TW201901153A - 折疊錯誤之ｔａｕ蛋白的檢測及檢測折疊錯誤之ｔａｕ蛋白的套組 - Google Patents

折疊錯誤之ｔａｕ蛋白的檢測及檢測折疊錯誤之ｔａｕ蛋白的套組 Download PDF

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本尼迪克特Ｋ 福爾拉特
穆罕默德 沙赫纳瓦兹
尼古拉斯 門德斯 迪納馬卡
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Abstract

提供用於自樣本，例如，自具有Tau蛋白病之患者擴增及檢測折疊錯誤之tau蛋白的方法及套組，前述Tau蛋白病諸如阿茲海默症、進行性上眼神經核麻痺症等。

Description

折疊錯誤之TAU蛋白的檢測及檢測折疊錯誤之TAU蛋白的套組
相關申請案之交互參照
本申請案主張2017年5月16日申請的美國臨時專利申請案第62/507,166號之優先權，其全部內容係以引用方式併入本文中。
Tau蛋白病(tauopathy)可包括例如阿茲海默症(Alzheimer's disease；AD)、帕金森氏症(Parkinson's Disease；PD)、進行性上眼神經核麻痺症(Progressive Supranuclear Palsy；PSP)、額顳葉失智症(FrontoTemporal Dementia；FTD)、皮質基底核退化症(Corticobasal degeneration；CBD)、輕度認知障礙(Mild cognitive impairment；MCI)、嗜銀顆粒病(Argyrophilic grain disease；AgD)、創傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury；TBI)、慢性創傷性腦病變(Chronic Traumatic Encephalopathy；CTE)、及拳擊員癡呆(Dementia Pugilistica；DP)、及類似疾病。折疊錯誤之tau聚集體及小纖維(fibrils)可經由成核及生長來形成並累積。折疊錯誤之tau聚集體可誘導細胞官能不良及組織損傷以及其他效應。
已證實即時震動誘導轉換(real time quaking-induced conversion；RT-QuiC)引起來自從匹克症(Pick’s disease)受試者抽取的腦均質物及腦脊髓液樣本之3-重複序列(3R)tau同功型(isoform)之複製，從而允許對此種罕有疾病之靈敏檢測及與其他Tau蛋白病之區別。然而，令人驚訝的，對於包括4R tau之折疊錯誤的具有臨床重要性之更普通Tau蛋白病而言，RT-QuiC之功效減少3至5個數量級，從而使得其對臨床及實驗室用途而言是無效及不切實際的。此等不利的結果係藉由用含有來自CBD、AgD、及FTDP-17、及PSP、以及AD(4R+3R Tau蛋白病)之病例的主導4-重複序列(4R)tau聚集體的腦樣本接種來獲得。一些AD及PSP樣本得到高於檢測極限之訊號，但該等訊號相較於匹克症腦樣本而言係離群值且為弱得多的。另外，並未針對污染來分析產生弱反應的AD及PSP樣本。4R或4R+3R Tau蛋白病之RT-QuiC分析一般而言並不呈現為與使用不患有免疫組織學檢測到的tau病理學之患病受試者的對照顯著不同。此等對照包括對以下各項之診斷：衰老(senile change；SC)、腦血管疾病(cerebrovascular disease；CVD)、瀰漫性路易氏體病(diffuse Lewy body disease；DLBD)、具有TDP-43之額顳葉失智症(frontotemporal dementia with TDP-43；FTD-TDP)、及肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis；ALS)。總之，已證實RT-QuiC分析對於包括4R主導及4R+3R混合Tau蛋白病之4R Tau蛋白病而言通常為無效及不切實際的。
本申請案理解到：例如用於相關疾病之診斷的折疊錯誤之tau蛋白的檢測可為有挑戰性之事業。
在一個實施例中，提供一種用於測定樣本中存在或 不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的方法。該方法可包括執行第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(protein misfolding cyclic amplification；PMCA)程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本之第一部分與第一受質蛋白(substrate protein)接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau蛋白。該第一PMCA程序可包括在有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第一培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由分析第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。
在另一實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在相應於第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的Tau蛋白病的方法。該方法可包括提供來自受試者之樣本。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本之第一部分與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括tau同功型。該第一受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括在有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養 循環可包括破壞第一培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由分析第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在該Tau蛋白病。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。該方法可提供：當第一受質蛋白由單體3R tau組成時，Tau蛋白病排除匹克症。
在一個實施例中，提供一種使用捕獲以用於測定樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的方法。該方法可包括自該樣本捕獲該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體以形成經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體與莫耳過量之第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該莫耳過量可大於經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中包括的蛋白質單體之量。該方法可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第一培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定該樣本中存在或不存 在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。
在另一實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括阿茲海默症(AD)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在AD。
在一個實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括帕金森氏症(PD)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第一受 質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在PD。
在另一實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括進行性上眼神經核麻痺症(PSP)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚 集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在PSP。
在一個實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括額顳葉失智症(FTD)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在FTD。
在另一實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括皮質基底核退化症(CBD)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包 括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在CBD。
在一個實施例中，提供一種用於測定樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的套組。該套組可包括第一受質蛋白，該第一受質蛋白可包括4R tau。該套組可包括第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的指示劑。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可相應於Tau蛋白病。該套組可包括緩衝液。該套組可包括肝素。該套組可包括鹽。該套組可包括說明書。該說明書可指導使用者獲得樣本。該說明書可指導使用者至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本之第一部分與第一受質蛋白、該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之該指示劑、該緩衝液、該肝素、及該鹽接觸來形成第一培養混合物。該第一培養混合物可由一定濃度之以下一或多者來形成：小於約20μM之該第一受質蛋白；小於約75μM之該肝素；小於約190mM之為NaCl的鹽；及小於約9.5μM之為硫代黃素T(Thioflavin T)的該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之該指示劑。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有 效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該說明書可指導使用者藉由根據該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之該指示劑分析第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定該樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。
併入本說明書並構成本說明書之一部分的隨附圖式說明示例性方法及結果，且僅僅用於說明示例性實施例。
圖1A顯示在培養之0h、5h、10h、及24h時獲取的電子顯微照片。
圖1B為可溶性寡聚Aβ蛋白質聚集體之西方墨點。
圖2A為顯示在藉由實例1的各種濃度之合成可溶性寡聚Aβ蛋白質接種的情況下，藉由ThT螢光隨時間變化量測的未擴增類澱粉形成之圖表。
圖2B為顯示在藉由實例1的各種濃度之合成可溶性寡聚Aβ蛋白質接種的情況下，藉由ThT螢光隨時間變化量測的擴增循環加速的類澱粉形成之圖表。
圖3A為隨ThT螢光標記變化量測的類澱粉形成相對時間之圖表，其顯示藉由來自AD、NND、及NAND群組的5個代表性樣本之CSF接種的Aβ聚集之平均動力學。
圖3B為在來自AD、NND、及NAND群組之樣本存在下Aβ聚集的以h計之停滯期時間的圖表。
圖3C為顯示在來自AD、NND及NAND患者之 CSF樣本存在下，在180次Aβ-PMCA循環之後，亦即，在90h之培養(P90)之後獲得的類澱粉形成之程度的圖表。
圖4A-D為針對AD相對NAND(圖4A)、AD相對NND(圖4B)及AD相對所有對照樣本(圖4C)的使用圖3B中顯示的停滯期值對不同截止點而言真陽性率(靈敏度)隨假陽性率(特異性)變化的圖表。圖4D估算對不同組之群組比較而言的最可靠截止點。
圖5的表1顯示使用停滯期數計算的對Aβ-PMCA測試之靈敏度、特異性及預測值的估算。
圖6為在來自AD及對照患者之CSF樣本存在下，針對在300次Aβ-PMCA循環之後，亦即，在150h之培養(P150)之後獲得的樣本的以h計之停滯期時間的圖表。
圖7A為顯示使用摻入人類CSF中的合成製備之Aβ寡聚物進行的免疫耗盡之結果的西方墨點。
圖7B為顯示藉由對照及免疫耗盡CSF樣本接種的Aβ聚集之動力學的圖表。
圖7C為顯示藉由對照及免疫耗盡CSF樣本接種的Aβ聚集之動力學的圖表，該免疫耗盡CSF樣本係僅用A11構形抗體耗盡。
圖8A為用於自複合生物樣本捕獲Aβ寡聚物的ELISA固相方法之示意表示。
圖8B為用於自複合生物樣本捕獲Aβ寡聚物的磁珠固相方法之示意表示。
圖9的表2顯示特異性抗體捕獲Aβ寡聚物之能力。
圖10為類澱粉形成相對時間之圖表，其顯示因存在摻入人類血漿中之不同數量之合成寡聚物而加速Aβ聚集。
圖11為顯示在來自AD患者及對照者之血漿樣本存在下，在Aβ-PMCA檢定中達到50%聚集之時間的圖表。
圖12為西方墨點，其顯示在蛋白酶消化之後在藉由西方墨點監視的相異數量之合成Aβ寡聚物的存在下，藉由培養/音波振動處理之循環進行Aβ聚集之擴增的結果。
圖13A為硫代黃素T螢光相對時間之圖表，其顯示藉由PD-PMCA進行的對αS種子之檢測。
圖13B為將達到50%聚集之時間隨指示量之αS種子變化來作圖的圖表。
圖14顯示相對患有阿茲海默症(AD)或非神經退化性疾病(NND)之對照者，在來自人類PD患者之CSF樣本中藉由PD-PMCA檢測αS種子。
圖15的表3證明不同序列或構形抗體捕獲αS寡聚物之能力。
圖16A為用於捕獲αS寡聚物之ELISA固相方法之示意表示。
圖16B為用於捕獲αS寡聚物之磁珠固相方法之示意表示。
圖17A、17B、及17C為一系列圖表，其顯示使用三種不同的α突觸核蛋白(synuclein)抗體進行的來自人類血漿之α突觸核蛋白寡聚物之免測沉澱/抗體之結果。圖17A顯示用抗體N-19之結果。圖17B顯示用抗體211之結果。圖17C顯示用抗體C-20之結果。
圖18A、18B、及18C為一系列圖表，其顯示檢測CSF樣本中之αS種子之結果。圖18A對照樣本中之結果。圖18B顯示PD患者中之結果。圖18C顯示患有多系統萎縮症 (Multiple System Atrophy；MSA)之患者的結果。
圖19為顯示重組全長4R TAU蛋白之製備及純化的流程圖。
圖20A為根據針對各種初始量之tau種子及對照物的ThT螢光的以%計的聚集之圖表。圖20A中之值為兩次重複測試之平均值，其中誤差槓指示標準偏差。
圖20B為相對以fmol計的寡聚tau種子之量之對數，如藉由ThT螢光量測的T50即達到50%聚集之時間之圖表。
圖20C為藉由ThT螢光隨時間推移跟蹤的聚集之圖表。
圖20D為tau寡聚物之數量與Tau-PMCA訊號(達到50%聚集之時間)之間的關係的圖表。
圖20E-20L為一系列圖表，其顯示基於所測試的條件中的8個之ThT螢光的聚集結果，包括4個不同的時間點(第0天、第7天、第14天及第30天)，其中樣本經受或不經受冷凍及融化且在緩衝液或CSF存在下進行。
圖20E為在第0天基於第一種子製備之ThT螢光的聚集之圖表。
圖20F為在第7天基於第一種子製備之ThT螢光的聚集之圖表。
圖20G為在第14天基於第一種子製備之ThT螢光的聚集之圖表。
圖20H為在第30天基於第一種子製備之ThT螢光的聚集之圖表。
圖20I為在第0天基於第二種子製備之ThT螢光的聚集之圖表。
圖20J為在第7天基於第二種子製備之ThT螢光的聚集之圖表。
圖20K為在第14天基於第二種子製備之ThT螢光的聚集之圖表。
圖20L為在第30天基於第二種子製備之ThT螢光的聚集之圖表。
圖20M為顯示跨於16種不同條件的再現性的T50值之表。
圖20N為針對用1pm之tau、Aβ40、AB42、HisαSyn、HuαSyn接種及不具有種子之對照進行的tau檢定的ThT螢光相對時間之圖表。
圖21A為顯示針對以下各項的在447h之培養時之ThT螢光的圖表：患有AD之患者、患有MCI之患者、患有其他Tau蛋白病之患者、使用摻有合成Tau寡聚物(12.5fmol)之健康CSF之樣本的陽性對照、不具有Tau種子之健康CSF之樣本的陰性對照；及患有其他神經病學疾病之對照患者。
圖21B顯示來自患有AD或其他Tau蛋白病之患者的樣本的tau-PMCA之螢光訊號，其相當於在含有重組tau寡聚物之樣本中觀察到的螢光訊號。
圖22為顯示針對受AD、FTD(額顳葉失智症)、CBD(皮質基底核退化症)、及PSP(進行性上眼神經核麻痺症)影響的患者相對來自對照之代表性CSF樣本的基於ThT之聚集%相對時間之圖表。
提供用於檢測或表徵樣本中之折疊錯誤之tau蛋白的方法及套組，包括測定或診斷自其獲取樣本的受試者中之Tau 蛋白病。可形成並累積tau蛋白之折疊錯誤聚集體。折疊錯誤聚集體可誘導細胞官能不良及組織損傷以及其他效應。例如，Tau蛋白病可包括主要考慮4R之折疊錯誤或4R及3R之混合物之折疊錯誤的彼等者：阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、進行性上眼神經核麻痺症(PSP)、額顳葉失智症(FTD)、皮質基底核退化症(CBD)、輕度認知障礙(MCI)、嗜銀顆粒病(AgD)、創傷性腦損傷(TBI)、慢性創傷性腦病變(CTE)、及拳擊員癡呆(DP)、及類似疾病。
在一些實施例中，本文的Tau蛋白病可排除匹克症。在一些實施例中，本文描述的Tau蛋白病可排除主要考慮3R tau折疊錯誤之彼等者，例如，匹克症。
該方法可包括蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)，其可提供經由活體外折疊錯誤及聚集過程之人工加速及擴增對諸如tau之折疊錯誤之蛋白質聚集體的超靈敏檢測。PMCA之基本概念已在先前在實驗上針對傳染性蛋白顆粒(Soto等人，WO 2002/04954；Estrada等人，美國專利申請公開案第20080118938號，其每一者係全部以引用方式併入本文中)及針對其他蛋白質折疊錯誤，諸如阿茲海默症中「Aβ」或「β類澱粉」及帕金森氏症中之α突觸核蛋白(Soto等人，WO 2016/040907，其係全部以引用方式併入本文中)之蛋白質折疊錯誤得以證明。然而，在本文件之申請日之前，沒有參考文獻描述PCMA用於擴增及檢測相應於任何Tau蛋白病的折疊錯誤之tau蛋白，該Tau蛋白病主要考慮4R之折疊錯誤，或考慮在4R tau存在下的3R tau之折疊錯誤，或除匹克症之外的任何Tau蛋白病。本文件揭示特定的實例及細節，從而賦能PMCA技術用於檢測折疊錯誤之tau聚集體的存在或不存在，且在各種實施例中，賦能一或多種另 外PMCA程序用於檢測其他折疊錯誤之蛋白質，諸如阿茲海默症中的折疊錯誤之Aβ及帕金森氏症中的α突觸核蛋白。此一或多種另外的PMCA程序可提供在各種Tau蛋白病間的區別，例如以便將AD及PD彼此區別且與PSP、FTD、CBD、MCI、AgD、TBI、CTE、DP、及類似疾病相區別。
如本文所使用，「Aβ」或「β類澱粉」係指經由類澱粉前驅物蛋白質(amyloid precursor protein；APP)之連續分裂形成的肽。各種Aβ同功型可包括38-43個胺基酸殘基。當APP藉由β及/或γ分泌酶以任何組合方式進行加工時，可形成Aβ蛋白質。Aβ可為罹患或疑似患有AD的個體之腦中的類澱粉斑塊之成分。各種Aβ同功型可包括且不限於Aβ40及Aβ42。各種Aβ肽可與神經元破壞相關聯，該神經元破壞與AD相關聯。
如本文所使用，「αS」或「α突觸核蛋白」係指全長、140胺基酸α突觸核蛋白蛋白質，例如，「αS-140」。其他同功型或片段可包括「αS-126」，α突觸核蛋白-126，其例如歸因於失去外顯子而缺乏殘基41-54；及「αS-112」，α突觸核蛋白-112，其例如歸因於失去外顯子5而缺乏殘基103-130。αS可存在於罹患PD或疑似患有PD之個體之腦中。各種αS同功型可包括且不限於αS-140、αS-126、及αS-112。各種αS肽可與神經元破壞相關聯，該神經元破壞與AD相關聯。
如本文所使用，「tau」係指蛋白質，其為自單一基因，例如，人類之MAPT(微管相關聯蛋白質tau)進行替代剪接之產物。tau蛋白包括多達全長形式及截斷形式之任何tau同功型。各種同功型包括但不限於已知存在於人類腦組織中之六個tau同功型，其相應於在tau基因之外顯子2、3、及10中的替代剪接。三個同功型具有三個結合結構域而其他三個具有四個 結合結構域。折疊錯誤之tau可存在於罹患AD或疑似患有AD或其他Tau蛋白病之個體的腦中，該等其他Tau蛋白病如同AD考慮為在4R及3R tau同功型兩者存在下的折疊錯誤。折疊錯誤之tau亦可存在於考慮為主要4R tau同功型之折疊錯誤的疾病中，諸如進行性上眼神經核麻痺症(PSP)、tau依賴性額顳葉失智症(FTD)、皮質基底核退化症(CBD)、輕度認知障礙(MCI)、嗜銀顆粒病(AgD)、及類似疾病。
如本文所使用，「折疊錯誤之蛋白質聚集體」為部分地或完整地含有蛋白質之結構構形的蛋白質，該結構構形不同於當涉及其在生物系統中內的典型、非病原性正常功能時存在的結構構形。折疊錯誤之蛋白質可聚集。折疊錯誤之蛋白質可定位在蛋白質聚集體中。折疊錯誤之蛋白質可為無功能蛋白質。折疊錯誤之蛋白質可為蛋白質之病原性構形異構物。單體蛋白質組合物可以不具有用於與種子相關聯的折疊錯誤、寡聚、及聚集的催化活性(折疊錯誤之蛋白質寡聚物能夠在PMCA條件下催化折疊錯誤)之原生(native)、非病原性構形來提供。單體蛋白質組合物可以無種子形式提供。
如本文所使用，「單體蛋白質」係指單一蛋白質分子。「可溶性經聚集折疊錯誤之蛋白質」係指保留在溶液中的單體蛋白質之寡聚物或聚集物。可溶性折疊錯誤之蛋白質之實例可包括任何數量之蛋白質單體，只要折疊錯誤之蛋白質保持可溶即可。例如，可溶性折疊錯誤之蛋白質可包括在2個單位與約50個單位之間的單體蛋白質之單體或聚集體。
單體及/或可溶性折疊錯誤之蛋白質可聚集以形成不可溶聚集體、高階寡聚物及/或tau小纖維。例如，Aβ或tau蛋白之聚集可導致在AD或Tau蛋白病受試者中可觀察到的原 纖維、小纖維、及最終折疊錯誤之斑塊或纏結。「種子」或「核」係指折疊錯誤之蛋白質或短的分段小纖維，尤其是具有用於進一步折疊錯誤、寡聚、及聚集之催化活性的可溶性折疊錯誤之蛋白質。此種成核依賴性聚集可藉由緩慢的停滯期表徵，在該緩慢停滯期中可形成聚集體核，該聚集體核可隨後催化其他聚集體及較大寡聚物及聚合物之迅速形成。停滯期可藉由添加預形成的核或種子來最小化或移除。可提供單體蛋白質組合物，其不具有用於與折疊錯誤之種子相關聯的折疊錯誤及聚集之催化活性。單體蛋白質組合物可以無種子形式提供。
如本文所使用，「可溶性」物質可在生理條件下於生物學流體中形成溶液，而「不可溶」物質可在生理條件在此等生物學流體中作為沉澱物、小纖維、沉積物、纏結、或其他非溶解形式存在。此等生物學流體可包括例如流體，或自以下一或多者壓出的流體：羊水；膽汁；血液；腦脊髓液；耵聹(cerumen)；皮膚；滲出物；糞便；胃液；淋巴；乳汁；黏液，例如鼻分泌物；黏膜，例如，鼻黏膜；腹膜液；血漿；胸膜液；膿液；唾液；皮脂；精液；汗液；滑液；淚液；尿；及類似物。不可溶物質可包括例如Aβ、αS、4R tau、3R tau、其諸如3R tau+4R tau之組合及類似物的小纖維。在生理條件下溶於非生物流體中而不是上述生物流體之一者中的物質可視為不可溶的。例如，Aβ、αS、4R tau、3R tau、其諸如3R tau+4R tau之組合及類似物的小纖維可溶於例如諸如十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate；SDS)之表面活性劑於水中之溶液中，但仍可在生理條件下於所提及生物流體之一或多者中為不可溶的。
在一些實施例中，樣本可排除作為沉澱物、小纖維、沉積物、纏結、斑塊、或可在生理條件下不可溶於所描述 生物流體中之一或多者中的其他形式的諸如Aβ、αS、4R tau、3R tau、其諸如3R tau+4R tau之組合及類似物的折疊錯誤之蛋白質之不可溶物質。
例如，在一些實施例中，樣本可排除呈小纖維形式之tau。樣本可排除呈不可溶形式的折疊錯誤之tau蛋白，例如，樣本可排除作為沉澱物、小纖維、沉積物、纏結、斑塊、或其他不可溶形式例如呈小纖維形式的折疊錯誤之tau蛋白。本文描述的方法可包括藉由排除呈不可溶形式的折疊錯誤之tau蛋白，例如，藉由自樣本排除作為沉澱物、小纖維、沉積物、纏結、斑塊、或其他不可溶形式例如呈小纖維形式的折疊錯誤之tau蛋白來製備樣本。本文描述的套組可包括說明書，其指導使用者藉由自樣本排除作為沉澱物、小纖維、沉積物、纏結、斑塊、或其他不可溶形式例如呈小纖維形式的折疊錯誤之tau蛋白來製備樣本。此種不可溶形式之所描述折疊錯誤之蛋白質自樣本的排除可為實質或完全的。
如本文所使用，折疊錯誤之蛋白質的聚集體係指包括可溶性折疊錯誤之蛋白質的蛋白質之非共價締合物。折疊錯誤之蛋白質的聚集體可「解聚集」，或破壞以破碎或釋放可溶性折疊錯誤之蛋白質。可溶性折疊錯誤之蛋白質種子的集合之催化活性可至少部分地隨混合物中此種種子之數量來縮放。因此，破壞混合物中折疊錯誤之蛋白質的聚集體以釋放折疊錯誤之蛋白質種子可導致用於單體蛋白質之寡聚或聚集的催化活性之增加。
在各種實施例中，提供一種用於測定樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的方法。該方法可包括執行第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序。該第一PMCA程 序可包括藉由使樣本之第一部分與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau蛋白。該第一PMCA程序可包括在有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第一培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由分析第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。
在各種實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在相應於第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的Tau蛋白病的方法。該方法可包括提供來自受試者之樣本。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本之第一部分與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括tau同功型。該第一受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括在有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第一培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由分析第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在 來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在該Tau蛋白病。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。該方法可提供：當第一受質蛋白由單體3R tau組成時，Tau蛋白病排除匹克症。
在各種實施例中，提供一種使用捕獲以用於測定樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的方法。該方法可包括自該樣本捕獲該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體以形成經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體與莫耳過量之第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該莫耳過量可大於經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中包括的蛋白質單體之量。該方法可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第一培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定該樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第一受質蛋白。
在各種實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括阿茲海默症(AD)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在AD。
在一些實施例中，測定受試者中存在或不存在AD可包括藉由測定AD tau蛋白聚集體之特性(signature)來將AD與一或多種另外的Tau蛋白病區別。AD tau蛋白聚集體之特性可包括以下一或多者：以下一或多個AD-特異性相應PMCA動力學參數：停滯期、T50、擴增速率、及擴增程度；使用對AD tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；對AD tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及AD tau蛋白聚集體之頻譜特性。
在各種實施例中，提供一種用於測定受試者中存在 或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括帕金森氏症(PD)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在PD。
在一些實施例中，測定受試者中存在或不存在PD可包括藉由測定PD tau蛋白聚集體之特性來將PD與一或多種另外的Tau蛋白病區別。PD tau蛋白聚集體之特性可包括以下一或多者：以下一或多個PD-特異性相應PMCA動力學參數：停滯期、T50、擴增速率、及擴增程度；使用對PD tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；對PD tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及PD tau蛋白聚集體之頻譜特性。
在各種實施例中，提供用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括進行性上眼神經核麻痺症(PSP)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得 來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在PSP。
在一些實施例中，測定受試者中存在或不存在PSP可包括藉由測定PSP tau蛋白聚集體之特性來將PSP與一或多種另外的Tau蛋白病區別。PSP tau蛋白聚集體之特性可包括以下一或多者：以下一或多個PSP-特異性相應PMCA動力學參數：停滯期、T50、擴增速率、及擴增程度；使用對PSP tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；對PSP tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及PSP tau蛋白聚集體之頻譜特性。
在各種實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括額顳葉失智症(FTD)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第 一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在FTD。
在一些實施例中，測定受試者中存在或不存在FTD可包括藉由測定FTD tau蛋白聚集體之特性來將FTD與一或多種另外的Tau蛋白病區別。FTD tau蛋白聚集體之特性可包括以下一或多者：以下一或多個FTD-特異性相應PMCA動力學參數：停滯期、T50、擴增速率、及擴增程度；使用對FTD tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；對FTD tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及FTD tau蛋白聚集體之頻譜特性。
在各種實施例中，提供一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病之方法，該Tau蛋白病包括皮質基底核退化症(CBD)。該方法可包括提供該受試者。該方法可包括獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該方法可包括至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本與第 一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物。該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一PMCA程序可包括藉由檢測在第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定受試者中存在或不存在CBD。
在一些實施例中，測定受試者中存在或不存在CBD可包括藉由測定CBD tau蛋白聚集體之特性來將CBD與一或多種另外的Tau蛋白病區別。CBD tau蛋白聚集體之特性可包括以下一或多者：以下一或多個CBD-特異性相應PMCA動力學參數：停滯期、T50、擴增速率、及擴增程度；使用對CBD tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；對CBD tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及CBD tau蛋白聚集體之頻譜特性。
在其他實施例中，上文描述的方法中之每一者可併入以下特徵之一或多者。詳言之，參考任何蛋白質受質、折疊錯誤之蛋白質聚集體、擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體、培養混合物、PMCA程序、樣本之部分、及類似物描述的每一特徵應理解為在各種其他實施例中獨立選擇的情況下描述任何其他蛋白質受質、折疊錯誤之蛋白質聚集體、擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體、培養混合物、PMCA程序、樣本之部分、及類似物。 例如，對「第一」蛋白質受質描述的特徵可在一些實施例中亦獨立地選擇來描述「第二」蛋白質受質；對「第一」折疊錯誤之蛋白質聚集體描述的特徵亦可獨立地選擇來描述「第二」折疊錯誤之蛋白質聚集體；對「第一」培養混合物描述之特徵亦可獨立地選擇來描述「第二」培養混合物；對「第一」PMCA程序描述之特徵亦可獨立地選擇來描述「第二」PMCA程序；及類似情況。另外，例如，參考「每一」蛋白質受質、折疊錯誤之蛋白質聚集體、擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體、培養混合物、PMCA程序、樣本之部分、及類似物描述的特徵應理解為在各種其他實施例中獨立選擇的情況下描述任何其他枚舉的要素，例如，如應用於蛋白質受質、折疊錯誤之蛋白質聚集體、擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體、培養混合物、PMCA程序、樣本之部分、及類似物的「第一」、「第二」、「第三」、及類似物。例如，參考「每一受質蛋白」之描述可獨立地選擇來描述並支援對「第一受質蛋白」、「第二受質蛋白」、「第三受質蛋白」及類似物之敘述。
在若干實施例中，一般對所枚舉或指定要素例如「第一」、「第二」、「每一」、及類似物描述的特徵可獨立地選擇為相同或相異的。例如，在一些實施例中，第一受質蛋白可包括4R tau且第二受質蛋白可包括Aβ；諸如溫度之條件可獨立地選擇用於第一及第二PMCA程序，及類似程序。在若干實施例中，一般對此等第一及第二要素描述的一些特徵可選擇為相同，或重疊，而一般對此等第一及第二要素描述的其他特徵可獨立地選擇為相異。例如，在一些實施例中，樣本之第一及第二部分可為相同的或加以組合，且第一及第二培養混合物可為相同的或加以組合，而相應第一及第二PMCA程序可在使用例 如4R tau及Aβ的不同第一及第二受質蛋白之組合培養混合物中並行地或連續地進行。
在若干實施例中，可針對每一蛋白質受質、折疊錯誤之蛋白質聚集體、擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體、培養混合物、PMCA程序、樣本之部分、及類似物獨立地選擇一個、兩個、或更多個實例。例如，各種方法實施例可包括使用4R tau作為第一受質蛋白之第一PMCA程序、使用Aβ作為第二受質蛋白之第二PMCA程序、使用α突觸核蛋白作為第三受質蛋白之第三PMCA程序、使用3R tau作為第四受質蛋白之第四PMCA程序、及類似程序。可對樣本，例如，實驗室樣本，或自諸如患有Tau蛋白病之受試者的受試者抽取的樣本執行此等多個PMCA程序。可例如如下對每一蛋白質受質、折疊錯誤之蛋白質聚集體、擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體、培養混合物、PMCA程序、樣本之部分、及類似物並行地執行此等多個PMCA程序。
在各種實施例中，該方法可包括測定樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之存在。該方法可包括至少執行第二PMCA程序以測定樣本中存在或不存在至少第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括藉由使樣本之第二部分與第二受質蛋白接觸來形成第二培養混合物。該第二受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括在有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次。每一培養循環可包括在第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第二培養混合物以有效引起第二受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第二培養混合物以有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括 藉由分析第二培養混合物中該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。
在一些實施例中，該方法可包括測定樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體及第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之存在。該方法可包括至少執行第三PMCA程序以測定樣本中存在或不存在至少第三折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第三PMCA程序可包括藉由使樣本之第三部分與第三受質蛋白接觸來形成第三培養混合物。該第三受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第三折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第三PMCA程序可包括在有效形成第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次。每一培養循環可包括在第三折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第三培養混合物以有效引起第三受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第三培養混合物以有效形成第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第三PMCA程序可包括藉由分析第三培養混合物中該第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第三折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第三折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第三受質蛋白。該第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第三受質蛋白。
在若干實施例中，該方法可包括測定樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體、第二折疊錯誤之蛋白質聚集體、及第四折疊錯誤之蛋白質聚集體之存在。該方法可包括至少執行第四PMCA程序以測定樣本中存在或不存在第四折疊錯誤之蛋白 質聚集體。該第四PMCA程序可包括藉由使樣本之第四部分與第四受質蛋白接觸來形成第四培養混合物。該第四受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第四折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第四PMCA程序可包括在有效形成第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次。每一培養循環可包括在第四折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第四培養混合物以有效引起第四受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第四培養混合物以有效形成第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第四PMCA程序可包括藉由分析第四培養混合物中該第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第四折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第四折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第四受質蛋白。該第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第四受質蛋白。
在各種實施例中，第一受質蛋白可獨立地包括tau同功型，例如，3R tau、4R tau、及類似物。在若干實施例中，該第一受質蛋白可包括4R tau。該第一受質蛋白可包括3R tau。例如，當樣本相應於匹克症或自患有匹克症之受試者抽取時，該第一受質蛋白可排除3R tau。該第一受質蛋白可為可溶的。該第一受質蛋白可為單體的。該第一受質蛋白可呈原生活體內構形，例如，折疊的。該第一受質蛋白可與每一其他受質蛋白相異。
在各種實施例中，該第二受質蛋白可獨立地包括以下一者：tau同功型，例如，3R tau、4R tau、及類似物；Aβ、α突觸核蛋白、及類似物。該第二受質蛋白可包括以下一者：3R tau、Aβ、α突觸核蛋白、及類似物。該第二受質蛋白可包括3R tau。該第二受質蛋白可包括Aβ。該第二受質蛋白可包括α突觸核蛋白。該第二受質蛋白可主要由以下一者組成，或由以下一者組成：3R tau、4R tau、Aβ、或α突觸核蛋白。該第二受質蛋白可為可溶的。該第二受質蛋白可為單體的。該第二受質蛋白可呈原生活體內構形，例如，折疊的。該第二受質蛋白可與每一其他受質蛋白相異。
在各種實施例中，該第三受質蛋白可獨立地包括以下一者：tau同功型，例如，3R tau、4R tau、及類似物；Aβ、α突觸核蛋白、及類似物。該第三受質蛋白可包括以下一者：3R tau、Aβ、α突觸核蛋白、及類似物。該第三受質蛋白可包括3R tau。該第三受質蛋白可包括Aβ。該第三受質蛋白可包括α突觸核蛋白。該第三受質蛋白可主要由以下一者組成，或由以下一者組成：3R tau、4R tau、Aβ、或α突觸核蛋白。該第三受質蛋白可為可溶的。該第三受質蛋白可為單體的。該第三受質蛋白可呈原生活體內構形，例如，折疊的。該第三受質蛋白可與每一其他受質蛋白相異。
在各種實施例中，該第四受質蛋白可獨立地包括以下一者：tau同功型，例如，3R tau、4R tau、及類似物；Aβ、α突觸核蛋白、及類似物。該第四受質蛋白可包括以下一者：3R tau、Aβ、α突觸核蛋白、及類似物。該第四受質蛋白可包括3R tau。該第四受質蛋白可包括Aβ。該第四受質蛋白可包括α突觸核蛋白。該第四受質蛋白可主要由以下一者組成，或由以下一者組成：3R tau、4R tau、Aβ、或α突觸核蛋白。該第四受質蛋白可為可溶的。該第四受質蛋白可為單體的。該第四受質蛋白可呈原生活體內構形，例如，折疊的。該第四受質蛋白可與每一其他受質蛋白相異。
在一些實施例中，該樣本可取自受試者。該方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定或診斷受試者中存在或不存在Tau蛋白病。
在若干實施例中，該方法可包括至少執行第二PMCA程序以測定樣本中存在或不存在第二折疊錯誤之蛋白質聚集體，例如，包括第二受質蛋白的折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括藉由使樣本之第二部分與第二受質蛋白接觸來形成第二培養混合物。該第二受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該等方法可包括藉由分析第二培養混合物中該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。該第二受質蛋白可包括以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、及3R tau。
在一些實施例中，該樣本可取自受試者。該等方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定或診斷受試者中存在或不存在Tau蛋白病。該等方法可包括至少執行第二PMCA程序以測定樣本中存在或不存在第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括藉由使樣本之第二部分與第二受質蛋白接觸來形成第二培養混合物。該第二受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括在有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次。每一培養循環可包括在第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第二培養混合物以有效引起第二受質蛋白 之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第二培養混合物以有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括藉由分析第二培養混合物中該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。
在各種實施例中，該受試者可患有Tau蛋白病。該等方法可包括根據：樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之存在；及樣本中第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之存在或不存在來表徵受試者中的Tau蛋白病之身份(identity)。該第二受質蛋白可包括以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、及3R tau。例如，折疊錯誤之4R tau聚集體作為第一折疊錯誤之蛋白質聚集體及Aβ作為第二折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在可指示受試者中之Tau蛋白病為AD；折疊錯誤之4R tau聚集體作為第一折疊錯誤之蛋白質聚集體及α突觸核蛋白作為第二折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在可指示受試者中之Tau蛋白病為PD；折疊錯誤之4R tau聚集體作為第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在及包括Aβ、α突觸核蛋白、或3R的第二折疊錯誤之蛋白質聚集體的不存在可指示4R Tau蛋白病，諸如PSP、CBD、AGD、及類似物。
在各種實施例中，該Tau蛋白病可包括原發性Tau蛋白病或繼發性Tau蛋白病。該Tau蛋白病可至少部分地藉由4R tau蛋白之折疊錯誤及/或聚集來表徵。該Tau蛋白病可至少部分地藉由4R tau蛋白及3R tau蛋白之折疊錯誤及/或聚集來表徵。該Tau蛋白病可至少部分地藉由約以下之一的折疊錯誤及/ 或聚集之4R tau蛋白與折疊錯誤及/或聚集的3R tau蛋白之比率來表徵：1：99、5：95、10：90、15：85、20：80、25：75、30：70、35：65、40：60、45：55、50：50、55：45、60：40、65：35、70：30、75：25、80：20、85：15、90：10、95：5、及99：1，或前述比率之任何兩者之間的範圍，例如，1：99與99：1之間。
在若干實施例中，該等方法可包括藉由針對以下至少一者之特性來分析第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體或其一或多個相應PMCA動力學參數來表徵Tau蛋白病之身份：阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、進行性上眼神經核麻痺症(PSP)、額顳葉失智症(FTD)、皮質基底核退化症(CBD)、輕度認知障礙(MCI)、嗜銀顆粒病(AgD)、創傷性腦損傷(TBI)、慢性創傷性腦病變(CTE)、及拳擊員癡呆(DP)。例如，表徵Tau蛋白病之身份可包括測定一或多個相應PMCA動力學參數，包括以下一或多者：停滯期、T50、擴增速率、及擴增程度。表徵Tau蛋白病之身份可包括將一或多個相應PMCA動力學參數與為Tau蛋白病之身份之特性的一或多個相應預定相應PMCA動力學參數比較來判定相似性或差異以有效表徵Tau蛋白病之身份。
在一些實施例中，該等方法可包括使用對Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體表徵Tau蛋白病之身份。該等方法可包括使用對Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑表徵Tau蛋白病之身份。對每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑可包括小分子、肽、或DNA或RNA適配體；及類似物。該等方法可包括使用每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體的頻譜特性表徵Tau蛋白病之身份。
在一些實施例中，該等方法可包括例如藉由分析每 一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之蛋白水解抵抗力表徵Tau蛋白病之身份。例如，每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體可與例如蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、及類似物的蛋白酶以0.1至5000μg/mL之蛋白酶濃度在自20℃至120℃之各種溫度下接觸並歷時例如自1min至4h之各種時間。每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之蛋白水解抵抗力可經表徵且用於區別各種Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體。
在若干實施例中，該等方法可包括藉由分析每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體對變性的穩定性來表徵Tau蛋白病之身份。例如，每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體可用胍鹽或尿素在誘導每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之蛋白質變性的足夠高溫下處理。胍鹽或尿素之濃度可在0.1M至8M之範圍。該溫度可在20℃至120℃之間的範圍。每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之穩定性可經表徵並用於區別各種Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體。
該等方法可包括每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之沉澱。該等方法可包括凝膠層析以表徵每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之大小。該等方法可包括每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之圓偏光二色性光譜學(circular dichroism spectroscopy)。該等方法可包括傅立葉轉換紅外光譜學以分析每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之二級結構。該等方法可包括核磁共振光譜學以分析每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之結構。該等方法可包括質譜法，例如，破碎及碰撞誘導之解離 以分析每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之二級及三級結構。該等方法可包括顯微術，例如，原子力顯微術、低溫電子顯微術、及類似物以分析每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之形態學。該些方法中之每一者可與使用具有不同質量、磁性性質、及/或同位素穩定性之原子同位素進行的置換聯用以對該等方法進行補充；例如，核磁共振光譜學可與每一Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體中之氘交換聯用以獲得結構資訊。
在各種實施例中，該等方法經提供以使得Tau蛋白病特定地排除匹克症。在各種實施例中，匹克症之排除不涵蓋匹克複合疾病之剩餘者。
在若干實施例中，該等方法可包括測定或診斷受試者中存在或不存在Tau蛋白病，包括將樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在與取自對照受試者之對照樣本比較。該檢測可包括檢測樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量。該樣本可取自受試者。該等方法可包括藉由將樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量與預定閾值量比較來測定或診斷受試者中存在或不存在Tau蛋白病。該樣本可取自根據認知測試不呈現失智症之臨床徵象的受試者。該等方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定或診斷受試者中存在或不存在Tau蛋白病。該樣本可取自根據對比度成像不呈現皮層斑塊或纏結之受試者。該等方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定或診斷受試者中存在或不存在Tau蛋白病。該樣本可取自根據認知測試呈現失智症之臨床徵象的受試者。該等方法可包括根據樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定 或診斷受試者中存在或不存在作為失智症之臨床徵象的促成因子之Tau蛋白病。該樣本可取自根據認知測試不呈現失智症之臨床徵象的受試者。該受試者可根據遺傳測試呈現對失智症之傾向。遺傳測試可例如根據ApoE4對偶基因、腦源性神經滋養因數(brain derived neurotrophic factor；BDNF)基因諸如val66met對偶基因(其中AA位置66處之纈胺酸由甲硫胺酸替代)之變異體、及類似物之一或兩個複本來指示增加的Tau蛋白病風險。該等方法可包括根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定或診斷受試者中存在或不存在Tau蛋白病。
在一些實施例中，該等方法可包括製備第一培養混合物，該第一培養混合物藉由以下至少一個濃度表徵：小於約20μM之第一受質蛋白；小於約75μM之肝素；小於約190mM之NaCl；及小於約9.5μM之硫代黃素T。
在各種實施例中，該等方法可包括製備第一培養混合物，其包括在約以下一或多者之以μM計的濃度下的第一受質蛋白：0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1,5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、25、50、70、100、150、200、250、500、750、1000、1500、或2000，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約0.001μM與約2000μM之間。該等方法可包括製備第一培養混合物，其藉由在約以下一或多者之以μM計的濃度下的肝素表徵：0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1,5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10 11、12、12.5、15、17.5、20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、及75，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約0.001μM與約75μM之間。該等方法可包括製備第一培養混合物，該第一培養混合物包括以下一或多者之緩衝液組合物：Tris-HCL、PBS、MES、PIPES、MOPS、BES、TES、及HEPES。該等方法可包括製備第一培養混合物，該第一培養混合物包括在約以下一或多者之總濃度下的緩衝液組合物：1μM、10μM、100μM、250μM、500μM、750μM、1mM、10mM、100mM、250mM、500mM、750mM、及1M，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約1μM與約1M之間。該等方法可包括製備第一培養混合物，該第一培養混合物包括在約以下一或多者之總濃度下的鹽組合物：1μM、10μM、100μM、250μM、500μM、750μM、1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、250mM、500mM、750mM、及1M，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約1μM與約1M之間。該鹽組合物可包括以下一或多者：NaCl及KCl。
在各種實施例中，該等方法可包括在約以下一或多者之pH下製備或維持第一培養混合物：5、5.5、6、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、或9，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約pH 5至約pH 9之間。
在一些實施例中，該等方法可包括製備第一培養混合物，該第一培養混合物包括在以下一或多者之總濃度下的指示劑：1nM、10nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、9.5μM、 10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM、750μM、1mM，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約1nM與約1mM之間。
在該等方法之一些實施例中，該培養可包括在以下一者的以℃計的溫度下加熱或維持第一培養混合物：5、10、15、20、22.5、25、27.5、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、50、55、60，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約5℃與約60℃之間。
在若干實施例中，該等方法可包括使第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑與第一培養混合物接觸。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑可藉由在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下的指示狀態及在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體不存在時的非指示狀態來表徵。測定樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在可包括檢測第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑的指示狀態。指示劑之指示狀態及指示劑之非指示狀態可藉由螢光之差異來表徵。測定樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在可包括檢測螢光之差異。該等方法可包括使莫耳過量的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑與第一培養混合物接觸。該莫耳過量可大於包括在第一受質蛋白中之蛋白質單體及第一培養混合物中之第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的總莫耳量。第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑可包括以下一或多者：硫代黃素，例如，硫代黃素T或硫代黃素S；剛果紅、m-I-二苯乙烯、金黃胺G、PIB、BF-227、X-34、TZDM、FDDNP、MeO-XO4、IMPY、NIAD-4、發光共軛聚噻吩、具有諸如綠色螢光蛋白及黃色螢光蛋白之螢光蛋白的融合物、其衍生物、及類似物。
在各種實施例中，該方法可包括測定樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量。例如，可將已知量的活體外合成的折疊錯誤之蛋白質聚集體添加至健康患者之生物流體之各種部分，例如，CSF。隨後，可對各種部分執行PMCA。在各種部分之每一者中，可添加折疊錯誤之蛋白質聚集體之螢光指示劑，且可隨例如PMCA循環之數量的變化來量測螢光以測定各種PMCA動力學參數，例如，達到最大螢光訊號之PMCA循環數量、達到最大螢光訊號之50%的PMCA循環數量、螢光訊號增加之停滯期、螢光訊號相對PMCA循環之增加速率、及類似物。校準曲線顯示所添加的合成種子之濃度與PMCA動力學參數之間的關係。可對未知樣本量測該等動力學參數且與校準曲線比較以測定存在於特定樣本中預期量之種子。替代地，樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量可藉由樣本之一系列已知稀釋液及每一連續稀釋之PMCA來測定，以測定第一折疊錯誤之蛋白質聚集體是否可在特定稀釋液中得以檢測。未稀釋樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量可基於已知稀釋液來估算，該已知稀釋液使得藉由PMCA未檢測到第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。在另一實例中，樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量可藉由樣本之一系列已知稀釋液及PMCA來測定，以測定每一連續稀釋液中的檢測訊號。連續稀釋液中所收集的檢測訊號可例如經由最小二乘方分析擬合來測定第一折疊錯誤之蛋白質聚集體是否可在特定稀釋液中得以檢測。在另一實例中，樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量可藉由已知量的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的抗體來測定
在一些實施例中，該等方法可包括在至少約以下一或多者之靈敏度下檢測樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體 之量：70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、及100%，例如，至少約70%。該等方法可包括在小於約以下一或多者下檢測樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量：625、62.5、6.25、630μg、63μg、6.3μg、630ng、63ng、6.3ng、630pg、200pg、63pg、6.3pg、630fg、300fg、200fg、125fg、63fg、50fg、30fg、15fg、12.5fg、10fg、5fg、或2.5fg。該等方法可包括在小於約以下一或多者下檢測樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量：100nmol、10nmol、1nmol、100pmol、10pmol、1pmol、100fmol、10fmol、3fmol、1fmol、100attomol、10attomol、5attomol、2attomol、1attomol、0.75attomol、0.5attomol、0.25attomol、0.2attomol、0.15attomol、0.1attomol、及0.05attomol，例如，小於約100nmol。該等方法可包括以與藉由樣本包括的第一受質蛋白之莫耳比率檢測樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量。該莫耳比率可小於約以下一或多者：1：100、1：10,000、1：100,000、及1：1,000,000，例如，小於約1：100。該等方法可包括與對照樣本比較來測定樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量。
在若干實施例中，該等方法可包括以至少約以下一或多者之特異性來檢測樣本中的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體：70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、及100%，例如，至少約70%。該等方法可包括檢測第一折疊錯誤之蛋白質聚集體，包括以下一或多者：西方墨點檢定、 點跡墨點檢定、酶聯免疫吸附檢定(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)、螢光蛋白/肽結合檢定、硫代黃素結合檢定、剛果紅結合檢定、沉澱檢定、電子顯微術、原子力顯微術、表面電漿子共振、及光譜學。ELISA可包括雙側夾心ELISA。該光譜學可包括以下一或多者：準光散射光譜學、多光譜紫外光譜學、共焦雙色螢光關聯光譜學、傅立葉轉換紅外光譜學、利用分光鏡檢測之毛細管電泳、電子自旋共振光譜學、核磁共振光譜學、及螢光共振能量轉移(Fluorescence Resonance Energy Transfer；FRET)光譜學。檢測第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括使第一培養混合物與蛋白酶接觸；及在以下一或多者中使用抗折疊錯誤之蛋白質抗體或對折疊錯誤之tau聚集體為特異性的抗體檢測第一折疊錯誤之蛋白質聚集體：西方墨點檢定、點跡墨點檢定、及ELISA。
在各種實施例中，該等方法可包括提供呈標記形式之第一受質蛋白。呈標記形式之第一受質蛋白可包括以下一或多者：共價併入之放射性胺基酸、共價併入、經同位素標記之胺基酸、及共價併入之螢光團。該等方法可包括檢測併入第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體中的呈標記形式之第一受質蛋白。
在一些實施例中，該樣本可包括以下一或多者：例如血液之生物流體、例如耵聹之生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該樣本可包括以下一或多者：羊水；膽汁；血液；腦脊髓液；耵聹；皮膚；滲出物；糞便；胃液；淋巴；乳汁；黏液；黏膜；腹膜液；血漿；胸膜液；膿液；唾液；皮脂；精液；汗液；滑液；淚液；及尿。該樣本可來源於以下一或多者之細胞或組織：皮膚、腦、心臟、肝、胰臟、肺、腎、胃腸、 神經、黏膜、血液細胞、腺、及肌肉。該等方法可包括諸如藉由抽取生物流體或生物材料，執行組織生檢、及類似方式自受試者獲得樣本。例如以流體或均質化形式添加至特定PMCA反應的樣本之每一部分之體積可為約以下一者的以μL計之體積：5,000、4,000、3,000、2,000、1000、900、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15、10、5、或1，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約1μL至約1000μL之間。在一些實施例中，當樣本為CSF時，添加至特定PMCA反應之每一部分之量可為例如約以下之前述一者的任何體積的以μL計之體積：80、70、60、50、40、30、25、20、15、或10，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約10μL至約80μL，例如，約40μL。在一些實施例中，當樣本為血漿時，添加至特定PMCA反應之每一部分之量可為例如約以下之前述一者的任何體積的以μL計之體積：750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約250μL至約750μL，例如，約500μL。在一些實施例中，當樣本為血漿時，添加至特定PMCA反應之每一部分之量可為例如約以下之前述一者的任何體積的以μL計之體積：5,000、4,000、3,000、2,000、1000、900、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、或200，或前述值之任何兩者之間的範圍，例如，約200μL至約1000μL之間。
在若干實施例中，該受試者可為以下一者：人類、小鼠、大鼠、犬、貓、牛、馬、鹿、麋鹿、綿羊、山羊、豬、及非人類靈長類動物。該受試者可為以下一或多者：患有Tau蛋白病之風險、患有Tau蛋白病、及處於針對Tau蛋白病之治 療之下。該等方法可包括藉由將樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量與比較樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量比較來測定受試者中Tau蛋白病之進程或體內環境恆定，該比較樣本係相較於樣本在不同時間取自受試者。該受試者可用Tau蛋白病調節療法來治療。該等方法可包括將樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量與比較樣本中該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量比較。該樣本及該比較樣本可在Tau蛋白病調節療法下的時間段內於不同時間取自受試者。該等方法可包括測定為以下一者的受試者：根據在該時間段內該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之改變而對Tau蛋白病調節療法有反應，或根據在該時間段內該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之體內環境恆定而對Tau蛋白病調節療法無反應。該等方法可包括用Tau蛋白病調節療法治療測定為對Tau蛋白病調節療法有反應的受試者。該等方法可包括用Tau蛋白病調節療法治療受試者以抑制第一受質蛋白之產生或抑制第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之聚集。
在一些實施例中，該受試者可用蛋白質折疊錯誤病症(protein misfolding disorder；PMD)調節療法來治療。該方法可包括將樣本中每一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量與比較樣本中每一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量比較。該樣本及該比較樣本可在每一折疊錯誤之蛋白質聚集體調節療法下的時間段內於不同時間取自受試者。該等方法可包括測定或診斷為以下一者的受試者：根據在該時間段內每一折疊錯誤之蛋白質聚集體之改變而對每一折疊錯誤之蛋白質聚集體調節療法有反應，或根據在該時間段內每一折疊錯誤之蛋白質聚集體之體內環境恆定而對每一折疊錯誤之蛋白質聚集體調節療法無反應。該方法可 包括用每一折疊錯誤之蛋白質聚集體調節療法治療測定為對每一折疊錯誤之蛋白質聚集體調節療法有反應之受試者。對於AD，例如，PMD調節療法可包括投與以下一或多者：BACE1(β分泌酶1)之抑制劑；γ-分泌酶之抑制劑；及Aβ體內環境恆定之調節劑，例如，Aβ體內環境恆定之免疫治療調節劑。該Aβ調節療法可包括投與以下一或多者：E2609；MK-8931；LY2886721；AZD3293；semagacestat(LY-450139)；avagacestat(BMS-708163)；索拉珠單抗；克雷內治單抗(crenezumab)；巴匹珠單抗(bapineuzumab)；BIIB037；CAD106；8F5或5598或針對Aβ globulomer產生的其他抗體，例如，如藉由Barghorn等人「Globular amyloid β-peptide1-42 oligomer--a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer’s disease」J.Neurochem.,2005,95,834-847所述，其全部教示內容係以引用方式併入本文中；ACC-001；V950；Affitrope AD02；及類似物。
對於PD，例如，PMD調節療法可包括主動免疫接種，諸如PD01A+或PD03A+；被動免疫接種，諸如PRX002、及類似物。PMD調節療法亦可包括用以下各項治療：GDNF(源於神經膠細胞系之神經滋養因數)、肉苷、鈣通道阻斷劑、特定而言Cav1.3通道阻斷劑諸如伊拉地平、菸鹼及菸鹼受體促效劑、GM-CSF、麩胱甘肽、PPAR-γ促效劑諸如吡格列酮、及多巴胺受體促效劑，包括D2/D3多巴胺受體促效劑及LRRK2(白胺酸富集的重複片段激酶2)抑制劑。
在若干實施例中，可使用PMCA在來自患者之樣本中量測折疊錯誤之蛋白質之量。具有升高的折疊錯誤之蛋白質量測值的患者可用針對PMD之疾病改質療法來治療。可不治療具有正常折疊錯誤之蛋白質量測值的患者。可跟蹤患者對疾 病改質療法之反應。例如，可在治療介入開始時，可在患者樣本中量測折疊錯誤之蛋白質位準。在治療患者達臨床有意義之時間段之後，可獲得另一患者樣本且可量測折疊錯誤之蛋白質位準。在治療介入之後顯示折疊錯誤之蛋白質位準之改變的患者可視為對治療有反應。顯示未改變的折疊錯誤之蛋白質位準的患者可視為無反應的。該等方法可包括在含有可干擾PMCA反應之患者樣本中檢測折疊錯誤之蛋白質聚集體。
在各種實施例中，該等方法可包括選擇性地濃縮樣本及第一培養混合物之一或多者中的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。選擇性地濃縮第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括在形成第一培養混合物之前預處理樣本。選擇性地濃縮第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括在培養第一培養混合物之前預處理第一培養混合物。選擇性地濃縮第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括接觸能夠結合第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的一或多種抗體以形成經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。能夠結合第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的一或多種抗體可包括以下一或多者：對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的胺基酸表位序列為特異性的抗體、及對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的構形為特異性的抗體。對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的構形為特異性的抗體可對Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau聚集體之構形表位有選擇性。能夠結合第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的一或多種抗體可偶合至固相。固相可包括磁珠及多孔板之一或多者。
例如，ELISA板可用用於來自患者樣本之經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的抗體塗覆。抗體塗覆的ELISA板可用患者樣本培養，未結合材料可予以洗除，且可執行PMCA反應。抗體亦可偶合至珠粒。珠粒可用患者樣本培養且用於將 第一折疊錯誤之蛋白質聚集體-抗體複合物與患者樣本之剩餘部分分離。
在一些實施例中，使樣本與第一受質蛋白接觸以形成第一培養混合物可包括使莫耳過量之第一受質蛋白與包括經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的樣本接觸。莫耳過量之第一受質蛋白可大於包括在經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中的蛋白質單體之總莫耳量。培養第一培養混合物可在經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集以形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。
在若干實施例中，破壞第一培養混合物可包括物理上破壞及/或以熱方式破壞。例如，破壞可包括以下一或多者：音波振動處理、攪拌、搖動、冷凍/融化、雷射照射、高壓釜培養、高壓、及均質化。破壞第一培養混合物可包括循環攪動。循環攪動可進行達以下一或多者：約50轉每分鐘(rotations per minute；RPM)與10,000RPM之間，約200RPM與約2000RPM之間，及約500RPM。破壞第一培養混合物可在每一培養循環進行達以下一或多者：約5秒與約10分鐘之間、約30秒與約1分鐘之間、約45秒與約1分鐘之間、及約1分鐘。培養第一培養混合物可在每一培養循環中獨立地進行達以下一或多者：約1分鐘與約5小時之間、約5分鐘與約5小時之間、約10分鐘與約2小時之間、約15分鐘與約1小時之間、及約25分鐘與約45分鐘。每一培養循環可包括獨立地培養及破壞第一培養混合物達以下一或多者：培養約1分鐘與約5小時之間且破壞約5秒與約10分鐘之間；培養約5分鐘與約5小時之間且破壞約5秒與約10分鐘之間；培養約10分鐘與約2小時之間且破壞約 30秒與約1分鐘之間；培養約15分鐘與約1小時之間且破壞約45秒與約1分鐘之間；培養約25分鐘與約45分鐘之間且破壞約45秒與約90秒之間；培養約29分鐘且破壞約1分鐘；及培養約1分鐘且破壞約1分鐘。進行培養循環可重複達以下一或多者：約2次與約1000次之間、約5次與約500次之間、約50次與約500次之間、及約150次與約250次之間。
在各種實施例中，使樣本與第一受質蛋白接觸以形成第一培養混合物可在生理條件下進行。該等方法可包括使樣本與莫耳過量之第一受質蛋白接觸以形成第一培養混合物。該莫耳過量可大於包括在樣本中的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中的蛋白質單體之總莫耳量。
在一些實施例中，該等方法可包括使樣本與例如硫代黃素T或硫代黃素S之硫代黃素及莫耳過量之第一受質蛋白接觸以形成第一培養混合物。該莫耳過量可大於包括在樣本中的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中的第一受質蛋白之量。該方法可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之至少部分的折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括搖動第一培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該等方法可包括藉由檢測相應於第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的硫代黃素之螢光來測定樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在。
在若干實施例中，第一受質蛋白可藉由以下一者產生：化學合成、重組產生、及自非重組生物樣本提取。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括可溶性第一折疊錯誤之蛋白質 聚集體及不可溶第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的一或多者。該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括以下一或多者：可溶性部分及不可溶部分。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可實質上為可溶性第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。在一些實施例中，該等方法可提供：樣本排除tau小纖維。例如，該樣本可經過濾或離心以移除tau小纖維。
在各種實施例中，該第二受質蛋白可與第一受質蛋白相異。該第二受質蛋白可包括以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、3R tau、及4R tau。該第一受質蛋白可包括4R tau。
在一些實施例中，該等方法可包括至少執行第二PMCA程序以測定樣本中存在或不存在第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括藉由使樣本之第二部分與第二受質蛋白接觸來形成第二培養混合物。該第二受質蛋白可經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括在有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次。每一培養循環可包括在第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第二培養混合物以有效引起第二受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第二培養混合物以有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括藉由分析第二培養混合物中該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。
在若干實施例中，Tau蛋白病可存在於受試者中。 該等方法可包括根據樣本中存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來表徵受試者中Tau蛋白病之身份。該等方法可包括根據樣本中存在或不存在該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體來表徵受試者中Tau蛋白病之身份。
在一些實施例中，該等方法可提供：Tau蛋白病不是主要藉由3R tau蛋白之折疊錯誤及/或聚集來表徵。例如，該Tau蛋白病可至少部分地藉由約以下之一的折疊錯誤及/或聚集之4R tau蛋白與折疊錯誤及/或聚集的3R tau蛋白之比率來表徵：1：99、5：95、10：90、15：85、20：80、25：75、30：70、35：65、40：60、45：55、50：50、55：45、60：40、65：35、70：30、75：25、80：20、85：15、90：10、95：5、及99：1，或前述比率之任何兩者之間的範圍，例如，1：99與99：1之間。
在各種實施例中，該等方法可包括使樣本與例如硫代黃素S或硫代黃素T之硫代黃素及莫耳過量之第一受質蛋白接觸以形成第一培養混合物。該莫耳過量可大於包括在樣本中的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中的蛋白質單體之量。該等方法可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之至少部分的折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括搖動第一培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該等方法可包括藉由檢測相應於第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的硫代黃素之螢光來測定樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。
在該等方法之一些實施例中，自樣本捕獲第一折疊錯誤之蛋白質聚集體以形成經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚 集體可使用對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體為特異性的一或多種抗體來進行。對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體為特異性的一或多種抗體可包括以下一或多者：對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的胺基酸表位序列為特異性的抗體、及對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的構形為特異性的抗體。對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的構形為特異性的抗體可對Tau蛋白病特異性第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之構形表位有選擇性。對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之構形為特異性的抗體可相應於以下一者：阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、進行性上眼神經核麻痺症(PSP)、額顳葉失智症(FTD)、皮質基底核退化症(CBD)、輕度認知障礙(MCI)、嗜銀顆粒病(AgD)、創傷性腦損傷(TBI)、慢性創傷性腦病變(CTE)、及拳擊員癡呆(DP)。對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體為特異性的一或多種抗體可偶合至固相。固相可包括磁珠及多孔板之一或多者。使樣本與第一受質蛋白接觸以形成第一培養混合物可包括使莫耳過量之第一受質蛋白與樣本接觸。莫耳過量之第一受質蛋白可大於包括在經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中的蛋白質單體之總莫耳量。培養第一培養混合物可在經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集以形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第一受質蛋白可包括4R tau蛋白。
在各種實施例中，該等方法可包括至少執行第二PMCA程序以測定樣本中存在或不存在第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括藉由使樣本之第二部分與第二受質蛋白接觸來形成第二培養混合物，該第二受質蛋白可經受病理學折疊錯誤及/或聚集。該第二PMCA程序可包括在有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環 兩次或更多次。每一培養循環可包括在第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第二培養混合物以有效引起第二受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞第二培養混合物以有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括藉由分析第二培養混合物中該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。Tau蛋白病可存在於受試者中。該等方法可包括根據：樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之存在；及樣本中第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之存在或不存在來表徵受試者中的Tau蛋白病之身份。該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。該第二受質蛋白可與第一受質蛋白相異。該第二受質蛋白可包括以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、及3R tau。
在一些實施例中，該等方法可包括藉由分析一或多種折疊錯誤之聚集體之至少一個特性來將每一Tau蛋白病與一或多種另外的Tau蛋白病區別，該等折疊錯誤之聚集體各自相應於Aβ、α突觸核蛋白、及3R tau之一者。每一特性可相應於以下一或多者：使用對一或多種折疊錯誤之聚集體中任何者之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；一或多種折疊錯誤之聚集體之一或多個PMCA動力學參數包括以下一或多者：停滯期、T50、擴增速率、及擴增程度；對一或多種折疊錯誤之聚集體中任何者有選擇性的指示劑；及一或多種折疊錯誤之聚集體中任何者的頻譜特性。
另外，例如，特異性抗體可用於第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。例如，對於AD，類澱粉抗體可包括以下一或多者： 6E10、4G8、82E1、A11、X-40/42、16ADV；及類似物。此等抗體可如下獲得：6E10及G8(Covance,Princeton,NJ)；82E1(IBL America,Minneapolis,MN)：A11(Invitrogen,Carlsbad,CA)；X-40/42(MyBioSource,Inc.,San Diego,CA)；及16ADV(Acumen Pharmaceuticals,Livermore,CA)。
另外，對於PD，例如，一或多種突觸核蛋白特異性抗體可包括PD特異性抗體，其包括以下一或多者：α/β突觸核蛋白N-19；α突觸核蛋白C-20-R；α突觸核蛋白211；α突觸核蛋白Syn 204；α突觸核蛋白2B2D1；α突觸核蛋白LB 509；α突觸核蛋白SPM451；α突觸核蛋白3G282；α突觸核蛋白3H2897；α/β突觸核蛋白Syn 202；α/β突觸核蛋白3B6；α/β/γ-突觸核蛋白FL-140；及類似物。在一些實例中，一或多種特異性抗體可包括以下一或多者：α/β突觸核蛋白N-19；α突觸核蛋白C-20-R；α突觸核蛋白211；α突觸核蛋白Syn 204；及類似物。此等抗體可如下獲得：α/β突觸核蛋白N-19(目錄號SC-7012,Santa Cruz Biotech,Dallas,TX)；α突觸核蛋白C-20-R(SC-7011-R)；α突觸核蛋白211(SC-12767)；α突觸核蛋白Syn 204(SC-32280)；α突觸核蛋白2B2D1(SC-53955)；α突觸核蛋白LB 509(SC-58480)；α突觸核蛋白SPM451(SC-52979)；α突觸核蛋白3G282(SC-69978)；α突觸核蛋白3H2897(SC-69977)；α/β突觸核蛋白Syn 202(SC-32281)；α/β突觸核蛋白3B6(SC-69699)；或α/β/γ突觸核蛋白FL-140(SC-10717)。
在各種實施例中，提供一種用於測定樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的套組。該套組可包括第一受質蛋白，該第一受質蛋白可包括4R tau。該套組可包括第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的指示劑。該第一折疊錯誤之蛋白 質聚集體可包括第一受質蛋白。該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體可相應於Tau蛋白病。該套組可包括緩衝液。該套組可包括肝素。該套組可包括鹽。該套組可包括說明書。該說明書可指導使用者獲得樣本。該說明書可指導使用者至少執行第一PMCA程序。該第一PMCA程序可包括藉由使樣本之第一部分與第一受質蛋白、該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之該指示劑、該緩衝液、該肝素、及該鹽接觸來形成第一培養混合物。該第一培養混合物可由一定濃度之以下一或多者來形成：小於約20μM之該第一受質蛋白；小於約75μM之該肝素；小於約190mM之為NaCl的鹽；及小於約9.5μM之為硫代黃素T的該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之該指示劑。該第一PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第一培養混合物以有效引起第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該說明書可指導使用者藉由根據該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之該指示劑分析第一培養混合物中該第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定該樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。
在若干實施例中，該套組可包括本文描述的方法之任何要素。此外，該套組可包括說明書，其指導使用者進行本文描述的方法之任何步驟。
在一些實施例中，例如，該說明書可包括指導使用者以獲得來自受試者之樣本。該樣本可包括以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物。該說明書 指導使用者根據樣本中存在或不存在該第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定或診斷受試者中的Tau蛋白病。
在各種實施例中，該套組可包括第二受質蛋白及第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑。該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體可包括第二受質蛋白。該第二受質蛋白可與第一受質蛋白相異。該第二受質蛋白可包括以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、3R tau、及4R tau。該說明書可指導使用者至少執行第二PMCA程序。該第二PMCA程序可包括藉由使樣本之第二部分與第二受質蛋白及第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑接觸來形成第二培養混合物。該第二PMCA程序可包括進行培養循環兩次或更多次以有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。每一培養循環可包括在第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養第二培養混合物以有效引起第二受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集。每一培養循環可包括破壞培養混合物以有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。該第二PMCA程序可包括藉由分析第二培養混合物中該第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在該第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。該說明書亦可指導使用者根據：樣本中第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之存在；及樣本中第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之存在或不存在來針對Tau蛋白病之身份表徵樣本。
在一些實施例中，該套組可包括PMCA設備。該PMCA設備可包括以下一或多者：多壁微滴定板；微射流板；搖動設備；分光計；及培養器。該設備可作為個別板或設備之一或多者、作為組合裝置、及類似物來包括。例如，搖動微板閱讀器可用以執行培養及搖動之循環且在實驗(例如，FLUOstar OPTIMA,BMG LABTECH Inc.,Cary,NC)之過程中自動地量測 ThT螢光發射。
對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之構形為特異性的抗體可相應於以下一者：阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、進行性上眼神經核麻痺症(PSP)、額顳葉失智症(FTD)、皮質基底核退化症(CBD)、輕度認知障礙(MCI)、嗜銀顆粒病(AgD)、創傷性腦損傷(TBI)、慢性創傷性腦病變(CTE)、及拳擊員癡呆(DP)。該說明書可包括根據使用對第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之構形為特異性的抗體進行的結合檢定測定受試者中存在或不存在以下一者：AD、PD、PSP、FTD、CBD、MCI、AgD、TBI、CTE、及DP。
實例
實例1：合成Aβ寡聚物之製備
Aβ1-42係使用固相N-第三丁氧基羰基化學作用在耶魯大學的W.Keck設施處合成且藉由逆相HPLC純化。將最終產物冷凍乾燥且藉由胺基酸分析及質譜法來表徵。為製備不含聚集折疊錯誤之Aβ蛋白質的儲備溶液，將聚集體高pH溶解且經由30kDa截止過濾器過濾以移除剩餘的聚集體。為製備不同類型之聚集體，將無種子的Aβ1-42之溶液(10μM)在pH 7.4的0.1M Tris-HCl中在25℃下在攪動下培養不同時間。此製備物取決於培養時間含有呈相異比例的Aβ單體以及小纖維、原纖維及可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質之混合物。聚集度係藉由ThT螢光發射、陰性染色之後的電子顯微術、利用A11構形抗體之點跡墨點研究及在凝膠電泳之後使用4G8抗Aβ抗體的西方墨點來表徵。
具有不同大小的Aβ寡聚物之混合物係在小纖維形成的過程期間產生。特定而言，可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質係 藉由在25℃下在攪拌下培養單體合成的Aβ1-42(10μM)來製備。在5h之培養之後，在陰性染色之後藉由電子顯微術觀察到豐富的可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質，其外觀上呈小球狀，其中僅觀察到少量原纖維及小纖維。在10h，主要存在原纖維，且在24h，觀察到大量長的小纖維。圖1A顯示在培養之0h、5h、10h、及24h時獲取的電子顯微照片。
根據Kayed等人「Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis」,Science 2003,300,486-489之方法，使用A11抗寡聚物特異性抗體測試可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質聚集體為陽性。在進一步培養之後，在10h及24h，觀察到原纖維及小纖維結構。聚集體之大小係藉由經由具有限定孔隙大小之過濾器過濾及在SDS-PAGE分離之後的西方墨點來測定。藉由培養5h形成的可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質係保持在具有30kDa截止值的過濾器且通過1000kDa截止過濾器。圖1B為可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質聚集體之西方墨點。此可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質之電泳分離顯示：大多數材料作為約170kDa SDS耐性聚集體遷移，在17kDa處存在微小帶。
實例2：Aβ-PMCA檢測合成的Aβ寡聚物
實例2A. Aβ聚集之接種係藉由在硫代黃素T存在下，利用或不利用不同數量之合成可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質(對照(無Aβ寡聚物)；或於合成可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質中3、80、300、及8400毫微微莫耳)培養無種子Aβ1-42來研究。Aβ-PMCA一般程序：將2μM無聚集體Aβ1-42於pH 7.4的0.1M Tris-HCl中之溶液(200μL總體積)放置於不透明96孔板中且單獨或在合成Aβ聚集體(如實例1所述藉由培養5h來製備)或 40μL之CSF等分試樣存在下培養。將樣本在5μM硫代黃素T(ThT)存在下培養且使用Eppendorf熱混合器在22℃之恆定溫度下經受循環攪動(在500rpm下1min，繼之以無搖動29min)。在各種時間點處，使用板式分光螢光計在435nm激發之後在485nm處於板中量測ThT螢光。圖2A為使用所指示毫微微莫耳濃度之合成可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質種子，藉由硫代黃素T螢光量測的類澱粉形成(無循環擴增)相對時間之圖表。監視緩衝液之肽濃度、溫度及pH以控制停滯期之程度及實驗間的再現性。在該些條件下，在其中執行實驗之時間(125h)期間未檢測出自發Aβ聚集。在0.3至8.4fmol之實例1的合成可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質存在下觀察到單體Aβ1-42蛋白質之聚集。
實例2B：使用擴增循環即培養及物理破壞之組合階段。將與圖2A相同的樣本在循環攪動(在500rpm下攪拌1min，繼之以無搖動29min)下培養。使用板式分光螢光計(激發：435nm；發射：485nm)，藉由結合至類澱粉小纖維之硫代黃素T(ThT)量測隨時間推移的聚集。圖表顯示3次重複測試之平均值加標準誤差。Aβ寡聚物之濃度係假定170kDa之平均分子量來估算。圖2B為顯示針對實例1的各種濃度之合成可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質，藉由ThT螢光隨時間變化量測的擴增循環加速的類澱粉形成之圖表。在該些條件下，藉由8400、300、80及3fmol之合成可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質誘導的單體Aβ1-42蛋白質之聚集明顯更快，且更易於與在不存在合成可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質情況下觀察到的區別。此結果指示：在該些條件下，給定樣本中的檢測極限為3fmol之可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質或更小。
實例3：Aβ-PMCA檢測AD患者之腦脊髓液中的折疊錯誤 之Aβ
CSF之等分試樣係自50位AD患者、39位受非退化性神經病學疾病(non-degenerative neurological disease；NND)影響的認知正常個體、及37位受包括其他形式之失智症的非AD神經退化性疾病(non-AD neurodegenerative disease；NAND)影響的患者獲得。測試CSF樣本係自50位診斷為具有可能的AD之患者獲得，該可能的AD係如DSM-IV及NINCDS-ADRA準則(McKhann等人，1984)定義且使用各種測試來測定，該等測試包括常規醫學檢查、神經病學評估、神經心理學評定、磁共振成像及對Aβ1-42、總Tau及磷酸Tau之CSF位準的量測。AD患者在樣本收集之時間時的平均年齡為71.0±8.1歲(範圍49-84)。對照CSF樣本係自39位受非退化性神經病學疾病(NND)影響的患者獲得，包括正常壓力水腦之12個病例、7位患有周邊神經病變之患者、7位患有多樣形式之腦腫瘤者、2位患有ICTUS者、1位患有嚴重頭痛者、3位患有腦炎者、1位患有高血壓者及6位不明者診斷者。自此組樣本獲取CSF樣本的平均年齡為64.6±14.7歲(範圍31-83)。對照CSF樣本亦取自37個受非AD神經退化性疾病(NAND)影響的個體，包括10個額顳葉失智症之病例(5行為變異體及5個語言變異體)、6位患有帕金森氏症之患者(包括4位與失智症相關聯者及1位患有運動神經元病者)、6位患有進行性上眼神經核麻痺症者、6位患有脊髓小腦性失調症者(1位與失智症相關聯)、4位患有肌肉萎縮性脊髓側索硬化症者、2位患有亨汀頓氏舞蹈症者、1位患有MELAS者、1位患有路易氏體失智症者、及1位患有血管性失智症者。對此群組而言，在樣本收集時的平均年齡為63.8±11.1歲(範圍41-80)。在一夜禁食之後，用防止損傷的針在L4/L5或L3/L4 間隙處的腰椎穿刺之後，將CSF樣本收集在聚丙烯管中。在3,000g下將樣本在4℃下離心3min，取等分試樣且在-80℃下儲存直至分析。測定CSF細胞計數、葡萄糖及蛋白質濃度。藉由速率濁度測定法量測白蛋白。為評估血腦阻障之完整性及鞘內IgG產生，計算白蛋白商(CSF白蛋白/血清白蛋白)X 103及IgG指數(CSF白蛋白/血清白蛋白)/(CSF IgG/血清IgG)。該研究係根據赫爾辛基宣言之規定來進行且獲倫理委員會批准。
分析之實驗以及原生部分係盲式進行。圖3A為隨ThT螢光標記變化量測的類澱粉形成相對時間之圖表，其顯示來自AD、NND、及NAND群組的5個代表性樣本的Aβ聚集之平均動力學。
結果指示：來自AD患者之CSF相較於對照CSF顯著地加速Aβ聚集(P<0.001)。藉由單向ANOVA、繼之以測試後塔基多重比較(Tukey’s multiple comparison)來分析在人類CSF樣本存在下的Aβ聚集動力學之差異顯著性。顯著水準係設定在P<0.05。在AD與來自其他兩個群組之樣本之間的差異為高度顯著的，其中P<0.001(***)。
圖3B為對來自AD、NND、及NAND群組之樣本而言的以h計之停滯期時間的圖表。為測定個別樣本對Aβ聚集之效應，估算停滯期，其係定義為在對照緩衝樣本的去除之後達到大於40個任意單位的ThT螢光之時間。選擇此值係考慮到其相應於對照緩衝樣本之讀數的約5倍。
圖3C為顯示在180次Aβ-PMCA循環，亦即，90h之培養(P90)之後獲得的類澱粉形成之程度的圖表。在實驗群組間的停滯期及P90之比較揭露來自AD與來自患有非退化性神經病學疾病或患有非AD神經退化性疾病之個體的對照樣本之 間的顯著差異。另外，在AD患者之聚集參數與年齡之間未檢測到相關性，從而指示標誌物之位準相應於患者CSF中之聚集Aβ蛋白質而非患者年齡。
圖5的表1顯示使用停滯期數計算的對Aβ-PMCA測試之靈敏度、特異性及預測值的估算。
為研究再現性，利用不同的樣本、試劑及新一批的作為Aβ-PMCA之受質的Aβ肽來獨立地進行類似於圖3A-C中所示一者的實驗。在每一患者中量測在300次Aβ-PMCA循環，亦即，150h之培養(P150)之後獲得的類澱粉形成之程度。對照組包括受其他神經退化性疾病影響的人及非神經性病之患者。每一樣本之資料表示重複測試管之平均值。藉由學生t檢驗分析統計學差異。圖6為在300次Aβ-PMCA循環之後，亦即，在150h之培養(P150)之後獲得的樣本的以h計之停滯期時間的圖表。
在研究過程中，甚至在用大濃度之合成寡聚物摻入之後，來自第四位置的一整組CSF樣本根本不聚集。預期在樣本收集期間的試劑污染干擾了檢定。
藉由判斷包括停滯期、A50、及P90的不同動力學參數評估不同樣本之間的聚集動力學之差異。停滯期係定義為達到高於單獨緩衝液之背景值的5倍的ThT螢光所需要的時間。A50相應於達到最大聚集之50%的時間。P90相應於在90h時的聚集程度(量測為ThT螢光)。使用此資料，利用藉由接收器操作特性(Receiver Operating Characteristics；ROC)曲線分析，使用MedCalc軟體(MedCalc Software,Ostend,Belgium)測定的截止點閾值來測定靈敏度、特異性及預測值。
實例4：針對CSF中AD之Aβ-PMCA檢測的折疊錯誤之Aβ 的閾值測定
為支援圖5的表1，使用停滯期資料，利用藉由接收器操作特性(ROC)曲線分析，使用MedCalc軟體(12.2.1.0版，MedCalc,Belgium)測定的截止點閾值來測定靈敏度、特異性及預測值。如圖5的表1所示，針對由患有非退化性神經病學疾病之年齡匹配個體組成的對照組估算出90.0%靈敏度及84.2%特異性。對比而言，對AD與包括其他形式之失智症的其他神經退化性疾病的臨床更相關差異而言，估算出100%靈敏度及94.6%特異性。Aβ-PMCA將AD與其他形式之神經退化性疾病區別的此能力係臨床顯著的。考慮所有對照個體的總體靈敏度及特異性分別為90%及92%。
為評估Aβ-PMCA測試將AD患者與對照區別的效能，針對不同截止點將真陽性率(靈敏度)隨假陽性率(特異性)的變化作圖。對此分析，使用針對AD相對NAND(圖4A)、AD相對NND(圖4B)及AD相對所有對照樣本(圖4C)的停滯期值。作為曲線下方面積來估算的測試效能對AD與NAND、NND及所有對照之比較而言分別為0.996±0.0033、0.95±0.020及0.97±0.011。使用MedCalc ROC曲線分析軟體(12.2.1.0版)進行統計分析且結果指示：測試可將AD與對照區別，其中P<0.0001。為估算針對不同組之群組比較的最可靠截止點，對每一截止值將靈敏度(藍線)及特異性(紅線)作圖(圖4D)。圖表顯示針對AD相對所有對照樣本(包括NAND及NND群組)的曲線及95%信賴區間。該些截止值係用於估計圖5的表1中之靈敏度、特異性及預測值。
實例5：Aβ-寡聚物免疫耗盡移除人類腦脊髓液中之Aβ種子且證實Aβ-PMCA在AD CSF中檢測到可溶性折疊錯誤之Aβ 蛋白質
執行免疫耗盡實驗以確認Aβ-PMCA檢測到與存在於CSF中的可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質相關聯的接種活性。用於可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質之有效免疫耗盡的方法首先藉由使用合成製備的可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質來最佳化。藉由用與特定而言識別Aβ(4G8)及構形(A11)抗體之序列的抗體之混合物共軛的岱拿珠(dynabead)進行培養來執行免疫耗盡。圖7A為顯示使用摻入人類CSF中的合成製備之Aβ寡聚物進行的免疫耗盡之結果的西方墨點。藉由此免疫耗盡有效地移除可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質。
圖7A及圖7B為如藉由硫代黃素T螢光量測的類澱粉形成相對時間之圖表，從而證明藉由可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質免疫耗盡來移除AD CSF中之接種活性。用4G8及A11抗體進行免疫耗盡之前或之後的AD CSF之樣本係用於在Aβ-PMCA檢定中接種Aβ聚集。免疫耗盡係應用於3 AD CSF。圖7B為顯示對照及免疫耗盡CSF樣本之動力學的圖表。圖7B顯示：對於免疫耗盡的AD CSF，Aβ-PMCA反應中之Aβ聚集之動力學與在對照CSF樣本中觀察到的相當，且兩者皆顯著地不同於在免疫耗盡之前利用AD CSF觀察到的聚集。圖7C為顯示對照及免疫耗盡CSF樣本之動力學的圖表，該免疫耗盡CSF樣本係僅用A11構形抗體耗盡且藉由Aβ-PMCA檢定來監視聚集。圖7C顯示類似結果，其係使用AD CSF獲得，該AD CSF係使用特定而言識別折疊錯誤之Aβ的A11構形抗體免疫耗盡。該些結果確認：Aβ-PMCA在AD CSF中檢測到可溶性折疊錯誤之β蛋白質。
實例6：固相免疫捕獲
圖8A及圖8B為用於自諸如血漿之複合樣本捕獲可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質的兩個固相方法之示意表示。策略1使用由結合至ELISA板上之固相的特異性抗體預塗覆的ELISA板。在洗滌板之後，Aβ-PMCA反應在相同板中進行。策略2使用由特異性抗體塗覆的磁珠作為固相。此方法提供對樣本之濃縮。
實例7：免疫捕獲之特異性
圖9顯示表2，其證明特異性抗體捕獲Aβ寡聚物之能力。頂部圖顯示用於此研究的多樣序列抗體之Aβ蛋白質上的表位識別位點之示意表示。圖9中之表2證明不同的序列或構形抗體捕獲Aβ寡聚物之效率。藉由將合成Aβ寡聚物摻入健康人類血漿中且藉由Aβ-PMCA檢測來量測捕獲寡聚物之能力。符號指示使用不同抗體的檢測極限為：<12fmol(+++)；在10-100fmol之間(++)；>1pmol(+)且不顯著地高於無捕獲試劑(-)的情況。
實例8：摻入人類血漿中的Aβ寡聚物之檢測
圖10為如藉由硫代黃素T螢光量測的類澱粉形成相對時間之圖表，其顯示檢測到摻入人類血漿中的可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質。用蛋白質G預塗覆的ELISA板係用抗構形抗體(來自Acumen之16ADV)塗覆。之後，將板用人類血漿(100μl)原樣(對照)或在用不同濃度之合成可溶性折疊錯誤之Aβ蛋白質摻入的情況下培養。在培養之後，使板在Aβ40單體(2μM)及ThT(5μM)存在下經受Aβ-PMCA(29min培養及30s搖動)。藉由硫代黃素螢光量測類澱粉形成。圖10為用3種類似作用的不同抗體進行的若干實驗。
實例9：相對於對照自AD患者樣本捕獲可溶性折疊錯誤之 Aβ
圖11為顯示在來自AD患者及對照者之血漿樣本中，在Aβ-PMCA檢定中達到50%聚集之時間的圖表。用抗Aβ抗體(82E1)塗覆的珠粒培養來自受AD、非AD神經退化性疾病(NAD)影響的患者、及健康對照者的血漿樣本。如實例2所述進行Aβ-PMCA。在每一群組之個別患者中記錄達到50%聚集所需的時間。藉由單向ANOVA繼之以塔基hoc後測試分析差異。此資料之ROC分析顯示對用於正確地自對照者鑑別AD患者而言82%的靈敏度及100%的特異性。
實例10：利用各種檢測方法時音波振動處理及搖動皆為有效的
圖12為西方墨點，其顯示藉由使用音波振動處理替代搖動作為用於破碎聚集體之手段的Aβ聚集擴增之結果。在相異數量之合成Aβ寡聚物存在下進行實驗。單獨(泳道1)或用300(泳道2)、30(泳道3)及3(泳道4)fmol之折疊錯誤之Aβ來培養10μg/ml的無種子單體Aβ1-42之樣本。將樣本無擴增冷凍(未擴增)或經受96次PMCA循環(擴增)，每一循環包括30min培養繼之以20sec音波振動處理。聚集之Aβ係藉由使用抗Aβ抗體之西方墨點在用蛋白酶(PK)處理樣本之後檢測到。在吾等實驗中，觀察到，使用硫代黃素T螢光之檢測不與音波振動處理相容，但在搖動作為物理破壞方法的情況下與搖動一起工作極好。圖12顯示對Aβ聚集體使用不同的檢測方法，在此情況下為西方墨點，音波振動處理亦與搖動工作良好。
實例11：產生單體Aβ作為PMCA受質
無種子單體Aβ係藉由粒徑排阻層析法獲得。簡言之，將在二甲亞碸中製備的1mg/mL肽溶液的等分試樣使用以 0.5mL/min用pH 7.5的10mM磷酸鈉溶析的Superdex 75管柱分餾。藉由在220nm處的UV吸光度檢測峰。收集相應於含有Aβ之單體/二聚體的4-10kDa分子量之峰且藉由胺基酸分析測定濃度。在-80℃下冷凍乾燥地儲存樣本。
實例12：Aβ之產生及純化
在37℃下，在Luria培養液(LB)中生長藏有pET28 GroES-Ub-Aβ42質體之大腸桿菌細胞，且用0.4mM IPTG誘導表現。在4h之後，收穫細胞且在溶解緩衝液(pH 8.0的20mM Tris-Cl、10mM NaCl、0.1mM PMSF、0.1mM EDTA及1mM β-巰基乙醇)中溶解並在18,000rpm下離心30min。將包涵體再懸浮於含有6M尿素之再懸浮緩衝液(pH 8.0的50mM Tris-Cl、150mM NaCl、及1mM DTT)中。藉由在18,000rpm下離心30min來移除不可溶蛋白質。收集含有GroES-Ub-Aβ42融合蛋白質之上清液。為自融合蛋白質分裂Aβ42，用再懸浮緩衝液稀釋融合蛋白質2倍且在37℃下用1：100酶比受質莫耳比率的重組去泛素化酶(Usp2cc)處理2h。之後，將樣本裝載於C18管柱上(25mm x 250mm,Grace Vydac,USA)。用溶劑系統緩衝液1(pH 10的30mM乙酸銨、2%乙腈)及緩衝液2(70%乙腈)以流動速率10ml/min使用緩衝液2之20-40%線性梯度歷經35min來純化Aβ42。將純化的Aβ42在-80℃下冷凍乾燥及儲存直至使用。
實例13：藉由PD-PMCA檢測αS種子
實例13A：藉由在硫代黃素T存在下，利用或不利用不同數量之合成可溶性寡聚αS蛋白質培養無種子αS之溶液來研究αS聚集之接種：對照(無αS寡聚物)；或1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、及1μg/mL之合成可溶性寡聚αS蛋白質種子。αS-PMCA一般程序：將100μg/mL無αS種子之αS於pH 7.4 的PBS(200μL總體積)之溶液放置在不透明96孔板中且單獨或在所指示濃度之合成αS聚集體或40μL之CSF等分試樣存在下培養。將樣本在5μM硫代黃素T(ThT)存在下培養且使用Eppendorf熱混合器在22℃之恆定溫度下經受循環攪動(在500rpm下1min，繼之以無搖動29min)。在各種時間點處，使用板式分光螢光計在435nm激發之後在485nm處於板中量測ThT螢光。圖13A為硫代黃素T螢光隨時間變化的圖表，其顯示藉由PD-PMCA，使用所指示濃度之合成可溶性寡聚AS蛋白質種子檢測AS種子。監視緩衝液之肽濃度、溫度及pH以控制停滯期之範圍及實驗間的再現性。在合成可溶性寡聚αS蛋白質種子之1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、及1μg/mL αS存在下觀察到單體αS蛋白質之聚集。
實例13B：使用實例1A中之樣本測定隨所添加αS種子之量變化的達到50%聚集之時間。圖13B為顯示將達到50%聚集之時間隨所添加的αS種子之量變化來作圖的圖表。
實例14：αS-PMCA檢測PD患者之腦脊髓液中之寡聚αS
藉由PD-PMCA執行在來自對照者及PD患者的人類CSF樣本中接種活性之檢測。使pH 7.4的PBS中之純化無種子α突觸核蛋白(100μg/mL)在37℃下，在500rpm之搖動下，在來自患有確認PD、AD或非神經退化性神經病學疾病(NND)之人類患者的CSF存在下聚集。使用板式分光螢光計，藉由在435nm激發之後在485nm處的硫代黃素螢光監視聚集之範圍。
自PD患者、受非退化性神經病學疾病(NND)影響的認知正常個體、及受阿茲海默症(AD)影響的患者獲得CSF之等分試樣。測試CSF樣本係自診斷為具有可能的AD之患者獲得，該可能的AD係如DSM-IV定義且使用各種測試來測定， 該等測試包括常規醫學檢查、神經病學評估、神經心理學評定、及磁共振成像。在一夜禁食之後，用防止損傷的針在L4/L5或L3/L4間隙處的腰椎穿刺之後，將CSF樣本收集在聚丙烯管中。在3,000g下將樣本在4℃下離心3min，取等分試樣且在-80℃下儲存直至分析。測定CSF細胞計數、葡萄糖及蛋白質濃度。藉由速率濁度測定法量測白蛋白。為評估血腦阻障之完整性及鞘內IgG產生，計算白蛋白商(CSF白蛋白/血清白蛋白)X 103及IgG指數(CSF白蛋白/血清白蛋白)/(CSF IgG/血清IgG)。該研究係根據赫爾辛基宣言之規定來進行且獲倫理委員會批准。
分析之實驗以及原生部分係盲式進行。圖14為隨ThT螢光標記變化量測的αS寡聚相對時間之圖表，其顯示來自PD、AD、及NND群組的代表性樣本的αS聚集之平均動力學。
結果指示：來自PD患者之CSF相較於對照CSF顯著地加速αS聚集(P<0.001)。藉由單向ANOVA、繼之以測試後塔基多重比較來分析在人類CSF樣本存在下的αS聚集動力學之差異顯著性。顯著水準係設定在P<0.05。在PD與來自其他兩個群組之樣本之間的差異為高度顯著的，其中P<0.001(***)。
實例15：免疫捕獲之特異性
圖15的表3證明不同序列或構形抗體捕獲αS寡聚物之能力。藉由將合成αS寡聚物摻入健康人類血漿中且藉由αS-PMCA檢測來量測捕獲寡聚物之能力。第一行顯示所測試的各種抗體及相應商業來源。第二行列出用於此研究的多樣序列抗體之αS蛋白質上的表位識別位點。第三行指示觀察到的特異性抗體捕獲αS寡聚物之能力。符號指示使用不同抗體的檢測極限為：<12fmol(+++)：10-100fmol(++)之間；>1pmol(+)且不顯著地高於無捕獲試劑(-)的情況。α/β突觸核蛋白抗體N-19(N 末端表位)及α突觸核蛋白抗體C-20-R(C末端表位)顯示最好的結果；且α突觸核蛋白抗體211(表位：胺基酸121-125)顯示極好的結果；α突觸核蛋白抗體204(表位：片段1-130)顯示良好結果；而16ADV小鼠IgG1(構形表位)未顯示結果。
實例16：固相免疫捕獲
圖16A及圖16B為用於自諸如血漿之複合樣本捕獲可溶性折疊錯誤之αS蛋白質的兩個固相方法之示意表示。策略1使用由結合至ELISA板上之固相的特異性抗體預塗覆的ELISA板。在洗滌板之後，αS-PMCA反應在相同板中進行。策略2使用由特異性抗體塗覆的磁珠作為固相。此方法提供對樣本之濃縮。
實例17：用於檢測摻入人類血漿中的α突觸核蛋白寡聚物之αS-PMCA
藉由抗α突觸核蛋白抗體塗覆的珠粒(Dynabead)執行來自人類血漿的α突觸核蛋白寡聚物之免測沉澱法，且使用α突觸核蛋白單體作為接種受質連同用於檢測之硫代黃素T進行接種聚集檢定。在利用α突觸核蛋白種子(+0.2μg種子)及不利用α突觸核蛋白種子(-種子)的情況下，用人類血漿(500μL)培養抗α突觸核蛋白塗覆的珠粒(1x107個珠粒)。在免測沉澱法之後，將珠粒再懸浮於20μL之反應緩衝液(1X PBS)中，且將10μL之珠粒添加至96孔板之每一孔中。藉由添加α突觸核蛋白單體(200μg/mL)及硫代黃素T(5μM)執行聚集檢定。藉由使用435nm之激發及485nm之發射的螢光計監視螢光之增加。圖17A說明在利用及不利用種子的情況下在血漿中使用N-19抗體之免測沉澱法/聚集結果。圖17B說明在利用及不利用種子的情況下在血漿中使用211抗體之免測沉澱法/聚集結果。圖 17C說明在利用及不利用種子的情況下在血漿中使用C-20抗體之免測沉澱法/聚集結果。
實例18：αS-PMCA以高靈敏度及特異性檢測受PD及多系統萎縮症影響的患者之腦脊髓液中的寡聚αS。
為研究αS-PMCA對PD及相關α突觸核蛋白病諸如多系統萎縮症(MSA)之生物化學診斷之效率，對來自受該些疾病影響的許多患者以及受其他疾病影響的對照者的CSF執行測試。圖18A、圖18B、及圖18C顯示使用αS-PMCA分別在來自對照者及受PD及MSA影響的患者之人類CSF樣本中檢測到接種活性。使pH 6.0的PBS中之純化無種子α突觸核蛋白(100μg/mL)在37℃下，在500rpm之搖動下，在來自人類患者及對照者的CSF存在下聚集。使用板式分光螢光計，藉由在435nm激發之後在485nm處的硫代黃素T螢光監視聚集之程度。
測試CSF樣本係自診斷為具有可能的PD及MSA之患者獲得，該可能的PD及MSA係如DSM-IV定義且使用各種測試來測定，該等測試包括常規醫學檢查、神經病學評估、神經心理學評定、及磁共振成像。在一夜禁食之後，用防止損傷的針在L4/L5或L3/L4間隙處的腰椎穿刺之後，將CSF樣本收集在聚丙烯管中。在3,000g下將樣本在4℃下離心3min，取等分試樣且在-80℃下儲存直至分析。測定CSF細胞計數、葡萄糖及蛋白質濃度。藉由速率濁度測定法量測白蛋白。該研究係根據赫爾辛基宣言之規定來進行且獲倫理委員會批准。
分析之實驗以及原生部分係盲式進行。圖18A、圖18B、及圖18C為隨ThT螢光標記變化量測的αS聚集相對時間之圖表，其顯示分別對對照者及來自PD及MSA群組之兩個代表性樣本的αS聚集之平均動力學。
結果指示：來自PD患者之CSF相較於對照CSF顯著地加速αS聚集(P<0.001)。藉由單向ANOVA、繼之以測試後塔基多重比較來分析在人類CSF樣本存在下的αS聚集動力學之差異顯著性。顯著水準係設定在P<0.05。在PD與來自其他兩個群組之樣本之間的差異為高度顯著的，其中P<0.001(***)。
29個PD或MSA樣本及41個對照的整租之結果為29個PD或MSA中之26個為陽性，而41個對照樣本中之3個為陽性，其相應於90%靈敏度及93%特異性。
實例19：全長4R tau蛋白及種子之合成
圖19為顯示重組全長4R tau蛋白之製備及純化的流程圖。將hTau40之基因轉染至大腸桿菌中且在標準條件下培養以表現hTau40。在生長期之後，將大腸桿菌細胞剝落、溶解、熱處理、且用硫酸銨沉澱來產生粗產物。使粗產物經受陽離子交換層析法、透析、隨後濃縮及緩衝液交換。使用在100kDa之質量下的截止過濾以進一步純化hTau40。純化hTau 40之產率為20mg/L之細菌培養物。隨後藉由在37℃下，使用循環攪動(在500rpm下1min搖動繼之以無搖動29min)用pH 7.4的10mM HEPES、100mM NaCl中之12.5μM肝素培養hTau 40單體3天來製備全長4R Tau種子。
實例20A：TAU PMCA
在96孔板上使用12.5μM Tau單體、1.25μM肝素、5μM硫代黃素T，使用循環攪動(在500rpm下1min搖動繼之以無搖動29min)執行Tau-PMCA檢定。以12.5pmol、1.25pmol、125fmol、12.5fmol、及1.25fmol之量將種子添加至孔。執行無種子之對照。使用板式分光螢光計(激發：435nm；發射：485nm)，藉由ThT螢光隨時間推移跟蹤聚集。圖20A為針對各 種初始量之種子及對照物的以%計的聚集之圖表。圖20A中之值為兩次重複測試之平均值，其中誤差槓指示標準偏差。圖20B為相對以fmol計的寡聚tau種子之量之對數，如藉由ThT螢光量測的T50即達到50%聚集之時間之圖表。
實例20B：TAU PMCA
為最佳化tau-PMCA檢定，全長人類Tau40包括四個不完整的串聯微管結合重複序列(4R)。藉由在37℃下在肝素(12.5μM)存在下培養全長Tau(50μM)3天來產生Tau寡聚物。種子係藉由接種tau聚集之能力、結合至硫代黃素T、西方墨點及電子顯微術來表徵。預形成的聚集體係用於成核且誘導Tau之聚集。對於檢定，使在含有3μM之肝素的pH 7.4的10mM HEPES、100mM NaCl中之無種子單體tau(15μM)在不存在或存在不同數量之合成種子的情況下藉由在20℃下培養29.5min繼之以在500rpm下搖動30sec經受tau-PMCA之循環。在該些條件下，僅觀察到Tau在預形成種子的存在下聚集且聚集之動力學取決於所添加的種子之量。重要地，觀察到PMCA訊號與添加至反應的種子之量成正比。此檢定相應於0.125pg之寡聚tau的檢測閥值。此檢測閥值基於tau單體之分子量相應於-2阿莫耳(atto-mol)，基於作為針對平均寡聚物大小的代理物的12mer寡聚物之分子量相應於0.15阿莫耳。
實例20C：TAU PMCA
使用全長Tau種子執行另一Tau-PMCA檢定，該等種子藉由在37℃下，在搖動下用pH 7.4的10mM HEPES、100mM NaCl中之12.5μM肝素培養Tau單體來製備。在96孔板上使用12.5μM Tau單體、1.25μM肝素、及5μM硫代黃素T，使用循環攪動(在500rpm下1min搖動繼之以無搖動29min) 執行檢定。圖20C為使用板式分光螢光計(激發：435nm；發射：485nm)，藉由ThT螢光隨時間推移跟蹤的聚集之圖表。圖20C顯示兩次重複測試之平均值及SD。圖20D為tau寡聚物之數量與Tau-PMCA訊號(達到50%聚集之時間)之間的關係的圖表。
實例20D：TAU PMCA為可再現的
進行大規模實驗以評估tau-PMCA檢定之穩固性及再現性以分析在有或無冷凍/融化的情況下在四個不同時間(0、14、28及30天)的效能。使用兩組不同的合成種子及五個不同濃度之合成種子(1250、125、12.5、1.25及0.125pg之種子)，摻入緩衝液或對照CSF中。每一樣本重複運作三次。實驗涵蓋若干步驟，包括以執行所有實驗所需的數量大規模表現及純化tau、對所產生的材料之品質控制、合成tau寡聚種子之產生及表徵及調查在緩衝液及在生物學基質(CSF)中之檢定精確度及再現性的tau-PMCA實驗。總計而言，實驗使用32個不同條件(2個不同種子x 4個時間點x：2種稀釋方式(冷凍或不冷凍)x 2個不同基質(緩衝液或CSF))。因為用五個不同濃度之寡聚種子測試所有條件且每一者重複進行三次，整個實驗涉及480個孔。蛋白質濃度、緩衝液及PMCA條件與實例20B相同。自32個所測試的條件，僅一個得到稍微顯著地不同於其他者的結果，從而指示高精度度及再現性。圖20E-20L係液一系列圖表，其顯示基於所測試的條件中的8個的ThT螢光之聚集結果，該等條件包括4個不同時間點(0、7、14及30天)，其中樣本經受或不經受冷凍及融化且在緩衝或CSF存在下進行，及兩個不同的種子製備物(圖20E-20H及圖20I-20L)。圖20E-20L證明：所獲得的結果在三次重複測試、不同時間點、及相異種子之間為極類似的。資料相應於三次重複測試樣本之平均值±標準誤差。不 存在種子時的tau受質在任何條件下在進行實驗的時間內未觀察到聚集。
為分析檢定之再現性，在1250pg之Tau種子存在下，測量實驗之T50值(達到50%聚集之時間)。在不同天進行的實驗之T50值不顯示任何統計學顯著差異且獲得71.5±1.8h之平均T50，該等實驗利用兩個種子製備物A或B之一及使用新鮮或冷凍的種子。對在所有其他種子濃度存在下進行的研究或對在緩衝液中進行的實驗觀察到類似的非顯著差異。圖20M為顯示跨於16種不同條件的再現性的T50值之表。所有值係藉由單向ANOVA、繼之以塔基多重比較測試來分析。
實例20E：TAU PMCA為特異性的
調查tau PMCA分析的特異性，尤其調查檢測由其他類澱粉源性蛋白質構成的聚集體之能力。製備Aβ及αSyn寡聚物質且用於交叉接種單體tau。圖20N為針對用1pm之tau、Aβ40、AB42、His αSyn、Hu αSyn接種及不用種子接種的tau檢定的ThT螢光相對時間之圖表。圖20N顯示：在AβαSyn種子存在下不可檢測到顯著訊號，且在約100h之前，甚至當該些粒子之濃度相對高時(等效於2ng之tau種子)未檢測到訊號。該些Aβ為αSyn種子且在前述實例中描述的各別Aβ-PMCA或αSyn-PMCA檢定中極有效地誘導聚集。該些結果指示：在所使用的條件及濃度下，在其他蛋白質聚集體之間不存在交叉接種，且tau-PMCA對檢測tau寡聚物為特異性的。
實例21A：TAU PMCA檢測人類CSF中之TAU
藉由Tau-PMCA分析來自AD患者(7個病例)、5個其他Tau蛋白病(1FTD、2PSP、2CBD)、受輕度認知障礙(MCI)影響的人及受其他神經病學疾病影響的對照者(7樣本)的人類 CSF樣本。圖21A為顯示在培養之447h時的ThT螢光，其中大多數樣本已達到最大螢光。陽性對照使用由合成Tau寡聚物(12.5fmol)摻入的健康CSF之樣本。陰性對照相應於不具有Tau種子的健康CSF之樣本。圖21A顯示：患有AD、其他Tau蛋白病、及MCI之患者顯示顯著高於陰性對照並與陽性對照一致的Tau聚集。7位患有其他神經病學疾病之對照患者中的6位與陰性對照一致。在其他神經病學疾病群組中的一位對照患者顯示與Tau蛋白病一致的最大螢光。此可指示彼患者中未經診斷的Tau蛋白病，或替代地，指示無意的污染。
實例21B：TAU PMCA檢測人類CSF中之TAU
調查來自11位受AD影響的患者、11位來自其他Tau蛋白病(4位PSP、1位FTD、5位CBD及1位CTE)及7位受無關神經錯亂影響的對照者之人類CSF樣本。陽性對照係藉由將CSF摻入20ng之重組tau寡聚物來製備。陰性對照為不具有tau種子之健康CSF。圖21B為來自患有AD或其他Tau蛋白病之患者的樣本的tau-PMCA之螢光訊號的圖表，其相當於在含有重組tau寡聚物之樣本中觀察到的螢光訊號。因此，來自患有AD或其他Tau蛋白病之患者的樣本能夠加速tau聚集。相反地，7位對照者中之6位在tau-PMCA中產生低訊號，其中值係等效於在沒有種子之CSF中觀察到的彼等值。不管小的樣本大小，對照者與患者之間的差異係統計學顯著的。該些陽性結果指示tau-PMCA能夠在患者之CSF中檢測到tau聚集體。圖21B顯示以任意單位表達的最大ThT螢光。藉由單向ANOVA繼之以測試後塔基多重比較來分析差異。** P<0.01。
實例22：TAU PMCA檢測人類CSF中之TAU
Tau-PMCA檢定之效能係在來自對照者及受AD、 FTD(額顳葉失智症)、CBD(皮質基底核退化症)、及PSP(進行性上眼神經核麻痺症)影響的患者之代表性CSF樣本存在下調查。在96孔板上使用12.5μM Tau單體、1.25μM肝素、5μM硫代黃素T，使用循環攪動(在500rpm下1min搖動繼之以無搖動29min)執行Tau-PMCA檢定。使用板式分光螢光計(激發：435nm；發射：485nm)，藉由ThT螢光隨時間推移跟蹤聚集。圖22為顯示基於ThT相對時間的聚集%之圖表。各種Tau蛋白病在T50、擴增速率、及擴增程度方面有所不同。例如，PSP及AD樣本之T50在150h約為相同的，而PSP樣本相較於AD似乎具有較短停滯期、較低擴增速率、及較低擴增程度。CBD似乎具有約175h之T50，與相較於AD及PSP兩者的較低擴增速率、及較低擴增程度。FTD似乎具有約210h之T50，與相較於AD、PSP、及CBD中之每一者的較高擴增速率、及較低擴增程度。對照CSF樣本具有相較於FTD的類似T50及擴增速率，與進一步較低的擴增程度。對照CSF樣本中之擴增可歸因於自發(無種子)擴增、意外污染、或具有稍微與FTD類似的動力學的未診斷Tau蛋白病。
論述
本發明tau-PMCA可提供超過其他方法之各種優點。例如，本發明之實施例能夠直接檢測關鍵的tau折疊錯誤之分子病原性事件，此與已知間接措施對比，諸如非病原性生物標誌物，tau之總池之量測，其中僅小部分形成突觸毒性寡聚聚集體，或tau之各種磷酸化物質的量測。本發明之實施例特定而言檢測折疊錯誤之tau寡聚物，其呈現疾病、接種tau折疊錯誤及因此在疾病期間在腦中傳播破壞的關鍵病理學特徵。另外，所有其他方法檢測樣本中存在的材料，PMCA遵循在患病腦中 發生的相同原理檢測藉由樣本中的寡聚種子之分鐘量達成的吾等添加至所接種反應的蛋白質之轉化。
在術語「包括(include)」或「包括(including)」用於說明書或申請專利範圍中的程度上，其意欲以與術語「包含」類似的方式為包括性的，如彼術語在用作申請專利範圍中之過渡用詞時所解釋的。此外，在使用術語「或」(例如，A或B)的程度上，其意欲指「A或B或兩者」。當申請人意欲指示「僅A或B而不是兩者」時，則使用術語「僅A或B而不是兩者」。因此，術語「或」在本文之使用為包括性的，而非排他使用。參見Bryan A.Garner,A Dictionary of Modern Legal Usage 624(第2版，1995)。此外，在術語「...中」或「至...中」用於說明書或申請專利範圍的程度上，其意欲另外指「...上」或「至...上」。在術語「選擇性地」用於說明書或申請專利範圍的程度上，其意欲指組件之條件，其中設備之使用者可按需要或在使用設備所需時啟用或停用該組件之特徵或功能。在術語「可操作地連接」用於說明書或申請專利範圍的程度上，其意欲指所識別組件係以執行指定功能之方式來連接。在術語「實質上」用於說明書或申請專利範圍的程度上，其意欲指所識別組件具有以如將在受試者行業中可接受的誤差程度所指示的關係或品質。
如本說明書及申請專利範圍中所使用，除非明確地指定單數，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數。例如，提及「一化合物」可包括兩種或兩種以上化合物之混合物，以及單一化合物。
如本文所使用，術語「約」連同數量意欲包括±該數量之10%。換言之，「約10」可意指9至11。
如本文所使用，術語「可選」及「視情況」意指隨 後描述的情形可發生或可不發生，以便描述包括其中該情形發生之實例及其中其不發生之實例。
另外，在本揭示內容之特徵或態樣就馬庫西群組來描述的情況下，熟習此項技術者將認識到，本揭示內容亦據此就馬庫西群組之任何個別構件或構件之子群組來描述。如熟習此項技術者所理解的，對於任何及所有目的，諸如就提供書面描述而言，本文揭示的所有範圍亦涵蓋任何及所有可能的子範圍及其子範圍之組合。任何所列範圍可易於視為充分地描述及賦能相同範圍，該等範圍可分解為至少相同的半部、三部分、四部分、五部分、十部分、及類似物。作為非限制性實例，本文論述的每一範圍可容易分解為下三分之一、中間三分之一及上三分一，及類似物。如熟習此項技術者亦將理解的，諸如「多至」、「至少」、「大於」、「小於」之所有語言包括所敘述的數量且係指可隨後分解為如上文論述的子範圍的額範圍。最終，如熟習此項技術者所理解的，範圍包括每一個別構件。例如，具有1-3個細胞之群組係指具有1、2、或3個細胞之群組。類似地，具有1-5個細胞之群組係指具有1、2、3、4、或5個細胞等等之群組。雖然各種態樣及實施例已在本文揭示，但其他態樣及實施例將對熟習此項技術者為明顯的。
如上所述，雖然本申請案已藉由其實施例之描述來說明，且雖然已相當詳細地描述實施例，但申請人並不意欲約束或以任何方式限制隨附申請專利範圍之範疇於此等細節。另外的優點及修改將對獲益於本申請案之熟習此項技術者顯而易見。因此，本申請案在其較寬態樣方面不限於所顯示的特定細節、說明性實例，或其涉及的任何設備。在不脫離一般發明概念之精神或範疇的情況下，可自此等細節、實例、及設備做出 偏離。
本文揭示的各種態樣及實施例係出於說明目的且不意欲為限制性的，其中真實的範疇及精神係藉由隨附申請專利範圍來指示。

Claims (130)

  1. 一種用於測定樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的方法，前述方法包含：執行第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序，前述第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序包含：藉由使前述樣本之第一部分與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物，前述第一受質蛋白包含4R tau；在有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第一培養混合物中前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第一受質蛋白且前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第一受質蛋白。
  2. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含測定前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在，前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體為折疊錯誤之4R tau聚集體。
  3. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含測定前述樣本中存在或不存在至少第二折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  4. 如請求項3所記載之方法，其進一步包含至少執行第二蛋 白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序以測定前述樣本中存在或不存在至少前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體，包含：藉由使前述樣本之第二部分與第二受質蛋白接觸來形成第二培養混合物，前述第二受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體；在有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第二培養混合物以有效引起前述第二受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第二培養混合物以有效形成前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第二培養混合物中前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第二受質蛋白且前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第二受質蛋白。
  5. 如請求項4所記載之方法，其中前述第二受質蛋白包含以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、及3R tau。
  6. 如請求項4所記載之方法，其中前述第二受質蛋白包含3R tau，前述方法進一步包含測定前述樣本中前述4R tau與前述3R tau之比率為約1：99與約99：1之間。
  7. 如請求項3所記載之方法，其進一步包含測定前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體及前述第二折疊錯誤之 蛋白質聚集體的前述存在。
  8. 如請求項3所記載之方法，其進一步包含測定前述樣本中存在或不存在至少第三折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  9. 如請求項8所記載之方法，其進一步包含至少執行第三蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序以測定前述樣本中存在或不存在至少前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體，包含：藉由使前述樣本之第三部分與第三受質蛋白接觸來形成第三培養混合物，前述第三受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體；在有效形成第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第三培養混合物以有效引起前述第三受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第三培養混合物以有效形成前述第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第三培養混合物中前述第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第三受質蛋白且前述第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第三受質蛋白。
  10. 如請求項9所記載之方法，其中前述第一受質蛋白包含4R tau，前述第二受質蛋白包含類澱粉-β(Aβ)，且前述第三受質蛋白包含α突觸核蛋白。
  11. 如請求項8所記載之方法，其進一步包含測定前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體、前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體、及前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在。
  12. 如請求項8所記載之方法，其進一步包含測定前述樣本中存在或不存在至少第三折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  13. 如請求項12所記載之方法，其進一步包含至少執行第四蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序以測定前述樣本中存在或不存在至少前述第四折疊錯誤之蛋白質聚集體，包含：藉由使前述樣本之第四部分與第四受質蛋白接觸來形成第四培養混合物，前述第四受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第四折疊錯誤之蛋白質聚集體；在有效形成第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第四折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第四培養混合物以有效引起前述第四受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第四培養混合物以有效形成前述第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第四培養混合物中前述第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第四折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第四折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第四受質蛋白且前述第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第四受質蛋白。
  14. 如請求項13所記載之方法，其中前述第一受質蛋白包含4R tau，前述第二受質蛋白包含類澱粉-β(Aβ)，前述第三受質蛋白包含α突觸核蛋白，且前述第四受質蛋白包含3R tau。
  15. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本係取自受試者，其進一步包含根據前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在測定或診斷前述受試者中存在或不存在Tau蛋白病。
  16. 如請求項15所記載之方法，前述方法進一步包含：至少執行第二蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序以測定前述樣本中存在或不存在包含第二受質蛋白的折疊錯誤之蛋白質聚集體，包含：藉由使前述樣本之第二部分與第二受質蛋白接觸來形成第二培養混合物，前述第二受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體；在有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第二培養混合物以有效引起前述第二受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第二培養混合物以有效形成前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第二培養混合物中前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第二受質 蛋白且前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第二受質蛋白。
  17. 如請求項16所記載之方法，其中前述受試者包含前述Tau蛋白病，前述方法進一步包含根據：前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述存在；及前述樣本中前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述存在或不存在來表徵前述受試者中的Tau蛋白病之身份。
  18. 如請求項16所記載之方法，其中前述第二受質蛋白包含以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、及3R tau。
  19. 如請求項16所記載之方法，前述方法進一步包含：至少執行第三蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序以測定前述樣本中存在或不存在包含第三受質蛋白的折疊錯誤之蛋白質聚集體，包含：藉由使前述樣本之第三部分與第三受質蛋白接觸來形成第三培養混合物，前述第三受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體；在有效形成第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第三培養混合物以有效引起前述第三受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第三培養混合物以有效形成前述第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第三培養混合物中前述第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中 存在或不存在前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第三受質蛋白且前述第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第三受質蛋白。
  20. 如請求項19所記載之方法，前述方法進一步包含：至少執行第四蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序以測定前述樣本中存在或不存在包含第四受質蛋白的折疊錯誤之蛋白質聚集體，包含：藉由使前述樣本之第四部分與第四受質蛋白接觸來形成第四培養混合物，前述第四受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第四折疊錯誤之蛋白質聚集體；在有效形成第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第四折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第四培養混合物以有效引起前述第四受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第四培養混合物以有效形成前述第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第四培養混合物中前述第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第四折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第四折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第四受質蛋白且前述第四擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第四受質蛋白。
  21. 如請求項15所記載之方法，其中前述Tau蛋白病包含原發 性Tau蛋白病或繼發性Tau蛋白病。
  22. 如請求項15所記載之方法，其中前述Tau蛋白病至少部分地藉由4R tau蛋白之折疊錯誤及/或聚集來表徵。
  23. 如請求項15所記載之方法，其中前述第二受質蛋白包含3R tau，前述方法進一步包含藉由前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體與前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之間的比率表徵前述Tau蛋白病，及根據為已知Tau蛋白病之特性的4R tau蛋白之折疊錯誤及/或聚集與3R tau蛋白之折疊錯誤及/或聚集的已知比率來測定相應於前述已知Tau蛋白病之前述Tau蛋白病。
  24. 如請求項15所記載之方法，其進一步包含藉由針對以下至少一者之特性來分析前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體或其一或多個相應蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力學參數來表徵前述Tau蛋白病之身份：阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、進行性上眼神經核麻痺症(PSP)、額顳葉失智症(FTD)、皮質基底核退化症(CBD)、輕度認知障礙(MCI)、嗜銀顆粒病(AgD)、創傷性腦損傷(TBI)、慢性創傷性腦病變(CTE)、及拳擊員癡呆(DP)。
  25. 如請求項24所記載之方法，其中表徵前述Tau蛋白病之前述身份包含：測定前述一或多個相應蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力學參數，包含以下一或多者：停滯期、T 50、擴增速率、及擴增程度；將前述一或多個相應蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力學參數與為前述Tau蛋白病之前述身份之特性的一或多個相應預定相應蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力 學參數比較來判定相似性或差異以有效表徵前述Tau蛋白病之前述身份。
  26. 如請求項24所記載之方法，其中表徵前述Tau蛋白病之前述身份包含使用以下一或多者：對Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體；對前述Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；前述Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之頻譜特性；前述Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之蛋白水解抵抗力；及前述Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau蛋白聚集體之變性穩定性。
  27. 如請求項15所記載之方法，其中其前提為前述Tau蛋白病排除匹克症。
  28. 如請求項15所記載之方法，其中測定或診斷前述受試者中存在或不存在Tau蛋白病包含將前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在與取自對照受試者之對照樣本比較。
  29. 如請求項1所記載之方法，其中前述檢測包含檢測前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量，前述樣本係取自受試者，前述方法進一步包含藉由將前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述量與預定閾值量比較來測定或診斷前述受試者中存在或不存在Tau蛋白病。
  30. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本係取自根據認知測試不呈現失智症之臨床徵象的受試者，前述方法進一步包含根據前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在測定或診斷前述受試者中存在或不存在Tau蛋白病。
  31. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本係取自根據對比度成像不呈現皮層斑塊或纏結的受試者，前述方法進一步包含根據前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在測定或診斷前述受試者中存在或不存在Tau蛋白病。
  32. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本係取自根據認知測試不呈現失智症之臨床徵象的受試者，前述方法進一步包含根據前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在測定或診斷前述受試者中存在或不存在作為失智症之前述臨床徵象的促成因子的Tau蛋白病。
  33. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本係取自根據認知測試不呈現失智症之臨床徵象的受試者及根據遺傳測試呈現失智症傾向的受試者，前述方法進一步包含根據前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在測定或診斷前述受試者中存在或不存在Tau蛋白病。
  34. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含製備前述第一培養混合物，前述第一培養混合物係藉由以下至少一個濃度表徵：小於約20μM之前述第一受質蛋白；小於約75μM之肝素；小於約190mM之NaCl；及小於約9.5μM之硫代黃素T。
  35. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含製備包含在約0.001μM與約2000μM之間的濃度下的前述第一受質蛋白之前述第一培養混合物。
  36. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含製備前述第一培 養混合物，其藉由在約0.001μM與約75μM之間的濃度下的肝素表徵。
  37. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含製備前述第一培養混合物，其包含以下一或多者之緩衝液組合物：Tris-HCL、PBS、MES、PIPES、MOPS、BES、TES、及HEPES。
  38. 如請求項31所記載之方法，其進一步包含製備前述第一培養混合物，其包含在約1μM與約1M之間的總濃度下的前述緩衝液組合物。
  39. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含製備前述第一培養混合物，其包含在約1μM與約1M之間的總濃度下的鹽組合物。
  40. 如請求項39所記載之方法，其中前述鹽組合物包含以下一或多者：NaCl及KCl。
  41. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含在約5與約9之間的pH下製備或維持前述第一培養混合物。
  42. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含製備前述第一培養混合物，其包含在約1nM與約1mM之間的總濃度下的指示劑。
  43. 如請求項1所記載之方法，其中前述培養包含在約5℃與約60℃之間的溫度下加熱或維持前述第一培養混合物。
  44. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含：使前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑與前述第一培養混合物接觸，前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述指示劑係藉由在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下的指示狀態及在不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的非指示狀態來表徵；及 其中前述測定前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述存在包含檢測前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述指示劑的前述指示狀態。
  45. 如請求項44所記載之方法，其中前述指示劑的前述指示狀態及前述指示劑的前述非指示狀態係藉由螢光之差異表徵，前述測定前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述存在包含檢測螢光之前述差異。
  46. 如請求項44所記載之方法，其進一步包含使莫耳過量的前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述指示劑與前述第一培養混合物接觸，前述莫耳過量大於包括在前述第一受質蛋白中的蛋白質單體及前述第一培養混合物中的前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之總莫耳量。
  47. 如請求項44所記載之方法，其中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述指示劑包含以下一或多者：硫代黃素、剛果紅、m-I-二苯乙烯、金黃胺G、PIB、BF-227、X-34、TZDM、FDDNP、MeO-XO4、IMPY、NIAD-4、發光共軛聚噻吩、螢光蛋白、及其衍生物。
  48. 如請求項1所記載之方法，其中前述測定前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述存在包含測定前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量。
  49. 如請求項47所記載之方法，其進一步包含以至少約70%之靈敏度檢測前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述量。
  50. 如請求項47所記載之方法，其進一步包含檢測在小於約100nmol下的前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述量。
  51. 如請求項47所記載之方法，其進一步包含以與藉由前述樣本包含的前述第一受質蛋白之莫耳比率檢測前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述量，前述莫耳比率小於約1：100。
  52. 如請求項47所記載之方法，其進一步包含與對照樣本比較來測定前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述量。
  53. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含以至少約70%之特異性檢測前述樣本中之前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  54. 如請求項1所記載之方法，其中前述檢測前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含以下一或多者：西方墨點分析、點跡墨點分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、螢光蛋白/肽結合分析、硫代黃素結合分析、剛果紅結合分析、沉澱分析、電子顯微術、原子力顯微術、表面電漿子共振、及光譜學。
  55. 如請求項54所記載之方法，其中前述酶聯免疫吸附分析(ELISA)包含雙側夾心酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  56. 如請求項54所記載之方法，其中前述光譜學包含以下一或多者：準光散射光譜學、多光譜紫外光譜學、共焦雙色螢光關聯光譜學、傅立葉轉換紅外光譜學、利用分光鏡檢測之毛細管電泳、電子自旋共振光譜學、核磁共振光譜學、及螢光共振能量轉移(FRET)光譜學。
  57. 如請求項1所記載之方法，其中前述檢測前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含：使前述第一培養混合物與蛋白酶接觸；及在以下一或多者中使用抗折疊錯誤之蛋白質抗體或對 折疊錯誤之tau聚集體為特異性的抗體檢測前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體：西方墨點檢定、點跡墨點檢定、及酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  58. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含提供呈標記形式之前述第一受質蛋白。
  59. 如請求項58所記載之方法，其中呈標記形式之前述第一受質蛋白包含以下一或多者：共價併入之放射性胺基酸、共價併入、經同位素標記之胺基酸、及共價併入之螢光團。
  60. 如請求項59所記載之方法，其中前述檢測前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含檢測併入前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體中的呈標記形式之前述第一受質蛋白。
  61. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本包含以下一或多者：羊水；膽汁；血液；腦脊髓液；耵聹；皮膚；滲出物；糞便；胃液；淋巴；乳汁；黏液；黏膜；腹膜液；血漿；胸膜液；膿液；唾液；皮脂；精液；汗液；滑液；淚液；及尿。
  62. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本係來源於以下一或多者之細胞或組織：皮膚、腦、心臟、肝、胰臟、肺、腎、胃腸、神經、黏膜、血液細胞、腺、及肌肉。
  63. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本之每一部分係藉由約1μL至約1000μL之體積表徵。
  64. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本之每一部分包含CSF，其係藉由約10μL至約80μL之體積表徵。
  65. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本之每一部分包含以下一者：血漿，其藉由約250μL至約750μL之體積表徵；及 血液，其藉由約200μL至約1000μL之體積表徵。
  66. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含自受試者獲得前述樣本。
  67. 如請求項66所記載之方法，其中前述受試者為以下一者：人類、小鼠、大鼠、犬、貓、牛、馬、鹿、麋鹿、綿羊、山羊、豬、及非人類靈長類動物。
  68. 如請求項66所記載之方法，其中前述受試者為以下一或多者：患有Tau蛋白病之風險、患有前述Tau蛋白病、及處於針對前述Tau蛋白病之治療下。
  69. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本係取自受試者，前述方法進一步包含藉由將前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述量與比較樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量比較來測定前述受試者中Tau蛋白病之進程或體內環境恆定，前述比較樣本係相較於前述樣本在不同時間取自前述受試者。
  70. 如請求項1所記載之方法，其中前述受試者係用Tau蛋白病調節療法治療，前述方法進一步包含：將前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述量與比較樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之量比較，前述樣本及前述比較樣本係在前述Tau蛋白病調節療法下的一時間段內的不同時間取自前述受試者；及測定為以下一者的前述受試者：根據在前述時間段內前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之改變而對前述Tau蛋白病調節療法有反應，或根據在前述時間段內前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之體內環境恆定而對前述Tau蛋白病調節療法無反應。
  71. 如請求項70所記載之方法，其進一步包含用前述Tau蛋白病調節療法治療測定為對前述Tau蛋白病調節療法有反應的前述受試者。
  72. 如請求項1所記載之方法，其中前述樣本係取自受試者，前述受試者係用Tau蛋白病調節療法治療受試者以抑制前述第一受質蛋白之產生或抑制前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之聚集。
  73. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含選擇性地濃縮前述樣本及前述第一培養混合物之一或多者中的前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  74. 如請求項73所記載之方法，其中前述選擇性地濃縮前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含在形成前述第一培養混合物之前預處理前述樣本。
  75. 如請求項70所記載之方法，其中前述選擇性地濃縮前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含在培養前述第一培養混合物之前預處理前述第一培養混合物。
  76. 如請求項73所記載之方法，其中前述選擇性地濃縮前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含接觸能夠結合前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的一或多種抗體以形成經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  77. 如請求項76所記載之方法，其中能夠結合前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述一或多種抗體包含以下一或多者：對前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的胺基酸表位序列為特異性的抗體，及對前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的構形為特異性的抗體。
  78. 如請求項77所記載之方法，其中對前述第一折疊錯誤之蛋 白質聚集體的構形為特異性的前述抗體對Tau蛋白病特異性折疊錯誤之tau聚集體之構形表位有選擇性。
  79. 如請求項77所記載之方法，其中能夠結合前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述一或多種抗體係偶合至固相。
  80. 如請求項79所記載之方法，其中前述固相包含磁珠及多孔板之一或多者。
  81. 如請求項76所記載之方法，其中前述使前述樣本與前述第一受質蛋白接觸以形成前述第一培養混合物包含使莫耳過量之前述第一受質蛋白與包含前述經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述樣本接觸，前述第一受質蛋白之前述莫耳過量大於包括在前述經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的蛋白質單體之總莫耳量中。
  82. 如請求項81所記載之方法，其中前述培養前述第一培養混合物係在前述經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下有效引起前述第一受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集以形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  83. 如請求項1所記載之方法，其中前述破壞前述第一培養混合物包含以下一或多者：音波振動處理、攪拌、搖動、冷凍/融化、雷射照射、高壓釜培養、高壓、及均質化。
  84. 如請求項1所記載之方法，其中前述破壞前述第一培養混合物包含循環攪動。
  85. 如請求項84所記載之方法，其中前述循環攪動係進行達以下一或多者：約50轉每分鐘(RPM)與10,000RPM之間，約200RPM與約2000RPM之間、及約500RPM。
  86. 如請求項1所記載之方法，其中前述破壞前述第一培養混合物係在每一培養循環進行達以下一或多者：約5秒與約 10分鐘之間、約30秒與約1分鐘之間、約45秒與約1分鐘之間、及約1分鐘。
  87. 如請求項1所記載之方法，其中前述培養前述第一培養混合物係在每一培養循環中獨立地進行達以下一或多者：約1分鐘與約5小時之間、約5分鐘與約5小時之間、約10分鐘與約2小時之間、約15分鐘與約1小時之間、及約25分鐘與約45分鐘。
  88. 如請求項1所記載之方法，其中前述每一培養循環包含獨立地培養及破壞前述第一培養混合物達以下一或多者：培養約1分鐘與約5小時之間且破壞約5秒與約10分鐘之間；培養約5分鐘與約5小時之間且破壞約5秒與約10分鐘之間；培養約10分鐘與約2小時之間且破壞約30秒與約1分鐘之間；培養約15分鐘與約1小時之間且破壞約45秒與約1分鐘之間；培養約25分鐘與約45分鐘之間且破壞約45秒與約90秒之間；培養約29分鐘且破壞約1分鐘；及培養約1分鐘且破壞約1分鐘。
  89. 如請求項1所記載之方法，其中前述進行前述培養循環係重複達以下一或多者：約2次與約1000次之間、約5次與約500次之間、約50次與約500次之間、及約150次與約250次之間。
  90. 如請求項1所記載之方法，其中前述使前述樣本與前述第一受質蛋白接觸以形成前述第一培養混合物在生理條件下進行。
  91. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含使前述樣本與莫耳過量之前述第一受質蛋白接觸以形成前述第一培養混合物，前述莫耳過量大於包括在前述樣本中的前述第一折疊 錯誤之蛋白質聚集體中的蛋白質單體之總莫耳量。
  92. 如請求項1所記載之方法，其進一步包含：使前述樣本與硫代黃素及莫耳過量之前述第一受質蛋白接觸以形成前述第一培養混合物，前述莫耳過量大於包括在前述樣本中的前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中的第一受質蛋白之量；進行前述培養循環兩次或更多次以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集；搖動前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由檢測相應於前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述硫代黃素之螢光來測定前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在。
  93. 如請求項1所記載之方法，其中前述第一受質蛋白係藉由以下一者產生：化學合成、重組產生、及自非重組生物樣本提取。
  94. 如請求項1所記載之方法，其中：前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含可溶性第一折疊錯誤之蛋白質聚集體及不可溶第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的一或多者；及前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含以下一或多者：可溶性部分及不可溶部分。
  95. 如請求項94所記載之方法，其中前述第一折疊錯誤之蛋白 質聚集體為前述可溶性第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  96. 如請求項1所記載之方法，其中其前提為前述樣本排除tau小纖維。
  97. 一種用於測定受試者中存在或不存在相應於第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的Tau蛋白病的方法，其包含：提供來自前述受試者之樣本；至少執行第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序，前述第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序包含：藉由使前述樣本之第一部分與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物，前述第一受質蛋白包含tau同功型，前述第一受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；在有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第一培養混合物中前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；及根據前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定前述受試者中存在或不存在前述Tau蛋白病；前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第一受 質蛋白且前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第一受質蛋白；且其前提為當前述第一受質蛋白由單體3R tau組成時，前述Tau蛋白病排除匹克症。
  98. 如請求項97所記載之方法，前述方法進一步包含：至少執行第二蛋白質折疊錯誤循環擴增程序以測定前述樣本中存在或不存在至少第二折疊錯誤之蛋白質聚集體，包含：藉由使前述樣本之第二部分與第二受質蛋白接觸來形成第二培養混合物，前述第二受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體；在有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第二培養混合物以有效引起前述第二受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第二培養混合物以有效形成前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第二培養混合物中前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第二受質蛋白且前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第二受質蛋白。
  99. 如請求項98所記載之方法，其中前述第二受質蛋白與前述 第一受質蛋白相異，且前述第二受質蛋白包含以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、3R tau、及4R tau。
  100. 如請求項98所記載之方法，其中前述第一受質蛋白包含4R tau。
  101. 如請求項98所記載之方法，前述方法進一步包含：至少執行第三蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序以測定前述樣本中存在或不存在至少第三折疊錯誤之蛋白質聚集體，包含：藉由使前述樣本之第三部分與第三受質蛋白接觸來形成第三培養混合物，前述第三受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體；在有效形成第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的條件下進行培養循環兩次或更多次，每一培養循環包含：在前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第三培養混合物以有效引起前述第三受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第三培養混合物以有效形成前述第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第三培養混合物中前述第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第三折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第三受質蛋白且前述第三擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第三受質蛋白。
  102. 如請求項101所記載之方法，其中前述Tau蛋白病存在於前 述受試者中，前述方法進一步包含根據：前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在；及前述樣本中前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來表徵前述受試者中的前述Tau蛋白病之身份。
  103. 如請求項97所記載之方法，其中其前提為前述Tau蛋白病不主要地藉由3R tau蛋白之折疊錯誤及/或聚集表徵。
  104. 如請求項97所記載之方法，其進一步包含：使前述樣本與硫代黃素及莫耳過量之前述第一受質蛋白接觸以形成前述第一培養混合物，前述莫耳過量大於包括在前述樣本中的前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中的蛋白質單體之量；進行前述培養循環兩次或更多次以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之至少前述部分的折疊錯誤及/或聚集；搖動前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由檢測相應於前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述硫代黃素之螢光來測定前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  105. 一種用於使用捕獲來測定樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的方法，其包含：自前述樣本捕獲前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體以形成經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；至少執行第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程 序，前述第一蛋白質折疊錯誤循環擴增程序包含：藉由使前述經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體與莫耳過量之第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物，前述第一受質蛋白經受活體內病理學折疊錯誤及/或聚集以形成前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述莫耳過量大於前述經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體中包括的蛋白質單體之量；進行培養循環兩次或更多次以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由檢測前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體之至少一部分來測定前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第一受質蛋白且前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第一受質蛋白。
  106. 如請求項105所記載之方法，其中前述自前述樣本捕獲前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體以形成經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體係使用對前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體為特異性的一或多種抗體來進行，前述抗體包含以下一或多者：對前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的胺基酸表位序列為特異性的抗體及對前述第一折疊錯誤之蛋白質 聚集體的構形為特異性的抗體。
  107. 如請求項106所記載之方法，其中對前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的構形為特異性的前述抗體對Tau蛋白病特異性第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之構形表位有選擇性。
  108. 如請求項106所記載之方法，其中對前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述構形為特異性的前述抗體相應於以下一者：阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、進行性上眼神經核麻痺症(PSP)、額顳葉失智症(FTD)、皮質基底核退化症(CBD)、輕度認知障礙(MCI)、嗜銀顆粒病(AgD)、創傷性腦損傷(TBI)、慢性創傷性腦病變(CTE)、及拳擊員癡呆(DP)。
  109. 如請求項105所記載之方法，其中對前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體為特異性的前述一或多種抗體係偶合至固相。
  110. 如請求項109所記載之方法，其中前述固相包含磁珠及多孔板之一或多者。
  111. 如請求項109所記載之方法，其中前述使前述樣本與前述第一受質蛋白接觸以形成前述第一培養混合物包含使莫耳過量之前述第一受質蛋白與前述樣本接觸，前述第一受質蛋白之前述莫耳過量大於包括在前述經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的蛋白質單體之總莫耳量中。
  112. 如請求項109所記載之方法，其中前述培養前述第一培養混合物係在前述經捕獲的第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下有效引起前述第一受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集以形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  113. 如請求項105所記載之方法，其中前述第一受質蛋白包含4R tau蛋白。
  114. 一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病的方法，前 述Tau蛋白病包含阿茲海默症(AD)，前述方法包含：提供前述受試者；自前述受試者獲得樣本，前述樣本包含以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物；至少執行第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序，前述第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序包含：藉由使前述樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物，前述第一受質蛋白包含4R tau；進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由檢測前述第一培養混合物中前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；及根據前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定前述受試者中存在或不存在AD。
  115. 如請求項114所記載之方法，其中測定前述受試者中存在或不存在AD進一步包含藉由測定AD tau蛋白聚集體之特性來將AD與一或多種另外的Tau蛋白病區別，前述特性包含以下一或多者：以下一或多個AD-特異性相應蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力學參數：停滯期、T 50、擴增速率、及擴增程度；使用對AD tau蛋白聚集體之構形表位有 選擇性的抗體進行的檢定；對AD tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及AD tau蛋白聚集體之頻譜特性。
  116. 一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病的方法，前述Tau蛋白病包含帕金森氏症(PD)，前述方法包含：提供前述受試者；自前述受試者獲得樣本，前述樣本包含以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物；執行至少第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序，包含：藉由使前述樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物，前述第一受質蛋白包含4R tau；進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由檢測前述第一培養混合物中前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；及根據前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定前述受試者中存在或不存在PD。
  117. 如請求項116所記載之方法，其中測定前述受試者中存在或不存在PD進一步包含藉由測定PD tau蛋白聚集體之特性來將PD與一或多種另外的Tau蛋白病區別，前述特性包含 以下一或多者：以下一或多個PD-特異性相應蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力學參數：停滯期、T 50、擴增速率、及擴增程度；使用對PD tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；對PD tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及PD tau蛋白聚集體之頻譜特性。
  118. 一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病的方法，前述Tau蛋白病包含進行性上眼神經核麻痺症(PSP)，前述方法包含：提供前述受試者；自前述受試者獲得樣本，前述樣本包含以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物；執行至少第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序，包含：藉由使前述樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物，前述第一受質蛋白包含4R tau；進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由檢測前述第一培養混合物中前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；及根據前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋 白質聚集體來測定前述受試者中存在或不存在PSP。
  119. 如請求項118所記載之方法，其中測定前述受試者中存在或不存在PSP進一步包含藉由測定PSP tau蛋白聚集體之特性來將PSP與一或多種另外的Tau蛋白病區別，前述特性包含以下一或多者：以下一或多個PSP-特異性相應蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力學參數：停滯期、T 50、擴增速率、及擴增程度；使用對PSP tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；對PSP tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及PSP tau蛋白聚集體之頻譜特性。
  120. 一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病的方法，前述Tau蛋白病包含額顳葉失智症(FTD)，前述方法包含：提供前述受試者；自前述受試者獲得樣本，前述樣本包含以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物；執行至少第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序，包含：藉由使前述樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物，前述第一受質蛋白包含4R tau；進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由檢測前述第一培養混合物中前述第一擴增折疊 錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；及根據前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定前述受試者中存在或不存在FTD。
  121. 如請求項120所記載之方法，其中測定前述受試者中存在或不存在FTD進一步包含藉由測定FTD tau蛋白聚集體之特性來將FTD與一或多種另外的Tau蛋白病區別，前述特性包含以下一或多者：以下一或多個FTD-特異性相應蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力學參數：停滯期、T 50、擴增速率、及擴增程度；使用對FTD tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；對FTD tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及FTD tau蛋白聚集體之頻譜特性。
  122. 一種用於測定受試者中存在或不存在Tau蛋白病的方法，前述Tau蛋白病包含皮質基底核退化症(CBD)，前述方法包含：提供前述受試者；自前述受試者獲得樣本，前述樣本包含以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物；至少執行第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序，前述第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序包含：藉由使前述樣本與第一受質蛋白接觸來形成第一培養混合物，前述第一受質蛋白包含4R tau；進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之至 少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由檢測前述第一培養混合物中前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體；及根據前述樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體來測定前述受試者中存在或不存在CBD。
  123. 如請求項122所記載之方法，其中測定前述受試者中存在或不存在CBD進一步包含藉由測定CBD tau蛋白聚集體之特性來將CBD與一或多種另外的Tau蛋白病區別，前述特性包含以下一或多者：以下一或多個CBD-特異性相應蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力學參數：停滯期、T 50、擴增速率、及擴增程度；使用對CBD tau蛋白聚集體之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；對CBD tau蛋白聚集體有選擇性的指示劑；及CBD tau蛋白聚集體之頻譜特性。
  124. 如請求項114、116、118、120、及120中任一項所記載之方法，其進一步包含：至少執行第二蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序以測定前述樣本中存在或不存在至少第二折疊錯誤之蛋白質聚集體，包含：藉由使前述樣本之第二部分與第二受質蛋白接觸來形成第二培養混合物，前述第二受質蛋白經受病理學折疊錯誤及/或聚集；進行培養循環兩次或更多次以有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含： 在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第二培養混合物以有效引起前述第二受質蛋白之至少一部分的折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第二培養混合物以有效形成前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由分析前述第二培養混合物中前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體；及前述Tau蛋白病存在於前述受試者中，前述方法進一步包含根據：前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在；及前述樣本中前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來表徵前述受試者中的前述Tau蛋白病之身份；前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第二受質蛋白；前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第二受質蛋白；且前述第二受質蛋白與前述第一受質蛋白相異，且前述第二受質蛋白包含以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、及3R tau。
  125. 如請求項124所記載之方法，其中測定前述受試者中存在或不存在每一Tau蛋白病進一步包含藉由分析一或多種折疊錯誤之聚集體之至少一個特性來將每一Tau蛋白病與一或多種另外的Tau蛋白病區別，前述折疊錯誤之聚集體各自相應於類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、及3R tau之一者，每一特性相應於以下一或多者：使用對一或多種折疊錯誤之 聚集體中任何者之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；使用對一或多種折疊錯誤之聚集體中任何者之構形表位有選擇性的抗體進行的檢定；前述一或多種折疊錯誤之聚集體之一或多個蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)動力學參數，其包含以下一或多者：停滯期、T 50、擴增速率、及擴增程度；對前述一或多種折疊錯誤之聚集體中任何者有選擇性的指示劑；及前述一或多種折疊錯誤之聚集體中任何者的頻譜特性。
  126. 一種用於測定樣本中存在或不存在第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的套組，其包含：第一受質蛋白，其包含4R tau；第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑，前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第一受質蛋白且前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體相應於Tau蛋白病；緩衝液；肝素；及鹽；說明書，前述說明書指導使用者：獲得樣本；執行至少第一蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序，包含：藉由使前述樣本之第一部分與前述第一受質蛋白、前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述指示劑、前述緩衝液、前述肝素、及前述鹽接觸來形成第一培養混合物，前述第一培養混合物係用一定濃度之以下一或多者形成：小於約20μM之前述第一受質蛋白；小於約75μM之 前述肝素；小於約190mM之作為NaCl的前述鹽；及小於約9.5μM之作為硫代黃素T的前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述指示劑；進行培養循環兩次或更多次以有效形成第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第一培養混合物以有效引起前述第一受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第一培養混合物以有效形成前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；及藉由根據前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述指示劑分析第一培養混合物中前述第一擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的存在或不存在來測定樣本中存在或不存在前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體。
  127. 如請求項126所記載之套組，其中前述說明書指導前述使用者自受試者獲得前述樣本，前述樣本包含以下一或多者：生物流體、生物材料、均質化組織、及細胞溶解產物，且前述說明書指導前述使用者根據前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定或診斷前述受試者中之Tau蛋白病。
  128. 如請求項126所記載之套組其進一步包含：第二受質蛋白及第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之指示劑，前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體包含前述第二受質蛋白，前述第二受質蛋白與前述第一受質蛋白相異且前述第二受質蛋白包含以下一者：類澱粉-β(Aβ)、α突觸核蛋白、3R tau、及4R tau； 前述說明書進一步指導前述使用者：執行至少第二蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)程序，包含：藉由使前述樣本之第二部分與前述第二受質蛋白及前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述指示劑接觸來形成第二培養混合物；進行培養循環兩次或更多次以有效形成第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體，每一培養循環包含：在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體存在下培養前述第二培養混合物以有效引起前述第二受質蛋白之折疊錯誤及/或聚集；破壞前述第二培養混合物以有效形成前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體；藉由分析前述第二培養混合物中前述第二擴增折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來測定前述樣本中存在或不存在前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體；根據：前述樣本中前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在；及前述樣本中前述第二折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述存在或不存在來針對Tau蛋白病之身份表徵前述樣本。
  129. 如請求項126所記載之套組，其進一步包含蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)設備，前述蛋白質折疊錯誤循環擴增(PMCA)設備包含以下一或多者：多壁微滴定板；微射流板；搖動設備；分光計；及培養器。
  130. 如請求項126所記載之套組，其中對前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體的前述構形為特異性的前述抗體相應於以下一 者：阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、進行性上眼神經核麻痺症(PSP)、額顳葉失智症(FTD)、皮質基底核退化症(CBD)、輕度認知障礙(MCI)、嗜銀顆粒病(AgD)、創傷性腦損傷(TBI)、慢性創傷性腦病變(CTE)、及拳擊員癡呆(DP)，前述說明書包含根據使用對前述第一折疊錯誤之蛋白質聚集體之前述構形為特異性的前述抗體進行的結合檢定測定前述受試者中存在或不存在以下一者：AD、PD、PSP、FTD、CBD、MCI、AgD、TBI、CTE、及DP。
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