TW201930880A - 用於測定抗－ｃｄ２６配體的生物學活性之定量的細胞法 - Google Patents

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Abstract

本發明係與用於在活體外測定一抗-CD26配體之功效的定量細胞法有關，較佳地為例如貝格洛姆單抗(begelomab)之抗-CD26單株抗體。

Description

用於測定抗-CD26配體的生物學活性之定量的細胞法
本發明係與用於在活體外測定一抗-CD26配體之功效的定量細胞法有關，較佳地為例如貝格洛姆單抗(begelomab)之抗-CD26單株抗體。
CD26係為一種在細胞表面上且以可溶形式表現的110-kDa多功能醣蛋白。例如肺、內皮細胞、心臟、腦、肝、腸、腎、胎盤、胰腺和骨骼肌之許多種組織與器官，都會表現該CD26抗原(Abbott C.A.等人，1994)。在細胞層級中，CD26的表現已經被發現在淋巴細胞群中，特別是在活化的T淋巴細胞、T休止與B淋巴細胞中，會具有較強的共活化性(Cordero OJ等，2007)。事實上，在特定的記憶T細胞的子集合中，CD26的表現於T細胞自身的活化後增加(森本C.等人，1989)。CD26在T細胞上的表現係與這些細胞產生大量的IL-2之能力有關，且因應促有絲分裂刺激而強烈增殖。但是，CD26的表現與輔助T淋巴細胞的活性為負相關(Mattern T.等人，1991)。
CD26之特徵在於二肽基肽酶IV(DPP-IV)之酶活性。上述之酶活性係特別地促進X-Pro位置之N-端胺基酸與相鄰胺基酸之間的肽鍵水解(Gorrel M.D.等人，2001)。CD26係屬於寡肽酶的子集合，其可以切割例如細胞介素、多胜肽、賀爾蒙與趨化介素等許多生物學活性受質中之N-末端二肽(De Meester I.等人，1999；Hildebrandt M.等人，2000)。
在人類中，CD26還與腺苷去胺酶(ADA)之結合(Franco R.等，1998)有關。ADA缺陷不僅通過免疫失調的一般機制，而且還會通過在細胞內累積嘌呤代謝之毒性代謝物而易於罹患免疫缺陷性疾病(Sauer A.V.等人，2012)。
CD26與ADA之間的連結之可能作用，實際上是通過細胞表面的腺苷受體，來調節在T細胞間提供負向訊息之局部細胞外腺苷濃度。有一些對CD26具有專一性的單株抗體，能夠對T細胞傳遞活化訊息，並在活體外調節免疫反應(Morimoto C.與Schlossman S.F等人，1998)。因此，CD26係與發炎、免疫內分泌及神經功能的調節有關，且亦與AIDS的病理生理學有關。
由於其係普遍地分佈，許多病理狀態都與CD26之表現及/或活性改變有關，其係與各別的病理狀況之嚴重程度相關。這些疾病可以分為至少五類：自體免疫疾病與發炎性疾病、惡性血液腫瘤、精神神經內分泌失調、傳染病與固態腫瘤。許多研究人員觀察到，在各種免疫媒介的疾病中，CD26的血清酶活性水平似乎有 所改變(Klemann C.等人，2016)。在臨床研究中，已經觀察到在CD26之表現/活性的變化，係與例如類風濕關節炎、多發性硬化症、I型糖尿病、與在宿主中之移植排斥疾病(GvHD)之各種自體免疫疾病有關。
在給予高選擇性CD26抑制劑之各種研究中，都顯示其延遲糖尿病的發作、減緩胰島炎、增加了調節性T細胞的數量，這代表CD26在免疫調節中發揮了重要的作用。
一些與患有類風濕性關節炎之患者有關的報導，顯示其在CD26表現/酶活性、疾病的嚴重程度、與治療之間的關聯性。這些發現可以為針對抑制CD26的酶活性之新治療方法，開啟了康莊大道。此外，已觀察到在罹患多發性硬化的患者之血液與腦脊液中，T細胞表面上CD26的表現為更高(Ohnuma K.等人，2011)。GvHD是造血幹細胞移植(HSCT)後的主要併發症，其係為許多血液疾病的重要治療方法(Ferrara J.L.M.等人，2009)。GvHD可以根據發病時間而區分為急性或慢性，並且係由捐贈者所移植的骨髓衍生之初始T細胞所導致，其損傷受贈者的組織(Henden A.S.,Hill G.R.，2015)。GvHD表示於使用骨髓移植作為挽救生命之治療法上的嚴重限制(Welniak L.A.等人，2007)。
GvHD的發展通常需要三個條件：(1)捐贈者的骨髓必須含有免疫活性細胞(immunocompetent cell)、(2)受贈者必須表現在捐贈者中不存在的組織抗原、(3)受贈者不應該誘發會破壞移植細胞之有效反應。
GvHD的特徵在於3個不同階段：1)在第一階段，因為放射性療法與化學療法而破壞宿主內的組織，並釋放例如TNF-α與IFN-γ之促炎性細胞介素；2)在第二活化階段，捐贈者的異體反應性T細胞，係被呈現受贈者抗原(APC)的細胞所暴露之組織抗原活化；3)最後，隨著胞毒型T細胞與效應T細胞所產生之細胞介素的進一步分泌作用，而發生細胞增殖現象。(Ferrara J.L.M.等人，2009)。
急性GvHD(aGvHD)的病理學、嚴重程度、與器官專一性，係由T淋巴細胞的不同亞群(Th1、Th2與Th17)之間的平衡來決定。事實上，Th1亞型已經被證實相較於其他亞型，更依賴捐贈者T細胞在與宿主的APC細胞相互作用，以及其等隨後分化為輔助T細胞時之細胞介素環境來進行活化。
主要的Th1細胞介素有IFN-γ、IL-2與TNFα。例如TNF和IFN-γ的Th1細胞介素含量增加，因為其等誘導調升趨化介素與能夠促進發炎反應之受體的能力，而與此疾病之更加早發而嚴重之發病情況有關。Th2細胞介素係為IL-4、IL-5、IL-10與IL-13。以Th2細胞來阻斷該反應，已經被觀察到係與胃腸道症狀增加，還有肝臟及皮膚損傷程度水平的減低有關。IL-6係為一種促炎性細胞介素，其可控制Th17細胞與調節性T細胞之間的平衡。IL-6抑制可能是透過誘導免疫耐受性來減低HCT中之GvHD嚴重性的潛在有效策略(Henden A.S.，Hill G.R.，2015)。
因此，釐清CD26在T細胞反應期間與改變細胞介素含量上所扮演的角色，無疑地將有助於了解GvHD之發病與發展進程(Henden A.S.，Hill G.R.，2015；Yi T.2009)。
在此一前提的基礎上，一種為了防止GvHD發病的新療法，係以使用抗-CD26單株抗體為基礎(Hatano R.，2013；Bacigalupo A.,2016)。最近在臨床前模型已經開發出抗-CD26抗體，以在該疾病的動物模型中防止GvHD發作。雖然在GVHD中CD26/DPPIV的角色還需要進一步調查，以抗人類CD26小鼠抗體(也就是貝格洛姆單抗)來進行治療，已經被報導對於治療患有急性類固醇抵抗型GvHD患者的GvHD係為有效的(美國專利第9,376,498號)。因此，臨床數據證實藉由單株抗體來使得CD26失去活性，會呈現出消除自身反應性T細胞亞群，接著解決GVHD症狀之有效治療方法。
有鑑於上述情況，將該CD26受體作為新治療方法中之分子靶標的重要性將不證自明。
效價測試提供了一種對於特定藥物之生物學活性的定量測量，並且代表一種在藥學分子的研發進程中之關鍵性質參數。
有許各種方法都可以用於開發效價測試，其包括有配體-受體試驗、動物測定法、體外細胞測定法、或是其他的生化分析法(例如酶測定法)。如果其能夠再現特定藥物之作用機制，則此效價測試會是特別重要的。
對於生物產品來說，較佳地係使用配體-受體測定法或活體外細胞實驗。前者，是因為其能夠直接測量藥物與其之分子靶標的親和力，也適合作為效價測試。
然而，就只是因為效價試驗應該要依據藥物的作用機制來進行開發，而這些資訊對於特別是單株抗體來說並不總是可取得的，因此使用這些類型的測試方法並不總是可行的。這種方法由於生物藥通常在活體內具有多種作用機制而更形複雜，例如其係特別難以在體外系統中重現。
本發明之作者目前已經發現抗-CD26單株抗體(貝格洛姆單抗)，能夠在專一性結合之後誘發CD26受體的內化作用，其之作用機制係被稱為「加帽作用(capping)」。該內化現象會抑制促炎性細胞介素的釋放，從而在發炎過程中扮演關鍵角色，這是由該抗-CD26配體所誘發之直接下游功能性事件。因此，所描述之作用機制，因而可以支持在所有自體免疫疾病中之單株抗體的所有應用，在該自體免疫疾病中自身反應性T淋巴細胞係失去活性，而同時仍保持其之免疫活性者。
因此，在藥學產品之效價測試係為了以功能性方式，來測定樣本中之活性化合物的含量而產生時，CD26的內化與抑制發炎細胞介素之分泌，都代表其係為可以用來評估任何抗-CD26配體的效價之新測試方法，較佳地為一種被開發以治療及/或診斷應用之單株抗體。
所描述的方法可以被應用於評估任何抗-CD26的效價，其係以貝格洛姆單抗之作用機制的革命性發現為基礎。此外，使用此種方法與允許對CD26的內化以及對抑制所得到之細胞介素的分泌/產生之作用進行定量。
總之，這些發現可以在1)再現性、2)易於在特定樣本中對於抗-CD26配體的活性進行定量，以及3)對於該抗-CD26配體之活性進行定量測量等等面向上，製備出非常有利的效價測試法，無論該配體係為被稱作貝格洛姆單抗者或係為新發現者。
因此，本發明係與活體外抗-CD26配體之效價測定方法有關，其包括以下步驟：a)在37℃下以濃度範圍落在0.001μg/ml至150μg/ml；較佳地為0.01μg/ml至100μg/ml，更佳地為0.01μg/ml至2μg/ml，甚至更佳地為0.01μg/ml至0.5μg/ml之抗-CD26配體，溫育以高於75%的比例表現該CD26受體之人類T淋巴細胞群；b)與抗-CD26抗體一起溫育，該抗體係以會辨識在該CD26受體上之一抗原決定區的螢光染料來標記，該抗原決定區係與步驟a)的抗-CD26配體所識別者不同；c)藉由細胞螢光分析的方式，來測定以抗-CD26配體來處理的細胞樣本之CD26的MFI值(MFIT)(螢光強度中位數值)，以及未經處理細胞的MFI值(MFINT)； d)以RFI(相對螢光強度，即為相對於基線來標準化之MFI值)來評估該CD26受體之內化百分比，其係以抗-CD26配體來處理的細胞樣本之CD26的MFI值(MFIT)，以及未經處理細胞的MFI值(MFINT)之間的比值，乘以100，然後以100來相減，如以下公式所示：
其中「%int CD26」或RFI，係為CD26的內化百分比，「MFIT」係為以CD26配體來處理的細胞(測試細胞)之MFI值，而「MFINT」則為未以CD26配體處理的細胞(對照細胞)之MFI值。
此等百分比(%int CD26或RFI)：- 如果低於20%代表該抗-CD26配體之效價低；- 如果範圍落在20%至30%，則代表該抗-CD26配體具有中等效價；- 如果其高於30%則代表該抗-CD26配體為高效價。
在圖12中，A組係為分別用於指定「低」、「中等」、與「高」效價之標準的緣由。明確地說，可以觀察到CD26的內化%所呈現之反應，係為劑量相關的S形(S形曲線)，其中在該配體之較低濃度下(在該圖中係標示為「RS」)，係具有較低的「%int CD26」值，同時反之亦然，在該配體之較高濃度下，其具有較高的「%int CD26」值，直到達到30%-35%之最大值(高原 區)。如果這個高原區被視為100%的「%int CD26」值，則可以如圖12B組所示將該曲線的所有值標準化。
在這一層的意義上，可以觀察到從0%到100%內化曲線，且因此其可以定義出三個不同的效價範圍：
1.「低」即是指具有範圍落在相對於該高原區0%至50%之內化百分比內的配體。
2.「中等」即是指具有範圍落在相對於該高原區50%至90%之內化百分比內的配體。
3.「高」即是指具有範圍落在相對於該高原區高於90%之內化百分比內的配體。
換句話說，此一概念可被歸納於以下表1中：
在本發明的替換具體實施例中，步驟a)的人類淋巴細胞群可在室溫下溫育。
該抗-CD26配體係為能夠與CD26受體專一性結合之任何分子，較佳地為抗-CD26單株抗體或其片段，更佳地為貝格洛姆單抗。
在本發明的方法之一較佳具體實施例中，步驟a)的抗-CD26配體之濃度為0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.5μg/ml、或2μg/ml。
在本發明的方法之一較佳具體實施例中，步驟b)之抗-CD26的抗體係為小鼠抗人類CD26 APC螢光標記共軛類型(BD Pharmingen公司；目錄型號：563670，細胞株編號：M-A261)，並且係以2.5μg/ml的濃度來進行培養。
依據本發明之方法的另一較佳具體實施例，在步驟b)中所使用之螢光染料係為可用於細胞螢光分析中之任何螢光染料，其係選自於由FITC、APC、PE、PE-Cy7、APC-H7、PerCP與PE-Cy5.5所構成的群組。該螢光染料係較佳地為APC。
再一次，依據本發明之方法的一較佳具體實施例，步驟a)的CD26+T淋巴細胞群，係選自於初代T淋巴細胞，以及人類T淋巴細胞之腫瘤細胞株的群落。較佳地，該人類T淋巴細胞腫瘤細胞株係是Karpas 299細胞株。
在依據本發明之方法的一較佳具體實施例中，步驟c)的細胞螢光分析係藉著FACS來進行。
依據本發明之方法也提供了該抗-CD26配體的效價之進一步驗證步驟，其提供了一種上述配體所釋放的細胞介素之抑制試驗，該細胞介素係選自於由IL-8、IL-1β、IL-6、IL-2、GM-CSF、IL-6與TNF-α所構成的群組，其等係作用於步驟a)之CD26+人類T淋巴細胞的群落上。在較佳具體實施例中，該細胞介素係為IL-8及/或IL-1β。步驟a)的該CD26+人類T淋巴細胞群，係選自於初代T淋巴細胞，以及人類T淋巴細胞之腫瘤細 胞株的群落。較佳地，該人類T淋巴細胞腫瘤細胞株係為Karpas 299細胞株。
在一較佳具體實施例中，該細胞介素生產的抑制試驗係藉由MesoScale Discovery(MSD)分析來進行。
本發明現在將基於例示而非限制之目的，而依據較佳具體實施例特別是參照隨附圖式來加以描述，其中：-圖1顯示以MSD分析來分析促炎性細胞介素含量之細胞培養流程。
-圖2顯示在周邊血液之初代單核細胞與經純化的CD4+T細胞(A)以及人類T細胞株Karpas 299(B)中，CD4+細胞(深色柱)與CD26+細胞(淺色柱)之百分比的細胞螢光分析。
-圖3顯示在溫育8小時之後Karpas 299細胞中(A組)，以及在4℃與37℃下溫育初代CD3+、CD4+、CD8+T細胞6小時與24小時之後(B、C、D組)，貝格洛姆單抗對CD26受體之內化的影響。
-圖4顯示貝格洛姆單抗在T細胞株中Karpas 299(A組)與在初代T細胞中(B組)中，所誘發之細胞介素IL-2、IL-8，IL-1β、GM-CSF、IL-6和TNF-α抑制程度。在該等圖式中，在縱坐標軸的左側標示電化學發光訊號值，而在橫坐標軸則標示對應的濃度。
-圖5顯示在Karpas 299細胞中以貝格洛姆單抗處理24小時後，與CD26有關之螢光減少現象。
-圖6顯示在Karpas 299細胞中，以從0.0005μg/mL(3×10-12M)之低劑量開始，至等150μg/mL(1×10-6M)之較高濃度的貝格洛姆單抗處理24小時後，與CD26有關之螢光減少現象。
-圖7顯示通過FACS分析所獲得之CD26的劑量反應的內化曲線(RFI)，其係針對在不同的溫度條件下(SVI-STB係為效價減低之樣本，其係為置於32.5℃下6個月之安定性加速樣本)儲存之貝格洛姆單抗來進行。
-圖8顯示針對於不同的細胞螢光計，通過FACS分析所獲得之該CD26內化曲線(RFI)。
-圖9顯示所觀察的相對於貝格洛姆單抗(WS-BEG-013)，小鼠單株抗-hCD26抗體(細胞株202.36)之相對效價。
-圖10顯示所觀察的相對於貝格洛姆單抗(WS-BEG-013)，該IgG2b小鼠抗體的K同型抗體(細胞株MG2b-57)的相對效價。
-圖11顯示測試樣本(TEST)的效價值，其係相對於參考標準RS(貝格洛姆單抗)來進行計算，以證實被命名為TEST之任何未知樣本的相對活性是如何相對於該參考標準(RS)來進行定量測量。
-圖12顯示被用來測定低、中等或高效價之標準的兩個範例圖式。
為了要更充分地說明本發明，現在提供以下應被視為是例示說明且並非限制性之實施例。
實施例1：針對單株抗體貝格洛姆單抗的作用機制之研究
為了產生用於在活體外評估該抗體之有效性的測試，針對貝格洛姆單抗(抗-CD26)的作用機制進行了研究。
該被稱為效價測試的測試方法之研發，對於測量特定藥物之生物學活性來說非常重要，因為在作為批次放行檢測之品質管制的範疇內，該活性在早期開發、先導研發、以及市場行銷等階段，均係為分子品質管制的重要構成部分。
具體來說，例如單株抗體之許多生物產品，係透過與細胞或可溶性靶標結合來發揮其之作用，隨後在該分子靶標的下游誘發適當的細胞事件。
因此其評估了以下內容：
˙CD26在人類T細胞株與人類初代T細胞中之表現/過度表現。
˙CD26在與貝格洛姆單抗結合之後的內化作用。
˙貝格洛姆單抗對於促炎性細胞介素的產生與釋放之影響。
材料和方法 初代細胞與細胞株
該人類T細胞株係自購自於SIGMA(Cat.06072604-1VL)的Karpa299淋巴瘤之T細胞。將該Karpas 299細胞培養在含有GlutaMAX的RPMI1640中(Gibco，cat.#72400)，其係補充了10%高溫滅菌小牛血清(Sigma，cat.#F2442，該高溫滅菌作業係在實驗室中進行)、1IU/ml盤尼西林/鏈黴素(Gibco，cat.#15140)、2mM的L-麩醯胺酸(Gibco，cat.#2503)、以及50μM的β-巰基乙醇(Sigma-Aldrich公司，cat.#M3148)。在解凍後，將該細胞增殖並冷凍保存。
將該細胞株加以分析，來評估黴漿菌是否存在(MycoAlertTM，Lonza，cat.#LT-07)，而並未發現後者。周邊血液單核細胞(PBMC)係係依據聖拉斐爾倫理委員會(IRB)批准的方案，在知情同意後通過葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分離梯度(Lymphoprep，Fresenius)，而自三個健康捐贈者得到的膚色血球層分離。為了要評估細胞存活率，將該PBMC以萘胺藍染色，並在血球計算盤中進行計數。將該PBMC係在開始實驗之前，係在37℃下於具有低劑量的IL-2(50IU/mL)與IL-7(5μg/mL)之完全培養基(RPMI 10%FBS+1%PenStrep與麩醯胺酸)中，培養隔夜(o/n)。
為了測定CD26在人類初代CD4+T細胞與T細胞株之細胞表面上的表現，購入該抗體α-CD26-FITC株BA5b(Biolegend，cat.#302704)。在三個捐贈者的初代 T細胞與Karpas 299細胞上，於稀釋範圍內測試抗體，以確定進行細胞螢光測定的最佳濃度。該最佳濃度將用於測定CD26在人類初代CD4+T細胞與T細胞株上表現之百分比，並用於測定CD26的內化作用。
CD26在T細胞株與人類初代CD4+ T細胞中之表現
將來自兩個捐贈者的初代CD4+細胞與Karpas 299細胞，以100,000個細胞/孔之密度，於96孔V型底板(Costar，cat.#3598)中，接種於添加0.2%BSA(Miltenyi公司，cat.#130-091-376)的autoMACS緩衝液(Miltenyi，cat.#130-091-222)內。該等細胞係於一定濃度範圍之α-CD26-FITC或α-IgG2a-FITC(Biolegend，cat.#400208)內培養15分鐘，該範圍係為從2.5μg/ml至31.3ng/ml。該等細胞接著係於4%甲醛中清洗並固定。陽性反應之CD26細胞的百分比，係使用FACSCanto II而藉由細胞螢光來測定。IgG-FITC係被用來測定非專一性鍵結。
在人類初代細胞與T細胞株上之CD26表現的定量
細胞螢光係用於測定在初代周邊血單核細胞(PBMC)與CD4+T細胞，並且還有該Karpas 299細胞株的細胞膜上，CD26的表現量。CD4+標記係被加入以作為T細胞標記。來自三個捐贈者的初代CD4+ T細胞與Karpas 299細胞，係以100,000個細胞/孔之密度，於96孔V型底板(Costar，cat.#3598)內，接種於MACS緩衝液中。該等細胞係以10μg/ml的α-CD26-FITC與2.5μg/ml的α-CD4，培養15分鐘。加入10μg/ml的α-IgG2a-FITC 與2.5μg/ml的α-IgG2b-APC(Biolegend，cat.400612)，以允許其進行圈選。該等細胞接著係於4%甲醛中清洗並固定。CD4+與CD26+細胞的百分比，係使用FACSCanto II藉由細胞螢光來測定。
測定CD26的內化作用
貝格洛姆單抗誘導在T細胞中之CD26受體的內化能力(在人類初代T細胞以及在T細胞株兩者內)，係透過細胞螢光分析來進行測定。該測定係在兩項獨立的實驗中進行。每次實驗係自三個膚色血球層分離CD4+ T細胞。接著，PBMC與所分離的細胞都以抗-CD4與抗-CD26抗體來進行標記，以測定所分離之細胞群落的純度，以及在實驗前之CD26細胞的百分比。此外，也可加入存活染料，以確保該實驗是在活細胞中進行。該等細胞係透過細胞螢光測定法來進行分析。
該CD4+細胞係因為CD4+群落的純度為>95%；在該CD4+群落中之CD26+細胞的百分比>75%，而被評估為具有良好的品質。該T-細胞株係以100,000個細胞/孔，接種於塗覆有2μg/ml的抗-CD3/抗-CD28(分別為eBioscience，cat.#16-0037-85與16-0289-85)之96孔平底板(Corning Costar，cat.#3598)內，並在37℃下培養2小時。在培養隔夜之後更換培養基，並將該等細胞以總體積為100μl的0.03mg/ml(2×10-7M)的貝格洛姆單抗、做為對照組之IgG2b(Sigma-Aldrich,cat.#SAB4700729或Biolegend,cat.#401202)、或是做為對照載體之PBS(Gibco，cat.#10010)來進行培養。各條 件試驗三次(三個細胞孔/條件)。該等處理係在4℃與37℃下進行8小時。接著將該等細胞標記，並以細胞螢光測定法來測定在CD4+細胞中，CD26+細胞的百分比。此外，在該處理開始前將一組細胞加以標記並在進行分析，以測定在0時之時CD4+CD26+細胞之百分比。在進行實驗當天，藉著1,500rpm離心5分鐘來分離PBMC，並分別與不同濃度的貝格洛姆單抗培養6和24小時。在以貝格洛姆單抗培養之後，清洗PBMC並用以下單株抗體來標記：與FITC-、PE-、APC、APC-H7-(Biolegend)拼合之CD3、CD4、CD8和CD26之人類抗體。前述已經說明，抗-CD26單株抗體可以與和貝格洛姆單抗不同之抗原決定區結合。與該螢光團拼合之對應於貝格洛姆單抗(IgG2b)的同型抗體，總是被用來作為陰性對照組。使用FACS Canto II流式細胞儀(BD Biosciences)來分析樣本。運用Flow Jo軟體(Tree Star Inc.)來分析所有數據，並以CD4+或CD8+細胞的相對螢光強度(RFI)來呈現。此一數值係藉著把標記了抗-CD26的樣本之平均螢光強度，除以對應的同型對照組來加以計算。
用於促炎性細胞介素的9-叢MSD(9-plex MSD assay)測定法
為了評估貝格洛姆單抗在T細胞活化中的作用，其針對促炎性細胞介素的產生進行了評估。
為了此一目的，係採用MesoScale Discovery(MSD)測定法，也就是9-叢測定法來分析人類促炎性細胞介素(cat.#15007B-2)。該初代T細胞與該 Karpas 299 T細胞株，係如以上(第4.1.1.2節)所描述的，以100,000個細胞/孔接種於塗覆有抗-CD3/抗-CD28之96孔平底板，並培養隔夜。
將該等細胞保持在含有GlutaMAX之RPMI 1640培養基中，並補充10%HI-FBS、1%青黴素/鏈黴素、2mM L-麩醯胺酸、以及50μMβ-巰基乙醇。該等細胞係如圖1中所示，以IL-12和貝格洛姆單抗進行處理。簡而言之，將該等細胞以20ng/ml di IL-12(R&D systems，cat.#219-IL-0059)與對照載體(0.1%牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，cat.#A2153-1kg)-PBS)預培養隔夜，或者是在沒有IL-12/對照載體的情況下培養隔夜。第二天，將沒有以IL-12隔夜預培養之細胞，與20ng/ml的IL-12一起培養2小時。接著，將這些所有的細胞以0.03mg/ml(2×10-7M)的IgG2b(Biolegend公司)、貝格洛姆單抗或PBS對照載體，一起培養6小時或24小時。在所有的實驗中，在該預定時間後收集該上清液，並冰凍在-80℃下直到需要進行新的分析。
為了要測試以抗-CD3和抗-CD28「塗覆」對於細胞介素分泌之影響，在經塗覆與未經塗覆的接種板上測試該等細胞，並以IL-12預培養隔夜，隨後以貝格洛姆單抗/IgG2b/PBS進行處理24小時。
細胞介素MSD分析可以檢測白細胞介素2(IL-2)、IL-8、IL-1β、顆粒球巨噬細胞株刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及IL-12p70的含量。該MSD細胞介素分 析係依據製造商的說明來進行，該接種板係在4℃而不是在室溫下封阻1小時，以防止可能發生之非專一性鍵結。採用該實驗之細胞培養適應期來製備該標準化曲線。MSD Discovery Workbench 4.0.12軟體，係用於生成標準化曲線並用於計算細胞介素濃度(pg/ml)。將該樣本的數值輸入該標準化曲線，以測定其等是否落在其之範圍內。以GraphPad Prism 6來製備所有細胞介素的圖式。最初，用於進行統計分析之比IgG2b對照組高兩倍之貝格洛姆單抗的抑制作用，係被任意地設定為閾值含量。
然而，由於在各種條件下均呈現出1.9倍的抑制作用，該閾值係被改變為1.9。為了在處理條件中評估統計顯著差異，在Graph Pad Prism 6.0中係以事後比較土耳其測試來運用雙向ANOVA測試，而獲得可以在多個試驗上調整的p值。
結果 CD26在人類T細胞株與人類初代T細胞中之表現/過度表現
圖2顯示在純化的CD4+ T細胞與Karpas 299細胞株中，來自周邊血的單核初代細胞群中，CD4+和CD26+細胞的百分比。通過細胞螢光測定法所獲得之結果，顯示在初代單核細胞中CD4+和CD26+細胞的百分比，係分別為大約>45%與>35%，而在分離CD4+ T細胞之後，此等百分比係分別變成>95%與>75%(圖2，A組)。幾乎所有的Karpas 299細胞都表現出CD4(>95%)以及高 含量之CD26(>95%)(圖2，B組)。總之，在分離的初代CD4+ T細胞群與Karpas 299細胞株中，CD26陽性細胞的百分比係分別為大約75%與95%。上述百分比也足夠用來在隨後的實驗步驟中，用於測量CD26含量的變化。
CD26的內化作用
細胞螢光分析係用來測定在初代T細胞與T細胞株中，貝格洛姆單抗誘導的CD26內化作用。相同的分析方法也被用來確認，在所存在之CD26減少與貝格洛姆單抗的濃度之間的劑量相關關係。在Karpas 299 T細胞株中，測定CD26+細胞的百分比，以及在該CD4+群落中CD26+的平均螢光強度(MFI)。在T Karpas 299細胞株中，僅會在37℃下，8小時後可以在CD4+群落中觀察到CD26 MFI減少的現象(分別為在4小時後出現7%的抑制作用-未在圖中報導之數據-以及在8小時後達22.3%)(圖3，A組)。此一減少現象在CD4+群落於37℃下，以貝格洛姆單抗培養8小時後，相對於以在4℃下進行的培養作業，也就是在所有的生物過程都受到低溫抑制時，CD26的MFI中係為統計學上顯著的。所獲得的數據顯示，在37℃下接著與貝格洛姆單抗結合之Karpas 299細胞質中，每個單一細胞的CD26受體數量會減少。由於在4℃下完全沒有觀察到相同的生物學現象，可以推斷CD26受體在與貝格洛姆單抗結合之後，會呈現在Karpas 299 T細胞株中之抗體作用機制。為了確保在Karpas 299細胞中與貝格洛姆單抗結合，所誘導的CD26受體的內化作用，可以用來作為臨床開發之批 次放行的效價測試，而進行劑量反應實驗。在上述實驗中，Karpas 299細胞係在37℃下以遞增之貝格洛姆單抗濃度來處理，請具體地係以0.5μg/ml(3×10-9M)、5μg/ml(3×10-8M)、與30μg/ml(2×10-7M)來處理24小時(圖5)。所得到之結果已經顯示，不斷遞增之抗-CD26濃度，可以在細胞膜中誘發逐漸增加之CD26內化現象，係具有極大的益處。明確地說，劑量為0.5μg/ml、5μg/mL與30μg/ml的貝格洛姆單抗(其等分別為3×10-9M、3×10-8M與2×10-7)，係對應於26.9%、34.5%、與43.8%之內化百分比。此一劑量反應效應係為開發效價測試之必要條件。
為了評估貝格洛姆單抗對於初代T細胞的影響，將衍生自周邊血的單核細胞在37℃下，以貝格洛姆單抗在三種不同條件(6μg/ml；30μg/ml與150μg/ml；4×10-8M、2×10-7M與1×10-6M)下培養6小時和24小時。在進行培養之後，立即標記該等細胞以評估其等之CD26表現。作為對照組，該單核細胞係在4℃下，以最高濃度的貝格洛姆單抗(150μg/ml，也就是1×10-6M)進行培養。在6小時之後，相較於在CD4+與CD8+T細胞中之CD26基線含量，可以觀察到CD26內化程度顯然減低(雖然並不顯著)(圖3，B組)。然而，在24小時還是可以獲得了統計學上顯著之結果(*，P<0.05)，特別是對於CD8+T細胞(圖3，C組)。如先前在Karpas 299細胞株所觀察到的，該單核細胞在4℃下以貝格洛姆單抗培養時，會減低CD26的調減功效(圖3，D組)，這說明了該抗體CD26複合物之內化作用的主動阻斷現象。簡而言 之，在以貝格洛姆單抗培養24小時之後，當其以濃度為30μg/ml(2×10-7M)的貝格洛姆單抗處理時，Karpas 299細胞中之CD26的表現係減低至43.8%，而此一現象係與抗-CD26的劑量有關(圖5)。正如所預期的，在4℃下在所分析之細胞表面上，並未在CD26的表現上觀察到變化。所獲得的結果清楚地說明，CD26受體係因應於與貝格洛姆單抗的結合而內化，隨後消除CD26+T細胞亞群的關鍵活化訊息。
促炎性細胞介素之釋放
考量到CD26的內化作用，可能會對該T細胞活化作用造成各種下游效應，於初代T細胞與Karpas 299細胞中，係針對某些促炎性細胞介素的含量，以貝格洛姆單抗加以處理之後來進行評估。
促炎性細胞介素可以被區分為兩組：第1組係與急性發炎有關；第2組則涉及慢性發炎。例如IL-1、TNF-α、IL-6、IL-11、IL-8之細胞介素與G-CSF和GM-CSF之其他趨化介素係屬於第一組。第二組可以進一步區分為例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和IL-13之可以介導體液反應的細胞介素，以及例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、干擾素、轉變生長因子-β以及腫瘤壞死因子α與β之可以介導細胞反應的那些細胞介素(Shaikh PZ，2011)。
促炎性細胞介素係為涉及例如類風濕性關節炎、多發性硬化症、GvHD等等一系列自體免疫疾病之分子。在這些疾病的致病機轉中，特別是在發炎過程中， CD26扮演著關鍵角色。基於此一理由，我們將對貝格洛姆單抗某些促炎性細胞介素的抑制作用進行評估。更具體地說，其將分析以下細胞介素的含量：白細胞介素-2(IL-2)、IL-8、IL-1β、顆粒球巨噬細胞株刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及IL-12p70。上清液樣本的一系列稀釋液係被在該測定中用來作為預先測試，對於所有的細胞介素來說，結果顯示除了在暴露在作為訊息之IL-12的IL-12p70細胞之上清液以外，該未經稀釋的樣本均係落在標準化曲線範圍內(未顯示)。基於此一理由，25μl之未經稀釋的標準上清液，係在MSD測定中進行測試。在這兩個實驗中，在所有測定板中之所有細胞介素的標準曲線，均呈現出經過充分校準的曲線。
將待分析的樣本插入至該標準化圖表內，以確認其等是否是落在檢測範圍內。測量並分析除了IL-12p70以外的所有細胞介素含量，雖然在初代T細胞捐贈者和Karpas 299T細胞株之間，有觀察到細胞介素含量的改變，而在一定條件下的含量則係低於檢測極限水平。在兩個實驗中，所分析之所有細胞群中之IL-1β和IL-6含量都非常低。如先前在文獻中所報導的(Vacaflores A.等人，2016)，以IL-12來處理該等細胞，在許多種條件下都清楚地誘導了IL-1β、IFN-γ、IL-6和IL-10的生產。因此，在IL-2、IL-8、IL-1β、顆粒球巨噬細胞株刺激因子(GM-CSF)、IL-6與腫瘤壞死因子α(TNF-α)，都可以觀察到在以貝格洛姆單抗處理之後的細胞介素的抑制作用(圖4)。
在Karpas 299細胞與初代T細胞中，於相同條件下都可以觀察到以貝格洛姆單抗培養之後，在IL-8與IL-1β含量強烈降低現象。
以下表2概要描述了貝格洛姆單抗在初代T細胞與Karpas 299細胞中，對於分泌不同細胞介素之抑制作用，其明確顯示了在37℃下培養該等細胞6或24小時之後，由貝格洛姆單抗所誘導之促炎性細胞介素含量的抑制作用。
此外，為了測試「塗覆」對於細胞介素分泌之影響，該等細胞係如「材料與方法」一節所述，在以抗-CD3/抗-CD28來塗覆，以IL-12、貝格洛姆單抗或適當的對照載體來處理之測定板上進行測試。一般來說，可以觀察到該細胞介素含量係無法被檢測出，或者係被證實在未經塗覆之測定板中係比經塗覆測定板還要低。這說明了該塗層對於構成用於研究貝格洛姆單抗在細胞介素含量中之功效的測定窗口來說，係不可或缺的。使用未經塗覆的測定板來測量貝格洛姆單抗對於細胞介素含量的功效，並未被進一步分析。在此一實驗的基礎上，所得到的結果說明該貝格洛姆單抗能夠強烈地降低在初 代T細胞與Karpas 299的兩種細胞中，例如IL-8、IL-1β與IL-6之特定細胞介素的生產，其彰顯了抗-CD26(貝格洛姆單抗)在治療自體免疫性疾病中之作用機制。
實施例2：建立用以測定該抗-CD26配體的效價之細胞分析法
本實驗部分之目的係要建立一種抗-CD26配體之活性的細胞測定法，其係由已知的抗-CD26單株抗體-貝格洛姆單抗開始。
貝格洛姆單抗係為一種由雜交瘤細胞所產生的抗-CD26單株抗體，其之臨床標的係為抑制在同種異體移植物中，捐贈者之T淋巴細胞的活化。
該分析法之目的係要測量存在於T淋巴細胞細胞膜上之CD26含量的變化(Karpas 299，CD4陽性)，其係在活體外以遞增之貝格洛姆單抗濃度來處理後者。
CD26係為一種與T淋巴細胞的活化有關，具有二肽基肽酶活性之膜醣蛋白。初步的數據證實在24小時的處理之後，貝格洛姆單抗誘導人類T淋巴細胞與Karpas 299細胞的表面上之CD26內化作用的能力。
具體來說，該等細胞係在37℃下以濃度遞增的貝格洛姆單抗來培養24小時，並接著以能夠分別與CD4和CD26受體結合，並且係與會在不同波長發光之螢光團拼合的兩種抗體來染色。在該FACS分析期間，對於所測試之各種濃度的貝格洛姆單抗，所測量之該螢光強度係與存在於每個單一細胞的該細胞表面上的CD26含量成比例。此一參數然後以儀器藉著計算選自陽 性CD4細胞群上，所得到之20,000單一螢光訊號擷取事件的中位數來量化。
細胞樣本的染色程序與FACS分析
在預先設定之貝格洛姆單抗培養時間到期時，該等細胞樣本係依據以下染色方法以與螢光團拼合之抗體來處理，然後透過FACS來分析表面CD26之表現：- 將每個孔中之物質轉移至1.5mL的微量離心中；- 在10,000rpm下離心5分鐘；- 以1mL之冷DPBS來洗滌該片狀沈澱物；- 在10,000rpm下離心5分鐘；- 將該片狀沈澱物乾燥並依據以下表3中所描述之FACS分析之培養程序，以後續抗體染色。
- 將該樣本渦旋震盪並在室溫下於黑暗中培養30分鐘；- 加入1毫升的DPBS並在10,000rpm下離心5分鐘；- 倒掉上清液並以1mL之冷DPBS來洗滌該片狀沈澱物；- 在10,000rpm下離心5分鐘；- 將該細胞片狀沈澱物在0.7-1E6細胞/mL的濃度下，重新懸浮於DPBS-5%FBS中並將該樣本儲存在 黑暗中於4℃下，直到讀取FACS讀數。如果無法在白天進行讀取，則藉由添加最終濃度為0.36%之聚甲醛來固定細胞。
在進行FACS分析期間，對於所測試之每種濃度的貝格洛姆單抗，均測量其與每個單一CD4陽性細胞之細胞表面上，所存在的CD26含量有關之螢光強度。此一參數然後由儀器以選自陽性CD4細胞群上，所獲取的20,000個事件的螢光所衍生之平均值來量化。為了獲得與FITC和APC有關的兩種螢光數據，由於這兩種螢光團係以不同波長發射，因此並不需要進行補償動作。
該數據接著運用BD FACS Diva程式進行再處理，其允許將CD26的表現含量，計算為在獲取數據時所記錄之所有事件的平均值(選自陽性CD4細胞群上)。
結果
貝格洛姆單抗的生物學活性，係以誘導Karpas 299細胞之細胞膜表面上所存在的CD26內化之能力來進行測量。
CD26在以遞增的貝格洛姆單抗濃度來處理之後的內化量，係以結合至該細胞膜表面所表現的CD26之該專一性抗體，所放射之平均螢光值的減低程度來測量(APC小鼠抗人類CD26，細胞株M-A261 RUO BD Pharmigen代碼563670)。
其之目的是要藉由批次與WS的比對效價測試，來產生每一批次產品之濃度-反應曲線，來與藉由將 該細胞以工作標準(WS)來處理所獲得之濃度-反應曲線進行比較，其中該曲線的平行度係為該測定之適用性的必備條件(以PLA.3分析軟體來進行平行檢定)。
如可以從圖5之該圖式中所看到的，在以貝格洛姆單抗處理24小時後，Karpas 299細胞減少大約40%之CD26相關螢光。
此外，此一在Karpas 299細胞中之作用係被證實為濃度-反應，這是研發細胞試驗所必需之條件。
所觀察到的功效係為貝格洛姆單抗專有的，因為IgG2b池(貝格洛姆單抗所歸屬的IgG類型)在任何測試條件下都不會誘導CD26內化。
為了獲得該生物效應的最佳生長條件之評估，決定以貝格洛姆單抗重複培養24小時，並在以Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28刺激後(Gibco kit,Life Technologies,code 11131D)，使用CD3+T淋巴細胞來進行。
CD26的內化百分比
從圖6中的圖式可以發現，在以貝格洛姆單抗處理24小時後，採用最高濃度的貝格洛姆單抗來處理後之Karpas 299細胞，其之CD26相關螢光減少大約48%(相當於150μg/mL，或1x10-6M)。
該濃度-反應曲線的擴展允許其得到較低的反應極限，其係相當於0.01μg/mL(7×10-11M)。
確認IgG2b池係缺乏效果(用來作陰性對照組)。
隨後的試驗係被設計以減少曲線的複雜性(以驗證該曲線是否具有單相或多相模式)。
不同樣本的貝格洛姆單抗之效價評估
然後進行三種貝格洛姆單抗樣本的效價評估，其中一種係置於32.5℃之安定性加速條件下儲存6個月(SVI-STB製備)。
依據FACS分析，批次1與批次2兩個獨立製備物之間，於CD26的內化動力學方面並沒有實質差異。
相反地，SVI-STB的製備物，藉著在32.5℃下培養6個月之貝格洛姆單抗降解樣本，在誘導CD26的內化方面似乎比其他者較沒有效果(圖7)。該結果可以支持改變貝格洛姆單抗樣本之方法的功能。
如可在圖7的圖式中看見的，貝格洛姆單抗所選擇的8個濃度，顯示儲存在4℃下之貝格洛姆單抗樣本，以及長時間承受至32.5℃之熱偏移的貝格洛姆單抗樣本，於曲線的中心區域呈現高變異性。
均儲存在4℃之最佳條件下的兩種貝格洛姆單抗樣本，在曲線的中心區域則沒有變異。
以不同的流式細胞儀來評估效價
為了要確保在以抗-C26培養後所獲得之CD26內化作用的結果，在改變讀取技術後也可以再現，我們使用兩種不同製造商之細胞螢光計來進行該內化實驗。
所獲得的結果(圖8)清楚地顯示，屬於不同細胞螢光計之技術，並不會改變內化曲線的結果。
具體而言，在這兩項實驗中可以輕易地辨識出，並非保存於最佳條件下之該貝格洛姆單抗樣本(SVI-STB)，相較於另外2個保存於最佳條件下之該貝格洛姆單抗樣本時，其在該曲線的中央部分顯示出高的變異性。
結論
藉著使用Karpas 299細胞株來進行的實驗測試，證實以貝格洛姆單抗誘導細胞膜之CD26的內化作用為基礎的細胞分析法，具有臨床運用藥物之批次放行測試功能的所有特性。
明確地說，該以貝格洛姆單抗培養之後的CD26內化作用為基礎之測試，允許對於臨床運用藥物之批次放行的各種特性中之任何可能的偏差，以專一且可再現的方式來進行鑑定。
實施例3：以其他抗-CD26抗體進行之效價測定驗證
該效價測定係以另外兩種抗-CD26抗體來進行測試：
- 小鼠抗-hCD26-mAb，(抗體株202.36)Thermo Fisher公司代碼：MA1-35147；批次：311030F
- IgG2b，小鼠同種異型K(抗體株MG2b-57)BioLegend公司代碼：M1395係作為陰性對照組。
為了檢測在細胞膜中之CD26，係使用該與APC(抗體株M-A261)BD Pharmingen公司代碼：563670；批次：8116645拼合之小鼠抗人類CD26抗體。
圖9與圖10顯示相對於貝格洛姆單抗(WS-BEG-013)所觀察到之相對效價。依據所獲得的結果，該抗體株202.36呈現出大約0.01的相對效價，而抗體株MG2b-57則呈現顯示為完全不具活性。如所觀察到的，依據本發明之效價測試因此也適用於其他CD26配體。
同樣在圖9中，在比較CD26於接近參考化合物WS-BEG-013(2μg/mL)之漸近線濃度的內化作用時，僅觀察到WS26-BEG-013(32.5%)出現大於30%之最大內化作用，而專一性地測試之抗體株202.36的該抗體，則是要比20%低得多(11.5%)，依據所宣稱的標準，這證明其係為具有低效價(即<20%，也就是<高原區%的50%)的抗體。
圖11顯示測試樣本(TEST)之效價值，其係相對於參考標準(RS)來進行計算，以顯示如何相較於貝格洛姆單抗來定量測量相對活性。在此一情況下，該參考標準品(RS)係濃度為1.8mg/之貝格洛姆單抗，而測試樣本則是濃度為1.26mg/mL的貝格洛姆單抗，也就是RS濃度的70%，其具有等於TEST/RS的濃度比之相對於RS之預期效價(例如1,26/1.8=0.7，也就是70%)。在圖11中，證實了在濃度比為70%，是如何如預期地觀察到為70%之相對效價(依據指南USP 1034「生物頻評估分析」中位數軟體PLA 3.0來進行計算)。
在圖11的圖式中，MFI值170代表細胞膜CD26的最大表現值(最大的水平漸近線)，而該數值110則代表達到CD26的最大內化值之該MFI值，因此其係對應於最小細胞膜表現之該數值(最小水平漸近線)。在此一範圍內，每個測定中均以絕對值來界定，且係藉由測量測試曲線與貝格洛姆單抗參考曲線的相對距離來進行效價估計。
在該圖式所顯示之直方圖中，顯示CD26相對於其最大細胞膜表現之內化百分比，其係由所測量到之最大MFI值來呈現(170)。在參照測試化合物時，此一百分比係與相對效價有關：- 在MFI值為130時，RS內化了在細胞膜中存在之23.1%的CD26，相較之下測試組僅內化18.5%(測試組/參考組比=0.80)；- 在MFI值為110(細胞膜CD26的存在最小)時，RS內化了在細胞膜中存在之12.1%的CD26，相較之下測試組僅內化9.9%(測試組/參考組比=0.82)。
可以觀察到，效價值不僅僅是在一點上之內化比，而是計算在兩個EC50s之間的相對比率，其等分別為參考組0.04342μg/mL，測試組0.06644μg/mL。
事實上，在所討論的範例中之該效價可以EC50 RS/EC50測試組來估計，而得到等於0.65之數值，也就是能夠確認該測試組的效價係為RS的效價之大約70%。
此外，藉著比較在接近於RS(2μg/ml)之該最低水平漸近線的濃度處之CD26內化作用，所觀察到之高於30%的CD26最大內化作用RS(36%)與測試組(35.9%)兩者，依據所宣稱的標準，這兩種案例都係為高效價，也就是>30%。
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Claims (11)

  1. 一種用於活體外測定抗-CD26配體之效價的方法，其包括以下步驟：a)在37℃或在室溫下，以濃度範圍落在0.001μg/ml至150μg/ml之抗-CD26配體，來溫育會以高於75%的比例，表現該CD26受體之人類T淋巴細胞群；b)與抗-CD26抗體一起溫育，該抗體係以會辨識在該CD26受體上之一抗原決定區的螢光染料來標記，該抗原決定區係與步驟a)的抗-CD26配體所識別者不同；c)藉由細胞螢光分析的方式，來測定以抗-CD26配體來處理的細胞樣本之CD26的MFI值(MFI T)，以及未經處理細胞的MFI值(MFI NT)；d)評估CD26受體的內化百分比(%int CD26)或依據以下方程式來計算之RFI： 其中，如果%intCD26的值為：- 小於20%，則代表該抗-CD26配體係為低效價；- 範圍落在20%至30%，則代表該抗-CD26配體係為中等效價；- 高於30%，則代表該抗-CD26配體係為高效價。
  2. 如請求項1之方法，其中該步驟a)的抗-CD26配體濃度係落在0.01μg/ml至100μg/ml，更佳地為0.01μg/ml至2μg/ml，甚至更佳地為0.01μg/ml至0.5μg/ml的範圍內。
  3. 如請求項1至2中任一項之方法，其中步驟a)的該抗-CD26配體係為一抗體或其片段。
  4. 如請求項3之方法，其中該抗-CD26抗體係為單株抗體貝格洛姆單抗(begelomab)。
  5. 如前述請求項中任一項之方法，其中該步驟b)的螢光染料係選自由FITC、APC、PE、PE-Cy7、APC-H7、PerCP與PE-Cy5.5所構成的群組，較佳地為APC。
  6. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟a)的該人類CD26+T淋巴細胞群係選自於一初始T淋巴細胞群及人類T淋巴細胞的腫瘤細胞株。
  7. 如請求項6之方法，其中該人類T淋巴細胞的腫瘤細胞株係為Karpas 299細胞株。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中該步驟c)的細胞螢光分析係藉由FACS來進行。
  9. 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含：在步驟a)的人類CD26+T淋巴細胞群上進行之一炎性細胞介素之生產抑制作用的測定步驟，該炎性細胞介素係選自由IL-8、IL-1β、IL-6、IL-2、GM-CSF、IL-6與TNF-α所構成的群組。
  10. 如請求項9之方法，其中該細胞介素生產的抑制作用係藉由MesoScale Discovery(MSD)試驗的方式來進行評估。
  11. 如請求項9或10之方法，其中該人類CD26+T淋巴細胞係為Karpas 299細胞株。
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