TW201934187A - 抗體藥物結合、純化、及調配之方法 - Google Patents

抗體藥物結合、純化、及調配之方法 Download PDF

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理查 席爾瓦
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Abstract

本文提供產生、純化、及調配抗體藥物結合物(ADC)之方法。該等方法使用連續結合過程、單程切向流過濾、逆流滲濾、及/或在線過程自動化技術。該等方法減少過程時間及成本且改良產物一致性。

Description

抗體藥物結合、純化、及調配之方法
本發明之領域大體上係關於使用連續結合過程、單程切向流過濾、逆流滲濾、及/或在線過程自動化技術產生、純化、及調配抗體藥物結合物(ADC)之方法。
與抗體藥物結合物(ADC)相關聯之製造瓶頸係雜質之移除及ADC向穩定緩衝液中之交換。目前，這使用結合及溶離管柱層析術或藉由切向流過濾(TFF)之主體(習知)滲濾來達成。本體滲濾涉及以緩衝液A (即，結合物最初所在的緩衝液)注入TFF系統。然後將ADC (於緩衝液A中)添加至滲餘物容器中，在該滲餘物容器中與初始體積混合。滲餘物容器之進料泵將來自滲餘物之結合物泵送於TFF膜上，在該TFF膜上其經保留(並返回至滲餘物)或丟棄。另一泵(滲濾泵)從該容器進料至容納於單獨容器中的緩衝液B (即，ADC將交換至其中的緩衝液)，進料管線為自該容器至滲餘物容器中。將兩個泵啓動，且滲餘物容器中之結合物開始通過TFF膜。在緩衝液經由廢物流移除時，滲餘物中之體積藉由將緩衝液B (以相等體積)添加至滲餘物容器中來維持。因此，結合物緩慢地交換至緩衝液B中。此純化方法成本高且就大規模製造而言不是最佳的，因為需要使ADC在TFF膜上再循環多個循環。再循環導致高加工體積及時間以及ADC於潛在高剪切區域的暴露增加。使用大量加工的ADC製造需要約4-5天來生產一批經純化、經調配的結合物，通常產率低。據此，需要改良的ADC結合過程。
單程切向流過濾(SPTFF)系統諸如可購自Pall Life Sciences之系統用於生物加工平台，通常作為減少體積或濃縮生物分子例如抗體的方式。然而，本發明人意外地發現SPTFF可與抗體藥物結合反應相關聯以不僅有助於抗體藥物結合物(ADC)之濃縮還有助於將未結合產物自結合反應移除並將純化之ADC交換至調配緩衝液中，從而實現完全連續的ADC產生及加工方法。本發明人亦發現逆流滲濾亦可出於類似目的用於抗體藥物結合反應中。
在一些實施例中，一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)組成物之連續方法包含：(i)將抗體或其抗原結合片段與藥物結合以形成ADC，(ii)移除未結合藥物，及(iii)將該ADC交換至穩定緩衝液中，其中(i)至(iii)係連續執行，且其中單程切向流過濾(SPTFF)用於移除該未結合藥物及/或將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
在一些實施例中，SPTFF用於移除該未結合藥物以將該ADC交換至該穩定緩衝液中。在一些實施例中，順流管柱層析術用於移除該未結合藥物且SPTFF用於將該ADC交換到該穩定緩衝液中。
在一些實施例中，一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)組成物之連續方法包含：(i)將抗體或其抗原結合片段與藥物結合以形成ADC，(ii)移除未結合藥物，及(iii)將該ADC交換至穩定緩衝液中，其中(i)至(iii)係連續執行，且其中逆流滲濾用於移除該未結合藥物及/或將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
在一些實施例中，逆流滲濾用於移除該未結合藥物以將該ADC交換至該穩定緩衝液中。在一些實施例中，順流管柱層析術用於移除該未結合藥物且逆流滲濾用於將該ADC交換到該穩定緩衝液中。
在一些實施例中，該方法進一步包含預加工該抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工係以(i)至(iii)連續執行。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工係使用SPTFF執行。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工係使用逆流滲濾執行。在一些實施例中，在預加工中僅使用一個SPTFF或逆流滲濾步驟。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工係在(i)至(iii)之前大量執行。
在一些實施例中，該方法進一步包含預加工藥物以供結合。
在一些實施例中，一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)組成物之連續方法包含：(i)預加工抗體或其抗原結合片段，(ii)將該抗體或其抗原結合片段與藥物結合以形成ADC，(iii)移除未結合藥物，及(iv)將該ADC交換至穩定緩衝液中，其中(i)至(iv)係連續執行，且其中單程切向流過濾(SPTFF)用於移除該未結合藥物及/或將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
在一些實施例中，一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)組成物之連續方法包含：(i)預加工抗體或其抗原結合物片段，(ii)將該抗體或其抗原結合片段與藥物結合以形成ADC，(iii)移除未結合藥物，及(iv)將該ADC交換至穩定緩衝液中，其中(i)至(iv)係連續執行，且其中逆流滲濾用於移除該未結合藥物及/或將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工包含將該抗體或其抗原結合片段交換至緩衝液中以供結合。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工包含還原該抗體或其抗原結合片段及/或氧化該抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，在不使用SPTFF或逆流滲濾之情況下達成還原及/或氧化。在一些實施例中，僅使用一個SPTFF或逆流滲濾步驟達成還原及/或氧化。在一些實施例中，使用多於一個SPTFF或逆流滲濾步驟達成還原及/或氧化。
在一些實施例中，一種用於在連續結合過程中產生抗體藥物結合物(ADC)之方法包含在結合反應進行的同時及在已形成至少一種結合反應產物(ADC)之後將一或多種結合反應試劑添加至該結合反應。在一些實施例中，該結合反應試劑包含抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該結合反應試劑包含連接至接頭之藥物。在一些實施例中，該結合反應試劑包含接頭。在某一實施例中，該結合反應試劑包含連接至接頭之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該結合反應試劑包含藥物。
在一些實施例中，該結合反應發生於流動反應器中。
在一些實施例中，該方法進一步包含預加工抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工係以該結合反應連續執行。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工係使用SPTFF執行。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工係使用逆流滲濾執行。在一些實施例中，在預加工中僅使用一個SPTFF或逆流滲濾步驟。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工係在該結合反應之前大量執行。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工包含將該抗體或其抗原結合物片段交換至緩衝液中以供結合。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段之該預加工包含還原該抗體或其抗原結合片段及/或氧化該抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，該ADC係使用單程切向流過濾濃縮。在一些實施例中，該ADC係使用單程切向流過濾純化。在一些實施例中，該ADC係使用單程切向流過濾來轉移至調配緩衝液中。
在一些實施例中，使用逆流滲濾濃縮ADC。在一些實施例中，使用逆流滲濾純化ADC。在一些實施例中，使用逆流滲濾將ADC轉移至調配緩衝液中。
在一些實施例中，該ADC係使用順流層析術來濃縮、純化、及/或轉移至調配緩衝液。
在一些實施例中，一種用於濃縮抗體藥物結合物(ADC)之方法包含使用單程切向流過濾。在一些實施例中，用於純化抗體藥物結合物(ADC)之方法包含使用單程切向流過濾。在一些實施例中，用於將抗體藥物結合物(ADC)轉移至調配緩衝液之方法包含使用單程切向流過濾。在一些實施例中，用於濃縮抗體藥物結合物(ADC)之方法包含使用逆流滲濾。在一些實施例中，用於純化抗體藥物結合物(ADC)之方法包含使用逆流滲濾。在一些實施例中，用於將抗體藥物結合物(ADC)轉移至調配緩衝液中之方法包含使用逆流滲濾。在一些實施例中，該ADC係於分批結合過程中產生。在一些實施例中，該ADC係於連續結合過程中產生。
在一些實施例中，該單程切向流過濾使用超濾膜。在一些實施例中，該單程切向流過濾使用滲濾膜。
在一些實施例中，該方法改良該ADC產生之一致性。在一些實施例中，該方法減少ADC產生之時間。
在一些實施例中，該單程切向流過濾改良該ADC產生之一致性。在一些實施例中，該單程切向流過濾減少ADC濃縮、純化、或轉移之時間。在一些實施例中，該單程切向流過濾減少所使用之緩衝液之量。
在一些實施例中，逆流滲濾改良該ADC產生之一致性。在一些實施例中，逆流滲濾減少ADC濃縮、純化、或轉移之時間。在一些實施例中，逆流滲濾減少所使用之緩衝液之量。
在一些實施例中，該方法進一步包含分析物之在線監測。
在一些實施例中，一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)之方法包含使用在線監測以監測組分至ADC結合反應之添加。
在一些實施例中，該在線監測測量添加至該ADC結合反應之組分之濃度。
在一些實施例中，該在線監測測量添加至該ADC結合反應之組分之流率。在一些實施例中，該組分係抗體或其抗原結合片段、藥物、接頭、連接至接頭之藥物、連接至接頭之抗體或其抗原結合片段、及/或結合緩衝液。
在一些實施例中，該方法進一步包含在線監測以測量組分至原位反應之添加。在一些實施例中，該組分係藥物、接頭、及/或原位反應緩衝液。
在一些實施例中，一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)之方法包含分析物之在線監測以確定以下之時間：(i)停止向ADC結合反應添加結合緩衝液；(ii)停止結合緩衝液於ADC結合反應中之再循環；及/或(iii)開始淋洗自ADC結合反應之結合緩衝液。在一些實施例中，該分析物係未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物。
在一些實施例中，一種用於在ADC結合過程之後純化抗體藥物結合物(ADC)之方法包含分析物之在線監測。在一些實施例中，該純化包含過濾。在一些實施例中，該過濾係超濾或滲濾。在一些實施例中，該過濾係切向流過濾。在一些實施例中，該切向流過濾係單程切向流過濾。在一些實施例中，過濾為逆流滲濾。
在一些實施例中，該分析物係於滲餘物中。在一些實施例中，該分析物係未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物之濃度。在一些實施例中，該分析物係ADC或抗體或其抗原結合片段之濃度。在一些實施例中，該分析物係結合反應緩衝液或過濾緩衝液之組分之濃度。
在一些實施例中，該分析物係pH。
在一些實施例中，該分析物係於滲透物中。在一些實施例中，該分析物係ADC或抗體或其抗原結合片段之濃度。在一些實施例中，該分析物係未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物之濃度。
在一些實施例中，該純化包含層析術，且該分析物係在層析管柱之端部處測量。在一些實施例中，該分析物係ADC或抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該分析物係未結合藥物、連接至接頭之未結合藥物、結合反應緩衝液之組分、或層析緩衝液之組分。
在一些實施例中，該結合反應係分批結合反應。在一些實施例中，該結合反應係連續結合反應。
在一些實施例中，該在線監測係使用可變路徑長度技術、流動池裝置、UV感測器、拉曼光譜術、或傅立葉轉換紅外光譜術(FITR)執行。
在一些實施例中，該分析物之該在線監測係使用FlowVPE執行。
在一些實施例中，該在線監測改良ADC產率。在一些實施例中，該在線監測改良ADC回收率。在一些實施例中，該在線監測減少ADC產生之時間。在一些實施例中，該在線監測減少所使用之緩衝液之量。
在一些實施例中，一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)之方法包含分析物之在線監測以確定停止向ADC結合反應添加結合反應組分之時間。在一些實施例中，該組分係抗體或其抗原結合片段、藥物、接頭、連接至接頭之藥物、及/或結合反應緩衝液。
在一些實施例中，該ADC包含抗體。在一些實施例中，其中該ADC包含抗體之抗原結合片段。在一些實施例中，該ADC包含特異性結合至CD37、CD33、FOLR1、CD123、CD19、cMET、ADAM9、或HER2之抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含huMov19、Z4681A、或G4732A之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。在一些實施例中，該等CDR為Kabat定義之CDR、Chothia定義之CDR、或AbM定義之CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含有包含以下序列之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3序列：分別SEQ ID NO:1-6、分別SEQ ID NO:7-12、分別SEQ ID NO:13-18、分別SEQ ID NO:19-24、分別SEQ ID NO:25-30、或分別SEQ ID NO:31-36。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含有包含以下序列之VH及VL序列：分別SEQ ID NO:37及38、分別SEQ ID NO:37及39、分別SEQ ID NO:40及41、分別SEQ ID NO:42及43、分別SEQ ID NO:44及45、分別SEQ ID NO:46及47、或分別SEQ ID NO:48及49。在一些實施例中，該抗體包含有包含以下序列之重鏈及輕鏈序列：分別SEQ ID NO:50及51、分別SEQ ID NO:50及52、分別SEQ ID NO:53及54、或分別SEQ ID NO:55及56。
在一些實施例中，該ADC包含選自由以下組成之群之接頭：SMCC、sSPDB、及肽接頭。在一些實施例中，該ADC包含美登木素(maytansinoid)或吲哚啉並-苯二氮平。在一些實施例中，該美登木素係DM1或DM4。在一些實施例中，該吲哚啉並-苯二氮平係DGN462或DGN549。
在一些實施例中，該ADC係IMGN529、IMGN779、IMGN853、IMGN632、或Kadcyla。
在一些實施例中，一種用於產生IMGN853之方法包含：(i)在連續結合過程中混合huMov19抗體及連接至磺基-SPDB之DM4以形成IMGN853，視情況其中在線監測係用於測量添加至結合反應之huMov19抗體之濃度；(ii)視情況使用單程切向流過濾濃縮IMGN853，視情況在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；(iii)使用單程切向流過濾純化IMGN853，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；及(iv)使用單程切向流過濾將該IMGN853交換至調配緩衝液中，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中雜質之濃度。
在一些實施例中，一種用於產生IMGN853之方法包含：(i)在連續結合過程中混合huMov19抗體及連接至磺基-SPDB之DM4以形成IMGN853，視情況其中在線監測係用於測量添加至結合反應之huMov19抗體之濃度；(ii)視情況使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾濃縮IMGN853，視情況在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；(iii)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾純化IMGN853，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；及(iv)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾將該IMGN853交換至調配緩衝液中，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中雜質之濃度。
在一些實施例中，一種用於產生IMGN779之方法包含：(i)在連續結合過程中混合Z4681A抗體及連接至磺基-SPDB之DGN462以形成IMGN779，視情況其中在線監測係用於測量添加至結合反應之Z4681A抗體之濃度；(ii)視情況使用單程切向流過濾濃縮IMGN779，視情況在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；(iii)使用單程切向流過濾純化IMGN779，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；及(iv)使用單程切向流過濾將該IMGN779交換至調配緩衝液中，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中雜質之濃度。
在一些實施例中，一種用於產生IMGN779之方法包含：(i)在連續結合過程中混合Z4681A抗體及連接至磺基-SPDB之DGN462以形成IMGN779，視情況其中在線監測係用於測量添加至結合反應之Z4681A抗體之濃度；(ii)視情況使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾濃縮IMGN779，視情況在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；(iii)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾純化IMGN779，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；及(iv)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾將該IMGN779交換至調配緩衝液中，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中雜質之濃度。
在一些實施例中，一種用於產生IMGN632之方法包含：(i)在連續結合過程中混合G4732A抗體及磺化DNG549C以形成IMGN632；(ii)視情況使用單程切向流過濾濃縮IMGN632，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；(iii)使用單程切向流過濾純化IMGN632，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；及(iv)使用單程切向流過濾將該IMGN632交換至調配緩衝液中，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中雜質之濃度。在一些實施例中，在結合過程之前於僅一個SPTFF步驟中還原及氧化G4732A抗體。
在一些實施例中，一種用於產生IMGN632之方法包含：(i)在連續結合過程中混合G4732A抗體及磺化DNG549C以形成IMGN632；(ii)視情況使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾濃縮IMGN632，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；(iii)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾純化IMGN632，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；及(iv)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾將該IMGN632交換至調配緩衝液中，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中雜質之濃度。在一些實施例中，在結合過程之前於僅一個SPTFF或逆流滲濾步驟中還原及氧化G4732A抗體。
在一些實施例中，該方法包含將結合過程之第一溫度增加至少5℃至高溫，其中該高溫係維持不多於20分鐘。
在一些實施例中，一種產生ADC之方法包含將結合過程之第一溫度增加至少5℃至高溫，其中該高溫係維持不多於20分鐘。
在一些實施例中，該高溫不多於55℃。在一些實施例中，該第一溫度增加至少10℃、至少15℃、至少20℃、或至少30℃。
在一些實施例中，該高溫係35℃至55℃或係40℃至50℃。
在一些實施例中，將該第一溫度增加至該高溫不需要長於2分鐘或不需要長於1分鐘。
在一些實施例中，該方法進一步包含將該高溫降低至視情況該第一溫度。在一些實施例中，將該高溫降低至視情況該第一溫度不需要長於2分鐘或不需要長於1分鐘。
在一些實施例中，將該第一溫度增加至該高溫然後降低該高溫之步驟係重複至少兩次或至少三次。在一些實施例中，將該第一溫度增加至該高溫然後降低該高溫之步驟係重複2-20次或5-10次。
在一些實施例中，該方法包含將結合過程之第一溫度降低至少5℃至低溫，其中該低溫係維持不多於20分鐘。
在一些實施例中，一種產生ADC之方法包含將結合過程之第一溫度降低至少5℃至低溫，其中該低溫係維持不多於20分鐘。在一些實施例中，該第一溫度降低不多於30℃。在一些實施例中，該溫度降低至少10℃、至少15℃、或至少20℃。
在一些實施例中，將該第一溫度降低至該低溫不需要長於2分鐘或不需要長於1分鐘。
在一些實施例中，該方法進一步包含將該低溫增加至視情況該第一溫度。在一些實施例中，將該低溫增加至視情況該第一溫度不需要長於2分鐘或不需要長於1分鐘。
在一些實施例中，將該第一溫度降低至該低溫然後增加該低溫之步驟係重複至少兩次或至少三次。在一些實施例中，將該第一溫度降低至該低溫然後增加該低溫之步驟係重複2-20次或5-10次。
在一些實施例中，其中該高溫或低溫係維持不多於15分鐘。在一些實施例中，該高溫或低溫係維持30秒至15分鐘。在一些實施例中，該高溫或低溫係維持15至20分鐘。在一些實施例中，該高溫或低溫係維持10至15分鐘。在一些實施例中，該高溫或低溫係維持5至10分鐘。在一些實施例中，該高溫或低溫係維持1至5分鐘。
在一些實施例中，該方法包含將結合過程之第一pH改變至少0.5至變化的pH，其中該變化的pH係維持不多於20分鐘。
在一些實施例中，一種產生ADC之方法包含將結合過程之第一pH改變至少0.5至變化的pH，其中該變化的pH係維持不多於20分鐘。
在一些實施例中，該第一pH增加至少1，視情況其中該變化的pH不超過9。在一些實施例中，該第一pH增加至少2或至少3。
在一些實施例中，該第一pH降低至少1，視情況其中該變化的pH不低於4。在一些實施例中，該第一pH降低至少2或至少3。
在一些實施例中，該方法進一步包含改變該變化的pH視情況至該第一pH。在一些實施例中，將該第一pH改變至該變化的pH然後改變該變化的pH至步驟係重複至少兩次或至少三次。在一些實施例中，將該第一pH改變至該變化的pH然後改變該變化的pH至步驟係重複2-20次或5-10次。
在一些實施例中，該變化的pH係維持不多於15分鐘。在一些實施例中，該變化的pH係維持30秒至15分鐘。在一些實施例中，該變化的pH係維持15至20分鐘。在一些實施例中，該變化的pH係維持10至15分鐘。在一些實施例中，該變化的pH係維持5至10分鐘。在一些實施例中，該變化的pH係維持1至5分鐘。
本文亦提供根據本文所提供之方法產生之ADC。
I. 定義
如本文所用之術語「抗體藥物結合物」(ADC)及「免疫結合物」係指連接至細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)且由以下通式定義之化合物或其衍生物：D-L-A，其中D = 細胞毒性藥物，L = 接頭，且A = 抗體或抗體片段。ADC亦可以相反次序由以下通式定義：A-L-D。ADC可包含每個抗體或其抗原結合片段多個藥物及接頭，例如，(D-L)4 -A或A-(L-D)2 。術語「抗體藥物結合物」及「免疫結合物」在本文中可互換使用。
「接頭」為能夠以穩定、共價的方式將藥物連接至細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)的任何化學部分。在化合物或抗體保持活性之條件下，接頭易受或實質上抵抗酸誘導之裂解、光誘導之裂解、肽酶誘導之裂解、酯酶誘導之裂解、及二硫鍵裂解。合適之接頭為此項技術中熟知的且包括例如二硫基、硫醚基、及肽接頭。
術語「抗體」意謂透過免疫球蛋白分子可變區內之至少一個抗原識別位點識別且特異性結合至標靶的免疫球蛋白分子，該等標靶諸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質、或前述者之組合。如本文所用，術語「抗體」涵蓋完整的多株抗體、完整的單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、包含抗體之融合蛋白、及任何其他經修飾免疫球蛋白分子，只要抗體表現出所要生物活性即可。基於免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ、及μ之識別，抗體可為五大類免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM)或其子類(同型) (例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2)之任一者。不同類別的免疫球蛋白具有不同且熟知的次單元結構及三維組態。抗體可為裸露的或結合至諸如毒素、放射性同位素等的其他分子。
術語「抗體片段」係指完整抗體之一部分。「抗原結合片段」係指結合至抗原之完整抗體之一部分。抗原結合片段可含有完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段、線性抗體、及單鏈抗體。抗體片段可為裸露的或結合至諸如毒素、放射性同位素等的其他分子。
如本文所用，術語「可變區」或「可變域」可互換使用並且在此項技術中係常見的。可變區通常係指抗體之一部分，一般而言輕鏈或重鏈之一部分，通常成熟重鏈中胺基末端約110至120個胺基酸或110至125個胺基酸及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其在抗體之間在序列上廣泛不同並且用於特定抗體針對其特定抗原之結合及特異性中。序列之可變性集中在稱為互補決定區(CDR)之彼等區域中，而可變域中之更高度保守區係稱為構架區(FR)。不希望受任何特定機制或理論束縛，咸信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之相互作用及特異性。在某些實施例中，可變區為人類可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠科CDR及人類構架區(FR)。在具體實施例中，可變區為靈長類動物(例如，非人類靈長類動物)可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠科CDR及靈長類動物(例如，非人類靈長類動物)構架區(FR)。
術語「VL」及「VL域」可互換使用以指代抗體之輕鏈可變區。
術語「VH」及「VH域」可互換使用以指代抗體之重鏈可變區。
術語「Kabat編號」及類似術語在此項技術中係公認的且指代對抗體或其抗原結合片段之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸殘基進行編號的系統。在某些態樣中，可根據Kabat編號系統確定CDR (參見例如，Kabat EA及Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391以及Kabat EA等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號)。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於31至35胺基酸位(其視情況可在35之後包括一或兩個額外胺基酸(在Kabat編號方案中稱為35A及35B))(CDR1)、50至65胺基酸位(CDR2)、及95至102胺基酸位(CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常存在於24至34胺基酸位(CDR1)、50至56胺基酸位(CDR2)、及89至97胺基酸位(CDR3)。在一特定實施例中，根據Kabat編號方案確定本文所述之抗體之CDR。
Chothia替代地提及結構環之位置(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。當使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-H1環之末端視環之長度而在H32與H34之間變化(此係由於Kabat編號方案將插入放置於H35A及H35B處；若35A或35B不存在，則環結束於32處；若僅35A存在，則環結束於33處；若35A及35B均存在，則環結束於34處)。AbM超變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且係藉由Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體來使用。
如本文所用，術語「恆定區」或「恆定域」可互換並且具有其在此項技術中共同的意義。恆定區為抗體部分，例如，輕鏈及/或重鏈之羧基末端部分，其不直接參與抗體與抗原之結合但可表現出各種效應功能，諸如與Fc受體之相互作用。免疫球蛋白分子之恆定區一般相對於免疫球蛋白可變域具有更保守的胺基酸序列。在某些態樣中，抗體或抗原結合片段包含對於抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)而言足夠的恆定區或其部分。
如本文所用，術語「重鏈」在關於抗體使用時可指代基於恆定域之胺基酸序列的任何不同類型，例如，α、δ、ε、γ、及μ，從而分別產生IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM類別之抗體，包括IgG之子類，例如，IgG1 、IgG2 、IgG3 、及IgG4 。重鏈胺基酸序列在此項技術中為熟知的。在特定實施例中，重鏈為人類重鏈。
如本文所用，術語「輕鏈」在關於抗體使用時可指代基於恆定域之胺基酸序列的任何不同類型，例如，κ或λ。輕鏈胺基酸序列在此項技術中為熟知的。在特定實施例中，輕鏈為人類輕鏈。
如本文所用之術語「結合過程」係指將結合反應試劑(例如，細胞結合劑、藥物、及接頭；細胞結合劑及連接至接頭之藥物；或連接至接頭之細胞結合劑及藥物)在允許試劑反應且形成ADC的條件下混合的過程。
如本文所用之術語「分批結合過程」係指以下結合過程，在該結合過程中，將結合反應試劑大量混合在一起，發生結合反應以形成結合反應產物(ADC)，然後大量移除結合反應產物(ADC)。
如本文所用之術語「連續結合過程」係指以下結合過程，在該結合過程中一或多種結合反應試劑在結合反應進行的同時及在已形成至少一種結合反應產物(ADC)之後繼續添加至結合反應。在結合反應進行時，可繼續自結合反應移除結合反應產物(ADC)。
如本文所用之術語「原位反應」係指將藥物及接頭混合以形成連接至接頭之藥物的過程。然後，連接至接頭之藥物可用於與細胞結合劑(例如，抗體)之結合反應中以形成ADC。
如本文所用之術語「流動反應器」係指用於連續反應化學的任何反應器容器，通常為管狀。流動反應器可由不銹鋼、玻璃、聚合物等製成。
如本文所用之術語「在線監測」係指例如在正發生結合反應、濃縮過程、純化過程、或緩衝液交換過程的同時即時監測分析物。
如本文所用之術語「過濾器」係指允許流體中物質之分離的選擇性障壁。分析係藉由選擇性地使一或多種流體行進(滲透)通過過濾器，同時延遲一或多種其他物質的通過來達成。
如本文所用之術語「進料流」係指經進料至過濾器或膜以供過濾器或膜中組分之分離的流體。
如本文所用之術語「滲餘物」係指不行進通過過濾器的進料流之部分。
如本文所用之術語「滲透物」係指行進通過過濾器的進料流之部分。
如本文所用之術語「切向流過濾」(TFF)係指進料流平行於膜面行進的基於膜之過濾過程。一部分進料流行進通過膜(滲透物)，而其餘部分(滲餘物)再循環回到進料儲存器。TFF亦稱為掃流過濾(cross-flow filtration)。用於執行TFF的系統係已知的且包括例如Pellicon型系統(Millipore, Billerica, MA)、Sartocon Cassette系統(Sartorius AG, Edgewood, NY)、及Centrasette型系統(Pall Corporation, East Hills, NY)。
如本文所用之術語「單程切向流過濾」(SPTFF)係指進料流僅通過過濾膜一次的切向流過濾過程。用於執行SPTFF之系統係已知的且包括例如Cadance型系統(Pall Corporation, Westborough, MA)。用於執行SPTFF之系統及方法揭示於例如美國專利第7,384,549號、美國專利第7,510,654號、美國專利第7,682,511號、美國專利第7,967,987號、美國專利第8,157,999號、及美國專利第8,231,787號，其各自以全文引用之方式並入本文。
如本文所用之術語「連續滲濾」係指以連續的方式藉由將進料流與稀釋劑混合並在滲透物及滲餘物經移除之情況下將其泵送穿過膜所達成的選擇性分離溶質的滲濾過程。在過濾進行時，容器中未形成產物；而是在過濾之時程期間產物經連續地自系統抽出。「逆流滲濾」係指其中過程流(例如，滲透物或滲餘物)在滲濾步驟中經回收的連續滲濾過程。
術語「在線監測」係指例如在生產或純化過程期間即時監測分析物。在線監測與過程中取樣或離線分析不同，後者不提供即時反饋。
術語「在線過程自動化技術」係指用於在過程期間監測分析物的任何在線測量裝置。
如本文所用之術語「分析物」係廣義的術語，且其無限制地指代流體中可經分析之物質或化學組分。分析物可包括天然存在之物質、人工物質、代謝物、及/或反應產物。在一些實施例中，本文所揭示之方法中用於測量之分析物係抗體或其抗原結合片段、藥物、接頭、結合至抗體或其抗原結合片段之接頭、結合至藥物之接頭、抗體-藥物結合物(ADC)、藥物-抗體比率(DAR)、及/或雜質。
如本文所用之術語「反應緩衝液」係指可在其中發生反應的緩衝液。因此，如本文所用之術語「結合反應緩衝液」或「結合緩衝液」係指可在其中發生結合反應(連續結合反應或分批結合反應)的緩衝液。類似地，如本文所用之術語「原位反應緩衝液」或「原文緩衝液」係指可在其中發生原位反應的緩衝液。
如本文所用之術語「調配緩衝液」係指允許活性成分之生物活性且不含有對調配物所將投與之受試者有不可接受之毒性的額外組分。
如本文所用之術語「吲哚啉並苯二氮平」(IGN)係指具有吲哚啉並苯二氮平核結構之化合物。吲哚啉並苯二氮平可經取代或未取代。其亦包括具有兩個由接頭連接之吲哚啉並苯二氮平核之化合物。可減少作為吲哚啉並苯二氮平核之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。在某些實施例中，吲哚啉並苯二氮平化合物包含由
表示之核結構，其可視情況經取代。
在一些實施例中，吲哚啉並苯二氮平化合物包含由表示之核結構，其可進一步經取代。
如本文所用之術語「吡咯並苯二氮平」(PBD)係指具有吡咯並苯二氮平核結構之化合物。吡咯並苯二氮平可經取代或未取代。其亦包括具有由接頭連接之兩個吡咯並苯二氮平核之化合物。可減少作為吲哚啉並苯二氮平核之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。在某些實施例中，吡咯並苯二氮平化合物包含由表示之核結構，其可視情況經取代。在某些實施例中，吡咯並苯二氮平化合物包含由表示之核結構，其可視情況經取代。
如本揭露及申請專利範圍中所使用，除非上下文另有明確說明，否則單數形式「一個/種(a/an)」及「該」包括複數形式。
應理解，無論什麽情況下在本文用語言「包含」描述實施例，亦提供以「由…組成」及/或「基本上由…組成」之術語描述的其他類似實施例。
如本文中諸如「A及/或B」之片語中所使用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」、及「B」。同樣，如諸如「A、B、及/或C」之片語中所使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。

II. 連續結合、單程切向流過濾、及逆流滲濾
本文提供用於執行及/或加工抗體藥物結合物(ADC)之連續方法。在分批形成及加工中，將組分添加至過程中，該過程進行一段時間，然後大量移除該過程之產物。相反，在本文所提供之連續方法中，繼續將組分添加至正在進行的過程中，且產物可在整個過程中經移除而不是在過程結束時大量移除。例如，在連續結合過程中，在反應進行的同時及在已形成至少一種結合反應產物(ADC)之後繼續將一或多種結合反應試劑添加至結合反應中。類似地，在下游連續濃縮、純化、及/或緩衝液交換過程中，繼續將ADC、緩衝液、及/或其他組分添加至濃縮純化中，及/或在該等過程進行時進行緩衝液交換，且可從該等正在進行的過程中移除經濃縮、經純化、及經緩衝液交換之ADC。據此，從ADC結合至ADC調配的整個ADC過程可為連續的(參見例如圖1(下圖))。
本發明人已經證明，可使用流動反應器連續執行結合過程。連續反應器允許在結合反應進行的同時及在已形成至少一種結合反應產物(ADC)之後繼續將一或多種結合反應試劑添加至結合反應中。在結合過程中流動反應器之使用允許結合反應之控制及結合過程之多面性(例如，快速溫度變化/較嚴格的溫度控制、藉由擴散介導之混合因此較均勻、及不受容器或套件限制的限制)且改良ADC結合過程之可擴充性(即，分批加工之習知規模擴大風險不適用且時空產率藉由運行當前過程達較長時間來最佳化(例如，執行安慰劑規模擴大(增加輸出))。
本發明人進一步證明，連續ADC加工可使用單程切向流過濾(SPTFF)來完成，其可成功地將未結合藥物與ADC分離。本體(習知)滲濾涉及以第一緩衝液A(產物最初所在的緩衝液)注入切向流過濾(TFF)系統。然後將產物添加至滲餘物容器中，在該滲餘物容器中與初始體積混合。滲餘物容器之進料泵將來自滲餘物之產物泵送於TFF膜上，在該TFF膜上其經保留(並返回至滲餘物)或丟棄。另一泵(滲濾泵)從該容器進料至容納於單獨容器中的緩衝液B(產物將交換至其中的緩衝液)，進料管線為自該容器至滲餘物容器中。將兩個泵啓動，且滲餘物容器中之產物開始通過TFF膜。在緩衝液經由廢物流移除時，滲餘物中之體積藉由將緩衝液B(以相等體積)添加至滲餘物容器中來維持。因此，產物緩慢地交換至緩衝液B中。
SPTFF使用將最初於緩衝液A中之產物交換至緩衝液B中的相關概念。然而，產物僅在膜上通過一次，因此必須達成所有適當體積的緩衝液B均達成完全的緩衝液交換。為此，SPTFF可以在堆疊階段添加緩衝液B。因此，產物僅通過膜一次：進入緩衝液A並離開緩衝液B中之模組。
類似地，連續ADC加工可使用逆流滲濾完成。
據此，與分批ADC加工相比，本文所提供之連續ADC加工方法(例如，使用SPTFF及/或逆流滲濾)可減少加工時間、改良產率、及/或提高產品一致性。本文所提供之連續ADC加工方法(例如，使用SPTFF及/或逆流滲濾)亦可消除分批結合過程中所使用之保持步驟。本文所提供之連續ADC加工方法(例如，使用SPTFF及/或逆流滲濾)亦可允許使用較小設備。SPTFF亦為有利的，因為可能由剪切力引起之對氧化敏感的抗體可能更適合於SPTFF。
ADC加工可涉及ADC之結合(形成)、ADC之濃縮、ADC之純化、及/或ADC之調配。儘管連續尤其可用於從ADC結合至調配的整個過程(例如，如圖1所示)，但是亦可能將連續加工步驟與分配加工步驟組合(例如，如圖2及圖3所示)。此外，上游加工步驟(例如，抗體、接頭、及/或藥物之製備)有可能為連續的且連續進料至ADC結合中。
據此，在本文所提供之一些方法中，用於形成抗體藥物結合物(ADC)之結合過程為連續的。在連續結合過程中，在結合反應進行的同時及在已形成至少一種結合反應產物(ADC)之後繼續將一或多種結合反應試劑添加至結合反應中。可將結合反應試劑放入系統中，同時從系統移除經組裝ADC。例如，在本文所提供之一些連續結合過程中，在結合反應進行的同時及在形成至少一種ADC之後繼續將細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)、連接至接頭之藥物、及結合反應緩衝液添加至結合反應中。在本文所提供之一些連續結合過程中，在結合反應進行的同時及在形成至少一種ADC之後繼續將連接至接頭之細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)、藥物、及結合反應緩衝液添加至結合反應中。在本文所提供之一些連續結合過程中，在結合反應進行的同時及在形成至少一種ADC之後繼續將細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)、藥物、接頭、及結合反應緩衝液添加至結合反應中。繼續添加之試劑可以在單一進料流中一起添加，或可分開進料至收集容器中或直接添加至反應容器中。
在本文所提供之一些連續結合過程中，在結合反應進行的同時及在形成至少一種ADC之後繼續將細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)、連接至接頭之細胞結合劑、藥物、連接至接頭之藥物、接頭、或結合反應緩衝液中之僅一者添加至結合反應中。在本文所提供之一些連續結合過程中，在結合反應進行的同時及在形成至少一種ADC之後繼續將選自由細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)、連接至接頭之細胞結合劑、藥物、連接至接頭之藥物、接頭、及結合反應緩衝液組成之群之兩種試劑添加至結合反應中。
使用SPTFF可允許連續添加組分及/或從結合反應移除組分。因此，SPTFF可用於製備用於ADC結合及用於加工經組裝ADC的試劑。SPTFF可實現連續ADC加工，使得可同時發生具體ADC之所有加工步驟(或亞組)(例如，產生、濃縮、純化、及/或調配)。逆流滲濾亦可用於製備用於ADC結合及用於加工經組裝ADC的試劑。
根據本文所提供之方法，SPTFF可用於濃縮ADC、純化ADC、及/或調配ADC(例如，藉由將ADC交換至調配緩衝液中)。SPTFF可用於將ADC從第一緩衝液轉移至第二緩衝液。逆流滲濾亦可用於濃縮ADC、純化ADC、及/或調配ADC (例如，藉由將ADC交換至調配緩衝液中)，且逆流滲濾亦可用於將ADC自第一緩衝液轉移至第二緩衝液中。
在本文所提供之一些方法中，SPTFF用於整個ADC產生、純化、及調配中，使從ADC產生至調配的整個過程為連續的。在本文所提供之一些方法中，逆流滲濾用於整個ADC產生、純化、及調配中，使從ADC產生至調配的整個過程為連續的。因此，示範性圖4及圖10所示之整個過程可為連續的。
在本文所提供之一些方法中，SPTFF與習知TFF組合使用，使得示範性圖4及圖10所示之過程之一些部分為連續的，而其他部分為分批執行的。例如，可在結合之前使用習知(分批)TFF(參見例如圖4中之TFF1)對抗體或其抗原結合片段進行緩衝液交換，然後進料至連續過程中，其中SPTFF係用於下游過程(參見例如圖4中之TFF2階段1及II)。在此類方法中可使用逆流滲濾來代替SPTFF或者將逆流滲濾與SPTFF組合使用。
在圖4及圖10中，以虛線所示之各方框表示可以分批或連續方式進行之過程之個別部分。例如，圖4左上方框中所示之用於將抗體置於緩衝液中以供結合之過程可使用SPTFF且以連續方式執行或可使用習知TFF且以分批方式執行。不論用於將抗體置於緩衝液中以供結合之過程是以分批方式還是以連續方式執行，結合反應下游的方框中所示之ADC濃縮及純化過程可使用SPTFF且以連續方式執行或可使用習知TFF且以分批方式進行。類似地，不論用於將抗體置於緩衝液中以供結合之過程是於分批過程中執行還是於連續過程中執行，且不論ADC係使用分批過程還是連續過程進行濃縮及純化，ADC可使用SPTFF以連續方式或使用習知TFF以分批方式執行。在此類方法中可使用逆流滲濾來代替SPTFF或者將逆流滲濾與SPTFF組合使用。
在一些實施例中，使用SPTFF執行ADC方法中之至少兩個步驟。例如，在一些實施例中，SPTFF係用於將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中且用於在形成ADC之後濃縮並純化ADC，同時SPTFF或TFF係用於將ADC交換至調配緩衝液中。在一些實施例中，SPTFF係用於將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中且用於將經純化ADC交換至調配緩衝液中，同時SPTFF或TFF係用於在形成ADC之後濃縮且純化ADC。在一些實施例中，SPTFF係用於濃縮且純化ADC且用於將經濃縮且經純化ADC交換至調配緩衝液中，其中SPTFF或TFF係用於將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中。
SPTFF可例如在濃縮ADC之方法中使用超濾膜。SPTFF可例如在純化ADC之方法中及/或在將ADC轉移至緩衝液(例如，調配緩衝液)之方法中使用滲濾膜。
在一些實施例中，使用SPTFF及/或逆流滲濾執行ADC方法中之至少兩個步驟。例如，在一些實施例中，SPTFF及/或逆流滲濾係用於將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中且用於在形成ADC之後濃縮並純化ADC，同時SPTFF、逆流滲濾、及/或TFF係用於將ADC交換至調配緩衝液中。在一些實施例中，SPTFF及/或逆流滲濾係用於將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中且用於將經純化ADC交換至調配緩衝液中，同時SPTFF、逆流滲濾、及/或TFF係用於在形成ADC之後濃縮且純化ADC。在一些實施例中，SPTFF及/或逆流滲濾係用於濃縮且純化ADC且用於將經濃縮且經純化ADC交換至調配緩衝液中，其中SPTFF、逆流滲濾、及/或TFF係用於將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中。
管柱層析術亦可在本文所提供之連續ADC加工方法(例如，與SPTFF及/或逆流滲濾組合)中以順流模式使用。例如，結合反應(例如，連續結合反應)可進料至順流管柱層析術中以移除結合反應之未結合藥物(類似於TFF2之作用，圖4中之階段ILDF步驟)。然後經由順流管柱層析術純化之ADC可進料至SPTFF過程中以供向調配緩衝液中之緩衝液交換(例如，TFF2，圖5中之階段II ILDF步驟)。經由順流管柱層析術純化之ADC亦可進料至逆流滲濾過程中以供向調配緩衝液中之緩衝液交換。
在一些情況下，本文所提供之連續流動結合過程之反應參數可經快速變化或「脈衝」。例如，在連續流動結合中，溫度可例如藉由水浴、封裝反應器、加熱器、熱電源、及/或使反應流動通過之線圈及/或管之節段絕緣來快速變化。此外，在連續流動結合中，pH可例如藉由添加酸或鹼來快速變化。據此，在某些情況下，使用脈衝參數執行結合反應。使用脈衝參數可例如減少反應時間(即，反應速度增加)，而不累及產物品質；藉由快速降低溫度來淬滅或短暫停止反應；在引入另一微擾(例如，添加另一化學試劑)之前穩定溶液中之結合物，然而較長暴露於參數可顯著降低產物品質或產物穩定性。
在某些情況下，將結合反應暴露於變化的溫度(例如，增加或降低)達指定時間增量達指定次數。例如，在一種情況下，溫度增加至少2℃、至少3℃、至少4℃、或至少5℃。據此，溫度可增加或降低至少5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、或35℃。例如，溫度可增加或降低5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、或35℃。溫度亦可增加或降低約5℃至約10℃、約10℃至約15℃、約15℃至約20℃、約20℃至約25℃、約25℃至約30℃、或約30℃至約35℃。因此，例如，溫度可增加(例如，從約20℃)至25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、或55℃之高溫。溫度亦可增加(例如，從約25℃)至30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、或55℃之高溫。在某些情況下，溫度不超過55℃。在某一情況下，溫度增加(例如，從約20℃)至在約35℃至約55℃之範圍內的高溫或在約40℃至約50℃之範圍內的高溫。在某些情況下，溫度增加(例如，從約20℃)至約60℃、至約70℃、至約80℃、至約90℃、或至約100℃之高溫(例如，達短時間增量諸如10秒)。在某些情況下，溫度升高(例如，從約20℃)至在60℃至70℃之範圍內、在70℃至80℃之範圍內、在80℃至90℃之範圍內、或在90℃至100℃之範圍內的高溫(例如，達短時間增量諸如10秒)。在某些情況下，將溫度升高或降低至高溫或低溫所需的時間不多於2分鐘。在某些情況下，將溫度升高或降低至高溫或低溫所需的時間不多於1分鐘。
在某些情況下，將結合反應暴露於變化的pH (例如，增加或降低)達指定時間增量達指定次數。例如，在一種情況下，pH增加或降低約1、約2、約3、約4、或約5。在一種情況下，pH增加約1至約2、約2至約3、約3至約4、或約4至約5。因此，例如，pH可增加(例如，從約4)至約5、約6、約7、約8、或約9。PH亦可增加(例如，從約5)至約6、約7、約8、或約9。PH亦可降低(例如，從約9)至約8、約7、約6、約5、或約4。
在某些情況下，脈衝(例如，於變化的溫度及/或pH之暴露)發生約30秒、約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘、約5分鐘、約6分鐘、約7分鐘、約8分鐘、約9分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時、約1.5小時、或約2小時。脈衝(例如，於變化的溫度和/或之暴露)亦可發生例如約30秒至約1分鐘、約1分鐘至約2分鐘，約2分鐘至約3分鐘、約3分鐘至約4分鐘、約4分鐘至約5分鐘、約6分鐘至約7分鐘、約7分鐘至約8分鐘，約8分鐘至約9分鐘、或約9分鐘至約10分鐘。脈衝(例如，於變化的溫度及/或之暴露)亦可發生約1至10分鐘、約1至15分鐘、約1至30分鐘、約1分鐘至1小時、約1分鐘至約1.5小時、或約1分鐘至約2小時。脈衝(例如，於變化的溫度及/或之暴露)亦可發生例如約1至5分鐘、或約5至10分鐘、約10至約15分鐘、約15分鐘至約30分鐘、約30分鐘至約1小時、約1小時至約1.5小時、或約1.5小時至約2小時。在某些情況下，脈衝(例如，於變化的溫度及/或pH之暴露)不超過2小時、1小時、30分鐘、20分鐘、或15分鐘。
在某些情況下，脈衝(例如，於變化的溫度及/或pH之暴露)發生一次。在某些情況下，脈衝(例如，於變化變的溫度及/或之暴露)重複兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、或十次。在某些情況下，脈衝(例如，於變化的溫度及/或之暴露)發生一至五次。在某些情況下，脈衝(例如，於變化的溫度及/或之暴露)發生二至二十次或五至十次。
連續ADC加工方法(例如，使用SPTFF及/或逆流滲濾)可在有或沒有在線監測過程(下文經討論)之情況下使用。

III. 在線過程自動化技術(在線PAT)
本文提供用於形成及加工抗體藥物結合物(ADC)之在線過程自動化技術。此類技術提供直接測量，其可消除離線檢定且減少操作員對材料的處理。在線監測可用於監測ADC (蛋白)濃度以及自由藥物之移除。這可允許基於獲自在線讀數之數據而不是基於過程(例如，純化過程)中所使用之滲濾體積(diavolume)之特定體積或數目來以最終ADC濃度為目標。PAT實施允許增加控制及可偵測性(例如，在穩態操作期間的改變可用於在產物品質受影響之前偵測出問題)，且使用多個PAT模組(例如，FlowVPE、UV感測器、pH計、電導計、壓力感測器、或流量計)可確保在個別單元操作上穩健的過程性能。
在線監測可用於例如監測例如原位反應及/或ADC結合反應(例如，連續結合反應或分批結合反應)中來自任何泵之進料流之流率。在線監測可用於例如監測添加至原位反應及/或ADC結合反應(例如，連續結合反應或分批結合反應)之組分之濃度。此一監測可確保對反應之化學計量的充分控制。在線監測可監測例如抗體或其抗原結合片段、藥物、接頭、連接至接頭之藥物、連接至接頭之抗體或其抗原結合片段、及/或結合緩衝液之流率或濃度。在線監測可監測至反應緩衝液中之抗體或其抗原結合片段之流率或濃度。
在線監測亦可用於例如確定例如藉由停止添加結合緩衝液、藉由停止結合緩衝液之循環、及/或開始淋洗或移除結合緩衝液來停止結合反應的時間。在本文所提供之一些實施例中，可使用未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物之的在線監測。未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物之測量可用於推斷結合反應中所達成之每抗體藥物之平均數(DAR)。因此，當達到目標DAR時，可停止結合反應。
在線監測亦可用於監測ADC之濃縮及/或純化。例如，可在示範性圖4所示之ILC及/或TFF2 ILDF過程之前或之後或者在示範性圖10所示之ILC或TFF3 ILDF過程之前或之後使用在線監測。濃縮及/或純化可使用過濾(例如，超濾、滲濾)。過濾可為切向流過濾，包括單程切向流過濾(SPTFF)。過濾可為逆流滲濾。當用於監測過濾時，可使用在線監測來測量滲餘物或滲透物中之分析物。因此例如，可使用滲餘物中未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物之在線監測來評估ADC之純化程度。未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物之水準可在結合反應後不久在滲餘物中為高的，但在純化後在滲餘物中為低的(參見例如圖12)。在線監測滲餘物或滲透物中之ADC可用於評估濃縮及/或純化過程期間的ADC損失(參見例如圖12)。
純化亦可使用層析術(例如，順流管柱層析術)。在層析管柱端部處的在線監測可例如測量ADC水準且可用於確定何時管柱過載或何時ADC穿透。
在線監測亦可用於測量pH，其可用於例如確定緩衝液交換之完全性(參見例如圖12)。
示範性在線監測技術包括使用例如傅立葉轉換紅外(FTIR)流動池、高效液相層析術(HPLC)、或超高效液相層析術(UPLC)。
在線監測技術可使用例如FlowVPE或UV感測器。在一些實施例中，FlowVPE用於執行在線監視。FlowVPE使用流動池以供連續監測。
切向流過濾(例如，單程切向流過濾(SPTFF))之效能可使用FlowVPE、UV感測器、pH計、電導計、壓力感測器、流量計等進行在線監測。逆流滲濾之效能亦可使用FlowVPE、UV感測器、pH計、電導計、壓力感測器、流量計等進行在線監測。
在線監測過程可與連續結合過程(上文所討論)(例如，使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾)或與分批結合過程(其為此項技術中已知的)組合使用。

IV. 抗體藥物結合物(ADC)
如本文所提供，抗體藥物結合物(ADC)可包含細胞結合劑、接頭、及藥物。
細胞結合劑可為抗體或其抗原結合片段，例如單株抗體或其抗原結合片段。細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)可為人源化細胞結合劑。細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)可為人類細胞結合劑。
細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)可特異性結合至人類CD37、CD33、FOLR1、CD123、CD19、cMET、ADAM9、或HER2。
細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)可包含表1中所提供之抗體之六個CDR。
細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)可包含表2中所提供之抗體之可變重鏈及/或可變輕鏈。在一些實施例中，細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)包含表2中所提供之抗體之可變重鏈及可變輕鏈之CDR(例如，Kabat定義之CDR、AbM定義之CDR、或Chothia定義之CDR)。
細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)可包含表3中所提供之抗體之重鏈及/或輕鏈。

在某些實施例中，抗FOLR1抗體由根據布達佩斯條約之條款於2010年4月7日寄存於美國典型培養物保藏中心(ATCC) (其位於10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110)且具有ATCC寄存號PTA-10772及PTA-10773或10774之質體編碼。
細胞結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)可為CD37-3、huMov19、Z4681A、G4732A、huB4、huCMET-27、huADAM9、或Herceptin (曲妥珠單抗)。
藥物可為細胞毒性劑。細胞毒劑可為導致細胞死亡、或誘導細胞死亡、或以某一方式降低細胞活力的任何化合物，且包括例如美登木素、美登木素類似物，苯二氮平(例如吲哚啉並-苯二氮平(IGN)或吡咯並苯二氮平(PBD)、類紫杉醇、CC-1065及CC-1065類似物、倍癌黴素(duocarmycin)及倍癌黴素類似物、烯二炔諸如卡奇黴素(calicheamicin)、尾海兔素及尾海兔素類似物包括澳瑞他汀(auristatin)、茅屋黴素(tomaymycin)衍生物、細黴素(leptomycin)衍生物、胺甲喋呤、順鉑、卡鉑、道諾黴素、阿黴素、長春新鹼、長春鹼、美法侖、絲裂黴素C、氮芥苯丁酸、及N-嗎啉基阿黴素。在一個實施例中，美登木素可為DM1。在另一實施例中，美登木素可為DM4。在一個實施例中，吲哚啉並-苯二氮平可為DGN462。在另一實施例中，吲哚啉並-苯二氮平可為DGN549。在其他實施例中，吡咯並苯二氮平可為talirine、tesirine、SJG136、或SGD1882。
合適連接基為此項技術中熟知的且包括例如二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團、及酯酶不穩定基團。接頭分子包括例如N -琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP) (參見例如Carlsson等人,Biochem. J. ,173: 723-737(1978))、N -琥珀醯亞胺基 4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)(參見例如美國專利第4,563,304號)、N -琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(參見美國公開案第20090274713號)、N -琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)(參見例如CAS登記號341498-08-6)、2-亞胺基硫雜環戊烷、或乙醯基琥珀酸酐。接頭可為SMCC、sSPDB、或肽接頭。
ADC可含有每抗體多個藥物。每抗體藥物之數目常指代藥物抗體比(DAR)。在一個態樣中，可連接至細胞結合劑之藥物分子之數目可平均為約2至約8。因此，例如，本文所提供之方法可以約3至約4之DAR為目標。
在一些實施例中，ADC為「IMGN853」。如本文所用，「IMGN853」係指含有huMov19抗體、磺基SPDB接頭、及DM4美登木素之ADC。HuMov19 (M9346A)含有：重鏈，其包含與作為PTA-10772寄存於美國典型培養物保藏中心(ATCC)之質體所編碼之重鏈之胺基酸序列相同的胺基酸序列；及(ii)輕鏈，其包含與作為PTA-10774寄存於ATCC之質體所編碼之輕鏈之胺基酸序列相同的胺基酸序列。IMGN853描述於WO2011/106528中，其以全文引用之方式並入本文中。
在一些實施例中，ADC為「IMGN779」。如本文所用，「IMGN779」係指含有Z4681A抗體、磺基SPDB接頭、及吲哚啉並-苯二氮平DGN462之ADC。
在一些實施例中，ADC為「IMGN632」。如本文所用，「IMGN632」係指圖11所示之ADC組成物。ADC組成物包含以磺化型式的包含每huCD123-6Gv4.7 (「G4723A」)抗體平均1.5至2.1個DGN549-C細胞毒性劑之ADC (圖11，上圖)。ADC組成物亦可包含未磺化ADC (圖11所示之單亞胺結構，下圖)。
結合至ADAM9之示範性ADC揭示於PCT/ US2017/067823 (以WO2018119196公開)中，其以全文引用之方式併入本文中。結合至ADAM9之示範性ADC揭示於2018年6月28日提交之美國公開案第62/691,342號中，其以全文引用之方式併入本文中。結合至cMET之示範性ADC揭示於PCT/US2018/012168 (以WO2018129029公開)中，其以全文引用之方式併入本文中。結合至CD19之示範性ADC揭示於WO2012156455中，其以全文引用之方式併入本文中。

V. 實例
實例 1 ：用於 IMGN853 之結合的連續結合過程
為了減少加工時間且改良大規模製造抗體藥物結合物(ADC)之產率，開發連續結合過程。在連續結合中，加工步驟同時發生。使用連續結合消除在純化及緩衝液交換步驟期間結合物之再循環以及在分批結合期間使用的中間保持步驟。以此方式，該過程連續運行4-5天，且在離開TFF純化步驟後直接調配結合物。此外，使用在線過程分析技術(PAT)系統以允許結合物之直接測量，因此消除離線檢定及操作員對材料的處理。此外，因為加工時間減少，所以不必需要大型設備來產生大量結合物：較小設備及較短加工時間足以產生大量產物。此外，對於給定量的產生之最終結合物，當使用連續加工生成時，產物品質概況更一致。相比之下，本體結合中對多批次的需求引入產物品質之批次間變異性增加的可能。
用於ADC「IMGN853」之結合的連續結合過程詳述於圖4中表示之流程圖。IMGN853含有透過磺基-SPDB接頭與DM4美登木素藥物結合的抗FOLR1抗體(「huMov19」)。IMGN853描述於WO 2011/106528中，其以全文引用之方式並入本文中。

實例 1A ：流動化學研究
習知IMGN853結合涉及於70% N,N-二甲基乙醯胺(DMA)中美登木素藥物DM4與N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(sSPDB)接頭之間的原位反應。將適當體積的DM4及sSPDB儲備溶液添加至原位反應容器中。將額外DMA (溶劑)添加至原位容器中至按體積計70% DMA。添加至原位反應容器中的最終反應物為反應緩衝液。在添加反應緩衝液之後，原位反應開始且混合60-120分鐘。然後將原位組分添加至含有M9346A (huMov19)抗體之結合容器中，該抗體已滲濾至反應緩衝液中。將所有組分混合，且在溫和混合隔夜之情況下進行結合反應，以生成目標藥物-抗體比(DAR)為3.4的所要結合物。
在此研究中，執行IMGN853之連續結合。連續結合反應使用所有相同的化學計量IMGN853參數，有一個值得注意的例外。將結合反應之反應緩衝液之pH從7.6增加至8.7。原位反應緩衝液之pH沒有改變且維持在7.6。制定pH之增加以增加結合反應動力學。代替針對結合反應以18小時為目標，較高pH緩衝液在約4小時內生成結合物，以實現較快讀出及較靈活的實驗方案。
對於連續結合實驗，使用注射泵連續添加試劑。設置如圖5所示。使用三個注射泵。第一注射泵控制溶解於DMA中之原位組分之添加。此等組分包括DM4(酬載)、sSPDB(接頭)、及DMA(額外溶劑)。將這三種組分以化學計量比組合，然後抽取至2.5 mL Hamilton Gastight注射器中。第二注射泵計量原位反應緩衝液之添加。使用5mL塑膠BD注射器。將1/16'' PEEK配管用於連續結合研究。將原位反應緩衝液及DMA組分進料管線進料至在線靜態混合器中以確保兩種試劑之充分混合。此兩種進料流透過單件配管組合並自相同配管材料的靜態混合器離開。原位緩衝液及DMA組分之流率分別為952.9nL/min及2.2233 μL/min。基於兩種入口流之流率及所使用之配管之截面積，以90分鐘原位反應為目標需要18.6釐米的PEEK配管。將這一長度的發生原位反應的PEEK配管進料至第二在線靜態混合器中。第二靜態混合器之另一入口來自第三注射泵。第三注射器控制抗體及結合反應緩衝液(pH 8.7)之添加。將抗體及結合反應緩衝液組合且抽取至30mL塑膠BD注射器中。使用相同的PEEK配管以在24.615μL/min之流率下進料抗體及結合反應緩衝液。與原位靜態混合器類似，第二靜態混合器確保結合反應組分充分混合並組合成單個離開流。結合反應物將靜態混合器留在一段4.3米長的相同PEEK配管中，以達成4小時的目標結合反應持續時間。
藉由在任何流動開始之前填充所有三個注射器來執行研究。首先，同時啓動原位反應緩衝液(注射器2)及DMA組分(注射器1)泵。約90分鐘後，啓動泵三(抗體及結合反應緩衝液)。從前兩個泵啓動約5小時後，從該段4.3米長的PEEK配管中溶離出結合物。通過直接自端部收集執行樣品分析(即，從充分混合的結合物彙集物中收集彙集的樣品)。為了測量原位及結合進料流(來自任何泵)之流率，可進一步使用流量計。流量計用作確保對反應之化學計量的充分控制的過程分析技術(PAT)機制。
第一IMGN853連續結合研究之結果顯示於表4中。

表4：第一IMGN853連續結合研究之結果。
研究顯示，連續結合產物品質與並排執行之對照(分批)產物品質相當。產物品質需要一些時間來達到穩態，如藉由在「早期」時間點的較低藥物-抗體比(DAR)所說明。這在第二研究中為一致的，在第二研究中30分鐘樣品亦具有略低DAR。在第二研究中直到3小時，產物品質達成在目標DAR下的穩態(如與並排分批對照相比)。除DAR外，就單體及自由藥物水準而言，產物品質亦相當。總之，此等結果指示，連續結合過程表現良好且就產物品質而言與並排分批對照相當。
第二研究之結果顯示於表5中。
此研究中使用與上文研究相同的參數，但該過程連續運行40小時以顯示100 mg設備設置可用於藉由使過程運行較長時間來生成多10x的產物。結果顯示，在溶離結合物之30分鐘與3小時之間，結合物達到穩態且藉由SEC及自由藥物分析與並排分批對照相當。在3小時下的產物品質與在40小時下溶離的結合物幾乎一致，指示只要將進料試劑供應至反應配管中，連續過程便一致地執行。
在製造設定中，各個別試劑之泵可用於使儲備溶液分開。不是將DM4、sSPDB、或DMA組合成單一進料流，而是可將各儲備溶液分別進料至收集容器中或直接進料至原位反應中。其可適用於抗體及結合反應緩衝液。抗體之儲備溶液可使用指定泵進料，而單獨的泵控制結合反應緩衝液在與其他結合反應組分的適當體積比下之添加。
其他PAT機制可用於在其進行時監測原位或結合反應。傅立葉轉換紅外(FTIR)流動池可在線用於監測原位或結合反應性能。此外，可沿著原位及結合反應配管在中間位置處放置多個FTIR流動池或類似的PAT工具以在發生反應時監測反應。可以從反應開始一直到結束測量所要結合物之形成。然後可使用PAT信號之任何顯著變化來識別在原位或結合反應(開始、中間、或結束)中發生錯誤的位置。對於結合物，替代PAT機制可為具有或不具有UV感測器之基於快速高效液相層析術(HPLC)之儀器(超高效液相層析術(UPLC))。基於HPLC之分析可用於測量DAR，而在線放置之UV感測器可監測結合反應中之抗體濃度。

實例 1B ： 單程切向流過濾研究
在IMGN853原料藥過程期間使用習知切向流過濾(TFF)兩次。首先，在結合反應之前，執行TFF以將經調配抗體緩衝液交換至結合反應緩衝液中(TFF1)。在結合反應後，使用TFF從粗反應混合器中移除殘餘的雜質且將結合物從結合反應緩衝液中緩衝液交換至基礎調配緩衝液中(TFF2)。開發連續過程以用單程TFF (SPTFF)方法代替這兩個習知TFF步驟。連續SPTFF利用Pall Life Sciences之在線濃縮(ILC)及在線滲濾(ILDF)技術。
對於TFF1，在習知加工期間將抗體在30mg/mL下滲濾達8個滲濾體積。在60mg/mL下調配進入的抗體且在習知TFF1加工期間在滲濾之前進行稀釋。在連續加工期間，將在60mg/mL下經調配抗體進料至T型連接器中，其中另一泵添加結合反應緩衝液以將抗體稀釋至30 mg/mL之目標濃度。在T型連接器後，將30mg/mL抗體之單一進料流進料至ILDF模組中。ILDF滲濾緩衝液泵控制結合反應緩衝液至ILDF模組之添加，使得在單程中達成緩衝液交換。結合反應緩衝液中離開ILDF之抗體為30 mg/mL。
PAT控制可在各種位置實施以監測並控制此單元操作。可對經調配抗體進料流(60 mg/mL)、經稀釋抗體進料蒸氣(30 mg/mL)、及/或結合反應緩衝液中之經緩衝液交換抗體放置FlowVPE或UV感測器。FlowVPE或UV感測器可用於測量不同進料蒸氣中抗體之濃度。此外，所有進料流之流量計均可用於監測並調節任何組分之流率，以確保在30 mg/mL下發生ILDF中之緩衝液交換。此外，ILDF後的電導率或pH探針可用於確保抗體至結合反應緩衝液中之緩衝液交換完成。
在結合後，習知TFF2通常以三個步驟執行，所有步驟均於單一單元操作中發生。首先經由超濾至30 mg/mL(從結合反應後的15mg/mL)濃縮結合後粗反應混合物。然後在稱為TFF2之階段I之步驟中，針對結合反應緩衝液將結合物滲濾達4個滲濾體積。在階段I期間，從粗反應混合物中移除殘餘的雜質。就在階段I之後，藉由針對8個滲濾體積的基礎調配緩衝液滲濾結合物來執行階段II。階段II經嚴格設計為緩衝液交換步驟，但對殘餘的雜質之額外清除沒有促進作用。
對於利用SPTFF之連續過程，評估三個單獨的步驟。首先，使用ILC模組以供濃縮。ILC沿循結合反應配管。在單程中，將在15mg/mL下進入ILC之結合物濃縮至30mg/mL，其中將移除之體積丟棄。用於IMGN853且在此情況下所述之濃縮係數為二(2)，但是可適當地使用其他濃縮係數以達成在滲濾之前濃縮結合物之相同結果。
在ILC後，將30 mg/mL結合物進料流進料至第一ILDF(ILDF1)中，其意謂模仿階段I。進料以供ILDF1之滲濾緩衝液為結合反應緩衝且，且其係在適當體積下添加以達成在單程中所要數目的滲濾體積。對於IMGN853，階段I係以四個習知滲濾體積之形式達成。概念驗證研究藉由調節滲濾緩衝液進料泵之流率評估殘餘的雜質之隨滲濾體積數變化的移除。
在ILDF1後，結合物維持在30mg/mL但具有顯著較低濃度的存在雜質。來自ILDF1之離開流進料至ILDF2，其中滲濾緩衝液為基礎調配緩衝液。結合物以於結合反應緩衝液(pH 7.6至8.7)中30 mg/mL進入ILDF且以於pH 5.0緩衝液中30mg/mL離開ILDF2。
使用Pall Life Sciences ILDF模組執行之初步概念驗證研究使用T01模組，其具有0.11 m2 之膜面積。對於結合物進料，在1-4 mL/min之間的流率下評估模組。改變滲濾緩衝液進料速率，使得滲濾體積數改變。使用ILDF評估在1與13之間個滲濾體積之加工。對於所有研究，使用習知分批加工生成結合物材料且冷凍成等分試樣。在冷凍之前且再次在解凍後(在加工之前)對自由美登木素物質進行定量。將粗反應混合物進料至ILC中。使用流量計測量滲餘物流之流率，以計算在模組上達成之濃縮係數。使用目標濃縮係數2執行IMGN853過程及所有研究。
進行以ILDF之第一研究以評估殘餘的雜質自IMGN853結合反應之清除。使用目標反應條件執行本體結合以生成供研究之材料。將結合後粗反應混合物過濾，等分且在使用前冷凍。解凍後，使用以濃縮係數2為目標之單程ILC模組濃縮粗反應混合物。粗反應混合物為15 mg/mL，且ILC後結合物之目標滲餘物濃度為30mg/mL。然後使用結合反應緩衝液將ILC後結合物稀釋至10mg/mL以在低起始濃度下測試ILDF模組。在ILDF之前從30 mg/mL稀釋至10mg/mL有效地減少結合物進料中自由藥物雜質之負載。這在圖6中顯而易見，該圖顯示在ILC之前及之後四種主要雜質物質之藥物雜質水準。結合後粗反應混合物具有高雜質水準。在ILC上濃縮然後稀釋至10mg/mL之後，雜質之濃度減少至起始濃度之約1/3。
在4mL/min下將10mg/mL結合物進料至T01 ILDF模組中，對於階段I目標為加工7個滲濾體積。階段I滲濾緩衝液為結合反應緩衝液(15mM磷酸鉀，2mM EDTA，pH 8.7)。自滲餘物管線取出樣品且分析其蛋白濃度以確定結合物自系統溶離的時間。在濃度達到穩態後，自滲餘物管線收集樣品且藉由RP-HPLC進行分析以定量自由藥物雜質水準並計算在ILDF上之清除率。圖6顯示取自ILDF1步驟之三個樣品之結果：早期、後期、及彙集。在ILDF上達成穩態後不久取得早期樣品。所有三個樣品之雜質水準均遠低於規格限度。就過程性能而言，在ILDF上自由藥物水準之減少為顯著的且可接受的。
在針對結合反應緩衝液首次通過ILDF以模擬TFF2之階段I後，然後使所得之彙集結合物再次行進通過模組以模仿階段II。在階段II之前，沖洗模組，然後準備進行針對基礎調配緩衝液(10 mM乙酸鹽，9%蔗糖，pH 5.0)之滲濾。在4 mL/min下進料結合物，且將滲濾緩衝液進料流率設定為以在ILDF上13個滲濾體積為目標。選擇此數目以匹配習知TFF加工之8個滲濾體積。
與ILDF1類似，自滲餘物管線收集樣品且進行分析以測量抗體之濃度。當偵測蛋白濃度時，收集產物，且定期自滲餘物管線去的樣品。在系統達到穩態後，藉由RP-HPLC分析自滲餘物管線收集之樣品以定量殘餘的雜質水準並計算在ILDF2上之清除率。在產物穿過ILDF且收集後，過濾彙集材料，然後藉由SEC及RP-HPLC進行分析。自ILDF2之所有樣品之結果示出於圖6，ILDF2模仿習知TFF2加工期間的階段II緩衝液交換。所有自由藥物水準均＜ 1%，遠低於經純化原料藥(DS)之最終規格。此等結果說明，藉由SPTFF連續純化IMGN853結合物為可行的且能夠生成如藉由SEC及RP-HPLC所測量，產物品質可接受的經純化結合物。
下一研究檢查ILDF在15 mg/mL之進料濃度下移除殘餘的雜質之清除能力。此濃度係在第一研究顯示在10 mg/mL下充分的清除之後經選擇。在此研究期間，結合物未經ILC加工。將來自本體結合之粗結合物反應混合物解凍並直接進料至ILDF。使用T01 ILDF模組且進料流率為4 mL/min。將結合反應緩衝液用於滲濾緩衝液，且將進料流率設定為初始以1個滲濾體積為目標。當藉由測量濃度來偵測滲餘物中之結合物時，自滲餘物管線收集樣品且藉由RP-HPLC進行分析以定量自由藥物水準。結果顯示於圖7中。結合後粗反應混合物具有高起始水準，該等水準與先前結合一致。在等效於加工1個滲濾體積的單程後，總自由藥物水準從進料中約26%降低至滲餘物中7%。
然後增加滲濾進料流率以目標為7個滲濾體積，其與習知TFF加工之目標4個滲濾體積相當。在系統達到穩態後，測量滲餘物中之自由藥物水準。如圖4所示，在此等加工條件下的單程後，自由藥物水準顯著降低。最終總自由藥物水準低於1%，其在最終產物品質之接受範圍內。此等結果指示，ILDF在15 mg/mL進料結合物濃度下表現良好且當加工達7個滲濾體積時將雜質移除至低於規格限度的水準。
為了比較，來自分批TFF2純化過程之自由藥物雜質清除率值顯示於圖8中。在習知TFF2分批加工(實心條) 4個滲濾體積後，總自由藥物雜質水準為3.4%。在SPTFF加工(條紋條) 7個滲濾體積(其等效於4個習知滲濾體積)後，總自由藥物水準為0.7%。這兩項研究之間的一個重要差異在於純化期間結合物之濃度。對於連續加工研究，進料至ILDF模組之結合物為15mg/mL。習知分批TFF加工係在30mg/mL下執行。
ILDF在15 mg/mL下表現良好，無需考慮壓力或產物品質，所以在隨後研究中增加進料之結合物濃度以最佳化ILDF之產率。目標進料結合物濃度為30 mg/mL。首先使粗反應混合物行進通過ILC，以濃縮係數2為目標。結合物在15mg/mL下進入ILC且濃縮至30mg/mL之目標。在進料至ILDF之前，收集在30 mg/mL下之所得結合物。ILDF之滲濾緩衝液為結合反應緩衝液，且將進料流率設定為以7個滲濾體積為目標。在T01 ILDF模組上，在30 mg/mL下之結合物之進料流率為4mL/min。在滲餘物流中偵測出蛋白後，收集結合物且收集樣品。使系統達到穩態，之後藉由RP-HPLC分析樣品以定量自由藥物水準並計算在ILDF上之清除率。結果顯示於圖9中。將ILDF後自由藥物水準與在ILC之前(15mg/mL粗反應混合物)及ILC後 (30mg/mL)取得之樣品進行比較。ILC後自由藥物水準略有增加，其歸因於對結合物的略微過濃縮。ILC後結合物經測量為31 mg/mL，指示濃縮係數2.1經使用。所得自由藥物水準略高，但為了準確評估ILDF，藉由在進料ILDF之前將適當體積的結合反應緩衝液添加至彙集材料來將結合物稀釋至30 mg/mL。
自在4 mL/min下之ILDF收集且藉由RP-HPLC分析之樣品顯示自ILDF前/ILC後樣品之自由藥物物質之清除。然而，滲餘物中結合物之濃度經測量為約20 mg/mL。據斷定，結合物濃度之下降係由於小盒中產物於膜上聚集並累積。為了減輕任何堵塞且減小系統中之壓力，將進料流率減小至3 mL/min。據此，滲濾緩衝液進料泵流率亦降低，使得以7個滲濾體積為目標以供加工。在減小ILDF之入口流率後，自滲餘物收集樣品且分析其濃度及自由藥物水準。樣品之濃度經確定為22.5 mg/mL，且自由藥物水準與在4 mL/min下測量之樣品相當。總體而言，這指示，加工7個滲濾體積足以純化結合物，但觀察到滲餘物中最大23 mg/mL結合物濃度。

實例 2 ： 用於 IMGN632 之結合的連續結合過程
用於ADC IMGN632之結合的連續結合過程詳述於圖10中表示之流程圖。IMGN632含有連接至細胞毒性酬載DGN549-C之抗CD123抗體(「G4732A」)。IMGN632顯示於圖11中。

實例 2A ：流動化學研究
反應設置與圖5所示之設置類似。第一注射器含有溶解於DMA中之DNA-烷基化IGN酬載「DGN549C」。第二注射器含有在適當體積比下的亞硫酸氫鹽儲備溶液及50mM琥珀酸鹽，pH 3.3。這兩種進料流於靜態在線混合器中混合以起始磺化反應。DGN549C以於混合流中1mM之最終濃度為目標。所得混合物為50mM琥珀酸鹽pH 3.3及50% DMA，其中亞硫酸氫鹽與DGN比為1.4莫耳過剩。兩個進料流以單一流之形式離開靜態在線混合器。基於體積流率確定配管長度，使得配管中反應物至滯留時間為3小時。磺化反應之溫度為25℃且藉由將配管沉沒至溫度控制水浴中來維持。第個注射器(圖5之Ab +緩衝液注射器)含有經再氧化抗CD123抗體(「G4723」)，其已用5%琥珀酸調節至pH 6.0。將適當體積的DMA及50 mM磷酸鉀添加至經再氧化抗體混合物。將均質混合物抽出於單個注射器中以在線與磺化反應組合。
磺化進料流進入第二靜態混合器，在第二靜態混合器中其與經pH調節經再氧化抗體混合。調節體積流率，使得離開第二靜態混合器之最終結合流達成2.0 mg/mL抗體濃度、15% DMA、及3.5 DGN與抗體之莫耳比的所要反應條件。結合配管線圈長度經選擇，使得滯留時間之目標為20小時之結合反應持續時間。與磺化配管類似，將結合配管沉沒於設定於25℃之溫度控制水浴中。

實例 2B ：單程切向流過濾研究
將在pH 4.2下的經pH調節粗結合物混合物在2 mg/mL之濃度下進料至ILC中，其以濃縮係數4為目標，使得滲餘物為約8 mg/mL。將在8 mg/mL下的所得結合物材料進料至ILDF SPTFF模組。第一ILDF之滲濾緩衝液為具有10% (v/v) DMA之10 mM琥珀酸鹽、50 µM亞硫酸氫鹽pH 4.2。將ILDF之流率調節至目標7個滲濾體積，與習知分批加工期間所使用之4個滲濾體積匹配。
在第一ILDF後，將材料在相同濃度下進料至第二ILDF模組，在該模組中滲濾緩衝液為10 mM琥珀酸鹽、50 µM亞硫酸氫鹽pH 4.2。設定滲濾緩衝液進料及產物進料之流率，使得目標滲濾體積數為15以達成與習知分批TFF加工期間所目標之10個滲濾體積類似的緩衝液交換。

實例 3 ： 脈衝處理改良 IMGN853 之結合
本發明人已發現，連續流動結合允許參數(例如，溫度或pH)之脈衝變化。脈衝在連續流動結合過程中為可能的，其中當試劑行進通過具有小體積的線圈及配管時反應發生。例如，短的線圈或配管節段可經快速加熱(例如，藉由絕緣)或冷卻以產生短的溫度偏移或「脈衝」。(參見例如圖12)。
發明人進一步發現，反應參數之脈衝變化為有利的，例如，較長的於變化之參數之暴露可損害該過程或導致對產物品質的負面影響。例如，增加結合反應之溫度達一段延長的時間可導致聚集增加。相反，如本文所說明，僅在短時間脈衝中增加結合反應之溫度可增加反應速度而不顯著增加聚集體形成。
IMGN853之結合係在溫度脈衝之情況下於小瓶中執行，期涉及將含有結合反應組分之小瓶放置於20℃下達約30分鐘，然後藉由將小瓶放置於在較高溫度下的水浴中達指定脈衝時間，然後使小瓶返回至20℃才脈衝。在20℃下回收小瓶，直至發生下一脈衝，且將該過程重複指定數目個脈衝。評估四種不同的脈衝條件：在40℃下4個脈衝，各7分鐘；在42.5℃下4個脈衝，各7分鐘；在50℃下5個脈衝，各1分鐘；且在60℃下5個脈衝，各1分鐘。在穩定20℃溫度之情況下執行對照反應。
反應完成程度(%)用於確定反應速率。在穩定的20℃溫度下，IMGN853結合反應需要約8小時以達到完成。(參見圖14，左圖)。所測試之所有脈衝條件均減少反應時間(即，在較少時間內達到100%完成)。(參見圖14，左圖)。在60℃下脈衝(5次)達每次脈衝1分鐘顯著增加高分子量(HMW；聚集體)物質之出現。(參見圖14，右圖)。相反，所測試之所有其他脈衝條件對HWM (聚集體)物種之出現具有極少影響。
此數據說明，藉由連續流動結合所實現之反應條件可在不損害產物品質之情況下改良反應動力學及生產力。

實例 4 ：用於結合之抗體之單步製備
在實例2中，IMGN632原料藥過程涉及兩個步驟以製備用於結合之G4723A抗體：還原及氧化(圖10，左上方框)。G4723A抗體之還原減少了天然半胱胺酸之間的鏈間二硫鍵且移除C442工程改造半胱胺酸殘基上之加帽基團。此步驟涉及將25莫耳當量TCEP添加至G4723A抗體。在還原反應之後，對經還原抗體混合物進行緩衝液交換以移除任何殘餘TCEP且製備用於再氧化反應之抗體。再氧化步驟涉及將8莫耳當量DHAA添加至經還原G4723A抗體以再形成抗體之鏈間二硫鍵。該反應留下呈自由硫醇之C442工程改造半胱胺酸殘基，其等可經由順丁烯二醯亞胺官能基團結合至酬載。
為了說明以連續型式執行此等反應之可行性，使用小規模流動反應器執行小規模研究。

實例 4A ：還原反應
執行還原反應以說明經調配G4723A抗體可於流動反應器中還原且產生與並排分批反應一致的產物品質的抗體。
執行基於G4723A抗體的150 mg還原規模以說明於流動反應器中之連續還原。將51.1 mg/mL的經調配G4723A抗體用作一種進料流。將抗體溶液抽取至注射器中。將在100 mM下於50 mM磷酸鉀pH 7.5中製備的TCEP-HCl儲備溶液與額外50 mM磷酸鉀pH 7.5組合作為連續反應之第二進料流。如此進行係因為當保持TCEP-HCl儲備溶液及50 mM磷酸鉀pH 7.5緩衝液進料流分開時，它們的流率及體積比較小。需要額外50 mM磷酸鉀pH 7.5緩衝液來將經調配G4723A抗體稀釋至5 mg/mL以供還原反應。
使用Harvard Apparatus注射泵及1/16th PEEK配管設置反應。選擇兩種進料流之體積比，使得混合之後的最終反應化學計量處於目標反應條件，即25莫耳當量TCEP-HCl對抗體，5 mg/mL抗體。將兩種進料流之合併體積流率用於計算所需PEEK配管之長度，使得反應持續時間或於流動反應器中之滯留時間為16小時。對於此實驗，在周圍溫度下執行並排分批對照及連續反應。
在20 mg G4723A抗體規模下設置並排分批對照還原反應。所有反應參數均經匹配。在16小時反應持續時間之後，對對照及連續反應進行取樣且標記以供分析。自流動反應器之出口對連續還原反應進行取樣。對主體對照分批反應進行取樣以供分析。
為了表徵還原反應，用Alexa-MAL 488螢光團標記樣品，該Alexa-MAL 488螢光團與抗體上之自由硫醇反應且可藉由UV分光計偵測。使樣品與Alexa-MAL 488反應且藉由SE-HPLC分析以計算Alexa-抗體比率。連續及並排對照反應之結果示出於表6。
表6中所示之數據指示，G4723A抗體藉由傳統分批及連續加工經還原。對於還原之前的經調配G4723A抗體，未觀察到Alexa標記。在還原反應期間鏈間二硫鍵經還原以形成自由硫醇之後，Alexa-MAL 488能夠與自由硫醇反應且結合自由硫醇。抗體之工程改造半胱胺酸及天然半胱胺酸之完全還原可導致10個標記。
在兩種樣品中偵測到大約7-8個Alexa-MAL 488標記，指示G4723A抗體經還原。此等結果與先前對較小規模進行的開發研究一致，在該等研究中，在還原反應之後識別出8個Alexa-MAL 488標記。與10個標記的理論目標的差異可能是由於在小規模上發生一些再氧化，其由反應容器中之空氣引起，導致自由硫醇再形成二硫鍵且減少用於與Alexa-MAL 488結合之抗體上可用自由硫醇之數目。
在較大規模上再重複後續研究，且目標為縮短大約3小時的還原時間。類似地，用Alexa-MAL 488標記自此等研究生成之抗體，且藉由SE-HPLC進行表徵以比較反應效率。後續研究之產物品質數據示出於表7中，在後續研究中，藉由增加兩種進料流之體積流率目標使還原反應時間為3小時。
除比較分批對照及連續反應之還原反應程度的Alexa:Ab比率之外，測量兩種反應產物之單體及HMW值。表7中之數據顯示，在以較高體積流率之較大規模下，連續還原反應與分批對照相當。此外，藉由連續反應所產生之抗體之單體略有增加。
此等結果說明，還原反應可使用流動化學以連續型式成功執行。
實例 4B ：再氧化反應
執行再氧化反應以說明經還原G4723A抗體可以連續型式再氧化。
歸因於反應規模及流動反應器設備，將用於供應再氧化研究之經還原抗體進行NAP純化。在IMGN632製造期間，將經還原抗體進行TFF純化以移除還原溶液之任何殘餘TCEP-HCl。在移除TCEP-HCl之後，將DHAA添加至反應池中以再形成抗體之鏈間二硫鍵，同時使兩個經工程改造C442半胱胺酸殘基自由以供結合。
對於再氧化研究，首先使用分批反應還原G4723A抗體，因為需要為再氧化反應條件設置流動反應器設備。在37℃下執行還原反應達1小時以相對於在5 mg/mL之抗體濃度下的抗體使用相同25莫耳當量TCEP-HCl來完全還原抗體。在還原反應之後，將反應樣品進行Alexa標記以確認抗體之還原。
然後將經還原抗體NAP純化以在添加DHAA之前移除溶液之殘餘TCEP-HCl。測量經NAP純化材料之濃度以確保再氧化反應設置的目標為適當的化學計量比。將經NAP純化經還原抗體分裂，使得可將並排分批對照反應設置為以連續再氧化樣品之對照。
對於連續再氧化反應，使用三種進料流。第一，將經還原抗體NAP純化。第二，按需要將DMA中之100 mM DHAA儲備溶液與額外DMA組合，以對於反應而言目標為最終5% (v/v)目標。第三，以50 mM磷酸鉀pH 7.5緩衝液將經NAP純化經還原抗體稀釋至對於反應而言目標2.5 mg/mL抗體濃度。基於經NAP純化經還原抗體濃度確定這三種進料流之體積比。調整該等比率，使得經合併進料流在混合之後得到最終目標再氧化反應條件。亦將體積流率用於計算將反應持續時間6小時為目標所需的1/16th PEEK配管之量。並排再氧化反應及連續再氧化反應均在周圍溫度下設置。
設置50 mg再氧化反應以供連續及對照反應。基於這三種進料流之體積流率，目標為6小時需要總計19.9呎1/16th PEEK配管。在開始反應之後的6.5小時開始，自流動反應器之出口間歇地對連續再氧化反應進行取樣。基於流動反應器內的潛在背壓，給出額外時間以確保反應達到穩態。所有取自流動反應器之出口或者分批再氧化反應之主體之樣品均用Alexa-MAL 488螢光團標記且藉由SE-HPLC表徵。隨時間推移對再氧化反應反應進行取樣以確保達成穩態。此外，在研究結束時亦標記含於注射器內且呈連續再氧化反應之進料流之一進料的經還原抗體。對此樣品進行測試以確保經還原抗體不發生再氧化同時在研究持續時間內處於注射器中。將此樣品與還原之後的樣品比較，以理解可能由周圍條件引起之經還原抗體之任何變化。此連續再氧化研究之結果示出於表8中。
此等數據指示，可使用連續加工成功執行再氧化反應。流動反應器中執行之再氧化反應表現出成功的再氧化，其具有大約2.4個Alexa-MAL 488標記。分批對照反應之數據與大約2.2個Alexa-MAL 488標記相當。再氧化之前的經還原抗體具有大約8個標記，其說明添加DHAA導致二硫鍵之再形成。與Alexa-MAL 488結合之其餘標記為可用於結合的經工程改造半胱胺酸殘基。此外，表8中所示之數據指示，經還原抗體在周圍條件下經歷極少量的再氧化。經還原抗體開始為8.15個標籤且在再氧化研究之持續時間之後僅減少至7.36。此數據指示，再氧化係藉由與DHAA之反應驅動，而不是藉由反應容器或緩衝液中存在的空氣驅動。
總體而言，此等結果顯示再氧化反應可於流動反應器中使用連續加工來成功達成。
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應理解，[實施方式]部分但不是[發明內容]及[摘要]部分意欲用於解釋申請專利範圍。[發明內容]及[摘要]部分可闡述如發明人所預期之本發明之一或多個但不是所有示範性實施例，且因此，不意欲以任何方式限制本發明及隨附申請專利範圍。
已藉助於說明特定功能之實行方案及其關係的功能性建構基元在上文描述本發明。為便於描述，本文中將該等功能性建構基元之邊界已任意地定義。可界定替代性邊界，只要指定功能及其關係得到適當執行即可。
具體實施例之前文描述將充分地揭露本發明之一般性質，以使得其他人藉由應用此項技術中之知識，在無不當實驗且不背離本發明之一般範疇的情況下，可輕易地針對各種應用對此等具體實施例進行修改及/或改變。因此，基於本文呈現之教示及指導，此等改變及修改意欲在所揭示實施例之等效物的含義及範圍內。應瞭解，本文之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，以使得本說明書之術語或措辭應由熟習此項技術者根據教示及指導進行解釋。
本發明之廣度及範疇不應受任何上述示範性實施例限制，而應僅根據以下申請專利範圍及其等效物定義。
本申請案中之申請專利範圍與母申請案或其他相關申請案之申請專利範圍不同。因此，申請人撤銷在本申請案或與本申請案有關的任何前任申請案中作出的任何申請專利範圍範疇的任何放棄聲明。因此，建議審查官可能需要再審視任何此類先前放棄聲明及為避免這樣而引用的參考文獻。此外，亦提醒審查官，不應將本申請案中做出之任何放棄聲明讀入母申請案或針對母申請案進行閱讀。
圖1顯示以整合回授控制機構之完全連續的抗體藥物結合物(ADC)製造過程(下圖)及其與習知分批加工(上圖)的關係。
圖2為顯示半分批操作(其並入實現連續的技術)(下圖)及其與習知分批加工(上圖)的關係之流程圖。
圖3為顯示半分批單元操作(下圖)之聯結及其與習知分批加工(上圖)的關係之流程圖。
圖4為顯示實例1中所述之抗體藥物結合物ADC 「IMGN853」之結合之連續結合過程之流程圖。「mAb」係指單株抗體(即，huMov19)。「D」係指藥物(即，美登木素DM4)，且「L」係指接頭(即，sSPDB)。
圖5顯示實例1A中所述之連續結合研究之設置。第一注射泵(L/D/DMA)進料溶解於DMA中之原位組分。緩衝液(IS)注射泵進料原位反應緩衝液(與結合反應緩衝液相同，但就原位反應而言pH為7.6)。第三注射器進料抗體及pH 8.7結合反應緩衝液。「mAb」係指單株抗體(即，huMov19)。「D」係指藥物(即，美登木素DM4)，且「L」係指接頭(即，sSPDB)。「IS」係指原位。
圖6顯示實例1B中所述之在ILC、ILDF1、及ILDF2階段取得之樣品中四種主要雜質物質之自由藥物雜質水準。
圖7顯示如實例1B中所述在15 mg/mL進料濃度下在ILDF1取得之樣品中四種主要雜質物質之自由藥物雜質水準。
圖8顯示連續及分批TFF純化過程之自由藥物雜質水準之比較。連續(條狀條)結合物材料係在15 g/L起始濃度下加工，而分批(實心條)材料在30 g/L下加工，如實例1B中所述。
圖9顯示如實例1B中所述在30 mg/mL進料濃度下在ILDF1取得之樣品中四種主要雜質物質之自由藥物雜質水準。
圖10為顯示實例2中所述之抗體藥物結合物(ADC)「IMGN632」之結合之連續結合過程之流程圖。「mAb」係指單株抗體(即，G4723A)。
圖11顯示IMGN632之化學結構。IMGN632為於亞硫酸氫鈉中包含含有連接至細胞毒性酬載DGN549-C之抗CD123 G4723之ADC之組成物。組成物中大部分ADC為上圖所示之磺化型式。下圖顯示未磺化形式的含有連接至細胞毒性酬載DGN549-C之抗CD123 G4723抗體的ADC (單亞胺結構)，其亦可存在於IMGN632組成物中。
圖12顯示在線過程自動化技術(PAT)之使用可如何用於增加控制及可偵測性。
圖13顯示可用於以高溫脈衝結合反應的加熱及冷卻反應器之示意圖。在脈衝反應器(標記為「PR」)，護套溫度升高，使得線圈內所容納之反應組分暫時加熱，誘導短暫的溫度偏移。然後，在冷卻反應器(標記為「CR」)中，護套溫度保持在較冷的溫度，以使線圈內之反應組分從高溫冷卻回來。這可減少反應期間發生的聚集之量。滯留時間反應器(RTR)在脈衝完成後維持所要的反應溫度，且其體積可基於所要的反應時間。
圖14顯示在暴露於連續20℃溫度或暴露於在較高溫度下的重複脈衝的結合反應中IMGN853結合之速率(左圖)及高分子量(HMW；聚集體)物質之累積。

Claims (140)

  1. 一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)組成物之連續方法，其包含：(i)將抗體或其抗原結合片段與藥物結合以形成ADC，(ii)移除未結合藥物，及(iii)將該ADC交換至穩定緩衝液中，其中(i)至(iii)係連續執行，且其中單程切向流過濾(SPTFF)及/或逆流滲濾係用於移除該未結合藥物及/或將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中SPTFF及/或逆流滲濾係用於移除該未結合藥物以將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中順流管柱層析術係用於移除該未結合藥物且SPTFF及/或逆流滲濾係用於將該ADC交換到該穩定緩衝液中。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其進一步包含預加工該抗體或其抗原結合片段。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工係以(i)至(iii)連續執行。
  6. 如申請專利範圍第4項或第5項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工係使用SPTFF及/或逆流滲濾執行，視情況其中該預加工中僅使用一個SPTFF或逆流滲濾步驟。
  7. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工係在(i)至(iii)之前大量執行。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該方法進一步包含預加工該藥物以供結合。
  9. 一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)組成物之連續方法，其包含：(i)預加工抗體或其抗原結合片段，(ii)將該抗體或其抗原結合片段與藥物結合以形成ADC，(iii)移除未結合藥物，及(iv)將該ADC交換至穩定緩衝液中，其中(i)至(iv)係連續執行，且其中單程切向流過濾(SPTFF)及/或逆流滲濾係用於移除該未結合藥物及/或將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
  10. 如申請專利範圍第4項至第9項中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工包含將該抗體或其抗原結合片段交換至緩衝液中以供結合。
  11. 如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工包含還原該抗體或其抗原結合片段及/或氧化該抗體或其抗原結合片段，視情況其中(a)該還原及/或該氧化係在不使用SPTFF或逆流滲濾之情況下達成或(b)該還原及/或該氧化係在僅使用一個SPTFF或逆流滲濾步驟達成。
  12. 一種用於在連續結合過程中產生抗體藥物結合物(ADC)之方法，其包含在結合反應進行的同時及在已形成至少一種結合反應產物(ADC)之後將一或多種結合反應試劑添加至該結合反應。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該結合反應試劑包含抗體或其抗原結合片段。
  14. 如申請專利範圍第12項或第13項之方法，其中該結合反應試劑包含連接至接頭之藥物。
  15. 如申請專利範圍第12項或第13項之方法，其中該結合反應試劑包含接頭。
  16. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該結合反應試劑包含連接至接頭之抗體或其抗原結合片段。
  17. 如申請專利範圍第12項、第13項、第15項、或第16項之方法，其中該結合反應試劑包含藥物。
  18. 如申請專利範圍第12項至第17項中任一項之方法，其中該結合反應發生在流動反應器中。
  19. 如申請專利範圍第12項至第18項中任一項之方法，其進一步包含預加工抗體或其抗原結合片段。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工係以該結合反應連續執行。
  21. 如申請專利範圍第19項或第20項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工係使用SPTFF及/或逆流滲濾執行，視情況其中該預加工中僅使用一個SPTFF或逆流滲濾步驟。
  22. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工係在該結合反應之前大量執行。
  23. 如申請專利範圍第19項至第22項中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工包含將該抗體或其抗原結合片段交換至緩衝液中以供結合。
  24. 如申請專利範圍第19項至第23項中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段之該預加工包含還原該抗體或其抗原結合片段及/或氧化該抗體或其抗原結合片段。
  25. 如申請專利範圍第5項至第10項中任一項之方法，其中該ADC係使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾來濃縮。
  26. 如申請專利範圍第5項至第11項中任一項之方法，其中該ADC係使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾來純化。
  27. 如申請專利範圍第5項至第12項中任一項之方法，其中該ADC係使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾來轉移至調配緩衝液。
  28. 如申請專利範圍第12項至第27項中任一項之方法，其中該ADC係使用順流層析術來濃縮、純化、及/或轉移至調配緩衝液。
  29. 一種用於濃縮抗體藥物結合物(ADC)之方法，其包含使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾。
  30. 一種用於純化抗體藥物結合物(ADC)之方法，其包含使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾。
  31. 一種用於將抗體藥物結合物(ADC)轉移至調配緩衝液中之方法，其包含使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾。
  32. 如申請專利範圍第29項至第31項中任一項之方法，其中該ADC係於分批結合過程中產生。
  33. 如申請專利範圍第29項至第31項中任一項之方法，其中該ADC係於連續結合過程中產生。
  34. 如申請專利範圍第25項、第29項、第32項、及第33項中任一項之方法，其中該單程切向流過濾使用超濾膜。
  35. 如申請專利範圍第26項、第27項、第30項、及第31項至第33項中任一項之方法，其中該單程切向流過濾使用滲濾膜。
  36. 如申請專利範圍第1項至第35項中任一項之方法，其中該方法改良該ADC產生之一致性。
  37. 如申請專利範圍第1項至第36項中任一項之方法，其中該方法減少ADC產生之時間。
  38. 如申請專利範圍第1項至第11項、第21項、第23項至第27項、及第29項至第37項中任一項之方法，其中該單程切向流過濾及/或該逆流滲濾改良該ADC產生之一致性。
  39. 如申請專利範圍第1項至第11項、第21項、第23項至第27項、及第29項至第38項中任一項之方法，其中該單程切向流過濾及/或該逆流滲濾減少ADC濃縮、純化、或轉移之時間。
  40. 如申請專利範圍第1項至第11項、第21項、第23項至第27項、及第29項至第39項中任一項之方法，其中該單程切向流過濾及/或該逆流滲濾減少所使用之緩衝液之量。
  41. 如申請專利範圍第1項至第40項中任一項之方法，其中該方法進一步包含分析物之在線監測。
  42. 一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)之方法，其中在線監測係用於監測組分至ADC結合反應之添加。
  43. 如申請專利範圍第41項或第42項之方法，其中該在線監測測量添加至該ADC結合反應之組分之濃度。
  44. 如申請專利範圍第41項至第43項中任一項之方法，其中該在線監測測量添加至該ADC結合反應之組分之流率。
  45. 如申請專利範圍第42項至第44項中任一項之方法，其中該組分係抗體或其抗原結合片段、藥物、接頭、連接至接頭之藥物、連接至接頭之抗體或其抗原結合片段、及/或結合緩衝液。
  46. 如申請專利範圍第42項至第44項中任一項之方法，其中該方法進一步包含在線監測以測量組分至原位反應之添加。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該組分係藥物、接頭、及/或原位反應緩衝液。
  48. 一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)之方法，其中分析物之在線監測係用於確定以下之時間：(i)停止向ADC結合反應添加結合緩衝液；(ii)停止結合緩衝液於ADC結合反應中之再循環；及/或(iii)開始淋洗自ADC結合反應之結合緩衝液。
  49. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該分析物係未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物。
  50. 一種用於在ADC結合過程之後純化抗體藥物結合物(ADC)之方法，其中該方法包含分析物之在線監測。
  51. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該純化包含過濾。
  52. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該過濾係超濾或滲濾，視情況其中該滲濾係逆流滲濾。
  53. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該過濾係切向流過濾。
  54. 如申請專利範圍第53項之方法，其中該切向流過濾係單程切向流過濾。
  55. 如申請專利範圍第42項至第54項中任一項之方法，其中該分析物係於滲餘物中。
  56. 如申請專利範圍第55項之方法，其中該分析物係未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物之濃度。
  57. 如申請專利範圍第55項或第56項之方法，其中該分析物係ADC或抗體或其抗原結合片段之濃度。
  58. 如申請專利範圍第55項至第57項中任一項之方法，其中該分析物係結合反應緩衝液或過濾緩衝液之組分之濃度。
  59. 如申請專利範圍第55項至第57項中任一項之方法，其中該分析物係pH。
  60. 如申請專利範圍第50項至第59項中任一項之方法，其中該分析物係於滲透物中。
  61. 如申請專利範圍第60項之方法，其中該分析物係ADC或抗體或其抗原結合片段之濃度。
  62. 如申請專利範圍第60項或第61項之方法，其中該分析物係未結合藥物或連接至接頭之未結合藥物之濃度。
  63. 如申請專利範圍第50項至第62項中任一項之方法，其中該純化包含層析術，且該分析物係在層析管柱之端部處測量。
  64. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該分析物係ADC或抗體或其抗原結合片段。
  65. 如申請專利範圍第63項或第65項之方法，其中該分析物係未結合藥物、連接至接頭之未結合藥物、結合反應緩衝液之組分、或層析緩衝液之組分。
  66. 如申請專利範圍第42項至第65項中任一項之方法，其中該結合反應係分批結合反應。
  67. 如申請專利範圍第42項至第65項中任一項之方法，其中該結合反應係連續結合反應。
  68. 如申請專利範圍第42項至第67項中任一項之方法，其中該在線監測係使用可變路徑長度技術、流動池裝置、UV感測器、拉曼光譜術、或傅立葉轉換紅外光譜術(FITR)執行。
  69. 如申請專利範圍第42項至第67項中任一項之方法，其中該分析物之該在線監測係使用FlowVPE執行。
  70. 如申請專利範圍第42項至第69項中任一項之方法，其中該在線監測改良ADC產率。
  71. 如申請專利範圍第42項至第70項中任一項之方法，其中該在線監測改良ADC回收率。
  72. 如申請專利範圍第42項至第71項中任一項之方法，其中該在線監測減少ADC產生之時間。
  73. 如申請專利範圍第42項至第72項中任一項之方法，其中該在線監測減少所使用之緩衝液之量。
  74. 一種用於產生抗體藥物結合物(ADC)之方法，其中分析物之在線監測係用於確定停止向ADC結合反應添加結合反應組分之時間。
  75. 如申請專利範圍第74項之方法，其中該組分係抗體或其抗原結合片段、藥物、接頭、連接至接頭之藥物、及/或結合反應緩衝液。
  76. 如申請專利範圍第1項至第75項中任一項之方法，其中該ADC包含抗體。
  77. 如申請專利範圍第1項至第75項中任一項之方法，其中該ADC包含抗體之抗原結合片段。
  78. 如申請專利範圍第1項至第77項中任一項之方法，其中該ADC包含特異性結合至CD37、CD33、FOLR1、CD123、CD19、cMET、ADAM9、或HER2之抗體或抗原結合片段。
  79. 如申請專利範圍第78項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段包含huMov19、Z4681A、或G4732A之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。
  80. 如申請專利範圍第79項之方法，其中該等CDR為Kabat定義之CDR、Chothia定義之CDR、或AbM定義之CDR。
  81. 如申請專利範圍第78項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段包含有包含以下序列之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3序列：分別SEQ ID NO:1-6、分別SEQ ID NO:7-12、分別SEQ ID NO:13-18、分別SEQ ID NO:19-24、分別SEQ ID NO:25-30、或分別SEQ ID NO:31-36。
  82. 如申請專利範圍第78項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段包含有包含以下序列之VH及VL序列：分別SEQ ID NO:37及38、分別SEQ ID NO:37及39、分別SEQ ID NO:40及41、分別SEQ ID NO:42及43、分別SEQ ID NO:44及45、分別SEQ ID NO:46及47、或分別SEQ ID NO:48及49。
  83. 如申請專利範圍第78項之方法，其中該抗體包含有包含以下序列之重鏈及輕鏈序列：分別SEQ ID NO:50及51、分別SEQ ID NO:50及52、分別SEQ ID NO:53及54、或分別SEQ ID NO:55及56。
  84. 如申請專利範圍第1項至第83項中任一項之方法，其中該ADC包含選自由以下組成之群之接頭：SMCC、sSPDB、及肽接頭。
  85. 如申請專利範圍第1項至第84項中任一項之方法，其中該ADC包含美登木素或吲哚啉並-苯二氮平。
  86. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該美登木素係DM1或DM4。
  87. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該吲哚啉並-苯二氮平係DGN462或DGN549。
  88. 如申請專利範圍第1項至第87項中任一項之方法，其中該ADC係IMGN529、IMGN779、IMGN853、IMGN632、或Kadcyla。
  89. 一種用於產生IMGN853之方法，其包含：(i)在連續結合過程中混合huMov19抗體及連接至磺基-SPDB之DM4以形成IMGN853，視情況其中在線監測係用於測量添加至結合反應之huMov19抗體之濃度；(ii)視情況使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾濃縮IMGN853，視情況在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；(iii)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾純化IMGN853，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；及(iv)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾將該IMGN853交換至調配緩衝液中，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中雜質之濃度。
  90. 一種用於產生IMGN779之方法，其包含：(i)在連續結合過程中混合Z4681A抗體及連接至磺基-SPDB之DGN462以形成IMGN779，視情況其中在線監測係用於測量添加至結合反應之Z4681A抗體之濃度；(ii)視情況使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾濃縮IMGN779，視情況在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；(iii)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾純化IMGN779，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；及(iv)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾將該IMGN779交換至調配緩衝液中，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中雜質之濃度。
  91. 一種用於產生IMGN632之方法，其包含：(i)在連續結合過程中混合G4732A抗體及磺化DNG549C以形成IMGN632；(ii)視情況使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾濃縮IMGN632，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；(iii)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾純化IMGN632，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中未結合藥物之濃度；及(iv)使用單程切向流過濾及/或逆流滲濾將該IMGN632交換至調配緩衝液中，視情況其中在線監測係用於測量滲餘物中雜質之濃度，視情況其中該G4732A抗體在該結合過程之前於僅一個SPTFF或逆流滲濾步驟中經還原及經氧化。
  92. 如申請專利範圍第1項至第28項或第34項至第91項中任一項之方法，其中該方法包含將結合過程之第一溫度增加至少5℃至高溫，其中該高溫係維持不多於20分鐘。
  93. 一種產生ADC之方法，其包含將結合過程之第一溫度增加至少5℃至高溫，其中該高溫係維持不多於20分鐘。
  94. 如申請專利範圍第92項或第93項之方法，其中該高溫不多於55℃。
  95. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該第一溫度增加至少10℃。
  96. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該第一溫度增加至少15℃。
  97. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該第一溫度增加至少20℃。
  98. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該第一溫度增加至少30℃。
  99. 如申請專利範圍第92項至第98項中任一項之方法，其中該高溫為35℃至55℃。
  100. 如申請專利範圍第99項之方法，其中該高溫為40℃至50℃。
  101. 如申請專利範圍第92項至第100項中任一項之方法，其中將該第一溫度增加至該高溫不需要長於2分鐘。
  102. 如申請專利範圍第101項之方法，其中將該第一溫度增加至該高溫不需要長於1分鐘。
  103. 如申請專利範圍第92項至第100項中任一項之方法，其進一步包含將該高溫降低至視情況該第一溫度。
  104. 如申請專利範圍第103項之方法，其中將該高溫降低至視情況該第一溫度不需要長於2分鐘。
  105. 如申請專利範圍第104項之方法，其中將該高溫降低至視情況該第一溫度不需要長於1分鐘。
  106. 如申請專利範圍第103項至第105項中任一項之方法，其中將該第一溫度增加至該高溫然後降低該高溫之步驟係重複至少兩次或至少三次。
  107. 如申請專利範圍第103項至第105項中任一項之方法，其中將該第一溫度增加至該高溫然後降低該高溫之步驟係重複2-20次或5-10次。
  108. 如申請專利範圍第1項至第28項或第34項至第91項中任一項之方法，其中該方法包含將結合過程之第一溫度降低至少5℃至低溫，其中該低溫係維持不多於20分鐘。
  109. 一種產生ADC之方法，其包含將結合過程之第一溫度降低至少5℃至低溫，其中該低溫係維持不多於20分鐘。
  110. 如申請專利範圍第108項或第109項之方法，其中該第一溫度降低不多於30℃。
  111. 如申請專利範圍第108項至第110項中任一項之方法，其中該溫度降低至少10℃。
  112. 如申請專利範圍第108項至第110項中任一項之方法，其中該溫度降低至少15℃。
  113. 如申請專利範圍第108項至第110項中任一項之方法，其中該溫度降低至少20℃。
  114. 如申請專利範圍第108項至第113項中任一項之方法，其中將該第一溫度降低至該低溫不需要長於2分鐘。
  115. 如申請專利範圍第114項之方法，其中將該第一溫度降低至該低溫不需要長於1分鐘。
  116. 如申請專利範圍第108項至第115項中任一項之方法，其進一步包含將該低溫增加至視情況該第一溫度。
  117. 如申請專利範圍第115項之方法，其中將該低溫增加至視情況該第一溫度不需要長於2分鐘。
  118. 如申請專利範圍第116項之方法，其中將該低溫增加至視情況該第一溫度不需要長於1分鐘。
  119. 如申請專利範圍第116項至第118項中任一項之方法，其中將該第一溫度降低至該低溫然後增加該低溫之步驟係重複至少兩次或至少三次。
  120. 如申請專利範圍第116項至第118項中任一項之方法，其中將該第一溫度降低至該低溫然後增加該低溫之步驟係重複2-20次或5-10次。
  121. 如申請專利範圍第92項至第120項中任一項之方法，其中該高溫或低溫係維持不多於15分鐘。
  122. 如申請專利範圍第92項至第121項中任一項之方法，其中該高溫或低溫係維持30秒至15分鐘。
  123. 如申請專利範圍第122項之方法，其中該高溫或低溫係維持5至10分鐘或10至15分鐘。
  124. 如申請專利範圍第122項之方法，其中該高溫或低溫係維持1至5分鐘。
  125. 如申請專利範圍第1項至第28項或第34項至第124項中任一項之方法，其中該方法包含改變結合過程之第一pH至少0.5至變化的pH，其中該變化的pH係維持不多於20分鐘。
  126. 一種產生ADC之方法，其包含將結合過程之第一pH改變至少0.5至變化的pH，其中該變化的pH係維持不多於20分鐘。
  127. 如申請專利範圍第125項或第126項之方法，其中該第一pH增加至少1，視情況其中該變化的pH不超過9。
  128. 如申請專利範圍第127項之方法，其中該第一pH增加至少2。
  129. 如申請專利範圍第127項之方法，其中該第一pH增加至少3。
  130. 如申請專利範圍第125項或第126項之方法，其中該第一pH降低至少1，視情況其中該變化的pH不低於4。
  131. 如申請專利範圍第130項之方法，其中該第一pH降低至少2。
  132. 如申請專利範圍第131項之方法，其中該第一pH降低至少3。
  133. 如申請專利範圍第125項至第132項中任一項之方法，其進一步包含將該變化的pH改變至視情況該第一pH。
  134. 如申請專利範圍第133項之方法，其中將該第一pH改變至該變化的pH然後改變該變化的pH至步驟係重複至少兩次或至少三次。
  135. 如申請專利範圍第133項之方法，其中將該第一pH改變至該變化的pH然後改變該變化的pH至步驟係重複2-20次或5-10次。
  136. 如申請專利範圍第125項至第135項中任一項之方法，其中該變化的pH係維持不多於15分鐘。
  137. 如申請專利範圍第125項至第136項中任一項之方法，其中該變化的pH係維持30秒至15分鐘。
  138. 如申請專利範圍第137項之方法，其中該變化的pH係維持5至10分鐘或10至15分鐘。
  139. 如申請專利範圍第137項之方法，其中該變化的pH係維持1至5分鐘。
  140. 一種ADC，其根據申請專利範圍第1項至第139項中任一項之方法產生。
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