TW202019476A

TW202019476A - 伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑

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Publication number: TW202019476A
Application number: TW108126291A
Authority: TW
Inventors: 柴垣圭一; 馬克Ｃ吉利斯; 維勇申; 金忠張
Original assignee: 日商參天製藥股份有限公司
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2020-06-01
Also published as: WO2020022438A8; WO2020022438A1

Abstract

本發明之目的在於提供一種視網膜纖維化之抑制方法。本發明人等發現，藉由併用抗內皮糖蛋白抗體及VEGF抑制劑，能夠抑制視網膜纖維化。因此，本發明提供一種與VEGF抑制劑併用之包含抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段之視網膜纖維化之抑制劑。該等抑制劑例如能夠用於伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之治療。

Description

伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑

本專利申請案基於美國臨時申請案編號第62/703,676號主張優先權，藉由於此作為參照，將其整體併入至本說明書中。本發明係關於一種視網膜纖維化之抑制方法，其特徵在於：將抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段與VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor，血管內皮生長因子)抑制劑併用。

眼之恆常性與體內之其他組織同樣地藉由正常之脈管結構、細胞外基質及多樣化之細胞功能而得以保持。若因感染、炎症、代謝性疾病等導致擾亂恆常性，則可能引起眼組織之纖維化。眼組織之纖維化藉由物理上擾亂視軸，或破壞組織之微小環境直至細胞無法正常發揮功能，而對視覺產生毀滅性之影響，全世界範圍內成為失明之原因。例如，於糖尿病視網膜病變中，伴隨糖尿病之缺氧性視網膜病變之結果，視網膜血管不受控制地增殖，導致視網膜纖維化及牽引性視網膜脫離。滲出型老年性黃斑變性中之視網膜下出血之後亦可能引起同樣之纖維化。目前，並不存在能夠利用之視網膜纖維化之治療藥。

老年性黃斑變性係高齡人之社會性失明之主要原因之一。老年性黃斑變性分為萎縮型老年性黃斑變性以及滲出型老年性黃斑變性，上述萎縮型老年性黃斑變性伴隨著地圖狀萎縮(視網膜色素上皮、脈絡膜毛細血管之萎縮)，上述滲出型老年性黃斑變性之特徵在於視網膜下或視網膜色素上皮下之脈絡膜新生血管(CNV：Choroidal Neovascularization)。明確了對於作為滲出型老年性黃斑變性之主要病情之CNV形成，血管內皮細胞生長因子(VEGF：Vascular Endothelial Growth Factor)發揮重要作用，目前，複數種抗VEGF藥作為滲出型老年性黃斑變性治療藥得到業界批准(非專利文獻1～3)。

已知CNV膜表現內皮糖蛋白(非專利文獻4)與血管新生相關。抗內皮糖蛋白抗體與增殖之血管內皮細胞之表面上之內皮糖蛋白結合，阻礙BMP(Bone Morphogenetic Protein，骨形態生成蛋白)訊號傳遞，引起血管內皮細胞之增殖抑制及細胞凋亡。又，抗內皮糖蛋白抗體於高氧負荷視網膜血管新生模型小鼠中抑制血管新生(非專利文獻5)，於右心室壓負荷模型小鼠中抑制心肌之纖維化(非專利文獻6)。

專利文獻1中提及藉由併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體來治療血管新生相關疾病。專利文獻2中揭示含有抗內皮糖蛋白抗體之製劑，提及與抗VEGF抗體併用。專利文獻3中揭示利用抗內皮糖蛋白抗體治療纖維化症。然而，迄今尚未知曉關於具體地對藉由併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體抑制視網膜纖維化進行研究之例。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2011/022339號 [專利文獻2]國際公開第2014/039682號 [專利文獻3]國際公開第2016/077451號 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2014; 252 (4): 647 - 55. [非專利文獻2]N Engl J Med. 2006; 355 (14): 1419 - 31. [非專利文獻3]Ophthalmology. 2012; 119 (12): 2537 - 48. [非專利文獻4]Curr Eye Res. 2000; 21 (6): 952 - 61. [非專利文獻5]Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014; 55 (10): 6490 - 8. [非專利文獻6]J Am Heart Assoc. 2014; 3 (4): 1 - 16.

[發明所欲解決之問題]

本發明之目的在於提供一種視網膜纖維化之抑制方法。 [解決問題之技術手段]

本發明人等發現，藉由併用抗內皮糖蛋白抗體及VEGF抑制劑，能夠抑制視網膜纖維化。

因此，於某態樣中，本發明提供一種包含抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段且併用VEGF抑制劑之視網膜纖維化之抑制劑。又，於另一態樣中，本發明提供一種包含抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段且併用VEGF抑制劑之伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑。 [發明之效果]

藉由本發明，能夠抑制對象之視網膜纖維化。又，藉由對罹患眼部疾病之對象抑制視網膜纖維化，能夠治療對象之眼部疾病。

於本說明書中，於數值帶有「約」之用語之情形時，意圖包含其值±10%之範圍。例如，「約20」包含「18～22」。數值之範圍包含兩端點間之全部數值及兩端點之數值。與範圍有關之「約」適用於其範圍之兩端點。因此，例如，「約20～30」包含「18～33」。

只要無特別具體規定，則本說明書中使用之用語具有對於有機化學、醫學、藥學、分子生物學、微生物學等領域之業者所通常理解之含義。以下記載若干關於本說明書中使用之用語之定義，但該等定義於本發明中優先於一般理解。

於本發明中，「抗體」意指免疫系之抗原結合性蛋白。具有抗原結合性區域之全長之天然存在之抗體係包含藉由雙硫鍵相互連結之2個重鏈(H鏈)及2個輕鏈(L鏈)之糖蛋白。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)。重鏈恆定區包含CH1、CH2及CH3之3個區。各輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。輕鏈恆定區包含CL之1個區。VH及VL之區域進而可細分為互補決定區(CDR)之具有超可變性之區域及架構區(FR)之以某種程度保存之區域。於VH及VL中，自胺基末端至羧基末端按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4之順序分別排列有3個CDR及4個FR。已知對於與抗原之結合而言，重要的是CDR3。重鏈及輕鏈之可變區包含與抗原相互作用之結合區。

揭示出抗體包含與抗原特異性地結合之1或其以上之區域，包含抗原結合區之抗體之片段與全長抗體同樣特異性地識別抗原。於本發明中，某抗體之「抗原結合性片段」意指與該抗體之抗原特異性地結合之抗體之一部分區域、部分或蛋白質之片段。作為抗原結合性片段之例，可列舉Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv、或單鏈Fv(scFv)。Fab係包含VL、VH、CL及CH1區之一價抗體片段。Fab'係包含VL、VH、CL、CH1區及鉸鏈部之一價抗體片段。F(ab')₂ 係包含藉由鉸鏈部之雙硫鍵結合之兩個Fab片段之二價抗體片段。Fv係包含抗體之單臂(single arm)之VL及VH之一價抗體片段。作為Fv片段之2個區即VL及VH可由各基因編碼，藉由基因重組技術並利用連接子連結該等區而製作作為1分子之蛋白質之scFv。scFv於VH及VL之間追加包含連接子。上述連接子係業界通常用於人為地連結VH及VL，使scFv抗體之抗原結合能穩定化之肽(例如，GS(Glutamine Synthetase，麩胺合成酶)連接子參照Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46 - 88(1991)，EK(Enterokinase，腸激酶)連接子參照Whitlow, et al., Protein Eng., 6: 989 (1993))。上述連接子通常包含甘胺酸及絲胺酸，其長度為15～18個胺基酸。亦可使用抗原結合性片段之組合，例如可例示：Fab3、雙功能抗體(Diabody)、三功能抗體(Triabody)、四功能抗體(Tetrabody)、微型抗體(Minibody)、雙scFv(Bis-scFv)、(scFv)₂ -Fc、完整IgG(intact-IgG)。該等例如於Holliger et al., Nature Biotechnology, 23 (9): 1126 – 36 (2005)中詳述。

抗體或抗原結合性片段只要不對其特性產生實質性影響，則可置換、缺失、附加或插入1個或數個、例如1～10個、1～5個、1個～3個、例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸。例如，於恆定區或FR區，可置換、缺失、附加或插入胺基酸。此種修飾例如可組合基因組編輯法、定點突變法(點突變及盒式突變等)、基因同源重組法、引子延長法及PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)法等業者周知之核酸修飾方法而容易實施。

抗體之恆定區(Fc區)不直接參與抗體對抗原之結合，例如經由與Fc受體(FcR)之相互作用，呈現抗體與抗體依賴性細胞毒殺作用相關等各種效應功能。又，Fc區於向患者投予後對抗體之生體可用率產生影響。根據其等之重鏈恆定區之胺基酸序列，可將免疫球蛋白劃分成不同之類型。該等係免疫球蛋白之5種主要類型：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，可將其等中之若干者進一步分類成亞型(同型)、例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。將與免疫球蛋白之不同類型對應之重鏈恆定區(Fc區)分別稱為α、δ、ε、γ及μ。眾所周知不同之免疫球蛋白之類型之次單元結構以及三維立體結構。可使抗體或其等之抗原結合片段於其等之C末端與任意之抗體同型、例如IgG、IgA、IgE、IgD及IgM、以及該同型之亞型、尤其來自IgG1、IgG2b、IgG2a、IgG3及IgG4之任一者之免疫球蛋白重鏈之全部或一部分結合。

抗體或其抗原結合性片段可藉由糖鏈等進一步修飾。例如，藉由修飾，可改變活體內(in vivo)之穩定性、可溶性、生體可用率或半衰期等藥物動態特性。又，抗體或其抗原結合性片段可為人源化抗體。「人源化抗體」意指將除人以外之動物之抗體之VH及VL之CDR之胺基酸序列移植至人抗體之VH及VL之適當位置而得之抗體。

抗內皮糖蛋白抗體 「內皮糖蛋白」亦作為CD105或edg-1而為人熟知，其係於增殖之血管內皮細胞中以高水準表現之同型二聚物之I型膜糖蛋白(Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1: 1623 - 1634)。正常組織之血管內皮細胞亦表現某種程度之內皮糖蛋白(Burrows et al., 同上；Wang et al., 1993, Int. J. Cancer 54: 363 - 370)。已知人之內皮糖蛋白與轉形生長因子β(TGF-β)特異性地結合，關於內皮糖蛋白推測之胺基酸序列顯示對作為TGF-β受體之一種的β-聚糖之高同源性。內皮糖蛋白又與活化素A及骨形態生成蛋白(BMP)-10、-9、-7及2等其他生長因子結合。BMP-9與包含內皮糖蛋白、BMP受體II及ALK(Activin receptor-like kinase，活化素受體樣激酶)1之複合體之結合於血管內皮細胞之增殖所需之SMAD1/5/8磷酸化之過程中較為重要。

內皮糖蛋白可為任何種類者，典型而言為哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、羊、猴等)、尤其是人之內皮糖蛋白。來自各種生物物種之內皮糖蛋白之胺基酸序列可利用公知之資料庫而容易地獲取。人內皮糖蛋白基因位於染色體9q34上，編碼區含有14個外顯子。已知具有與TGF-β結合之能力之2種不同之同功異型物(L及S)。人之內皮糖蛋白之具有代表性之胺基酸序列登錄為基因庫(GenBank)登錄號P17813(L同功異型物)及Q5T9B9(S同功異型物)。於本發明中，「內皮糖蛋白」包含其天然存在之對立基因及經過加工之形態。

「抗內皮糖蛋白抗體」係以充分之親和性及特異性與內皮糖蛋白結合之抗體。例如，可使用藉由明示出處而將整體納為本說明書之一部分之專利文獻1～3；美國專利第5,928,641號；美國專利第6,200,566號；美國專利第6,190,660號；及美國專利第7,097,836號中說明之抗內皮糖蛋白抗體。尤其已知有TRC105、TRC205、SN6、44G4、MJ7/18、Tec-11等抗內皮糖蛋白抗體(參照專利文獻3)。關於該等抗體之多數，已被證實活體外(ex vivo)及活體內(in vivo)之有效性。

於某實施態樣中，抗內皮糖蛋白抗體為TRC105(卡羅圖西單抗(carotuximab)，亦被稱為DE-122)。將TRC105之胺基酸序列示於圖1及序列編號1、2。TRC105與人之內皮糖蛋白之孤兒區結合，而競爭性地阻礙BMP結合，其結果阻礙SMAD1/5/8磷酸化，阻礙血管新生。TRC105與小鼠內皮糖蛋白結合，但不妨礙小鼠內皮糖蛋白與小鼠BMP結合。另一方面，抗體M1043與小鼠內皮糖蛋白特異性地結合，阻礙小鼠BMP結合。因此，M1043係於小鼠模型中模仿人類情況下之TRC105之效果之抗體。於另一實施態樣中，抗內皮糖蛋白抗體為專利文獻3中記載之TRC205。

於某實施態樣中，抗內皮糖蛋白抗體包含重鏈以及輕鏈，上述重鏈包括：包含胺基酸序列DAWMD(序列編號3)之VH-CDR1、包含胺基酸序列EX₁ RSX₂ ASNHATYYAESVKG(此處，X₁ 為A或I，X₂ 為K、Q或R)(序列編號4)之VH-CDR2、及包含胺基酸序列WRRFFDS(序列編號5)之VH-CDR3，上述輕鏈包括：包含胺基酸序列RASSSVSYMH(序列編號6)之VL-CDR1、包含胺基酸序列AX₃ SNLAS(此處，X₃ 為T或S)(序列編號7)之VL-CDR2及包含胺基酸序列QQWSSNPLT(序列編號8)之VL-CDR3。於某實施態樣中，X₁ 為I，X₂ 為K，X₃ 為T。於某實施態樣中，X₁ 為A，X₂ 為K，X₃ 為T。

於某實施態樣中，抗內皮糖蛋白抗體包括：包含序列編號9～14之任一者所示之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及/或包含序列編號15～23之任一者所示之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。於某實施態樣中，抗內皮糖蛋白抗體包括：包含序列編號10所示之胺基酸序列之VH及/或包含序列編號15所示之胺基酸序列之VL。於某實施態樣中，抗內皮糖蛋白抗體包括：包含序列編號14所示之胺基酸序列之VH及/或包含序列編號23所示之胺基酸序列之VL。該等VH及VL之胺基酸序列中之除互補決定區(CDR)以外之序列可經其他胺基酸序列、例如來自人或其他動物之抗體之架構之胺基酸序列置換。

於某實施態樣中，重鏈可變區包含序列編號10所示之胺基酸序列，且亦可包含選自由如下所組成之群中之1個或複數個修飾： (a)第49位之甘胺酸(G)之利用丙胺酸(A)或絲胺酸(S)之置換； (b)第51位之丙胺酸(A)之利用異白胺酸(I)之置換； (c)第54位之離胺酸(K)之利用精胺酸(R)或天冬醯胺(Q)之置換；及 (d)第81位之白胺酸(L)之利用纈胺酸(V)之置換。

於某實施態樣中，輕鏈可變區包含序列編號15所示之胺基酸序列，且亦可包含選自由如下所組成之群中之1個或複數個修飾： (a)第4位之甲硫胺酸(M)之利用白胺酸(L)之置換； (b)第19位之丙胺酸(A)之利用纈胺酸(V)之置換； (c)第22位之蘇胺酸(T)之利用絲胺酸(S)之置換； (d)第47位之丙胺酸(A)之利用異白胺酸(I)之置換；及 (e)第50位之蘇胺酸(T)之利用絲胺酸(S)之置換。

於某實施態樣中，抗內皮糖蛋白抗體包括：包含序列編號24或25所示之胺基酸序列之重鏈恆定區(Fc)及/或包含序列編號26所示之胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)。於某實施態樣中，抗內皮糖蛋白抗體包括：包含序列編號24所示之胺基酸序列之Fc及/或包含序列編號26所示之胺基酸序列之CL。於某實施態樣中，抗內皮糖蛋白抗體包括：包含序列編號25所示之胺基酸序列之Fc及/或包含序列編號26所示之胺基酸序列之CL。

VEGF 抑制劑 已知血管內皮生長因子(VEGF)於活體外誘導內皮細胞之增殖及移動，於活體內誘導血管滲透及血管新生。又，VEGF亦於新形成之血管中作為內皮細胞之抗細胞凋亡因子而發揮功能。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F及胎盤生長因子(PIGF)之7個成員。其等全部於VEGF同源性區中具有8個半胱胺酸殘基之共通結構。關於VEGF-A，存在6個不同之同功異型物，VEGF-A165係主要之同功異型物。該等同功異型物於血管新生方面之功能重複。VEGF家族之各成員具有不同之物理及生物學性質，其等經由特異性酪胺酸激酶受體而發揮作用。關於VEGF之3個高親和性受體，已知VEGFR(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，血管內皮生長因子受體)-1/Flt1(類fms酪胺酸激酶-1)、VEGFR-2/Kdr(Kinase insert domain receptor，激酶插入區受體)/Flk(Fetal Liver Kinase，胎肝激酶)-1(含有受體/胎兒肝臟激酶-1之激酶插入區)及VEGFR-3。該等受體分類為PDGF(Platelet Derived Growth Factor，血小板衍生生長因子)受體家族。VEGFR-1及VEGFR-2以高親和性與VEGF-A165結合。

VEGF可為任何種類者，典型而言為哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、羊、猴等)、尤其是人之VEGF。來自各種生物物種之VEGF之胺基酸序列可利用公知之資料庫而容易地獲取。例如，如Leung et al., Science, 246: 1306 (1989)及Houck et al, Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991)中所記載，人VEGF-A包含165個胺基酸，亦存在相關之121、189及206個胺基酸之形態。165個胺基酸之相當於人VEGF之胺基酸8～109或1～109之多肽亦包含於人VEGF-A。人之VEGF-A之具有代表性之胺基酸序列登錄為基因庫登錄號P15692。於本發明中，「VEGF」包含其天然存在之對立基因及經過加工之形態。

於本發明中，「VEGF抑制劑」意指藉由與VEGF或者1種或複數種VEGF受體或者編碼其等之核酸結合，可中和、阻斷、阻礙、抑制、降低或干擾VEGF活性之分子。較佳為VEGF抑制劑與VEGF或VEGF受體結合。VEGF抑制劑包含：抗VEGF抗體及其等之抗原結合性片段；與VEGF或VEGF受體結合而阻斷配位基-受體相互作用之多肽(例如免疫黏附素、肽體)；抗VEGF受體抗體及VEGF受體拮抗劑，例如VEGFR酪胺酸激酶之小分子抑制劑、與VEGF結合之適體；以及與編碼VEGF或VEGF受體之核酸序列於嚴格條件下雜交之核酸(例如RNAi)。

抗VEGF抗體係VEGF抑制劑之1種。於本發明中，「抗VEGF抗體」意指以充分之親和性及特異性與VEGF結合之抗體。於某實施態樣中，抗VEGF抗體為對VEGF-A具有特異性之抗體、例如雷珠單抗、貝伐珠單抗或布羅盧西珠單抗(Brolucizumab)。亦能夠使用與對VEGF-A具有特異性之抗體有共通之CDR之抗體及其等之抗原結合性片段。

作為VEGF抑制劑之其他例，可列舉：阿柏西普、康柏西普、培戈-阿比西普(Abicipar pegol)、哌加他尼鈉、舒尼替尼、索拉非尼、阿西替尼、哌加他尼、帕唑帕尼、PTK787、SU11248、AG-013736、Bay439006、ZD-6474、CP632、CP-547632、AZD-2171、CDP-171、SU-14813、CHIR-258、AEE-788、SB786034、BAY579352、CDP-791、EG-3306、GW-786034、RWJ-417975/CT6758及KRN-633等。於某實施態樣中，VEGF抑制劑為選自由雷珠單抗、貝伐珠單抗、布羅盧西珠單抗、阿柏西普、康柏西普及培戈-阿比西普所組成之群中之VEGF-A抑制劑。

製造方法 本發明之抗內皮糖蛋白抗體或者其抗原結合性片段或者抗VEGF抑制劑可購買，亦可使用業者公知之方法、例如基因工程手法或化學合成等各種方法進行製造。基因工程手法例如包括：製作含有編碼抗內皮糖蛋白抗體或者其抗原結合性片段或者抗VEGF抑制劑之核酸之能夠複製的選殖載體或表現載體；藉由業者公知之適當方法將該載體導入至宿主細胞；培養宿主細胞使核酸表現；以及回收獲得之多肽，進行純化。於核酸包含複數個核酸分子之情形時，可將包含各核酸分子之複數個載體之組合(set)導入至宿主細胞，或者亦可將包含複數個核酸之1個載體導入至宿主細胞。可使肽標籤與目標多肽連結，使用肽標籤將多肽純化。

能夠使用包含適於使用之宿主細胞之控制序列之載體。作為控制序列，包含：轉錄之啟動子序列、用以控制轉錄之任意操縱子序列、編碼核糖體結合部位之序列、增強子序列、多聚腺苷酸化序列、以及控制轉錄或轉譯之結束之序列等。載體亦可進而包含業者公知之各種序列、例如限制酶切割部位、藥劑耐性基因等標記基因(選擇基因)、訊號序列、前導序列等。關於該等各種序列或部位，業者可根據表現之多肽之種類、使用之宿主細胞、培養培養基等條件進行適當選擇而使用。

載體可為組入至宿主之基因組之載體、未組入之載體、存在於細胞質並自主複製之游離型載體之任一者。例如可使用反轉錄病毒載體(例如腫瘤反轉錄病毒載體、慢病毒載體、假型載體)、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、猿猴病毒載體、牛痘病毒載體、仙台病毒載體、艾司坦-巴爾病毒(EBV)載體、HSV(herpes simplex virus，疱疹單純型病毒)載體等病毒載體。較佳為缺損複製能力之病毒載體以使病毒無法於感染之細胞中自我複製。又，亦可利用脂質體及陽離子脂質等轉染試劑將核酸導入至宿主細胞。磷酸鈣轉形、DEAE(Diethylaminoethyl，二乙基胺基乙基)-葡聚糖、電穿孔、粒子轟擊等方法亦能夠用於核酸導入。

作為宿主細胞，可使用業者公知之任意細胞。例如作為具有代表性之宿主細胞，可列舉：大腸桿菌等原核細胞、及中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、人源細胞等哺乳動物細胞、酵母、昆蟲細胞等真核細胞。

於宿主細胞中表現之抗體等蛋白質可自宿主細胞之培養培養基、宿主細胞之萃取物及/或溶解物中純化。純化方法可適當組合業者公知之任意方法而進行。例如，能夠藉由離心分離、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換管柱上之分餾、乙醇沈澱、逆相HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析)、藉由二氧化矽之層析、藉由肝素瓊脂糖凝膠之層析、陰離子或陽離子樹脂層析(聚天冬胺酸管柱等)、聚焦層析、SDS(Sodium Dodecylsulfate，十二烷基硫酸鈉)-PAGE(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯醯胺凝膠電泳)、硫酸銨沈澱及親和層析進行純化。

因此，於某態樣中，提供編碼上述抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段或者VEGF抑制劑之核酸、包含該核酸之載體、包含該核酸或載體之宿主細胞及/或該宿主細胞之萃取物及/或溶解物。核酸可不變更編碼之胺基酸序列而以使用適於宿主細胞之密碼子(最佳密碼子)之方式加以修飾。如此藉由利用最佳密碼子進行修飾，能夠提高宿主細胞中之多肽之表現效率。

使用方法 如藉由下述實施例所證實，藉由併用抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段與VEGF抑制劑，視網膜之纖維化得到抑制。因此，於某態樣中，提供一種視網膜纖維化之抑制方法，其包括對需要抑制視網膜纖維化之對象投予抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段以及VEGF抑制劑。於本發明中，「視網膜纖維化之抑制」意指：防止對象之視網膜纖維化；延遲、停止或者抑制纖維化之進行；及/或改善纖維化。視網膜纖維化可為眼部疾病、例如下述列舉之眼部疾病之症狀之一。

抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段與VEGF抑制劑之併用係藉由其視網膜纖維化抑制效果，例如對伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之治療及/或預防有用。因此，於某態樣中，提供一種伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之治療方法，其包括對需要治療伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之對象投予抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段以及VEGF抑制劑。伴隨視網膜纖維化之眼部疾病例如包含：老年性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、增殖性玻璃體視網膜病變、視網膜動脈阻塞、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變、視網膜脫離、視網膜色素上皮脫離、葡萄膜炎、缺血性視神經病變。於某實施態樣中，伴隨視網膜纖維化之眼部疾病為老年性黃斑變性、尤其是滲出型老年性黃斑變性。

於本說明書中使用時，「進行治療」或「治療」意指於罹患伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之對象中，延遲、停止或者抑制眼部疾病之惡化及/或減輕、緩和、改善或消除其症狀。

於本說明書中使用時，「加以預防」或「預防」意指於對象中、尤其於罹患伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之可能性較高，但至今仍未患病之對象中，防止伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之發病及/或降低伴隨視網膜纖維化之眼部疾病發病之可能性。罹患伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之可能性較高，但至今仍未患病之對象例如包含具有糖尿病、高血壓或吸菸等風險因素之對象。

作為視網膜纖維化之抑制或伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之治療及/或預防之對象，可列舉：動物、典型而言哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、羊、猴等)、尤其人。

將抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段(第1成分)與VEGF抑制劑(第2成分)「併用」意指向對象投予含有第1成分及第2成分之投予劑型或者分別含有各成分之投予劑型之組合。即，第1成分及第2成分可以該兩者皆被包含之組合物之形態投予，亦可分別作為各自被包含之組合物之組合進行投予。第1成分及第2成分可同時投予，亦可連續投予，或者，第1成分及第2成分只要用於相同目的(即，抑制視網膜纖維化或者治療伴隨視網膜纖維化之眼部疾病)，則亦可延遲任一方而投予。

抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及VEGF抑制劑之投予方法並無特別限定，可經由經口投予、非經腸投予、注射、輸液、滴眼、前眼房內、玻璃體內投予等一般之投予路徑，較佳為玻璃體內投予。兩成分之投予路徑可相同，亦可不同。例如，可於玻璃體內投予兩成分，亦可於玻璃體內投予一者，經由另一投予路徑、例如靜脈內投予另一者。

作為經口投予之劑型，可列舉：顆粒劑、細粒劑、粉劑、包衣錠劑、錠劑、栓劑、散劑、膠囊劑、微膠囊劑、咀嚼劑、液劑、懸浮劑、乳濁液等。作為注射投予之劑型，可列舉靜脈注射用、點滴投予用、眼內注射用、延長活性物質之釋放之製劑等。作為玻璃體內投予用之劑型，可列舉：液劑、懸浮劑、乳濁液等。

該等劑型藉由利用慣例使有效成分製劑化進行製造。進而可根據製劑上之需要，調配醫藥上可容許之各種製劑用物質。製劑用物質可視製劑之劑型適當進行選擇，例如可列舉：緩衝劑、界面活性劑、穩定劑、防腐劑、賦形劑、稀釋劑、添加劑、崩解劑、黏結劑、被覆劑、潤滑劑、滑澤劑、調味劑、甜味劑、助溶劑等。

於某實施態樣中，將抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及/或VEGF抑制劑以玻璃體內投予用之注射劑之形式進行投予。玻璃體內投予用之注射劑可視需要使用氯化鈉等等張劑；磷酸鈉等緩衝劑；聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯等界面活性劑；甲基纖維素等增黏劑等進行製備。

關於抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及/或VEGF抑制劑之投予量及投予次數，業者可根據投予對象之動物物種、健康狀態、年齡、體重、投予路徑、投予形態等進行適當設定以實現向對象投予有效量。例如，抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段與VEGF抑制劑之投予量之比以質量比計可為1：100～100：1、1：50～50：1、1：30～30：1、1：25～25：1、1：10～10：1、1：5～5：1、1：3～3：1或1：2～2：1，例如為約1：1。

能夠將1種或其以上之抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段與1種或其以上之VEGF抑制劑併用。又，可與1種或其以上之進一步之有效成分、尤其是用以治療及/或預防眼部疾病之有效成分併用。適於併用之有效成分例如包含抗炎劑、抗菌劑、抗真菌劑、免疫抑制劑、抗病毒劑。

除抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段與VEGF抑制劑之併用以外，亦可實施藥物療法以外之眼部疾病之治療法。適合之治療法例如包含外科手術、光線力學療法、基因治療、再生醫學、角膜移植、雷射治療。

於某態樣中，提供一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段，其於視網膜纖維化之抑制中用以與VEGF抑制劑一起使用。於另一態樣中，提供一種VEGF抑制劑，其於視網膜纖維化之抑制中用以與抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段一起使用。於另一態樣中，提供一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及VEGF抑制劑之組合，其用於抑制視網膜纖維化。

於某態樣中，提供一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段之用途，其用於與VEGF抑制劑併用而製造視網膜纖維化之抑制劑。於另一態樣中，提供一種VEGF抑制劑之用途，其用於與抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段併用而製造視網膜纖維化之抑制劑。於另一態樣中，提供一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及VEGF抑制劑之組合之用途，其用於製造視網膜纖維化之抑制劑。

於某態樣中，提供一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段，其於伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之治療中用以與VEGF抑制劑一起使用。於另一態樣中，提供一種VEGF抑制劑，其於伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之治療中用以與抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段一起使用。於另一態樣中，提供一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及VEGF抑制劑之組合，其用於治療伴隨視網膜纖維化之眼部疾病。

於某態樣中，提供一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段之用途，其用於與VEGF抑制劑併用而製造伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑。於另一態樣中，提供一種VEGF抑制劑之用途，其用於與抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段併用而製造伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑。於另一態樣中，提供一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及VEGF抑制劑之組合之用途，其用於製造伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑。

於某態樣中，提供一種用以抑制視網膜纖維化之套組，其特徵在於包括：包含抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段之第1部分、及包含VEGF抑制劑之第2部分，且併用抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及VEGF抑制劑。

於某態樣中，提供一種用以治療伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之套組，其特徵在於包括：包含抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段之第1部分及/或包含VEGF抑制劑之第2部分，且併用抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及VEGF抑制劑。

進而，套組可進而包括：包含使用說明之隨附文件(例如文件、磁帶、CD-ROM(Compact Disc-Read Only Memory，唯讀光碟)等)等就商業觀點及使用者之觀點而言較理想之其他材料。套組之部分或材料能夠包含於具有標籤之容器。較佳之容器包括瓶子、小玻璃瓶、注射器、試管、平皿、薄膜等。容器可由玻璃、塑膠等多種材料形成。

本發明例如提供下述實施態樣。 [1]一種抑制劑，其特徵在於：其係包含抗內皮糖蛋白抗體或者其抗原結合性片段及/或VEGF抑制劑之視網膜纖維化之抑制劑，且併用抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及VEGF抑制劑。 [2]一種視網膜纖維化之抑制劑，其包含與VEGF抑制劑併用之抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段。 [3]一種視網膜纖維化之抑制劑，其包含與抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段併用之VEGF抑制劑。 [4]如第1項至第3項中任一項所記載之抑制劑，其用以治療眼部疾病。 [5]一種伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑，其特徵在於包含：抗內皮糖蛋白抗體或者其抗原結合性片段及/或VEGF抑制劑，且併用抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段及VEGF抑制劑。 [6]一種伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑，其包含與VEGF抑制劑併用之抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段。 [7]一種伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑，其包含與抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段併用之VEGF抑制劑。 [8]如第4項至第7項中任一項所記載之藥劑，其中眼部疾病選自由老年性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、增殖性玻璃體視網膜病變、視網膜動脈阻塞、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變、視網膜脫離、視網膜色素上皮脫離、葡萄膜炎、缺血性視神經病變所組成之群。 [9]如第4項至第8項中任一項所記載之藥劑，其中眼部疾病為老年性黃斑變性。 [10]如第4項至第9項中任一項所記載之藥劑，其中眼部疾病為滲出型老年性黃斑變性。

[11]如第1項至第10項中任一項所記載之藥劑或抑制劑，其中抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段包括重鏈可變區及輕鏈可變區，重鏈可變區包括：包含胺基酸序列DAWMD(序列編號3)之VH-CDR1、包含胺基酸序列EX₁ RSX₂ ASNHATYYAESVKG(此處，X₁ 為A或I，X₂ 為K、Q或R)(序列編號4)之VH-CDR2及包含胺基酸序列WRRFFDS(序列編號5)之VH-CDR3，並且，輕鏈可變區包括：包含胺基酸序列RASSSVSYMH(序列編號6)之VL-CDR1、包含胺基酸序列AX₃ SNLAS(此處，X₃ 為T或S)(序列編號7)之VL-CDR2及包含胺基酸序列QQWSSNPLT(序列編號8)之VL-CDR3。 [12]如第11項記載之藥劑或抑制劑，其中X₁ 為I，X₂ 為K，X₃ 為T。 [13]如第1項至第12項中任一項所記載之藥劑或抑制劑，其中抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段包括：包含序列編號14之胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列編號23之胺基酸序列之輕鏈可變區。 [14]如第1項至第13項中任一項所記載之藥劑或抑制劑，其中抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段包含具有序列編號24中記載之胺基酸序列之重鏈恆定區及/或具有序列編號26中記載之胺基酸序列之輕鏈恆定區。 [15]如第1項至第14項中任一項所記載之藥劑或抑制劑，其中抗內皮糖蛋白抗體為TRC105。 [16]如第1項至第15項中任一項所記載之藥劑或抑制劑，其中VEGF抑制劑為VEGF-A抑制劑。 [17]如第1項至第16項中任一項所記載之藥劑或抑制劑，其中VEGF抑制劑選自由雷珠單抗、貝伐珠單抗、布羅盧西珠單抗、阿柏西普、康柏西普及培戈-阿比西普所組成之群。 [18]如第1項至第17項中任一項所記載之藥劑或抑制劑，其中VEGF抑制劑為抗VEGF抗體或其抗原結合性片段。 [19]如第18項記載之藥劑或抑制劑，其中抗VEGF抗體為雷珠單抗、貝伐珠單抗或布羅盧西珠單抗。 [20]如第18項或第19項記載之藥劑或抑制劑，其中抗VEGF抗體為雷珠單抗。 [21]如第1項至第20項中任一項所記載之藥劑或抑制劑，其為玻璃體內投予用。

於本說明書中引用之所有文獻藉由明示出處而設為本說明書之一部分。上述說明皆為非限定性，可不脫離於隨附之申請專利範圍中定義之本發明之範圍而進行變更。進而，下述實施例皆為非限定性實施例，僅供以對本發明進行說明。 [實施例]

基因修飾小鼠之繆氏細胞障礙之誘導繆氏細胞係具有維持視網膜之恆常性所需之多種功能之神經膠細胞。為了構建可誘導繆氏細胞障礙之小鼠模型，如先前所記載(Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al., The Journal of neuroscience, 2012; 32: 15715 - 27; Shen W, Lee SR, Araujo J, et al. Glia. 2014; 62: 1110 - 24; Shen W, Zhu L, Lee SR, et al. Journal of neuroinflammation. 2013; 10: 137)，生成Rlbp-CreER-DTA176基因修飾小鼠。簡而言之，為了獲得繆氏細胞特異性基因標靶，利用藉由Cre/Lox-P方法並使用視黃醛結合蛋白質1(Rlbp1)基因之調節區域之一部分作為細胞特異性啟動子之可誘導基因修飾模型。又，使用具有弱毒型之白喉毒素片段A(DTA176)基因之基因修飾系統之小鼠即Rosa-DTA176小鼠。使Rlbp1-CreER小鼠與Rosa-DTA176小鼠交配，生成Rlbp-CreER-DTA176基因修飾小鼠。於8～10週齡之Rlbp-CreER-DTA176小鼠中，藉由他莫昔芬之腹腔內注射，使弱毒型之白喉毒素片段A(DTA176)對繆氏細胞特異性地表現，誘導繆氏細胞障礙。已知於Rlbp-CreER-DTA176基因修飾小鼠中，若誘導繆氏細胞障礙，則產生視網膜血管新生、血管滲漏、視網膜纖維化等異常，另一方面光受體被破壞(Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al. 2012(上述)、Shen W, Zhu L, Lee SR, et al. 2013(上述))。使用不投予他莫昔芬之Rlbp-CreER-DTA176基因修飾小鼠作為對照。

受驗藥物之玻璃體內注射如先前所記載(Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al. 2012(上述)、Shen W, Lee SR, Araujo J, et al. 2014(上述)、Shen W, Zhu L, Lee SR, et al. 2013(上述))，藉由氯胺酮(48 mg/kg)及美托咪定(0.6 mg/kg)對小鼠進行麻醉，藉由滴眼1%托品卡胺及0.5%去氧腎上腺素1～2滴使瞳孔擴張後，使用安裝有32號針之漢密爾頓(Hamilton)注射器，實施受驗藥物之玻璃體內注射。玻璃體內注射於繆氏細胞障礙誘導之7天前以及繆氏細胞障礙誘導之4週後及8週後實施。對各眼以2 μl/eye注射抗小鼠內皮糖蛋白單株抗體(M1043(參照Nolan-Stevaux O, Zhong W, Culp S, et al. PloS one. 2012; 7: e50920)，2.7 μg/μl)、作為抗VEGF-A抗體之抗小鼠VEGF164抗體(2.5 μg/μl，R&D Systems，#AF-493-NA)或兩抗體之混合劑。再者，兩抗體之混合劑分別將各抗體之2倍濃縮液等量混合進行製備。作為對照，同樣地注射磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS，Phosphate buffered saline)。

螢光眼底造影檢查為了觀察視網膜脈管結構之變化，如先前所記載(Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al. 2012(上述)、Shen W, Lee SR, Araujo J, et al. 2014(上述))，於繆氏細胞障礙誘導之6週後及10週後實施螢光眼底造影檢查(FFA)。具體而言，對各小鼠腹腔內注射10%螢光素鈉0.05 ml後，於2～5分鐘內取得圖像。將繆氏細胞障礙之誘導、玻璃體內注射及FFA之排程示於圖2。

將繆氏細胞障礙誘導之6及10週後之具有代表性之FFA圖像示於圖3。於繆氏細胞障礙誘導之6週後之FFA中，於僅投予PBS之MCKO小鼠(A)中觀察到較多伴隨強集中性血管滲漏之病變，於投予抗內皮糖蛋白抗體(C)或抗VEGF抗體(E)之小鼠中病變較少，於併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體之小鼠(G)中未觀察到病變。於繆氏細胞障礙誘導之10週後之FFA中，於僅投予PBS之MCKO小鼠(B)中觀察到較多病變，於投予抗內皮糖蛋白抗體之小鼠(D)中觀察到少量病變，於投予抗VEGF抗體之小鼠(F)中未有較強病變，觀察到彌漫性漏出，於併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體之小鼠(H)中未觀察到該等異常。

對該等圖像根據以下之基準給出得分(圖4)。0：無自血管之異常滲漏之正常圖案之螢光眼底造影像；1：觀察到彌漫性滲漏，可容易地鑑定病變，但無強集中性血管滲漏；2：觀察到3個以下伴隨強集中性血管滲漏之病變；3：觀察到4～6個伴隨強集中性血管滲漏之病變；4：觀察到7個以上伴隨強集中性血管滲漏之病變。將得分之平均值示於圖4。投予抗內皮糖蛋白抗體或抗VEGF抗體之小鼠相較於僅投予PBS之小鼠得分顯著較低，併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體之小鼠之得分更低。

於繆氏細胞障礙誘導之12週後摘出眼球，為了進行視網膜全形封閉標本之免疫染色，切開眼杯，於4%多聚甲醛中固定1小時，於4℃下置於PBS中。第二天，將視網膜單獨分離，於含有用以檢測神經膠樣變性之抗GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein，神經膠質纖維酸性蛋白)抗體(兔多株，1：250，Dako#Z0334)或用以檢測微神經膠質細胞之抗離子化鈣結合承接分子1(Iba1，Ionized calcium binding adapter molecule 1)抗體(1：400，Wako#019-19741)之溶液中培養標本。藉由共聚焦雷射掃描顯微鏡對視網膜全形封閉標本進行觀察、拍攝，如先前所記載(Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al. 2012(上述)、Shen W, Lee SR, Araujo J, et al. 2014(上述)、Shen W, Zhu L, Lee SR, et al. 2013(上述))，對顯微鏡圖像進行定量分析。

將結果示於圖5及6。已知GFAP係組織纖維化之前階段即神經膠細胞浸潤之指標。投予抗內皮糖蛋白抗體或抗VEGF抗體之小鼠相較於僅投予PBS之小鼠，被抗GFAP抗體染色之面積顯著較小，併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體之小鼠更小。已知Iba1係與炎症相關之微神經膠質細胞之標記物。投予抗內皮糖蛋白抗體或抗VEGF抗體之小鼠相較於僅投予PBS之小鼠，被抗Iba1抗體染色之面積顯著較小，併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體之小鼠更小。該等結果提示藉由併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體，視網膜纖維化之進行得到抑制。

西方墨點法於繆氏細胞障礙誘導之12週後摘出眼球，採取視網膜組織，為了評估視網膜中之靶蛋白之表現量，實施西方墨點法。具體而言，藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠對視網膜樣品進行電泳，將分離出之蛋白質轉錄至PVDF(Polyvinylidene Fluoride，聚偏二氟乙烯)薄膜後，與針對靶蛋白之一次抗體(VEGF-A(Novus Biologicals，Cat# NB100-664)、TGFβ-pan(CST，Cat# 3711)、Smad3(CST，Cat# 9523)、P-Smad3(CST，Cat# 9520))進行培養。其後，與對應於一次抗體之辣根過氧化酶偶聯物二次抗體進行培養，使用G:Box生物成像系統(Syngene)使靶蛋白可視化、定量化。再者，使用α/β-微管蛋白(CST，Cat#2148)之表現量，修正靶蛋白之表現量。

將結果示於圖7。MCKO小鼠與對照小鼠相比，TGF-β及VEGF-A之表現較高。於MCKO小鼠及對照小鼠中未發現Smad3之表現量有差異，但磷酸化Smad3之量於MCKO小鼠中顯著較高。投予抗內皮糖蛋白抗體或抗VEGF抗體之小鼠相較於僅投予PBS之小鼠，磷酸化Smad3之量顯著較少，於併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體之小鼠中更少。已知Smad3之磷酸化係組織纖維化之指標。因此，該等結果提示藉由併用抗內皮糖蛋白抗體及抗VEGF抗體，視網膜之纖維化得到抑制。 [產業上之可利用性]

本發明提供一種視網膜纖維化之抑制方法，能夠於醫療領域利用。例如期待用於伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之治療及/或預防、尤其是老年性黃斑變性之治療。

圖1係表示抗內皮糖蛋白抗體TRC105之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖2係表示Rlbp-CreER-DTA176小鼠中之繆氏細胞障礙之誘導、玻璃體內注射及螢光眼底造影檢查之排程。圖3A-3H係表示已誘導繆氏細胞障礙之Rlbp-CreER-DTA176小鼠(MCKO小鼠)中之具有代表性之螢光眼底造影檢查之圖像。圖4係表示MCKO小鼠之基於螢光眼底造影檢查之病變得分。﹡﹡P＜0.01，vs MCKO，PBS.†P＜0.05，vs MCKO＋抗VEGF；‡P＜0.01，vs MCKO＋M1043；N＝17～21/群(藉由單因子ANOVA(one-way Analysis of Variance，單因子變異數分析)進行分析)。圖5係表示MCKO小鼠之視網膜全形封閉標本之利用抗GFAP抗體之免疫染色之結果。﹡﹡P＜0.01，vs 正常組＋PBS；†P＜0.05及‡P＜0.01，vs MCKO＋PBS；N＝7～10/群(藉由單因子ANOVA進行分析)。圖6係表示MCKO小鼠之視網膜全形封閉標本之利用抗Iba1抗體之免疫染色之結果。﹡P＜0.05及﹡﹡P＜0.01，vs 正常組＋PBS；†P＜0.05及‡P＜0.01，vs MCKO＋PBS；N＝7～10/群(藉由單因子ANOVA進行分析)。圖7A-7D係表示MCKO小鼠之視網膜組織中之TGF-β、VEGF-A、Smad3及磷酸化Smad3之西方墨點法之結果。﹡P＜0.05及﹡﹡P＜0.01，vs 正常組＋PBS；‡P＜0.01，vs MCKO＋PBS；N＝6～10/群(藉由單因子ANOVA進行分析)。

Claims

一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段之用途，其用於製造與VEGF抑制劑併用之伴隨視網膜纖維化之眼部疾病之藥劑。
如請求項1之用途，其中抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，重鏈可變區包括：包含胺基酸序列DAWMD(序列編號3)之VH-CDR1、包含胺基酸序列EX₁ RSX₂ ASNHATYYAESVKG(此處，X₁ 為A或I，X₂ 為K、Q或R)(序列編號4)之VH-CDR2及包含胺基酸序列WRRFFDS(序列編號5)之VH-CDR3，並且，輕鏈可變區包括：包含胺基酸序列RASSSVSYMH(序列編號6)之VL-CDR1、包含胺基酸序列AX₃ SNLAS(此處，X₃ 為T或S)(序列編號7)之VL-CDR2及包含胺基酸序列QQWSSNPLT(序列編號8)之VL-CDR3。
如請求項2之用途，其中X₁ 為I，X₂ 為K，X₃ 為T。
如請求項1之用途，其中抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段包括：包含序列編號14之胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列編號23之胺基酸序列之輕鏈可變區。
如請求項1之用途，其中抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段包含具有序列編號24中記載之胺基酸序列之重鏈恆定區及/或具有序列編號26中記載之胺基酸序列之輕鏈恆定區。
如請求項1之用途，其中抗內皮糖蛋白抗體為TRC105。
如請求項1至6中任一項之用途，其中VEGF抑制劑為抗VEGF抗體或其抗原結合性片段。
如請求項7之用途，其中抗VEGF抗體為雷珠單抗、貝伐珠單抗或布羅盧西珠單抗。
如請求項7之用途，其中抗VEGF抗體為雷珠單抗。
如請求項1之用途，其中眼部疾病選自由老年性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、增殖性玻璃體視網膜病變、視網膜動脈阻塞、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變、視網膜脫離、視網膜色素上皮脫離、葡萄膜炎、缺血性視神經病變所組成之群。
如請求項1之用途，其中眼部疾病為老年性黃斑變性。
如請求項1之用途，其中眼部疾病為滲出型老年性黃斑變性。
如請求項1之用途，其中藥劑為玻璃體內投予用。
一種抗內皮糖蛋白抗體或其抗原結合性片段之用途，其用於與VEGF抑制劑併用而製造視網膜纖維化之抑制劑。