TW201930351A - 雙特異性抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係提供一種新穎的藥劑，係用於自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制或治療。本發明之發明者等經過精心檢討的結果，著眼於PD-1/CD19雙特異性抗體作為可解決上述課題之物質，進而完成本發明。本發明之PD-1/CD19雙特異性抗體顯示活化B細胞之增殖抑制作用及免疫球蛋白產生抑制作用，再者，亦具有抑制從記憶T細胞產生細胞激素之作用。

Description

雙特異性抗體
本發明係關於對在同一B細胞上表現之PD-1及CD19可分別特異性結合之雙特異性抗體(以下，簡稱為PD-1/CD19雙特異性抗體)以及其醫藥治療用途。
PD-1係屬於免疫球蛋白家族之免疫抑制受體，係具有抑制由設來自抗原受體之刺激而活化的T細胞之免疫活化訊號的功能之分子。從PD-1基因剔除小鼠的解析等已知，PD-1訊號係在自體免疫性擴張性心肌症、類紅斑性狼瘡症候群、自體免疫性腦脊髄炎、全身性紅斑狼瘡、移植物抗宿主病、第一型糖尿病及類風濕性關節炎等自體免疫疾病的抑制中發揮重要的作用。因此，增強PD-1訊號之物質已被指稱可成為自體免疫疾病之預防或治療之劑。
另一方面，CD19係在B細胞表現之膜蛋白，與B細胞受體複合體一起對B細胞傳遞刺激之分子。
目前為止，增強PD-1訊號之物質，已知有辨識PD-1之雙特異性抗體(專利文獻1至3)。此等雙特異性抗體，係將辨識屬於T細胞受體複合體成員之CD3之抗 體的抗原辨識部位與辨識PD-1之抗體的抗原辨識部位以基因工程連結而成者，具有藉由使PD-1置於T細胞受體複合體附近的頻率上升，而增強對T細胞受體複合體之PD-1的抑制訊號之作用。進一步，在此等專利文獻中，亦記載PD-1雙特異性抗體可使用於自體免疫疾病的預防或治療。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：國際公開第2003/011911號說明書
專利文獻2：國際公開第2004/072286號說明書
專利文獻3：國際公開第2013/022091號說明書
本發明之目的係提供一種新穎的藥劑，係用於自體免疫疾病的預防、症狀進展抑制、復發抑制或治療。
本發明之發明者等經過精心檢討的結果，著眼於將PD-1/CD19雙特異性抗體作為可解決上述課題之物質，進而完成本發明。
亦即，本發明係如下所述。
[1]一種PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂(以下，有簡稱為第一臂 之情形)及與CD19特異性結合之第二臂(以下，有簡稱為第二臂之情形)。
[2]如前項[1]記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，該第一臂包含與PD-1特異性結合之抗體(以下，稱為抗PD-1抗體)之重鏈可變區域(以下，簡稱為VH)及輕鏈可變區域(以下，簡稱為VL)。
[3]如前項[1]或[2]記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，該第二臂包含與CD19特異性結合之抗體(以下，稱為抗CD19抗體)之VH及VL。
[4]如前項[2]或[3]記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係具有從N末端開始依序為抗PD-1抗體之VH、抗CD19抗體之VL、抗CD19抗體之VH及抗PD-1抗體之VL且各別通過胜肽連接子或者是直接連結而成的結構。
[5]如前項[2]或[3]記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係具有從N末端開始依序為抗PD-1抗體之VL、抗PD-1抗體之VH、抗CD19抗體之VH及抗CD19抗體之VL且各別通過胜肽連接子或者是直接連結而成的結構。
[6]如前項[2]或[3]記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係具有從N末端開始依序為抗CD19抗體之VL、抗PD-1抗體之VH、抗PD-1抗體之VL及抗CD19抗體之VH且各別通過胜肽連接子或者是直接連結而成的結構。
[7]如前項[4]至[6]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係具有進一步在前項[4]記載之抗PD-1抗體之VL、在前項[5]記載之抗CD19抗體之VL或在前項[6]記載之CD19抗體之VH之C末端與具有絞鍊(hinge)部位至CH3區域之人類IgG恆定區域(以下，有簡稱為「IgG恆定區域(絞鍊/CH3)」之情形)的多肽之N末端通過胜肽連接子或者是直接連結而成之結構。
[8]如前項[2]或[3]記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係具有從N末端開始依序為抗CD19抗體之VL、抗CD19抗體之VH、IgG恆定區域(絞鍊/CH3)，抗PD-1抗體之VH及抗PD-1抗體之VL且各別通過胜肽連接子或者是直接連結而成的結構。
[9]如前項[7]或[8]記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係具有進一步包含含有IgG恆定區域(絞鍊/CH3)之多肽的結構。
[10]如前項[4]至[9]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，胜肽連接子為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號1；以下，簡稱為(Gly)×4-Ser)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列編號2；以下，簡稱為((Gly)×4-Ser)×3)。
[11]如前項[1]至[3]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係雙抗體(diabody)、雙特異性sc(Fv)2、雙特異性微抗體(minibody)、雙特異性F(ab’)2、雙特異性雜交抗體、共價型雙抗體(雙特異性DART)、雙 特異性(FvCys)2、雙特異性F(ab’拉鍊)2、雙特異性(Fv拉鍊)2、雙特異性三抗體或雙特異性mAb2之形態。
[12]如前項[1]至[3]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係雙特異性雜交抗體之形態。
[13]如前項[1]至[6]及[10]至[12]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係IgG抗體。
[14]如前項[13]記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，IgG抗體係IgG1抗體或IgG4抗體。
[15]如前項[14]記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，IgG1抗體係不具有ADCC及/或CDC作用之抗體。
[16]如前項[7]至[9]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，IgG恆定區域(絞鍊/CH3)的同型(isotype)為IgG1。
[17]如前項[1]至[16]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，PD-1及CD19分別為人類PD-1及人類CD19。
[18]如前項[1]至[17]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係單株抗體。
[19]如前項[1]至[18]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係人類化或完全人類型抗體。
[20]如前項[1]至[19]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係單離抗體。
[21]如前項[1]至[20]中任一項記載之PD-1/CD19雙 特異性抗體或其抗體片段，其中，該第一臂容許PD-1及PD-L1間之相互作用、PD-1及PD-L2之相互作用或此兩種相互作用。
[22]如前項[1]至[21]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係與在B細胞上表現之PD-1及CD19結合。
[23]一種人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體，具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD19特異性結合之第二臂，其中，(a)該第一臂包含抗人類PD-1抗體之VH及VL，該第二臂包含抗人類CD19抗體之VH及VL，(b)分別與在B細胞上表現之PD-1及CD19結合，(c)該第一臂容許PD-1及PD-L1間之相互作用，以及(d)係雙特異性雜交抗體之形態、及/或IgG1抗體或者是IgG4抗體。
[1-1]一種醫藥組成物，係包含選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體，及藥學上容許的載體。
[2-1]一種自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制復發抑制及/或治療之劑，係包含選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體作為有效成分。
[2-2]如前項[2-1]記載之劑，其中，自體免疫疾病為：貝賽特氏症(Behcet's disease)、全身性紅斑狼瘡、慢性圓盤狀紅斑狼瘡、多發性硬化症(全身性硬皮症、進行性全身性硬化症)、硬皮症、多發性肌炎、皮膚肌炎、結節性動脈周圍炎(結節性多發動脈炎(periarteritis nodosa)、顯微鏡性多發血管炎)、大動脈炎症候群(高安氏動脈炎)、惡性類風濕性關節炎、類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、脊椎關節炎、混合性結締組織病、薛格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、成人史迪爾氏病(Adult Still's disease)、血管炎、過敏性肉芽腫血管炎、過敏性血管炎、類風濕性血管炎、大型血管炎、ANCA關連血管炎(例如、多發血管炎性肉芽腫症及嗜酸性球性多發血管炎性肉芽腫症)、柯根氏症候群(Cogan's syndrome)、RS3PE症候群、顳動脈炎、巨細胞性動脈炎、風濕性多發性肌痛症、纖維肌痛症、抗磷脂質抗體症候群、嗜酸性球性筋膜炎、IgG4關連疾病(例如、原發性硬化性膽管炎、自體免疫性胰臟炎等)、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、重症肌無力症、慢性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、原發性膽汁性肝硬化、大動脈炎症候群、古巴斯捷氏症候群(Goodpasture syndrome)、急速進行性腎絲球腎炎、抗腎絲球基底膜腎炎、巨紅血球性貧血、自體免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自體免疫性嗜中性球減少症、特發性血小板減少性紫斑病、甲狀腺機能亢進症(葛瑞夫茲病(Graves disease))、橋本病、自體免疫性腎上腺機能不全、原發性 甲狀腺機能低下症、愛迪生氏病(Addison's disease)、特發性愛迪生氏病(慢性腎上腺皮質機能低下症)、第一型糖尿病、進程緩慢型第一型糖尿病、局部型硬皮症、乾癬、乾癬性關節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線狀IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、圓形禿、白斑、尋常性白斑、原田病、自體免疫性視神經症、特發性無精子症、習慣性流產、炎症性腸疾病(例如、潰瘍性大腸炎、克隆氏症(Crohn's disease))、乳糜瀉(celiac disease)、異位性皮膚炎、視神經脊髄炎、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經炎、多灶性運動神經病、肺泡蛋白症、自體免疫性出血病XIII、復發性多發軟骨炎、結節病、僵直性脊椎炎、嚴重氣喘、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、嗜酸性球性鼻竇炎(eosinophilic sinusitis)、擴張性心肌症、食物過敏、全身性肥大細胞增生症、肌萎縮性脊髓側索硬化症或包涵體肌炎。
[2-3]如前項[2-1]或[2-2]記載之劑，係與選自：類固醇藥物(例如，乙酸可體松(cortisone acetate)、氫化可體松(hydrocortisone)、氫化可體松磷酸鈉、氫化可體松琥珀酸鈉、乙酸氟氫可體松(fludrocortisone acetate)、去氫可體松(prednisolone)、乙酸去氫可體松、去氫可體松琥珀酸鈉、去氫可體松丁基乙酸酯、去氫可體松磷酸鈉、乙酸鹵潑尼松(halopredone acetate)、甲基去氫可體松(methyl prednisolone)、去氫可體松乙酸甲酯、去氫可體松鈉琥珀酸甲酯、去炎松(triamcinolone)、乙酸去炎松、丙酮去炎 松(triamcinolone acetonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸地塞米松、地塞米松磷酸鈉、棕櫚酸地塞米松、乙酸帕拉米松(paramethasone acetate)、貝他米松(betamethasone)等)、干擾素β-1a、干擾素β-1b、乙酸格拉替雷(glatiramer acetate)、雙羥蒽醌(mitoxantrone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環孢素(cyclosporine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、克拉屈濱(cladribine)、腎上腺皮質刺激賀爾蒙(ACTH)、皮質促激素(corticotropin)、咪唑立賓(mizoribine)、普樂可復(tacrolimus)、芬戈莫德(fingolimod)、阿倫單抗(alemtuzumab)、免疫抑制劑(例如、環孢素、普樂可復、芬戈莫德等)、抗風濕藥物(例如、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、布西拉明(bucillamine)、來氟米特(leflunomide)、咪唑立賓、普樂可復等)及抗細胞激素藥(例如、英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、托珠單抗(tocilizumab)、依那西普(etanercept)、阿巴西普(abatacept)、戈利木單抗(golimumab)、賽妥珠單抗(certolizumab))中之一種以上的藥劑一起投予者。
[3-1]一種移植物抗宿主病(GVHD)之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療之劑，係包含選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體作為有效成分。
[4-1]一種自體反應性B細胞介導性疾病之預防、症 狀進展抑制、復發抑制及/或治療之劑，係包含選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體作為有效成分。
[4-2]如前項[4-1]記載之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療之劑，其中，自體反應性B細胞介導性疾病為：全身性紅斑狼瘡、葛瑞夫茲病、重症肌無力症、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性血小板減少症、氣喘、冷凝球蛋白血症(Cryoglobulinemia)、原發性膽管硬化症或惡性貧血。
[5-1]一種自體反應性B細胞抑制劑，係包含選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體作為有效成分。
[5-2]如前項[5-1]記載之自體反應性B細胞抑制劑，其中，自體反應性B細胞係抑制免疫球蛋白產生。
[5-3]如前項[5-2]記載之自體反應性B細胞抑制劑，其中，免疫球蛋白係IgG或IgM。
[6-1]一種記憶T細胞活化抑制劑，係包含選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體作為有效成分。
[6-2]如前項[6-1]記載之記憶T細胞活化抑制劑，其中，記憶T細胞活化抑制係抑制細胞激素產生。
[7-1]一種自體免疫疾病(特別是，自體反應性B細胞介導性疾病)或移植物抗宿主病(GVHD)之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療之方法，係包含對患者投予有效量之選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體。
[7-2]一種自體反應性B細胞抑制或記憶T細胞活化抑制之方法，係包含對患者投予有效量之選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體。
[8-1]一種選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體，係用於自體免疫疾病(特別是，自體反應性B細胞介導性疾病)或移植物抗宿主病(GVHD)之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療。
[8-2]一種選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體，係用於自體反應性B細胞抑制或記憶T細胞活化抑制。
[9-1]一種選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體之用 途，係用於自體免疫疾病(特別是，自體反應性B細胞介導性疾病)或移植物抗宿主病(GVHD)之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療之劑之製造。
[9-2]一種選自前項[1]至[22]中任一項記載之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或前項[23]記載之人類化或完全人類型單離PD-1/CD19雙特異性抗體之用途，係用於自體反應性B細胞抑制劑或記憶T細胞活化抑制劑之製造。
本發明之PD-1/CD19雙特異性抗體由於具有PD-1促效劑作用，進一步顯示對活化B細胞之抑制作用，因此可使用於自體免疫疾病或GVHD之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療。
第1圖顯示實施例1記載之B細胞標的PD-1促效劑(B細胞標的PD-1促效劑X及B細胞標的PD-1促效劑M)之結構。圖中，「VH CD19」及「VL CD19」分別表示抗CD19抗體之VH及VL，「VH PD-1」及「VL PD-1」分別表示抗PD-1抗體之VH及VL。「L1」，「L2」及「L3」分別表示連結各VH及VL之胜肽連接子，L1及L3具有以(Gly)×4-Ser表示之結構，L2具有以((Gly)×4-Ser)×3表示之結構。
第2圖顯示實施例2記載之B細胞標的PD-1促效劑 M-Fc之結構。圖中，「IgG1(Hinge-CH3)」表示具有絞鍊部至CH3區域之人類IgG1恆定區域。「L4」表示具有以(Gly)×4-Ser或((Gly)×4-Ser)×3表示之結構的胜肽。其他記號係與第1圖所示者相同意義。
第3圖表示B細胞標的PD-1促效劑X之對人類PD-1及人類CD19顯示特異性結合性之流式細胞術。
第4圖表示B細胞標的PD-1促效劑M對人類PD-1及人類CD1顯示特異性結合性之流式細胞術。
第5圖表示B細胞標的PD-1促效劑M-Fc對人類PD-1及人類CD19顯示特異性結合性之流式細胞術。
第6圖顯示各B細胞標的PD-1促效劑對活化人類B細胞之細胞增殖的作用。(A)B細胞標的PD-1促效劑M(圖中，以「促效劑M」表示)，(B)B細胞標的PD-1促效劑X(圖中，以「促效劑X」表示)，(C)B細胞標的PD-1促效劑M-Fc(圖中，以「促效劑M-Fc」表示)。
第7圖顯示B細胞標的PD-1促效劑M-Fc對人類B細胞中之IgM及IgG產生之作用。
第8圖顯示在異種移植GVHD小鼠模式中之B細胞標的PD-1促效劑M-Fc之作用。
第9圖顯示B細胞標的PD-1促效劑對源自人類記憶T細胞之IL-2產生之作用。
第10圖顯示B細胞標的PD-1促效劑M-Fc對胸腺依存性抗原之免疫反應之作用。圖中縱軸表示對血清中之KLH的抗體價。
第11圖顯示實施例9記載之小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-1之結構。圖中，「VH mCD19」及「VL mCD19」分別表示抗小鼠CD19抗體之VH及VL，「VH mPD-1」及「VL mPD-1」分別表示抗小鼠PD-1抗體之VH及VL。其他記號表示與前述相同意義。
第12圖顯示實施例9記載之小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-2之結構。圖中之記號表示與前述相同意義。
第13圖表示小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-1對小鼠PD-1及小鼠CD19顯示特異性結合性之流式細胞術。
第14圖表示小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-2對小鼠PD-1及小鼠CD19顯示特異性結合性之流式細胞術。
第15圖顯示小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-1及-2對NP-OVA誘發免疫小鼠中之免疫反應的各別的生體內(in vivo)作用。圖的縱軸表示類型轉換記憶B細胞的細胞數，「Mouse Agonist-Fc-1」表示小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-1，「Mouse Agonist-Fc-2」表示小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-2。
PD-1(Programmed Cell Death-1，程式性細胞死亡-1)係在人類中，具有GenBank登錄編號NP_005009所示之胺基酸序列構成的膜型蛋白質。本說明書中記載為「PD-1」時，沒有特別的限制，亦有使用包含其全部的同功型(isoform)、及存在有本發明之「與PD-1特異性結合之第一臂」的抗原決定位(epitope)之者及該等之改變體者 之情形。本發明中，PD-1較佳為人類PD-1。
CD19係在人類中，具有Genbank登錄編號NP_001761所示之胺基酸序列，於B細胞表現，而形成B細胞受體及複合體之膜型蛋白質。在本說明書中記載為「CD19」時，沒有特別的限制，亦有使用包含其全部的同功型、及保存有本發明之「與CD19特異性結合之第二臂」的抗原決定位者及該等之改變體者之情形。在本發明中，CD19較佳為人類CD19。
本說明書中所謂「單離」，係指從宿主細胞抽出之含有複數至無數成分的夾雜物中，藉由鑑定、分離及/或精製，而成為實質上單一純粹的成分。
本說明書中所謂「單株抗體」，係指對相同的特定抗原進行結合，而從實質上均一的抗體集團獲得之抗體。
本說明書中所謂「雙特異性抗體」，係指在一分子中兼具對二種不同的抗原分子或抗原決定位之結合特異性的抗體。本發明係關於可對在B細胞上表現之PD-1及CD19各別地特異性結合之雙特異性抗體及其抗體片段。在一態樣中，係關於可同時對在B細胞上表現之PD-1及CD19各別地特異性結合之雙特異性抗體及其抗體片段。再者，在一態樣中係關於可對在同一B細胞上表現之PD-1及CD19各別地特異性結合之雙特異性抗體及其抗體片段。
在雙特異性抗體之形態中，包含例如：雙 抗體、雙特異性sc(Fv)2、雙特異性微抗體、雙特異性F(ab’)2、雙特異性雜交抗體、共價型雙抗體(雙特異性DART)、雙特異性(FvCys)2、雙特異性F(ab’拉鍊)2、雙特異性(Fv拉鍊)2、雙特異性三抗體及雙特異性mAb2等。
所謂雙抗體，係將辨識不同抗原的VH、VL彼此以胜肽連接子連結而成之單鏈胜肽的二倍體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993),Vol.90,No.14：p.6444-6448)。
所謂雙特異性sc(Fv)2，係將辨識不同抗原之兩種抗體之2組VH/VL通過胜肽連接子以產生連續的單鏈形態之方式進行改變而成的低分子化抗體(參照J.Biological Chemistry(1994),Vol.269：p.199-206)。
所謂雙特異性F(ab’)2，係將辨識不同的兩種抗原之抗體的Fab’片段藉由雙硫鍵等進行共價鍵結而成之低分子化抗體。
所謂雙特異性微抗體，係將辨識各種不同抗原之scFv與抗體的恆定區域CH3域(domain)以連結之方式進行改變而成的低分子抗體片段，以其CH3域上的雙硫鍵等進行共價鍵結而成的低分子化抗體(參照Biochemistry(1992),Vo.31,No.6,p.1579-1584)。
所謂雙特異性雜交抗體，係將辨識不同的兩種抗原之抗體的重鏈/輕鏈複合體藉由雙硫鍵等進行共價鍵結而成的完整抗體。
在本發明中，較佳的雙特異性抗體之形態， 係以二個可變區域間的可動區域為較廣之形態者為佳，例如，雙特異性雜交抗體。
雙特異性雜交抗體，例如可從藉由雜交融合瘤法(參照US4474893)所製作出的融合瘤來產生。再者，雙特異性雜交抗體係可藉由使分別編碼辨識不同抗原之抗體的重鏈及輕鏈之總計4種類的cDNA在哺乳動物細胞中共表現並分泌而製造。
本發明中使用之單株抗體，係可藉由融合瘤法(例如參照，Kohler及Milstein等，Natur(1975)，Vol.256,p.495-97，Hongo等，Hybridoma(1995),Vol.14,No.3,p.253-260，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988),Vol.2)及Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,p.563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA法(例如參照，US4816567)、噬菌體顯示方法(例如參照，Ladner等之US5223409、US5403484及US5571698，Dower等之US5427908及US5580717，McCafferty等之US5969108及US6172197及Griffiths等之US5885793、US6521404、US6544731、US6555313、US6582915及US6593081)進行製作。
抗體或單株抗體，在對人類投予時，為了使其抗原性減低或消失，可以嵌合抗體、人類化抗體或完全人類型抗體之形態進行製作。
「嵌合抗體」係指可變區域序列與恆定區 域序列係源自各別的哺乳動物之抗體，例如，可變區域序列源自小鼠抗體，恆定區域序列源自人類抗體者。嵌合抗體係可從藉由上述融合瘤法、重組DNA法或噬菌體顯示方法所單離之抗體產生融合瘤，藉由公知的手法將經單離之編碼抗體可變區域之基因，使用公知的方法，與源自人類的編碼抗體恆定區域之基因進行連結而製作(例如參照，Cabilly等之US4816567)。
所謂「人類化抗體」，係指將源自如小鼠之其他哺乳種的生殖細胞型的互補性決定區域(CDR)序列移植至人類框架序列上而成的抗體。為人類化抗體時，亦可藉由從上述方法所單離之抗體產生融合瘤，將藉由公知手法所單離之編碼抗體CDR區域之基因，使用公知的方法，與源自人類的編碼抗體框架區域之基因進行連結而製作(例如參照，Winter之US5225539及US5530101，Queen等之US5585089號及US6180370)。
所謂「人類抗體」或「完全人類型抗體」，係指由框架區域及CDR區域構成的可變區域以及恆定區域兩者皆為源自人類生殖細胞型免疫球蛋白序列之抗體。本發明中所使用的人類抗體，係可藉由使用以產生人類抗體之方式而經轉形(transformation)之小鼠，例如，Humab小鼠(例如參照，Lonberg與Kay等之US5545806、US5569825、US5625126、US5633425、US5789650、US5877397、US5661016、US5814318，US5874299及US5770429)、KM小鼠(例如參照，Ishida等之 WO2002/43478)、Xeno小鼠(參照例如，US5939598、US6075181、US6114598、US6150584及US6162963)或Tc小鼠(參照例如，Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000),p.722-727)的方法進行製作。再者，亦可以藉由免疫引起人類抗體反應之方式，使用將人類免疫細胞再構築而成的SCID小鼠(例如參照，Wilson等之US5476996及US5698767)進行調製。再者，本發明中使用的人類抗體，亦可藉由上述之噬菌體顯示方法進行製作。
本說明書中，所謂PD-1/CD19雙特異性抗體的「抗體片段」，係指全長抗體的一部分，具有對PD-1的抗原結合部分及對CD19的抗原結合部分之抗體，可舉例如F(ab’)2等。在此，所謂抗原結合部分，係指抗體可與其抗原結合之最少單元，例如，由框架區域構成，該框架區域係通過VH及VL中各別的3個CDR與該等CDR的組合，以可辨識目標抗原之方式來配置CDR。
本說明書中所謂「同型」，係可使用由重鏈恆定區域基因編碼之稱為抗體組(antibody class)(例如，IgM或IgG)者。本發明之雙特異性抗體較佳的同型係IgG1或IgG4，在此，IgG1係以對Fc受體的結合經消失或減弱者為佳。具體而言，將其重鏈恆定區域之任意胺基酸藉由置換、缺失或插入，即可獲得對Fc受體之結合經消失或減弱的IgG1抗體。可舉出例如，在各別二個重鏈恆定區域或絞鍊區域上，EU編號系統之第234號的白胺酸經置換成丙胺酸、及/或第235號之白胺酸經置換成丙胺酸之IgG1 抗體。再者，亦可為在雙特異性抗體之各別二個重鏈恆定區域或絞鍊區域上，EU編號系統之第235號的白胺酸經置換成甘胺酸、及/或第236號之甘胺酸經置換成精胺酸的抗體。再者，為了使抗體的不均一性減低，較佳為C末端之胺基酸，例如，EU編號系統之第447號的離胺酸缺失之抗體。
本發明之雙特異性抗體的Fc區域，亦可以使二個不同重鏈容易締合之方式，而使其區域的任意胺基酸經置換。可列舉例如：具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈上的恆定區域之EU編號系統的第351號之白胺酸置換成離胺酸，且第366號的蘇胺酸置換成離胺酸，具有與CD19特異性結合之第二臂之VH的重鏈中之恆定區域中的第351號之白胺酸置換成天門冬胺酸，且第368號的白胺酸置換成麩胺酸之PD-1/CD19雙特異性抗體。再者，亦可舉：具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈中之恆定區域中EU編號系統之第351號的白胺酸置換成天門冬胺酸，且第368番號的白胺酸置換成麩胺酸，具有與CD19特異性結合之第二臂之VH之重鏈中的恆定區域中第351號的白胺酸置換成離胺酸，且第366號的蘇胺酸置換成離胺酸之PD-1/CD19雙特異性抗體。
再者，本發明之雙特異性抗體為IgG4時，以抑制抗體分子內中的互換(swapping)之方式，更佳為其重鏈恆定區域之任意胺基酸係經置換、缺失或插入的改變體。例如，較佳為將位於絞鍊區域之EU編號系統的第226 號之絲胺酸置換成脯胺酸之抗體。此外，本說明書中，將抗體之可變區域的CDR與框架分開的胺基酸位置係依據Kabat而規定(參照Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,(1987)及(1991))。再者，恆定區域之胺基酸係依據以Kabat的胺基酸位置為準的EU編號系統(參照Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242)來表示。
本說明書之所謂「自體反應性B細胞」，表示對自體抗原產生抗體的B細胞。
與PD-1特異性結合之第一臂
本說明書中，所謂「與PD-1特異性結合之第一臂」，係指不論是否包含於抗體或抗體片段的一部分，或不是一部分，或其自體作為單體存在，至少含有抗PD-1抗體之VH及VL，藉由將該等締合，而可與PD-1特異性結合之抗體部分，例如，在如此之第一臂中，亦包含抗PD-1抗體的Fab部。在此，所謂「與PD-1特異性結合」，係可以至少藉由具有高於1x10-5M，更佳為1x10-7M，又更佳為1x10-9M之親和性(解離常數(Kd值))的結合活性與PD-1直接結合，至少在CD28、CTLA-4及ICOS等所謂屬於CD28家族受體之其他受體成員中不具有實質性結合為特徵而使用。再者，所謂「與PD-1特異性結合之抗體」或「抗PD-1抗體」中之「抗體」，係指全長抗體，亦即，以雙硫鍵連結而成的由2個重鏈及2個輕鏈構成之完全長的抗體，較佳 為其單株抗體。
再者，該第一臂更佳為容許PD-1及PD-L1之相互作用、PD-1及PD-L2之相互作用、或該兩相互作用者。該第一臂是否容許PD-1及PD-L1之相互作用、PD-1及PD-L2之相互作用、或該兩相互作用，可藉由公知的方法，例如，將該第一臂對固定化PD-L1蛋白質或PD-L1表現細胞與可溶型PD-1蛋白質的結合之影響，例如，使用Biocare分析、ELISA分析、流式細胞術、酵素結合免疫吸附檢定法(ELISA)、螢光能量轉移測定法(FRET)或螢光微量測定技術(FMAT(註冊商標))進行測定而判斷。
與CD19特異性結合之第二臂
本說明書中，所謂「與CD19特異性結合之第二臂」，係指不論是否包含於抗體或抗體片段的一部分，或不是一部分，或其自體作為單體存在，至少含有抗CD19抗體之VH及VL，藉由締合該等而可與CD19特異性結合之抗體部分，例如，在如此之第二臂中包含抗CD19抗體的Fab部。在此，所謂「與CD19特異性結合」，係可以至少藉由具有高於1x10-5M，更佳為1x10-7M，又更佳為1x10-9M之親和性(解離常數(Kd值))的結合活性與CD19直接結合，且不與其他蛋白質實質性結合為特徵而使用。再者，所謂「與CD19特異性結合之抗體」或「抗CD19抗體」中之「抗體」係指全長抗體，亦即，以雙硫鍵連結而成的由2個重鏈及2個輕鏈構成之完全長的抗體，較佳為其單株抗體。
本發明之PD-1/CD19雙特異性抗體之較佳的同型係IgG抗體，更佳為IgG1或者是IgG4抗體，又更佳為IgG1抗體。
本發明之雙特異性抗體中，同抗體為IgG1抗體時，較佳之形態為導入使與Fc受體的結合實質性消失的變異，可舉例如，在各別兩個重鏈恆定區域或絞鍊區域上，EU編號系統之第234號的白胺酸置換成丙胺酸置換、及/或第235號的白胺酸置換成丙胺酸之IgG1抗體。或者是，亦可為各別兩個重鏈恆定區域或絞鍊區域上，EU編號系統之第235號的白胺酸置換成甘胺酸、及/或第236號的甘胺酸置換成精胺酸之IgG1抗體。再者，更佳為該等雙特異性抗體之重鏈C末端的胺基酸，例如，EU編號系統之第447號的離胺酸缺失之抗體。又，PD-1/CD19雙特異性抗體為IgG4抗體時，較佳為將位於其絞鍊區域之EU編號系統第226號的絲胺酸置換成脯胺酸的抗體。
PD-1/CD19雙特異性抗體之製造及精製方法
本發明之PD-1/CD19雙特異性抗體及其抗體片段，亦可藉由WO2014/051433、WO2013/157953或WO2013/157954所揭示之方法製造。
例如，將分別插入有(1)編碼具有抗PD-1抗體之VH的重鏈之多核苷酸、(2)編碼具有抗CD19抗體之VH的重鏈編碼之多核苷酸、(3)編碼具有抗PD-1抗體之VL的輕鏈之多核苷酸、及(4)編碼具有抗CD19抗體之VL 的輕鏈之多核苷酸的表現載體，對哺乳動物細胞進行基因導入使轉形，並使兩重鏈及輕鏈一同表現以及分泌即可製造。
在此，表現本發明之雙特異性抗體的宿主細胞，係可將表現載體進行基因導入，或係可將經導入之表現載體表現之任何的宿主細胞。較佳的是，如SF-9及SF-21細胞之昆蟲細胞，更佳的是，包含CHO細胞、BHK細胞、SP2/0細胞及NS-0骨髓瘤細胞之小鼠細胞，如COS及Vero細胞之靈長類細胞，如MDCK細胞、BRL 3A細胞、融合瘤、腫瘤細胞、永生化的初代細胞、W138、HepG2、HeLa、HEK293、HT1080或PER.C6之胚胎性的網膜細胞等哺乳類細胞。此外，在表現系統的選擇中，亦有以使抗體適當地醣苷基化之方式，使用哺乳類細胞之表現載體及宿主。人類細胞株，較佳為PER.C6，係由於可獲得與人類之醣苷基化模式一致的抗體因而利於使用。
藉由表現載體的基因導入而轉形之宿主細胞中的蛋白質之產生，可參考例如：Current Protocols in Protein Science(1995),Coligan JE,Dunn BM,Ploegh HL,Speicher DW,Wingfield PT,ISBN 0-471-11184-8，Bendig,1988來實施，再者，用以將宿主細胞的培養生產性最大化之一般指南、程序及實用的方法，可參考Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach(M.Butler,ed.,IRL Press,1991)來實施。宿主細胞中的抗體表現，係記載於例如，EP0120694、EP0314161、EP0481790號、EP0523949、 US4816567及WO2000/63403等公開公報。
在此，宿主細胞的培養條件可藉由公知的方法最佳化，可將蛋白質的生產量最適化。培養可在例如皿、滾瓶(roller bottle)或者是反應槽中，藉由批次培養、饋料批式培養(fed-batch culture)、連續培養、利用中空系統之培養等進行。為了藉由細胞培養大規模地(連續地)進行重組蛋白質的生產，較佳為使細胞在懸浮液中增殖。再者，較佳為在沒有源自動物或人類血清或者是源自動物或人類血清的構成要素之條件下進行細胞的培養。
在宿主細胞中表現，藉由公知的方法從其細胞或細胞培養基所回收的抗體，係使用公知的方法進行精製。精製方法包含免疫沉降法、離心法、過濾、尺寸排除層析法、親和性層析法、陽離子及/或陰離子交換層析法、疏水性相互作用層析法等。再者，較佳為使用蛋白質A或蛋白質G親和性層析法(參照例如，US4801687及US5151504)。
[醫藥的用途]
本發明之PD-1/CD19雙特異性抗體對自體免疫疾病或移植物抗宿主病(GVHD)的預防、症狀進展抑制及/或治療有用。
本發明之雙特異性抗體可預防、症狀進展抑制及/或治療的自體免疫疾病可列舉例如：貝賽特氏症、全身性紅斑狼瘡、慢性圓盤狀紅斑狼瘡、多發性硬化症(全身性硬皮症、進行性全身性硬化症)、硬皮症、多發性肌炎、 皮膚肌炎、結節性動脈周圍炎(結節性多發動脈炎、顯微鏡性多發血管炎)、大動脈炎症候群(高安氏動脈炎)、惡性類風濕性關節炎、類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、脊椎關節炎、混合性結締組織病、薛格連氏症候群、成人史迪爾氏病、血管炎、過敏性肉芽腫血管炎、過敏性血管炎、類風濕性血管炎、大型血管炎、ANCA關連血管炎(例如、多發血管炎性肉芽腫症及嗜酸性球性多發血管炎性肉芽腫症)、柯根氏症候群、RS3PE症候群、顳動脈炎、巨細胞性動脈炎、風濕性多發性肌痛症、纖維肌痛症、抗磷脂質抗體症候群、嗜酸性球性筋膜炎、IgG4關連疾病(例如、原發性硬化性膽管炎、自體免疫性胰臟炎等)、格林-巴利症候群、重症肌無力症、慢性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、原發性膽汁性肝硬化、大動脈炎症候群、古巴斯捷氏症候群、急速進行性腎絲球腎炎、抗腎絲球基底膜腎炎、巨紅血球性貧血、自體免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自體免疫性嗜中性球減少症、特發性血小板減少性紫斑病、甲狀腺機能亢進症(葛瑞夫茲病(亦稱為，Basedow病))、橋本病、自體免疫性腎上腺機能不全、原發性甲狀腺機能低下症、愛迪生氏病、特發性愛迪生氏病(慢性腎上腺皮質機能低下症)、第一型糖尿病、進程緩慢型第一型糖尿病、局部型硬皮症、乾癬、乾癬性關節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線狀IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、圓形禿、白斑、尋常性白斑、原田病、自體免疫性視神經症、特發性無精 子症、習慣性流產、炎症性腸疾病(例如、潰瘍性大腸炎、克隆氏症)、乳糜瀉、異位性皮膚炎、視神經脊髄炎、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經炎、多灶性運動神經病、肺泡蛋白症、自體免疫性出血病XIII、復發性多發軟骨炎、結節病、僵直性脊椎炎、重症氣喘、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、嗜酸性球性鼻竇炎、擴張性心肌症、食物過敏、全身性肥大細胞增生症、肌萎縮性脊髓側索硬化症及包涵體肌炎等。
再者，本發明的雙特異性抗體特別對自體反應性B細胞介導性疾病的預防、症狀進展抑制及/或治療有用，例如，全身性紅斑狼瘡、Basedow病、重症肌無力症、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性血小板減少症、氣喘、冷凝球蛋白血症、原發性膽管硬化症或惡性貧血。
本發明中所謂「治療」係指例如，使某種疾病或其症狀治癒或改善，所謂「預防」，係指將某種疾病或症狀表現防範於未然或使其遲延一定期間，所謂「症狀進展抑制」係指抑制症狀的進展或惡化而制止病態的進行。此外，「預防」的意義中亦包含抑制復發。
本發明之PD-1/CD19雙特異性抗體通常係全身性或局部性地以非經口的形式投予。所述之投予方法具體而言，可列舉：注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予可列舉例如：靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等，在靜脈內注射的情形中，較佳為藉由點滴進行之投予。其投予量依據年齡、體重、 症狀、治療效果、投予方法、處理時間等而異，惟通常是每一成人，每一次，在0.1μg/kg至300mg/kg的範圍，特佳為在0.1mg/kg至10mg/kg的範圍，從一日一次至複數次非經口投予，或者是在一日於30分鐘至24小時的範圍對靜脈內持續地投予。當然如前述，投予量係因應各種條件而變動，因此有少於上述投予量之量即充分的情形，亦有必須超過範圍進行投予的情形。
[製劑]
本發明之PD-1/CD19雙特異性抗體作為用於注射劑或點滴的輸液而被製劑化使用時，該注射劑或輸液可為水溶液、懸浮液或乳液的任一種形態，再者，亦可以使用時藉由添加溶劑進行溶解、懸浮或乳濁而使用之方式，與藥學上容許的載體一起作為固形劑而進行製劑化。作為用於注射劑或點滴之輸液中所使用的溶劑，可使用例如：注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖溶液及等張液(例如，氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、硼砂、丙二醇等的溶液)等。
在此、藥學上容許的載體可列舉例如：穩定劑、溶解補助劑、懸浮化劑、乳化劑、無痛化劑、緩衝劑、保存劑、防腐劑、pH調整劑及抗氧化劑等。穩定劑可使用例如：各種胺基酸、白蛋白、球蛋白、明膠、甘露醇、葡萄糖、聚葡萄醣、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、四乙酸乙二胺鈉、檸檬酸鈉、二丁基羥基甲苯等。溶解補助劑可使用例如：醇(例如， 乙醇等)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(例如，聚山梨糖醇酯20(註冊商標)、聚山梨糖醇酯80(註冊商標)、HCO-50等)等。懸浮化劑可使用例如：甘油單硬脂酸酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧基甲基纖維素、羥基甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。乳化劑可使用例如：阿拉伯膠、海藻酸鈉、黃蓍膠等。無痛化劑可使用例如：芐醇、氯丁醇、山梨糖醇等。緩衝劑可使用例如：磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、硼酸緩衝液、碳酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、Tris緩衝液、麩胺酸緩衝液、6-胺基己酸(Epsilon aminocaproic acid)緩衝液等。保存劑可使用例如：對羥基安息香酸甲酯、對羥基安息香酸乙酯、對羥基安息香酸丙酯、對羥基安息香酸丁酯、氯丁醇、芐醇、羥基氯苯胺、脫氫乙酸鈉、四乙酸乙二胺鈉、硼酸、硼砂等。防腐劑可使用例如：羥基氯苯胺、對羥基安息香酸、氯丁醇等。pH調整劑可使用例如：鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等。抗氧化劑可使用例如(1)抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉(metabisulfite)、亞硫酸鈉等水溶性抗氧化劑、(2)抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚、丁基羥基甲苯、卵磷脂、五倍子酸丙酯、α-維生素E等油溶性抗氧化劑及(3)檸檬酸、乙二胺四乙酸、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等金屬螯合劑等。
用於注射劑或點滴之輸液係可藉由在其最終步驟進行滅菌或者是無菌操作法，例如，利用過濾器等進行過濾並滅菌，接著填充至無菌容器而製造。再者，用 於注射劑或點滴之輸液亦可將藉由真空乾燥及凍結乾燥之無菌粉末(亦可為包含藥學上容許之載體的粉末)在使用時溶解至適當的溶劑中而使用。
[併用劑或調配劑]
本發明之PD-1/CD19雙特異性抗體亦可與在自體免疫疾病或移植物抗宿主病(GVHD)之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療中所使用的其他藥劑一起組合使用。在本發明中，與其他藥劑一起組合使用時(併用)的投予形態中，可為在1製劑中調配有兩成分之調配劑形態，亦可為作為分別的製劑之投予形態。藉由其併用，可補充其他藥劑的預防、症狀進展抑制，復發抑制及/或治療之效果，亦可維持或減低投予量或投予次數。本發明之雙特異性抗體與其他藥劑分別投予時，可在一定期間同時投予，之後，僅投予該雙特異性抗體或僅投予其他藥劑。再者，可先投予本發明之雙特異性抗體，該投予完成後再投予其他藥劑，亦可為先投予其他藥劑，該投予完成後再投予本發明之雙特異性抗體，各別的投予方法可相同亦可不同。亦可提供包含本發明之雙特異性抗體的製劑與包含其他藥劑之製劑的套組。在此，其他藥劑的投予量，可以臨床上使用之用量為基準而適當地選擇。再者，其他藥劑亦可將任意2種以上以適當的比率組合而投予。又，在前述其他藥劑中，不僅包含目前為止所發現者亦包含今後所發現者。
例如，將本發明之雙特異性抗體應用於第一型糖尿病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療 時，亦可與：胰島素製劑(例如，人類胰島素、Insulin glargine、insulin lispro、insulin detemir、Insulin aspart等)、磺醯尿素劑(例如，格列苯脲(Glibenclamide)、格列齊特(Gliclazide)、格列美脲(Glimepiride)等)、速效型胰島素分泌促進藥(例如，那格列奈(Nateglinide)等)、雙胍類製劑(例如，二甲雙胍等)、胰島素抵抗性改善藥(例如，吡格列酮(Pioglitazone)等)、α-葡萄糖苷酶抑制劑(例如，阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)等)、糖尿病性神經症治療藥(例如，依帕司他(epalrestat)、每息禮延(Mexiletine)、咪達普利(Imidapril)等)、GLP-1類似物製劑(例如，利拉魯肽(Liraglutide)、依克那肽(Exenatide)、利西拉肽(Lixisenatide)等)、DPP-4抑制劑(例如，西格列汀(Sitagliptin)、維格列汀(Vildagliptin)、阿格列汀(Alogliptin)等)等組合使用。
再者，例如，將本發明之雙特異性抗體應用於多發性硬化症之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療時，亦可與類固醇藥物(例如、乙酸可體松、氫化可體松、磷酸氫化可體松鈉、琥珀酸氫化可體松鈉、乙酸氟氫可體松、去氫可體松、乙酸去氫可體松、琥珀酸去氫可體松鈉、丁基乙酸去氫可體松、磷酸去氫可體松鈉、乙酸鹵潑尼松、甲基去氫可體松、乙酸甲酯去氫可體松、琥珀酸甲酯去氫可體松鈉、去炎松、乙酸去炎松、去炎松縮丙酮化合物、地塞米松、乙酸地塞米松、磷酸地塞米松鈉、棕櫚酸地塞米松、乙酸帕拉米松、貝他米松等)、干擾素 β-1a、干擾素β-1b、乙酸格拉替雷、雙羥蒽醌、硫唑嘌呤、環磷醯胺、環孢素、甲氨蝶呤、克拉屈濱、腎上腺皮質刺激賀爾蒙(ACTH)、皮質促激素、咪唑立賓、普樂可復、芬戈莫德及阿倫單抗等組合使用。
再者，例如，將本發明之雙特異性抗體應用於全身性紅斑狼瘡之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療時，亦可與類固醇藥物(例如，上述記載之類固醇藥物)或免疫抑制劑(例如，環孢素、普樂可復、芬戈莫德等)組合使用。
例如，將本發明之雙特異性抗體應用於類風濕性關節炎之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療時，亦可與類固醇藥物(例如，上述記載之類固醇藥物)，抗風濕藥物(例如，甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、布西拉明、來氟米特、咪唑立賓、普樂可復等)或抗細胞激素藥(例如，英夫利昔單抗、阿達木單抗、托珠單抗、依那西普、阿巴西普、戈利木單抗及賽妥珠單抗等)等組合使用。
應用於其他的自體免疫疾病或自體反應性B細胞介導性疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療時，可將本發明之雙特異性抗體，與上述記載之其他藥劑中之任一種以上組合使用。
藉由下述實施例進一步說明本發明，惟本發明之範圍不受此限定。基於本發明之記載所屬技術領域具有通常知識者可進行各種變更、修飾，此等變更、修飾亦包含於本發明。
[實施例]
實施例1：B細胞標的PD-1促效劑之調製
本實施例中之「B細胞標的PD-1促效劑」，係由抗人類CD19抗體之VH及VL與抗人類PD-1抗體之VH及VL構成之單鏈雙抗體(single-chain Diabody)(以下，亦簡稱為scDb)。第1圖顯示其結構之概略。該scDb係將編碼各抗體的可變區域以及胜肽連接子之DNA以預定的順序連結製作而成的DNA插入至表現載體，使其在動物細胞(Free Style 293F細胞)中表現。培養上清液中所產生之scDb係在回收後，利用Protein A親和力層析法及尺寸排除層析法進行精製。本實施例所調製出的scDb係二種類，一種為「B細胞標的PD-1促效劑X」，另一種為「B細胞標的PD-1促效劑M」。此外，將B細胞標的PD-1促效劑X及M分別構成之該抗人類CD19抗體及抗人類PD-1抗體，依據以公知的抗體取得法為準的方法而取得。進一步，藉由公知的方法，將分別編碼該等VH及VL之cDNA單離，用於構築表現本實施例之scDb的DNA。
實施例2：B細胞標的PD-1促效劑M-Fc之調製
本實施例中之「B細胞標的PD-1促效劑M-Fc」，係使由人類CD19抗體之VH及VL與抗人類PD-1抗體之VH及VL構成的雙特異性sc(Fv)2，與融合有絞鍊部位至CH3區域為止之人類IgG1恆定區域(以下，簡稱為「IgG1恆定區域(絞鍊/CH3)」)的多肽(以下，亦稱為多肽A)，及僅由 IgG1恆定區域(絞鍊/CH3)構成之多肽(以下，亦稱為多肽B)的二種蛋白質締合而構成的異二倍體。該異二倍體具有使Fcγ受體結合性消失之變異。第2圖中顯示其結構之概略。
編碼B細胞標的PD-1促效劑M-Fc之多肽A的DNA，係在製造B細胞標的PD-1促效劑M以外，將實施例1中取得之分別編碼抗人類CD19抗體之VH及VL以及抗人類PD-1抗體之VH及VL的DNA、與編碼胜肽連接子之DNA一起以預定的順序連結而製作。此外，構成多肽A及B的一部分之編碼IgG1恆定區域(絞鍊/CH3)之DNA，係基於公知的基因情報利用PCR法取得其cDNA。將插入有分別編碼多肽A及B之各DNA序列的表現載體，基因導入至Free Style 293F細胞並使其表現，而在培養上清液中產生。回收其培養上清液後，藉由利用Protein A親和力層析法及尺寸排除層析法進行精製而調製。
實施例3：B細胞標的PD-1促效劑之結合性評估
利用使用表現人類PD-1之CHO-S細胞之流式細胞術，評估由B細胞標的PD-1促效劑所致之對表現人類PD-1之CHO-S細胞表現之PD-1的結合性。在B細胞標的PD-1促效劑X及M之C末端附加6×His標籤，在與相同細胞結合之各促效劑的檢測中，使用Alexa Fluor 488標識抗His標籤抗體(MBL，產品編號D291-A48)。另一方面，由於在B細胞標的PD-1促效劑M-Fc中包含人類IgG1恆定 區域，因此在與相同細胞結合之B細胞標的PD-1促效劑M-Fc的檢測中，使用PE標識抗人類IgG-Fc抗體(Thermo Fisher Scientific，產品編號H10104)。
任一B細胞標的PD-1促效劑皆確認到與表現人類PD-1之CHO-S細胞結合。另一方面，未確認到與作為對照組使用之CHO-S細胞的結合，因此可確認此結合係表現出對PD-1之特異性。
接著，藉由同樣的方法，確認到B細胞標的PD-1促效劑與人類CD19之特異性結合。上述結果示於第3、4及5圖。
實施例4：B細胞標的PD-1促效劑對人類B細胞的作用
從源自健康人類之周邊血液單核細胞(LONZA，產品編號CC-2702)使用人類B細胞分離套組II(B Cell Isolation Kit II human)(Miltenyi Biotec，產品編號130-091-151)，分離人類B細胞。將人類B細胞播種至細胞培養盤，添加小鼠抗人類CD79B抗體(LifeSpan Biosciences,Inc.，產品編號LS-C134648)及山羊抗小鼠IgG-Fcγ片段F(ab’)2抗體(Jackson ImmunoResearch，產品編號115-006-008)及B細胞標的PD-1促效劑X或者是M或M-Fc，進行3日的培養。培養3日後使用CellTiter-Glo2.0 Reagent(Promega，產品編號G924B)測定在培養液中的ATP量。將其結果示於第6圖。B細胞標的PD-1促效劑係在體外(in vitro)抑制活化人類B細胞的細胞增殖。
實施例5：B細胞標的PD-1促效劑M-Fc對人類B細胞的作用
使用移植有源自健康人類之周邊血液單核細胞(LONZA，產品編號CC-2702)之NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm 1 Wjl/SzJ小鼠(以下，簡稱為NSG小鼠)，評估相對於人類抗體產生之生體內作用。每一隻NSG小鼠移植1×107個源自健康人類之周邊血液單核細胞。在移植當日、7、14、17、21、24及28日，1日1次在腹腔內投予6mg/kg之B細胞標的PD-1促效劑M-Fc。在移植第28日從尾靜脈進行採血，並調製血清。將血清中所含的人類IgM使用ELISA套組(eBioscience，產品編號88-50620)進行定量。將血清中所含的人類IgG使用ELISA套組(eBioscience，產品編號88-50550)進行定量。將其結果示於第7圖。B細胞標的PD-1促效劑M-Fc係在生體內抑制人類IgM產生及IgG產生。
實施例6：B細胞標的PD-1促效劑M-Fc對異種移植GVHD小鼠模式的作用
使用移植有源自健康人類之周邊血液單核細胞(LONZA，產品編號CC-2702)之NSG小鼠，評估對異種移植GVHD之作用。每1隻NSG小鼠1移植1×107個源自健康人類之周邊血液單核細胞。在移植當日、7、14、17、21、24及28日，在腹腔內1日1次投予6mg/kg之B細胞標的PD-1促效劑M-Fc。利用Kaplan-Meier法作成媒體投予群及B細胞標的PD-1促效劑M-Fc投予群之至移植55日為 止的生存曲線，利用對數等級檢定(Log-rank test)進行群間比較。將其結果示於第8圖。B細胞標的PD-1促效劑M-Fc對異種移植GVHD顯示有效性。
實施例7：B細胞標的PD-1促效劑對人類記憶T細胞的作用
將源自健康人類之周邊血液單核細胞(LONZA，產品編號CC-2702)接種至細胞培養盤，添加破傷風類毒素(List Biological Labs,Inc.，產品編號191A)與B細胞標的PD-1促效劑X或M，進行4日培養。培養4日後的培養上清液中所含之IL-2使用Bio-Plex Pro人類細胞激素板(BIO-RAD，產品編號M50000007A)進行定量。將其結果示於第9圖。B細胞標的PD-1促效劑在體外抑制從人類記憶T細胞的細胞激素產生。
實施例8：B細胞標的PD-1促效劑M-Fc對胸腺依存性抗原之免疫反應的作用
使用將CD19及PD-1的各基因之細胞外區域分別置換成人類CD19及人類PD-1基因的人類CD19/人類PD-1敲入(Knock in)C57BL/6小鼠，評估藉由屬於胸腺依存性抗原之鑰孔蟲戚血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)進行免疫誘導之抗KLH抗體產生的免疫反應之生體內作用。將0.2mg/mL的KLH(Thermo Fisher，產品編號77600)與等量的Alum(Thermo Fisher，產品編號77161)良好地混合而調製懸浮液，作為誘發劑。將200μL的該誘發劑投予在該小鼠的腹腔內。從免疫處置當日起每日從尾靜脈實施 採血，並調製血清。測定在免疫處置當日、第7日、第14日、第22日、第29日及第41日中相對於血清中之KLH之抗體價，以使各時間點的抗體價為同等之方式進行對照群及B細胞標的PD-1促效劑M-Fc投予群之分配。在免疫處置第41日再度於腹腔內投予200μL的誘發劑(二次免疫)。在二次免疫第3日、第7日、第10日、第14日及第17日將B細胞標的PD-1促效劑M-Fc以1日1次3mg/kg的投予量進行腹腔內投予。測定二次免疫當日、第7日、第14日及第21日之相對於血清中之KLH之抗體價。此外，相對於血清中之KLH之抗體價，係將相對於固相化於ELISA盤之KLH的結合藉由HRP標識山羊抗小鼠IgG抗體(Southern Biotec，產品編號1030-05)進行檢測，使用小鼠抗KLH單株抗體(BioLegend，產品編號408402)以作成之檢量線為基礎藉由相對定量法而計算出。將其結果示於第10圖。B細胞標的PD-1促效劑M-Fc係抑制對於胸腺依存性抗原的免疫反應。
此外，人類CD19/人類PD-1敲入C57BL/6小鼠可以Genesis.2009 Jun；47(6)：414-22.所記載之方法為基準而製作。
實施例9：小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-1及-2之調製
本實施例中之「小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-1」，係由抗小鼠CD19抗體之VH及VL與抗小鼠PD-1抗體之VH及VL構成之scDb，與融合有IgG1恆定區域(絞鍊/CH3) 之多肽(以下，亦稱為多肽C)、及多肽B兩種蛋白質締合而構成之異二倍體。該異二倍體係具有使Fcγ受體結合性消失的變異。於第11圖顯示其結構的概略。
另一方面，本實施例中之「小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-2」，係藉由在IgG1恆定區域(絞鍊/CH3)之N末端及C末端分別融合有由抗小鼠CD19抗體之VH及VL與抗小鼠PD-1抗體之VH及VL構成之2種類scFv的多肽(以下，亦稱為多肽D)、與多肽B二種蛋白質締合而構成的異二倍體。該異二倍體亦具有使Fcγ受體結合性消失之變異。於第12圖顯示其結構的概略。
各別編碼抗小鼠CD19抗體之VH及VL以及抗小鼠PD-1抗體之VH及VL之DNA，係使用藉由抗小鼠CD19單株抗體產生融合瘤及抗小鼠PD-1單株抗體產生融合瘤所調製的全部RNA，依據以公知的單株抗體可變區域之鹼基序列解析法為準的方法而取得。將取得之各個DNA，與編碼胜肽連接子之DNA一起以預定之順序連結而製作。此外，編碼IgG1恆定區域(絞鍊/CH3)之DNA，係基於公知的基因情報利用PCR法取得其cDNA。將插入有分別編碼多肽C及多肽B、或多肽D及多肽B之各DNA序列的表現載體，基因導入至Free Style 293F細胞並使其表現，而在培養上清液中產生。回收其培養上清液後，藉由利用Protein A親和力層析法及尺寸排除層析法而調製。
利用使用表現小鼠PD-1之CHO-S細胞之流 式細胞術，評估由小鼠B細胞標的PD-1促效劑所致之表現於表現小鼠PD-1之CHO-S細胞與PD-1的結合性。結合於相同細胞之小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-1及-2的檢測中，使用PE標識抗人類IgG-Fc抗體(Thermo Fisher Scientific，產品編號H10104)。
任一小鼠B細胞標的PD-1促效劑皆確認到與表現小鼠PD-1之CHO-S細胞的結合。另一方面，沒有確認到與作為對照組使用之CHO-S細胞的結合，因此可確認此結合表現出對PD-1之特異性。接著，藉由同樣的方法，確認到B細胞標的PD-1促效劑與小鼠CD19之特異性結合。上述結果示於第13及14圖。
實施例10：B細胞標的PD-1促效劑對於NP-OVA誘發免疫小鼠中之免疫反應之生體內作用
使用C57BL/6小鼠，評估對於4-羥基-3-硝基苯基乙醯基卵白蛋白(4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl Ovalbumin，NP-OVA)的免疫反應之生體內作用。將1mg/mL之NP-OVA(LGC Bioresearch，產品編號N-5051)與等量之Alum(Thermo Fisher，產品編號77161)良好地混合而調製懸浮液，作為誘發劑。將200μL之該誘發劑投予至小鼠之腹腔內。在免疫處置第3日、第7日及第10日將小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-1及-2，以1日1次7mg/kg之投予量進行腹腔內投予。在免疫處置第14日採取脾臓，使用細胞過濾器(cell strainer)調製單細胞懸浮液。利用使用氯化銨溶血劑處置後之單細胞懸浮液的流式細胞術，進行類 型轉換記憶B細胞(B220+CD38+GL7-IgD-IgM-)數之評估，利用Wilcoxon排序和檢定(Wilcoxon rank sum test)進行群間比較。將其結果示於第15圖。
在小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-2投予群中，顯著地抑制類型轉換記憶B細胞的增加。另一方面，在小鼠B細胞標的PD-1促效劑-Fc-1投予群中，並未抑制類型轉換記憶B細胞的增加。
此外，針對各表面抗原之抗體，使用Brilliant Violet 605標識抗小鼠/人類CD45R/B220抗體(BioLgend，產品編號103244)、Brilliant Violet 711標識抗小鼠CD38抗體(BD Bioscience，產品編號740697)、Alexa Fluor488標識抗體小鼠/人類GL7抗體(BioLgend，產品編號144612)、APC標識抗小鼠IgD抗體(BioLegend，產品編號405714)及PE/Dazzle594標識抗小鼠IgM抗體(BioLegend，產品編號406530)。
[產業上之可利用性]
本發明之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係對自體免疫疾病或移植物抗宿主病(GVHD)之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療有用。
<110> 小野藥品工業股份有限公司
<120> PD-1/CD19雙特異性抗體
<130> P18-178WO-2
<150> 日本特願2017-196039
<151> 2017-10-06
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2

Claims (42)

  1. 一種自體免疫疾病或移植物抗宿主病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療之劑，係包含具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD19特異性結合之第二臂之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之劑，其中，該第一臂包含抗PD-1抗體之VH及VL。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之劑，其中，該第二臂包含抗CD19抗體之VH及VL。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體具有從其N末端開始依序為抗PD-1抗體之VH、抗CD19抗體之VL、抗CD19抗體之VH及抗PD-1抗體之VL且各別通過胜肽連接子或者是直接連結而成的結構。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體具有從其N末端開始依序為抗PD-1抗體之VL、抗PD-1抗體之VH、抗CD19抗體之VH及抗CD19抗體之VL且各別通過胜肽連接子或者是直接連結而成的結構。
  6. 如申請專利範圍第4或5項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體具有進一步在申請專利範圍第4項中所記載之抗體中的抗PD-1抗體之VL或在申請專利範圍第5項中所記載之抗體中的抗CD19抗體之 VL之C末端，與具有絞鍊部位至CH3區域之人類IgG恆定區域的多肽之N末端通過胜肽連接子或者是直接連結而成之結構。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體具有進一步包含具有絞鍊部位至CH3區域之人類IgG恆定區域之多肽的結構。
  8. 如申請專利範圍第4至7項中任一項所述之劑，其中，胜肽連接子為(Gly)×4-Ser或((Gly)×4-Ser)×3。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體為雙抗體、雙特異性sc(Fv) 2、雙特異性微抗體、雙特異性F(ab’) 2、雙特異性雜交抗體、共價型雙抗體、雙特異性(FvCys) 2，雙特異性F(ab’拉鍊) 2、雙特異性(Fv拉鍊) 2、雙特異性三抗體或雙特異性mAb 2之形態。
  10. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體為雙特異性雜交抗體之形態。
  11. 如申請專利範圍第1至5及8至10項中任一項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體為IgG抗體。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之劑，其中，該IgG抗體為IgG 1抗體或IgG 4抗體。
  13. 如申請專利範圍第6或7項所述之劑，其中，絞鍊部位至CH3區域之人類IgG恆定區域的同型為IgG 1。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之劑，其中， PD-1及CD19分別為人類PD-1及人類CD19。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體為人類化或完全人類型抗體。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體之第一臂容許PD-1及PD-L1間的相互作用。
  17. 如申請專利範圍第1至16項中任一項所述之劑，其中，該PD-1/CD19雙特異性抗體係與在B細胞上表現之PD-1及CD19結合。
  18. 一種自體免疫疾病或移植物抗宿主病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療之劑，係包含具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD19特異性結合之第二臂之人類化或完全人類型PD-1/CD19雙特異性抗體作為有效成分；其中，(a)該第一臂包含抗人類PD-1抗體之VH及VL，該第二臂包含抗人類CD19抗體之VH及VL，(b)該PD-1/CD19雙特異性抗體係與在B細胞上表現之PD-1及CD19結合，(c)該第一臂容許PD-1及PD-L1間之相互作用，以及(d)該PD-1/CD19雙特異性抗體為雙特異性雜交抗體之形態、及/或IgG 1抗體或者是IgG 4抗體。
  19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之劑，其中， 自體免疫疾病為：貝賽特氏症、全身性紅斑狼瘡、慢性圓盤狀紅斑狼瘡、多發性硬化症、硬皮症、多發性肌炎、皮膚肌炎、結節性動脈周圍炎、大動脈炎症候群、惡性類風濕性關節炎、類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、脊椎關節炎、混合性結締組織病、薛格連氏症候群、成人史迪爾氏病、血管炎、過敏性肉芽腫血管炎、過敏性血管炎、類風濕性血管炎、大型血管炎、ANCA關連血管炎、柯根氏症候群、RS3PE症候群、顳動脈炎、巨細胞性動脈炎、風濕性多發性肌痛症、纖維肌痛症、抗磷脂質抗體症候群、嗜酸性球性筋膜炎、IgG 4關連疾病、格林-巴利症候群、重症肌無力症、慢性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、原發性膽汁性肝硬化、大動脈炎症候群、古巴斯捷氏症候群、急速進行性腎絲球腎炎、抗腎絲球基底膜腎炎、巨紅血球性貧血、自體免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自體免疫性嗜中性球減少症、特發性血小板減少性紫斑病、甲狀腺機能亢進症、橋本病、自體免疫性腎上腺機能不全、原發性甲狀腺機能低下症、愛迪生氏病、特發性愛迪生氏病、第一型糖尿病、進程緩慢型第一型糖尿病、局部型硬皮症、乾癬、乾癬性關節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線狀IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、圓形禿、白斑、尋常性白斑、原田病、自體免疫性視神經症、特發性無精子症、習慣性流產、炎症 性腸疾病、乳糜瀉、異位性皮膚炎、視神經脊髄炎、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經炎、多灶性運動神經病、肺泡蛋白症、自體免疫性出血病XIII、復發性多發軟骨炎、結節病、僵直性脊椎炎、重症氣喘、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、嗜酸性球性鼻竇炎、擴張性心肌症、食物過敏、全身性肥大細胞增生症、肌萎縮性脊髓側索硬化症或包涵體肌炎。
  20. 如申請專利範圍第1至19項中任一項所述之劑，係與選自類固醇藥物、干擾素β-1a、干擾素β-1b、乙酸格拉替雷、雙羥蒽醌、硫唑嘌呤、環磷醯胺、環孢素、甲氨蝶呤、克拉屈濱、腎上腺皮質刺激賀爾蒙(ACTH)、皮質促激素、咪唑立賓、普樂可復、芬戈莫德、阿倫單抗、免疫抑制劑、抗風濕藥物及抗細胞激素藥中之一種以上的藥劑一起投予者。
  21. 一種單離之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD19特異性結合之第二臂。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，該第一臂包含抗PD-1抗體之VH及VL。
  23. 如申請專利範圍第21或22項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，該第二臂包含抗CD19抗體之VH及VL。
  24. 如申請專利範圍第21至23項中任一項所述之 PD-1/CD19雙特異性抗體，其中，該單離之PD-1/CD19雙特異性抗體具有從其N末端開始依序為抗PD-1抗體之VH、抗CD19抗體之VL、抗CD19抗體之VH及抗PD-1抗體之VL且各別通過胜肽連接子或者是直接連結而成的結構。
  25. 如申請專利範圍第21至23項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體，其中，該單離之PD-1/CD19雙特異性抗體具有從其N末端開始依序為抗PD-1抗體之VL、抗PD-1抗體之VH、抗CD19抗體之VH及抗CD19抗體之VL且各別通過胜肽連接子或者是直接連結而成的結構。
  26. 如申請專利範圍第24或25項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體，係具有進一步在申請專利範圍第24項中所記載之PD-1/CD19雙特異性抗體中之抗PD-1抗體之VL或在申請專利範圍第25項中所記載之PD-1/CD19雙特異性抗體中之抗CD19抗體之VL之C末端，與具有絞鍊部位至CH3區域之人類IgG恆定區域的多肽之N末端通過胜肽連接子或者是直接連結而成之結構。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體，係具有進一步包含具有絞鍊部位至CH3區域之人類IgG恆定區域之多肽的結構。
  28. 如申請專利範圍第24至27項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體，其中，胜肽連接子為(Gly)×4-Ser或((Gly)×4-Ser)×3。
  29. 如申請專利範圍第21至23項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，該PD-1/CD19雙特異性抗體係雙抗體、雙特異性sc(Fv) 2、雙特異性微抗體、雙特異性F(ab’) 2、雙特異性雜交抗體、共價型雙抗體、雙特異性(FvCys) 2、雙特異性F(ab’拉鍊) 2、雙特異性(Fv拉鍊) 2、雙特異性三抗體或雙特異性mAb 2之形態。
  30. 如申請專利範圍第21至23項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，該PD-1/CD19雙特異性抗體係雙特異性雜交抗體之形態。
  31. 如申請專利範圍第21至25及28至30項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，該PD-1/CD19雙特異性抗體係IgG抗體。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，該PD-1/CD19雙特異性抗體係IgG 1抗體或IgG 4抗體。
  33. 如申請專利範圍第26或27項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體，其中，從絞鍊部位至CH3區域為止之人類IgG恆定區域的同型為IgG 1。
  34. 如申請專利範圍第21至33項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，PD-1及CD19分別為人類PD-1及人類CD19。
  35. 如申請專利範圍第21至34項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，該PD-1/CD19 雙特異性抗體係人類化或完全人類型抗體。
  36. 如申請專利範圍第21至35項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，其中，該第一臂容許PD-1及PD-L1間的相互作用。
  37. 如申請專利範圍第21至36項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，該PD-1/CD19雙特異性抗體係與在B細胞上表現之PD-1及CD19結合。
  38. 一種人類化或完全人類型之單離之PD-1/CD19雙特異性抗體，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD19特異性結合之第二臂，其中，(a)該第一臂包含抗人類PD-1抗體之VH及VL，該第二臂包含抗人類CD19抗體之VH及VL，(b)與在B細胞上表現之PD-1及CD19結合，(c)該第一臂容許PD-1及PD-L1間之相互作用，以及(d)為雙特異性雜交抗體之形態、及/或IgG 1抗體或者是IgG 4抗體。
  39. 一種醫藥組成物，係包含選自申請專利範圍第21至37項中任一項所述之單離之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或申請專利範圍第38所述之人類化或完全人類型之單離之PD-1/CD19雙特異性抗體，及藥學上容許的載體。
  40. 一種自體反應性B細胞介導性疾病之預防、症狀進展 抑制、復發抑制及/或治療之劑，係包含申請專利範圍第21至37項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或申請專利範圍第38項所述之人類化或完全人類型之單離之PD-1/CD19雙特異性抗體作為有效成分。
  41. 一種自體反應性B細胞抑制劑，係包含申請專利範圍第21至37項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或申請專利範圍第38項所述之人類化或完全人類型之單離之PD-1/CD19雙特異性抗體作為有效成分。
  42. 一種記憶T細胞活化抑制劑，係包含申請專利範圍第21至37項中任一項所述之PD-1/CD19雙特異性抗體或其抗體片段，或申請專利範圍第38項所述之人類化或完全人類型之單離之PD-1/CD19雙特異性抗體作為有效成分。
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