TW201923346A

TW201923346A - 檢測或抑制細胞外游離mg53的方法和用途

Info

Publication number: TW201923346A
Application number: TW107138745A
Authority: TW
Inventors: 瑞平肖; 張岩; 呂鳳祥
Original assignee: 北京大學
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2019-06-16
Also published as: CN109932509B; WO2019085804A1; CN109932509A

Abstract

本申請案關於一種用於檢測MG53相關疾病或預測MG53相關疾病的風險的方法，該方法包括以下步驟：a.獲得待測樣品；和b.檢測在所述待測樣品中的細胞外游離MG53。本申請案還關於一種用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53活性的方法，該方法包括向需要其的個體施用有效量的MG53抑制劑。此外，本申請案還關於一種MG53抗體或其抗原結合片段，編碼該等抗體或其抗原結合片段的核酸，包括該等核酸的殖株或表達載體，包括該等殖株或表達載體的宿主細胞，以及包括上述各產品的藥物組合物。再者，本申請案還關於一種用於檢測細胞外游離MG53的檢測試劑及其用途以及MG53抑制劑在製備用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53的藥物中的用途。

Description

檢測或抑制細胞外游離MG53的方法和用途

本申請案關於生物醫藥領域，具體地，本申請案關於一種用於檢測細胞外游離MG53、或者檢測相關疾病或預測MG53相關疾病的風險的方法和一種用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53活性的方法，以及用於所述方法的組合物。

Mitsugumin 53(MG53)又稱為TRIM72，是三結構域蛋白（Tripartite motif-containing Proteins, TRIM）家族中的一員。MG53由N端的TRIM結構域和C端的SPRY結構域組成，TRIM結構域由依次相連的Ring、B-box、coiled-coil結構域組成（參見Chuanxi Cai et al.,the Journal of Biological Chemistry , Vol. 284 (5), 3314-3322 (2009)）。MG53主要表達在橫紋肌中，對於骨骼肌和心臟甚至整個機體的穩態維持發揮著重要作用。之前發現，MG53具有細胞修復功能和心臟保護功能（參見，例如，Chuanxi Cai et al.,Nature Cell Biology , Vol. 11, 56-64 (2009); CN101797375B）。另外，進一步的研究發現，在缺血預適應（ischemic preconditioning, IPC）和缺血後適應（ischemic postconditioning, PostC）中，MG53也是起保護作用的重要分子之一，MG53分子的兩端可以分別與Caveolin-3以及p85-PI3K激酶相互結合形成複合物，並激活下游的再灌損傷保護激酶（reperfusion injury salvage kinase, RISK）途徑，從而實現心肌細胞和心臟的保護作用（參見，Chun-Mei Cao et al.,Circulation 121, 2565-2574, (2010)）。

之前對MG53的研究還發現，MG53具有E3泛素連接酶活性，參與調控胰島素抗性和代謝症候群的發生發展。例如，在兩篇文獻中報道了MG53 N端的TRIM結構域中的Ring結構域具有E3泛素連接酶活性，可以與胰島素受體（insulin receptor，IR）及胰島素受體基質（insulin receptor substrate-1，IRS1）結合，並介導它們的泛素化修飾和蛋白酶體途徑的降解，進而阻遏胰島素訊息傳遞路徑，導致以胰島素抗性為發病核心環節的肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常等代謝類疾病的發生發展（參見，例如，R. Song et al.,Nature 494, 375-379, (2013)；J.S.Yi et al.,Nature communications 4, 2354 (2013)）。

但是，現有技術中普遍認為MG53僅在細胞內發揮與調控胰島素抗性和代謝症候群的發生發展相關的活性。

本申請案關於一種用於檢測MG53相關疾病或預測MG53相關疾病的風險的方法以及一種用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53活性的方法。此外，本申請案還關於一種MG53抗體或其抗原結合片段，編碼該等抗體或其抗原結合片段的核酸，包括該等核酸的殖株或表達載體，包括該等殖株或表達載體的宿主細胞，以及包括上述各產品的藥物組合物。而且，本申請案還關於一種用於檢測細胞外游離MG53的檢測試劑在製備試劑盒中的用途以及MG53抑制劑在製備用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53的藥物中的用途。

一方面，本申請案關於一種用於檢測MG53相關疾病或預測MG53相關疾病的風險的方法，包括以下步驟：a. 獲得待測樣品；和b.檢測在所述待測樣品中的細胞外游離MG53。

在某些實施方式中，所述待測樣品是體液。在某些實施方式中，所述待測樣品選自全血、血漿、血清、組織液、尿液或者汗液。在某些實施方式中，所述待測樣品選自全血、血漿或血清。在某些實施方式中，所述待測樣品基本上不含細胞。

在某些實施方式中，所述步驟b包括將MG53檢測試劑與所述待測樣品接觸。在某些實施方式中，所述MG53檢測試劑是MG53抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段。在某些實施方式中，所述MG53檢測試劑是可以與MG53結合的小分子化合物。在某些實施方式中，所述MG53檢測試劑具有可檢測標記。在某些實施方式中，所述可檢測標記具有發光性、磁性、放射性或酶活性。在某些實施方式中，所述步驟b包括進行放射免疫測定、西方墨點法、鄰位連接技術、免疫螢光測定法、酶免疫測定法、免疫沉澱測定法、化學發光法、免疫組織化學測定法、免疫斑點試驗或狹縫印跡檢測法。

在某些實施方式中，本申請所述的方法進一步包括：c.將步驟b中獲得的MG53的檢測數值與對照數值進行比較。在某些實施方式中，所述對照數值來自於對照樣品。在某些實施方式中，所述對照樣品與待測樣品來自於相同或不同的個體。在某些實施方式中，所述對照樣品與待測樣品來自於相同的個體，但是對照樣品的採集時間早於或晚於待測樣品一段時間。在某些實施方式中，所述一段時間中所述個體接受了治療或健康狀態發生了變化。在某些實施方式中，所述對照數值是從健康個體或患有MG53相關疾病的個體中獲得的。在某些實施方式中，所述個體是人或非人哺乳動物。

在某些實施方式中，所述MG53相關疾病是代謝症候群。在某些實施方式中，所述MG53相關疾病是糖代謝或脂質代謝相關疾病。在某些實施方式中，所述糖代謝或脂質代謝相關疾病選自胰島素抗性症、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、高胰島素血症、高膽固醇血症、高血糖、高血脂、高血壓和肥胖組成的組。

另一方面，本申請關於一種用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53活性的方法，其包括向需要其的個體施用有效量的MG53抑制劑。

在某些實施方式中，所述MG53抑制劑與MG53特異性結合。

在某些實施方式中，所述MG53抑制劑是MG53抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段、或者MG53的無功能蛋白片段。在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段包括三個重鏈互補決定區，所述三個重鏈互補決定區包含在SEQ ID NO：1、9、17、25或33所示的序列中。在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段進一步包括三個輕鏈互補決定區，所述三個輕鏈互補決定區包含在SEQ ID NO：2、10、18、26或34所示的序列中。在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段包括重鏈，所述重鏈包括如下序列或者與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：1、3、9、11、17、19、25、27、33或35所示的序列。在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段包括輕鏈，所述輕鏈包括如下序列或者與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34或36所示的序列。

在某些實施方式中，所述MG53抑制劑是小分子化合物。在某些實施方式中，所述MG53抑制劑是具有式Ia或Ib的化合物或其藥學上可接受的鹽，

其中，L為化學鍵、或任選取代的C₁ -C₁₂ 亞烷基；M為化學鍵、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳香亞基或5-12元雜環亞基；X為化學鍵、或任選取代的-CH=N-NH-C(O)-、-CH2-O-、-O-CH₂ -C(O)-NH-、-O-C(O)-或-O-C(O)-CH=CH-；Y為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；Q為任選取代的C₁ -C₁₂ 亞烷基或C₂ -C₁₂ 亞烯基；T為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；R₁ 各自獨立地為氫、硝基、鹵素、羥基、氰基、或任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基或C₁ -C₁₂ 烷氧基；n為1-5的任意正整數。

在某些實施方式中，所述L為化學鍵或C₁ -C₃ 亞烷基。在某些實施方式中，所述M為化學鍵、或任選取代的苯亞基或呋喃亞基。在某些實施方式中，所述Y為任選取代的苯基、呋喃基、喹啉基或苯並二惡茂基。在某些實施方式中，所述Q為任選取代的C₁ -C₃ 亞烷基或C₂ -C₃ 亞烯基。在某些實施方式中，所述T為任選取代的苯基或1,3,4-噻二唑基。

在某些實施方式中，所述MG53抑制劑是具有式II的化合物或其藥學上可接受的鹽，

其中，A為氫、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；G為-C(O)-O-R₃ ，其中R₃ 是任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基；J為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基；或者G和J連同其連接的碳原子共同形成，其中R₄ 各自獨立地為氫、硝基、鹵素、羥基、氰基、或任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基或C₁ -C₁₂ 烷氧基，n為1-4的任意正整數；B為化學鍵、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳香亞基或5-12元雜環亞基；D為化學鍵、或任選取代的-O-R₅ -，其中R₅ 選自任選取代的C₁ -C₁₂ 亞烷基；E為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基。

在某些實施方式中，所述A是任選取代的萘基、苯基或噻吩基。在某些實施方式中，所述G為-C(O)-O-R₃ ，其中R₃ 是任選取代的C₁ -C₃ 烷基；J選自任選取代的苯基；或者G和J連同其連接的碳原子共同形成，其中R₄ 均為氫。在某些實施方式中，所述B為化學鍵、或任選取代的亞苯基或呋喃亞基。在某些實施方式中，所述D為化學鍵、或任選取代的-O-CH₂ -。在某些實施方式中，所述E為任選取代的苯基。

在某些實施方式中，所述MG53抑制劑是具有式III的化合物或其藥學上可接受的鹽，

式III
其中，A為氫、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；Y各自獨立地為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；R₇ 為氫、硝基、鹵素、羥基、氰基、或任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基或C₁ -C₁₂ 烷氧基。

在某些實施方式中，A為任選取代的苯基。在某些實施方式中，Y為任選取代的苯基。在某些實施方式中，R₇ 為氫、硝基、鹵素、羥基或氰基。

在某些實施方式中，上述任一實施方式中提及的所述“任選取代的”是指不被取代基取代或者被選自下組的一個或多個取代基取代：硝基、鹵素、羥基、氰基、C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基、苯甲醯胺基、或-C(O)-O-R₆ ，其中所述C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基或苯甲醯胺基可以進一步被硝基、鹵素、羥基、氰基、C₁ -C₃ 烷基或C₁ -C₃ 烷氧基取代，其中R₆ 為氫或C₁ -C₃ 烷基。

在某些實施方式中，所述MG53抑制劑是如下化合物或其藥學上可接受的鹽。

在某些實施方式中，本申請所述的方法可用於緩解、治療或預防MG53相關疾病或其症狀。在某些實施方式中，所述MG53相關疾病為代謝症候群。在某些實施方式中，所述MG53相關疾病為糖代謝或脂質代謝相關疾病。在某些實施方式中，所述糖代謝或脂質代謝相關疾病選自胰島素抗性症、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、高胰島素血症、高膽固醇血症、高血壓和肥胖組成的組。

在某些實施方式中，糖尿病腦血管疾病包括腦動脈硬化、缺血性腦血管病、腦出血、腦萎縮和腦梗塞。

在某些實施方式中，糖尿病眼部併發症包括糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、與糖尿病相關的葡萄膜炎和失明。

在某些實施方式中，糖尿病神經病變包括糖尿病周圍神經病變。

另一方面，本申請關於一種MG53抗體或其抗原結合片段，所述MG53抗體或其抗原結合片段包括三個重鏈互補決定區，所述三個重鏈互補決定區包含在SEQ ID NO：1、9、17、25或33所示的序列中。在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段進一步包括三個輕鏈互補決定區，所述三個輕鏈互補決定區包含在SEQ ID NO：2、10、18、26或34所示的序列中。在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段包括重鏈，其中所述重鏈具有如下胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：1、3、9、11、17、19、25、27、33或35所示的序列。在某些實施方式中，所述的MG53抗體或其抗原結合片段，其進一步包括輕鏈，其中所述輕鏈具有如下胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34或36所示的序列。

另一方面，本申請關於一種抗體或抗原結合片段，其與上述任一實施方式中所述的抗體或抗原結合片段競爭性結合MG53。

另一方面，本申請關於一種分離的核酸，其編碼上述任一實施方式中所述的抗體或抗原結合片段。在某些實施方式中，所述分離的核酸包括如下核苷酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或者99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：5、6、7、8、13、14、15、16、21、22、23、24、29、30、31、32、37、38、39或40所示的序列。

另一方面，本申請關於一種殖株或表達載體，其包括上述任一實施方式中所述的分離的核酸。

另一方面，本申請關於一種宿主細胞，其包括上述任一實施方式中所述的殖株或表達載體。

再一方面，本申請關於一種藥物組合物，其包括上述任一實施方式中所述的抗體或抗原結合片段、上述任一實施方式中所述的殖株或表達載體、或上述任一實施方式中所述的細胞，以及藥學上可接受的賦形劑。

另一方面，本申請關於一種用於檢測細胞外游離MG53的檢測試劑在製備試劑盒中的用途，所述試劑盒用於檢測MG53相關疾病、預測MG53相關疾病的風險或進展、鑒定潛在的MG53抑制劑、評估對MG53相關疾病的治療效果或檢測細胞外游離MG53的活性。在某些實施方式中，所述檢測細胞外游離MG53的檢測試劑可以是上述任一實施方式中所述的MG53檢測試劑。在某些實施方式中，所述MG53相關疾病可以是上述任一實施方式中所述的MG53相關疾病。

另一方面，本申請關於一種MG53抑制劑在製備用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53的藥物中的用途。在某些實施方式中，所述MG53抑制劑可以是上述任一實施方式中所述的MG53抑制劑。在某些實施方式中，所述方法可以用於緩解、治療或預防MG53相關疾病或其症狀。在某些實施方式中，所述MG53相關疾病可以是上述任一實施方式中所述的MG53相關疾病。

儘管本申請將在以下公開多個方面和實施方式，但是在不違背本申請主題精神和範圍的前提下，本發明所屬技術領域中具有通常知識者顯然可以對其進行各種等同改變和修改。本申請公開的多個方面和實施方式僅用於舉例說明，其並非旨在限制本申請，本申請的實際保護範圍以申請專利範圍為準。除非另外指明，本申請中使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的含義。本申請中引用的所有參考文獻、專利、專利申請均透過整體引用併入本申請。

檢測 MG53 相關疾病或預測 MG53 相關疾病的風險的方法

一方面，本申請關於一種用於檢測MG53相關疾病或預測MG53相關疾病的風險的方法，包括以下步驟：a. 獲得待測樣品；和b.檢測在所述待測樣品中的細胞外游離MG53。

MG53

本申請中使用的術語「MG53」是指動物體內表達的天然存在的野生型MG53以及MG53突變體。

MG53蛋白存在於很多動物體內，包括但不限於，人、大猩猩、猴子、豬、牛、狗、家兔、大鼠、小鼠等哺乳動物。MG53蛋白是一種多功能蛋白，其結構如圖1所示。各物種的全長MG53蛋白長度略有不同，但是通常具有約477個胺基酸，由N端的TRIM結構域和C端的SPRY結構域組成，TRIM結構域由依次相連的Ring、B-box、coiled-coil結構域（RBCC）組成。MG53蛋白是膜修復的重要成分之一，在缺血再灌注損傷的預適應保護和後適應保護中發揮重要作用，同時MG53蛋白的高表達也會引起胰島素抗性和代謝症候群的發生。關於MG53的結構、功能以及與其他蛋白的相互作用，本領域中已有詳細報導（參見，例如，Chuanxi Cai et al.,Journal of Biological Chemistry , 284 (5), 3314-3322, (2009)；Xianhua Wang et al.,Circulation Research 107, 76-83, (2010)；Eun Young Park et al.,Proteins , 790-795 (2009)）。

在某些實施方式中，野生型MG53的胺基酸序列如SEQ ID NO：41、42、43、44、45、46、47或61所示，分別對應於人、恆河猴/食蟹猴、大鼠、小鼠、豬、狗、兔和狨猴的野生型MG53蛋白。在某些實施方式中，本申請所使用的術語“MG53”是指來源於所檢測或治療的個體的MG53。

待測樣品

本申請中使用的術語「待測樣品」，是指從個體體內獲得的或者從個體的體外或離體樣本獲得的樣品，包括本發明所屬技術領域中具有通常知識者認為含有或可能含有細胞外游離MG53的來自個體的任何材料。在某些實施方式中，所述待測樣品是血液樣品。在某些實施方式中，所述待測樣品是體液。在某些實施方式中，所述待測樣品選自全血、血漿、血清、組織液、尿液或者汗液。在某些實施方式中，所述待測樣品選自全血、血漿或血清。在某些實施方式中，所述待測樣品可能進一步包含其它物質，如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物和抗生素等。

在某些實施方式中，所述待測樣品中基本上不含細胞，例如不含心肌細胞、橫紋肌細胞或血球細胞。本申請中使用的術語「基本上不含」是指不含有多於特定量的、或者不含有多於所屬領域透過使用一般去除雜質技術後所剩餘量的、或者不含有實質性影響其它物質功能的量的特定物質。例如，所述樣品中基本上不含細胞可以是指樣品中不含有超過特定量的細胞（如，每毫升不超過1000個、800個、500個、200個、100個、50個、20個、10個、5個或1個細胞）；或者是指樣品中不含有透過常規的分離手段（例如，離心取上清）後一般剩餘的細胞數量的細胞。可以使用本領域已知的任何方法獲得樣品。例如，可以使用真空或常壓採血針獲得血液樣品。在某些實施方式中，在進行檢測前可以對採集的血液樣品進行進一步的處理，例如進行離心。

MG53 檢測試劑

在某些實施方式中，所述MG53檢測試劑是MG53抗體或其抗原結合片段、或者MG53配體或其MG53結合片段。可以使用本申請所描述的任一MG53抗體或其抗原結合片段、或MG53配體或其MG53結合片段，或者其組合作為MG53檢測試劑。

在某些實施方式中，所述MG53檢測試劑是可以與MG53結合的小分子化合物。可以使用本申請所描述的任一可與MG53結合的小分子化合物，或者其組合作為MG53檢測試劑。

在某些實施方式中，所述MG53檢測試劑進一步具有可檢測標記。在某些實施方式中，所述可檢測標記具有發光性、磁性、放射性或酶活性。可檢測標記的例子包括，螢光標記、酶標記、放射性同位素標記、化學發光標記、電化學發光標記、金屬粒子標記和半抗原標記。

螢光標記的例子包括，5-(6)-羧基螢光素、5-或6-羧基螢光素、6-(螢光素)-5-(6)-羧醯胺基己酸、異硫氰酸酯螢光素、羅丹明、四甲基羅丹明、染料（如Cy2、Cy3和Cy5）、任選取代的香豆素（例如，AMCA、PerCP）、藻膽蛋白（例如，R-藻紅蛋白（RPE）和別藻紅蛋白（APC）、得克薩斯紅、普林斯頓紅、綠色螢光蛋白（GFP）及其類似物、R-藻紅蛋白和別藻紅蛋白的偶聯物、以及無機螢光標記（如基於半導體材料的粒子（如塗覆CdSe奈米晶體的粒子））。

酶標記的例子包括辣根過氧化物酶（HRP）、鹼性磷酸酶（ALP或AP）、β-半乳糖苷酶（GAL）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、β-N-乙醯氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、蔗糖酶、黃嘌呤氧化酶、螢火蟲螢光素酶和葡萄糖氧化酶（GO）。

辣根過氧化物酶常用基質的例子包括，3,3'-二氨基聯苯胺（DAB）、鎳增強的二氨基聯苯胺、3-氨基-9-乙基哢唑（AEC）、聯苯胺二鹽酸鹽（BDHC）、Hanker-Yates試劑（HYR）、靛酚藍（IB）、四甲基聯苯胺（TMB）、4-氯-1-萘酚（CN）、α-萘酚派洛寧（α-NP）、鄰聯茴香胺（OD）、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽（BCIP）、硝基四氮唑藍（NBT）、2-（p-碘苯基）-3-p-硝基苯基- l-5-苯基氯化四氮唑（INT）、四硝基四氮唑藍（TNBT）、和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-半乳糖苷/鐵-鐵氰化鉀（BCIG/FF）。

鹼性磷酸酶常用基質的例子包括，萘酚-AS-B 1-磷酸鹽/快速紅TR（NABP/FR）、萘酚-AS-MX-磷酸鹽/快速紅TR（NAMP/FR）、萘酚-AS-B1-磷酸鹽/-快速紅TR（NABP/FR）、萘酚-AS-MX-磷酸鹽/快速紅TR（NAMP/FR）、萘酚-AS-B1-磷酸鹽/新品紅（NABP/NF）、溴氯吲哚磷酸鹽/硝基四氮唑藍（BCIP/NBT）、和5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-吡喃半乳糖苷（BCIG）。

放射性同位素標記的例子包括碘、鈷、硒、氚、碳、硫和磷的同位素。

化學發光標記的例子包括魯米諾、異魯米諾、吖啶酯、1,2-二氧戊環和吡啶並噠嗪。

電化學發光標記的例子包括釕衍生物。

金屬粒子標記的例子包括金粒子和塗層金粒子，其可以透過銀染被轉化。

半抗原標記的例子包括DNP、螢光素異硫氰酸酯（FITC）、生物素和地高辛。

在某些實施方式中，示例性的可檢測標記具有如下結構中的一種或多種。

這些可檢測標記可以透過共價結合、親和結合、嵌入、錯合、結合、混合或加入等方式與所述MG53檢測試劑連接。

檢測方法

可以使用本領域常用的方法進行步驟b.檢測在所述待測樣品中的細胞外游離MG53。在某些實施方式中，這些方法包括但不限於放射免疫測定、西方墨點法、鄰位連接技術、免疫螢光測定法、酶免疫測定法、免疫沉澱測定法、化學發光法、免疫組織化學測定法、免疫斑點試驗或免疫狹縫試驗。

本領域的一般技術人員知曉在進行上述各種測定法中使用的一般技術和技術的其他變型，並且也能夠單獨使用上述方法或同核磁共振（NMR）、基質輔助雷射解吸電離飛行時間（MALDI-TOF）、液相-質譜/質譜（LC-MS / MS）等組合或替換地使用。

在一個實施方式中，酶免疫測定法是一種三明治酵素免疫分析法，其使用特異性地結合MG53的抗體來檢測細胞外游離MG53。示例性的三明治酵素免疫分析法包括如下步驟：a. 將特異性結合細胞外游離MG53的抗體與固相載體連接，形成固相抗體，並洗滌除去未結合的抗體及雜質；b. 加入待測標本，使之與固相抗體接觸一定時間以形成固相抗體-抗原複合物，洗滌除去其他未結合的物質；c. 加入帶有酶標記的能夠與細胞外游離MG53結合的抗體，使之與固相抗體-抗原複合物接觸一定時間以與固相抗體-抗原複合物充分結合，洗滌除去未結合的帶有酶標記的抗體；d. 加入上述酶標記的基質，並在適合條件下使酶標記催化基質，並根據基質反應的程度確定細胞外游離MG53的量。

數據處理

本申請所述的檢測方法可以進一步包括數據處理步驟。在某些實施方式中，本申請所述的方法進一步包括：c.將步驟b中獲得的MG53的檢測數值與對照數值進行比較。

在某些實施方式中，所述對照數值來自對照樣品。在某些實施方式中，所述對照樣品與待測樣品來自於不同的個體。例如，對照樣品可以來自健康個體或確定患有MG53相關疾病的個體，而待測樣品來自於患有或疑似患有MG53相關疾病的個體。

在某些實施方式中，所述對照樣品與待測樣品來自於相同的個體，但是對照樣品的採集時間早於或晚於待測樣品一段時間。在某些實施方式中，在所述一段時間中所述個體接受了治療或健康狀態發生了變化。在另一些實施方式中，對照樣品和待測樣品採集於相同個體的不同部分。

在某些實施方式中，所述對照數值是從健康個體或確定患有MG53相關疾病的個體中獲得的。在某些實施方式中，對照數值是以MG53的濃度的形式表現的。

在某些實施方式中，這些對照數值可以是陰性對照值，等於或低於該數值表示待測樣品所來源的個體沒有患有MG53相關疾病或患有MG53相關疾病的風險較低。在某些實施方式中，可以根據從一定數量健康個體獲得的MG53檢測數值的平均值制定陰性對照值，例如，將該等平均值、該等平均值的80%、90%、110%、120%、150%或200%作為陰性對照值。

在另一些實施方式中，這些對照數值可以是陽性對照值，等於或高於該數值表示待測樣品所來源的個體患有MG53相關疾病或患有MG53相關疾病的風險較高。在某些實施方式中，可以根據從一定數量確定患有MG53相關疾病的個體中獲得的MG53檢測數值的平均值制定陽性對照值，例如，將該等平均值、該等平均值的80%、90%、110%、120%、150%或200%作為陽性對照值。

個體

本申請中使用的術語「個體」是指，人類和非人動物。非人動物包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物。「個體」也可以是家畜動物（例如，牛、豬、羊、雞、兔或馬），或齧齒類動物（例如，大鼠或小鼠），或靈長類動物（例如，大猩猩或猴子），或家養動物（例如，狗或貓）。「個體」可以是雄性或者雌性，也可以是不同年齡階段。人類「個體」可以是高加索人、非洲人、亞洲人、閃族人，或其他種族，或不同種族的雜合體。人類「個體」可以是老年、成年、青少年、兒童或者嬰兒。

在某些實施方式中，所述個體是人或非人哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠。

MG53 相關疾病

本申請中使用的術語「MG53相關疾病」是指此類疾病的產生、發病、發展等與MG53的活性相關的疾病。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以透過常規的技術手段來確定某種疾病是否與MG53相關。例如，可以透過過量表達MG53蛋白、或者剔除MG53、或者透過例如反義核酸技術、CRISPR/Cas9技術、Trim21媒介蛋白酶體降解的技術來降低MG53在個體中的含量並評估該疾病在該個體中的情況，從而確定該疾病是否與MG53相關。

本申請中使用的術語「代謝症候群」是指以代謝紊亂引起的脂質和非脂質心血管危險因素的群集為特徵的病症。在某些實施例中，透過以下風險因子中的任意3個的存在來鑒定代謝症候群：男性中腰圍大於102 cm或女性中腰圍大於88 cm；至少150 mg/dL的血清三酸甘油酯；男性中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）小於40 mg/dL或女性中小於50 mg/dL；至少130/85 mmHg的血壓；和至少110 mg/dL的空腹血糖。可在臨床實踐中容易地測量這些風險因子，例如，根據文獻Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III), JAMA, 2001, 285: 2486-2497中的指引，其全部內容透過引用併入本申請。

檢測方法的用途

本申請所述的檢測MG53相關疾病或預測MG53相關疾病的風險的方法可用於多種用途。

在某些實施方式中，該檢測方法可用於檢測個體中是否患有MG53相關疾病或者預測其患有MG53相關疾病的風險。例如，如上文所述，個體中細胞外游離MG53的含量等於或低於陰性對照值表示該個體沒有患有MG53相關疾病或患有MG53相關疾病的風險較低；個體中細胞外游離MG53的含量等於或高於陽性對照值表示該個體患有MG53相關疾病或患有MG53相關疾病的風險較高。

在某些實施方式中，該檢測方法可用於預測個體中MG53相關疾病的進展。例如，透過確定個體中細胞外游離MG53與相同個體一段時間之前的數值相比的含量和/或活性的變化，預測個體中MG53相關疾病的情況（例如，改善或惡化）。在某些實施方式中，與相同個體一段時間之前的數值相比，個體中細胞外游離MG53的含量和/或活性降低表示該個體中MG53相關疾病得到了改善；與相同個體一段時間之前的數值相比，個體中細胞外游離MG53的含量和/或活性升高表示該個體中MG53相關疾病變得惡化。

在某些實施方式中，該檢測方法可用於鑒定潛在的細胞外游離MG53抑制劑。在某些實施方式中，在該用途中通常包括將待測試化合物或試劑與細胞外游離MG53相接觸，隨後檢測細胞外游離MG53。在某些實施方式中，能夠將細胞外游離MG53的含量降低至少10%的待測試化合物或試劑可以被認為是細胞外游離MG53抑制劑。在某些實施方式中，能夠將細胞外游離MG53的含量降低至少20%、40%、50%、80%、90%、95%或更多。這些被鑒定出的細胞外游離MG53抑制劑可以用來治療、預防或緩解MG53相關疾病。待測試化合物或試劑包括，例如，小分子有機和無機化合物（例如，人工合成的化學庫和天然產物庫中獲取的分子）、抗體或其抗原結合片段、配體或其結合片段、或MG53的無功能蛋白片段。

在某些實施方式中，該檢測方法可用於確定個體是否會對細胞外游離MG53抑制劑產生反應。在接觸細胞外游離MG53抑制劑後，待測樣品中細胞外游離MG53的存在情況和含量可以指示所述待測樣品來源的個體是否會對細胞外游離MG53抑制劑反應。例如，待測樣品中細胞外游離MG53的含量和/或活性降低至少10%表示待測樣品來源的個體可能會對細胞外游離MG53抑制劑產生反應。在某些實施方式中，與對照樣品相比，待測樣品中細胞外游離MG53的含量降低至少20%、40%、50%、80%、90%、95%或更多。

在某些實施方式中，該檢測方法可用於評估對MG53相關疾病的治療效果。在這些實施方式中，所述對照樣品與待測樣品來自於相同的個體，但是對照樣品的採集時間早於待測樣品一段時間，並且在一段時間中所述個體接受了治療。在某些實施方式中，與對照樣品相比，待測樣品中細胞外游離MG53的含量降低至少10%表示個體對當前接受的治療產生了反應。在某些實施方式中，與對照樣品相比，待測樣品中細胞外游離MG53的含量和/或活性降低至少20%、40%、50%、80%、90%、95%或更多。根據對反應的評估結果，可以維持或改變對個體的治療方案。

在某些實施方式中，該檢測方法可用於評估利用MG53或其突變體對相關疾病進行治療後，細胞外游離MG53或其突變體的含量的變化。在這些實施方式中，所述對照樣品與待測樣品來自於相同的個體，但是對照樣品的採集時間早於待測樣品一段時間，並且在一段時間中所述個體接受了MG53或其突變體蛋白治療，使得細胞外游離MG53或其突變體蛋白的含量和/或活性發生改變。根據評估結果，可以維持或改變個體的治療方案。

降低或抑制個體中細胞外游離 MG53 活性的方法

MG53 抑制劑

MG53抑制劑可以是小分子有機或無機化合物（例如，從人工合成的化學庫和天然產物庫中獲取的分子）、抗體或其抗原結合片段、配體或其MG53結合片段、或MG53的無功能蛋白片段。在某些實施方式中，所述MG53抑制劑能夠將細胞外游離MG53活性降低至少5%、10%、20%、40%、50%、80%、90%、95%或更多。

在本申請中，當「活性」與增加或降低一同使用的時候，是指檢測到的功能活性，其可以表現為細胞外游離MG53的含量變化、或者含量不變但是功能活性變化。在一些實施方式中，所述MG53的活性與代謝症候群相關。在一些實施方式中，所述MG53的活性與糖代謝或脂質代謝相關。在一些實施方式中，所述MG53的活性與胰島素抗性症、高胰島素血症、高膽固醇血症、高血糖、高血脂、高血壓或肥胖相關。在一些實施方式中，所述MG53的活性是指與胰島素受體及胰島素受體基質的結合活性。

在某些實施方式中，所述MG53抑制劑與MG53特異性結合。

本申請中使用的術語「特異性結合」當用於形容MG53抑制劑時是指：在複雜混合物中該MG53抑制劑較佳地識別MG53，所述抑制劑與MG53的結合常數為其與其他非特異性結合蛋白的結合常數的至少2倍。在某些實施方式中，MG53抑制劑與MG53的平衡解離常數小於或等於10^-6 或10^-7 M。在某些實施方式中，MG53抑制劑與MG53的平衡解離常數小於或等於10^-7 M或10^-8 M。

在某些實施方式中，所述MG53抑制劑是MG53抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段、或者MG53的無功能蛋白片段。可以用於本申請的MG53抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段、或者MG53的無功能蛋白片段包括但不限於本申請所述描述的任一MG53抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段、或者MG53的無功能蛋白片段，或其組合。

在某些實施方式中，所述MG53抑制劑是可以與MG53結合的小分子化合物。可以用於本申請的與MG53結合的小分子化合物包括但不限於本申請所述描述的任一與MG53結合的小分子化合物，或其組合。

降低或抑制方法的用途

在某些實施方式中，本申請所述的降低或抑制方法可用於緩解、治療或預防MG53相關疾病或其症狀，所述的降低或抑制方法包括向個體施用治療有效量的MG53抑制劑。MG53相關疾病的定義參見上文。

對某種疾病或症狀的「緩解」、「治療」或「預防」包括預防或減輕某種疾病或不適狀況，降低某種疾病或不適狀況發生或發展的速度，減少發展出某種疾病或不適狀況的風險，預防或延遲與某種疾病或不適狀況相關的症狀發展，減少或消除與某種疾病或不適狀況相關的症狀，完全或部分地逆轉某種疾病或不適狀況，治癒某種疾病或不適狀況，或以上的組合。

本申請中使用的術語「治療有效量」是指，可以緩解或者消除個體的疾病或症狀，或者可以預防性地抑制或防止疾病或症狀發生的藥物的量。治療有效量可以是將個體的一種或多種疾病或症狀緩解到一定程度的藥物的量；可以將那些跟疾病或症狀成因相關的一種或多種生理或生物化學參數部分或完全恢復到正常的藥物的量；和/或可以降低疾病或症狀發生的可能性的藥物的量。

本申請中提供的MG53抑制劑的治療有效劑量依賴於本技術領域中習知的多種因素，例如體重、年齡、過往病史、目前正在接受的治療、對象的健康狀況和藥物相互作用的強度、過敏（allergy）、超敏（hypersensitivity）和副作用，以及給藥途徑和疾病發展的程度。本領域熟練人員（例如醫生或獸醫）可根據這些或其它條件或要求相應降低或升高劑量。

在某些實施方式中，本申請提供的MG53抑制劑可在治療有效劑量約0.01 mg/kg到約100 mg/kg之間給藥（例如，約0.01 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、約70 mg/kg、約75 mg/kg、約80 mg/kg、約85 mg/kg、約90 mg/kg、約95 mg/kg或約100 mg/kg）。在某些實施方式中，所述MG53抑制劑以約50 mg/kg或更少的劑量給藥。在某些實施方式中，給藥劑量為10 mg/kg或更少、5 mg/kg或更少、1 mg/kg或更少、0.5 mg/kg或更少或0.1 mg/kg或更少。某一特定劑量可分為多次間隔給藥，例如每天一次、每天兩次或更多、每月兩次或更多、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次或每兩月或更多月一次。在某些實施方式中，給藥劑量可隨治療進程變化。例如，在某些實施方式中，初始給藥劑量可比後續給藥劑量高。在某些實施方式中，給藥劑量在治療進程中根據給藥對象的反應進行調整。

給藥方案可透過調整達到最佳反應（例如，治療反應）。例如，可進行單劑量給藥或在一段時間分多個分隔的劑量給藥。

本申請中公開的MG53抑制劑可透過本技術領域中習知的給藥方式給藥，例如注射給藥（如，皮下注射、腹腔注射、靜脈注射，包括靜脈滴注，肌肉注射或皮內注射）或非注射給藥（如，口服給藥、鼻腔給藥、舌下給藥、直腸給藥或外用給藥）。本申請中公開的MG53抑制劑可以以本申請所述的藥物組合物的形式給藥。

在某些實施方式中，可以將本申請中公開的MG53抑制劑與其它藥劑或者療法進行聯合來治療相關的疾病或者病症。在一些實施方式中，所述MG53抑制劑與其它藥劑或者療法同時施用或者先後施用。在一些實施方式中，所述其它藥劑或者療法是用於治療胰島素抗性症、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、高胰島素血症、高膽固醇血症、高血糖、高血脂、高血壓和肥胖中的一種或多種的藥劑或者療法。在一些實施方式中，所述其它藥劑是降糖劑，例如，PPAR激動劑、二肽基肽酶（IV）抑制劑、GLP-1類似物、胰島素或胰島素類似物、胰島素促分泌素、SGLT2抑制劑、人糊精類似物、雙胍、α-葡糖苷酶抑制劑或其組合。

MG53 抗體及其抗原結合片段

本申請的另一方面還提供了一種MG53抗體或其抗原結合片段。

在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段包括三個重鏈互補決定區，所述三個重鏈互補決定區包含在SEQ ID NO：1、9、17、25或33所示的序列中。在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段進一步包括三個輕鏈互補決定區，所述三個輕鏈互補決定區包含在SEQ ID NO：2、10、18、26或34所示的序列中。在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段包括三個重鏈互補決定區和三個輕鏈互補決定區，所述六個互補決定區包含在下組中：SEQ ID NO：1/2、9/10、17/18、25/26或33/34所示的序列中。

在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段包括重鏈，所述MG53抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區具有如下胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：1、9、17、25或33所示的序列。

在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段的重鏈具有如下胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：3、11、19、27或35所示的序列。

在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段進一步包括輕鏈，所述MG53抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區具有如下胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：2、10、18、26或34所示的序列。

在某些實施方式中，所述MG53抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈具有如下胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：4、12、20、28或36所示的序列

本申請的又一方面還提供了一種競爭性抗體或其抗原結合片段，其與上述抗體或抗原結合片段競爭性結合MG53。

本申請中使用的術語「競爭性結合」是指抗體或其抗原結合片段可以特異性抑制其針對的抗原與另一抗體分子（例如，MG53和其它MG53抗體）之間的相互結合作用的能力。在某些實施方式中，阻斷兩個抗原-抗體分子結合的競爭性抗體或抗原結合片段可將兩個抗原-抗體分子之間的相互結合作用抑制至少50%。在某些實施方式中，這樣的抑制作用可以大於60%、大於70%、大於80%，或大於90%。

本申請中使用的術語「抗體」包括任何可結合某特定抗原的免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多特異性抗體或雙特異性（雙價）抗體。一個天然的完整抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈由一個可變區和第一、第二、第三恆定區組成；每條輕鏈由一個可變區和一個恆定區組成。哺乳動物的重鏈可分為α、δ、ε、γ和μ亞型，哺乳動物的輕鏈可分為λ或κ亞型。抗體呈「Y」型，「Y」型結構的頸部由兩條重鏈的第二和第三恆定區組成，其透過二硫鍵結合。「Y」型結構的每條臂包括一條重鏈的可變區和第一恆定區，以及與其結合的一條輕鏈的可變區和恆定區。其中重鏈的第一恆定區透過鉸鏈區與第二恆定區相連。輕鏈和重鏈的可變區決定抗原結合的特異性。每條鏈的可變區均含有三個高變區，稱互補決定區（CDR），輕鏈（L）的CDR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3。本申請公開的抗體和抗原結合片段的CDR邊界可透過Kabat，Chothia或 Al-Lazikani命名法命名或識別，詳細內容可參見Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997)；Chothia, C. 等人，J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985)；Chothia, C. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987)；Chothia, C. 等人，Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989)和Kabat E.A. 等人，National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)。其中，三個CDR由被稱為框架區（FR）的連續部分間隔開，框架區比CDR更加高度保留並形成一個支架支撐可變區的結構。重鏈和輕鏈的恆定區與抗原結合的特異性無關，但具有多種效應功能。抗體依據重鏈恆定區的胺基酸序列可以分成幾類。根據是否含有α、δ、ε、γ和μ重鏈，抗體可分別分為五個主要的分類或異構體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。幾個主要的抗體分類還可分為亞類，如IgG1（γ1重鏈）、IgG2（γ2重鏈）、IgG3（γ3重鏈）、IgG4（γ4重鏈）、IgA1（α1重鏈）或IgA2（α2重鏈）等。

本申請中使用的術語「抗原結合片段」指由含有一個或多個CDR的抗體部分但不具有完整抗體結構的抗體片段所形成的一種抗體片段。抗原結合片段的例子包括，但不限於，Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂ 片段、Fv片段、單鏈抗體分子（scFv）、scFv二聚體、駱駝化單域抗體（camelized single domain antibody）和奈米抗體。抗原結合片段可以與母體抗體結合相同的抗原。

抗體的「Fab」片段是指由一條輕鏈（包括可變區和恆定區）和一條重鏈的可變區和第一恆定區經二硫鍵結合起來的那部分抗體。

「Fab'」片段是指包含了部分鉸鏈區的Fab片段。

「F(ab')₂ 」片段是指Fab'的二聚體。

抗體的「Fv」片段由一條輕鏈的可變區和一條重鏈的可變區組成。

「單鏈抗體分子」或「scFv」是指由輕鏈可變區與重鏈可變區直接相連或透過一個肽鏈連接而成的工程抗體。詳細介紹可以參見例如Huston JS 等，Proc Natl Acad Sci USA、85:5879(1988)。

「scFv二聚體」是指由兩個scFv形成的聚合體。

「駱駝化單域抗體（Camelized single domain antibody）」（又稱為「重鏈抗體」或「HCAb（Heavy-chain-only antibodies，HCAb）」）是指含有兩個重鏈可變區而不含有輕鏈的抗體（Riechmann L.和Muyldermans S., J Immunol Methods. Dec 10;231(1-2):25-38 (1999)；Muyldermans S., J Biotechnol. Jun;74(4):277-302 (2001)；WO94/04678；WO94/25591；U.S. Patent No. 6,005,079）。重鏈抗體最初從駝科（駱駝、單峰駝和美洲駝）衍生得到。雖然缺失輕鏈，但是駱駝化抗體具有抗原結合的全部功能（參見Hamers-Casterman C.等人，Nature. 363(6428):446-8 (1993)；Nguyen VK.等，“Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation,” Immunogenetics. 54(1):39-47 (2002)；Nguyen VK. 等人，Immunology. 109(1):93-101 (2003)），其全部內容透過引用併入本申請。

「奈米抗體」是由一個來自重鏈抗體的重鏈可變區和兩個恆定區CH2和CH3組成。

在某些實施方式中，本申請所述抗體是全人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、鼠源抗體或兔源抗體。在某些實施方式中，本申請所述抗體是多株抗體、單株抗體或重組抗體。在某些實施方式中，本申請所述抗體是單特異性抗體、雙特異性抗體或多特異抗體。在某些實施方式中，本申請所述抗體可以進一步地被標記。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是全人源單株抗體，其任選地由基因轉殖大鼠產生，例如，內源性大鼠免疫球蛋白基因表達被去活化、且攜帶具有J基因座缺失和C-kappa突變的重組的人源免疫球蛋白基因座的基因轉殖大鼠，其也可以由改造後的細胞（例如CHO細胞表達)產生。

本申請中使用的術語「全人源」當用於抗體或抗原結合片段時，是指所述抗體或抗原結合片段的胺基酸序列對應於由人或人免疫細胞生產的、或從例如利用人源抗體庫的基因轉殖非人動物等非人來源衍生的抗體的胺基酸序列，或者其他編碼人源抗體的序列。

本申請中使用的術語「人源化」當用於抗體或抗原結合片段時，是指包括來源於非人動物的CDR、來源於人的FR區，以及來源於人的恆定區（當適用時）的抗體或抗原結合片段。由於人源化的抗體或抗原結合片段具有更低的免疫原性，其在某些實施方式中可用作人的治療劑。在某些實施方式中，所述非人動物是哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠）。在某些實施方式中，所述人源化抗體或抗原結合片段除了CDR序列是非人源的以外，基本上全部由人源序列組成。

本申請中使用的術語「嵌合」當用於抗體或抗原結合片段時，是指具有來源於一種物種的重鏈和/或輕鏈的一部分，而所述重鏈和/或輕鏈其餘部分來源於不同物種的抗體或抗原結合片段。在一些實施方式中，嵌合抗體可以包括來源於人的恆定區和來源於非人動物（例如小鼠或兔）的可變區。

在某些實施方式中，本申請所述MG53抗體和其抗原結合片段能夠以≤10^-6 M（例如，≤5x10^-7 M, ≤2x10^-7 M, ≤10^-7 M, ≤5x10^-8 M, ≤2x10^-8 M的結合親和性與MG53特異性結合。結合親和性可以用K_D 值表示，其透過當抗原和抗原結合分子的結合達到平衡時的解離速率與結合速率的比值（koff/kon）計算得到。所述抗原結合親和性（例如，K_D ）可以透過本領域已知的適宜方法進行檢測，所述方法包括使用儀器（例如，Biacore）進行的等離子共振結合法，例如參見Murphy, M.等人，Current protocols in protein science, Chapter 19, unit 19.14, 2006。

在某些實施方式中，本申請所述抗體和其抗原結合片段以0.2 nM-2000 nM（例如1 nM-1500 nM、5 nM-1000 nM、10 nM-900 nM、20 nM-800 nM或50 nM-800 nM)的IC₅₀ 抑制MG53與其配體的結合。

本申請中所使用的術語「同源性」的百分比是指，針對胺基酸序列而言，將候選胺基酸序列與對比胺基酸序列進行序列對比，並在必要時引入間隔，使相同的胺基酸數目達到最多，並在此基礎上計算兩條胺基酸序列之間相同胺基酸的百分比；針對核酸序列而言，將候選核酸序列與對比核酸序列進行序列對比，並在必要時引入間隔，使相同的核苷酸數目達到最多，並在此基礎上計算兩條核酸序列之間相同核苷酸的百分比。可以透過本領域所知的多種方式進行比對以確定同源性的百分比。例如，可以使用公開工具進行序列比對，例如BLASTp（美國國家生物技術信息中心網站（NCBI）：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，也可參見，Altschul S.F等人，J. Mol. Biol.，215:403–410 (1990)；Stephen F.等人，Nucleic Acids Res., 25:3389–3402 (1997)）、ClustalW2（歐洲生物信息研究所網站：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，可參見，Higgins D.G.等人，Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A.等人， Bioinformatics (Oxford、England), 23(21): 2947-8 (2007)）和TCoffee（瑞士生物信息學研究所網站，可參見，Poirot O.等人，Nucleic Acids Res., 31(13): 3503-6 (2003); Notredame C.等人，J. Mol. Boil., 302(1): 205-17 (2000)）。使用軟體進行序列比對時，可以使用軟體提供的預設參數，也可以根據比對的需要適當調整參數，這些都在本發明所屬技術領域中具有通常知識者的知識範圍之內。

在某些實施方式中，本申請所述的MG53抗體或其抗原結合片段還包括透過對本申請所述的MG53抗體或其抗原結合片段進行胺基酸殘基的保留替換後得到的那些MG53抗體或其抗原結合片段。

本申請使用的術語胺基酸殘基的「保留替換」指性質相似的胺基酸之間的替換，例如極性胺基酸之間的替換（如，穀氨醯胺和天冬醯胺之間的替換），疏水性胺基酸之間的替換（如，亮胺酸、異亮胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸之間的替換），以及帶相同電荷的胺基酸之間的替換（如，精胺酸、賴胺酸和組胺酸之間的替換，或者穀胺酸和天冬胺酸之間的替換）等。

在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段進一步包括共軛物。

在某些實施方式中，所述共軛物可以是可檢測標記、藥代動力學修飾部分、純化部分或細胞毒性部分。多種共軛物可以與本申請中的抗體或其抗原結合片段結合（參見：例如，Conjugate Vaccines, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York (1989)）。在某些實施方式中，本申請公開的MG53抗體或其抗原結合片段可以透過工程的方法使其含有一個或多個共軛物結合位點，這些位點可用來結合一種或多種共軛物。例如，這樣的位點可包含一種或多種反應性胺基酸殘基（例如，半胱胺酸殘基和組胺酸殘基）用於協助與共軛物的共價連接。在某些實施方式中，MG53抗體或其抗原結合片段可間接連接共軛物，或透過另一個共軛物相連。例如，所述MG53抗體或其抗原結合片段可連接生物素，然後間接結合第二共軛物（例如，親和素），其與生物素相連。在某些實施方式中，所述共軛物可以是可檢測標記，例如，螢光標記（例如，螢光素、羅丹明、丹醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅）、酶-基質標記物（例如，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶）、放射性同位素（例如，¹²³ I、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、³⁵ S、³ H、¹¹¹ In、¹¹² In、¹⁴ C、⁶⁴ Cu、⁶⁷ Cu、⁸⁶ Y、⁸⁸ Y、⁹⁰ Y、¹⁷⁷ Lu、²¹¹ At、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、¹⁵³ Sm、²¹² Bi、及³² P或其他鑭系元素）、發色團部分、地高辛、生物素/親和素、DNA分子或金。在某些實施方式中，所述共軛物可以是PEG，其幫助延長抗體的半衰期。在某些實施方式中，所述共軛物可以是純化部分（例如，磁珠）。在某些實施方式中，所述共軛物可以是細胞毒性部分，例如，紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙素、阿黴素、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素及其類似物、抗代謝物（例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴）、烷化劑（例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀（BSNU）和洛莫司汀（CCNU）、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C和順鉑）、蒽環類抗生素（例如，柔紅黴素和阿黴素）、抗生素（例如，更生黴素、博來黴素、光神黴素和氨茴黴素（AMC））以及抗有絲分裂劑（例如，長春新鹼和長春鹼）。

MG53 配體及其 MG53 結合片段

本申請的一方面提供了一種MG53配體及其MG53結合片段。在本申請中，可以使用MG53配體及其MG53結合片段作為MG53檢測試劑或者MG53抑制劑。不希望受到理論的束縛，可以透過檢測MG53配體或其MG53結合片段與細胞外游離MG53結合來檢測細胞外游離MG53的存在與否或者濃度；還可以透過向個體施用MG53配體或其MG53結合片段從而競爭性結合MG53，從而阻斷或者減少MG53同體內原本的反應配體/受體的結合。

在一些實施方式中，MG53配體是胰島素受體或其變體，例如如SEQ ID NO：58所示的人胰島素受體。在一些實施方式中，MG53配體是胰島素受體的胞外區或其變體。

MG53 的無功能蛋白片段

本申請的一方面提供了一種MG53的無功能蛋白片段。本申請所述的「MG53的無功能蛋白片段」可以是任何與天然MG53相比缺少一種或多種生理功能的蛋白片段。在某些實施方式中，MG53的無功能蛋白片段能夠與天然MG53競爭性結合MG53配體/受體。在某些實施方式中，與天然MG53相比，MG53的無功能蛋白片段的活性降低至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。在某些實施方式中，上述降低的活性是與MG53相關疾病相關的活性。在某些實施方式中，上述降低的活性是MG53活化AKT磷酸化的活性。

在某些實施方式中，所述MG53的無功能蛋白片段是一種MG53突變體。本申請中使用的術語「MG53突變體」或者「MG53蛋白突變體」是指天然的野生型MG53蛋白的胺基酸序列已被修飾的MG53蛋白變體。這類修飾包括但不限於一個或多個胺基酸缺失、添加和/或被取代。在某些實施方式中，本申請中的MG53突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY結構域內具有至少一個絲胺酸缺失和/或突變為任何其他非絲胺酸或蘇胺酸的胺基酸。

在某些實施方式中，所述MG53突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY區域內有至少一個絲胺酸突變為非極性胺基酸，所述非極性胺基酸選自下組：甘胺酸、丙胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸和色胺酸。較佳地，在某些實施方式中，所述非極性胺基酸為丙胺酸。在某些實施方式中，所述MG53突變體在野生型MG53的胺基酸序列的基礎上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY區域內有至少一個絲胺酸突變為除絲胺酸和蘇胺酸之外的極性胺基酸。在某些實施方式中，所述極性胺基酸選自下組：穀氨醯胺、半胱胺酸、天冬醯胺、酪胺酸、天冬胺酸、穀胺酸、賴胺酸、精胺酸和組胺酸。較佳地，在某些實施方式中，所述極性胺基酸為半胱胺酸。

在某些實施方式中，所述MG53突變體具有SEQ ID NO: 48-57中任一項所示的胺基酸序列。在某些實施方式中，所述MG53突變體的胺基酸序列與SEQ ID NO: 48-57中任一項所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或者至少99%的序列同源性。

其它關於MG53突變體的內容可以參見中國專利申請201610847346.4，其全部內容透過引用併入本申請。

MG53 抗體或其抗原結合片段、 MG53 配體或其 MG53 結合片段、或者 MG53 的無功能蛋白片段的製備方法

可以使用本領域常規的方法製備本申請中的MG53抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段、或者MG53的無功能蛋白片段，例如，可以透過化學合成方法製備，也可以透過基因工程方法製備。

化學合成方法主要包括固相合成和液相合成兩種方法。固相多肽合成方法包括，例如Merrifield固相合成法，該方法已詳細記載在文獻Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85: 2149-2154、M. Bodanszky等人, Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, Second Edition, 1976”、以及J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983中，其全部內容透過引用併入本申請。Merrifield固相合成法主要包括以下步驟，根據目標多肽的胺基酸序列，先使被保護的羧基末端胺基酸與樹脂連接；連接後洗滌樹脂；脫去羧基末端胺基酸α氨基上的保護基（例如，叔丁氧羰基），脫去這個保護基的時候必須要確保不斷裂該胺基酸和樹脂間的連接鍵；然後在所得的樹脂上偶聯倒數第二個羧基末端被保護的胺基酸，進行這一偶聯時，在第二個胺基酸的游離羧基和連在樹脂上的第一個胺基酸的氨基之間形成一個醯胺鍵；根據目標多肽的胺基酸連接順序，依次重複前述反應過程，直到所有胺基酸都連接到樹脂上；最後，從樹脂上切下被保護的肽，脫去保護基即可得到目標多肽。本申請的多肽也可以透過液相合成方法製備，例如可以用標準的溶液肽合成法製備，該方法已詳細記載在文獻E. Schroder and K. Kubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965中，其全部內容透過引用併入本申請。液相合成法主要包括，利用形成醯胺鍵的化學或酶方法分步偶聯胺基酸或肽片段。

可使用基因工程方法透過細胞培養和表達的方式產生MG53抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段、或者MG53的無功能蛋白片段。在該方法中，使用帶有編碼需要表達的目標蛋白的目標基因的殖株或表達載體轉化宿主細胞，並將轉化的宿主細胞在營養培養基中培養，所述營養培養基經修飾後適宜於誘導啟動子、選擇轉化細胞或擴增編碼目的序列的基因，有關該方法的詳細描述可參考Sambrook等人編著的分子選殖（實驗手冊，冷泉港，1989）。

本申請中用於產生所述抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段、或者MG53的無功能蛋白片段的宿主細胞可在多種培養基中培養。市售的培養基，例如Sigma生產的Ham's F10、最低基本培養液（MEM）、RPMI-1640及Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)可用於培養所述宿主細胞。另外，任何在Ham等人，Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等人，Anal. Biochem. 102:255 (1980), 美國專利號4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 或 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 或美國專利申請RE. 30,985中提及的培養基都可以用作所述宿主細胞的培養基。這些培養基都可添加必要的激素和/或其他生長因子（例如，胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽類（例如，氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂或磷酸鹽）、緩衝液（例如，HEPES）、核苷酸（例如，腺苷酸和胸腺嘧啶）、抗生素（例如，慶大黴素）、微量元素（終濃度通常在微莫耳範圍用於提供營養的無機化合物，例如硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸鋅或氯化錳），和葡萄糖或與之等同的能量源。所述培養基還可含有本領域習知的適當濃度的任何其他必要的添加劑。本發明所屬技術領域中具通常知識者熟知如何選擇培養宿主細胞所用的條件，如溫度和pH值等。

在使用基因工程技術表達上述目標蛋白時，所述目標蛋白可在細胞內、細胞壁膜空間生成，或直接分泌到培養基中。如果所述抗體在細胞內生成，首先裂解宿主細胞，然後除去宿主細胞的裂解片段或顆粒殘骸，例如，可透過離心或超音波的方法。如果所述抗體在壁膜空間生成，可以使用，例如在文獻Carter等人，Bio/Technology 10:163-167 (1992)中描述的方法分離目標蛋白。簡要地說，在醋酸鈉（pH=3.5）、EDTA和苯甲磺醯氟（PMSF）存在的條件下裂解細胞約30分鐘以上，隨後離心除去細胞碎片。如果所述抗體分泌到培養基中，則通常先使用市售的蛋白濃度過濾器（如Amicon或Millipore的Pellicon ultrafiltration unit）濃縮該表達系統的上清液。在任何前述的步驟中都可加入蛋白酶抑制劑（例如，PMSF）以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污染物的生長。

從所述細胞中製得的產物可採用純化方法進行純化，例如羥磷灰石色層分析、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換色層分析柱、硫酸銨沉澱、鹽析以及親和色層分析，其中親合色層分析為較佳的純化技術。在任意初步純化步驟之後，可用低pH疏水相互作用色層分析的方法處理含有感興趣的產物和雜質的混合物，用pH約2.5-4.5的洗滌緩衝液，較佳地在低鹽濃度下進行（例如，從約0到0.25 M鹽濃度）。

分離的核酸

另一方面，本申請關於一種分離的核酸，其包含編碼上述任一實施方式中所述的抗體或抗原結合片段。在某些實施方式中，所述分離的核酸包括如下核苷酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或者99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：5、6、7、8、13、14、15、16、21、22、23、24、29、30、31、32、37、38、39或40所示的序列。

本申請中使用的術語「分離的」是指一種物質（例如，多肽或者核酸）與它在自然界中正常存在的環境相分離或存在於與它在自然界中正常存在的環境不同的環境中。

「分離的」物質已經經人工由自然狀態改變。如果自然界中出現某種「分離的」物質或成分，那麼其已經被改變或脫離其原始狀態，或二者均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在的多核苷酸或多肽是未被分離的，但如果這些多核苷酸或多肽與之在天然狀態下共存的物質足夠分離並以足夠純的狀態存在，則可以認為是「分離的」。在某些實施方式中，抗體和抗原結合片段的純度為至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%，其純度可由電泳方法（例如，SDS-PAGE、等電聚焦或毛細管電泳），或色層分析法（例如，離子交換色層分析或反相HPLC）確定。

本申請使用的術語「核酸」或「多聚核苷酸」指核糖核酸（RNA）、脫氧核糖核酸（DNA）、或核糖核酸-脫氧核糖核酸的混合物（例如，DNA-RNA雜交物）。核酸或多聚核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA，或DNA-RNA雜交物。核酸或多聚核苷酸可以是線性的或環狀的。

本申請使用的術語「編碼」或「為……編碼」指能夠轉錄為mRNA和/或轉譯為肽或蛋白質。

在一些實施方式中，包含多核苷酸的核苷酸可以是修飾形式的。所述修飾包括鹼基修飾（例如，溴尿核苷），核糖修飾（例如，阿糖胞苷和2',3'-二脫氧核糖）以及核苷酸間鍵結修飾（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯（phosphoroselenoate）、二硒代磷酸酯（phosphorodiselenoate）、縮苯胺硫代磷酸酯（phosphoroanilothioate）、縮苯胺磷酸酯（phoshoraniladate）和氨基磷酸酯）。

本申請所述的分離的核酸還包括根據遺傳密碼的簡併性替換過的核酸。本申請中使用的術語「遺傳密碼的簡併性」是指，同一種胺基酸具有兩個或更多個密碼子的現象。例如，脯胺酸具有4個同義密碼子，即CCU、CCC、CCA、CCG。本領域習知，由於核酸遺傳密碼的簡併性，可以將某已知核酸序列中的某些位置的核酸進行替換，但卻不改變編碼的胺基酸序列。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以很容易地進行遺傳密碼簡併性的替換，例如，透過鹼基的定點突變技術。不同生物體對不同的密碼子的偏好性存在區別，為在某個選定的生物細胞內表達本申請的抗體或抗原結合片段，可以選擇該生物細胞所偏好的密碼子，獲得相應的編碼基因，透過重組表達得到本申請的抗體或抗原結合片段。

殖株或表達載體

本申請中使用的術語「載體」是指，可將編碼某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中並使該蛋白獲得表達的一種運載工具。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內得以表達。舉例來說，載體包括：質體、噬菌體、柯斯質體、人工染色體（例如，酵母人工染色體（YAC）、細菌人工染色體（BAC）或P1衍生的人工染色體（PAC））、噬菌體（例如，λ噬菌體或M13噬菌體），以及動物病毒等。可用作載體的示例性的動物病毒包括逆轉錄病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒（例如，單純皰疹病毒）、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒（例如，SV40）。載體可含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還可包括協助其進入細胞的成分，包括但不限於，病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼。

宿主細胞

再一方面，本申請關於一種宿主細胞，其包括上述任一實施方式中所述的殖株或表達載體。

本申請中使用的術語「宿主細胞」是指被引入，或能夠引入編碼本申請所述的一種或多種抗體、MG53配體或無功能MG53片段的核酸序列（「選定基因」）的細胞，並且其進一步表達或能夠表達感興趣的選定基因。該術語包括親代細胞的子代，無論其在形態學或遺傳組成上是否與親代相同，只要存在選定基因即可。

可以將包括編碼選定基因的多核苷酸的載體引入宿主細胞用於選殖或基因表達。本申請中適用於選殖或表達所述載體中的DNA的宿主細胞為原核細胞或真核細胞。適用於本申請的原核細胞包括真細菌和古生菌。其中真細菌包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和放線菌，示例性的真細菌包括例如，大腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷白氏桿菌屬、變形桿菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、以及志賀氏菌屬、假單胞菌屬等。

除了原核細胞以外，真核微生物（例如，絲狀真菌或酵母）也可作宿主細胞選殖或表達選定基因的載體。釀酒酵母，或麵包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，許多其他屬、種和株都比較常用且在本申請中適用，如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母屬宿主（例如，乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母（ATCC 12,424）、保加利亞克魯維酵母（ATCC 16,045）、魏氏克魯維酵母（ATCC 24,178）、克魯雄酵母（ATCC 56,500）、果蠅克魯維酵母（ATCC 36,906）、耐熱克魯維酵母和馬克斯克魯維酵母）；解脂耶氏酵母（EP 402,226）；巴斯德畢赤酵母（EP 183,070）；假絲酵母；裡氏木黴（EP 244,234）；鏈孢黴；西方許旺酵母（例如，西方許旺酵母）；和絲狀真菌（例如，脈孢菌、青黴菌、彎頸黴和曲黴菌黴）。

本申請中提供的宿主細胞可以是哺乳動物宿主細胞，且哺乳動物宿主細胞的培養已經成為常規操作。可用的哺乳動物宿主細胞實例有，SV40轉化的猴腎細胞CV1系（COS-7, ATCC CRL 1651）；人胚胎腎細胞系（293 或懸浮培養的293細胞亞殖株，參見Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977) ）；幼地鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10）；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR（CHO，參見Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；小鼠睾丸支持細胞（TM4，參見Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TRI細胞（參見Mather等，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)）；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞系（Hep G2）。

小分子化合物

本申請的一方面提供了與MG53結合的小分子化合物。在本申請中，可以使用與MG53結合的小分子化合物作為MG53檢測試劑或者MG53抑制劑。

在某些實施方式中，所述與MG53結合的小分子化合物是具有式Ia或Ib的化合物或其藥學上可接受的鹽，

其中，L為化學鍵、或任選取代的C₁ -C₁₂ 亞烷基；M為化學鍵、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳香亞基或5-12元雜環亞基；X為化學鍵、或任選取代的-CH=N-NH-C(O)-、-CH₂ -O-、-O-CH₂ -C(O)-NH-、-O-C(O)-或-O-C(O)-CH=CH-；Y為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；Q為任選取代的C₁ -C₁₂ 亞烷基或C₂ -C₁₂ 亞烯基；T為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；R₁ 各自獨立地為氫、硝基、鹵素、羥基、氰基、或任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基或C₁ -C₁₂ 烷氧基；n為1-5的任意正整數。

在某些實施方式中，所述與MG53結合的小分子化合物是具有式II的化合物或其藥學上可接受的鹽，

其中，A為氫、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；G為-C(O)-O-R₃ ，其中R₃ 是任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基；J為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基；或者G和J連同其連接的碳原子共同形成，其中R₄ 各自獨立地為氫、硝基、鹵素、羥基、氰基、或任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基或C₁ -C₁₂ 烷氧基，n為1-4的任意正整數；B為化學鍵、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳香亞基或5-12元雜環亞基；D為化學鍵、或任選取代的-O-R₅ -，其中R₅ 選自任選取代的C₁ -C₁₂ 亞烷基；E為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基。

在某些實施方式中，所述與MG53結合的小分子化合物是具有式III的化合物或其藥學上可接受的鹽，

式III
其中，A為氫、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；Y各自獨立地為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基；R₇ 為氫、硝基、鹵素、羥基、氰基、或任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基或C₁ -C₁₂ 烷氧基。

為了簡明起見，在單個實施方式的上下文中描述的本申請的各種特徵還可以以分開的方式或者以任何適當的子結合的方式提供。

本申請中使用的術語「取代」，當指化學基團時，指所述化學基團的一個或多個氫原子被去除並且被取代基取代。

本申請中使用的術語「取代基」具有本領域習知的通常含義，指共價連接至或者在適合的情況下稠合至母體基團的化學部分。

本申請中使用的術語「任選地取代」指化學基團可以不具有取代基（即未取代的）或者可以具有一個或多個取代基（即取代的）。應當理解的是在給定原子處的取代受到化合價數的限制。在某些實施方式中，上述任一實施方式中提及的取代基的示例性例子為：硝基、鹵素、羥基、氰基、C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基、苯甲醯胺基、或-C(O)-O-R₆ ，其中所述C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基或苯甲醯胺基可以進一步被硝基、鹵素、羥基、氰基、C₁ -C₃ 烷基或C₁ -C₃ 烷氧基取代，其中R₆ 為氫或C₁ -C₃ 烷基。

本申請中使用的術語「C_n -C_m 」表示碳原子數的範圍，其中n和m是整數並且碳原子數的範圍包括端點（即n和m）和其間的各整數點。例如，C₁ -C₆ 表示1至6個碳原子的範圍，包括1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子、4個碳原子、5個碳原子和6個碳原子。

本申請中使用的術語「烷基」，無論是作為其他術語的一部分還是單獨使用，指飽和的烴基基團，其可以是直鏈的或支鏈的。術語「C_n -C_m 烷基」指具有n至m個碳原子的烷基。在某些實施方式中，烷基基團含有1至12、1至8、1至6、1至4、1至3或1至2個碳原子。烷基基團的示例包括但不限於化學基團如甲基、乙基、n -丙基、異丙基、n -丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、2-甲基-1-丁基、n -戊基、3-戊基、n -己基、1,2,2-三甲基丙基等。

本申請中使用的術語「烯基」，無論是作為其他術語的一部分還是單獨使用，指不飽和的烴基基團，其可以是直鏈的或支鏈的，具有至少一個碳-碳雙鍵。在某些實施方式中，烯基基團含有2至12、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4或2至3個碳原子。在某些實施方式中，烯基基團還能有1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1個碳碳雙鍵。烯基基團的示例包括但不限於化學基團如乙烯基、n -丙烯基、異丙烯基、n -丁烯基、仲丁烯基等。

本申請中使用的術語「亞烷基」，無論是作為其他術語的一部分還是單獨使用，指二價飽和的烴部分，其可以是直鏈的或支鏈的，並且其連接分子的兩個其他部分。術語「C_n -C_m 亞烷基」指具有n至m個碳原子的亞烷基。在某些實施方式中，亞烷基基團含有1至12、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4或1至3個碳原子。亞烷基基團的示例包括但不限於化學基團如亞甲基、亞乙基、1-甲基-亞甲基、亞丙基、亞丁基等。

本申請中使用的術語「亞烯基」，無論是作為其他術語的一部分還是單獨使用，指二價不飽和的烴基部分，其可以是直鏈的或支鏈的，具有至少一個碳-碳雙鍵，並且其連接分子的兩個其他部分。術語「C_n -C_m 亞烯基」指具有n至m個碳原子的亞烯基。在某些實施方式中，亞烯基基團含有2至12、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4或2至3個碳原子。在某些實施方式中，亞烯基基團還能有1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1個碳-碳雙鍵。

本申請中使用的術語「芳基」或「芳香基」，無論是作為其他術語的一部分還是單獨使用，指在形成環的碳原子之間具有交替的雙鍵和單鍵的單-或多-碳環環系基團。術語「C_n -C_m 芳基」指具有n至m個形成環的碳原子的芳基。在某些實施方式中，芳基環系在一個或多個環中具有5至10、5至8或5至6個碳原子。在某些實施方式中，芳基環系具有稠合在一起的2個或多個環。芳基基團的示例包括但不限於化學基團如苯基、萘基、四氫萘基、茚滿基、茚基等。在某些實施方式中，苯基包括稠合的苯基，例如苯並二惡茂基。

本申請中使用的術語「芳香亞基」，無論是作為其他術語的一部分還是單獨使用，指連接分子的兩個其他部分的二價芳環或環系，即上述兩個部分與環在兩個不同的環位置鍵合。當芳香亞基的芳環是單環環系時，上述兩個部分與同一環的兩個不同的環位置鍵合。當芳香亞基的芳環是多環環系時，上述兩個部分可以與同一環或不同環的兩個不同的環位置鍵合。術語「C_n -C_m 芳基亞基」指具有n至m個形成環的碳原子的芳基亞基。芳香亞基可以是取代的或未取代的。未取代的芳香亞基除了其連接的分子的兩部分以外沒有其他取代基。取代的芳香亞基除了其連接的分子的兩部分以外還具有其他取代基。

本申請中使用的術語「烷氧基」，無論是作為其他術語的一部分還是單獨使用，指式「-O-烷基」所示的基團。術語「C_n -C_m 烷氧基」指烷氧基的烷基部分具有n至m個碳原子。在某些實施方式中，烷基部分具有1至6、1至4或1至3個碳原子。烷氧基基團的示例包括但不限於化學基團如甲氧基、乙氧基、丙氧基（例如n -丙氧基和異丙氧基）、t -丁氧基等。

本申請中使用的術語「n元」，其中n是整數，其通常與環系一起使用以描述環系中形成環的原子數。例如，呱啶基為6元雜環烷基環的一個示例，吡唑基為5元雜芳基環的一個示例，吡啶基為6元雜芳基環的一個示例，而1,2,3,4-四氫-萘為10元芳基的一個示例。

本申請中使用的術語「雜芳基」指其中在芳環中的至少一個環原子是雜原子並且其餘的環原子是碳原子的芳基基團。術語「n-m元雜芳基」指具有n至m個形成環的成員的雜芳基。雜原子的示例包括但不限於氧、硫、氮、磷等。在某些實施方式中，雜芳基可以具有5至10、5至8或5至6個形成環的成員。在某些實施方式中，雜芳基是5元或6元雜芳基。雜芳基的示例包括但不限於呋喃基、噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡咯基、N-低級烷基吡咯基、吡啶基-N-氧化物、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吲哚基等。

5元雜芳基是具有有5個環原子的環的雜芳基，其中一個或多個（例如1、2或3個）環原子可以獨立地選自N、O、P和S。5元雜芳基的示例包括但不限於噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、異噻唑基、異噁唑基、1,2,3-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-三唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-三唑基、1,3,4-噻二唑、1,3,4-噁二唑基等。

6元雜芳基是具有有6個環原子的環的雜芳基，其中一個或多個（例如1、2或3個）環原子可以獨立地選自氮、氧、硫和磷。6元雜芳基的示例包括但不限於吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、噠嗪基等。

本申請中使用的術語「雜芳亞基」，無論是作為其他術語的一部分還是單獨使用，指連接分子的兩個其他部分的二價雜芳基，即上述兩個部分與環在兩個不同的環位置鍵合。當雜芳亞基的芳環是單環環系時，上述兩個部分與同一環的兩個不同的環位置鍵合。當雜芳亞基的芳環是多環環系時，上述兩個部分可以與同一環或不同環的兩個不同的環位置鍵合。雜芳亞基可以是取代的或未取代的。未取代的雜芳亞基除了其連接的分子的兩部分以外沒有其他取代基。取代的雜芳亞基除了其連接的分子的兩部分以外還具有其他取代基。

本申請中使用的術語「雜環烷基」指在環系中的至少一個原子是雜原子而其餘環原子是碳原子的環烷基。術語「n-m元雜環烷基」指具有n至m個形成環的成員的雜環烷基。此外，該環還可以具有一個或多個雙鍵，但不具有完全共軛的系統。在某些實施方式中，雜環烷基是飽和的雜環烷基。雜原子的示例包括但不限於氧、硫、氮、磷等。在某些實施方式中，雜環烷基具有3至8、3至6或4至6個形成環的碳原子。雜環烷基的示例包括但不限於氮雜環丁烷、氮丙啶、吡咯烷基、呱啶基、呱嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉高呱嗪等。

本申請中使用的術語「雜環烷亞基」，無論是作為其他術語的一部分還是單獨使用，指連接分子的兩個其他部分的二價雜環烷基，即上述兩個部分與環在兩個不同的環位置鍵合。術語「C_n-m 雜環烷亞基」指具有n至m個碳原子的雜環烷亞基。在某些實施方式中，雜環烷亞基含有3至8、3至6或4至6個成環碳原子。

本申請中使用的術語「雜環基」包括雜芳基和雜環烷基。

本申請中使用的術語「雜環亞基」包括雜芳亞基和雜環烷亞基。

本申請中使用的術語「鹵素」指選自氟、氯、溴和碘的原子。

本申請中使用的術語「氰基」指式「-CN」所示的基團。

本申請中使用的術語「羥基」指式「-OH」所示的基團。

本申請中使用的術語「硝基」指式「-NO₂ 」所示的基團。

本申請中使用的術語「苯甲醯胺基」指式「-NH-C(=O)-苯基」。

本申請中使用的術語「化合物」旨在包括所示結構的所有立體異構體（例如對映異構物和非對映異構物）、幾何異構體、互變異構體和同位素。除非另外指明，本申請中透過名稱或結構標識為一個特定互變異構形式的化合物旨在包括其他的互變異構形式。

本申請所述的化合物可以是不對稱的（例如具有一個或多個立體中心）。除非另外指明，所有的立體異構體，例如對映異構物和非對映異構物，都旨在包含在內。可以以光學活化或外消旋的形式分離含有不對稱取代的碳原子的本申請的化合物。如何從不具有光學活性的初始原料製備光學活化形式的方法是本領域習知的，如透過離析外消旋混合物或透過立體選擇性合成。在本申請所述的化合物中還可以存在烯烴、碳-碳雙鍵等多種幾何異構體，並且在本申請中已經考慮了所有的這些穩定異構體。本申請描述了化合物的順式和反式幾何異構體並且其可以以異構體的混合物或單獨的異構體形式分離。

在某些實施方式中，本申請所述的化合物具有（R ）-構型。在某些實施方式中，本申請所述的化合物具有（S ）-構型。

可以透過本領域習知的多種方法中的任一對化合物的外消旋混合物進行離析。示例性的方法包括使用光學離析酸的分級結晶，光學離析酸是一種具有光學活性的成鹽有機酸。用於分級重結晶方法的適宜的離析試劑是例如具有光學活性的酸（如，酒石酸、二乙醯酒石酸、二苯甲醯酒石酸、扁桃酸、蘋果酸、乳酸的D和L形式）或各種具有光學活性的樟腦磺酸。適於分級結晶方法的其他離析試劑包括N-甲基苄胺、2-苯甘氨醇、去甲麻黃鹼、麻黃鹼、N-甲基麻黃鹼、環己基乙胺、1,2-二氨基環己烷等的立體異構純形式。

還可以透過在裝有光學活性離析試劑（例如二硝基苯甲醯基苯基甘胺酸）的柱上透過洗脫進行外消旋混合物的離析。可以由本發明所屬技術領域中具有通常知識者確定適宜的洗脫溶劑組合物。

本申請的化合物還包括互變異構形式。互變異構形式是由同時伴有質子的遷移的單鍵與相鄰雙鍵的對換導致的。互變異構形式包括具有相同實驗式和總電荷的異構質子化狀態的質子的互變異構體。質子互變異構體的示例包括酮-烯醇對、醯胺-亞胺酸對、內醯胺-內醯亞胺對、烯胺-亞胺對和環狀的形式，其中質子能夠佔據雜環系統的兩個或多個位置，例如1H-和3H-咪唑、1H-，2H-和4H-1,2,4-三唑、1H-和2H-異吲哚以及1H-和2H-吡唑。互變異構形式透過適宜的取代能夠平衡或空間鎖定成一種形式。

本申請的化合物還可以包括中間體或最終化合物中出現原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序數但不同質量數的那些原子。例如，氫的同位素包括氕、氘和氚。

小分子化合物的獲得方法

在某些實施方式中，本申請的小分子化合物可以透過有機合成獲得。可以使用任意習知的有機合成技術製備並且可以根據多種可能的合成途徑合成本申請的化合物，包括其鹽、酯、水合物或溶劑化物。

可以在適宜的溶劑中進行製備本申請化合物的反應，有機合成領域的通常知識者能夠容易地對溶劑進行選擇。適宜的溶劑能夠在反應進行的溫度下（例如可以是從溶劑的冷凍溫度至溶劑的沸騰溫度的溫度範圍）基本上不與初始原料（反應物）、中間體或產物反應。可以在一種溶劑或一種以上溶劑的混合物中進行給定的反應。根據特定反應步驟，本發明所屬技術領域中具有通常知識者能夠針對特定反應步驟選擇適宜的溶劑。

本申請化合物的製備可能關於各種化學基團的保護和去保護。本發明所屬技術領域中具有通常知識者能夠容易地確定是否需要保護和去保護以及選擇適宜的保護基團。保護基團化學可以參見例如T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., Wiley & Sons, Inc., New York (1999)，其全部內容透過引用併入本申請。

可以根據本領域習知的任意適宜方法對反應進行監測。例如，可以利用光譜法，如核磁共振光譜（例如¹ H或¹³ C）、紅外光譜、分光光度法（例如UV-可見）、質譜，或者利用色層分析法，如高效液相色層分析（HPLC）、液相色層分析-質譜（LCMS）或薄層層析（TLC）對產物的形成進行監測。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以利用多種方法對化合物進行純化，包括高效液相色層分析（HPLC）（例如參見“Preparative LC-MS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization” Karl F. Blom, Brian Glass, Richard Sparks, Andrew P. Combs J. Combi. Chem. 2004, 6(6), 874-883，其全部內容透過引用併入本申請）和正相矽膠柱層析。

在某些實施方式中，本申請的小分子化合物可以透過商業途徑購買獲得。在某些實施方式中，本申請的小分子化合物可以是商業可獲得的化合物庫，例如荷蘭的SPECS化合物庫。

藥物組合物

再一方面，本申請關於一種藥物組合物，其包括活性物質（例如，上述任一實施方式中所述的抗體或抗原結合片段、MG53配體或MG53無功能片段、上述任一實施方式中所述的殖株或表達載體、或上述任一實施方式中所述的細胞或上述任一種小分子化合物），以及藥學上可接受的賦形劑。

可以採用藥物領域習知的方法製備這些藥物組合物。在某些實施方式中，可以將本申請的活性物質與藥學上可接受的載劑混合用於製備藥物組合物。

本申請中使用的術語「藥學上可接受的」指在合理的醫學判斷範圍內適宜用於與人和動物的組織接觸而無過度的毒性、刺激、過敏反應或者其他問題或併發症，具有合理的收益/風險比的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。在某些實施方式中，藥學上可接受的化合物、材料、組合物和/或劑型指由管理機構批准（如美國食品藥品管理局、中國食品藥品管理局或歐洲藥品局）或者列於普遍認可的藥典中（如美國藥典、中國藥典或歐洲藥典）的用於動物（更特別地用於人）的那些。

可以用在本申請的藥物組合物中的藥學上可接受的賦形劑包括，但不限於，例如，藥學可接受的液體、凝膠、或固體載劑、水相介質（例如，氯化鈉注射液，林格氏液注射液，等滲透壓葡萄糖注射液，無菌水注射液，或葡萄糖和乳酸林格注射液）、非水相介質（例如，植物來源的不揮發性油、棉花籽油、玉米油、芝麻油、或者花生油）、抗微生物物質、等滲物質（例如氯化鈉或葡萄糖）、緩衝液（例如磷酸鹽或枸櫞酸鹽緩衝液）、抗氧化劑（例如硫酸氫鈉）、麻醉劑（例如鹽酸普魯卡因）、懸浮劑/分散劑（例如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、或聚乙烯吡咯烷酮）、螯合劑（例如EDTA（乙二胺四乙酸）或EGTA（乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸））、乳化劑（例如聚山梨醇酯80（吐溫-80））、稀釋劑、佐劑、輔劑、或無毒輔助物質，其他本領域習知的成分、或以上的多種組合。適用的成分可包括，例如，填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝液、防腐劑、潤滑劑、矯味劑、增稠劑、著色劑或乳化劑。

在某些實施方式中，所述的藥物組合物為口服製劑。口服製劑包括，但不限於，膠囊、囊劑、藥丸、片劑、錠劑（用於味道的基底，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠）、粉末、顆粒劑、或者是水或非水溶液或懸浮液、或者油包水或水包油的乳劑、或者是酏劑或糖漿、或者是糖果錠劑（適用惰性基質，如白明膠和甘油，或蔗糖或者阿拉伯膠）和/或漱口藥及其類似物。

口服的固體製劑（如膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸、粉末、顆粒等）中包括所述的活性物質與一種或多種藥學上可接受的賦形劑，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，和/或以下物質：（1）填料或者補充劑，例如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇，和/或矽酸；（2）黏合劑，例如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、和/或阿拉伯膠；（3）濕潤劑，例如丙三醇；（4）分裂劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或者木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽和/或碳酸鈉；（5）阻滯劑溶液，例如石蠟；（6）加速吸收劑，例如季銨化合物；（7）潤滑劑，例如乙醯醇與單硬脂酸甘油酯；（8）吸收劑，例如高嶺土與皂土；（9）助流劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉、及其混合物；與（10）著色劑。

口服的液體製劑包括藥學可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑和酏劑等。除了活性物質之外，液體劑型還可以含有常用的惰性稀釋劑，例如，水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯（甲）酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油類（特別地，棉籽油、花生油、玉米油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯、以及以上兩種或多種的混合物。除了惰性稀釋液之外，口服的液體製劑也可以添加佐劑，例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調味劑、顏料、香料和防腐劑。

在某些實施方式中，所述的藥物組合物為注射製劑。注射製劑包括無菌水溶液或分散液、混懸劑或乳化劑。在所有情況下，所述的注射製劑應當無菌且應當是液體以方便注射。它在生產和貯存條件下應保持穩定，並應當抗微生物（例如，細菌和真菌）的污染。載劑可以是一種溶劑或分散介質，其包含，例如，水、乙醇、多羥基化合物（例如，甘油、丙二醇，以及液體聚乙二醇等）及其適當的混合物和/或植物油。所述的注射製劑應保持適當的流動性，適當的流動性可透過多種方式維持，例如，透過使用如卵磷脂等塗層，使用表面活性劑等。可以透過加入各種抗菌和抗真菌劑（例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等）來實現抗微生物污染。

在某些實施方式中，所述的藥物組合物為口腔噴霧製劑或鼻腔噴霧製劑。所述噴霧製劑包括，但不限於，水性氣霧劑、非水性懸浮液、脂質體製劑或者固體顆粒製劑等。水性氣霧劑是透過將作用劑的水性溶液或者懸浮液和常規的藥學上可接受的賦形劑與穩定劑一同配製。該載劑與穩定劑根據特定化合物的需要而變化，但是其一般包括非離子型表面活性劑（吐溫類（TWEENs）、或聚乙二醇）、油酸、卵磷脂、胺基酸如甘胺酸，緩衝液、鹽、糖或者糖醇。氣霧劑通常由等滲溶液製備，可以透過噴霧器遞送。

在某些實施方式中，所述的藥物組合物可以和一種或多種其他藥物混合使用。在某些實施方式中，所述的藥物組合物包含至少一種其他藥物。在某些實施方式中，所述的其他藥物為心血管類藥物、用於治療腎臟疾病的藥物、用於細胞修復的藥物等。

在某些實施方式中，所述藥物組合物可以透過適當的途徑遞送到對象中，包括但不限於，透過口服途徑、注射途徑（如靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射、心內注射、鞘內注射、胸膜腔內注射、腹腔內注射等）、黏膜途徑（如鼻腔內給藥、口腔內給藥等）、舌下途徑、直腸途徑、經皮途徑、眼內途徑、肺部途徑。在某些實施方式中，所述藥物組合物可透過注射途徑給藥。

試劑盒

另一方面，本申請關於一種用於檢測細胞外游離MG53的試劑盒。

在某些實施方式中，該試劑盒包括MG53檢測試劑（例如本申請所述的MG53檢測試劑）。在某些實施方式中，該試劑盒還包括一種或多種其他成分，例如MG53標準溶液、稀釋液、洗滌液、終止液、和顯色劑等。本申請所述的試劑盒能夠用於本申請所述的檢測細胞外游離MG53的方法。

試劑盒中的試劑可以置於任意種類的容器中，以使得試劑中的各個成分得以穩定保存且不會被容器的材料吸附或改變。例如，密封玻璃安瓿中可以含有凍乾的基質/分子和/或緩衝劑，其在中性、非反應性氣體（例如，氮氣）下包裝。安瓿可以由任意適宜的材料組成，例如玻璃、有機聚合物（例如，聚碳酸酯或聚苯乙烯等），陶瓷、金屬或一般用於存放試劑的任意其他材料。適宜容器的其他例子包括簡單的瓶子，其可以由與安瓿類似的物質製造，以及封套，其可以由金屬箔內襯（例如，鋁或合金）組成。其他容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器等。容器可能具有無菌入口，如具有可使用皮下注射針穿刺的瓶塞的瓶子。其他容器可以具有兩個室，其被易於除去的膜所分隔，將膜除去後可以使所述成分混合。可除去的膜可以是玻璃、塑膠、橡膠等。

在某些實施方式中，該試劑盒還包括酵素連結免疫分析盤和封盤膜。

在某些實施方式中，試劑盒還可以與說明書一併提供。說明書可以被印刷於紙上或其他材料上，和/或以電子可讀媒體的形式提供，如磁片、CD-ROM、DVD-ROM、硬碟、錄影帶、光碟、錄音帶等。詳細的說明書可以不在實物上與試劑盒相關聯；作為替代，可以引導使用者到試劑盒的生產廠商或經銷商指定的網站，或以電子郵件形式提供說明。在說明書中記載了檢測細胞外游離MG53的方法。

製藥用途

另一方面，本申請關於一種MG53抑制劑在製備用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53的藥物中的用途。在某些實施方式中，所述MG53抑制劑可以是上述任一MG53抑制劑。在某些實施方式中，所述方法可以用於緩解、治療或預防MG53相關疾病或其症狀。在某些實施方式中，所述MG53相關疾病可以是上述任一MG53相關疾病。在一些實施方式中，所述藥物是本申請所述的藥物組合物。

又一方面，本申請關於一種MG53檢測試劑在製備用於檢測細胞外游離MG53的試劑盒中的用途。在某些實施方式中，所述試劑盒可用於檢測MG53相關疾病、預測MG53相關疾病的風險或進展、鑒定潛在的MG53抑制劑、評估對MG53相關疾病的治療效果或檢測細胞外游離MG53的活性。在一些實施方式中，所述MG53檢測試劑以本申請所述的藥物組合物形式提供。

實施例

提供下述實施例以解釋本申請。其並非旨在以任何方式進行限制。

實施例 1 ： MG53 抗體的製備以及表現

MG53 抗體的製備

利用從小鼠中提取的總RNA做逆轉錄，合成cDNA。利用Oligo-dT作為引子，利用逆轉錄酶進行逆轉錄反應，得到cDNA庫。以合成的cDNA庫做模板，利用特異性引子，透過PCR方法獲得小鼠MG53（NP _001073401.1）的編碼核酸。PCR 程序如下：變性，攝氏98度3分鐘；循環過程攝氏98度30秒，攝氏65度30秒，攝氏72度90秒，30 個循環；隨後攝氏72度5分鐘延長後，攝氏4度保存。引子序列如下：上游引子：5’-ataggtaccg ccaccatgtc ggctgcaccc ggcct-3’（SEQ ID NO：59）；下游引子：5’-atactcgagc ggcctgttcc tgctccggcc-3’ （SEQ ID NO：60）；攜帶有KpnI 和XhoI酶切位點。

利用KpnI 和XhoI對 PCR 產物進行雙酶切，同時利用同樣的雙酶切處理空載體質體pcDNA4/TO/myc-HisB，凝膠回收並利用T4連接酶將PCR產物連接入載體，形成質體pcDNA4-mMG53-myc。定序驗證序列正確。

將表達質體pcDNA4-mMG53-myc瞬時轉染入HEK293細胞中。2天後，將從所述瞬時轉染的細胞培養中收獲的上清液用於蛋白純化。將所述蛋白用SDS-PAGE純化並定量以用於免疫。

將100 μg的MG53蛋白透過腹腔注射來分別免疫3隻兔子。經過三次到五次免疫後，對兔子取血收集血清並透過ELISA測試測定抗體效價，選擇出效價最高的兔子。

從效價最高的兔子的脾臟中分離出B淋巴細胞。將分離的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合（以1:1比例）。融合的具體實驗步驟如下：用5-10 mL ECF溶液洗滌並懸浮細胞混合物。加入ECF溶液將濃度調整至2x10⁶ 細胞/mL。在細胞電融合後，將融合室中的細胞懸液立即轉移進入含有更多體積培養基的無菌管中。在攝氏37度培養超過24小時後，將所述細胞懸液混合並移液入96孔盤（0.5 x10⁶ 細胞/盤）。在攝氏37度、5% CO₂ 條件下培養細胞。當所述殖株足夠大時，將100 μL上清液從96孔盤轉移用於抗體篩選測試。

使用ELISA檢測融合瘤上清液與MG53蛋白的結合。簡言之，用1 μg/mL的人MG53蛋白在4°C塗佈盤（coating plate）過夜。在阻斷（blocking）和洗滌後，將所述融合瘤上清液以不同的倍數稀釋後，轉移至所述塗佈盤並在室溫下孵育1小時。之後洗滌所述塗佈盤並隨後用山羊抗兔IgG（H+L）HRP的二抗（Goat Anti-Rabbit HRP (IgG H&L) (ab6721) | Abcam）孵育45分鐘。洗滌後，加入TMB基質並用2M HCl終止反應。使用微盤分析儀（Molecular Device）讀取450 nm處的吸收光值。根據結果篩選出結合性質最好並且適於檢測的5個單株融合瘤細胞，5個單株融合瘤的結合數據如下表所示。

其中，陽性標準值（市售的MG53抗體）為0.456；陰性標準值（無關抗體）為0.083。

將5個融合瘤細胞系進行再選殖。簡言之，對於每個融合瘤細胞系，將細胞進行計數並在選殖培養基中稀釋至5細胞/孔、1細胞/孔和0.5細胞/孔。將200 μL/孔鋪板入96孔盤，一個平板為5細胞/孔，一個盤為1細胞/孔和四個盤為0.5細胞/孔。將所有平板置於攝氏37度、5% CO₂ 。孵育直至所有細胞系可以透過ELISA測試。

隨後對5個單株融合瘤細胞進行基因定序，結果顯示MG53抗體分別為抗體#6（重鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：7所示，輕鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：8所示）、抗體#110（重鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：15所示，輕鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：16所示）、抗體#84（重鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：23所示，輕鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：24所示）、抗體#9（重鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：31所示，輕鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：32所示）、抗體#43（重鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：39所示，輕鏈核苷酸序列：如SEQ ID NO：40所示）。

MG53 抗體的結合能力表現

透過表面等離子共振（SPR）來驗證MG53抗體與MG53結合的能力。將重組人MG53蛋白（rhMG53）溶解在10 mM醋酸鈉緩衝液（pH=4.5）中，並隨後使用Amine Coupling試劑盒（GE Healthcare）透過伯胺基將rhMG53固定在CM5晶片上，並用1M的氨基乙醇阻斷其它的活性位點。將對照流體室活化並且在不存在MG53的情況下進行阻斷。將固定水平固定在500 Biacore反應單位（RU），並逐漸增加流經晶片表面的MG53抗體#84的濃度（胺基酸重鏈序列：如SEQ ID NO：19所示，輕鏈序列：如SEQ ID NO：20所示，濃度從1.95 nM-1000 nM），數據結果如圖2所示。由上述實驗結果可知，本申請的MG53抗體能夠與rhMG53以高親和性結合。

透過表面等離子共振（SPR）來驗證MG53抗體阻斷MG53與胰島素受體胞外區結合的能力。將重組的胰島素受體胞外區（IR）溶解在10 mM醋酸鈉緩衝液（pH=4.5）中，並隨後使用Amine Coupling試劑盒（GE Healthcare）透過伯胺基將IR固定在CM5晶片上，並用1M的氨基乙醇阻斷其它的活性位點。將對照流體室活化並且在不存在IR的情況下進行阻斷。將固定水平固定在500 Biacore反應單位（RU），並逐漸增加流經晶片表面的反應物的濃度（在圖3a所示的實驗中，使用的是rhMG53，濃度從0.49 nM-500 nM；在圖3b所示的實驗中，使用的是rhMG53以及MG53抗體#84的混合物，其中MG53抗體的濃度固定為500 nM，而rhMG53的濃度從0 nM-2000 nM）。

上面兩個結合實驗均在攝氏25度，PBS-P（20 mM磷酸緩衝液，2.7 mM NaCl, 137 mM KCl, 0.05%（體積比）的表面活性劑P-20，pH=7.4）緩衝液中進行。在每次樣品注射後用10 mM NaOH（pH=10）進行再生。使用Biacore T200儀器進行檢測並使用其軟體進行數據分析。

實施例 2 ：細胞外游離 MG53 的功能研究

實施例2中使用的西方墨點法的步驟如下：

(1) 製膠：將玻璃板洗淨，烘乾。組裝垂直電泳儀，按順序分別灌注8%分離膠和5%濃縮膠。

(2) 配製電泳緩衝液：用Tris和甘胺酸配製5×電泳緩衝液的母液，稀釋至1×，取600 mL加入垂直電泳槽。

(3) 上樣：將製好的蛋白樣品冷卻至室溫融化並且離心混勻，從左至右依次上樣為蛋白標準品，蛋白樣品，若有孔無樣品，則應加入等量的1×上樣緩衝液補充以配平，不留空道，以防條帶歪斜。

(4) 跑膠：將電泳裝置與電源連接，加7 V/cm的電壓，當溴酚藍前沿進入分離膠並且蛋白標準品分離出明顯的條帶之後，把電壓提高到11 V/cm，持續電泳至溴酚藍到達分離膠的底部。

(5) 配製轉膜緩衝液：用Tris和甘胺酸配製20×轉膜緩衝液的母液，稀釋至1×，加入20％的甲醇混勻，備用。

(6) 轉膜：用濕式電轉槽轉膜，按「三明治」式的順序依次從黑色塑膠板上擺放海綿、雙層濾紙、凝膠、PVDF膜、雙層濾紙、海綿，小心夾緊後放入電轉槽，（注意PVDF膜和凝膠之間切勿出現氣泡，否則影響轉膜的效果）加入轉膜緩衝液1000 mL，將裝置放在冰上，接通電源，恆流275 mA轉膜2小時。

(7) 阻斷：將10×TBS溶液先稀釋至1×，加0.1%的Tween-20配製成1×TBST溶液，然後加入5％（w/v）的脫脂奶粉作為阻斷緩衝液，轉膜完成後，小心取出PVDF膜，放入阻斷緩衝液中，室溫在搖床上慢搖阻斷1小時。

(8) 孵一抗：一抗溶液的配製，在含5%（w/v）BSA的TBST溶液中加入1‰一抗。膜封閉完成以後，用TBST洗三次，每次5 min，加入對應的一抗溶液，4℃搖床慢搖孵育過夜。

(9) 孵二抗：配製二抗溶液，二抗在含5%脫脂奶粉的TBST中以1:2000的比例稀釋即為二抗溶液，注意二抗需和一抗對應，即需要注意是鼠抗還是兔抗等。將一抗孵育過夜的膜取出，用TBST洗三次，每次5 min，然後加入二抗溶液，室溫搖床慢搖孵育1小時。

(10) 化學發光檢測：將二抗孵育過的PVDF膜取出，用TBST洗三次，每次5 min，將膜浸在TBST中備用。配製化學發光反應基質A、B，按照體積比為1:1的比例混合，注意避光操作，然後加在PVDF膜上，反應5 min，用BIO-RAD的ChemiDocXRS進行化學發光檢測條帶。

(11) 重新孵育一抗：用TBST洗膜2次，每次5 min。加入洗脫緩衝液，50℃, 50 rpm洗膜30 min。TBST洗膜6次，每次5 min。抗體洗脫後，又可以透過孵育其他一抗-二抗檢測相應蛋白質。化學發光檢測條帶印跡圖片用ImageJ軟件分析灰度值。

使用本申請的抗體檢測細胞外游離 MG53

從14周齡的WT小鼠以及MG53^-/- （透過基因剔除技術剔除MG53基因）小鼠的尾靜脈取血，離心取血清。使用0.5 μL血清上樣，將MG53抗體#84作為一抗，HRP抗兔抗體作為二抗，進行西方墨點法檢測，檢測結果如圖4所示。由實驗結果可知，使用本申請的MG53抗體能夠清楚區分表達MG53的樣品以及不表達MG53的樣品。

從14周齡的WT小鼠以及TG小鼠（透過基因技術使得MG53基因過表達）的尾靜脈取血，離心取血清。使用0.5 μL血清上樣，將MG53抗體#84作為一抗，HRP抗兔抗體作為二抗，進行西方墨點法檢測，檢測結果如圖5所示。由實驗結果可知，使用本申請的MG53抗體進行的實驗能夠清楚區分不同濃度的血清MG53。

使用上述相同的西方墨點法，使用MG53抗體#84檢測rmMG53-myc（HEK293細胞表達的帶有myc標籤的重組小鼠MG53蛋白）以及rhMG53（HEK293細胞表達的純化重組人MG53蛋白），檢測結果如圖6所示。由實驗結果可知，本申請的MG53抗體能夠用於檢測人源和鼠源的細胞外游離MG53。

細胞外游離 MG53 的功能驗證

獲取37名第2型糖尿病患者的血清（T2D）以及21名正常人的血清（對照）。使用上述相同的西方墨點法，檢測上述血清樣品，檢測結果如圖7所示。由實驗結果可知，第2型糖尿病患者中的血清MG53含量相對於正常人中的含量具有統計學意義（利用t-test檢驗），從而能夠基於血清MG53的含量來判斷是否患有糖尿病以及患有糖尿病的風險。

獲取18只用高脂肪飲食（使用Cat. #D12492飼料，購自 ResearchDiets Inc.，其中60%的能量來自於脂肪，餵養35周）小鼠的血清以及15隻用正常飲食小鼠的血清。使用上述相同的西方墨點法，檢測上述血清樣品，檢測結果如圖8所示。由實驗結果可知，高脂肪飲食會誘導血清MG53的升高，從而能夠根據血清MG53的含量來判斷患有脂肪代謝類疾病的風險。

獲取6隻12周大的ZDF大鼠（Zucker diabetic fatty rat，購自Vital River Laboratories（中國，北京），Cat# 123）以及6隻正常SD大鼠的血清，用ELISA試劑盒（Cusbio）檢測血清中的MG53含量，用血糖儀（Roche）檢測血糖含量，用ELISA試劑盒（Millipore）檢測血胰島素含量，並測量體重。數據如圖9所示。由實驗結果可知，血清MG53的含量與體重、血糖以及血胰島素的含量呈線性相關，從而能夠根據血清MG53的含量來判斷糖尿病的風險和進展，以及對治療的反應。

選擇8-10周大小的C57（購自維通利華）小鼠，整夜禁食，隨後以6 mg/kg的劑量尾靜脈注射重組人MG53蛋白（rhMG53）或BSA，在10分鐘後以1 U/kg的劑量腹腔注射或不注射胰島素。再過10分鐘後，處死小鼠並獲取相應的組織材料。使用西方墨點法檢測實驗各組骨骼肌、肝臟、脂肪及心臟組織中的胰島素訊息傳遞路徑重要分子akt的磷酸化含量，進而檢測幾種組織的胰島素敏感性。其中各抗體來源如下：Anti-phospho Ser473 Akt （p-AktS473），CST Cat# 4060；Anti-total Akt （t-Akt），CST Cat# 9272；Anti-GAPDH，Bioeasy Technology，Cat# BE0023。利用One-way anova進行統計分析。**表示P＜0.01。檢測結果如圖10所示。由實驗結果可知，血清MG53會降低胰島素的敏感性，從而能夠透過降低血清MG53的濃度或者活性來改善胰島素的敏感性。

高糖和高胰島素誘導的來自離體灌流齧齒動物心臟的 MG53 釋放

成年SD大鼠（250至300 g）或小鼠（20至30 g）用戊巴比妥麻醉（70 mg/kg體重，腹腔注射）。大鼠或小鼠的心臟被切離，並且在Langendorff裝置上以55 mm汞柱的恆定壓力用Krebs-Henseleit緩衝液灌流（NaCl 118 mM，KCl 4.7 mM，CaCl₂ 2.5 mM，MgSO₄ •7H₂ O 1.2 mM，KH₂ PO₄ 1.2 mM以及葡萄糖11.1 mM）。緩衝液持續通有95 % O₂ / 5 % CO₂ （pH 7.4），並且透過熱浴/循環泵加熱。持續監控心臟的溫度，並且使其持續保持在37±0.5°C。收集不同時間段流出的灌流液。對於EDTA或BFA處理，灌流液溶液中包括0.75 mM EDTA-Na（灌流液溶液中無Ca²⁺ ）或30M BFA。收集的灌流液樣品用Amicon Ultra-15 10K濾膜離心裝置（Millipore，Cat# UFC801096）以3,000 rpm離心15分鐘並重複3次。經濃縮的灌流液樣品用於後續的分析。

用生理鹽水給離體齧齒動物的心臟進行Langendorff灌流之後，我們透過對在大鼠心臟中經過30分鐘時間段的累積以及在小鼠心臟中經過60分鐘時間段的累積的流出灌流液進行西方墨點法分析，檢測到了大量MG53的釋放（圖32）。引人注目的是，用高糖（25 mM）代謝挑戰使大鼠心肌MG53釋放在刺激後的第一個30分鐘增加3倍（圖32A）。升高的MG53釋放持續到葡萄糖挑戰的第二個30分鐘期間（30–60分鐘），並且以葡萄糖濃度依賴的方式遞增（圖32A和32B）。與此形成強烈對比的是，不能被生物體利用的L-葡萄糖無法改變心肌MG53的釋放（圖32C）。為了模仿代謝症候群和T2D的條件，我們研究了葡萄糖和胰島素共同刺激的效應。用基底濃度的葡萄糖（11.1 mM）刺激胰島素使得離體灌流的大鼠心臟中的心肌MG53釋放以時間依賴的和濃度依賴的方式增加（圖32D和32E）。高糖和高胰島素共同存在刺激MG53以~4倍於基線的速率釋放（圖32C）。另外，我們使用MG53過表達（mg53 TG）和剔除（mg53^-/- ）小鼠模型，證明了糖和胰島素的結合刺激誘導的MG53從mg53 TG心臟中釋放與野生型（wt）小鼠相比增加至少兩倍，而在mg53^-/- 心臟的灌流液中沒有檢測到MG53的釋放（圖32G和32H）。這證實了西方墨點法檢測到的釋放的蛋白。如圖35A和35B所示，高糖加高胰島素引起的MG53釋放的發生不會帶來灌流的大鼠心臟中心肌乳酸脫氫酶（LDH）或肌酸激酶（CK）釋放（指示細胞膜完整性喪失）的任何變化，這表示代謝調節的MG53釋放不是由於心肌損傷造成的。

高糖和高胰島素引起離體骨髓肌中的 MG53 釋放和體內的 MG53 釋放

成年雄性C57小鼠（20至30 g）用戊巴比妥麻醉（70mg/kg，腹腔注射）。自小鼠分離比目魚肌，並且在室溫（22^o C）下以改良的Krebs-Henseleit溶液（NaCl 118 mM，KCl 4.7 mM，CaCl₂ 2.5 mM，MgSO₄ •7H₂ O 1.2 mM，KH₂ PO₄ 1.2 mM，葡萄糖5 mM）在通有95% O₂ /5% CO₂ 混合氣體的情況下以1.0 mL/min的速度連續灌流。適應灌流10分鐘後，用含有或不含有高糖（25 mM）結合高胰島素（10 U/L）的改良的Krebs-Henseleit溶液緩衝液處理比目魚肌2小時。灌流液樣品在超濾濃縮後用西方墨點法實驗分析。

除了心肌，高糖（25 mM）和高胰島素（10 U/L）的結合處理還有效地引起從來自野生型小鼠的離體灌流的骨骼肌（比目魚肌）中釋放MG53（圖33A）。葡萄糖誘導的從骨骼肌中釋放MG53的發生不會帶來任何灌流液中的LDH或CK濃度的升高（圖35C和35D）。這一結果表示，代謝刺激在生理條件下能夠促使骨骼肌以及心肌釋放MG53。由於骨骼肌占個體身體非脂肪重量的大約40%，我們假設高糖誘導的MG53釋放將足以升高體內的循環MG53含量。高血糖（葡萄糖，2 g/kg，腹腔注射，以40分鐘間隔重複三次）提高了野生型小鼠的血清MG53（圖33B）。

健康人體中葡萄糖的口服遞送

健康的志願者禁食過夜，然後以30分鐘間隔口服遞送葡萄糖（75 g）兩次。在葡萄糖處理之前以及在第二次給藥後30和90分鐘採集血樣。血樣以3,000 rpm離心，並且收集血清用於進行西方墨點法。

在健康人體中，葡萄糖的口服施用顯著升高了血清MG53含量（圖33C），同時提高了血糖含量，而不帶來血清LDH濃度的變化。

調節分泌途徑介導代謝誘導的 MG53 釋放

利用藥理學和基因學的方法，我們隨後嘗試解釋代謝調節MG53的釋放的潛在機制。首先，為了區別調節MG53分泌與被動漏出，我們評價了一種蛋白轉運抑制劑Brefeldin A（BFA）的作用效果。在表達MG53-myc的HEK293細胞中，BFA以劑量依賴的方式抑制高糖誘導的MG53釋放（圖33D）。BFA（30 μM）還可以在離體灌流的大鼠心臟中阻斷葡萄糖誘導的MG53釋放（圖33E），這說明葡萄糖引起的MG53釋放是由經典分泌途徑介導的。對於大多數的調節分泌，細胞質Ca²⁺ 濃度的升高是分泌囊泡膜與細胞膜的融合以及透過胞吐作用釋放囊泡內容物的先決條件。用EDTA（0.75mM）緩衝胞外Ca²⁺ 離子實際上會很大程度上阻斷代謝調節的MG53分泌（圖33F）。在syt7^-/- 小鼠中，離體灌流的心臟中和體內的高糖加高胰島素刺激的MG53釋放被阻斷（圖33G和33H），這表示代謝調節的MG53分泌需要Syt7。值得注意的是，不論是EDTA處理還是Syt7缺失，均沒有改變灌流的齧齒動物心臟中（圖33F和33G）或體內（圖33H）的基礎MG53釋放，這說明基礎MG53釋放可能歸因於非典型的分泌或者漏出。將這些結果匯總在一起，我們認為，和多種細胞因子一樣，代謝誘導的MG53釋放是由Ca²⁺ 離子和SNARE結合蛋白依賴的分泌機制介導的。

MG53 的心臟特異性過表達足以引起系統性胰島素抗性和代謝症候群

為了進一步研究血液中MG53的慢性增高和代謝疾病發生可能的因果關係，我們構建了心臟特異過表達MG53的基因轉殖小鼠（mg53 h-TG）。心肌MG53分泌會持續提供循環MG53，而骨骼肌中的MG53表達不會被干擾。圖34A示出了14周齡的年輕成年mg53 h-TG小鼠中的基礎血清MG53含量明顯高於同窩的野生型小鼠。

測量了3至38周齡野生型和mg53 h-TG小鼠禁食體重，並且分別對14和30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠進行了葡萄糖耐受測試（GTT）和胰島素耐受測試（ITT）。簡言之，對於GTT，小鼠禁食過夜（16小時）並且隨後腹腔注射D-葡萄糖（2 g/kg，Sigma-Aldrich）。對於ITT，小鼠隨機餵食並且用牛胰島素攻毒（0.75單位/kg，Sigma-Aldrich，腹腔注射）在注射前以及注射後的不同時間點（如圖34C和34D中所示）收集來自尾靜脈的血液並測量血糖。

年輕的mg53 h-TG小鼠表現出中度肥胖（圖34B）、葡萄糖不耐受和胰島素不耐受（圖34C和34D）。在30周齡時，MG53的心臟特異性過表達足以引起全面的代謝症候群，表現為高血糖症、高胰島素血症和血脂異常（圖34E-34G）、腹部脂肪堆積、白色脂肪、棕色脂肪和脂肪非脂肪比增加（圖34H-34M），以及脂肪肝和胰腺增生（圖34N和34O）。隨著系統性胰島素抗性的發展，在此時間點mg53 h-TG小鼠顯示出嚴重的肥胖、葡萄糖不耐受和胰島素不耐受（圖34B-34D）。同時mg53 h-TG小鼠每天的能量消耗顯著低於野生型對照（圖34Q-34S），但是他們每天的進食量、核心體溫或身體活力並沒有發生變化（圖34Q-34S）。在後面的時間點，mg53 h-TG小鼠也發展出糖尿病併發症，如糖尿病心肌病。因此，循環MG53的慢性增高首先損傷全身的胰島素反應，其次導致造成肥胖、糖尿病和多種心血管併發症的系統性代謝症候群。

實施例 3 ：抗體治療效果的研究

選擇8-10周齡的20隻db/db小鼠（糖尿病模型小鼠，購自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME） Cat# 000642），其中10隻小鼠作為對照組，僅注射IgG（Sigma, I5381）；另10隻作為治療組，注射MG53抗體#84。同時訂購年齡相同的5隻db/+小鼠。db/+小鼠僅用於最後取材，不進行注射。

小鼠到達後，穩定1周，而後測小鼠的體重、血糖，並檢查狀態。實驗當天，動物不禁食，早8點測量體重和血糖。而後進行分組，注意嚴格匹配體重和血糖。根據分組情況進行注射。隨後，以1 mg/隻/次，注射體積0.24ml /隻/次，於9點注射1次。之後小鼠禁食，在實驗當天15點、19點分別測量血糖。並在之後的每天9點測量體重，9點和15點分別測量血糖，連續測量10天。

在注射後的第8天進行胰島素耐受實驗（ITT），實驗條件參見文獻Song等人，Central role of E3 biquitin ligase MG53 in insulin resistance and metabolic disorders, Nature, 494, 375-381, 2013中的描述。

檢測結果如圖11所示。由實驗結果可知，MG53抗體能夠有效降低血糖並且能夠改善胰島素的敏感性，從而能夠用於治療糖尿病。

實施例 4 ： MG53 小分子抑制劑的研究

實施例4所用的所有小分子化合物均購買自荷蘭的SPECS化合物庫，MG53蛋白由ORIGENE公司合成製備。

電腦虛擬篩選

首先對MG53蛋白進行同源模擬，選擇蛋白一級結構即胺基酸序列同源性較高並且被解析的結構分辨率較高的已知蛋白結構作為參考結構，然後用Cavity 2.0對小分子結合口袋進行預測，選擇口袋體積相對較大、解離常數（pKD）較大並且具有兩親性的口袋作為目標口袋。

篩選的原則是透過不同角度不同方式去篩選，每種篩選方法按照小分子化合物和蛋白的結合強弱給分，而每次都選擇給分較高的分子，最後取不同方法篩選結果的交集。具體操作如下：首先，使蛋白口袋中的各個基團固定，用小分子化合物去自由對接，選取給分高的兩萬個化合物；然後讓小分子化合物和基團都可以自由旋轉對接，選取給分高的四千個化合物；接下來用pymol軟體進行手動篩選，篩選的標準有以下五個：a. 化合物的分子量要大於300 Da，分子量太小特異性反應會變弱；b. 化合物與口袋中的基團之間要有至少三個氫鍵的相互作用，這是為了增加化合物和蛋白之間的相互作用；c. 化合物對蛋白口袋要有80%以上的佔有率，這也是為了降低非特異性；d. 化合物不能是一個多肽，這是為了避免機體內的多肽的非特異性結合；e. 化合物中不含有金屬原子。最後得到了140個小分子化合物。

細胞篩選

接下來對這140個分子進行細胞層面的篩選。為了進行大量的篩選實驗，構建專用細胞篩選體系。首先構建帶GFP螢光標記的IRS1質體（IRS1-GFP）以及帶Myc標記的MG53質體（MG53-myc），同時將這兩種質體轉染細胞當中使其高表達，正常情況下，MG53會行使其E3連接酶的活性介導IRS1的泛素化降解，使其產生的螢光強度與對照組相比顯著降低，從而破壞細胞胰島素訊息傳遞路徑。將這兩種質體共轉細胞的同時再加入一個小分子化合物，如果小分子化合物對MG53蛋白活性有抑制作用，會阻礙其在細胞內行使其正常的功能，此時IRS1的螢光強度會得到一定的恢復，據此來甄別對MG53具有抑制作用的小分子化合物。為了選擇一種可控性比較好並且容易操作的細胞，在HEK293T和HEK293A細胞中做了比較實驗。即，分別在這兩種細胞中共轉MG53-Myc和IRS1-GFP。篩選結果如圖12所示。發現HEK293T細胞中，MG53能夠使IRS1的螢光強度有一個較大的減弱。為了增大後續篩選實驗的操作窗口，選擇在HEK293T細胞中進行後續實驗。

建立篩選體系以後，在HEK293T細胞中進行140個小分子化合物的篩選。首先用10 mL的細胞培養皿培養HEK293T細胞，兩天換一次培養基，挑選生長健康狀態較好的細胞，等到細胞鋪滿整個細胞培養皿80%的時候進行MG53-Myc和IRS1-GFP的共轉染，並且同時進行對照組pcDNA4空載體和IRS1-GFP的共轉染。轉染後細胞培養24小時，對照組在螢光顯微鏡下可以看到GFP有很強的表達，而此時實驗組的螢光強度有50%以上的減弱。接下來，用0.125%的胰酶將細胞分別消化下來，低速離心收集細胞，再把細胞混勻以後分別鋪在96孔盤的酵素連結免疫分析盤上，繼續培養。24小時以後對細胞進行換液和加入待測小分子化合物。繼續培養24小時，最後用PBS將細胞洗3次，進行485nm/528nm的螢光信號檢測。分別對化合物進行濃度為100 μM、10 μM和1 μM的篩選。共篩選出48個候選化合物分子。

SPR 篩選

對這48個候選的化合物分子進行SPR實驗的初步篩選。根據理論計算，MG53蛋白和小分子化合物之間相互結合的理論反應值為5，因此篩選的標準之一就是反應值要大於或等於5。我們選擇了兩個濃度，分別是50 μM和100 μM進行篩選，另外對照組是PBS溶液。如圖13所示，在這48個小分子化合物中總共有15個分子的反應值不小於5（其中，10號、14號、16號、17號、25號、68號、13號、16號和28號相對高反應；1號、3號、26號、28號、56號和10號相對低反應），這些化合物作為下一步篩選的候選分子。

接下來，透過濃度依賴的SPR實驗探究這15個候選分子與MG53結合的動力學特徵。篩選標準包括解離常數要小於50 μM，不是非特異性結合，分子純度要高，最後篩選得到4個候選分子（數據參見圖14，分別是1號，10號，26號和16號）。這4個分子的解離常數均小於50 μM（看右邊對應的S型曲線，解離常數為當反應值達到最大反應值一半時的化合物濃度），最低反應濃度都非常小，達到了奈莫耳級別，這表示該化合物與MG53蛋白結合的特異性越高，成藥性越好，相應的動力學曲線也都是「S」型曲線，表示這4個化合物分子有較好的動力學特徵。另外的11個化合物分子由於分子純度不夠（透過小分子質譜的方式進行檢測），或者是解離常數太大（解離常數在50 μM以上），亦或是表現出糟糕的動力學特徵（動力學曲線呈直線或不是S型曲線，表示分子和MG53蛋白結合具有很強的非特異性），等等。在所有的這4個候選分子中，值得一提的是第26號分子，其最低反應濃度僅僅1.2 nM，解離常數為100 nM，表示這個分子和MG53蛋白具有非常好的特異性結合，而且其SPR的反應曲線是「慢上慢下」類型，這表示，如果將其用於給藥治療的話，將表現出用藥量少，藥效長，藥效穩定，並且給藥時間間隔長等諸多優點，因此具有很大的成藥可能性。

降解實驗驗證

接下來，對4個候選分子的細胞內活性進行了進一步的驗證。將培養狀態良好的HEK293T細胞分為6組，分別轉染IRS1以及MG53-myc，對於轉染了IRS1和MG53-myc的4組細胞分別進行加化合物處理，所加化合物濃度均為50 μM，加入化合物24小時以後進行細胞總蛋白的提取以及SDS-PAGE膠垂直電泳實驗。曝光時分別檢測了IRS1以及MG53蛋白的表達情況，以GAPDH作為內參對照。我們發現這4個化合物分子對於MG53介導的IRS1的泛素化降解均具有一定的不同程度的恢復作用（參見圖15），這表示這些化合物分子對於MG53在細胞內行使其E3連接酶的功能具有一定程度的抑制作用。

篩選出的4個化合物的結構如下：

無

圖1：野生型MG53的分子結構模式圖。

圖2：用於檢測MG53抗體與抗原蛋白親和力的SPR實驗結果圖，該抗體的K_D =17.7 nM。

圖3：a. 用於檢測MG53與胰島素受體胞外區親和力的SPR實驗結果圖，MG53與胰島素受體胞外區的K_D =8.0 nM；b. 用於檢測MG53抗體阻斷MG53與胰島素受體胞外區結合的SPR實驗結果圖。抗體的Ki=265 nM。

圖4：使用本申請的抗體做為一抗透過西方墨點法檢測MG53^-/- 小鼠（MG53基因剔除）和野生型小鼠血清中MG53的含量。上圖是西方墨點圖，下圖是根據西方墨點圖計算出的數值繪製的柱狀圖。其中**表示P＜0.01，具有顯著差異，利用t-test統計檢驗。

圖5：使用本申請的抗體做為一抗透過西方墨點法檢測TG小鼠（MG53基因過表達）和野生型小鼠血清中MG53的含量。上圖是西方墨點圖，下圖是根據西方墨點圖計算出的數值繪製的柱狀圖。其中**表示P＜0.01，具有顯著差異，利用t-test統計檢驗。

圖6：使用本申請的抗體做為一抗透過西方墨點法檢測重組小鼠MG53和重組人MG53。

圖7：使用本申請的抗體做為一抗透過西方墨點法檢測II型糖尿病病人和正常人血清中MG53的含量。上圖是蛋白西方墨點圖，下圖是根據西方墨點圖計算出的數值繪製的柱狀圖。其中**表示P＜0.01，具有顯著差異，利用t-test統計檢驗。

圖8：使用本申請的抗體做為一抗透過西方墨點法檢測高脂肪飲食小鼠和正常飲食小鼠血清中MG53的含量。上圖是西方墨點圖，下圖是根據西方墨點圖計算出的數值繪製的柱狀圖。其中**表示P＜0.01，具有顯著差異，利用t-test統計檢驗。

圖9：a. 禁食正常大鼠和禁食ZDF大鼠的血清MG53的含量；b. 禁食正常大鼠和禁食ZDF大鼠中血清MG53濃度與體重的關係圖；c. 禁食正常大鼠和禁食ZDF大鼠中血清MG53濃度與血糖含量的關係圖；d. 禁食正常大鼠和禁食ZDF大鼠中血清MG53濃度與血清胰島素含量的關係圖。其中**表示P＜0.01，具有顯著差異，利用t-test統計檢驗。

圖10：檢測了在注射或不注射胰島素，以及隨後注射BSA或rhMG53的小鼠中在不同組織（骨骼肌、肝、內臟脂肪以及心臟）中GAPDH（對照）、Akt以及胰島素誘導的磷酸化後的Akt的濃度。上圖是西方墨點圖，下圖是根據西方墨點圖計算出的數值繪製的柱狀圖。其中**表示P＜0.01，具有顯著差異，利用One-way anova統計檢驗。

圖11：a. 正常小鼠和糖尿病模型小鼠的血清MG53的含量；b. 對照組（給藥IgG）和治療組（給藥MG53抗體）中的血糖含量；c. 胰島素耐受實驗中，對照組（給藥IgG）和治療組（給藥MG53抗體）的血糖含量。其中**表示P＜0.01，具有顯著差異，*表示P＜0.05，具有顯著差異，利用t-test統計檢驗。

圖12：分別在HEK293T細胞和HEK293A細胞中共轉染IRS1質體（IRS1-GFP）以及帶Myc標記的MG53質體（MG53-myc），檢測GFP的螢光強度，其中**表示P＜0.01，具有顯著差異，*表示P＜0.05，具有顯著差異，利用t-test統計檢驗。

圖13：用於篩選不同候選分子的SPR實驗的反應值。

圖14：a. 化合物1的SPR實驗的反應值；b. 化合物10的SPR實驗的反應值；c. 化合物26的SPR實驗的反應值；d. 化合物16的SPR實驗的反應值。

圖15：在HEK293T中共轉染IRS1質體（IRS1-GFP）以及帶Myc標記的MG53質體（MG53-myc），並且分別加入化合物1、10、26和16，隨後檢測GFP的螢光強度。***表示P＜0.001，具有顯著差異，利用One-way anova統計檢驗。

圖16：顯示抗體#6的重鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 3及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 7。其中，陰影標示的序列對應於抗體#6的重鏈可變區。

圖17：顯示抗體#6的輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 4及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 8。其中，陰影標示的序列對應於抗體#6的輕鏈可變區。

圖18：顯示抗體#110的重鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 11及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 15。其中，陰影標示的序列對應於抗體#110的重鏈可變區。

圖19：顯示抗體#110的輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 12及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 16。其中，陰影標示的序列對應於抗體#110的輕鏈可變區。

圖20：顯示抗體#84的重鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 19及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 23。其中，陰影標示的序列對應於抗體#84的重鏈可變區。

圖21：顯示抗體#84的輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 20及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 24。其中，陰影標示的序列對應於抗體#84的輕鏈可變區。

圖22：顯示抗體#9的重鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 27及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 31。其中，陰影標示的序列對應於抗體#9的重鏈可變區。

圖23：顯示抗體#9的輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 28及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 32。其中，陰影標示的序列對應於抗體#9的輕鏈可變區。

圖24：顯示抗體#43的重鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 35及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 39。其中，陰影標示的序列對應於抗體#43的重鏈可變區。

圖25：顯示抗體#43的輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 36及其編碼核酸序列SEQ ID NO: 40。其中，陰影標示的序列對應於抗體#43的輕鏈可變區。

圖26：顯示人野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO: 41、猴子野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO: 42、大鼠野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO: 43以及小鼠野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO: 44。

圖27：顯示豬野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO: 45、狗野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO: 46、兔野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO: 47以及狨猴野生型MG53的胺基酸序列SEQ ID NO: 61。

圖28：顯示一些MG53突變體的序列（SEQ ID NO: 48-50）。

圖29：顯示一些MG53突變體的序列（SEQ ID NO: 51-53）。

圖30：顯示一些MG53突變體的序列（SEQ ID NO: 54-57）。

圖31：顯示人胰島素受體的序列（SEQ ID NO: 58）。

圖32：顯示高糖和高胰島素誘導的在離體灌流的齧齒類動物心臟中的MG53釋放。圖32 A示出了代表性的西方墨點圖（上方區塊）和平均數據（下方區塊），其表示高糖會在離體灌流的大鼠心臟中以時間依賴的方式增加灌流液中的MG53（n=12個心臟）。圖32 B示出了代表性的西方墨點圖（上方區塊）和平均數據（下方區塊），其表示高糖會在離體灌流的大鼠心臟中以濃度依賴的方式增加灌流液中的MG53含量（n=10個心臟）。圖32C示出了用高濃度的D-葡萄糖（25 mM）或者L-葡萄糖（在存在11.1 mM的基底D-葡萄糖的條件下，13.9 mM L-葡萄糖）（n=8/組）灌流的離體大鼠心臟中的灌流液中的MG53；獲取基礎條件下（0分鐘，11.1 mM D-葡萄糖）的數據和處理30分鐘後的數據。圖32D用胰島素刺激，其他條件與圖32A一致（n=11）。圖32E用胰島素刺激，其他條件與圖32A一致（n=6）。圖32F示出了在離體灌流的大鼠心臟中用高糖（25 mM）結合高胰島素（10單位/升）（葡萄糖+胰島素）的代謝刺激（n=15）。圖32G和圖32H示出了MG53基因轉殖小鼠心臟灌流液中的MG53比野生型對照小鼠更為豐富，無論是在基礎狀態還是代謝刺激狀態（葡萄糖+胰島素，25 mM葡萄糖結合10單位/升胰島素）（圖32G），而在mg53^-/- 小鼠心臟灌流液中無法檢測到MG53（圖32H）（n=8/組）。在所有的柱狀圖中，數據都已標準化至對應的透過亮綠染色得到的非特異性條（NS），並且以平均值±標準差表示（*P＜0.05，**P＜0.01）；A-E、G和H進行單向ANOVA，並且F進行t-test。各柱狀圖的對照為各自凝膠的第一泳道。

圖33：顯示高糖和高胰島素誘導的離體骨骼肌中的MG53分泌和體內的MG53分泌。圖33A示出了代表性的西方墨點圖（上方區塊）和平均數據（下方區塊），其表示經過或不經過高濃度的葡萄糖（25 mM）和胰島素（10單位/升）（葡萄糖+胰島素）處理（n=12），小鼠比目魚肌的灌流液中的MG53含量。圖33B示出了代表性的西方墨點圖和平均數據，其表示高血糖（葡萄糖，2 g/kg，腹腔注射，以40分鐘間隔重複三次）增加野生型小鼠中的血清MG53（n=8）。圖33C示出了代表性的西方墨點圖和平均數據，其表示口服葡萄糖施用（75 g，以30分鐘間隔施用兩次）（n=8）前後的來自健康人體的血清MG53。圖33D示出了BFA劑量依賴性地抑制C2C12細胞中的MG53釋放。細胞經Ad-b-gal或Ad-MG53感染，並且用高糖（25 mM）孵育3小時（n=8）。圖33E示出了BFA（30 mM）阻斷高糖（25 mM）結合高胰島素（10單位/升）（葡萄糖+胰島素）誘導的大鼠離體灌流的心臟中灌流液中MG53的增加（n=10）。圖33F示出了EDTA-Na（0.75 mM）阻斷代謝壓力（葡萄糖+胰島素，25 mM葡萄糖結合10單位/升胰島素）誘導的大鼠離體灌流的心臟中灌流液中MG53的增加（n=10）。圖33G示出了代謝刺激（葡萄糖+胰島素，25毫莫耳葡萄糖結合10單位/升胰島素）提高野生型小鼠的MG53釋放，而syt7^-/- 小鼠心臟則不然（n=10）。圖33H示出了高血糖（葡萄糖，2 g/kg，腹腔注射，以40分鐘間隔重複三次）增加野生型小鼠中的血清MG53，而syt7^-/- 小鼠則不然（n=10）。在所有的下方區塊中，數據都已歸一化至對應的透過亮綠染色得到的非特異性條（NS），並且以均值±標準差表示（*P＜0.05，**P＜0.01）；A進行t-test，並且B-H進行單向ANOVA。

圖34：顯示心臟特異性的MG53過表達導致系統性胰島素抗性和代謝症候群。圖34A示出了代表性的西方墨點圖和平均數據，其表示14周齡野生型和MG53心臟特異性過表達的基因轉殖小鼠（mg53 h-TG）中的血清MG53含量（野生型n=12，mg53 h-TG n=14）。圖34B示出了3至38周齡野生型和mg53 h-TG小鼠禁食體重（野生型n=28，mg53 h-TG n=22）。圖34C示出了在指定年齡的野生型和mg53 h-TG小鼠中的葡萄糖耐受測試（14周齡，野生型和mg53 h-TG均為n=9；30周齡，野生型n=7，mg53 h-TG n=6）。圖34D示出了在指定年齡的野生型和mg53 h-TG小鼠中的胰島素耐受測試（14周齡，野生型n=9，mg53 h-TG n=10；30周齡，野生型n=8，mg53 h-TG n=7）。圖34E示出了30周齡時的血糖（野生型n=11，mg53 h-TG n=13）。圖34F示出了30周齡時的禁食血清胰島素（野生型n=11，mg53 h-TG n=13）。圖34G示出了30周齡時的禁食血清三酸甘油酯含量（野生型n=11，mg53 h-TG n=13）。圖34H示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠屍檢期間拍攝的照片，其顯示腹腔內的脂肪沉積（野生型n=11，mg53 h-TG n=14）。圖34I示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠的皮下和內臟脂肪重量（野生型n=11，mg53 h-TG n=14）。圖34J示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠的棕色脂肪重量（野生型n=11，mg53 h-TG n=14）。圖34K示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠的身體非脂肪重量和脂肪重量（野生型n=11，mg53 h-TG n=14）。圖34L示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠的身體非脂肪重量和脂肪重量占體重百分比（野生型n=11，mg53 h-TG n=14）。圖34M示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠白色和棕色脂肪的蘇木精和伊紅染色（野生型n=11，mg53 h-TG n=14）。圖34N示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠肝臟的蘇木精和伊紅染色（野生型n=11，mg53 h-TG n=14）。圖34O示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠胰腺的蘇木精和伊紅染色（野生型n=11，mg53 h-TG n=14）。圖34P示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠骨骼肌的蘇木精和伊紅染色（野生型n=11，mg53 h-TG n=14）。標尺大小：白色脂肪，50 μm；棕色脂肪，25 μm，肝臟，100 μm；以及胰腺，100 μm。圖34Q示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠的氧氣消耗量（n=12）。圖34R示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠的CO₂ 產量（n=12）。圖34S示出了30周齡的野生型和mg53 h-TG小鼠每天的能量消耗（n=12）。數據為平均值±標準差。相對於野生型，*P＜0.05，**P＜0.01；t-test。

圖35：顯示高糖和高胰島素誘導的MG53從橫紋肌中的釋放。圖35A示出了灌流液中的乳酸脫氫酶（LDH，n=10），其來自經或不經高糖（25 mM）和高胰島素（10單位/升）刺激30分鐘的小鼠心臟的灌流液。圖35A示出了來自經或不經高糖（25 mM）和高胰島素（10單位/升）刺激30分鐘的小鼠心臟的灌流液的肌酸激酶（CK，n-8）。圖35C示出了來自經或不經高糖（25 mM）和高胰島素（10單位/升）處理的小鼠骨骼肌（比目魚肌）的灌流液的LDH含量（n=10）。圖35D示出了來自經或不經高糖（25 mM）和高胰島素（10單位/升）處理的小鼠骨骼肌（比目魚肌）的灌流液的CK含量（n=10）。數據為平均值±標準差。

序列表

<110> 北京大學

<120> 檢測或抑制細胞外游離MG53的方法和用途

<130> 066467-8002CN01

<140> 107138745
<141> 2018-11-01

<160> 61

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 136
<212> PRT
<213> 兔

<400> 1

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Leu Ser
35 40 45

Arg Asn Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60

Trp Ile Gly Tyr Val Asp Phe Glu Asp Asp Arg Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ser Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110

Val Arg Gly Asn Pro Gly Ala Thr Arg Gly Gly Ile Ile Trp Gly Pro
115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135

<210> 2
<211> 134
<212> PRT
<213> 兔

<400> 2

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Val Thr Gln Thr Pro Ser Ser
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Lys Ser Val Pro Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser
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Gln Ser Val Tyr Ser Asn Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
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Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Ala Ser
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Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<212> PRT
<213> 兔

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr
145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
165 170 175

Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val
180 185 190

Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr
195 200 205

Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn
210 215 220

Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr
225 230 235 240

Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr
275 280 285

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290 295 300

Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile
305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu
355 360 365

Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe
370 375 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu
385 390 395 400

Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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<212> PRT
<213> 兔

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Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Ala Ser
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Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val
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Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val
165 170 175

Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln
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tcgctggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

acagcctctg gaatcgacct cagtaggaat gatataaatt gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg aatggatcgg atacgttgat tttgaggatg acagatacta cgcgagctgg 240

gtgaaaggcc gcttcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggtggatct gaaaatgacc 300

agtctgacaa gcgcggacac ggccacatat tactgtgtca gaggcaatcc tggcgctact 360

cgtggtggaa tcatctgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctcg 408

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gatgtggtgt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gatataaata tcgtgacagt 360

gataatactg ctttcggcgg agggaccgag gtggtggtca aa 402

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aaggggctgg aatggatcgg atacgttgat tttgaggatg acagatacta cgcgagctgg 240

gtgaaaggcc gcttcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggtggatct gaaaatgacc 300

agtctgacaa gcgcggacac ggccacatat tactgtgtca gaggcaatcc tggcgctact 360

cgtggtggaa tcatctgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctcggg gcaacctaag 420

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accctcacca atggggtacg caccttcccg tccgtccggc agtcctcagg cctctactcg 600

ctgagcagcg tggtgagcgt gacctcaagc agccagcccg tcacctgcaa cgtggcccac 660

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gacaccctca tgatctcacg cacccccgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccag 840

gatgaccccg aggtgcagtt cacatggtac ataaacaacg agcaggtgcg caccgcccgg 900

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ccggccccca tcgagaaaac catctccaaa gccagagggc agcccctgga gccgaaggtc 1080

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acatttgcca tcgtggtgac ccagactcca tcttccaagt ctgtccctgt gggaggcaca 120

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cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatt atgcatccat tctggcatct 240

ggggtctcat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300

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aaggtgaccc agggcacgac ctcagtcgtc cagagcttca ataggggtga ctgttag 717

<210> 9
<211> 136
<212> PRT
<213> 兔

<400> 9

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45

Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu
50 55 60

Trp Ile Gly Ser Ile Asn Asn Leu Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110

Ala Arg Gly Ser Gly Gly Thr Ser Asn Ser Tyr Asn Ile Trp Gly Pro
115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135

<210> 10
<211> 134
<212> PRT
<213> 兔

<400> 10

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45

Gln Thr Ile Tyr Asn Asn Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Asp Ser
65 70 75 80

Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gln Phe Thr
85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110

Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Ser Thr Asp Gly Ser Ala Phe Gly Gly Gly
115 120 125

Thr Glu Val Val Val Lys
130

<210> 11
<211> 459
<212> PRT
<213> 兔

<400> 11

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45

Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu
50 55 60

Trp Ile Gly Ser Ile Asn Asn Leu Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110

Ala Arg Gly Ser Gly Gly Thr Ser Asn Ser Tyr Asn Ile Trp Gly Pro
115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val
130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr
145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
165 170 175

Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val
180 185 190

Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr
195 200 205

Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn
210 215 220

Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr
225 230 235 240

Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr
275 280 285

Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg
290 295 300

Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile
305 310 315 320

Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His
325 330 335

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg
340 345 350

Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu
355 360 365

Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe
370 375 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu
385 390 395 400

Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
405 410 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly
420 425 430

Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445

Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455

<210> 12
<211> 238
<212> PRT
<213> 兔

<400> 12

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45

Gln Thr Ile Tyr Asn Asn Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Asp Ser
65 70 75 80

Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gln Phe Thr
85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110

Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Ser Thr Asp Gly Ser Ala Phe Gly Gly Gly
115 120 125

Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile
130 135 140

Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val
145 150 155 160

Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val
165 170 175

Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln
180 185 190

Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
195 200 205

Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln
210 215 220

Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235

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<212> DNA
<213> 兔

<400> 13
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tccgtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

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gaggggctgg aatggatcgg aagtattaat aatcttggta gcgcatacta cgcgagctgg 240

gcaaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggtggatct gaaaatgacc 300

agtctgacaa tcgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gaggtagtgg tggtactagc 360

aattcatata acatctgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctcg 408

<210> 14
<211> 402
<212> DNA
<213> 兔

<400> 14
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

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<210> 15
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<212> DNA
<213> 兔

<400> 15
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tccgtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

accgtctctg gattctccct cagtcgcaat gcaatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180

gaggggctgg aatggatcgg aagtattaat aatcttggta gcgcatacta cgcgagctgg 240

gcaaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggtggatct gaaaatgacc 300

agtctgacaa tcgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gaggtagtgg tggtactagc 360

aattcatata acatctgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctcggg gcaacctaag 420

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ctgagcagcg tggtgagcgt gacctcaagc agccagcccg tcacctgcaa cgtggcccac 660

ccagccacca acaccaaagt ggacaagacc gttgcgccct cgacatgcag caagcccacg 720

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<210> 16
<211> 717
<212> DNA
<213> 兔

<400> 16
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

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gtcaccatca attgccaggc cagtcaaact atttataata acaaccagtt atcgtggttt 180

cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatc tggcatccac tctggattct 240

ggggtctcat cgcggttcaa aggcagtgga tctggggcac agttcactct caccatcagc 300

gatgtggtgt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gatataagtc tagtagcact 360

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caaacaactg gcatcgagaa cagtaaaaca ccgcagaatt ctgcagattg tacctacaac 600

ctcagcagca ctctgacact gaccagcaca cagtacaaca gccacaaaga gtacacctgc 660

aaggtgaccc agggcacgac ctcagtcgtc cagagcttca ataggggtga ctgttag 717

<210> 17
<211> 134
<212> PRT
<213> 兔

<400> 17

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15

Val Gln Cys Leu Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30

Gly Gly Ser Leu Lys Val Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Leu Ser
35 40 45

Arg Tyr Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu
50 55 60

Trp Ile Gly Ile Ile Arg Thr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Ala Asp
85 90 95

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110

Val Arg Gly Gly Pro Gly Ser Gly Ala Ala Asn Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser
130

<210> 18
<211> 132
<212> PRT
<213> 兔

<400> 18

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser
35 40 45

Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Pro Ser
65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110

Ala Gly Ala Tyr Ser Val Asn Ile Asp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu
115 120 125

Val Val Val Arg
130

<210> 19
<211> 457
<212> PRT
<213> 兔

<400> 19

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15

Val Gln Cys Leu Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30

Gly Gly Ser Leu Lys Val Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Leu Ser
35 40 45

Arg Tyr Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu
50 55 60

Trp Ile Gly Ile Ile Arg Thr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Ala Asp
85 90 95

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110

Val Arg Gly Gly Pro Gly Ser Gly Ala Ala Asn Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140

Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175

Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln
180 185 190

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser
195 200 205

Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys
210 215 220

Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro
225 230 235 240

Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270

Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
275 280 285

Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln
290 295 300

Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His
305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys
325 330 335

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
340 345 350

Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu
355 360 365

Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
370 375 380

Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val
420 425 430

Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445

Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455

<210> 20
<211> 236
<212> PRT
<213> 兔

<400> 20

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser
35 40 45

Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Pro Ser
65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110

Ala Gly Ala Tyr Ser Val Asn Ile Asp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu
115 120 125

Val Val Val Arg Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro
130 135 140

Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val
145 150 155 160

Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly
165 170 175

Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser
180 185 190

Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr
195 200 205

Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr
210 215 220

Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235

<210> 21
<211> 402
<212> DNA
<213> 兔

<400> 21
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtctg 60

tcggtggagg agtccggggg aggcctggtc cagcctgggg gatccctgaa agtcacctgc 120

acagcctctg gattcgacct cagtagatat gaaatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180

gaggggctgg aatggatcgg aatcattcgt actagtggta acacatatta cgcgagctgg 240

gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggcggatct gaaaatgacc 300

agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgtca gaggtggtcc tggtagtggt 360

gctgctaatt ggggcccagg caccctggtc accgtctcct ca 402

<210> 22
<211> 396
<212> DNA
<213> 兔

<400> 22
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120

gtcaccatca gttgccagtc cagtcagagt gtttataata acaactactt atcctggtat 180

cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatt atacatccac tctgccatct 240

ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300

gacctggagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gcgcttatag cgttaatatt 360

gatgctttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaga 396

<210> 23
<211> 1374
<212> DNA
<213> 兔

<400> 23
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtctg 60

tcggtggagg agtccggggg aggcctggtc cagcctgggg gatccctgaa agtcacctgc 120

acagcctctg gattcgacct cagtagatat gaaatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180

gaggggctgg aatggatcgg aatcattcgt actagtggta acacatatta cgcgagctgg 240

gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggcggatct gaaaatgacc 300

agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgtca gaggtggtcc tggtagtggt 360

gctgctaatt ggggcccagg caccctggtc accgtctcct cagggcaacc taaggctcca 420

tcagtcttcc cactggcccc ctgctgcggg gacacaccca gctccacggt gaccctgggc 480

tgcctggtca aagggtacct cccggagcca gtgaccgtga cctggaactc gggcaccctc 540

accaatgggg tacgcacctt cccgtccgtc cggcagtcct caggcctcta ctcgctgagc 600

agcgtggtga gcgtgacctc aagcagccag cccgtcacct gcaacgtggc ccacccagcc 660

accaacacca aagtggacaa gaccgttgcg ccctcgacat gcagcaagcc cacgtgccca 720

ccccctgaac tcctgggggg accgtctgtc ttcatcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780

ctcatgatct cacgcacccc cgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggatgac 840

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ctacgggagc agcagttcaa cagcacgatc cgcgtggtca gcaccctccc catcgcgcac 960

caggactggc tgaggggcaa ggagttcaag tgcaaagtcc acaacaaggc actcccggcc 1020

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaga gggcagcccc tggagccgaa ggtctacacc 1080

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ggcttctacc cttccgacat ctcggtggag tgggagaaga acgggaaggc agaggacaac 1200

tacaagacca cgccggccgt gctggacagc gacggctcct acttcctcta cagcaagctc 1260

tcagtgccca cgagtgagtg gcagcggggc gacgtcttca cctgctccgt gatgcacgag 1320

gccttgcaca accactacac gcagaagtcc atctcccgct ctccgggtaa atga 1374

<210> 24
<211> 711
<212> DNA
<213> 兔

<400> 24
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120

gtcaccatca gttgccagtc cagtcagagt gtttataata acaactactt atcctggtat 180

cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatt atacatccac tctgccatct 240

ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300

gacctggagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gcgcttatag cgttaatatt 360

gatgctttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcagaggtg atccagttgc acctactgtc 420

ctcatcttcc caccagctgc tgatcaggtg gcaactggaa cagtcaccat cgtgtgtgtg 480

gcgaataaat actttcccga tgtcaccgtc acctgggagg tggatggcac cacccaaaca 540

actggcatcg agaacagtaa aacaccgcag aattctgcag attgtaccta caacctcagc 600

agcactctga cactgaccag cacacagtac aacagccaca aagagtacac ctgcaaggtg 660

acccagggca cgacctcagt cgtccagagc ttcaataggg gtgactgtta g 711

<210> 25
<211> 139
<212> PRT
<213> 兔

<400> 25

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Ala Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ile Ser Leu Ser
35 40 45

Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60

Trp Ile Gly Val Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110

Ala Arg Leu Ser Tyr Tyr Thr Tyr Gly His Ala Tyr Leu Lys Asp Ile
115 120 125

Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135

<210> 26
<211> 135
<212> PRT
<213> 兔

<400> 26

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro
20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser
35 40 45

Gln Ser Leu Tyr Asn His Asn Ser Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ala
50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110

Gln Gly Ser Tyr Asp Cys Ser Ser Ala Asp Cys Thr Ala Phe Gly Gly
115 120 125

Gly Thr Glu Val Val Val Lys
130 135

<210> 27
<211> 462
<212> PRT
<213> 兔

<400> 27

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Ala Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ile Ser Leu Ser
35 40 45

Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60

Trp Ile Gly Val Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95

Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110

Ala Arg Leu Ser Tyr Tyr Thr Tyr Gly His Ala Tyr Leu Lys Asp Ile
115 120 125

Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala
130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser
145 150 155 160

Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val
165 170 175

Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe
180 185 190

Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205

Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
210 215 220

Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser
225 230 235 240

Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
245 250 255

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val
275 280 285

Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro
290 295 300

Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr
305 310 315 320

Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys
325 330 335

Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350

Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro
355 360 365

Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
370 375 380

Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly
385 390 395 400

Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp
405 410 415

Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp
420 425 430

Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455 460

<210> 28
<211> 239
<212> PRT
<213> 兔

<400> 28

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro
20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser
35 40 45

Gln Ser Leu Tyr Asn His Asn Ser Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ala
50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110

Gln Gly Ser Tyr Asp Cys Ser Ser Ala Asp Cys Thr Ala Phe Gly Gly
115 120 125

Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140

Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
145 150 155 160

Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175

Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190

Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205

Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220

Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235

<210> 29
<211> 417
<212> DNA
<213> 兔

<400> 29
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tcggcggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

gcggtctctg gaatatccct cagtagctat gcaatgaact gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg aatggatcgg agtcatttat gctagtggtg gcacatacta cgcgagctgg 240

gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggtggatct gaaaatgacc 300

agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcaa gattgagtta ctatacttat 360

ggccatgctt atcttaagga catctggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcctca 417

<210> 30
<211> 405
<212> DNA
<213> 兔

<400> 30
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgccc aagtgctgac ccagactgca tcgcccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120

gtcaccatca agtgccagtc cagtcagagt ctttataatc acaactcctt agcctggttt 180

cagcagaaag cagggcagcc tcccaagcgc ctgatctatt ctgcatccac tctggcatct 240

ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300

gacgtgcagt gtgccgatgc tgccacttac tactgtcaag gcagttatga ttgtagtagt 360

gctgattgta ctgctttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaa 405

<210> 31
<211> 1389
<212> DNA
<213> 兔

<400> 31
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tcggcggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

gcggtctctg gaatatccct cagtagctat gcaatgaact gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg aatggatcgg agtcatttat gctagtggtg gcacatacta cgcgagctgg 240

gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggtggatct gaaaatgacc 300

agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcaa gattgagtta ctatacttat 360

ggccatgctt atcttaagga catctggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggg 420

caacctaagg ctccatcagt cttcccactg gccccctgct gcggggacac acccagctcc 480

acggtgaccc tgggctgcct ggtcaaaggg tacctcccgg agccagtgac cgtgacctgg 540

aactcgggca ccctcaccaa tggggtacgc accttcccgt ccgtccggca gtcctcaggc 600

ctctactcgc tgagcagcgt ggtgagcgtg acctcaagca gccagcccgt cacctgcaac 660

gtggcccacc cagccaccaa caccaaagtg gacaagaccg ttgcgccctc gacatgcagc 720

aagcccacgt gcccaccccc tgaactcctg gggggaccgt ctgtcttcat cttcccccca 780

aaacccaagg acaccctcat gatctcacgc acccccgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840

gtgagccagg atgaccccga ggtgcagttc acatggtaca taaacaacga gcaggtgcgc 900

accgcccggc cgccgctacg ggagcagcag ttcaacagca cgatccgcgt ggtcagcacc 960

ctccccatcg cgcaccagga ctggctgagg ggcaaggagt tcaagtgcaa agtccacaac 1020

aaggcactcc cggcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccagagggca gcccctggag 1080

ccgaaggtct acaccatggg ccctccccgg gaggagctga gcagcaggtc ggtcagcctg 1140

acctgcatga tcaacggctt ctacccttcc gacatctcgg tggagtggga gaagaacggg 1200

aaggcagagg acaactacaa gaccacgccg gccgtgctgg acagcgacgg ctcctacttc 1260

ctctacagca agctctcagt gcccacgagt gagtggcagc ggggcgacgt cttcacctgc 1320

tccgtgatgc acgaggcctt gcacaaccac tacacgcaga agtccatctc ccgctctccg 1380

ggtaaatga 1389

<210> 32
<211> 720
<212> DNA
<213> 兔

<400> 32
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgccc aagtgctgac ccagactgca tcgcccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120

gtcaccatca agtgccagtc cagtcagagt ctttataatc acaactcctt agcctggttt 180

cagcagaaag cagggcagcc tcccaagcgc ctgatctatt ctgcatccac tctggcatct 240

ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300

gacgtgcagt gtgccgatgc tgccacttac tactgtcaag gcagttatga ttgtagtagt 360

gctgattgta ctgctttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 420

cctactgtcc tcatcttccc accagctgct gatcaggtgg caactggaac agtcaccatc 480

gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540

acccaaacaa ctggcatcga gaacagtaaa acaccgcaga attctgcaga ttgtacctac 600

aacctcagca gcactctgac actgaccagc acacagtaca acagccacaa agagtacacc 660

tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720

<210> 33
<211> 133
<212> PRT
<213> 兔

<400> 33

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser
35 40 45

Ser Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60

Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95

Lys Val Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110

Arg Asp Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu
115 120 125

Val Thr Val Ser Ser
130

<210> 34
<211> 135
<212> PRT
<213> 兔

<400> 34

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala
20 25 30

Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala
35 40 45

Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60

Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu
85 90 95

Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Ala Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110

Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Gly Ala Gly Tyr Tyr Asn Val Phe Gly Gly
115 120 125

Gly Thr Glu Val Val Val Lys
130 135

<210> 35
<211> 456
<212> PRT
<213> 兔

<400> 35

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser
35 40 45

Ser Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60

Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95

Lys Val Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110

Arg Asp Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu
115 120 125

Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140

Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys
145 150 155 160

Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
165 170 175

Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser
180 185 190

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser
195 200 205

Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val
210 215 220

Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro
225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270

Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile
275 280 285

Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln
290 295 300

Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln
305 310 315 320

Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala
325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro
340 345 350

Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser
355 360 365

Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380

Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr
385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr
405 410 415

Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe
420 425 430

Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445

Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455

<210> 36
<211> 239
<212> PRT
<213> 兔

<400> 36

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala
20 25 30

Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala
35 40 45

Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60

Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu
85 90 95

Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Ala Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110

Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Gly Ala Gly Tyr Tyr Asn Val Phe Gly Gly
115 120 125

Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140

Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
145 150 155 160

Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175

Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190

Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205

Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220

Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235

<210> 37
<211> 399
<212> DNA
<213> 兔

<400> 37
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

acagtctctg gattgtccct cagtagctat gcagtgagct gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg aatggatcgg aatcatttat gctagtggta aaacatacta cgcgagctgg 240

gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa ggtgaccagt 300

ctgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag accgagatta ttacggcatg 360

gacccctggg gcccagggac cctcgtcacc gtctcttca 399

<210> 38
<211> 405
<212> DNA
<213> 兔

<400> 38
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

agatgtgctg acattgtgat gacccagact ccagcctccg tggaggcagc tgtgggaggc 120

acagtcacca tcaagtgcca ggccagtcag agcattagtg actacttatc ctggtatcag 180

cagaaaccag ggcagcgtcc caagctcctg atctatgaag catccaagct ggcctctggg 240

gtcccgtcgc ggttcagcgg cagtggatat gggacagagt tcactctcac catcagcgac 300

ctggagtgtg ccgctgctgc catttactac tgtcaaacca cttatggtag tagtggtgct 360

ggttattata atgtttttgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaa 405

<210> 39
<211> 1371
<212> DNA
<213> 兔

<400> 39
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

acagtctctg gattgtccct cagtagctat gcagtgagct gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg aatggatcgg aatcatttat gctagtggta aaacatacta cgcgagctgg 240

gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa ggtgaccagt 300

ctgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag accgagatta ttacggcatg 360

gacccctggg gcccagggac cctcgtcacc gtctcttcag ggcaacctaa ggctccatca 420

gtcttcccac tggccccctg ctgcggggac acacccagct ccacggtgac cctgggctgc 480

ctggtcaaag ggtacctccc ggagccagtg accgtgacct ggaactcggg caccctcacc 540

aatggggtac gcaccttccc gtccgtccgg cagtcctcag gcctctactc gctgagcagc 600

gtggtgagcg tgacctcaag cagccagccc gtcacctgca acgtggccca cccagccacc 660

aacaccaaag tggacaagac cgttgcgccc tcgacatgca gcaagcccac gtgcccaccc 720

cctgaactcc tggggggacc gtctgtcttc atcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780

atgatctcac gcacccccga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca ggatgacccc 840

gaggtgcagt tcacatggta cataaacaac gagcaggtgc gcaccgcccg gccgccgcta 900

cgggagcagc agttcaacag cacgatccgc gtggtcagca ccctccccat cgcgcaccag 960

gactggctga ggggcaagga gttcaagtgc aaagtccaca acaaggcact cccggccccc 1020

atcgagaaaa ccatctccaa agccagaggg cagcccctgg agccgaaggt ctacaccatg 1080

ggccctcccc gggaggagct gagcagcagg tcggtcagcc tgacctgcat gatcaacggc 1140

ttctaccctt ccgacatctc ggtggagtgg gagaagaacg ggaaggcaga ggacaactac 1200

aagaccacgc cggccgtgct ggacagcgac ggctcctact tcctctacag caagctctca 1260

gtgcccacga gtgagtggca gcggggcgac gtcttcacct gctccgtgat gcacgaggcc 1320

ttgcacaacc actacacgca gaagtccatc tcccgctctc cgggtaaatg a 1371

<210> 40
<211> 720
<212> DNA
<213> 兔

<400> 40
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

agatgtgctg acattgtgat gacccagact ccagcctccg tggaggcagc tgtgggaggc 120

acagtcacca tcaagtgcca ggccagtcag agcattagtg actacttatc ctggtatcag 180

cagaaaccag ggcagcgtcc caagctcctg atctatgaag catccaagct ggcctctggg 240

gtcccgtcgc ggttcagcgg cagtggatat gggacagagt tcactctcac catcagcgac 300

ctggagtgtg ccgctgctgc catttactac tgtcaaacca cttatggtag tagtggtgct 360

ggttattata atgtttttgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 420

cctactgtcc tcatcttccc accagctgct gatcaggtgg caactggaac agtcaccatc 480

gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540

acccaaacaa ctggcatcga gaacagtaaa acaccgcaga attctgcaga ttgtacctac 600

aacctcagca gcactctgac actgaccagc acacagtaca acagccacaa agagtacacc 660

tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720

<210> 41
<211> 477
<212> PRT
<213> 智人

<400> 41

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30

Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45

Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60

Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80

Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95

Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110

Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125

Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140

Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160

Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175

Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190

Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205

Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220

Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240

Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255

Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270

Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285

Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300

Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320

Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335

His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly
340 345 350

Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Ala Pro Arg
355 360 365

Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380

Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400

Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415

Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430

Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro
435 440 445

Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460

Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475

<210> 42
<211> 477
<212> PRT
<213> 恒河猴/食蟹猴

<400> 42

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30

Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45

Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60

Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80

Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95

Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110

Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125

Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140

Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160

Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175

Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190

Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205

Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220

Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240

Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255

Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270

Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285

Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300

Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320

Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335

His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350

Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Gly Pro Arg
355 360 365

Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380

Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400

Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415

Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430

Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445

Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ser
450 455 460

Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Ser Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475

<210> 43
<211> 477
<212> PRT
<213> 大鼠

<400> 43

Met Ser Thr Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30

Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Asp Asp
35 40 45

Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Ser Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60

Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80

Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95

Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110

Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125

Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Ala Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140

Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160

Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175

Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg
180 185 190

Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205

Leu Ser Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220

Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240

Phe Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ser Pro
245 250 255

Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270

Lys Phe Gln Val Trp Lys Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Glu Leu
275 280 285

Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300

Ser Ala Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320

Ala Gly Glu Asp Thr Cys Gln Phe Asp Lys Thr Val Ala Val Val Ala
325 330 335

Lys Gln Leu Leu Ser Gln Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350

Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Ala Ser Arg
355 360 365

Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380

Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400

Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Pro Pro Ala Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415

Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Thr Phe Tyr Asp Ala Ser Asn Thr
420 425 430

Asp Ala Leu Thr Pro Leu Phe Ser Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445

Val Tyr Pro Met Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ser
450 455 460

Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Ser Glu Gln Ala
465 470 475

<210> 44
<211> 477
<212> PRT
<213> 小鼠

<400> 44

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30

Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45

Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60

Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ser Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80

Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95

Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110

Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala Gln Ala Arg
115 120 125

Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Met Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140

Met Arg Lys Glu Lys Thr Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160

Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175

Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg
180 185 190

Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205

Leu Ser Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220

Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240

Phe Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ser Pro
245 250 255

Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270

Lys Phe Gln Val Trp Lys Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285

Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300

Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320

Ala Gly Glu Asp Thr Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335

Gln Gln Leu Leu Ser Gln Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350

Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Ala Ser Arg
355 360 365

Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380

Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400

Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Pro Pro Ala Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415

Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Ala Phe Tyr Asp Ala Ser Asn Pro
420 425 430

Asp Val Leu Thr Pro Ile Phe Ser Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445

Val Tyr Pro Ile Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460

Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gln Glu Gln Ala
465 470 475

<210> 45
<211> 478
<212> PRT
<213> 猪

<400> 45

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30

Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45

Gly Thr Val Leu Cys Pro Ser Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60

Leu Ser Thr Asn Gln Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80

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100 105 110

Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125

Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140

Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Gly Val Leu Glu Gln Gln Leu Val Glu
145 150 155 160

Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175

Gly Lys Met Arg Leu Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190

Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205

Leu Gly Ser Leu Lys Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220

Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240

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245 250 255

Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
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Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Met
275 280 285

Gln Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Thr Ala His Pro Ser Leu Val Leu
290 295 300

Ser Ala Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320

Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Thr
325 330 335

His Gln Leu Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350

Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Gly Ala Gln Ala Gly Arg
355 360 365

Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380

Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400

Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Arg Pro Ser Arg Ile Gly Ile Tyr
405 410 415

Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430

Asp Ala Leu Glu Leu Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445

Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460

Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Ser Gly Gly Glu Ala
465 470 475

<210> 46
<211> 477
<212> PRT
<213> 狗

<400> 46

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30

Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ser Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45

Gly Thr Val Pro Cys Pro Cys Cys Gln Ala Leu Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60

Leu Ser Thr Asn Gln Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80

Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
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Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
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Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125

Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140

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Val Glu Glu Met Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
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Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
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Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205

Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220

Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
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245 250 255

Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
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Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Val Thr
275 280 285

Lys Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Leu
290 295 300

Ser Pro Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320

Ala Gly Glu Asp Pro Cys Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335

Gln Gln Val Leu Ser Asp Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Gln Val Gly
340 345 350

Glu Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Gln Ala Ser Arg
355 360 365

Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380

Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400

Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Ile Tyr
405 410 415

Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Pro
420 425 430

Asp Ala Leu Glu Leu Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445

Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460

Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Gly Glu Glu Ala
465 470 475

<210> 47
<211> 477
<212> PRT
<213> 兔

<400> 47

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30

Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ser Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45

Gly Thr Val Asn Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
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Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80

Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
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Cys Glu Gln Asp Arg Val Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110

Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ser Arg
115 120 125

Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Ser
130 135 140

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Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175

Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190

Glu Ala Glu Arg Val Arg Ser Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205

Leu Gly Gly Leu His Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220

Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
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Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
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Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285

Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
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Ser Pro Thr Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320

Ala Gly Asp Asp Ala Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335

Gln Gln Leu Leu Ser Asp Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350

Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ser Glu Ala Ser Arg
355 360 365

Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380

Leu Arg Asp Gly Lys Thr Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400

Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Leu Gly Leu Tyr
405 410 415

Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ala Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430

Asp Ala Leu Glu Leu Leu Phe Ala Phe Arg Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445

Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460

Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Gly Gln Glu Ala
465 470 475

<210> 48
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列

<400> 48

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
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Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
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Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
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Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
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Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
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Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
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Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
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Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
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Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205

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Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
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Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
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325 330 335

His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly
340 345 350

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355 360 365

Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380

Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400

Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415

Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430

Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro
435 440 445

Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460

Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475

<210> 49
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列

<400> 49

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
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Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45

Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60

Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ser Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80

Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95

Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110

Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala Gln Ala Arg
115 120 125

Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Met Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140

Met Arg Lys Glu Lys Thr Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160

Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175

Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg
180 185 190

Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205

Leu Ser Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220

Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240

Phe Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ala Pro
245 250 255

Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270

Lys Phe Gln Val Trp Lys Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285

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290 295 300

Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro
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<211> 477
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<400> 50

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<400> 51

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<400> 52

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<212> PRT
<213> 人工序列

<400> 53

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<400> 54

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Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
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Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
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Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
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Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Gly Gln Lys Ala Pro Pro
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Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
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Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
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Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
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Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
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Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
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Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro
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Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
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Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
325 330

<210> 57
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列

<400> 57

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
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Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
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Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
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Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
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<212> PRT
<213> 智人

<400> 58

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Gly Asn Cys Ser Gln Pro Asp Asp Pro Thr Lys Cys Val Ala Cys Arg
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260 265 270

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275 280 285

Leu His His Lys Cys Lys Asn Ser Arg Arg Gln Gly Cys His Gln Tyr
290 295 300

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340 345 350

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355 360 365

Ile Asn Ile Arg Gly Gly Asn Asn Leu Ala Ala Glu Leu Glu Ala Asn
370 375 380

Leu Gly Leu Ile Glu Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Lys Ile Arg Arg Ser
385 390 395 400

Tyr Ala Leu Val Ser Leu Ser Phe Phe Arg Lys Leu Arg Leu Ile Arg
405 410 415

Gly Glu Thr Leu Glu Ile Gly Asn Tyr Ser Phe Tyr Ala Leu Asp Asn
420 425 430

Gln Asn Leu Arg Gln Leu Trp Asp Trp Ser Lys His Asn Leu Thr Ile
435 440 445

Thr Gln Gly Lys Leu Phe Phe His Tyr Asn Pro Lys Leu Cys Leu Ser
450 455 460

Glu Ile His Lys Met Glu Glu Val Ser Gly Thr Lys Gly Arg Gln Glu
465 470 475 480

Arg Asn Asp Ile Ala Leu Lys Thr Asn Gly Asp Gln Ala Ser Cys Glu
485 490 495

Asn Glu Leu Leu Lys Phe Ser Tyr Ile Arg Thr Ser Phe Asp Lys Ile
500 505 510

Leu Leu Arg Trp Glu Pro Tyr Trp Pro Pro Asp Phe Arg Asp Leu Leu
515 520 525

Gly Phe Met Leu Phe Tyr Lys Glu Ala Pro Tyr Gln Asn Val Thr Glu
530 535 540

Phe Asp Gly Gln Asp Ala Cys Gly Ser Asn Ser Trp Thr Val Val Asp
545 550 555 560

Ile Asp Pro Pro Leu Arg Ser Asn Asp Pro Lys Ser Gln Asn His Pro
565 570 575

Gly Trp Leu Met Arg Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Ile Phe
580 585 590

Val Lys Thr Leu Val Thr Phe Ser Asp Glu Arg Arg Thr Tyr Gly Ala
595 600 605

Lys Ser Asp Ile Ile Tyr Val Gln Thr Asp Ala Thr Asn Pro Ser Val
610 615 620

Pro Leu Asp Pro Ile Ser Val Ser Asn Ser Ser Ser Gln Ile Ile Leu
625 630 635 640

Lys Trp Lys Pro Pro Ser Asp Pro Asn Gly Asn Ile Thr His Tyr Leu
645 650 655

Val Phe Trp Glu Arg Gln Ala Glu Asp Ser Glu Leu Phe Glu Leu Asp
660 665 670

Tyr Cys Leu Lys Gly Leu Lys Leu Pro Ser Arg Thr Trp Ser Pro Pro
675 680 685

Phe Glu Ser Glu Asp Ser Gln Lys His Asn Gln Ser Glu Tyr Glu Asp
690 695 700

Ser Ala Gly Glu Cys Cys Ser Cys Pro Lys Thr Asp Ser Gln Ile Leu
705 710 715 720

Lys Glu Leu Glu Glu Ser Ser Phe Arg Lys Thr Phe Glu Asp Tyr Leu
725 730 735

His Asn Val Val Phe Val Pro Arg Lys Thr Ser Ser Gly Thr Gly Ala
740 745 750

Glu Asp Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Ser Leu Gly Asp Val Gly
755 760 765

Asn Val Thr Val Ala Val Pro Thr Val Ala Ala Phe Pro Asn Thr Ser
770 775 780

Ser Thr Ser Val Pro Thr Ser Pro Glu Glu His Arg Pro Phe Glu Lys
785 790 795 800

Val Val Asn Lys Glu Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Arg His Phe Thr
805 810 815

Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gln Ala Cys Asn Gln Asp Thr Pro Glu Glu
820 825 830

Arg Cys Ser Val Ala Ala Tyr Val Ser Ala Arg Thr Met Pro Glu Ala
835 840 845

Lys Ala Asp Asp Ile Val Gly Pro Val Thr His Glu Ile Phe Glu Asn
850 855 860

Asn Val Val His Leu Met Trp Gln Glu Pro Lys Glu Pro Asn Gly Leu
865 870 875 880

Ile Val Leu Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Arg Tyr Gly Asp Glu Glu Leu
885 890 895

His Leu Cys Val Ser Arg Lys His Phe Ala Leu Glu Arg Gly Cys Arg
900 905 910

Leu Arg Gly Leu Ser Pro Gly Asn Tyr Ser Val Arg Ile Arg Ala Thr
915 920 925

Ser Leu Ala Gly Asn Gly Ser Trp Thr Glu Pro Thr Tyr Phe Tyr Val
930 935 940

Thr Asp Tyr Leu Asp Val Pro Ser Asn Ile Ala Lys Ile Ile Ile Gly
945 950 955 960

Pro Leu Ile Phe Val Phe Leu Phe Ser Val Val Ile Gly Ser Ile Tyr
965 970 975

Leu Phe Leu Arg Lys Arg Gln Pro Asp Gly Pro Leu Gly Pro Leu Tyr
980 985 990

Ala Ser Ser Asn Pro Glu Tyr Leu Ser Ala Ser Asp Val Phe Pro Cys
995 1000 1005

Ser Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ser Arg Glu Lys Ile
1010 1015 1020

Thr Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met Val Tyr
1025 1030 1035

Glu Gly Asn Ala Arg Asp Ile Ile Lys Gly Glu Ala Glu Thr Arg
1040 1045 1050

Val Ala Val Lys Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Leu Arg Glu Arg
1055 1060 1065

Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Gly Phe Thr Cys
1070 1075 1080

His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Lys Gly Gln Pro
1085 1090 1095

Thr Leu Val Val Met Glu Leu Met Ala His Gly Asp Leu Lys Ser
1100 1105 1110

Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Ala Glu Asn Asn Pro Gly Arg
1115 1120 1125

Pro Pro Pro Thr Leu Gln Glu Met Ile Gln Met Ala Ala Glu Ile
1130 1135 1140

Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Phe Val His Arg
1145 1150 1155

Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val Ala His Asp Phe Thr Val
1160 1165 1170

Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp
1175 1180 1185

Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met
1190 1195 1200

Ala Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Ser Ser Asp
1205 1210 1215

Met Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Thr Ser Leu Ala
1220 1225 1230

Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln Val Leu Lys Phe
1235 1240 1245

Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Asn Cys Pro Glu
1250 1255 1260

Arg Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe Asn Pro Lys
1265 1270 1275

Met Arg Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys Asp Asp
1280 1285 1290

Leu His Pro Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu Glu
1295 1300 1305

Asn Lys Ala Pro Glu Ser Glu Glu Leu Glu Met Glu Phe Glu Asp
1310 1315 1320

Met Glu Asn Val Pro Leu Asp Arg Ser Ser His Cys Gln Arg Glu
1325 1330 1335

Glu Ala Gly Gly Arg Asp Gly Gly Ser Ser Leu Gly Phe Lys Arg
1340 1345 1350

Ser Tyr Glu Glu His Ile Pro Tyr Thr His Met Asn Gly Gly Lys
1355 1360 1365

Lys Asn Gly Arg Ile Leu Thr Leu Pro Arg Ser Asn Pro Ser
1370 1375 1380

<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列

<400> 59
ataggtaccg ccaccatgtc ggctgcaccc ggcct 35

<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列

<400> 60
atactcgagc ggcctgttcc tgctccggcc 30

<210> 61
<211> 609
<212> PRT
<213> 狨猴

<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> Xaa可為任何自然發生之胺基酸

<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(71)
<223> Xaa可為任何自然發生之胺基酸

<220>
<221> misc_feature
<222> (480)..(480)
<223> Xaa可為任何自然發生之胺基酸

<400> 61

Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15

Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30

Phe Cys His Ile Cys Leu Arg Arg Met Lys Thr Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45

Asp Thr Val Pro Xaa Thr Ser Cys Gln Ala Asn Lys Pro Thr Asn Leu
50 55 60

Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Arg Trp Pro Pro Gly Ser Thr
65 70 75 80

Ala Arg Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr Cys Glu Gln Asp Arg
85 90 95

Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly Ser His Arg Gly His
100 105 110

Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg Ser Arg Asp Arg Glu
115 120 125

Met Gly Gly Arg Ile Pro Gly Ala Gly Leu Met Gly Gly Ala Glu Pro
130 135 140

Gly Gly Ala Arg Thr Gly Gln Arg Pro Lys Trp Tyr Ser Cys Thr Arg
145 150 155 160

Trp Ala Gly Arg Thr Gly Ser Pro Arg Gly Ala Gly Gly Gly Ala Ala
165 170 175

Phe Gly Arg Glu Pro Gly Gly Arg Gly Gly Ala Val Leu Met Ser Ser
180 185 190

Ala Glu Ala His Ala Pro Leu Lys Leu Arg Asn Leu Gly Arg Pro Asp
195 200 205

Gly Leu Gln Ala Gly Leu Thr Gly Arg Glu Ala Gly Trp Pro Gly Arg
210 215 220

Pro Phe Ala Thr Gly Glu Gly Leu Ala Gly Gly Leu Arg Glu Asp Pro
225 230 235 240

Arg Arg Glu Pro Glu Gly Gly Gly Arg Pro Glu Gly Ser Gly Arg Asp
245 250 255

Pro Ile Pro Gly Ser Leu Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu
260 265 270

Gln Glu Ala Cys Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His
275 280 285

Gln Leu Val Glu Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Ala Ala Val
290 295 300

Gly Asp Gln Leu Gly Lys Met Arg Leu Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly
305 310 315 320

Ser Leu Asp Arg Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala
325 330 335

Leu Arg Arg Glu Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg
340 345 350

Gln Met Glu Lys Val Leu Glu Glu Val Thr Asp Lys Pro Gln Thr Glu
355 360 365

Phe Leu Met Lys Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu
370 375 380

Ala Glu Ser Pro Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile
385 390 395 400

Ser Asp Asp Phe Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu
405 410 415

Met Pro Ala Leu Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro
420 425 430

Ser Leu Val Val Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln
435 440 445

Lys Ala Pro Pro Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val
450 455 460

Ala Val Val Ala His Gln Arg Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Xaa
465 470 475 480

Val Glu Val Gly Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ser Ala
485 490 495

Glu Ala Pro Arg Arg Gly Arg Leu His Pro Val Pro Ser Gln Gly Leu
500 505 510

Trp Leu Leu Gly Leu Arg Glu Ser Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu
515 520 525

Ala Lys Glu Pro Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg
530 535 540

Ile Gly Leu Tyr Met Ser Phe Ser Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp
545 550 555 560

Ala Ser Asp Ala Asp Ala Leu Val Leu Leu Phe Ala Phe His Glu Arg
565 570 575

Leu Pro Gly Pro Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys
580 585 590

Gly Lys Asn Ala Gln Pro Leu Leu Leu Leu Gly Pro Glu Gly Ala Glu
595 600 605

Ala

Claims

一種用於檢測MG53相關疾病或預測MG53相關疾病的風險的方法，包括以下步驟： a. 獲得待測樣品；和 b. 檢測在所述待測樣品中的細胞外游離MG53。
根據請求項1所述的方法，其中所述待測樣品選自全血、血漿、血清和組織液。
根據請求項1所述的方法，其中所述待測樣品中基本上不含細胞。
根據請求項1所述的方法，其中所述步驟b包括將MG53檢測試劑與所述待測樣品接觸。
根據請求項4所述的方法，其中所述MG53檢測試劑是MG53抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段。
根據請求項4所述的方法，其中所述MG53檢測試劑是可以與MG53結合的小分子化合物。
根據請求項4所述的方法，其中所述MG53檢測試劑具有可檢測標記。
根據請求項7所述的方法，其中所述可檢測標記具有發光性、磁性、放射性或酶活性。
根據請求項1所述的方法，其中所述步驟b包括進行放射免疫測定、西方墨點法、鄰位連接技術、免疫螢光測定法、酶免疫測定法、免疫沉澱測定法、化學發光法、免疫組織化學測定法、免疫斑點試驗或狹縫印跡檢測法。
根據請求項1所述的方法，其進一步包括： c. 將步驟b中獲得的MG53的檢測數值與對照數值進行比較。
根據請求項10所述的方法，其中所述對照數值來自對照樣品。
根據請求項11所述的方法，其中所述對照樣品與待測樣品來自於相同或不同的個體。
根據請求項11所述的方法，其中所述對照樣品與待測樣品來自於相同的個體，但是對照樣品的採集時間早於或晚於待測樣品一段時間。
根據請求項13所述的方法，其中在所述一段時間中所述個體接受了治療或健康狀態發生了變化。
根據請求項10所述的方法，其中所述對照數值是從健康個體或患有MG53相關疾病的個體中獲得的。
根據請求項12-15中任一項所述的方法，其中所述個體是人或非人哺乳動物。
根據請求項1所述的方法，其中所述MG53相關疾病是代謝症候群。
根據請求項1所述的方法，其中所述MG53相關疾病是糖代謝或脂質代謝相關疾病。
根據請求項18所述的方法，其中所述糖代謝或脂質代謝相關疾病選自由胰島素抗性症、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、高胰島素血症、高膽固醇血症、高血糖、高血脂、高血壓和肥胖所組成的群組。
一種用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53活性的方法，包括向需要其的個體施用有效量的MG53抑制劑。
根據請求項20所述的方法，其中所述MG53抑制劑與MG53特異性結合。
根據請求項20所述的方法，其中所述MG53抑制劑是MG53抗體或其抗原結合片段、MG53配體或其MG53結合片段、或者MG53的無功能蛋白片段。
根據請求項22所述的方法，其中所述MG53抗體或其抗原結合片段包括重鏈，所述重鏈包括如下序列或者與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：1、3、9、11、17、19、25、27、33或35所示的序列。
根據請求項22所述的方法，其中所述MG53抗體或其抗原結合片段包括輕鏈，所述輕鏈包括如下序列或者與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34或36所示的序列。
根據請求項20所述的方法，其中所述MG53抑制劑是小分子化合物。
根據請求項20所述的方法，其中所述MG53抑制劑是具有式Ia或Ib的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中， L為化學鍵、或任選取代的C₁ -C₁₂ 亞烷基； M為化學鍵、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳香亞基或5-12元雜環亞基； X為化學鍵、或任選取代的-CH=N-NH-C(O)-、-CH₂ -O-、-O-CH₂ -C(O)-NH-、-O-C(O)-或-O-C(O)-CH=CH-； Y為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基； Q為任選取代的C₁ -C₁₂ 亞烷基或C₂ -C₁₂ 亞烯基； T為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基； R₁ 各自獨立地為氫、硝基、鹵素、羥基、氰基、或任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基或C₁ -C₁₂ 烷氧基； n為1-5的任意正整數。
根據請求項26所述的方法，其中所述L為化學鍵或C₁ -C₃ 亞烷基。
根據請求項26所述的方法，其中所述M為化學鍵、或任選取代的苯亞基或呋喃亞基。
根據請求項26所述的方法，其中所述Y為任選取代的苯基、呋喃基、喹啉基或苯並二惡茂基。
根據請求項26所述的方法，其中所述Q為任選取代的C₁ -C₃ 亞烷基或C₂ -C₃ 亞烯基。
根據請求項26所述的方法，其中所述T為任選取代的苯基或1,3,4-噻二唑基。
根據請求項20所述的方法，其中所述MG53抑制劑是具有式II的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中， A為氫、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基； G為-C(O)-O-R₃ ，其中R₃ 是任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基；J為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基；或者G和J連同其連接的碳原子共同形成，其中R₄ 各自獨立地為氫、硝基、鹵素、羥基、氰基、或任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基或C₁ -C₁₂ 烷氧基，n為1-4的任意正整數； B為化學鍵、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳香亞基或5-12元雜環亞基； D為化學鍵、或任選取代的-O-R₅ -，其中R₅ 選自任選取代的C₁ -C₁₂ 亞烷基； E為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基。
根據請求項32所述的方法，其中所述A是任選取代的萘基、苯基或噻吩基。
根據請求項32所述的方法，其中所述G為-C(O)-O-R₃ ，其中R₃ 是任選取代的C₁ -C₃ 烷基；J選自任選取代的苯基；或者G和J連同其連接的碳原子共同形成，其中R₄ 均為氫。
根據請求項32所述的方法，其中所述B為化學鍵、或任選取代的亞苯基或呋喃亞基。
根據請求項32所述的方法，其中所述D為化學鍵、或任選取代的-O-CH₂ -。
根據請求項32所述的方法，其中所述E為任選取代的苯基。
根據請求項20所述的方法，其中所述MG53抑制劑是具有式III的化合物或其藥學上可接受的鹽，式III 其中， A為氫、或任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基； Y各自獨立地為任選取代的C₆ -C₁₂ 芳基或5-12元雜環基； R₇ 為氫、硝基、鹵素、羥基、氰基、或任選取代的C₁ -C₁₂ 烷基或C₁ -C₁₂ 烷氧基。
根據請求項38所述的方法，其中A為任選取代的苯基。
根據請求項38所述的方法，其中Y為任選取代的苯基。
根據請求項38所述的方法，其中R₇ 為氫、硝基、鹵素、羥基或氰基。
根據請求項26-41中任一項所述的方法，其中所述任選取代的是指不被取代基取代或者被選自下組的一個或多個取代基取代：硝基、鹵素、羥基、氰基、C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基、苯甲醯胺基、或-C(O)-O-R₆ ，其中所述C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基或苯甲醯胺基可以進一步被硝基、鹵素、羥基、氰基、C₁ -C₃ 烷基或C₁ -C₃ 烷氧基取代，其中R₆ 為氫或C₁ -C₃ 烷基。
根據請求項20所述的方法，其中所述MG53抑制劑是如下化合物或其藥學上可接受的鹽。
根據請求項20所述的方法，其用於緩解、治療或預防MG53相關疾病或其症狀。
根據請求項44所述的方法，其中所述MG53相關疾病為代謝症候群。
根據請求項44所述的方法，其中所述MG53相關疾病為糖代謝或脂質代謝相關疾病。
根據請求項46所述的方法，其中所述糖代謝或脂質代謝相關疾病選自由胰島素抗性症、糖尿病腦血管疾病、糖尿病眼部併發症、糖尿病神經病變、糖尿病足、高胰島素血症、高膽固醇血症、高血壓和肥胖所組成的群組。
一種MG53抗體或其抗原結合片段，其包括三個重鏈互補決定區，所述三個重鏈互補決定區包含在SEQ ID NO：1、9、17、25或33所示的序列中。
根據請求項48所述的MG53抗體或其抗原結合片段，其包括三個輕鏈互補決定區，所述三個輕鏈互補決定區包含在SEQ ID NO：2、10、18、26、或34所示的序列中。
根據請求項48所述的MG53抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈，其中所述重鏈具有如下胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或者99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：1、3、9、11、17、19、25、27、33或35所示的序列。
根據請求項50所述的MG53抗體或其抗原結合片段，其進一步包括輕鏈，其中所述輕鏈具有如下胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或者99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34或36所示的序列。
一種抗體或抗原結合片段，其與請求項48-51中任一項所述的抗體或抗原結合片段競爭性結合MG53。
一種分離的核酸，其編碼請求項48-52中任一項所述的抗體或抗原結合片段。
根據請求項53所述的核酸，其包括如下核苷酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或者99%序列同源性的序列：SEQ ID NO：5、6、7、8、13、14、15、16、21、22、23、24、29、30、31、32、37、38、39或40所示的序列。
一種殖株或表達載體，其包括請求項53或54所述的分離的核酸。
一種宿主細胞，其包括請求項55所述的殖株或表達載體。
一種藥物組合物，其包括請求項48-52中任一項所述的抗體或抗原結合片段、請求項55所述的殖株或表達載體、或請求項56所述的細胞，以及藥學上可接受的賦形劑。
一種用於檢測細胞外游離MG53的檢測試劑在製備試劑盒中的用途，所述試劑盒用於檢測MG53相關疾病、預測MG53相關疾病的風險或進展、鑒定潛在的MG53抑制劑、評估對MG53相關疾病的治療效果或檢測細胞外游離MG53的活性。
一種MG53抑制劑在製備用於降低或抑制個體中細胞外游離MG53的藥物中的用途。