TW202023621A - 生物活性劑之經口傳輸的組成物 - Google Patents

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Abstract

生物活性劑之經口投與水棲或陸棲物種的組成物包含粒子，各粒子包含分散於油滴中之生物活性劑，所述油滴分散於包含腸溶性塗佈聚合物之基質中，其中所述粒子各自更包含黏膜黏著性聚合物。亦提供製造及使用所述組成物之方法。

Description

生物活性劑之經口傳輸的組成物
本發明是有關於生物活性劑之經口投與水棲或陸棲物種的組成物，以及製造及使用所述組成物之方法。
經口投與藥物及疫苗提供若干優勢。可在限制及勞動量極少之情況下經由食物或水向許多動物投與劑量。限制亦向動物施加壓力，從而使藥物或疫苗接種有效性降低且增加傳染性疾病之風險。對於產肉動物，經口投與之另一優勢為其可避免注射部位反應。斷針、注射部位污染或使用高反應性佐劑可導致膿腫，從而損害屠體及皮膚。這些反應會降低所屠宰之動物的價值。這在魚類疫苗接種方案中亦是一個問題，在所述方案中，需要自魚池或開放型海洋籠中捕獲魚類且單獨注射。經口接種快速而有效，且不需要多次處置動物以投與後續強化接種。經口投與之後發生不良免疫反應之可能性亦小得多，且因此更安全。
在壓力或勞動量極少之情況下，經口疫苗接種為一種能在魚類養殖系統中一次性接種或治療大量魚類的特別成本有效的方式。這在可藉由在攝食/飲水過程中攝入而實現經口投與疫苗時尤其成立。另外，經口疫苗可用比可注射疫苗調配物更成本有效的方式製造，因為產生經口疫苗所需之純化步驟較少。經口疫苗接種亦提供較少副作用之優勢，所述副作用為諸如壓力或其他注射反應。
儘管藥物且尤其是疫苗之經口投與具有優勢，但由於缺乏適當疫苗傳輸系統，技術發展已有所延緩。在無適合傳輸系統之情況下，大部分經口疫苗在胃腸(gastrointestinal，GI)道中經歷降解，尤其在低pH值胃部條件下，從而導致吸收受限，繼而導致免疫反應不足。
歷史上，免疫接種依賴於藉由非經腸投與疫苗來誘導體液免疫。然而，由非經腸投與誘導之抗體未必能達到黏膜表面，即大部分感染劑(infectious agent)之進入部位。黏膜免疫力產生於黏膜表面，包含腸、肺、口、眼、乳腺及泌尿生殖道以及魚皮及魚鰓，由於抗原與黏膜組織接觸，故黏膜為抵抗感染劑之第一道重要防線。
已開發出各種媒劑用於將藥物或疫苗傳輸至腸黏膜組織。生物可降解聚合物，諸如聚-(DL-丙交酯)及聚-(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)已用於生產抗原之經口投與組成物。然而，生產這些聚合物粒子需使用可能會損害脆弱抗原之溶劑。另外，使用溶劑會妨礙在那些組成物內併入減毒活有機體(諸如病毒或細菌)。
開發適當經口傳輸系統之其他挑戰包含需要選擇僅為食物或飼料級且生物可降解之化合物及佐劑，以及需要持久且穩定之免疫反應。
在一個態樣中，本發明提供一種生物活性劑之經口投與水棲或陸棲物種的組成物，所述組成物包含粒子，各粒子包含分散於油滴中之生物活性劑，所述油滴分散於包含腸溶性塗佈聚合物之基質中，其中所述粒子各自更包含黏膜黏著性聚合物。
在另一態樣中，本發明提供一種向動物胃後傳輸生物活性劑之方法，所述方法包含向所述動物經口投與如上所述之組成物的步驟，其中所述生物活性劑為免疫原。
在另一態樣中，本發明提供一種對水棲或陸棲物種進行疫苗接種之方法，所述方法包含向所述物種經口投與如上所述之組成物的步驟，其中所述組成物為疫苗之傳輸媒劑。
在另一態樣中，本發明提供一種製備組成物之方法。所述方法依序包含： (a)形成包含分散或溶解之生物活性劑的水性混合物； (b)使步驟(a)之所述水性混合物在油中均質化以產生所述水性混合物於所述油中之乳液； (c)形成步驟(b)之產物於包含腸溶性塗佈聚合物之水溶液中的漿液；以及 (d1)將步驟(c)之漿液噴入、滴入或注入含有針對所述腸溶性塗佈聚合物之交聯劑的水溶液中以形成粒子，其中步驟(a)之所述水性混合物更包含黏膜黏著性聚合物，或 (d2)由步驟(c)之漿液形成粒子，其中步驟(b)更包含在黏膜黏著性聚合物水溶液中形成所述乳液之液滴，且與黏膜黏著性聚合物交聯以形成中間物粒子。
本申請案主張2013年12月6日申請之美國申請案第61/912,958號之優先權權益，所述申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。
除非本文中另外定義，否則本發明所採用之科學及技術術語將具有一般熟習此項技術者通常所理解及使用之含義。此外，如本文以及申請專利範圍中所使用，術語「至少一個(種)(at least one)」與「一個(種)或多於一個(種)(one or more)」具有相同含義且包含一個(種)、兩個(種)、三個(種)或多於三個(種)。除非另外指明，否則組成物中之組分之百分比或份數以重量計。術語「分散(dispersed)」意謂懸浮及/或溶解。
「經口疫苗接種(Oral vaccination)」定義為經由飲食經口投與免疫原性材料以刺激動物之全身性免疫系統，以產生對病原體之特異性免疫反應。
「交聯(Crosslink)」及其變化形式是指兩種或多於兩種材料及/或物質經由一個或多於一個共價及/或非共價(例如，離子)結合而鍵聯，所述材料及/或物質包含本文所揭示之那些中的任一者。交聯可自然地(例如，胱胺酸殘基之二硫鍵)或經由合成或半合成途徑實現。帶電聚合物之交聯可藉由與帶相反電荷之多價相對離子的離子結合來實現。可藉由所述交聯製備堅固的固體結構，例如水凝膠。
「胃保護(Gastric protection)」是指保護生物活性劑免受胃破壞且免於活性損失。
本發明之組成物包含顆粒狀材料，所述顆粒狀材料包括生物活性劑及黏膜黏著性聚合物，其中所述生物活性劑分散於油中。油滴隨後包埋在腸溶性塗佈聚合物之外部基質中或經其塗佈。由於所述聚合物在低pH值下仍保持不溶且保持為完好保護塗層或層，因此所述外部基質包圍油滴，從而保護內容物免於曝露於動物胃中之低pH值條件。粒子之平均幾何尺寸(有時稱為直徑)通常在10微米至5000微米之範圍內，且可直接形成在所述尺寸範圍內或藉由碾磨、研磨或其他方式減小至所述尺寸。粒子直徑通常小於100微米，較佳小於50微米。
在一些實施例中，將黏膜黏著性聚合物及生物活性劑混合在一起且相互接觸，在粒子內結合在一起，隨後分散於油滴中。這些粒子中之一者或多於一者存在於單個油滴內，且一個或多於一個小油滴存在於外部基質內。黏膜黏著性聚合物及/或腸溶性塗佈聚合物可經交聯或未經交聯。
在其他實施例中，生物活性劑如上分散於油滴內，且這些隨後包埋在黏膜黏著性聚合物中。所得粒子隨後包埋在腸溶性塗佈聚合物之外部基質中。黏膜黏著性聚合物及/或腸溶性塗佈聚合物可經交聯或未經交聯。
在一些實施例中，本發明提供一種用於經口投與疫苗以刺激水棲及陸棲物種中抵抗特定疾病之免疫反應的組成物。所述組成物包括有效量之抗原作為生物活性劑。本發明組成物經設計使生物活性材料與動物之腸黏膜接觸以刺激吸收及黏膜免疫力。本發明之組成物通常與飼料或醫藥學上可接受之載劑一起經口投與，包含例如水(例如動物飲用水)、錠劑、膠囊、藥團劑型、飼料小丸劑或作為食物添加劑，以便將所述組成物帶入目標物種之腸道中。
本發明之組成物在向個體傳輸生物活性劑方面提供若干優勢。首先，製造傳輸系統之方法不使用其他方法製備粒子通常需要之有機溶劑或高溫及pH值。藉由在製備本發明組成物之全程中保持水性環境處於溫和pH值條件及低溫下，可經口傳輸敏感生物活性劑(諸如減毒活細菌或病毒)。第二，額外腸溶性塗佈聚合物層保護生物活性劑以免在胃腸道中降解。在免疫原之情況下，這允許以較少量之抗原/疫苗刺激相同的免疫反應。第三，油分散液封閉生物活性劑，在製備期間以及在暴露於胃期間防止諸如蛋白、肽之較小生物活性分子及藥物瀝濾至水溶液環境中。另外，黏膜黏著性聚合物自身提供佐劑效果。最後，傳輸系統可容易地調配以有效傳輸至水棲及陸棲物種。
用於製備本發明組成物之全部組分通常為食品級、無毒且生物可降解的，且通常為天然存在的。以下描述適用於製備所述組成物之材料。生物活性劑
生物活性劑可為能夠直接或間接地引發一種或多於一種物理、化學及/或生物效應的天然存在的、合成的或半合成的材料(例如，化合物、醱酵物、提取物、細胞結構)。生物活性劑可能能夠預防、緩解、治療及/或治癒活體之異常及/或病理狀況，諸如藉由破壞寄生有機體或藉由限制疾病或異常之效應。視效應及/或其應用而定，生物活性劑可為藥劑(諸如預防劑或治療劑)、診斷劑及/或化妝品用試劑，且包含而不限於疫苗、藥物、前藥、親和力分子、合成有機分子、激素、抗體、聚合物、酶、低分子量分子蛋白質化合物、肽、維生素、類固醇、類固醇類似物、脂質、核酸、碳水化合物、其前驅物及其衍生物。生物活性劑亦可為營養補充劑。非限制性營養補充劑包含蛋白質、碳水化合物、水溶性維生素(例如維生素C、B複合維生素及其類似物)、脂溶性維生素(例如維生素A、維生素D、維生素E、維生素K及其類似物)、礦物及草本提取物。生物活性劑可得自市面及/或藉由已知技術製備。
本發明中之生物活性劑包含而不限於疫苗(疫苗亦可作為免疫刺激複合物、抗原與霍亂毒素及其B次單元、凝集素及佐劑之結合物之一部分加以傳輸)、抗生素、親和力分子、合成有機分子、聚合物、低分子量蛋白質化合物、肽、維生素、類固醇、類固醇類似物、脂質、核酸、碳水化合物、其前驅物及其衍生物。生物活性劑亦可為殺蟲劑，例如滅鼠劑。
生物活性劑可為免疫原，亦即，能夠在動物體內建立特異性免疫反應之材料。免疫原之實例包含抗原及疫苗。舉例而言，免疫原可包含免疫原性肽、蛋白質或重組蛋白，包含包括免疫原性肽及/或蛋白質及細菌(例如菌苗)之混合物；完全的滅活、減毒及感染性病毒粒子；完全的殺死、減毒及感染性原核生物；完全的殺死、減毒及感染性原生動物，包含其任何生命週期階段；以及完全的殺死、減毒及感染性多細胞病原體、重組次單位疫苗及重組載體，以傳輸及表現編碼免疫原性蛋白(例如DNA疫苗)的基因。
一種或多於一種生物活性劑通常構成粒子重量(不包括水)之至少0.1%，或至少1%，或至少5%。通常，其構成至多40%或至多20%或至多10%。黏膜黏著性聚合物
黏膜黏著性聚合物為特異性結合黏膜組織之聚合物，且為有助於保持生物活性劑緊密接近黏膜，從而改良投藥之聚合物。適合之實例包含合成聚合物，諸如聚(丙烯酸)、羥丙基甲基纖維素及聚(丙烯酸甲酯)、經羧酸官能化之聚合物、經硫酸官能化之聚合物、經胺官能化之聚合物及其衍生物或改質形式；以及天然存在之聚合物，諸如角叉菜膠、玻尿酸、聚葡萄胺糖、陽離子瓜爾豆膠及海藻酸鹽。亦可使用天然存在之聚合物之衍生型式或其他改質型式，且許多所述聚合物為此項技術中已知的。非限制性實例包含丙二醇海藻酸酯及果膠、羧甲基聚葡萄胺糖、羧甲基甲殼素、甲二醇聚葡萄胺糖、三甲基聚葡萄胺糖及其類似物。
較佳黏膜黏著性聚合物為聚葡萄胺糖及經改質或衍生化之聚葡萄胺糖，其可藉由對甲殼動物外骨骼之主要化合物甲殼素進行去乙醯化而獲得。聚葡萄胺糖[a-(1~4)-2-胺基-2-去氧-ß-D-葡聚糖]為與纖維素密切相關之黏多糖，其展現由分子量、去乙醯化程度及黏度決定之化學特性。聚葡萄胺糖可形成微米粒子及奈米粒子，所述粒子可藉由與諸如磷酸根離子、戊二醛或硫酸根離子之交聯劑進行化學反應而結合大量抗原。
儘管一些較佳實施例中使用聚葡萄胺糖，但可使用其他聚合物以達成類似黏膜黏著功能。這些包含但不限於明膠、海藻酸鹽、聚葡萄糖、玻尿酸、瓊脂及抗性澱粉。
一種或多於一種黏膜黏著性聚合物通常構成粒子重量(不包括水)之至少1%，或至少10%，或至少15%。其通常構成至多50%，或至多30%，或至多20%。油
在典型傳統產物中，大量生物活性劑因在其製備及通過胃通道期間自粒子中瀝出而損失至水性環境中，尤其是分子尺寸較小之生物活性劑，諸如病毒、蛋白質、藥物、抗生素、殺蟲劑及其類似物。在本發明中，自粒子中釋出的生物活性劑大部分是以離散粒子形式散逸，而含有生物活性劑之部分(domain)或相則分散於油中或經油塗佈。可使用任何類型之油，包含呈液體或固體形式之植物油、動物油或合成油及脂肪或蠟來塗佈生物活性劑。本發明中所使用之植物來源油包括而不限於蓖麻油、椰子油、可可脂、玉米油、棉籽油、橄欖油、橄欖鯊烷、棕櫚油、花生油、芥花油、紅花油、芝麻油、大豆油、葵花油、硬脂酸酯、巴西棕櫚蠟及其混合物。本發明中所使用之動物來源油包括而不限於魚油、鯊魚鯊烷、乳脂、蜂蠟、羊毛蠟、豬油及其類似物。在一些情況下，分散油為橄欖油或鯊魚鯊烷與任何其他類型之油、脂肪或蠟之混合物。油之質量通常大於生物活性劑與黏膜黏著性聚合物之總質量。
在典型程序中，以1份溶液比1.1-5份油之重量比使含有生物活性劑及黏膜黏著性聚合物之水溶液與油均質化，直至產生均勻乳液。為了輔助形成均勻且穩定之乳液，可添加非離子界面活性劑。適合之非離子界面活性劑包含而不限於乙氧基化脂族醇、聚氧乙烯界面活性劑及羧酸酯等。在形成穩定乳液之後，藉由黏膜黏著性聚合物之化學或物理反應使分散於油中之水性液滴固化。舉例而言，藉由降低溫度或改變乳液之pH值來固化明膠及瓊脂聚合物；而藉由使乳液之pH值升高至6.5以上及/或藉由添加諸如三聚磷酸(tripolyphosphate，TPP)鈉之相對離子來固化聚葡萄胺糖。
一種或多於一種油通常構成粒子重量(不包括水)之至少1.5%，或至少10%，或至少20%。其通常構成至多40%，或至多30%，或至多25%。腸溶性塗佈聚合物
將含有黏膜黏著性聚合物或經其塗佈之油分散液之液滴分散於腸溶性塗佈聚合物之基質中，所述基質為生物活性劑提供胃保護及完整胃後釋放或傳輸，亦即釋放於腸道中。
例示性腸溶性塗佈聚合物包含在足夠高之pH值下可溶於水、但在低pH值下不溶於水的聚合物。通常，其在大於5.0之pH值下為可溶的，且在小於4.0之pH值下為不可溶的。適合之聚合物在欲釋放生物活性材料之動物腸道中之相對溫和pH值條件下為實質上可溶或可消化的，但在胃中為不可溶且不可消化的，其中腸溶性塗佈聚合物之外部基質保護敏感生物活性劑免於劣化。在一些情況下，腸溶性塗佈聚合物例如與二價陽離子交聯以防止在胃中溶解或消化。
適合之腸溶性塗佈聚合物可選自各種親水性聚合物中之任一種，包含例如聚丙烯酸、聚(甲基)丙烯酸酯、羧甲基纖維素、甲基纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素及水溶性、天然或合成多醣膠。一種例示性合成腸溶性塗佈聚合物為Eudragit® FS30D(贏創工業(Evonik Industries))。海藻酸鈉及果膠由於其溫和交聯條件而成為較佳水溶性膠。
海藻酸鹽特別由於其在形成固體膠組成物方面之易用性而成為胃敏感性生物活性劑之較佳親水性載劑基質。海藻酸鹽溶液在與二價陽離子合併或混合時形成固體凝膠。在一些實施例中，儘管海藻酸鹽未交聯，但其在胃環境中保持不可消化性及不可溶性，且因此當處於動物胃之低pH值條件下時保護粒子內容物。
海藻酸鹽包括不同比例之1,4-鍵聯β-D-甘露糖酸(M)、α-L-古洛糖酸(G)及交替(MG)嵌段。海藻酸鹽溶液之黏度主要藉由M/G嵌段之分子比率決定。低黏度海藻酸鹽通常含有最少50%甘露糖酸單元，且其黏度在20毫帕至200毫帕範圍內。中等黏度及高黏度海藻酸鹽含有最少50%古洛糖酸單元且其黏度通常超過200毫帕。
在一些實施例中，形成聚合物之基質為海藻酸鹽、果膠或其混合物。低黏度級海藻酸鹽及低甲氧基果膠較佳。典型低甲氧基果膠之甲基化程度低於50%，且這些果膠通常與諸如Ba、Ca、Mg、Sr或Zn之二價陽離子交聯。
一種或多於一種腸溶性塗佈聚合物通常構成粒子重量(不包括水)之至少10%，或至少20%，或至少30%。其通常構成至多70%，或至多50%，或至多40%。視情況存在之成分
在一些實施例中，除主要生物活性劑以外，所述組成物視情況包含營養物質、營養藥劑、誘食劑及/或味覺掩蔽化合物。亦可包含穿透增強劑或佐劑以引發強免疫反應且改良黏膜淋巴細胞吸收抗原。一種例示性佐劑為β葡聚糖。製造組成物
第一種製造粒子之通用方法如下。將包括分散生物活性劑及黏膜黏著性聚合物之水性混合物與油均質化以產生水性混合物於油中之乳液。通常使用1份水性混合物對1.1-5份油之重量比來製造乳液。隨後使乳液在包括腸溶性塗佈聚合物之水溶液中形成漿液，且將所述漿液噴入、滴入或注入含有針對所述腸溶性塗佈聚合物之交聯劑的水溶液中，從而形成粒子。
在第二種通用方法中，將包括分散生物活性劑之水性混合物與油均質化以產生水性混合物於油中之乳液。通常使用1份水性混合物對1.1-5份油之重量比來製造乳液。隨後使乳液之液滴分散於黏膜黏著性聚合物水溶液中，進行交聯以形成可視情況自交聯溶液中分離之中間物粒子。隨後使經分離或未分離之中間物粒子在包括腸溶性塗佈聚合物之水溶液中形成漿液。藉由噴霧乾燥或藉由冷凍乾燥及碾磨來形成粒子。
在一種製造組成物之特定方法中，使含有與黏膜黏著性聚合物結合之生物活性劑之分散粒子的油在視情況包含1%至3%低甲氧基果膠之5%至15%低黏度級海藻酸鈉溶液中形成漿液，且將所述漿液注入、滴入或噴霧霧化至諸如氯化鈣之二價陽離子之水溶液中。可藉由向氯化鈣溶液中傳輸海藻酸鹽分散液之速率及方法來調節所得基質粒子之大小。在另一實施例中，藉由使用此項技術中已知的任何乾燥方法，例如噴霧乾燥或真空乾燥，在不使海藻酸鹽交聯之情況下乾燥所述漿液。所得粒子之大小通常在約20微米至約8毫米之範圍內，更通常在約50微米至約1000微米之範圍內。
在一種替代特定方法中，將0.5%至2%不可溶二價陽離子源(諸如CaCO3 )添加至含生物活性劑之油滴於海藻酸鈉溶液中之漿液中，隨後添加0.5%至1%弱有機酸(諸如葡萄糖酸-△-內酯(glucono-delta-lactone，GDL))作為酸化劑以緩慢釋放陽離子，諸如鈣離子。陽離子使海藻酸鹽交聯以形成固體餅膠，其可切短或碾碎成小碎塊或粒子。所得碎塊或粒子之大小通常在約50微米至約10毫米之範圍內，更通常在約100微米至約5000微米之範圍內。熟練從業者應認識到，可使用基於離子相互作用之親和力，利用其他天然或合成聚合物(較佳為陰離子聚合物)形成本發明組成物之基礎。使用組成物
本發明組成物可呈水性懸浮液形式儲存，或藉由此項技術中已知的任何乾燥方法進行乾燥且以脫水狀態長期儲存而無顯著活性損失。
本發明之組成物可作為飲用水之組分、作為食物添加劑或作為含有醫藥學上可接受之載劑及視情況存在之佐劑的疫苗調配物的一部分經口投與。或者，本發明組成物可包含於其他標準經口劑型中。熟習此項技術者應瞭解，存在多種適用於向目標動物傳輸組成物的技術公認之食物、飼料、營養藥劑或醫藥劑型及可接受之載劑。
可以單次或多次劑量方案實現根據本發明之組成物之投與。在一個實施例中，以在約3天至約10天或更長之時期內投與之多次劑量方案投與免疫原性組成物，且可在目標物種證明免疫性之損失時進行週期性重複。
為了應用於豬、家禽、牛或水棲動物之飲用水，可將其他油或惰性聚丙烯或聚酯粒子併入組成物中以增加浮力(亦即，降低密度)，使得用於在魚類養殖池中進行傳輸之供水裝置可用於傳輸本發明組成物。因此，所述組成物可作為動物日常飼料之組分或其飲用水之組分投與動物。 實例實例 1a 製備本發明之組成物
如下製備本發明之組成物。在50℃下將3公克黏膜黏著性聚合物(聚葡萄胺糖，FMC生物聚合物公司(FMC Biopolymers Inc.))溶解於100毫升0.5 N冰醋酸溶液中。用氫氧化鈉將溶液之pH值調節至5.8且允許溶液冷卻降至室溫。添加吐溫80(Tween 80)(0.2%，西格馬公司(Sigma)，聖路易(St Louis)，密蘇里州(MO))及消泡劑(0.5%，西格馬，聖路易，密蘇里州)，且將聚葡萄胺糖溶液保持在4℃下直至使用。將30毫升含有300毫克卵白蛋白(ovalbumin)(「(OVA)」，一種模型疫苗)之溶液添加至聚葡萄胺糖溶液中，以產生混合物。將所得溶液添加至195公克含有5%斯潘80(Span-80)(西格馬公司)之橄欖油中，且在冰浴中在10,000轉/分鐘下均質化30分鐘，以形成油包水型乳液。將20毫升三聚磷酸鈉水溶液(5%)及0.5 N NaOH在混合下緩慢添加至連續油相中含有卵白蛋白及交聯聚葡萄胺糖微米粒子的生物活性劑乳液中。允許粒子硬化至少2小時，但並未自油相中移除。
將粒子於油中之分散液攪拌成330毫升9%低黏度級海藻酸鈉(FMC生物聚合物公司)水溶液，其亦包含66公克寡醣(即溶型菊糖，嘉吉公司(Cargill)，明尼阿波利斯(Minneapolis)，明尼蘇達州(MN))、10公克卵磷脂及3公克吐溫-80。將所得水性分散液注入含有5% CaCl2 之交聯溶液中，以形成海藻酸鹽基質珠粒，各珠粒含有多個油滴，所述油滴又各自含有卵白蛋白及交聯聚葡萄胺糖之微米粒子。將珠粒冷凍乾燥且碾磨成大小低於150微米之粒子，以獲得本發明之乾組成物。實例 1b
一種形成本發明組成物之替代方法利用生物活性劑水溶液於油中之乳液。將10毫升含有100毫克卵白蛋白之水溶液與15公克含有5%斯潘-80之芥花油合併且均質化，以形成精細油包水型乳液。將所述乳液與100毫升3%聚葡萄胺糖水溶液混合，且將分散液注入含有5%三聚磷酸溶液(5% TPP)之交聯溶液中。允許粒子硬化至少2小時。所得固體交聯聚葡萄胺糖粒子含有經包埋之油滴，且這些油滴各自又含有卵白蛋白水溶液之小於10微米之分散液滴。藉由過濾分離固體粒子且將其精細地分散於400毫升9%低黏度級海藻酸鹽水溶液中。將所得水性分散液注入含有5% CaCl2 之交聯溶液中，以形成海藻酸鹽基質珠粒。將所述珠粒冷凍乾燥且碾磨成大小低於150微米之粒子，以獲得本發明之乾組成物。實例 2 製備免疫 原性組成物
在50℃下將聚葡萄胺糖(3公克，FMC生物聚合物公司)溶解於100毫升0.5 N冰醋酸溶液中。用氫氧化鈉將溶液之pH值調節至5.8且允許溶液冷卻降至室溫。將10毫升含有100毫克卵白蛋白(OVA，作為模型疫苗)之溶液與50毫克免疫刺激劑(β葡聚糖，AHD國際公司(AHD International)，亞特蘭大(Atlanta)，佐治亞州(GA))混合且添加至聚葡萄胺糖溶液中。使所得混合物在150公克含有5%重量/重量斯潘-80之鯊魚鯊烷油(傑德沃德國際公司(Jedwards International))中在10,000轉/分鐘下乳化30分鐘，以形成連續油相中含OVA水溶液液滴、聚葡萄胺糖及β葡聚糖之乳液。在攪拌下將所述乳液添加至400毫升9%低黏度級海藻酸鈉於0.5 N NaOH中之水溶液中，所述水溶液亦含有寡醣(40公克，即溶型菊糖)。將所得乳液注入5% CaCl2 溶液中以使海藻酸鹽交聯，從而產生本發明之免疫原性組成物。將所述組成物冷凍乾燥且碾磨成大小低於250微米之粒子。實例 3 製備用於治療 / 預防魚類寄生蟲感染之組成物
製備含有用於治療魚類寄生蟲感染之蛋白質抗原或殺寄生蟲化合物的組成物。將10毫克生物活性劑溶解於10毫升如以上實例2中所述之3%聚葡萄胺糖水溶液中，且在15公克含有75%橄欖油、20%鯊烷油及5%斯潘-80之油混合物中乳化。
將1毫升5%三聚磷酸鈉水溶液、0.5 N NaOH溶液在1公克橄欖油中乳化且混入生物活性劑乳液中，產生含有生物活性劑及交聯聚葡萄胺糖之粒子於油中之分散液。允許分散液靜置2小時以使交聯聚葡萄胺糖硬化。在攪拌下將所得粒子於油中之分散液添加至20毫升含有9%低黏度級海藻酸鈉、1%低甲氧基果膠、30%重量/重量即溶型菊糖及1%吐溫-80之溶液中。將所得混合物注入含有3% CaCl2 之交聯溶液中，以形成含有經包埋之分散油滴的海藻酸鹽-果膠基質珠粒，各分散油滴又含有生物活性劑及交聯聚葡萄胺糖之微米粒子。將該等珠粒冷凍乾燥且碾磨至小於150微米，以獲得本發明之乾組成物。實例 4 製備含有醫藥學藥物之組成物
製備含有用於治療結腸疾病之醫藥學藥物(糖皮質激素，諸如地塞米松(dexamethasone)或甲基潑尼龍(methyl prednisolone))之組成物。將所述藥物添加至如以上實例1或實例2中所述之聚葡萄胺糖溶液中，且在95%鯊烷油與5%斯潘-80之混合物中乳化。製備含有處於0.5 N NaOH中之5%三聚磷酸鈉於鯊烷油中之鹼性乳液，且緩慢混入(20%重量/重量)生物活性劑乳液中以使聚葡萄胺糖交聯，且允許所述混合物靜置至少2小時以使經交聯之粒子硬化。以1:3乳液/尤特奇(Eudragit)液體之比率將聚葡萄胺糖微米粒子之油分散液混入含有腸溶性塗佈聚合物(30%重量/重量尤特奇® FS30D, 贏創工業公司)之液體中，且噴霧乾燥，以形成本發明之乾顆粒狀組成物。實例 5 生物活性劑於本發明組成物中之囊封效率
藉由使用卵白蛋白(OVA)模擬典型蛋白藥物或疫苗來評估其他油分散液及腸溶性塗佈聚合物基質在本發明組成物中之作用。製備三種含有OVA(西格馬公司)之組成物。藉由將100毫克OVA溶解於10毫升3%聚葡萄胺糖溶液中來製備由OVA結合型聚葡萄胺糖微米粒子組成之組成物1，且將所述溶液注入10% TPP水溶液中，以形成交聯珠粒，隨後保持2小時以使所述珠粒硬化，且隨後冷凍乾燥並碾磨。藉由在15公克含有3%斯潘-80之鯊烷油中乳化10毫升含有100毫克OVA之水溶液來製造組成物2，且將所得乳液混合於20毫升3%聚葡萄胺糖溶液中。隨後將所得漿液注入10% TPP溶液中以形成珠粒，隨後如上進行硬化、冷凍乾燥及碾磨。如實例2中製備由OVA結合型聚葡萄胺糖微米粒子組成之本發明組成物3。
如下測定OVA在三種類型組成物中之囊封效率。使500毫克各組成物分散於10毫升RIPA緩衝劑中且在室溫下培育30分鐘。將懸浮液渦旋5分鐘，接著在3000轉/分鐘下離心15分鐘。使用如下之西方墨點分析來分析上清液之OVA含量。
西方墨點法：如上所述用RIPA緩衝液溶解組成物，且將等效於12微克蛋白質/樣本之計算量負載於10% SDS-聚丙烯醯胺梯度凝膠(SDS-PAGE，伯樂公司(Bio-Rad)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亞州(CA))上。將蛋白轉移至PVDF膜(伯樂公司)上且在含有0.5%吐溫-20之PBS(PBS-T)中用5%無脂乳阻斷1小時。在1:5000稀釋度下在室溫下將墨點與適當初級抗體一起培育1小時。用PBS-T(3×10毫升，各5分鐘)洗滌之後，在1:5000稀釋度下將膜與適當HRP結合型二級抗體(EMD密理博公司(EMD Millipore Corporation)，比勒利卡(Billerica)，馬薩諸塞州(MA)，美國(USA))一起培育1小時。用PBS-T(3×10毫升，各5分鐘)洗滌之後，用ECL基質(阿姆舍蘭生物科學公司(Amsheram Biosciences))對化學發光膜進行顯影。OVA之囊封效率(OVA原始量之保留百分比)呈現於表1中。 表1
組成物 囊封效率(%)
1 70
2 95
3 95
結果顯示組成物2及組成物3中之油分散液在防止生物活性劑瀝出(損失)至簡單水性環境方面的保護作用。然而，如以下實例7中所述，當在胃條件下測試時，發現比較組成物2與本發明組成物3之間存在顯著差異。實例 6 無保護蛋白抗原活性在模擬胃液中降級
為了評估蛋白抗原在典型胃曝露之後的活性損失，在37℃下，在振盪器上將未囊封OVA(10毫克)在10毫升含0.08%胃蛋白酶之模擬胃液pH 2中培育2小時。在15分鐘、30分鐘、60分鐘及120分鐘培育時間抽取培養基，且使用如上所述之西方墨點分析來分析殘餘OVA之量。表2顯示曝露於模擬胃液中超過2小時之OVA降級，指示為相對於曝露前活性的剩餘活性百分比。 表2
時間(分鐘) 剩餘活性(%)
15 61
30 55
60 38
120 2
這些結果顯示，無保護之蛋白類抗原或生物活性劑的活性在動物消化道中將完全降級。實例 7 本發明組成物中對生物活性劑的胃保護
為了評估胃曝露之後蛋白抗原之剩餘活性，如實例5中所述製備三種組成物。在37℃下，在振盪器上將三種組成物各500毫克在10毫升含0.08%胃蛋白酶之模擬胃液pH 2中培育2小時。在2小時曝露結束時，抽取胃液且如實例5中所述量測組成物中OVA之剩餘活性。表3顯示曝露於模擬胃液2小時之後，各組成物中之OVA的剩餘活性。 表3
組成物 剩餘活性(%)
1 10
2 20
3 90
這些結果清楚顯示，相對於先前技術組成物1及組成物2，本發明之組成物3具有優越胃保護作用。實例 8 組成物中之海藻酸鹽之黏度等級對胃保護之作用
根據以上實例2製備三種含有9%低級黏度海藻酸鹽(50厘泊)、6%中級黏度海藻酸鹽(300厘泊)及1%高級黏度海藻酸鹽(800厘泊)之組成物。如實例7中所述使三種組成物曝露於模擬胃液，且如實例5中所述量測組成物中之OVA之剩餘活性。表4顯示曝露於模擬胃液2小時之後，各組成物之OVA之剩餘活性。 表4
海藻酸鹽黏度等級 剩餘活性(%)
高(800厘泊) 25
中等(300厘泊) 40
低(50厘泊) 90
這些結果顯示，含有較低黏度等級海藻酸鹽之組成物在模擬動物消化道中向蛋白類抗原或生物活性劑提供更好保護。實例 9 本發明組成物之最佳粒度
在本實施例中，評估在模擬胃環境中對經乾燥及碾磨之本發明組成物之粒度的保護作用。如實例5中所述製備OVA組成物，隨後將乾粉末分成2種粒度：通過50微米篩網之小粒子，及被截留在50微米篩網上但通過100微米篩網之大粒子。表5顯示曝露於模擬胃液中2小時之後，各粒度組成物中之OVA的剩餘活性。 表5
粒度 剩餘活性(%)
50-100微米 90
＜50微米 40
這些結果顯示，當乾組成物被碾磨至大於50微米之粒度時，提供最佳胃保護。實例 10 向小鼠經口投與 OVA 組成物
向小鼠經口投與卵白蛋白，以測試本發明組成物在誘導免疫反應方面之效力。
動物：使用10週齡至12週齡雌性BALB/C小鼠。允許小鼠任意取食。各實驗組圈養於單獨的籠中。
卵白蛋白組成物：如實例5中所述將卵白蛋白(1毫克/公克卵白蛋白，西格馬公司，聖路易，密蘇里州)併入本發明組成物中。之如下對三組小鼠(每組4隻)進行接種：1)經口投與含卵白蛋白(OVA)之組成物，2)皮下(subcutaneously，SC)投與OVA溶液，3)經口投與無抗原組成物。在0週及3週時對小鼠進行接種。各劑量投與總共100毫克塗佈於飼料球粒上的乾組成物與玉米油混合物，乾組成物/油之比率為1:2重量/重量。在第4週時將各小鼠處死且收集血清及脾細胞。
免疫分析：藉由ELISA分析血清之IgG及IgA。使用吸附至聚苯乙烯板之OVA進行ELISA。在1:25之血清稀釋度下將樣品一式三份置放於各孔中。使用與辣根過氧化酶結合之山羊抗小鼠抗體，隨後使用鄰苯二胺基質(西格馬公司，聖路易，密蘇里州，美國)。藉由將板置放於微量滴定板分光光度計中且在490奈米下對板進行讀數來測定各孔之光學密度。使用先前所述之技術測試脾細胞中之OVA特異性抗體分泌細胞(antibody secreting cells，ASC)。
藉由測定光學密度隨時間增加來定量OVA特異性IgG及IgA抗體。預期接種OVA之各小鼠的OVA特異性血清以及IgA、IgG及ASC分泌細胞在注射OVA且經口攝入本發明組成物的那些小鼠中同樣有所增加。預期將在攝入無抗原組成物之小鼠中無法偵測到OVA特異性IgG或IgA抗體。因此，預期所述組成物在經口投予後誘導免疫反應方面是有效的。實例 11 向雞 隻經口投予含有抗原之組成物
沙門氏菌腸炎(Salmonella enteritidis )為產蛋母雞的一個主要病因。感染會降低產量且增加雞群死亡率。此外，沙門氏菌腸炎可通過雞蛋傳遞至小雞，從而感染後代或食用經感染之雞蛋的人類。由於感染始於此細菌附著並侵入腸黏膜，且長期感染涉及腸淋巴組織感染，因此刺激黏膜免疫力對控制這種疾病而言不可或缺。
為了評定用本發明之疫苗組成物對雞進行接種之效力，將沙門氏菌腸炎之鞭毛蛋白(一種關鍵免疫原)併入實例2之組成物內，不同之處在於以1:2重量/重量之比率將疫苗乳液混合於鹼性海藻酸鈉相中且將所述漿液噴霧乾燥。將乾組成物塗佈於飼料表面上且經口投與雞隻。10週齡雞隻以2週之間隔接受3次經口投配負載有300微克沙門氏菌腸炎之鞭毛蛋白抗原或牛血清白蛋白的組成物。在最後一次經口投配抗原之後一週，收集血清及腸液且藉由ELISA分析鞭毛蛋白特異性抗體。預期結果顯示經口接種之鳥類血清中具有顯著增加之鞭毛蛋白特異性抗體。實例 12 向牛犢經口投予含有抗原之組成物
顯示經口投與根據本發明製備的含有卵白蛋白之組成物刺激牛犢肺中之免疫反應的效力。
將卵白蛋白併入如實例1a中所述之組成物中。為了經口投予牛犢，在飼料中投與含有40微克卵白蛋白/毫克之劑量的組成物。每個實驗組使用4個牛犢且各牛犢連續5天接受5毫克卵白蛋白/劑量。
使用兩組牛犢來評定經口投與卵白蛋白誘導特異性免疫反應之效力。第1組藉由皮下(SC)注射間隔3週投配2次含卵白蛋白之不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)。此組充當非經腸對照組，接種方法常規地用於任何疫苗。第2組間隔3週接受2個含有卵白蛋白之組成物之經口療程。評估血清對卵白蛋白之同型抗體反應。預期結果顯示經口攝入含OVA組成物之牛犢中產生大量OVA特異性IgG及IgA。預期極高血清IgA含量預示在牛體內刺激全身性免疫反應之有效性較高。實例 13 向魚類經口投予含弧菌抗原之組成物
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus )為水產養殖中的一種嚴重細菌感染，在虹鱒魚中尤其嚴重。目前其在所有產鱒魚之國家中為地域性的，在所述地域可造成嚴重經濟損失。其亦正變成養殖鮭魚之更主要的病原體，主要是在淡水生長階段，但已報導其亦在海洋中造成損失。疫苗接種可防止溶藻弧菌在鮭魚養殖週期之任何階段造成顯著影響。典型疫苗接種方案涉及對2至5公克魚苗進行初次疫苗接種以及在初次疫苗接種之後4個月至6個月進行經口強化接種。然而，理想疫苗接種方案將涉及僅定期向魚類提供一種類型疫苗接種，以便在整個培養期中在魚類血清中維持有效抗體效價。
實驗設計：顯示經口投與含有根據本發明製備之組成物的ERM疫苗在鱒魚血清中刺激免疫反應的效力。
將減毒溶藻弧菌併入如實例1b中所述之組成物內。為了經口投與魚類，在飼料中投與含有2微克溶藻弧菌疫苗/毫克劑量之組成物。每個實驗組使用20條平均大小為5公克之魚，且各魚連續5天接受1劑量含溶藻弧菌疫苗之飼料日量。
使用三組魚來評定經口投與溶藻弧菌疫苗相對於標準注射接種在誘導免疫反應方面之效力。使用注射接種方案對第1組進行接種。此組充當非經腸對照組，接種方法常規地用於任何疫苗。第2組接受1個含溶藻弧菌疫苗之組成物的經口療程。第3組接受1個無疫苗組成物之經口療程。接種後6週評估血清對溶藻弧菌之同型抗體反應。預期結果顯示經口攝入含溶藻弧菌之組成物的魚中產生大量溶藻弧菌特異性IgA。預期經口接種及注射接種之魚的血清中的免疫反應相當。預期極高血清IgA含量預示在魚類中刺激全身性免疫反應有效性較高。實例 14 含滅鼠劑之組成物
華法林(Warfarin)為用於控制大鼠及小鼠鼠害的最常見滅鼠劑。攝取含華法林之誘餌的嚙齒動物在15分鐘至30分鐘內展現明顯中毒症狀，且在1小時至2小時內變得無意識。然而，由於其快速見效，嚙齒動物通常僅攝取半致死量之華法林並且在8小時內恢復。囊封華法林可延遲症狀發作，從而允許攝取完全致死劑量。
實驗方法：使用10週齡至12週齡雌性BALB/C小鼠。允許小鼠任意取食。各實驗組圈養於單獨的籠中。
本發明之華法林組成物：大體如實例3中所述將華法林(400毫克/公克組成物，西格馬公司，聖路易，密蘇里州)併入組成物中。如下允許三組小鼠(每組4隻)任意取食：1)本發明之華法林組成物，混合在誘餌中，華法林活性為4%；2)未囊封之華法林，混合在誘餌飼料中，華法林活性為4%；3)含如實例3中之組成物的誘鉺，其不含華法林或其他生物活性劑。監測飼料攝入及對小鼠之殺滅效果。
結果顯示，第1組與第3組之飼料攝入類似，而第2組中之飼料攝入(未囊封之華法林)少25%以上。預期第1組中之所有小鼠在攝食8小時後均死亡，而所有第2組小鼠在攝食8小時後仍存活。

Claims (16)

  1. 一種用於經口投與生物活性劑至水棲或陸棲物種之組成物，其包括粒子，該粒子各自包括分散於油滴中之於水溶液中之生物活性劑及黏膜黏著性聚合物，該油滴包埋在包括腸溶性塗佈聚合物之基質中或經其塗佈。
  2. 如請求項1之組成物，其中該腸溶性塗佈聚合物經交聯。
  3. 如請求項2之組成物，其中交聯該腸溶性塗佈聚合物之交聯劑包括二價金屬陽離子。
  4. 如請求項1至3中任一項之組成物，其中該黏膜黏著性聚合物經交聯。
  5. 如請求項4之組成物，其中該黏膜黏著性聚合物中之該交聯是藉由與三聚磷酸鹽結合而形成。
  6. 如請求項1至3中任一項之組成物，其中該黏膜黏著性聚合物係分散於該油滴中。
  7. 如請求項6之組成物，其中該黏膜黏著性聚合物與該生物活性劑結合。
  8. 如請求項1至3中任一項之組成物，其中該粒子之直徑大於50微米。
  9. 如請求項1至3中任一項之組成物，其中該生物活性劑為免疫原。
  10. 如請求項1至3中任一項之組成物，其中該黏膜黏著性聚合物為一或多種選自由以下所組成之群的聚合物：角叉菜膠、聚葡萄胺糖、玻尿酸、海藻酸鹽、前述任一者之衍生物或改質形式、經羧酸官能化之聚合物、經硫酸官能化之聚合物及經胺官能化之聚合物。
  11. 如請求項1至3中任一項之組成物，其中該腸溶性塗佈聚合物為一或多種選自由以下所組成之群的聚合物：聚(甲基)丙烯酸酯、海藻酸鹽、果膠、羧基甲基纖維素、甲基纖維素及鄰苯二甲酸乙酸纖維素。
  12. 如請求項1至3中任一項之組成物，其中該腸溶性塗佈聚合物基質包括低黏度級海藻酸鹽、低甲氧基果膠或其組合。
  13. 如請求項1至3中任一項之組成物，其中該油為一或多種選自由脂肪、油及蠟所組成之群的油。
  14. 如請求項13之組成物，其中該油為植物油或動物油。
  15. 一種如請求項9之組成物用於製造醫藥品之用途，其中該醫藥品係用於向動物胃後傳輸生物活性劑，且其中該醫藥品係用於經口投與。
  16. 一種如請求項1至14中任一項之組成物用於製造醫藥品之用途，其中該醫藥品係用於對水棲或陸棲物種進行疫苗接種，其中該醫藥品係用於經口投與，且其中所述組成物為疫苗之傳輸媒劑。
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