TW201922261A - 無痛、無水腫且無副作用之局部減脂可注射組成物及製備其之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種無痛、無水腫且無副作用地減少局部脂肪之組成物；及一種用於製備其之方法。更特定言之，本發明係關於一種無副作用之用於減少局部脂肪的包含特定混合比之甘膽酸（或其鹽）或牛膽酸（或其鹽）及磷脂醯膽鹼（PPC）的組成物，該等副作用諸如疼痛、水腫、除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死、投藥部位感覺缺失、廣泛腫脹、紅斑、硬結、感覺異常、結節、搔癢、灼燒感、神經損傷、及吞咽困難；及一種製備其之方法。 DCA單一可注射製劑或混合有DCA作為增溶劑之PPC可注射製劑為用於減少局部脂肪之習知可注射製劑，已知其由於不僅溶解脂肪細胞而且溶解纖維母細胞、血管內皮細胞及骨胳肌肉細胞所必然導致的細胞壞死而伴隨有諸如以下之副作用：疼痛、感覺缺失、廣泛腫脹、局部水腫、紅斑、硬結、感覺異常、結節、搔癢、灼燒感、吞咽困難及其類似者。因而，患者主訴疼痛、不適及焦慮，順應性低。另一方面，根據本發明的用於減少局部脂肪之可注射組成物為安全且穩定之調配物，選擇性溶解脂肪細胞，且對誘導脂肪細胞之細胞凋亡具有極佳效果，以使得其為提高患者之順應性及生命品質而無上文所提及之副作用的極佳組成物。
Description
本發明係關於一種適用於使用醫藥學上活性之磷脂醯膽鹼無痛、無水腫且無副作用地以非外科方式減少具有局部脂肪沈積之個體中之脂肪的組成物；及一種用於製備其之方法。更特定言之，本發明係關於一種以減輕的疼痛及副作用（尤其除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死；水腫；投藥部位感覺缺失；廣泛腫脹；紅斑；硬結；感覺異常；結節；搔癢；灼燒感；神經損傷；或吞咽困難）減少局部脂肪之組成物及製劑，該組成物包含：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內；一種包含其之套組；一種製備其之方法；及一種使用該組成物或製劑以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除局部脂肪沈積之方法。
本申請案主張2017年11月3日申請之韓國專利申請案第10-2017-0146264號之優先權，其全部內容以引用之方式併入本文中。
局部沈積之脂肪受到許多人的特別關注。在面部或身體部分具有非想要的凸起或鼓起之脂肪沈積之人看起來吸引力更低且看起來更年老。其可由衰老、生活方式或遺傳素質引起。為克服此問題，吾人嘗試經由運動及飲食來改善，但減脂效果有限。
用於減少局部脂肪沈積之典型的外科美容整形外科程序包括吸脂、抽脂及吸脂體雕（liposculpture suction），其為移除大量脂肪之美容整形外科。最小侵襲性的美容（非外科）程序為使用醫療裝置、中胚層療法或仿單外注射之程序。然而，外科程序之恢復耗時數週或數月，且某些個別主體（諸如吸菸者及糖尿病患者）可能會經受相當久的恢復延遲，且包括潛在併發症及風險，諸如引起每100,000個人中有20例死亡之致命副作用，全身麻醉、出血過多、內臟損傷、細菌感染、疤痕、瘀傷、腫脹及疼痛之風險。在為其替代方案的非外科方法之情況下，由於缺乏在衛生當局監督下批准進行之大規模臨床試驗，無法確保安全性及功效，所以存在潛在風險。需要開發不具有外科及非外科程序之風險的臨床上可用之新型藥物。
用於局部減脂之可注射藥物為向皮下脂肪層中注射以誘導脂肪細胞損失之藥物注射劑。一典型實例為PPC注射劑。PPC注射劑為多烯磷脂醯膽鹼之縮寫，且存在由德國（Germany）之A. Nattermann GmbH在20世紀50年代開發用於治療肝病之Essentiale® N i.v.，及經開發用於預防及治療脂肪栓塞之Lipostabil® N i.v.，及已在韓國（the Republic of Korea）經批准作為因肝硬化所致之肝昏迷之輔助醫藥的Lipobean®。
在PPC注射劑被開處用於預防及治療肝病或脂肪栓塞期間，1988年一名意大利（Italian）醫生Dr.Sergio Maggiori在法國巴黎（Paris, France）之MesoTherapy Society第一次報導如下測試結果：Xantelasma，黃色脂肪沈積於眼瞼中之疾病藉由PPC注射劑治療；1999年一名巴西（Brazilian）皮膚病學家Dr, Patricia G.Rittes在Brazil Dermatology Society宣佈用PPC注射劑使下眼瞼脂肪墊減少之測試結果，證實用PPC注射劑有可能使脂肪損失。自此以後，已公開關於小規模安全性及PPC注射劑至脂肪沈積之腹部、肋部、大腿、頦下、背部、臂、腿部及脂瘤中之安全性的測試結果。
PPC注射劑為主要組分多烯磷脂醯膽鹼與增溶劑去氧膽酸混合之組成物。PPC為生物膜之必需磷脂及主要組分，且由疏水性尾部結構構成，其中五個脂肪酸鍵結至甘油碳骨架中的磷及膽鹼之親水性頭部。其構成人體之細胞膜及粒線體網路的55%。因為其幾乎不在人體中合成，所以其為自身體外部供應之必需成分。其大量包含於大豆、蛋及其類似物中。且其可藉由物理或化學方法使用核酸提取且以高純度純化。
去氧膽酸（DCA）為二級膽汁鹽之一，腸內細菌之代謝副產物，且作為增溶劑混合以使可溶性差的PPC成為穩定可注射組成物。用DCA增溶之PPC以小於10 nm之混合微胞系統形式穩定分散。若在PPC不經增溶之情況下注射，則其將不溶解於單分子中且無法獲得所需血液濃度。另外，血管可能會變得阻塞且可能會發生血栓，因此未經增溶之PPC不用作注射劑。若藥物在靜脈內注射期間未經增溶且形成懸浮沈澱物，則較大粒子將堵塞血管，影響受堵塞血管附近的周圍組織之血流，或損傷或刺激組織，從而導致搔癢、疼痛、癲癇發作及其類似者。在嚴重情況下，可能會發生栓塞。
PPC已基於以下事實而被視為減脂之活性成分：Lipostabil® N iv，一種包含PPC作為主要組分及DCA作為增溶劑之組成物被開處用於治療脂肪組織流入靜脈中引起栓塞之脂肪栓塞。但，據證實，DCA作為增溶劑混合於PPC注射劑中引起因洗滌劑效果所致之壞死，導致脂肪細胞減少。因此，已發現，PPC注射劑之降脂活性成分為DCA（非專利文獻1）。基於此，2015年FDA批准由Kythera biopharmaceuticals公司（一家位於美國的私人持有之公司）開發的不含有PPC之DCA單一注射劑作為細胞溶解劑用於經由頦下減脂改善外貌。
然而，因為DCA單一注射劑或用DCA增溶之PPC注射劑不僅溶解脂肪細胞（3T3L1脂肪細胞），而且非選擇性地溶解正常纖維母細胞、內皮細胞及骨胳肌肉細胞，所以其為細胞溶解注射劑而非脂肪降解注射劑（非專利文獻2）。
臨床上，PPC及DCA混合之組成物據報導會引起疼痛（78.4%）、血腫（83.8%）、紅斑（100%）、灼燒感（100%）、水腫（100%）及硬結（66.7%），且DCA單一組成物據報導會引起疼痛（100%）、瘀傷（91.9%）、紅斑（100%）、灼燒感（100%）、腫脹（100%）及硬結（89.2%）（非專利文獻3）。另外，DCA單一組成物之大規模臨床試驗之結果顯示，引起疼痛（73.6%）、血腫（72.9%）、水腫（67.8%）、感覺缺失（65.5%）、紅斑（35.3%）、腫脹（29.1%）、硬結（28.3%）、搔癢（16.3%）及結節（14.3%）（非專利文獻4）。此等有害情況由如下作用機制引起：皮下注射之DCA堵塞向細胞之氧氣供應，引起即刻細胞膨脹及細胞膜之起泡及損傷，導致細胞因快速炎性反應所致而壞死（非專利文獻5）。
當細胞在活體內死亡時，壞死與細胞凋亡存在顯著差異。細胞凋亡係指主動死亡，其中各種基因及蛋白質之表現及活性由細胞內部計劃性之信號調節，且經由該過程產生之細胞凋亡體藉由周圍細胞或巨噬細胞之吞噬作用移除，及其類似者，以便其不引起炎症。另一方面，壞死為因外部環境之變化所致而突然發生的被動死亡，其導致染色體之不規則凝集及細胞質之腫脹。最後，細胞碎片經由細胞降解形成且已知其會引起炎症（Earnshaw, WC, Curr. Opin. Cell Biol., 7, 第337-343頁, 1995）。
因此，當局部減脂注射劑充當細胞壞死因子時，炎性作用影響除被投予藥物的目標部位外之周圍區域，以致其亦影響正常運作之細胞且因此將其殺死。此等事實總結而言，重要的為，在無已得到批准之外貌修復注射劑的副作用之情況下選擇性且高效地誘導脂肪細胞之脂肪溶解及細胞凋亡，該等副作用諸如疼痛、腫脹、感覺缺失、廣泛腫脹、紅斑、硬結、感覺異常、結節、搔癢、灼燒感、及除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死。然而，迄今為止尚無自此視角開發之研究及調配物（非專利文獻6）。
迄今為止，已存在用Lipostabil® N i.v.、Essentiale® N i.v.（PPC及DCA混合之組成物之可注射調配物）之仿單外處理用於局部減脂，且不僅已對Kybella（DCA單一組成物）進行許多關於減脂之研究，而且Kybella在世界上最先得到FDA批准作為細胞溶解藥物用於外貌改善。但先前技術及組成物具有某些限制。想要用非外科處理減少脂肪之人由於由PPC + DCA組成物或DCA單一組成物引起之副作用而主訴不適及焦慮，該等副作用諸如疼痛、腫脹、感覺缺失、廣泛腫脹、紅斑、硬結、感覺異常、結節、搔癢、灼燒感、及除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死。出於此等原因，儘管臨床功效目前已得到驗證，但藥物順應性較低。因此，與當前可用的細胞溶解注射劑相比，需要開發不會引起因炎症所致之疼痛及腫脹且藉由選擇性地誘導脂肪細胞之細胞凋亡及降解在無副作用之情況下減少脂肪的注射劑。本發明滿足此等需求。
基於以上事實，本發明之發明人研究PPC之減脂效果，且報導如下測試結果：不具有DCA之單獨PPC組成物僅藉由細胞凋亡、且不藉由壞死來減少脂肪細胞，但不影響纖維母細胞（非專利文獻7）。自此以後，本發明人已完成本發明，研究基於PPC作為活性成分無痛、無水腫且無副作用之選擇性脂肪細胞減少組成物。 （非專利文獻1）Rotunda AM, Suzuki H, Moy RL, Kolodney M., Detergent effects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectable phosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution. Dermatol Surg 30(7):1001-8(2004) （非專利文獻2）A.Gupta, Action and comparative efficacy of phosphatidylcholine formulation and isolated sodium deoxycholate for different cell type, Aest Plast Sur, 33:346-352, 2009 （非專利文獻3）Giovanni Salti, Phosphatidylcholine and sodum deoxycholate in the treatment of localized fat: A doube-blind, randomized study, Dermatol Surg 34:60-66, 2007 （非專利文獻4）Humphrey等人, ATX-101 for reduction of submental fat: A Phase Ⅲ randomized controlled trial, J AM ACAD DERMATOL 第75卷, 第4期, 788-797, 2016 （非專利文獻5）Duncan, Injectable therapies for localized fat loss: state of the art, Clin Plastic Surg, 1-13, 2011 （非專利文獻6）Duncan, Refinement of Technique in injection lipolysis based on scientific studies and clinical evaluation, Clin Plastic Surg 36 195-209 (2009) （非專利文獻7）Dong-Seok Kim, Phosphatidylcholine induces apoptosis of 3T3-L1 adipocytes, Journal of biomedical science,18:91,1-7, 2011
技術問題
為了解決習知DCA單一注射劑或用DCA增溶之PPC注射劑之副作用問題，諸如疼痛、水腫及由非選擇性細胞溶解引起之各種副作用，尤其由除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死引起之嚴重臨床副作用，本發明之發明人進行測試以製備一種安全且穩定的局部減脂可注射組成物，其藉由誘導脂肪細胞之細胞凋亡及脂肪溶解之機制無痛且無水腫地減少脂肪，且選擇性地減少脂肪細胞而不損傷纖維母細胞、血管內皮細胞及骨胳肌肉細胞。因此，發明人已在證實以下事實之後完成本發明：藉由以特定比率添加牛膽酸（TCA）、尤其甘膽酸（GCA）至磷脂醯膽鹼（PPC）來製備之本發明組成物為安全的且具有極佳調配穩定性，且並不誘導細胞壞死，但選擇性地僅誘導脂肪細胞之細胞凋亡及降解。
因此，本發明之一態樣為提供一種以減輕的疼痛及副作用（水腫；投藥部位感覺缺失；廣泛腫脹；紅斑；硬結；感覺異常；結節；搔癢；灼燒感；神經損傷；吞咽困難；及除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死）減少局部脂肪之組成物，該組成物包含：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
本發明之另一態樣為提供一種以減輕的疼痛及副作用移除個體中之局部脂肪沈積之製劑，該製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
本發明之另一態樣為提供一種套組，其包含：（I）第一容器，其包含具有減輕的疼痛及副作用的用於移除局部脂肪沈積之組成物或製劑，該組成物或製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該組成物或製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內；以及 （II）能夠將該組成物或製劑遞送至脂肪沈積部位之遞送裝置。
本發明之另一態樣為提供一種套組，其包含：（I）第一容器，其包含具有減輕的疼痛及副作用的用於移除局部脂肪沈積之組成物或製劑，該組成物或製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者是以與該磷脂醯膽鹼相同或更小之重量被包含；以及（II）能夠將該組成物或製劑遞送至脂肪沈積部位之遞送裝置。
本發明之另一態樣為提供一種製備以減輕的疼痛及副作用（水腫；投藥部位感覺缺失；廣泛腫脹；紅斑；硬結；感覺異常；結節；搔癢；灼燒感；神經損傷；吞咽困難；及除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死）減少局部脂肪之可注射組成物之方法，該方法包含以下步驟：（a）添加選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者至注射用水，隨後在攪拌的同時溶解以獲得澄清混合物；（b）添加防腐劑，隨後攪拌；（c）添加磷脂醯膽鹼，隨後在室溫下攪拌；及（d）用水調節該組成物之總體積，隨後攪拌，其中該選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者與該磷脂醯膽鹼之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
本發明之另一態樣為提供一種用於製備具有減輕的疼痛及副作用的用於以非外科方式移除局部脂肪沈積之醫藥組成物之方法，該方法包含添加磷脂醯膽鹼以及選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者，
其中該選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者以與該磷脂醯膽鹼相同或更小之重量添加。
本發明之另一態樣為提供一種以減輕的疼痛及副作用移除局部脂肪沈積之方法，該方法包含向具有局部脂肪沈積之個體投予有效量之磷脂醯膽鹼；及至少一種選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的磷脂醯膽鹼增溶劑。
本發明之另一態樣為提供一種以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除具有局部脂肪沈積之個體中之局部脂肪沈積的方法，該方法包含投予包含以下之製劑：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者。
本發明之另一態樣為提供一種以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除個體中之局部脂肪沈積之方法，該方法包含向該具有局部脂肪沈積之個體投予包含以下之製劑：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者，其中該製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
在一個具體實例中，製劑包含1.0%至約15.0%之濃度為脂肪溶解濃度的磷脂醯膽鹼。
在一個具體實例中，製劑為可注射製劑。在另一具體實例中，製劑為用於減少脂肪細胞之可注射製劑。
本發明亦提供一種在具有局部脂肪沈積之個體中非外科減少的方法。
在一個具體實例中，該方法包含投予呈具有pH 6.0至pH 9.0之pH的醫藥學上可接受之製劑形式的包含用甘膽酸或牛膽酸增溶之磷脂醯膽鹼組成物中之至少一者的製劑。
在一個具體實例中，投藥過程包含皮下注射。
在一個具體實例中，局部脂肪沈積選自由以下組成之群：下眼瞼脂肪凸出、脂瘤、脂質營養不良及與脂肪團相關之脂肪沈積物。
在一個具體實例中，脂肪沈積侷限於個體之眼下面、頦下（頦下面）、臂下面、臀部、小腿、背部、大腿、踝部或胃部中。
本發明亦提供一種套組，其包含關於使用以非外科方式移除個體中之局部脂肪沈積之包含用甘膽酸或牛膽酸增溶的磷脂醯膽鹼組成物中之至少一者之製劑的書面指示。技術解決方案
根據本發明之一態樣，提供一種以減輕的疼痛及副作用（水腫；投藥部位感覺缺失；廣泛腫脹；紅斑；硬結；感覺異常；結節；搔癢；灼燒感；神經損傷；吞咽困難；及除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死）減少局部脂肪之組成物，該組成物包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
根據本發明之另一態樣，提供一種以減輕的疼痛及副作用移除個體中之局部脂肪沈積物之製劑，該製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
根據本發明之另一態樣，提供一種套組，其包含：（I）第一容器，其包含具有減輕的疼痛及副作用的用於移除局部脂肪沈積之組成物或製劑，該組成物或製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該組成物或製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內；以及 （II）能夠將該組成物或製劑遞送至脂肪沈積部位之遞送裝置。
根據本發明之另一態樣，提供一種套組，其包含：（I）第一容器，其包含具有減輕的疼痛及副作用的用於移除局部脂肪沈積之組成物或製劑，該組成物或製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者是以與該磷脂醯膽鹼相同或更小之重量被包含；以及（II）能夠將該組成物或製劑遞送至脂肪沈積部位之遞送裝置。
根據本發明之另一態樣，提供一種製備以減輕的疼痛及副作用（水腫；投藥部位感覺缺失；廣泛腫脹；紅斑；硬結；感覺異常；結節；搔癢；灼燒感；神經損傷；吞咽困難；及除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死）減少局部脂肪之可注射組成物之方法，該方法包含以下步驟：（a）添加選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者至注射用水，隨後在攪拌的同時溶解以獲得澄清混合物；（b）添加防腐劑，隨後攪拌；（c）添加磷脂醯膽鹼，隨後在室溫下攪拌；及（d）用水調節該組成物之總體積，隨後攪拌，其中該選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者與該磷脂醯膽鹼之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
根據本發明之另一態樣，提供一種用於製備具有減輕的疼痛及副作用的用於以非外科方式移除局部脂肪沈積之醫藥組成物之方法，該方法包含添加磷脂醯膽鹼以及選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者，其中該選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者以與該磷脂醯膽鹼相同或更小之重量添加。
根據本發明之另一態樣，提供一種以減輕的疼痛及副作用移除個體中之局部脂肪沈積之方法，該方法包含向該具有局部脂肪沈積之個體投予有效量之磷脂醯膽鹼；及至少一種選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的磷脂醯膽鹼增溶劑。
根據本發明之另一態樣，提供一種以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除具有局部脂肪沈積之個體中之局部脂肪沈積的方法，該方法包含投予包含以下之製劑：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者。
根據本發明之另一態樣，提供一種以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除個體中之局部脂肪沈積之方法，該方法包含向該具有局部脂肪沈積之個體投予包含以下之製劑：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者，其中該製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。 術語
在本發明中，術語『磷脂醯膽鹼（phosphatidylcholine）』係指IUPAC名稱1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼為磷脂之化合物且在本說明書中稱為PPC。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同的含義。儘管與本文所述之方法及材料類似或等效的任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試，但描述較佳之方法及材料。
如本文所用，以下術語中之每一者在此章節中具有與其相關之含義。
冠詞「一（a/an）」在本文用於表示冠詞之文法對象之一或多者（亦即至少一者）。舉例而言，「一要素（an element）」係指一或多個要素。
當提及諸如量、時間長度等之可量測值時，術語「約（about）」係指包含與規定值相差± 20%、± 10%、± 5%、± 1%或± 0.1%之變化，因為該變化對於進行規定方法為恰當的。
若疾病或病症之症狀之嚴重程度、該等症狀由患者經歷之頻率或兩者降低，則疾病或病症「緩解（alleviated）」。
如本文所用，術語「膽汁酸（bile acid）」包括類固醇酸（及/或其甲酸陰離子）及其鹽，且見於動物（例如人類）之膽汁中。「去氧膽酸（deoxycholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱(4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12- 二羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊酸之化合物，且在本說明書中稱為DCA。
「甘膽酸（glycocholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊醯基]胺基]乙酸之化合物，且在本說明書中稱為GCA。
「牛膽酸（taurocholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊醯基]胺基]乙磺酸之化合物，且在本說明書中稱為TCA。
「膽酸（cholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊酸之化合物，且在本說明書中稱為CA。
「鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱((4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊酸之化合物，且在本說明書中稱為CDCA。
「熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱(4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊酸之化合物，且在本說明書中稱為UDCA。
「甘去氧膽酸（glycodeoxycholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱2-[[(4R)-4-[(3R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-二羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊醯基]胺基]乙酸之化合物，且在本說明書中稱為GDCA。
「牛去氧膽酸（taurodeoxycholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱2-[[(4R)-4-[(3R,5R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-二羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊醯基]胺基]乙磺酸之化合物，且在本說明書中稱為TDCA。
「豬去氧膽酸（hyodeoxycholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱(4R)-4-[(3R,5R,6S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-3,6-二羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊酸之化合物，且在本說明書中稱為HDCA。
「石膽酸（lithocholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱(4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊酸之化合物，且在本說明書中稱為LCA。
「牛熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羥基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-17-基]戊醯基]胺基]乙磺酸之化合物，且在本說明書中稱為TUDCA。
「去氫膽酸（dehydrocholic acid）」為一類膽汁鹽，且係指IUPAC名稱(4R)-4-[(5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-3,7,12-三側氧基-1,2,4,5,6,8,9,11,14,15,16,17-十二氫環戊并[a]菲-17-基]戊酸之化合物，且在本說明書中稱為DHCA。
術語「患者（patient）」、「個體（subject）」、「個別主體（individual）」及其類似術語在本文中可互換使用，且係指能夠完成本文所描述之方法的任何動物或其細胞（諸如試管內或原位）。在某些非限制性具體實例中，患者、個體或個別主體為人類。
如本文所用，術語「組成物（composition）」或「醫藥組成物（pharmaceutical composition）」可指至少一種用於本發明中之化合物或組成物與諸如任何額外載劑、穩定劑、懸浮劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑及其類似物之其他化學組分的混合物。醫藥組成物促進化合物向生物體之投予。
如本文所用，術語「有效量（effective amount）」、「醫藥有效量（pharmaceutically effective amount）」及「治療有效量（therapeutically effective amount）」係指能夠提供所需生物結果之無毒性且充足之量。結果可為疾病之病徵、症狀或病因之減輕及/或緩解，或生物系統之任何其他所需變化。在任何個別情況下之適當治療量可由一般熟習此項技術者使用常規測試來確定。
如本文所用，術語「功效（efficacy）」可指分析內實現之最大效果（Emax）。
如本文所用，「指導材料（instructional material）」包含可用於傳達本發明之化合物、組成物、載體或遞送系統於套組中用於緩解本文所提及之各種疾病或病症之效用的公開案、記錄、圖式或任何其他呈現媒介。選擇性地或替代性地，指導材料可描述至少一種緩解哺乳動物之細胞或組織中的疾病或病症之方法。本發明之套組之指導材料例如可附著至包含本發明之所鑑別化合物、組成物、載體或遞送系統之容器，或可與含有化合物、組成物、載體或遞送系統之容器一起運送。
替代性地，指導材料可與容器分開運送，意圖由接收者將材料與化合物（組成物）協作使用。
術語「局部投藥（local administration）」係指經由非全身性途徑向患者之肌肉或真皮下位置或其周圍投予醫藥成分。因此，局部投藥排除經由全身性途徑投藥，諸如靜脈內或經口投藥。
術語「醫藥學上可接受（pharmaceutically acceptable）」係指彼等性質及/或物質自藥理學/毒理學視角可為患者接受，且關於組成、調配、穩定性、患者接受性及生物可用性自物理/化學視角可為製備藥物化學家接受。「醫藥學上可接受之載劑（pharmaceutically acceptable carrier）」係指不干擾活性成分之生物活性之有效性且對被投予其之宿主無毒性的介質。
「治療性（therapeutic）」治療為出於減輕或消除病理學病徵或症狀之目的，向展示彼等病徵或症狀之個體投予之治療。
如本文所用，術語「治療（treatment/treating）」定義為向患者施用或投予治療劑，亦即本發明化合物（單獨或與另一醫藥劑組合）；或向自患者分離之組織或細胞系（例如用於診斷或活體外應用）施用或投予治療劑，該患者具有本文所涵蓋之病況、本文所涵蓋之病況之症狀或有可能患上本文所涵蓋之病況，施用或投予之目的為治癒、癒合、緩解、減輕、改變、彌補、改善、改良或影響本文所涵蓋之病況、本文所涵蓋之病況之症狀或患上本文所涵蓋之病況之可能性。該等治療可基於獲自藥理學領域之知識而經特定調整或修改。
術語「治療有效量（therapeutically effective amount）」為當向患者投予時改善疾病之症狀的本發明化合物之量。構成「治療有效量」的本發明化合物之量將視化合物、疾病狀態及其嚴重程度、待治療之患者之年齡及其類似因素而變化。治療有效量可由一般熟習此項技術者鑒於其自身知識及本發明而常規地確定。
範圍：在本發明通篇中，本發明之各種態樣可以範圍格式呈現。應理解，範圍格式之描述僅為了方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明之範疇的不靈活限制。因此，範圍之描述應視為已具體揭示所有可能之子範圍以及該範圍內之個別數值。舉例而言，對諸如1至6之範圍的描述應視為已具體揭示子範圍，諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該範圍內之個別數值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。不管範圍之廣度如何，此均適用。
除非另外陳述，否則在本發明中用於表示組成物含量之術語「%」意謂w/v%之含量，且除非另外陳述，否則意謂以總組成物計之w/v%值。
在本發明中，『選自由甘膽酸或牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者/磷脂醯膽鹼』之描述中的符號『/』為常用形式之分數呈現。
在下文中，將詳細描述本發明。
FDA批准之Kybella（DCA 1.0%）（一種用於改善外貌之細胞溶解劑）及用DCA增溶之仿單外處理的PPC可注射組成物（例如Lipostabil、Essential、Lipobean）當其被投予用於局部減脂時伴有因炎性反應所致之疼痛及水腫。另外，其為引起纖維母細胞、骨胳肌肉細胞、血管內皮細胞以及脂肪細胞壞死之非選擇性細胞溶解劑，且已報導致命副作用，諸如投藥部位壞死、潰瘍及下頜麻痹及神經損傷。出於此原因，已警告不要將藥物注射至唾液腺、淋巴結、肌肉或極靠近其之區域中，以防止對除脂肪外之組織的潛在損傷。另外，當前接受Kybella之個體持續報導副作用，諸如疼痛、腫脹、面部麻痹及皮膚壞死。
就此而言，本發明之發明人發現，不具有增溶劑之PPC（5.0%）單一組成物具有Kybella（DCA 1.0%）之等效試管內脂肪細胞減少效果，但PPC藉由細胞凋亡及降解機制選擇性地誘導脂肪細胞減少，且據證實有可能開發一種無痛、無水腫且無副作用之減脂組成物。然而，PPC在製備物理或化學上穩定且安全可注射之組成物時具有侷限性，因為其溶解度較差。基於此背景，本發明人自2010年起已研究含有PPC作為主要組分的脂肪細胞減少劑之組成物。因此，分散於高壓均質機中之PPC展示脂肪細胞減少的時間及濃度依賴性效果，但其在產業使用中由於穩定性低而受限。
出於此原因，本發明人以物理及化學方式進行調配物測試以製備可安全且穩定地皮下注射可溶性差的PPC之組成物（圖1至3）。此研究係基於以下假設：毒性可由膽汁酸（鹽）之表面活性特異性表現。因為表面活性功能抑制PPC所固有之脂肪細胞之細胞凋亡及降解效果且藉由壞死功能誘導細胞溶解，所以其造成局部減脂伴有疼痛、水腫及副作用。因此，界面活性劑之特定類型及其使用容量（比率）給熟習此項技術者帶來顯著技術障礙。
下文在各種比較實施例、實施例及實驗實施例中提供之結果展現本發明組成物之未預期的特定效果。簡言之，本發明人選擇在所選組成物之中在活體內水腫、病變及炎症評估中無原位不良反應或具有輕度不良反應的膽汁酸（鹽）之組合，其據調配物測試之結果證實為產業上可適用且安全的。在所選膽汁酸（鹽）之中，在試管內評估脂肪細胞、纖維母細胞、內皮細胞及骨胳肌肉細胞之活力中針對脂肪細胞選擇性選擇GCA及TCA，且隨後，用GCA或TCA增溶之PPC組成物對脂肪細胞之細胞凋亡及降解之效果得到驗證。另外，據證實，本發明之用GCA增溶之PPC複合組成物不僅不具有全身毒性而且不具有局部毒性。本發明研究者之臨床試驗之結果展現以下未預期的發現：組成物對減脂之功效並不次於Kybella，且組成物無痛、無水腫且無副作用或疼痛、水腫及副作用降低80%或更大。此將在下文更詳細地描述。
作為經選擇作為PPC之增溶劑的膽汁鹽（膽酸（CA）、去氧膽酸（DCA）、甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）、鵝去氧膽酸（CDCA）、熊去氧膽酸（UDCA）、甘去氧膽酸（GDCA）、牛去氧膽酸（TDCA）、豬去氧膽酸（HDCA）、牛熊去氧膽酸（TUDCA）、石膽酸（LCA）及去氫膽酸（DHCA））測試之結果，據證實，LCA及DHCA不能增溶PPC（圖3A及3B），且CA、DCA、GCA、TCA、CDCA、UDCA、GDCA、TDCA、HDCA及TUDCA在特定或更大莫耳比下穩定增溶PPC（圖2A至2J）。
用CA、DCA、GCA、TCA、CDCA、UDCA、GDCA、TDCA、HDCA及TUDCA（其為選自調配物測試之膽汁酸）對炎症、水腫及病變進行活體內測試。在膽汁酸之中，DCA為最強效界面活性劑且據報導會導致由非選擇性細胞溶解所引起之炎症、腫脹及臨床副作用。因此，本發明人意識到，展示有害效果之添加劑（如膽汁酸之中的DCA）不為適合增溶劑，因為其抑制PPC對選擇性脂肪細胞之細胞凋亡及降解之固有活性。因而，首先，實施不同濃度的膽汁酸之活體內注射劑以研究水腫、皮膚病變及炎症（其為代表性有害實例）。
作為膽汁酸的活體內水腫測試之結果（圖4A至4G），在投藥之後2小時，據證實： 「無」 - 用GCA（1.25-2.5%）或TCA（1.25-2.5%）增溶之PPC（2.50-5.0%）複合組成物， 「輕度」 - PPC（1.25-10.0%）、GCA（1.0%）、TCA（1.0%）及TUCA（1.0%、2.5%）之單一組成物，及PPC（7.5%、10.0%）+GCA（3.75%、5.0%）及PPC（7.5%、10.0%）+TCA（3.75%、5.0%）之複合組成物， 「中度」 - PPC（12.5%、15.0%）、UDCA（1.0%）、GDCA（1.0%）、CDCA（1.0%）、CA（1.0%）、GCA（2.5%、5.0%）、TCA（2.5%、5.0%）及TUDCA（5.0%、7.5%）之單一組成物，及PPC（5.0%）+CA（2.5%）、PPC（15.0%）+GCA（7.5%）及PPC（15.0%）+TCA（7.5%）之複合組成物， 「重度」及「極其嚴重」 - 其他單一組成物及複合組成物。
與用DCA（2.2%）增溶之PPC（5.0%）展示極其嚴重水腫相比，本發明之PPC（2.5-15.0%）+GCA（1.25-7.50%）複合組成物（圖4N）及PPC（5.0%）+GCA（2.5-7.5%）複合組成物（圖4P）為無水腫之令人驚訝的發明。令人驚訝的發現為，在GCA或TCA單獨注射劑之情況下所觀測到的水腫程度在PPC + GCA及PPC + TCA複合組成物中顯著降低。然而，單獨DCA或用2.2%增溶之5.0% PPC之組成物在投藥之後展示極其嚴重水腫，表明DCA具有誘導細胞壞死及中斷PPC固有之選擇性脂肪細胞的細胞凋亡及降解之效果（圖4M）。
作為活體內皮膚病變測試之結果（圖5A至5F），在投藥之後2小時，據證實： 「無」 - PPC（1.25-15.0%）、GCA（1.0%）、TCA（1.0%）及TUDCA（1.0-7.5%）之單一組成物，及PPC（2.5-10.0%）+GCA（1.25-5.0%）及PPC（5.0%）+GCA（2.5-5.0%）之複合組成物， 「輕度」 - HDCA（1.0%）、CA（1.0%）、GCA（2.5%、5.0%）及TCA（2.5%、5.0%）之單一組成物，及PPC（15.0%）+GCA（7.5%）之複合組成物， 「中度」 - DCA（1.0%）、UDCA（1.0%）、TDCA（1.0%）、GDCA（1.0%）、CDCA（1.0%）、CA（2.5%）、GCA（7.5%）及TCA（7.5%）之單一組成物， 「重度」及「極其嚴重」 - 其他單一組成物及複合組成物。
此等結果與水腫測試結果相一致，且據證實，與GCA或TCA單一組成物相比，皮下注射PPC + GCA或PPC + TCA複合組成物緩解病變症狀。
作為活體內H&E炎症測試之結果（圖6A至6F），據證實： 「無」 - PPC（2.5-7.5%）、TUDCA（1.0-5.0%）之單一組成物，及PPC（2.5-7.5%）+GCA（1.25-3.75%）、PPC（5.0%）+GCA（2.5-7.5%）、PPC（5.0%）+TCA（2.5%）及PPC（5.0%）+TUDCA（4.0%）之複合組成物， 「輕度」 - PPC（10.0%、12.5%）、GCA（1.0%）、TCA（1.0%）及TUDCA（7.5%）之單一組成物，及PPC（10.0%）+GCA（5.0%）、PPC（5.0%）+GCA（10.0%）之複合組成物， 「中度」 - PPC（15.0%）、TDCA（1.0%）、GDCA（1.0%）、CDCA（1.0%）、CA（1.0%）及GCA（2.5%及更高）及TCA（2.5%及更高）之單一組成物，及PPC（15.0%）+GCA（7.5%）及PPC（5.0%）+CA（2.5%）之複合組成物， 「重度」及「極其嚴重」 - 其他單一組成物及複合組成物。
此等結果與水腫及病變測試結果相一致，證明當與PPC複合時GCA或TCA單一注射劑之毒性未受毒害或未得到緩解，但DCA或其等效膽汁酸導致由中斷細胞凋亡及降解之PPC固有活性的壞死所引起之疼痛、水腫及副作用。
作為對基於膽汁酸之以上調配物測試、及活體內水腫、炎症及皮膚病變測試結果而選擇的用增溶劑TUDCA、TCA及GCA增溶之PPC組成物進行的試管內脂肪細胞活力測試之結果，PPC單一組成物組、用GCA或TCA增溶之PPC組展示以時間及濃度依賴性方式降低之脂肪細胞活力（圖7A至7D）。有一個不尋常的發現：TUDCA抑制脂肪細胞之細胞凋亡及降解。就此而言，已公開關於TUDCA之細胞的細胞凋亡抑制之研究結果（Andrew L.Rivard, Administration of Tauroursodeoxycholic acid reduced apoptosis following myocardial infarction in rat, The American Journal of Chinese Medicine, 第35卷, 第2期, 279-295, 2007），表明PPC以不同方式對細胞壞死及細胞凋亡起作用。
單一PPC 5.0%、PPC 5.0% + GCA 2.5%及PPC 15.0% + TCA 7.5%在96小時時展示與DCA 1.0%類似的脂肪細胞減少活性。亦即，單一PPC 5.0%及PPC 5.0% + GCA 2.5%之組展示與FDA批准用於外貌改善之細胞溶解劑Kybella（DCA 1.0%）相同的脂肪細胞活力，且在此等實驗組中脂肪細胞減少效果方面無統計顯著差異（圖7E）。綜合而言，重要的為自毒性低（諸如對PPC固有之脂肪細胞選擇性細胞凋亡及降解與壞死無中斷活性（或此毒性可由PPC抵消））且可提供組成物安全性及調配穩定性的膽汁酸選擇增溶劑，其經選擇以將PPC製備為局部減脂可注射組成物。亦即，令人驚訝地發現，應選擇對PPC固有之減脂效果不具有負面轉變（PPC + DCA）或抑制（PPC + TUDCA）活性（諸如壞死）的增溶劑。
作為對混合用於PPC增溶之莫耳比之GCA單一組成物進行的試管內脂肪細胞活力測試之結果，GCA展示以時間及濃度依賴性方式降低之脂肪細胞活力。且PPC單一組成物與用GCA增溶之PPC組成物之間在脂肪細胞活力方面無統計顯著差異（圖7F至7H）。亦即，PPC單一組成物及用GCA增溶之PPC組成物的脂肪細胞之細胞凋亡效果為等效的。為檢查本發明之組成物中GCA對脂肪細胞減少之效果，觀測PPC的隨GCA輸入增加之脂肪細胞減少效果。作為在用GCA（2.5-8.75%）增溶之PPC（5.0%）複合組成物及PPC（5.0%）單一組成物之後96小時脂肪細胞活力測試的結果，用GCA（2.5-7.5%）增溶之PPC（5.0%）複合組成物之效果與PPC（5.0%）單一組成物相比統計學上不顯著。亦即，該等組之脂肪細胞之細胞凋亡效果為等效的。然而，用GCA（8.75%）增溶之PPC（5.0%）處理組在脂肪細胞之細胞凋亡效果方面展示統計顯著差異（圖7I）。此等結果表明，當GCA/PPC之莫耳比率為3.04 mol/mol（PPC 5.0% + GCA 8.75%）或更大時，PPC之固有正面效能可能會受不利影響。
根據先前報導，DCA組成物或用DCA增溶之PPC組成物已據報導會因不僅溶解脂肪細胞而且溶解纖維母細胞、骨胳肌肉細胞及血管內皮細胞而引起臨床上致命的副作用。作為對PPC單一組成物及用GCA增溶之PPC複合組成物之細胞活力的觀測之結果，令人驚訝地發現，PPC + GCA選擇性地減少脂肪細胞，不同於PPC + DCA（圖8A至8D）。本發明之組成物為無致命副作用地安全減脂之選擇性脂肪細胞減少組成物，該等副作用諸如皮膚壞死、下頜神經麻痹、吞咽困難，彼等副作用會由市售細胞溶解劑Lipostabil® N,iv（PPC + DCA）及Kybella i.v.（DCA）引起。
為評估脂肪細胞減少因壞死抑或細胞凋亡及降解所致，經由凋亡蛋白酶3活性觀測對脂肪細胞之細胞凋亡之效果且經由甘油釋放觀測對脂肪細胞脂肪溶解之效果。
PPC單一組成物及PPC + GCA複合組成物展示相當大水準地誘導凋亡蛋白酶-3活性之時間依賴性效果。然而，PPC + DCA複合組成物與PPC或PPC + GCA相比抑制凋亡蛋白酶-3活性。有趣的為，DCA 1.0%展示一定的凋亡蛋白酶-3活性直至24小時，但在48小時之後，凋亡蛋白酶-3活性返回至處理前水準。此現象被視為因為以下事實：抵抗細胞之細胞凋亡之作用直至緊接在用DCA單一組成物處理之後24小時才部分觀測到，且隨後該作用藉由炎性反應變為細胞壞死路徑（圖10A及10B）。
在處理之後24小時，除DCA 1.0%及PPC 5.0% + GCA 5.0%以外之測試材料類似地誘導甘油分泌。在處理之後48小時，單一PPC、PPC + DCA、單一DCA及單一GCA組展示比24小時時略高的細胞溶解活性。詳言之，PPC + GCA組展示比PPC單一組成物高得多的細胞之細胞凋亡效果（圖10C及10D）。
因此，PPC單一組成物及PPC + GCA複合組成物因與PPC + DCA之壞死機制不同的細胞凋亡及脂肪溶解機制而造成減少脂肪細胞之特定效果。在該機制下，發現當向皮下脂肪層投予本發明之組成物時，無痛、無水腫且無副作用地減少脂肪。
基於試管內脂肪細胞減少之效果，對PPC單一組成物（2.5%、5.0%、10.0%及15.0%）、PBS（陰性對照）及Isuprel（陽性對照）、DCA 1.0%、GCA 2.5%、PPC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+HDCA 2.5%、PPC 5.0%+UDCA 3.0%、PPC 5.0%+TDCA 2.5%、PPC 5.0%+GDCA 2.5%、PPC 5.0%+CDCA 2.5%、PPC 5.0%+CA 2.5%、PPC 5.0%+TUDCA 4.0%、PPC 5.0%+TCA 2.5%及PPC（2.5-10.0%）+GCA（1.25-5.0%）進行活體內H&E組織病理學測試。因此，注射單一DCA或PPC + DCA複合組成物之脂肪組織在投藥區域中展示重度炎症，且細胞因壞死而溶解，且誘導顯著損傷。DCA單一組成物即使DCA以1%之低濃度被包含亦展示重度炎症水準，且炎性誘導作用大於GCA單一組成物之炎性誘導作用。PPC + GCA之複合組成物顯示，脂肪細胞變得更小，明顯觀測到細胞凋亡細胞，且脂肪細胞變為藉由崩塌的脂肪細胞之融合形成之脂肪細胞，在所有處理濃度下炎症誘導程度均較低，且發現形態特徵僅損傷脂肪細胞膜（圖11A至11D）。
調配物測試之結果；活體內水腫、炎症及皮膚病變測試結果；試管內脂肪細胞、肌肉細胞、纖維母細胞、內皮細胞活力測試結果；及活體內脂肪墊H&E組織病理學測試結果綜合而言，與由銷售產品DCA增溶之PPC複合組成物及GCA單一組成物相比，本發明之由GCA增溶之PPC複合組成物具有顯著更低局部毒性。為根據優良實驗室操作（good laboratory practice，GLP）驗證此等結果，藉由計算臨床劑量對米格魯犬（beagle dog）進行單劑量毒性研究。因此，據證實，本發明之複合組成物為無毒性的（圖12A至12C）。
為評估活體內疼痛之程度，在投予各實驗組成物之後量測小鼠的移動之距離及速度。除PPC單一製劑及GCA + PPC製劑以外，移動之距離及速度在所有實驗組中與投藥之前相比均顯著減小。且結果顯示，在用PPC 5.0%單一組成物、PPC 5.0% + TUDCA 4.0%、PPC 5.0% + GCA 2.5%或PPC 5.0% + TCA 2.5%處理之組中移動之距離及速度不變或略微增加。另一方面，在用PPC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+HDCA 2.5%、PPC 5.0%+UDCA 3.0%、PPC 5.0%+TDCA 2.5%、PPC 5.0%+GDCA 2.5%、PPC 5.0%+CDCA 2.5%或PPC 5.0%+CA 2.5%處理之小鼠組中移動之距離及速度減小20%，且據判斷活性因疼痛而降低（圖13A及13B）。
基於調配物測試之結果；活體內水腫、炎症及皮膚病變測試結果；試管內脂肪細胞、肌肉細胞、纖維母細胞、內皮細胞活力測試結果；活體內脂肪墊H&E組織病理學測試結果；單劑量毒性測試結果；及疼痛測試結果，在向人類個體投藥用於臨床驗證之前及之後評估安全性及功效。研究者之臨床研究之結果顯示，在於頦下脂肪注射，0.2 cc，1 cm間隔，6至8 mm深度，總共50個點，10 ml劑量，以4週時間間隔6次之後12週，視覺上證實頦下脂肪減少（圖14A）。個體報導之滿意水準為5名中之4名，且在與給藥前像片比較之後的改善報導為1.5級（圖14A）。另外，頦下脂肪在CT上減少30.36%，自投藥之前的5.6 mm變為最終投藥之後12週的3.9 mm（圖14B）。
在投予本發明之GCA增溶之PPC可注射組成物之後，對已接受用DCA增溶之PPC注射組成物（先前商業化之產品）的六名男性及女性患者進行疼痛、水腫及副作用之臨床評估。在用9.6%利多卡因（lidocaine）乳膏局部麻醉30分鐘或更久之後，向個體用配備有13 mm針之注射器在腹部及肋部（1.5 cm間隔，10至12 mm深度，每個點0.5 cc，每次投藥50 ml至100 ml）或在頦下脂肪中（1.0 cm間隔，6至8 mm深度，每個點0.2 cc，每次投藥10 ml）注射包含以1:1比率混合之生理鹽水及Lipobean®（用DCNa 2.4%增溶之PPC 5.0%之注射劑）之組成物（PPC 2.5% + DCNa 1.2%）的注射劑，且以相同投藥方法向個體投予本發明之組成物（用2.8% GCA增溶之5.0% PPC注射劑或用4.0% GCA增溶之5.0% PPC注射劑）。作為測試之結果，已接受用DCNa增溶之PPC組成物之注射劑的個體尤其在投藥時及在投藥之後10天主訴疼痛及水腫，且亦報導皮膚病變，諸如紅斑、血腫、瘀傷及局部損傷，諸如硬結、結節、搔癢及灼燒感。然而，令人驚訝地，接受本發明之用GCA增溶之PPC注射劑的個體緩解至輕度水準，詳言之至疼痛（圖15A）及水腫（圖15B）實質上不存在之點。亦即，與接受用DCA增溶之PPC注射劑之組相比，安全性提高80%或更大，且在個體之中未報導重度不良反應（圖15A至15C）。特定言之，未觀測到諸如腫脹、血腫、瘀傷、紅斑、感覺異常、硬結、結節及搔癢之副作用，或以顯著低水準觀測到該等副作用。
另外，當用GCA增溶之PPC在0.5 cc，1.5 cm間隔，12 mm深度，總共200個點，100 ml劑量下向腹部及肋部投予時，視覺上未觀測到皮膚病變（圖16）。如圖16中所示，除由注射針本身所引起之瘀傷或由注射時的血管損傷所引起之血管損傷以外，紅斑減少至無或輕度。且未觀測到感覺異常、廣泛腫脹、硬結、感覺異常、結節、搔癢、灼燒感、吞咽困難及其類似者（圖15C）。
總之，本發明之組成物為創新發明，其以細胞凋亡及降解之機制選擇性地減少脂肪細胞；減輕患者之焦慮及不適；改良患者之藥品順應性；且具有調配穩定性。且本發明之組成物不導致由投予DCA或用DCA增溶之PPC之習知可注射組成物後的炎症所引起之疼痛及水腫；且不導致由非選擇性細胞溶解活性所引起之廣泛腫脹、紅斑、不適如瘀傷及感覺缺失、硬結、感覺異常、結節、搔癢、灼燒感、神經損傷及吞咽困難。
因此，提供一種具有減輕的疼痛及副作用的用於減少局部脂肪之組成物，該組成物包含： （i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者， 其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
另外，提供一種以減輕的疼痛及副作用減少局部脂肪之組成物，該組成物基本上由以下組成： （i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者， 其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
特定言之，提供一種具有減輕的疼痛及副作用的用於減少局部脂肪之組成物，該組成物包含： （i）磷脂醯膽鹼； （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者；及 （iii）水（或注射用水）， 其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
另外，提供一種以減輕的疼痛及副作用減少局部脂肪之組成物，該組成物基本上由以下組成： （i）磷脂醯膽鹼； （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者；及 （iii）水（或注射用水）， 其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
本發明之減脂可注射組成物可施用至局部區域，且較佳施用至脂肪，沈積至腹部、頦下、前臂、大腿、腰部、髖部、眼下、胸罩線及其類似處之脂瘤，但不限於此，且可施用於頸部皺紋改善。
本發明之組成物較佳用於非外科移除個體中之局部脂肪沈積。術語「非外科（non-surgical）」係指不需要切開之醫療程序。
本發明之組成物之配方不受特別限制，只要其用於減少脂肪（詳言之，減少局部脂肪）之目的，且包括例如注射劑，諸如貼片、積存等，且其較佳可為可注射組成物。亦即，本發明係關於一種可非外科地直接注射至需要脂肪移除之患者之處理部位中的組成物或製劑。
本發明之減少局部脂肪之可注射組成物為一種用於治療脂肪組織增生或過度增殖性病症（疾病）之醫藥組成物，且該病症不受特別限制，只要其在此項技術中已知為脂肪組織之病理性過度增殖或過度積聚，例如肥胖（腹部肥胖）、下眼瞼脫逸（lower eyelid escape）、脂瘤、德爾肯氏病（Dercum's disease）、馬德隆氏頸（Madelung's neck）、脂肪水腫、壓源性結節（piezogenic nodule）、黃皮症（Xanthosis）、脂肪營養不良、與脂肪團相關之脂肪積聚及其類似者，但不限於此。
投予本發明之可注射組成物之方法不受限制，但可藉由鑒於疾病之嚴重程度、患者之年齡、性別及其他狀況而適用於患者的方法投予。該種投藥途徑在該方法中不受特別限制，但較佳直接投予至皮下脂肪層（組織），例如在晶格間隔中以0.5至2.0 cm間隔多次皮下或真皮內注射。
在本發明中，術語副作用（side effect）係指已為已知或市售的包含特定膽汁鹽之PPC製劑之副作用，該等PPC製劑尤其為已知為減少局部脂肪之注射劑的習知DCA增溶之PPC注射劑（例如Lipostabil、Essential、Lipobean）或DCA單一製劑（例如Kybella）。且其係指除預期為藥物之治療效果（在本發明中為減脂效果）之主要作用外的對人體之有害作用。特定言之，副作用除由注射針本身所引起之血腫及瘀傷以外，為選自由以下組成之群的至少一者：水腫、感覺缺失（尤其投藥部位感覺缺失）、廣泛腫脹、紅斑、血腫、瘀傷、硬結、感官異常、結節、搔癢、灼燒感、吞咽困難及除脂肪細胞外之細胞（肌肉細胞、纖維母細胞、血管內皮細胞等）壞死及其類似者，但不限於此。本發明之減少局部脂肪之可注射組成物特性在於，局部不良反應緩解至副作用實質上不存在之程度。
如本文所用，術語「緩解疼痛及副作用（alleviation of pain and side effects）」包含疼痛及副作用的減輕、消除、以低水準存在（部分移除）、實質上不存在（實質上移除）及完全不存在（完全移除）之含義。
在本發明中，疼痛及水腫包括在注射劑投予時的疼痛及在投予之後的疼痛及水腫。本發明之特性在於與涉及疼痛及水腫的習知市售DCA單一組成物或用DCA增溶之PPC注射劑相對，顯著減輕之疼痛及水腫（實質上無疼痛及水腫）。此等無痛且無水腫之PPC注射劑首次揭示於本發明中，且詳言之，其特性在於不存在因炎症所致的持續多於10天之繼發性疼痛及水腫以及在注射時及緊接在投藥之後的原發性疼痛。在本發明中，疼痛之含義區別於由針侵入所引起之症狀（例如噁心、針所致瘀傷、針所致血腫、針所致腫脹），且其意謂已由DCA單一注射劑或DCA + PPC可注射組成物本身之特徵所引起之疼痛或水腫（炎症）。在本發明之一個具體實例中，與用作對照組之市售的「用DCA增溶之PPC注射劑」相比，本發明之PPC + GCA複合製劑在注射時獨特地幾乎不顯示任何疼痛（圖15A）。考慮到本發明之複合製劑的粒子特性（微胞、粒度等）類似於現有市售製劑（用DCNa增溶之PPC注射劑之代表性實例）且所有注射劑均在類似於人體之pH下投予，本發明之組成物之效果難以自先前已知的技術預測。
另外，本發明之組成物之特性在於特異性導致脂肪細胞之細胞凋亡及脂肪溶解。在本發明之一個具體實例中，本發明之PPC + GCA複合製劑不會實質上影響除脂肪細胞外之其他細胞（諸如纖維母細胞、骨胳肌肉細胞及血管內皮細胞），且據證實，細胞凋亡及脂肪溶解之誘導僅在脂肪細胞中特異性有效（參見圖8A至8D）。此效果與用其他膽汁酸增溶之PPC製劑（代表性地為市售PPC+DCA製劑）相當，該等製劑造成除脂肪細胞外之細胞壞死。在本發明中首次揭示，當GCA與PPC以某些比率混合時，其具有脂肪細胞特異性（選擇性）效果。
可注射製劑藉由以下方式製備：將主要藥物（在本發明中為用GCA增溶之PPC）及必要時其他添加劑溶解於注射用水中，用細菌過濾器過濾溶液，對溶液滅菌，將溶液填充於小瓶、安瓿或自由場注射器（free field syringe）中，隨後密封。因此，在製備注射劑時，注射用水以及水可用於填充剩餘量。注射用水不受特別限制，只要其為意圖用於稀釋固體注射劑或水可溶可注射溶液之注射用蒸餾水或注射用緩衝溶液即可。舉例而言，可使用磷酸鹽緩衝溶液或磷酸二氫鈉（NaH2
PO4
）（在pH 3.5至7.5的範圍內）-檸檬酸緩衝溶液或其類似物。本文所用之磷酸鹽可呈鈉鹽或鉀鹽形式，或可呈酸酐或水合物形式，且可呈檸檬酸或酸酐或水合物形式。注射用水之實例包括葡萄糖注射液、木糖醇注射液、D-甘露糖醇注射液、果糖注射液、生理鹽水、聚葡萄糖40注射液、聚葡萄糖70注射液、胺基酸注射液、林格氏溶液（Ringer's solution）及乳酸-林格氏溶液，但不限於此。
在本發明中，磷脂醯膽鹼（PPC）為廣泛見於動物、植物、酵母及真菌中之磷脂。其亦稱為卵磷脂、多烯磷脂醯膽鹼及3-sn-磷脂醯膽鹼且具有式1之基本結構。其為哺乳動物的主要於腦、神經、血球、蛋黃及其類似物中之膜性磷脂。在植物中，其包含於大豆、向日葵籽、小麥胚芽中，且很少見於細菌中。一般而言，飽和脂肪酸鍵結至甘油之1位，不飽和脂肪酸鍵結至2位，且大多數醯基為C12至C22（12至22個碳原子）。 ＜式1＞
本發明之磷脂醯膽鹼具有如式1中所示之結構，R1為具有12至22個碳原子之飽和或不飽和脂肪酸，且R2為具有12至22個碳原子之飽和或不飽和脂肪酸。飽和或不飽和脂肪酸可呈直鏈或分支鏈形式，且不飽和脂肪酸可包含單不飽和或多（例如二、三或四）不飽和。本發明之磷脂醯膽鹼可為單一化合物或可為具有不同碳數目之R1及R2醯基的各種化合物之混合物。較佳地，本發明之磷脂醯膽鹼可具有700 g/mol至1000 g/mol之分子量，且更佳750 g/mol至800 g/mol之分子量。
本發明之磷脂醯膽鹼可自選自由以下組成之群的任一者提取：各種動物或植物，例如大豆、向日葵籽、小麥胚芽及蛋黃。替代性地，可購買及使用市售的本發明之磷脂醯膽鹼，或可使用藉由此項技術中已知的化學合成方法製備之產物。
本發明之磷脂醯膽鹼較佳可自大豆或蛋黃分離。一般而言，自大豆分離之磷脂醯膽鹼之典型結構為如以下式2。且，一般而言，衍生自蛋黃之磷脂醯膽鹼之典型結構如下文式3所示。本發明中所用之磷脂醯膽鹼可為僅由以下式2或3之化合物構成之單一化合物，或進一步包括基於式1的具有不同碳數目之R1及R2醯基之數種化合物的混合物。混合物可含有實質上50重量%或更大、更佳70重量%或更大、且最佳90重量%或更大的以下式2或3之化合物。 ＜式2＞＜式3＞
最佳地，本發明之磷脂醯膽鹼可自大豆提取且可為以93.0重量%或更大之比率含有具有如式2中所示之結構的化合物之混合物。
在本發明之減少局部脂肪之可注射組成物中，磷脂醯膽鹼以總組成物計以0.625至15.0%（w/v）之濃度、較佳以1.25至12.5%（w/v）之濃度、且更佳以2.5至10.0%（w/v）之濃度包含於總組成物中。最佳地，磷脂醯膽鹼可以總組成物計以2.5至7.5%（w/v）之濃度被包含。當磷脂醯膽鹼之濃度小於0.625%（w/v）時，不存在脂肪溶解效果（參見圖7A至7D）。當磷脂醯膽鹼之濃度大於15%（w/v）時，由於其黏度高而不便向皮下脂肪層投予多劑量，且因為需要過度使用增溶劑，所以顯現出炎性反應之中度異常，且可能會出現嚴重副作用，諸如疼痛、腫脹及炎症。
本發明之減少局部脂肪之組成物特性在於選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者（在下文中縮寫為（ii））與磷脂醯膽鹼（PPC，在下文中縮寫為（i））之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。換言之，（ii）比（i）之莫耳比可在0.7至3.0的範圍內，（ii）比（i）之莫耳比更佳可在0.7至2.60的範圍內，且（ii）比（i）之莫耳比最佳可在0.7至1.73的範圍內。當彼等以小於0.7之莫耳比（mol/mol）被包含時，難以形成穩定微胞，導致調配穩定性較差。因此，莫耳比之下限值較佳為0.70或更大，且更佳為0.76。當莫耳比之上限值為3.04或更大時，疼痛、水腫及副作用分別顯著展現為輕度或更重炎症、中度或更重水腫及重度或更重皮膚病變，且因細胞壞死而限制PPC之固有功能而非提供對脂肪細胞之細胞凋亡及脂肪溶解之正面效果。在3.0或更小之莫耳比下，此等副作用及疼痛顯著減輕。詳言之，當其以2.60或更小之莫耳比包括在內時，未觀測到水腫、病變及炎症或觀測到輕度症狀。臨床上，輕微水腫可見，但此為實質上無痛且無副作用之水準，且因此用作本發明中之更佳範圍。最佳地，當莫耳比為1.73或更小時，水腫及病變以及由炎症所引起之臨床疼痛及水腫不會出現。
在本發明中，（ii）比（i）之莫耳比之範圍包括最小或最大界限值選自由以下值組成之群的範圍：0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、1.09、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.10、1.09、1.08、1.09、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.20、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.30、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.50、1.54、1.50、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99、2.00、2.01、2.02、2.03、2.04、2.05、2.06、2.07、2.08、2.09、2.10、2.11、2.12、2.13、2.14、2.15、2.16、2.17、2.18、2.19、2.20、2.21、2.22、2.23、2.2 2.42、2.43、2.44、2.45、2.46、2.47、2.48、2.32、2.33、2.34、2.62、2.63、2.64、2.65、2.66、2.67、2.68、2.69、2.70、2.71、2.72、2.73、2.50、2.52、2.53、2.54、2.55、2.56、2.57、2.58、2.59、2.74、2.75、2.76、2.77、2.78、2.79、2.80、2.81、2.82、2.83、2.84、2.85、2.86、2.87、2.88、2.89、2.90、2.91、2.92、2.93、2.94、2.95、2.96、2.99及3.00。作為本發明之一最佳實例，0.76及1.39之界限值可選自上文所描述的本發明之莫耳比之範圍之中。因此，熟習此項技術者顯而易知，0.76至1.39之莫耳比範圍（亦即在0.76或更大至1.39或更小之範圍內的所有值）可應用於本發明。
特定言之，本發明之減少局部脂肪之組成物之特性在於在組成物中以特定混合比含有『甘膽酸或其鹽』。甘膽酸為具有約465.63 g/mol之分子量的膽汁鹽且在本文可稱為GCA或GC。甘膽酸可以醫藥學上可接受之鹽形式使用。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意謂生理學上可接受且當向人類投予時通常不會引起過敏反應或類似反應，且包括（但不限於）鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。較佳地，本發明之甘膽酸鹽可為甘膽酸鈉（GCNa）。
甘膽酸或其鹽可根據此項技術中已知的方法自動物腸道提取，且可商業上購買或藉由此項技術中已知的化學合成方法使用。
更特定言之，用於製備能夠微濾之澄清溶液及直徑為10 nm或更小之混合微胞（其可安全且穩定地皮下注射）的GCA與PPC之最小莫耳比（GCA/PPC）為0.76（PPC 5.0% + GCA 2.2%）。在小於最小莫耳比之莫耳比下，製劑之穩定性由於沈澱現象而較低。因此，較佳以使得GCA與PPC之莫耳比（GCA/PPC）在0.76至3.0的範圍內（以PPC 5%計，GCA 2.2至8.65%（w/v））的方式包含甘膽酸或其鹽，且特定範圍係指上文所提及之莫耳比。當甘膽酸以其鹽形式使用時，莫耳比較佳可僅基於甘膽酸鹽中之甘膽酸部分計算。
本發明之減少局部脂肪之組成物之特性在於在組成物中以特定混合比含有『牛膽酸或其鹽』。牛膽酸為具有約515.71 g/mol之分子量的膽汁鹽且在本文可稱為TCA。牛膽酸可以醫藥學上可接受之鹽形式使用。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意謂生理學上可接受且當向人類投予時通常不會引起過敏反應或類似反應，且包括（但不限於）鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。較佳地，本發明之甘膽酸鹽可為甘膽酸鈉（TCNa）。
牛膽酸或其鹽可根據此項技術中已知的方法自動物腸道提取，且可商業上購買或藉由此項技術中已知的化學合成方法使用。
更特定言之，用於製備能夠微濾之澄清溶液及直徑為10 nm或更小之混合微胞（其可安全且穩定地皮下注射）的TCA與PPC之最小莫耳比（TCA/PPC）為0.78（PPC 5.0% + TCA 2.5%）。在小於最小莫耳比之莫耳比下，製劑之穩定性由於沈澱現象而較低。因此，較佳以使得TCA與PPC之莫耳比（TCA/PPC）在0.78至3.0的範圍內（以PPC 5%計，TCA 2.5至9.57%（w/v））的方式包含甘膽酸或其鹽，且特定範圍係指上文所提及之莫耳比。當牛膽酸以其鹽形式使用時，莫耳比較佳可僅基於牛膽酸鹽中之牛膽酸部分計算。
此時，選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一種（物質）較佳之以與磷脂醯膽鹼相同或更小之重量（或重量/體積百分比（亦即%w/v））被包含。舉例而言，基於PPC之重量比可在1:0.1至1的範圍內。特定言之，基於PPC之重量比可為1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9或1。當該種重量標準基於莫耳比（GCA/PPC莫耳比或TCA/PPC莫耳比）應用時，莫耳比較佳可在0.7至1.73、更佳0.76至1.73的範圍內。
較佳地，選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一種（物質）是以小於磷脂醯膽鹼之重量（或重量/體積百分比（亦即%w/v））被包含。舉例而言，基於PPC之重量比可在1:0.1至0.999的範圍內。特定言之，基於PPC之重量比可為1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8或1:0.9。當該種重量標準基於莫耳比（GCA/PPC莫耳比或TCA/PPC莫耳比）應用時，莫耳比較佳可在0.7或更大至小於1.73、更佳0.76或更大至小於1.73的範圍內。
當甘膽酸或牛膽酸以其鹽形式使用時，重量比較佳可僅基於甘膽酸鹽中之甘膽酸部分之比率或牛膽酸中之牛膽酸部分之比率計算。
選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者可如下使用： （A）單獨的個別物質（甘膽酸、甘膽酸鹽之一、牛膽酸、牛膽酸鹽之一）可與PPC複合，或 （B）GCA或其鹽、及TCA或其鹽之混合物（在下文中為GCA-TCA混合物）可與PPC複合。
如上文所描述，以特定混合比包含GCA、TCA或其鹽與磷脂醯膽鹼（PPC）的本發明之組成物之特性在於為非脂質體微胞製劑。亦即，本發明之組成物之特性在於組成物中存在微胞形式之磷脂醯膽鹼，其不同於使用脂質體系統之習知PPC調配物。
GCA、TCA或其鹽以如上文所描述之特定劑量（或混合比、莫耳比）包含於本發明之減脂可注射組成物中，以使得其不僅調配穩定性極佳，而且不同於包含於PPC可注射組成物中之習知增溶劑（尤其去氧膽酸及其鹽類型），該等習知增溶劑導致副作用，諸如細胞壞死伴有身體疼痛及水腫、血腫、感覺缺失、紅斑、腫脹、硬結、搔癢、結節及其類似者，GCA、TCA或其鹽與PPC一起誘導高效脂肪溶解及脂肪細胞之細胞凋亡作用以使得疼痛及副作用得到實質上消除，且展示極佳減脂效果（疼痛及水腫減輕80%或更大，紅斑、血腫、硬結、搔癢及結節減輕大於80%）。因此，本發明之一特徵亦為，用於單獨疼痛管理之消炎劑及/或鎮痛組分不必包括或組合於組成物中。
同時，本發明之組成物可進一步包含選自由以下組成之群的至少一者：防腐劑；等張劑；及pH調節劑。
特定言之，以總組成物計，本發明之減少局部脂肪之組成物較佳可進一步包含選自由以下組成之至少一者：0.1至5%（w/v）之防腐劑、0.1至10%（w/v）之等張劑及0.01至2%（w/v）之pH調節劑。
防腐劑可選自由以下組成之群：苯甲醇、利多卡因、普魯卡因（procaine）及氯丁醇，但不限於此。更佳為苯甲醇。苯甲醇為芳族醇之一且為無色透明液體。本發明之可注射組成物中所含苯甲醇之濃度較佳可為0.1%（w/v）至2%（w/v）。
等張劑用以在含有磷脂醯膽鹼的本發明之組成物投予至身體中時以適當方式維持（控制）滲透壓力，且亦具有進一步穩定化溶液中之磷脂醯膽鹼之輔助效果。等張劑可為醫藥學上可接受之糖、鹽或其任何組合或混合物。其實例包括葡萄糖作為糖，及氯化鈉、氯化鈣、硫酸鈉、甘油、丙二醇、分子量為1000或更小之聚乙二醇及其類似物作為水可溶無機鹽。且更佳地，其可為氯化鈉。其可單獨使用或以兩者或更多者之組合形式使用。等張劑之濃度較佳為0.1%（w/v）至5%（w/v），且可經調節至適量，以使得含有各別混合物中之每一者的溶液調配物變為等張溶液，視本發明之組成物中所含的組分之類型、量及其類似因素而定。
本發明之pH調節劑起控制可注射製劑之pH之作用且包括酸性及鹼性物質兩者。酸性物質包括（但不限於）氫氯酸、乙酸、己二酸、抗壞血酸、抗壞血酸鈉、乙醇鈉、蘋果酸、丁二酸、酒石酸、反丁烯二酸及檸檬酸。鹼性物質包括（但不限於）無機鹼（例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鎂、碳酸鈣、氧化鎂、氨、合成水滑石）、有機鹼（例如鹼性胺基酸，諸如離胺酸、精胺酸等，葡甲胺等）及其類似物。在本發明中，pH調節劑可於單獨的組成物中分別包括酸性物質及鹼性物質，或兩種或更多種物質可組合使用。更佳地，本發明之pH調節劑可為氫氧化鈉及/或氫氯酸。待添加之pH調節劑之量可視本發明之組成物之成分的種類及量而變化，且較佳為0.01%（w/v）至1.32%（w/v）、更佳0.01%（w/v）至1%（w/v）。本發明之組成物較佳可於pH 7.0至pH 7.8之範圍中提供，且pH調節劑之種類及量可根據溶液之特定組成由一般熟習此項技術者改變。
作為最佳形式，本發明提供一種以減輕的疼痛及副作用減少局部脂肪之組成物，該組成物由以下組成： （i）磷脂醯膽鹼； （ii）選自由甘膽酸（GCA）或牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者； （iii）防腐劑； （iv）等張劑； （v）pH調節劑；及 （vi）剩餘水， 其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。可參考以上描述理解組成物之個別組分特性、含量、組合及其類似者。
本發明亦提供一種以減輕的疼痛及副作用移除個體中之局部脂肪沈積之製劑，該製劑包含： （i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者， 其中該製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
本發明亦提供一種以減輕的疼痛及副作用移除個體中之局部脂肪沈積之製劑，該製劑由以下組成： （i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者， 其中該製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
本發明亦提供一種以減輕的疼痛及副作用移除個體中之局部脂肪沈積之製劑，該製劑基本上由以下組成： （i）磷脂醯膽鹼； （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者；及 （iii）水（或注射用水）， 其中該製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
作為最佳形式，本發明提供一種以減輕的疼痛及副作用移除局部脂肪之製劑，該製劑由以下組成： （i）磷脂醯膽鹼； （ii）選自由甘膽酸（GCA）或牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者； （iii）防腐劑； （iv）等張劑； （v）pH調節劑；及 （vi）剩餘水， 其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。構成製劑之特定物質之組成、含量及特性與減少局部脂肪之組成物之彼等相同。
本發明之減少局部脂肪之組成物及本發明之製劑特性可為由pH 6.8至pH 7.8構成。
本發明之組成物或製劑之單位劑量（unit dose/unit dosage）可為例如以下之總量：500 ml、400 ml、300 ml、200 ml、100 ml、90 ml、80 ml、70 ml、60 ml、50 ml、40 ml、30 ml、20 ml、10 ml、9 ml、8 ml、7 ml、6、ml、5 ml、4 ml、3 ml、2 ml、1 ml、0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.6 ml、0.5 ml、0.4 ml、0.3 ml、0.2 ml、0.1 ml、0.09 ml、0.08 ml、0.07 ml、0.06 ml、0.05 ml、0.04 ml、0.03 ml、0.02 ml、0.01 ml、0.009 ml、0.008 ml、0.007 ml、0.006 ml、0.005 ml、0.004 ml、0.003 ml、0.002 ml、0.001 ml、0.0009 ml、0.0008 ml、0.0007 ml、0.0006 ml、0.0005 ml、0.0004 ml、0.0003 ml、0.0002 ml或0.0001 ml，至哺乳動物之受影響區域，但不限於此。單位劑量將部分視目標區域、脂肪之量及所需結果而定。
特定言之，本發明之組成物或製劑之單位劑量可以0.1 ml至500 ml、較佳1 ml至200 ml、更佳1 ml至100 ml總量之範圍投予至受影響區域。
本發明之組成物或製劑可藉由在受影響區域中藉由單次投藥以一定時間間隔向多個目標部位（點）投予而投予，且總量可指經由此等多個目標部位在單次投藥時投予的劑量之總量。對於一個受影響區域，目標部位可設定在1至50、較佳2至30、更佳3至15等之範圍內。另外，本發明之組成物或製劑包含在一個受影響區域上以單次投藥向一個目標部位投予，且在此情況下，熟習此項技術者充分理解，總量基於一個目標部位之量計算。
此外，本發明之組成物或製劑可以（但不限於）每個目標部位0.01-20 ml、較佳0.1-10 ml、更佳0.02-5 ml、最佳0.1-1 ml之劑量範圍投予。
本發明之組成物或製劑可向目標部位投予一次或多次。在某些具體實例中，本發明之組成物向目標部位投予至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。一或多次投藥可在一小時、一天、一週、一個月或一年中進行。較佳地，向單一目標部位之多次投藥係以每年10、9、8、7、6、5、4、3或2或更少次，每個月10、9、8、7、6、5、4 、3或2或更少次，每週10、9、8、7、6、5、4、3或2或更少次，每天10、9、8、7、6、5、4、3或2或更少次，每小時10、9、8、7、6、5、4、3或2或更少次投予。在某些具體實例中，在目標部位向個體提供1-100、2-50、3-30、4-20或5-10次投藥。該等投藥可經1年、6個月、5個月、4個月、3個月、2個月、1個月、3週、2週或1週或更少之時段進行。
本發明之組成物或製劑可在皮膚下方各種水準（深度）處投予，包括（但不限於）例如皮膚下方0.1-4吋、0.5-3吋、1-2吋。
本發明亦提供一種套組，其包含： （I）第一容器，其包含具有減輕的疼痛及副作用的用於移除局部脂肪沈積之組成物或製劑，該組成物或製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該組成物或製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內；以及 （II）能夠將該組成物或製劑遞送至脂肪沈積部位之遞送裝置。
作為更佳具體實例，本發明提供一種套組，其包含： （I）第一容器，其包含具有減輕的疼痛及副作用的用於移除局部脂肪沈積之組成物或製劑，該組成物或製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者是以與該磷脂醯膽鹼相同或更小之重量被包含；以及 （II）能夠將該組成物或製劑遞送至脂肪沈積部位之遞送裝置。
在本發明之套組中，（I）包含於第一容器中之組成物或製劑參考上文所描述的本發明之減少局部脂肪之組成物及製劑的描述來理解。第一容器具有足以容納本發明之組成物或製劑之單位劑量（劑量體積）的容積。舉例而言，第一容器可適於容納500 ml、100 ml、20 ml、10 ml、5 ml、4 ml、3 ml、2 ml或1 ml溶液。在一些具體實例中，第一容器可具有0.01 ml至約100 ml、約0.1 ml至約90 ml、約0.5 ml至約80 ml、約1 ml至約70 ml、約2 ml至約60 ml、約3 ml至約50 ml、約4 ml至約40 ml、約5 ml至約30 ml、約6 ml至約20 ml及約7 ml至約10 ml之容積。在一更佳具體實例中，第一容器為具有約1-10 ml之體積容量的小瓶或安瓿。
本發明之套組包含（II）用於將第一容器中之組成物遞送至脂肪沈積部位之遞送裝置。遞送裝置之特定類型不受特別限制，但較佳可為注射器，及/或可進一步包括另一適合遞送裝置（例如貼片）。
遞送裝置先前可已裝載單位劑量之本發明之組成物或製劑。
本發明之套組可視情況進一步包含多個容器。舉例而言，套組可進一步包含適量之稀釋劑用於稀釋包含於第一容器中之組成物或調配物及/或包含任何其他第二藥劑之第二容器。任何其他第二藥劑可根據套組之目的由熟習此項技術者選擇作為構成組分，且其種類不受特別限制，且其實例包括抗微生物劑、血管收縮劑、抗血栓劑、抗凝血劑、分散劑、抗分散劑、滲透增強劑、類固醇安神劑、肌肉鬆弛劑及止瀉劑。
套組可包括關於使用以減輕的疼痛及副作用減少局部脂肪之組成物或製劑的書面描述。因此，包含於第一容器（I）中之組成物或製劑可根據書面描述投予。書面描述可提供使用指示，其可視例如目標部位、待治療之哺乳動物、所需結果、目標部位之位置、溶液之濃度及脂肪沈積之量而定。較佳地，書面描述用於治療哺乳動物，諸如人類、犬、貓或馬。書面描述亦可包括關於治療其他家畜及/或農畜之資訊。
書面描述可包括關於使用本發明之組成物處理某些目標區域（諸如哺乳動物之眼睛下面、頦下、臂下面、髖部、小腿、背部、大腿、踝部或腹部）之資訊。在某些具體實例中，書面描述為使用本發明之組成物治療與眼瞼脂肪脫逸、脂瘤、脂質營養不良、水牛背脂肪營養不良（buffalo hump fat dystrophy）或脂肪團相關的脂肪沈積之具體說明書。
書面描述可包括關於第一容器之組分的（必要時）稀釋之量及/或第二容器之稀釋劑之資訊。書面描述可提供關於本發明之組成物或製劑之恰當投予的資訊，諸如投藥之頻率或劑量。
術語「包含（comprising）」與「含有（containing）」或「特性化（being characterized）」同義使用，且不排除組成物及方法中未提及之額外成分或步驟。術語「由……組成（consisting of）」排除未單獨描述之額外要素、步驟或成分。術語「基本上由……組成（essentially consisting of）」意謂，在組成物或方法之範疇中，該術語包括所描述之材料或步驟、以及不會實質上影響組成物或方法之基本特性的任何材料或步驟。
本發明提供一種製備具有減輕的疼痛及副作用的用於減少局部脂肪之可注射組成物之方法，該方法包含以下步驟： （a）添加選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者至注射用水，隨後在攪拌的同時溶解以獲得澄清混合物； （b）添加防腐劑，隨後攪拌； （c）添加磷脂醯膽鹼，隨後在室溫下攪拌；及 （d）用水調節該組成物之總體積，隨後攪拌， 其中該選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者與該磷脂醯膽鹼之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
在下文中，將逐步地描述本發明之製備減少局部脂肪之可注射組成物的方法。
在步驟（a）中，添加選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者至注射用水，隨後在攪拌的同時溶解以獲得實質上澄清混合物。
此時，選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一種（物質）及其組合及混合比如上文於組成物中所描述。在步驟（a）中，可視情況預添加pH調節劑。
步驟（b）為投予防腐劑之步驟。在步驟（b）中，可進一步添加等張劑及pH調節劑中之任一者或其兩者且攪拌。防腐劑、等張劑及pH調節劑之組分及濃度與上文在組成物之描述中所描述相同。
在本發明中，攪拌或混合可藉由已知攪拌構件（攪拌器）進行，且熟習此項技術者可視待引入以便提高效率之材料之種類或特性而改變諸如溫度、壓力、時間或旋轉速度之條件。
在步驟（c）中，添加磷脂醯膽鹼至步驟（b）中攪拌之混合物中，且在遮光及氣密之條件下攪拌混合物直至增溶混合物。攪拌可藉由此項技術中已知的攪拌構件（攪拌器）執行，較佳執行2至24小時、更佳5至15小時。旋轉速度不限於此，但可在100至1000 rpm下進行。經由以上過程，磷脂醯膽鹼可製備為組成物中的具有小粒度（2至10 nm之粒徑、較佳2至6 nm之粒徑）之均質粒子。若攪拌過程執行少於2小時，則無法獲得所需粒度及均質性，且若其超過24小時，則對於製備過程並不經濟。熟習此項技術者亦將能夠設定各種製程條件以增加組分材料之溶解度，例如在諸如氮氣壓力之條件下攪拌組分材料。
在步驟（d）中，用水調節總體積且均質地混合。水可替換為注射用水，其與上文所描述相同。在步驟（d）中，可進行pH調節劑之添加。在此步驟中，為了根據注射製劑之分佈確保產物穩定性，可藉由使用可用作注射劑的酸溶液或諸如磷酸鹽之緩衝液（pH調節劑）調節pH，且可製備物理或化學穩定之注射製劑。可用於本發明中的pH調節劑之種類或量如上文所描述。
此外，該方法可進一步包括（e）過濾步驟（d）中攪拌之溶液以獲得具有2至10 nm粒徑之磷脂醯膽鹼的濾液。
步驟（e）為經由過濾以高濃度分離具有2至10 nm粒徑之磷脂醯膽鹼分子的步驟。過濾可使用此項技術中已知的習知過濾構件進行，且過濾可藉由例如針筒過濾器進行。粒徑較佳可在2與5 nm之間。
作為較佳具體實例，本發明提供一種用於製備具有減輕的疼痛及副作用的用於以非外科方式移除局部脂肪沈積之醫藥組成物之方法，該方法包含添加磷脂醯膽鹼以及選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者，其中該選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者以與該磷脂醯膽鹼相同或更小之重量添加。關於此等特定實例，參考上文所描述的本發明之組成物及製劑之描述理解特定材料組成、混合比及其類似者。
本發明亦提供一種以減輕的疼痛及副作用移除個體中之局部脂肪沈積之方法，該方法包含向該具有局部脂肪沈積之個體投予有效量之磷脂醯膽鹼；及至少一種選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的磷脂醯膽鹼增溶劑。
亦即，在以上方法中，磷脂醯膽鹼以總組成物計以0.625至15%（w/v）之濃度包含於用於投予磷脂醯膽鹼之醫藥學上可接受之可注射溶液（組成物）中，且較佳以1.25至12.5%（w/v）之濃度，且更佳以2.5至10.0%（w/v）之濃度包含於組成物中。在此情況下，用於磷脂醯膽鹼投予之組成物之單位劑量可為500 ml、400 ml、300 ml、200 ml、100 ml、90 ml、80 ml、70 ml、60 ml、50 ml、40 ml、30 ml、20 ml、10 ml、9 ml、8 ml、7 ml、6、ml、5 ml、4 ml、3 ml、2 ml、1 ml、0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.6 ml、0.5 ml、0.4 ml、0.3 ml、0.2 ml、0.1 ml、0.09 ml、0.08 ml、0.07 ml、0.06 ml、0.05 ml、0.04 ml、0.03 ml、0.02 ml、0.01 ml、0.009 ml、0.008 ml、0.007 ml、0.006 ml、0.005 ml、0.004 ml、0.003 ml、0.002 ml、0.001 ml、0.0009 ml、0.0008 ml、0.0007 ml、0.0006 ml、0.0005 ml、0.0004 ml、0.0003 ml、0.0002 ml或0.0001 ml或更少。特定言之，用於向受影響區域投予磷脂醯膽鹼之組成物之單位劑量可為0.1 ml至500 ml、較佳1 ml至200 ml、且更佳1 ml至100 ml之總體積。
在以上方法中，磷脂醯膽鹼之增溶劑及磷脂醯膽鹼可以0.7至3.0、更佳0.7至2.60、最佳0.7至1.73之莫耳比（增溶劑/磷脂醯膽鹼）投予。
磷脂醯膽鹼及磷脂醯膽鹼之增溶劑可同時或依序投予。舉例而言，當包含於本發明之醫藥組成物中的各組分為單一組成物時，其可同時投予。若組成物不為單一組成物，則一種組分可在投予其他組分之前或之後數分鐘內投予。較佳地，磷脂醯膽鹼之增溶劑及磷脂醯膽鹼可同時投予。不管各組分同時抑或依序投予，較佳地，此等組分中之每一者包含於醫藥學上可接受之可注射溶液（組成物）中，且包含各組分之組成物不必按照上文所描述的本發明之組成物，且可使用向個體投藥之結果滿足各組分之莫耳比的方法。
在該方法中，選自由等張劑及pH調節劑組成之群的至少一者可與磷脂醯膽鹼及/或磷脂醯膽鹼之增溶劑同時或依序投予。可參考本說明書中的以上描述理解此等組分之特定濃度及其類似者。
投藥較佳可為直接注射至已出現局部脂肪沈積（積聚）之部位中，且注射較佳包括皮下注射、真皮內注射及其類似注射。
個體較佳為哺乳動物。該等哺乳動物包括人類或靈長類動物（例如猴、黑猩猩等）、家畜（例如犬、貓、馬等）、農畜（例如山羊、綿羊、豬、母牛等）或實驗室動物（例如小鼠、大鼠等）。個體亦可為動物來源之細胞、組織、器官或其類似物。較佳地，其可為需要移除局部脂肪沈積（積聚）之人類，且移除包括美容及治療目的兩者。作為該種實例，其可為需要治療因異常局部脂肪沈積所致的病理性病況（疾病）之患者。
舉例而言，本發明之組成物可用於治療患者中之某些脂肪病況，包括脂瘤、脫垂、動脈粥樣硬化、馬得隆咽喉（madelung throat）、脂性水腫、phyozoospermia結節、黃色心肌瘤（yellow cardioma）、脂肪營養不良及脂肪團。在某些具體實例中，本發明之組成物可用於治療各部位處之脂肪病況，諸如在哺乳動物之眼睛、頦、臂、髖部、小腿、背部、大腿、踝部或腹部下方之局部脂肪沈積。
如本文所用，術語「治療（treatment）」為涉及抑制、消除、緩解、改善及/或預防疾病或因疾病所致的症狀或病況之概念。
本發明亦關於一種減少哺乳動物中之脂肪（尤其皮下脂肪）沈積之方法，其中本發明較佳用於非外科移除個體中之局部脂肪沈積。作為一特定實例，本發明之非外科方法不包含吸脂、脂肪整形操作或吸入皮下脂肪組織切除術。
本發明方法特性在於疼痛及副作用得以緩解（實質上減輕至無之水準），且可參考以上描述理解疼痛及副作用之詳細描述。
較佳地，本發明提供一種以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除具有局部脂肪沈積之個體中之局部脂肪沈積的方法，該方法包含投予包含以下之製劑：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者。製劑或包含於本發明方法中所用製劑中之組成物可為單一組成物或按照上文所描述的本發明之組成之製劑。作為其他實例，製劑或包含於製劑中之組成物不必按照上文所描述的本發明之組成，且可使用向個體投藥之結果滿足（ii）比（i）之莫耳比為0.7至3.0、較佳0.7至2.60、最佳0.7至1.73的方法。
作為較佳實例，本發明提供一種以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除個體中之局部脂肪沈積之方法，該方法包含向該具有局部脂肪沈積之個體投予包含以下之製劑：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者， 其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
在以上方法中，參考在本發明之說明書中的以上描述在組成、含量及特性等方面理解製劑，且本發明之移除局部脂肪沈積之方法包含或其組成為向個體（哺乳動物）之脂肪沈積部位（受影響區域）局部投予單位劑量（總量）之上文在本發明之說明書中所描述的一或多種組成物或製劑。關於組成物、製劑及其單位劑量，將參考上文所提及之描述。
本發明方法係關於一種減少皮下脂肪沈積之方法。該等方法可包含或其組成為向哺乳動物中之脂肪沈積部位局部投予劑量單位之一或多種本發明之組成物或製劑。
製劑以有效量向有需要之個體投予，『有效量（effective amount）』係指展示局部減脂效果（包括對脂肪沈積疾病之改善、治療、預防效果）之量。一般而言，所投予之總量、單位劑量及處理數目將視目標部位中之脂肪之量、目標部位之位置、脂肪組成物之形式及所需結果而變化。一般而言，待處理之脂肪之量愈大，所投予之量愈大。因為構成「治療有效量」的本發明組成物之量將視疾病狀態及其嚴重程度、待治療之患者之年齡等而變化，所以治療有效量不限於本文所述之量，且可由一般熟習此項技術者常規地確定。
參考以上描述理解以上投藥方法，且作為一較佳實例，其可在目標部位使用注射器經由皮下注射而經皮或皮下投予。目標部位可為例如0.1 cm×0.1 cm至約5 cm×5 cm。本發明之組成物可以本文所述的各種間隔、劑量及量向與該部位相鄰或靠近之相同目標部位投予。有利效果
包含特定混合比之牛膽酸或甘膽酸（或其鹽）及磷脂醯膽鹼（PPC）的本發明之減少局部脂肪沈積之可注射組成物具有穩定且安全配方，且具有極大的脂肪細胞特異性脂肪溶解及脂肪細胞特異性細胞凋亡之效果而無脂肪細胞壞死，脂肪細胞壞死由包含DCA之習知PPC製劑（諸如Lipostabil®）及僅包含DCA之製劑（諸如Kybella）引起。因此，無副作用地減少脂肪細胞之效果極佳，該等副作用諸如疼痛、水腫、感覺異常、廣泛腫脹、紅斑、硬結、感覺異常、結節、搔癢、灼燒感、及除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死。
在下文中，將參考以下實施例詳細描述本發明。然而，以下實施例僅僅用於說明本發明且並不意欲限制本發明之範疇。材料
添加至本發明之可注射組成物及比較組成物的製劑中之材料如下： 磷脂醯膽鹼（PPC，S-100，LIPOID GmbH，784 g/mol，基於油醯基-亞油醯基-甘油-磷酸膽鹼）、膽酸（CA，New Zealand pharm）、去氧膽酸（DCA，Sigma-Aldrich）、去氧膽酸鈉（DCNa，New Zealand pham）、甘膽酸（GCA，New Zealand pham）、甘膽酸鈉（GCNa，New Zealand pham）、牛膽酸（TCA，Sigma-Aldrich）、牛膽酸鈉（TCNa，New Zealand pham）、鵝去氧膽酸（CDCA，Sigma-Aldrich）、熊去氧膽酸（UDCA，Sigma-Aldrich）、甘去氧膽酸（GDCA，Sigma-Aldrich）、牛去氧膽酸（TDCA，Sigma-Aldrich）、豬去氧膽酸（HDCA，Sigma-Aldrich）、石膽酸（LCA，Sigma-Aldrich）、去氫膽酸（DHCA，Sigma-Aldrich）、牛熊去氧膽酸（TUDCA，Tokyo Chemical Industry）苯甲醇（Sigma-Aldrich，0.9% w/v）、氯化鈉（Sigma-Aldrich，0.44% w/v）、氫氧化鈉（Sigma-Aldrich，0.04-0.76% w/v）、氫氯酸（Sigma-Aldrich，0.001-0.6% w/v）及注射用水。在添加之材料中，等張劑（氯化鈉）以使得其在實施例及比較實施例中與苯甲醇一起添加之方式使用。分析裝置
本發明之可注射組成物及比較組成物之分析中所用的裝置如下。
粒度係使用奈米粒度分析器（Microtrac Wave, MICROTRACT, USA）來量測。因沈澱所致的層分離係用攝影機（Nikkon，D5200，AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR鏡頭）觀測。透明度係使用分光光度計（CM-3600d，KONICA MINOLTA, JAPAN）來量測。pH係用pH計（ST3100，OHAUS, GERMANY）量測，且等張性係用滲透壓力計（Vapro 5600，Elitech Group, Tokyo, Japan）量測，且黏度係使用黏度計（數位黏度計CL-2，CAS, Korea）分析。
如下製備本發明之組成物（實施例）及比較組成物（比較實施例），作為根據增溶劑之類型的減少局部脂肪之基於PPC之製劑。在下文中，組成物之%意謂%（w/v）。比較實施例 1 ： PPC 單一可注射製劑
如下製備不具有增溶劑之磷脂醯膽鹼單一組成物（PPC濃度0.313-15.0%）。使用高壓均質機，製備分別包含PPC 3.125 mg（0.3125%）、6.25 mg（0.625%）、12.5 mg（1.25%）、25.0 mg（2.5%）、50.0 mg（5.0%）、75.0 mg（7.5%）、100.0 mg（10.0%）、125.0 mg（12.5%）或150.0 mg（15.0%）及苯甲醇9 mg（0.9%）於1 ml中之可注射組成物。且其代表性結果展示於下表1中。在下文中，組成物之% w/v表示為%。
特定製備方法如下。向經洗滌及滅菌之製備罐中饋入注射用水（在室溫下），且向其中添加磷脂醯膽鹼（PPC）及苯甲醇，且將混合物在氮氣壓力、遮光及室溫之條件下在200 RPM下攪拌2小時。在完成攪拌之後，將混合物轉移至氮氣壓力下的超高壓均質機（Nano Disperser NLM100，Ilshin Autoclave, Korea）。在12,000 psi下執行超高壓均質化（分散）7個循環，且將粒子精細粉碎。隨後，調節pH。在經由0.2 μm過濾器過濾之後，將小瓶填滿及密封。 表1 用高壓均質機分散之PPC單一可注射製劑
如圖1A中所示，不具有增溶劑之PPC 5.0%組成物緊接在攪拌24至72小時之後具有混濁外觀。在最終攪拌之後1天時，組成物因PPC不分散於注射用水中而具有較差調配穩定性，且產業使用受限。此外，如圖1B及表1中所示，在不添加增溶劑之情況下用高壓均質機分散0.625至10.0% PPC所得之組成物的描述視濃度而展現輕微混濁或混濁，且粒度為17.16 ± 5.88至16.69 ± 4.51 nm且不穩定分散之脂質體系統。作為觀測在製備之後30天時的性質之結果，據證實，PPC在2.5%或更大之濃度下沈澱且不分散於注射用水中且因低調配穩定性而不適用作產業可注射製劑（圖1B）。
為了獲得PPC以10 nm或更小之粒度穩定分散的微胞結構之澄清溶液之可注射組成物，製備藉由用各種濃度之各種膽汁酸（BA）（諸如DCA、CA、GCA、TCA、CDCA、UDCA、GDCA、TDCA、HDCA、LCA、DHCA及TUDCA）增溶而製備之PPC複合組成物。且，其組成詳細展示於以下比較實施例及實施例中。比較實施例 2 ： 用 DCA 增溶之 PPC 可注射製劑
如下表2中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、20.0 mg（2.0%）、21.0 mg（2.1%）、22.0 mg（2.2%）、23.0 mg（2.3%）、24.0 mg（2.4%）、25.0 mg（2.5%）或30.0 mg（3.0%）DCA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用去氧膽酸（DCA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC 5.0%）之組成物，與先前已知的Lipostabil®調配物及其類似物之組成物相同。特定言之，將注射用水置入經清潔及滅菌（室溫）之製備罐中，且添加氫氧化鈉至注射用水。隨後添加去氧膽酸及苯甲醇、攪拌且使其溶解。隨後，向其中添加磷脂醯膽鹼，且將混合物在遮光、密封、室溫（25℃）及氮氣壓力下在200 RPM下攪拌約24小時。在完成攪拌之後，調節pH（必要時，用額外氫氧化鈉或氫氯酸），且將其經由0.2 μm過濾器過濾，且填充至小瓶中並密封。表2展示用各種濃度之DCA增溶之PPC可注射製劑的性質。 表2 用DCA增溶之PPC可注射製劑
緊接在製備之後及在製備之後30天（在於室溫下靜置之後）評估用去氧膽酸（DCA）增溶之PPC可注射製劑之調配穩定性，且評估結果展示於圖2A中。當DCA對於PPC 5%以2.1%或更大添加時，觀測到穩定醫藥調配物，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（比較實施例2-4至2-9）。在比較實施例2-1至2-3中，因沈澱現象而觀測到不穩定調配物。基於以上比較，得出結論，穩定可注射製劑可基於PPC 5%在2.1%或更大之DCA下製備。詳言之，在比較實施例2-1至2-3中，磷脂醯膽鹼粒度為50.80 ± 330.0 nm至39.60 ± 26.14 nm，且其形成為不為微胞結構之不穩定乳液或脂質體結構。在比較實施例2-4至2-9中，形成10 nm或更小之微胞結構。如上文所描述，DCA與PPC之莫耳比（DCA/PPC）小於0.87之組成物被視為不適用於可注射製劑，因為實質上穩定調配物不存在。實施例 1 ： 製備用 GCA 增溶之 PPC 可注射製劑
如以下表3及4中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、20.0 mg（2.0%）、21.0 mg（2.1%）、22.0 mg（2.2%）、23.0 mg（2.3%）、24.0 mg（2.4%）、25.0 mg（2.5%）、26.0 mg（2.6%）、27.0 mg（2.7%）、28.0 mg（2.8%）、29.0 mg（2.9%）、30.0 mg（3.0%）、35.0 mg（3.5%）、40.0 mg（4.0%）或45.0 mg（4.5%）DCA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用甘膽酸（GCA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC）之組成物。特定言之，將注射用水置入經清潔及滅菌（室溫）之製備罐中，且添加氫氧化鈉（0.04-0.72%）至注射用水。隨後添加甘膽酸及苯甲醇、攪拌且使其溶解。隨後，向其中添加磷脂醯膽鹼，且將混合物在遮光、密封、室溫（25℃）及氮氣壓力下在200 RPM下攪拌約24小時。在完成攪拌之後，調節pH（必要時，用額外氫氧化鈉或0.001-0.6%氫氯酸），且將其經由0.2 μm過濾器過濾，且填充至小瓶中並密封。表3及4展示用各種濃度之GCA增溶之PPC可注射製劑的性質。 表3
表4
緊接在製備之後及在製備之後30天（冷藏）評估表3及4中的用甘膽酸（GCA）增溶之PPC可注射組成物之調配穩定性。評估結果展示於圖2B中。當GCA對於PPC 5.0%以2.2%或更大添加時，據證實，調配物穩定，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（實施例1-1至1-12）。在比較實施例1-1至1-4中，據證實，調配物因沈澱現象而不穩定。實施例1-1至1-3緊接在製備之後略微混濁，但在用0.2 μm過濾器過濾之後，其展示透明性質，且因此據證實，其可用作注射用製劑。因此，得出結論，穩定可注射製劑可基於5.0% PPC在2.2%或更大之GCA下製得。比較實施例1-1至1-4之組成物之粒度在198.2 ± 721.0 nm至28.2 ± 11.35 nm的範圍內，亦即組成物分散為不穩定乳液或脂質體，以致據判斷，實質上穩定調配物不存在且不適用於可注射製劑。除此以外，添加有GCA 2.2%或更大（GCA/PPC莫耳比為0.76或更大）之PPC複合組成物（實施例1-1至1-12）由大小為10 nm或更小之微胞結構構成，且添加有GCA 2.8%或更大（GCA/PPC莫耳比為0.97或更大）之PPC複合組成物（實施例1-7至1-12）由大小為5 nm或更小之微胞結構構成，且被發現適用於可注射製劑。
因為用GCA增溶之PPC複合組成物之黏度與PPC濃度成比例增加，所以對各種組成物進行黏度測試。特定言之，基於PPC 5.0%以5 nm或更小之粒度分散的2.8%之GCA濃度，研究用GCA（1.4-11.2%）增溶之PPC（2.5-20.0%）複合組成物及用GCA（4.2-12.6%）增溶之PPC 5.0%複合組成物的特性。在安裝自旋針（spin needle）第1號之後在60 RPM下3分鐘在室溫（25℃）下量測500 ml以上組成物中之每一者。作為測試之結果，據證實，粒度為4.23 ± 1.69至1.37 ± 0.530 nm，且透明度（660 nm）量測為99.11 ± 0.77%。表5展示用各種濃度之GCA增溶之PPC可注射製劑的黏度特性。基於下表5，據證實，當PPC超過15%（w/v）時，其因高黏度而不適用於投予。 表5 實施例 2 ： 製備用 TCA 增溶之 PPC 可注射製劑
如以下表6及7中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、20.0 mg（2.0%）、21.0 mg（2.1%）、22.0 mg（2.2%）、23.0 mg（2.3%）、24.0 mg（2.4%）、25.0 mg（2.5%）、26.0 mg（2.6%）、27.0 mg（2.7%）、28.0 mg（2.8%）、29.0 mg（2.9%）、30.0 mg（3.0%）、35.0 mg（3.5%）、40.0 mg（4.0%）或45.0 mg（4.5%）TCA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用牛膽酸（TCA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC）之組成物。特定製備方法與上文所提及之實施例1之製備方法相同。表6及7展示用各種濃度之TCA增溶之PPC可注射製劑的特性。 表6
表7
緊接在製備之後及在製備之後30天（冷藏）評估表6及7中的用牛膽酸（TCA）增溶之PPC可注射組成物之調配穩定性，且評估結果展示於圖2C中。當TCA關於PPC 5.0%以2.5%或更大添加時，據證實，調配物穩定，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（實施例2-1至2-9）。在比較實施例2-1至2-7中，據證實，調配物因沈澱現象而不穩定。實施例2-1緊接在製備之後略微混濁，但在用0.2 μm過濾器過濾之後，其展示透明性質，且因此據證實，其可用作注射用製劑。因此，得出結論，穩定可注射製劑可基於5.0% PPC在2.5%或更大之TCA下製得。比較實施例2-1至2-7之組成物之粒度在139.6 ± 126.14 nm至146.1 ± 2908 nm的範圍內，亦即組成物分散為不穩定乳液或脂質體，以致據判斷，實質上穩定調配物不存在且不適用於可注射製劑。除此以外，添加有TCA 2.5%或更大（TCA/PPC莫耳比為0.78或更大）之PPC複合組成物（實施例2-1至2-9）由大小為10 nm或更小之微胞結構構成，且添加有TCA 2.8%或更大（TCA/PPC莫耳比為0.88或更大）之PPC複合組成物（實施例2-4至2-9）由大小為5 nm或更小之微胞結構構成，且被發現適用於可注射製劑。比較實施例 3 ： 用 CA 增溶之 PPC 可注射製劑
如下表8中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、20.0 mg（2.0%）、21.0 mg（2.1%）、22.0 mg（2.2%）、23.0 mg（2.3%）、24.0 mg（2.4%）、25.0 mg（2.5%）或30.0 mg（3.0%）CA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用膽酸（CA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC）之組成物。特定製備方法與上文所提及之實施例1之製備方法相同。 表8
緊接在製備之後及在製備之後30天（冷藏）評估表8中的用膽酸（CA）增溶之PPC可注射組成物之調配穩定性，且評估結果展示於圖2D中。當CA關於PPC 5.0%以2.2%或更大添加時，據證實，調配物穩定，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（比較實施例3-5至3-9）。在比較實施例3-1至3-4中，據證實，調配物因沈澱現象而不穩定。比較實施例3-5緊接在製備之後幾乎透明，且在用0.2 μm過濾器過濾之後，其展示透明性質。因此，得出結論，穩定可注射製劑可基於5.0% PPC在2.2%或更大之CA下製得。比較實施例3-1至3-4之組成物之粒度在50.80 ± 330 nm至583.00 ± 293 nm的範圍內，亦即組成物分散為不穩定乳液或脂質體，但比較實施例3-5至3-9由大小為10 nm或更小之微胞結構構成。如上文所描述，據判斷，實質上穩定調配物不存在於CA/PPC莫耳比小於0.88之組成物中，且其不適用於可注射製劑。比較實施例 4 ： 用 CDCA 增溶之 PPC 可注射製劑
如下表9中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、20.0 mg（2.0%）、21.0 mg（2.1%）、22.0 mg（2.2%）、23.0 mg（2.3%）、24.0 mg（2.4%）、25.0 mg（2.5%）或30.0 mg（3.0%）CDCA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用鵝去氧膽酸（CDCA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC）之組成物。特定製備方法與上文所提及之實施例1之製備方法相同。 表9
緊接在製備之後及在製備之後30天（冷藏）評估表9中的用鵝去氧膽酸（CDCA）增溶之PPC可注射組成物之調配穩定性，且評估結果展示於圖2E中。當CDCA關於PPC 5.0%以2.2%或更大添加時，據證實，調配物穩定，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（比較實施例4-5至4-9）。在比較實施例4-1至4-4中，據證實，調配物因沈澱現象而不穩定。因此，得出結論，穩定可注射製劑可基於5.0% PPC在2.2%或更大之CA下製得。比較實施例4-1至4-4之組成物之粒度在80.05 ± 280.0 nm至35.73 ± 0.830 nm的範圍內，亦即組成物分散為不穩定乳液或脂質體，但比較實施例4-5至4-9由大小為10 nm或更小之微胞結構構成。如上文所描述，據判斷，實質上穩定調配物不存在於CDCA/PPC莫耳比小於0.89之組成物中，且其不適用於可注射製劑。比較實施例 5 ： 用 UDCA 增溶之 PPC 可注射製劑
如下表10中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、25.0 mg（2.5%）、26.0 mg（2.6%）、27.0 mg（2.7%）、28.0 mg（2.8%）、29.0 mg（2.9%）或30.0 mg（3.0%）UDCA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用熊去氧膽酸（UDCA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC）之組成物。特定製備方法與上文所提及之實施例1之製備方法相同。 表10
緊接在製備之後及在製備之後30天（冷藏）評估表10中的用熊去氧膽酸（UDCA）增溶之PPC可注射組成物之調配穩定性，且評估結果展示於圖2F中。當UDCA關於PPC 5.0%以2.7%或更大添加時，據證實，調配物穩定，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（比較實施例5-6至5-9）。在比較實施例5-1至5-5中，據證實，調配物因沈澱現象而不穩定。比較實施例5-6緊接在製備之後幾乎透明，且在用0.2 μm過濾器過濾之後，其展示透明性質。因此，得出結論，穩定可注射製劑可基於5.0% PPC在2.7%或更大之UDCA下製得。比較實施例5-1至5-5之組成物之粒度在289.0 ± 265.0 nm至42.42 ± 250 nm的範圍內，亦即組成物分散為不穩定乳液或脂質體，但比較實施例5-6至5-9由大小為10 nm或更小之微胞結構構成。如上文所描述，據判斷，實質上穩定調配物不存在於UDCA/PPC莫耳比小於1.12之組成物中，且其不適用於可注射製劑。比較實施例 6 ： 用 GDCA 增溶之 PPC 可注射製劑
如下表11中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、20.0 mg（2.0%）、21.0 mg（2.1%）、22.0 mg（2.2%）、23.0 mg（2.3%）、24.0 mg（2.4%）、25.0 mg（2.5%）或30.0 mg（3.0%）GDCA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用甘去氧膽酸（GDCA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC）之組成物。特定製備方法與上文所提及之實施例1之製備方法相同。 表11
緊接在製備之後及在製備之後30天（冷藏）評估表11中的用甘去氧膽酸（GDCA）增溶之PPC可注射組成物之調配穩定性，且評估結果展示於圖2G中。當GDCA關於PPC 5.0%以2.4%或更大添加時，據證實，調配物穩定，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（比較實施例6-7至6-9）。在比較實施例6-1至6-6中，據證實，調配物因沈澱現象而不穩定。比較實施例6-7緊接在製備之後幾乎透明，且在用0.2 μm過濾器過濾之後，其展示透明性質。因此，得出結論，穩定可注射製劑可基於5.0% PPC在2.4%或更大之GDCA下製得。比較實施例6-1至6-6之組成物之粒度在204.4 ± 1880 nm至134.8 ± 680.1 nm的範圍內，亦即組成物分散為不穩定乳液或脂質體，但比較實施例6-7至6-9由大小為10 nm或更小之微胞結構構成。如上文所描述，據判斷，實質上穩定調配物不存在於GDCA/PPC莫耳比小於0.87之組成物中，且其不適用於可注射製劑。比較實施例 7 ： 用 TDCA 增溶之 PPC 可注射製劑
如下表12中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、20.0 mg（2.0%）、21.0 mg（2.1%）、22.0 mg（2.2%）、23.0 mg（2.3%）、24.0 mg（2.4%）、25.0 mg（2.5%）或30.0 mg（3.0%）TDCA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用牛去氧膽酸（TDCA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC）之組成物。特定製備方法與上文所提及之實施例1之製備方法相同。 表12
緊接在製備之後及在製備之後30天（冷藏）評估表12中的用牛去氧膽酸（TDCA）增溶之PPC可注射組成物之調配穩定性，且評估結果展示於圖2H中。當TDCA關於PPC 5.0%以2.3%或更大添加時，據證實，調配物穩定，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（比較實施例7-6至7-9）。在比較實施例7-1至7-5中，據證實，調配物因沈澱現象而不穩定。比較實施例7-6緊接在製備之後幾乎透明，且在用0.2 μm過濾器過濾之後，其展示透明性質。因此，得出結論，穩定可注射製劑可基於5.0% PPC在2.3%或更大之TDCA下製得。比較實施例7-1至7-5之組成物之粒度在185.1 ± 1834 nm至123.5 ± 72.0 nm的範圍內，亦即組成物分散為不穩定乳液或脂質體，但比較實施例7-6至7-9由大小為10 nm或更小之微胞結構構成。如上文所描述，據判斷，實質上穩定調配物不存在於TDCA/PPC莫耳比小於0.74之組成物中，且其不適用於可注射製劑。比較實施例 8 ： 用 HDCA 增溶之 PPC 可注射製劑
如下表13中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、20.0 mg（2.0%）、21.0 mg（2.1%）、22.0 mg（2.2%）、23.0 mg（2.3%）、24.0 mg（2.4%）、25.0 mg（2.5%）或30.0 mg（3.0%）HDCA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用豬去氧膽酸（HDCA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC）之組成物。特定製備方法與上文所提及之實施例1之製備方法相同。 表13
緊接在製備之後及在製備之後30天（冷藏）評估表13中的用豬去氧膽酸（HDCA）增溶之PPC可注射組成物之調配穩定性，且評估結果展示於圖2I中。當TDCA關於PPC 5.0%以2.3%或更大添加時，據證實，調配物穩定，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（比較實施例8-6至8-9）。在比較實施例8-1至8-5中，據證實，調配物因沈澱現象而不穩定。比較實施例8-6緊接在製備之後幾乎透明，且在用0.2 μm過濾器過濾之後，其展示透明性質。因此，得出結論，穩定可注射製劑可基於5.0% PPC在2.3%或更大之HDCA下製得。比較實施例8-1至8-5之組成物之粒度在537.2 ± 320 nm至81.65 ± 24.30 nm的範圍內，亦即組成物分散為不穩定乳液或脂質體，但比較實施例8-6至8-9由大小為10 nm或更小之微胞結構構成。如上文所描述，據判斷，實質上穩定調配物不存在於HDCA/PPC莫耳比小於0.95之組成物中，且其不適用於可注射製劑。
不尋常的發現為，用HDCA增溶之PPC複合組成物當低溫（4-8℃）儲存時混濁且在室溫下變為澄清溶液。已推斷出，PPC + HDCA複合組成物在冷藏期間調配穩定性較差且應長期儲存在室溫下。然而，HDCA不被視為適用於對PPC複合組成物進行品質控制之增溶劑，因為當PPC + HDCA長期儲存在室溫下時，溶血磷脂醯膽鹼增加，此會導致溶血。比較實施例 9 ： 用 TUDCA 增溶之 PPC 可注射製劑
如下表14中所示，藉由添加50.0 mg PPC（5.0%）及分別10.0 mg（1.0%）、15.0 mg（1.5%）、20.0 mg（2.0%）、25.0 mg（2.5%）、30.0 mg（3.0%）、35.0 mg（3.5%）、40.0 mg（4.0%）、45.0 mg（4.5%）或50.0 mg（5.0%）TUDCA、及添加9 mg苯甲醇（0.9%）於1 ml中，製備用牛熊去氧膽酸（TUDCA）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC）之組成物。特定製備方法與上文所提及之實施例1之製備方法相同。 表14
緊接在製備之後及在製備之後30天（冷藏）評估表14中的用牛熊去氧膽酸（TUDCA）增溶之PPC可注射組成物之調配穩定性，且評估結果展示於圖2J中。當TUDCA關於PPC 5.0%以4.0%或更大添加時，據證實，調配物穩定，且組成物展示透明（澄清）溶液性質（比較實施例9-7至9-9）。在比較實施例9-1至9-6中，據證實，調配物因沈澱現象而不穩定。因此，得出結論，穩定可注射製劑可基於5.0% PPC在4.0%或更大之TUDCA下製得。比較實施例9-1至9-6之組成物之粒度在86.30 ± 850 nm至22.8 ± 0.980 nm的範圍內，亦即組成物分散為不穩定乳液或脂質體，但比較實施例9-7至9-9由大小為10 nm或更小之微胞結構構成。如上文所描述，據判斷，實質上穩定調配物不存在於TUDCA/PPC莫耳比小於1.29之組成物中，且其不適用於可注射製劑。
下表15展示製備如比較實施例1至9及實施例1及2中所描述之PPC可注射組成物所需要的較佳BA/PPC莫耳比之中，各種膽汁酸（BA）與PPC之最佳最小莫耳比（BA/PPC）。可用於製備澄清溶液之穩定可注射組成物的膽汁鹽（BA），其中PPC在低溫及室溫條件下分散於大小為10 nm或更小之微胞結構中時為去氧膽酸（DCA）、膽酸（CA）、甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）、鵝去氧膽酸（CDCA）、熊去氧膽酸（UDCA）、甘去氧膽酸（GDCA）、牛去氧膽酸（TDCA）及牛熊去氧膽酸（TUDCA），且在室溫條件下時為豬去氧膽酸（HDCA）。在上文所提及之最小莫耳比下，其使PPC增溶以分散為穩定澄清溶液之微胞結構。用膽汁酸（BA）增溶PPC之最佳BA/PPC最小莫耳比為0.92 ± 0.17。亦即，最佳BA/PPC最小莫耳比為0.74至1.29，如下表15中所示。為了增溶PPC 5%，BA應以至少2.49 ± 0.56%（w/v）混合。 表15 比較實施例 10 ： 用 LCA 增溶之 PPC 可注射製劑
藉由與上文所提及之實施例1之方法相同的方法，製備用石膽酸（LCA）3.0%（w/v）增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC 5.0%）之組成物。
然而，如圖3A中所示，當在氫氧化鈉下增溶PPC時，石膽酸（LCA）因膠凝現象而展現混濁及沈澱性質。比較實施例 11 ： 用 DHCA 增溶之 PPC 可注射製劑
藉由與上文所提及之實施例1之方法相同的方法，製備用去氫膽酸（DHCA）2.5%、3.0%、4.0%或5.0%增溶之基於磷脂醯膽鹼（PPC 5.0%）之組成物。然而，如圖3B中所示，當在增溶PPC之後用氫氧化鈉調節pH時，去氫膽酸（DHCA）展現混濁性質及沈澱性質，以致其不適用於可注射組成物。比較實施例 12 至 30 ： 製備 PPC 單一、 BA 單一及 PPC+BA 複合組成物
以單一組成物形式，製備各種濃度（1.0至7.5%（w/v）及其類似者）的去氧膽酸（DCA）單一（比較實施例12）、膽酸（CA）單一（比較實施例13）、甘膽酸（GCA）單一（比較實施例14）、牛膽酸（TCA）單一（比較實施例15）、鵝去氧膽酸（CDCA）（比較實施例16）、熊去氧膽酸（UDCA）單一（比較實施例17）、甘去氧膽酸（GDCA）單一（比較實施例18）、牛去氧膽酸（TDCA）單一（比較實施例19）、豬去氧膽酸（HDCA）單一（比較實施例20）及牛熊去氧膽酸（TUDCA）單一（比較實施例21）可注射組成物。特定言之，藉由分別添加10.0 mg（1.0%）、25.5 mg（2.5%）、50.0 mg（5.0%）或75.5 mg（7.5%）膽汁酸、及添加9 mg（0.9%）苯甲醇，製備組成物。方法為，將注射用水置入經清潔及滅菌（室溫）之製備罐中，且添加氫氧化鈉至注射用水。隨後添加膽汁酸（鹽）及苯甲醇、攪拌且使其溶解。隨後，將其在遮光、密封、室溫（25℃）及氮氣壓力下在200 RPM下攪拌約2小時。在完成攪拌之後，調節pH，且將其經由0.2 μm過濾器過濾，且填充至小瓶中並密封。
另外，製備各種濃度之PPC單一組成物[（PPC 1.25%、2.50%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%及15.0%）（比較實施例22）]。特定製備方法與比較實施例1之製備方法相同。
且，以複合組成物形式，製備PPC 5.0%+DCA 2.2%（比較實施例23）、PPC 5.0%+HDCA2.5%（比較實施例24）、PPC 5.0%+UDCA 3.0%（比較實施例25）、PPC 5.0%+TDCA 2.5%（比較實施例26）、PPC 5.0%+GDCA 2.5%（比較實施例27）、PPC 5.0%+CDCA 2.5%（比較實施例28）、PPC 5.0%+CA 2.5%（比較實施例29）及PPC 5.0%+TUDCA 4.0%（比較實施例30）。特定製備方法與比較實施例2至9之製備方法相同。實施例 3 及 4 ： 製備用 GCA 或 TCA 增溶之 PPC 複合組成物
製備PPC+GCA[（PPC 2.5%+GCA 1.25%、PPC 5.0%+GCA 2.5%、PPC 7.5%+GCA 3.75%、PPC 10.0%+GCA 5.0%、PPC 15.0%+GCA 7.5%、PPC 5.0%+GCA 5.0%、PPC 5.0%+GCA 7.5%、PPC 5.0%+GCA 10.0%、PPC 5.0%+GCA 15.0%、PPC 5.0%+GCA 20.0%及PPC 5.0%+GCA 25.0%）（實施例3）]及PPC+TCA[（PPC 2.5%+TCA 1.25%、PPC 5.0%+TCA 2.5%、PPC 7.5%+TCA 3.75%、PPC 10.0%+TCA 5.0%、PPC 15.0%+TCA 7.5%、PC 5.0%+TCA 5.0%、PPC 5.0%+TCA 7.5%、PPC 5.0%+TCA 10.0%、PPC 5.0%+TCA 15.0%、PPC 5.0%+TCA 20.0%及PPC 5.0%+TCA 25.0%）（實施例4）]之組成物。特定製備方法與實施例1及2之製備方法相同。測試實施例 1 ： 副作用 （ 炎症、水腫及皮膚病變 ） 之比較
測試各種濃度之磷脂醯膽鹼（PPC）單一組成物（比較實施例22）、膽汁酸（BA）單一組成物（比較實施例12至21）、用DCA、HDCA、UDCA、TDCA、GDCA、CDCA或CA增溶之PPC複合組成物（比較實施例23至29）、及用GCA或TCA增溶之PPC複合組成物（實施例3及4）的水腫、皮膚病變及炎症。
投藥部位之炎症、水腫及局部或廣泛皮膚病變為習知熟知且使用的DCA單一可注射組成物（諸如Kybella）或PPC可注射組成物（諸如Lipostabil、Lipobean等）典型地觀測到之局部副作用。以下結果展示在活體內皮下注射膽汁酸（鹽）單一組成物、PPC單一組成物及膽汁酸增溶之PPC複合組成物的水腫、炎症及皮膚病變結果。根據以下結果觀測到，用特定莫耳比的GCA、TCA或TUDCA增溶之PPC可注射組成物導致實質上無炎症及水腫或得到80%緩解之炎症及水腫。該等結果為根據個別物質之功效評估不可預知的發現。在下文描述以下測試方法及結果。在下文中，組成物之%意謂%（w/v）。1-1 ： 大鼠爪水腫
為評估水腫程度，將上文所描述之各測試組成物注射至大鼠爪中。特定言之，購得雄性史泊格多利大鼠（Sprague Dawley rat）（6週大），且在一週適應之後使用。隨機選擇大鼠（體重：170-200 g），且在投予測試組成物之前用測徑規量測大鼠爪厚度。為了觀測水腫，向大鼠爪投予0.1 ml PBS及各種測試組成物。於正要注射之前、緊接在注射之後及在注射之後1或2小時藉由測徑規進行爪體積量測。另外，當量測厚度時，藉由對爪之底部攝影觀測注射部位之皮膚病變（使用4×4 cm刻度）。
水腫程度評估為0至4級。將緊接在注射之後及在注射之後1或2小時的水腫程度與注射之前相比較評估，其中等級為完全無水腫[-，（與注射之前相比，腫脹程度為0%）]、輕度水腫[+，（與注射之前相比，腫脹程度為1-20%）]、中度水腫[++，（與注射之前相比，腫脹程度為20-40%）]、重度水腫[+++，（與注射之前相比，腫脹程度為40-60%）]及極其嚴重水腫[++++，（與注射之前相比，腫脹程度為60%或更大）]。
在投予PPC單一組成物（PPC 1.25%、2.50%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%或15.0%）之後2小時（當水腫為最嚴重時）的水腫評估結果如下表16中所示，「輕度」級自PPC 1.25%延伸至10.0%，「中度」級展示於PPC 12.5%及15.0%中。在投予DCA 1.0%之後2小時的水腫增加至「重度」（圖4A）。總之，PPC單一組成物在高濃度下展示濃度依賴性水腫，但PPC 15%單一組成物（亦即最高濃度）誘導比DCA 1.0%顯著更低等級之水腫。 表16
在投予各種濃度之膽汁酸（1.0%、2.5%、5.0%、7.5%）之後2小時（當水腫為最嚴重時）的水腫評估結果如下表17中所示，「輕度」級展示於TUDCA 1.0%、2.5%、GCA 1.0%及TCA 1.0%中，「中度」級展示於UDCA 1.0%、GDCA 1.0%、CA 1.0%、GCA 2.5-5.0%、TCA 2.5-5.0%、TUDCA 5.0-7.5%中，且剩餘各種濃度之膽汁酸展示「重度」及「極其嚴重」水腫（圖4B至4K）。 表17
特定言之，如下文描述之試管內脂肪細胞活力測試之結果中所示，PPC 5%展示等效於DCA 1%的減少脂肪細胞之能力。比較基於增溶PPC 5%所正常且通常需要的2.5%濃度之膽汁酸之結果，在投藥之後2小時，水腫程度在TUDCA情況下為「輕度」，在GCA及TCA情況下為「中度」，在HDCA、TDCA、GDCA及CA情況下為「重度」，且在DCA、UDCA、CDCA情況下為「極其嚴重」，如表17中所示。圖4L展示比較在注射PPC 5.0%單一組成物、增溶PPC 5.0%所需濃度（通常約2.5%，但對於UDCA 3%、對於TUDCA 4%為恰當的）的各膽汁酸之單一組成物或PBS之後2小時的水腫之結果，且結果與表17類似。
就此而言，為了證實用各種膽汁酸增溶之PPC複合組成物之炎症程度，比較在投予用各膽汁酸增溶之PPC 5.0%複合組成物之後2小時的水腫程度。如表18中所示，據證實，GCA、TCA及TUDCA展示「無水腫」，CA展示「中度」，且HDCA、UDCA、TDCA、GDCA及CDCA展示「重度」（圖4M）。 表18
令人驚訝的發現為，由GCA（2.5%）、TCA（2.5%）及TUDCA（5.0%）單一組成物誘導之水腫程度為中度（表17），但由用GCA（2.5%）、TCA（2.5%）及TUDCA（4.0%）增溶之PPC 5.0%複合組成物誘導之水腫程度降低至無或輕度（圖4M）。
為了觀測根據濃度變化之水腫，比較用GCA或TCA增溶之PPC複合組成物之時間依賴性水腫程度。因此，據證實，在投藥之後2小時，對應於PPC 2.5-5.0%之複合組成物展示「無水腫」，對應於PPC 7.5-10.0%之複合組成物展示「輕度」，且對應於PPC 15.0%之複合組成物展示「中度」，如表19及20（圖4N至4O）中所示。 表19
表20
在用膽汁酸增溶之PPC複合組成物中，獲得穩定澄清溶液之製備時間隨著待添加之膽汁酸之濃度增加而縮短。出於此原因，評估能夠增溶PPC 5.0%之GCA或TCA之濃度增加的組成物之水腫。測試材料為PPC 5.0%分別與2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、5.0%、20.0%或25.0% GCA或TCA混合之複合組成物。如表21及表22中所示，無水腫或輕度水腫之較佳GCA/PPC莫耳比為2.60 mol/mol或更小，且水腫在3.47 mol/mol或小於以上值之莫耳比下為輕度及中度，且在大於3.47 mol/mol之莫耳比下顯示重度水腫。另外，無水腫或輕度水腫之較佳TCA/PPC莫耳比為2.35 mol/mol或更小，且水腫在3.13 mol/mol或小於以上值之莫耳比下為輕度及中度，且在大於3.13 mol/mol之莫耳比下顯示重度水腫（圖4P及4Q）。 表21
表22
活體內水腫測試之結果綜合而言，PPC 1.25-10.0%單一組成物在投藥之後2小時（當水腫為最嚴重時）展示「輕度」水腫，如表16至22及圖4（圖4A至4Q）中所示。在經選擇用於解決因PPC單一組成物之低調配穩定性所致的產業使用侷限性之膽汁酸（BA）中，DCA 2.5%、UDCA 2.5%、CDCA 2.5%、HDCA 2.5%、TDCA 2.5%、GDCA 2.5%及CA 2.5%展示「重度」及「極其嚴重」水腫，且GCA 2.5%、TCA 2.5%及TUDCA 5.0%展示「中度」水腫。但，用GCA、TCA或TUDCA增溶之PPC 5.0%複合組成物展示「無」或「輕度」水腫。作為觀測水腫根據濃度及混合量之變化的結果，用1.25-5.0% GCA或TCA增溶之PPC 2.5-10.0%複合組成物展示「無」或「輕度」水腫。3.47 mol/mol或更小、較佳2.60 mol/mol或更小之GCA/PPC莫耳比；及3.13 mol/mol或更小、較佳2.35 mol/mol或更小之TCA/PPC莫耳比展示「無」或「輕度」水腫。根據先前研究之結果及試管內脂肪細胞活力測試（參見下文描述之測試2）結果，發現TUDCA因抑制細胞凋亡之效果而不為適合增溶劑，細胞凋亡為PPC之脂肪細胞溶解機制。1-2 ： 皮膚病變 （ 紅斑 ） 之量測
為了觀測在注射測試組成物之後與皮膚相關之有害情況，當在測試實施例1-1中量測爪厚度時，藉由對大鼠爪之底部攝影觀測皮膚病變（使用4 cm×4 cm刻度）。皮膚病變之等級評估為0至4級。將緊接在注射之後及在注射之後1或2小時的皮膚病變等級與注射之前相比較評估，其中等級定義為無紅斑（-）、極輕微紅斑（視覺上幾乎不可鑑別），輕度（+）]、顯著紅斑（中度，++）、輕微嚴重紅斑（重度，+++）及重度紅斑（極其嚴重，++++）。
首先，在PPC（1.25-15.0%）單一組成物之所有濃度組中均完全無紅斑，如表23（圖5A）中所示。 表23
隨後，各種濃度之單一組成物（BA 1.0%、2.5%、5.0%及7.5%）之皮膚病變結果如表24中所示，2.5%或更大之DCA、HDCA、UDCA、GDCA、TDCA及CDCA、以及5.0%或更大之CA展示重度及極其嚴重紅斑。且據證實，5.0%或更小之GCA及TCA展示無或輕度紅斑，且TUDCA展示無紅斑（圖5B及5C）。 表24
用各種膽汁酸增溶之PPC 5.0%複合組成物之皮膚病變結果如表25中所示，在投藥之後2小時，用DCA、HDCA、UDCA或CDCA增溶之PPC 5.0%複合組成物展示重度紅斑，用TDCA、GDCA或CA增溶之PPC 5.0%複合組成物展示中度紅斑，且用GCA、TCA及TUDCA增溶之PPC 5.0%複合組成物展示無紅斑（圖5D）。 表25
為了觀測根據濃度變化之病變，在各種濃度之用GCA增溶之PPC複合組成物下比較病變程度。如表26中所示，在PPC 10.0% + GCA 5.0%或更小下未觀測到病變，且在PPC 15.0% + GCA 7.5%下觀測到輕度病變（圖5E）。 表26
評估能夠增溶PPC 5.0%之增加濃度的GCA之組成物的病變。如表27中所示，無病變或輕度病變之較佳GCA/PPC莫耳比為2.60 mol/mol或更小，且病變在3.47 mol/mol或更大之莫耳比下為重度或極其嚴重（圖5F）。 表27
活體內病變測試之結果綜合而言，如表23至27及圖5中所示，PPC 1.25-10.0%單一組成物展示無病變。在經選擇用於解決因PPC單一組成物之低調配穩定性所致的產業使用侷限性之膽汁酸（BA）中，DCA 2.5%、UDCA 2.5%、CDCA 2.5%、HDCA 2.5%、TDCA 2.5%、GDCA 2.5%及CA 5.0%或更大展示「重度」及「極其嚴重」病變，且5.0%或更小之GCA及TCA展示無或輕度病變，且TUDCA展示無病變。在用額外膽汁酸增溶之PPC 5.0%複合組成物的情況下，用DCA、HDCA、UDCA或CDCA增溶之PPC 5.0%複合組成物展示重度病變，用TDCA、GDCA或CA增溶之PPC 5.0%複合組成物展示中度病變，但用GCA、TCA或TUDCA增溶之PPC 5.0%複合組成物展示無病變。作為病變根據濃度及混合量之變化的結果，用GCA 1.25-5.0%增溶之PPC 2.5-10.0%複合組成物展示無病變，用GCA 7.5%增溶之PPC 15.0%複合組成物展示輕度病變。另外，據證實，2.60 mol/mol或更小之GCA/PPC莫耳比展示無或輕度病變。1-3 ： H&E 染色組織學測試 （ 炎症 ）
在完成測試實施例1-1及1-2之後3小時將大鼠處死以評估在注射測試組成物之後的炎症程度。將注射區域之組織解剖，用10%福馬林固定，且隨後製備試樣，且使用光學顯微鏡擷取影像。炎症程度評估如下。
無炎症（-）指示，功能性組織（諸如汗腺、血管及脂肪組織）良好維持且炎性細胞不可見。輕度（+）指示，功能性組織（汗腺、血管、脂肪組織等）之形式良好維持且偶爾出現炎性細胞。中度（++）指示，功能性組織（汗腺、血管、脂肪組織等）之形態受損且炎性細胞出現於組織中。重度（+++）指示，功能性組織之形態受損且炎性細胞增加，且炎性細胞（諸如嗜中性球、單核細胞及其類似細胞）遷移至血管周圍之組織。極其嚴重（+++）指示，功能性組織之形態因水腫及炎症而受損，且炎性細胞（諸如嗜中性球、單核細胞及其類似細胞）不僅增加而且擴散至乳頭狀真皮，且明顯觀測到組織損傷。
首先，作為所有濃度PPC（1.25-15.0%）單一組成物的炎症評估之結果，PPC 2.50-7.50%展示「無」炎症，PPC 10.0-12.5%展示「輕度」，且PPC 15.0%展示「中度」，如下表28（圖6A）中所示。 表28
隨後，作為各種濃度之膽汁酸（BA 1.0%、2.5%、5.0%及7.5%）之炎症評估結果，1.0%或更大之DCA、HDCA及UDCA展示重度及極其嚴重炎症，2.5%或更大之TDCA、GDCA、CDCA及CA展示重度及極其嚴重炎症。且2.5%或更大之GCA及TCA展示中度炎症，且高濃度之TUDCA僅展示輕度炎症（圖6B及6C）。 表29
為了測試用膽汁酸增溶之PPC複合組成物之炎症程度，製備用各種膽汁酸增溶之PPC 5.0%複合組成物且量測炎症。如表29中所示，用DCA、HDCA、UDCA或CDCA增溶之PPC複合組成物展示「極其嚴重」，用TDCA或GDCA增溶之PPC複合組成物展示「重度」，且用CA增溶之PPC複合組成物展示「中度」。另一方面，用GCA、TCA或TUDCA增溶之PPC複合組成物獨特地展示無炎症。且令人驚訝地發現，GCA 2.5%及TCA 2.5%單一組成物展示中度炎症，但用GCA 2.5%或TCA 2.5%增溶之PPC 5.0%複合組成物展示無炎症（圖6D）。
為了檢查根據濃度變化之炎症程度，比較用GCA增溶之各種PPC複合組成物之炎症程度。因此，PPC 7.5%+GCA 3.75%或更小展示「無」炎症，PPC 10.0%+GCA 5.0%展示輕度炎症，且PPC 15.0%+GCA 7.50%展示中度炎症（圖6E）。
為了檢查根據增溶劑之混合量增加的炎症程度，製備包含能夠增溶PPC 5.0%之增加濃度的GCA之組成物且評估炎症。如表28中所示，展示無或輕度炎症之較佳GCA/PPC莫耳比為3.47 mol/mol或更小，且據證實，3.47 mol/mol或更大之莫耳比展示極其嚴重炎症（圖6F）。
由用於減少局部脂肪之皮下注射所引起的水腫、病變及炎症之活體內測試結果之概述如下。為了製備穩定組成物形式之PPC 5.0%，其具有與DCA 1.0%等效的脂肪細胞減少功效，膽汁酸一般而言應以2.5%之濃度混合，但據證實，DCA、HDCA、UDCA、TDCA、GDCA、CDCA及CA在2.5%濃度下導致重度及極其嚴重的由炎症所引起之水腫及病變。另外，與上文所提及之膽汁酸一起調配的PPC 5.0%複合組成物誘導顯著疼痛及水腫。因此，彼等膽汁酸不適用作併入於本發明之基於PPC之局部減脂可注射組成物中的增溶劑。另一方面，GCA + PPC製劑及TCA + PPC製劑不引起疼痛、水腫及病變，且此等發現為根據PPC、GCA或TCA單一組成物不可預知的不可思議之發現。
總之，已發現，本發明之GCA + PPC複合製劑及TCA + PPC複合製劑較佳具有0.7至3.0的膽汁酸與PPC之莫耳比（亦即GCA/PPC莫耳比或TCA/PPC莫耳比）。當莫耳比（mol/mol）為小於0.7時，調配穩定性因為難以形成穩定微胞而降低。因此，較佳具有至少0.7或更大之莫耳比，更佳地，當莫耳比為0.76或更大時，就穩定性及製程時間而言為最有利的。當莫耳比超過3.04時，顯著誘導副作用，諸如炎症、水腫及皮膚病變，且壞死之可能性增加，而非提供對脂肪細胞之細胞凋亡及脂肪溶解之正面效果。在3.0或更小之莫耳比下，該等副作用及疼痛顯著減輕。詳言之，當莫耳比在以上範圍內為2.60或更小時，副作用及疼痛減輕至實質上無該等副作用及疼痛。最佳地，當莫耳比為1.73或更小時，據證實，製得不含全部炎症、水腫及病變之極佳減脂組成物。疼痛之證實之結果進一步描述於以下測試實施例中。
另外，就疼痛、水腫及副作用而言證實為更有利的為，PPC於總組成物中之絕對含量可較佳為12.5%（w/v）或更小，且更佳為10.0%（w/v）或更小。測試實施例 2 ： 細胞減少效果之比較 2-1 ： 脂肪細胞 （ 3T3-L1 ） 減少效果之比較
執行測試以比較PPC單一組成物及用膽汁酸增溶之PPC組成物之脂肪細胞減少活性。分化之3T3L-1脂肪細胞系用於觀測脂肪細胞減少活性，且藉由MTT分析監測細胞活力。藉由比較各測試材料之脂肪細胞活力獲得以下結果。特定言之，TUDCA、GCA或TCA（其為根據活體內測試結果選擇之增溶劑）與PPC之混合組成物在以下試管內測試結果中在未預期混合比下影響脂肪細胞活力，且以下資料展現該未預期發現。下文描述在以下實驗中所用之材料及方法。在下文中，組成物之%係指%（w/v）。
特定測試方法如下。將分化之3T3-L1脂肪細胞在85-92%細胞匯合下培養。將細胞用以下測試組成物中之每一者處理且在37℃下培養0至96小時：PPC單一組成物（PPC 0.3125%、0.625%、1.25%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、15.0%）、DCA單一組成物（DCA 1.0%、1.1%、2.2%）、GCA單一組成物（GCA 1.25%、2.5%、5.0%）、用GCA增溶之PPC複合組成物（PPC 0.3125%+GCA 0.1563%、PPC 0.625%+GCA 0.3125%、PPC 1.25% +GCA 0.625%、PPC 2.5%+GCA 1.25%、PPC 5.0%+GCA 2.5%、PPC 7.5%+GCA3.75%、PPC 10.0%+GCA 5.0%、PPC 15.0%+GCA 7.5%、PPC 5.0%+GCA、3.75%、PPC 5.0%+GCA 5.0%、PPC 5.0%+GCA 6.25%、PPC 5.0%+GCA 7.5%、PPC 5.0%+GCA 8.75%）、用TCA增溶之PPC複合組成物（PPC 0.3125%+TCA 0.1563%、PPC 0.625%+TCA 0.3125%、PPC 1.25% +TCA 0.625%、PPC 2.5%+TCA 1.25%、PPC 5.0%+TCA 2.5%、PPC 7.5%+TCA3.75%、PPC 10.0%+TCA 5.0%、PPC 15.0%+TCA 7.5%）、用TUDCA增溶之PPC複合組成物（PPC 0.3125%+TUDCA 0.25%、PPC 0.625%+TUDCA 0.5%、PPC 1.25% +TUDCA 1.0%、PPC 2.5%+TUDCA 2.0%、PPC 5.0%+TUDCA 4.0%、PPC 7.5%+TUDCA 6.0%、PPC 10.0%+TUDCA 8.0%、PPC 15.0%+TUDCA 12.0%）、用DCA增溶之PPC複合組成物（PPC 2.5%+DCA 1.1%、PPC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 10.0%+DCA 4.4%）或用其他膽汁酸增溶之PPC複合組成物（PPC 5.0%+HDCA 2.5%、PPC 5.0%+UDCA 3.0%、PPC 5.0%+TDCA 2.5%、PPC 5.0%+GDCA 2.5%、PPC 5.0%+CDCA 2.5%、PPC 5.0%+CA 2.5%）。將細胞用PBS洗滌兩次，用MTT試劑（50 μl）處理，且在37℃下靜置2小時。在移除上清液之後，將MTT甲月朁晶體溶解於DMSO中，且使用微量盤讀取器在540 nm下量測吸光度。
因此，如圖7A至7D中所示，PPC單一組成物及PPC + GCA複合組成物展現類似的時間及濃度依賴性方式之脂肪細胞減少活性。且在相同濃度下，PPC + TCA組成物展示比PPC單一及PPC + GCA組成物更低之脂肪細胞減少效果。然而，用PPC + TUDCA組成物處理不降低脂肪細胞活力（圖7A至7D）。
另外，如圖7E中所示，在96小時時，PPC 5.0%單一組成物、PPC 5.0% + GCA 2.5%及PPC 15.0% + TCA 7.5%展示與DCA 1.0%單一組成物類似的脂肪細胞減少活性。亦即，具有與由FDA批准作為外貌改善細胞溶解劑的Kybella（DCA 1.0%）相同之脂肪細胞減少活性的製劑為PPC 5.0%單一組成物及PPC 5.0% + GCA 2.5%及更大之複合組成物。彼等測試組之間不存在統計顯著差異（圖7E）。
PPC單一組成物展示時間及濃度依賴性脂肪細胞減少效果，且PPC + GCA複合組成物在相同濃度下（此意謂具有相同PPC濃度之測試組）展示類似效果。相比之下，PPC + TCA在相同濃度下展示更低脂肪細胞減少效果，表明TCA抑制PPC之脂肪細胞減少效果。由於此，『PPC + TCA』調配物應在極高劑量下處理以實現類似於現有商業產品的效果之脂肪細胞減少效果。亦即，如圖7E中所示，為了獲得類似於現有製劑（諸如Kybella（DCA 1.0%））之效果的脂肪細胞減少效果，PPC + TCA製劑需要以PPC 15.0% + TCA 7.5%之水準施用。但，用TCA 7.5%增溶之PPC 15%組成物具有一問題，因具有20 cP或更大之高黏度而難以用30G注射針投予多劑量。總之，『PPC + TCA』製劑被視為就副作用而言具有一些優點。然而，考慮到產業經濟可行性及與高劑量投藥相關之其他額外問題，『PPC + GCA』製劑優於『PPC + TCA』製劑。
另外，發現用TUDCA增溶之PPC即使在高濃度下亦不具有脂肪細胞減少效果，在極高劑量下（PPC 15% + TUDCA 12%）情況亦如此。因此，觀測到TUDCA抑制脂肪細胞之細胞凋亡及降解。就此而言，已報導關於細胞之細胞凋亡受TUDCA抑制的研究（Andrew L.Rivard, Administration of Tauroursodeoxycholic acid reduced apoptosis following myocardial infarction in rat, The American Journal of Chinese Medicine, 第2卷, 279-295, 2007）。此等結果表明，PPC視增溶劑之選擇而對脂肪細胞減少具有不同效果，且可以不同方式對細胞之壞死及細胞凋亡起作用。
關於用GCA增溶之PPC複合組成物（PPC + GCA）（其較佳根據以上測試之結果選擇）及用DCA增溶之PPC複合組成物（PPC + DCA）（亦即現有商業產品），除PPC單一組成物本身之脂肪細胞減少活性以外，觀測選為增溶劑之GCA及DCA對脂肪細胞減少活性之效果。測試結果展示於圖7F至7H中。在96小時之後，單一PPC及PPC + GCA在相同濃度下（此意謂具有相同PPC濃度之測試組）展示類似脂肪細胞減少效果水準，但單一GCA展示比PPC + GCA更低之脂肪細胞減少效果。
PPC + DCA在相同濃度下與單一PPC相比展示更高脂肪細胞減少效果，且展示比單一DCA更高之脂肪細胞減少效果（圖7F至7H），但如以下測試實施例2-3中所示，該效果歸於細胞壞死（圖10A及10B）。另外，亦發現HDCA、UDCA、CDCA、TDCA、GDCA及CA（其為在以上測試實施例中（亦即在活體內皮下注射之後的水腫、病變及炎症測試中）已被發現毒性類似於DCA之其他膽汁酸）以誘導細胞壞死而非脂肪細胞之細胞凋亡及降解的方式具有減少脂肪細胞之效果，脂肪細胞之細胞凋亡及降解為PPC之固有機制（圖8D）。因此，此等種類之膽汁酸不為適合增溶劑，因為儘管脂肪細胞減少效果似乎略高，但其會導致疼痛、水腫及副作用。
製備穩定可注射之澄清混合PPC微胞所需的最小GCA與PPC之莫耳比（GCA/PPC）為0.76 mol/mol，且其需要12小時或更久之攪拌及2天之操作時間。出於此原因，增加GCA輸入之量可縮短製備時間。然而，過多劑量之添加劑可能會導致對脂肪細胞之細胞凋亡及降解的PPC固有藥理學活性以及安全性之負面效果，因此固定PPC濃度（5.0%）且增加GCA濃度（2.5%-8.75%）以觀測對脂肪細胞減少之效果。
因此，如圖7I中所示，當比較PPC 5.0%單一組成物及PPC + GCA複合組成物時，當GCA與PPC之莫耳比（GCA/PPC）為2.60 mol/mol（PPC 5.0% + GCA 7.50%）或更小時，測試組之間的脂肪細胞活力不存在統計顯著差異，且當GCA與PPC之莫耳比（GCA/PPC）為3.04 mol/mol（PPC 5.0% + GCA 8.75%）或更大時，實驗組之間的脂肪細胞活力存在統計顯著差異。亦即，當GCA/PPC莫耳比為3.04 mol/mol（PPC 5.0% + GCA 8.75%）或更大時，對PPC固有之正面活性又不良效果的可能性會增加。2-2 ： 在用膽汁 酸 增溶之 PPC 複合組成物的情況下脂肪細胞、纖維母細胞、骨胳肌肉細胞及血管內皮細胞活力之比較 _ 本發明之脂肪細胞特異性
根據先前報導，DCA組成物或用DCA增溶之PPC組成物已據報導會因不僅溶解脂肪細胞而且溶解纖維母細胞、骨胳肌肉細胞及血管內皮細胞而引起嚴重的臨床副作用。在此態樣中，評估本發明之PPC + GCA複合組成物之效果。
測試之特定方法及材料如下： 在分別用PPC複合組成物（PPC 5.0%+GCA 2.5%、PPC 5.0%+TCA 2.5%、PPC 5.0%+TUDCA 4.0%、PPC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+HDCA 2.5%、PPC 5.0%+UDCA 3.0%、PPC 5.0%+TDCA 2.5%、PPC 5.0%+GDCA 2.5%、PPC 5.0%+CDCA 2.5%或PPC 5.0%+CA 2.5%）處理3T3-L1脂肪細胞、正常纖維母細胞、骨胳肌肉細胞及內皮細胞之後72小時藉由MTT分析來量測細胞活力，且結果計算為與未經處理之對照組相比的活細胞總百分比。
將3T3-L1脂肪細胞（ATCC）在補充有10%胎牛血清、100單位/ml青黴素及100 μg/ml鏈黴素之杜爾貝科氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（Invitrogen）中在5% CO2
及37℃之條件下培養。使脂肪細胞分化繼續2或4天直至細胞匯合度達至100%，且在含有1 μg/ml胰島素、500 μM甲基-異丁基-黃嘌呤及250 nM地塞米松（dexamethasone）之DMEM培養基中誘導分化3天（分化前及分化後脂肪細胞展示於圖9A及9B中）。隨後，將培養基替換為含有1 μg/ml胰島素（Sigma）之DMEM培養基，且使培養基維持且每隔2至3天改變直至分化程度達至最大。若耗時超過7天，則使細胞保持在正常DMEM培養基中直至開始測試。在與處理測試材料一起培育72小時之後，將MTT溶液於PBS中稀釋至1 mg/ml，且添加50 μL MTT（Sigma）溶液至各培養基已被移除之孔。在於37℃及5% CO2
之條件下培育細胞3小時之後，移除MTT溶液。在藉由處理200 μL DMSO（Sigma）溶解之後，執行MTT分析（在570 nm下量測）。
將纖維母細胞（CCD-986sk，人類纖維母細胞，基於第2繼代）培養達至85%匯合度，且隨後移除培養基（IMDM、10% FBS、1%抗生素混合物）。在將測試材料混合及處理至新培養基中之後，在預定處理時間移除培養基且執行MTT分析（在570 nm下量測）。
將骨胳肌肉細胞（C2C12；小鼠肌細胞，基於第2繼代）培養達至80%匯合度，且隨後移除培養基（DMEM、10% FBS、1%抗生素混合物）。且將細胞於含有2%馬血清之DMEM中培養4天。細胞之細長形狀在80%或更大下觀測到，且將測試材料於新培養基中混合及處理，在預定處理時間移除培養基且執行MTT分析（在570 nm下量測）。
使血管內皮細胞（HUVEC：人類內皮，基於第3繼代）於用1%明膠塗佈之培養皿中在室溫下靜置1天。隨後，在於經塗佈之培養皿中培養達至80%匯合度之後，移除培養基（EGM-Plus、10% FBS、1%抗生素混合物）。在將測試材料於新培養基中混合及處理之後，在預定處理時間移除培養基且執行MTT分析（在570 nm下量測）。（注意：若細胞繼代至第6繼代或更多，則丟棄）。
作為觀測各種細胞之活力之結果，如圖8A至8D中所示，發現用GCA或TCA增溶之PPC複合組成物選擇性地僅減少脂肪細胞，不同於用DCA、UDCA、HDCA、CDCA、TDCA、GDCA或CA增溶之PPC複合組成物。此表明，當本發明之組成物PPC + GCA施用至實際的人時，其可僅特異性減少脂肪細胞而不會不利地影響脂肪細胞周圍之人類組織。2-3 ： 凋亡蛋白酶 3 活性分析
對測試材料執行凋亡蛋白酶3活性分析以確定MTT分析結果中之細胞死亡因壞死抑或細胞凋亡所致。凋亡蛋白酶3在細胞凋亡發生時特異性增加且為細胞凋亡之標記。根據製造商手冊使用來自Abcam之凋亡蛋白酶3分析套組（比色），且測試之方法如下：將3T3-L1脂肪細胞之1ⅹ105
個細胞分佈至各孔，且處理包含PPC 5.0%、PPC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+GCA 2.5%、PPC 5.0%+GCA 5.0%、DCA 1.0%、GCA 1.0%或GCA 5.0%之製劑及PBS，隨後在37℃下培育0-48小時。隨後將細胞用50 ul細胞溶解緩衝液（10 mM Tris-HCl、10 mM NaH2
PO4
/NaHPO4
，pH 7.5、130 mM NaCl、1% Triton X-100及10 mM焦磷酸鈉）處理，且在4℃下靜置10分鐘。藉由在1000×rpm下離心1分鐘收集上清液，且藉由BCA方法進行蛋白質定量。添加50 μl反應緩衝液（4 mM HEPES，pH 7.5、10%甘油、2 mM二硫蘇糖醇）及0.5 μl 4 mM DEVD-p-NA至各樣品，且使其在37℃下反應1小時。隨後，在405 nm下用光譜螢光量測術量測波長。
因此，如圖10A及10B中所示，PBS不誘導脂肪細胞中之凋亡蛋白酶-3活性。PPC單一組成物及PPC + GCA複合組成物展示相當大程度地誘導凋亡蛋白酶-3活性之時間依賴性效果。然而，PPC + DCA複合組成物與PPC或PPC + GCA相比抑制凋亡蛋白酶-3活性。有趣的為，DCA 1.0%展示一定的凋亡蛋白酶-3活性直至24小時，但在48小時之後，凋亡蛋白酶-3活性返回至處理前水準。此現象被視為因為在DCA單一組成物處理之後24小時才有細胞之細胞凋亡之作用，且隨後存在細胞藉由後續炎性反應變得壞死之反應。在GCA處理組中觀測到凋亡蛋白酶-3活性，但不存在時間或濃度依賴性變化。另一方面，據證實，凋亡蛋白酶-3活性在GCA + PPC複合製劑中以時間及濃度依賴性方式展示為較高。當PPC與DCA混合時，由PPC單一組成物誘導的凋亡蛋白酶-3之活性顯著降低。此等結果表明，PPC單一組成物之細胞凋亡特異性效果受DCA抑制，且添加有DCA之PPC製劑誘導更多脂肪細胞壞死，其與炎症及其類似者相關。2-4 ： 脂肪溶解分析
對測試材料執行甘油活性分析以確定MTT分析中之細胞死亡因壞死抑或脂肪溶解所致。甘油為在脂肪分解時增加之特定標記。根據製造商手冊使用Abcam脂肪溶解分析套組（比色），且測試之方法如下：將3T3-L1脂肪細胞之1ⅹ105
個細胞分佈至各孔，且處理包含PPC 5.0%、PPC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+GCA 2.5%、PPC 5.0%+GCA 5.0%、DCA 1.0%、GCA 1.0%或GCA 5.0%之製劑及PBS，隨後在37℃下培育0-48小時。且隨後誘導溶解。添加30 ul脂肪溶解分析緩衝液（137 mM NaCl、5 mM KCl、4.2 mM NaHCO3
、1.3 mM CaCl2
、0.5 mM KH2
PO4
、0.5 mM MgCl2
、0.5 mM MgSO4
、5 mM葡萄糖、20 mM Hepes（pH 7.4）、1% BSA、1 uM異丙基腎上腺素（Isoproterenol））至培養基，調節總體積至50 ul，且將其培育20分鐘。在向其中添加甘油分析複合物（50 μl）之後，將溶液在室溫下培育30分鐘。在OD 570下量測吸光度（使用用於絕對測定之標準曲線）。
因此，如圖10C及10D中所示，PBS不誘導脂肪細胞中之甘油分泌。在24小時時，除DCA 1.0%及PPC 5.0% + GCA 5.0%以外，測試材料類似地誘導甘油分泌。在48小時時，單一PPC、PPC + DCA、單一DCA及單一GCA組展示比24小時之活性略高的細胞溶解活性。詳言之，PPC + GCA組展示比PPC單一組成物高得多的細胞之細胞凋亡效果。測試實施例 3 ： 可注射製劑於由高脂飲食誘導之小鼠肥胖模型中的功效及副作用之評估 .
購得雄性C57BL/6小鼠（4週大）。持續12週提供高脂飲食（Research diet，60% kcal脂質）以使其高度肥胖。在此之後，將PPC之單一組成物（2.5%、5.0%、10.0%及15.0%）、PBS（陰性對照）、Isuprel（陽性對照）、DCA 1.0%及GCA 2.5%、以及PC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+HDCA 2.5%、PPC 5.0%+UDCA 3.0%、PPC 5.0%+TDCA 2.5、PPC 5.0%+GDCA 2.5%、PPC 5.0%+CDCA 2.5%、PPC 5.0%+CA 2.5%、PPC 5.0%+TUDCA 4.0%、PPC 5.0%+TCA 2.2%及PPC（2.5-10.0%）+GCA（1.25-5.0%）之複合組成物分別直接投予至由高脂飲食誘導之小鼠肥胖模型的腹股溝區域之脂肪組織（皮下脂肪組織）中，且觀測活體內脂肪減少。投予各測試材料一次。將0.2 ml各測試材料皮下注射至小鼠之腹股溝脂肪墊中。最終，在注射後8天處死小鼠。解剖被處死之小鼠之腹股溝脂肪墊，且將皮下脂肪快速移出且固定於4%甲醛溶液中。在固定之後，將脂肪墊洗滌並脫水，用石蠟溶液處理以製得石蠟塊，用蘇木精及伊紅染色，且用光學顯微鏡觀測。
首先，在注射PPC單一組成物之組織中，在2.5%至10%之濃度範圍下以濃度依賴性方式誘導脂肪細胞之細胞凋亡及降解，且脂肪組織中的脂肪細胞之大小減小。一些減小之脂肪細胞黏在一起，死亡細胞之區域透明，且脂肪細胞似乎因降解之脂肪細胞之融合而增大。在15.0%濃度下，不僅減少脂肪細胞，而且證實在脂肪細胞周圍出現巨噬細胞（圖11A）。
隨後，在由膽汁酸增溶之PPC複合組成物的情況下，明顯觀測到脂肪細胞之細胞凋亡，顯示較小脂肪細胞，且在注射用DCA、CDCA、HDCA、UDCA、GDCA、TDCA或CA增溶之PPC複合組成物之脂肪組織中的脂肪細胞周圍顯而易見巨噬細胞介導之吞噬作用。在注射Isuprel之脂肪組織（陰性對照組）中，脂肪細胞之大小減小，觀測到細胞之細胞凋亡之組態，且觀測到除脂肪細胞外之細胞的浸潤以清除細胞凋亡之細胞。在注射DCA單一組成物或用DCA增溶之PPC組成物之脂肪組織中，在投予組成物之部位誘導重度炎症，且細胞因壞死而溶解，且誘導顯著損傷。DCA單一組成物即使以1%之低濃度包含DCA亦展示重度炎症，且炎症誘導作用大於PPC單一組成物及PPC + GCA複合組成物之炎症誘導作用。相對地，注射PBS（陰性對照）或PPC 5.0% + TUDCA 4.0%之脂肪組織具有透明細胞膜界限及良好形成之細胞形狀，且在組織中僅由脂肪細胞組成。在注射PPC 5.0% + TCA 2.5%之脂肪組織中，脂肪細胞之大小整體減小，且在較小區域中觀測到除脂肪細胞外之細胞的浸潤以清除細胞凋亡之細胞。在注射本發明之PPC 5.0% + GCA 2.5%之脂肪組織中，不誘導炎症，脂肪細胞之大小減小，細胞凋亡之區域透明，且脂肪細胞似乎因降解之脂肪細胞之融合而增大（圖11B及11C）。
如圖11D中所示，作為檢驗本發明之PPC + GCA複合組成物在注射至大鼠脂肪墊中之後不僅對脂肪細胞而且對真皮及表皮之效果的結果，在PBS注射之後，真皮及表皮組織良好保留且不存在炎性細胞（諸如嗜中性球）。且脂肪組織中存在透明細胞膜界限及良好形成之細胞形狀，且脂肪組織僅由脂肪細胞組成。在注射PPC 5.0%單一組成物之後，真皮及表皮組織良好保留且不存在炎性細胞（諸如嗜中性球）。在脂肪組織中，脂肪細胞之大小減小，且一些細胞膜降解，且一些脂肪細胞似乎因降解之脂肪細胞之融合而增大。在注射PPC 2.5%+GCA 1.25%複合組成物之後，真皮及表皮組織良好保留且不存在炎性細胞（諸如嗜中性球）。在脂肪組織中，脂肪細胞之大小減小，且一些細胞膜降解，且一些脂肪細胞似乎因降解之脂肪細胞之融合而增大。在注射PPC 5.0%+GCA 2.5%複合組成物之後，真皮及表皮組織良好保留且不存在炎性細胞（諸如嗜中性球）。在脂肪組織中，脂肪細胞之大小減小，且細胞凋亡之區域透明，且一些脂肪細胞似乎因降解之脂肪細胞之融合而增大。在注射PPC 10.0%+GCA 5.0%複合組成物之後，真皮及表皮組織輕微損傷，且存在一些炎性細胞，且觀測到輕微水腫。在脂肪組織中，脂肪細胞之大小減小，且在細胞凋亡之區域中存在巨噬細胞之吞噬作用及因細胞凋亡所致之核酸碎片，且一些脂肪細胞似乎因降解之脂肪細胞之融合而增大。在注射GCA 2.5%單一組成物之後，真皮及表皮組織輕微損傷，且分散有炎性細胞（諸如嗜中性球及其類似細胞），因此明顯觀測到炎症。且脂肪組織中存在透明細胞膜界限及良好形成之細胞形狀，且脂肪組織僅由脂肪細胞組成。根據以上結果，據證實，當GCA單一組成物處理時比GCA及PPC複合製劑更顯著地誘導脂肪細胞、真皮及表皮上之炎性反應。
總之，在注射單一DCA或用DCA、HDCA、UDCA、CDCA、TDCA、GDCA或CA增溶之PPC複合組成物之脂肪組織中，在投藥部位誘導重度炎症，且細胞因壞死而溶解，且誘導顯著損傷。然而，在注射本發明之PPC + GCA複合組成物之脂肪組織中，脂肪細胞之大小減小，且細胞凋亡之區域透明。且一些脂肪細胞因降解之脂肪細胞之融合而變得更大。儘管輕微誘導濃度依賴性炎症，但呈現對脂肪細胞膜之損傷的形態特徵。測試實施例 4 ： 用 GCA 增溶之 PPC 可注射製劑之毒性的評估
藉由向米格魯犬單次皮下投藥，評估用GCA 2.8%增溶之PPC 5.0%可注射製劑之毒性效果。特定言之，檢查全部動物之紋身數目，且在到達時量測其一般狀況、體重及體溫。在到達之後的12天隔離及適應時間段期間，一天一次觀測一般症狀，一週一次量測體重，且在隔離及適應時間段結束時檢查動物之健康狀況。在終止隔離及適應時間段之後，基於體重分離一隻雄性及一隻雌性之對照組、及兩隻雄性及兩隻雌性之各測試組動物。測試動物為總共14隻米格魯犬（雄性：5-6個月，7.05-8.16 kg/雌性：5-6個月，5.83-7.14 kg），7隻雄性及7隻雌性犬，且基於投藥當天之體重計算對每隻個別動物之投藥劑量，且在投藥之前對頸背脫毛。將測試材料使用拋棄式注射器（10 ml，23G）皮下投予至頸背之左及右側中。測試組設定為低劑量組（劑量：PPC 90 mg/kg+GCA 50.4 mg/kg，注射量：1.8 ml/kg，最大注射量/部位：0.8 ml/部位）、中劑量組（劑量：PPC 180 mg/kg+GCA 100.8 mg/kg，注射量：3.6 ml/kg，最大注射量/部位：1.6 ml/部位）、高劑量組（劑量：PPC 360 mg/kg+GCA 201.6 mg/kg，注射量：7.2 ml/kg，最大注射量/部位：3.2 ml/部位）及對照組（生理鹽水，注射量：7.2 ml/kg，最大注射量/部位：3.2 ml/部位）。詳細測試結果描述如下。
1）存在或不存在死亡；在測試時間段期間，在全部測試及對照組中均未觀測到死亡。
2）一般症狀；在測試時間段期間，在全部測試及對照組中均未觀測到症狀。
3）體重變化；在測試時間段期間，在全部測試及對照組中均未觀測到異常變化。
4）剖檢；在全部測試及對照組中均未觀測到異常變化。
5）組織病理學檢查；在雄性及雌性高劑量組之皮下組織中觀測到極少至輕微程度之肉芽腫性炎症（參見圖12A至12C）。如上文所描述，僅在注射本發明之可注射製劑之高劑量組中觀測到極輕微炎症。然而，出於在向人類及其他動物投藥時設定適當劑量濃度之觀點，該炎症程度可被視為無副作用。測試實施例 5 ： 活體內疼痛之比較
藉由經由量測動物之移動距離及移動速度在活體內評估由DCA、GCA或PPC之單一組成物、以及用膽汁酸增溶之PPC複合組成物誘導的疼痛程度，獲得以下結果。在下文中，組成物之%意謂%（w/v）。
特定言之，在向小鼠爪注射100 ul單一組成物（DCA 1.0%、PPC 5.0%或GCA 2.5%）或複合組成物（PC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%HDCA 2.5%、PPC 5.0%+UDCA 3.0%、PPC 5.0%+TDCA 2.5%、PPC 5.0%+GDCA 2.5%、PPC 5.0%+CDCA 2.5%、PPC 5.0%+CA 2.5%、PPC 5.0%+GCA 2.5%、PPC 5.0%+TCA 2.5%或PPC 5.0%+TUDCA 4.0%）之後，觀測到水腫。在投藥之後2小時在水腫被證實為最大程度之後，使用Noldus Video Traking系統比較5分鐘之移動距離(cm)及移動速度（cm/s）。
如圖13A及13B中所示，PPC 5.0%單一組成物、PPC 5.0%+TUDCA 4.0%、PPC 5.0%+GCA 2.5%及PPC 5.0%+TCA 2.5%組之移動距離及移動速度不改變或輕微增大。另一方面，PC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+HDCA 2.5%、PPC 5.0%+UDCA 3.0%、PPC 5.0%+TDCA 2.5%、PPC 5.0%+GDCA 2.5%、PPC 5.0%+CDCA 2.5%及PPC 5.0%+CA 2.5%組之移動距離及移動速度減小約20%，且此等結果據判斷歸因於因疼痛所致之活性降低。此表明，與現有商業產品相比，本發明之可注射製劑引起顯著更少疼痛（實質上無痛）。測試實施例 6 ： 用 GCA 增溶之 PPC 組成物之臨床評估 6-1 ： 關於減脂功效之臨床評估
向具有局部頦下脂肪沈積之患者投予本發明之組成物之中的用GCA 2.8%增溶之PPC 5.0%可注射組成物。特定言之，在用9.6%利多卡因乳膏局部麻醉30分鐘或更久之後，向5 cc注射器裝載13 mm 30G注射針，且將組成物以4週時間間隔注射6次至頦下脂肪中（總共50個點，每個點0.2 cc且總共10 ml，1.0 cm間隔，且深度為6-8 mm）。在12週之後，評估標準臨床像片、電腦斷層攝影（computed tomography，CT）成像、研究者報導之改善、個體報導之改善及個體之滿意。
在最終投藥之前及之後12週獲取臨床像片，且在以下條件下對個體之前端、左側透視圖、右側透視圖及左側面及右側面攝影：在前端像片中，個體以Frankfort水平面水平之姿勢凝視攝影機，該水平面為個體之兩耳之耳屏點及眼眶齶之最低部分相接之平面。在透視圖像片中，在使個體身體轉動45度之後，個體以如下姿勢凝視攝影機，其中面部被安置以便與鼻尖及眼球邊緣成直線，且Frankfort水平面水平。在側面像片中，使個體身體自前端位置旋轉90度以便與鼻尖及頦成直線。此時，據證實，相對的眉毛不可見，且姿勢正確，使得身體不向側面傾斜、彎曲或伸展。且隨後個體以如下姿勢凝視攝影機，其中將連接個體之背部與頭部後面的線調節為垂直，且Frankfort水平面水平。用於攝影之攝影機為具有60 mm短焦鏡頭之Nikon DSLR攝影機D5200。
在最後一次投藥之前及之後12週獲取CT影像，且量測頦下脂肪之厚度及面積。個體根據通知在穿戴規定上衣及頭帶之後舒適地躺下時進行吞咽唾液。
在最後投藥之前及之後12週獲取CT影像，且量測頦下脂肪之厚度及面積。個體根據通知在穿戴規定上衣及頭帶之後舒適地躺下時禁止吞咽唾液。此時，CT成像之枕頭為頸（NECK）型，且使個體之頭部固定至通過前額、鼻、頦及鎖骨中間之雷射導引線。CT成像之成像參數為掃描範圍（自耳道至鎖骨底部）、切片（5.0 mm）、皮膚之FOV、矩陣大小512×512、旋轉時間0.5秒及光束準直64×0.6 mm。裝置來自GE Medical systems，且使用來自Infinity之Xelis 1.0 6.0 BN 6 3D分析影像。
本發明之可注射組成物之臨床功效充分展示於圖16A及16B中。圖14A為展示個體在投藥之前及在最終投藥之後12週的臨床影像之像片，其中以每個點0.2 cc之劑量、總共50個點、總共10 ml以4週時間間隔向個體投予6次本發明之用GCA增溶之PPC複合組成物，且即使用裸眼亦觀測到頦下脂肪之減少。個體報導之滿意水準為5名中之4名，且在比較投藥之前的影像之後評估之改善為1.5級。有趣的為，個體為先前已接受用DCNa增溶之PPC可注射組成物（以Lipobean i.v.形式市售）之患者，且個體描述一重大驚喜：本發明之組成物在投藥時、緊接在投藥之後及隨時間推移為無痛的。
另外，圖14B經由CT展示對局部沈積之脂肪減少之量的定量評估之結果。位於CT矢狀面之下頜端點下方3 cm、通過中間頦的頸闊肌前頦下脂肪之厚度減小30.36%，自投藥之前的5.6 mm減小為在12週最終投藥之後的3.9 mm。6-2 ： 關於疼痛、水腫及副作用之臨床評估
在投予本發明之用GCA增溶之PPC可注射組成物之後，對已接受用DCA增溶之PPC可注射組成物（先前商業化）的六名男性及女性患者進行疼痛、水腫及副作用之臨床評估。特定言之，在用9.6%利多卡因乳膏局部麻醉30分鐘或更久之後，向用裝載有13 mm 30G注射針之注射器於腹部及肋部中（1.5 cm間隔，10-12 mm深度，每個點0.5 cc，及每次投藥總共50 ml至100 ml）或於頦下脂肪中（1.0 cm間隔，6-8 mm深度，每個點0.2 cc，及每次投予總共10 ml）已接受Lipobean i.v.（5 ml）用可注射鹽水溶液（5 ml）以1:1之比率稀釋的10 ml組成物（亦即PPC 2.5%+DCNa 1.2%）之個體，用相同投藥方法投予10 ml本發明之組成物（用GCA 2.8%增溶之PPC 5.0%可注射製劑（GCA與PPC之莫耳比為0.97）或用GCA 4.0%增溶之PPC 5.0%可注射製劑（GCA與PPC之莫耳比為1.39））。在投藥之後，向個體給出問卷、10 cm尺及藍色油筆用於視覺模擬量表（Visual Analogue Scale，VAS）疼痛評估，且在投藥時、在投藥之後1、3、7及10天評估疼痛、水腫、腫脹、血腫、瘀傷、紅斑、感覺缺失、硬結、感覺異常、結節及搔癢。藉由使用10 cm尺及行星筆（planetary pen）以10 cm長之線在左端記錄無痛且在右端記錄可想像之最嚴重疼痛，評估疼痛。在水腫及腫脹之情況下，在看著鏡子的同時使用10 cm尺按壓投藥部位及其他部位之後，個體記錄為0.無、1.輕度（2 mm或更小）、2.中度（2-4 mm）、3.重度（4-6 mm）及4.極其嚴重（6-8 mm）。在血腫、瘀傷及紅斑之情況下，個體藉由與所附實例影像相比較將程度記錄為0.無、1.輕度、2.中度、3.重度及4.極其嚴重。在作為主觀症狀的感覺缺失、硬結、感覺異常、結節及搔癢之情況下，在按壓整個投藥部位之後，個體將程度記錄為0.無、1.輕度、2.中度、3.重度及4.極其嚴重。
如圖15（圖15C）及圖16中所示，已接受用DCNa增溶之PPC可注射組成物之投予的個體尤其在投藥時及在投藥之後10天主訴疼痛及水腫，且個體報導皮膚病變，諸如紅斑、血腫及瘀傷，及局部不良事件，諸如硬結、結節、搔癢及灼燒感。然而，令人驚訝地，接受本發明之用GCA增溶之PPC可注射製劑的投予之個體尤其展示輕度水準（亦即幾乎不存在）疼痛（圖15A）及水腫（圖15B）。詳言之，如圖15A中所示，極不尋常地，本發明之PPC + GCA複合組成物即使在注射時亦幾乎無痛。全面考慮如下事實：為習知製劑且用作比較實施例的用DCNa（DCA之鈉鹽）增溶之PPC可注射製劑具有與本發明之組成物類似的粒子特性（微胞、粒度等），且彼等可注射製劑在類似於人體之pH下投予，本發明之組成物之該效果為難以自先前已知的技術預測之獨特效果。
另外，如圖16中所示，除由注射針本身所引起之瘀傷或由注射時的血管損傷所引起之血腫以外，由測試材料所引起之血腫及紅斑在投予本發明之組成物之後減輕至無或輕度水準。特定言之，如圖15C中所示，不存在如下之副作用，神經損傷，諸如感覺缺失、廣泛腫脹、由藥物所引起之血腫、瘀傷、紅斑、硬結、感覺異常、結節、搔癢、灼燒感（溫覺（warmth））、吞咽困難及其類似者。考慮到活體內、試管內及單劑量毒性之測試結果，用GCA增溶之PPC組成物的脂肪細胞之細胞凋亡及脂肪降解效果可以安全性及高功效臨床展現於人類中。產業利用性
如上文所描述，本發明係關於一種適用於使用醫藥學上活性之磷脂醯膽鹼無痛、無水腫且無副作用地以非外科方式減少具有局部脂肪沈積之個體中之脂肪的組成物；及一種用於製備其之方法。更特定言之，一種以減輕的疼痛及副作用（尤其除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死；水腫；投藥部位感覺缺失；廣泛腫脹；紅斑；硬結；感覺異常；結節；搔癢；灼燒感；神經損傷；或吞咽困難）減少局部脂肪之組成物及製劑，該組成物包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內；一種包含其之套組；一種製備其之方法；及一種使用該組成物或製劑以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除局部脂肪沈積之方法。
去氧膽酸（DCA）之單一組成物或磷脂醯膽鹼（PPC）及去氧膽酸（DCA）之複合組成物（用於減少局部脂肪之習知可注射製劑）據報導會誘導由脂肪細胞之壞死以及纖維母細胞、內皮細胞及骨胳肌肉細胞之細胞溶解所引起之副作用，諸如感覺缺失、廣泛腫脹、由藥物所引起之血腫、瘀傷、紅斑、硬結、感覺異常、結節、搔癢、灼燒感（溫覺）、吞咽困難及其類似者。然而，因為本發明之減少局部脂肪之可注射製劑藉由選擇性地誘導僅脂肪細胞之脂肪溶解及細胞凋亡而減少局部脂肪，所以本發明之組成物不僅展示減少脂肪細胞之顯著效果，而且展現可顯著減輕伴隨著習知細胞溶解可注射組成物之疼痛及副作用。因而，個體之藥物順應性顯著提高，且最終，想要減少局部脂肪的個體之生活品質得以提高。因此，產業利用性較高。
無
圖1A及1B展示未添加增溶劑之PPC用攪拌器及高壓均質機分散的一系列影像。圖1A展示組成物之影像，其中影像係緊接在添加僅5%（w/v）PPC至注射用水隨後用攪拌器攪拌72小時之後獲得，及在最終攪拌之後1天獲得。圖1B展示組成物之影像，其中影像係緊接在添加各種濃度（自左向右為0.625%（w/v）、1.25%（w/v）、2.5%（w/v）、5.0%（w/v）、7.5%（w/v）、10.0%（w/v））之PPC至注射用水隨後攪拌1小時且在高壓均質機中分散之後獲得，及在製備組成物之後7天及30天獲得。
圖2A至2J展示用各種濃度之DCA、GCA、TCA、CA、CDCA、UDCA、GDCA、TDCA、HDCA及TUDCA增溶之PPC 5.0%組成物的一系列影像，展示調配穩定性，其中影像係緊接在製備組成物之後及製備之後30天獲得。
圖2A展示調配物性質×去氧膽酸（DCA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖2B展示調配物性質×甘膽酸（GCA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖2C展示調配物性質×牛膽酸（TCA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖2D展示調配物性質×膽酸（CA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖2E展示調配物性質×鵝去氧膽酸（CDCA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖2F展示調配物性質×熊去氧膽酸（UDCA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖2G展示調配物性質×甘去氧膽酸（GDCA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖2H展示調配物性質×牛去氧膽酸（TDCA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖2I展示調配物性質×豬去氧膽酸（HDCA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖2J展示調配物性質×牛熊去氧膽酸（TUDCA）以PPC 5%（w/v）計之濃度%（w/v）。
圖3A及3B展示無法增溶PPC之膽汁酸之一實例及用各種濃度之GCA增溶之複合PPC製劑的描述。圖3A展示用石膽酸（LCA）增溶之PPC複合組成物之一影像，且不可能製備混合微胞。圖3B展示用去氫膽酸（DHCA）增溶之PPC複合組成物之一影像，且不可能製備穩定混合微胞。
圖4A至4Q示出展示水腫測試之結果之圖，其中水腫水準（大鼠爪之厚度（mm））係緊接在注射0.1 ml單一PPC組成物、各種膽汁鹽（DCA、HDCA、UDCA、TDCA、GDCA、CDCA、CA、GCA、TCA及TUDCA）之單一組成物、用膽汁酸（DCA、GCA、TCA等）增溶之各種濃度之PPC的複合組成物及PBS（大鼠爪厚度（mm））至大鼠爪之後量測及在注射之後1小時及2小時量測。測試對每個處理重複4次且藉由測徑規進行。在下文中，%係指%（w/v）。
圖4A展示在注射各種濃度之PPC單一組成物（1.25-15.0%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4B展示在注射各種濃度之DCA單一組成物（1.0-7.5%之後的水腫之比較結果。
圖4C展示在注射各種濃度之HDCA單一組成物（1.0-7.5%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4D展示在注射各種濃度之UDCA單一組成物（1.0-7.5%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4E展示在注射各種濃度之TDCA單一組成物（1.0-7.5%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4F展示在注射各種濃度之GDCA單一組成物（1.0-7.5%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4G展示在注射各種濃度之CDCA單一組成物（1.0-7.5%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4H展示在注射各種濃度之CA單一組成物（1.0-7.5%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4I展示在注射各種濃度之GCA單一組成物（1.0-7.5%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4J展示在注射各種濃度之TCA單一組成物（1.0-7.5%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4K展示在注射各種濃度之TUDCA單一組成物（1.0-7.5%）及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4L展示在注射PPC 5.0%單一組成物及增溶PPC所需之濃度（典型地約2.5%，但對於UDCD 3%且對於TUDCA 4%為恰當的）的膽汁鹽之單一組成物之後2小時的水腫之比較結果。
圖4M展示在注射增溶PPC所需之濃度的膽汁酸之單一組成物及用以上各別膽汁酸增溶之PPC 5.0%之複合組成物之後2小時的水腫之比較結果。
圖4N展示在注射用各種濃度之GCA（1.25-7.5%）增溶之PPC（2.5%-15.0%）的複合組成物及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4O展示在注射用各種濃度之TCA（1.25-7.5%）增溶之PPC（2.5%-15.0%）的複合組成物及DCA 1%單一組成物之後的水腫之比較結果。
圖4P展示在注射用各種濃度之GCA（2.5-25%）增溶之PPC 5.0%的複合組成物之後的水腫之比較結果。
圖4Q展示在注射用各種濃度之TCA（2.5-25%）增溶之PPC 5.0%的複合組成物之後的水腫之比較結果。
圖5A至5F展示投藥部位之一系列影像，其中影像係在注射1.0 ml PPC（1.25-15.0%）單一組成物及PBS（圖5A）、1.0-7.5%濃度之各種類型的膽汁鹽（DCA、HDCA、UDCA、TDCA、GDCA、CDCA、CA、GCA、TCA及TUDCA）之單一組成物（圖5B及5C）、用各種種類之膽汁鹽增溶之PPC 5.0%複合組成物（圖5D）、用GCA（1.25-7.5%）增溶之PPC（2.5-15.0%）複合組成物（圖5E）或用GCA（2.5-20.0%）增溶之PPC（5.0%）複合組成物（圖5F）至大鼠爪之後2小時獲取。爪影像係使用4×4 cm刻度獲取。
圖6A至6F展示組織學測試之一系列影像。在注射1.0 ml PPC（1.25-15.0%）單一組成物及PBS（圖6A）、1.0-7.5%濃度之各種種類的膽汁鹽（DCA、HDCA、UDCA、TDCA、GDCA、CDCA、CA、GCA、TCA及TUDCA）之單一組成物（圖6B及6C）、用各種種類之膽汁鹽增溶之PPC 5.0%複合組成物（圖6D）、用GCA（1.25-7.5%）增溶之PPC（2.5-15.0%）複合組成物（圖6E）或用GCA（2.5-20.0%）增溶之PPC（5.0%）複合組成物（圖6F）之後3小時，處死大鼠。將注射區域切割，用10%福馬林固定，且隨後使用光學顯微鏡進行組織學檢查。H & E染色展現經處理爪之炎症（200×放大率）。
圖7A至7I展示展現用測試材料處理的3T3-L1脂肪細胞之活力降低之一系列影像。脂肪細胞活力藉由溴化3-(4,5-二甲基噻唑（dimethyltazol）-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓（MTT）分析來量測。實驗對每個處理重複3次，且結果表示為相對於未經處理之對照的活細胞總百分比。在PPC（0.3125-15.0%）單一組成物、用TUDCA（0.25-12.0%）增溶之PPC（0.3125-15.0%）複合組成物、用TCA（0.1563-7.5%）增溶之PPC（0.3125-15.0%）複合組成物或用GCA（0.1563-7.5%）增溶之PPC（0.3125-15.0%）複合組成物對分化之3T3-L1脂肪細胞處理之後24小時（圖7A）、48小時（圖7B）、72小時（圖7C）及96小時（圖7D），量測脂肪細胞活力。
圖7E展示展現脂肪細胞在DCA（1.0%）及PPC（5.0%）作為單一組成物、以及PPC（5.0%）+GCA（2.5%）、PPC（5.0-15.0%）+TCA（2.5-7.5%）及PPC（5.0-15.0%）+TUDCA（4.0-12.0%）作為複合組成物的處理之後96小時的活力之圖。
圖7F至7H展示展現脂肪細胞在PPC（2.5-10.0%）、DCA（1.1-4.4%）及GCA（1.25-5.0%）作為單一組成物、以及PPC（2.5-10.0%）+GCA（1.25-5.0%）及PPC（2.5-10.0%）+DCA（1.1-4.4%）作為複合組成物的處理之後96小時的活力之圖。
圖7I展示展現脂肪細胞在PPC（5.0%）單一組成物及用各種濃度之GCA（2.5-8.75%）增溶之PPC（5.0%）複合組成物的處理之後96小時的活力之圖。
圖8A至8D展示展現用PPC 5.0%單一組成物及用膽汁酸增溶之PPC複合組成物（PPC 5.0%+GCA 2.5%、PPC 5.0%+TCA 2.5%、PPC 5.0%+TUDCA 4.0%、PPC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+HDCA 2.5%、PPC 5.0%+UDCA 3.0%、PPC 5.0%+TDCA 2.5%、PPC 5.0%+GDCA 2.5%、PPC 5.0%+CDCA 2.5%及PPC 5.0%+CA 2.5%）處理的骨胳肌肉細胞（圖8A）、正常纖維母細胞（圖8B）、血管內皮細胞（圖8C）及3T3-L1脂肪細胞（圖8D）之活力降低之一系列影像。細胞活力藉由溴化3-(4,5-二甲基噻唑（dimethyltazol）-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓（MTT）分析來量測。實驗對每個處理重複3次，且結果表示為相對於未經處理之對照的活細胞總百分比。
圖9A及9B展示在3T3-L1脂肪細胞分化之前（圖9A）及之後（圖9B）的狀態。使用分化培養基誘導3T3-L1前驅脂肪細胞（左側影像）之分化。使用油紅染色法對分化之脂肪細胞（右側影像）染色且用200×放大率染色。
圖10A至10D展示展現如下結果之一系列影像，經由凋亡蛋白酶3活性分析可知本發明之可注射組成物特異性具有細胞凋亡效果，而非使脂肪細胞壞死；且經由量測甘油釋放可知其具有脂肪溶解效果。
圖10A及10B展示凋亡蛋白酶3活性之結果。將3T3-L1脂肪細胞以1×105
個細胞塗於各孔中，且將含有PPC 5.0%、PPC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+GCA 2.5%、PPC 5.0%+GCA 5.0%、DCA 1.0%或GCA（1.0-5.0%）之製劑及PBS對照在37℃下培育0-48小時（重複3次）。隨後，在24小時（圖10A）及48小時（圖10B）之後用分光光度計在405 nm之波長下量測結果。
圖10C及10D展示甘油釋放之結果。各測試材料之處理以與圖10A及10B中相同之方式進行。將經材料處理之脂肪細胞在37℃下培養0-48小時以誘導脂肪溶解。在室溫下培育30分鐘之後，用分光光度計量測OD570（重複3次）。
圖11A至11D展示展現在來自被投予測試材料之小鼠之脂肪墊中觀測到的組織學變化之影像。圖11A展示注射PPC（2.5-15.0%）單一組成物之結果。
圖11B展示注射PBS、Isuprel或DCA 1.0%作為單一組成物、以及PPC 5.0%+DCA 2.2%、PPC 5.0%+CDCA 2.5%、PPC 5.0%+HDCA 2.5%或PPC 5.0%+UDCA 3.0%作為複合組成物之結果。
圖11C展示注射PPC 5.0%+GDCA 2.5%、PPC 5.0%+TDCA 2.5%、PPC 5.0%+CA 2.5%、PPC 5.0%+GCA 2.5%、PPC 5.0%+TCA 2.5%或PPC 5.0%+TUDCA 4.0%作為複合組成物之結果。
圖11D展示注射PBS、PPC 5.0%或GCA 2.5%作為單一組成物、以及PPC（2.5-10.0%）+GCA（1.25-5.0%）作為複合組成物之結果。
在注射之後，切開投藥部位之脂肪組織。將切開之組織用甲醛固定、浸漬至石蠟塊中，且隨後在載玻片上碎片化。藉由H&E染色觀測組織壞死、細胞凋亡及降解。
圖12A至12C展示單劑量皮下投予PPC + GCA複合組成物至米格魯犬以便觀測毒性反應之結果之影像。在投藥14天之後，執行剖檢以進行組織病理學檢查，且在H&E染色之後獲取影像。
對於米格魯雌性及雄性，圖12A展示低劑量投藥組（PPC（90 mg/kg）+GCA（50.4 mg/kg）複合組成物）之結果，圖12B展示中劑量投藥組（PPC（180 mg/kg）+GCA（100.8 mg/kg）複合組成物）之結果，且圖12C展示高劑量投藥組（PPC（360 mg/kg）+GCA（201.6 mg/kg）複合組成物）之結果。
圖13A及13B展示藉由量測實驗動物之移動距離（cm）及移動速度（cm/s）評估活體內疼痛誘導程度之結果。特定言之，將100 μl各測試材料注射至大鼠爪底板中，且觀測水腫。因此，據證實，在注射之後2小時觀測到最嚴重水腫，且此時間點設定為最大疼痛。經由距離及時間比較注射測試材料之前及之後的移動。使用Noldus Video Traking系統來量測注射之前及之後的移動，且用移動距離（圖13A）及移動速度（圖13B）進行比較。
圖14A及14B展示接受本發明之用GCA增溶之PPC複合組成物的個體中之頦下脂肪減少之功效結果。在用9.6%利多卡因軟膏使投藥部位（頦下）局部感覺缺失之後，以4週時間間隔注射6次10 ml PPC 5.0%+GCA 2.8%複合可注射組成物（PPC 500 mg + GCA 280 mg）至頦下脂肪中（總共50個點，每個點0.2 cc，1.0 cm間隔，6-8 mm深度，且使用30 G 13 mm注射針）。在12週之後，獲取系列影像。圖14A為藉由標準臨床攝影方法獲取之影像，且圖14B為在CT上展示頦下脂肪厚度減小之系列影像。
圖15A至15C展示比較在向已經歷用DCA增溶之PPC可注射組成物之注射的6名個體投予用GCA增溶之PPC複合組成物之後的疼痛、水腫及有害實例之結果。測試材料為Lipobean i.v.（PPC 50.0 mg+DCNa 24.0 mg於1 ml中）用可注射0.9%鹽水溶液以1:1之比率稀釋的10 ml溶液（亦即PPC 25.0 mg+DCNa 12.0 mg）；10 ml用GCA 2.8%增溶之PPC 5.0%（PPC 50.0 mg+GCA 28.0 mg於1 ml中）；及10 ml用GCA 4.0%增溶之PPC 5.0%（PPC 50.0 mg+GCA 40.0 mg於1 ml中）。將各測試材料注射至頦下脂肪中（總共50個點，每個點0.2 cc，1.0 cm間隔，6-8 mm深度，及30 G 13 mm注射針），且在投予各材料之後1、3、7及10天時執行問卷調查。
圖15A展示用100 mm疼痛VAS量測之疼痛程度，圖15B展示根據水腫等級量表（0：無-0 mm，1：輕度-2 mm，2：中度-4 mm，3：重度-6 mm，4：極其嚴重-8 mm）之水腫程度，且圖15C展示投藥部位之5個等級（0：不存在，1：輕度，2：中度，3：重度，4：極其嚴重）的包括廣泛腫脹、血腫、瘀傷、紅斑、結節及搔癢之有害實例。
圖16展示比較在投予Lipobean i.v.（PPC 50.0 mg+DCNa 24.0 mg於1 ml中）用可注射0.9%鹽水溶液以1:1之比率稀釋的溶液（亦即PPC 25.0 mg+DCNa 12.0 mg於1 ml溶液中）或用GCA增溶之PPC複合組成物（PPC 50.0 mg+GCA 40 mg於1 ml中）之後的皮膚病變（紅斑、瘀傷及血腫）之影像。在用9.6%利多卡因軟膏使投藥部位（頦下面）局部感覺缺失30分鐘之後，將50 ml各測試材料投予至肋部之皮下脂肪層中（總共100個點，每個點0.5 cc，1.5 cm間隔，10-12 mm深度，且使用30 G 13 mm注射針）。在投藥之後2天獲取影像。在用DCA增溶之PPC可注射製劑之投予部位，沿藥物分散區域觀測皮膚病變，諸如紅斑、瘀傷及血腫。然而，本發明之用GCA增溶之PPC複合可注射製劑僅顯示由針侵入所引起之血腫及瘀傷。
Claims (42)
- 一種具有減輕的疼痛及副作用的用於減少局部脂肪之組成物，該組成物包含： （i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者， 其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
- 如請求項1所述之組成物，其中該副作用為選自由以下組成之群的至少一者：除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死；水腫；投藥部位感覺缺失；廣泛腫脹；紅斑；硬結；感覺異常；結節（nodule）；搔癢；灼燒感；神經損傷；及吞咽困難。
- 如請求項1所述之組成物，其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至2.6的範圍內。
- 如請求項1所述之組成物，其中該磷脂醯膽鹼以0.625至15%（w/v）之濃度包含於該組成物中。
- 如請求項4所述之組成物，其中該磷脂醯膽鹼以1.25至12.5%（w/v）之濃度包含於該組成物中。
- 如請求項1所述之組成物，其中該鹽為鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。
- 如請求項1所述之組成物，其中該組成物進一步包含選自由以下組成之群的至少一者：防腐劑；等張劑；及pH調節劑。
- 如請求項1所述之組成物，其中該組成物用於以非外科方式移除個體中之局部脂肪沈積。
- 如請求項1所述之組成物，其中該組成物為可注射組成物。
- 如請求項1所述之組成物，其中該組成物特異性誘導脂肪細胞之細胞凋亡及脂肪溶解。
- 一種以減輕的疼痛及副作用移除個體中之局部脂肪沈積之製劑，該製劑包含： （i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者， 其中該製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
- 如請求項11所述之製劑，其中該製劑用於以非外科方式移除個體中之局部脂肪沈積。
- 如請求項11所述之製劑，其中該磷脂醯膽鹼以0.625至15%（w/v）之濃度包含於該總製劑中。
- 如請求項11所述之製劑，其中該製劑之pH在6.8至7.8的範圍內。
- 如請求項11所述之製劑，其中該製劑進一步包含選自由以下組成之群的至少一者：防腐劑；等張劑；及pH調節劑。
- 如請求項11所述之製劑，其中該製劑為可注射製劑。
- 一種套組，其包含： （I）第一容器，其包含具有減輕的疼痛及副作用的用於移除局部脂肪沈積之組成物或製劑，該組成物或製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該組成物或製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內；以及 （II）能夠將該組成物或製劑遞送至脂肪沈積部位之遞送裝置。
- 如請求項17所述之套組，其中該組成物或製劑用於以非外科方式移除個體中之局部脂肪沈積。
- 如請求項17所述之套組，其中該組成物或製劑以可注射調配物形式提供。
- 如請求項17所述之套組，其中該遞送裝置預裝載有該組成物或製劑之可注射調配物。
- 如請求項17所述之套組，其中該組成物或製劑包含以該組成物或製劑計0.625至15%（w/v）之濃度之磷脂醯膽鹼。
- 如請求項17所述之套組，其中該組成物或製劑進一步包含選自由以下組成之群的至少一者：防腐劑；等張劑；及pH調節劑。
- 如請求項17所述之套組，其中該套組包含關於使用該具有減輕的疼痛及副作用的移除個體中之局部脂肪沈積之組成物或製劑的書面描述。
- 一種套組，其包含： （I）第一容器，其包含具有減輕的疼痛及副作用的用於移除局部脂肪沈積之組成物或製劑，該組成物或製劑包含：（i）磷脂醯膽鹼；及 （ii）選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者，其中該選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者是以與該磷脂醯膽鹼相同或更小之重量被包含；以及 （II）能夠將該組成物或製劑遞送至脂肪沈積部位之遞送裝置。
- 一種製備具有減輕的疼痛及副作用的用於減少局部脂肪之可注射組成物之方法，該方法包含以下步驟： （a）添加選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者至注射用水，隨後在攪拌的同時溶解以獲得澄清混合物； （b）添加防腐劑，隨後攪拌； （c）添加磷脂醯膽鹼，隨後在室溫下攪拌；及 （d）用水調節該組成物之總體積，隨後攪拌， 其中該選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者與該磷脂醯膽鹼之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
- 如請求項25所述之方法，其中該磷脂醯膽鹼以該組成物計以0.625至15%（w/v）之濃度被包含。
- 如請求項25所述之方法，其中該選自由甘膽酸（GCA）、牛膽酸（TCA）及其鹽組成之群的至少一者與該磷脂醯膽鹼之莫耳比在0.7至2.6的範圍內。
- 如請求項25所述之方法，其中該防腐劑為苯甲醇。
- 如請求項25所述之方法，其中該步驟（b）進一步包含添加等張劑。
- 如請求項25所述之方法，其中該組成物特異性誘導脂肪細胞之細胞凋亡及脂肪溶解。
- 一種用於製備具有減輕的疼痛及副作用的用於以非外科方式移除局部脂肪沈積之醫藥組成物之方法，該方法包含添加磷脂醯膽鹼以及選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者， 其中該選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者以與該磷脂醯膽鹼相同或更小之重量添加。
- 如請求項31所述之方法，其中該磷脂醯膽鹼以該組成物計以0.625至15%（w/v）之濃度被包含。
- 如請求項31所述之方法，其中該組成物進一步包含選自由以下組成之群的至少一者：防腐劑；等張劑；及pH調節劑。
- 一種於個體中以減輕的疼痛及副作用移除局部脂肪沈積之方法，該方法包含向該具有局部脂肪沈積之個體投予有效量之磷脂醯膽鹼；及至少一種選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的磷脂醯膽鹼增溶劑。
- 如請求項34所述之方法，其中該磷脂醯膽鹼增溶劑與該磷脂醯膽鹼之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
- 如請求項34所述之方法，其中以非外科方式移除該局部脂肪沈積。
- 如請求項34所述之方法，其中該副作用為選自由以下組成之群的至少一者：水腫；除脂肪細胞外之肌肉細胞、纖維母細胞及血管內皮細胞壞死；投藥部位感覺缺失；廣泛腫脹；紅斑；硬結；感覺異常；結節；搔癢；灼燒感；神經損傷；及吞咽困難。
- 如請求項34所述之方法，其中該投藥步驟包含皮下注射。
- 一種在具有局部脂肪沈積之個體中以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除局部脂肪沈積的方法，該方法包含向該具有局部脂肪沈積之個體投予包含以下之製劑：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者。
- 如請求項39所述之方法，其中該製劑中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
- 如請求項39所述之方法，其中該製劑呈可注射組成物之形式。
- 一種在個體中以減輕的疼痛及副作用以非外科方式移除局部脂肪沈積之方法，該方法包含向具有局部脂肪沈積之個體投予包含以下之製劑：（i）磷脂醯膽鹼；及（ii）選自由甘膽酸、牛膽酸及其鹽組成之群的至少一者， 其中該組成物中（ii）比（i）之莫耳比在0.7至3.0的範圍內。
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