TW201930342A - 包含nkg2d結構域的多特異性嵌合受體及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本申請提供靶向NKG2D的嵌合受體，和包含NKG2D結構域與和第二抗原結合結構域例如IL-3結構域的多特異性嵌合受體。還提供了雙嵌合受體系統，其包含包含NKG2D結構域的第一嵌合受體和包含第二抗原結合結構域例如IL-3結構域的第二嵌合受體。還提供了工程化免疫效應細胞（例如T細胞）、醫藥組合物、套組和治療癌症的方法。

Description

包含NKG2D結構域的多特異性嵌合受體及其使用方法

[相關申請的交叉引用]

本申請要求2017年12月28日提交的國際專利申請號PCT/CN2017/119397的優先權，其內容通過引用以其全文併入本文。

[ASCII文本文件形式的序列表提交]

以下以ASCII文本文件提交的內容通過引用以其全文併入本文：計算機可讀形式（CRF）的序列表（文件名：761422000941SEQLISTING.txt，記錄日期：2018年12月28日，大小：85KB）。

本發明涉及嵌合受體、多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統、工程化免疫效應細胞，及其使用方法。

急性髓性白血病（AML）由支配骨髓和血液的骨髓前體細胞異常克隆增生表徵，其嚴重損害正常造血。AML是最常見的急性白血病類型，在西方世界約占所有成年發作白血病的25%。發病率為每年每100,000個成年人3-5個，AML在所有白血病中具有最高的死亡率（DiNardo和Cortes 2016）。在過去的40年中，AML患者的五年相對總體存活率從1975年至1980年的很差的6.3%略增加到2007至2012年的23.9%（Mardiros等，2015）。

AML的標準的一線治療方法是化學療法，其使用阿糖胞苷與蒽環類藥物的組合作為誘導治療，隨後對在誘導治療後實現完全緩解（CR）的患者進行重複週期的高劑量阿糖胞苷和/或異體幹細胞移植（alloSCT）。雖然可以在大約70%的年輕患者中通過目前的誘導化學療法實現初始CR，但是43%的患者會最終復發，並且18%使用一線誘導治療從來不會達到CR（Forman和Rowe 2013）。AlloSCT是第二次緩解之後的較佳治療方法。接受alloSCT的患者中五年無疾病生存率是40-50%，這證實了AML對基於免疫的療法的易感性。但是，患有原發性難治性疾病或具有持續低於6個月的初始CR的患者從alloSCT治療收效甚微（Mardiros等，2015）。另外，習用補救性化學療法對患者器官的細胞毒性損傷進一步降低了alloSCT的成功機會。因此，復發或誘導失敗後AML患者需要更有效並且毒性更低的治療方法。

T細胞具有攻擊和消滅腫瘤（特別是具有能夠產生新型抗原的突變負載的那些腫瘤）的潛力。但是，T細胞的抗腫瘤能力經常被免疫抑制性腫瘤微環境（TME）積極地抑制（McGranahan 等，2016）。嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）是通過轉導編碼融合蛋白的基因而構建的，該融合蛋白包含T細胞受體（TCR）的針對腫瘤細胞上的抗原的胞外抗原結合結構域、鉸鏈區和胞內信號傳導結構域，以在抗原結合後誘導T細胞活化。不同于依賴于天然TCR用於腫瘤抗原識別的傳統T細胞，CAR-T細胞被重新定向至未經處理的抗原，從而獨立於其主要組織相容性複合體（MHC）抗原表現而殺死腫瘤細胞。因此，CAR-T細胞具有克服免疫療法的許多固有缺陷的能力。二十年的臨床前研究和臨床試驗後，已經證實了基於CAR-T的療法的安全性和可行性，並且在惡性血液病中獲得史無前例的臨床結果（Kochenderfer等，2015; Louis等，2011）。

本文提及的所有公開、專利、專利申請和公佈的專利申請的公開內容通過引用以其整體併入本文。

本申請提供了靶向NKG2D配位體和第二抗原的多特異性嵌合受體和雙重嵌合受體系統，所述第二抗原例如腫瘤抗原，例如CD123。還提供了靶向NKG2D配位體的嵌合受體。

本申請的一方面提供一種嵌合受體，其包含：(a) 包含NKG2D結構域的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，胞外結構域包含第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域。

本申請的一方面提供一種多特異性嵌合受體，其包含(a) 包含NKG2D結構域和第二抗原結合結構域的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。

本申請的一方面提供一種多特異性嵌合受體，其包含多肽鏈，所述多肽鏈包含：(a) 包含第一NKG2D結構域、第二NKG2D結構域和第二抗原結合結構域的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，胞外結構域從N-末端至C-末端包含：第二抗原結合結構域、第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域經由肽連接子融合至第一NKG2D結構域。在一些實施例中，肽連接子的長度不多於約50個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子包含選自SEQ ID NO: 12-15的胺基酸序列。

本申請的一方面提供一種多特異性嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每個多肽鏈包含：(a) 包含第一NKG2D結構域和第二抗原結合結構域的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，每個胞外結構域還包含二聚化基序。在一些實施例中，二聚化基序放置在NKG2D結構域和第二抗原結合結構域之間。在一些實施例中，二聚化基序是白胺酸拉鍊或半胱胺酸拉鍊。在一些實施例中，第二抗原結合結構域經由肽連接子融合至NKG2D結構域。在一些實施例中，肽連接子的長度不多於約50個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子包含選自SEQ ID NO: 12-15的胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽的NKG2D結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈中的每個從N-末端至C-末端包含：第二抗原結合結構域、NKG2D結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域。

在根據上文所述的多特異性嵌合受體的任一個的一些實施例中，多特異性嵌合受體是雙特異性嵌合受體。

在根據上文所述的多特異性嵌合受體的任一個的一些實施例中，第二抗原結合結構域是抗體片段。在一些實施例中，抗體片段特異性特異性結合于選自由以下組成的組的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是配位體或配位體結合結構域。在一些實施例中，配位體或配位體結合結構域來源於選自由以下組成的組的分子：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是IL-3結構域。在一些實施例中，IL-3結構域包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或其變異體，該變異體與SEQ ID NO: 9的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性。

在根據上文所述的嵌合受體或多特異性嵌合受體的任一個的一些實施例中，NKG2D結構域、或第一NKG2D結構域和/或第二NKG2D結構域包含SEQ ID NO: 7或8的胺基酸序列或其變異體，該變異體與SEQ ID NO: 7或8的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性。

在根據上文所述的嵌合受體或多特異性嵌合受體的任一個的一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由以下組成的組的分子：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些實施例中，跨膜結構域包含SEQ ID NO: 4或45的胺基酸序列。

在根據上文所述的嵌合受體或多特異性嵌合受體的任一個的一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列。

在根據上文所述的嵌合受體或多特異性嵌合受體的任一個的一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由以下組成的組的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域包含CD28的胞質結構域和/或4-1BB的胞質結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。

在根據上文所述的嵌合受體或多特異性嵌合受體的任一個的一些實施例中，嵌合受體或多特異性嵌合受體還包含位於胞外結構域的C-末端和跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區來源於CD8α。在一些實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。

在一些實施例中，提供了一種或多種分離的核酸，其包含編碼上文所述的嵌合受體或多特異性嵌合受體的任一個中的一個或多個多肽鏈的核酸序列。

本申請的一方面提供了一種雙嵌合受體系統，其包含：(i)第一嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每個多肽鏈包含：(a) 包含NKG2D結構域的第一胞外結構域；(b) 第一跨膜結構域；和(c) 第一胞內信號傳導結構域；和(ii) 第二嵌合受體，其包含第三多肽鏈，所述第三多肽鏈包含：(a) 包含第二抗原結合結構域的第二胞外結構域；和(b) 第二跨膜結構域。在一些實施例中，第二嵌合受體還包含第二胞內信號傳導結構域。

本申請的一方面提供了一種雙嵌合受體系統，其包含：(i)第一嵌合受體，其包含第一多肽鏈，所述第一多肽鏈包含：(a) 包含NKG2D結構域和第二KKG2D結構域的第一胞外結構域；(b) 第一跨膜結構域；和(c) 第一胞內信號傳導結構域；和(ii) 第二嵌合受體，其包含第二多肽鏈，所述第二多肽鏈包含：(a) 包含第二抗原結合結構域的第二胞外結構域；和(b) 第二跨膜結構域。在一些實施例中，第二嵌合受體還包含第二胞內信號傳導結構域。

在根據上文所述的雙嵌合受體系統中任一個的一些實施例中，第二抗原結合結構域是抗體片段。在一些實施例中，抗體片段特異性結合選自由以下組成的組的抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是配位體或配位體結合結構域。在一些實施例中，配位體或配位體結合結構域來源於選自由以下組成的組的分子：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是IL-3結構域。在一些實施例中，IL-3結構域包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或其變異體，該變異體與SEQ ID NO: 9的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性。

在根據上文所述的雙嵌合受體系統中任一個的一些實施例中，NKG2D結構域或第一NKG2D結構域和/或第二NKG2D結構域包含SEQ ID NO: 7或8的胺基酸序列或其變異體，該變異體與SEQ ID NO: 7或8的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性。

在根據上文所述的雙嵌合受體系統中任一個的一些實施例中，第一和/或第二跨膜結構域來源於選自由以下組成的組的分子：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些實施例中，第一和/或第二跨膜結構域包含SEQ ID NO: 4或45的胺基酸序列。

在根據上文所述的雙嵌合受體系統中任一個的一些實施例中，第一和/或第二胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列。

在根據上文所述的雙嵌合受體系統中任一個的一些實施例中，第一和/或第二胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由以下組成的組的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域包含CD28的胞質結構域和/或4-1BB的胞質結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。

在根據上文所述的雙嵌合受體系統中任一個的一些實施例中，第一和.或第二嵌合受體還包含位於胞外結構域的C-末端和跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區來源於CD8α。在一些實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。

在一些實施例中，提供了一種或多種分離的核酸，其包含編碼上文所述的雙嵌合受體系統的任一個中的一個或多個多肽鏈的核酸序列。在一些實施例中，提供了一種分離的核酸，其包含編碼第一嵌合受體的第一核酸序列和編碼第二嵌合受體的第二核酸序列，其中第一核酸序列經由編碼自切割肽的第三核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。在一些實施例中，自切割肽是T2A、P2A或F2A肽。

在一些實施例中，提供了一種嵌合受體，其包含選自由SEQ ID NO: 16-20和SEQ ID NO: 33-35組成的組的胺基酸序列或其變異體，該變異體與選自由SEQ ID NO: 16-20和SEQ ID NO: 33-35組成的組的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，提供了一種雙嵌合受體系統，其包含：第一嵌合受體，該第一嵌合受體包含SEQ ID NO: 34的胺基酸序列或其變異體，該變異體與SEQ ID NO: 34的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性；和第二嵌合受體，該第二嵌合受體包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列或其變異體，該變異體與SEQ ID NO: 41的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，提供了一種雙嵌合受體系統，其包含：第一嵌合受體，該第一嵌合受體包含SEQ ID NO: 35的胺基酸序列或其變異體，該變異體與SEQ ID NO: 35的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性；和第二嵌合受體，該第二嵌合受體包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列或其變異體，該變異體與SEQ ID NO: 42的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，提供了一種多肽，其包含SEQ ID NO: 36或37的胺基酸序列或其變異體，該變異體與SEQ ID NO: 36或37的胺基酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，提供了一種分離的核酸，其包含選自由SEQ ID NO: 21-27和38-40組成的組的核酸序列或其變異體，該變異體與選自由SEQ ID NO: 21-27和38-40組成的組的核酸序列具有至少約85%（例如至少約90%、92%、95%、98%或99%）序列同一性。

在一些實施例中，提供了一種或多種載體，其編碼上文所述的任意一種或多種分離的核酸。在一些實施例中，載體是慢病毒載體。

本申請的另一方面提供了一種工程化免疫效應細胞，其包含上文所述的嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統、分離的核酸或載體中的任一種。在一些實施例中，免疫效應細胞是T細胞、NK細胞、外周血單核細胞（PBMC）、造血幹細胞、多能幹細胞或胚胎幹細胞。在一些實施例中，免疫效應細胞是T細胞。

在一些實施例中，提供了一種醫藥組合物，其包含上文所述的任一種工程化免疫效應細胞和醫藥上可接受的載劑。

本申請的另一方面提供了一種治療個體中癌症的方法，包括向該個體施用有效量的上文所述的任一種醫藥組合物。在一些實施例中，癌症是多發性骨髓瘤、急性成淋巴細胞性白血病或慢性淋巴細胞性白血病。

還提供了使用方法、套組和製品，其包含嵌合受體、多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統、工程化免疫效應細胞、分離的核酸或載體中的任一種。

本申請提供了的多特異性（例如雙特異性）嵌合受體和雙嵌合受體系統，其靶向NKG2D配位體和第二抗原例如CD123（例如IL-3結構域）。在一些實施例中，不像基於抗體的CAR一樣，本文所述的嵌合受體和雙嵌合受體系統利用配位體和T細胞上的它們的同源受體之間的高親和力和特異性。NKG2D配位體僅在應激細胞特別是腫瘤細胞上表現。表現NKG2D嵌合受體和雙嵌合受體系統的工程化免疫細胞具有增強的抗腫瘤能力，並且為抗癌治療提供有用的治療劑。

因此，本申請的一方面提供了一種多特異性嵌合受體，其包含：包含NKG2D結構域和第二抗原結合結構域（例如靶向CD123的結合結構域）的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種多特異性嵌合受體，其包含多肽鏈，所述多肽鏈包含：(a) 包含第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）、第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種多特異性嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每個多肽鏈包含：(a) 包含NKG2D結構域和第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，胞外結構域還包含二聚化基序，例如白胺酸拉鍊。

在另一方面，提供了一種雙嵌合受體系統，其包含：(i)第一嵌合受體，其包含(a)包含NKG2D結構域的第一胞外結構域；(b) 第一跨膜結構域；和(c) 第一胞內信號傳導結構域；和(ii) 第二嵌合受體，其包含 (a) 包含第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）的第二胞外結構域； (b) 第二跨膜結構域；和任選的(c) 第二胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一嵌合受體包含單一多肽鏈，其中第一胞外結構域包含第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域。在一些實施例中，第一嵌合受體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 包含NKG2D結構域的第一胞外結構域；(b)第一跨膜結構域；和(c)第一胞內信號傳導結構域。

本文還描述了包含嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統的工程化免疫效應細胞（例如T細胞）、使用該工程化免疫效應細胞治療癌症的套組、製品和方法。

I.定義

本文使用的“嵌合受體”是指遺傳工程化的受體，其可用於將一種或多種通過抗原-抗體相互作用或配位體-受體結合的特異性多肽相互作用移植到免疫效應細胞例如T細胞上。一些嵌合受體也被稱為“嵌合抗原受體”、“人工T細胞受體”、“嵌合T細胞受體”或“嵌合免疫受體”。在一些實施例中，嵌合受體包含對一種或多種抗原（例如腫瘤抗原）具有特異性的胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和T細胞和/或其它受體的胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，胞外抗原結合結構域包含來源於配位體或受體的胞外結構域的至少一個結構域，其中配位體或受體是細胞表面抗原，例如腫瘤抗原。

“NKG2D嵌合受體”是指具有胞外結構域的嵌合受體，該胞外結構域包含對NKG2D配位體具有特異性的一個或多個結合結構域（例如NKG2D結構域）。“NKG2D × IL-3嵌合受體”是指具有胞外結構域的嵌合受體，該胞外結構域包含對NKG2D配位體具有特異性的結合結構域（例如NKG2D結構域）和對CD123具有特異性的結合結構域（例如IL-3結構域）。

本文使用的“NKG2D結構域”是指NKG2D的胞外結構域中的功能片段，其可以在NKG2D結構域二聚化後特異性地結合一個或多個NKG2D配位體。示例性的人NKG2D配位體包括但不限於MICA、MICB和ULBP分子。

本文使用的“IL-3結構域”是指IL-3的功能片段（包括全長IL-3），其可以特異性地結合CD123，例如IL-3R複合物和/或IL-3RA亞基。

本文使用的術語“靶向”、“特異性地結合”、“特異性地識別”或“對……具有特異性”是指可量測的並且可重複的相互作用，例如在標靶和抗原結合蛋白（例如抗原結合結構域、配位體或嵌合受體）之間的結合，其用於決定在包括生物分子在內的異質分子群體的存在下存在標靶。例如，特異性結合標靶的抗原結合蛋白是與其結合其它標靶相比，以更大的親和力、親合力、更容易地和/或以更長持續時間結合該標靶的抗原結合蛋白。在一些實施例中，抗原結合蛋白與不相關標靶的結合程度小於該抗原結合蛋白與該標靶的結合的約10%，例如通過放射免疫測定（RIA）量測的。在一些實施例中，特異性結合標靶的抗原結合蛋白的解離常數（Kd）≦1 μM、≦100 nM、≦10 nM、≦1 nM或≦0.1 nM。在一些實施例中，抗原結合蛋白特異性地結合在來自不同物種的蛋白質之間保守的蛋白質上的抗原決定基。在一些實施例中，特異性結合可以包括但不需要專一結合。

術語“特異性”是指抗原結合蛋白（例如抗原結合結構域、配位體或嵌合受體）對於抗原的特定抗原決定基的選擇性識別。本文使用的術語“多特異性”是指抗原結合蛋白（例如嵌合受體）具有兩個或更多個抗原結合位點，此等抗原結合位點中的至少兩個結合不同的抗原。本文使用的“雙特異性”是指具有兩種不同抗原結合特異性的抗原結合蛋白（例如嵌合受體）。

“結合親和力”通常是指分子（例如抗原結合結構域、配位體和嵌合受體）的單一結合位點與其結合配偶體（例如抗原）之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另有說明，如本文所使用的，“結合親和力”是指反應一個結合對的成員（例如抗原結合結構域和抗原）之間的1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對於其配偶體Y的親和力通常可以通過解離常數（Kd）來表示。親和力可以通過本領域已知的常用方法來量測，包括本文所述的那些方法。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原，並且傾向于容易解離，而高親和力抗體通常更快地結合抗原，並且傾向於保持更長時間的結合。量測結合親和力的多種方法是本領域已知的，其中的任一種方法可以為了本申請的目的而使用。

術語“抗體”包括單克隆抗體（包括全長4鏈抗體或具有免疫球蛋白Fc區的全長僅重鏈抗體）、具有多抗原決定基特異性的抗體組合物、多特異性抗體（例如雙特異性抗體、雙抗體和單鏈分子）以及抗體片段（例如Fab、F(ab′)₂ 和Fv）。本文考慮的抗體包括單結構域抗體例如僅重鏈抗體。

“抗體片段”包含完整抗體的一部分，較佳完整抗體的抗原結合區和/或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂ 和Fv片段；雙抗體、線性抗體（參見美國專利號5,641,870，實例2；Zapata等,Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；單鏈抗體分子；單結構域抗體（例如V_H H）和從抗體片段形成的多特異性抗體。

“單鏈Fv”也縮寫成“sFv”或“scFv”，是包含被連接成單一多肽鏈的V_H 和V_L 抗體結構域的抗體片段。較佳地，sFv多肽還包含在V_H 和V_L 結構域之間的多肽連接子，其使得sFv能夠形成抗原結合所需的結構。關於sFv的綜述，參見Pluckthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, 編輯Rosenburg和Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)。

關於肽的“百分比（%）胺基酸序列同一性”和“同源性”，多肽或抗體序列被定義為比對序列並且如果需要的話引入空位後以實現最大百分比序列同一性並且不將任何保守性取代考慮為序列同一性的一部分後，與特定肽或多肽序列中的胺基酸殘基相同的候選序列中的胺基酸殘基的百分比。為了確定百分比胺基酸序列同一性的目的的比對可以通過熟習此項技術者已知的多種方式實現，例如使用公共可得的計算機軟體例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN™ (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可以確定合適的用於量測比對的參數，包括在正在被比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何算法。

編碼本文所述的嵌合受體或雙嵌合受體系統的“分離的”核酸分子是從至少一種污染核酸分子中鑒定並分離的核酸分子，所述核酸分子通常與其產生的環境相關聯。較佳地，分離的核酸不與與產生環境相關的所有成分相關聯。編碼本文的多肽和抗體的分離的核酸分子為除了其天然存在的形式或佈置之外的形式。因此，分離的核酸分子與細胞中天然存在的編碼本文的多肽和抗體的核酸不同。

術語“控制序列”是指在特定宿主生物體中表現可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適用於原核細胞的控制序列，例如包括啟動子、任選的操縱子序列、和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺苷酸化信號和強化子。

當被置於與另一個核酸序列的功能性關係中時，核酸被“可操作地連接”。例如，如果其被表現為參與多肽分泌的前蛋白，用於前序列或分泌型前導序列的DNA被可操作地連接至用於多肽的DNA；如果其影響序列的轉錄，啟動子或強化子被可操作地連接至編碼序列；或者如果其位置使得有利於翻譯，核糖體結合位點被可操作地連接至編碼序列。一般地，“可操作地連接”意指被連接的DNA序列是連續的，並且在分泌型前導序列的情況下，是連續的並且在閱讀相中。但是，強化子不必須是連續的。通過在方便的限制性位點連接來完成連接。如果不存在這樣的位點，那麼根據習用實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或連接子。

本文使用的術語“載體”是指能夠傳播與其連接的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製的核酸結構的載體，以及被整合到已經導入了該載體的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這樣的載體在本文中被稱為“表現載體”。

本文使用的術語“自體同源的”意指來源於同一個個體的任何材料，並且該材料隨後被再次引入該個體。

“同種異體的”是指來源於相同物種的不同個體的移植物。

本文使用的術語“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”是指外源核酸被轉移或引入到宿主細胞中的方法。“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”細胞是已經用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。該細胞包括初級受試者細胞及其子代。

本文使用的表述“細胞”、“細胞株”、“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類命名包括子代。因此，詞語“轉染子”和“轉染的細胞”包括初級受試者細胞和從其來源的培養物，而不考慮轉移的數目。還應理解，所有子代的DNA內容可能由於故意的或無意中產生的突變而不完全相同。包括具有與在最初轉化的細胞中篩選的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的多種子代。

本文使用的“治療（treatment或treating）”是用於獲得包括臨床結果在內的有益或所需結果的方法。為了本發明的目的，有益或所需臨床結果包括但不限於以下中的一種或多種：緩解一種或多種由疾病導致的症狀、減輕疾病程度、穩定疾病（流入預防或延遲疾病惡化）、預防或延遲疾病擴散（例如轉移）、預防或延遲疾病復發、延遲或減慢疾病進展、改善疾病狀況、提供疾病緩解（部分或總體）、降低治療疾病所需的一種或多種其它藥物的劑量、延遲疾病進展、增加生活質量和/或延長生存。“治療”還涵蓋減輕癌症的病理後果。本申請的方法考慮此等治療方面的任意一種或多種。

本文使用的“個體”或“受試者”是指哺乳動物，包括但不限於人、牛、馬、貓科動物、犬科動物、囓齒動物或靈長類動物。在一些實施例中，個體是人。

本文使用的術語“有效量”是指足以治療指定紊亂、病症或疾病（例如緩解、減輕、減少和/或延遲其一種或多種症狀）的藥劑（例如工程化免疫效應細胞或其醫藥組合物）的量。關於癌症，有效量包括足以導致腫瘤收縮和/或降低腫瘤生長速率（例如抑制腫瘤生長）或者預防或延遲其它不想要的細胞增生的量。在一些實施例中，有效量是足以延遲發展的量。在一些實施例中，有效量是足以預防或延遲復發的量。有效量可以以一次或多次施用而被施用。有效量的藥物或組合物可以：(i) 減少癌細胞的數目；(ii) 減小腫瘤尺寸；(iii)抑制、延遲、在一定程度上減慢並且較佳終止癌細胞滲入外周器官中；(iv) 抑制（即在一定程度上減慢並且較佳終止）腫瘤轉移；(v) 抑制腫瘤生長；(vi) 預防或延遲腫瘤的發生和/復發；和/或(vii) 在一定程度上減輕與癌症相關的一種或多種症狀。

本文使用的“延遲”癌症發展意指推遲、阻礙、減慢、阻止、穩定和/或延緩疾病發展。該延遲可以具有可變的時間長度，這取決於病史和/或被治療的個體。對於熟習此項技術者明顯的是，實際上充分或顯著的延遲可以涵蓋預防，因為個體不會患上該疾病。“延遲”癌症發展的方法是當與未使用該方法相比降低在給定時間範圍內疾病發展的可能性的方法。這樣的比較通常以臨床研究為基礎，使用統計學顯著數目的個體。癌症發展可以是使用標準方法可以檢測的，包括但不限於計算機軸位體層攝影術（CAT掃描）、磁共振成像（MRI）、腹部超聲波、凝血實驗、動脈造影術或活組織檢查。發展還可以指最初不能檢測到的癌症進展並且包括發生、復發和發作。

應理解的是，本文所述的本申請的實施例包括由實施例組成和/或基本上由實施例組成。

本文中提及“約”一個數值或參數包括（並且描述）針對該數值或參數本身的變化。例如，提及“約X”的描述包括“X”的描述。

如本文使用的，提及“不是”一個數值或參數通常意指並且描述“除了”一個數值或參數“之外”。例如，該方法不用於治療X型癌症意指該方法用於治療除了X之外類型的癌症。

本文使用的術語“約X-Y”與“約X至約Y”具有相同含義。

如本文使用的並且在所附申請專利範圍中，除非上下文清楚地另有說明，否則單數形式“一”、“一個”和“該”包括複數提及。

II. 多特異性嵌合受體和雙嵌合受體系統

本申請提供靶向NKG2D配位體的嵌合受體和嵌合受體系統。本申請的一方面提供一種多特異性嵌合受體，其包含含有NKG2D結構域和第二抗原結合結構域（諸如CD123結合結構域例如IL-3結構域）的胞外結構域。

在一些實施例中，提供了一種嵌合受體，其包含：(a) 包含NKG2D結構域的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3　。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，嵌合受體還包含位於胞外結構域的C-末端和跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，嵌合受體從N-末端到C-末端包含：第一NKG2D結構域、肽連接子、第二NKG2D結構域、跨膜結構域（CD8α）、來源於4-1BB的共刺激結構域和來源於CD3ζ的初級信號傳導結構域。在一些實施例中，NKG2D結構域包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列。

在一些實施例中，提供了一種嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 包含NKG2D結構域和二聚化基序（例如白胺酸拉鍊或半胱胺酸拉鍊）的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽鏈的NKG2D結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於第一胞外結構域的C-末端和第一跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於每條多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。

在一些實施例中，提供了一種嵌合受體，其包含：(a) 包含第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，嵌合受體還包含位於胞外結構域的C-末端和跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，嵌合受體從N-末端至C-末端包含：第一NKG2D結構域、肽連接子、第二NKG2D結構域、跨膜結構域（CD8α）、來源於4-1BB的共刺激結構域和來源於CD3ζ的初級信號傳導結構域。在一些實施例中，NKG2D結構域包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種嵌合受體，其包含與SEQ ID NO: 33的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種分離的核酸序列，其包含與SEQ ID NO: 38的核酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的核酸序列。

在一些實施例中，提供了一種多特異性（例如雙特異性）嵌合受體，其包含：(a) 包含NKG2D結構域和第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域特異性地結合選自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77組成的組的抗原。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是來源於選自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80組成的組的分子的配位體或配位體結合結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，多特異性嵌合受體還包含位於胞外結構域的C-末端和跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。

嵌合受體（例如多特異性嵌合受體）可以包含一條或多條多肽鏈。在一些實施例中，嵌合受體是單體的。在一些實施例中，單體嵌合受體包含含有第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域的胞外結構域。在一些實施例中，胞外結構域從N-末端至C-末端包含：第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）、第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域。在一些實施例中，胞外結構域從N-末端至C-末端包含：第一NKG2D結構域、第二NKG2D結構域和第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）。在一些實施例中，第一NKG2D結構域交聯至第二NKG2D結構域。在一些實施例中，第一NKG2D結構域包含在N-末端的第一工程化殘基，且第二NKG2D結構域包含在C-末端的第二工程化殘基，其中第一工程化殘基例如經由二硫鍵或鹽橋與第二工程化殘基結合（associate）。在一些實施例中，第二抗原結合結構域經由肽連接子融合至第一NKG2D結構域，肽連接子例如長度不大於約50個胺基酸的肽連接子，例如包含選自SEQ ID NO: 12-15的胺基酸序列的肽連接子。

在一些實施例中，嵌合受體（例如多特異性嵌合受體）是二聚體的，例如同型二聚體的或異二聚體的。在一些實施例中，二聚的嵌合受體包含兩條多肽鏈，每條包含單一NKG2D結構域。在一些實施例中，二聚的嵌合受體包含兩條相同的多肽鏈。在一些實施例中，二聚的嵌合受體包含兩條不同的多肽鏈。在一些實施例中，每條多肽鏈從N-末端至C-末端包含：第二抗原結合結構域、NKG2D結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，每條多肽鏈從N-末端至C-末端包含：NKG2D結構域、第二抗原結合結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，二聚的嵌合受體的每條多肽鏈的NKG2D結構域彼此非共價結合以形成二聚體。在一些實施例中，二聚的嵌合受體的每條多肽鏈的NKG2D結構域例如在胞外結構域中通過二硫鍵和/或經由二聚化基序（例如白胺酸拉鍊或半胱胺酸拉鍊）彼此非共價結合以形成二聚體。在一些實施例中，第二抗原結合結構域經由肽連接子融合至NKG2D結構域，肽連接子例如長度不大於約50個胺基酸的肽連接子，例如包含選自SEQ ID NO: 12-15的胺基酸序列的肽連接子。在一些實施例中，第二抗原結合結構域經由二聚化基序（例如白胺酸拉鍊或半胱胺酸拉鍊）融合至NKG2D結構域。

因此，在一些實施例中，提供了一種多特異性性（例如雙特異性）嵌合受體，其包含一條多肽鏈，該多肽鏈包含：(a) 胞外結構域，其包含第一NKG2D結構域、第二NKG2D結構域和第二抗原結合結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域特異性結合選自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77組成的組的抗原。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是來源於選自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80組成的組的分子的配位體或配位體結合結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域經由肽連接子融合至第一NKG2D結構域或第二NKG2D結構域，肽連接子例如長度不大於約50個胺基酸的肽連接子，例如包含選自SEQ ID NO: 12-15的胺基酸序列的肽連接子。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，多特異性嵌合受體還包含位於胞外結構域的C-末端和跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，多特異性嵌合受體還包含位於多肽的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，多肽鏈從N-末端至C-末端包含：第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）、第一肽連接子、第一NKG2D結構域、第二肽連接子、第二NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種多特異性（例如雙特異性）嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 胞外結構域，其包含NKG2D結構域和第二抗原結合結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽鏈的NKG2D結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域特異性結合選自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77組成的組的抗原。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是來源於選自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80組成的組的分子的配位體或配位體結合結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域經由肽連接子融合至NKG2D結構域，肽連接子例如長度不大於約50個胺基酸的肽連接子，例如包含選自SEQ ID NO: 12-15的胺基酸序列的肽連接子。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於第一胞外結構域的C-末端和第一跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於每條多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈各自從N-末端至C-末端包含：第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）、肽連接子、NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種多特異性（例如雙特異性）嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 胞外結構域，其包含NKG2D結構域、二聚化基序（例如白胺酸拉鍊或半胱胺酸拉鍊）和第二抗原結合結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽鏈的NKG2D結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域特異性結合選自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77組成的組的抗原。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是來源於選自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80組成的組的分子的配位體或配位體結合結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於第一胞外結構域的C-末端和第一跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於每條多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽各自從N-末端至C-末端包含：第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）、白胺酸拉鍊、NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，第二抗原結合結構域特異性結合細胞表面抗原，例如腫瘤抗原。示例性的腫瘤抗原包括但不限於CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是抗體片段，例如單鏈抗體（例如scFv）或單結構域抗體（例如V_H H）。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是特異性結合CD123（例如IL-3R或IL-3RA亞基）的抗體片段（例如scFv或V_H H）。

在一些實施例中，第二抗原結合結構域是配位體。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是配位體結合結構域，例如受體的胞外結構域。示例性的配位體和受體包括但不限於NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是IL-3結構域。

因此，在一些實施例中，提供了一種多特異性（例如雙特異性）嵌合受體，其包含一條多肽鏈，該多肽鏈包含：(a) 胞外結構域，其包含第一NKG2D結構域、第二NKG2D結構域和CD123結合結構域（例如IL-3結構域）；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，CD123結合結構域經由肽連接子融合至第一NKG2D結構域或第二NKG2D結構域，肽連接子例如長度不大於約50個胺基酸的肽連接子，例如包含選自SEQ ID NO: 12-15的胺基酸序列的肽連接子。在一些實施例中，CD123結合結構域是抗-CD123抗體片段（例如scFv或V_H H）。在一些實施例中，CD123結合結構域是IL-3結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，多特異性嵌合受體還包含位於胞外結構域的C-末端和跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，多特異性嵌合受體還包含位於多肽的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，多肽鏈從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、第一肽連接子、第一NKG2D結構域、第二肽連接子、第二NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。示例性的多特異性嵌合受體在圖1A-1B中示出。

在一些實施例中，提供了一種多特異性（例如雙特異性）嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 胞外結構域，其包含NKG2D結構域和CD123結合結構域（例如IL-3結構域）；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽鏈的NKG2D結構域。在一些實施例中，CD123結合結構域經由肽連接子融合至NKG2D結構域，肽連接子例如長度不大於約50個胺基酸的肽連接子，例如包含選自SEQ ID NO: 12-15的胺基酸序列的肽連接子。在一些實施例中，CD123結合結構域是抗-CD123抗體片段（例如scFv或V_H H）。在一些實施例中，CD123結合結構域是IL-3結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於第一胞外結構域的C-末端和第一跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於每條多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽各自從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、肽連接子、NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。示例性的多特異性嵌合受體在圖1D中示出。

在一些實施例中，提供了一種多特異性（例如雙特異性）嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 胞外結構域，其包含NKG2D結構域、二聚化基序（例如白胺酸拉鍊或半胱胺酸拉鍊）和CD123結合結構域（例如IL-3結構域）；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽鏈的NKG2D結構域。在一些實施例中，CD123結合結構域是抗-CD123抗體片段（例如scFv或V_H H）。在一些實施例中，CD123結合結構域是IL-3結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於第一胞外結構域的C-末端和第一跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於每條多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽各自從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、白胺酸拉鍊、NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。示例性的多特異性嵌合受體在圖1C中示出。

示例性的NKG2D× IL-3嵌合受體和其序列在表1中示出。對於具有兩個相同多肽鏈的二聚的嵌合受體，示出了單體的亞基的胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種NKG2D × IL-3嵌合受體，其包含與選自由SEQ ID NO: 16-20組成的組的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的多肽。在一些實施例中，提供了一種NKG2D× IL-3嵌合受體，其包含選自由SEQ ID NO: 16-20組成的組的胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種NKG2D嵌合受體，其包含與SEQ ID NO: 33的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的多肽。在一些實施例中，提供了一種NKG2D嵌合受體，其包含SEQ ID NO: 33的胺基酸序列。還提供了一種多肽，其包含選自由SEQ ID NO: 16-20和33組成的組的胺基酸序列。

在一些實施例中，提供了一種或多種分離的核酸，其編碼本文提供的嵌合受體或多特異性嵌合受體的任一個。在一些實施例中，其中嵌合受體是具有兩條相同的多肽鏈的二聚的嵌合受體，提供了編碼嵌合受體的單體亞基即單一拷貝的多肽鏈的分離的核酸。在一些實施例中，提供了一種分離的核酸，其與選自由SEQ ID NO: 21-25和38組成的組的核酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性。在一些實施例中，分離的核酸是DNA。在一些實施例中，分離的核酸時RNA（例如MRNA）。在一些實施例中，提供了一種或多種載體，其包含編碼上文所述的嵌合受體或多特異性嵌合受體的核酸中的任一個。在一些實施例中，載體是表現載體。在一些實施例中，載體是病毒載體，例如慢病毒載體。在一些實施例中，載體是非病毒載體。

表1. 示例性的NKG2D × IL-3嵌合受體

雙嵌合受體系統

本申請的一方面提供一種雙嵌合受體系統，其包含： (i)第一嵌合受體，其包含：(a) 包含NKG2D結構域的第一胞外結構域、(b) 第一跨膜結構域；和(c) 第一胞內信號傳導結構域；和(ii) 第二嵌合受體，其包含：(a) 包含第二抗原結合結構域的第二胞外結構域、(b) 第二跨膜結構域和任選的(c) 第二胞內信號傳導結構域。第一嵌合受體特異性結合NKG2D配位體，並且第二嵌合受體特異性結合第二抗原，例如腫瘤抗原，例如CD123。

第一嵌合受體和第二嵌合受體各自可以包含一條或多條多肽鏈。雙嵌合受體系統可以包含本文所述的第一嵌合受體和第二嵌合受體的任意組合。

在一些實施例中，第一嵌合受體包含單一多肽鏈，該多肽鏈包含：(a) 第一胞外結構域，其包含第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域，(b) 第一跨膜結構域，和(c) 第一細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一NKG2D結構域交聯至第二NKG2D結構域。在一些實施例中，第一NKG2D結構域包含在N-末端的第一工程化殘基，並且第二NKG2D結構域包含在C-末端的第二工程化殘基，其中第一工程化殘基例如經由二硫鍵或鹽橋與第二工程化殘基結合。在一些實施例中，第一跨膜結構域來源於由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，第一胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，第一胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，第一嵌合受體還包含位於第一胞外結構域的C-末端和第一跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，第一嵌合受體還包含位於多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第一嵌合受體包含多肽鏈，該多肽鏈從N-末端至C-末端包含：第一NKG2D結構域、肽連接子、第二NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。示例性的第一嵌合受體在圖1E中示出。

在一些實施例中，第一嵌合受體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 第一胞外結構域，其包含NKG2D結構域；(b) 第一跨膜結構域；和(c) 第一胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽鏈的NKG2D結構域。在一些實施例中，第一跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，第一胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，第一胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於第一胞外結構域的C-末端和第一跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於每條多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽各自從N-末端至C-末端包含：NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。示例性的第一嵌合受體在圖1F中示出。

在一些實施例中，第一嵌合受體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 第一胞外結構域，其包含NKG2D結構域和二聚化結構域（例如白胺酸拉鍊或半胱胺酸拉鍊）；(b) 第一跨膜結構域；和(c) 第一胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，二聚化結構域位於NKG2D結構域的N-末端。在一些實施例中，二聚化結構域位於NKG2D結構域的C-末端。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽鏈的NKG2D結構域。在一些實施例中，第一跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，第一胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，第一胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於第一胞外結構域的C-末端和第一跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於每條多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽各自從N-末端至C-末端包含：白胺酸拉鍊、NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，第二嵌合受體包含多肽鏈，該多肽鏈包含：(a) 第二胞外結構域，其包含第二抗原結合結構域，和(b) 第二跨膜結構域。在一些實施例中，第二嵌合受體不包含胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第二胞外結構域還包含NKG2D結構域，例如第二胞外結構域從N-末端至C-末端包含：NKG2D結構域和第二抗原結合結構域，或第二抗原結合結構域和NKG2D結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域特異性結合選自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77組成的組的抗原。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是來源於選自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80組成的組的分子的配位體或配位體結合結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是CD123結合結構域，例如IL-3結構域。在一些實施例中，第二跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，第二嵌合受體還包含位於第二胞外結構域的C-末端和第二跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，第二嵌合受體還包含位於多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第二嵌合受體包含多肽鏈，該多肽鏈從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、CD8α鉸鏈區和CD8α跨膜結構域。示例性的第二嵌合受體在圖1E和圖1F中示出。

在一些實施例中，第二嵌合受體包含多肽鏈，該多肽鏈包含：(a) 第二胞外結構域，其包含第二抗原結合結構域，(b) 第二跨膜結構域，和 (c) 第二胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第二胞外結構域還包含NKG2D結構域，例如，第二胞外結構域從N-末端至C-末端包含：NKG2D結構域和第二抗原結合結構域，或第二抗原結合結構域和NKG2D結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域特異性結合選自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77組成的組的抗原。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是來源於選自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80組成的組的分子的配位體或配位體結合結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是CD123結合結構域，例如IL-3結構域。在一些實施例中，第二跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，第二胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，第二胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，第二胞內信號傳導結構域不包含初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第二嵌合受體還包含位於胞外結構域的C-末端和跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，第二嵌合受體還包含位於多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第二嵌合受體包含多肽鏈，該多肽鏈從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域和來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種雙嵌合受體系統，其包含：(i) 第一嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 第一胞外結構域，其包含NKG2D結構域，(b) 第一跨膜結構域，和(c) 第一胞內信號傳導結構域；和(ii) 第二嵌合受體，其包含第三多肽鏈，該多肽鏈包含：(a) 第二胞外結構域，其包含第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域），(b) 第二跨膜結構域，和任選的(c) 第二胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵與第二多肽鏈的NKG2D結構域交聯。在一些實施例中，第一跨膜結構域和/或第二跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。一些實施例中，第一胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3ζ。在一些實施例中，第一胞內信號傳導結構域和/或第二胞內結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，第二嵌合受體不包含胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於第一胞外結構域的C-末端和第一跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，每條多肽鏈還包含位於每條多肽鏈的N-末端的信號肽（例如CD8α信號肽）。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽各自從N-末端至C-末端包含：NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第三多肽鏈從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域和CD8α跨膜結構域。示例性的雙嵌合受體系統在圖1F中示出。

在一些實施例中，第一嵌合受體的一個或多個多肽和第二嵌合受體的一個或多個多肽通過多順反子核酸構建體表現。例如，第一嵌合受體的一個或多個多肽經由自切割肽融合至第二嵌合受體的一個或多個多肽。示例性的自切割肽包括但不限於T2A、P2A和F2A肽。T2A肽已經被描述，例如，參見Szymczak AL等，Correction of multi-gene deficiency in vivo using a “self-cleaving” 2A peptide-based retroviral vector.Nat Biotechnol 2004; 22(5)589-594。

在一些實施例中，提供了編碼本文所述的任一種雙嵌合受體系統的一種或多種分離的核酸。在一些實施例中，提供了一種分離的核酸，其包含編碼第一嵌合受體的第一核酸序列和編碼第二嵌合受體的第二核酸序列，其中第一核酸序列經由編碼自切割肽（例如T2A）的第三核酸序列可操作地連接至第二核酸序列。在一些實施例中，其中第一嵌合受體是具有兩條相同多肽鏈的二聚的嵌合受體，第一核酸編碼第一嵌合受體的單體亞基，即單一拷貝的多肽鏈。

在一些實施例中，提供了一種嵌合受體，其包含與選自由SEQ ID NO: 34-35和41-42組成的組的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種NKG2D × IL-3雙嵌合受體系統，其包含第一嵌合受體和第二嵌合受體，第一嵌合受體包含與SEQ ID NO: 34的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列，並且第二嵌合受體包含與SEQ ID NO: 41的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種NKG2D × IL-3雙嵌合受體系統，其包含第一嵌合受體和第二嵌合受體，第一嵌合受體包含與SEQ ID NO: 35的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列，並且第二嵌合受體包含與SEQ ID NO: 42的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種多肽，其包含與SEQ ID NO: 36或37的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種分離的核酸，其與選自由SEQ ID NO: 26-27、39-40和43-44組成的組的核酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性。在一些實施例中，分離的核酸是DNA。在一些實施例中，分離的核酸是RNA（例如MRNA）。在一些實施例中，提供了一種或多種載體，其包含編碼上文所述的雙嵌合受體系統或嵌合受體的任意一種或多種核酸。在一些實施例中，載體是表現載體。在一些實施例中，載體是病毒載體，例如慢病毒載體。在一些實施例中，載體是非病毒載體。示例性的雙嵌合受體系統在下文中示出：

表2. 示例性的NKG2D × IL-3雙嵌合受體系統

胞外結構域

本文所述的嵌合受體（包括多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統的第一嵌合受體和第二嵌合受體）包含含有一個或多個（例如1、2、3、4、5、6或更多個）抗原結合結構域（包括一個或多個NKG2D結構域和/或第二抗原結合結構域）的胞外結構域。NKG2D結構域和第二抗原結合結構域可以經由肽鍵彼此直接融合、或經由肽連接子或經由二聚化基序（例如白胺酸拉鍊或半管胺酸拉鍊）彼此融合。

NKG2D結構域

嵌合受體的胞外結構域包含一個或多個NKG2D結構域。在一些實施例中，嵌合受體的胞外結構域包含單一NKG2D結構域。在一些實施例中，胞外結構域包含第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域。在一些實施例中，第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域是相同的。在一些實施例中，第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域是不同的。在一些實施例中，第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域經由肽鍵彼此直接融合，或經由肽連接子彼此融合。

在一些實施例中，NKG2D結構域來源於人NKG2D分子。在一些實施例中，NKG2D結構域來源於NKG2D（例如人NKG2D）的胞外結構域。在一些實施例中，NKG2D結構域是正向NKG2D結構域，即，具有與野生型NKG2D結構域相同順序的胺基酸序列的結構域。在一些實施例中，NKG2D結構域包含來自野生型NKG2D的胞外結構域的大約至少100、105、110、115、120、125、130、135、140、150或更多個中的任一數目的胺基酸。在一些實施例中，NKG2D結構域是反向NKG2D結構域，即具有與野生型NKG2D結構域相反的序列的結構域。在一些實施例中，NKG2D結構域（包括第一NKG2D結構域和/或第二NKG2D結構域）包含與SEQ ID NO: 7或8具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，NKG2D結構域包含與相應的NKG2D野生型序列相比至少1、2、3、4、5或更多個胺基酸取代（例如保守性胺基酸取代）。

NKG2D是NKG2家族的一個獨特的成員，NKG2家族是刺激或抑制NK細胞的細胞毒性活性的C型凝集素受體。NKG2D是主要在NK細胞和CD8⁺ T細胞（例如αβT細胞和γδT細胞）的表面上表現的II型跨膜錨定糖蛋白。其在多種物種中高度保守，在人和鼠科受體之間具有70%序列同一性。不同於與CD94異二聚化並且結合非經典I類MHC糖蛋白的其它NKG2受體，NKG2D形成同型二聚體並且結合細胞應激可誘導的分子。不斷積累的證據表明，NKG2D在針對應激細胞或異常細胞（例如自體腫瘤細胞和病毒感染的細胞）的免疫監視作用起到至關重要的作用。

已經在人類中鑒定了多種NKG2D配位體，包括由MHC家族中的基因編碼的MIC分子（MHC I類鏈相關蛋白A和B，或MICA和MICB）和成簇存在於人第6號染色體上的ULBP分子（UL16結合蛋白，也稱為RAET1蛋白）（Bahram 等，2005）。所有NKG2D配位體與MHC I類分子是同源的，並且展示出相當大的等位基因變異。雖然NKG2D配位體RNA在機體的所有組織和器官中廣泛表現，NKG2D配位體通常不存在于正常成年細胞的表面（Le Bert和Gasser 2014）。但是，NKG2D配位體的表現響應于細胞應激（包括熱激、DNA損傷和停滯的DNA複製）主要在上皮來源的組織中被誘導或上調。NKG2D配位體存在於細胞上標記該細胞用於NK細胞靶向以及潛在消除（Le Bert和Gasser，2014）。有趣的是，在多種血液和實體腫瘤中轉化細胞中的高活性的DNA修復途徑導致NKG2D配位體的表現，這致使此等細胞易感於NK-介導的細胞溶解（Sentman等，2006）。

NKG2D由KLRK1基因編碼。NKG2D是一種跨膜受體蛋白，其包含三個結構域：胞質結構域（人NKG2D的1-51位殘基）、跨膜結構域（人NKG2D的52-72位殘基）和胞外結構域（人NKG2D的73-216位殘基）。NKG2D的胞外結構域含有C型凝集素結構域（人NKG2D的98-213位殘基）。

第二抗原結合結構域

第二抗原結合結構域特異性結合細胞表面分子。第二抗原結合結構域可以選擇為識別一種抗原，該抗原充當與特定疾病狀態相關的靶細胞上的細胞表面標記。由第二抗原結合結構域靶向的抗原可以直接或間接參與該疾病。在一些實施例中，抗原是腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原與B細胞惡性相關。

腫瘤抗原是由腫瘤細胞產生的蛋白質，其可以引起免疫應答，特別是T細胞介導的免疫應答。本發明的靶向抗原的選擇會取決於待治療的癌症的特定類型。示例性的腫瘤抗原包括，例如，膠質瘤相關的抗原、癌胚抗原（CEA）、β-人絨毛膜促性腺激素、α-胎甲球蛋白（AFP）、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶反轉錄酶、RU1、RU2（AS）、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特異性抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、中性白細胞彈性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰島素生長因子 (IGF)-I、IGF-II、IGF-I受體和間皮素。

在一些實施例中，腫瘤抗原是腫瘤特異性抗原（TSA）或腫瘤相關抗原（TAA）。TSA是腫瘤細胞獨有的，不出現在機體的其它細胞上。TAA相關抗原不是腫瘤細胞獨有的，而是在不能誘導對抗原的免疫耐受性的狀態的情況下也在正常細胞上表現。抗原在腫瘤上的表現可以發生在免疫系統能夠對該抗原應答的情況下。TAA可以是在胎兒發育過程中當免疫系統不成熟並不能應答時在正常細胞上表現的抗原，或者TAA可以是以極低水準正常存在于正常細胞上但以高得多的水準在腫瘤細胞上表現的抗原。

TSA或TAA抗原的非限制性實例包括以下：分化抗原例如MART-1/MelanA (MART-I)、gp 100 (Pmel 17)、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2和腫瘤特異性多向抗原例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；過表現的胚胎抗原例如CEA；過表現的致癌基因和突變的腫瘤抑制物基因例如p53、Ras、HER2/neu；由染色體異位產生的獨特腫瘤抗原；例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原例如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它大的、基於蛋白質的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-連環素、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO- 1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合蛋白\親環素C相關蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

第二抗原結合結構域可以具有任意合適的形式。在一些實施例中，第二抗原結合結構域來源於抗體，例如四鏈抗體或單結構域抗體諸如僅重鏈抗體。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是抗體片段，例如Fab、Fv、scFv或VHH。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是特異性結合選自由以下組成的組的抗原的抗體片段：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。

在一些實施例中，第二抗原結合結構域是配位體或受體的配位體結合結構域。在一些實施例中，第二抗原結合結構域是來源於選自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80組成的組的分子的配位體或配位體結合結構域。

CD123結合結構域

在一些實施例中，第二抗原結合結構域是CD123結合結構域。在一些實施例中，CD123結合結構域是抗CD123抗體的抗體片段（例如scFv或VHH）。在一些實施例中，CD123結合結構域是CD123的配位體或IL-3結構域。在一些實施例中，IL-3結構域來源於人IL-3，例如人IL-3的全長或功能片段。在一些實施例中，CD123結合結構域包含與SEQ ID NO: 9具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施例中，提供了一種嵌合受體，其包含：(a) 包含CD123結合結構域的胞外結構域；和(b) 跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。在一些實施例中，嵌合受體還包含胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3　。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域由（或基本上由）一個或多個共刺激信號傳導結構域組成。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。在一些實施例中，嵌合受體還包含位於胞外結構域的C-末端和跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區（例如CD8α鉸鏈區）。在一些實施例中，嵌合受體從N-末端到C-末端包含：CD123結合結構域和跨膜結構域（CD8α）。在一些實施例中，CD123結合結構域是IL-3結構域。在一些實施例中，CD123結合結構域包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列。

在一些實施例中，提供了一種嵌合受體，其包含與SEQ ID NO: 41或42具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種分離的核酸，其包含與SEQ ID NO: 43或44具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的序列同一性的核酸序列。

IL-3（白介素-3）基因位於5號染色體，編碼長度為152個胺基酸的蛋白。IL-3是一種能夠支持大範圍的細胞活性（例如細胞生長、分化和凋亡）的細胞因子。IL-3通過結合白介素-3受體（IL-3R，也稱為CD123抗原）發揮作用。IL-3R是異二聚的受體，包含由IL-3、集落刺激因子2（CSF2/GM-CSF）和白介素5（IL5）的受體共有的配位體特異性α亞基和信號轉導β亞基。IL-3R的活性導致βc鏈的磷酸化、募集含有SH2的銜接子分子例如Vav1以及經由Jak2/STAT5和Ras/MAPK途徑的下游信號轉導。

IL-3R是75 kD的糖蛋白，當由N-糖苷酶水解時變為43 kD。IL-3R具有負責特異性結合IL-3的三個胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導不可缺少的短胞間結構域（Sato等，1993）。IL-3R是對IL-3具有低親和力和高特異性的異二聚的受體。結合IL-3後，IL-3R被活化並促進細胞增生和存活（Liu等，2015）。

CD123在AML母細胞（即成粒細胞）上過表現。75至89%的AML患者中的AML母細胞和白血病幹細胞（LSC）表現CD123。形成鮮明的對比，在正常造血幹細胞（HSC）上存在低的或檢測不到的CD123的表現（Frankel等，2014；Jordan等，2000）。除了AML之外，CD123也在多種惡性血液病中過表現，包括B細胞株急性淋巴細胞白血病、慢性骨髓白血病、漿細胞樣樹突狀細胞瘤和毛細胞白血病（Munoz等，2001）。該表現譜使得CD123在疾病的臨床診斷、預後和介入中成為有價值的生物標記。目前，早期臨床試驗已經證實CD123靶向療法是安全的，並且對造血不具有重大不良影響。在人類中CD123靶向療法的抗白血病活性仍正在被研究。

二聚化基序

在一些實施例中，胞外結構域包含二聚化基序和單一NKG2D結構域。在一些實施例中，胞外結構域包含第二抗原結合結構域、單一NKG2D結構域和置於它們之間的二聚化基序。二聚化基序促使嵌合受體中兩條多肽鏈的二聚化，由此促使形成NKG2D同型二聚體和NKG2D同型二聚體與NKG2D配位體結合。合適的二聚化基序是本領域已知的。在一些實施例中，二聚化基序是白胺酸拉鍊。在一些實施例中，白胺酸拉鍊包含SEQ ID NO: 10的胺基酸。在一些實施例中，二聚化基序是半胱胺酸拉鍊。示例性的半胱胺酸拉鍊是本領域已知的。參見，例如，Guilaume等 (2015) PLoS ONE 10(6): e0128779。

肽連接子

在一些實施例中，NKG2D結構域和第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）經由肽連接子與彼此融合。在一些實施例中，第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域經由肽連接子與彼此融合。嵌合受體的不同結構域也可以經由肽連接子與彼此融合。連接不同結構域的肽連接子可以是相同的或不同的。

嵌合受體中的每個肽連接子可以根據多種結構域的結構和/或功能特徵而具有相同的或不同的長度和/或序列。可以獨立地選擇和優化每個肽連接子。嵌合受體中的使用的一個或多個肽連接子的柔性和/或其它特性的程度可以對包括但不限於對一個或多個特定抗原或抗原決定基的親和力、特異性或親合力的特性具有一些影響。例如，可以選擇較長的肽連接子以確保兩個鄰近的結構域在空間上不相互干擾。在一些實施例中，短肽連接子可以放置在嵌合受體的跨膜結構域和胞內信號傳導結構域之間。在一些實施例中，肽連接子包含柔性殘基（例如甘胺酸和絲胺酸），使得鄰近結構域可以相互自由移動。例如，甘胺酸-絲胺酸雙聯體可以是合適的肽連接子。

肽連接子可以具有任意合適的長度。在一些實施例中，肽連接子的長度為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或更多中的任一數目的胺基酸。在一些實施例中，肽連接子的長度不多於約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更少中的任意數目的胺基酸。在一些實施例中，肽連接子的長度是約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、約10個胺基酸至約30個胺基酸長、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸，或約1個胺基酸至約100個胺基酸。

肽連接子可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，來源於僅重鏈抗體的鉸鏈區的序列可以用作連接子。例如參見WO1996/34103。在一些實施例中，肽連接子是柔性連接子。示例性的柔性連接子包括甘胺酸聚合物(G)_n (SEQ ID NO: 28)、甘胺酸-絲胺酸聚合物（包括，例如(GS)_n (SEQ ID NO: 29)、(GSGGS)_n (SEQ ID NO: 30)、(GGGS)_n (SEQ ID NO: 31)和(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 32)，其中n是至少為1的整數）、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和本領域已知的其它柔性連接子。在一些實施例中，肽連接子包含選自SEQ ID NO: 12-15的胺基酸序列。

跨膜結構域

本申請的嵌合受體（包括多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統的第一嵌合受體和第二嵌合受體）包含可以直接或間接融合至胞外抗原結合結構域的跨膜結構域。跨膜結構域可以來源於天然來源或來源於合成來源。本文使用的“跨膜結構域”是指在細胞膜（較佳真核細胞膜）中熱力學穩定的任何蛋白質結構。可適用于本文所述的嵌合受體中的跨膜結構域可以獲得自天然存在的蛋白質。或者，它可以是合成的非天然存在的蛋白質節段，例如在細胞膜中熱力學穩定的疏水性蛋白質節段。

跨膜結構域基於跨膜結構域的三維結構分類。例如，跨膜結構域可以形成α螺旋、多於一個α螺旋的複合體、β-筒狀或能夠跨越細胞的磷脂雙層的任何其它穩定結構。此外，跨膜結構域還可以或者替代性地基於跨膜結構域拓撲學分類，包括跨膜結構域跨膜的通過次數和蛋白質的方向。例如，單次通過的膜蛋白跨細胞膜一次，多次通過的膜蛋白跨細胞膜至少兩次（例如2、3、4、5、6、7或更多次）。膜蛋白可以根據其終點和穿過膜的節段相對於細胞的內部和外部的拓撲學被定義為I型、II型或III型。I型膜蛋白具有單一跨膜區，並且使其定向使得蛋白的N-末端存在於細胞的脂雙層的胞外側並且蛋白的C-末端存在於胞質側。II型膜蛋白也具有單一跨膜區，但使其定向使得蛋白的C-末端存在於細胞的脂雙層的胞外側並且蛋白的N-末端存在於胞質側。III型膜蛋白具有多個跨膜節段，並且可以基於跨膜節段的數目和N-末端和C-末端的位置進一步下位分類。

在一些實施例中，本文所述的嵌合受體的跨膜結構域來源於I型單次通過的膜蛋白。在一些實施例中，來自多次穿過的膜蛋白的跨膜結構域也可以適用于本文所述的嵌合受體中。多次穿過的膜蛋白可以包含複雜的（至少2、3、4、5、6、7或更多個）α螺旋或β片層結構。較佳地，多次穿過的膜蛋白的N-末端和C-末端存在於脂雙層的相對側，例如，蛋白的N-末端存在於脂雙層的胞質側並且蛋白的C-末端存在於胞外側。

在一些實施例中，嵌合受體的跨膜結構域包含選自T細胞受體的α、β或 ζ 鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CDIOO (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的跨膜結構域的跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。

在一些實施例中，跨膜結構域來源於CD28。在一些實施例中，跨膜結構域來源於CD8α。在一些實施例中，跨膜結構域是CD8α的全長跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域是CD8α的截短的跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域是包含SEQ ID NO: 4或45的胺基酸序列的CD8α的跨膜結構域。

用於本文所述的嵌合受體的跨膜結構域還可以包含合成的非天然存在的蛋白節段的至少一部分。在一些實施例中，跨膜結構域是合成的非天然存在的α螺旋或β片層。在一些實施例中，蛋白節段是至少約20個胺基酸，例如至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸。合成的跨膜結構域的實例是本領域已知的，例如美國專利號7,052,906 B1和PCT公開號WO 2000/032776 A2中的那些，其相關公開內容通過引用併入本文。

跨膜結構域可以包含跨膜區和位於跨膜結構域的C-末端側的胞質區。跨膜結構域的胞質區可以包含三個或更多個胺基酸，並且在一些實施例中，有助於確定跨膜結構域在脂雙層中的方向。在一些實施例中，一個或多個半胱胺酸殘基存在於跨膜結構域的跨膜區中。在一些實施例中，一個或多個半胱胺酸殘基存在於跨膜結構域的胞質區中。在一些實施例中，跨膜結構域的胞質區包含帶正電荷的胺基酸。在一些實施例中，跨膜結構域的胞質區包含胺基酸精胺酸、絲胺酸和離胺酸。

在一些實施例中，跨膜結構域的跨膜區包含疏水性胺基酸殘基。在一些實施例中，嵌合受體的跨膜結構域包含人工疏水序列。例如，苯丙胺酸、色胺酸和擷胺酸的三聯體可以存在於跨膜結構域的C末端。在一些實施例中，跨膜區主要包含疏水性胺基酸殘基，例如丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸或擷胺酸。在一些實施例中，跨膜區是疏水性的。在一些實施例中，疏水區包含多白胺酸-丙胺酸序列。蛋白或蛋白節段的親水性或者疏水或親水特性可以通過本領域已知的任何方法評估，例如Kyte和Doolittle親水性分析。

胞內信號傳導結構域

本申請的嵌合受體（包括多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統的第一嵌合受體和第二嵌合受體）包含胞內信號傳導結構域。胞內信號傳導結構域負責激活表現嵌合受體的免疫效應細胞的至少一種正常效應功能。術語“效應功能”是指細胞的一種特化功能。T細胞的效應功能例如可以是細胞溶解活性或輔助活性（包括分泌細胞因子）。因此，術語“胞質信號傳導結構域”是指轉導效應功能信號並且指導細胞進行特化功能的蛋白部分。雖然通常可以採用整個胞質信號傳導結構域，但是在許多情況下不必需使用整條鏈。就使用胞質信號傳導結構域的截短部分來說，這類截短的部分只要轉導效應功能信號就可以代替完整鏈使用。因此，術語胞質信號傳導結構域意味著包括足以轉導效應功能信號的胞質信號傳導結構域的任何截短的部分。

在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，嵌合受體包含基本上由免疫效應細胞的初級胞內信號傳導結構域組成的胞內信號傳導結構域。“初級胞內信號傳導結構域”是指以刺激的方式發揮作用以誘導免疫效應功能的胞質信號傳導序列。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域含有被稱為基於免疫受體酪胺酸的活化基序或ITAM的信號傳導基序。本文使用的“ITAM”是一種保守的蛋白基序，其通常存在於許多免疫細胞中表現的信號傳導分子的尾部。該基序可以包含產生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I的由6-8個胺基酸間隔的兩個重複的胺基酸序列YxxL/I，其中x各自獨立地為任何胺基酸。信號傳導分子內的ITAM對於細胞內的信號轉導是重要的，細胞內的信號轉導至少部分由活化信號傳導分子後ITAM中的酪胺酸殘基的磷酸化介導。ITAM還可以充當殘基信號傳導途徑的其它蛋白的停靠位點。示例性的含有ITAM的初級胞質信號傳導序列包括來源於CD3　、FcRγ (FCER1G)、FcRβ(Fcε Rib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。

在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域來源於CD3　。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域由CD3　的胞質信號傳導結構域組成。在一些實施例中，初級胞內信號傳導結構域是野生型CD3　的胞質信號傳導結構域。在一些實施例中，野生型CD3　的初級胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列。

共刺激信號傳導結構域

除了抗原特異性信號的刺激外，許多免疫效應細胞還需要共刺激以促使細胞增生、分化和生存以及激活細胞的效應功能。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含至少一個共刺激信號傳導結構域。本文使用的術語“共刺激信號傳導結構域”是指介導細胞內的信號轉導以誘導免疫應答（例如效應功能）的蛋白的至少一部分。本文所述的嵌合受體的共刺激信號傳導結構域可以是來自共刺激蛋白的胞質信號傳導結構域，其轉導信號並且調節由免疫細胞（例如T細胞、NK細胞、巨噬細胞、中性粒細胞或嗜酸粒細胞）介導的應答。“共刺激信號傳導結構域”可以是共刺激分子的胞質部分。術語“共刺激分子”是免疫細胞（例如T細胞）上的同源結合配偶體，其與共刺激配位體特異性結合，由此通過免疫細胞介導共刺激應答（例如但不限於增生和生存）。

在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含單一共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含兩個或更多個（例如約2、3、4或更多個中的任一個數）共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含兩個或更多個相同的共刺激信號傳導結構域，例如CD28的兩個拷貝的共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含兩個或更多個來自不同共刺激蛋白（例如本文所述的任意兩個或更多個共刺激蛋白）的共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含初級胞內信號傳導結構域（例如CD3ζ的胞質信號傳導結構域）和一個或多個共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，一個或多個共刺激信號傳導結構域和初級胞內信號傳導結構域（例如CD3ζ的胞質信號傳導結構域）經由任選的肽連接子與彼此融合。初級胞內信號傳導結構域和一個或多個共刺激信號傳導結構域可以以任何合適的順序排布。在一些實施例中，一個或多個共刺激信號傳導結構域位於跨膜結構域和初級胞內信號傳導結構域（例如CD3ζ的胞質信號傳導結構域）之間。多個共刺激信號傳導結構域可以提供附加的或協同的刺激作用。

宿主細胞（例如免疫細胞）中的共刺激信號傳導結構域的激活可以誘導細胞增加或減少細胞因子的產生和分泌、噬菌特性、增生、分化、存活和/或細胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信號傳導結構域可以適用于本文所述的嵌合受體中。可以基於諸如以下的因素來選擇共刺激信號傳導結構域的類型：表現效應分子的免疫效應細胞的類型（例如T細胞、NK細胞、巨噬細胞、中性粒細胞或嗜酸粒細胞）和所需免疫效應功能（例如ADCC效應）。用於在嵌合受體中使用的共刺激信號傳導結構域的實例可以是共刺激蛋白的胞質信號傳導結構域，包括不限於B7/CD28家族的成員（例如B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD- 1、PD-L2/B7-DC和PDCD6）；TNF超家族的成員（例如4- 1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配位體/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配位體/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配位體/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配位體/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配位體/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配位體/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B）；SLAM家族的成員(例如2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；和任何其它共刺激分子例如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、I類HLA、HLA- DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)和NKG2C。

在一些實施例中，一種或多種共刺激信號傳導結構域選自由CD27、CD28、4-1BB (即CD137)、ICOS、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特異性結合CD83的配位體組成的組。

在一些實施例中，本申請的嵌合受體中的胞內信號傳導結構域包含來源於CD28的共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含CD3ζ的胞質信號傳導結構域和CD28的共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，本申請的嵌合受體中的胞內信號傳導結構域包含來源於4-1BB (即CD137)的共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含CD3ζ的胞質信號傳導結構域和4-1BB的共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含4-1BB的共刺激信號傳導結構域，該共刺激信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。

在一些實施例中，本申請的嵌合受體的胞內信號傳導結構域包含CD28的共刺激信號傳導結構域和4-1BB的共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含CD3ζ的胞質信號傳導結構域、CD28的共刺激信號傳導結構域和4-1BB的共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，胞內信號傳導結構域包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD28的共刺激信號傳導結構域、4-1BB的共刺激信號傳導結構域和CD3ζ的胞質信號傳導結構域。

本文所述的任一個共刺激信號傳導結構域的變異體也在本公開內容的範圍內，使得共刺激信號傳導結構域能夠調節免疫細胞的免疫應答。在一些實施例中，共刺激信號傳導結構域包含與野生型配對物相比最高達10個胺基酸殘基變異（例如1、2、3、4、5或8）。這樣的包含一個或多個胺基酸變異的共刺激信號傳導結構域可以被稱為變異體。共刺激信號傳導結構域的胺基酸殘基的突變可以導致與不包含該突變的共刺激信號傳導結構域相比信號轉導增加以及增強的免疫應答刺激。共刺激信號傳導結構域的胺基酸殘基的突變可以導致與不包含該突變的共刺激信號傳導結構域相比信號轉導降低以及減低的免疫應答刺激。

鉸鏈區

本申請的嵌合受體（包括多特異性性嵌合受體、雙嵌合受體系統的第一嵌合受體和第二嵌合受體）可以包含位於胞外抗原結合結構域和跨膜結構域之間的鉸鏈區。鉸鏈區是通常存在於蛋白質的兩個結構域之間並且可以允許蛋白質的柔性以及一個或兩個結構域相對於彼此移動的胺基酸節段。可以使用提供這樣的效應分子的柔性和胞外抗原結合結構域相對於跨膜結構域移動的任何胺基酸序列。

鉸鏈區可以含有約10-100個胺基酸，例如約15-75個胺基酸、20-50個胺基酸或30-60個胺基酸中的任一個範圍。在一些實施例中，鉸鏈區的長度可以為至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75個中任一數目的胺基酸。

在一些實施例中，鉸鏈區是天然存在的蛋白的鉸鏈區。本領域已知包含鉸鏈區的任何蛋白的鉸鏈區適用于本文所述的嵌合受體中。在一些實施例中，鉸鏈區是天然存在的蛋白的鉸鏈區的至少一部分並且為嵌合受體賦予柔性。在一些實施例中，鉸鏈區來源於CD8α。在一些實施例中，鉸鏈區是CD8α的鉸鏈區的一部分，例如含有CD8α的鉸鏈區的至少15（例如20、25、30、35或40）個連續胺基酸的片段。在一些實施例中，CD8α的鉸鏈區包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。

抗體（例如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗體）的鉸鏈區也適用于本文所述的嵌合受體中。在一些實施例中，鉸鏈區是連接抗體的恒定結構域CH1和CH2的鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區是抗體的鉸鏈區，並且包含抗體的鉸鏈區和該抗體的一個或多個恒定區。在一些實施例中，鉸鏈區包含抗體的鉸鏈區和該抗體的CH3恒定區。在一些實施例中，鉸鏈區包含抗體的鉸鏈區和該抗體的CH2和CH3恒定區。在一些實施例中，抗體是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗體。在一些實施例中，抗體是IgG抗體。在一些實施例中，抗體是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施例中，鉸鏈區包含IgG1抗體的鉸鏈區和CH2和CH3恒定區。在一些實施例中，鉸鏈區包含IgG1抗體的鉸鏈區和CH3恒定區。

非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受體的鉸鏈區。在一些實施例中，Fc受體的胞外配位體結合結構域的C-末端與跨膜結構域的N-末端之間的鉸鏈區是肽連接子，例如(GxS)n連接子，其中x和n獨立地可以為3和12之間（包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）或更大的整數。

信號肽

本申請的嵌合受體（包括多特異性性嵌合受體、雙嵌合受體系統的第一嵌合受體和第二嵌合受體）可以在該一個或多個多肽的N-末端包含信號肽（也稱為信號序列）。一般地，信號肽是將多肽靶向至細胞中的所需位點的肽序列。在一些實施例中，信號肽將效應分子靶向至細胞的分泌途徑，並且會允許效應分子整合並錨定到脂雙層中。適用于本文所述的嵌合受體中的信號肽（包括天然存在的蛋白的信號序列或合成的非天然存在的信號序列）對熟習此項技術者是明顯的。在一些實施例中，信號肽來源於選自由CD8　、GM-CSF受體　、IL-3和IgG1重鏈組成的組的分子。在一些實施例中，信號肽來源於CD8α。在一些實施例中，IL-3的信號肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。在一些實施例中，CD8α的信號肽包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。

III. 工程化免疫效應細胞

本申請還提供了宿主細胞（例如工程化免疫效應細胞），其包含本文所述的嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統中的任一個。

因此，在一些實施例中，提供了一種包含嵌合受體的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），該嵌合受體包含：(a)包含NKG2D結構域的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，胞外結構域包含第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域。

在一些實施例中，提供了一種包含多特異性（例如雙特異性）嵌合受體的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），該多特異性嵌合受體包含：(a) 胞外結構域，其包含NKG2D結構域和第二抗原結合結構域（例如IL-3結構域）；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種包含多特異性（例如雙特異性）嵌合受體的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），該多特異性嵌合受體包含：(a) 胞外結構域，其包含第一NKG2D結構域、第二NKG2D結構域和CD123結合結構域（例如IL-3結構域）；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，CD123結合結構域是抗-CD123抗體片段（例如scFv或VHH）。在一些實施例中，CD123結合結構域是IL-3結構域。在一些實施例中，多肽鏈從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、第一肽連接子、第一NKG2D結構域、第二肽連接子、第二NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種包含多特異性（例如雙特異性）嵌合受體的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），該多特異性嵌合受體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 胞外結構域，其包含NKG2D結構域和CD123結合結構域（例如IL-3結構域）；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽鏈的NKG2D結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈各自從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、肽連接子、NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，胞外結構域還包含置於NKG2D結構域和CD123結合結構域之間的二聚化基序（例如白胺酸拉鍊或半胱胺酸拉鍊）。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈各自從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、白胺酸拉鍊、NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種包含雙嵌合受體系統的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），雙嵌合受體系統包含：(i)第一嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a) 包含NKG2D結構域的第一胞外結構域；(b) 第一跨膜結構域；和(c)第一胞內信號傳導結構域；和(ii) 包含第三多肽鏈的第二嵌合受體，該第三多肽鏈包含：(a) 包含第二抗原結合結構域的第二胞外結構域；(b) 第二跨膜結構域；和任選的(c) 第二胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈各自從N-末端至C-末端包含：NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第二嵌合受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域和任選的來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種包含雙嵌合受體系統的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），雙嵌合受體系統包含(i)包含第一多肽鏈的第一嵌合受體，第一多肽鏈包含：(a)第一胞外結構域，其包含第一NKG2D結構域和第二NKG2D結構域；(b) 第一跨膜結構域；和(c)第一胞內信號傳導結構域；和(ii) 包含第二多肽鏈的第二嵌合受體，該第二多肽鏈包含：(a) 包含第二抗原結合結構域的第二胞外結構域；(b) 第二跨膜結構域；和任選的(c) 第二胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第一嵌合受體包含多肽鏈，該多肽鏈從N-末端至C-末端包含：第一NKG2D結構域、第二NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第二嵌合受體包含多肽鏈，該多肽鏈從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域和任選的來源於4-1BB的共刺激信號傳導結構域。

在一些實施例中，工程化免疫效應細胞表現一種或多種免疫調諧劑。在一些實施例中，工程化哺乳動物細胞包含編碼免疫調諧劑的異源核酸。在一些實施例中，編碼免疫調諧劑的異源核酸存在于編碼本文所述的嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統的載體上。在一些實施例中，免疫調諧劑是Runx3的調節劑。在一些實施例中，調節劑是多肽，例如來源於Runx3或MITF的多肽。在一些實施例中，調節劑是RNA，例如miRNA或siRNA。Runx3可以幫助T細胞歸巢並浸潤到實體瘤中，T細胞歸巢並浸潤到實體瘤中是成功T細胞介導的免疫治療中的重要因素。

載體

本申請提供用於克隆和表現本文所述的嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統中任一個的載體。在一些實施例中，載體適用於在真核細胞（例如哺乳動物細胞）中複製和整合。在一些實施例中，載體是病毒載體。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、痘苗病毒載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物。病毒載體技術是本領域熟知的並且記載於例如Sambrooket al . (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)和其它病毒學和分子生物學手冊中。

大量基於病毒的系統已經被開發用於將基因轉入哺乳動物細胞中。例如，逆轉錄病毒提供一種基因遞送系統的便利平臺。可以使用本領域已知的技術將異源核酸插入到載體中並且包裝在逆轉錄病毒顆粒中。然後分離重組病毒並將其遞送到體外或離體的工程化哺乳動物細胞。大量逆轉錄病毒系統是本領域已知的。在一些實施例中，使用腺病毒載體。大量腺病毒載體是本領域已知的。在一些實施例中，使用慢病毒載體。在一些實施例中，使用自我失活慢病毒載體。例如，可以使用本領域已知的流程包裝攜帶嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統的自我失活慢病毒載體。可以使用本領域已知的方法將得到的慢病毒載體用於轉導哺乳動物細胞（例如初級人T細胞）。來源於逆轉錄病毒（例如慢病毒）的載體是適合實現長期基因轉移的工具，因為其允許轉基因的長期穩定整合和其在後代細胞中增生。慢病毒載體還具有低免疫原性，並且能夠轉導非增生細胞。

在一些實施例中，載體包含編碼本文所述的嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統的任一種核酸。可以使用本領域任何已知的分子克隆方法（包括例如使用限制性內切酶位點和一種或多種選擇性標記）將核酸克隆到載體中。在一些實施例中，核酸可操作地連接至啟動子。多種啟動子已經被開發用於在哺乳動物細胞中的基因表現，並且本領域已知的任何啟動子可以用於本發明中。啟動子可以大致分類為組成型啟動子或調控型啟動子例如誘導型啟動子。

在一些實施例中，編碼嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統的核酸可操作地連接至組成型啟動子。組成型啟動子允許異源基因（也稱為轉基因）在宿主細胞中組成型表現。示例性的本文考慮的組成型啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)啟動子、人延伸因子-1α (hEF1α)、泛素C啟動子(UbiC)、磷酸甘油激酶啟動子 (PGK)、猿猴病毒40早期啟動子(SV40)和CMV早期強化子偶聯的雞β-肌動蛋白啟動子(CAGG)。這類組成型啟動子驅使轉基因表現的效率已經在大量研究中被廣泛比較。例如，Michael C. Milone等比較了CMV、hEF1α、UbiC和PGK在初級人T細胞中驅使嵌合受體表現的效率，並且得出結論是hEF1α啟動子不僅誘導高水準的轉基因表現，還任選地在CD4和CD8人T細胞中維持（Molecular Therapy、17(8): 1453-1464 (2009)）。

在一些實施例中，編碼嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統的核酸可操作地連接至誘導型啟動子。誘導型啟動子屬於調控型啟動子類。誘導型啟動子可以由一種或多種條件誘導，例如物理條件、工程化免疫效應細胞的微環境或工程化免疫效應細胞的生理狀態、誘導物（即誘導劑）或其組合。在一些實施例中，誘導條件在工程化哺乳動物細胞中和/或在接受醫藥組合物的受試者中不誘導內源基因的表現。在一些實施例中，誘導條件選自由以下組成的組：誘導物、照射（例如電離輻射、光）、溫度（例如熱）、氧化還原狀態、腫瘤環境和工程化哺乳動物細胞的活化狀態。

在一些實施例中，載體還含有選擇性標記物基因或報告基因以從通過慢病毒載體轉染的宿主細胞群體中選擇表現嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統的細胞。選擇性標記和報告基因二者可以側接適當的調控序列以能夠在宿主細胞中表現。例如，載體可以含有用於調控核酸序列表現的轉錄和翻譯終止子、起始序列和啟動子。

免疫效應細胞

“免疫效應細胞”是可以執行免疫效應功能的免疫細胞。在一些實施例中，免疫效應細胞至少表現FcγRIII和執行ADCC效應功能。介導ADCC的免疫效應細胞的實例包括外周血單核細胞（PBMC）、自然殺傷（NK）細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。

在一些實施例中，免疫效應細胞是T細胞。在一些實施例中，T細胞是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或其組合。在一些實施例中，T細胞在表現嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統並且結合至靶細胞例如CD20+或CD19+腫瘤細胞之後產生IL-2、TFN和/或TNF。在一些實施例中，CD8+ T細胞在表現嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統並且結合至靶細胞後，裂解該抗原特異性靶細胞。

在一些實施例中，免疫效應細胞是NK細胞。在其它實施例中，免疫效應細胞可以是確立的細胞株，例如NK-92細胞株。

在一些實施例中免疫效應細胞從幹細胞分化，幹細胞例如造血幹細胞、多能幹細胞、iPS或胚胎幹細胞。

通過將嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統引入免疫效應細胞例如T細胞中而製備工程化免疫效應細胞。在一些實施例中，通過轉染本文所述的任一種分離的核酸或任一種載體而將嵌合受體、多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統引入免疫效應細胞中。在一些實施例中，通過當細胞穿過微流體系統例如CELL SQUEEZE^® 時將蛋白質插入到細胞膜中，而將嵌合受體、多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統引入免疫效應細胞中（參見例如美國專利申請公開號20140287509）。

將載體或分離的核酸引入哺乳動物細胞的方法是本領域已知的。所述的載體可以通過物理、化學或生物學方法被轉入免疫效應細胞中。

用於將載體引入免疫效應細胞的物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質轉染、粒子轟擊、微注射、電穿孔等。用於產生包含載體和/或外源核酸的細胞的方法是本領域熟知的。參見，例如Sambrook等(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 美國冷泉港實驗室。在一些實施例中，載體通過電穿孔被引入細胞中。

用於將載體引入免疫效應細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體已經成為用於將基因插入哺乳動物（例如人）細胞的應用最廣的方法。

用於將載體引入免疫效應細胞的化學方法包括膠體分散系統，例如大分子複合物、納米膠囊、微球、珠粒和基於脂質的系統，包括水包油乳液、微團、混合微團和脂質體。用作體外遞送運載體的示例性膠體系統是脂質體（例如人工膜囊泡）。

在一些實施例中，編碼本文所述的任一種嵌合受體、多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統的RNA分子可以通過習用方法（例如體外轉錄）製備並且然後經由已知方法（例如mRNA電穿孔）被引入到免疫效應細胞中。參見例如Rabinovich等, Human Gene Therapy 17:1027-1035。

在一些實施例中，轉導的或轉染的免疫效應細胞在引入載體或分離的核酸之後離體增生。在一些實施例中，轉導的或轉染的免疫效應細胞培養增生持續至少約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中任一個。在一些實施例中，轉導的或轉染的免疫效應細胞被進一步評估或篩選以選擇工程化哺乳動物細胞。

報告基因可用於鑒定潛在的轉染細胞並且用於評估調控序列的功能。一般，報告基因是不存在於受體生物體或組織中或受體生物體或組織不表現的並且編碼通過一些易於檢測的性質（例如酶活性）證明表現的多肽的基因。在DNA已經被引入受體細胞之後的適當時間測定報告基因的表現。合適的報告基因可以包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶或綠色熒光蛋白基因（例如Ui-Tei等 FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）。合適的表現系統是公知的，並且可以使用已知技術製備或可以購買獲得。

證明工程化免疫效應細胞中存在編碼嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統的核酸的其它方法包括，例如，熟習此項技術者公知的分子生物學測定，例如Southern和Northern印跡、RT-PCR和PCR；生物化學測定，例如通過免疫生物學方法（例如ELISA和Western印跡）檢測存在或不存在特定肽。

T細胞的來源

在擴增和遺傳修飾T細胞之前，從個體獲得T細胞的來源。可以從許多來源獲得T細胞，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點的組織、腹水、胸膜積液、脾組織和腫瘤。在一些實施例中，可以使用任意數量的本領域可得的T細胞株。在一些實施例中，可以使用任意數量的熟習此項技術者已知的技術（例如FICOLL™分離）從收集自受試者的血液單位中獲得T細胞。在一些實施例中，通過單采術獲得來自個體的循環血液的細胞。單采術產物通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其它有核白細胞、紅血細胞和血小板。在一些實施例中，可以洗滌通過單采術收集的細胞，以去除血漿成分並且將細胞置於合適的緩衝液或培養基中用於隨後的處理步驟。在一些實施例中，用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）洗滌細胞。在一些實施例中，洗滌溶液缺少鈣，並且可以缺少鎂，或可以缺少許多二價陽離子，如果不是全部二價陽離子的話。再次，令人驚奇的是，在該不存在的情況下的初始激活步驟導致放大的激活。熟習此項技術者易於理解，洗滌步驟可以通過熟習此項技術者已知的方法完成，例如通過根據製造商的說明書使用半自動“流過”離心（例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5）。洗滌之後，可以將細胞重懸于多種生物相容性緩衝液中，諸如例如無Ca²⁺ 無Mg²⁺ PBS、PlasmaLyte A或具有或不具有緩衝液的其它鹽水溶液。或者，可以去除單采術樣品的不需要成分，並且將細胞直接重懸於培養基中。

在一些實施例中，通過裂解紅血細胞並且耗盡單核細胞（例如通過PERCOLL™梯度離心或通過逆流離心淘選）而從外周血淋巴細胞中分離T細胞。可以通過陽性或陰性選擇技術進一步分離T細胞的特定子群體，例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T細胞。例如，在一些實施例中，通過用抗-CD3/抗-CD28（即3×28）綴合的珠粒（例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T）溫育持續足以陽性選擇所需T細胞的一端時間而分離T細胞。在一些實施例中，時間段為約30分鐘。在一個另外的實施例中，時間段的範圍為30分鐘至36小時或更長和其之間的所有整數值。在一個另外的實施例中，時間段時至少1、2、3、4、5或6小時。在一些實施例中，時間段是10至24小時。在一些實施例中，溫育時間段是24小時。為了從患有白血病的患者中分離T細胞，使用更長的溫育時間例如24小時可以增加細胞產量。在與其它細胞類型相比T細胞很少的任何情況下，（例如在從腫瘤組織中或從免疫缺陷的個體中分離腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL））可以使用更長的溫育時間分離T細胞。此外，使用更長的溫育時間可以增加捕獲CD8+ T細胞的功效。因此，通過簡單地縮短或延長時間，允許T細胞結合至CD3/CD28珠粒，和/或通過增加或減小珠粒與T細胞的比率（如本文進一步描述的）可以在培養起始時或在處理過程中的其它時間點優先選擇或優先不選擇T細胞的子群體。另外，通過增加或減少抗-CD3和/或抗-CD28抗體在珠粒或其它表面上的比率，可以在培養起始時或在其它所希望的時間點優先選擇或優先不選擇T細胞的子群體。熟習此項技術者將認識到也可以使用多輪選擇。在一些實施例中，可能需要進行選擇程序並且在激活和擴增處理中使用“未被選擇的”細胞。“未被選擇的”細胞還可以進行其它輪的選擇。

可以使用針對陰性選擇的細胞所特有的表面標記的多種抗體的組合來實現通過陰性選擇的T細胞群體富集。一個方法是通過使用針對陰性選擇的細胞上存在的細胞表面標記的單克隆抗體混合物進行陰性磁免疫吸附或流式細胞術的細胞分選和/或選擇。例如，為了通過陰性選擇富集CD4+細胞，單克隆抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。在某些實施例中，可能需要富集或陽性選擇代表性地表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的調節性T細胞。或者，在某些實施例中，通過抗-CD25綴合的珠粒或其它類似的選擇方法耗盡T調節性細胞。

為了通過陽性或陰性選擇分離所需的細胞群體，可以改變細胞和表面（例如顆粒，諸如珠粒）的濃度。在某些實施例中，可能需要顯著減小珠粒和細胞混合在一起的體積（即增加細胞濃度），以確保細胞和珠粒的最佳接觸。例如，在一個實施例中，使用2,000,000,000個細胞/mL的濃度。在一個實施例中，使用1,000,000,000個細胞/mL的濃度。在一個另外的實施例中，使用大於100,000,000個細胞/mL的濃度。在一個另外的實施例中，使用10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000或50,000,000個細胞/mL的濃度。在另外的實施例中，可以使用125,000,000或150,000,000個細胞/mL的濃度。使用高濃度可以導致增加的細胞產量、細胞激活和細胞擴增。此外，使用高細胞濃度允許更有效地捕獲可以微弱表現感興趣的靶抗原的細胞（例如CD28陰性T細胞），或者允許更有效地從存在許多腫瘤細胞的樣品（例如白血病血液、腫瘤組織等）中捕獲。這類細胞群體可以具有治療價值並且是希望獲得的。例如，使用高濃度的細胞允許更有效地選擇通常具有更微弱的CD28表現的CD8+ T細胞。

在一些實施例中，可能需要使用較低濃度的細胞。通過顯著稀釋T細胞和表面（例如顆粒諸如珠粒）的混合物，將顆粒和細胞之間的相互作用最小化。這選擇表現大量待與顆粒結合的所需抗原的細胞。例如，CD4+ T細胞表現較高水準的CD28，在稀濃度下比CD8+T細胞更有效地被捕獲。在一些實施例中，使用的細胞濃度是5×10⁶ /mL。在一些實施例中，使用的濃度可是是約1×10⁵ /mL至1×10⁶ /mL以及其之間的任何整數值。

在一些實施例中，可以在2-10^o C或在室溫在回旋機上以不同速度溫育細胞持續不同時間長度。

還可以在洗滌步驟之後冷凍用於刺激的T細胞。不希望囿於理論，冷凍和隨後的解凍步驟通過去除細胞群體中的粒細胞和一定程度上的單核細胞而提供更加均一的產物。去除血漿和血小板的洗滌步驟之後，將細胞重懸於冷凍液中。因為許多冷凍液和參數是本領域已知的，並且在本文上下文中是有用的，一種方法涉及使用含有20% DMSO和8%人血清白蛋白的PBS、或含有10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5% DMSO，或含有31.25% Plasmalyte-A、31.25%葡萄糖5%、0.45% NaCl、10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5% DMSO，或含有例如含有Hespan和PlasmaLyte A的其它合適的細胞冷凍液的培養基，然後以每分鐘1°的速度將細胞冷凍至−80^o C，並且保存在液氮儲罐的氣相中。可以使用其它受控的冷凍方法以及不受控制的立即在-20℃或液氮中冷凍。

在一些實施例中，如本文所述解凍並洗滌冷凍保存的細胞，在激活之前允許在室溫下靜置1小時。

本申請還預期在需要本文所述的擴增細胞之前的某個時間段從受試者採集血液樣品或單采術產物。同樣地，可以在任何需要的時間點採集待擴增的細胞來源，並且可以將所需細胞（例如T細胞）分離並冷凍後期用於會得益於T細胞療法的任何數量的疾病或病症（例如本文所述的那些）的T細胞療法。在一個實施例中，從大體上健康的受試者採集血液樣品或單采成分血。在某些實施例中，從處於患病的風險但尚未患病的大體上健康的受試者採集血液樣品或單采成分血，並且分離和冷凍感興趣的細胞用於後期使用。在某些實施例中，可以在以後的時間擴增、冷凍和使用該T細胞。在某些實施例中，在本文所述的診斷特定疾病之後不久但在任何治療之前從患者採集樣品。在一個另外的實施例中，在任何數量的相關治療形式之前，從來自受試者的血液樣品或單采成分血中分離細胞，上述相關治療形式包括但不限於用以下治療：藥劑（例如那他珠單抗、依法利珠單抗、抗病毒劑）、化學療法、放射、免疫抑制劑（諸如環孢菌素、咪唑硫嘌呤、甲胺蝶呤、麥考酚酯和FK506）、抗體或其它免疫毀滅性藥劑（諸如CAMPATH、抗-CD3抗體、環磷醯胺、氟達拉濱、環孢菌素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228）和放射。此等藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調磷酸酶（環孢黴素和FK506）或抑制對於生長因子誘導的信號傳導重要的p70S6激酶（雷帕黴素）（Liu等Cell 66:807-815, 1991; Henderson等, Immun 73:316-321, 1991; Bierer等, Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）。在一個另外的實施例中，從患者分離並冷凍細胞用於以後與骨髓或幹細胞移植、使用化學藥劑（例如氟達拉濱、外線束放射治療 (XRT)、環磷醯胺）或抗體（例如OKT3或CAMPATH）的T細胞毀滅性療法結合（例如，之前、同時或之後）使用。在另一個實施例中，B-細胞毀滅性療法（例如與CD20反應的藥劑，例如利妥昔單抗）之前分離細胞，並且可以被冷凍用於在B-細胞毀滅性療法之後的後續治療使用。

在一些實施例中，在治療之後直接從患者中獲得T細胞。就這一點而言，已經觀察到，某些癌症治療特別是用破壞免疫系統的藥物治療之後，治療後不久當患者正常地從該治療恢復的時期中，獲得的T細胞的質量對於其離體擴增的能力可以是最佳的或改善的。同樣地，使用本文所述的方法離體操作之後，此等細胞可以處於較佳的狀態用於增強的移植和體內擴增。因此，在該恢復階段收集血液細胞（包括T細胞、樹突狀細胞或造血系的其它細胞）預期在本發明的上下文中。另外，在某些實施例中，動員（例如用GM-CSF動員）和調節方案可用於在受試者中產生以下環境：其中偏好特定細胞類型的群體恢復、再循環、再生和/或擴增，特別是在治療後的一個確定的時間窗口中。示例性的細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞和免疫系統的其它細胞。

T細胞的激活和擴增

用本文所述的嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統遺傳修飾T細胞之前或之後，通常使用例如美國專利號6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 和美國專利申請公開號20060121005中所述的方法激活該T細胞。

一般地，可以通過與表面接觸來擴增T細胞，該表面具有與其附接的刺激CD3/TCR複合物相關信號的劑和刺激T細胞表面上的共刺激分子的配位體。具體地，T細胞群體可以如本文所述被刺激，例如，通過與抗-CD3抗體或其抗原結合片段、或表面上固定的抗-CD2抗體接觸，或通過與蛋白激酶C活化劑（例如苔蘚抑素）連同鈣離子載體接觸。對於T細胞表面上的輔助分子的共刺激，使用結合輔助分子的配位體。例如，可以適於刺激T細胞增生的條件下將T細胞群體與抗-CD3抗體和抗-CD28抗體接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞增生，抗-CD3抗體和抗-CD28抗體。抗CD-28抗體的實例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)，可用作本領域通常已知的其它方法（Berg等, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen等, J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland等, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999）。

在一些實施例中，可以通過不同方案提供T細胞的初級刺激信號和共刺激信號。例如，提供每種信號的劑可以在溶液中，或者與表面偶聯。當與表面偶聯時，劑可以與同一表面（即以“順式”構造）或與分離的表面（即以“反式”構造）偶聯。或者，一種劑可以與一個表面偶聯，另一劑在溶液中。在一個實施例中，提供共刺激信號的劑與細胞表面結合，並且提供初級激活信號的劑在溶液中或與表面偶聯。在某些實施例中，兩種劑可以都在溶液中。在另一個實施例中，劑可以為可溶形式，然後交聯至表面（例如表現將與此等劑結合的Fc受體或抗體或其它結合劑的細胞）。就這一點而言，參見例如美國專利申請公開號20040101519和20060034810公開了人工抗原呈遞細胞（aAPC），其考慮用於激活和擴增本發明的T細胞。

在某些實施例中，T細胞與劑包被的珠粒結合，隨後將珠粒和細胞分開，然後培養細胞。在一個替代性的實施例中，在培養之前不將劑包被的珠粒與細胞分開，而是在一起培養。在一個另外的實施例中，首先通過施加力例如磁力而集中珠粒和細胞，導致細胞表面標記的連接增加，由此誘導細胞刺激。

例如，細胞表面蛋白可以通過允許附接抗-CD3和抗-CD28的順磁珠粒（3×28珠粒）接觸T細胞而連接細胞表面蛋白。在一個實施例中，細胞（例如10⁴ 至10⁹ 個T細胞）和珠粒（例如比率為1:1的DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T順磁珠粒）在緩衝液中較佳PBS（不含二價陽離子例如鈣和鎂）中結合。再次，熟習此項技術者可以容易地理解可以使用任何細胞濃度。例如，靶細胞可以在樣品中非常稀少，並且可包含僅0.01%的樣品或全部樣品（即100%）可以包含感興趣的靶細胞。因此，任何細胞數量都在本發明的上下文中。在某些實施例中，可能需要顯著減小顆粒和細胞混合在一起的體積（即增加細胞的濃度），以確保細胞與顆粒最大接觸。例如，在一個實施例中，使用約2,000,000,000個細胞/ml的濃度。在另一個實施例中，使用大於100,000,000個細胞/mL。在一個另外的實施例中，使用10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000或50,000,000個細胞/mL的細胞濃度。在在又另一個實施例中，使用75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000或100,000,000個細胞/mL的細胞濃度。在另外的實施例中，可以使用125,000,000或150,000,000個細胞/mL的濃度。使用高濃度可以導致增加的細胞產量、細胞激活和細胞擴增。此外，使用高細胞濃度允許更有效地捕獲可以微弱表現感興趣的靶抗原的細胞，例如CD28陰性T細胞。這類細胞群體可以具有治療價值並且在某些實施例中是希望獲得的。例如，使用高濃度的細胞允許更有效地選擇通常具有更微弱的CD28表現的CD8+ T細胞。

在一些實施例中，可以培養混合物若干小時（例如3小時）至約14天或其間的任何完整小時數。在另一個實施例中，可以培養混合物21天。在本發明的一個實施例中，將珠粒和T細胞在一起培養約8天。在另一個實施例中，將珠粒和T細胞在一起培養2-3天。也可能需要若干週期的刺激，使得T細胞的培養時間可以是60天或更長。適用于T細胞培養的條件包括合適的培養基（例如最小重要培養基（Minimal Essential Media）或RPMI培養基1640 或X-vivo 15 (Lonza)），其可以含有增生和存活必需的因子，包括血清（例如胎牛或人血清）、白介素-2（IL-2）、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或熟習此項技術者已知的用於細胞生長的任何其它添加劑。用於細胞生長的其它添加劑包括，但不限於，表面活性劑、人血漿蛋白粉和還原劑例如N-乙醯-半胱胺酸和2-巰基乙醇。培養基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其具有對於T細胞生長和擴增來說充足的添加的胺基酸、丙酮酸鈉和維生素，無血清或補充有適當量的血清（或血漿）或一組明確的激素和/或一定量的一種或多種細胞因子。僅在實驗培養中包含抗生素例如青黴素和鏈黴素，而在待輸注到受試者體內的細胞的培養中不包含抗生素。將靶細胞維持在支持生長所必需的條件下，例如適當的溫度（例如37℃）和氣氛（例如空氣加5%CO₂ ）。已經暴露於不同刺激次數的T細胞可以表現出不同的特徵。例如，典型的血液或單采的外周血單核細胞產物具有大於細胞毒性或抑制性T細胞群體（TC、CD8）的輔助T細胞群體（TH，CD4+）。通過刺激CD3和CD28受體離體擴增T細胞會產生T細胞群體，該T細胞群體在第8-9天之前主要由TH細胞組成，而約8-9天后T細胞群體包含越來越多的TC細胞群體。因此，取決於治療的目的，用主要由TH細胞組成的T細胞群體輸注受試者可以是有利的。類似地，如果TC細胞的抗原特異性亞組已經被分離，那麼其可以有利於更大程度地擴增該亞組。

此外，除了CD4和CD8標記，其它表型標記變化顯著，但是該變化在細胞擴增過程期間大部分是可再現的。因此，這種可再現性使能夠為特定目的定制激活的T細胞產品。

IV. 醫藥組合物

本申請還提供了醫藥組合物，其包含包含本文所述的任一種嵌合受體、多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統的任一種工程化免疫效應細胞和醫藥上可接受的載劑。醫藥組合物可以通過混合具有所需程度的純度的多個工程化免疫效應細胞與任選的醫藥上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）為凍幹製劑或水溶液形式來製備。

可接受的載體、賦形劑或穩定劑在採用的劑量和濃度下對於接受者是無毒的，並且包括緩衝劑、抗氧化劑（包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉）；防腐劑、等張劑（isotonicifier）、穩定劑、金屬絡合物（例如Zn-蛋白質絡合物）；螯合劑（例如EDTA）和/或非離子表面活性劑。

緩衝劑用於將pH控制在優化治療效果的範圍內，特別是如果穩定性是pH依賴性的情況下。緩衝劑較佳以從約50 mM至約250 mM的範圍內的濃度存在。本發明使用的合適的緩衝劑包括有機和無機酸及其鹽。例如，檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。另外，緩衝劑可以包含組胺酸和三甲基胺鹽例如Tris。

添加防腐劑以阻止微生物生長，並且通常以從0.2%-1.0% (w/v)的範圍內存在。本發明使用的合適的防腐劑包括十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮鹵化物（例如氯化物、溴化物、碘化物）、苄索氯銨；硫汞撒、苯酚、丁基或苄基醇；對羥基苯甲酸烷基酯（例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯）；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇、3-戊醇和間甲酚。

張度劑，有時也稱為“穩定劑”，存在以調節或保持組合物中液體的張度。當與大的帶電荷的生物分子（例如蛋白質和抗體）一起使用是，張度劑通常被稱為“穩定劑”，因為其可以與胺基酸側鏈的帶電荷基團相互作用，從而減少分子間和分子內相互作用的可能性。考慮其它成分的相對量，張度劑可以以重量計0.1%-25%較佳1-5%之間的任意量存在。較佳的張度劑包括多元糖醇，較佳三元或更高元糖醇，例如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。

額外的賦形劑包括能夠起以下一種或多種作用的劑：(1) 膨脹劑（bulking agent）、(2)溶解性增強劑、(3)穩定劑和(4)防止變性或粘附到容器壁的劑。這類賦形劑包括：多元糖醇（以上列舉的）；胺基酸例如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖（myoinisitose）、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、丙三醇、環醇類 (例如纖維醇)、聚乙二醇；含硫還原劑 （例如尿素、麩胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉）; 低分子量蛋白質（例如人血清白蛋白、 牛血清白蛋白、明膠或其它免疫球蛋白）；親水性聚合物（例如聚乙烯吡咯烷酮）；單糖 (例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二糖(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三糖（例如棉子糖）；以及聚糖（例如糊精或葡聚糖）。

非離子表面活性劑或去污劑（也稱為“潤濕劑”）存在以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白質免於攪拌引起的聚集，這還允許製劑暴露于剪切表面應力而不會引起活性治療性蛋白質或抗體變性。非離子表面活性劑以約0.05 mg/mL至約1.0 mg/mL，較佳約0.07 mg/mL至約0.2 mg/mL的範圍內存在。

合適的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯（20、40、60、65、80等）、泊洛沙姆（184、188等）、PLURONIC®多元醇、TRITON®、聚氧乙烯山梨醇酐單醚（TWEEN®-20、TWEEN®-80等）、聚桂醇400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻子油10、50和60、單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。可以使用的陰離子去污劑包括十二烷基硫酸鈉、十六烷磺基琥珀酸鈉和二辛基磺酸鈉。陽離子去污劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。

對於待用於體內施用的醫藥組合物，其必須是無菌的。可以通過過濾穿過無菌濾膜而使醫藥組合物無菌。本文的醫藥組合物通常被放置到具有無菌進入口的容器中，例如靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針穿透的塞的小瓶。

施用途徑根據已知的被接受的方法，例如在長時間內通過以合適的方式（例如通過皮下、靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、病灶內或關節內途徑注射或輸注、局部施用、吸入或通過持續釋放或緩釋方式）單次或多次推注或輸注。

如果被治療的特定指征需要的話，本文所述的醫藥組合物還可以含有多於一種活性化合物或劑，較佳具有互補活性的不會對彼此產生負面影響的那些。替代性地或另外地，組合物可以包含細胞毒性劑、化療劑、細胞因子、免疫抑制劑或生長抑制劑。這類分子適當地以對預期目的有效的量組合存在。

V. 治療癌症的方法

本申請還涉及在細胞免疫療法中使用的方法和組合物。在一些實施例中，細胞免疫療法用於治療癌症，包括但不限於惡性血液病和實體腫瘤。任一種本文所述的嵌合受體、多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統和工程化免疫效應細胞（例如工程化T細胞）可用於治療癌症的方法。

在一些實施例中，提供了一種治療個體（例如人個體）中的癌症（例如多發性骨髓瘤、急性淋巴細胞性白血病或慢性淋巴細胞性白血病）的方法，包括向個體施用有效量的醫藥組合物，所述醫藥組合物包含：(1) 包含嵌合受體的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），該嵌合受體包含：(a) 包含NKG2D結構域的胞外結構域；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域；和(2) 醫藥上可接受的載劑。在一些實施例中，嵌合受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：第一NKG2D結構域、第二NKG2D結構域、CD8　鉸鏈區、CD8　跨膜結構域、來源於4-1BB的刺激信號傳導結構域和來源於CD3　的初級胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種治療個體（例如人個體）中的癌症（例如多發性骨髓瘤、急性淋巴細胞性白血病或慢性淋巴細胞性白血病）的方法，包括向個體施用有效量的醫藥組合物，所述醫藥組合物包含：(1) 包含多特異性嵌合受體的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），該多特異性嵌合受體包含一條多肽鏈，該多肽鏈包含：(a)胞外結構域，其包含第一NKG2D結構域、第二NKG2D結構域和CD123結合結構域（例如IL-3結構域）；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域；和(2) 醫藥上可接受的載劑。在一些實施例中，CD123結合結構域是抗CD123抗體片段（例如scFv或VHH）。在一些實施例中，CD123結合結構域是IL-3結構域。在一些實施例中，多肽鏈從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、第一肽連接子、第一NKG2D結構域、第二肽連接子、第二NKG2D結構域、CD8　鉸鏈區、CD8　跨膜結構域、來源於4-1BB的刺激信號傳導結構域和來源於CD3　的初級胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種治療個體（例如人個體）中的癌症（例如多發性骨髓瘤、急性淋巴細胞性白血病或慢性淋巴細胞性白血病）的方法，包括向個體施用有效量的醫藥組合物，所述醫藥組合物包含：(1) 包含多特異性嵌合受體的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），該多特異性嵌合受體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含：(a)胞外結構域，其包含NKG2D結構域和CD123結合結構域（例如IL-3結構域）；(b) 跨膜結構域；和(c) 胞內信號傳導結構域；和(2) 醫藥上可接受的載劑。在一些實施例中，第一多肽鏈的NKG2D結構域經由一個或多個二硫鍵交聯至第二多肽鏈的NKG2D結構域。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈各自從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、肽連接子、NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，胞外結構域還包含置於NKG2D結構域和CD123結合結構域之間的二聚化基序（例如白胺酸拉鍊或半胱胺酸拉鍊）。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈各自從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、白胺酸拉鍊、NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。

在一些實施例中，提供了一種治療個體（例如人個體）中的癌症（例如多發性骨髓瘤、急性淋巴細胞性白血病或慢性淋巴細胞性白血病）的方法，包括向個體施用有效量的醫藥組合物，所述醫藥組合物包含：(1) 包含雙嵌合受體系統的工程化免疫效應細胞（例如T細胞），該雙嵌合受體系統包含：(i) 包含第一多肽鏈和第二多肽鏈的第一嵌合受體，每條多肽鏈包含：(a)包含NKG2D結構域的第一胞外結構域；(b) 第一跨膜結構域；和(c) 第一胞內信號傳導結構域；和(ii) 包含第三多肽鏈的第二嵌合受體，該第三多肽鏈包含：(a) 包含第二抗原結合結構域的第二胞外結構域；(b) 第二跨膜結構域；和任選的(c) 第二胞內信號傳導結構域；和(2) 醫藥上可接受的載劑。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈各自從N-末端至C-末端包含： NKG2D結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域、來源於4-1BB的刺激信號傳導結構域和來源於CD3ζ的初級胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，第二嵌合受體包含一條多肽鏈，該多肽鏈從N-末端至C-末端包含：IL-3結構域、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜結構域和任選的來源於4-1BB的刺激信號傳導結構域。

本文所述的方法適用於治療多種癌症，包括實體癌和液體癌。在一些實施例中，癌症是多發性骨髓瘤、急性淋巴細胞性白血病或慢性淋巴細胞性白血病。在一些實施例中，癌症是難治的或復發的癌症。本文所述的方法可用作第一療法、第二療法、第三療法或在輔助設置或新輔助設置中與本領域已知的其它類型的癌症療法的組合療法，其它類型的癌症療法例如化療、外科手術、放射、基因療法、免疫療、骨髓移植、幹細胞移植、靶向療法、冷凍療法、超聲療法、光動力療法、射頻消蝕或類似療法。

醫藥組合物的施用可以以任何便利的方式執行，例如注射、輸注、灌輸或移植。組合物可以經動脈、皮下、皮內、瘤內、結節內（intranodally）、髓內、肌內、靜脈內或腹腔內施用至患者。在一些實施例中，醫藥組合物經全身施用。在一些實施例中，醫藥組合物通過輸注施用至個體，例如靜脈內輸注。用於免疫療法的輸注技術是本領域已知的（參見，例如，Rosenberg等, New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)）。在一些實施例中，組合物通過靜脈內注射施用。

本發明的醫藥組合物的劑量和所需藥物濃度可以根據預想的特定用途改變。適當的施用劑量或途徑的確定是熟習此項技術者熟知的。動物實驗提供了確定人療法的有效劑量的可靠指導。可以遵循Mordenti, J.和Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,” InToxicokinetics and New Drug Development , Yacobi等, 編輯, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46主張的原則進行有效劑量的種間類推。不同劑型對於不同治療和不同病症有效以及意圖治療特定器官或組織的施用可能需要以與治療另一器官或組織的不同的方式遞送。

在一些實施例中，醫藥組合物的量在個體中有效地引起目標臨床反應。在一些實施例中，醫藥組合物的量在個體中有效地引起（部分或完全）疾病緩解。在一些實施例中，醫藥組合物的量在個體中有效地防止癌症的復發或疾病進展。在一些實施例中，醫藥組合物的量在個體中有效地延長生存（例如無疾病生存）。在一些實施例中，醫藥組合物在個體中有效地改善生活質量。

在一些實施例中，醫藥組合物的量有效地抑制實體瘤或淋巴瘤的生長或減小實體瘤或淋巴瘤的尺寸。在一些實施例中，實體瘤或淋巴瘤的尺寸減小至少約10%（包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中任一個）。

在一些實施例中，醫藥組合物的量在個體中有效地抑制腫瘤轉移。在一些實施例中，至少約10%（包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中任一個）轉移被抑制。在一些實施例中，提供了一種抑制轉移到淋巴結的方法。在一些實施例中，提供了一種抑制轉移到肺的方法。可以通過本領域任何已知的方法評估轉移，例如通過血液測試、骨掃描、x射線掃描、CT掃描、PET掃描和活組織檢查。

VI. 套組和製品

還提供了包含本文所述的任一種嵌合受體、多特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統或工程化免疫效應細胞的套組、單位劑量和製品。在一些實施例中，提供了一種套組，其包含本文所述的任一種醫藥組合物並且較佳提供用於使用該套組的說明書。

本申請的套組在合適的包裝中。合適的包裝包括但不限於，小瓶、瓶、罐、軟包裝（例如密封Mylar或塑膠帶）和類似包裝。套組可以任選地提供額外的組件，例如緩衝器和解釋信息。因此，本申請還提供了製品，其包括小瓶（例如密封小瓶）、瓶、罐、軟包裝等。

製品可包含容器和在容器上或與容器連接的標簽或包裝插入物。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多種材料例如玻璃或塑膠製成。一般地，容器容納本文所述的有效治療疾病或病症（例如癌症）的組合物，並且可以具有無菌進入孔口（例如容器可以是具有可被皮下注射針穿透的塞的靜脈內溶液袋或小瓶）。標簽或包裝插入物表明該組合物用於治療個體中的特定病症。標簽或包裝插入物還會包含用於將該組合物施用至個體的說明書。標簽可以指示覆水和/或使用的指導。容納醫藥組合物的容器可以是多此次使用的小瓶，其允許重複施用（例如2-6次施用）複水劑型。包裝插入物是指慣例包括在治療產品的商業包裝中的說明書，其含有關於涉及這類治療產品使用的指征、用法、劑量、施用、禁忌症和/或警告。另外，製品還可以包含第二容器，其包含醫藥上可接受的緩衝劑，例如用於注射的抑菌水（BWFI）、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液（Ringer's solution）和葡萄糖溶液。其還可以包含從商業和用戶角度需要的其它材料，包括其它緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。

套組或製品可以包含以足以在藥房（例如醫院藥房和複方藥房）存儲和使用的量包裝的多個單位劑量的醫藥組合物和使用說明書。

實例

以下實例意圖僅僅為本申請的示例，並且因此不應該被認為以任何方式限制本發明。通過示例性說明的方式而不通過限制的方式提供以下實例和詳細描述。

實例1. NKG2D× IL-3嵌合受體和雙NKG2D/IL-3嵌合受體系統的製備

該實例描述了典型的雙特異性嵌合受體、雙嵌合受體系統和工程化T細胞的設計和製備。

雙特異性嵌合受體和雙嵌合受體系統構建體的設計

表1和表2示出了七種構建體的組成和相應的序列。

構建體1：單體NKG2D× IL-3嵌合受體（LIC2001）。該雙特異性嵌合受體包含單一多肽鏈，該多肽鏈從N-末端至C-末端包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域，其中胞外結構域從N-末端至C-末端包含對CD123結合具有特異性的IL-3結構域、第一肽連接子、在其N-末端具有工程化的精胺酸殘基的第一NKG2D結構域、第二肽連接子和在其C-末端具有工程化的天冬胺酸殘基的第二NKG2D結構域。NKG2D結構域在二聚化後負責NKG2D配位體結合。工程化的精胺酸和天冬胺酸殘基可以彼此連接以阻止NKG2D二聚體與未與腫瘤細胞結合的游離的NKG2D配位體結合。核酸構建體編碼該單一多肽鏈。

構建體2：單體NKG2D× IL-3嵌合受體（LIC2001-1）。該雙特異性嵌合受體包含單一多肽鏈，該多肽鏈從N-末端至C-末端包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域，其中胞外結構域從N-末端至C-末端包含對CD123結合具有特異性的IL-3結構域、第一肽連接子、第一NKG2D結構域、第二肽連接子和第二NKG2D結構域。NKG2D結構域在二聚化後負責NKG2D配位體結合。核酸構建體編碼該單一多肽鏈。為了進行比較，構建了單特異性NKG2D嵌合受體（LIC2001-2），其從N-末端至C-末端包含：包含第一正向NKG2D結構域、肽連接子和第二正向NKG2D結構域的胞外結構域；跨膜結構域（CD8　）和胞內信號傳導結構域（4-1BB和CD3　）。LIC2001-2的胺基酸序列是SEQ ID NO: 33，LIC2001-2的核酸序列是SEQ ID NO: 38。

構建體3：具有白胺酸拉鍊基序的二聚NKG2D× IL-3嵌合受體（LIC2002）。該雙特異性嵌合受體包含兩條相同的多肽鏈，每條多肽鏈從N-末端至C-末端包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域，其中胞外結構域從N-末端至C-末端包含對CD123結合具有特異性的IL-3結構域、白胺酸拉鍊基序和反向NKG2D結構域，該NKG2D結構域在同型二聚化後負責NKG2D配位體結合。核酸構建體編碼單一拷貝的多肽鏈。

構建體4：不具有白胺酸拉鍊基序的二聚NKG2D× IL-3嵌合受體（LIC2002-1）。該雙特異性嵌合受體包含兩條相同的多肽鏈，每條多肽鏈從N-末端至C-末端包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域，其中胞外結構域從N-末端至C-末端包含對CD123具有特異性的IL-3結構域、肽連接子和反向NKG2D結構域，該NKG2D結構域同型二聚化後負責NKG2D配位體結合。核酸構建體編碼單一拷貝的多肽鏈。

構建體5：具有白胺酸拉鍊基序的二聚NKG2D× IL-3嵌合受體（LIC2002-2）。該雙特異性嵌合受體包含兩條相同的多肽鏈，每條多肽鏈從N-末端至C-末端包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域，其中胞外結構域從N-末端至C-末端包含對CD123結合具有特異性的IL-3結構域、白胺酸拉鍊基序和正向NKG2D結構域，該NKG2D結構域在同型二聚化後負責NKG2D配位體結合。核酸構建體編碼單一拷貝的多肽鏈。

構建體6：雙NKG2D/IL-3嵌合受體系統（LIC2003）。設計了雙NKG2D/IL-3嵌合受體系統的多順反子核酸構建體。該構建體編碼第一多肽和第二多肽，該第一多肽從N-末端至C-末端包含：包含同型二聚化後負責NKG2D配位體結合的反向NKG2D結構域和正向NKG2D結構域的胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域，隨後是T2A自切割肽，並且該第二多肽從N-末端至C-末端包含：對CD123結合具有特異性的IL-3結構域、隨後是跨膜結構域，沒有胞內信號傳導結構域。構建體表現後，第一多肽形成第一嵌合受體，第二多肽形成第二嵌合受體。

構建體7：雙NKG2D/IL-3嵌合受體系統（LIC2004）。設計了雙NKG2D/IL-3嵌合受體系統的多順反子核酸構建體。該構建體編碼第一多肽和第二多肽，該第一多肽從N-末端至C-末端包含：包含同型二聚化後負責NKG2D配位體結合的正向NKG2D結構域的胞外結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域，隨後是T2A自切割肽，並且該第二多肽從N-末端至C-末端包含：對CD123結合具有特異性的IL-3結構域、隨後是跨膜結構域，沒有胞內信號傳導結構域。構建體表現後，兩個拷貝的第一多肽形成二聚的第一嵌合受體，第二多肽形成第二嵌合受體。構建了單特異性NKG2D嵌合受體（LIC2004-1），其從N-末端至C-末端包含：包含正向NKG2D結構域的胞外結構域、CD8α鉸鏈結構域；跨膜結構域（CD8α）和胞內信號傳導結構域（4-1BB和CD3ζ）。LIC2004-1的胺基酸序列是SEQ ID NO: 35，LIC2004-1的核酸序列是SEQ ID NO: 40。

生成慢病毒表現載體

簡言之，由GenScript使用pLVX-Puro (Clontech#632164)通過使用EcoR I和Xba I用人延長因子1α啟動子（hEF1α）基因代替原來的啟動子來修飾慢病毒。由GenScript構建NKG2D × IL-3嵌合受體基因或NKG2D/IL-3雙嵌合受體系統基因，並且經由EcoR I/Hpa I將其克隆到載體中，以提供重組慢病毒表現質體，該表現質體進一步進行慢病毒包裝程序。

將包括pMDLg/pRRE (Addgene#12251)、pRSV-Rev (Addgene#12253) 和pMD2.G (Addgene#12259)的慢病毒包裝質體混合物與pLVX- NKG2D × IL-3嵌合受體/雙嵌合受體系統-Puro表現質體以與聚醚醯亞胺預先優化的比率預先混合，然後恰當地混合，並且在室溫下溫育5分鐘。然後將轉染混合物逐滴添加到293FT細胞並輕輕混合。此後，將細胞在37℃和5% CO₂ 細胞培養箱內溫育過夜。在4°C, 500 g離心10分鐘後收集上清液。將上清液過濾通過0.45μm PES過濾器後，用20%蔗糖梯度超離心濃縮病毒上清液。離心後，小心棄置上清液，用預冷的DPBS仔細沖洗病毒片狀沈澱。然後量測病毒的濃度。將病毒恰當地等分成試樣，然後立即保存在-80℃。基於GenScript開發的HTRF套組通過p24確定病毒效價。對應於以上所述的七種構建體中的每個製備以下重組慢病毒表現質體：pLLV-LIC2001、pLLV-LIC2001-1、pLLV-LIC2002、pLLV-LIC2002-1、pLLV-LIC2002-2、pLLV-LIC2003和pLLV-LIC2004以及pLLV-LIC2001-2和pLLV-LIC2004-1。

PBMC製備

採集白血球，在R10培養基中將細胞濃度調整至5x10⁶ 個細胞/mL。然後將白血球與0.9% NaCl溶液以1:1（v/v）比率混合。將3 mL lymphoprep培養基添加到15 mL離心管中，在lymphoprep的頂層緩慢分層出6 mL稀釋的淋巴細胞混合物。將淋巴細胞混合物在20°C在800 g無制動離心30分鐘。然後用200 μL移液管收集淋巴細胞白膜層（buffy coat）。將收集的部分用至少6倍的0.9% NaCl或R10稀釋以降低溶液的密度。然後將收集的部分在20℃在250 g離心10分鐘。完全吸走上清液，向細胞片狀沈澱添加10 mL的R10。將混合物在20℃在250進一步離心10分鐘。然後吸走上清液。向細胞片狀沈澱添加2 mL 37°C預溫熱的具有100IU/mL IL-2的R10，然後將細胞片狀沈澱輕柔地重懸。然後計數細胞的數目，將PBMC樣品準備用於以後的實驗。

T細胞純化

使用Miltenyi Pan T細胞分離套組（Cat#130-096-535）如下遵循製造商提供的方案從PBMC中純化出人T細胞。首先確定細胞數目。將細胞懸液在300 g離心10分鐘。然後完全吸去上清液，將細胞片狀沈澱以每10⁷個總細胞重懸於40μL緩衝液中。每10⁷個總細胞添加10μL的Pan T細胞生物素-抗體混合物（Pan T Cell Biotin-Antibody Cocktail），完全混合，在冰箱中（2~8°C）溫育約5分鐘。然後每10⁷ 個細胞添加30μL緩衝液。每10⁷ 個細胞添加20μL Pan T細胞微珠粒混合物（Pan T Cell MicroBead Cocktail）。將混合物很好地混合，在冰箱中（2~8°C）溫育另外的10分鐘。磁性分離最少需要500 μL。將LS柱放置在合適的MACS分離器的磁場中。通過用3 mL的緩衝液沖洗來製備柱。然後將細胞懸液施加到柱上，收集含未標記的細胞的流過液（flow-through），這代表富集的T細胞部分。然後通過用3 mL緩衝液洗滌柱，收集代表富集的T細胞的穿過的未標記的細胞，並且與來自前面步驟的流過液合併，來收集T細胞。然後將T細胞重懸於R10+100IU/mL IL-2中。然後在轉導之前用人T細胞激活/擴增套組（Miltenyi #130-091-441）預先激活初級T細胞持續3天。

用每種重組慢病毒轉染純化的T細胞，或用編碼每種嵌合受體構建體的mRNA通過電穿孔轉染純化的T細胞，然後在37^o C, 5% CO₂ 培養箱中溫育過夜。製備表現本實例中所述的七種構建體中每一個的工程化T細胞。

在工程化T細胞上表現嵌合受體

通過電穿孔將編碼LIC2002-2和LIC2004嵌合受體構建體的mRNA分子分別遞送至T細胞。使用流式細胞術測定檢測嵌合受體的表現。簡言之，收集電穿孔的T細胞，並且用DPBS沖洗，然後將其重懸於含有2 　L PE-綴合的CD314蛋白（MILTENYI BIOTEC, 130-111-645）的100 　L DPBS中用於NKG2D結構域檢測，或重懸於10 μL PE-綴合的抗-IL-3抗體（MILTENYI BIOTEC, 130-096-084）的100 　L DPBS中用於IL-3結構域檢測。將反應混合物在4^o C溫育20分鐘。隨後，將細胞用200 　L DPBS洗滌，重懸於DPBS中，並通過流式細胞術分析。如圖2所示，工程化T細胞表現具有NKG2D和IL-3結構域二者的一個或多個嵌合受體。

體外細胞毒性測定

收集工程化細胞，並將其接種到384孔反應板中。靶細胞是重組表現CD123的人慢性骨髓性白血病（CML）細胞株K562-Luc和K562-CD123-Luc。所有細胞株被內部工程化以表現螢火蟲螢光素酶。為了測定工程化T細胞對腫瘤細胞的細胞毒性，將工程化T細胞與靶細胞以20:1的效應細胞（工程化T細胞）:靶細胞的比率(“E:T比率”)共同溫育20小時。根據製造商的方案製備ONE-GLO^TM 發光螢光素酶測定試劑（Promega#E6110），將其添加到共培養的細胞，以檢測每個孔中剩餘的熒光素酶活性。由於螢光素酶僅在靶細胞中表現，孔中剩餘的螢光素酶活性與孔中有活力的靶細胞的數目直接相關。通過在效應細胞不存在的情況下向靶細胞添加培養基來獲得最大螢光素酶活性。通過添加最終濃度為1%的Triton X-100作為陽性對照確定最小螢光素酶活性。根據公式具體的裂解/細胞毒性%=100%×[1-(LUC樣品-LUC最小)/(LUC最大-LUC最小)]計算具體的裂解/細胞毒性。螢光素酶值（“LUC”或發光）與每個反應孔中有活力的細胞的數量成正比。

如圖3A所示，表現LIC2001-1的T細胞（76.63±4.58%）、表現LIC2002-2的T細胞（96.52±1.68%）和表現LIC2004的T細胞（96.89±0.70%）證明對K562-CD123-Luc具有顯著殺傷效應。如圖3B所示，觀察到對K562-Luc細胞的殺傷效應：表現LIC2001-1的T細胞（35.98±6.08%）、表現LIC2002-2的T細胞（94.42±2.66%）、表現LIC2004的T細胞（95.87±1.61%）。但是，表現不同NKG2D × IL-3嵌合受體構建體的工程化T細胞針對K562-CD123-Luc細胞比針對K562-Luc細胞顯示出更高的細胞毒性。

將表現LIC2002-2的T細胞和表現LIC2004的T細胞與人急性骨髓性白血病（AML）細胞株KG1-Luc以10:1、5:1或2.5:1的效應細胞（工程化T細胞）:靶細胞比率共同溫育，以測定針對KG1-Luc的體外細胞毒性。如圖3C所示，對於表現LIC2002-2的T細胞(83.68±7%、78.55±4%和60.87±10%)和表現LIC2004的T細胞(85.6±3%、76.89±4%和75.53±1%)觀察到有力的且劑量依賴性的細胞毒性效應。

比較了不同效應細胞:靶細胞比率的情況下表現LIC2002-2的T細胞、表現LIC2004的T細胞和表現LIC2004-1 的T細胞針對K562-CD123-Luc的細胞毒性活性。LIC2004-1構建體是LIC2004雙嵌合受體系統中的NKG2D嵌合受體。結果在圖4中示出。Y軸顯示特定殺傷的百分數，X軸顯示效應細胞:靶細胞（即工程化T細胞: K562-CD123-Luc細胞）比率的自然對數。將E:T比率的對數相對於特定殺傷的百分數作圖，通過線性回歸將其擬合為虛線。較小斜率的擬合線表示較強的殺傷能力。結果證明，LIC2004雙嵌合受體系統比相應的單獨NKG2D嵌合受體（即LIC2004-1）具有更高的功效（p=0.031）。雙特異性嵌合受體構建體LIC2002-2和LIC2004的功效之間不具有顯著差異（p=0.277）。使用Graphpad Prism 6進行統計學分析。

作用機制

進行一系列體外細胞毒性測定，以研究表現NKG2D × IL-3嵌合受體構建體的工程化T細胞的機制。首先，將“NKG2D-CD123 T細胞” (表現LIC2004的T細胞)、“NKG2D T細胞” (表現NKG2D-CD8鉸鏈-CD8TM-4-1BB-CD3　的　細胞)和“CD123結合T細胞” (表現IL3-CD8鉸鏈-CD8TM的T細胞)與靶K562-CD123-luc和K562-luc細胞分別以20:1的E:T比率共培養。

如圖5A所示，NKG2D-CD123 T細胞(70.59±1.5%)顯示出顯著的腫瘤殺傷效應，而NKG2D T細胞的腫瘤殺傷效應（42.14±8.4%）弱得多，CD123結合T細胞顯示出對靶腫瘤細胞不具有細胞毒性。在圖5B中，NKG2D-CD123 T細胞也顯示出針對K562-luc細胞的顯著的細胞毒性（88.28±6.58%），而NKG2D T細胞顯示出針對K562-luc細胞的較低的細胞毒性(66.68±2.87%)，CD123結合T細胞不具有針對K562-luc細胞的細胞毒性(-46.98±11.22%)。此等結果表明，NKG2D-CD123 T細胞比NKG2D T細胞更有效。

此外，在存在或不存在可溶性MICA的情況下進行細胞毒性測定，當以20:1的E:T比率與靶細胞（K562-Luc或K562-CD123-Luc）共培養時，分別用重組MICA蛋白或BSA蛋白阻斷NKG2D-CD123 T細胞（LIC2002-2或LIC2004）。將濃度為0 ng/mL、100ng/mL或1000 ng/mL的MICA或BSA添加至共培養物中。不用mRNA電穿孔的T細胞充當陰性對照。

如圖6A-6B所示，用測試的高濃度的MICA處理能夠阻斷NKG2D結構域，並且降低表現LIC2002-2的T細胞和表現LIC2004的T細胞的細胞毒性活性。用非特異性BSA處理未顯著影響工程化T細胞針對腫瘤細胞的細胞毒性。

如圖7所示，表現LIC2002-2的T細胞和表現LIC2004的T細胞與K562-CD123-Luc或K562-Luc細胞以20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1或0.625:1的效應細胞（工程化T細胞）：靶細胞比率共溫育。結果顯示LIC2004和LIC2002-2對K562細胞株的劑量依賴性殺傷作用。在表現NKG2D和CD123二者的K562細胞株上觀察到比僅表現NKG2D的K562細胞株更強的殺傷效應。

IFNγ釋放

表現LIC2002-2、LIC2004或LIC2004-1構建體的工程化T細胞分別與K562-CD123-Luc、K562-Luc或KG1-Luc細胞株共溫育20小時。收集來自共培養物的上清液，並對其評估以確定細胞因子釋放水準（例如干擾素γ（IFNγ）釋放）。

圖8A示出了工程化T細胞與CD123陽性K562-CD123-Luc共培養20小時後無細胞上清液中的IFNγ的水準。分泌的IFNγ水準是1526.51±92.13 pg/mL (LIC2002-2)、1089.36±8.06 pg/mL (LIC2004)、687.62±31.65 pg/mL (LIC2004-1)和64.15±16.56 pg/mL（無RNA對照）。在無T細胞對照中檢測不到IFNγ。

圖8B示出了工程化T細胞與K562-Luc共培養20小時後無細胞上清液中IFNγ的水準。分泌的IFNγ的水準是3416.67±71.15 pg/mL (LIC2002-2)、3063.46±119.46 pg/mL (LIC2004)、1841.41±222.18 pg/mL (LIC2004-1)和3.99±11.57 pg/mL（無RNA對照）。在無T細胞對照中檢測不到IFNγ。

圖8C示出了工程化T細胞與KG1-Luc共培養20小時後無細胞上清液中的IFNγ的水準。分泌的IFNγ水準是267.75±34.33 pg/mL (LIC2002-2)、265.87±12.19 pg/mL (LIC2004)、236.56±16.45pg/mL (LIC2004-1)和220.56±80.5 pg/mL（無RNA對照）。在無T細胞對照中檢測不到IFNγ。

無

圖1A示出了示例性的雙特異性嵌合受體（LIC2001）的示意圖，該雙特異性嵌合受體包含含有IL-3結構域和兩個NKG2D結構域的單一多肽鏈。在第一NKG2D結構域（例如反向NKG2D結構域）的N末端帶正電荷的殘基（R）被工程化，並且在第二NKG2D結構域（例如正向NKG2D結構域）的C末端帶負電荷的殘基（D）被工程化。工程化的R和D殘基互相形成一個鹽橋以促進二聚化。

圖1B示出了示例性的雙特異性嵌合受體（LIC2001-1）的示意圖，該雙特異性嵌合受體包含含有IL-3結構域和兩個NKG2D結構域的單一多肽鏈。

圖1C示出了示例性的包含兩條多肽鏈的雙特異性嵌合受體的示意圖，每條多肽鏈包含IL-3結構域、白胺酸拉鍊基序和NKG2D結構域。每條多肽鏈的白胺酸拉鍊基序促進二聚化。另外，NKG2D結構域可以經由二硫鍵彼此交聯。LIC2002包含IL-3結構域、白胺酸拉鍊基序和反向NKG2D結構域。LIC2002-2包含IL-3結構域、白胺酸拉鍊基序和正向NKG2D結構域。

圖1D示出了示例性的包含兩條多肽鏈的雙特異性嵌合受體（LIC2002-1）的示意圖，每條多肽鏈包含IL-3結構域和NKG2D結構域。NKG2D結構域經由二硫鍵彼此交聯。

圖1E示出了示例性的雙嵌合受體系統（LIC2003）的示意圖，該雙嵌合受體系統包含靶向NKG2D配位體的第一嵌合受體和靶向CD123的第二嵌合受體。第一嵌合受體包含一條包含兩個NKG2D結構域的多肽鏈，兩個NKG2D結構域可以經由二硫鍵彼此交聯。第二嵌合受體包含IL-3結構域。第二嵌合受體可以或可以不含有胞內信號傳導結構域。

圖1F示出了示例性的雙嵌合受體系統（LIC2004）的示意圖，該雙嵌合受體細胞包含靶向NKG2D配位體的第一嵌合受體和靶向CD123的第二嵌合受體。第一嵌合受體包含兩條多肽鏈，每條多肽鏈包含單一的NKG2D結構域，其中NKG2D結構域經由二硫鍵彼此交聯。第二嵌合受體包含IL-3結構域。第二嵌合受體可以或可以不含有胞內信號傳導結構域。該圖示出了示例性的不具有胞內信號傳導結構域的第二IL-3嵌合受體。

圖2示出了通過流式細胞術確定的在工程化T細胞中的NKG2D × IL-3嵌合受體構建體（LIC2004和LIC2002-2）的表現。

圖3A-3C示出了表現多種NKG2D × IL-3嵌合受體構建體的工程化T細胞針對腫瘤細胞K562-CD123-Luc (圖3A)、K562-Luc (圖3B)和KG1-Luc (圖3C)的體外細胞毒性活性。

圖4示出了比較表現多種嵌合受體構建體的工程化T細胞針對K562-CD123-Luc的劑量依賴性的細胞毒性活性的圖。

圖5A-5B示出了表現多種構建體的工程化T細胞針對腫瘤細胞K562-CD123-Luc (圖5A)和K562-Luc (圖5B)的細胞毒性活性。“NKG2D-CD123結合物”指定表現LIC2004雙嵌合受體系統的工程化T細胞。“NKG2D”指定僅表現LIC2004雙嵌合受體系統中的包含NKG2D結構域的嵌合受體（即LIC2004-1）的工程化T細胞。“CD123結合物”指定僅表現LIC2004雙嵌合受體系統中的包含IL-3結構域的嵌合受體的工程化T細胞。

圖6A示出了MICA（NKG2D的同源配位體）對表現NKG2D × IL-3嵌合受體構建體的工程化T細胞殺死K562-CD123-Luc和K562-Luc細胞的阻斷作用。圖6B示出了BSA對表現NKG2D × IL-3嵌合受體構建體的工程化T細胞殺死K562-CD123-Luc和K562-Luc細胞不具有顯著阻斷作用。

圖7示出了表現LIC2004和LIC2002-2構建體的工程化T細胞針對K562和K562-CD123-Luc腫瘤細胞的細胞毒性活性。

圖8A-8C示出了通過將表現LIC2002-2、LIC2004和LIC2004-1構建體的工程化T細胞與K562-CD123-Luc、K562-Luc和KG1-Luc細胞株共培養，IFNγ的分泌水準。

Claims (30)

1. 一種嵌合受體，其包含一條多肽鏈，所述多肽鏈包含： (a) 包含NKG2D結構域的胞外結構域； (b) 跨膜結構域；以及 (c) 胞內信號傳導結構域。
2. 一種多特異性嵌合受體，其包含一條多肽鏈，所述多肽鏈包含： (a) 胞外結構域，所述胞外結構域包含第一NKG2D結構域、第二NKG2D結構域和第二抗原結合結構域； (b) 跨膜結構域；以及 (c) 胞內信號傳導結構域。
3. 如申請專利範圍第2項所述的多特異性嵌合受體，其中所述胞外結構域從N-末端至C-末端包含：所述第二抗原結合結構域、所述第一NKG2D結構域和所述第二NKG2D結構域。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的嵌合受體，其中所述第二抗原結合結構域經由肽連接子融合至所述第一NKG2D結構域。
5. 一種多特異性嵌合受體，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每條多肽鏈包含： (a) 胞外結構域，所述胞外結構域包含NKG2D結構域和第二抗原結合結構域； (b) 跨膜結構域；以及 (c) 胞內信號傳導結構域。
6. 如申請專利範圍第5項所述的多特異性嵌合受體，其中每個胞外結構域還包含二聚化基序。
7. 如申請專利範圍第6項所述的多特異性嵌合受體，其中所述二聚化基序置於所述NKG2D結構域和所述第二抗原結合結構域之間。
8. 如申請專利範圍第6項或第7項所述的多特異性嵌合受體，其中所述二聚化基序是白胺酸拉鍊。
9. 如申請專利範圍第8項所述的多特異性嵌合受體，其中所述第二抗原結合結構域經由肽連接子融合至所述NKG2D結構域。
10. 如申請專利範圍第5項至第9項中任一項所述的多特異性嵌合受體，其中所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈每個從N-末端至C-末端包含：所述第二抗原結合結構域、所述NKG2D結構域、所述跨膜結構域和所述胞內信號傳導結構域。
11. 一種雙嵌合受體系統，其包含： (i) 第一嵌合受體，所述第一嵌合受體包含： (a) 包含NKG2D結構域的第一胞外結構域； (b) 第一跨膜結構域；以及 (c) 第一胞內信號傳導結構域；以及 (ii) 第二嵌合受體，所述第二嵌合受體包含： (a) 包含第二抗原結合結構域的第二胞外結構域；以及 (b) 第二跨膜結構域。
12. 如申請專利範圍第11項所述的雙嵌合受體系統，其中所述第二嵌合受體還包含第二胞內信號傳導結構域。
13. 如申請專利範圍第2項至第10項中任一項所述的多特異性嵌合受體或如申請專利範圍第11項或第12項所述的雙嵌合受體系統，其中所述第二抗原結合結構域是抗體片段。
14. 如申請專利範圍第13項所述的多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統，其中所述抗體片段特異性結合選自由CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、CD138、c-Met、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77組成的組的抗原。
15. 如申請專利範圍第2項至第10項中任一項所述的多特異性嵌合受體或如申請專利範圍第11項或第12項所述的雙嵌合受體系統，其中所述第二抗原結合結構域是配位體或配位體結合結構域。
16. 如申請專利範圍第15項所述的多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統，其中所述配位體或配位體結合結構域來源於選自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80組成的組的分子。
17. 如申請專利範圍第16項所述的多特異性嵌合受體或雙嵌合受體系統，其中所述第二抗原結合結構域是IL-3結構域。
18. 如申請專利範圍第1項至第10項或第13項至第17項中任一項所述的嵌合受體或如申請專利範圍第11項至第17項中任一項所述的雙嵌合受體系統，其中所述NKG2D結構域或所述第一NKG2D結構域和/或所述第二NKG2D結構域包含SEQ ID NO: 7或8的胺基酸序列。
19. 如申請專利範圍第1項至第10項或第13項至第18項中任一項所述的嵌合受體或如申請專利範圍第11項至第18項中任一項所述的雙嵌合受體系統，其中所述跨膜結構域或所述第一跨膜結構域和/或所述第二跨膜結構域來源於選自由CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1組成的組的分子。
20. 如申請專利範圍第1項至第10項或第13項至第19項中任一項所述的嵌合受體或如申請專利範圍第11項至第19項中任一項所述的雙嵌合受體系統，其中所述胞內信號傳導結構域或所述第一胞內信號傳導結構域和/或所述第二胞內信號傳導結構域包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導結構域。
21. 如申請專利範圍第1項至第10項或第13項至第20項中任一項所述的嵌合受體或如申請專利範圍第11項至第20項中任一項所述的雙嵌合受體系統，其中所述胞內信號傳導結構域或所述第一胞內信號傳導結構域和/或所述第二胞內信號傳導結構域包含共刺激信號傳導結構域。
22. 如申請專利範圍第21項所述的嵌合受體或雙嵌合受體系統，其中所述共刺激信號傳導結構域來源於選自由CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、ICOS、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位體及其組合組成的組的共刺激分子。
23. 一種嵌合受體，其包含與選自由SEQ ID NO: 16-20和33-35組成的組的胺基酸序列具有至少約85%序列同一性的胺基酸序列。
24. 一種多肽，其包含與SEQ ID NO: 36或37的胺基酸序列具有至少約85%序列同一性的胺基酸序列。
25. 一種分離的核酸，其包含編碼如申請專利範圍第1項至第10項或第13項至第23項中任一項所述的嵌合受體的核酸序列。
26. 一種分離的核酸，其編碼如申請專利範圍第11項至第22項中任一項所述的雙嵌合受體系統，所述分離的核酸包含編碼所述第一嵌合受體的第一核酸序列和編碼所述第二嵌合受體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列經由編碼自切割肽的第三核酸序列與所述第二核酸序列可操作地連接。
27. 一種分離的核酸，其包含與選自由SEQ ID NO: 21-27和SEQ ID NO: 38-40組成的組的核酸序列具有至少約85%序列同一性的核酸序列。
28. 一種工程化免疫效應細胞，其包含如申請專利範圍第1項至第23項中任一項所述的嵌合受體或雙嵌合受體系統或如申請專利範圍第25項至第27項中任一項所述的分離的核酸。
29. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第28項所述的工程化免疫效應細胞和醫藥上可接受的載劑。
30. 一種治療個體中癌症的方法，其包含向所述個體施用有效量的如申請專利範圍第29項所述的醫藥組合物。