TW201930335A

TW201930335A - α病毒複製子顆粒

Info

Publication number: TW201930335A
Application number: TW107145906A
Authority: TW
Inventors: 赤畑渉; 司
Original assignee: 美商Ｖｌｐ醫療股份有限公司
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2019-08-01
Also published as: US20250129342A1; TWI908704B; CN111742053A; JP7701080B2; AR114942A1; AU2018388071B2; US20220002682A1; JP2024016216A; RU2020123508A; IL275436B1; SG11202005792RA; IL275436A; JP7412002B2; BR112020012190A8; JP2021507713A; KR20200100126A; EP3728611A1; WO2019124441A1; US20190185822A1; EP3728611A4

Abstract

本發明提供的是α病毒複製子顆粒(ARP)，其包括(i)包括殼體及/或外膜之α病毒結構蛋白，及(ii)包括編碼α病毒非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及至少一個目的基因的α病毒複製子，其中至少殼體、外膜中的E3及E2中之一者係包括一個或多個胺基酸的改變，但外膜中之E1不包括胺基酸的改變。

Description

α病毒複製子顆粒

本發明係關於可使用作為基因傳遞系統的α病毒複製子顆粒。

基因療法的目的是將遺傳物質引入細胞，以補償異常基因或製造有益的蛋白質。如果突變的基因造成必需蛋白質出現缺陷或缺失，基因療法可能引入該基因的正常拷貝，以恢復該蛋白質的功能。

因為在治療如癌症、病毒感染、心肌梗塞、遺傳性疾病等慢性疾病方面的潛力，所以基因療法成為醫學及藥學科學上的新興領域。

直接插入細胞的基因通常不起作用。替代地，稱為載體(vector)的載劑(carrier)通過基因工程來傳遞基因。某些病毒常被使用作為載體，因為它們可以經由感染細胞而傳遞新的基因。這些病毒經過修飾，所以在人體內使用時不會引起疾病。某些類型的病毒，諸如反轉錄病毒，將它們的遺傳物質(包含新基因)整合到人類細胞的染色體中。其他病毒，諸如腺病毒，將其基因引入細胞核，但基因並未整合到染色體中。

可將載體直接注射到特定的組織而在特定組織中經由個體細胞吸收或經靜脈注射(經由IV)入體內。另外，可以取出病人的細胞樣本，並在實驗室設置下暴露於載體。然後再將含有載體的細胞返回給病人。如果處理成功，由載體傳遞的新基因將製造有功能的蛋白質。(https：//ghr.nlm.nih.gov/primer/therapy/procedures,Int J Pharm Investig.2013 Jan-Mar；3(1)：1-7.)

α病毒包括一組基因、結構及血清學上相關的披衣病毒科(Togaviridae family)的蚊子媒介病毒。α病毒包含東部馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus)(EEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus)(VEEV)、大沼澤地病毒(Everglades Virus)、穆坎博病毒(Mucambo Virus)、皮春納病毒(Pixuna Virus)、西部馬腦炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus)(WEEV)、辛德畢斯病毒(Sindbis Virus)、Semliki森林病毒(Semliki Forest Virus)、米德爾堡病毒(Middleburg Virus)、基孔肯雅熱病毒(Chikungunya Virus)(CHIKV)、奧絨絨病毒(O'nyong-nyong Virus)、羅氏河病毒(Ross River Virus)、巴馬森林病毒(Barmah Forest Virus)、蓋塔病毒(Getah Virus)、鷺山病毒(Sagiyama Virus)、貝巴魯病毒(Bebaru Virus)、馬亞羅病毒(Mayaro Virus)、烏納病毒(Una Virus)、奥拉病毒(Aura Virus)、瓦塔羅阿病毒(Whataroa Virus)、巴班肯病毒(Babanki Virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach Virus)、高地J病毒(Highlands J virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan Virus)、納杜姆病毒(Ndumu Virus)及博吉河病毒(Buggy Creek Virus)。含有單一病毒蛋白、殼體的結構亞單位係與二十面體核殼體中的RNA基因組相關。在病毒粒子中，殼體被脂質外膜包圍且膜上覆蓋著跨膜蛋白刺突的規律排列，該刺突各個都是由兩種醣蛋白E1及E2之異二聚體複合物所組成。

α病毒複製子顆粒(ARP)是在細胞或培養物中產生，它包含"複製子","複製子"可以在包括α病毒結構蛋白及膜脂的病毒粒子殼內表現非α病毒基因。

U.S.Pat.No.7,045,335、WO 2004/085660及Virology 239,389-401,1997中說明α病毒複製子顆粒。U.S.Pat.No.7,078,218中說明其製造方法，將該段所引述的文獻內容通過引用方式併入。

由於缺乏合適的方法將基因適當地引入細胞，因此基因療法的臨床應用仍然有限，這是許多研究者感興趣的領域。要實現成功的基因療法，開發合適的基因傳遞系統可能是最重要的因素之一(Int.J Pharm Investig.2013 Jan-Mar；3(1)：1-7)。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[PTL 1]

US Patent No. 7,045,335

[PTL 2]

WO2004/085660

[PTL 3]

US Patent No. 7,078,218

[非專利文獻]

[NPL 1]

Int J Pharm Investig. 2013 Jan-Mar; 3(1)：1-7

[NPL 2]

Virology 239, 389-401, 1997

本發明係關於包括改良之α病毒複製子顆粒的基因傳遞系統。

在一方面，α病毒複製子顆粒(ARP)係包括：(i)包括殼體及/或外膜的α病毒結構蛋白，及(ii)包括編碼α病毒非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及至少一個目的基因的α病毒複製子顆粒，其中至少殼體、外膜中的E3及E2中之一者係包括一個或多個胺基酸的改變，但外膜中的E1不包括胺基酸的改變。

在一方面，本發明提供ARP，其中病毒結構蛋白在α病毒殼體蛋白核定位訊號(NLS)中具有一種或多種改變。

在一方面，α病毒殼體蛋白是EEEV、WEEV、VEEV、CHIKV、羅氏河病毒或巴馬森林病毒殼體蛋白。在本文中所說明的本發明的上述方面或任何其他方面的各種具體例中，一種或多種改變是在EEEV殼體蛋白的胺基酸67至70處的NLS；WEEV殼體蛋白的胺基酸67至70處的NLS；VEEV殼體蛋白的胺基酸64至68處的NLS；CHIKV殼體蛋白的胺基酸62至69處的NLS；在羅氏河病毒殼體蛋白的胺基酸71至74處的NLS，或巴馬森林病毒殼體蛋白的胺基酸64至68處的NLS。

在本文中所說明的本發明的上述方面或任何其他方面的各種具體例中，改變是NLS的荷電胺基酸或NLS的鹼性荷電胺基酸的取代。在一些具體例中，荷電胺基酸或鹼性荷電胺基酸是離胺酸或精胺酸。在某些具體例中，離胺酸或精胺酸係經非離胺酸或非精胺酸之胺基酸取代。在具體實施例中，離胺酸或精胺酸係經天冬醯胺酸或丙胺酸取代。

在本文中所說明的本發明的上述方面或任何其他方面的各種具體例中，EEEV病毒殼體蛋白NLS在胺基酸67處改變。在特定具體例中，EEEV病毒殼體蛋白NLS具有取代K67N。

在本文中所說明的本發明的上述方面或任何其他方面的各種具體例中，WEEV病毒殼體蛋白NLS在胺基酸67、68及69的一處或多處改變。在特定具體例中，WEEV殼體蛋白NLS包括K67N、K68N及/或K69N。

在本文中所說明的本發明的上述方面或任何其他方面的各種具體例中，VEEV殼體蛋白NLS在胺基酸64、65及67的一處或多處改變。在特定具體例中，VEEV病毒殼體蛋白NLS包括K64N、K65A或K65N，及/或K67A或K67N。

在本文中所說明的本發明的上述方面或任何其他方面的各種具體例中，羅氏河病毒殼體蛋白NLS在胺基酸71、72、73及74的一處或多處改變。在特定具體例中，羅氏河病毒殼體蛋白NLS包括R71N、R72N、R73N及/或R74N。

在本文中所說明的本發明的上述方面或任何其他方面的各種具體例中，巴馬森林病毒殼體蛋白NLS在胺基酸64、65、67及68的一處或多處改變。在特定具體例中，巴馬森林病毒殼體蛋白NLS包括K64A、K65A或K65N、K67A、K67N、K68A及/或K68N。

US Patent Publication Nos.2014-170186或2017-073377中詳細說明殼體NLS中的改變。這些公告的內容以引用方式併入本文中。

在一方面，α病毒E2蛋白可在CHIKV E2蛋白中與胺基酸234相對應的胺基酸位置具有非離胺酸殘基(如，天冬醯胺酸)及/或在CHIKV E2蛋白中與胺基酸251相對應的胺基酸位置有修飾，使病毒萌發期間E2蛋白不穩定。

在一方面，α病毒E3蛋白可包括在弗林蛋白酶(furin)位點(Arg-X-X-Arg)的胺基酸序列中的改變/突變。

術語"Arg-X-X-Arg"指明弗林蛋白酶的最小裂解位點及"X-X"包含任何兩個胺基酸的組合。在弗林蛋白酶位點對胺基酸序列改變的實例包含對Ile-Glu/Asp-Gly-Arg、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或Ser-Gly-Gly-Gly-Ser的改變。US Patent Publication Nos.2016-0040134及2016-0200775中詳細說明有關弗林蛋白酶位點的改變(將引證的文獻通過引用方式併入本文中)。

例如，VEEV CT83株在其E3區末端有一個弗林蛋白酶位點RKRR，RKRR可被SGGGS取代。

根據本發明，α病毒複製子包括編碼α病毒非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的核苷酸，及至少一個目的基因。α病毒非結構蛋白可以是衍生自與衍生出結構蛋白的α病毒相同的α病毒。α病毒非結構蛋白可以是衍生自與衍生出結構蛋白的α病毒不相同的α病毒(嵌合α病毒複製子顆粒)。例如，根據本發明可提供ARP，其包括衍生自CHIKV的α病毒結構蛋白及包括編碼VEEV nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的核苷酸及至少一個目的基因之病毒複製子。

在一方面，本發明提供α病毒複製子顆粒(ARP)，其包括(i)包括殼體及/或外膜的CHIKV結構蛋白，及(ii)包括編碼VEEV非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及至少一個目的基因的VEEV複製子。

目的基因可從衍生自任何期望來源，如，病毒、原核生物、真核生物、古菌之廣泛的各種序列中加以選擇。目的基因之類別的實例包含，例如，免疫原，包含抗原蛋白、細胞介素、毒素、治療蛋白、酶、反義序列及免疫反應調節子。

在另一方面，本發明提供製備α病毒複製子顆粒的方法，包括以下步驟：將細胞與下列者共轉染：i)包括編碼α病毒非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及至少一個目的基因的載體，ii)包括編碼α病毒殼體蛋白之多核苷酸的載體，及iii)包括編碼α病毒E3-E2-6K-E1之多核苷酸的載體，其中至少殼體、E3及E2中之一者包括一個或多個胺基酸的改變，但E1不包括胺基酸的改變，培養經轉染的細胞，及從細胞培養物純化ARP。

通常，編碼α病毒結構蛋白的核苷酸包括編碼E1、E2、6k及E3的核苷酸。表現野生型病毒結構蛋白時，6K及E3在組裝過程中自然裂解，並從ARP中去除。成熟野生型ARP可包括殼體、E1及E2蛋白。當一個或多個胺基酸序列的改變被引入，例如，E3蛋白的弗林蛋白酶位點時，E3可能不會被裂解並含在ARP中。在本說明書及權利要求中，"病毒結構蛋白"不僅是指那些具有6k及/或E3者，也指那些不具6K及/或E3者。

第1圖例示其中α病毒是CHIKV或VEEV的代表性ARP。

在一方面，本發明提供嵌合α病毒複製子顆粒，(i)包括殼體及/或外膜的CHIKV結構蛋白，及(ii)包括編碼VEEV非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及至少一個目的基因的VEEV複製子。

[第1圖]

第1圖顯示生成ARP的圖示規程。

[第2圖]

第2圖顯示VEEV複製子顆粒的建構。

[第3圖]

第3圖顯示VEEV_pBR322_NLuc載體。

[第4圖]

第4圖顯示TC83_CMV_CAwt_輔助1p載體。

[第5圖]

第5圖顯示TC83_CMV_CAmut_輔助1p載體。

[第6圖]

第6圖顯示TC83_CMV_WTgp_輔助2p載體。

[第7圖]

第7圖顯示TC83_CMV_E3gp_輔助2p載體。

[第8圖]

第8圖顯示用於測定封裝(packaging)VEEV複製子入VEE VRP之能力的圖示規程。

[第9圖]

第9圖顯示第8圖所示測驗之結果。

[第10圖]

第10圖顯示在VEEV複製子顆粒之建構中，多選殖位點的納入。

[第11圖]

第11圖顯示VEEV_pBR322_MCS_NLuc_推測載體。

[第12圖]

第12圖顯示純化之VEE病毒複製子顆粒的西方墨點分析結果。

[第13圖]

第13圖顯示經由包括編碼IKK之核苷酸的VRP所感染的細胞之西方墨點分析。第一道，經VRP感染的細胞，第二道，經IKK質體載體轉染的細胞(正向對照)。

[第14圖]

第14圖顯示經由包括編碼JNK2之核苷酸的VRP所感染的細胞之西方墨點分析。

[第15圖]

第15圖顯示經由包括編碼螢光素酶之基因的VRP所感染的細胞之螢光素酶檢測結果。

[第16圖]

第16圖顯示經由包括編碼GFP之基因的VRP所感染的細胞中之GFP表現。

[第17圖]

第17圖顯示經由包括編碼GFP之基因的VRP所感染的M2極化巨噬細胞中之GFP表現。

[第18圖]

第18圖顯示實施例9的圖示規程。

[第19圖]

第19圖顯示實施例9的結果。

[第20圖]

第20圖顯示得自CHIKV結構蛋白及VEEV複製子之純化嵌合APR的西方墨點分析。

[第21圖]

第21圖顯示經由第20圖之ARP所感染的細胞之FACS分析。

定義

本文中所使用"α病毒"意指屬於披衣病毒科之含有RNA的病毒。示例之披衣病毒包含但不限於東部馬腦炎病毒(EEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、大沼澤地病毒、穆坎博病毒、皮春納病毒、西部馬腦炎病毒(WEEV)、辛德畢斯病毒、Semliki森林病毒、米德爾堡病毒、基孔肯雅熱病毒(CHIKV)、奧絨絨病毒、羅氏河病毒、巴馬森林病毒、蓋塔病毒、鷺山病毒、貝巴魯病毒、馬亞羅病毒、烏納病毒、奥拉病毒、瓦塔羅阿病毒、巴班肯病毒、孜拉加奇病毒、高地J病毒、摩根堡病毒、納杜姆病毒、博吉河病毒及奧克爾布病毒(Ockelbo virus)。

所謂"α病毒結構蛋白"意指多肽或其片段，具有與自然發生的病毒殼體或外膜蛋白至少約有80%的胺基酸序列同一性。具體例中，α病毒結構蛋白具有與下列病毒至少約85%、90%、95%或更高的胺基酸序列同一性：東部馬腦炎病毒(EEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、大沼澤地病毒、穆坎博病毒、皮春納病毒、西部馬腦炎病毒(WEEV)、辛德畢斯病毒、Semliki森林病毒、米德爾堡病毒、基孔肯雅熱病毒(CHIKV)、奧絨絨病毒、羅氏河病毒、巴馬森林病毒、蓋塔病毒、鷺山病毒、貝巴魯病毒、馬亞羅病毒、烏納病毒、奥拉病毒、瓦塔羅阿病毒、巴班肯病毒、孜拉加奇病毒、高地J病毒、摩根堡病毒、納杜姆病毒及博吉河病毒。可從GenBank得到α病毒結構蛋白的野生型胺基酸序列。

在具體實施例中，α病毒是CHIKV，例如CHIKV 37997株或LR2006 OPY-1株。在其他的具體例中，α病毒是VEEV，例如VEEV TC-83株。

所謂"α病毒複製子"意指可在體內目標細胞中直接引導其自身擴增的RNA分子。複製子編碼催化RNA擴增的聚合酶(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4)，並含有複製所需的順式RNA序列，經由所編碼的聚合酶識別及利用這些序列。α-病毒複製子通常含有下列有序元素：5'UTR、編碼α病毒非結構蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4)的序列、3'UTR及poly A訊號。α-病毒複製子亦含有一個或多個引導目的基因表現的病毒亞基因組啟動子。在現有的技術中教示這些序列可具有一種或多種突變。

所謂"α病毒複製子顆粒"(ARP)意指用α病毒結構蛋白封裝的α病毒複製子。ARP不含有編碼任何α病毒結構蛋白的多核苷酸。

所謂"劑"意指任何小分子化合物、抗體、核酸分子或多肽，或其片段。

本文中所使用，術語"佐劑"意指一種化合物，該化合物在與特定免疫原組合而使用於製劑中時，將增強、改變或修飾所產生的免疫反應。在某些具體例中，佐劑與ARP組合使用。免疫反應的修飾包含抗體及細胞免疫反應之其中一者或兩者之特異性的增強或擴大。免疫反應的修飾亦可指某些抗原-特異性免疫反應的減少或抑制。具體例中，佐劑是Ribi佐劑。

所謂"改善"意指減少、抑制、減弱、減輕、停滯或穩定疾病或其症狀的發展或進展。

所謂"改變"意指有關多肽序列或多核苷酸序列，在特定位置的胺基酸或核苷酸的變化。本文中所使用，改變係包含在多肽或多核苷酸之特定位置的胺基酸或核苷酸的取代、刪除或插入。在一些具體例中，在α病毒殼體蛋白核定位訊號的改變包含以未荷電胺基酸(如，丙胺酸或天冬醯胺酸，或鹼性荷電胺基酸諸如離胺酸或精胺酸除外的任何胺基酸)取代荷電胺基酸(如，離胺酸或精胺酸)。

所謂"改變"意指參照標準所屬領域已知方法諸如本文所描述的方法，而檢測到的基因或多肽的表現水平或活性的變化(增加或減少)。本文中所使用，改變包含10%、25%、50%、75%、100%或更多的表現水平變化。改變包含10-、20-、50-、70-、80-、90-、100-、200-、500-、1000-倍或更多的表現水平變化。

所謂"類似物"意指不相同的分子，但具有類似的功能或結構特徵。例如，多肽類似物保留相應天然存在多肽的生物活性，同時具有一定的生化修飾，從而增強類似物相對於自然存在多肽的功能。這種生化修飾可以提高類似物的蛋白酶抗性、膜透性或半衰期，而不改變，例如，配體結合。類似物可包含非天然的胺基酸。

在本公開中，"包括(comprises)"、"包括(comprising)"、"含有(containing)"及"具有(having)"等可具有美國專利法賦予的定義及可意指"包含(includes)"、"包含(including)"等；"主要由…組成(consisting essentially of)"或"主要由…組成(consists essentially)"同樣地具有美國專利法賦予的定義且術語是開放的，允許所列舉之外的存在，只要所列舉之外的存在不改變所列舉的基本或新穎的特徵即可，但不包括現有技術具體例。

"檢測"意指確認待檢測分析物的存在、缺失或數量。

所謂"疾病"意指損傷或干擾細胞、組織或器官之正常功能的任何病症或失調。

所謂"有效量"意指改善與未經治療患者相關之疾病的症狀所需的藥劑量。使用於實踐本發明作為預防或治療疾病用的活性化合物的有效量取決於給藥方式、個體的年齡、體重及一般健康狀態而變化。最終，主治醫生或獸醫將決定適當的量及劑量方案。這種量稱為"有效"量。

所謂"片段"意指多肽或核酸分子的一部分。這種部分包含，較佳地，參考核酸分子或多肽全長的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100，200、300、400、500、600、700、800、900或1000個核苷酸或胺基酸。

所謂"標記"意指在與疾病或失調有關的表現水平或活性上發生改變的任何蛋白質或多核苷酸。

本文中所使用，"核定位訊號"或"NLS"是指胺基酸序列，當存在於多肽表面時，該胺基酸序列將多肽靶向細胞核。NLS序列係所屬領域習知者。參照，例如，Goldfarb,D.,and N.Michaud(1991)Trends Cell Biol.1,20-24；Gorlich,D.,and I.W.Mattaj(1996)Science 271,1513-1518)。具體例中，NLS包含一個或多個帶正電荷胺基酸諸如離胺酸或精胺酸的短序列。NLS的共通序列包含K-K/R-X-K/R(Schneider,J.et al. (1988)Cell 54,117-125)及由約10個胺基酸之間隔子分開的兩個鹼性胺基酸簇團，如，KR[PAATKKAGQA]KKKK(Dingwall et al.,/Cell Biol.107(3)：841-9)。關於本發明的α病毒胺基酸序列，NLS存在於EEEV殼體蛋白的胺基酸67至70處(KRKK)；WEEV殼體蛋白的胺基酸67至70處(KKKK)；VEEV殼體蛋白的胺基酸64至68處(KKPKK)；CHIKV殼體蛋白的胺基酸62至69處(RRNRKNKK)；羅氏河病毒殼體蛋白的胺基酸71至74處(RKKK)；及巴馬森林病毒殼體蛋白的胺基酸64至68處(KKPKK)。例如，可採用VEEV TC83殼體蛋白的K64N。

本文中所使用，如"獲得藥劑"的"獲得"包含合成、購買或以其他方式取得藥劑。

所謂"降低"意指至少10%、25%、50%、75%或100%的負向改變。

所謂"參考"意指標準或對照的條件。

"參考序列"是使用作為序列比較之基礎的定義序列。參考序列可以是特定序列的子集或全部；例如，全長cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。對於多肽，參考多肽序列的長度一般至少約16個胺基酸，較佳至少約20個胺基酸，更佳至少約25個胺基酸，甚至更佳約35個胺基酸，約50個胺基酸，或約100個胺基酸。對於核酸，參考核酸序列的長度一般至少約50個核苷酸，較佳至少約60個核苷酸，更佳至少約75個核苷酸，甚至更佳約100個或約300個核苷酸或於其上下或其間的任何整數。

通常使用序列分析軟體(例如，Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705,BREAST、BESTFIT、GAP或PRETTYBOX程式)測定序列同一性。這類軟體經由對各種取代、刪除及/或其他修飾進行同源性的程度分配而匹配相同或相似的序列。保守取代通常包含在下列群組內的取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。在確定同一性程度的示例性方法中，可使用BLAST程式，概率分數介於e<"3>及e<"100>之間表示密切相關的序列。

所謂"結構多蛋白"意指包括至少兩個可分離多肽的組成胺基酸分子，而這些多肽提供病毒殼體或外膜。具體例中，多肽容易被病毒酶(如，殼體自身蛋白酶(autoproteinase)及訊息酶)裂解。

所謂"個體"意指哺乳動物，包含，但不限於，人類或非人類哺乳動物，諸如牛、馬、狗、羊或貓。

本文提供的範圍應理解為範圍內所有值的簡寫。例如，1至50的範圍應理解為包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所構成之群組的任何數值、數值組合或子範圍。

本文中所使用，術語"治療(treat)"、"治療(treating)"、"治療(treatment)"等意指減少或改善與該等相關的失調及/或症狀。應理解的是，雖然不排除，但治療失調或病狀並不要求完全消除與該等相關的失調、病狀或症狀。

除非上下文中具體說明或顯而易見，本文中所使用術語"或"應理解為包含在內。

除非上下文中具體說明或顯而易見，本文中所使用術語"一個(a)"、"一個(an)"及"所述(the)"應理解為單數或複數。

除非上下文中具體說明或顯而易見，本文中所使用術語"約"應理解為在所屬領域的正常容許範圍內，例如在平均值的2個標準偏差內。"約"可理解為在所述值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%內。除非另外從上下文中清楚得知，本文所提供的所有數值都由術語"約"修飾。

本文所提供的組成物或方法可與一種或多種本文所提供的任何其他組成物及方法組合。

α病毒複製子

當α病毒複製子傳遞到真核細胞時，可經由自身轉錄(通過自身產生的反義拷貝)導致多種子RNA的產生。α病毒複製子可在傳遞到細胞後直接轉譯，這種轉譯提供依賴RNA的RNA聚合酶，然後從傳遞的RNA產生反義及有義的轉錄。因此傳遞的RNA導致多種子RNA的產生。這些子RNA以及共線次基因組轉錄本，可以自己轉譯而提供編碼蛋白質的原位表現，或可被轉錄而提供與所傳遞的RNA有相同意義的進一步轉錄本，這些RNA被轉譯而提供蛋白質的原位表現。這種轉錄序列的總體結果是引入之複製子RNA之數目大量擴增，從而使經編碼的蛋白質成為細胞的主要多肽產物。

根據本發明，α病毒複製子包括編碼非結構蛋白n1、n2、n3及n4的多核苷酸，及至少一個目的基因。α病毒複製子不編碼任何α病毒結構蛋白。

α病毒非結構蛋白可以是衍生自上述α病毒之一的野生型蛋白質或是在野生型胺基酸序列中具有一種或多種改變。在各種先前技術參考文獻中公開了α病毒非結構蛋白的改變，並且該技術可基於眾所周知的資訊而選擇合適的α病毒非結構蛋白。

所屬領域熟知α病毒複製子且可採用任何先前公開的複製子(例如，Virology.1997 Dec 22；239(2)：389-401.、WO2009/131604、WO2011/005799、WO2012/031043、WO2014/1270493及WO2015/095167，上述引證文獻的內容係通過引用方式併入本文中)。

α病毒結構蛋白

ARP具有殼體及外膜蛋白之α病毒結構蛋白。較佳地，α病毒結構蛋白包括殼體蛋白及E2及E1外膜蛋白，及亦可具有外膜的E3蛋白。根據本發明，至少殼體及外膜之一具有至少一種加強哺乳動物細胞中ARP表現的改變。

具體例中，α病毒結構蛋白包含至少一種α病毒殼體蛋白，其在相應於α病毒殼體蛋白NLS中的離胺酸殘基的胺基酸位置具有非離胺酸殘基(如，丙胺酸或天冬醯胺酸)及/或在相應於α病毒殼體蛋白NLS中的精胺酸殘基的胺基酸位置具有非精胺酸殘基(如，丙胺酸或天冬醯胺酸)。在具體實施例中，α病毒殼體蛋白是具有一種或多種K67N、K68N及K69N改變的WEEV CBA87株殼體蛋白。在某些具體例中，α病毒殼體蛋白是具有一種或多種K64N、K65A、K65N、K67A及K67N改變的VEEV TC83株殼體蛋白。在一些具體例中，α病毒殼體蛋白是具有K67N改變的EEEV PE-6株殼體蛋白。在特定具體例中，α病毒殼體蛋白是具有一種或多種R62A、R63A、R65A、K66A、K68A及K69A改變的CHIKV 37997株殼體蛋白；α病毒殼體蛋白是具有一種或多種R71N、K72N、K73N及K74N改變的羅氏河病毒殼體蛋白；α病毒殼體蛋白是具有一種或多種K64A、K64N、K65A、K65N、K67A、K67N、K68A及K68N改變的巴馬森林病毒殼體蛋白。可從GenBank獲得上述α病毒之野生型殼體蛋白胺基酸序列。

具體例中，α病毒E2蛋白在CHIKV E2蛋白中相應於胺基酸234的胺基酸位置具有非離胺酸殘基(如，天冬醯胺酸)及/或在CHIKV E2蛋白中相應於胺基酸251的胺基酸位置之修飾，使病毒萌發時E2蛋白不穩定。

具體例中，可修飾編碼α病毒E3的多核苷酸而使其在弗林蛋白酶位點(Arg-X-X-Arg)的胺基酸序列包含改變/突變。

術語"Arg-X-X-Arg"係指弗林蛋白酶的最小裂解位點及"X-X"包含任何兩個胺基酸的組合。在弗林蛋白酶位點對胺基酸序列改變的實例包含對Ile-Glu/Asp-Gly-Arg、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或Ser-Gly-Gly-Gly-Ser的改變。US Patent Publication Nos.2016-0040134及2016-0200775中有詳細說明(將上述引證的文獻通過引用方式併入本文中)。

例如，VEEV CT83株在其E3區末端具有包含RKRR的弗林蛋白酶位點，而編碼RKRR的多核苷酸序列可被編碼SGGGS者取代。

本發明的一些具體例中，蛋白質可包括含有產生沉默性取代、添加或缺失的改變的突變，但不會改變所編碼之蛋白質的性質或活性，也不會改變蛋白質的製造方式。

製備ARP的方法

可經由所屬領域習知的製程製備ARP。Virology 239,389-401,1997中公開製備ARP的例示製程，將上述引證文獻的內容通過引用方式併入本文中。

通常，可經由用編碼α病毒複製子的載體共轉染適當的宿主細胞而製造ARP，即，包括編碼nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及一個目的基因的載體；及至少一個編碼α病毒結構蛋白的輔助載體。較佳地，用編碼α病毒複製子的載體、編碼殼體蛋白的載體及編碼外膜蛋白的載體共轉染細胞。

特別是，本發明提供製備α病毒複製子顆粒的方法，包括以下步驟：將細胞與下列者共轉染，i)包括編碼α病毒非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及至少一個目的基因的載體，ii)包括編碼α病毒殼體蛋白之多核苷酸的載體，及iii)包括編碼α病毒E3-E2-6K-E1之多核苷酸的載體，其中至少殼體、E3及E2中之一者包括一個或多個胺基酸的改變，但E1不包括胺基酸的改變，培養經轉染的細胞，及從細胞培養物純化ARP。

分子生物學領域中熟練的技術人員應理解可使用廣泛的各種表現系統中的任何一種來生產ARP。欲共轉染的確切細胞(宿主細胞)對本發明並不是關鍵。可在原核宿主中(如，大腸桿菌(E.coli))或真核宿主中(如，啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，昆蟲細胞，如，Sf21細胞或哺乳動物細胞，如，NIH 3T3、HeLa、COS細胞)生產ARP。可從廣大範圍的來源中獲得這種細胞(如，美國菌種保存中心，Rockland,Md.；亦參照，如，Ausubel et al.，同上)。昆蟲細胞的非限制實例為，草地夜蛾(Spoaoptera frugiperda(Sf))細胞，如，Sf9、Sf21，粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞，如，High Five細胞及果蠅S2細胞。黴菌(包含酵母菌)宿主細胞的實例為啤酒酵母菌、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)(K.lactis)、包含白色念珠菌(C.albicans)及平滑念珠菌(C.glabrata)的念珠菌屬、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(S.pombe)、嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)及解脂耶羅維亞酵母菌(Yarrowia lipolytica)。哺乳動物細胞的實例為COS細胞、乳倉鼠腎細胞、小鼠L細胞、LNCaP細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎(HEK)細胞、非洲綠猴細胞、CV1細胞、HeLa細胞、MDCK細胞、Vero及Hep-2細胞。亦可使用非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母細胞或其他兩棲動物源的細胞。原核宿主細胞包含細菌細胞，例如，大腸桿菌、枯草桿菌(B.subtilis)及分枝桿菌。

所屬領域習知獲得編碼所述蛋白質之多核苷酸的方法。例如，編碼特定α病毒蛋白，如，CHIKV、WEEV、EEEV、VEEV、羅氏河病毒或巴馬森林病毒結構蛋白的基因，可經由RT-PCR從感染該病毒的細胞中提取的多腺苷酸化mRNA中分離出來。所得的產物基因可以多核苷酸插入到載體中的形式選殖。

術語"載體"意指可在生物體、細胞或細胞組分之間傳遞及/或傳輸核酸序列的工具。載體包含會自主複製或可整合入宿主細胞染色體中的質體、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌質體、轉位子、人工染色體等。載體也可以是不會自主複製的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同股內的DNA及RNA組成的多核苷酸、聚離胺酸接合DNA或RNA、肽接合DNA或RNA、脂質體接合DNA等。在許多但不是全部的具體例中，本發明載體是質體或桿粒(bacmids)。

通常，欲表現的核酸分子"可操作地連接"啟動子及/或強化子，且受啟動子及/或強化子的轉錄調控控制。

轉染的方法及表現載體的選擇將取決於所選擇的宿主系統。轉染方法說明於，如，Ausubel et al.(同上)中；可從，如，Cloning vehicles：A Laboratory Manual(P.H.Pouwels et al.,1985,Supp.1987)中所提供者來選擇表現載體。將本段所引證的參考文獻通過引用方式併入本文中。

有用於生產本發明ARP的各種表現系統存在。適用於生產這種ARP的表現載體包含，而不限於，染色體的、游離基因組的及病毒衍生的載體，如，衍生自細菌質體、噬菌體、轉位子、酵母游離基因組、插入單元、酵母染色體單元、病毒諸如桿狀病毒(baculoviruses)、乳多泡病毒(papova viruses)諸如SV40、痘瘡病毒(vaccinia viruses)、腺病毒(adenoviruses)、禽痘病毒(fowl pox viruses)、假性狂犬病病毒(pseudorabies viruses)及反轉錄病毒(retroviruses)的載體，及衍生自其組合的載體。

本文中使用的建構體及/或載體包括編碼結構蛋白的α病毒多核苷酸，而結構蛋白包含本文所述之外膜蛋白或殼體蛋白。而且，本文中使用的建構體及/或載體包括編碼非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的α病毒多核苷酸，及目的基因。

載體可以是，例如，噬菌體、質體、病毒或反轉錄載體。包括核苷酸的建構體及/或載體應可操作地連接適當的啟動子，諸如CMV啟動子、λ噬菌體PL啟動子、大腸桿菌的lac、phoA及tac啟動子、SV40早期及晚期啟動子及反轉錄LTR啟動子，其為非限制性實例。其他適合的啟動子為所屬領域熟練技術人員習知是取決於所需的宿主細胞及/或表現速率。表現建構體將進一步含有轉錄起始、終止的位點，及在轉錄區用於轉譯的核醣體結合位點。由建構體表現的轉錄本的編碼部分較佳包括開始的轉譯起始密碼子及位於欲轉譯的多肽末端適當位置的終止密碼子。

載體較佳地包含至少一個可選擇的標記。這些標記包含真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、G418或新黴素耐藥性，及在大腸桿菌及其他細菌中培養用的四環素、康黴素(kanamycin)或安比西林(ampicillin)耐藥性基因。載體中較佳的是病毒載體，諸如桿狀病毒、痘病毒(poxvirus)(如，痘瘡病毒、鳥類痘病毒(avipox virus)、金絲雀痘病毒(canarypox virus)、禽痘病毒、浣熊痘病毒(raccoonpox virus)、豬痘病毒(swinepox virus)等)、腺病毒(如，犬腺病毒(canine adenovirus))、皰疹病毒(herpesvirus)及反轉錄病毒。可用於本發明的其他載體包括在細菌中使用的載體，包括pQE70、pQE60及pQE-9、pBluescript載體、Phagescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。其中較佳的真核載體是pFastBacl pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl及pSG、pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL。其他適合的載體對熟練的技術人員來說是顯而易見的。

可製備重組建構體並使用於轉染，而可將包含那些本文所述之病毒蛋白表現到真核細胞及/或原核細胞中。因此，本發明提供宿主細胞，其包括含有編碼α病毒結構蛋白(包括殼體、E3、E2、6K及E1)或其部分的核酸之載體(或載體等)，及包括編碼α病毒nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的核酸及至少一個目的基因之載體，在允許ARP形成的條件下。

具體例中，所述載體是重組桿狀病毒。另一個具體例中，所述重組桿狀病毒被轉染到昆蟲細胞中。在較佳具體例中，所述細胞是昆蟲細胞。另一個具體例中，所述昆蟲細胞是Sf9細胞。

生產多肽的一種特殊細菌表現系統是大腸桿菌pET表現系統(Novagen,Inc.,Madison,Wis)。根據這種表現系統，將編碼多肽的DNA以經設計而允許表現的方式插入到pET載體中。由於編碼這種多肽的基因受T7調控信號的控制，因此經由在宿主細胞中誘導T7RNA聚合酶的表現來實現多肽的表現。通常是使用回應IPTG誘導而表現T7 RNA聚合酶的宿主菌株來實現。一旦生產，即根據所屬領域已知的標準方法例如，本文中說明的方法將重組多肽分離。

另一個生產多肽的細菌表現系統是pGEX表現系統(Pharmacia)。這個系統採用GST基因融合系統，係設計用於高水平表現基因或基因片段作為功能基因產物快速純化及回收的融合蛋白。將目的蛋白質與來自日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)的麩胱甘肽S-轉移酶蛋白的羧基端融合，很容易地使用麩胱甘肽Sepharose 4B經由親和層析法從細菌裂解液中純化。用麩胱甘肽洗提，可在溫和條件下回收融合蛋白。從融合蛋白中裂解麩胱甘肽S-轉移酶結構域是由於該結構域上游的位點特異性蛋白酶識別位點的存在而促進的。例如，可用凝血酶裂解在pGEX-2T質體中表現的蛋白質；可用Xa因子裂解在pGEX-3X中表現的蛋白質。

取決於所選擇的載體及宿主細胞，在表現重組蛋白並生成α病毒複製子的條件下，經由培養經載體轉染的宿主細胞而生產ARP，並形成含有α病毒複製子的ARP，而該α病毒複製子係以α病毒結構蛋白的粒子封裝。具體例中，本發明包括生產ARP的方法，該方法關於共轉染包括編碼α病毒非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及至少一個目的基因的載體，至少一個載體各編碼至少一個α病毒蛋白進入合適的宿主細胞，並在允許ARP形成的條件下表現所述α病毒蛋白。另一個具體例中，真核細胞選自由酵母、昆蟲、兩棲類、鳥類或哺乳動物細胞所構成之群組。選擇適當的生長條件是在所屬領域普通熟練技術人員的技術範圍內。

培養生產本發明ARP的細胞之方法包含，但不限於，批次、加料批次、連續及灌流細胞培養技術。具體例中，用編碼α病毒複製子的載體及包括編碼殼體之多肽的載體，及包括編碼外膜蛋白的多核苷酸的載體共轉染細胞，諸如衍生自CHIKV或VEEV者，在生物反應器或發酵室中生長，其中細胞傳遞並表現蛋白質(如，重組蛋白)而用於進行純化及分離。通常，細胞培養是在無菌、控制溫度及大氣條件下進行的。生物反應器是一種用於培養細胞的小室，可以監測環境條件諸如溫度、大氣、攪拌及/或pH值。具體例中，生物反應器是不鏽鋼室。另一個具體例中，所述生物反應器是預先滅菌的塑料袋(如，Cellbag.RTM.,Wave Biotech,Bridgewater,N.J.)。在其他的具體例中，所述預先滅菌的塑料袋是約50L至1000L袋。

使用維持其完整性的方法，諸如梯度離心法，如，氯化銫法、蔗糖法及碘克沙醇法，及標準純化技術包含，如，離子交換及凝膠過濾層析，而進行ARP的分離。

以下是如何製造、分離及純化本發明ARP的實施例。所屬領域熟練技術人員理解有更多的方法可以用來製造及純化ARP。據此，本發明不限於本文中所說明的方法。

一般而言，經由將哺乳動物細胞(如，人胚胎腎(293T)細胞)或Sf9細胞(非感染的)接種到振盪燒瓶中，使細胞隨著細胞的生長及增殖而增加及擴大(例如從125ml的燒瓶到50L的Wave袋)，來完成本發明ARP的生產。用於培養細胞的培養基是為合適的細胞株而調配的(較佳為無血清培養基，如，昆蟲培養基ExCell-420，JRH)。其次，用合適的載體(如，哺乳動物表現載體或用於SF細胞的重組桿狀病毒)，以最有效的多重感染(如，每個細胞約有1至3個斑塊形成單位)轉染或感染細胞。多核苷酸或其部分在細胞中表現，它們在其中自我組裝成ARP，並在感染後大約24至72小時(hpi)從細胞中分泌。通常，當細胞處於對數生長中期(4至8.×10⁶細胞/ml)時，轉染或感染是最有效的，並且至少有90%的存活。此外，在細胞培養中，轉染細胞可暴露於高pH條件(pH>7.2，如，pH7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8或以上)，以增加ARP產量。

本發明的ARP大約在感染後48至120小時收穫，此時細胞培養基中ARP的水平接近最大值，但在廣泛的細胞溶解之前。收穫時細胞密度及成活力可為約0.5×10⁶至約1.5×10⁶細胞/ml，成活力至少為20%，如染料排除測定法所示。其次，移除培養基並使澄清。可將約0.4至約1.0M濃度的NaCl添加到培養基中，較佳為約0.5M，以避免ARP的聚集。可用一次性使用、預先滅菌的中空纖維0.5或1.00μπι過濾芯或類似裝置，經由切向流過濾(TFF)而將含有本發明ARP的細胞培養液中的細胞及細胞碎片去除。

此外，在細胞培養中，轉染細胞可暴露於高pH條件(pH>7.2，如，pH7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8或以上)，以增加ARP產量。

其次，使用拋棄式、預先滅菌的500,000分子量去除中空纖維濾芯進行超濾而濃縮在澄清化培養液中的ARP。濃縮後的ARP可在含有0.5M NaCl的10倍體積pH7.0至8.0的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中進行透析過濾，而去除殘留的培養基組分。

於約4℃至約10℃，在20%至60%的不連續蔗糖梯度下，在含有0.5M NaCl之pH7.2的PBS緩衝液中，於6,500 x g離心18小時，可進一步將濃縮、透析過濾的ARP純化。通常ARP會在約30%至約40%蔗糖之間或介面處(在20%及60%的分步梯度中)形成特別的可見帶，可以從梯度收集並儲存。可將此產品稀釋成包括200mM NaCl，為下一步的純化過程作準備。此產品含有ARP及可含有完整的桿狀病毒顆粒。

可經由陰離子交換層析法或44%等密度蔗糖墊離心法而進一步純化ARP。在陰離子交換層析中，將得自蔗糖梯度(見上文)的樣品裝入含有陰離子介質的管柱(如，Matrix Fractogel EMDTMAE)，並通過可將ARP與其他污染物(如，桿狀病毒及DNA/RNA)分離的鹽梯度(約0.2M至約1.0M NaCl)而洗提。在蔗糖墊離心法中，將含有ARP的樣品添加到44%的蔗糖墊中，並在30,000g離心約18小時。ARP在44%蔗糖的頂部形成一條帶，而桿狀病毒在底部沉澱，其它污染蛋白停留在頂部的0%蔗糖層。收集ARP峰或帶。

如需要，可失活完整的桿狀病毒。可經由化學方法而失活，例如，福馬林或β-丙內酯(BPL)。也可在很大程度上經由使用所屬領域習知的選擇性沉澱法及層析法而達成完整桿狀病毒的去除及/或失活，如以上所例示。失活方法包括在約25℃至約27℃下將含有ARP的樣品在0.2%的BPL中培養3小時。也可經由在4℃將含有ARP的樣品在0.05%的BPL中培養3天，然後在37℃下培養1小時而將桿狀病毒失活。

在失活/去除步驟之後，包括ARP的產品可以通過另一個透析過濾步驟而去除失活步驟中的任何試劑及/或任何殘留的蔗糖，並將ARP 放入所需的緩衝液(如，PBS)中。包括ARP的溶液可以用所屬領域已知的方法(如，無菌過濾)進行滅菌，並儲存在冰箱或冷凍箱中。

以上技術可以在各種不同的規模上實踐。例如，T燒瓶、振盪燒瓶、轉瓶，上至工業尺寸的生物反應器。生物反應器可包括不銹鋼槽或預先滅菌塑料袋(例如，Wave Biotech,Bridgewater,N.J.所販售的系統)。所屬領域熟練技術人員將知道什麼最適合他們的目的。

如本文所說明，當給予期望的宿主時，本發明的ARP被經α病毒感染的細胞所佔據，而該α病毒係衍生結構蛋白的α病毒。複製子中包含的目的基因在ARP進入時被內化到細胞中。這一性質有助於使用本文所說明的ARP作為基因的傳遞載體，因為它們能夠將目的基因傳遞到所需的細胞中。

天然α病毒基因組除了編碼非結構複製酶多蛋白外，還編碼病毒結構蛋白，而α病毒複製子不編碼α病毒結構蛋白。因此，α病毒複製子可以在細胞中導致其自身基因組RNA拷貝的產生，但不能導致含有RNA的病毒粒子的產生。無法產生這些病毒粒子意味著，與野生型α病毒不同的是，複製子不能以具有傳染性的形式永久存在。在野生型病毒中永久存在所必需的α病毒結構蛋白不存在於複製子中，它們的位置被至少一個目的基因所取代，因此亞基因組轉錄本編碼的是目的蛋白質而不是結構性α病毒結構蛋白。

因此，在某些具體例中，ARP包括可以是或可編碼的目的基因，諸如需要傳遞給個體的治療劑或診斷劑，如，成像劑、核酸序列(包含siRNA及microRNA)、放射性核種、激素、肽、抗病毒劑、抗腫瘤/化療劑、細胞生長調節劑、細胞生長抑制劑、細胞介素、抗原，佐劑及毒素。封裝在病毒結構蛋白顆粒中的複製子不應對ARP的穩定性產生不良作用。這可經由產生含有特定目的基因的ARP，並評估其對ARP穩定性(如果有的話)的影響來確定。

據此，本發明提供將目的基因引入細胞的方法。根據本發明，目的基因包含在α病毒複製子中，而α病毒複製子由α病毒結構蛋白的粒子封裝。在相關具體例中，ARP與細胞接觸。在相關具體例中，使ARP進入細胞，從而將目的基因傳遞到細胞中。

本文中所使用，術語"治療(treat)"、"治療(treating)"、"治療(treatment)"等意指減少或改善與之相關的失調及/或症狀。應理解的是，雖然不排除，但治療失調或病狀並不要求完全消除與之相關的失調、病狀或症狀。

本文中所使用，術語"預防(prevent)"、"預防(preventing)"、"預防(prevention)"、"預防性治療(prophylactic treatment)"等意指降低個體之失調或病狀發展的可能性，該個體不具有，但有發展成失調或病狀的風險或易患失調或病狀。

目的基因可以是編碼抗原的基因。可將本發明的ARP製備成可注射的形式，作為液體溶液或作為懸浮液。也可將適合注射的固體形式製備成乳劑，或用脂質體封裝ARP。疫苗抗原通常與藥學上可接受的載體組合，該載體包含不會誘導產生對接受載體的個體有害的抗體的任何載體。適宜的載體通常包括代謝緩慢的大分子，諸如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物、脂質聚集體及非活性病毒顆粒。這種載體是所屬領域的那些熟練技術人員熟知的。這些載體也可有佐劑的功能。

本文所說明的ARP可與佐劑(如，Ribi)組合而給藥。佐劑是增強疫苗效力的免疫刺激劑。如果需要，將包括一個或多個α病毒多肽或其片段或變異體的ARP與增強針對目的抗原而產生的免疫反應之效力的佐劑組合而給藥。有效佐劑包含，但不限於，鋁鹽諸如氫氧化鋁及磷酸鋁、胞壁醯肽、細菌細胞壁組分、皂素佐劑及其他作為免疫刺激劑而增強組成物的效力的物質。

免疫原組成物，即，本文所述的ARP、藥學上可接受的載體及佐劑，通常也含有稀釋劑，諸如水、鹽水、甘油、乙醇。也可存在輔助性物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝物質等。可將蛋白質調配成中性或鹽形式的疫苗。免疫原組成物通常是經由注射而腸外給予；這種注射可以是皮下注射或是肌肉內注射。其他製劑適用於其他形式的給藥，諸如栓劑或口服。口服組成物可作為溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊或緩釋製劑而給予。

免疫原組成物係以與製劑劑量配合的方式給藥。免疫原組成物包括本文所說明的免疫有效量的ARP及其他先前提到的組分。所謂免疫有效量意指單一劑量或按多劑量方案而給予的組成物，對於治療或預防感染有效的量。取決於欲接受治療的個體、個體的健康及身體狀況、個體免疫系統產生抗體的能力、所希望的保護程度及其他相關因素，給藥的劑量將有所不同。所需活性成分的確切數量將取決於醫生的判斷，但通常為每劑量的抗原在5μg至250μg之間。

醫藥組成物及給藥

本發明的特點是包括本文所說明之ARP的醫藥組成物。本文之有用的醫藥組成物含有藥學上可接受的包含任何適當的稀釋劑或賦形劑的載劑及本發明的ARP，該載劑包含其本身不誘導產生對接受組成物的脊椎動物有害的免疫反應的任何藥劑，並且可在無不當毒性的情況下給予。本文中所使用術語"藥學上可接受的"意指經由聯邦或州政府的監管機構批准，或列於美國藥典、歐洲藥典或其他普遍公認的藥典中，用於哺乳動物，更特別的是用於人類。這些組成物可適用作為疫苗及/或抗原組成物而用於誘導脊椎動物中的保護性免疫反應。

藥學上可接受的載劑包含但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、無菌等張水緩衝液及其組合。關於藥學上可接受的載劑、稀釋劑和其他賦形劑的詳細討論發表在"Remington's Pharmaceutical Sciences"(Mack Pub.Co.N.J.現行版)。製劑應適合於給藥模式。在較佳具體例中，製劑適用於人體給藥，較佳是無菌的、非微粒的及/或非熱原性。

如需要，組成物也可含有少量的潤濕或乳化劑，或pH緩衝劑。組成物可以是固態的，諸如適合於重構的冷凍乾燥粉末、液體溶液、懸浮液、乳劑、錠劑、丸劑、膠囊、緩釋製劑或粉劑。口服製劑可包含標準載劑諸如製藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。

在某些具體例中，ARP組成物以液體形式供應，例如在有指明ARP組成物的數量及濃度的密封容器中。

較佳地，裝在密封容器中至少約50μg/ml而提供液體形式的ARP組成物，更佳地至少約100μg/ml、至少約200μg/ml、至少500μg/ml或至少1mg/ml。

或者，疫苗製劑是經由鼻內給藥，通過滴劑、大顆粒氣霧劑(大於約10微米)或噴入上呼吸道或小顆粒氣霧劑(小於10微米)或噴入下呼吸道。雖然上述任何一種傳遞途徑都會導致免疫反應，但鼻內給藥的附加好處是在許多病毒(包含α病毒，例如CHIKV或VEEV)的入口位點引發黏膜免疫。

因此，本發明還包括調配疫苗或抗原組成物的方法，該疫苗或抗原組成物誘導哺乳動物對感染或其至少一種症狀產生免疫力，調配的方法包括在所述製劑中添加有效劑量的ARP，如，α病毒(如，CHIKV或VEEV)。

在某些情況下，較佳是用單一劑量刺激免疫，然而也可經由相同或不同的途徑而給予額外的劑量，以達到所需的效果。對於新生兒及嬰兒，例如，可能需要多次給藥來引發足夠的免疫水平。在整個兒童時期，有需要可每隔一段時期持續給藥，以維持足夠的水平或保護。

同樣地，特別易受反復或嚴重感染的成人，諸如，例如，保健工作者、日托工作者、幼兒家庭成員、老年人及心肺功能或免疫系統受損的個體可能需要多次免疫來建立及/或維持保護性的免疫反應。可監測所誘導免疫的水平，例如，測量中和分泌及血清抗體的量，及有需要調整劑量或重複疫苗接種，以引發及維持所需的保護水平。

熟練的技術人員可輕易測定藥物製劑的劑量，例如，首先確定引發預防或治療性免疫反應的有效的劑量，如，經由測量病毒特異性免疫球蛋白的血清力價，或測量血清樣本或尿液樣本或黏膜分泌物中抗體的抑制率。所述劑量可以從動物研究中測定。用於研究疫苗效能的非限制動物清單包含天竺鼠、倉鼠、雪貂、栗鼠、小鼠及棉花鼠，以及非人類靈長類動物。大多數動物不是感染性因子的天然宿主，但仍能提供疾病各方面的研究。例如，可將疫苗候選物給藥上述任何動物，如，本發明的ARP，以部分表徵所誘導的免疫反應，及/或測定是否產生任何中和抗體。例如，許多研究都是在小鼠模型中進行，因為小鼠體型小成本低，因此允許研究者進行較大規模的研究。

此外，可經由熟練技術人員進行人的臨床研究來確定人的最佳有效劑量。這樣的臨床研究是例行的，在所屬領域上是眾所周知的。採用的確切劑量也將取決於給藥途徑。有效劑量可從體外或動物試驗系統所得到的劑量-反應曲線來推斷。

在所屬領域中也習知，使用非特異性的免疫反應刺激劑，稱為佐劑，可增強特定組成物的免疫原性。佐劑已被實驗用於促進對未知抗原之免疫力的普遍提高。免疫方案多年來一直使用佐劑來刺激反應，因此，佐劑為所屬領域普通熟練技術人員所熟知。一些佐劑會影響抗原的呈現方式。例如，當蛋白質抗原被明礬沉澱時，免疫反應就會增加。抗原的乳化也延長抗原呈現的持續時間。在Vogel等人的"A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients(第2版)"中所說明之任何佐劑的內涵，出於所有目的以引用方式整體併入本文，是在本發明的範圍內設想的。

示例性佐劑包含完全弗氏佐劑(含有已殺死的結核分枝桿菌之免疫反應非特異性刺激劑)、不完全弗氏佐劑及氫氧化鋁佐劑。其他佐劑包括GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP化合物諸如thur-MDP及nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂質A及單磷醯脂質A(MPL)。也可考慮RIBI，RIBI在2%角鯊烯/Tween-80乳劑中，含有從細菌中提取的三種組分：MPL、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)。也可使用MF-59、Novasome.RTM.、MHC抗原。

也可以用"免疫刺激劑"來調配本發明的ARP。這些是身體自身的化學傳訊者(細胞介素)，以增加免疫系統的反應。免疫刺激劑包含但不限於具有免疫刺激、免疫增強及促炎活性的各種細胞介素、淋巴介素及趨化介素，諸如介白素(如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生長因子(如，粒細胞-巨噬細胞(GM)-群落刺激因子(CSF)；及其他免疫刺激分子，諸如巨噬細胞炎症因子、FLt 3配體、B7.1、B7.2等。免疫刺激分子可在與ARP相同的製劑中給予，也可分別給予。可給予蛋白質或是編碼該蛋白質的表現載體，以產生免疫刺激作用。因此在具體例中，本發明包括抗原及疫苗製劑，其係包括佐劑及/或免疫刺激劑。

根據本發明，包括所述ARP的傳遞系統可將目的基因傳遞到真核細胞的細胞質中，因而可治療癌症、病毒感染、神經系統疾病、自體免疫性疾病、移植物排斥及單基因或多基因遺傳性疾病。

將參照下列實施例詳細說明本發明，然而這些實施例的目的並非限制本申請案的範圍。

[實施例1]

VEEV複製子顆粒(VRP)的建構

第2圖顯示圖示規程。

建立表現螢光素酶的VEEV複製子質體

1)合成全長VEEV TC83非結構蛋白(nsp)1、nsp2、nsp3及nsp4片段(ThermoFisher)。

類似地，如下，合成與複製子建構體之各種不同片段相應的gblock(IDT)。

2)VEEV gblock1-ClaI-RSVp-5’UTR-nsp1(bp1-470)-RsrII-ApaI-26Sp-sgRNA到VEEV CA基因的ATG。這個片段與pBR322骨幹質體在5'端有36bp的重疊。這是片段#1。

3)VEEV gblock2-這個片段與VEEV gblock1有64bp的重疊，起始於ApaI位點，直至ATG起始密碼子。隨後是奈米螢光素酶ORF(Promega)及VEEV 3'UTR的前72個鹼基。

4)片段#2的選殖-使用下表所示的寡聚體，經由重疊延伸PCR方法首先組裝VEEV gblock2、全長VEEV 3'UTR及VEEV PolyA訊號(A_(n=55))：

VEEV_Oligo2與pBR322骨幹質體有15bp的重疊。

5)其次，使用Gibson Assembly方法組裝VEEV gblock1(片段#1)、片段#2及pBR322骨幹(用ClaI及NruI-HF酶切)而得到pBR322-RSVp-RsrII-ApaI-26Sp-sgRNA-NanoLuc-A(n=55)-SV40 pA骨幹建構體(BB)。這個骨幹建構體缺少全長TC83 nsp1-4片段。

6)使用含有RsrII及ApaI限制性位點的引子-i)5'-ccggccCGGACCGacaagtctctatca.cc-3'(SEQ ID NO：11，fwd引子)及ii)5'-ggccggGGGCCCctctcaggtagctgaatg-3'(SEQ ID NO：12，rev引子)，從得自1)的合成Thermo質體來擴增nsp1-4片段(bp 470至7461)。使用RsrII及ApaI位點將這個PCR擴增nsp片段選殖到BB骨幹質體中而得到全長VEEV TC83複製子建構體。(第3圖)

輔助質體

第4圖及第5圖顯示編碼VEEV TC83殼體的輔助質體建構體。建構體分別表現野生型VEEV殼體蛋白(SEQ ID NO：1)及在NLS具有突變的VEEV殼體(K64N，SEQ ID NO：2)。

第6圖及第7圖顯示本文所使用表現VEEV TC83醣蛋白E3-E2-6K-E1的輔助質體建構體。建構體分別表現野生型VEEV TC83醣蛋白E3-E2-6K-E1(SEQ ID NO：3)及E3經修飾的E3-E2-6K-E1(E3 RKRR末端的弗林蛋白酶位點被SGGGS置換，SEQ ID NO：4)。

細胞培養及共轉染

將293T細胞接種在6孔板中含有10%FBS、青黴素及鏈黴素的完全DMEM中。使用PEI(每質體1.7μg)，將細胞與含有(VR)(SEQID：5)或缺少(BB)nsp1-4片段的等量VEEV RSVp-NLuc構建體共轉染，以及與編碼殼體的輔助性質體及編碼醣蛋白E1-6K-E2-E3的輔助質體共轉染。輔助質體的組合為(SEQ ID NO：1及3)、(SEQ ID NO：1及4)、(SEQ ID NO：2及3)或(SEQ ID NO：2及4)。細胞在37℃下與轉染混合物培養約3小時，隨後去除轉染混合物，用1X PBS洗滌細胞，添加新鮮的DMEM。在48hpt(轉染後的小時數)或72hpt收獲封裝的病毒複製子顆粒(VRP)。為獲得VRP，在4℃下以1200rpm將細菌培養液離心5min，沉澱任何細胞碎片，而獲得轉染細胞的培養上清液。通過0.45um過濾器過濾上清液。將獲取的VRP貯存在4℃或-80℃。

[實施例2]

測定VEEV複製子封裝入VEE病毒複製子顆粒(VRP)的能力

感染性及螢光素酶檢測

第8圖顯示圖示規程。

將293T細胞接種於96孔板中，密度約為每孔10,000個細胞。在37℃下，用未稀釋或2倍連續稀釋的收獲VRP來感染細胞，感染後14小時(hpi)去除VRP；用PBS洗滌細胞，並在孔中添加新鮮的DMEM。進一步培養細胞，且在24、48及72hpi收獲細胞並進行螢光素酶檢測。將等量的感染細胞及Nano-Glo螢光素酶檢測系統(Promega)添加到白色底不透明96孔板(Costar)中進行螢光素酶檢測。使用Bio-Tek Synergy HTX微孔盤儀立即測定螢光素酶活性。

結果

第9圖顯示其結果。確定早在24hpi在VRP感染的細胞中就有螢光素酶的表現。而缺少nsp1-4(BB)之骨架建構體感染的細胞幾乎不表現螢光素酶。

[實施例3]

新VEEV複製子建構體

經由引入多選殖位點(MCS)而使得能夠引入各種不同的"目的基因"，來製備新的VEEV TC83複製子質體建構體。第10圖顯示圖示規程。第11圖及SEQ ID NO：6顯示該建構體。在第11圖的建構體中，引入編碼螢光素酶的核苷酸作為目的基因。可針對欲感染的細胞而選擇質體中的啟動子。

[實施例4]

製備在殼體及/或E3-E2-6K-E1中有/無突變，且具有目的基因的VRP

在此實施例中，以如實施例1的方式將含有目的基因的VEEV複製子質體與VEEV殼體輔助質體及VEEV E3-E2-6K-E1醣蛋白輔助質體對293T細胞進行共轉染。採用編碼螢光素酶、GFP、IKK或JNK2的基因作為目的基因。

使用下列質體：i-1)包括編碼VEEV CT83野生型殼體蛋白之多核苷酸的質體，或i-2)包括編碼在NLS(K64N)具有突變的VEEV CT83殼體蛋白之多核苷酸的質體，ii-1)包括編碼野生型VEEV CT83 E3-E2-6K-E1之多核苷酸的質體，或ii-2)包括編碼在E3的弗林蛋白酶位點具有突變的VEEV CT83 E3-E2-6K-E1之多核苷酸的質體，及iii)包括編碼VEEV CT83 nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及編碼螢光素酶、GFP、IKK或JNK2的目的基因的質體。

共轉染

將293T細胞與包括目的基因、編碼VEEV殼體(WT或突變)的輔助質體及編碼E3-E2-6K-E1(WT或突變)的輔助質體的VEEV TC83複製子質體進行共轉染。將3種質體(1μg的殼體、1μg的E3-E2-6K-E1及10μg含有目的基因的VEEV複製子)轉染至293T細胞(經由PEI方法)並將細胞培養4至7天。然後從上清液收集VRP，並經由Optiprep密度沉澱法純化。

經由西方墨點法使用抗VEEV抗體(ATCC)作為第一抗體(1：2000)及抗小鼠IgG(1：4000)作為第二抗體來確定純化的VRP。第12圖顯示使用下列質體所得到之VRP的結果：i)包括編碼在NLS(K64N)具有突變的VEEV CT83殼體蛋白之多核苷酸的質體，ii)包括編碼野生型VEEV CT83 E3-E2-6K-E1之多核苷酸的質體，及iii)包括編碼VEEV CT83 nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸，還有編碼GFP、IKK或JNK2的多核苷酸的質體。

[實施例5]

使用在實施例4中用下列載體而得到的VRP：i)包括編碼在NLS(K64N)具有突變的VEEV CT83殼體蛋白之多核苷酸的質體，ii)包括編碼野生型VEEV CT83 E3-E2-6K-E1之多核苷酸的質體，及iii)包括編碼VEEV CT83 nsp1、nsp2、nsp3及nsp4之多核苷酸，還有編碼IKK或JNK2之多核苷酸的質體。

用含有IKK或JNK2基因的VRP感染293T細胞。以與實施例2相同的方式進行VRP對293T細胞的感染。

經由西方墨點法確認在經VRP感染之293T細胞中之IKK的表現。使用IKK表現載體質體轉染的293T細胞作為正向對照組。用Rb抗IKK抗體(Proteintech)作為第一抗體(1：500)及HRP標記抗RbIgG作為第二抗體(1：4000)對細胞溶解產物進行西方墨點分析。

第13圖顯示其結果。在第13圖中，第1道顯示VRP感染的293T細胞。第2道顯示正向對照組，即，IKK表現載體質體轉染的細胞。如此圖所示，VRP感染的293T細胞表現IKK蛋白質。

經西方墨點法確認在感染的293T細胞中，從經插入JNK2基因的複製子表現了JNK2。使用無感染的293T細胞作為對照組。使用小鼠抗JNK2抗體(Santa Cruz)作為第一抗體(1：500)及HRP標記的抗小鼠IgG作為第二抗體(1：4000)。第14圖顯示其結果。經具有JNK2作為目的基因的VRP所感染的293T細胞，確認表現JNK2。

[實施例6]

在殼體NLS中突變的影響

使用在實施例4中用下列載體而得到的兩種類型的VRP：i-1)包括編碼VEEV CT83野生型殼體蛋白之多核苷酸的質體，或i-2)包括編碼在NLS(K64N)具有突變的VEEV CT83殼體蛋白之多核苷酸的質體，ii)包括編碼野生型VEEV CT83 E3-E2-6K-E1之多核苷酸的質體，及iii)包括編碼VEEV CT83 nsp1、nsp2、nsp3及nsp4之多核苷酸，還有編碼螢光素酶之多核苷酸的質體。

以與實施例2相同的方式進行VRP對293T細胞的感染。以與實施例2相同的方式進行螢光素酶檢測。第15圖顯示其結果。

在此圖中，對照組相應螢光素酶活性之背景值。殼體具有NLS突變的VRP顯示螢光素酶活性(900556)明顯高於WT殼體的VRP之螢光素酶活性(118063)。

該數據指明，相較於殼體無修飾的α病毒複製子顆粒，殼體之修飾導致較高產率及表現。

[實施例7]

使用在實施例4中用下列載體共轉染293T細胞而得到的VEE病毒複製子顆粒(VRP)：i)包括編碼在NLS(K64N)具有突變的VEEV CT83殼體蛋白之多核苷酸的質體，ii)包括編碼野生型VEEV CT83 E3-E2-6K-E1之多核苷酸的質體，及iii)包括編碼VEEV CT83 nsp1、nsp2、nsp3及nsp4之多核苷酸，及編碼GFP之多核苷酸的質體。

以與實施例2相同的方式進行如此得到的VRP對293T細胞的感染。對照組顯示無感染的正常細胞。確認細胞中之GFP表現。第16圖顯示其結果。

[實施例8]

使用與實施例7中所使用的相同VEEV複製子顆粒。用VRP感染巨噬細胞J774.A1細胞及骨髓衍生巨噬細胞(BMDM)細胞。在轉染的巨噬細胞中表現編碼GFP的目的基因。

用IL-4處理兩種細胞48小時後，進行極化並分析GFP表現。第17圖顯示其結果。

[實施例9]

CT26模型的體內效應研究

第18圖顯示此實施例的圖示規程。此實施例使用在實施例4中用下列質體而製備的VRP：i)包括編碼在NLS(K64N)具有突變的VEEV CT83殼體蛋白之多核苷酸的質體，ii)包括編碼野生型VEEV CT83 E3-E2-6K-E1之多核苷酸的質體，及iii)包括編碼VEEV CT83 nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸，及編碼人IκB激酶(IKK)之多核苷酸的質體。

本研究由4組組成，n=8，共32隻動物。接收動物並在腫瘤體積達到60至100mm³的第0天隨機分組，從第0天開始服藥：G1：載體，G2：抗Pd-1 mAb，G3：VRP及G4：10mg/kg的VRP及抗Pd-1 mAb的組合(BIWx 3及IP)。監測腫瘤生長直至治療開始後30天。

於第1、3、4組，在第0、第2、第4、第6、第8及第10天向小鼠腫瘤內注射50μl載體或分散於載體中的VRP。用0.3ml胰島素型注射器將VRP或載體注射到右側腫瘤內。目標是使用一個入口點，但經由進出移動針頭而徹底將材料分配到腫瘤中。

每星期進行2次腫瘤大小的測量。本研究的人道終點是腫瘤負荷3000mm³及/或體重減輕20%或更多。第19圖顯示各組中所有8隻動物的結果。

數據指明，包括編碼IKK的基因之VRP及VRP與抗PD-1抗體的組合證實抗腫瘤作用優於對照組及抗PD-1單一免疫療法。

[實施例10]

使用下列幾組載體，以與實施例4相同的方式製備嵌合α病毒複製子顆粒。

嵌合ARP 1

i)包括編碼野生型CHIKV 37997株殼體蛋白之多核苷酸的質體，ii)包括編碼野生型CHIKV 37997株E3-E2-6K-E1之多核苷酸的質體，及iii)包括編碼VEEV CT83 nsp1、nsp2、nsp3及nsp4之多核苷酸，及編碼GFP之多核苷酸的質體。

嵌合ARP 2

i)包括編碼野生型CHIKV OPY-1株殼體蛋白之多核苷酸的質體，ii)包括編碼野生型CHIKV OPY-1株E3-E2-6K-E1之多核苷酸的質體，及iii)包括編碼VEEV CT83 nsp1、nsp2、nsp3及nsp4之多核苷酸，及編碼GFP之多核苷酸的質體。

如實施例1的方式純化所得到的ARP。使用抗CHIKV兔血清(1：2000)作為第一抗體及羊抗兔IgG-HRP(1：4000)為第二抗體，經由西方墨點法確認經純化的嵌合ARP。第20圖顯示其結果。確認兩種嵌合ARP的生成。

用編碼GFP的嵌合ARP感染293T細胞。感染後，將細胞培養48小時，並經由FACS檢測GFP的表現。使用無感染細胞作為對照組。第21圖顯示其結果。5.21%及4.07%經感染ARP的細胞表現GFP，表明在細胞中嵌合ARP成功地表現GFP蛋白(目的基因是編碼GFP的核苷酸)。

<110> 美商VLP醫療股份有限公司

<120> α病毒複製子顆粒

<130> 578576

<150> US62/608,213

<151> 2017-12-20

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 275

<212> PRT

<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒

<400> 1

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒

<400> 2

<210> 3

<211> 980

<212> PRT

<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 981

<212> PRT

<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒

<400> 4

<210> 5

<211> 11542

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包括螢光素酶基因核苷酸的基因組RNA表現載體

<400> 5

<210> 6

<211> 11596

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包括具多選殖位點螢光素酶基因的基因組RNA表現載體

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV_gblock2_fwd引子

<400> 7

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEv_gblock2_rev引子

<400> 8

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV_Oligo1_fwd引子

<400> 9

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV_Oligo2_rev引子

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 11

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 12

Claims

一種α病毒複製子顆粒(ARP)，係包括(i)包括殼體及/或外膜的α病毒結構蛋白，及(ii)包括編碼α病毒非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及至少一個目的基因的α病毒複製子，其中至少殼體、外膜中的E3及E2中之一者係包括一個或多個胺基酸的改變，但外膜中的E1不包含胺基酸的改變。
如申請專利範圍第1項所述之α病毒複製子顆粒，其中α病毒結構蛋白包括在α病毒殼體蛋白核定位訊號(NLS)中的一種或多種改變。
如申請專利範圍第2項所述之α病毒複製子顆粒，其中α病毒殼體蛋白核定位訊號中的一個或多個離胺酸或精胺酸係經天冬醯胺酸或丙胺酸取代。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之α病毒複製子顆粒，其中α病毒結構蛋白包括在α病毒E2蛋白中的一種或多種改變。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之α病毒複製子顆粒，其中α病毒結構蛋白包括在α病毒E3蛋白的弗林蛋白酶(furin)位點的一種或多種改變。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之α病毒複製子顆粒，其中α病毒是CHIKV或VEEV。
如申請專利範圍第6項所述之α病毒複製子顆粒，其中CHIKV是CHIKV 37997株或OPY-1株。
如申請專利範圍第6項所述之α病毒複製子顆粒，其中VEEV是VEEV TC-83株。
如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之α病毒複製子顆粒，其中目的基因係編碼抗原。
一種製備α病毒複製子顆粒的方法，包括以下步驟：將細胞與下列者共轉染：i)包括編碼α病毒非結構蛋白nsp1、nsp2、hsp3及nsp4的多核苷酸，及至少一個目的基因的載體，ii)包括編碼α病毒殼體蛋白之多核苷酸的載體，及iii)包括編碼α病毒E3-E2-6K-E1之多核苷酸的載體，其中至少殼體、E3及E2中之一者係包括一個或多個胺基酸的改變，但E1不包括胺基酸的改變，培養經轉染的細胞，及從細胞培養物純化ARP。
如申請專利範圍第10項所述之方法，其中α病毒結構蛋白包括在α病毒殼體蛋白核定位訊號(NLS)中的一種或多種改變。
如申請專利範圍第11項所述之方法，其中α病毒殼體蛋白核定位訊號中的一個或多個離胺酸或精胺酸係經天冬醯胺酸或丙胺酸取代。
如申請專利範圍第10項至第12項中任一項所述之方法，其中α病毒結構蛋白包括在α病毒E2蛋白中的一種或多種改變。
如申請專利範圍第13項所述之方法，其中α病毒結構蛋白包括在α病毒E3蛋白的弗林蛋白酶位點的一種或多種改變。
如申請專利範圍第10項至第14項中任一項所述之方法，其中α病毒是CHIKV或VEEV。
如申請專利範圍第15項所述之方法，其中CHIKV是CHIKV 37997株或OPY-1株。
如申請專利範圍第15項所述之方法，其中VEEV是VEEV TC-83株。
如申請專利範圍第10項至第17項中任一項所述之方法，其中目的基因係編碼抗原。
一種α病毒複製子顆粒(ARP)，係包括(i)包括殼體及/或外膜的CHIKV結構蛋白，及(ii)包括編碼VEEV非結構蛋白nsp1、nsp2、nsp3及nsp4的多核苷酸及至少一個目的基因的VEEV複製子。
如申請專利範圍第19項所述之α病毒複製子顆粒，其中CHIKV是CHIKV 37997株或OPY-1株，及VEEV是VEEV TC-83株。