TW202016295A

TW202016295A - Car表現t細胞及car表現載體

Info

Publication number: TW202016295A
Application number: TW108131332A
Authority: TW
Inventors: 武千央; 疊家貴之; 山口晶子
Original assignee: 日商諾伊爾免疫生物科技股份有限公司; 日商武田藥品工業有限公司
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2020-05-01
Also published as: EA202190624A1; AU2019331866B2; AU2019331866A1; KR20210053925A; EP3845654A1; US20210309712A1; CN112771166B; WO2020045610A1; CO2021003508A2; MX2021002373A; EP3845654A4; IL281013A; BR112021003640A2; CN120060149A; JPWO2020045610A1; MX2025008390A; CA3111170A1; SG11202101930XA; CN112771166A

Abstract

本發明提供一種抗腫瘤活性高於單獨表現CAR(不表現細胞激素及/或趨化因子)之免疫細胞(CAR-T細胞等)的免疫細胞(CAR-T細胞等)。本發明之一態樣中所提供之T細胞表現(1)嵌合抗原受體(CAR)、(2)選自由介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)及介白素-27(IL-27)所組成之群中之至少1種、以及(3)CC趨化因子配體19(CCL19)。

Description

CAR表現T細胞及CAR表現載體

本發明係關於一種可用於癌免疫治療之表現嵌合抗原受體(於本說明書中，記載為「CAR」)之免疫細胞(於本說明書中，記載為「CAR表現免疫細胞」)、代表性地為表現CAR之T細胞(於本說明書中，記載為「CAR-T細胞」)、及用以製作CAR表現免疫細胞(CAR-T細胞等)之表現載體。更詳細而言，本發明係關於一種表現特定之細胞激素及趨化因子之CAR表現免疫細胞(CAR-T細胞等)及用以製作其之表現載體。

藉由投予CAR-T細胞所進行之癌免疫療法雖於白血病或淋巴瘤等造血器官惡性腫瘤中表現出有效性，但尤其於實體癌中，存在因如下問題而未見治療效果之癌種或病例：CAR-T細胞於生物內之存活率較低、由癌細胞所具有之腫瘤免疫逃逸機制所引起之癌微環境下之CAR-T細胞之活性抑制等。因此，謀求一種尤其於實體癌中表現出治療效果之抗腫瘤活性更高之CAR-T細胞。

於專利文獻1及非專利文獻1中記載有一種抗腫瘤活性優於先前之CAR-T細胞之表現IL-7及CCL19之CAR-T細胞。然而，於專利文獻1及非專利文獻1中不包含對其以外之細胞激素及趨化因子之組合之具體記載。

於非專利文獻2中記載有一種因CAR之信令而持續性獨立地提昇之表現膜結合型嵌合IL-15(mbIL-15)之CAR-T細胞。然而，於非專利文獻2中不包含對mbIL-15與CCL19等趨化因子之組合之具體記載。

於非專利文獻3中記載藉由使用IL-15與IL-15Rαsushi區經由柔性連接子連結而成之融合蛋白，與併用先前之IL-15與IL-15Rαsushi區相比，可使淋巴細胞(NK細胞、NK-T細胞、記憶體CD8陽性細胞)之增殖或樹狀細胞之活化等中之活性較強。然而，於非專利文獻3中不包含對IL-15及IL-15Rαsushi區與CCL19等趨化因子之組合之具體記載。

於非專利文獻4中記載藉由轉染小鼠之IL-15與IL-15Rα之分泌型融合蛋白，CD8陽性T細胞之存活能力及增殖能力提昇。然而，於非專利文獻4中不包含對IL-15與CCL19等趨化因子之組合之具體記載。

於非專利文獻5中記載有單鏈IL-27(利用柔性連接子將p28與EBI3連結而成者)、及其對炎症性腸病(IBD)之治療之效果。然而，於非專利文獻5中不包含對CAR-T細胞之具體記載，又，不包含對單鏈IL-27與CCL19等趨化因子之組合之具體記載。

於專利文獻2中揭示有表現重組IL-7、重組IL-15或該等之組合之T細胞，記載此種細胞激素之表現使T細胞之存活提昇。然而，於專利文獻2中不包含對CAR-T細胞之具體記載，又，不包含對上述特定之細胞激素與CCL19等趨化因子之組合之具體記載。

於專利文獻3中記載有一種含有編碼IL-2、IL-4、IL-7、IL-15或該等之組合之表現構建物、及CAR構建物之經修飾之自然殺手T細胞。然而，於專利文獻3中不包含對上述特定之細胞激素與CCL19等趨化因子之組合之具體記載。

於專利文獻4中記載有一種表現IL-7、IL-15(IL-15/IL-15Rα融合蛋白)、IL-21等膜結合型細胞激素之CAR-T細胞。然而，於專利文獻4中不包含對上述特定之細胞激素與CCL19等趨化因子之組合之具體記載。

於專利文獻5中記載有一種表現IL-15之以CD19為靶之CAR-T細胞。然而，於專利文獻5中不包含對IL-15與CCL19等趨化因子之組合之具體記載。

於非專利文獻6中記載有一種表現IL-15及/或IL-21之以GPC3為靶之CAR-T細胞。然而，於專利文獻6中不包含對上述特定之細胞激素與CCL19等趨化因子之組合之具體記載。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]WO2016/056228 [專利文獻2]WO2007/037780 [專利文獻3]WO2013/040371 [專利文獻4]WO2014/186469 [專利文獻5]US2013/0071414 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Adachi et al., Nature Biotechnology, VOL 36, No 4, 346-353 [非專利文獻2]Hurton et al., Proc Natl Acad Sci., 113(48), E7788-97, 2016 [非專利文獻3]Mortier et al., J Biol Chem. 281(3), 1612-9, 2006 [非專利文獻4]Rowley et al., Eur J Immunol. 39(2), 491-506, 2009 [非專利文獻5]Sasaoka et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 300: G568-576 [非專利文獻6]Barta et al., Armored Glypican-3-Specific CAR T cells for the Immunotherapy of Hepatocellular Carcinoma, ASGCT 2018, May 2018, abstract

[發明所欲解決之問題]

本發明之課題在於提供一種抗腫瘤活性高於單獨表現CAR(不表現細胞激素及/或趨化因子)之免疫細胞(CAR-T細胞等)之免疫細胞(CAR-T細胞等)。 [解決問題之技術手段]

可控制T細胞等免疫細胞之功能之分子於生物內存在至少數百種。本發明者等人發現於CAR-T細胞中，藉由與CAR一起，將選自由作為細胞激素之介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)及介白素-27(IL-27)所組成之群中之至少1種與作為趨化因子之CC趨化因子配體19(CCL19)加以組合而表現，與單獨表現CAR之情形相比，增強抗腫瘤活性，尤其是CAR-T細胞之持續性及增殖性提昇，從而完成本發明。

再者，IL-15、IL-18、IL-27及CCL19係生物內存在之天然(未導入外源性基因)T細胞不表現之細胞激素及趨化因子。IL-21係生物內存在之天然T細胞(例如NKT細胞、CD4陽性T細胞)表現之細胞激素。於本發明中，表現上述特定之細胞激素及趨化因子意指藉由於T細胞導入用以表現外源性之上述特定之細胞激素及趨化因子之基因，以高於生物內存在之天然T細胞之水準表現上述特定之細胞激素及趨化因子。

又，將上述特定之介白素及趨化因子與CAR一起基因轉殖至T細胞並表現之實施形態可擴展為將該等基因轉殖至T細胞以外之免疫細胞、例如NK細胞、單核球、巨噬細胞、樹狀細胞等並表現之實施形態。

本發明至少包含下述發明。 [1] 一種T細胞，其表現 (1)嵌合抗原受體(CAR)、 (2)選自由介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)及介白素-27(IL-27)所組成之群中之至少1種、以及 (3)CC趨化因子配體19(CCL19)。 [2] 如項1所記載之T細胞，其中上述(2)為IL-15。 [3] 如項2所記載之T細胞，其中上述IL-15係處於與IL-15Rα連結而形成融合蛋白之狀態之IL-15。 [4] 如項3所記載之T細胞，其中上述融合蛋白係IL-15LSP與IL-15連結而成之融合蛋白(IL15_LSP )、IL-15Rα細胞外區與IL-15連結而成之融合蛋白(_s IL15_RA )、IL-15與全長之IL-15Rα連結而成之融合蛋白(_mb IL15_RA )、或包含訊息肽及sushi區之IL-15Rα與IL-15連結而成之融合蛋白(_sushi IL15)。 [5] 如項3所記載之T細胞，其中上述融合蛋白係IL-15與全長之IL-15Rα連結而成之融合蛋白(_mb IL15_RA )、或包含訊息肽及sushi區之IL-15Rα與IL-15連結而成之融合蛋白(_sushi IL15)。 [6] 一種醫藥，其含有如項1所記載之T細胞。 [7] 如項6所記載之醫藥，其係癌之治療劑。 [8] 如項7所記載之醫藥，其中上述癌係黑色素瘤、梅克爾細胞癌、大腸癌、腎癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、小腸癌、前列腺癌、膀胱癌、直腸癌、胰腺癌、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、膽道癌、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。 [9] 一種表現載體，其包含 (1)編碼CAR之核酸、 (2)編碼選自由IL-15、IL-18、IL-21及IL-27所組成之群中之至少1種之核酸、以及 (3)編碼CCL19之核酸。 [10] 如項9所記載之表現載體，其中上述(2)為IL-15。 [11] 如項10所記載之表現載體，其中上述IL-15係處於與IL-15Rα連結而形成融合蛋白之狀態之IL-15。 [12] 如項11所記載之表現載體，其中上述融合蛋白係IL-15LSP與IL-15連結而成之融合蛋白(IL15_LSP )、IL-15Rα細胞外區與IL-15連結而成之融合蛋白(_s IL15_RA )、IL-15與全長之IL-15Rα連結而成之融合蛋白(_mb IL15_RA )、或包含訊息肽及sushi區之IL-15Rα與IL-15連結而成之融合蛋白(_sushi IL15)。 [13] 如項11所記載之表現載體，其中上述融合蛋白係IL-15與全長之IL-15Rα連結而成之融合蛋白(_mb IL15_RA )、或包含訊息肽及sushi區之IL-15Rα與IL-15連結而成之融合蛋白(_sushi IL15)。 [14] 一種CAR-T細胞之製造方法，其包括將如項9所記載之表現載體導入至T細胞之步驟。 [15] 一種癌之治療方法，其包括對必需癌之治療之對象投予如項1所記載之T細胞之步驟。 [16] 如項15所記載之治療方法，其中上述癌係黑色素瘤、梅克爾細胞癌、大腸癌、腎癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、小腸癌、前列腺癌、膀胱癌、直腸癌、胰腺癌、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、膽道癌、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。 [17] 如項1所記載之T細胞，其用作癌之治療之有效成分。 [18] 如項17所記載之T細胞，其中上述癌係黑色素瘤、梅克爾細胞癌、大腸癌、腎癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、小腸癌、前列腺癌、膀胱癌、直腸癌、胰腺癌、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、膽道癌、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。

於本說明書中，有時將上述[1]之T細胞稱為「本發明之T細胞」，將上述[6]之醫藥稱為「本發明之醫藥」，將上述[9]之表現載體稱為「本發明之表現載體」，將上述[14]之CAR-T細胞之製造方法稱為「本發明之製造方法」。

業者可整體斟酌本說明書中所揭示之內容，適當轉換上述發明之形態(範疇)。上述[6]之本發明之醫藥例如可轉換為「一種癌之治療方法，其包括對必需癌之治療之對象投予表現(1)CAR、(2)選自由IL-15、IL-18、IL-21及IL-27所組成之群中之至少1種、以及(3)CCL19之T細胞之步驟」；「一種T細胞，其用作癌之治療之有效成分，且表現(1)CAR、(2)選自由IL-15、IL-18、IL-21及IL-27所組成之群中之至少1種、以及(3)CCL19」；「一種T細胞於用以治療癌之醫藥之製造中之用途，該T細胞表現(1)CAR、(2)選自由IL-15、IL-18、IL-21及IL-27所組成之群中之至少1種、以及(3)CCL19」等。

業者可整體斟酌本說明書中所揭示之內容，將藉由與CAR一起於T細胞表現特定之細胞激素及趨化因子所獲得之本發明之T細胞、以及作為與其相關之實施形態之本發明之醫藥、本發明之表現載體、本發明之製造方法等各發明適當轉換為與CAR一起於T細胞以外之免疫細胞(NK細胞、單核球、巨噬細胞、樹狀細胞等)表現特定之細胞激素及趨化因子、以及作為與其相關之實施形態之醫藥、表現載體、製造方法等各發明。 [發明之效果]

藉由本發明之T細胞表現特定之細胞激素(IL-15等)及趨化因子(CCL19)，T細胞之持續性及增殖性提昇，故而可增強由CAR所帶來之抗腫瘤活性(降低殘存腫瘤細胞數，提昇IFNγ之產生量，提昇宿主免疫細胞(T細胞、樹狀細胞、NK細胞等)於腫瘤局部之移動及累積)。又，藉由含有此種本發明之T細胞之醫藥，可提昇癌之治療效果。尤其是本發明之T細胞可參與NK細胞之活化，藉此，可對對NK細胞有敏感性之癌(黑色素瘤、梅克爾細胞癌、大腸癌、腎癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、小腸癌、前列腺癌、膀胱癌、直腸癌、胰腺癌、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、膽道癌、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等)之治療有用。進而，藉由抗腫瘤活性之增強而投予細胞數減少，藉此可期待降低CRS(Cytokine Release Syndrome，細胞激素釋放症候群)等副作用或降低製造成本等效果。

本發明之特定之細胞激素及趨化因子之組合即便於對全部免疫細胞，即不僅對如上所述之T細胞，亦對NK細胞、單核球、巨噬細胞、樹狀細胞等，與CAR基因一起進行基因轉殖並表現之情形時，亦發揮可獲得抗腫瘤活性較高之各種CAR表現免疫細胞之作用效果。

於本說明書中，「轉染」意指將任意之物質導入至細胞之內部。細胞之內部至少包含細胞質內及核內。

「培養(Culture)」或「進行培養」意指於組織外或體外，例如於培養皿、皮氏培養皿、燒瓶或培養槽(tank)中維持細胞，使之增殖且/或分化。

「多能性(pluripotency)」意指可分化為具有各種不同之形態或功能之組織或細胞，且可分化為三胚層之任一系統之細胞之能力。「多能性(pluripotency)」係就無法分化為胚盤，因此無形成個體之能力之方面而言，與可分化為包括胚盤在內之生物之所有組織之「全能性(totipotency)」有所區分。

「多能性(multipotency)」意指可分化為複數個限定數量之系統之細胞之能力。例如間充質幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞雖為專能性(multipotent)，但不為多能性(pluripotent)。

作為「幹細胞(stem cell)」，例如可列舉多能性幹細胞(pluripotent stem cell)。

本發明中可使用之「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」係指具有如下能力之幹細胞：可分化為生物之具有各種不同之形態或功能之組織或細胞，且可分化為三胚層(內胚層、中胚層、外胚層)之任一系統之細胞。其並無特別限定，例如可列舉：胚胎幹細胞(ESC)、藉由核移植所獲得之源自選殖胚胎之胚胎幹細胞、精子幹細胞、胚胎生殖細胞、人工多能性幹細胞(於本說明書中，亦有時稱為「iPSC」)等。

又，本發明中可使用之「多能性幹細胞(multipotent stem cell)」係指具有可分化為複數個限定數量之系統之細胞之能力的幹細胞。作為本發明中可使用之「多能性幹細胞(multipotent stem cell)」，例如可列舉：齒髓幹細胞、口腔黏膜源性幹細胞、毛囊幹細胞、培養纖維母細胞、或源自骨髓幹細胞之成體幹細胞等。較佳之多能性幹細胞(pluripotent stem cell)為ESC及iPSC。

「人工多能性幹細胞(iPSC)」係指藉由於哺乳動物體細胞或未分化幹細胞導入特定之因子(核初始化因子)進行再編程所獲得之細胞。目前，「人工多能性幹細胞」有各種細胞，除由山中等人藉由於小鼠纖維母細胞導入Oct3/4・Sox2・Klf4・c-Myc 4個因子所建立之iPSC(Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676)以外，亦可使用將相同之4個因子導入至人類纖維母細胞所建立之源自人類細胞之iPSC(Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.)；導入上述4個因子後，以Nanog之表現作為指標進行篩選所建立之Nanog-iPS細胞(Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.)；利用不包含c-Myc之方法所製作之iPS細胞(Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106)；利用脫毒法導入6個因子所建立之iPS細胞(Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8(5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3): 458-66.)。又，亦可使用由Thomson等人製作之導入OCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28 4個因子所建立之人工多能性幹細胞(Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.)、由Daley等人製作之人工多能性幹細胞(Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146)、由櫻田等人製作之人工多能性幹細胞(日本專利特開2008-307007號)等。除此以外，亦可使用公開之所有論文(例如Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5, 568-574；Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797)、或專利(例如日本專利特開2008-307007號、日本專利特開2008-283972號、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)中所記載之該領域中公知之人工多能性幹細胞中之任一種。

作為「人工多能性幹細胞」，可利用NIH、理研(理化學研究所)、京都大學等建立之各種iPSC株。例如若為人類iPSC株，則可列舉：理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大學之253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等。或者亦可使用由京都大學或Cellular Dynamics International等提供之臨床級細胞株以及使用該等細胞株所製作之研究用及臨床用細胞株等。

作為「胚胎幹細胞(ESC)」，若為小鼠ESC，則可利用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化學研究所)等建立之各種小鼠ESC株，若為人類ESC，則可利用NIH、理研、京都大學、Cellartis公司建立之各種人類ESC株。例如作為人類ESC株，可利用NIH之CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell Research之H1株、H9株、理研之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。或者亦可使用臨床級細胞株以及使用該等細胞株所製作之研究用及臨床用細胞株等。

「包含(comprise(s)或comprising)～」意指表示包含接在該語句後之要素，但並不限定於此。因此，暗示包含接在該語句後之要素，但並未暗示排除其他任意之要素。「由～所構成(consist(s) of或consisting of)」意指包含接在該語句後之所有要素，且限定於此。因此，「由～所構成」之語句表示要求或必需所列舉之要素，且實質上不存在其他要素。「本質上由～所構成」意指包含接在該語句後之任意之要素，且限定於不影響本發明中對該要素所特定之活性或作用之其他要素。因此，「本質上由～所構成」之語句表示要求或必需所列舉之要素，但任意選擇其他要素，根據該等是否對所列舉之要素之活性或作用產生影響，有時存在，亦有時不存在。

藉由將本發明之特定之細胞激素及趨化因子之組合與CAR基因一起基因轉殖至免疫細胞、尤其是負責獲得性免疫中之細胞性免疫之T細胞、或負責自然免疫之NK細胞、單核球、巨噬細胞、樹狀細胞等並表現，可提供一種抗腫瘤活性較高之CAR表現免疫細胞。換言之，本發明之特定之細胞激素及趨化因子之組合之基因轉殖及表現可分別對進行CAR之基因轉殖及表現之T細胞(CAR-T細胞)、NK細胞(CAR-NK細胞)、單核球(CAR-單核球)、巨噬細胞(CAR-巨噬細胞)、樹狀細胞(CAR-樹狀細胞)等賦予進一步之技術特徵。

「免疫細胞」只要為具有利用某些作用機制可毒殺癌細胞等靶細胞(病原細胞)之能力之細胞(所謂免疫效應細胞)，則並無特別限制，例如可列舉：負責獲得性免疫中之細胞性免疫之T細胞、或負責自然免疫之NK細胞、單核球、巨噬細胞、樹狀細胞等。於較佳之一實施形態中，免疫細胞可為T細胞。另一方面，於另一較佳之實施形態中，免疫細胞可為NK細胞、巨噬細胞、樹狀細胞等負責自然免疫之細胞。認為即便於T細胞之HLA(human leukocyte antigen，人類白細胞抗原)型一致之情形時，亦有相當程度之因同種異體(allo)移植而引起GVHD(graft versus host disease，移植物抗宿主疾病)之風險，相對於此，異體NK細胞等不會引起GVHD。因此，若準備各種HLA型之異體免疫細胞，則可現成地使用。關於CAR-NK細胞，例如記載於US2016/0096892, Mol Ther. 25(8): 1769-1781 (2017)等中，關於CAR-樹狀細胞、CAR-巨噬細胞等，例如記載於WO2017/019848, eLIFE. 2018 e36688等中。

以下，藉由依據採用T細胞作為免疫細胞之代表例之情形時之實施形態的記載而說明本發明。然而，本發明並不僅限定於免疫細胞為T細胞之實施形態，免疫細胞為NK細胞、單核球、巨噬細胞、樹狀細胞等之實施形態亦包含於本發明中。於以下之記載中，「(CAR-)T細胞」可適當改稱為「(CAR-)NK細胞」、「(CAR-)單核球」、「(CAR-)巨噬細胞」、「(CAR-)樹狀細胞」等。

以下，對本發明之T細胞詳細地進行說明。

本發明之T細胞表現(1)CAR、(2)選自由IL-15、IL-18、IL-21及IL-27所組成之群中之至少1種、以及(3)CCL19。

本發明中之T細胞與表現一般或公知之CAR之T細胞同樣地，可為αβT細胞、γδT細胞、CD8⁺ T細胞、CD4⁺ T細胞、腫瘤浸潤T細胞、記憶體T細胞、初始T細胞、NKT細胞等任一T細胞。

T細胞可為自浸潤於血液、骨髓液等體液、脾臟、胸腺、淋巴結等組織、或原發腫瘤、轉移性腫瘤、癌性腹水等癌組織之免疫細胞進行單離、純化而成者。又，T細胞亦可為藉由於適當之條件下培養人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚胎幹細胞(ES細胞)、或其他幹細胞、前驅細胞等，分化誘導為T細胞者。

T細胞可源自人類，亦可為源自人類以外之哺乳類(非人類哺乳類)之細胞。作為非人類哺乳類，例如可列舉：小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、狗、貓、豬、牛、馬、綿羊、猴。

(1)CAR 本發明之T細胞所表現之CAR基本上與一般或公知之CAR同樣地，藉由(i)識別癌細胞之細胞表面抗原之單鏈抗體、(ii)跨膜區、及(iii)誘導T細胞之活化之訊號傳遞區各部位之肽視需要經由間隔子連結而構成。

(i)識別癌細胞之細胞表面抗原之單鏈抗體典型地為單鏈可變區片段(scFv)，該單鏈可變區片段包含源自與該抗原特異性地結合之單株抗體之抗原結合部位之輕鏈可變區及重鏈可變區、及將該等連結之連接肽。

以CAR作為靶之「癌細胞之細胞表面抗原」只要為於癌細胞及其前驅細胞特異性地表現之生物分子、藉由細胞之癌化重新可見表現之生物分子、或與正常細胞相比癌細胞中表現水準增加之生物分子即可。此種抗原一般被稱為「腫瘤相關抗原」(TAA)，例如可列舉：BCMA、B7-H3、B7-H6、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD56、CD70、CD74、CD97、CD123、CD133、CD138、CD171、CD248、CAIX、CEA、c-Met、CS1(CD319)、CSPG4、CLDN6、CLD18A2、CYP1B1、DNAM-1、GD2、GD3、GM2、GFRα4、GPC3、GPR20、GPRC5D、globoH、Gp100、GPR20、GPRC5D、EGFR、EGFRvariant、EpCAM、EGP2、EGP40、FAP、FITC、HER2、HER3、HPV E6、HPV E7、hTERT、IgG κ鏈、IL-11Ra、IL-13Ra2、KIT、Lewis A、Lewis Y、Legumain、LMP1、LMP2、Ly6k、LICAM、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE-A1、黑色素瘤相關抗原1、MUC1、MUC16、NA-17、NY-BR-1、NY-ESO-1、O-acetyl-GD2、h5T4、PANX3、PDGRFb、PLAC1、聚唾液酸、PSCA、PSMA、RAGE1、ROR1、sLe、SSEA-4、TARP、TAG-72、TEM7R、Tn抗原、TRAIL受體、TRP2、TSHR、α-胎蛋白、間皮素、葉酸受體α(FRα)、葉酸受體β(FRβ)、FBP、UPK2、VEGF-R2、WT-1，但並不限定於該等。

(ii)跨膜區係成為用以將CAR固定於T細胞之細胞膜之區之多肽。作為此種跨膜區，例如可列舉源自BTLA、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、4-1BB(CD137)、CTLA-4、GITR、ICOS、LAG3、OX40、SLAMF4(CD244、2B4)、或者T細胞受體之α或β鏈之跨膜區。或者亦可使用具有相對於上述跨膜區之天然胺基酸序列為80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同源性之胺基酸序列的變異型跨膜區。於本發明之一實施形態中，作為跨膜區，較佳為CD8之跨膜區。

於跨膜區可連結作為由任意之胺基酸序列所構成之長度為1～100個胺基酸、較佳為10～70個胺基酸之肽(寡肽或多肽)的鉸鏈區。作為此種鉸鏈區，例如可列舉源自CD3、CD8、KIR2DS2或IgG4、IgD或其他免疫球蛋白之鉸鏈區。或者亦可使用具有相對於上述鉸鏈區之天然胺基酸序列為80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同源性之胺基酸序列的變異型鉸鏈區。於本發明之一實施形態中，作為鉸鏈區，較佳為CD8之鉸鏈區。

(iii)誘導T細胞之活化之訊號傳遞區係成為於上述單鏈抗體識別癌細胞之細胞表面抗原而結合時用以訊號傳遞至T細胞內之區的多肽。作為此種訊號傳遞區，例如可列舉選自由如下物質所組成之群中之1種或2種以上之細胞內區：MHC I類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞激素受體、整合素、活化NK細胞受體、Toll樣受體、B7-H3、BAFFR、BTLA、BY55(CD160)、CD2、CD3ζ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD103、4-1BB(CD137)、CDS、CEACAM1、CRTAM、CNAM1(CD226)、DAP10、Fc受體相關γ鏈、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICOS(CD278)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、Ly9(CD229)、LAT、LFA-1(CD11a/CD18)、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PSGL1、SELPLG(CD162)、SEMA4D(CD100)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAMF4(CD244、2B4)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLAMF8(BLAME)、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1及VLA-6。或者亦可使用具有相對於上述訊號傳遞區(細胞內區)之天然胺基酸序列為80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同源性之胺基酸序列的變異型訊號傳遞區(細胞內區)。於本發明之一實施形態中，較佳為訊號傳遞區包含CD28、4-1BB及CD3ζ 3種細胞內區。

於訊號傳遞區包含複數個細胞內區之情形時，各細胞內區彼此可經由由2～10個胺基酸所構成之連接肽(寡肽或多肽)而連結。作為此種連接肽，例如可列舉由甘胺酸-絲胺酸連續序列所構成之肽。

單鏈抗體與跨膜區、及跨膜區與訊號傳遞區分別可包含作為由任意之胺基酸序列所構成之長度為1～100個胺基酸、較佳為10～50個胺基酸之肽(寡肽或多肽)的間隔區。作為間隔區，例如可列舉由甘胺酸-絲胺酸連續序列所構成之肽。

本發明之T細胞所表現之如上所述之CAR之胺基酸序列只要根據T細胞之用途、典型地為作為用以治療癌之醫藥之有效成分之功能，採用適當者即可。作為針對癌細胞之細胞表面抗原之單鏈抗體(i)之胺基酸序列，公知有各種序列，於本發明中亦可利用該等胺基酸序列之資訊。或者亦可按照常規方法，重新製作所需之針對癌細胞之細胞表面抗原之抗體，確定該新抗體(較佳為重鏈及輕鏈可變區、尤其是CDR)之胺基酸序列，於本發明中利用該資訊。又，作為跨膜區(ii)及T細胞活化訊號傳遞區(iii)各者之胺基酸序列，亦公知有源自人類及源自人類以外之哺乳動物之各種序列，由於該等亦登記於NCBI(美國生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)、UniProt(通用蛋白質資源(The Universal Protein Resource)；https://www.uniprot.org)等資料庫，故而於本發明中亦可利用該等資訊。

(2)細胞激素本發明之T細胞所表現之細胞激素係選自由IL-15、IL-18、IL-21及IL-27所組成之群中之至少1種。本發明之T細胞可表現上述4種細胞激素中之任一種，亦可表現2種以上。

IL-15係具有與T細胞之存活、活化、及向記憶體T細胞之分化、以及NK細胞之活化等相關之功能的細胞激素。本發明中之「IL-15」之用語不僅包含天然全長之IL-15蛋白質，亦於保持本發明之作用效果下之IL-15之功能之範圍內包含各種實施形態。即，本發明中之「IL-15」不僅包含由天然IL-15之胺基酸序列所構成之蛋白質(多肽)之整體，亦包含其一部分(功能性部分多肽)、或者對天然胺基酸序列(較佳為於具有如下所述之同源性之範圍內)缺失、置換或附加一個或複數個胺基酸序列而成之天然IL-15之整體或其一部分之變異體，進而，亦包含天然IL-15之整體或其一部分或其等之變異體與其他蛋白質連結而採取融合蛋白之形態(例如處於與IL-15Rα之整體或其一部分連結而形成融合蛋白之狀態)之情形。於本發明中，T細胞「表現IL-15」包括於不失去本發明之作用效果之範圍內表現如上所述之各種形態之IL-15(為具有天然胺基酸序列之蛋白質之整體或其一部分或其等之變異體，可採取亦可不採取融合蛋白之形態)。

作為IL-15，例如可列舉如下所述之4個實施形態。該等均為公知(參照如上所示之非專利文獻2、非專利文獻3、非專利文獻4及專利文獻4等)。然而，本發明中可使用之IL-15並不限定於該等具體例，就序列中之訊息肽及連接子之有無及種類、各要素之順序、其他觀點而言，亦可使用經修飾之各種IL-15(於本說明書中，有時稱為「修飾型」IL-15)。

IL-15之第1實施形態：IL-15LSP/IL-15(於本說明書中，有時記載為「IL15_LSP 」) 「IL-15LSP」係由29個胺基酸所構成之長鏈訊息肽，於第1實施形態中與IL-15之N末端側結合。藉由表現第1實施形態之IL-15，增強CAR-T細胞之抗腫瘤活性。「IL-15LSP」之用語亦不僅包含由天然IL-15LSP之胺基酸序列所構成之多肽之整體，亦包含其一部分(功能性部分多肽)、或者對天然胺基酸序列(較佳為於具有如下所述之同源性之範圍內)缺失、置換或附加一個或複數個胺基酸序列而成之天然IL-15LSP之整體或其一部分之變異體。再者，作為第1實施形態之修飾型之一例，可列舉將「IL-15LSP」置換為「IL-2SP」(為IL-2之訊息肽，與IL-15LSP同樣地可為天然蛋白質之整體或其一部分或其等之變異體)者。

IL-15之第2實施形態：IL-15/IL-15Rα細胞外區(於本說明書中，有時記載為「_s IL15_RA 」) 「IL-15Rα細胞外區」係指IL-15Rα(介白素15受體α鏈)中除跨膜區及細胞內區以外之部分。IL-15Rα細胞外區包含sushi區(各種結合性蛋白質共通可見之模體(motif))。「IL-15Rα細胞外區」之用語亦不僅包含由天然IL-15Rα細胞外區之胺基酸序列所構成之多肽之整體，亦包含其一部分(功能性部分多肽)、或者對天然胺基酸序列(較佳為於具有如下所述之同源性之範圍內)缺失、置換或附加一個或複數個胺基酸序列而成之天然IL-15Rα細胞外區之整體或其一部分之變異體。於第2實施形態中，IL-15Rα細胞外區通常經由連接子(例如由26個胺基酸所構成之甘胺酸-絲胺酸連接子)，與IL-15之C末端側結合。又，於第2實施形態中，通常IL-2SP(為IL-2訊息肽，可為天然蛋白質之整體或其一部分或其等之變異體)與IL-15之N末端側結合，以代替IL-15LSP。第2實施形態為分泌型，成為與IL-15Rβ(與介白素2受體共有之介白素15受體β鏈)及γc(作為介白素2、4、7、9、15、21等受體所共有之共通γ鏈)強力結合之促效劑。

IL-15之第3實施形態：IL-15/IL-15Rα全長(於本說明書中，有時記載為「_mb IL15_RA 」) 「IL-15Rα全長」包含IL-15Rα之細胞外區、跨膜區及細胞內區兩者，於第3實施形態中，通常經由連接子(例如由20個胺基酸所構成之甘胺酸-絲胺酸連接子)，與IL-15之C末端側結合。「IL-15Rα全長」之用語亦不僅包含由天然IL-15Rα全長之胺基酸序列所構成之蛋白質(多肽)之整體，亦包含對天然胺基酸序列(較佳為於具有如下所述之同源性之範圍內)缺失、置換或附加一個或複數個胺基酸序列而成之天然IL-15Rα全長之變異體。又，於第3實施形態中，亦通常IL-2SP(可為天然蛋白質之整體或其一部分或其等之變異體者)與IL-15之N末端側結合，以代替IL-15LSP。第3實施形態為膜結合型，藉由將其進行表現，增強CAR-T細胞之抗腫瘤活性。

IL-15之第4實施形態：IL-15Rαsushi/IL-15(於本說明書中，有時記載為「_sushi IL15」) 於第4實施形態中，包含訊息肽及sushi區之IL-15Rα通常經由連接子(例如由20個胺基酸所構成之連接子)，與IL-15之N末端側結合。「IL-15Rαsushi」之用語亦不僅包含由天然IL-15Rαsushi之胺基酸序列所構成之多肽之整體，亦包含其一部分(功能性部分多肽)、或者對天然胺基酸序列(較佳為於具有如下所述之同源性之範圍內)缺失、置換或附加一個或複數個胺基酸序列而成之天然IL-15Rαsushi之整體或其一部分之變異體。第4實施形態為分泌型。

於本發明中，就如下述實施例(試驗例)所示之細胞之持續性及增殖性之觀點而言，作為IL-15，較佳為處於與IL-15Rα(具有天然胺基酸序列之蛋白質之整體或其一部分或其等之變異體)之融合蛋白之形態之IL-15(具有天然胺基酸序列之蛋白質之整體或其一部分或其等之變異體)。例如較佳為上述第2、第3或第4之實施形態或該等之修飾型，更佳為上述第3及第4之實施形態或該等之修飾型。

IL-18係具有與T細胞之活化、NK細胞之活化及樹狀細胞之活化等相關之功能之細胞激素。本發明中之「IL-18」之用語不僅包含天然全長之IL-18蛋白質，亦於保持本發明之作用效果下之IL-18之功能之範圍內包含各種實施形態。即，本發明中之「IL-18」不僅包含由天然IL-18之胺基酸序列所構成之蛋白質(多肽)之全長，亦包含其一部分(功能性部分多肽)、或者對天然胺基酸序列(較佳為於具有如下所述之同源性之範圍內)缺失、置換或附加一個或複數個胺基酸序列而成之天然IL-18之整體或其一部分之變異體，進而，亦包含天然IL-18之整體或其一部分與其他蛋白質連結而採取融合蛋白之形態之情形。於本發明中，T細胞「表現IL-18」包括於不失去本發明之作用效果之範圍內表現如上所述之各種形態之IL-18(為具有天然胺基酸序列之蛋白質之整體或其一部分或其等之變異體，可採取亦可不採取融合蛋白之形態)。

IL-21係具有與CD8⁺ T細胞之功能及向記憶體T細胞之分化、以及NK細胞之存活等相關之功能之細胞激素。本發明中之「IL-21」之用語不僅包含天然全長之IL-21蛋白質，亦於保持本發明之作用效果下之IL-21之功能之範圍內包含各種實施形態。即，本發明中之「IL-21」不僅包含由天然IL-21之胺基酸序列所構成之蛋白質(多肽)之全長，亦包含其一部分(功能性部分多肽)、或者對天然胺基酸序列(較佳為於具有如下所述之同源性之範圍內)缺失、置換或附加一個或複數個胺基酸序列而成之天然IL-21之整體或其一部分之變異體，進而，亦包含天然IL-21之整體或其一部分與其他蛋白質連結而採取融合蛋白之形態之情形。於本發明中，T細胞「表現IL-21」包括於不失去本發明之作用效果之範圍內表現如上所述之各種形態之IL-21(為具有天然胺基酸序列之蛋白質之整體或其一部分或其等之變異體，可採取亦可不採取融合蛋白之形態)。

IL-27係具有與T細胞之存活、NK細胞之活化、腫瘤之增殖及血管新生之抑制等相關之功能之細胞激素。本發明中之「IL-27」之用語不僅包含天然全長之IL-27蛋白質，亦於保持本發明之作用效果下之IL-27之功能之範圍內包含各種實施形態。即，本發明中之「IL-27」不僅包含由天然IL-27之胺基酸序列所構成之蛋白質(多肽)之全長，亦包含其一部分(功能性部分多肽)、或者對天然胺基酸序列(較佳為於具有如下所述之同源性之範圍內)缺失、置換或附加一個或複數個胺基酸序列而成之天然IL-27之整體或其一部分之變異體，進而，亦包含天然IL-27之整體或其一部分與其他蛋白質連結而採取融合蛋白之形態之情形。於本發明中，T細胞「表現IL-27」包括於不失去本發明之作用效果之範圍內表現如上所述之各種形態之IL-27(為具有天然胺基酸序列之蛋白質之整體或其一部分或其等之變異體，可採取亦可不採取融合蛋白之形態)。

作為IL-27，例如可列舉構成IL-27之2個次單元、p28及EBI3(愛潑斯坦-巴爾病毒誘導基因3)藉由連接子、例如(G₄ S)₃ 之類之由20～30個胺基酸所構成之連接子(參照如上所示之非專利文獻5等)、由GSTSGSGKPGSGEGSTKG所構成之連接子(J Immunol. 183, 6217-26 (2009))連結而成之融合蛋白(單鏈蛋白質)。「p28」及「EBI3」之用語亦分別包含具有天然胺基酸序列之多肽之整體或其一部分或其等之變異體。

本發明之T細胞所表現之如上所述之細胞激素之胺基酸序列只要根據本發明之T細胞(CAR-T細胞)之用途、典型地為作為用以治療癌之醫藥之有效成分之功能，考慮包括CAR-T細胞之持續性及增殖性之提昇之由CAR-T細胞所帶來之對抗腫瘤活性之增強之效果，採用適當者即可。源自人類及源自人類以外之哺乳動物(例如小鼠)之天然IL-15、IL-18、IL-21及IL-27以及IL-15Rα之胺基酸序列係公知，亦登記於NCBI、UniProt等資料庫，故而於本發明中亦可利用該資訊。作為一例，示出登記為UniProtKB-P40933之人類之天然IL-15(包含訊息肽及前肽部分之全長)之胺基酸序列作為序列編號18，示出登記為UniProtKB-Q13261之人類之天然IL-15Rα(包含訊息肽、sushi區、細胞外區等之全長)之胺基酸序列作為序列編號19。於如下所述之於特定之序列編號之胺基酸序列中將小鼠之天然胺基酸序列置換為人類之天然胺基酸序列的實施形態中，可參照序列編號18及19中所包含之對應之部分之胺基酸序列。又，作為IL-15、IL-18、IL-21及IL-27以及IL-15Rα各者之變異體、與其他蛋白質之融合蛋白及該等之修飾型，公知有各種物質，於本發明中亦可利用該等胺基酸序列之資訊。

作為IL-15、IL-18、IL-21及IL-27各者之變異體，例如可列舉如下者：作為整體或作為部分區(domain)，例如於如下所述置換訊息肽之情形時，作為除該訊息肽以外之區之同源性，具有相對於各源自人類或人類以外之哺乳動物之天然胺基酸序列為80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同源性之胺基酸序列。作為相對於源自某一生物種之天然胺基酸序列具有如上所述之範圍之同源性的變異體，亦有合適為(實質上包含)源自其他生物種之天然胺基酸序列之情況。又，IL-15、IL-18、IL-21及IL-27可為將序列中之訊息肽置換為公知之訊息肽而成者。於本發明之一態樣中，於由序列編號4：IL15_LSP _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)、序列編號6：_s IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)、序列編號8：_mb IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)、序列編號10：_sushi IL15_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#6)、序列編號12：IL-18_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#7)、序列編號14：IL-21_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#8)、序列編號16：_sc IL27_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#9)各者之鹼基序列表現之蛋白質(多肽)之胺基酸序列中，或者於序列編號5：包含IL15_LSP 之融合蛋白、序列編號7：包含_s IL15_RA 之融合蛋白、序列編號9：包含_mb IL15_RA 之融合蛋白、序列編號11：包含_sushi IL15之融合蛋白、序列編號13：包含IL-18之融合蛋白、序列編號15：包含IL-21之融合蛋白、序列編號17：包含_sc IL27之融合蛋白各者之胺基酸序列中，小鼠之天然IL-15、IL-18、IL-21或IL-27之胺基酸序列可置換為具有如上所述之同源性之變異體之胺基酸序列、或者實質上相當於此種變異體之人類之天然IL-15、IL-18、IL-21或IL-27之胺基酸序列或該等之進一步之變異體。

作為IL-15Rα細胞外區、IL-15Rα全長及IL-15Rαsushi各者之變異體，可列舉具有相對於各源自人類或人類以外之哺乳動物之天然胺基酸序列為80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同源性之胺基酸序列者。於本發明之一態樣中，於由序列編號4：IL15_LSP _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)、序列編號6：_s IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)、序列編號8：_mb IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)、序列編號10：_sushi IL15_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#6)各者之鹼基序列表現之蛋白質(多肽)之胺基酸序列中，或者於序列編號5：包含IL15_LSP 之融合蛋白、序列編號7：包含_s IL15_RA 之融合蛋白、序列編號9：包含_mb IL15_RA 之融合蛋白、序列編號11：包含_sushi IL15之融合蛋白各者之胺基酸序列中，小鼠之天然IL-15Rα細胞外區、IL-15Rα全長或IL-15Rαsushi之胺基酸序列可置換為具有如上所述之同源性之變異體之胺基酸序列、或者實質上相當於此種變異體之人類之天然IL-15Rα細胞外區、IL-15Rα全長或IL-15Rαsushi之胺基酸序列或該等之進一步之變異體。

IL-15、IL-18、IL-21及IL-27較佳為與本發明之T細胞之製作中所使用之T細胞(該T細胞所具有之IL-15、IL-18、IL-21及IL-27之受體)相同之種類之源自人類或人類以外之哺乳動物(例如小鼠)者。關於IL-15、IL-18、IL-21及IL-27各者之融合蛋白中所包含之IL-15、IL-18、IL-21及IL-27以外之部位(例如IL-15Rα)，亦較佳為與本發明之T細胞之製作中所使用之T細胞相同之種類之源自人類或人類以外之哺乳動物者。於本發明之一態樣中，於由序列編號4：IL15_LSP _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)、序列編號6：_s IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)、序列編號8：_mb IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)、序列編號10：_sushi IL15_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#6)、序列編號12：IL-18_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#7)、序列編號14：IL-21_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#8)、序列編號16：_sc IL27_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#9)各者之鹼基序列表現之蛋白質(多肽)之胺基酸序列中，或者於序列編號5：包含IL15_LSP 之融合蛋白、序列編號7：包含_s IL15_RA 之融合蛋白、序列編號9：包含_mb IL15_RA 之融合蛋白、序列編號11：包含_sushi IL15之融合蛋白、序列編號13：包含IL-18之融合蛋白、序列編號15：包含IL-21之融合蛋白、序列編號17：包含_sc IL27之融合蛋白各者之胺基酸序列中，小鼠之天然IL-15、IL-18、IL-21或IL-27之胺基酸序列或IL-15Rα細胞外區、IL-15Rα全長或IL-15Rαsushi之胺基酸序列可置換為各人類之天然胺基酸序列。

(3)趨化因子本發明之T細胞所表現之趨化因子為CCL19。CCL19主要由淋巴結之樹狀細胞或巨噬細胞產生，具有經由作為其受體之CCR7，引起T細胞、B細胞及成熟樹狀細胞之移動之功能。本發明中之「CCL19」不僅包含由天然CCL19之胺基酸序列所構成之蛋白質(多肽)之全長，亦包含其一部分(功能性部分多肽)、或者對天然胺基酸序列(較佳為於具有如下所述之同源性之範圍內)缺失、置換或附加一個或複數個胺基酸序列而成之天然CCL19之全長或其一部分之變異體。

本發明之T細胞所表現之如上所述之趨化因子之胺基酸序列只要根據本發明之T細胞(CAR)之用途、典型地為作為用以治療癌之醫藥之有效成分之功能，考慮包括CAR-T細胞之持續性及增殖性之提昇之由CAR-T細胞所帶來之對抗腫瘤活性之增強之效果，採用適當者即可。源自人類及源自人類以外之哺乳動物(例如小鼠)之天然CCL19之胺基酸序列係公知，亦登記於NCBI、UniProt等資料庫，故而於本發明中亦可利用該資訊。又，於本發明中亦可利用作為CCL19之變異體所公知者之胺基酸序列之資訊。

作為CCL19之變異體，例如可列舉如下者：作為整體或作為部分區，具有相對於源自人類或人類以外之哺乳動物之天然CCL19之胺基酸序列為80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同源性之胺基酸序列。於本發明之一態樣中，於由序列編號4：IL15_LSP _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)、序列編號6：_s IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)、序列編號8：_mb IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)、序列編號10：_sushi IL15_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#6)、序列編號12：IL-18_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#7)、序列編號14：IL-21_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#8)、序列編號16：_sc IL27_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#9)各者之鹼基序列表現之蛋白質(多肽)之胺基酸序列中，小鼠之天然CCL19之胺基酸序列可置換為具有如上所述之同源性之變異體之胺基酸序列、或者實質上相當於此種變異體之人類之天然CCL19之胺基酸序列或其進一步之變異體。

CCL19較佳為與本發明之T細胞之製作中所使用之T細胞(該T細胞所具有之CCL19之受體)相同之種類之源自人類或人類以外之哺乳動物(例如小鼠)者或其變異體。

以下，對本發明之醫藥詳細地進行說明。

本發明之醫藥含有如上所述之本發明之T細胞，可視需要進而含有其他成分。業者可考慮用途(治療對象)或劑型，使用本發明之T細胞適當地製備本發明之醫藥。

本發明之醫藥主要為以對應於本發明之T細胞所表現之CAR作為靶之癌細胞之細胞表面抗原(癌特異性抗原)之癌作為治療對象的醫藥(抗癌劑)。因此，只要於癌組織內包含表現CAR作為靶之抗原之癌細胞，且藉由本發明之T細胞可見一定水準之治療效果，則本發明之醫藥設為對象之癌之種類並無特別限定。作為本發明之醫藥可設為對象之癌，例如可列舉：腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、皮膚癌(例如黑色素瘤、梅克爾細胞癌)、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、陰道癌、頸部癌、頭頸癌、子宮癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、脾臟癌、肺癌、非小細胞肺癌、氣管癌、支氣管癌、結腸癌、直腸癌、小腸癌、大腸癌、胃癌、食管癌、膽囊癌、睾丸癌、卵巢癌、輸卵管癌、鼻咽癌等癌；骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織及造血組織之癌；軟骨肉瘤、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤等肉瘤；肝母細胞瘤、神經管胚細胞瘤、腎母細胞瘤、神經胚細胞瘤、胰腺母細胞瘤、胸膜肺母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤等胚細胞瘤；生殖細胞瘤；淋巴瘤；白血病、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤。較佳為可列舉：對NK細胞有敏感性之癌(黑色素瘤、梅克爾細胞癌、大腸癌、腎癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、小腸癌、前列腺癌、膀胱癌、直腸癌、胰腺癌、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、膽道癌、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等)。更佳為可列舉：黑色素瘤、大腸癌、腎癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病。

作為本發明之醫藥可含有之T細胞以外之成分，例如可列舉藥學上所容許之添加劑，更具體而言，可列舉：生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、細胞潛伏期培養基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇、穩定劑、助溶劑、界面活性劑、緩衝劑、防腐劑、等張劑、填充劑、潤滑劑等。

本發明之醫藥可利用與表現公知之CAR之T細胞相同之方法，投予至必需癌之治療之對象(癌症患者、荷癌動物等)而使用。作為投予方法，例如可列舉於腫瘤內、靜脈內、動脈內、肌內、皮下、腹腔內等之注射。

本發明之醫藥中所包含之本發明之T細胞之量可根據用途、劑型及目標治療效果等，例如考慮癌之種類、位置、嚴重程度、接受治療之對象之年齡、體重及狀態等，適當地調節。例如本發明之醫藥可以於1次之投予中投予通常為1×10⁴ ～1×10¹⁰ 個、較佳為1×10⁵ ～1×10⁹ 個、更佳為5×10⁶ ～5×10⁸ 個本發明之T細胞之方式進行製劑化。

本發明之醫藥之投予間隔並無特別限定，可考慮每次投予之本發明之T細胞之量等而適當調整，例如可1天4次、3次、2次或1次、隔1天、隔2天、隔3天、隔4天、隔5天、一週1次、隔7天、隔8天、隔9天、一週2次、一個月1次或一個月2次獨立地投予。

本發明之醫藥(抗癌劑)可與公知之抗癌劑併用。作為抗癌劑，例如可列舉：環磷醯胺、苯達莫司汀、依弗醯胺、達卡巴嗪等烷化藥；噴司他丁、氟達拉濱、克拉屈濱、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶、6-巰嘌呤、依諾他濱等代謝拮抗劑；利妥昔單抗、西妥昔單抗、曲妥珠單抗等分子靶向藥；伊馬替尼、吉非替尼、埃羅替尼、阿法替尼、達沙替尼、舒尼替尼、曲美替尼等激酶抑制劑；硼替佐米等蛋白酶體抑制劑；環孢素、他克莫司等鈣調磷酸酶抑制藥；艾達黴素、多柔比星、絲裂黴素C等抗癌性抗生素；伊立替康、依託泊苷等植物鹼；順鉑、奧沙利鉑、卡鉑等鉑製劑；他莫昔芬、比卡魯胺等激素療法藥；干擾素、納武單抗、帕博利珠單抗等免疫控制藥。

於併用本發明之醫藥與其他抗癌劑之情形時，可為如下任一形態：(a)使用其他抗癌劑後使用本發明之醫藥；(b)同時使用本發明之醫藥與其他抗癌劑；(c)使用本發明之醫藥後使用其他抗癌劑。於併用本發明之醫藥與其他抗癌劑之情形時，癌之治療效果進一步提昇，並且藉由減少本發明之醫藥及/或其他抗癌劑各者之投予次數或投予量，期待可降低由各抗癌劑所引起之副作用。

以下，對本發明之表現載體詳細地進行說明。

本發明之表現載體包含(1)編碼CAR之核酸、(2)編碼選自由IL-15、IL-18、IL-21及IL-27所組成之群中之至少1種之核酸、以及(3)編碼CCL19之核酸。

於本發明中，表現載體「包含編碼IL-15之核酸」不僅包含編碼天然全長之IL-15蛋白質之核酸，亦包含採用如上所述之各種實施形態之IL-15。表現載體「包含編碼IL-18之核酸」、「包含編碼IL-21之核酸」、「包含編碼IL-27之核酸」、「包含編碼CCL19之核酸」亦相同。

「核酸」只要為核苷酸及具有與該核苷酸同等之功能之分子進行聚合而成之分子，則可為任意物質，例如可列舉：作為核糖核苷酸之聚合物之RNA、作為脫氧核糖核苷酸之聚合物之DNA、混合核糖核苷酸及脫氧核糖核苷酸而成之聚合物、及包含核苷酸類似物之核苷酸聚合物，進而，可為包含核酸衍生物之核苷酸聚合物。又，核酸亦可為單鏈核酸或雙鏈核酸。又，雙鏈核酸亦包含另一鏈於嚴格之條件下與一鏈雜交之雙鏈核酸。

作為核苷酸類似物，只要為與RNA或DNA相比，為了使核酸酶耐性提昇或穩定化，為了提高與互補鏈核酸之親和性，或者為了提高細胞透過性，或者為了使之可視化而對核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、RNA或DNA實施過修飾之分子，則可為任意物質。作為核苷酸類似物，可為天然存在之分子，亦可為非天然分子，例如可列舉糖部修飾核苷酸類似物或磷酸二酯鍵修飾核苷酸類似物等。

作為糖部修飾核苷酸類似物，只要為對核苷酸之糖之一部分或全部化學結構附加或置換任意之化學結構物質而成者，則可為任意物質，作為其具體例，可列舉：經2'-O-甲基核糖取代之核苷酸類似物、經2'-O-丙基核糖取代之核苷酸類似物、經2'-甲氧基乙氧基核糖取代之核苷酸類似物、經2'-O-甲氧基乙基核糖取代之核苷酸類似物、經2'-O-[2-(胍)乙基]核糖取代之核苷酸類似物、經2'-氟核糖取代之核苷酸類似物、藉由於糖部導入交聯結構而具有2個環狀結構之交聯結構型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)，更具體而言，可列舉：2'位之氧原子與4'位之碳原子經由亞甲基交聯而成之鎖人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、及乙烯交聯結構型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]，進而可列舉：肽核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)]、氧肽核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]及肽核糖核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等。

作為磷酸二酯鍵修飾核苷酸類似物，只要為對核苷酸之磷酸二酯鍵之一部分或全部化學結構附加或置換任意之化學物質而成者，則可為任意物質，作為其具體例，可列舉取代為硫代磷酸酯鍵之核苷酸類似物、取代為N3'-P5'亞磷醯胺鍵之核苷酸類似物等[細胞工程，16, 1463-1473 (1997)][RNAi法與反義法，講談公司(2005)]。

作為核酸衍生物，只要為與核酸相比，為了使核酸酶耐性提昇、穩定化，為了提高與互補鏈核酸之親和性，為了提高細胞透過性，或者使之可視化而對該核酸附加其他化學物質而成之分子，則可為任意物質，作為其具體例，可列舉：5'-聚胺加成衍生物、膽固醇加成衍生物、類固醇加成衍生物、膽汁酸加成衍生物、維生素加成衍生物、Cy5加成衍生物、Cy3加成衍生物、6-FAM加成衍生物及生物素加成衍生物等。

本發明之表現載體只要為與T細胞或其前驅物接觸而導入至細胞內，於T細胞中表現其所編碼之特定之蛋白質(多肽)，藉此可製作本發明之T細胞者即可，為何種實施形態並無特別限定。業者可設計可於T細胞中表現所需之蛋白質(多肽)之表現載體而製作。

本發明之表現載體可為直鏈狀，亦可為環狀，可為質體等非病毒載體，可為病毒載體，亦可為利用轉位子之載體。

作為病毒載體，例如可列舉：反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體。作為較佳之反轉錄病毒載體，例如可列舉pMSGV載體(Tamada k et al., ClinCancer Res 18: 6436-6445(2002))及pMSCV載體(TAKARA BIO公司製造)。於使用反轉錄病毒載體之情形時，該載體中所包含之基因被引入至主體細胞(於本發明中為T細胞)之基因組，故而可長時間穩定地表現基因。

於本發明之一實施形態中，1個表現載體包含(1)編碼CAR之核酸、(2)編碼選自由IL-15、IL-18、IL-21及IL-27所組成之群中之至少1種之核酸、以及(3)編碼CCL19之核酸之所有要素。於本發明之另一實施形態中，第1表現載體包含上述(1)～(3)中之1個或2個要素，第2表現載體包含剩餘之要素。於本發明之另一實施形態中，第1表現載體包含上述(1)，第2表現載體包含上述(2)，第3表現載體包含上述(3)。因此，本發明之表現載體有根據實施形態，意指複數種表現載體之組合(set)、即上述第1及第2表現載體之組合、或上述第1、第2及第3表現載體之組合之情形。於1個表現載體包含複數個要素之情形時，自上游側向下游側以何種順序配置該等要素並無特別限定。

本發明之表現載體所包含之特定之3個要素(CAR、細胞激素及趨化因子)之鹼基序列只要以根據選擇何種蛋白質(多肽)作為各要素，編碼該蛋白質(多肽)之胺基酸序列之方式設計即可。表現載體所包含之核酸(寡核苷酸)可藉由化學寡DNA合成反應而製作，亦可製作為cDNA(選殖)。

本發明之表現載體除編碼上述特定之要素之序列(基因)以外，亦可視需要(關於如上所述之複數種表現載體之組合，各表現載體獨立地)包含參與各基因之表現之啟動子、終止子、增強子、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苷酸化訊號、核定位訊號(NLS)、多選殖位點(MCS)等序列。

於本發明之一實施形態中，於1個表現載體包含上述3個要素中之2個以上之情形時，可於各要素之間插入編碼自剪切型肽(2A肽)或IRES(Internal Ribozyme Entry Site，內部核糖體進入位點)之基因。

2A肽係源自病毒之自剪切型肽，具有胺基酸序列中之特定之位置(自C末端起1個殘基之位置)經內質網剪切之特徵(Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5(5): 627-638(2005))。因此，經由2A肽引入至其前後之基因於細胞內相互獨立地表現。作為2A肽，例如可列舉源自小核糖核酸病毒、輪狀病毒、昆蟲病毒、口瘡病毒或錐體蟲病毒者。

本發明之表現載體亦可進而包含編碼報導基因(代表性地為編碼螢光蛋白質之基因)、藥劑選擇基因、自殺基因等「功能基因」之核酸(鹼基序列)。

於使用「抗藥性基因」作為功能基因之情形時，藉由於本發明之CAR-T細胞之製造方法中，將特定之藥劑添加至培養基中，可篩選導入有包含抗藥性基因之本發明之表現載體之細胞。作為抗藥性基因，例如可列舉：耐康黴素性基因、耐安比西林性基因、耐嘌呤黴素性基因。該等基因可使用任一種，亦可使用2種以上。

於使用「編碼螢光蛋白質之基因」作為功能基因之情形時，於本發明之CAR-T細胞之製造方法中，可使用螢光顯微鏡觀察導入有本發明之表現載體之T細胞，或者利用流式細胞儀(細胞分選儀)篩選導入有本發明之表現載體之細胞。作為報導基因之代表例，可列舉編碼螢光蛋白質之基因。作為「編碼螢光蛋白質之基因」，例如可列舉：Sirius、BFP、EBFP等藍色螢光蛋白質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP等青色螢光蛋白質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green(例如hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer等綠色螢光蛋白質；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana等黃色螢光蛋白質；KusabiraOrange(例如hmKO2)、mOrange等橙色螢光蛋白質；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry等紅色螢光蛋白質；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed(例如hdKeimaRed)、mRasberry、mPlum等近紅外螢光蛋白質。該等基因可使用任一種，亦可使用2種以上。於利用2種以上之編碼螢光蛋白質之基因之情形時，若使該螢光蛋白質之發光波長不同，則不妨礙相互之視認性，故而較佳。

於使用「自殺基因」作為功能基因之情形時，藉由根據癌之治療經過，例如於腫瘤消失之階段投予使自殺基因之功能活化之藥劑，可控制生物內之本發明之T細胞之數量。作為自殺基因，例如可列舉編碼如下物質之基因：白喉毒素A、單純疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、羧肽酶G2(CPG2)、脫羧糖酯酶(CA)、胞嘧啶脫胺酶(CD)、細胞色素P450(cyt-450)、脫氧胞嘧啶核苷激酶(dCK)、硝基還原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘帶狀疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(XGPRT)、或誘導性半胱天冬酶9(inducible caspase 9)。該等基因可使用任一種，亦可使用2種以上。使各自殺基因之功能活化之藥劑係公知，例如對單純疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)可列舉更昔洛韋，對誘導性半胱天冬酶9(inducible caspase 9)可列舉作為二聚物衍生化合物之AP1903。

以下，對本發明之CAR-T細胞之製造方法詳細地進行說明。本發明之CAR-T細胞之製造方法包括將如上所述之本發明之表現載體導入至T細胞之步驟(以下，稱為「表現載體導入步驟」)。

用以將表現載體導入至T細胞之方法可採用與表現載體之實施形態對應之適當者。例如可利用病毒感染法、磷酸鈣法、脂轉染法、顯微注射法、電穿孔法等公知之方法，將表現載體導入至T細胞。本發明之表現載體可利用公知之方法，又，適當使用市售之套組(按照其指示書)，製備為適於各方法中之用途之形態。於表現載體導入步驟中，只要使此種製備物與T細胞接觸，一般於添加有包含表現載體之製備物之培養基中培養T細胞即可。

於本發明之較佳之一實施形態中，本發明之表現載體利用病毒感染法導入至T細胞。例如可列舉如下方法：使用與反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體各病毒載體對應之市售之套組，將本發明之載體及各病毒之包裝載體(質體)轉染至宿主細胞而製作重組病毒後，使T細胞感染所獲得之重組病毒。作為市售之病毒載體用套組，例如可列舉反轉錄病毒包裝套組(Retrovirus packaging Kit)Eco(TAKARA BIO公司製造)。作為宿主細胞，例如可列舉：GP2-293細胞(TAKARA BIO公司製造)、Plat-GP細胞(Cosmo Bio公司製造)、PG13細胞(ATCC CRL-10686)、PA317細胞(ATCC CRL-9078)等。

於本發明之CAR-T細胞之製造方法中，亦可於表現載體導入步驟之前後進而包括其他步驟。作為其他步驟，例如可列舉：T細胞之培養步驟；或包括使表現載體中所包含之功能基因發揮作用之處理之步驟。

成為導入本發明之表現載體之對象之T細胞通常可於活體外之環境下，利用公知之方法預先培養。例如可自自人類或非人類動物採取之血液、骨髓液等體液；脾臟、胸腺、淋巴結等組織；或原發腫瘤、轉移性腫瘤、癌性腹水等癌組織，按照常規方法單離、純化T細胞後，於適當之培養基中培養T細胞，於該培養基中添加(含有)本發明之表現載體(之製備物)。或者亦可預先自iPS細胞、ES細胞、其他多能性幹細胞，經過適當之分化誘導步驟而製作T細胞(或其前驅物)，於該培養基中添加(含有)本發明之表現載體(之製備物)。

又，於本發明之表現載體包含抗藥性基因作為功能基因之情形時，為了篩選導入有該表現載體之T細胞，可於表現載體導入步驟後，進行將與所使用之抗藥性基因對應之藥劑添加至培養基中而培養T細胞之步驟。業者可適當地調整與抗藥性基因對應之藥劑之使用條件、例如培養基中之濃度或培養時間等。

於本發明之表現載體包含編碼螢光蛋白質之基因(報導基因)作為功能基因之情形時，可於表現載體導入步驟後，進行利用螢光顯微鏡觀察導入有表現載體之T細胞之步驟、或利用細胞分選儀篩選導入有表現載體之T細胞之步驟。業者可適當地調整利用螢光顯微鏡之觀察或利用細胞分選儀之篩選時之條件、例如與螢光蛋白質對應之激發波長之光之照射或發光波長之光之檢測等。 [實施例]

以下之實施例中之CAR係以人類CD20作為靶之CAR，具體而言，為由抗人類CD20scFv、小鼠CD8跨膜區及小鼠CD28_4-1BB_CD3ζ細胞內訊號模體所構成之抗人類CD20CAR。又，以下之實施例中之細胞激素係包含小鼠IL-15(「IL15_LSP 」、「_s IL15_RA 」、「_mb IL15_RA 」或「_sushi IL15」)；小鼠IL-18；小鼠IL-21；小鼠IL-27(p28及EBI3)之單鏈蛋白質「_sc IL27」之任一種。以下之實施例中之趨化因子為小鼠CCL19。以如下方式製作表現該等CAR、細胞激素及趨化因子之源自小鼠之T細胞後，進行試驗。

[表1]

[實施例1-1]IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞於載體製作步驟中，首先藉由步驟1人工合成3種DNA片段(DNA片段1～3)，其後，藉由步驟2，使用上述3種DNA片段，製作包含編碼特定之CAR、細胞激素及趨化因子之基因之全部之1個表現載體。繼而，於CAR-T細胞製造步驟中，首先藉由步驟1，使用上述表現載體製備反轉錄病毒載體，其後，藉由步驟2，使用該反轉錄病毒載體製備物將上述特定之基因轉導至小鼠T細胞。

[A：載體製作步驟]IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體之製作步驟1：DNA片段之合成 DNA片段#1：包含抗人類CD20 CAR之DNA片段人工合成包含編碼由抗人類CD20scFv、小鼠CD8跨區及小鼠CD28_4-1BB_CD3ζ細胞內訊號模體所構成之抗人類CD20 CAR之鹼基序列的DNA片段(DNA片段#1)。將DNA片段#1整體之鹼基序列示於序列編號1(圖7)。於序列編號1中，第3～785個鹼基係編碼抗人類CD20scFv之序列，第795～1040個鹼基係編碼小鼠CD8跨膜區之序列，第1041～1637個鹼基係編碼小鼠CD28_4-1BB_CD3ζ細胞內訊號模體之序列(其中第1041～1163個鹼基編碼小鼠CD28之細胞內區，第1164～1298個鹼基編碼小鼠4-1BB之細胞內區，第1299～1637個鹼基編碼小鼠CD3ζ之細胞內區之多肽)。將由DNA片段#1之第3～1637個鹼基序列表現之融合蛋白之胺基酸序列示於序列編號2。

DNA片段#2：包含終止密碼子及多選殖位點之DNA片段人工合成包含終止密碼子之鹼基序列及多選殖位點(MCS)之鹼基序列的DNA片段(DNA片段#2)。將DNA片段#2整體之鹼基序列示於序列編號3(圖8)。

DNA片段#3：IL15_LSP 及CCL19用DNA片段人工合成包含編碼作為自剪切型肽之2A肽(F2A)、小鼠IL-2訊息肽(IL-2SP)、小鼠IL-15構建物「IL15_LSP 」(由IL-15LSP及IL-15所構成之融合肽)、F2A以及小鼠CCL19之鹼基序列的DNA片段(DNA片段#3)。將DNA片段#3整體之鹼基序列示於序列編號4(圖9)。於序列編號4中，第7～81個鹼基係編碼第1 F2A之序列，第82～168個鹼基係編碼小鼠IL-15_LSP 之序列，第169～567個鹼基係編碼小鼠IL-15(終止密碼子除外)之序列，第568～642個鹼基係編碼第2 F2A之序列，第646～969個鹼基係編碼小鼠CCL19之序列。將由DNA片段#3之第7～969個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含IL15_LSP 之融合蛋白整體之胺基酸序列示於序列編號5。

步驟2：反轉錄病毒表現載體之製作將DNA片段#1與DNA片段#2連結而製作構建物(抗人類CD20 CAR_MCS)。藉由限制酶(Nco I及Sal I)處理將所獲得之構建物引入至pMSGV反轉錄病毒表現載體(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445(2002))，製作含有抗人類CD20 CAR_MCS之pMSGV反轉錄病毒表現載體。

其次，製作將DNA片段#1之第1337～1637個鹼基序列與DNA片段#3連結之構建物。藉由限制酶(Sbf I及Sal I)處理將所獲得之構建物引入至含有抗人類CD20 CAR_MCS之pMSGV反轉錄病毒載體，製作含有抗人類CD20 CAR_F2A_IL15_LSP _F2A_CCL19之pMSGV反轉錄病毒表現載體(IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體)。

[B：CAR-T細胞製造步驟]IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞之製造步驟1：反轉錄病毒之製備使用脂染胺3000(Thermo Fisher Scientific公司)，將藉由上述載體製作步驟所獲得之IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體與pCL-Eco質體(Novus biologicals公司)一起轉染至GP2-293包裝細胞株(TAKARA BIO公司)。再者，作為GP2-293包裝細胞株之培養液，使用加入有10%之滅活過之FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)及抗生素之DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，達爾伯克改良伊格爾培養基)。於自轉染起48小時後，回收GP2-293包裝細胞株之培養液之上清液，獲得IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體製備物。

步驟2：小鼠T細胞之轉導於固相化之抗小鼠CD3單株抗體(3 μg/mL)、抗小鼠CD28單株抗體(1 μg/mL)及IL-2之存在下，將源自小鼠之脾臟及淋巴結之3×10⁶ 個經純化之小鼠T細胞活化48小時。繼而，於將25 μg/mL之RetroNectin(註冊商標：TAKARA BIO公司)固相化而成之平板之孔內，將步驟1中所獲得之含有IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體之製備物(GP2-293細胞培養液上清液)與如上所述活化之小鼠T細胞進行混合，以1500 rpm離心2小時後，於IL-2之存在下培養6小時。為了自培養液去除反轉錄病毒，而回收小鼠T細胞，轉移至含有IL-2之新RPMI完全培養基中，進而培養42小時，藉此獲得導入有IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體、即表現抗人類CD20 CAR、IL15_LSP 及CCL19之小鼠T細胞(IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞，於本說明書中，稱為「IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞」)。

再者，上述T細胞之培養中所使用之「RPMI完全培養基」係加入有滅活過之10%FBS、抗生素、50 mM之2-巰基乙醇、25 mM之HEPES緩衝液之RPMI-1640培養基。以下，作為T細胞之培養液，使用視需要進而添加另外記載之成分之RPMI完全培養基。

[實施例1-2]_s IL15_RA (分泌型IL-15/IL-15RA融合蛋白)×CCL19 CAR-T細胞 [A：載體製作步驟]_s IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體之製作使用與實施例1-1之步驟1相同之DNA片段#1及DNA片段#2，且使用如下所述之DNA片段#4代替DNA片段#3，與實施例1-1之步驟2同樣地製作構建物後，獲得含有抗人類CD20 CAR_F2A__s IL15_RA _F2A_CCL19之pMSGV反轉錄病毒表現載體(_s IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體)。

DNA片段#4：_s IL15_RA 及CCL19用DNA片段合成包含編碼F2A、小鼠IL-2SP、小鼠IL-15構建物「_s IL15_RA 」(由IL-15、連接子及IL-15Rα細胞外區所構成之融合肽)、F2A以及小鼠CCL19之鹼基序列的DNA片段(DNA片段#4)。將DNA片段#4整體之鹼基序列示於序列編號6(圖10)。於序列編號6中，第7～81個鹼基係編碼第1 F2A之序列，第82～141個鹼基係編碼小鼠IL-2SP之序列，第142～1137個鹼基係編碼_s IL15_RA 之序列(其中第142～540個鹼基編碼小鼠IL-15(訊號序列及終止密碼子除外)，第541～618個鹼基為連接子，第619～1137個鹼基編碼小鼠IL-15Rα細胞外區)，第1138～1212個鹼基係編碼第2 F2A之序列，第1216～1539個鹼基係編碼小鼠CCL19之序列。將由DNA片段#4之第7～1539個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含_s IL15_RA 之融合蛋白整體之胺基酸序列示於序列編號7。

[B：CAR-T細胞製造步驟]_s IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞之製造使用藉由上述載體製作步驟所獲得之_s IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體作為反轉錄病毒表現載體，以代替IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體，除此以外，與實施例1-1之CAR-T細胞製造步驟同樣地，於步驟1中獲得含有反轉錄病毒之製備物，於步驟2中獲得表現該反轉錄病毒中所包含之抗人類CD20 CAR、_s IL15_RA 及CCL19各基因之小鼠T細胞(_s IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞，於本說明書中，稱為_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞)。

[實施例1-3]_mb IL15_RA (膜結合型IL-15/IL-15RA融合蛋白)×CCL19 CAR-T細胞 [A：載體製作步驟]_mb IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體之製作使用與實施例1-1之步驟1相同之DNA片段#1及DNA片段#2，且使用如下所述之DNA片段#5代替DNA片段#3，與實施例1-1之步驟2同樣地製作構建物後，獲得含有抗人類CD20 CAR_F2A__mb IL15_RA _F2A_CCL19之pMSGV反轉錄病毒表現載體(_mb IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體)。

DNA片段#5：_mb IL15_RA 及CCL19用DNA片段合成包含編碼F2A、小鼠IL-2SP、小鼠IL-15之構建物「_mb IL15_RA 」(由IL-15、連接子及全長之IL-15Rα所構成之融合肽)、F2A以及小鼠CCL19之鹼基序列的DNA片段。將該DNA片段#5整體之鹼基序列示於序列編號8(圖11)。於序列編號8中，第7～81個鹼基係編碼第1 F2A之序列，第82～141個鹼基係編碼小鼠IL-2SP之序列，第142～1311個鹼基係編碼_mb IL15_RA 之序列(其中第142～540個鹼基編碼小鼠IL-15(訊號序列及終止密碼子除外)，第541～618個鹼基為連接子，第619～1311個鹼基編碼小鼠IL-15Rα(全長))，第1312～1386個鹼基係編碼第2 F2A之序列，第1390～1713個鹼基係編碼小鼠CCL19之序列。將由DNA片段#5之第7～1713個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含_mb IL15_RA 之融合蛋白整體之胺基酸序列示於序列編號9。

[B：CAR-T細胞製造步驟]_mb IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞之製造使用藉由上述載體製作步驟所獲得之_mb IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體作為反轉錄病毒表現載體，以代替IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體，除此以外，與實施例1-1之CAR-T細胞製造步驟同樣地，於步驟1中獲得含有反轉錄病毒之製備物，於步驟2中製造表現該反轉錄病毒中所包含之抗人類CD20 CAR、_mb IL15_RA 及CCL19各基因之小鼠T細胞(_mb IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞，於本說明書中，稱為「_mb IL15×CCL19 CAR-T細胞」)。

[實施例1-4]_sushi IL15(分泌型IL-15RA/IL-15融合蛋白)×CCL19 CAR-T細胞 [A：載體製作步驟]_sushi IL15_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體之製作使用與實施例1-1之步驟1相同之DNA片段1及DNA片段2，且使用如下所述之DNA片段#6代替DNA片段#3，與實施例1-1之步驟2同樣地製作構建物後，獲得含有抗人類CD20 CAR_F2A__sushi IL15_F2A_CCL19之pMSGV反轉錄病毒表現載體(_sushi IL15_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體)。

DNA片段#6：_sushi IL15及CCL19用DNA片段合成包含編碼F2A、小鼠IL-15構建物「_sushi IL15」(由IL-15Rα之sushi區、連接子及IL-15所構成之融合肽)、F2A以及小鼠CCL19之鹼基序列的DNA片段。將該DNA片段#6整體之鹼基序列示於序列編號10(圖12)。於序列編號10中，第7～81個鹼基係編碼第1 F2A之序列，第82～777個鹼基係編碼_sushi IL15之序列(其中第82～375個鹼基編碼小鼠IL-15Rα之SP及sushi區，第376～435個鹼基為連接子，第436～777個鹼基編碼小鼠IL-15(訊號序列及前肽除外))，第778～852個鹼基係編碼第2 F2A之序列，第856～1179個鹼基係編碼小鼠CCL19之序列。將由DNA片段#6之第7～1179個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含_sushi IL15之融合蛋白整體之胺基酸序列示於序列編號11。

[B：CAR-T細胞製造步驟]_sushi IL15_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞之製造使用藉由上述載體製作步驟所獲得之_sushi IL15_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體作為反轉錄病毒表現載體，以代替IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體，除此以外，與實施例1-1之CAR-T細胞製造步驟同樣地，於步驟1中獲得含有反轉錄病毒之製備物，於步驟2中獲得表現該反轉錄病毒中所包含之抗人類CD20 CAR、_sushi IL15及CCL19各基因之小鼠T細胞(_sushi IL15_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞，於本說明書中，稱為「_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞」)。

[實施例2]IL-18×CCL19 CAR-T細胞 [A：載體製作步驟]IL18_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體之製作使用與實施例1-1之步驟1相同之DNA片段1及DNA片段2，且使用如下所述之DNA片段#7代替DNA片段#3，與實施例1-1之步驟2同樣地製作構建物後，獲得含有抗人類CD20 CAR_F2A_IL-18_F2A_CCL19之pMSGV反轉錄病毒表現載體(IL18_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體)。

DNA片段#7：IL-18及CCL19用DNA片段人工合成包含編碼第1 F2A、小鼠IL-18、第2 F2A及小鼠CCL19之鹼基序列的DNA片段。將該DNA片段#7整體之鹼基序列示於序列編號12(圖13)。於序列編號12中，第7～81個鹼基係編碼第1 F2A之序列，第82～657個鹼基係編碼小鼠IL-18之序列，第658～732個鹼基係編碼第2 F2A之序列，第736～1059個鹼基係編碼小鼠CCL19之序列。將由DNA片段#7之第7～1059個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之融合蛋白整體之胺基酸序列示於序列編號13。

[B：CAR-T細胞製造步驟]IL18_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞之製造使用藉由上述載體製作步驟所獲得之IL18_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體作為反轉錄病毒表現載體，以代替IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體，除此以外，與實施例1-1之CAR-T細胞製造步驟同樣地，於步驟1中獲得含有反轉錄病毒之製備物，於步驟2中獲得表現該反轉錄病毒中所包含之抗人類CD20 CAR、IL-18及CCL19各基因之小鼠T細胞(IL18_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞，於本說明書中，稱為「IL18×CCL19 CAR-T細胞」)。

[實施例3]IL-21×CCL19 CAR-T細胞 [A：載體製作步驟]IL21_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體之製作使用與實施例1-1之步驟1相同之DNA片段1及DNA片段2，且使用如下所述之DNA片段#8代替DNA片段#3，與實施例1-1之步驟2同樣地製作構建物後，獲得含有抗人類CD20 CAR_F2A_IL-21_F2A_CCL19之pMSGV反轉錄病毒表現載體(IL21_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體)。

DNA片段#8：IL-21及CCL19用DNA片段人工合成包含編碼第1 F2A、小鼠IL-21、第2 F2A及小鼠CCL19之鹼基序列的DNA片段。將該DNA片段#8整體之鹼基序列示於序列編號14(圖14)。於序列編號14中，第7～81個鹼基係編碼第1 F2A之序列，第82～567個鹼基係編碼小鼠IL-21之序列，第568～642個鹼基係編碼第2 F2A之序列，第646～969個鹼基係編碼小鼠CCL19之序列。將由DNA片段#8之第7～969個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之融合蛋白整體之胺基酸序列示於序列編號15。

[B：CAR-T細胞製造步驟]IL21_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞之製造使用藉由上述載體製作步驟所獲得之IL21_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體作為反轉錄病毒表現載體，以代替IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體，除此以外，與實施例1-1之CAR-T細胞製造步驟同樣地，於步驟1中獲得含有反轉錄病毒之製備物，於步驟2中獲得表現該反轉錄病毒中所包含之抗人類CD20 CAR、IL-21及CCL19各基因之小鼠T細胞(IL21_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞，於本說明書中，稱為「IL21×CCL19 CAR-T細胞」)。

[實施例4]_sc IL27×CCL19 CAR-T細胞 [A：載體製作步驟]_sc IL27_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體之製作使用與實施例1-1之步驟1相同之DNA片段1及DNA片段2，且使用如下所述之DNA片段#9代替DNA片段#3，與實施例1-1之步驟2同樣地製作構建物後，獲得含有抗人類CD20 CAR_F2A_scIL-27_F2A_CCL19之pMSGV反轉錄病毒表現載體(_sc IL27_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體)。

DNA片段#9：_sc IL27及CCL19用DNA片段人工合成包含編碼第1 F2A、小鼠IL-27構建物「scIL27」(由p28、連接子及EBI3所構成之融合肽)、第2 F2A以及CCL19之鹼基序列的DNA片段。將該DNA片段#9整體之鹼基序列示於序列編號16(圖15)。於序列編號16中，第7～81個鹼基係編碼第1 F2A之序列，第82～1437個鹼基係編碼_sc IL27之序列(其中第82～765個鹼基編碼小鼠EBI3，第766～819個鹼基為連接子，第820～1437個鹼基編碼小鼠p28)，第1438～1512個鹼基係編碼第2 F2A之序列，第1516～1839個鹼基係編碼小鼠CCL19之序列。將由DNA片段#9之第7～1839個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含_sc IL27之融合蛋白整體之胺基酸序列示於序列編號17。

[B：CAR-T細胞製造步驟]_sc IL27_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞之製造步驟使用藉由上述載體製作步驟所獲得之_sc IL27_CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體作為反轉錄病毒表現載體，以代替IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體，除此以外，與實施例1-1之CAR-T細胞製造步驟同樣地，於步驟1中獲得含有反轉錄病毒之製備物，於步驟2中獲得表現該反轉錄病毒中所包含之抗人類CD20 CAR、scIL27及CCL19各基因之小鼠T細胞(_sc IL27_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞，於本說明書中，稱為「_sc IL27×CCL19 CAR-T細胞」)。

[比較例1]轉導(-)T細胞不進行反轉錄病毒載體之製作及使用其之向T細胞之轉染，於實施例1-1之步驟B步驟2中，加入等量之用於GP2-293細胞培養之DMEM培養基以代替使用IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體製備物，除此以外，以相同之順序製造僅進行活化之小鼠T細胞(於本說明書中，稱為「轉導(-)T細胞」)。

[比較例2]conv. CAR-T細胞 [A：載體製作步驟]抗人類CD20 CAR表現載體之製作以與實施例1-1之步驟A步驟2之中途為止相同之順序，使用DNA片段1、DNA片段2及pMSGV反轉錄病毒載體，製作含有抗人類CD20 CAR_MCS之pMSGV反轉錄病毒表現載體。使用其作為不共表現細胞激素及趨化因子之對照用反轉錄病毒表現載體(抗人類CD20 CAR表現載體)。

[B：CAR-T細胞製造步驟]抗人類CD20 CAR-T細胞之製造使用抗人類CD20 CAR表現載體作為反轉錄病毒表現載體，以代替IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR表現載體，除此以外，與實施例1-1之CAR-T細胞製造步驟同樣地，於步驟1中獲得含有反轉錄病毒之製備物，於步驟2中獲得僅表現該反轉錄病毒中所包含之抗人類CD20 CAR(不表現細胞激素及趨化因子)之小鼠T細胞(抗人類CD20 CAR-T細胞，於本說明書中，稱為「conv. CAR-T細胞」)。

[試驗例1]所導入之CAR、細胞激素及趨化因子之表現水準之確認 [A：利用流式細胞儀之CAR之表現測定] 使用上述實施例及比較例中所製造之T細胞，利用如下所述之流式細胞儀分析細胞表面之抗人類CD20 CAR之表現水準。

再者，流式細胞儀使用流式細胞儀「BD FACSCanto^TM II」(BD Biosciences公司)，資料分析使用FlowJo software(BD Biosciences公司)。

使用經生物素標記之蛋白質L(與抗人類CD20scFv之κ輕鏈特異性地結合)及Brilliant Violet^TM 421(BV421)結合抗生蛋白鏈菌素，對各T細胞進行處理，檢測CAR之表現。同時，使用別藻藍蛋白(APC)結合抗小鼠CD8單株抗體(BioLegend公司)，測定各T細胞群中之CD8陽性率。認為一般CD8陽性T細胞具有直接細胞毒殺活性，故而藉由表現CD8陽性T細胞之存在(陽性率)，可作為效能(potency)之支持。

將結果示於圖1。確認關於所有實施例(及比較例2)之CAR-T細胞，於細胞群中之60%以上之細胞中表現抗人類CD20 CAR(為陽性)。

[B：細胞激素及趨化因子之分泌量之測定] 回收自轉導起42小時後之各T細胞之培養上清液，使用市售之ELISA套組(僅IL-18使用MBL公司製造者，其以外使用R＆D systems公司製造者)測定IL-15、IL-18、IL-21、IL-27及CCL19之濃度。

將結果示於圖2。關於IL-15 (圖2A)，自實施例1-1之CAR-T細胞(15LSP×19 CAR-T)之培養上清液，以250 pg/mL之濃度檢測出IL-15。另一方面，實施例1-2(s15RA×19 CAR-T)、實施例1-3(mb15RA×19 CAR-T)及實施例1-4(sushi15×19 CAR-T)之CAR-T細胞之培養上清液中之IL-15之濃度係與未轉導之活化T細胞(轉導(-)：比較例1)及對照抗人類CD20 CAR表現T細胞(conv. CAR-T：比較例2)相同程度，於試驗例1中所使用之上述ELISA套組中未見IL-15之分泌。但是，於下述試驗例2中，實施例1-2、實施例1-3及實施例1-4表現出明顯之細胞增殖效果，故而可解釋為於該等實施例中亦與實施例1-1同樣地表現、分泌IL-15。

關於IL-18(圖2B)，自實施例2之CAR-T細胞(18×19 CAR-T)之培養上清液，以150 pg/mL以上之濃度檢測出IL-18。另一方面，自對照抗人類CD20 CAR表現T細胞(conv. CAR-T：比較例2)向培養上清液中之分泌量係與未轉導之活化T細胞(轉導(-)：比較例1)相同程度之微量。

關於IL-21(圖2C)，自實施例3之CAR-T細胞(21×19 CAR-T)之培養上清液，以400 pg/mL以上之濃度檢測出IL-18。另一方面，自對照抗人類CD20 CAR表現T細胞(conv. CAR-T：比較例2)之分泌量與未轉導之活化T細胞(轉導(-)：比較例1)均為檢測極限以下(Not Detected)。

關於IL-27(圖2D)，自實施例4之CAR-T細胞(sc27×19 CAR-T)之培養上清液，以250 pg/mL以上之濃度檢測出作為IL-27之次單元之p28。另一方面，自對照抗人類CD20 CAR-T細胞(conv. CAR-T：比較例2)之分泌量係與未轉導之活化T細胞(轉導(-)：比較例1)相同程度(培養上清液中之濃度50 pg/mL左右)。

關於CCL19(圖2E)，對照抗人類CD20 CAR-T細胞(conv. CAR-T：比較例2)及未轉導之活化T細胞(轉導(-)：比較例1)之培養上清液中之濃度為檢測極限以下，相對於此，各實施例之CAR-T細胞之培養上清液中之濃度為150～500 pg/mL。

[試驗例2]CAR-T細胞之活體外增殖能力之評價使用上述實施例及比較例中所製造之T細胞，以如下方式測定CAR-T細胞之細胞數及增殖能力，藉此研究自各T細胞所產生之細胞激素(IL-15、IL-18、IL-21及IL-27)是否發揮生物功能而表現免疫誘導效果。

將各T細胞利用CytoTell^TM UltraGreen(AAT Bioquest公司)染色後，於與經絲裂黴素C處理之以表現人類CD20之方式進行基因重組之P815肥大細胞瘤(hCD20/P815)相同之孔內進行共培養，進行刺激。於自刺激開始起培養3天、5天或7天後，回收細胞，進行流式細胞儀分析。利用APC結合抗Thy1.2單株抗體(eBioscience公司)進行染色，將各T細胞(淋巴細胞)群中之Thy1.2陽性細胞視為存活之T細胞，測定細胞數。

將結果示於圖3。轉導(-)T細胞(比較例1)即便與hCD20/P815細胞共培養，亦不發生活化刺激，活細胞數於培養第3天成為1/10以下。另一方面，與hCD20/P815細胞共培養之IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-1)、_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-2)、_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-3)、_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T細胞(實施例2)、IL-21×CCL19 CAR-T細胞(實施例3)及scIL27×CCL19 CAR-T細胞(實施例4)均於培養第3天，確認到與作為對照之conv. CAR-T細胞(比較例2)同等或同等以上之活細胞數之增殖維持。進而，若持續培養至7天，則尤其是_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-2)、_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-3)、_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-4)表現出明顯之細胞增殖。IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-1)、IL-18×CCL19 CAR-T細胞(實施例2)、IL-21×CCL19 CAR-T細胞(實施例3)及scIL27×CCL19 CAR-T細胞(實施例4)係於培養第3天至第7天維持與作為對照之conv. CAR-T細胞(比較例2)同等之細胞數。

同時，進行Thy1.2陽性細胞群中之利用CytoTell試劑之染色強度之柱狀圖分析。將刺激開始5天後之細胞群之結果示於圖4。IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-1)、_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-2)、_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-3)、_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T細胞(實施例2)及IL-21×CCL19 CAR-T細胞(實施例3)與作為對照之conv. CAR-T細胞(比較例2)相比，第二代(分裂1次後)之細胞群之比率尤其減少，又，第五代以後(4次以上之分裂後)之細胞群之比率增加。

根據圖3及圖4之結果，可知尤其是_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-2)、_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-3)及_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-4)中所產生之IL-15/IL-15Rα融合蛋白及CCL-19之組合就提高CAR-T細胞之存活及增殖且發揮生物功能之方面而言較佳。

[試驗例3]CAR-T細胞之腫瘤細胞毒殺活性之評價使用上述實施例及比較例中所製造之T細胞，研究靶抗原特異性腫瘤細胞毒殺活性。

[A：利用流式細胞儀之腫瘤細胞毒殺活性之測定] 將以表現人類CD20之方式進行基因重組之P815肥大細胞瘤(hCD20/P815)作為靶腫瘤細胞，使用未進行此種基因重組之P815肥大細胞瘤(P815)作為對照腫瘤細胞。

採取上述靶腫瘤細胞或對照腫瘤細胞，接種於培養板後，作為效應T細胞，加入各實施例之CAR-T細胞(IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-1)、_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-2)、_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-3)、_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T細胞(實施例2)、IL-21×CCL19 CAR-T細胞(實施例3)及scIL27×CCL19 CAR-T細胞(實施例4))或比較例2之CAR-T細胞(conv. CAR-T細胞)，進行72小時共培養。以CAR陽性細胞數成為靶腫瘤細胞之1/3量之方式加入效應T細胞(E：T比＝1：3)，配合CAR表現率最低之T細胞之接種數，於其他T細胞群添加未轉導之T細胞，藉此使接種之總T細胞數於各群為相同數量。於共培養72小時後，回收所有細胞，進行流式細胞儀分析及活細胞數之測定。利用APC結合抗Thy1.2單株抗體(eBioscience公司)及Zombie Green Fixable Viability Kit(BioLegend公司)進行染色，根據Thy1.2陽性率算出活細胞群中之T細胞及腫瘤細胞之比率。活細胞數係使用NucleoCounter NC-200(chemometec公司)進行測定。

將結果示於圖5。如圖5A所示，根據活細胞中之Thy1.2陰性率算出共培養72小時後之hCD20/P815腫瘤細胞數，結果與IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-1)、_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-2)、_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-3)、_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T細胞(實施例2)、IL-21×CCL19 CAR-T細胞(實施例3)或scIL27×CCL19 CAR-T細胞(實施例4)共培養之hCD20/P815腫瘤細胞數均與轉導(-)T細胞(比較例1)相比明顯減少，與conv. CAR-T細胞(比較例2)相比亦進一步減少，存活之腫瘤細胞為1%以下。另一方面，如圖5B所示，關於未表現人類CD20之P815細胞，於任一群中均未見腫瘤細胞之減少，未確認到對未表現人類CD20之腫瘤細胞之非特異性細胞毒殺。

[B：藉由ELISA分析之IFNγ產生測定] 作為靶抗原特異性細胞毒殺能力之活化之指標，利用市售之ELISA分析套組(R&D公司)測定自CAR-T細胞所產生之干擾素γ(IFNγ)。測定與上述P815細胞(對照腫瘤細胞)或hCD20-P815細胞(靶腫瘤細胞)共培養之各實施例之CAR-T細胞(IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-1)、_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-2)、_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-3)、_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T細胞(實施例2)、IL-21×CCL19 CAR-T細胞(實施例3)及scIL27×CCL19 CAR-T細胞(實施例4))或比較例2之CAR-T細胞(conv. CAR-T細胞)共培養4天後之培養上清液中之IFNγ之量。

將結果示於圖6。如圖6A所示，於與hCD20-P815細胞共培養之IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-1)、_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-2)、_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-3)、_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞(實施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T細胞(實施例2)、IL-21×CCL19 CAR-T細胞(實施例3)或scIL27×CCL19 CAR-T細胞(實施例4)之任一培養上清液中，均高於conv. CAR-T細胞(比較例2)，檢測出約15 ng/mL以上之IFNγ。與轉導(-)T細胞(比較例1)共培養之群中之IFNγ產生量係檢測極限以下。另一方面，如圖6B所示，與P815細胞共培養之各CAR表現細胞培養上清液中之IFNγ之濃度係10 pg/mL以下。

根據以上之試驗例3(圖5及圖6)之結果，確認上述各實施例及比較例2之T細胞均表現出對人類CD20表現細胞、即靶抗原特異性之細胞毒殺活性。

[試驗例4]小鼠腫瘤模型中之治療效果使用上述實施例1-3及實施例1-4、比較例2中所製造之T細胞，使用如下所述之荷癌小鼠研究對小鼠黑色素瘤腫瘤移植模型或小鼠大腸癌腫瘤模型之治療效果。

(小鼠黑色素瘤腫瘤移植模型中之治療效果) 將5×10⁵ 個以表現人類CD20之方式進行基因重組之小鼠黑色素瘤B16F10(B16F10-hCD20)接種於C57BL/6N小鼠之皮下。於接種後第7天將作為抗癌劑之環磷醯胺(CPA、50 mg/kg)投予至腹腔內，於第10天將1×10⁶ 個實施例1-3之CAR-T細胞(_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T)、或實施例1-4之CAR-T細胞(_sushi IL15×CCL19 CAR-T)、或比較例2(Conv. CAR-T)投予至靜脈內。作為對照群，設定僅進行CPA投予之CAR-T未治療群、接種B16F10-hCD20小鼠黑色素瘤後未處理之非治療群。小鼠之腫瘤體積係1週測定2次。

將小鼠黑色素瘤腫瘤移植模型之腫瘤體積之結果示於圖16。橫軸係將對小鼠皮下接種B16F10-hCD20之天設為0天之接種後之天數，縱軸係腫瘤體積(腫瘤之長徑×(腫瘤之短徑)² /2(mm³ ))。標準偏差係於各實驗群中算出。「no treatment」係未處理之群，「CPA」係僅投予CPA之群，「CPA＋Conv.」係投予CPA後投予比較例2(Conv. CAR-T)之群，「CPA＋_mb IL15_RA ×19」係投予CPA後投予實施例1-3之CAR-T細胞(_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T)之群，「CPA＋_sushi IL15_RA ×19」係投予CPA後投予實施例1-4之CAR-T細胞(_sushi IL15×CCL19 CAR-T)之群。

如圖16所示，於投予實施例1-3之CAR-T細胞(_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T)及實施例1-4之CAR-T細胞(_sushi IL15_RA ×CCL19 CAR-T)之情形時，與投予比較例2(Conv. CAR-T)之情形或未處理群(no treatment)及僅投予CPA之情形相比，確認到腫瘤體積之減少效果。因此，可知實施例1-3之CAR-T細胞(_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T)及實施例1-4之CAR-T細胞(_sushi IL15×CCL19 CAR-T)於小鼠黑色素瘤腫瘤模型中具有優異之抗腫瘤活性。

(小鼠大腸癌腫瘤移植模型中之治療效果) 將5×10⁵ 個以表現人類CD20之方式進行基因重組之小鼠大腸癌MC38(MC38-hCD20)接種於C57BL/6N小鼠之皮下。於接種後第7天將作為抗癌劑之環磷醯胺(CPA、50 mg/kg)投予至腹腔內，於第10天將1×10⁶ 個實施例1-3之CAR-T細胞(_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T)、或實施例1-4之CAR-T細胞(_sushi IL15×CCL19 CAR-T)、或比較例2(Conv. CAR-T)投予至靜脈內。作為對照群，設定僅進行CPA投予之CAR-T未治療群、接種MC38-hCD20小鼠大腸癌後未處理之非治療群。小鼠之腫瘤體積係1週測定2次。

將小鼠大腸癌腫瘤移植模型之腫瘤體積之結果示於圖17。橫軸係將對小鼠皮下接種MC38-hCD20之天設為0天之接種後之天數，縱軸係腫瘤體積(腫瘤之長徑×(腫瘤之短徑)² /2(mm³ ))。標準偏差係於各實驗群中算出。「no treatment」係未處理之群，「CPA」係僅投予CPA之群，「CPA＋Conv.」係投予CPA後投予比較例2(Conv. CAR-T)之群，「CPA＋_mb IL15_RA ×19」係投予CPA後投予實施例1-3之CAR-T細胞(_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T)之群，「CPA＋_sushi IL15_RA ×19」係投予CPA後投予實施例1-4之CAR-T細胞(_sushi IL15×CCL19 CAR-T)之群。

如圖17所示，於投予實施例1-3之CAR-T細胞(_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T)及實施例1-4之CAR-T細胞(_sushi IL15×CCL19 CAR-T)之情形時，與投予比較例2(Conv. CAR-T)之情形或未處理群(no treatment)及僅投予CPA之情形相比，確認到腫瘤體積之減少效果。因此，可知實施例1-3之CAR-T細胞(_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T)及實施例1-4之CAR-T細胞(_sushi IL15×CCL19 CAR-T)於小鼠大腸癌模型中亦具有優異之抗腫瘤活性。

於上述實施例及試驗例中，使用源自小鼠之T細胞或包含小鼠之天然胺基酸序列之細胞激素(IL-15與IL-15Rα等連結而成之融合蛋白等)及趨化因子(CCL19)，又，進行小鼠之體內試驗。然而，於與小鼠以外之哺乳動物、較佳為人類相關之實施形態中，即不論於使用源自人類之T細胞或包含人類之天然胺基酸序列之細胞激素(IL-15與IL-15Rα等連結而成之融合蛋白等)及趨化因子(CCL19)之情形時，抑或於進行人類之體內試驗之情形時，業者均可同樣地實施本發明，且可瞭解發揮本發明之作用效果。

例如利用序列編號5所表示之小鼠之天然胺基酸序列所實施(製作及使用)之包含IL15_LSP 之融合蛋白可利用序列編號18所表示之與IL-15相關之人類之天然胺基酸序列中之第1～29個(訊息肽部分)及第49～162個(IL-15部分)胺基酸序列，又，利用具有編碼此種胺基酸序列之鹼基序列之核酸而實施。

利用序列編號7所表示之小鼠之天然胺基酸序列所實施之包含_s IL15_RA 之融合蛋白可利用序列編號18所表示之與IL-15相關之人類之天然胺基酸序列中之第49～162個(IL-15部分)胺基酸序列、以及序列編號19所表示之與IL-15Rα相關之人類之天然胺基酸序列中之第31～205個(IL-15Rα細胞外區)胺基酸序列，又，利用具有編碼此種胺基酸序列之鹼基序列之核酸而實施。

利用序列編號9所表示之小鼠之天然胺基酸序列所實施之包含_mb IL15_RA 之融合蛋白可利用序列編號18所表示之與IL-15相關之人類之天然胺基酸序列中之第49～162個(IL-15部分)胺基酸序列、以及序列編號19所表示之與IL-15Rα相關之人類之天然胺基酸序列中之第1～267個(IL-15Rα之全長)胺基酸序列，又，利用具有編碼此種胺基酸序列之鹼基序列之核酸而實施。

利用序列編號11所表示之小鼠之天然胺基酸序列所實施之包含_sushi IL15之融合蛋白可利用序列編號18所表示之與IL-15相關之人類之天然胺基酸序列中之第49～162個(IL-15部分)胺基酸序列、以及序列編號19所表示之與IL-15Rα相關之人類之天然胺基酸序列中之第31～95個(sushi區)胺基酸序列，又，利用具有編碼此種胺基酸序列之鹼基序列之核酸而實施。 [產業上之可利用性]

本發明之持續性及增殖性優異之CAR-T細胞適於用以製造癌等之治療用醫藥之用途。又，本發明之表現載體適於用以製造此種CAR-T細胞之用途。 [序列表非關鍵文字]

序列編號1：包含抗人類CD20 CAR之DNA片段(DNA片段#1)之鹼基序列序列編號2：由DNA片段#1之第3～1637個鹼基序列表現之融合蛋白之胺基酸序列序列編號3：編碼終止密碼子及限制酶位點之MCS DNA片段(DNA片段#2)之鹼基序列序列編號4：IL15_LSP _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)之鹼基序列序列編號5：由DNA片段#3之第7～969個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含IL15_LSP 之融合蛋白整體之胺基酸序列序列編號6：_s IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)之胺基酸序列序列編號7：由DNA片段#4之第7～1539個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含_s IL15_RA 之融合蛋白整體之胺基酸序列序列編號8：_mb IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)之鹼基序列序列編號9：由DNA片段#5之第7～1713個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含_mb IL15_RA 之融合蛋白整體之胺基酸序列序列編號10：_sushi IL15_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#6)之鹼基序列序列編號11：由DNA片段#6之第7～1179個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含_sushi IL15之融合蛋白整體之胺基酸序列序列編號12：IL-18_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#7)之鹼基序列序列編號13：由DNA片段#7之第7～1059個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之融合蛋白整體之胺基酸序列序列編號14：IL-21_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#8)之鹼基序列序列編號15：由DNA片段#8之第7～969個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之融合蛋白整體之胺基酸序列序列編號16：_sc IL27_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#9) 序列編號17：由DNA片段#9之第7～1839個鹼基序列表現且於2個部位之F2A進行自剪切之包含_sc IL27之融合蛋白整體之胺基酸序列序列編號18：登記為UniProtKB-P40933之人類之天然IL-15(包含訊息肽及前肽部分之全長)之胺基酸序列序列編號19：登記為UniProtKB-Q13261之人類之天然IL-15Rα(包含訊息肽、sushi區、細胞外區等之全長)之胺基酸序列

圖1表示於實施例(試驗例1)中利用流式細胞儀對下述各T細胞分析CAR(橫軸)及CD8(縱軸)之表現水準之結果。圖中之數值(%)表示各區間之細胞群相對於所有細胞之百分比。「轉導(-)」係關於比較例1之轉導(-)T細胞(無轉導之T細胞)之結果，「conv. CAR-T」係關於比較例2之conv. CAR-T細胞(抗人類CD20 CAR-T細胞)之結果，「15_LSP ×19 CAR-T」係關於實施例1-1之IL15_LSP ×CCL19 CAR-T細胞(IL15_LSP _CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞)之結果，「_s 15_RA ×19 CAR-T」係關於實施例1-2之_s IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(_s IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞)之結果，「_mb 15_RA ×19 CAR-T」係關於實施例1-3之_mb IL15_RA ×CCL19 CAR-T細胞(_mb IL15_RA _CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞)之結果，「_sushi 15×19 CAR-T」係關於實施例1-4之_sushi IL15×CCL19 CAR-T細胞(_sushi IL15_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞)之結果，「18×19 CAR-T」係關於實施例2之IL-18×CCL19 CAR-T細胞(IL18_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞)之結果，「21×19 CAR-T」係關於實施例3之IL-21×CCL19 CAR-T細胞(IL21_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞)之結果，「_sc 27×19 CAR-T」係關於實施例4之_sc IL27×CCL19 CAR-T細胞(_sc IL27_CCL19_抗人類CD20 CAR-T細胞)之結果。(於下述圖2～6中亦相同) 圖2表示於實施例(試驗例1)中利用ELISA對上述各T細胞測定(A)IL-15、(B)IL-18、(C)IL-21、(D)IL-27及(E)CCL19於培養上清液中之分泌量之結果。圖3表示於實施例(試驗例2)中測定自由與人類CD20表現P815肥大細胞瘤(hCD20/P815)之共培養所引起之活化刺激起3天後、5天後及7天後之上述各T細胞之活細胞數的結果。圖4表示於實施例(試驗例2)中進行上述各T細胞之利用CytoTell試劑之染色強度之柱狀圖分析的結果。柱狀圖之波峰表示由細胞分裂所引起之代數，環形圖中之數值(%)表示Thy1.2陽性T細胞群中之門控之組分(1表示未分裂之第一代，2表示分裂1次後之第二代，3表示分裂2次後之第三代，4表示分裂3次後之第四代，＞5表示分裂4次以上之第五代以後)之百分比。圖5表示於實施例(試驗例3)中利用流式細胞儀測定上述各T細胞對(A)靶腫瘤細胞(hCD20/P815)及(B)對照腫瘤細胞(P815)之腫瘤細胞毒殺活性之結果。圖6表示於實施例(試驗例3)中測定與(A)靶腫瘤細胞(hCD20/P815)及(B)對照腫瘤細胞(P815)共培養時之上述各T細胞之培養上清液中之IFNγ之濃度的結果。圖7表示序列編號1(抗人類CD20 CAR DNA片段)之鹼基序列中所包含之基因等之組態。圖8表示序列編號3(MCS DNA片段)之鹼基序列中所包含之基因等之組態。圖9表示序列編號4(IL15_LSP _F2A_CCL19 DNA片段)之鹼基序列中所包含之基因等之組態。圖10表示序列編號6(_s IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段)之鹼基序列中所包含之基因等之組態。圖11表示序列編號8(_mb IL15_RA _F2A_CCL19 DNA片段)之鹼基序列中所包含之基因等之組態。圖12表示序列編號10(_sushi IL15_F2A_CCL19 DNA片段)之鹼基序列中所包含之基因等之組態。圖13表示序列編號12(IL-18_F2A_CCL19 DNA片段)之鹼基序列中所包含之基因等之組態。圖14表示序列編號14(IL-21_F2A_CCL19 DNA片段)之鹼基序列中所包含之基因等之組態。圖15表示序列編號16(_sc IL27_F2A_CCL19 DNA片段)之鹼基序列中所包含之基因等之組態。圖16表示於實施例(試驗例4)中測定對小鼠黑色素瘤腫瘤移植模型之抗腫瘤活性(腫瘤體積之變化)之結果。圖17表示於實施例(試驗例4)中測定對小鼠大腸癌腫瘤模型之抗腫瘤活性(腫瘤體積之變化)之結果。

Claims

一種T細胞，其表現 (1)嵌合抗原受體(CAR)、 (2)選自由介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)及介白素-27(IL-27)所組成之群中之至少1種、以及 (3)CC趨化因子配體19(CCL19)。
如請求項1之T細胞，其中上述(2)為IL-15。
如請求項2之T細胞，其中上述IL-15係處於與IL-15Rα連結而形成融合蛋白之狀態之IL-15。
如請求項3之T細胞，其中上述融合蛋白係IL-15LSP與IL-15連結而成之融合蛋白(IL15_LSP )、IL-15Rα細胞外區與IL-15連結而成之融合蛋白(_s IL15_RA )、IL-15與全長之IL-15Rα連結而成之融合蛋白(_mb IL15_RA )、或包含訊息肽及sushi區之IL-15Rα與IL-15連結而成之融合蛋白(_sushi IL15)。
如請求項3之T細胞，其中上述融合蛋白係IL-15與全長之IL-15Rα連結而成之融合蛋白(_mb IL15_RA )、或包含訊息肽及sushi區之IL-15Rα與IL-15連結而成之融合蛋白(_sushi IL15)。
一種醫藥，其含有如請求項1之T細胞。
如請求項6之醫藥，其係癌之治療劑。
如請求項7之醫藥，其中上述癌係黑色素瘤、梅克爾細胞癌、大腸癌、腎癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、小腸癌、前列腺癌、膀胱癌、直腸癌、胰腺癌、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、膽道癌、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
一種表現載體，其包含 (1)編碼CAR之核酸、 (2)編碼選自由IL-15、IL-18、IL-21及IL-27所組成之群中之至少1種之核酸、以及 (3)編碼CCL19之核酸。
如請求項9之表現載體，其中上述(2)為IL-15。
如請求項10之表現載體，其中上述IL-15係處於與IL-15Rα連結而形成融合蛋白之狀態之IL-15。
如請求項11之表現載體，其中上述融合蛋白係IL-15LSP與IL-15連結而成之融合蛋白(IL15_LSP )、IL-15Rα細胞外區與IL-15連結而成之融合蛋白(_s IL15_RA )、IL-15與全長之IL-15Rα連結而成之融合蛋白(_mb IL15_RA )、或包含訊息肽及sushi區之IL-15Rα與IL-15連結而成之融合蛋白(_sushi IL15)。
如請求項11之表現載體，其中上述融合蛋白係IL-15與全長之IL-15Rα連結而成之融合蛋白(_mb IL15_RA )、或包含訊息肽及sushi區之IL-15Rα與IL-15連結而成之融合蛋白(_sushi IL15)。
一種CAR-T細胞之製造方法，其包括將如請求項9之表現載體導入至T細胞之步驟。
一種癌之治療方法，其包括對必需癌之治療之對象投予如請求項1之T細胞之步驟。
如請求項15之治療方法，其中上述癌係黑色素瘤、梅克爾細胞癌、大腸癌、腎癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、小腸癌、前列腺癌、膀胱癌、直腸癌、胰腺癌、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、膽道癌、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
如請求項1之T細胞，其用作癌之治療之有效成分。
如請求項17之T細胞，其中上述癌係黑色素瘤、梅克爾細胞癌、大腸癌、腎癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、小腸癌、前列腺癌、膀胱癌、直腸癌、胰腺癌、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、膽道癌、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。