調控序列回應一或多個轉錄調控因子之存在與否而控制編碼序列之轉錄程度，該轉錄調控序列，諸如啟動子，係可操作地連接該編碼序列。一轉錄調控序列一般都與一編碼 序列以順式可操作地連接，但不需與其直接相鄰。舉例而言，一強化子係為可操作地連接至一編碼序列的一轉錄調控序列，即使他們非為鄰近的。
關於融合多肽，術語「操作性地連接」可指每一組件與其他組件連接時與未連接時完成相同功能。舉例而言，對於一融合多肽，其中一ZFP DNA結合結構域係融合至一裂解結構域，若在該融合多肽中該ZFP DNA結合結構域部分可結合其標靶位點和/或其結合位點而該裂解結構域可在該標靶位點之鄰近裂解DNA，則該ZFP DNA結合結構域與該裂解結構域係為操作性的連接。
一蛋白質、多肽或核酸的一「功能片段」係為其全部序列並未與該全長蛋白質、多肽或核酸完全一致但仍保有與該全長蛋白質、多肽或核酸相同之功能的一蛋白質、多肽或核酸。功能片段與可具有比其相對應之天然分子更多、更少或與之相同數目的殘基，和/或可包含一或多個胺基酸或核苷酸取代。用於測定核酸(如編碼功能、與另一核酸雜交的能力)功能的方法係為本領域所熟知。同樣地，用於測定蛋白質功能的方法係為眾所周知的。舉例而言，多肽之DNA結合功能可由例如濾膜結合、電泳位移率或免疫沈澱檢測法測定。DNA裂解可由凝膠電泳法檢測。參見Ausubel等人，見前文。一蛋白質與另一蛋白質交互作用的能力可藉由例如共免疫沈澱法、雙雜交分析或遺傳性的和生化的互補作用測定。參見例如Fields等人(1989)Nature 340：245-246；U.S.Patent No.5,585,245以及PCT WO 98/44350。
結合位點
公開說明於本文之一些實例中係為用於修復被位點特異性核酸酶所標靶之聚核苷酸序列的方法，以便所得之修復的聚核苷酸序列與該聚核苷酸序列的第一複本一致。該所得之聚核苷酸序列在隨後的實驗中可被該位點特異性核酸酶再標靶針對。這樣的方法提供優勢給本領域之技術人員，例 如不需要提出新的位點特異性核酸酶之設計與發展，因此減少與發展用於聚核苷酸序列裂解之新的位點特異性核酸酶相關的費用與時間。此外，不必要在構築體內引入額外的插入結合位點，因為對於標靶供體或基因或其他調控元件之切除而言只需要一單一核苷酸結合位點。
進一步公開說明於本文之一些實例中係為用於修復被位點特異性核酸所標靶之聚核苷酸序列的方法，以便所得之修復的聚核苷酸序列可被該位點特異性核酸酶辨識、結合以及裂切割。所得之聚核苷酸序列在隨後的實驗中可被該位點特異性核酸酶再標靶針對。這樣的方法提供優勢給本領域之技術人員，例如不需要提出新的位點特異性核酸酶之設計與發展，因此減少與發展用於聚核苷酸序列裂解之新的位點特異性核酸酶相關的費用與時間。此外，不必要在構築體內引入額外的插入結合位點，因為對於標靶供體或基因或其他調控元件之切除而言只需要一單一核苷酸結合位點。
被位點特異性核酸酶所標靶之該聚核苷酸序列可被描述為一獨特的結合位點、為一位點特異性結合位點、為一標靶位點為一標靶序列、為一結合位點或為一插入位點。亦即，該聚核苷酸序列包括多個鋅指核酸酶(ZFN)結合位點，使得當與合適之ZNF對結合時，該結合位點在該ZFN之標靶位點之間被切割。然而，在其他方面，該聚核苷酸序列包括一TALEN結合序列，使得當與合適之TALEN核酸酶結合時，該位點在該TALEN核酸酶之標靶位點之間被切割。在進一步方面，該聚核苷酸序列包括一CRISPR結合序列，使得當與合適之CRISPR核酸酶結合時，該位點在該CRISPR核酸酶之標靶位點之間被切割。通常，該聚核苷酸序列包括位點特異性核酸酶結合序列，使得當與合適之位點特異性核酸酶結合時，該位點在該位點特異性核酸酶之標靶位點之間被切割。
該標靶位點包含未於其所整合至之細胞之基因體內發現的聚核苷酸序列。因此，減少或消除在基因體內發生不必要的裂解。對鋅指核酸酶 而言該標靶位點通常是成對的以便鋅指核酸酶形成同源二聚體或異源二聚體以在合適位點裂解。
插入位點可含只被同源二聚體結合的標靶位點、只被異源二聚體結合的標靶位點或一被同源與異源二聚體結合之標靶位點的組合。因為一或多項下述理由可在一些情況下使用同源二聚體結合之標靶位點：遞輸一ZFN可能比二個更有效率、同源二聚化減少因ZFN表現不相等引起之化學計量不相等的問題、減少來自在標靶位點外裂解的毒性、當使用CCHC(非典型)鋅指結構域時可能被破壞之同源二聚體為一半和/或獨特可被標靶之位點的總數可被擴增。
一標靶位點不必要是用於鋅指核酸酶之三個核苷酸的倍數係顯而易見的。舉例而言，在發生交叉股相互作用之情況中(參見例如美國專利6,453,242及WO 02/077227)，多指結合結構域之一或多個個別鋅指可結合至重疊的四聯體亞位點。因此，三指蛋白質可結合10-核苷酸序列，其中第10核苷酸係為被末端指結合之四聯體的部分，四指蛋白質可結合13-核苷酸序列，其中第13核苷酸係為被末端指結合之四聯體的部分，諸如此類。
多指結合結構域中之個別鋅指之間的胺基酸連接子序列的長度與性質亦影響與標靶序列之結合。舉例而言，多指結合結構域中之相鄰鋅指之間存在所謂「非典型連接子」、「長連接子」或「結構性連接子」可允許該等鋅指結合至不緊鄰之亞位點。此類連接子之非限制性實例係被述於例如美國專利編號6,479,626與WO01/53480中。因此，鋅指結合結構域之標靶位點中的一或多個亞位點可彼此相隔1、2、3、4、5個或更多個核苷酸。只是提供一個實例，四指結合結構域可結合至13-核苷酸標靶位點，該標靶位點的序列中包括兩個連續3-核苷酸亞位點、一個介入核苷酸以及兩個連續三聯體亞位點。
序列(例如標靶位點)之間的距離係指如自彼此最接近的序列的邊緣所量測兩個目標位點之間介入的核苷酸數或核苷酸對數。
於某些實施例，其中裂解係取決於兩個鋅指結構域/裂解半結構域融合分子與各別目標位點的結合，該兩標靶位點可在相對的DNA股上。於其他實施例中，兩標靶位點皆在同一DNA股上。
於其他實施例中，側接該介入聚核苷酸序列之標靶位點係被安排成直接重複。於本實施例之一些方面，兩標靶位點係皆位於該有義股上。於本發明之一些方面，一標靶位點係位於該有義股上且該第二標靶位點係位於該反義股上。於本實施例之其他方面，一標靶位點係位於該介入聚核苷酸序列之上游且係以2、3、4、5、6或更多標靶位點之多重複本提供。於本實施例之進一步方面，一標靶位點係位於該介入聚核苷酸序列之下游且係以2、3、4、5、6或更多標靶位點之多重複本提供。
於額外之實施例中，側接該介入聚核苷酸序列之標靶位點係被安排成迴文序列。於本實施例之一些方面，兩標靶位點係皆位於該有義股上。於本發明之一些方面，一標靶位點係位於該有義股上且該第二標靶位點係位於該反義股上。於本實施例之其他方面，一標靶位點係位於該介入聚核苷酸序列之上游且係以2、3、4、5、6或更多標靶位點之多重複本提供。於本實施例之進一步方面，一標靶位點係位於該介入聚核苷酸序列之下游且係以2、3、4、5、6或更多標靶位點之多重複本提供。
該插入位點可被整合至內源性基因體DNA序列之內之植物基因體內的任何地方。於某些實施例中，該插入位點係被整合至玉米基因體中之Zp15基因，如美國專利申請編號12/653,735中所述，其係為用於標靶插入外源性序列的期望位點。於其他實施例中，該插入誤點係被整合至偏好玉米之基因座，如美國專利申請編號14/531,739中所述，其係為用於標靶插入外源性序列的期望位點。於進一步之實施例中，該插入位點係被整合至偏好大豆 之基因座內，如美國專利申請編號14/531,732中所述，其係為用於標靶插入外源性序列的期望位點。
DNA結合結構域
本文揭示的方法可使用任何DNA結合結構域。於某些實施例中，DNA結合結構域包括一鋅指蛋白。鋅指結合結構域包括一或多個鋅指。Miller等人(1985)EMBO J.4：1609-1614、Rhodes(1993)Scientific American Feb.：56-65、美國專利編號6,453,242。本文所述之鋅指結合結構域通常包含2、3、4、5、6或更多個鋅指。
通常，一單一鋅指結構域於長度上係約為30胺基酸。結構的研究表示每一鋅指結構域(結構組元motif)包含兩β褶板(維持包含兩個不變之半胱胺酸殘基的β轉折)和一α螺旋(包含兩個不變之組胺酸殘基)，其係透過鋅原子與兩個半胱胺酸和兩個組胺酸之配位而維持於一特定構形。
鋅指包含典型的C2H2鋅指(即彼等其中之鋅原子與兩個半胱胺酸和兩個組胺酸殘基配位者)以及非典型鋅指諸如C3H鋅指(彼等其中之鋅原子與三個半胱胺酸和一個組胺酸殘基配位者)和C4鋅指(彼等其中之鋅原子與四個半胱胺酸殘基配位者)。亦參見WO02/057293以及美國專利公開案第20080182332號關於用於植物之非典型ZFP。
經工程改造之鋅指結合結構域與天然存在的鋅指蛋白質相比可具有新穎結合特異性。工程改造方法包含但不限於合理設計及多種類型之選擇。合理設計包含例如使用包括三聯體(或四聯體)核苷酸序列及個別鋅指胺基酸序列之資料庫，其中各三聯體或四聯體核苷酸序列係與結合特定三聯體或四聯體序列之鋅指的一或多個胺基酸序列相關聯。
包含噬菌體顯示與雙雜交系統之示例性的選擇方法係被揭露於美國專利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568，以及WO98/37186、WO98/53057、WO00/27878、WO01/88197和GB 2,338,237。
對鋅指結合結構域之結合特異性的加強已描述於所共有之WO02/077227。
因為個別鋅指結合之一3-核苷酸(即三聯體)序列(或一可與鄰接之鋅指的4-核苷酸結合位點重疊一個核苷酸的4-核苷酸序列)，鋅指結合結構域被工程改造以結合之序列(例如標靶序列)的長度將決定在工程改造之鋅指結合結構域內的鋅指數目。舉例而言，對於其指結構組元未結合至重疊之亞位點的ZFP，6-核苷酸標靶序列係被二指結合結構域所結合；9-核苷酸標靶序列係被三指結合結構域所結合，諸如此類。如本文所註明，用於在一標靶位點之個別鋅指的結合位點(即亞位點)不必要是連續的，但可被一或多個核苷酸所隔開，取決於在多指結合結構域內鋅指之間之胺基酸序列(即指間連接子inter-finger linker)的長度與性質。
於一多指鋅指結合結構域，鄰接之鋅指可被大約5胺基酸的胺基酸連接序列或是一或多個非典型連接子所分開。參見例如共有之美國專利編號6,453,242和6,534,261。對於包括多於三指之工程改造的鋅指結合結構域，於一些實施例中期望在某些鋅指之間插入較長(「非典型」)的指間連接子，因其可增加背該結合結構域結合之親和性和/或特異性。參見例如美國專利編號6,479,626和WO01/53480。因此，多指鋅指結合結構域亦可以非典型指間連接子之存在與位置相關為特徵。舉例而言，包括三個指(由兩個典型指間連接子接合)、一個長連接子與三個額外指(由兩個典型指間連接子接合)的六指鋅指結合結構域係被表示為2x3組態。同樣地，包括兩個指(其間具有一典型連接子)、一個長連接子與兩個額外指(由典型連接子接 合)的結合結構域係被表示為2x2組態。包括三個兩指單元(於其中每個單元該兩指係以典型連接子接合)的蛋白質，且於其中每個兩指單元係由一長連接子接合至鄰接的兩指單元，係稱為3x2組態。
多鋅指結合結構域中兩鄰接鋅指之間存有長或非典型指間連接子通常允許該兩指結合至在標靶序列上並未立即連續的亞位點。因此，在標靶位點中亞位點之間可有一或多個核苷酸的間隙；即，標靶位點可包含不被鋅指所接觸的一或多個核苷酸。舉例而言，2x2鋅指結合結構域可結合至被一個核苷酸分開的兩個6-核苷酸序列，即，其結合至一13-核苷酸標靶位點。亦參見Moore等人(2001a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1432-1436；Moore等人(2001b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1437-1441和WO01/53480。
如先前所提及，一個標靶亞位點係為一被單一鋅指所結合的3-或4-核苷酸序列。為某些目的，一個二指單元係被表示為一「結合模組」。一結合模組可藉由例如在結合一特定6-核苷酸標靶序列之多指蛋白質(通常是三指)的環境內選擇兩鄰接指而獲得。另外，模組可藉由個別鋅指之組合而構成。亦參見WO98/53057和WO01/53480。
或者，DNA結合域可來源於核酸酶。舉例而言，諸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII之歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶的識別序列係為已知的。亦參見美國專利第5,420,032號、美國專利第6,833,252號、Be·lfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388、Dujon等人(1989)Gene 82：115-118、Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127、Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228、Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263：163-180、Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280：345-353及New England Biolabs目錄。此外，歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶之DNA結合特異性可經工程改造以結合非自然之標靶位點。參見例如Chevalier等人(2002)Molec.Cell 10：895-905、 Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res.31：2952-2962、Ashworth等人(2006)Nature 441：656-659、Paques等人(2007)Current Gene Therapy 7：49-66、美國專利公開第20070117128號。
作為另一替代，DNA結合結構域可來源於白胺酸拉鏈蛋白質。白胺酸拉鏈是許多真核調控蛋白中之蛋白質-蛋白質相互作用中涉及的一類蛋白質，該等真核調控蛋白質為與基因表現有關之重要轉錄因子。白胺酸拉鏈係指此等跨越幾個界(包括動物、植物、酵母等)之轉錄因子中共用之通用結構組元。白胺酸拉鏈由兩個多肽(同源二聚體或異源二聚體)以白胺酸殘基經α-螺旋均勻間隔使得兩個多肽之白胺酸殘基在螺旋的同一面上結束的方式結合於特異性DNA序列形成。白胺酸拉鏈之DNA結合特異性可用於本文揭示之DNA結合域中。
於一些實例中，一或多種核酸酶之DNA結合結構域包括自然存在或經工程改造(非自然存在)之TAL效應物DNA結合結構域或TALEN。參見例如美國專利公開案第20110301073號，其係以全文引用方式併入本文中。已知黃單胞菌屬(Xanthomonas)之植物病原菌會在重要作物中引起許多疾病。黃單胞菌屬之病原性係視保守性III型分泌(T3S)系統而定，該系統將更多不同效應蛋白注入植物細胞中。這些注入的蛋白質當中包括轉錄活化因子樣(TALEN)效應物，其模擬植物轉錄活化因子並操控植物轉錄組(參見Kay等人，(2007)Science 318：648-651)。這些蛋白質含有DNA結合結構域及轉錄活化結構域。一種最充分表徵之TAL效應物為來自野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種(Xanthomnas campestgris pv.Vesicatoria)之AvrBs3(參見Bonas等人，(1989)Mol Gen Genet 218：127-136及WO2010079430)。TAL效應物含有一種由串聯重複序列構成的中心結構域，每個重複序列含有大約34個胺基酸，這些重複序列對於這些蛋白質之DNA結合特異性是關鍵的。另外，其含有一個核定位序列及一個酸性轉錄活化結構域(綜述參見Schornack S，等人，(2006) J Plant Physiol 163(3)：256-272)。另外，在植物病原性細菌青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)中已發現到兩個名為brg11與hpx17的基因是與青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)生物變種菌株GMI1000及生物變種4菌株RS1000中之黃單胞菌AvrBs3家族是同源的(參見Heuer等人，(2007)Appl and Enviro Micro 73(13)：4379-4384)。這些基因彼此之間的核苷酸序列有98.9%相同，差異在於hpx17的重複結構域中有1,575bp的缺失。然而，這兩種基因產物與黃單孢菌AvrBs3家族蛋白的序列一致性均小於40%。參見例如美國專利公開案第20110301073號，其以全文引用的方式併入本文中。
此等TAL效應物之特異性係視串聯重複序列中所發現之序列而定。該重複序列係包括大致102bp且其彼此之間通常有91-100%的同源性(Bonas等人，同上)。重複序列的多形現象通常位於位置12及13處，且在位置12及13處之高變雙殘基的身分標識與TAL效應物目標序列中之連續核苷酸的身分標識之間似乎存在一對一的對應性(參見Moscou及Bogdanovc,(2009)Science 326：1501及Boch等人，(2009)Science 326：1509-1512)。已用實驗方式測定這些TAL效應物之用於DNA識別之天然編碼，使得位置12及13處之HD序列結合至胞嘧啶(C)，NG結合至T，NI結合至A、C、G或T，NN結合至A或G，及ING結合至T。這些DNA結合性重複序列已被組配為具有新的重複序列組合與數目的蛋白質，並製造出能夠在植物細胞中與新序列相互作用且活化非內源性報告基因之表現的人工轉錄因子(Boch等人，同上)。經工程改造之TAL蛋白已被連接至FokI裂解半結構域，以產生在酵母報告測定(基於質體之目標)中展現出活性之TAL效應子結構域核酸酶融合物(TALEN)。
CRISPR(成簇的、規律間隔的短回文重複序列)叢集規律間隔短回文重複序列)/CAS(CRISPR相關的)核酸酶系統是近來經工程改造之基於可用于基因組工程改造的細菌系統之核酸酶系統。其係部分地基於許多細菌和 古細菌之適應性免疫反應。當病毒或質體侵入細菌時，侵入者的DNA區段藉由『免疫』反應轉化成CRISPR RNA(crRNA)。此crRNA接著通過部分互補的區域與稱為tracrRNA之另一類型的RNA結合，以引導Cas9核酸酶至與目標DNA中之與crRNA同源之稱為「原型間隔子」的區域。Cas9在crRNA轉錄物內所含的20個核苷酸的引導序列所指定的位點處裂解DNA，以在DSB處產生鈍端。Cas9需要crRNA及tracrRNA以用於位點特異性DNA識別及裂解。此系統現已經工程改造以使得crRNA及tracrRNA可組合成一個分子(「單引導RNA」)，且該單引導RNA之crRNA等效部分可經工程改造以引導Cas9核酸酶引導至任何所期望的序列(參見Jinek等人(2012)Science 337，第816頁-第821頁，Jinek等人，(2013),eLife 2：e00471，及David Segal,(2013)eLife 2：e00563)。於其他實例中，crRNA與tracrRNA聯合以引導Cpf1核酸酶至一與crRNA同源的區域以使用交錯端裂解DNA(參見Zetsche,Bernd等人，Cell 163.3(2015)：759-771.)。因此，CRISPR/Cas系統可經工程改造以在基因體中之所期待的標靶處產生雙股斷裂(DSB)，且藉由修復抑制劑的使用影響DSB的修復，從而增加容易出錯的修復。
於某些實施例中，位點特異性核酸酶可以是天然存在之位點特異性核酸酶的「功能衍生物」。原生序列多肽之「功能衍生物」為具有與原生序列多肽相同之定性生物學特性的化合物。「功能衍生物」包含但不限於原生序列之片段及原生序列多肽及其片段之衍生物，限制條件為其具有與相應原生序列多肽相同之生物活性。本文涵蓋之生物活性為功能衍生物將DNA受質水解成片段之能力。術語「衍生物」涵蓋多肽之胺基酸序列變異體、共價修飾及其融合物。位點特異性核酸酶蛋白質多肽或其片段之適合衍生物包含但不限於位點特異性核酸酶蛋白質或其片段之突變體、融合物、共價修飾。包含鋅指、TALEN、CRISPER cas9、CRISPR cpf1或其片段之位點特異性核酸酶蛋白質，以及位點特異性核酸酶蛋白質或其片段，可自細胞獲得或化學合 成或藉由組合此等兩個程序獲得。細胞可為天然產生位點特異性核酸酶蛋白質之細胞，或天然產生之位點特異性核酸酶蛋白質且經基因工程改造以產生較高表現程度之內源性位點特異性核酸酶蛋白質或自外源引入之核酸產生之位點特異性核酸酶蛋白質的細胞，該核酸編碼與內源性位點特異性核酸酶蛋白質相同或不同之位點特異性核酸酶蛋白質。在一些情況中，細胞不會天然產生位點特異性蛋白質，且係經基因工程改造以產生位點特異性核酸蛋白質。該位點特異性核酸酶蛋白質係藉由和給予該位點特異性核酸酶蛋白質功能的其他結構域共表現該位點特異性核酸酶蛋白質而部署於植物細胞內(例如用於CRISPR之引導RNA；wo形式之引導RNA可用以促進Cas介導之基因體裂解，如於Le Cong,F.等人，(2013)Science 339(6121)：819-823.所揭露)。
裂解結構域
如上所述，該DNA結合結構域可與一裂解(核酸酶)結構域聯合。舉例而言，歸巢核酸內切酶的DNA結合特異性可經修飾，同時保留核酸酶功能。另外，鋅指蛋白質亦可融合至裂解結構域形成鋅指核酸酶(ZFN)。本文所揭示之融合蛋白的裂解結構域部分可自任何核酸內切酶或核酸外切酶獲得。可以衍生出裂解結構域之例示性核酸內切酶包括(但不限於)限制性核酸內切酶及歸巢核酸內切酶。參見例如2002-2003 Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA；及Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388。裂解DNA之額外酶係為已知的(例如S1核酸酶、綠豆核酸酶、胰臟DNase I、微球菌核酸酶、酵母HO核酸內切酶；亦參見Linn等人(編)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。已知包含I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII之歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶的非限制性實例。亦參見美國專利第5,420,032號、美國專利第6,833,252號、Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388、Dujon等人(1989)Gene 82：115-118、Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228、Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280：345-353及New England Biolabs目錄。此等酶(或其功能片段)中之一或多者可用作裂解結構域及裂解半結構域之來源。
限制性核酸內切酶(限制酶)存在於許多物種中且能夠序列特異性結合於DNA(在識別位點)，且在結合位點處或結合位點附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型)在從識別位點移除之位點處裂解DNA且具有可分離結合及裂解結構域。舉例而言，IIS型酶FokI催化DNA之雙股裂解，在一股上距離其識別位點9個核苷酸處且在另一股上距離其識別位點13個核苷酸處。參見例如美國專利5,356,802、5,436,150和5,487,994；以及Li等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279、Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2764-2768、Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887、Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269：31,978-31,982。因此，在一實施例中，融合蛋白質包括來自至少一種IIS型限制酶之裂解結構域(或裂解半結構域)以及一或多個鋅指結合域，其可經或未經工程改造。
裂解結構域可與結合域分離之一示例性IIS型限制酶係為FokI。此特定酶呈二聚體時有活性。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10,570-10,575。因此，出於本公開說明之目的，用於所揭示之融合蛋白中的FokI酶部分視為裂解半結構域。因此，對於使用鋅指-FokI融合物的標靶雙股裂解和/或標靶細胞序列置換，可使用各自包括FokI裂解半結構域之兩個融合蛋白質來復原催化活性裂解結構域。或者，亦可使用含有鋅指結合域及兩個FokI裂解半結構域之單個多肽分子。使用鋅指-FokI融合物之標靶裂解及標靶序列改變的參數提供於本公開說明之他處。
裂解結構域或裂解半結構域可為保留裂解活性或保留多聚(例如二聚)形成功能裂解結構域之能力的任何蛋白質部分。
示例性IIS型限制酶係描述於共有之國際公開案WO 2007/014275中，其以全文引用之方式併入本文中。
為了提高裂解特異性，裂解結構域亦可經修飾。在某些具體例中，採用裂解半結構域之變異體，此等變異體使裂解半結構域之均二聚降至最低且防止裂解半結構域之均二聚。此類經修飾之裂解半結構域的非限制性實例詳細描述於WO 2007/014275中，其以全文引用之方式併入本文中。亦參見實例。於某些實施例中，該裂解結構域包括一最小化或防止同源二聚化之經工程改造之裂解辦結構域(亦稱為二聚化結構域變異體)係為本領域技術人員所知並描述於美國專利公開號20050064474和20060188987，號，其以全文引用之方式併入本文中。FokI之位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537及538處之胺基酸殘基為影響FokI裂解半結構域之二聚化的全部標靶。參見例如美國專利公開號第20050064474和20060188987號、國際專利公開號WO 07/139898、Miller等人(2007)Nat.Biotechnol.25(7)：778-785.
形成絕對雜二聚體之FokI的額外經工程改造之裂解半結構域亦可用於本文所述之ZFN中。於一實施例中，第一裂解半結構域包含在FokI之490和538位置上胺基酸殘基的變異且第二裂解半結構域包含在胺基酸殘基486和499上的變異。
於某些實施例中，裂解結構域包括兩個裂解半結構域，這兩個都是一包括一結合結構域之單一多肽的部分，一第一裂解半結構域和一第二裂解半結構域。改裂解結構域可具有相同的胺基酸序列或相異的胺基酸序列，只要他們可作用以裂解DNA。
一般而言，若該融合蛋白質包括裂解半結構域，需要兩個融合蛋白質來裂解。另外，可使用包括兩裂解半結構域之一單一蛋白質。該兩個裂解半結構域可源自相同的核酸內切酶(或其功能片段)或各裂解半結構域可源自相異的核酸內切酶(或其功能片段)。此外，用於兩個融合蛋白質之標靶位點較佳地安排成相對於彼此以便讓該兩融合蛋白質對其各自標靶位置的結合將該裂解半結構域處於彼此之間於空間方向上允許該裂解半結構域形成一有作用的裂解結構域，例如藉由二聚化。因此，於某些實施例中，標靶位點之近緣可被5-8個核苷酸或15-18個核苷酸分開。然而兩個逼把位點之間可介入任何整數之核苷酸或核苷酸對(例如從2至50個核苷酸或更多)一般而言，裂解點位於標靶位點之間。
融合蛋白質
用於融合蛋白質(以及編碼相同之多肽)之設計與構築的方法係為本領域技術人員所知。舉例而言，用於包括DNA結合結構域(例如鋅指結構域)和調控裂解結構域之融合蛋白質的設計與構築的方法，以及編碼此類融合蛋白質之多肽係描述於共有之美國專利6,453,242和6,534,261以及美國專利申請公開號2007/0134796和2005/0064474；其以全文引用之方式併入本文中。於某些實施例中，構築編碼該融合蛋白質的聚核苷酸。此等聚核苷酸可被插入至一載體且該載體可被導入至一細胞中(關於載體和用於將聚合酸導入至細胞的方法，參見下述額外公開說明)。
於本文所述之方法的某些實施例中，一鋅指核酸酶包括一包括一鋅指結合結構域和一來自FokI限制酶之裂解半結構域的融合蛋白質，且兩個此等融合蛋白質表現於一細胞中。在一細胞中兩個融合蛋白質的表現係由於將該兩個融合蛋白質遞輸至該細胞、將其中之一蛋白質與一編碼其中之一蛋白質的核酸遞輸至該細胞、兩個各自編碼其中之一蛋白質的核酸遞輸至該細 胞，或藉由將編碼這兩個蛋白質的一單一核酸遞輸至該細胞。於額外之實施例中，一融合蛋白質包括一包括兩個裂解半結構域與一鋅指結合結構域之單一多肽鏈。在這種情況下，一單一融合蛋白質表現於一細胞中，且不希望被理論所束縛，認為其裂解DNA是該裂解半結構域形成分子內二聚物的結果。
於某些實施例中，該融合蛋白質(例如ZFP-FokI融合物)之組件係被安排成該鋅指結構域係最靠近該融合蛋白質之胺基末端，且該裂解半結構域係最靠近該羧基末端。此反映出諸如源自FokI酶之自然發生二聚合的裂解結構域中該裂解結構域的相對方位，其中該DNA結合結構域係最靠近該胺基末端且該裂解半結構域係最靠近該羧基末端。於這些實施例中，二聚化裂解半結構域以形成一功能核酸酶，係由該融合蛋白質結合至位在相反DNA股上的位點所帶來，其中該結合位點之5'端係為彼此靠近的。
於額外之實施例中，該融合蛋白質(例如ZFP-FokI融合物)之組件係被安排成該裂解半結構域係最靠近該融合蛋白質之胺基末端，且該鋅指結構域係最靠近該羧基末端。於這些實施例中，二聚化裂解半結構域以形成一功能核酸酶，係由該融合蛋白質結合至位在相反DNA股上的位點所帶來，其中該結合位點之3'端係為彼此靠近的。
於又一額外之實施例，一第一融合蛋白質包含最靠近該融合蛋白質之胺基末端的裂解半結構域和最靠近羧基末端的鋅指結構域，以及一第二融合蛋白質係被安排成其鋅指結構域最靠近該融合蛋白質之胺基末端且該裂解半結構域係最靠近該羧基末端。於這些實施例中，兩個融合蛋白質皆結合至相同的DNA股，其中包含最靠近羧基末端之鋅指結構域之第一融合蛋白質的結合位點位於包含最靠近胺基末端之鋅指結構之第二融合蛋白質的結合位點的5'側。
於所揭示融合蛋白質之某些實施例中，鋅指結構域和裂解結構域(或裂解半結構域)之間的胺基酸序列係被表示為「ZC連接子」。該ZC連 接子係與上述之指間連接子區分開來。對於獲得最佳化裂解之ZC的詳請，參見例如美國專利公開號20050064474A1和20030232410號，以及國際專利公開號WO05/084190。
於一實施例中，本公開說明提供一包括具有一或多個識別螺旋胺基酸序列之鋅指蛋白質的ZFN。於另一實施例中，本公開說明提供一包括編碼具有一或多個識別螺旋之ZFP的核苷酸序列的ZFP表現載體。
標靶整合
本公開說明之方法與組成可用以在其第一插入位點裂解任何細胞基因體內之DNA，其促進一外源性序列之穩定的標靶整合至該插入位點和/或外源性序列的切除，於適當之ZFN對的存在下。此外，由外源性序列之切除而來之DNA修復與重組製造出一與該第一位點相同的第二插入位點。因此，最初使用以標靶該第一插入位點之ZFN對可隨後再重新使用。
本公開說明之方法與組成可用以在其第一插入位點裂解任何細胞基因體內之DNA，其促進一外源性序列之穩定的標靶整合至該插入位點和/或外源性序列的切除，於適當之ZFN對的存在下。此外，由外源性序列之切除而來之DNA修復與重組製造出一被該位點特異性核酸酶識別、結合並裂解之第二插入位點。因此，最初使用以標靶該第一插入位點之ZFN對可隨後再重新使用。
一進一步之實施例包含於一植物細胞內導入包括一標記基因與一感興趣之基因的外源性序列。標記基因與感興趣之基因兩者都被相同ZFN結合位點所側接(描繪成具有不同陰影的三角形)，以便該標記基因可被適當地刪除，例如當插入額外的基因。移除標記基因可造成隨後之ZFN結合位點的修復，以便該ZFN結合位點被該原始用於移除該標記基因的ZFN所識別。
於諸如植物之有機體中，當有數量有限之有效的可篩選標記時，其允許使用少至一個可篩選標記，大舉促進堆疊感興趣之基因的潛力。於某些實施例中，例如取決於同源性導向之DNA修復的效率，可使用一「分割」可篩選標記。使用一分割可篩選標記之供體DNA序列的正確整合產生可表現的可篩選標記基因。於另一實施例中，用於移除之外源性序列係被一分割標記基因之部分序列所側接於基因體中。切除後，該標記基因係被重新構築，導致產生一功能標記基因。
決於同源性導向之DNA修復的效率，可能需要使用一「分割」可篩選標記。使用一分割可篩選標記之供體DNA序列的正確整合產生可表現的可篩選標記基因。可篩選標記可自一整合之DNA序列切除且可被回收。使用可篩選標記切除限制了所需之可篩選標記的數目至兩個或可能只要一個。
對於標靶整合至一本文所述之整合插入位點，一或多個DNA結合結構域(例如ZFP)係經工程改造以結合預定裂解位點處或附近之標靶位點，且包含該經工程改造之DNA結合結構域和裂解結構域的融合蛋白質係被表現於細胞中。融合蛋白質之DNA結合(例如鋅指)部分與標靶點結合時，DNA在標靶位點附近被該裂解結構域裂解，較佳經雙股斷裂裂解。
於該插入位點出現之雙股斷裂促進外源性序列之整合，經由同源重組或透過非同源性末端接合。於某些實施例中，包括將被插入之插入位點之外源性序列的聚核苷酸將包含一或多個與該插入位點聚核苷酸和/或周圍基因體同源之區域以促進同源重組。供體欲基因體序列之間大約25、50、100、200、500、750、1,000、1,500、2,000核苷酸或更多之序列同源性(或10與2,000之間任何整數值之核苷酸或更多)將支援其同源性重組。於某些實施例中，該同源臂長度係少於1,000鹼基對。於其他實施例中，該同源臂長度係少於750鹼基對。亦參見美國臨時專利申請第61/124,047號，其以全文引用之方式併入本文中。一供體分子(外源性序列)可包含同源至細胞染色質的 多個不連續區域。舉例而言，對於通常不出現在一感興趣之區域的標靶序列插入，所言序列可出現於供體核酸分子並被同源性區域側接至一感興趣區域的基因序列。
任何感興趣之序列(外源性序列)可從本文所述之插入位點導入。示例性之外源性序列包含但不限於多肽編碼序列(例如cDNAs)、啟動子、加強子與其他調控序列(例如干擾RNA序列、shRNA表現卡匣、表位標記、標記基因、裂解酶識別位點與多種類型之表現構築體。可使用標準分子生物學技術(選殖、合成等)獲得此等序列和/或商業性取得。可在該融合蛋白質表現之前、表現同時或表現隨後將該外源性基因導入至該細胞。
該供體聚核苷酸可為DNA或RNA、單股或雙股且可以線型或環形形式導入之一細胞中。若以線型形式導入，該供體序列之末端可被本領域技術人員所知之方法所保護(例如免於被核酸外切降解)。舉例而言，一或多個雙脫氧核苷酸殘基係被添加至一線型分子之3'末端和/或自我互補之寡核苷酸連接至其中一末端或兩末端都接。參見例如Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4959-4963、Nehls等人(1996)Science 272：886-889。用於保護外源性聚核苷酸免於降解的額外方法包含但不限於添加端點胺基以及使用修飾之核苷酸間連接，諸如硫代磷酸酯、胺基磷酸酯以及O-甲基核醣或去氧核醣殘基。
一核苷酸可被導入之一細胞中作為具有額外序列之載體分子的一部分，該額外序列係諸如複製起始、啟動子和編碼抗生素抗性之基因。此外，供體聚核苷酸可被導入為裸核酸、為與諸如奈米粒子、脂質體或泊洛沙姆(poloxamer)之試劑的核酸複合體，或可被細菌或病毒遞輸至植物細胞，(諸如農桿菌、根瘤菌Rhizobium sp.NGR234、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、馬鈴薯病毒X、 花椰菜嵌紋病毒以及木薯脈花葉病毒。參見例如Chung等人(2006)Trends Plant Sci.11(1)：1-4。
如上所述，每個都包括鋅指結合結構域和裂解半結構域之兩個融合蛋白質(同源二聚體或異源二聚體)之插入位點上的結合位點，可位於離開3-5鹼基對、5-8鹼基對或15-18鹼基對遠，從與另一結合位點最靠近之每一結合位點的邊緣量起，且裂解發生於該結合位點之間。不論裂解發生於一單一位點或結合位點之間的多個位點係為無形的，因為該被裂解之基因序列被該供體序列取代。因此，為藉由標靶重組有效率地改變單一核苷酸對的序列，結合位點之間區域的中點係在彼核苷酸對之10,000個核苷酸之內、較佳地係在1,000個核苷酸之內、或500個核苷酸、或200個核苷酸、或100個核苷酸、或50個核苷酸、或20個核苷酸、或10個核苷酸、或5個核苷酸、或2個核苷酸、或一個核苷酸，或在感興趣之核苷酸對上。
亦提供可加強標靶重組程度的方法與組成，包括但不限於使用額外的ZFP功能結構域融合物以活化參與同源重組之基因的表現，諸如RAD54上位組之植物基因(例如AtRad54、AtRad51)，以及其產物與上述基因產物交互作用的基因。參見例如Klutstein M，等人Genetics.2008 Apr；178(4)：2389-97。
與本公開說明所述之方法與組成結合，可使用同樣地ZFP功能結構域以抑制參與非同源性末端接合之基因的表達(例如Ku70/80、XRCC4、聚(ADP核醣)聚合酶、DNA連接酶4)。參見例如Riha等人(2002)EMBO 21：2819-2826、Freisner等人(2003)Plant J.34：427-440、Chen等人(1994)European Journal of Biochemistry 224：135-142。使用鋅指結合結構域與功能結構域之間融合物之用於活化與抑制基因表現的方法係揭露於如所共有之美國專利6,534,261、6,824,978和6,933,113。額外之抑制方法包含使用反義寡核苷酸 和/或小干擾RNA(siRNA或RNAi)或標靶至要被抑制之基因序列的shRNA。
於包括鋅指/核酸酶融合分子與供體DNA分子的細胞中，可藉由在細胞循環之G2其停滯該細胞而達到進一步增加標靶重組的效率，當同源導向修復程序被最大化活化。此等停滯可由多種方式達成。舉例而言，能以例如藥物、化合物和/或小分子之影響細胞循環前進者處理細胞以邊將細胞停滯於G2期。此類型之示例性分子包含但不限於影響微管聚合之化合物(例如長春鹼、諾考達唑、紫杉醇)、與DNA交互作用之化合物(例如順式二胺二氯鉑(II)、順鉑、多柔比星doxorubicin)和/或影響DNA合成之化合物(例如胸苷、羥基脲、L-含羞草鹼、依托泊苷、5-氟尿嘧啶)。可藉由使用組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑(例如丁酸鈉、曲古抑菌素A)達成重組效率之額外的增加，其改變染色質結構以讓基因體DNA更容易被細胞重組機器進入。
用於細胞循環停滯之額外方法包含過表現抑制CDK細胞循環激酶的蛋白質，例如藉由將編碼該蛋白質之cDNA導入至該細胞或藉由將經工程改造之活化編碼該蛋白質之基因表現的ZFP導入至該細胞。亦可就由抑制周期蛋白和CDK的活性達到細胞循環停滯，例如使用RNAi方法(例如美國專利第6,506,559號)或藉由將一經工程改造之抑制一或多個參與細胞循環前進之基因表現的ZFP導入該細胞中，例如週期蛋白和/或CDK基因。用於調控基因表現之經工程改造之鋅指蛋白質的合成方法，參見例如所共有之美國專利第6,534,261號。
或者，於某些情況下，標靶裂解係在沒有供體聚核苷酸(較佳地係於S或G2期)之情況下進行，且重組發生於同源染色體之間。
表現載體
本文所述之編碼一或多個融合蛋白質(例如ZFN)之核酸可被選殖至一載體以轉形至原核或真核細胞以用於複製和/或表現。載體可為原核載體例如質體或穿梭載體、昆蟲載體或真核載體。編碼融合蛋白質之核酸可被選殖至一表現載體，以施用至一細胞。
為表現該融合蛋白質(例如ZFN)，編碼該融合蛋白質之序列通常被亞選殖至包含啟動子之表現載體以引導轉錄。合適之細菌和真核生物啟動子係為本領域之技術人員所熟知且描述於例如Sambrook等人，Molecular Cloning.A Laboratory Manual(2nd ed.1989；3rded.,2001)、Kriegler,Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)以及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，如前述。用於表現該ZFP之細菌表現系統係可在例如大腸桿菌、芽孢桿菌和沙門氏菌(Palva等人，Gene 22：229-235(1983))。用於此類系統之套件係為商業販售的。用於哺乳動物細胞、酵母與昆蟲細胞之真核表現系統係為本領域之技術人員所熟知且為商業販售的。
用以引導融合蛋白質-編碼核酸之表現的啟動子係取決於該特定應用。舉例而言，適合宿主細胞之強大的組成型啟動子通常用於融合蛋白質之表現與純化。
相反的，當一融合蛋白質係體內施用以調控一植物基因(參見下述之「核酸遞輸至植物細胞」一節)，使用組成型、調節型(例如發育期間、依組織或細胞型態或是依環境)或誘導型啟動子，係取決於該融合蛋白質之特定使用。植物啟動子之非限制性實例包含源自阿拉伯芥泛素-3(ubi-3)(Callis，等人，1990,J.Biol.Chem.265-12486-12493)、A.tumifaciens甘露氨酸合成酶(△mas)(Petolino等人、美國專利編號6,730,824)和/或木薯脈花葉病毒(CsVMV)(Verdaguer等人，1996,Plant Molecular Biology 31：1129-1139)之啟動子序列。亦參見實例。
除了啟動子，該表現載體典型包含一轉錄單元或表現卡匣，其包含所有用於在宿主細胞不論原核或真核細胞中表現核酸所需之額外的元件。典型的表現卡匣因此包含可操作地連接至編碼該融合蛋白質的啟動子，以及所需之訊號，例如用於轉錄之有效聚腺苷酸化、轉錄終止、核醣體結合位點或轉譯終止。表現卡匣之額外的元件可包含例如加強子、異源接合訊號和/或核定位訊號(NLS)。
用於輸送基因訊息至細胞的特定表現載體係針對該融合蛋白質之預期用途而選擇，例如表現於植物、動物、細菌、真菌、原生動物等。(參見下述之表現載體)。標準的細菌和動物表現載體係為本領域所知且詳細描述於例如美國專利公開號20050064474A1和國際專利公開號WO05/084190、WO05/014791和WO03/080809。
標準的轉染方法可被用以製造表現大量蛋白質的細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞株，其接著可使用標準技術純化(參見例如Colley等人，J.Biol.Chem.264：17619-17622(1989)、Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher，編，1990))。真核和原核細胞之轉形係依據標準技術進行(參見例如Morrison,J.Bact.132：349-351(1977)、Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology 101：347-362(Wu等人編，1983)。
可使用任何已知之用於導入外來核苷酸序列至此類宿主細胞的方法。這些包含使用磷酸鈣轉染、polybrene、原生質體融合、電穿孔、超聲波方法(例如超音波微氣泡轉染)、脂質體、顯微注射、裸DNA、質體載體、病毒載體(游離型和整合型)以及任何所熟知用於將轉殖基因體DNA、cDNA、合成DNA或其他外來物質導入至宿主細胞的方法(參見例如Sambrook等人，如上述)。所用之特定基因工程改造程序只要能夠將至少一基因至成功導入至可表現所選之蛋白質的宿主細胞。
遞輸至植物細胞
如上所述，DNA構築體可藉由多種傳統技術而導入至一所期望之植物宿主中(例如至其基因體中)。對於此類技術之回顧，參見例如Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology(1988,Academic Press,N.Y.)Section VIII,pp.421-463以及Grierson & Corey,Plant Molecular Biology(1988,2d Ed.),Blackie,London,Ch.7-9。
舉例而言，DNA構築體可使用諸如植物細胞原生植體之電穿孔和顯微注射技術而導入至植物細胞之基因體中，或者DNA構築體可使用基因槍方法諸如DNA粒子轟擊而導入至植物組織中(參見例如Klein等人(1987)Nature 327：70-73)。或者，DNA構築體可經由奈米粒子轉形而導入至植物細胞中(參見例如美國專利申請編號12/245,685，其係以全文引用方式併入本文中)。或者，DNA構築體可與合適之T-DNA邊界/側接區域結合並被導入至傳統的根癌土壤桿菌宿主載體中。根癌土壞桿菌介導之轉形技術包含去武裝以及使用二元載體，如科學文獻所述。參見例如Horsch等人(1984)Science 233：496-498，以及Fraley等人(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 80：4803。
此外，基因轉移可使用非農桿菌細菌或病毒來達成，諸如根瘤菌Rhizobium sp.NGR234、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、馬鈴薯病毒X、花椰菜嵌紋病毒及木薯脈花葉病毒及/或菸草嵌紋病毒，參見例如Chung等人(2006)Trends Plant Sci.11(1)：1-4。
根癌土壤菌菌宿主之毒力功能將引導包含構築體與相鄰標記之T-股插入植物細胞DNA，當細胞被使用二元T DNA載體之細菌感染時(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12：8711-8721)或共同培養程序(Horsch等人(1985)Science 227：1229-1231)。通常，農桿菌轉形系統係用於工程改造雙子葉植物(Bevan等人(1982)Ann.Rev.Genet 16：357-384、Rogers等人(1986)Methods Enzymol.118：627-641)。農桿菌轉形系統亦可用以將DNA轉形以及轉移至單子葉植物和植物細胞。參見美國專利編號5,591,616、Hernalsteen等人(1984) EMBO J 3：3039-3041、Hooykass-Van Slogteren等人(1984)Nature 311：763-764、Grimsley等人(1987)Nature 325：1677-179、Boulton等人(1989)Plant Mol.Biol.12：31-40；和Gould等人(1991)Plart Physiol.95：426-434。
替代的基因轉移和轉形方法包含但不限於原生質體轉形，其係透過鈣-、聚乙二醇(PEG)-或電穿孔介導之裸DNA攝取(參見Paszkowski等人(1984)EMBO J 3：2717-2722、Potrykus等人(1985)Molec.Gen.Genet.199：169-177、Eromm等人(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：5824-5828和Shimamoto(1989)Nature 338：274-276)以及植物組織之電穿孔法(D'Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505)。用於植物細胞轉形之額外的方法包含顯微注射、碳化矽介導的DNA攝取(Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reporter 9：415-418)以及顯微注射轟擊(參見Klein等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：4305-4309和Gordon-Kamm等人(1990)Plant Cell 2：603-618)。
可使用本公開說明之方法與組成將外源性基因插入至已被插入至一植物之基因體的插入位點。這是有用的，因為被導入至植物基因體的轉殖基因係極度依賴於其整合位點。因此，編碼例如除草劑耐受性、昆蟲抗性、營養素、抗生素或治療分子的基因可被標靶重組插入至有利於其表現之一植物基因體的區域中。
藉由任何上述轉形技術產生之經轉形植物細胞可經培養以再生整個植物，其具有經轉形基因型且因此具有所需表現型。此類再生技術依賴於組織培養生長培養基中某些植物激素之操縱，通常依賴於已與所需核苷酸序列一起引入之殺生物劑及/或除草劑標記物。植物自培養之原生質體再生描述於Evans，等人，「Protoplasts Isolation and Culture」in Handbook of Plant Cell Culture，第124頁-第176頁，Macmillian Publishing Company,New York,1983；及Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,第21頁-第73頁，CRC Press,Boca Raton,1985。亦可自植物愈傷組織、外植體、器官、花粉、胚芽或其部 分獲得再生。此類再生技術一般描述於Klee等人.(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486中。
導入至植物細胞之核酸可被用來在基本上任何植物上賦予所期望之性狀。各式各樣之植物與植物細胞系統可為本文所述之期望的生理與農藝特性而使用本公開說明之核酸構築體與上述多樣轉形方法加以工程改造。於較佳的實施例中，用於工程改造之標靶植物和植物細胞包含但不限於彼等單子葉及雙子葉植物，諸如包括以下之作物：穀類作物(例如小麥、玉米、水稻、小米、大麥)、果實作物(例如蕃茄、蘋果、梨子、草莓、柳橙)、飼草作物(例如苜蓿)、根用蔬菜作物(例如胡蘿蔔、馬鈴薯、甜菜、山藥)、葉用蔬菜作物(例如萵苣、菠菜)；開花植物(例如矮牽牛、玫瑰、菊花)、針葉樹及松樹(例如冷杉(pine fir)、雲杉)；用於植物修復之植物(例如重金屬積聚植物)；油料作物(例如向日葵、油菜籽)以及用於實驗目的之植物(例如芥菜屬)。因此，本公開說明之方法及組成物可用於大範圍之植物，包含但不限於來自蘆筍屬(Asparagus)、燕麥屬(Avena)、芸苔屬(Brassica)、柑桔屬(Citrus)、西瓜屬(Citrullus)、辣椒屬(Capsicum)、南瓜屬(Cucurbita)、胡蘿蔔屬(Daucus)、飛蓬屬(Erigeron)、大豆屬(Glycine)、棉屬(Gossypium)、大麥屬(Hordeum)、萵苣屬(Lactuca)、黑麥草屬(Lolium)、番茄屬(Lycopersicon)、蘋果屬(Malus)、木薯屬(Manihot)、菸草屬(Nicotiana)、諸葛菜屬(Orychophragmus)、稻屬(Oryza)、鱷梨屬(Persea)、菜豆屬(Phaseolus)、豌豆屬(Pisum)、梨屬(Pyrus)、李屬(Piunus)、蘿蔔屬(Raphanus)、黑麥屬(Secale)、茄屬(Solanum)、高樑屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、葡萄屬(Vitis)、豇豆屬(Vigna)及玉蜀黍屬(Zea mays)之種。
熟習該項技術者應認識到，在外源性序列穩定併入於基因轉殖植物中且確認可運作之後，其可藉由有性雜交而導入至其他植物中。可使用多種標準育種技術中之任一者，視待雜交之品種而定。
經轉形的植物細胞、癒合組織、組織或植物係可藉由針對所述經工程改造之植物材料進行選擇或篩選由轉形DNA上存在的標誌物基因所編碼之性狀來鑑別及分離。例如，可藉由在含有抑制量之抗生素或除草劑(該轉形基因構築體賦予了對該抗生素或除草劑之抗性)的培養基上培植所述經工程改造之植物材料來進行選擇。此外，亦可藉由篩選所述重組核酸構築體上可能存在之任何可見的標記基因(例如，β-葡糖醛酸酶、螢光素酶、B或C1基因)之活性來鑑別經轉形的植物及植物細胞。此類選擇及篩選方法係為本領域之技術人員所熟知。
亦可使用物理和生物化學的方法以鑑別包含所插入之基因構築體的植物或植物細胞轉形體。此等方法包含但不限於：1)用於偵測與測定該重組DNA插入的南方分析法或PCR擴增法；2)用於偵測與檢測基因構築體之RNA轉錄的北方墨點法、S1 RNase保護、引子延伸或反轉錄酶-PCR擴增法；3)用於偵測酵素或核糖酵素活性的酵素測定法，其中此類基因產物係由該基因構築體所編碼；4)蛋白質凝膠電泳法、西方墨點技術、免疫沉澱法或酶聯免疫分析法(ELISA)，其中該基因構築體產物係為蛋白質。額外的技術諸如原位雜交法、酶染色法以及免疫染色法亦可用於偵測在特定植物器官和組織中重組構築體之存在或表現。用來做所有這些檢定的方法係為本領域技術人員所熟知。
使用本公開說明之方法之基因操控的影響可用例如自感興趣之組織中分離RNA(例如mRNA)之北方墨點法而獲得。一般而言，若存在mRNA或mRNA數量增加，可假設相對應之轉殖基因被表現。可使用其他用於量測基因和/或所編碼之多肽活性的方法。可使用不同類別之酵素測定法，取決於所用之受質以及檢測反應產物或副產物增加或減少的方法。此外，多肽表現的程度可用免疫化學的方法量測，例如ELISA、RIA、EIA以及其他本領域技術人員熟知之基於抗體的測定法，諸如電泳偵測分析法(使用染色或 西方墨點)。作為非限制性實例，使用ELISA測定法偵測AAD-1和PAT蛋白質係描述於美國專利申請編號11/587,893中，其以全文引用之方式併入本文中。該轉殖基因可為選擇性地表現於植物的一些組織中或在某些發育階段，或者該轉殖基因可表現於基本上所有的植物組織、基因上沿著其整個生命週期。然而，任何重組表模型亦可應用。
本公開說明亦涵蓋了上述之基因轉殖植物的種子，其中該種子係具有轉殖基因或基因構築體。本公開說明進一步涵蓋了上述之基因轉殖植物的子代、純系、細胞株或細胞，其中該子代、純系、細胞株或細胞具有該轉殖基因或基因構築體。
融合蛋白質(例如ZFN)和編碼融合蛋白質之表現載體可直接施用至用於基因調控、標靶裂解和/或重組的植物。於某些實施例中，該植物包含多個種內同源標靶基因。植物可包含多個種內同源基因係為已知的。因此，可施用一或多個不同的融合蛋白質或編碼融合蛋白質的表現載體至植物以標靶植物中一或多個Zp15基因。
有效數量之施用係藉由任何通常用於將融合蛋白質導入至與欲處理之植物細胞終極接觸的任何路徑。用任何合適的方法施用ZFP，較佳地係以可接受的載體。施用此等調節子的合適方法係為可用且為本領域技術人員所熟知，並且，儘管可以使用多於一種的路徑施用特定組成，一特定的路徑通常提供一比其他路徑更直接更有效的反應。
載體亦可被使用且部份係由被施用的特定組成決定，以及被用以施用該組成的方法所決定。因此，
遞輸至哺乳動物細胞
本文所述之ZFN可被遞輸至標靶哺乳動物細胞，其係藉由任何適合之方式包括注入ZFN mRNA。參見Hammerschmidt等人(1999)Methods Cell Biol.59：87-115
遞輸包括鋅指之蛋白質的方法係描述於例如美國專利編號6,453,242、6,503,717、6,534,261、6,599,692、6,607,882、6,689,558、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219與7,163,824中，其全部以全文引用之方式併入本文中。
如本文所述之ZFN可使用包含編碼一或多個該ZFN之載體而被遞輸。可使用任何載體系統，包含但不限於質粒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體和腺伴隨病毒載體等。亦參見美國專利編號6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824，其以全文引用之方式併入本文中。此外，這些載體可包括一或多個ZFN編碼序列係為顯而易見的。因此，當導入一或多對ZFN至細胞時，該ZFN可能攜帶於相同載體上或於不同載體上。當使用多個載體時，每個載體可包括一編碼一或多個ZFN的序列。
可使用傳統之基於病毒和非病毒之基因轉移方法將編碼經工程改造之ZFP導入至哺乳動物細胞中。此類方法可用以將編碼ZFP之核酸體外施用至哺乳動物細胞於某些實施例中，編碼ZFP之核酸可為體內或離體施用。
非病毒載體遞輸系統包含電穿孔、脂質體轉染(lipofection)、顯微注射、基因槍、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質：核酸共軛、裸DNA、人造病毒體以及試劑加強之DNA攝取。使用例如Sonitron 2000系統(Rich-Mar)之超音波微氣泡轉染(sonoporation)亦可用於核酸之遞輸。病毒載體遞輸系統包含DNA和RNA病毒，遞輸至該細胞後其具有游離基因 體或整合之基因體。額外之示例性核酸遞輸系統包含由Amaxa Biosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics Inc,(參見如US6008336)所提供者。脂質體轉染係描述於例如US 5,049,386、US 4,946,787和US 4,897,355，且脂質體轉染試劑係為商業銷售的(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。適合用於有效率的聚核苷酸之受體識別脂質體轉染的陽離子和中性脂質包含Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024那些。可遞輸至細胞(離體施用)或標靶組織(體內施用)。包含標靶脂質體諸如免疫脂質複合體之脂質：核酸複合體的準備係為本領域之技術人員所熟知(參見,Crystal,Science 270：404-410(1995)、Blaese等人，Cancer Gene Ther.2：291-297(1995)、Behr等人，Bioconjugate Chem.5：382-389(1994)、Remy等人，Bioconjugate Chem.5：647-654(1994)、Gao等人，Gene Therapy 2：710-722(1995)、Ahmad等人，Cancer Res.52：4817-4820(1992)、美國專利編號4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。
如上述，所揭露之方法與組成可被使用於任何類型之哺乳動物細胞。蛋白質(例如ZFP)、編碼該蛋白質之聚核苷酸與包括本文所述蛋白質和/或核苷酸之組成可藉由任何合適的方法遞輸至標靶細胞。合適之細胞包含但不限於真核生物和原核生物細胞和/或細胞株。從此等細胞生成之此類細胞或細胞株的非限制性實例包含COS、CHO(例如CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6以及昆蟲細胞如Spodoptera fugrperda(Sf)、真菌細胞如Saccharomyces、Pichia和Schizosaccharomyces。於某些實施例中，該細胞株係為CHO-K1、MDCK或HEK293細胞株。合適之初生細胞包含末梢血液單核細胞(PBMC)與及他血液細胞次集合，例如 但不限於CD4+T細胞或CD8+T細胞。合適之細胞亦包含幹細胞，諸如作為實例，胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞和間充質幹細胞。
本公開說明之實施例進一步示例於下面之實例中。應科理解這些實例係作為說明之用。從上述實施例與之後的實例，本領域之技術人員可探知本公開說明之基本特徵，不背離其精神與範圍，可產生本公開說明之實施例的各種變化與修改以適應各種用途和條件。因此，除了本文所顯示與描述者，從前述之描述中對本公開說明之實施例的多種修改，對本領域之技術人員係為顯而易見的。此修改係在本申請專利範圍之內。以下係提供以作為說明之用並非旨在限制本發明之範圍。
實例 實例1：pDAB105826之設計與構築
使用本領域公認之指南設計並構築包含一第一鋅指核酸酶基因表現卡匣與一第二pat基因表現卡匣的pDAB105826質體。所產生之第一鋅指核酸酶基因表現卡匣包含下列基因元件：玉蜀黍泛素1啟動子(ZmUbi1；美國專利編號7,179,902)：：辨識並裂解eZFN2之鋅指核酸酶基因的編碼序列(eZFN2；美國專利編號8,802,921)：：玉蜀黍Per 5 3UTR(ZmPer5；美國專利編號6,699,984)。該第二pat基因表現卡匣包含下列基因元件：水稻肌動蛋白啟動子(OsAct1；美國專利編號5,641,876)：：草丁膦乙醯轉移酶基因(pat；美國專利編號RE44962)：：以及玉蜀黍脂肪酶3' UTR(ZmLip；美國專利編號7,179,902)。此質體之組合係經由限制酶碎解與定序反應確認並提供於圖1。
實例2：pDAB118231之設計與構築
使用本領域公認之指南設計並構築包含一第一cry34基因表現卡匣、一第二cry35Ab1基因表現卡匣、一經工程改造之降落點(ELP1；美國專 利編號2014/0090113)、一第一位點特異性核酸酶結合位點(eZFN2結合位點；SEQ ID NO：1)、一第三aad-1表現卡匣以及一第二位點特異性核酸酶結合位點(eZFN2結合位點)的pDAB118231質體。該eZFN2結合位點與該aad-1基因表現卡匣係提供為SEQ ID NO：18。所產生之第一cry34基因表現卡匣包含下列基因元件：甘蔗桿菌病毒啟動子(SCBV；Bouhida等人，J.Gen.Virol.74：15-22(1993))：：TRAP 4葉綠體轉運肽(TRAP4；美國專利申請編號2013/0295638)：：cry34轉殖基因的編碼序列(Cry34；美國專利編號7,524,810)；該TRAP4-cry34Ab1序列係提供為SEQ ID NO：19)：：馬鈴薯pinII 3'UTR(StPinII；An等人，Plant Cell.1；115-22(1989))。該第二cry35Ab1基因表現卡匣包含下述之基因元件：水稻泛素3啟動子(OsUbi3；Sivamani,E.,Qu,R.,Plant Molecular Biology 60；225-239(2006))：：cry35Ab1轉殖基因(Cry35Ab1；美國專利編號7,985,892)：：以及玉蜀黍per 5 3’UTR(ZmPer5；美國專利編號6,699,984)。該第三aad-1轉殖基因表現卡匣包含下列基因元件：玉蜀黍泛素1啟動子(ZmUbi1；美國專利編號7,179,902)：：aad-1轉殖基因(AAD-1；美國專利申請編號2009/0093366)：：以及玉蜀黍脂肪酶3' UTR(ZmLip；美國專利編號7,179,902)。此質體之組合係經由限制酶碎解與定序反應確認並提供於圖2。
實例3：pDAB118232之設計與構築
使用本領域公認之指南設計並構築包含一第一cry34基因表現卡匣、一第二cry35Ab1基因表現卡匣、一經工程改造之降落點(ELP1；美國專利編號2014/0090113)、一第一位點特異性核酸酶結合位點(eZFN2結合位點)、一第三aad-1表現卡匣以及一第二位點特異性核酸酶結合位點(eZFN2結合位點)的質體pDAB118232。該eZFN2結合位點與該aad-1基因表現卡匣係提供為SEQ ID NO：18。所產生之第一cry34基因表現卡匣包含下列基因元 件：甘蔗桿菌病毒啟動子(SCBV；Bouhida等人，J.Gen.Virol.74：15-22(1993))：：TRAP 8葉綠體轉運肽(TRAP8；美國專利申請編號2013/158766))：：cry34轉殖基因的編碼序列(Cry34；美國專利編號7,524,810)；該TRAP8-cry34Ab1序列係提供為SEQ ID NO：20)：：馬鈴薯pinII 3'UTR(StPinII；An等人，Plant Cell.1；115-22(1989))。該第二cry35Ab1基因表現卡匣包含下述之基因元件：水稻泛素3啟動子(QsUbi3；Sivamani,E.,Qu,R.,Plant Molecular Biology 60；225-239(2006))：：cry35Ab1轉殖基因(Cry35Ab1；美國專利編號7,985,892)：：以及玉蜀黍per 5 3’UTR(ZmPer5；美國專利編號6,699,984)。該第三aad-1轉殖基因表現卡匣包含下列基因元件：玉蜀黍泛素1啟動子(ZmUbi1；美國專利編號7,179,902)：：aad-1轉殖基因(AAD-1；美國專利申請編號2009/0093366)：：以及玉蜀黍脂肪酶3' UTR(ZmLip；美國專利編號7,179,902)。此質體之組合係經由限制酶碎解與定序反應確認並提供於圖3。
實例4：pDAB118233之設計與構築
使用本領域公認之指南設計並構築包含一第一cry34基因表現卡匣、一第二cry35Ab1基因表現卡匣、一經工程改造之降落點(ELP1；美國專利編號2014/0090113)、一第一位點特異性核酸酶結合位點(eZFN2結合位點)、一第三aad-1表現卡匣以及一第二位點特異性核酸酶結合位點(eZFN2結合位點)之質體pDAB118233。該eZFN2結合位點與該aad-1基因表現卡匣係提供為SEQ ID NO：18。所產生之第一cry34基因表現卡匣包含下列基因元件：甘蔗桿菌病毒啟動子(SCBV；Bouhida等人，J.Gen.Virol.74：15-22(1993))：：TRAP 12葉綠體轉運肽(TRAP12；美國專利申請編號2013/0205440))：：cry34轉殖基因的編碼序列(Cry34；美國專利編號7,524,810)；該TRAP 12-cry34Ab1序列係提供為SEQ ID NO：21)：：馬跉薯pinII 3'UTR(StPinII；An等人，Plant Cell.1；115-22(1989))。該第二cry35Ab1基因表現卡匣包含下述之基因元件：水稻泛素3啟動子(OsUbi3；Sivamani,E.,Qu,R.,Plant Molecular Biology 60；225-239(2006))：：cry35Ab1轉殖基因(Cry35Ab1；美國專利編號7,985,892)：：以及玉蜀黍per 5 3’UTR(ZmPer5；美國專利編號6,699,984)。該第三aad-1轉殖基因表現卡匣包含下列基因元件：玉蜀黍泛素1啟動子(ZmUbi1；美國專利編號7,179,902)：：aad-1轉殖基因(AAD-1；美國專利申請編號2009/0093366)：：以及玉蜀黍脂肪酶3' UTR(ZmLip；美國專利編號7,179,902)。此質體之組合係經由限制酶碎解與定序反應確認並提供於圖4。
實例5：植物轉形與基因轉殖事件之分子確認
使用基於農桿菌之轉形法將上述構築體導入至玉蜀黍c.v.B104轉形株。經由農桿菌介導之未成熟胚芽轉形將實驗的構築體轉形至玉米中，該未成熟胚芽係分離自近親品系玉蜀黍c.v.B104。所用方法與Ishida等人(1996)Nature Biotechnol 14：745-750及Frame等人.(2006)Plant Cell Rep 25：1024-1034公開之方法類似，但有若干的修改及改良(如在Miller(2013)WO 2013090734 A1中所述)以使得該方法能適用於高通量轉形。用以在玉米中產生大量基因轉殖事件的方法實例係於美國專利申請公開案第US 2013/0157369 A1號中給出，其以胚芽感染及共培養步驟開始。
根據qPCR測定，經測定包含該轉殖基因之所有元件之1-2複本且缺乏可偵測之質體主鏈的T0事件係被保留以用於T1種子製造。T0事件相互回交至玉蜀黍c.v.B104以製造該T1子代。每個構築體三個事件被選為本研究。
實例6：T 1植物評估與雜交
產自含有基因轉殖事件(118231[1]-016.001、118231[1]-021.001、118231[1]-028.001、118232[1]-002.001、118232[1]-023.001、118232[1]-028.001、118233[1]-006.001、118233[1]-011.001、118233[1]-015.001)之構築體pDAB118231、pDAB118232和pDAB118233之親代標靶植物株之所得T1標靶子代株系(分離1：1無效(null)：半合子(hemizygous))的種子係經種植並栽種在溫室中。另外，來自eZFN2表現株系pDAB105826.2.137(分離1：2：1無效：半合子：同型合子)之S1種子係被種植於一溫室中並成長。在大約V2葉階段，以符合其相對可篩選基因之除草劑處理這些事件；以184g ae/ha+1%作物油濃度之Assure IITM處理具aad1轉殖基因的事件、以IgniteTM 280 SL(草銨膦)(480g ae/ha)處理具pat轉殖基因的事件，以移除不具備轉殖基因的無效植物。使用分子確認檢測法對存活之植物進行接合性基因分型。包含該事件(pDAB105826.2.137)之eZFN2表現植物係與包含事件(118231[1]-016.001、118231[1]-021.001、118231[1]-028.001、118232[1]-002.001、118232[1]-023.001、118232[1]-028.001、118233[1]-006.001、118233[1]-011.001、118233[1]-015.001)之標靶植物雜交以產生用於基因體編輯評估之F1育種堆疊。製造雜交以便從該eZFN2表現植物(較佳地係同型合子植物)中分離出花粉並用以使該包含該轉殖基因之T1標靶植物受精。
實例7：包含一切除之AAD-1轉殖基因之事件的分子分析
將來自構築體DAB118231、pDAB118232與pDAB118233之T1標靶x eZFN2表現株pDAB105826.2.137而得的F1育種堆疊係種植於溫室中。種植後一週，依據標準指南對植物DNA取樣。簡要地，從每一植物收集幾個1cm葉盤以用於分子分析。在Thermo KingFisherFlexTM機器(Thermo Scientific,Inc.,Carlsbad,CA)上使用Qiagen MagAttractTM套組(Qiagen,Germantown,MA)萃取DNA。對aad-1轉殖基因、ELP、cry35Ab1轉殖基因和pat轉殖基 因，使用特定的TaqMan®測定進行拷貝數分析。根據表1設定Biplex TaqMan® PCR反應並使用表2之熱循環條件與列於表3之引子進行。使用Roche LightCycler 480TM即時PCR系統依據製造商的建議分析每一反應所產生的螢光程度。FAM螢光部分係在465/510之光密度激發，且HEX螢光部分係在533/580之光密度激發。藉由比較未知樣品之標靶/參考值(△△Ct)(由LightCycler®480輸出)與已知拷貝數標準品(1-複本：半合子、2-複本：同型合子)之標靶/參考值(△△Ct)測定轉殖基因拷貝數。在基因轉殖事件之分子確認完成後，包含切除的aad-1可篩選標記之修飾事件的植物係被鑑別並生長成熟。這些植物係被雜交(切除的植物作為花粉供體)至玉蜀黍c.v.B104植物以產生種子。
實例8：從分子堆疊基因座計算可篩選標記之切除速率
為測定該可篩選標記從包含cry34Ab1和cry35Ab1之分子堆疊中切除的速率，來自從T1標靶植物被eZFN2表現株雜交而來之F1植物的組織樣品係於DNA層級上分析。開始，針對aad-1轉殖基因之移除，對代表9個雜交之全部1,832個F1樣品進行基因型分析，其係使用TaqMan® PCR測定該基因座之組件的存在與拷貝數。拷貝數係計算為實驗株對已知樣品之△△Ct值的比例，當比值為二、一或零係分別表示同型合子、半合子或無效。因為許多雜交係使用標靶事件半合子植物產生且無法選擇無效，對於所有發現於標靶事件之基因表現卡匣，643樣本經鑑別為無效並不令人意外。此外，該可篩選標記基因(pat)係被檢測且發現佚失於其中248植物中。另外，共有350不包含標靶事件也無eZFN2表現株的植物。這些樣品(無效、不具eZFN2表現株且不具標靶)都沒有被包含於額外之分析中。從剩下的植物樣品，根據測定，發現23植物不具有aad-1基因之任何可偵測的拷貝數，從而造成3.7%之整體切除率。在個別事件之基礎上，切除率範圍係從0.0-9.7%，並有事件其中切除率之中位數3.3%。
為檢驗aad-1切除的精確性，在分子堆疊內之額外的基因座基因分型上面測試之F1組織樣品。使用PCR，為cry35Ab1和ExZACTTM降落點(ELP)兩者之存在基因分型該樣品。認為當植物修復被ZFN造成在基因體之雙股裂解時發生了切除。因為在這些實驗中沒有供體DNA，兩種可能的修復方法係可使用單股黏合(SSA)或非同源性末端接合(NHEJ)。完成進一步研究以調查基因移除的遺傳性並分析當發生切除時的DNA足跡。
實例9：可篩選標記之切割事件的分析
為檢驗該核酸介導之切除的精確性以及修飾之遺傳性，將被測定已於該F1代被該位點特異性核酸酶修飾之株系的BC1群體種植於印第安納波利斯(Indianapolis)溫室並評量其接合子型式、蛋白質表現以及DNA序列。使用qPCR以對cry35Ab1、cry34Ab1和ExZACTTM降落點(ELP)之存在進行基因型分析，確認了BC1群體內位點特異性核酸酶修飾的遺傳性(上表3)。這些資料顯示F1群體內所表徵修飾(aad-1已被移除)係為高度遺傳性且在BC1群體如預期分離。全部共測試20株系且除其中6個雜交外都通過卡方測試(Chi square testing)。卡方測試失敗的其中四個雜交係來自相同的堆疊(表5)。所有的T1標靶株x eZFN2表現株雜交生產出一aad-1被切除的植物除了只有一雜交對外。亦藉由進行pat qPCR測定針對eZFN2表現株之存在篩選事件。BC1群組qPCR結果確認所評量之20株系中的17沒有可偵測之aad-1轉殖基因的存在。
為檢驗aad-1切除期間所使用的修復機制，將上述株系擴增而來的片段予以定序並與其親代構築體比較。測試來自17個雜交之每一個的一植物。總共有來自雜交的15個片段產生可使用的序列資料，以及一株系未產生PCR產物以及一株系產生不可靠的序列資料。序列分析顯示其中10株系於aad-1切除後產生完美的序列修復(圖6與表6)。5株系包含小刪除和插入，其係在接合之前破壞鋅指識別位點，從而防止進一步的切割(表6)。
表現出aad-1基因卡匣完全切除的植物係藉由DNA接合子型式分析預見不包含可偵測程度之AAD-1蛋白質確認(圖5)。任何被切除的植物中沒有AAD-1蛋白質，而標靶事件之間的蛋白質層級從~5-60ng/cm2不等。
位點特異性核酸酶的使用允許了改變植物基因體的能力。如於實例中所顯示，3.7%之可篩選標記移除的頻率。該切除係接著被遺傳至下一世代。透過序列層級之確認驗證，於17雜交事件中之10雜交(59%)的基因移除與完美DNA修復係為首次進一步被展示。
實例10：生物測定結果
由此產生之基因轉殖事件係進階經生物測定以進一步表徵該CRY蛋白質在昆蟲生物測定的抑制效應。評估基因轉殖事件西方玉米根蟲對根損壞。從基因轉殖事件分離並定量CRY34Ab1、CRY35Ab1和AAD1的總蛋白質。全部基因轉殖事件(例如pDAB118231、pDAB118232以及pDAB118233)顯示出對西方玉米根蟲活性的抑制如藉由計算根損壞評分所例證(表7)。相較之下，控制植物(例如B104)並未提供任何對西方玉米根蟲活性的抑制(表7)。因此，包含連接至cry34Ab1轉殖基因並與cry35Ab1轉殖基因堆疊之葉綠體轉運肽(TRAP 4、TRAP 8或TRAP 12)的基因轉殖事件穩健地表現CRY34Ab1和CRY35Ab1蛋白質，此外，包含連接至cry34Ab1轉殖基因並與cry35Ab1轉殖基因堆疊之葉綠體轉運肽(TRAP 4、TRAP 8或TRAP 12)的基因轉殖事件提供該基因轉殖植物昆蟲抗性。
實例11：切除者構築體之設計與準備以及基因轉殖大豆生產
充分利用與菸草和玉蜀黍中鋅指核酸酶介導之轉殖基因刪除的經驗，且基於由快速測試測定中生物方法獲得之裂解結果，鑑別出用於在大豆測試的兩個eZFN(eZFN4和eZFN14)。再者，為鑑別合適的調控元件與有效切除所需之表現程度，選擇三種不同集合之調控元件，例如AtUbi10/AtUbi10、AtUbi3/AtUbi3、CsVMV/AtuORF23(用於菸草的標準品)，與eZFN4(SEQ ID NO：22)和/或eZFN14(SEQ ID NO：23)的組合來測試。四個構築體(圖7)被用於基因轉殖生產以產生全部共65個高品質的事件(表8)。
11.1：pDAB122423之設計與構築
使用本領域公認之指南設計並構築包含一第一鋅指核酸酶基因表現卡匣與一第二pat基因表現卡匣的pDAB122423質體。所產生之第一鋅指核酸酶基因表現卡匣包含下列基因元件：阿拉伯芥泛素3啟動子(AtUbi3；Callis等人(1995)Genetics 139(2)：921-39)：：辨識並裂解eZFN4之鋅指核酸酶基因的編碼序列(eZFN4；PCT/US2011/022145)：：由阿拉伯芥泛素3終止。該第二pat基因表現卡匣包含下列基因元件：木薯脈花葉病毒啟動子(CsVMV；Verdaguer等人，1996,Plant Molecular Biology 31：1129-1139)：：草丁膦乙醯轉移酶基因(pat,Wohlleben et al.(1988)Gene 70：25-37)：：由根癌土壤桿菌orf-1 3' UTR (AtuORF1；Huang等人，J.Bacteriol.172：1814-1822)終止。此質體之組合係經由限制酶碎解與定序反應確認並提供於圖7。
11.2：pDAB122432之設計與構築
使用本領域公認之指南設計並構築包含一第一鋅指核酸酶基因表現卡匣與一第二pat基因表現卡匣的pDAB122432質體。所產生之第一鋅指核酸酶基因表現卡匣包含下列基因元件：阿拉伯芥泛素10啟動子(AtUbi10；Callis等人(1990)J.Biol.Chem.265：12486-93)：：辨識並裂解eZFN4之鋅指核酸酶基因的編碼序列：：由阿拉伯芥泛素10終止。該第二pat基因表現卡匣包含下列基因元件：CsVMV啟動子：：pat基因：：由AtuORF1終止。此質體之組合係經由限制酶碎解與定序反應確認並提供於圖7和圖8。
11.3：pDAB122427之設計與構築
使用本領域公認之指南設計並構築包含一第一鋅指核酸酶基因表現卡匣與一第二pat基因表現卡匣的pDAB122427質體。所產生之第一鋅指核酸酶基因表現卡匣包含下列基因元件：CsVMV啟動子.辨識並裂解eZFN4之鋅指核酸酶基因的編碼序列：：由根癌土壤桿菌orf-23 3' UTR(AtuORF23；Barker et al.,Plant Molecular Biology 1983,2(6),335-50)終止。該第二pat基因表現卡匣包含下列基因元件：CsVMV啟動子：：pat基因：：由AtuORF1終止。此質體之組合係經由限制酶碎解與定序反應確認並提供於圖7。
11.4：pDAB122426之設計與構築
使用本領域公認之指南設計並構築包含一第一鋅指核酸酶基因表現卡匣與一第二pat基因表現卡匣的pDAB122426質體。所產生之第一鋅指核酸酶基因表現卡匣包含下列基因元件：CsVMV啟動子：：辨識並裂解eZFN14之鋅指核酸酶基因的編碼序列：：由根癌土壞桿菌orf-23 3' UTR(AtuORF23；Barker et al.,Plant Molecular Biology 1983,2(6),335-50)終止。該第二pat基因表 現卡匣包含下列基因元件：CsVMV啟動子：：pat基因：：由AtuORF1終止。此質體之組合係經由限制酶碎解與定序反應確認並提供於圖7。
11.5：pDAB 105988之設計與構築
使用本領域公認之指南設計並構築包含一第一鋅指核酸酶基因表現卡匣與一第二黃色螢光蛋白(YFP)基因表現卡匣的pDAB105988質體。所產生之第一pat基因表現卡匣包含下列基因元件：組成型CsVMV基因啟動子：：pat的編碼序列：：以及來自AtuORF23基因的3'非轉譯區和終止子。該第二YFP基因表現卡匣包含下列基因元件：AtUbi10啟動子：：Phialidium sp.黃色螢光蛋白基因(PhiYFP,Evrogen,Moscow,Russia)，以及來自根癌土壤桿菌之ORF1基因的3'非轉譯區和終止子(AtuORF1 3’UTR,(Barker等人，1983))。第三部分HPT基因表現卡匣包含下列基因元件：阿拉伯芥類硫醇還原酶蛋白質基因內含子(At3g25580)、潮黴素磷酸轉移酶基因之3'區(HPT(美國專利5,668,298))以及來自AtuORF23基因的3'非轉譯區和終止子。該pat基因卡匣係被用於eZFN2之結合位點所側接(PCT/US2011/022145)；該pat YFP基因與HPT部分基因卡匣係被用於eZFN4之結合位點所側接(PCT/US2011/022145)且該HPT部分基因卡匣係被eZFN3所側接(PCT/US2011/022145)。此外，在YFP與部分HPT基因卡匣之間有一CCR5 ZFN結合位點(美國專利公開號2008/0159996)。在pat與YFP基因卡匣之間存有大約1kb區域的隨機DNA(美國專利公開號20150040267)。此質體之組合係經由限制酶碎解與定序反應確認並提供於圖11。
實例12：植物轉形與基因轉殖事件之分子確認
使用基於農桿菌轉形法將上述之四個構築體(圖7)導入至大豆c.v.Maverick轉形株。用於基因轉殖生產的方法係描述於美國專利公開號2014/0173774 A1，並造成65個高品質事件(表8)。
為拷貝數分析，播種三週後從充分擴展的枳葉收集葉組織。使用THERMO FISHER KINGFISHERTM磁粒子處理器(Waltham,MA)與供應商建議的方式以QIAGEN MAGATTRACTTM套組(Valencia,CA)萃取基因體DNA。使用用於AAD12、PAT、YFP與ZFN基因之特定的水解探針測定轉殖基因拷貝數。發展用於外源性大豆低拷貝數保留區GMS116(GenBankTM登記編號AK286292.1)之水解探針測定作為內部參考標準。
表9列出水解探針測定成份的寡核苷酸序列。引子與BHQ探針係由INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES(Coralville,IA)合成，而MGB探針係由APPLIED BIOSYSTEMS(Grand Island,NY)合成。根據表10以約10ng之DNA設置雙重水解探針PCR反應，且測定條件顯示於表11。
為用於擴增反應，在包含0.1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.4μM之每一引子以及0.2μM之每一探針的10μL體積多重反應中以1X最終濃度製備LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix主混合反應試劑(ROCHE APPLIED SCIENCE,Indianapolis,IN)。於465nm激發FAM(6-羧基螢光素)螢光部份並在510nm量測螢光；用於HEX(六氯螢光素)螢光部份的對應值係為533nm與580nm，而用於VIC®的對應值係為538nm與554nm。使用Roche LightCycler®480即時PCR系統依據製造商的建議分析每一反應所產生的螢光程度。藉由比較未知樣品之目標/參考基因值與已知複本數標準品(1-拷貝代表半合子植物、2-拷貝代表同型合子植物)之目標/參考基因值的LightCycler®480輸出測定轉殖基因拷貝數。Cp分數，即螢光訊號與背景臨界值使用擬合點演算法交叉的點(LightCycler®軟體版本1.5)，以及Relative Quant模組(基於△△Ct法)係被用來進行即時PCR資料分析。
使用out-out PCR確認來自具正向與反向寡核苷酸側接2個eZFN辨識位點之標靶構築體pDAB105988的切除。在包含1.25單位之TaKaRa Ex TaqTM DNA聚合酶()、400nM之dNTP、正向引子(3176F：ATTGAGGGGATAAGGCCAAC；SEQ ID NO：36)反向引子(9779R：TACTGCCGTGACGTAGCATC；SEQ ID NO：37)各200nM和30ng之基因體DNA的50μl反應物中，使用Biometra T Professional Thermacycler(Biometra GmbH,Goettingen,Germany)進行PCR擴增反應。使用下列標準PCR程序：在 95ºC變性10分鐘；35次循環之98ºC15秒、60ºC30秒與72ºC45秒。百分之十的PCR產物係可視化於2%洋菜糖E-凝膠(Life Technologies,Carlsbad,CA)上。使用PurelinkTM quick PCR純化套組純化剩餘之反應物，並送至Eurofins MWG Operon(Huntsville,AL)直接定序。使用DNA序列分析軟體Sequencher 4.10.1(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)比對。
實例13：切除者株系之表徵與選擇以及T2種子製造
根據為選擇切除者株系所建立之標準表徵T1事件，即遺傳性、分離、1-2拷貝數、完整PTU、基因位置與表現。完成包含用於遺傳性之除草劑噴霧、用於同型合子之分離與鑑別的DNA分析、拷貝數與缺少主鏈、用於表現之RNA分析以及用於完整PTU之NGS的多種活動，總共選出8個切除者株系(每構築體2個-表12)以用來雜交並培植於大盆，以確保從同型合子植物製造足量的T2種子以產生大量雜交。
實例14：F1基因型之雜交與分析
總共完成6,480個雜交，包括16個雜交重組(8切除者株系x 2相互交叉)。所產生之F1 3,818種子中，2,466 F1子代係藉由qPCR分析F1群組中之PAT、YFP、AAD12與ZFN。F1包含1拷貝之標靶與1拷貝之切除者。對於具標靶株系pDAB105988.19.104.003-1-6-99的雜交，可用2拷貝之PAT與1拷貝之ZFN基因確認F1植物。具有減少之YFP拷貝數(<1n)的任何植物係為用於切除的潛在候選者(圖10A)。如圖11所指出，具有YFP切除的植物可能相對不具有從qPCR得來之螢光訊號。這些植物係被歸類為具有完全切除。若植物具有中等訊號(以YFP對內源性參考GMS116之相對比率0.8作為任意的截止點)，他們被認為是嵌合切除。對於具有標靶株系pDAB112797.2.046.001-1-4的雜交，尚未進行切除之F1植物可確認具有1拷貝之AAD12、2拷貝數之PAT與1拷貝之ZFN基因。具有減少之PAT拷貝數(<2n)的任何植物係為用於切除的潛在候選者(圖10B)。
根據以qPCR分析之2,466 F1子代，使用兩種不同的啟動子/終止子組合，AtUbi10/eZFN4-HF/AtUbi10和AtUbi3/eZFN4/AtUbi3從eZFN4鑑別出具成功完全切除之植物的頻率分別為1.23%和0.13%(表13)。在全部四種構築體中偵測到範圍從1.58%至10.68%的嵌合體切除。
實例15：於F2世代之分析
為測試是否YFP切除被傳送到下一世代，將18F1植物的F2子代種植於溫室並以qPCR進行對PAT、YFP和ZFN4的拷貝數分析。(F1親代係源自於切除者ZFN4 pDAB122432.3.082與標靶株系pDAB105988.19.104雜交：1顯示完全切除、6係為嵌合體以及11顯示沒有切除的證據。)由qPCR鑑別為缺乏YFP的任何F2植物，進一步使用out-out PCR確認進行了切除。可用擴增子定序揭露切除足跡。
未計算切除速率，未繼承任何標靶基因座的植物(無效以及只有切除者的植物)係被排除在總結之外(表14)。在F1代中顯示完全切除之一事件的情形下，所有具標靶的F2植物皆如預期有切除的YFP，確認100%遺傳性。對於在F1代中偵測得之不具切除的植物，在F2中仍有0.63%完全切除。嵌合F1事件在F2代具有2.06%完全切除。
完全切除之F2植物係以out-out PCR確認，其使用正向和反向寡核苷酸側接兩個eZFN4識別位點在pDAB105988上。將PCR產物送至擴增子Sanger定序。定序結果顯示ZFN結合位點在完全切除YFP植物不再包含切除者元件後恢復。對於具切除者拷貝數之切除的F2植物，新修復的ZFN結合位點係受制於DSB和不完美修復的持續產生，導致與INDEL的嵌合足跡。
本發明之各方面已描述於某些實施例中，可在本公開說明之精神與範圍內進一步修改。因此，本申請旨在涵蓋本發明之實施例使用其一般原則的任何變化、使用或改編。此外，本申請旨在涵蓋此類偏離本公開說明者，這些偏離係在這些實施例之領域的已知或慣例實踐中且在所附之申請專利範圍內。
<110> 陶氏農業科學公司
<120> 位點特異性核酸酶結合位點之重構
<130> 78591-US-PSP
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 用於位點特異性核酸酶之獨特結合位點
<400> 1
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 2
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子/探針序列
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 5
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 6
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子/探針序列
<400> 7
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 8
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子/探針序列
<400> 10
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 11
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 12
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子/探針序列
<400> 13
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 14
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子序列
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 引子/探針序列
<400> 16
<210> 17
<211> 74
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 修復之結合位點的定序結果，其係被位點特異性核酸酶切除並重新結合以產生一可 被相同位點特異性核酸酶裂解之結合位點
<220>
<221> eZFN2結合位點
<222> (21)..(57)
<400> 17
<210> 18
<211> 3453
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被eZFN2結合位點側接之AAD-1基因表現卡匣
<220>
<221> eZFN2結合位點
<222> (1)..(37)
<220>
<221> eZFN2結合位點
<222> (3417)..(3453)
<400> 18
<210> 19
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAP4與Cry34ab1融合基因
<400> 19
<210> 20
<211> 570
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Trap8與Cry34Ab1融合基因
<400> 20
<210> 21
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAP12與cry34ab1融合基因
<400> 21
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eZFN4結合位點
<400> 22
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eZFN14結合位點
<400> 23
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於AAD-12之正向引子
<400> 24
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於AAD-12之探針
<400> 25
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於AAD-12之反向引子
<400> 26
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於YFP之正向引子
<400> 27
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於YFP之探針
<400> 28
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於YFP之反向引子
<400> 29
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於FokI之正向引子
<400> 30
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於FokI之探針
<400> 31
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於FokI之反向引子
<400> 32
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於GMS116之正向引子
<400> 33
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於GMS116之探針
<400> 34
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於GMS116之反向引子
<400> 35
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於out-out PCR之3176F正向引子
<400> 36
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於out-out PCR之9779R反向引子
<400> 37

Claims (27)

  1. 一種用於製造一修復的位點特異性核酸酶結合位點的方法，該方法包括下列步驟：a.提供一基因體，該基因體包括一位點特異性核酸酶結合位點之一第一拷貝、一介入聚核苷酸序列以及該位點特異性核酸酶結合位點之一第二拷貝，其中該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝與該位點特異性核酸酶結合位點之第二拷貝係為完全相同的；b.引入一位點特異性核酸酶，該位點特異性核酸酶係設計成在該位點特異性核酸酶結合位點結合並裂解；c.切割該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝；d.切割該位點特異性核酸酶結合位點之該第二拷貝；e.將該第一切割之位點特異性核酸酶結合位點與該第二切割之位點特異性核酸酶結合位點重新組合；f.製造該修復之位點特異性核酸酶結合位點，其中該修復之位點特異性核酸酶結合位點與該位點特異性核酸酶結合位點之該第一拷貝係為完全相同的。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該位點特異性核酸酶係選自由鋅指核酸酶、TALEN核酸酶、CRISPR核酸酶、TALEN核酸酶或其任何組合所組成之群。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該鋅指核酸酶包括FokI核酸酶。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該FokI核酸酶包括高保真FokI核酸酶。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該介入聚核苷酸序列係被完全自該基因體移除。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該介入聚核苷酸序列包括一轉殖基因。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該轉殖基因編碼一可篩選標記。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該修復之位點特異性核酸酶結合位點係經由NHEJ介導之細胞過程修復。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該修復之位點特異性核酸酶結合位點於長度上係大於6bp。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該位點特異性核酸酶結合位點之第一拷貝係位於該位點特異性核酸酶結合位點之第二拷貝的3,000bp至4,000bp內。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該修復之位點特異性核酸酶不包括INDEL。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該位點特異性核酸酶結合位點之第一拷貝、該介入聚核苷酸序列與該位點特異性核酸酶結合位點之第二拷貝包括一天然的基因體序列或真核生物之基因體內的基因轉殖序列。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，該方法進一步包含以下步驟： g.以該位點特異性核酸酶標靶針對該修復之位點特異性核酸酶結合位點；h.以該位點特異性核酸酶切割該修復之位點特異性核酸酶結合位點；i.引入一供體多核苷酸序列；j.在該切割之位點特異性核酸酶結合位點內整合該供體多核苷酸序列；以及k.製造一包括該供體聚核苷酸序列穩定整合至該基因體內的基因體。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該介入核苷酸序列包括一編碼轉殖基因或基因表現卡匣的聚核苷酸。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該位點特異性核酸酶結合位點係為迴文的。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該位點特異性核酸酶結合位點係為非迴文的。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該修復之位點特異性核酸酶結合位點係被遺傳於後代。
  18. 一種植物，其包括如申請專利範圍第1項所述之該修復之位點特異性核酸酶結合位點。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之植物，其中該植物包括一基因轉殖事件。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之植物，其中該基因轉殖事件包括一農藝性狀。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之植物，其中該農藝性狀係選自由殺蟲劑抗性性狀、除草劑耐受性性狀、氮利用效率性狀、水分使用效率性狀、營 養品質性狀、DNA結合性狀、小RNA性狀、可篩選標記性狀或其任何組合所組成之群。
  22. 如申請專利範圍第20項所述之植物，其中該農藝性狀包括除草劑耐受性性狀。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之植物，其中該除草劑耐受性性狀包括 aad-1編碼序列。
  24. 如申請專利範圍第19項所述之植物，其中該基因轉殖植物製造出商品化產物。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之植物，其中該商品化產物係選自由蛋白質濃縮物、蛋白質分離物、穀物、膳食、麵粉、油或纖維所組成之群。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之植物，其中該基因轉殖植物係選自由雙子葉植物或單子葉植物所組成之群。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之植物，其中該單子葉植物係為 玉蜀黍植物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112083171A (zh) * 2020-09-07 2020-12-15 中国人民解放军总医院第八医学中心 Ku70蛋白T455位点磷酸化抑制剂及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018111640A1 (en) * 2016-12-14 2018-06-21 Dow Agrosciences Llc Reconstruction of site specific nuclease binding sites
US11326177B2 (en) 2020-07-31 2022-05-10 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR12 transgenic maize
US11369073B2 (en) 2020-07-31 2022-06-28 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR12 transgenic maize
US11214811B1 (en) 2020-07-31 2022-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR6 transgenic maize
US20240011043A1 (en) 2020-07-31 2024-01-11 Inari Agriculture Technology, Inc. Generation of plants with improved transgenic loci by genome editing
US11242534B1 (en) * 2020-07-31 2022-02-08 Inari Agriculture Technology, Inc. INHT31 transgenic soybean

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
US6750379B2 (en) 2000-03-09 2004-06-15 Dekalb Genetics Corporation Homologous recombination-mediated transgene alterations in plants
DE10131786A1 (de) 2001-07-04 2003-01-16 Sungene Gmbh & Co Kgaa Rekombinationssysteme und Verfahren zum Entfernen von Nukleinsäuresequenzen aus dem Genom eukaryotischer Organismen
EP1869186B1 (en) 2005-04-04 2010-10-13 Bayer BioScience N.V. Methods and means for removal of a selected dna sequence
PH12012501467B1 (en) 2010-01-22 2018-07-04 Corteva Agriscience Llc Excision of transgenes in genetically modified organisms
MX336846B (es) * 2010-01-22 2016-02-03 Sangamo Biosciences Inc Alteracion genomica dirigida.
PT2525650T (pt) * 2010-01-22 2017-06-27 Dow Agrosciences Llc Zonas de entrada geneticamente manipuladas para o direcionamento de genes em plantas
AU2013259647B2 (en) * 2012-05-07 2018-11-08 Corteva Agriscience Llc Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
CN105263312A (zh) 2013-04-05 2016-01-20 美国陶氏益农公司 用于在植物基因组内整合外源序列的方法和组合物
BR112015031639A2 (pt) * 2013-06-19 2019-09-03 Sigma Aldrich Co Llc integração alvo
CN108513580A (zh) * 2015-10-08 2018-09-07 哈佛学院董事及会员团体 多重基因组编辑
WO2018111640A1 (en) * 2016-12-14 2018-06-21 Dow Agrosciences Llc Reconstruction of site specific nuclease binding sites

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112083171A (zh) * 2020-09-07 2020-12-15 中国人民解放军总医院第八医学中心 Ku70蛋白T455位点磷酸化抑制剂及其应用

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