TW202002995A - 製造t細胞的方法 - Google Patents

Abstract

本揭示涉及用於過繼免疫療法的T細胞製造方法。本揭示還提出了基因轉導T細胞的方法、使用T細胞及其T細胞群的方法。一方面，本揭示提出解凍冷凍的外周血單核細胞(PBMC)、靜置解凍的PBMC、用固定於固相上的抗CD3抗體和抗CD28抗體激活培養的PBMC中的T細胞、用病毒載體轉導激活的T細胞、擴增轉導的T細胞以及獲得擴增T細胞的方法。

Description

製造T細胞的方法

相關申請的交叉引用

本申請主張2018年9月3日提交的美國臨時申請號62/726,350、2018年3月23日提交的美國臨時申請號62/647,571、2018年2月21日提交的美國臨時申請號62/633,113、2018年2月9日提交的美國臨時申請號62/628,521、2018年4月16日提交的德國專利申請號10 2018 108 996.1、2018年2月28日提交的德國專利申請號10 2018 104628.6、2018年2月9日提交的德國專利申請號10 2018 102 971.3的優先權，各自內容透過引用整體併入本文。

本揭示一般涉及用於過繼免疫療法的T細胞製造方法。本揭示還提出了基因轉導T細胞的方法、使用T細胞及其T細胞群的方法。

最近，透過T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)的基因強制表達重定向T細胞對腫瘤相關抗原的特異性提升了過繼性T細胞轉移領域。第二代和第三代CAR的使用有助於解決長期存在的轉移後體內T細胞持久性不足的問題，而該問題嚴重阻礙了其功效。然而，更廣泛應用的重大障礙仍然存在，例如：需要在個體化的基礎上生產T細胞產物，這使得此種具有前景的治療方法難以在經濟上可行。雖然使用T細胞（例如自體T細胞）已經顯示出前景，但在先前高度治療的患者中可能難以獲得合適數量的自體細胞。

US2003/0170238和US2003/0175272描述了過繼性免疫療法的方法，其中可透過將T細胞從激活刺激物移開而使T細胞靜置至少48-72小時（通常至少約72-120小時），然後透過用有絲分裂單克隆抗體(mAb)（諸如可溶性抗CD3和抗CD28mAb）等標記細胞在輸注前重新激活它們，再將標記的細胞與任選在單核細胞和粒細胞中增強的自體單核細胞混合。

美國2017/0051252描述了製造T細胞治療劑的方法，包括獲得含有T細胞和抗原呈遞細胞(APC)的細胞群的步驟；在細胞培養基中培養細胞群，所述細胞培養基包含(i)一種或多種細胞因子、(ii)一種抗CD3抗體或其CD3結合片段和(iii)一種抗CD28抗體或其CD28結合片段、B7-1或其CD28結合片段或B7-2或其CD28結合片段，其中培養物激活並刺激T細胞；用病毒載體轉導激活的細胞群；以及在細胞生長培養基中培養細胞群以擴增轉導的T細胞；從而製造T細胞治療劑。

需要改進的策略來體外轉導細胞群，從而可能產生足夠的T細胞用於研究、診斷和治療目的。本文提出了該技術問題的一種解決方案。

一方面，本揭示涉及一種轉導T細胞的方法，包括解凍冷凍的外周血單核細胞(PBMC)、靜置解凍的PBMC、用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活培養的PBMC中的T細胞、用病毒載體轉導激活的T細胞、擴增轉導的T細胞以及獲得擴增的T細胞。

一方面，T細胞在培養的PBMC中被固定於固相支持物上的抗CD3抗體和抗CD28抗體激活。

另一方面，靜置步驟可能在不超過約1小時、不超過約2小時、不超過約3小時、不超過約4小時、不超過約5小時、不超過約6小時、不超過約7小時、不超過約8小時、不超過約9小時、不超過約10小時、不超過約11小時、不超過約12小時、不超過約18小時、不超過約24小時、不超過約48小時、不超過約36小時、不超過約48小時、不超過約60小時、不超過約72小時、不超過約84小時、不超過約96小時、不超過約108小時或不超過約120小時的時間段內進行。

另一方面，靜置可能在約0.5小時至約48小時、約0.5小時至約36小時、約0.5小時至約24小時、約0.5小時至約18小時、約0.5小時至約12小時、約0.5小時至約6小時、約1小時至約6小時、約2小時至約5小時、約3小時至約5小時、約3小時至約4小時、約4至約5小時、或約1小時至約24小時、約2至約24小時、約12至約48小時、約0.5小時至約120小時、約0.5小時至約108小時、約0.5小時至約96小時、約0.5小時至約84小時、約0.5小時至約72小時或約0.5小時至約60小時的時間段內進行。

另一方面，靜置步驟可能在約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時或約10小時的時間段內進行。

一方面，透過約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約2小時至約5小時、約3小時至約5小時、約3小時至約4小時或約4至約5小時的靜置步驟所產生的T細胞倍數擴增是透過約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約24小時或約16至約20小時的靜置步驟所產生的T細胞倍數擴增的約相等（約1:1）、約至少1.1倍、約至少1.2倍、約至少1.3倍、約至少1.5倍、約至少1.7倍或約至少2.0倍。在一優選方面，透過約4小時的靜置步驟所產生的T細胞的倍數擴增是透過約16小時（例如，過夜）的靜置步驟產生的T細胞的倍數擴增的約至少1.5倍。一方面，T細胞產生之間的唯一差異是靜置時間減少。

一方面，透過約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約2小時至約5小時、約3小時至約5小時、約3小時至約4小時或約4至約5小時的靜置步驟所產生的T細胞數量是透過約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約24小時或約16至約20小時的靜置步驟所產生的T細胞數量的約相等（約1:1）、約至少1.1倍、約至少1.2倍、約至少1.3倍、約至少1.5倍、約至少1.7倍或約至少2.0倍。在一優選方面，透過約4小時的靜置步驟所產生的T細胞數量是透過約16小時（例如，過夜）的靜置步驟所產生的T細胞的倍數擴增的約至少1.5倍或約1.3倍至約2.0倍。一方面，T細胞產生之間的唯一差異是靜置時間減少。

再一方面，抗CD3抗體和抗CD28抗體各自的濃度可能不超過約0.1µg/ml、不超過約0.2µg/ml、不超過約0.3µg/ml、不超過約0.4µg/ml、不超過約0.5µg/ml、不超過約0.6µg/ml、不超過約0.7µg/ml、不超過約0.8µg/ml、不超過約0.9µg/ml、不超過約1.0µg/ml、不超過約2.0µg/ml、不超過約4.0µg/ml、不超過約6.0µg/ml、不超過約8.0µg/ml或不超過約10.0µg/ml。

再一方面，抗CD3抗體和抗CD28抗體各自的濃度可能為約0.1µg/ml至約1.0µg/ml、約0.1µg/ml至約0.8µg/ml、約0.1µg/ml至約0.6µg/ml、約0.1µg/ml至約0.5µg/ml、約0.1µg/ml至約0.25µg/ml、約0.2µg/ml至約0.5µg/ml、約0.2µg/ml至約0.3µg/ml、約0.3µg/ml至約0.5µg/ml、約0.3µg/ml至約0.4µg/ml、約0.2µg/ml至約0.5µg/ml、約0.1µg/ml至約10.0µg/ml、約0.1µg/ml至約8.0µg/ml、約0.1µg/ml至約6.0µg/ml、約0.1µg/ml至約4.0µg/ml或約0.1µg/ml至約2.0µg/ml。

一方面，本文所述的激活可能在不超過約1小時、不超過約2小時、不超過約3小時、不超過約4小時、不超過約5小時、不超過約6小時、不超過約7小時、不超過約8小時、不超過約9小時、不超過約10小時、不超過約11小時、不超過約12小時、不超過約14小時、不超過約16小時、不超過約18小時、不超過約20小時、不超過約22小時、不超過約24小時、不超過約26小時、不超過約28小時、不超過約30小時、不超過約36小時、不超過約48小時、不超過約60小時、不超過約72小時、不超過約84小時、不超過約96小時、不超過約108小時或不超過約120小時的時間段內進行。

另一方面，本文所述的激活可能在約1小時至約120小時、約1小時至約108小時、約1小時至約96小時、約1小時至約84小時、約1小時至約72小時、約1小時至約60小時、約1小時至約48小時、約1小時至約36小時、約1小時至約24小時、約2小時至約24小時、約4小時至約24小時、約6小時至約24小時、約8小時至約24小時、約10小時至約24小時、約12小時至約24小時、約12小時至約72小時、約24小時至約72小時、約6小時至約48小時、約24小時至約48小時、約6小時至約72小時或約1小時至約12小時的時間段內進行。

一方面，本文所述的T細胞對患者或個體是自體的。另一方面，本文所述的T細胞對患者或個體是同種異體的。

另一方面，本文所述的固相可能為珠、板、燒瓶或袋的表面。

再一方面，本文所述的板可能為6孔、12孔或24孔板。

一方面，本文所述燒瓶的接種表面積可能為至少約25cm² 、約75cm² 、約92.6cm² 、約100cm² 、約150cm² 、約162cm² 、約175cm² 、約225cm² 、約235cm² 、約300cm² 、約1720cm² 、約25cm² 至約75cm² 、約25cm² 至約225cm² 或約25cm² 至約1720cm² 。

另一方面，本文所述袋的容積可能為約50ml至約100升、約100ml至約100升、約150ml至約100升、約200ml至約100升、約250ml至約100升、約500ml至約100升、約1升至約100升、約1升至約75升、約1升至約50升、約1升至約25升、約1升至約20升、約1升至約15升、約1升至約10升、約1升至約5升、約1升至約2.5升或約1升至約2升。

再一方面，本文所述的激活可能在存在T細胞激活刺激物的情況下進行。

一方面，本文所述的細胞因子可能包括白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素7(IL-7)、白細胞介素15(IL-15)和/或白細胞介素21(IL-21)。

另一方面，IL-7的濃度可能為不超過約1ng/ml、不超過約2ng/ml、不超過約3ng/ml、不超過約4ng/ml、不超過約5ng/ml、不超過約6ng/ml、不超過約7ng/ml、不超過約8ng/ml、不超過約9ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約11ng/ml、不超過約12ng/ml、不超過約13ng/ml、不超過約14ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約16ng/ml、不超過約17ng/ml、不超過約18ng/ml、不超過約19ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml或不超過約100ng/ml。

另一方面，IL-7的濃度可能為約1ng/ml至100ng/ml、約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml、約1ng/ml至10ng/ml、約2ng/ml至10ng/ml、約4ng/ml至10ng/ml、約6ng/ml至10ng/ml或約5ng/ml至10ng/ml。

再一方面，IL-15的濃度可能為不超過約5ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml、不超過約100ng/ml、不超過約110ng/ml、不超過約120ng/ml、不超過約130ng/ml、不超過約140ng/ml、不超過約150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml或500ng/ml。

另一方面，IL-15的濃度可能為約5ng/ml至500ng/ml、約5ng/ml至400ng/ml、約5ng/ml至300ng/ml、約5ng/ml至200ng/ml、約5ng/ml至150ng/ml、約5ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至100ng/ml、約20ng/ml至100ng/ml、約30ng/ml至100ng/ml、約40ng/ml至100ng/ml、約50ng/ml至100ng/ml、約60ng/ml至100ng/ml、約70ng/ml至100ng/ml、約80ng/ml至100ng/ml、約90ng/ml至100ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約5ng/ml至50ng/ml、約10ng/ml至50ng/ml或約20ng/ml至50ng/ml。

另一方面，IL-2的濃度可能為不超過約1000IU/ml、不超過約950IU/ml、不超過約900IU/ml、不超過約850IU/ml、不超過約800IU/ml、不超過約750IU/ml、不超過約700IU/ml、不超過約650IU/ml、不超過約600IU/ml、不超過約550IU/ml、不超過約500IU/ml、不超過約450IU/ml、不超過約400IU/ml、不超過約350IU/ml、不超過約300IU/ml、不超過約250IU/ml、不超過約200IU/ml、不超過約150IU/ml、不超過約100IU/ml、不超過約90IU/ml、不超過約80IU/ml、不超過約70IU/ml、不超過約65IU/ml、不超過約60IU/ml、不超過約55IU/ml、不超過約50IU/ml、不超過約40IU/ml、不超過約30IU/ml、不超過約20IU/ml、不超過約10IU/ml或不超過約5IU/ml。

另一方面，IL-2的濃度可能為約10IU/ml至1000IU/ml、約20IU/ml至900IU/ml、約30IU/ml至800IU/ml、約40IU/ml至700IU/ml、約50IU/ml至600IU/ml、約50IU/ml至550IU/ml、約50IU/ml至500IU/ml、約50IU/ml至450IU/ml、約50IU/ml至400IU/ml、約50IU/ml至350IU/ml、約50IU/ml至300IU/ml、約50IU/ml至250IU/ml、約50IU/ml至200IU/ml、約50IU/ml至150IU/ml或約50IU/ml至100IU/ml。

另一方面，IL-21的濃度可能為不超過約1ng/ml、不超過約2ng/ml、不超過約3ng/ml、不超過約4ng/ml、不超過約5ng/ml、不超過約6ng/ml、不超過約7ng/ml、不超過約8ng/ml、不超過約9ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約11ng/ml、不超過約12ng/ml、不超過約13ng/ml、不超過約14ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約16ng/ml、不超過約17ng/ml、不超過約18ng/ml、不超過約19ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml或不超過約100ng/ml。

另一方面，IL-21的濃度可能為約1ng/ml至100ng/ml、約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml、約1ng/ml至10ng/ml、約2ng/ml至10ng/ml、約4ng/ml至10ng/ml、約6ng/ml至10ng/ml、約5ng/ml至10ng/ml、約10ng/ml至20ng/ml、約10ng/ml至30ng/ml、約10ng/ml至40ng/ml、約10ng/ml至50ng/ml、約10ng/ml至60ng/ml、約10ng/ml至70ng/ml、約10ng/ml至80ng/ml、約10ng/ml至90ng/ml或約10ng/ml至100ng/ml。

一方面，本文所述的轉導可能在不超過約1小時、不超過約2小時、不超過約3小時、不超過約4小時、不超過約5小時、不超過約6小時、不超過約7小時、不超過約8小時、不超過約9小時、不超過約10小時、不超過約11小時、不超過約12小時、不超過約14小時、不超過約16小時、不超過約18小時、不超過約20小時、不超過約22小時、不超過約24小時、不超過約26小時、不超過約28小時、不超過約30小時、不超過約36小時、不超過約42小時、不超過約48小時、不超過約54小時、不超過約60小時、不超過約66小時、不超過約72小時、不超過約84小時、不超過約96小時、不超過約108小時或不超過約120小時的時間段內進行。

再一方面，本文所述的轉導可能在約1小時至約120小時、約1小時至約108小時、約1小時至約96小時、約1小時至約72小時、約1小時至約48小時、約1小時至約36小時、約1小時至約24小時、約1小時至約12小時、約2小時至約24小時、約4小時至約24小時、約12小時至約24小時、約12小時至約48小時、約12小時至約72小時、約24小時至約72小時或約36小時至約72小時的時間段內進行。

另一方面，本文所述的病毒載體可能為表達T細胞受體(TCR)的γ-逆轉錄病毒載體。

再一方面，本文所述的病毒載體可能為表達TCR的慢病毒載體。

一方面，本文所述的轉導可能在存在T細胞激活刺激物的情況下進行。

一方面，本文所述的擴增可能在存在T細胞激活刺激物的情況下進行。

一方面，本文所述的擴增可能在不超過約1天、不超過約2天、不超過約3天、不超過約4天、不超過約5天、不超過約6天、不超過約7天、不超過約8天、不超過約9天、不超過約10天、不超過約15天、不超過約20天、不超過約25天或不超過約30天的時間段內進行。

另一方面、本文所述的擴增可能在約1天至約30天、約1天至約25天、約1天至約20天、約1天至約15天、約1天至約10天、約2天至約10天、約3天至約10天、約4天至約10天、約4天至約30天、約6天至約25天、約10天至約30天或約12天至約30天的時間段內進行。

一方面，獲得的T細胞數量可能至少約1x10⁹ 、可能至少約2x10⁹ 、可能至少約3x10⁹ 、可能至少約4x10⁹ 、可能至少約5x10⁹ 、可能至少約6x10⁹ 、可能至少約7x10⁹ 、可能至少約8x10⁹ 、可能至少約9x10⁹ 、可能至少約1x10¹⁰ 、可能至少約5x10¹⁰ 、可能至少約1x10¹¹ 、可能至少約5x10¹¹ 、可能至少約1x10¹² 、可能至少約5x10¹² 或可能至少約1x10¹³ 個細胞。

另一方面，獲得的T細胞數量可能約1x10⁹ 至約1x10¹³ 、約1x10⁹ 至約5x10¹² 、約1x10⁹ 至約1x10¹² 、約1x10⁹ 至約5x10¹¹ 、約1x10⁹ 至約1x10¹¹ 、約1x10⁹ 至約5x10¹⁰ 、約1x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約2x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約3x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約4x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約5x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約6x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約7x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約8x10⁹ 至約1x10¹⁰ 或約9x10⁹ 至約1x10¹⁰ 個細胞。

一方面，獲得的T細胞可能為CD3+CD8+T細胞和/或CD3+CD4+T細胞。

另一方面，PBMC可能獲得自患者。

再一方面，本揭示涉及透過本文所述的方法產生基因轉導T細胞。

另一方面，本揭示涉及含有透過本文所述方法產生的基因轉導T細胞和藥用載劑的藥物組合物。

另一方面，本揭示涉及一種製備T細胞群的方法，包括解凍冷凍的外周血單核細胞(PBMC)、靜置解凍的PBMC、用固定於固相上的抗CD3抗體和抗CD28抗體激活靜置PBMC中的T細胞、擴增激活的T細胞以及獲得包含擴增T細胞的T細胞群。

再一方面，本揭示涉及透過本文所述方法製備的T細胞群。

另一方面，本揭示涉及治療患有癌症或有癌症治療需要的患者或個體的方法，包括向患者施用有效量的本文所述擴增T細胞。一方面，有此需要的患者或個體是癌症患者。一方面，待治療的癌症選自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌(UBC)、急性淋巴細胞白血病(ALL)和子宮癌(UEC)中的一種或多種。

另一方面，擴增可能在至少一種選自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21組成的組的細胞因子存在的情況下進行。一方面，擴增在IL-7和IL-15組合存在的情況下發生。

另一方面，解凍、靜置、激活、轉導、擴增和/或獲得可能在封閉系統中進行。

另一方面，本揭示涉及一種製備T細胞群的方法，包括獲得新鮮的外周血單核細胞(PBMC)（即PBMC不是透過解凍冷凍保存的PBMC來獲得）、用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活新鮮PBMC中的T細胞、用病毒載體轉導激活的T細胞、擴增轉導的T細胞以及收穫擴增的T細胞。

一方面，獲得和激活執行時間可能不超過1天。

一方面，擴增執行時間可能超過1天。

另一方面，擴增執行時間可能約1天至2天、約1天至3天、約1天至約4天、約1天至約5天、約1天至6天、約1天至7天、約1天至8天、約1天至9天、約1天至10天、約2天至3天、約2天至4天、約2天至5天、約2天至6天、約2天至7天、約2天至8天、約2天至9天、約2天至10天、約3天至4天、約3天至5天、約3天至6天、約3天至7天、約3天至8天、約3天至9天、約3天至10天、約4天至5天、約4天至6天、約4天至7天、約4天至8天、約4天至9天、約4天至10天、約5天至6天、約5天至7天、約5天至8天、約5天至9天或約5天至10天。

另一方面，收穫可能在激活後約4天至約12天、約4天至約11天、約4天至約10天、約4天至約9天、約4天至約8天、約4天至約7天、約4天至約6天、約4天至約5天、約5天至約12天、約5天至約11天、約5天至約10天、約5天至約9天、約5天至約8天、約5天至約7天或約5天至約6天內進行。

另一方面，收穫的T細胞數量可能選自約2x10⁹ 至約5x10⁹ 、約5x10⁹ 至約10x10⁹ 、約10x10⁹ 至約15x10⁹ 、約5x10⁹ 至約35x10⁹ 、約5x10⁹ 至約30x10⁹ 、約10x10⁹ 至約30x10⁹ 、約15x10⁹ 至約20x10⁹ 、約20x10⁹ 至約35x10⁹ 、約24x10⁹ 至約33x10⁹ 以及約24.8x10⁹ 至約32.2x10⁹ 組成的組。

另一方面，激活、轉導、擴增和收穫可能在封閉或半封閉的系統中進行。

另一方面，封閉系統可能為CliniMACS、Prodigy^TM 、WAVE(XURI^TM )生物反應器、WAVE(XURI^TM )生物反應器與BioSafeSepax^TM II組合、G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統或G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統與BioSafeSepax^TM II組合。

一方面，本揭示提出了透過以下方法產生T細胞群，所述方法包括解凍冷凍的外周血單核細胞(PBMC)、靜置解凍的PBMC、用固定於固相上的抗CD3抗體和抗CD28抗體激活靜置PBMC中的T細胞、擴增激活的T細胞以及獲得包含擴增T細胞的T細胞群。

一方面，本揭示提出了轉導T細胞的方法，包括解凍冷凍的外周血單核細胞(PBMC)、靜置解凍的PBMC、用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活培養PBMC中的T細胞、用病毒載體轉導激活的T細胞、擴增轉導的T細胞以及獲得擴增的T細胞；製備T細胞群的方法，包括解凍冷凍的外周血單核細胞(PBMC)、靜置解凍的PBMC、用固定於固相上的抗CD3抗體和抗CD28抗體激活靜置PBMC中的T細胞、擴增激活的T細胞以及獲得包含擴增T細胞的T細胞群；以及治療患有癌症或有癌症治療需要的患者或個體的方法，包括向患者施用有效量的本文所述擴增T細胞。一方面，有此需要的患者或個體是癌症患者。一方面，待治療的癌症選自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌(UBC)、急性淋巴細胞白血病(ALL)和子宮癌(UEC)中的一種或多種。

基於T細胞的免疫治療靶向作用於主要組織相容性複合體(MHC)分子提呈的來源於腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白的肽表位。腫瘤特異性T淋巴細胞所識別的抗原，即其表位，可以是源自所有蛋白類型的分子，如酶、受體、轉錄因子等，他們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達通常上調。

MHC分子有兩類：MHCI類和MHCII類。MHCI類分子由一條α重鏈和β-2-微球蛋白，MHCII類分子由一條α和一條β鏈組成。其三維構形形成一個結合槽，用於與肽進行非共價相互作用。大部分有核細胞上都可發現MHC-I類分子。他們提呈主要為內源性的蛋白、缺陷核糖體產物(DRIP)和較大肽裂解生成的肽。然而，源自內體隔室或外源性來源的肽也經常在MHC-I類分子上發現。這種I-類分子非經典提呈方式被稱為交叉提呈。MHC II類分子主要發現於專業抗原提呈細胞(APC)上，並且主要提呈，例如，在內吞作用過程中由APC攝入並且隨後被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。

肽和MHC I類的複合體由負載適當T細胞受體(TCR)的CD8陽性T細胞進行識別，而肽和MHCII類分子的複合體由負載適當TCR的CD4陽性輔助T細胞進行識別。本領域已熟知TCR、肽和MHC由此按1:1:1的化學計算量而存在。

CD4陽性輔助T細胞在誘導和維持CD8陽性細胞毒性T細胞的有效反應中發揮重要作用。腫瘤相關抗原(TAA)衍生的CD4陽性T細胞表位的識別對開發能觸發抗腫瘤免疫反應的藥物產品可能非常重要。在腫瘤部位，T輔助細胞維持著對細胞毒性T細胞(CTL)友好的細胞因子環境並吸引效應子細胞，如CTL、天然殺手(NK)細胞、巨噬細胞和粒細胞。

在沒有炎症的情況下，MHC II類分子的表達主要局限於免疫系統細胞，尤其是專業抗原提呈細胞(APC)，例如，單核細胞、單核細胞源性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。在癌症患者的腫瘤細胞中發現有MHC II類分子的表達。本說明書的拉長（較長）肽可發揮MHC II類活性表位的功能。

MHC-II類表位活化的輔助T細胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應子功能中發揮著重要作用。觸發TH1型的T輔助細胞反應的輔助T細胞表位支持CD8陽性殺手T細胞的效應子功能，其中包括直接作用於腫瘤細胞的細胞毒性功能（該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關肽/MHC複合體）。這樣，腫瘤相關T輔助細胞肽表位單獨使用或與其他腫瘤相關肽組合使用可作為刺激抗腫瘤免疫反應的疫苗組合物的活性藥物成分。

哺乳動物（如小鼠）模型顯示，即使沒有CD8陽性T淋巴細胞，CD4陽性T細胞也能透過分泌干擾素-γ(IFNγ)抑制血管生成而足以抑制腫瘤的表現。有CD4陽性T細胞作為直接抗腫瘤效應子的證據。

由於HLA II類分子的組成性表達通常僅限於免疫細胞，因此，直接從原發腫瘤中分離II類肽之前被認為是不可能的事。然而，Dengjel等人成功地在腫瘤中直接識別了多個MHC II類表位（WO2007/028574,EP1760088B1，其內容透過引用整體併入本文）。

由於CD8依賴型和CD4依賴型這兩種反應共同並協同地促進抗腫瘤作用，因此，確定和表徵由CD8+T細胞（配體：MHCI類分子+肽表位）或CD4陽性T輔助細胞（配體：MHC II類分子+肽表位）識別的腫瘤相關抗原對開發腫瘤疫苗非常重要。

對於MHC I類肽若要觸發（引發）細胞免疫反應，其也必須與MHC分子結合。這一過程依賴於MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態性。MHC-1類-結合肽的長度通常為8-12個氨基酸殘基，並且在其與MHC分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基（「錨」）。這樣，每個MHC的等位基因都有「結合基序」，從而確定哪些肽能與結合溝槽特異性結合。

在MHCI類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些MHC-I類分子結合，而且它們之後還必須能被負載特異性T細胞受體(TCR)的T細胞識別。

對於被T淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用於治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。所述抗原應主要由腫瘤細胞表達，而不由正常健康組織表達，或表達數量相對較少。在一個優選的實施方案中，與正常健康組織相比，所述肽應在腫瘤細胞中過度提呈。更為適宜的情況是，該相應抗原不僅出現於一種腫瘤中，而且濃度（即每個細胞的相應肽拷貝數目）亦高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原往往是源自直接參與因細胞週期控制或凋亡抑制中的其功能而發生的正常細胞向腫瘤細胞轉化的蛋白。另外，這些直接導致轉化事件的蛋白的下游靶標可能會被上調，因此可能與腫瘤間接相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標。表位存在於抗原氨基酸序列中，以確保這種肽（「免疫原性肽」）源自腫瘤相關抗原，並可導致體外或體內T細胞反應。

因此，TAA是基於T細胞療法（包括但不限於腫瘤疫苗）研發的起點。識別和表徵TAA的方法通常基於使用可分離自患者或健康受試者的T細胞，或基於腫瘤與正常組織之間的差別轉錄特性或差別肽表達模式的產生。然而，對腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過度表達或選擇性表達的基因的識別並不提供在免疫療法中使用這些基因所轉錄抗原的準確資訊。這是因為，有著相應TCR的T細胞必須要存在而且對這個特定表位的免疫耐受性必須不存在或為最低水準，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應用。因此，在本說明書的一個非常優選的實施方案中，只選擇那些針對可發現功能性和/或增殖性T細胞情況的過量提呈或選擇性提呈肽，這一點非常重要。這種功能性T細胞被定義為在以特異性抗原刺激後能夠克隆地擴增並能夠執行效應子功能（「效應子T細胞」）的T細胞。

如本文所用的術語「T細胞受體(TCR)」是指T細胞上的蛋白質受體，其由α(α)和β(β)鏈的異二聚體組成，儘管在一些細胞中TCR由γ和δ(γ/δ)鏈組成。在本揭示的實施方案中，可能在包含TCR的任何細胞上修飾TCR，例如：包括輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調節性T細胞、天然殺手T細胞和γδT細胞。

TCR是存在於T淋巴細胞（或T細胞）表面上的一種分子，其通常負責識別與主要組織相容性複合體(MHC)分子結合的抗原。在95%T細胞中，它是由α和β鏈組成的異二聚體，而5%的T細胞具有由γ和δ鏈組成的TCR。TCR與抗原和MHC的結合透過由相關酶、共同受體和特化輔助分子介導的一系列生化事件導致其T淋巴細胞的激活。在免疫學中，CD3抗原（CD代表分化簇）是由哺乳動物中四條不同鏈（CD3-γ、CD3δ和兩個CD3ε）組成的蛋白質複合體，所述鏈與被稱為T細胞受體(TCR)的分子和ζ鏈相關聯而在T淋巴細胞中產生激活信號。TCR、ζ-鏈和CD3分子一起構成TCR複合體。CD3-γ、CD3δ和CD3ε鏈是含有單個細胞外免疫球蛋白結構域的免疫球蛋白超家族的高度相關細胞表面蛋白。CD3鏈的跨膜區帶負電荷，這種特徵可使這些鏈與帶正電荷的TCR鏈（TCRα和TCRβ）相關聯。CD3分子的細胞內尾部含有一種稱為免疫受體酪氨酸激活基序（簡稱ITAM）的單個保守基序，其對於TCR的信號傳導能力至關重要。

CD28是在T細胞上表達的分子之一，這些分子提供T細胞激活所需的共刺激信號。CD28是B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的受體。被Toll樣受體配體激活時，B7.1表達在抗原呈遞細胞(APC)中上調。抗原呈遞細胞上的B7.2表達為組成性表達。CD28是在幼稚T細胞上組成性表達的唯一B7受體。除了TCR之外，透過CD28的刺激可以為T細胞提供有效的共刺激信號，以產生各種白細胞介素（特別是IL-2和IL-6）。

一方面，T細胞的擴增和/或激活在存在一種或多種IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21的情況下發生。另一方面，T細胞的擴增和/或激活發生於單獨的IL-2、單獨的IL-7、單獨的IL-15、IL-2和IL-15組合或IL-7和IL-15組合。

透過降低腫瘤大小或防止腫瘤在這些受試者中生長或再生長，本揭示的TCR構建體可能適用於患有或疑似患有癌症的受試者。因此，本揭示進一步涉及一種在受試者中降低生長或或防止腫瘤形成的方法，其透過將本揭示的TCR構建體引入受試者的分離T細胞中並且將轉化T細胞重新引入受試者中，從而實現抗腫瘤反應來減小或消除受試者的腫瘤。可以使用的合適T細胞包括：細胞毒性淋巴細胞(CTL)或含有需要破壞的T細胞受體的任何細胞。正如本領域技術人員所熟知的，可很容易獲得分離受試者這些細胞的各種方法。例如，使用細胞表面標誌物表達或使用市售試劑盒（例如，來自Pierce,Rockford,Ill的ISOCELL™）。

預期TCR構建體可以作為裸DNA引入受試者自身T細胞中或引入合適的載體中。本領域中使用裸DNA透過電穿孔穩定轉染T細胞的方法，請參見，例如，美國專利號6,410,319，其內容透過引用整體併入。裸DNA通常系指以適當表達方向包含於質粒表達載體中的編碼本揭示TCR的DNA。有利的情況是，使用裸DNA可減少產生表達本揭示TCR的T細胞所需的時間。

或者，可以使用病毒載體（例如，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體）將TCR構建體引入T細胞。根據本揭示的方法使用的合適載體在受試者的T細胞中為非複製型。已知有大量基於病毒的載體，其中細胞中維持的病毒拷貝數足夠低，可維持細胞的存活性。示例性載體包括：pFB-neo載體(STRATAGENE®)以及基於HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的載體。

一旦確立轉染或轉導T細胞能夠將TCR構建體表達為具有所需調節和所需水準的表面膜蛋白，則可以確定TCR在宿主細胞中是否具有提供所需信號誘導的功能。隨後，將轉導的T細胞重新引入或給予受試者以激活受試者的抗腫瘤反應。

為了便於用藥，可以將根據本揭示所述的轉導T細胞製成藥物組合物或製成適於體內給藥的植入體，同時具有合適的載劑或稀釋劑，其還可以為藥用型的。本領域已經描述了製備這種組合物或植入物的方法（參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mack, ed.（1980，其內容透過引用整體併入本文））。在合適的時候，可按照其各自的給藥途徑以常規方法將轉導T細胞配製成半固體或液體形式的製劑，例如：膠囊、溶液、注射劑、吸入劑或氣霧劑。可利用本領域已知的方法來防止或最小化組合物到達靶組織或器官之前的釋放和吸收，或確保組合物定時釋放。但是，理想的情況是，使用不妨礙細胞表達TCR的藥用形式。因此，理想的情況是，轉導T細胞可以製成含有平衡鹽溶液（優選為Hanks平衡鹽溶液或生理鹽水）的藥物組合物。

在某些方面，本發明包括製備和/或擴增抗原特異性重定向T細胞的方法，其包括用含有編碼TCR的DNA構建體的表達載體來轉染T細胞，然後，任選地用抗原陽性細胞、重組抗原或受體抗體來刺激細胞，而使細胞增殖。

另一方面，提出了使用裸DNA透過電穿孔或其他非病毒基因轉移（例如但不限於聲孔作用）來穩定地轉染和重定向T細胞的方法。大多數研究者已使用病毒載體將異源基因攜帶入T細胞中。透過使用裸DNA，可以減少產生重定向T細胞所需的時間。「裸DNA」系指以適當表達方向包含於表達盒或載體中的編碼TCR的DNA。本揭示的電穿孔方法可產生穩定的轉染子，其表達並在其表面上攜帶TCR。

在某些方面，T細胞為原代人T細胞，例如：源自人外周血單核細胞(PBMC)、用G-CSF刺激後收集PBMC、骨髓或臍帶血的T細胞。條件包括使用mRNA和DNA以及電穿孔。轉染後，可能立即輸注細胞或者可能儲存細胞。在某些方面，轉染後，細胞可能在基因轉移入細胞後約1、2、3、4、5天或更長時間內離體繁殖數天、數週或數月作為主體群。另一方面，轉染後，克隆轉染子並離體擴增證明存在單個整合或附加體型維持的表達盒或質粒且表達TCR的克隆。選擇用於擴增的克隆顯示出了特異性識別和裂解肽表達靶細胞的能力。可透過用IL-2或結合共同γ鏈的其他細胞因子（例如：IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等）刺激來擴增重組T細胞。可透過用人工抗原呈遞細胞刺激來擴增重組T細胞。重組T細胞可用人工抗原呈遞細胞進行擴增，或者用抗體（如：OKT3，其與T細胞表面上的CD3交聯）進行擴增。重組T細胞亞群可用人工抗原提呈細胞進行刪除，或者用抗體（如：Campath，其與T細胞表面上的CD52結合）進行刪除。另一方面，可冷凍保存基因修飾的細胞。

本發明的組合物的形式可以為單位劑型，其中每個劑量單位（例如：注射劑）含有預定量的組合物，其單獨或與其他活性劑適當組合使用。本文所用的單位劑型術語系指適合作為人和動物受試者單位劑量的物理離散單位，每個單位含有預定量的本發明組合物，其單獨或與其他活性劑組合使用，該預定量經計算為足以產生所需效果的量，適當情況下與藥用稀釋劑、載劑（carrier或vehicle）相關。本發明新單位劑型的規格取決於特定受試者中與藥物組合物相關的特定藥效學。

理想的情況是，有效量或足夠量的分離轉導T細胞存在於組合物中並引入受試者中，從而確立長期、特異性抗腫瘤反應，相較於這種治療不存在將導致的情況降低腫瘤大小或消除腫瘤生長或再生長。理想的情況是，與除了不存在轉導T細胞以外相同的條件相比，重新引入受試者的轉導T細胞數量使腫瘤大小降低約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%或約99%。

因此，轉導T細胞的給予量應考慮給予途徑，並且應該使得引入足夠數量的轉導T細胞以實現所需的治療反應。此外，本文所述組合物中所含每種活性劑的量（例如，依照每種待接觸細胞的量或依照特定體重的量）在不同應用中可能不同。一般來說，轉導T細胞的理想濃度應該足以在接受治療的受試者中提供至少約1×10⁶ 至約1×10⁹ 個轉導T細胞/患者m² （或kg），更理想的情況是，約1×10⁷ 至約5×10⁸ 個轉導T細胞/患者m² （或kg），但是可使用任何超出，例如，大於5×10⁸ 個細胞/患者m² （或kg），或低於，例如，小於1×10⁷ 個細胞/患者m² （或kg）的合適的量。給藥方案可以基於公認的基於細胞的療法（參見，例如，美國專利號4,690,915，其內容透過引用整體併入本文），或者可採用交替連續輸注策略。

這些值為在優化實施本發明的本發明方法後醫師所使用的轉導T細胞範圍提供了一般指導。本文中對這些範圍的敍述絕不排除使用更高或更低量的組分，因為這在特定應用中可能是必要的。例如，根據組合物是否與其他藥物組合物聯合使用，或根據藥代動力學、藥物分佈和代謝的個體間差異，實際劑量和方案可能會不同。本領域技術人員可根據特定情況的緊急需要進行任何必要的調整。

術語「T細胞」或「T淋巴細胞」是本領域公認的，包括胸腺細胞、幼稚T淋巴細胞、未成熟T淋巴細胞、成熟T淋巴細胞、靜置T淋巴細胞或激活T淋巴細胞。適用於特定實施方案的示例性T細胞群包括但不限於輔助性T細胞（HTL；CD4+T細胞）、細胞毒性T細胞（CTL；CD8+T細胞）、CD4+CD8+T細胞、CD4-CD8−T細胞或其他任何T細胞亞群。適用於特定實施方案的其他示例性T細胞群包括但不限於表達以下一種或多種標誌物的T細胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197和HLA-DR，如果需要，可透過陽性或陰性選擇技術進一步分離。

外周血單核細胞(PBMC)定義為具有圓形細胞核的任何血細胞（即，淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞）。這些血細胞是免疫系統中抵抗感染和適應入侵細菌的關鍵組成部分。淋巴細胞群由CD4+和CD8+T細胞、B細胞和自然殺手細胞、CD14+單核細胞和嗜鹼性粒細胞/嗜中性粒細胞/嗜酸性粒細胞/樹突細胞組成。這些細胞通常使用FICOLL™（一種分離血液層的親水性多糖）從全血或白細胞分離術產物中分離，單核細胞和淋巴細胞在血漿層下形成血沉棕黃層。在一實施方案中，「PBMC」是指包含至少T細胞和任選NK細胞以及抗原呈遞細胞的細胞群。

術語「激活」系指T細胞已被充分刺激而誘導可檢測細胞增殖的狀態。在特定的實施方案中，激活還可與誘導細胞因子產生和可檢測的效應子功能相關。術語「激活的T細胞」尤其系指正在增殖的T細胞。僅透過TCR產生的信號不足以完全激活T細胞，還需要一種或多種次級信號或共刺激信號。因此，T細胞激活包括透過TCR/CD3複合體的初級刺激信號以及一種或多種次級共刺激信號。共刺激可以透過已經接受主要激活信號的T細胞的增殖和/或細胞因子產生來證明，例如透過CD3/TCR複合體或透過CD2的刺激。

本文所使用的靜置T細胞系指不分裂或產生細胞因子的T細胞。與激活的T細胞（約12-15微米）相比，靜置T細胞較小（約6-8微米）。

本文所使用的預引發T細胞為靜置T細胞，其已經預先激活至少一次並已從激活刺激物中移除至少約1小時、至少約2小時、至少約3小時、至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時、至少約12小時、至少約24小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時、至少約108小時或至少約120小時。或者，靜置可能在約0.5小時至約120小時、約0.5小時至約108小時、約0.5小時至約96小時、約0.5小時至約84小時、約0.5小時至約72小時、約0.5小時至約60小時、約0.5小時至約48小時、約0.5小時至約36小時、約0.5小時至約24小時、約0.5小時至約18小時、約0.5小時至約12小時、約0.5小時至約6小時、約1小時至約6小時、約2小時至約5小時、約3小時至約5小時或約4小時至約5小時的時間段內進行。預引發的T細胞通常具有記憶表型。

可透過激活T細胞並用與輔助分子結合的配體刺激T細胞表面上的輔助分子來誘導T細胞群增殖。可透過使T細胞與第一製劑接觸來完成T細胞群的激活，所述第一製劑可刺激T細胞中TCR/CD3複合體相關信號。可以透過連接T細胞受體(TCR)/CD3複合體或CD2表面蛋白或透過直接刺激受體偶聯信號傳導途徑來完成T細胞中TCR/CD3複合體相關信號的刺激。因此，抗CD3抗體、抗CD2抗體或蛋白激酶C激活劑可與鈣離子載體一起使用來激活T細胞群。

為了誘導增殖，可使激活的T細胞群與第二製劑接觸，所述第二製劑可刺激T細胞表面上的輔助分子。例如，可用針對T細胞表面上CD28分子的抗CD28抗體來刺激CD4+T細胞群增殖。或者，CD4+T細胞可以用CD28的天然配體（例如：B7-1和B7-2）來刺激。天然配體可為可溶性、在細胞膜上、或與固相表面偶聯。可透過使用單克隆抗體ES5.2D8來完成CD8+T細胞群的增殖，所述單克隆抗體ES5.2D8與CD9（激活T細胞上存在的分子量為約27kD的輔助分子）結合。或者，可透過刺激一種或多種細胞內信號誘導激活T細胞群的增殖，所述細胞內信號由連接輔助分子（如：CD28）產生。

提供主要激活信號的製劑和提供共刺激劑的製劑可以以可溶性形式加入或偶聯至固相表面。在一項優選實施方案中，兩種製劑可以偶聯至相同的固相表面。

在激活和刺激T細胞表面上的輔助分子之後，可監測應對持續暴露於配體或其他製劑（其在細胞內作用以模擬輔助分子介導的途徑）的T細胞增殖進展。當T細胞增殖速率降低時，可用另外的抗CD3抗體和共刺激配體等重新激活和重新刺激T細胞，以誘導進一步的增殖。在一項實施方案中，可透過檢查細胞大小來監測T細胞增殖速率。或者，可透過測定應對暴露於配體或其他製劑（例如B7-1或B7-2）的細胞表面分子表達來監測T細胞增殖。可重複監測和再刺激T細胞以持續增殖，從而產生比原始T細胞群數量增加約100倍至約100,000倍的T細胞群。

本揭示的方法可用於擴增選擇的T細胞群以用於治療傳染病或癌症。得到的T細胞群可以進行基因轉導並用於免疫療法，或者可用於感染因子的體外分析。在T細胞群擴增至足夠數量後，可將擴增的T細胞恢復至個體。本揭示的方法還可提供可再生的T細胞來源。因此，來自個體的T細胞可以離體擴增，一部分擴增的細胞群可重新給予個體，而另一部分則可等分冷凍長期保存，隨後擴增和給予個體。類似地，可從患有癌症的個體中獲得腫瘤浸潤淋巴細胞群，並刺激T細胞增殖至足夠數量並恢復至個體。

本揭示還可能涉及的組合物含有向T細胞提供共刺激信號以用於T細胞擴增的製劑（例如，抗CD28抗體、B7-1或B7-2配體），其與固相表面偶聯，可能另外包括與相同的固相表面偶聯的向T細胞提供主要激活信號的製劑（例如，抗CD3抗體）。這些製劑可能優選附著於珠或燒瓶或袋上。包含每種製劑與不同固相表面偶聯（即，提供主要T細胞激活信號的製劑與第一固相表面偶聯和提供共刺激信號的製劑與第二固相表面偶聯）的組合物也可能在本揭示的範圍內。

一方面，能夠與本文所述的方法和實施方案一起使用的TAA肽包括，例如，美國專利公開號20160187351、美國專利公開號20170165335、美國專利公開號20170035807、美國專利公開號20160280759、美國專利公開號20160287687、美國專利公開號20160346371、美國專利公開號20160368965、美國專利公開號20170022251、美國專利公開號20170002055、美國專利公開號20170029486、美國專利公開號20170037089、美國專利公開號20170136108、美國專利公開號20170101473、美國專利公開號20170096461、美國專利公開號20170165337、美國專利公開號20170189505、美國專利公開號20170173132、美國專利公開號20170296640、美國專利公開號20170253633、美國專利公開號20170260249、美國專利公開號20180051080和美國專利公開號20180164315所述的TAA肽，本文所述的這些專利公開內容和序列表透過引用整體併入本文。

一方面，本文所述的T細胞選擇性地識別提呈上述一個或多個專利和公開內容中所述TAA肽的細胞。

另一方面，能夠與本文所述的方法和實施方案一起使用的TAA包括選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:157的至少一種。

實施例

實施例 1

自體 T 細胞製造過程

純化幼稚(T_n )、幹細胞記憶(T_scm )以及中央記憶(T_cm )T細胞亞群的過繼細胞轉移與分化程度更高的效應子記憶(T_em )和效應子(T_eff )T細胞轉移相比，可導致更佳的腫瘤消退。工程化T細胞產物的傳統製造過程可能需要10-15天。但是，長於約12天（例如14天）的過程可能導致細胞效力降低，例如，更有效的T_n 、T_scm 和T_cm T細胞亞群減少和更低效的T_em 和T_eff T細胞亞群增加。例如，圖1A顯示了來自兩個健康供體（例如：供體6和供體8）的T細胞離體培養時間延長（例如14天），其中期望的T_cm T細胞亞群相較於培養0天、6天或10天減少。另一方面，分化較高且持久時間較短的T_em T細胞亞群相較於培養0、6或10天數量增加。圖1B顯示了來自三名患者（例如：患者864、患者453和患者265）的T細胞離體培養時間延長（例如14天），其中期望的T_cm T細胞亞群相較於培養0天、6天或10天減少。另一方面，分化較高且持久時間較短的T_em T細胞亞群相較於培養0、6或10天數量增加。

更有效的T_n 、T_scm 和T_cm T細胞亞群較少可導致分泌細胞因子（例如，干擾素γ(INF-γ)）的有效激活T細胞更少。圖2顯示了與激活和培養10天相比，激活和培養15天後，從三名健康供體（例如：供體6(D6)、供體7(D7)和供體8(D8)獲得的外周血單核細胞(PBMC)所分泌的INF-γ減少。

為了縮短製造過程，本揭示的實施方案包括約7至約10天的過程，可製造超過100億(10x10⁹ )個細胞而未喪失效力。此外，可優化幾種原料的濃度以將商品成本降低30%。

自體 T 細胞製造過程中消除或修改靜置條件對 T 細胞激活的影響

圖3顯示了用於測試靜置條件對T細胞激活和擴增影響的實驗設計。簡言之，A組表示第一批次PBMC，其在第0天解凍，之後在無細胞因子的情況下靜置過夜(O/N)（即，24小時），接著用固定在非組織培養處理板上的抗CD3和抗CD28抗體激活所述靜置PBMC。IL-7是一種穩態細胞因子，其透過阻止細胞凋亡來促進T細胞存活。靜置期間可將IL-7添加到PBMC中。B1-B3組表示第二批次PBMC，其在第1天解凍，之後在存在IL-7（B1組）或存在IL-7+IL-15（B2組）或無細胞因子（B3組）的情況下靜置4-6小時，接著用固定在非組織培養處理板上的抗CD3和抗CD28抗體激活所述靜置PBMC。C組表示第三批次PBMC，其在第1天解凍（無靜置且無細胞因子），接著用固定在組織培養板上的抗CD3和抗CD28抗體激活所述解凍PBMC。可在第8-10天收穫細胞並計數，之後進行激活系列分析。

CD25和CD69是細胞因子或絲裂原激活的淋巴細胞表面上的激活標誌物。VSV-G假型慢病毒載體（例如：LV-R73）的結合和進入已被證明由VSV-G包膜蛋白與宿主細胞上的低密度脂蛋白受體(LDL-R)相互作用介導。靜置T細胞不表達LDL-R，但是，用抗CD3和抗CD28抗體激活可誘導LDL-R在T細胞上表達並允許有效的慢病毒轉導。這表明受激活水準調節的LDL-R表達的動力學可影響VSV-G慢病毒載體的轉導效率。

圖4顯示了A、B1-B3和C組中的CD25、CD69和hLDL-R表達水準相當，提示靜置時間可能縮短，例如，從24小時縮短至4-6小時，而未顯著降低T細胞激活。

自體 T 細胞製造過程中消除或修改靜置條件對 T 細胞擴增的影響

圖5A和5B分別顯示A和B1-B3組經第7天擴增和第10天擴增後，倍數擴增和細胞存活性相當。但是，無靜置的C組在第7天擴增（5倍）（圖5A）和第10天擴增（16倍）（圖5B）的倍數擴增最小。這些結果表明靜置時間可能縮短，例如：從24小時縮短到4-6小時，而不會顯著減少T細胞擴增。

圖6和7顯示了在2個供體（即，供體1（圖6）或供體2（圖7））中用表達TCR的病毒載體（例如LV-R73）轉導的激活T細胞在A、B1-B3和C組第9天擴增的倍數擴增和存活性。B1和B2組顯示出比A、B3和C組更好的細胞擴增，提示在存在細胞因子（例如，IL-7或IL-7+IL-15）的情況下簡短靜置時間（例如，5小時）可能會增加轉導T細胞的擴增。Rep1和Rep2表示兩次重複。這些結果支持在存在細胞因子（例如，IL-7和/或IL-15）的情況下在自體T細胞製造過程中縮短靜置時間（例如，從24小時縮短至4-6小時），而不會顯著減少T細胞擴增。

自體 T 細胞製造過程中消除或修改靜置條件對 T 細胞中轉基因表達的影響

使用肽/MHC複合體載入的四聚體來檢測T細胞表達之與肽/MHC複合體特異性結合的轉導TCR，圖8顯示了在大規模生產中，針對供體13、供體14和供體16，在T75組織培養瓶中靜置4小時（用IL-7）和24小時（無細胞因子）或在G-Rex100燒瓶中靜置4小時（用IL-7）的T細胞中轉基因表達（例如，重組TCR表達）相當。這些結果表明，大規模製造過程中可縮短靜置時間，例如從24小時縮短到4-6小時，不會顯著降低轉導T細胞中的轉基因表達。此外，使用一個G-Rex100燒瓶可替代多個T75燒瓶而進一步簡化靜置過程。

圖9顯示了對於供體13、供體14和供體16的小規模或大規模生產中靜置4-6小時、6小時或24小時的T細胞在第10天擴增時倍數擴增相當。這些結果表明，大規模製造過程中可縮短靜置時間，例如從24小時縮短到4-6小時，不會顯著影響轉導T細胞的擴增。

自體 T 細胞製造過程中抗 CD3 和抗 CD28 抗體濃度對 T 細胞激活的影響

激活是自體T細胞製造過程中一個重要步驟，這是因為轉導效率和擴增速率都依賴於T細胞激活。透過使用抗體結合CD3受體和共受體（例如CD28）而刺激T細胞是激活T細胞的常用方法。T細胞激活可作為病毒載體（例如，慢病毒載體）轉導的準備步驟。

圖10顯示了用於測試抗CD3和抗CD28抗體濃度對T細胞激活影響的實驗設計。簡言之，第0天，解凍和在無激活細胞因子的情況下培養或靜置PBMC過夜或24小時。第1天，靜置PBMC的激活方式為：在存在IL-7+IL-15的情況下，在兩個包覆有不同濃度（例如，0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml）抗CD3和抗CD28抗體的24孔板中孵育。第2天，分析激活T細胞的CD25、CD69和hLDL-R表達，並用VSV-G假型化慢病毒載體（例如，1xEngLV-R73）轉導。第6/7和第9天，進行分析，例如：細胞計數、存活性和用dextramers(Dex)螢光激活細胞分選(FACS)，dextramers(Dex)是基於葡聚糖骨架的多聚體，該骨架載有多個螢光素和肽/MHC複合體，用於檢測表達重組TCR的T細胞。

圖11顯示，在病毒轉導之前，用0.5μg/ml和1.0μg/ml抗CD3和抗CD28抗體激活的T細胞在供體16和供體14內均具有相當水準的CD25、CD69和hLDL-R表達。但是，這些表達水準顯著高於用較低濃度（例如0.1μg/ml和0.25μg/ml）抗CD3和抗CD28抗體激活的T細胞的表達水準。這些結果表明，可降低抗CD3和抗CD28抗體的濃度，例如從1.0μg/ml降低至0.5μg/ml，不會顯著減少T細胞激活。

自體 T 細胞製造過程中抗 CD3 抗體、抗 CD28 抗體和細胞因子濃度對 T 細胞擴增的影響

圖12顯示，在第10天擴增時，在存在不同濃度（例如，25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml）IL-15的情況下，由0.5μg/ml或1.0μg/ml抗CD3和抗CD28抗體激活的T細胞的細胞計數在各供體16、供體13和供體14內相當。這些結果表明，可降低抗CD3和抗CD28抗體的濃度，例如，從1.0μg降低/ml至0.5μg/ml，並且可降低IL-15的濃度，例如，從100ng/ml降低至25ng/ml，不會顯著降低T細胞擴增。

圖13顯示，在存在不同濃度（例如，25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml）IL-15的情況下，由0.5μg/ml或1.0μg/ml抗CD3和抗CD28抗體激活的重組TCR轉導T細胞的四聚體染色在各供體16、供體13和供體14內相當。這些結果表明，可降低抗CD3和抗CD28抗體的濃度，例如，從1.0μg/ml降低至0.5μg/ml，並且可降低IL-15的濃度，例如，從100ng/ml降低至25ng/ml，不會顯著降低T細胞的病毒轉導。

這些結果一起表明：(1)解凍PBMC後的靜置時間可縮短，例如，從24小時縮短至4-6小時，不會顯著降低T細胞激活、轉基因表達和T細胞擴增；(2)可降低抗CD3和抗CD28抗體的濃度，例如，從1.0μg/ml降低至0.5μg/ml且可降低細胞因子（例如，IL-15）的濃度，例如，從100ng/ml降低至25ng/ml，不會顯著降低T細胞激活、轉基因表達和T細胞擴增。

自體 T 細胞製造過程中激活持續時間對慢病毒載體轉導效率的影響

開發自體T細胞製造過程的主要目標之一是用編碼TCR的慢病毒構建體在原代人T細胞中提高轉導速率。與僅能轉導分裂細胞的γ逆轉錄病毒不同，慢病毒理論上既可轉導分裂細胞又可轉導非分裂細胞。但是，用慢病毒轉導靜置T細胞的轉導效率較差。T細胞的激活已被證明可促進彼等之慢病毒轉導。因此，用固定的珠或可溶形式的抗CD3和抗CD28抗體刺激T細胞已成為進行慢病毒轉導的先決條件，是製造用於過繼細胞療法的基因修飾T細胞的標準部分。

由於T細胞激活步驟在製備用於轉導的T細胞中起著關鍵作用，因此，可能需要優化用抗CD3和抗CD28抗體激活的有效持續時間。

為了確定最佳激活持續時間，進行了評估不同激活持續時間對轉導效率影響的時程研究。結果顯示，轉導T細胞的最佳時間窗可能在用抗CD3和抗CD28抗體激活16-24h後。因此，對於所有進一步的過程開發和臨床製造，轉導前T細胞激活的時間可從48h減至16-24h。

在本揭示的另一項實施方案中，對於新鮮PBMC（即，未冷凍的PBMC），可能無需靜置。因此，未靜置的新鮮PBMC可透過抗CD3抗體和抗CD28抗體激活，之後透過病毒載體轉導，以獲得轉導的T細胞。

儘管轉導T細胞的方法可能涉及以下順序步驟：在組織培養物中激活T細胞，然後將激活的T細胞轉移到不同的組織培養物中，並在此過程中用病毒載體轉導激活的T細胞，但是，可同時進行激活和轉導步驟。例如，當T細胞在被抗CD3和抗CD28抗體激活時，轉導激活的T細胞可在相同的培養物中同時進行。透過這種方法，整個T細胞轉導過程（即從提供PBMC至獲得轉導的T細胞）可縮短至3-4天。

實施例 2

確定提高慢病毒構建體轉導效率的 T 細胞激活最佳持續時間

來自健康供體的PBMC使用抗CD3和抗CD28抗體以不同的時間間隔激活以準備轉導。來自PBMC的激活T細胞用表達靶向作用於R7P1D5TCR的TAA的不同慢病毒構建體產生的濃縮上清液進行處理。轉導細胞在存在IL-7和IL-15的情況下進行擴增。所述產物基於R7P1D5TCR轉基因表達進行比較，基因表達使用特異性dextramer/四聚體透過流式細胞術測定。

代表性材料與方法

代表性方法

為了比較T細胞激活的不同持續時間，本文所述的代表性實驗遵循標準的小規模T細胞製備過程進行，涉及例如4個步驟：解凍/靜置、激活、轉導和擴增。

解凍和靜置

來自健康供體（n=3，D3、D4、D9）的冷凍PBMC在以5%人AB血清補充的溫熱TexMACS培養基中解凍。細胞用benzonase核酸酶(50U/ml)在37℃下處理15分鐘、洗滌、計數並在完全TexMACS培養基中靜置過夜。

激活

在解凍細胞當日，用以PBS稀釋的抗CD3和抗CD28抗體(1μg/mL)包覆24孔非組織培養板，密封並在4℃下孵育過夜。次日，收穫靜置PBMC，計數、洗滌並以1x10⁶ /ml濃度重懸。吸出抗體溶液，用完全培養基洗滌孔，之後向每個孔中加入2x10⁶ 個細胞。在37℃下進行激活指定時間間隔。

轉導

收穫、洗滌和計數激活的T細胞。製備含有濃縮病毒上清液、硫酸魚精蛋白(10μg/ml)、IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的轉導混合物。對於每次轉導，在無菌微量離心管中分離1.0x10⁶ 個細胞，並以400×g離心5分鐘。每個細胞團重懸於對應於特定MOI的0.5ml轉導混合物中。細胞懸浮液置於24孔G-Rex板的適當標記孔中。在37℃和5%CO₂ 下孵育24小時後，向每個孔中加入以IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)補充的1.5ml培養基。轉導後96小時，透過流式細胞術確定轉基因表達。使用多聚MHC-肽複合體（Dextramer或四聚體）透過FACS監測轉基因TCR的表面表達。

流式細胞術

簡言之，以給定的慢病毒感染複數(MOI)轉導的1.0x10⁶ 個細胞按照工作說明進行染色。對於四聚體染色，細胞用含1μl TAA四聚體的50μl流式緩衝液在室溫下避光孵育15分鐘。四聚體染色後用T細胞表面標誌物（例如CD3、CD4、CD8等）的抗體染色。用來自補償珠的自補償基質獲取樣品。

結果

從2個供體（D3和D4）獲得的PBMC使用與板結合的抗CD3和CD28抗體激活16、24和48小時。細胞用3種不同的慢病毒構建體（R72、R21和R22）轉導。

圖14A顯示CD3⁺ CD8⁺ 四聚體⁺ T細胞百分比隨著激活持續時間的增加而逐漸減少，大約為16h＞24h＞48h。在檢測的構建體和供體中始終都觀察到該順序。

為了確定可導致轉基因高表達的病毒轉導的最佳激活持續時間，進行了時程研究。來自一個供體(D9)的PBMC用與板結合的抗CD3和抗CD28抗體激活指定的激活持續時間（例如，0至48小時），並用編碼R7P1D5TCR的兩種不同慢病毒構建體（即，LV-R73和LV-R78）中的每一種進行轉導。

圖14B顯示在激活16-20小時的細胞中轉基因表達最高。結果表示轉導後96小時透過流式細胞術以CD3⁺ CD8⁺ 四聚體⁺ T細胞%測得的轉基因表達水準。最佳激活視窗確定為約16至約20小時，且可延長至最大24小時以增加GMP製造的靈活性。

總之，這些結果可解釋在激活48小時的T細胞中觀察到的低轉導率的其中一種原因，並且顯示16至24小時的較短激活時間對於執行慢病毒轉導可能是最佳時間。儘管將激活時間限制為16至24小時可能影響48小時激活所實現的穩健擴增，但是，認為這種變化可對產品非常有益並且被實施用於所有進一步的過程開發和臨床製造。

實施例 3

與所有生物過程一樣，T細胞製造規模擴大是該過程開發的挑戰性部分。在擴大規模的所有階段，維持T細胞功能和品質以保持產品功效至關重要。對於自體T細胞製造過程，本發明人確定了關鍵步驟並將規模擴大分為兩部分：可在非組織培養表面上進行激活規模擴大，以及可在G-Rex裝置中進行轉導和擴增規模擴大。

儘管珠或可溶性抗體呈現出較為簡單的、易於擴大規模的激活細胞方法，但是，在非組織培養物表面（24孔板）上使用固定的抗體進行激活的自體T細胞製造過程產生最佳的慢病毒轉導和擴增率。但是，從多個24孔非組織培養抗體包覆的板中收穫激活細胞是費力耗時的步驟，為原本簡單的過程增加了複雜性。考慮到激活至多1x10⁹ 個PBMC，在每次製造運行中可能需要大約20個板和480次操作來收穫激活細胞。

激活T細胞的常規方法可能包括開放系統和勞動密集型過程，其使用市售珠或非組織培養物處理的24孔或6孔板且包覆有抗CD3和抗CD28抗體（「板結合」），各抗體的濃度為1ug/mL。但是，開放系統方法可能需要較長的時間（例如，大約8小時）才能完成。為了簡化開放系統和勞動密集型過程，本揭示的實施方案可能包括：適用於封閉系統的簡單過程，所述封閉系統可與市售封閉系統（例如，G-Rex^TM 系統和Xuri^TM 細胞擴增系統）的容器（例如，袋）配合使用，從而使終產物的T細胞激活譜、T細胞轉導性和功能性與使用常規方法激活的T細胞相當。另外，本揭示所述的方法（例如，燒瓶結合方法）可能需要較短的時間（例如，約1小時）即可完成，這比傳統方法快約8倍。

用於開發自體T細胞製造過程的優化在小規模下進行，採用24孔非組織培養板進行激活和採用24孔G-Rex板進行轉導和擴增。在此規模下，第2天轉導的1-2百萬個T細胞進行30倍至40倍擴增直至第10天，在收穫時產生3-8千萬個細胞。但是，最終過程的目標可能是轉導2.5-4億個激活細胞並擴增至超過100億個存活CD3⁺ T細胞，從而維持10天的製造時間表。因此，一方面，本文提出了整個過程的規模擴大。

對於包括更多數量細胞激活方法的本揭示實施方案，非組織培養物處理的T175cm² 燒瓶可提供更大的表面積和更簡單的平臺，從而使需要的操作非常少。優化後，使用燒瓶結合抗體激活T細胞使得擴增和轉導與板結合抗體相當。因此，激活步驟的規模擴大是簡化用於臨床製造的自體T細胞製造過程的主要開發內容。基於更多的細胞數量，轉導和擴增規模從G-Rex-24孔板擴大至G-Rex100。使用G-Rex裝置可促進激活後步驟的接近線性規模擴大，尤其是在接種密度方面。其他參數（例如：進料和分瓶次數）可進行標準化，從而實現最大的擴增率和存活性。在全規模PD運行中驗證整個規模擴大過程可確保在GMP中T細胞產物1號過程的技術成功轉移。

板結合與燒瓶結合

T細胞激活與之後的轉導和擴增是T細胞製造的關鍵步驟。為了優化條件以擴大這些步驟的規模，使用T175cm² 燒瓶提供了合適的激活平臺，表面積更大、操作更少，從而可替代包覆有抗CD3和抗CD28抗體的24孔板。在優化T175cm² 燒瓶的關鍵參數後進行的比較研究中，使用包覆在燒瓶上（燒瓶結合）的抗體激活的多個供體的細胞顯示出與使用包覆在24孔板上（板結合）的抗體激活的細胞具有相當的激活、轉導和擴增水準。

此外，轉導和擴增步驟從小規模（G-Rex-24孔板）擴大至中等規模（2-6個G-Rex10或1個G-Rex100），再擴大至全規模(5-8個G-Rex100)。整個規模擴大過程可能在2次全規模過程開發(PD)運行中進行驗證。使用最終過程產生的所有產物在Dex⁺ CD3⁺ CD8⁺ 細胞百分比方面符合臨床放行標準，並產生足以滿足臨床劑量的細胞數。

透過板結合方法和燒瓶結合方法 （ 非組織培養物處理的燒瓶用抗 CD3 和抗 CD28 抗體包覆 ） 激活的 T 細胞之間在激活水準 （ 流式細胞術 ） 、轉導性 （ Dextramer 染色 ， FACS ） 、擴增 （ 細胞計數 ） 和功能性 (IFN- γ ELISA) 方面的比較

來自健康供體的PBMC使用抗CD3和抗CD28抗體使用非組織培養物處理的T175cm² 燒瓶或24孔板激活以準備轉導。激活的T細胞用編碼R7P1D5TCR的慢病毒構建體進行轉導，並接種於G-Rex24孔板或G-Rex10/G-Rex100燒瓶中。轉導的T細胞在存在IL-7和IL-15的情況下擴增，並在所述過程的第10天收穫。對產物進行過程中測試和最終測試，以確定細胞計數、存活性和轉導的CD8⁺ T細胞的百分比。

代表性材料與方法

方法

實驗遵循標準自體T細胞製造過程，其涉及4個步驟：解凍/靜置、激活、轉導和擴增，但是規模不同。

解凍和靜置

來自健康供體的冷凍PBMC在以5%人AB血清補充的溫熱TexMACS培養基（完全培養基）中解凍。細胞用benzonase核酸酶(50U/ml)在37℃下處理15分鐘、洗滌、計數並在完全TexMACS培養基中靜置過夜。

激活

在解凍細胞當日，用以PBS稀釋的抗CD3和抗CD28抗體(1μg/mL)包覆24孔非組織培養板或T175cm² 燒瓶，密封並在4℃下孵育過夜。次日，收穫靜置PBMC，計數、洗滌並以1x10⁶ /ml濃度重懸。吸出抗體溶液，用完全培養基洗滌孔，之後向每個孔中加入2x10⁶ 個細胞。在37℃下進行激活指定時間間隔。

轉導

收穫、洗滌和計數激活的T細胞。轉導混合物含有臨床前慢病毒上清液（基於指定的MOI計算）、硫酸魚精蛋白(10μg/ml)、IL-7(10ng/mL)和IL-15(100ng/mL)。對於每次轉導，激活的細胞被分離，並以400×g離心5分鐘。每個細胞團重懸於轉導混合物（1ml/2x10⁶ 個細胞）並接種於適當大小的G-Rex燒瓶中。在37℃和5%CO₂ 下孵育24小時後，使用以IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)補充的培養基將每個G-Rex燒瓶中的培養物體積調至指定的一半或滿容量。定期監測細胞計數和存活性直到該過程的第10天。使用多聚MHC-肽複合體（Dextramer或四聚體）透過FACS監測轉基因TCR的表面表達。

流式細胞術

簡言之，按照工作說明對1.0x10⁶ 個轉導細胞進行染色。四聚體染色後用T細胞表面標誌物的抗體染色。用來自補償珠的自補償基質獲取樣品。

結果

為了評價非組織培養物處理的T175cm² 燒瓶作為24孔板的替代物用於包覆抗CD3和抗CD28抗體以激活T細胞，抗體濃度保持與小規模相同，其他參數（例如，包覆體積、細胞密度和接種體積）針對燒瓶較大面積進行了優化。

為了比較激活標誌物CD25、CD69和LDL-R在板結合(PB)和燒瓶結合(FB)激活的PBMC中的存活性和表達，在激活後16-24小時使用FB或PB抗CD3和CD28抗體進行FACS染色和採集。未刺激的PBMC用作陰性對照。

圖15顯示，在優化的條件下，T175cm² 燒瓶中激活的T細胞（燒瓶結合，FB）與在板結合(PB)條件下激活的T細胞相比，激活標誌物CD25、CD69和LDL-R表達水準相當。這些結果表明，鑒於FB和PB激活的T細胞產生的激活水準相當，因而使用FB抗體進行規模擴大激活是可行的。

為了比較第10天收穫的使用PB或FB抗體激活之T細胞產物（來自供體6、供體7和供體8）的轉基因表達和擴增，使用TAA特異性dextramer或轉基因TCRβ鏈特異性抗體透過流式細胞術測定R7P1D5TCR的表面表達。倍數擴增的計算基於轉導時（第2天）接種於G-Rex板或燒瓶和收穫當天（第10天）的存活細胞數。圖16A和16B分別顯示了FB和PB激活T細胞中相當的轉導和倍數擴增水準。這些結果表明，鑒於FB和PB激活T細胞產生的轉導和擴增水準相當，因而使用FB抗體進行規模擴大轉導和擴增是可行的。

為了進一步驗證激活的成功規模擴大，比較了FB和PB激活方法產生的T細胞產物的功能性。為了評價使用PB或FB抗體激活產生的LV-R73轉導T細胞產物的抗原特異性IFN-γ誘導，與腫瘤細胞系（Target+ve、Target-ve）共培養的T細胞上清液中釋放的IFN-γ使用市售的ELISA試劑盒進行定量。

圖17顯示，FB激活LV-R73轉導的T細胞與PB激活轉導的T細胞分泌相當水準的抗原特異性IFN-γ以應對供體6、供體7和供體8中表達TAA的腫瘤細胞。這些結果表明，鑒於FB和PB激活的T細胞產生的IFN-γ分泌水準相當，因而使用FB抗體擴大IFN-γ分泌T細胞的規模是可行的。

為了擴大其餘過程的規模，轉導2.5x10⁸ -4.0x10⁸ 個激活T細胞，並以0.5x10⁶ /cm² G-Rex100燒瓶表面積的最佳接種密度進行接種。使用多個G-Rex100燒瓶以最佳密度接種轉導的細胞。其他參數（例如：細胞進料和分瓶條件）也可進行優化，從而實現最大的擴增。最終製造過程在2次全規模過程開發運行中進行檢測。使用最終過程產生的所有產物均符合%Dextramer和整合拷貝數放行標準。這些製造運行中產生的細胞數量滿足所有世代水準的臨床劑量。PD規模擴大運行的結果總結於以下的表1中。

表1：2次全規模PD運行的產物特徵小結

採用上述方法的GMP製造已在少數供體中產生了超過200億個細胞。

燒瓶結合與袋結合

透過燒瓶結合方法和袋結合方法 （ 例如 ， 包覆有抗 CD3 和抗 CD28 抗體的 Saint-GobainVueLifeAC 袋 ） 激活的 T 細胞之間在激活水準 （ 流式細胞術 ） 、轉導性 （ Dextramer 染色 ， FACS ） 和擴增 （ 細胞計數 ） 方面的比較

為了比較使用抗CD3和抗CD28抗體包覆的袋與板的T細胞激活，圖18顯示了用於測試使用包覆抗CD3和抗CD28抗體的袋和板對T細胞激活影響的實驗設計。簡言之，第0天，解凍PBMC並靜置過夜（24小時）。第1天，靜置的PBMC透過將其接種於使用抗CD3和抗CD28抗體包覆16-20小時的燒瓶（例如，T175cm² 燒瓶）或袋（例如，Saint-GobainVueLifeAC袋）來激活。第2天，分析激活T細胞的CD25、CD69和hLDL-R表達，並用VSV-G假型化慢病毒載體（例如，1xEngLV-R73）進行轉導。第6/7和第10天，進行分析，例如：細胞計數、存活性和用dextramers(Dex)螢光激活細胞分選(FACS)。

圖19顯示，在優化的條件下，在濃度為1μg/ml或2μg/ml的抗體結合的袋中激活的T細胞（來自供體16和供體14）與燒瓶結合（T175cm² 燒瓶，標記為「標準」）條件下激活的T細胞相比，激活標誌物CD25、CD69和LDL-R表達水準相當。這些結果表明，鑒於袋結合(Bag)和燒瓶結合(FB)激活的T細胞產生的激活水準相當，因而使用袋結合(Bag)抗體進行規模擴大激活是可行的。

圖20和21分別顯示了擴增的第6天和第10天，在濃度為1μg/ml或2μg/ml的抗體結合的袋中激活的T細胞（來自供體16和供體14）與FB條件下激活的T細胞相比，T細胞計數（即，細胞擴增）相當。這些結果表明，鑒於袋結合和燒瓶結合激活的T細胞產生的擴增水準相當，因而使用袋結合抗體進行規模擴大擴增是可行的。

實施例 4

T 細胞製造過程中的短暫靜置與過夜靜置

圖22顯示了根據本揭示一實施方案所述透過使PBMC靜置約4小時時間段的T細胞製造過程220 。例如，T細胞製造過程220 可包括分離和冷凍保存來自白細胞分離術的PBMC(221 )，其中可測試無菌性；解凍、靜置（例如，約4小時）並激活T細胞(222 )；用病毒載體轉導(223 )；用細胞因子擴增(224 )；分瓶/進料細胞(225 )，其中可測試細胞計數和免疫表型；收穫和冷凍保存藥物產品細胞(226 )，其中可測試細胞計數和黴漿菌；以及冷凍保存後放行(227 )，其中可測試存活性、無菌性、內毒素、免疫表型、整合載體拷貝數和水皰性口炎病毒糖蛋白G(VSV-g)。

圖2顯示了根據本揭示一實施方案所述透過T細胞製造過程220 的三次不同試產(qualificationrun)製造的T細胞的特徵，方法是：在存在IL-7的情況下，使PBMC靜置較短時間（例如，約4至約6小時）。

表2：透過靜置PBMC較短時間（例如，約4至約6小時，優選為約4小時，在GMP潔淨室中）的T細胞製造過程220 的試產(QR)

圖23A和表2顯示了透過過夜靜置PBMC製造的T細胞平均倍數擴增(n=7)為78.7倍。

為了確定轉導TCR是否在擴增T細胞的細胞表面上表達，擴增T細胞用特異性結合轉導TCR的肽/MHC複合體載入的dextramer染色，然後透過流式細胞術鑒定表達轉導TCR的CD8+T細胞。圖23B和表2顯示了透過短時間靜置製造的Dex+/CD8+T細胞平均百分比(n=7)為約53.4%，提示轉導TCR在擴增T細胞的細胞表面上表達。

為了確定在表達轉導TCR的擴增T細胞中存在哪些T細胞表型，用各種免疫細胞表面標誌物染色細胞，然後以流式細胞術鑒定T細胞表型（例如，T_n/scm 、T_cm 、T_em 和T_eff ）。其中，T_n/scm 可能比其他更適合於免疫療法，這是因為T_n/scm 可能具有淋巴歸巢、增殖可能性、自我更新和多能性的特性。圖23C顯示平均約50%的表達轉導TCR的擴增T細胞(n=4)表現出T_n/scm 表型。

為了確定表達轉導TCR的擴增T細胞的細胞毒性活性，用不同濃度靶肽脈衝處理的腫瘤細胞與表達轉導TCR的擴增T細胞一起孵育，所述TCR特異性識別靶肽/MHC複合體，然後測量腫瘤細胞生長。圖23D顯示，表達轉導TCR的擴增T細胞以肽濃度依賴性方式抑制腫瘤細胞生長。

從不同健康供體（例如，供體7、13、17、18和21）（圖23E）中獲得的PBMC與從不同患者（例如，患者312、319、351、472和956）（圖23F）中獲得的PBMC之間表達轉導TCR的擴增T細胞的細胞毒性活性似乎相當。

為了確定表達轉導TCR的擴增T細胞的細胞毒性可能性，表達靶肽的腫瘤細胞與表達轉導TCR的擴增T細胞(220-T)一起孵育，所述TCR特異性識別靶肽/MHC複合體，然後測量腫瘤細胞的倍數生長。圖23G和圖23H顯示，與缺乏靶特異性TCR的未轉導T細胞(NT)相比，在效應子與腫瘤細胞比為10:1和3:1的情況下，透過用表達轉導TCR的擴增T細胞(220-T)（效應子）孵育，可增加對腫瘤生長的緩解或抑制。

圖24顯示了過夜靜置PBMC（約16小時）的T細胞製造過程240 。例如，T細胞製造過程240 可包括分離PBMC(241 )，其中PBMC可為新鮮使用或在準備使用前可為冷凍保存的，或可用作T細胞製造的起始材料，也可能選擇淋巴細胞群（例如，CD8、CD4或兩者均選擇）；將淋巴細胞解凍並靜置過夜（例如約16小時）(242 )，這可讓凋亡細胞死亡並恢復T細胞的功能性（如果使用新鮮材料，則可能無需此步驟）；激活淋巴細胞(243 )，可使用抗CD3和抗CD28抗體（可溶性或表面結合，例如：磁珠或生物可降解珠）；用CAR或TCR轉導(244 )，可使用編碼CAR或TCR的慢病毒或逆轉錄病毒構建體，或可使用非病毒方法；和擴增淋巴細胞、收穫和冷凍保存(245 )，可在存在細胞因子、血清（ABS或FBS）和/或冷凍保存培養基的情況下進行。

圖3顯示了透過過夜靜置PBMC（例如，約16小時）的T細胞製造過程(240 )的三次不同試產所製造的T細胞的特徵。

表3：過夜靜置PBMC（在GMP潔淨室中）的T細胞製造過程的試產(QR)。

與短時間靜置（例如，約4小時）的T細胞製造過程相比，約16小時靜置時間下製造的T細胞產生較少的T細胞倍數擴增。圖25A和表3顯示透過靜置PBMC約16小時製造的T細胞平均倍數擴增(n=7)為約45倍，而靜置約4小時的較短時間為約78.7倍（表2）。TT和PQ分別表示技術轉移和過程試產。

與靜置約4小時相比，過夜靜置（約16小時）產生的表達轉導TCR的擴增T細胞較少。圖25B和表3顯示透過過夜靜置PBMC約16小時製造的Dex+/CD8+T細胞平均百分比(n=7)為約51.9%，而靜置約4小時為約53.4%（表2）。

與靜置約4小時相比，過夜靜置約16小時產生的表達具有T_n/scm 表型的表達轉導TCR的擴增T細胞較少。圖25C顯示，平均約40%的擴增T細胞(n=5)具有T_n/scm 表型，相比之下，靜置約4小時約為50%（圖23C）。

圖25D顯示，與陰性對照組（例如，腫瘤細胞與不表達轉導TCR(Target-ve)的擴增T細胞一起孵育或無效應子）相比，在效應子與腫瘤細胞比為10:1、3:1和1:1的情況下，透過腫瘤細胞與表達轉導TCR的擴增T細胞（效應子）一起孵育，可顯著更多地抑制腫瘤生長。此外，從健康供體(n=5)（圖25E）中獲得的PBMC與從癌症患者(n=7)（圖25F）中獲得的PBMC之間表達轉導TCR的擴增T細胞的細胞毒性活性似乎相當。

表4總結了根據本揭示的一實施方案以約4小時短時間靜置（過程220 ）以及過夜靜置約16小時（過程240 ）製造的T細胞的特徵。 表4

表4顯示了短時間靜置的過程220 （約4-6小時）可能允許多一天的擴增（例如，過程240的第8天為過程220的第9天），因此，產生更多細胞。

實施例 5

封閉系統中的 T 細胞製造

如上所述，過程220 和240 可在開放系統（例如，G-Rex^TM ）中執行。但是，開放系統中對造血細胞（例如，T細胞）的離體操作可能引入感染因子污染的風險，並可能降低移植的可能性和造血合適性。在製造臨床細胞產品過程中，由於整個培養過程需保證無菌，因此，可優選封閉培養系統。

圖26顯示了開放和封閉系統中的離體操作方案。封閉系統不僅可減輕外部處理風險和污染，還可促進產品的穩健性和品質，並提高產品安全性，從而減少下游加工、最終產品分析和測試的挑戰。儘管數量相對較少的細胞（例如，≤1x10⁹ ）可在開放系統中以相對小的體積培養（例如，1升），但是，數量相對較大的細胞（例如，約1x10⁹ 至約2x10¹¹ ）可在封閉系統中以相對大的體積培養，例如，5升（例如，WAVE(XURI^TM )）生物反應器袋和G-Rex^TM 燒瓶）至50升（例如，靜態袋）。這些封閉系統的細胞培養技術可提供高品質、個體化的細胞療法，作為受控、更便捷和經濟有效的細胞製造途徑。

本揭示的T細胞製造過程可在任何細胞培養封閉系統中實施，包括市售系統，例如：CliniMACS Prodigy^TM (Miltenyi)、WAVE(XURI^TM )生物反應器(GE Biosciences)單用或與BioSafe Sepax^TM II聯合使用、以及G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統(WilsonWolf)單用或與BioSafe Sepax^TM II聯合使用。G-Rex^TM 封閉系統為擴增容器，GatheRex^TM 為用於濃縮和收穫的泵。

CliniMACS Prodigy^TM (Miltenyi)

CliniMACS Prodigy^TM 含有TCT過程軟體和TS520管套件，可進行封閉系統處理，用於細胞富集、轉導、洗滌和擴增。例如，MACS-CD4和CD8-MicroBeads可用於富集，TransACT珠（例如，CD3/CD28試劑）可用於激活，表達重組TCR的慢病毒載體可用於轉導，TexMACS培養基-3%-HS-IL2可用於培養，磷酸鹽緩衝鹽水/乙二胺四乙酸緩衝液可用於洗滌。此系統可以產生約4-5x10⁹ 個細胞，包含用於製造腔室最大~300mL填充體積的自動化方案，並在10至14天的過程期間執行選擇和激活（TransACT珠）、轉導和擴增。

WAVE (Xuri^TM )生物反應器(GEBiosciences)

WAVE(Xuri^TM )生物反應器可在進行和/或不進行灌注的情況下在培養袋（例如，Xuri Cellbags)中培養T細胞。用於進料的培養基袋可為5升的HycloneLabtainer。廢物袋可為Mbag（購自GE Healthcare）。此系統可產生約15-30x10⁹ 個細胞，使用可進行培養控制和監測的獨角獸軟體，包含可容納約0.3升至約25升的搖動托盤，並執行灌注功能以保持培養體積的同時調節氣體交換並將新鮮培養基和細胞因子引入細胞培養物。

WAVE(Xuri^TM )生物反應器可包括用於擴增的Xuri袋、用於解凍和靜置的Saint Gobain’sVueLife袋以及用於激活的VueLife AC袋。WAVE(Xuri^TM )生物反應器可與其他技術（例如Sepax^TM 細胞分離系統(GE Biosciences)）配合使用，以進行培養物洗滌和體積減少步驟。無菌焊接機(Terumo BCT^TM )可用於連接用於溶液轉移的無菌袋和用於管道密封的熱封機。

Sepax^TM 細胞分離系統依賴於分離腔，所述分離室透過注射器腔的旋轉進行分離（離心）和透過注射器活塞的移位進行組分轉移。光學感測器可測量分離組分的吸光度，並管理正確輸出容器中每種組分的流動方向，例如，可從血液樣品中分離和收集血漿、血沉棕黃層和紅細胞。

圖27顯示，第0天，Sepax^TM 細胞分離系統分離的冷凍PBMC可進行解凍、洗滌、靜置（例如，過夜(O/N)），培養袋（例如，VueLife AC細胞袋）可用抗CD3抗體和抗CD28抗體包覆；第1天，可將靜置的PBMC轉移至包覆有抗CD3抗體和抗CD28抗體的培養袋中進行激活；第2天，可洗滌細胞並透過Sepax^TM 細胞分離系統將培養基減少為適於病毒轉導（例如，用表達TCR的慢病毒載體轉導）的合適體積。細胞擴增可在有灌注功能的搖動托盤上面的Xuri^TM 培養袋中進行，以維持培養體積，同時調節氣體交換並將新鮮培養基和細胞因子引入細胞培養物。可使用Sepax^TM 細胞分離系統收穫並洗滌擴增的轉導T細胞。

G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統(WilsonWolf)

G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統包括：用於細胞擴增的氣體交換容器(G-Rex-CS)和自動泵(GatheRex)，所述自動泵可讓操作者排出培養物中存在的過量培養基並收集細胞，而沒有污染的風險。收穫過程可分為兩個階段：細胞濃縮和細胞收穫。在細胞濃縮過程中，GatheRex^TM 封閉系統可透過空氣泵操作，所述空氣泵用無菌空氣對G-Rex^TM 裝置（例如：燒瓶）加壓，可讓細胞上方90%的培養基移至培養基收集袋中。此過程一旦完成，第一光學檢測器則會感應培養基收集管線中存在空氣，自動停止泵運行。在開始收穫過程之前，操作者可透過手動旋轉G-Rex^TM 裝置以使細胞自透氣膜脫附而使用剩餘的10%培養基來重懸細胞。然後，重新激活空氣泵，並將重懸的細胞吸入細胞收集袋中。一旦第二光學檢測器檢測到細胞收集管線有空氣，則自動結束該階段。此系統可產生約15-20x10⁹ 個細胞，每容器容納5升。

G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統可支持在容器中轉導和擴增並用泵收穫。解凍、靜置和激活步驟可在VueLife^TM 袋中進行。GatheRex^TM 封閉系統可與其他技術（例如Sepax^TM 細胞分離系統）配合使用，以進行培養物洗滌和體積減少步驟。無菌焊接機(TerumoBCT^TM )可用於連接用於溶液轉移的無菌袋和用於管道密封的熱封機。

圖28顯示，第0天，Sepax^TM 細胞分離系統分離的冷凍PBMC可進行解凍、洗滌、靜置（例如，過夜(O/N)）；第1天，培養袋可用抗CD3抗體和抗CD28抗體包覆，可將靜置的PBMC轉移至包覆培養袋進行激活；第2天，可洗滌細胞並透過Sepax^TM 細胞分離系統將培養基減少為適於病毒轉導（例如，用表達TCR的慢病毒載體轉導）的合適體積。細胞擴增和進料可在G-Rex^TM 封閉系統裝置中進行。然後，可用GatheRex^TM 泵收穫、用Sepax^TM 細胞分離系統洗滌擴增的轉導T細胞。

表5顯示透過開放系統（例如，G-Rex^TM ）獲得的T細胞（如表4所示，即，過程220 和240 ）和透過封閉系統（例如，CliniMACS Prodigy^TM 、WAVE(XURI^TM )生物反應器與BioSafe Sepax^TM II聯合使用、以及G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統與BioSafeSepax^TM II聯合使用）獲得的T細胞之間的比較。 表5

這些結果顯示，本揭示的T細胞製造過程可易於在封閉系統中實施，使產生的T細胞與開放系統產生的T細胞具有相當的特徵，同時減輕外部處理風險和污染，促進產品的穩健性和品質，並提高產品安全性，從而減少下游加工、最終產品分析和測試的挑戰。

為了進一步比較在封閉系統中製造與在開放系統中製造工程化T細胞的功能特徵，根據本揭示的過程對獲自供體17的PBMC進行處理，以產生擴增的轉導T細胞。然後在存在或不存在TCR特異性肽/MHC複合體（靶標）的情況下測量表達TCR的擴增轉導T細胞的IFN-γ釋放。

圖29顯示，透過兩次運行（運行#1和運行#2）所測得的封閉系統中製造的工程化T細胞，在存在靶標的情況下，比開放系統中製造（例如，過程220 ）的細胞釋放顯著更多的IFN-γ。這些結果表明，封閉系統中製造的工程化T細胞可能比開放系統中製造的細胞具有更大的細胞毒性活性。

實施例 6

約 5-6 天內 GMP 製造 TCR 工程化 T 細胞

使用自體工程化T細胞方法的過繼性細胞療法利用安全有效靶標及其同源TCR的轉化開發。這些TCR經基因工程改造為患者自身（自體）的T細胞，以用於實體瘤的免疫治療。

圖30顯示了三種T細胞產物（T細胞產物#1、T細胞產物#2和T細胞產物#3）的製造概況，各產物表達對抗其自身各自HLA-A*02:01限制性腫瘤靶向抗原的轉基因TCR。T細胞產物#1和T細胞產物#2使用開放系統從解凍冷凍的PBMC、靜置解凍的PBMC、激活靜置的PBMC（步驟2）、轉導激活的T細胞（步驟3）、到「收穫和冷凍保存藥物產品細胞」（步驟6）分別在約8-11天和約7-10天內製造，用於IND驅動的第1期首次應用於人體試驗。

T細胞產物#3可透過將擴增期從約5-8天（T細胞產物#1和#2）縮短至約3-4天來製造。此外，T細胞產物#3可透過在第0天激活新鮮PBMC（即，PBMC未冷凍保存然後解凍）來製造。此不同於T細胞產物#1的製造（在第0天解凍冷凍保存的PBMC，然後在第1天激活解凍的PBMC）和T細胞產物#2的製造（在第0天解凍冷凍保存的PBMC並激活解凍的PBMC）。

相對於使用開放系統製造的T細胞產物#1和#2，T細胞產物#3可使用完全封閉系統或半封閉系統來製造，其中一些步驟可透過使用開放系統進行，例如從T細胞激活到為了轉導而減少體積和/或從收穫到洗滌、濃縮和冷凍保存。

圖31顯示了從白細胞分離術收集到輸注就緒的TCRT細胞產物#1的周轉時間可能需要約30天，例如，從樣品收集到收穫約14天，從品質控制(QC)到產品放行約16天；製造TCRT細胞產物#2的周轉時間可能需要約26天，例如，從樣品收集到收穫約10天，從QC到產品放行約16天。

但是，需要快速的周轉。圖30顯示，T細胞產物#3使用較短的製造過程製造，例如從「可選解凍、靜置和激活」（步驟2）到「收穫和冷凍保存藥物產品細胞」（步驟6）5-6天，並使用半封閉系統。圖31顯示，TCRT細胞產物#3的製造可能需要約23天，例如從樣品收集到收穫約7天，從QC到產品放行約16天。對於商業製造，例如，TCRT細胞產物（如，T細胞產物#1、T細胞產物#2和T細胞產物#3）可能需要約13天製造，例如，從樣品收集到收穫約6天，從QC到產品放行約7天。

圖32顯示了使用新鮮PBMC的T細胞製造過程320 ，所述新鮮PBMC不是透過解凍冷凍保存的PBMC獲得，因此，可最大限度地減少因冷凍、解凍和/或靜置PBMC導致的細胞損失，並在製造過程開始時使細胞數最大化。例如，T細胞製造過程320 可包括第0天，分離新鮮PBMC(321 )，使用在袋（例如，Saint-GobainVueLifeAC袋，用抗CD3和抗CD28抗體包覆）中的例如抗CD3和抗CD28抗體（可溶性或表面結合性，如：磁珠或生物可降解珠）激活新鮮淋巴細胞(322 )；第1天，用CAR或TCR轉導(323 )，使用例如編碼CAR或TCR的慢病毒或逆轉錄病毒構建體或非病毒方法（例如，脂質體）；以及在存在細胞因子、血清（ABS或FBS）和/或冷凍保存培養基的情況下，第2天，擴增淋巴細胞，第5/6天收穫和冷凍保存(324 )。

用更短的擴增改進產品特徵

T細胞免疫的品質、有效性、壽命和位置可源自幼稚T細胞(T_n )多樣化成為在保護性免疫中具有特定作用的各種表型不同的亞群。這些包括記憶幹(T_scm )細胞、中樞記憶(T_cm )細胞、效應子記憶(T_em )細胞和高度分化效應子(T_eff )T細胞。抗原特異性T_n 產生長壽命的T_scm 和T_cm ，其可自我更新並提供壽命較短的T_em 和T_eff 細胞增殖群。因此，選擇分化程度較低的T_n 、T_scm 或T_cm 亞群用於基因修飾可提供具有更高治療功效的細胞。

為了評價在不同製造時間收穫的T細胞產物的分化狀態，在製造第4天（擴增3天）、第7天（擴增6天）和第10天（擴增9天）收穫從3個供體（供體1、供體2和供體3）獲得的CD8+T細胞，然後進行T細胞記憶表型分析。

圖33顯示，表現為較低分化表型（例如，T_n/scm -CD45RA+CCR7+和T_cm -CD45RO+CCR7+）的CD8+T細胞數量以擴增時間依賴性方式降低，即，第4天＞第7天＞第10天。相反，表現為較高分化表型（例如，T_em -CD45RO+CCR7-和T_eff- CD45RA+CCR7-）的CD8+T細胞數量以擴增時間依賴性方式增加，即，第4天＜第7天＜第10天，提示第4天的擴增細胞比第7天和第10天的擴增細胞具有更多的較低分化表型。這些結果表明，T細胞擴增時間越短，T細胞表現較低分化記憶表型就越多，從而具有更高的治療功效。

在原代CD8+T細胞反應期間可能需要CD27和CD28共刺激。這種共刺激可為幼稚CD8+T細胞提供增殖和存活提示。為了評價在不同製造時間收穫的T細胞產物的CD27和CD28共刺激可能性，在製造第4天、第7天和第10天收穫從3個供體（供體1、供體2和供體3）獲得的CD8+T細胞，然後進行CD27和CD28表達分析。

圖34顯示，表現CD27+CD28+共刺激表型的CD8+T細胞數量以擴增時間依賴性方式降低，即第4天＞第7天＞第10天，提示第4天擴增細胞的CD27和CD28共刺激優於第7天和第10天擴增細胞的CD27和CD28共刺激。這些結果表明，一般情況下，T細胞擴增時間越短，T細胞表達CD27和CD28就越多。

為了評價在不同製造時間收穫的T細胞產物的複製可能性，在製造第4、7和10天收穫T細胞，並用細胞因子敏感性測定法監測應對相關細胞因子（例如，IL-7、IL-15或IL-2）的生長。

圖35顯示，以IL-7、IL-15或IL-2誘導約21天的T細胞生長以擴增時間依賴性方式降低，即第4天＞第7天＞第10天，提示第4天擴增細胞的複製可能性優於第7天和第10天擴增細胞的複製可能性。這些結果表明，T細胞擴增時間越短，T細胞對細胞因子的增殖反應就越多。

為了評價在不同製造時間收穫的T細胞產物的抗腫瘤活性，在製造第5天、第7天和第9天收穫從4個供體（供體1、供體2、供體3和供體4）獲得的T細胞產物，然後進行應對暴露於靶陽性細胞系的干擾素-γ(IFN-γ)釋放測定。

圖36顯示，IFN-γ分泌以擴增時間依賴性方式降低，即第5天＞第7天＞第9天，提示一般情況下第5天擴增細胞的抗腫瘤活性優於第7天和第9天擴增細胞的抗腫瘤活性。這些結果表明，一般情況下，T細胞擴增時間越短，T細胞分泌IFN-γ就越多。

為了進一步評價在不同製造時間收穫的T細胞產物的細胞毒性活性，測定基於對用遞減濃度同源肽脈衝的T2細胞的IFNγ反應之EC₅₀ 。

圖37顯示，EC₅₀ 以擴增時間依賴性方式增加，即第5天＞第7天＞第9天，提示第5天擴增細胞的肽特異性細胞毒性活性優於第7天和第9天擴增細胞的肽特異性細胞毒活性。

T 細胞產物 #3 的 GMP 製造

用最終T細胞產物#3過程製造的產物的特徵

圖38顯示了擴增量化指標。在兩次技術轉移(TT)製造運行和兩次過程試產(PQ)製造運行(n=4)中，短期（例如，約6天）擴增後收穫平均1.3x10¹⁰ 個細胞，具有＞90%的存活性。

圖39顯示了使用TCR特異性HLA-dextramer透過流式細胞術檢測的T細胞產物#3TCR的表面表達。顯示的代表性FACS圖和合併資料（平均值±SD）基於使用來自健康供體的白細胞分離術產物進行的技術轉移(TT)和過程試產(PQ)製造運行(n=4)。

圖40顯示了最終T細胞產物#3的T細胞記憶表型，其中在表現出用於製造的PBMC中的T細胞群為高度可變記憶表型的供體中(n=4)（分別為T_n/scm -17.9%、19.2%、11.2%、35.0%T_cm -23.4%、15.7%、0.9%、2.4%T_em -34.8%、27.0%、25.9%、43%T_eff -23.8%、38.2%、62.0%、16.1%），透過技術轉移(TT1,TT2)和過程試產(PQ1,PQ2)製造運行所產生的T細胞保持著較低分化的表型。

圖41顯示了應對暴露於靶陽性(LVR11KEA)和陰性(NT)細胞系的IFN-γ釋放。透過技術轉移(TT)和過程試產(PQ)製造運行產生的T細胞顯示對靶陽性細胞的特異性細胞毒性活性（例如，IFN-γ釋放）。陰性對照細胞中未檢測到IFN-γ釋放。

圖42顯示，EC₅₀ 的測定係基於對遞減濃度同源肽脈衝靶細胞的IFNγ反應。結果顯示，透過過程試產(PQ1)製造運行產生的T細胞表現的抗腫瘤活性(EC₅₀ =0.3149)與所述測定中陽性對照產生的抗腫瘤活性(EC₅₀ =0.7037)相當。

圖43的代表圖顯示了T細胞產物#3在Incucyte®殺滅測定中的細胞毒性可能性。資料表示為存在T細胞產物#3的情況下，在與遞減濃度相關肽脈衝處理的靶陰性細胞系共培養的72小時期間的腫瘤生長倍數。結果顯示，透過過程試產(PQ1)製造運行產生的T細胞對靶細胞有肽劑量依賴性殺滅。

總之，較短的離體擴增和總體「周轉時間」不僅可對細胞產物的品質產生重大影響，而且還可對細胞免疫療法的臨床適用性產生重大影響。在TCR工程化T細胞的GMP製造期間縮短擴增期的過程開發工作已經完成，其開發了用於T細胞產物#3的為期5-6天的強大半封閉T細胞製造過程。在GMP環境潔淨室中T細胞產物#3製造的技術轉移(TT)和過程試產(PQ)運行證實了縮短擴增期製造過程的可重複性和可行性。對於GMP製造的T細胞產物，確認了TCR工程化T細胞的所有放行、表型和功能測試。

實施例7

從癌症患者產生的 T 細胞產物的製造和功能

如上所述，從健康供體中產生的T細胞產物#3顯示了T細胞記憶表型和細胞毒性可能性。如下所示，與健康供體產生的T細胞產物#3相比，在癌症患者產生的T細胞產物#3中觀察到了相似的特徵。

患者和供體特徵

W=白人；AI=美洲印第安人；H=西班牙裔

使用從癌症患者和健康供體中獲得的PBMC以小規模製造T細胞產物#3。簡言之，第0天，將從4名癌症患者和4名健康供體的白細胞分離術產物中分離的冷凍保存PBMC解凍並在存在IL-7的情況下靜置約4-6小時，然後在NTC24孔板中激活並孵育大約16-24小時。第1天，用表達重組TCR（例如，R11KEATCR）的病毒載體以5µl/10⁶ 個細胞轉導細胞。未轉導(NT)細胞作為對照。轉導和未轉導細胞以至少1.0x10⁶ 個細胞/ml（例如，2.0x10⁶ 個細胞/ml）接種。第2天，將轉導和未轉導細胞在含有IL-7和IL-15的TexMACS完全培養基中擴增。第6天（即，擴增4天），收穫擴增的細胞，然後進行流式細胞術分析和功能測定，以確定回收率、存活性、表型、整合DNA拷貝數和功能。

圖44顯示，在解凍後、靜置後和激活後，從癌症患者(Pt)和健康供體(HD)中獲得的T細胞回收率相當。

圖45顯示，第6天（即，擴增4天），除PT1和PT4外（其中轉導了所有細胞），各患者轉導和未轉導細胞中T細胞產物#3的總存活細胞和存活性%均相當。

圖46顯示，第6天（即，擴增4天），除PT1和PT4外（其中轉導了所有細胞），各患者轉導和未轉導細胞中T細胞產物#3的倍數擴增均相當。

表型分析

圖47顯示，在從癌症患者(PT1-PT4)和健康供體(D1-D4)中獲得的PBMC中，CD3+CD8+細胞的擴增（如箭頭所示）優先於CD3+CD4+細胞。

圖48顯示，在從患者(PT1-PT4)和健康供體(D1-D4)中獲得的T細胞產物#3和未轉導細胞(NT)中，CD3+CD8+細胞的總平均值與CD3+CD4+細胞相當。

圖49顯示了T細胞產物#3的流式細胞術分析的實例。結果提示，43.8%的T細胞產物#3含有CD3+CD8+細胞，其中64.7%的細胞表達R11KEATCR（如肽/MHCdextramer(Dex)染色所示），35.3%的細胞不表達R11KEATCR。

圖50顯示，在從癌症患者(PT1-PT4)和健康供體(D1-D4)產生的CD8+T細胞產物#3中，R11KEATCR表達相當。

圖51也顯示，R11KEATCR平均表達量在從癌症患者(PT1-PT4)（如，64.3%）和健康供體(D1-D4)（如，68.2%）產生的CD8+T細胞產物#3中相當。

圖52顯示了確定T細胞產物#3的T細胞記憶(T_memory )表型的門控方案。例如，透過門控CD45RA和CCR7，可識別幼稚「年輕」T細胞(CD45RA+CCR7+)、終末分化的「老」T細胞(TemRA)(CD45RA+CCR7-)、效應子記憶T細胞(Tem)(CD45RA-CCR7-)和中央記憶T細胞(Tcm)(CD45RA-CCR7+)。

圖53顯示，在從患者(PT1-PT4)和健康供體(D1-D4)產生的T細胞產物#3的理想幼稚和Tcm隔室都有顯著的平均值增加。這些結果表明，轉導的細胞可能擁有更強的輸注後持久能力並在體內產生更持續的反應。

功能測定

為了確定T細胞產物#3的功能性，可用特異性結合R11KEATCR的相關肽（例如，1μg/ml）或不與R11KEATCR結合的不相關肽（例如，1μg/ml，作為對照）刺激細胞。用激活所有淋巴細胞的PMA和離子黴素刺激作為陽性對照，不刺激作為陰性對照。刺激2小時後，加入蛋白質轉運抑制劑。刺激後6小時，透過細胞內染色(ICS)評估CD3+CD8+細胞中的細胞因子和信號分子（例如，CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2）和巨噬細胞炎性蛋白-1-β(MIP-1β)的表達。

圖54顯示T細胞產物#3的實例，在用相關肽(d)刺激後，與用不相關肽(c)刺激相比，T細胞產物#3中CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2和MIP-1β的表達水準增加。用激活所有淋巴細胞的PMA和離子黴素刺激作為陽性對照(b)，不刺激作為陰性對照(a)。

圖55顯示了T細胞產物#3的多功能性。數字0、1、2、3、4和5分別表示T細胞產物#3表達CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2和MIP-1β中無、任何1者、任何2者、任何3者、任何4者以及全部5者的部分。例如，在用相關肽刺激後，從R11KEATCR(R11)轉導的健康供體(D3)中獲得的T細胞產物#3超過50%表達來自CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2和MIP-1β中的至少2種細胞因子，而相比之下，用不相關肽刺激後，0%的細胞表達至少2種細胞因子。相反，在用相關肽和不相關肽刺激之間，未轉導(NT)細胞中細胞因子表達無顯著差異。這些結果顯示，由健康供體產生並用R11KEATCR轉導的T細胞產物#3具有多功能性。陽性對照（即，用PMA/離子黴素刺激的T細胞）在有或沒有TCR轉導的情況下均表現出多功能性。陰性對照（即，沒有刺激的T細胞）在有或沒有TCR轉導的情況下功能性均較差。

圖56顯示，在用相關肽刺激後，健康供體（例如，D3和D2）和癌症患者（例如，PT1、PT2和PT3）產生的R11KEATCR+(CD8+Vb8+)T細胞產物#3均具有多功能性。根據這些功能測定確定，D1、D4和PT4產生的T細胞可能不會出現多功能性。但是，如下所示，D1、D4和PT4產生的T細胞仍然具有針對靶細胞的細胞毒性活性。

圖57顯示了當癌症患者（例如，PT1-PT4）產生的T細胞產物#3與高靶細胞系（約有1,000個拷貝/細胞的相關肽提呈於細胞表面）接觸時，這些細胞的IFN-γ釋放呈現E:T比依賴性方式，例如，10:1＞3.3:1＞1:1。請注意，PT4產生的T細胞（在圖56中似乎不具有多功能性）也顯示了E:T比依賴性方式的IFN-γ釋放。

圖58顯示了當健康供體（例如，D1-D4）產生的T細胞產物#3與高靶細胞系（約有1,000個拷貝/細胞的相關肽提呈於細胞表面）接觸時，這些細胞的IFN-γ釋放呈現E:T比依賴性方式，例如，10:1＞3.3:1＞1:1。請注意，D1和D4產生的T細胞（在圖56中似乎不具有多功能性）也顯示了E:T比依賴性方式的IFN-γ釋放。

圖59顯示了當健康供體(D1-D4)產生的T細胞產物#3與細胞表面上提呈不同水準相關肽的細胞（例如，細胞表面上提呈約1,000拷貝/細胞的相關肽的高靶細胞系，細胞表面上提呈約50拷貝/細胞的相關肽的低靶細胞系，以及細胞表面上不提呈相關肽的無靶細胞系）接觸時，這些細胞的平均IFN-γ釋放呈現肽提呈水準依賴性方式，即，高靶＞低靶＞無靶。

類似地，圖60顯示了當癌症患者(PT1-PT4)產生的T細胞產物#3與高靶細胞系、低靶細胞系以及無靶細胞系接觸時，這些細胞的平均IFN-γ釋放呈現肽提呈水準依賴性方式，即，高靶＞低靶＞無靶。

圖61顯示，與細胞表面不提呈相關肽的靶陰性細胞系接觸時，健康供體（例如，D3）產生的T細胞產物#3缺乏殺滅活性。簡言之，用R11KEATCR(R11)轉導或不轉導(NT)的D3產生的T細胞與靶陰性細胞系以10:1、3.3:1和1:1的E:T比進行共培養。透過使用IncuCyteKillingAssay測定細胞殺滅活性。這些結果顯示，用(R11)和不用(NT)TCR轉導的T細胞之間對靶陰性細胞系的細胞殺滅無顯著差異。

相反，圖62顯示，與細胞表面提呈相關肽的靶陽性細胞系接觸時，健康供體（例如，D3）產生的T細胞產物#3具有TCR特異性殺滅活性。也就是說，表達R11KEATCR的T細胞以E:T比依賴性方式殺滅靶陽性細胞，例如，10:1＞3.3:1＞1:1。相反，在不轉導(NT)的T細胞之間在不同E:T比下細胞殺滅無顯著差異。

圖63A-63C顯示，與細胞表面提呈相關肽的靶陽性細胞系接觸時，健康供體（例如，D3和D4）和癌症患者（例如，PT1和PT2）產生的用R11KEA TCR(R11)轉導的T細胞產物#3的TCR特異性殺滅活性。D3、D4、PT1和PT2產生的表達R11KEA TCR(R11)的T細胞以E:T比依賴性方式殺滅靶陽性細胞，例如：10:1（圖63A）＞3.3:1（圖63B）＞1:1（圖63C）。相反，在不同的E:T比下無R11KEA TCR轉導(NT)的T細胞之間細胞殺滅無顯著差異。

總之，這些結果顯示，T細胞產物#3過程可產生具有靶特異性的表達TCR轉基因的T細胞產物。此過程同時適用於從癌症患者以及從健康供體中獲得的起始材料。T細胞產物#3過程比製備T細胞產物#1和#2的時間短，但仍可產生含有大量幼稚和Tcm細胞的產物。T細胞產物#3可以是多功能的，並應對靶陽性腫瘤細胞系而分泌IFN-γ。T細胞產物#3還可在細胞系殺滅測定中表現出良好的效應子功能。

本揭示的優勢可包括自體T細胞製造過程，其可將臨床製造工程化TCR T細胞產物的靜置時間縮短至例如4-6小時，將激活時間縮短至例如16-20小時，將轉導時間縮短至例如24小時，將擴增期縮短至例如5-7天。影響各步驟的關鍵參數可系統評估，並且可對其進行優化以產生超過100億個具有高度識別和有效殺滅靶表達腫瘤細胞能力的年輕腫瘤反應性T細胞。除了提高T細胞產物的品質外，這些優化還可使製造成本降低30%。此外，本揭示的自體T細胞製造過程的規模擴大可使用激活T細胞的燒瓶結合和/或袋結合的抗CD3和抗CD28抗體進行，以產生相當水準的激活、轉導性和擴增，並且這些規模擴大過程可能比使用板結合抗體的過程更快捷。

本專利說明書中引用的所有參考文獻均透過引用併入本文，如同每篇參考文獻被具體和單獨地指出透過引用併入。任何參考文獻的引用均為其在申請日之前的公開內容，不應解釋為認可本揭示內容無權憑藉之前的發明而先於此類參考文獻。

應當理解，上述每個元素或者兩個或更多個元素一起也可以在與上述類型不同的其他類型方法中找到有用的應用。在無進一步分析的情況下，前述內容同樣充分地揭示本揭示的要點，其他人可以透過應用當前知識，容易地將其適用於各種應用場合而不會遺漏從現有技術觀點來看公平構成所附申請專利範圍中闡述的本揭示的通用或具體方面基本特點的特徵。前述實施方案僅作為示例呈現；本揭示內容的範圍僅透過以下申請專利範圍進行限制。

1‧‧‧供體 2‧‧‧供體 3‧‧‧供體 4‧‧‧供體 6‧‧‧供體 7‧‧‧供體 8‧‧‧供體 12‧‧‧供體 13‧‧‧供體 14‧‧‧供體 16‧‧‧供體 17‧‧‧供體 18‧‧‧供體 21‧‧‧供體 220‧‧‧步驟 221‧‧‧步驟 222‧‧‧步驟 223‧‧‧步驟 224‧‧‧步驟 225‧‧‧步驟 226‧‧‧步驟 227‧‧‧步驟 240‧‧‧T細胞製造過程 241‧‧‧步驟 242‧‧‧步驟 243‧‧‧步驟 244‧‧‧步驟 245‧‧‧步驟 265‧‧‧患者 312‧‧‧患者 319‧‧‧患者 320‧‧‧T細胞製造過程 321‧‧‧步驟 322‧‧‧步驟 323‧‧‧步驟 324‧‧‧步驟 351‧‧‧患者 453‧‧‧患者 472‧‧‧患者 864‧‧‧患者 956‧‧‧患者

為了進一步理解本揭示的本質、目的和優點，應參考以下詳細描述並結合以下附圖，其中類似的元件符號表示類似的元件。

圖1A和1B顯示了透過延長從不同供體獲得的T細胞的離體培養丟失T_naive/scm 和T_cm 表型。

圖2顯示了與第10天生長的不同供體細胞相比，第15天生長的細胞中IFN-γ分泌減少。

圖3顯示了測試靜置條件對T細胞激活和擴增影響的實驗設計。

圖4顯示了不同實驗組中CD25、CD69和hLDL-R的表達水準。

圖5A和5B分別顯示了第7天擴增和第10天擴增時不同實驗組中的倍數擴增和細胞存活性。

圖6顯示了用病毒載體轉導的激活T細胞在不同實驗組中第9天的倍數擴增和存活性。

圖7顯示了用病毒載體轉導的激活T細胞在不同實驗組中第9天的倍數擴增和存活性。

圖8顯示了由不同靜置時間和不同生產規模產生的T細胞中轉基因表達。

圖9顯示了第10天由不同靜置時間和不同生產規模產生的倍數擴增。

圖10顯示了測試抗CD3和抗CD28抗體濃度對T細胞激活影響的實驗設計。

圖11顯示了不同濃度抗CD3和抗CD28抗體激活的T細胞中CD25、CD69和hLDL-R的表達。

圖12顯示了第10天擴增時，在存在不同濃度的IL-15情況下，由不同濃度抗CD3和抗CD28抗體激活的T細胞的細胞計數。

圖13顯示了在存在不同濃度的IL-15情況下，由不同濃度抗CD3和抗CD28抗體激活的重組TCR-轉導T細胞的四聚體染色。

圖14A顯示了不同激活持續時間產生的CD3⁺ CD8⁺ 四聚體⁺ T細胞的百分比。

圖14B顯示了不同激活持續時間產生的轉基因表達。

圖15顯示了由板結合或燒瓶結合的抗CD3和抗CD28抗體激活的T細胞中CD25、CD69和LDL-R的表達。

圖16A顯示了燒瓶結合(FB)和板結合(PB)激活T細胞中的轉導水準。

圖16B顯示了燒瓶結合(FB)和板結合(PB)激活T細胞中的倍數擴增。

圖17顯示了由燒瓶結合(FB)激活LV-R73（表達T細胞受體的慢病毒載體）轉導的T細胞和板結合(PB)激活轉導的T細胞應對不同供體中表達腫瘤相關抗原(TAA)的腫瘤細胞而引發的抗原特異性IFN-γ水準。

圖18顯示了測試使用抗CD3和抗CD28抗體包覆的袋和板對T細胞激活影響的實驗設計。

圖19顯示了在袋結合或燒瓶結合的抗CD3和抗CD28抗體中激活的T細胞之CD25、CD69和LDL-R的表達。

圖20顯示了第6天擴增時，由不同濃度的袋結合抗體激活的T細胞和在FB條件下激活的T細胞產生的細胞擴增。

圖21顯示了第10天擴增時，由不同濃度的袋結合抗體激活的T細胞和在FB條件下激活的T細胞產生的細胞擴增。

圖22顯示了根據本揭示一實施方案所述的T細胞製造過程。

圖23A顯示了根據本揭示一實施方案所製造T細胞的倍數擴增。

圖23B顯示了根據本揭示一實施方案所製造T細胞的轉導TCR表達。

圖23C顯示了根據本揭示一實施方案所製造T細胞的表型。

圖23D顯示了根據本揭示一實施方案所製造T細胞的腫瘤細胞生長抑制活性。

圖23E顯示了根據本揭示另一實施方案所製造T細胞的腫瘤細胞生長抑制活性。

圖23F顯示了根據本揭示另一實施方案所製造T細胞的腫瘤細胞生長抑制活性。

圖23G顯示了根據本揭示另一實施方案所製造T細胞的腫瘤細胞殺滅活性。

圖23H顯示了根據本揭示另一實施方案所製造T細胞的腫瘤細胞殺滅活性。

圖24顯示了過夜靜置（約16小時）的T細胞製造過程。

圖25A顯示了過夜靜置（約16小時）製造的T細胞倍數擴增。

圖25B顯示了過夜靜置（約16小時）製造的T細胞的轉導TCR表達。

圖25C顯示了過夜靜置（約16小時）製造的T細胞的表型。

圖25D顯示了過夜靜置（約16小時）製造的T細胞的腫瘤細胞生長抑制活性。

圖25E和25F顯示了過夜靜置（約16小時）製造的T細胞的細胞毒性活性。

圖26顯示了開放和封閉系統中的離體操作方案。

圖27顯示了根據本揭示的一實施方案所述封閉系統中的離體操作方案。

圖28顯示了根據本揭示的另一實施方案所述封閉系統中的離體操作方案。

圖29顯示了開放和封閉系統中製造的T細胞的IFN-γ釋放。

圖30顯示了根據本揭示一些實施方案所述的T細胞製造示意圖。

圖31顯示了根據本揭示的一實施方案所述從白細胞分離術收集到輸注就緒的代表性周轉時間。LP^# ：白細胞分離術收集、處理和冷凍（可選）。COA：簽發分析報告所需的額外時間。

圖32顯示了根據本揭示一實施方案所述的T細胞製造過程。

圖33顯示了根據本揭示一實施方案所述的製造過程生產的T細胞的T細胞記憶表型。

圖34顯示了根據本揭示一實施方案所述的製造過程生產的T細胞的CD27和CD28共刺激表型。

圖35顯示了根據本揭示一實施方案，IL-7、IL-15或IL-2誘導的T細胞生長以擴增時間依賴性方式降低。

圖36顯示了根據本揭示一實施方案，IFN-γ分泌以擴增時間依賴性方式降低。

圖37顯示了根據本揭示一實施方案，EC₅₀ 以擴增時間依賴性方式增加。

圖38顯示了根據本揭示一實施方案所述的擴增量化指標。

圖39顯示了根據本揭示一實施方案所述的TCR的表面表達。

圖40顯示了根據本揭示一實施方案所述最終產物的T細胞記憶表型。

圖41顯示了根據本揭示一實施方案所述的應對暴露於靶細胞的IFN-γ釋放。

圖42顯示了根據本揭示一實施方案所述的EC₅₀ 測定。

圖43顯示了根據本揭示一實施方案所述之T細胞的細胞毒性可能性。

圖44顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間細胞回收的比較。

圖45顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間細胞存活性的比較。

圖46顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間倍數擴增的比較。

圖47顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間細胞表型的比較。

圖48顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間細胞表型的比較。

圖49顯示了根據本揭示一實施方案所述T細胞產物的TCR表達。

圖50顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間TCR表達的比較。

圖51顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間TCR表達的比較。

圖52顯示了根據本揭示一實施方案所述的門控方案和T_memory 亞群。

圖53顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間細胞表型的比較。

圖54顯示了根據本揭示一實施方案所述T細胞產物中的細胞因子表達。

圖55顯示了根據本揭示一實施方案所述獲得自健康供體的T細胞產物中的細胞因子表達。

圖56顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間細胞因子表達的比較。

圖57顯示了根據本揭示一實施方案所述獲得自癌症患者的T細胞產物中的IFN-γ釋放。

圖58顯示了根據本揭示一實施方案所述獲得自健康供體的T細胞產物中的IFN-γ釋放。

圖59顯示了根據本揭示一實施方案所述獲得自健康供體的T細胞產物中的IFN-γ釋放。

圖60顯示了根據本揭示一實施方案所述獲得自癌症患者的T細胞產物中的IFN-γ釋放。

圖61顯示了根據本揭示一實施方案所述獲得自健康供體的T細胞產物的細胞殺滅活性。

圖62顯示了根據本揭示一實施方案所述獲得自健康供體的T細胞產物的細胞殺滅活性。

圖63A顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間細胞殺滅的比較。

圖63B顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間細胞殺滅的比較。

圖63C顯示了根據本揭示一實施方案所述從健康供體和癌症患者所獲得T細胞產物之間細胞殺滅的比較。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無

國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

220‧‧‧步驟

221‧‧‧步驟

222‧‧‧步驟

223‧‧‧步驟

224‧‧‧步驟

225‧‧‧步驟

226‧‧‧步驟

227‧‧‧步驟

Claims (88)

1. 一種轉導一T細胞的方法，其包括以下步驟： 解凍冷凍的外周血單核細胞(PBMC)， 靜置解凍的PBMC， 用一抗CD3抗體和一抗CD28抗體激活靜置PBMC中的該T細胞， 用一病毒載體轉導該激活的T細胞， 擴增該轉導的T細胞，以及 獲得該擴增的T細胞。
2. 如請求項1中所述的方法，其中，該激活步驟包括用一固相支持物上的該抗CD3抗體和該抗CD28抗體固定該靜置PBMC中的該T細胞。
3. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中，該靜置步驟在約0.5小時至約48小時、約0.5小時至約36小時、約0.5小時至約24小時、約0.5小時至約18小時、約0.5小時至約12小時、約0.5小時至約6小時、約1小時至約6小時、約2小時至約5小時、約3小時至約5小時、或約1小時至約24小時、約2至約24小時、約12至約48小時、約0.5小時至約120小時、約0.5小時至約108小時、約0.5小時至約96小時、約0.5小時至約84小時、約0.5小時至約72小時或約0.5小時至約60小時的時間段內進行。
4. 如請求項1至3中任一項所述的方法，其中，該抗CD3抗體和該抗CD28抗體各自的濃度不超過約0.1µg/ml、不超過約0.2µg/ml、不超過約0.3µg/ml、不超過約0.4µg/ml、不超過約0.5µg/ml、不超過約0.6µg/ml、不超過約0.7µg/ml、不超過約0.8µg/ml、不超過約0.9µg/ml、不超過約1.0µg/ml、不超過約2.0µg/ml、不超過約4.0µg/ml、不超過約6.0µg/ml、不超過約8.0µg/ml或不超過約10.0µg/ml。
5. 如請求項1至3中任一項所述的方法，其中，該抗CD3抗體和該抗CD28抗體各自的濃度為約0.1µg/ml至約10.0µg/ml、約0.1µg/ml至約8.0µg/ml、約0.1µg/ml至約6.0µg/ml、約0.1µg/ml至約4.0µg/ml、約0.1µg/ml至約2.0µg/ml、約0.1µg/ml至約1.0µg/ml、約0.1µg/ml至約0.8µg/ml、約0.1µg/ml至約0.6µg/ml、約0.1µg/ml至約0.5µg/ml、約0.1µg/ml至約0.25µg/ml、約0.2µg/ml至約0.5µg/ml、約0.2µg/ml至約0.3µg/ml、約0.3µg/ml至約0.5µg/ml、約0.3µg/ml至約0.4µg/ml或約0.4µg/ml至約0.5µg/ml。
6. 如請求項1至5中任一項所述的方法，其中，激活在不超過約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約22小時、約24小時、約26小時、約28小時、約30小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時、約108小時或約120小時的時間段內進行。
7. 如請求項1至5中任一項所述的方法，其中，激活在約1小時至約120小時、約1小時至約108小時、約1小時至約96小時、約1小時至約84小時、約1小時至約72小時、約1小時至約60小時、約1小時至約48小時、約1小時至約36小時、約1小時至約24小時、約2小時至約24小時、約4小時至約24小時、約6小時至約24小時、約8小時至約24小時、約10小時至約24小時、約12小時至約24小時、約12小時至約72小時、約24小時至約72小時、約6小時至約48小時、約24小時至約48小時、約6小時至約72小時或約1小時至約12小時的時間段內進行。
8. 如請求項1至7中任一項所述的方法，其中，該固相為一珠、一板、一燒瓶或一袋的一表面。
9. 如請求項8所述的方法，其中，該板為6孔、12孔或24孔板。
10. 如請求項8所述的方法，其中，該燒瓶的一接種表面積為約25cm² 至約75cm² 、約25cm² 至約100cm² 、約25cm² 至約150cm² 或約50cm² 至約1720cm² 。
11. 如請求項8所述的方法，其中，該袋的一容積為約5ml至約100升、約100ml至約100升、約150ml至約100升、約200ml至約100升、約250ml至約100升、約500ml至約100升、約1升至約100升、約1升至約75升、約1升至約50升、約1升至約25升、約1升至約20升、約1升至約15升、約1升至約10升、約1升至約5升、約1升至約2.5升或約1升至約2升。
12. 如請求項1至11中任一項所述的方法，其中，該靜置在存在至少一種細胞因子的情況下進行。
13. 如請求項12所述的方法，其中，該至少一種細胞因子包括白細胞介素7(IL-7)和/或白細胞介素15(IL-15)。
14. 如請求項13所述的方法，其中IL-7的濃度為不超過約1ng/ml、不超過約2ng/ml、不超過約3ng/ml、不超過約4ng/ml、不超過約5ng/ml、不超過約6ng/ml、不超過約7ng/ml、不超過約8ng/ml、不超過約9ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約11ng/ml、不超過約12ng/ml、不超過約13ng/ml、不超過約14ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約16ng/ml、不超過約17ng/ml、不超過約18ng/ml、不超過約19ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml或不超過約100ng/ml。
15. 如請求項13所述的方法，其中IL-7的濃度為約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml、約1ng/ml至10ng/ml、約2ng/ml至10ng/ml、約4ng/ml至10ng/ml、約6ng/ml至10ng/ml或約5ng/ml至10ng/ml。
16. 如請求項13至15中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為不超過約5ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml、不超過約100ng/ml、不超過約110ng/ml、不超過約120ng/ml、不超過約130ng/ml、不超過約140ng/ml、不超過約150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml或500ng/ml。
17. 如請求項13至15中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為約5ng/ml至500ng/ml、約5ng/ml至400ng/ml、約5ng/ml至300ng/ml、約5ng/ml至200ng/ml、約5ng/ml至150ng/ml、約5ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至100ng/ml、約20ng/ml至100ng/ml、約30ng/ml至100ng/ml、約40ng/ml至100ng/ml、約50ng/ml至100ng/ml、約60ng/ml至100ng/ml、約70ng/ml至100ng/ml、約80ng/ml至100ng/ml、約90ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至50ng/ml、約20ng/ml至50ng/ml、約30ng/ml至50ng/ml或約40ng/ml至50ng/ml。
18. 如請求項1至16中任一項所述的方法，其中轉導在不超過約1小時、不超過約2小時、不超過約3小時、不超過約4小時、不超過約5小時、不超過約6小時、不超過約7小時、不超過約8小時、不超過約9小時、不超過約10小時、不超過約11小時、不超過約12小時、不超過約14小時、不超過約16小時、不超過約18小時、不超過約20小時、不超過約22小時、不超過約24小時、不超過約26小時、不超過約28小時、不超過約30小時、不超過約36小時、不超過約42小時、不超過約48小時、不超過約54小時、不超過約60小時、不超過約66小時、不超過約72小時、不超過約84小時、不超過約96小時、不超過約108小時或不超過約120小時的時間段內進行。
19. 如請求項1至16中任一項所述的方法，其中轉導在約1小時至120小時、約1小時至108小時、約1小時至96小時、約1小時至72小時、約1小時至48小時、約1小時至36小時、約1小時至24小時、約2小時至24小時、約4小時至24小時、約6小時至24小時、約8小時至24小時、約10小時至24小時、約12小時至24小時、約14小時至24小時、約16小時至24小時、約18小時至24小時、約20小時至24小時或約22小時至24小時的時間段內進行。
20. 如請求項1至19中任一項所述的方法，其中該病毒載體是表達一T細胞受體(TCR)的一逆轉錄病毒載體。
21. 如請求項1至20中任一項所述的方法，其中病毒載體是表達一TCR的一慢病毒載體。
22. 如請求項1至21中任一項所述的方法，其中，該轉導在存在至少一種細胞因子的情況下進行。
23. 如請求項22所述的方法，其中，該至少一種細胞因子包括白細胞介素7(IL-7)和/或白細胞介素15(IL-15)。
24. 如請求項23所述的方法，其中IL-7的濃度為不超過約1ng/ml、不超過約2ng/ml、不超過約3ng/ml、不超過約4ng/ml、不超過約5ng/ml、不超過約6ng/ml、不超過約7ng/ml、不超過約8ng/ml、不超過約9ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約11ng/ml、不超過約12ng/ml、不超過約13ng/ml、不超過約14ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約16ng/ml、不超過約17ng/ml、不超過約18ng/ml、不超過約19ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml或不超過約100ng/ml。
25. 如請求項23所述的方法，其中IL-7的濃度為約1ng/ml至100ng/ml、約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml、約1ng/ml至10ng/ml、約2ng/ml至10ng/ml、約4ng/ml至10ng/ml、約6ng/ml至10ng/ml、約8ng/ml至10ng/ml或約9ng/ml至10ng/ml。
26. 如請求項23至25中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為不超過約5ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml、不超過約100ng/ml、不超過約110ng/ml、不超過約120ng/ml、不超過約130ng/ml、不超過約140ng/ml、不超過約150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml或500ng/ml。
27. 如請求項23至25中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為約5ng/ml至500ng/ml、約5ng/ml至400ng/ml、約5ng/ml至300ng/ml、約5ng/ml至200ng/ml、約5ng/ml至150ng/ml、約5ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至100ng/ml、約20ng/ml至100ng/ml、約30ng/ml至100ng/ml、約40ng/ml至100ng/ml、約50ng/ml至100ng/ml、約60ng/ml至100ng/ml、約70ng/ml至100ng/ml、約80ng/ml至100ng/ml、約90ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至50ng/ml、約20ng/ml至50ng/ml、約30ng/ml至50ng/ml或約40ng/ml至50ng/ml。
28. 如請求項1至27中任一項所述的方法，其中，該擴增在存在至少一種細胞因子的情況下進行。
29. 如請求項28所述的方法，其中，該至少一種細胞因子包括白細胞介素7(IL-7)和/或白細胞介素15(IL-15)。
30. 如請求項29所述的方法，其中IL-7的濃度為不超過約1ng/ml、不超過約2ng/ml、不超過約3ng/ml、不超過約4ng/ml、不超過約5ng/ml、不超過約6ng/ml、不超過約7ng/ml、不超過約8ng/ml、不超過約9ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約11ng/ml、不超過約12ng/ml、不超過約13ng/ml、不超過約14ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約16ng/ml、不超過約17ng/ml、不超過約18ng/ml、不超過約19ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml或不超過約100ng/ml。
31. 如請求項29所述的方法，其中IL-7的濃度為約1ng/ml至100ng/ml、約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml或約1ng/ml至10ng/ml。
32. 如請求項29至31中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為不超過約5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml或500ng/ml。
33. 如請求項29至31中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為約5ng/ml至500ng/ml、約5ng/ml至400ng/ml、約5ng/ml至300ng/ml、約5ng/ml至200ng/ml、約5ng/ml至150ng/ml、約5ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至100ng/ml、約20ng/ml至100ng/ml、約30ng/ml至100ng/ml、約40ng/ml至100ng/ml、約50ng/ml至100ng/ml、約60ng/ml至100ng/ml、約70ng/ml至100ng/ml、約80ng/ml至100ng/ml、約90ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至50ng/ml、約20ng/ml至50ng/ml、約30ng/ml至50ng/ml或約40ng/ml至50ng/ml。
34. 如請求項1至33中任一項所述的方法，其中該擴增在不超過約1天、不超過約2天、不超過約3天、不超過約4天、不超過約5天、不超過約6天、不超過約7天、不超過約8天、不超過約9天、不超過約10天、不超過約15天、不超過約20天、不超過約25天或不超過約30天的時間段內進行。
35. 如請求項1至33中任一項所述的方法，其中該擴增在約1天至約30天、約1天至約25天、約1天至約20天、約1天至約15天、約1天至約10天、約2天至約10天、約3天至約10天、約4天至約10天、約5天至約10天、約6天至約10天、約7天至約10天、約8天至約10天或約9天至約10天的時間段內進行。
36. 如請求項1至35中任一項所述的方法，其中，該獲得的T細胞數量為至少約1x10⁹ 、可能至少約2x10⁹ 、可能至少約3x10⁹ 、可能至少約4x10⁹ 、可能至少約5x10⁹ 、可能至少約6x10⁹ 、可能至少約7x10⁹ 、可能至少約8x10⁹ 、可能至少約9x10⁹ 、可能至少約1x10¹⁰ 、可能至少約5x10¹⁰ 、可能至少約1x10¹¹ 、可能至少約5x10¹¹ 、可能至少約1x10¹² 、可能至少約5x10¹² 或可能至少約1x10¹³ 個細胞。
37. 如請求項1至35中任一項所述的方法，其中，該獲得的T細胞數量為約1x10⁹ 至約1x10¹³ 、約1x10⁹ 至約5x10¹² 、約1x10⁹ 至約1x10¹² 、約1x10⁹ 至約5x10¹¹ 、約1x10⁹ 至約1x10¹¹ 、約1x10⁹ 至約5x10¹⁰ 、約1x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約2x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約3x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約4x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約5x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約6x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約7x10⁹ 至約1x10¹⁰ 、約8x10⁹ 至約1x10¹⁰ 或約9x10⁹ 至約1x10¹⁰ 個細胞。
38. 如請求項1至37中任一項所述的方法，其中該獲得的T細胞為CD3⁺ CD8⁺ T細胞。
39. 一種治療一癌症患者的方法，包括向該患者給予有效量的按照請求項1至38中任一項所述方法產生該獲得的T細胞。
40. 如請求項39所述的方法，其中PBMC獲得自患者。
41. 一種基因轉導T細胞，其透過請求項1至38中任一項所述的方法產生。
42. 一種藥物組合物，其包含請求項41所述的該基因轉導T細胞和一種藥用載劑。
43. 一種製備一T細胞群的方法，其包括以下步驟： 解凍冷凍的外周血單核細胞(PBMC)， 靜置該解凍的PBMC， 用固定於一固相上的一抗CD3抗體和一抗CD28抗體激活該靜置PBMC中的該T細胞， 擴增該激活的T細胞，以及 獲得包含該擴增T細胞的該T細胞群。
44. 如請求項43所述的方法，其中，該靜置在不超過約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約22小時、約24小時、約26小時、約28小時、約30小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時、約108小時或約120小時的時間段內進行。
45. 如請求項43所述的方法，其中，該靜置在約1小時至約120小時、約1小時至約108小時、約1小時至約96小時、約1小時至約84小時、約1小時至約72小時、約1小時至約60小時、約1小時至約48小時、約1小時至約36小時、約1小時至約24小時、約2小時至約24小時、約4小時至約24小時、約6小時至約24小時、約8小時至約24小時、約10小時至約24小時、約12小時至約24小時、約12小時至約72小時、約24小時至約72小時、約6小時至約48小時、約24小時至約48小時、約6小時至約72小時或約1小時至約12小時的時間段內進行。
46. 如請求項43至45中任一項所述的方法，其中，該抗CD3抗體和該抗CD28抗體各自的濃度不超過約0.1µg/ml、不超過約0.2µg/ml、不超過約0.3µg/ml、不超過約0.4µg/ml、不超過約0.5µg/ml、不超過約0.6µg/ml、不超過約0.7µg/ml、不超過約0.8µg/ml、不超過約0.9µg/ml、不超過約1.0µg/ml、不超過約2.0µg/ml、不超過約4.0µg/ml、不超過約6.0µg/ml、不超過約8.0µg/ml或不超過約10.0µg/ml。
47. 如請求項43至45中任一項所述的方法，其中，該抗CD3抗體和該抗CD28抗體各自的濃度為約0.1µg/ml至約10.0µg/ml、約0.1µg/ml至約8.0µg/ml、約0.1µg/ml至約6.0µg/ml、約0.1µg/ml至約4.0µg/ml、約0.1µg/ml至約2.0µg/ml、約0.1µg/ml至約1.0µg/ml、約0.1µg/ml至約0.8µg/ml、約0.1µg/ml至約0.6µg/ml、約0.1µg/ml至約0.5µg/ml、約0.1µg/ml至約0.25µg/ml或約0.2µg/ml至約0.5µg/ml。
48. 如請求項43至47中任一項所述的方法，其中該激活在不超過約1小時、不超過約2小時、不超過約3小時、不超過約4小時、不超過約5小時、不超過約6小時、不超過約7小時、不超過約8小時、不超過約9小時、不超過約10小時、不超過約11小時、不超過約12小時、不超過約14小時、不超過約16小時、不超過約18小時、不超過約20小時、不超過約22小時、不超過約24小時、不超過約26小時、不超過約28小時、不超過約30小時、不超過約36小時、不超過約42小時、不超過約48小時、不超過約54小時、不超過約60小時、不超過約66小時、不超過約72小時、不超過約84小時、不超過約96小時、不超過約108小時或不超過約120小時的時間段內進行。
49. 如請求項43至47中任一項所述的方法，其中，該激活在約1小時至約120小時、約1小時至約108小時、約1小時至約96小時、約1小時至約84小時、約1小時至約72小時、約1小時至約60小時、約1小時至約48小時、約1小時至約36小時、約1小時至約24小時、約2小時至約24小時、約4小時至約24小時、約6小時至約24小時、約8小時至約24小時、約10小時至約24小時、約12小時至約24小時、約14小時至約24小時、約16小時至約24小時、約18小時至約24小時、約20小時至約24小時、約22小時至約24小時或約23小時至約24小時的時間段內進行。
50. 如請求項43至49中任一項所述的方法，其中，該固相為一珠、一板、一燒瓶或一袋的一表面。
51. 如請求項50所述的方法，其中，該板為6孔、12孔或24孔板。
52. 如請求項50所述的方法，其中，該燒瓶的一接種表面積為約25cm² 至約75cm² 、約25cm² 至約100cm² 、約25cm² 至約150cm² 或約50cm² 至約1720cm² 。
53. 如請求項50所述的方法，其中，該袋的一容積為約50ml至約100升、約100ml至約100升、約150ml至約100升、約200ml至約100升、約250ml至約100升、約500ml至約100升、約1升至約100升、約1升至約75升、約1升至約50升、約1升至約25升、約1升至約20升、約1升至約15升、約1升至約10升、約1升至約5升、約1升至約2.5升或約1升至約2升。
54. 如請求項43至53中任一項所述的方法，其中，該激活在存在至少一種細胞因子的情況下進行。
55. 如請求項54所述的方法，其中，該至少一種細胞因子包括白細胞介素7(IL-7)和/或白細胞介素15(IL-15)。
56. 如請求項55所述的方法，其中IL-7的濃度為不超過約1ng/ml、不超過約2ng/ml、不超過約3ng/ml、不超過約4ng/ml、不超過約5ng/ml、不超過約6ng/ml、不超過約7ng/ml、不超過約8ng/ml、不超過約9ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約11ng/ml、不超過約12ng/ml、不超過約13ng/ml、不超過約14ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約16ng/ml、不超過約17ng/ml、不超過約18ng/ml、不超過約19ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml或不超過約100ng/ml。
57. 如請求項55所述的方法，其中IL-7的濃度為約1ng/ml至100ng/ml、約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml、約1ng/ml至10ng/ml、約2ng/ml至10ng/ml、約4ng/ml至10ng/ml、約6ng/ml至10ng/ml或約5ng/ml至10ng/ml。
58. 如請求項55至57中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為不超過約5ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml、不超過約100ng/ml、不超過約110ng/ml、不超過約120ng/ml、不超過約130ng/ml、不超過約140ng/ml或不超過約500ng/ml。
59. 如請求項55至57中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為約5ng/ml至500ng/ml、約5ng/ml至400ng/ml、約5ng/ml至300ng/ml、約5ng/ml至200ng/ml、約5ng/ml至150ng/ml、約5ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至100ng/ml、約20ng/ml至100ng/ml、約30ng/ml至100ng/ml、約40ng/ml至100ng/ml、約50ng/ml至100ng/ml、約60ng/ml至100ng/ml、約70ng/ml至100ng/ml、約80ng/ml至100ng/ml、約90ng/ml至100ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約5ng/ml至50ng/ml、約10ng/ml至50ng/ml或約20ng/ml至50ng/ml。
60. 如請求項43至59中任一項所述的方法，還包括用一病毒載體轉導該激活的T細胞。
61. 如請求項62所述的方法，其中該病毒載體是表達一T細胞受體(TCR)的一逆轉錄病毒載體。
62. 如請求項60或61所述的方法，其中該病毒載體是表達一TCR的一慢病毒載體。
63. 如請求項60至62中任一項所述的方法，其中，該轉導在存在至少一種細胞因子的情況下進行。
64. 如請求項63所述的方法，其中，該至少一種細胞因子包括白細胞介素7(IL-7)和/或白細胞介素15(IL-15)。
65. 如請求項64所述的方法，其中IL-7的濃度為不超過約1ng/ml、不超過約2ng/ml、不超過約3ng/ml、不超過約4ng/ml、不超過約5ng/ml、不超過約6ng/ml、不超過約7ng/ml、不超過約8ng/ml、不超過約9ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約11ng/ml、不超過約12ng/ml、不超過約13ng/ml、不超過約14ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約16ng/ml、不超過約17ng/ml、不超過約18ng/ml、不超過約19ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml或不超過約100ng/ml。
66. 如請求項64所述的方法，其中IL-7的濃度為約1ng/ml至100ng/ml、約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml或約1ng/ml至10ng/ml。
67. 如請求項64至66中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為不超過約5ng/ml、不超過約10ng/ml、不超過約15ng/ml、不超過約20ng/ml、不超過約25ng/ml、不超過約30ng/ml、不超過約35ng/ml、不超過約40ng/ml、不超過約45ng/ml、不超過約50ng/ml、不超過約60ng/ml、不超過約70ng/ml、不超過約80ng/ml、不超過約90ng/ml、不超過約100ng/ml、不超過約110ng/ml、不超過約120ng/ml、不超過約130ng/ml、不超過約140ng/ml、不超過約150ng/ml、不超過約200ng/ml、不超過約250ng/ml、不超過約300ng/ml、不超過約350ng/ml、不超過約400ng/ml、不超過約450ng/ml或不超過約500ng/ml。
68. 如請求項64至66中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為約5ng/ml至500ng/ml、約5ng/ml至400ng/ml、約5ng/ml至300ng/ml、約5ng/ml至200ng/ml、約5ng/ml至150ng/ml、約5ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至100ng/ml、約20ng/ml至100ng/ml、約30ng/ml至100ng/ml、約40ng/ml至100ng/ml或約50ng/ml至100ng/ml。
69. 一種T細胞群，其透過請求項43至68中任一項所述的方法製備。
70. 如請求項1至38和43至68中任一項所述的方法，其中，該擴增在存在至少一種選自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21組成的組的細胞因子的情況下進行。
71. 如請求項70所述的方法，其中，該至少一種細胞因子包括IL-2。
72. 如請求項70所述的方法，其中，該至少一種細胞因子包括IL-7和IL-15。
73. 一種製備一T細胞群的方法，其包括以下步驟： 解凍外周血單核細胞(PBMC)， 靜置該解凍的PBMC約4至約6小時， 用一抗CD3抗體和一抗CD28抗體激活該靜置PBMC中的T細胞， 用一病毒載體轉導該激活的T細胞， 擴增該轉導的T細胞，以及 獲得該擴增的T細胞。
74. 如請求項73所述的方法，其中，該獲得的T細胞從約2倍至5倍、約5倍至約10倍、約5倍至約15倍、約5倍至約20倍、約5倍至約25倍、約25倍至約50倍、約50倍至約60倍、約60倍至約100倍、約65倍至約90倍、約70倍至約85倍和約67倍至約88倍組成的組中擴增。
75. 如請求項73所述的方法，其中，靜置時間約4至約6小時所獲得的T細胞擴增倍數，是相同條件下靜置時間約16至約20小時所製備獲得的T細胞擴增倍數的至少約1.5倍。
76. 如請求項73所述的方法，其中該獲得的T細胞數量是選自約2x10⁹ 至約5x10⁹ 、約5x10⁹ 至約10x10⁹ 、約10x10⁹ 至約15x10⁹ 、約5x10⁹ 至約35x10⁹ 、約5x10⁹ 至約30x10⁹ 、約10x10⁹ 至約30x10⁹ 、約15x10⁹ 至約20x10⁹ 、約20x10⁹ 至約35x10⁹ 、約24x10⁹ 至約33x10⁹ 以及約24.8x10⁹ 至約32.2x10⁹ 組成的組。
77. 如請求項73所述的方法，其中，靜置時間約4小時至約6小時所獲得的T細胞數量，是相同條件下靜置時間約16小時至約20小時所製備獲得的T細胞數量的約1.5至2.0倍。
78. 如請求項1至38、43至68和70至77中任一項所述的方法，其中，該解凍、靜置、激活、轉導、擴增和獲得在一封閉系統中進行。
79. 如請求項78所述的方法，其中，該封閉系統為CliniMACSProdigy^TM 、WAVE(XURI^TM )生物反應器、WAVE(XURI^TM )生物反應器與BioSafeSepax^TM II組合、G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統或G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統與BioSafeSepax^TM II組合。
80. 一種製備一T細胞群的方法，其包括以下步驟： 獲得新鮮的外周血單核細胞(PBMC)， 用一抗CD3抗體和一抗CD28抗體激活該新鮮PBMC中的該T細胞， 用一病毒載體轉導該激活的T細胞， 擴增該轉導的T細胞，以及 收穫該擴增的T細胞。
81. 如請求項80所述的方法，其中該擴增執行時間為約1天至2天、約1天至3天、約1天至約4天、約1天至約5天、約1天至6天、約1天至7天、約1天至8天、約1天至9天、約1天至10天、約2天至3天、約2天至4天、約2天至5天、約2天至6天、約2天至7天、約2天至8天、約2天至9天、約2天至10天、約3天至4天、約3天至5天、約3天至6天、約3天至7天、約3天至8天、約3天至9天、約3天至10天、約4天至5天、約4天至6天、約4天至7天、約4天至8天、約4天至9天、約4天至10天、約5天至6天、約5天至7天、約5天至8天、約5天至9天或約5天至10天。
82. 如請求項80所述的方法，其中該收穫在該激活後約4天至約12天、約4天至約11天、約4天至約10天、約4天至約9天、約4天至約8天、約4天至約7天、約4天至約6天、約4天至約5天、約5天至約12天、約5天至約11天、約5天至約10天、約5天至約9天、約5天至約8天、約5天至約7天或約5天至約6天內進行。
83. 如請求項80至82中任一項所述的方法，其中該收穫的T細胞數量是選自約2x10⁹ 至約5x10⁹ 、約5x10⁹ 至約10x10⁹ 、約10x10⁹ 至約15x10⁹ 、約5x10⁹ 至約35x10⁹ 、約5x10⁹ 至約30x10⁹ 、約10x10⁹ 至約30x10⁹ 、約15x10⁹ 至約20x10⁹ 、約20x10⁹ 至約35x10⁹ 、約24x10⁹ 至約33x10⁹ 以及約24.8x10⁹ 至約32.2x10⁹ 組成的組。
84. 如請求項80至83中任一項所述的方法，其中，該激活、轉導、擴增和收穫在該封閉系統中進行。
85. 如請求項84所述的方法，其中，該封閉系統為CliniMACSProdigy^TM 、WAVE(XURI^TM )生物反應器、WAVE(XURI^TM )生物反應器與BioSafeSepax^TM II組合、G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統或G-Rex/GatheRex^TM 封閉系統與BioSafeSepax^TM II組合。
86. 如請求項80至85中任一項所述的方法，其中該新鮮PBMC不是透過解凍一冷凍保存的PBMC獲得。
87. 如請求項80至86中任一項所述的方法，其中，該獲得和激活執行時間不超過1天。
88. 如請求項80至87中任一項所述的方法，其中，該擴增執行時間不超過1天。

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