TW202038976A - 用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物 - Google Patents

用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物 Download PDF

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山田章子
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Abstract

本發明提供一種用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物，其特徵在於：其係包含纖維母細胞作為有效成分者，此處，上述纖維母細胞係損傷較局部存在於上述皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞，上述組合物係應用於上述色素沉著部位或其附近之真皮組織。

Description

用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物
本發明係關於一種包含纖維母細胞作為有效成分之用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物。
皮膚係將生物體內與生物體外之環境分開之覆蓋體表之器官。皮膚作為物理屏障發揮作用，防止乾燥或有害物質侵入至生物體內，對於生命之維持發揮不可缺少之作用。
高等脊椎動物之皮膚自最外層起大致包含表皮、真皮、皮下組織之層。表皮主要包含稱為角質細胞(角化細胞)之細胞，於表皮之最深部(基底層)角質細胞分裂，並且朝向上層分化為棘層、顆粒層，繼而分化為角質層，同時向表面移動，不久便成為皮垢而脫落。
於表皮之基底層存在黑色素細胞，藉由黑色素細胞內之黑素體而生成黑色素。所生成之黑色素被攝取至周圍之角質細胞。被攝取之黑色素與角質細胞之更替一併移行至角質層並耗費約40天向生物體外排出。
認為皮膚之黃褐斑、雀斑等色素沉著之原因在於：因激素之異常或紫外線暴露、局部之炎症等而於黑色素細胞過度形成黑色素或者黑色素顆粒沉著於表皮基底層之角質細胞內等。開發有治療或預防色素沉著，例如由於年齡增長所引起之老年性色素斑等之方法或治療劑(美白劑)，但並未獲得所期待之效果，或雖然獲得暫時性之效果，但存在效果並不持續而復發等課題，從而一直存在開發新治療法或預防法、治療劑之需求。
近年來，開發有使用細胞等之再生醫學，其亦應用於美容領域。例如，於引用文獻1中揭示有以治療皮膚中之色素脫失症為目的之黑色素細胞與纖維母細胞之混合細胞組合物。又，於引用文獻2中揭示有為了抗衰老、尤其是去除皮膚之皺紋，應用自體之皮膚纖維母細胞之方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2007/061168號公報 [專利文獻2]中國專利申請公開第106176561號說明書
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於提供一種用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物。 [解決問題之技術手段]
本發明者等進行了努力研究，結果發現藉由將包含損傷較局部存在於色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞的組合物應用於色素沉著部位或其附近之真皮組織，可治療或預防皮膚之色素沉著。即，本發明包含以下之發明。
[1]一種用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物，其特徵在於：其係包含纖維母細胞作為有效成分者， 此處，上述纖維母細胞係損傷較局部存在於上述皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞， 上述組合物係應用於上述色素沉著部位或其附近之真皮組織。 [2]如[1]之組合物，其中上述色素沉著源自從由老年性色素斑、脂溢性角化症、黃褐斑、雀斑及花瓣狀色素斑所組成之群中選擇1種以上之疾病。 [3]如[1]或[2]之組合物，其中上述纖維母細胞源自生物體之低曝光部位或非曝光部位之組織。 [4]如[1]至[3]中任一項之組合物，其中上述纖維母細胞源自選自由臀部、腹部、胸部、大腿部、上臂部、背部、牙齦、口腔黏膜、頭部、手掌、足底及耳廓後部所組成之群中之組織。 [5]如[1]至[4]中任一項之組合物，其中上述纖維母細胞為自體之纖維母細胞。 [6]如[1]或[2]之組合物，其中上述纖維母細胞為自多能性幹細胞或組織幹細胞分化之纖維母細胞。 [7]如[1]至[6]中任一項之組合物，其中上述纖維母細胞之細胞衰老標記物之表現較局部存在於上述色素沉著部位之纖維母細胞低。 [8]如[7]之組合物，其中上述細胞衰老標記物係從由衰老相關酸性β-半乳糖苷酶(SA-βgal)、細胞週期檢查機制相關因子及細胞衰老相關分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype(SASP))因子所組成之群中選擇1種或2種以上。 [9]如[1]至[8]中任一項之組合物，其係藉由細胞治療而應用。 [10]一種治療或預防皮膚之色素沉著之方法，其特徵在於： 包括將包含纖維母細胞作為有效成分之組合物應用於需要其之對象， 此處，上述纖維母細胞係損傷較局部存在於上述皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞， 上述組合物係應用於上述色素沉著部位或其附近之真皮組織。 [11]一種減輕或預防皮膚之色素沉著之非治療性美容方法，其特徵在於： 包括將包含纖維母細胞作為有效成分之組合物應用於需要其之對象， 此處，上述纖維母細胞係損傷較局部存在於上述皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞， 上述組合物係應用於上述色素沉著部位或其附近之真皮組織。 [發明之效果]
根據本發明，可治療或預防於色素沉著部位產生之黑色素之過度合成。
以下，一面參照圖式等一面對用以實施本發明之形態進行說明，但本發明之技術範圍並不僅限定於下述形態。
本說明書中，「第1」、「第2」、「第3」等用語係用於對一個要素與另一個要素進行區別，例如亦可將第1要素表達為第2要素，同樣地將第2要素表達為第1要素，並不因此脫離本發明之範圍。
只要無特別之定義，則本說明書中使用之用語(技術用語及科學用語)具有與業者通常所理解之用語相同之含義。
＜用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物＞ 於一實施態樣中，本發明提供一種用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物，其特徵在於：其係包含纖維母細胞作為有效成分者，此處，上述纖維母細胞係損傷較局部存在於上述皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞，上述組合物係應用於上述色素沉著部位或其附近之真皮組織。根據本發明，可抑制由存在於表皮之黑色素細胞過度合成黑色素，其結果，可治療或預防皮膚之色素沉著，又，亦可用於減輕或預防皮膚之色素沉著之美容方法。於本說明書中，所謂「色素沉著部位附近之真皮組織」係指存在於色素沉著部位之周邊部的真皮組織，例如距色素沉著部位之邊界為1 cm以內、較佳為5 mm以內、更佳為3 mm以內、最佳為1 mm以內之區域中所包含之真皮組織。
認為色素沉著由如下原因等引起：由於激素之異常或紫外線暴露、局部之炎症等而由黑色素細胞過度形成黑色素，或者黑色素顆粒沉著於表皮基底層之角質細胞內。作為色素沉著，例如由老年性色素斑、脂溢性角化症、黃褐斑、雀斑及花瓣狀色素斑等疾病引起。即，藉由應用本發明，由色素沉著部位之黑色素細胞過度合成黑色素之現象得以抑制，可治療或預防色素沉著，又，亦可用於減輕或預防皮膚之色素沉著之美容方法。
所謂纖維母細胞係構成結締組織之細胞之一，其係存在於大多數器官及組織之細胞。纖維母細胞產生膠原蛋白、彈性蛋白、透明質酸等構成真皮之成分。本發明之組合物包含損傷較局部存在於皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞。於本說明書中，所謂「損傷較局部存在於皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞」係指與局部存在於皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞相比而言，DNA之損傷較少之纖維母細胞。一般而言，細胞中所包含之負責遺傳信息之DNA因活性氧、紫外線、放射線及/或化學物質等而不斷受到損傷。該等DNA損傷藉由細胞所具備之各種DNA修復機制發揮作用而得到修復。然而，若DNA之損傷之發生頻度超過DNA修復速度，則DNA修復變得來不及，DNA損傷累積。其結果，在細胞之DNA中累積變異，細胞衰老之狀態不斷發展。
所謂「損傷較局部存在於皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞」，亦可指細胞衰老程度較局部存在於皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞低之纖維母細胞。又，亦可指相較於局部存在於皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞，細胞尺寸小及/或增殖性高之纖維母細胞。細胞衰老例如可藉由調查細胞衰老標記物之表現而進行評價。作為細胞衰老標記物，例如已知有衰老相關酸性β-半乳糖苷酶(SA-βgal)、細胞週期檢查機制相關因子(例如，p16INK4a 、p21CIP1 及/或p53等)、及細胞衰老相關分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype(SASP))因子等，藉由調查該等之1種或2種以上之表現量，可比較細胞衰老之程度。
SASP因子中，包含炎症性細胞激素、趨化因子、生長因子或細胞外基質降解酶等，但並無限定，例如可列舉：GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，顆粒球巨噬細胞株刺激因子)、GRO(growth-regulated oncogene，生長調節致癌基因)-α、GRO-β、GRO-γ、IGFBP(insulin-like growth factor-binding protein，似胰島素生長因子結合蛋白)-7、IL(interleukin，介白素)-1α、IL-6、IL-7、IL-8、MCP(monocyte chemoattractant protein，單核球趨化蛋白)-1、MCP-2、MIP(macrophage inflammatory protein，巨噬細胞炎性蛋白)-1α、MMP(matrix metalloproteinase，基質金屬蛋白酶)-1、MMP-10、MMP-3、雙調蛋白、ENA(epithelial neutrophil activating peptide，上皮嗜中性球活化肽)-78、伊紅趨素-3(eotaxin-3)、GCP(granulocyte chemotactic protein，顆粒球趨化蛋白)-2、GITR(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，糖皮質素誘導的腫瘤壞死因子受體)、HGF、ICAM(intercellular adhesion molecule，細胞間黏著分子)-1、IGFBP-2、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、IL-13、IL-1β、MCP-4、MIF(macrophage migration inhibitory factor，巨噬細胞遷移抑制因子)、MIP-3α、MMP-12、MMP-13、MMP-14、NAP2(neutrophil activating peptide 2，嗜中性球活化肽2)、腫瘤抑制素M、骨保護素、PIGF(placental growth factor，胎盤生長因子)、RANTES(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，受激活調節正常T細胞表現及分泌因子)、sgp130(soluble glycoprotein 130，可溶性糖蛋白130)、TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinase，金屬蛋白酶組織抑制劑)-2、TRAIL-R3(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor 3，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體3)、Acrp30(adipocyte complement-related protein of 30 kDa，30 kDa脂肪細胞補體相關蛋白)、血管生成素、Axl、bFGF(basic fibroblast growth factor，鹼性纖維母細胞生長因子)、BLC(B lymphocyte chemoattractant，B-淋巴細胞化學引誘劑)、BTC、CTACK(Cutaneous T-Cell Attracting Chemokine，皮膚T細胞虜獲趨化因子)、EGF-R(epidermal growth factor-receptor，表皮生長因子受體)、Fas、FGF(fibroblast growth factor，纖維母細胞生長因子)-7、G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor，顆粒球群落刺激因子)、GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor，膠細胞源性神經營養因子)、HCC-4、I-309、IFN-γ(Interferon-γ，干擾素-γ)、IGFBP-1、IGFBP-3、IL-1R1(interleukin-1 receptor 1，介白素1受體1)、IL-11、IL-15、IL-2R-α、IL-6R、I-TAC、瘦體素、LIF(leukemia inhibitory factor，白血病抑制因子)、MMP-2、MSP-a、PAI( plasminogen activator inhibitor，纖維蛋白溶酶原活化物抑制劑)-1、PAI-2、PDGF-BB(platelet-derived growth factor-BB，血小板衍生生長因子-BB)、SCF、SDF(stromal cell-derived factor，基質細胞衍生因子)-1、sTNFRI(soluble tumor necrosis factor receptor I，可溶性腫瘤壞死因子受體I)、sTNFRII、血小板生成素、TIMP-1、tPA、uPA、uPAR、VEGF、MCP-3、IGF-1、TGF-β、MIP-1-δ、IL-4、FGF-7、PDGF-BB、IL-16、BMP-4、MDC、MCP-4、IL-10、TIMP-1、Fit-3配體、ICAM-1、Axl、CNTF、INF-γ、EGF、BMP-6等。藉由調查該等因子之1種或2種以上之表現量，亦可比較細胞衰老之程度。
作為定量細胞衰老標記物之方法，只要使用公知之方法即可，並無限定，例如可使用ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯結免疫吸附劑分析法)、即時PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)法、西方墨點法、北方墨點法、流式細胞術、或微陣列法等，藉由該等方法，可比較細胞衰老標記物之表現量。藉由將包含損傷較局部存在於皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞，例如細胞衰老標記物之表現量較局部存在於色素沉著部位之纖維母細胞低之纖維母細胞之組合物應用於色素沉著部位或其附近之真皮組織，可治療或預防色素沉著。
於一實施態樣中，本發明中所使用之纖維母細胞亦可使用源自生物體之低曝光部位或非曝光部位之組織的纖維母細胞。本說明書中所謂「生物體之低曝光部位或非曝光部位之組織」係指人類在度過日常生活時之大多數時間中由衣服或毛髮等所覆蓋之部位，且暴露於光之頻度(例如，與臉相比)相對較低之部位，例如可列舉：臀部、腹部、胸部、大腿部、上臂部、背部、牙齦、口腔黏膜、頭部、手掌、足底或耳廓後部等組織。若為源自低曝光部位之組織的纖維母細胞，則暴露於光、尤其是紫外線之頻度較低，因此損傷較少而較佳。於一實施態樣中，本發明中所使用之纖維母細胞可為將生物體組織切碎，藉由膠原酶、胰蛋白酶等蛋白質降解酶處理而獲得之初代纖維母細胞，亦可為對所獲得之初代纖維母細胞進行繼代使其增殖而成之纖維母細胞。又，於一實施態樣中，本發明中所使用之纖維母細胞亦可為使用公知之培養基所培養者。
於一實施態樣中，本發明中所使用之纖維母細胞亦可為源自自體之纖維母細胞。若為源自自體之纖維母細胞，則應用於對象之情形時不會因免疫反應而被排斥，從而較佳。
於一實施態樣中，本發明中所使用之纖維母細胞亦可為自多能性幹細胞或組織幹細胞分化之纖維母細胞。多能性幹細胞可為iPS細胞(induced pluripotent stem cell，誘導多能性幹細胞)、ES細胞(embryonic stem cell，胚胎幹細胞)或Muse細胞(multilineage differentiating stress enduring cell，多系分化持續應激細胞)等，亦可使用藉由自該等多能性幹細胞利用公知之方法進行分化誘導而獲得之纖維母細胞或於分化誘導之過程中獲得之纖維母細胞之前驅細胞(例如，包含間葉系幹細胞)。
本說明書中，所謂「真皮組織(亦稱為真皮)」係皮膚中存在於表皮與皮下組織之間之組織，主要由纖維母細胞與膠原蛋白、彈性纖維(彈性蛋白)、細胞外基質、透明質酸等構成。本發明之組合物可藉由應用於色素沉著部位或其附近之真皮組織而直接或間接地作用於存在於色素沉著部位之黑色素細胞，從而抑制黑色素之過度產生。作為應用本發明之組合物之方法，可為用以提供細胞治療之本技術領域中所公知之任意方法，例如利用注射器注射懸濁液狀組合物之方法。
本發明之組合物除纖維母細胞以外，亦可包含藥學上可容許之載體。本說明書中所謂「藥學上可容許之載體」係指由各國政府之監管機構批准且可於動物、尤其是人類中使用的稀釋液、佐劑、賦形劑、或媒劑等。於一實施形態中，作為本發明之組合物中所可包含之載體，可列舉生理學緩衝溶液、可注入之凝膠溶液、生理鹽水、及水，但並不限定於該等。本發明中可使用之生理學緩衝溶液例如包含緩衝生理鹽水、磷酸緩衝液、漢克氏平衡鹽溶液、三羥甲基胺基甲烷緩衝生理鹽水、及HEPES(Hydroxyethylpiperazine Ethane Sulfonic Acid，羥乙基哌嗪乙磺酸)緩衝生理鹽水，但並不限定於該等。
本發明中可使用之可注入之凝膠溶液可於注入前為凝膠形態，亦可為注入後凝膠化者。可注入之凝膠溶液例如包含水、生理鹽水或生理學緩衝溶液、及凝膠化物質。作為凝膠化物質之例，可列舉蛋白質類(膠原蛋白、彈性蛋白、凝血酶、纖維黏連蛋白、明膠、血纖維蛋白、原彈性蛋白、多肽類、層黏連蛋白、蛋白多糖類、血纖維蛋白糊、自集自組裝胜肽水凝膠類、缺端膠原等)、多糖類(果膠、纖維素、氧化纖維素、甲殼素、聚葡萄胺糖、瓊脂糖、透明質酸等)、聚核苷酸類(核糖核酸類、脫氧核糖核酸類等)、海藻酸鹽、交聯海藻酸鹽、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、聚(氧伸烷基)、聚(環氧乙烷)-聚(環氧丙烷)之共聚物、聚(乙烯醇)、聚丙烯酸酯、單硬脂醯基甘油琥珀酸酯/聚乙二醇(MGSA/PEG)之共聚物、及該等之組合，但並不限定於該等。
本發明之組合物中所包含之纖維母細胞之個數根據要應用之色素沉著之部位之大小、色素沉著之程度、對象之年齡、對象疾病、應用方法等而適當決定，因此並無限定。
＜對用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物進行評價之方法＞ 本發明之組合物例如可藉由使用圖1之色素沉著皮膚模型1a進行評價。例如，可藉由包含以下順序之方法而評價。
(1)藉由光照射對纖維母細胞100造成損傷之後進行培養之步驟(相當於圖1(A))， (2)將上述步驟(1)中獲得之纖維母細胞100於第1插入式細胞培養容器11上進行培養之步驟(相當於圖1(B))， (3)將包含黑色素細胞202與角質細胞201之細胞群200於第2插入式細胞培養容器21上進行培養之步驟(相當於圖1(C))， (4)於上述步驟(2)中獲得之纖維母細胞100上，設置上述步驟(2)中獲得之培養有纖維母細胞100之第2插入式細胞培養容器21並進行培養之步驟(相當於圖1(D))， (5)將組合物300於第3插入式細胞培養容器31上進行培養之步驟(相當於圖1(E))， (6)將上述步驟(4)中獲得之培養有纖維母細胞100之第2插入式細胞培養容器21轉移至上述步驟(5)中獲得之培養有組合物300之第3插入式細胞培養容器31上，並進行培養之步驟(相當於圖1(F))， (7)以上述步驟(6)中獲得之包含黑色素細胞202與角質細胞201之細胞群200中之色素產生及/或色素沉著之程度為指標，評價組合物300之治療或預防效果之步驟。
本說明書中，培養有纖維母細胞100之第1插入式細胞培養容器11、及培養有組合物300之第3插入式細胞培養容器31係模擬皮膚之真皮之結構，因此有時將其稱為「真皮模型」(第1真皮模型10或第2真皮模型30)。又，於本說明書中，包含細胞群200之結構係模擬皮膚之表皮之結構，因此有時將其稱為「表皮模型20」。
纖維母細胞100較佳為於光敏劑之存在下被光照射而造成損傷。作為所使用之光敏劑，例如可列舉：補骨脂素、NAD(nicotinamide adenine dinucleotide，菸醯胺腺嘌呤二核苷酸)、核黃素、色胺酸、葉酸、卟啉、亞甲基藍、經硫醇基保護之金奈米簇(AUxSRy)等。藉由使用光敏劑，所照射之光被增感，可效率良好地對纖維母細胞100造成損傷。
對纖維母細胞100造成損傷時所使用之光只要是雖會對細胞內之核酸，例如DNA或RNA造成損傷，但未讓所有細胞死滅之程度之波長即可，較佳為紫外光(約200 nm～約400 nm)，更佳為UVA(約320 nm～約400 nm)。所照射之光之強度只要是雖會對細胞內之核酸，例如DNA或RNA造成損傷，但未誘導細胞凋亡等而讓所有細胞死滅之程度即可，可根據波長或照射之時間、細胞密度等而適當調整。例如，於照射UVA之情形時，可照射0.01 J/cm2 ～100 J/cm2 、較佳為0.1 J/cm2 ～20 J/cm2 、更佳為0.5 J/cm2 ～10 J/cm2 。
藉由將進行了光照射之纖維母細胞培養一定時間，可僅使未誘導細胞凋亡等而生存之纖維母細胞100增殖(相當於圖1之(A))。藉由光照射而受到損傷之纖維母細胞例如呈現如下特徵：細胞之形態伸長，增殖能力下降，衰老相關因子(衰老相關酸性β半乳糖苷酶(SA-β-gal))、黑色素生成因子(例如幹細胞生長因子(SCF)、肝細胞生長因子(HGF)等)之產生量增加等細胞衰老之程度增加(參照圖2、圖3、圖4、圖5)。細胞衰老之程度可藉由測定上述細胞衰老標記物而調查。藉由調節光照射量，可獲得所期望之細胞衰老程度之纖維母細胞100。
第2插入式細胞培養容器21之內徑較第1插入式細胞培養容器11及第3插入式細胞培養容器31小。藉此可將第2插入式細胞培養容器21插入於第1插入式細胞培養容器11及第3插入式細胞培養容器31之培養部分而使用。
色素沉著皮膚模型1所使用之細胞可源自任意動物，但較佳為源自脊椎動物，更佳為源自哺乳動物，最佳為源自人類。
色素沉著皮膚模型(1、1a)所使用之纖維母細胞100較佳為源自真皮之纖維母細胞。
所謂角質細胞201係構成表皮之細胞之一，其係生物體之表皮組織中於最深部(基底層)分裂，並且朝向上層分化為棘層、顆粒層，然後分化為角質層，同時向表面移動，不久便成為皮垢脫落之細胞。
所謂黑色素細胞202係構成表皮組織之細胞之一，其係生物體中存在於表皮之基底層，形成黑色素之細胞。
色素沉著皮膚模型(1、1a)所使用之纖維母細胞100、角質細胞201及黑色素細胞202分別可為自生物體組織採取之初代培養細胞，亦可為預先單離及/或增殖並市售或發佈之細胞，亦可為經培養之細胞株，亦可為自ES細胞、iPS細胞、或Muse細胞等多能性幹細胞分化誘導之細胞。
第1真皮模型10亦可包含纖維母細胞100以外之細胞，例如亦可包含真皮組織中所包含之肥胖細胞、組織細胞、漿細胞、真皮樹狀細胞等。第1真皮模型10中所包含之纖維母細胞例如包含1×104 ～108 個/cm2 、較佳為0.1～10×105 個/cm2 之細胞數。
第1真皮模型10較佳為纖維母細胞100與水凝膠化劑一起播種。本說明書中，所謂「水凝膠化劑」係指為了形成水凝膠而添加之物質。作為本發明中所使用之水凝膠化劑，例如可選自由膠原蛋白、明膠、玻尿酸鹽、玻尿酸、血纖維蛋白、海藻酸鹽、瓊脂糖、聚葡萄胺糖、甲殼素、纖維素、果膠、澱粉、層黏連蛋白、血纖維蛋白原/凝血酶、肌原纖維蛋白、彈性蛋白、橡膠、纖維素、瓊脂、麩質、酪蛋白、白蛋白、玻連蛋白、肌腱蛋白、巢蛋白(entactin)/巢蛋白(nidogen)、糖蛋白質、葡糖胺聚醣、聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(環氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈、基質膠以及該等之組合所組成之群中。
步驟(2)亦可於抗壞血酸或其鹽之存在下實施。若存在抗壞血酸或其鹽，則促進纖維母細胞100之增殖或膠原蛋白之產生，藉此促進複層化成真皮之結構，故而較佳。於本說明書中，所謂「抗壞血酸」係指抗壞血酸或其衍生物(例如抗壞血酸-2-磷酸、抗壞血酸-1-磷酸、L-抗壞血酸鈉、L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷等)，進而亦包含其鹽(鈉鹽、鎂鹽等)。
細胞群200亦可包含角質細胞201及黑色素細胞202以外之細胞，例如亦可包含表皮組成中所包含之蘭格汗氏細胞(Langerhans cell)或梅克爾細胞(Merkel cell)。細胞群200例如包含角質細胞201：黑色素細胞202為1：1～1000：1、較佳為30：1～3：1之比之細胞。細胞群200例如包含角質細胞201為1×102 ～106 個/cm2 、較佳為1.0～10×104 個/cm2 、更佳為約4～8×104 個/cm2 ，包含黑色素細胞202為1～10×103 個/cm2 、較佳為4～8×103 個/cm2 。
表皮模型20例如可使用亦有所市售之TESTSKIN (商標) LSE-melano (TOYOBO)、MelanoDerm (商標) (MatTek)等。
色素沉著皮膚模型1例如可使用通常之角質細胞培養所使用之培養液作為培養液，例如KG培養基(keratinocyte growth medium，角質細胞生長培養基)、EpilifeKG2(Kurabo)、Humedia-KG2(Kurabo)、分析培養基(TOYOBO)等，且於約37℃下耗費0～30天進行培養。作為培養基，除此以外可使用DMEM培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium，杜爾貝科改良伊格爾培養基)(GIBCO)或含有抗壞血酸且KGM與DMEM以1：1混合之培養基等。
色素沉著皮膚模型1係將藉由光照射而造成損傷之纖維母細胞直接或間接地作用於黑色素細胞，促進黑色素之產生。因此，藉由測定色素沉著皮膚模型1之色素產生及/或色素沉著之程度，可評價對色素沉著產生影響之因子。
本說明書中所謂「色素產生」係指色素沉著皮膚模型產生之色素，例如黑色素色素之產生。黑色素色素主要由黑色素細胞產生。色素產生量例如可自色素沉著皮膚模型、尤其是第2細胞群(角質細胞及黑色素細胞)提取黑色素色素並測定405 nm之吸光度而求出黑色素量。又，關於色素產生量，例如可藉由使用ELISA法、流式細胞術、西方點墨法、免疫組織化學法、qPCR法等方法測定色素沉著皮膚模型、尤其是第2細胞群(角質細胞及黑色素細胞)中所包含之黑色素或編碼其之核酸量(例如mRNA量)，但並不限定於此。
本說明書中，所謂「色素沉著之程度」係指可見光下之色素沉著皮膚模型、尤其是第2細胞群(角質細胞及黑色素細胞)之顏色之明度。本發明之色素沉著皮膚模型中，明度依存於黑色素細胞產生之黑色素量而變化。因此，若黑色素量變多，則明度下降，色素沉著皮膚模型呈現深色。反之，若黑色素量下降，則明度上升，色素沉著皮膚模型呈現淺色。即，藉由比較色素沉著皮膚模型之顏色之明度，可評價所添加之候選物質對色素沉著之治療或預防效果。明度可藉由將色素沉著皮膚模型記錄為圖像並使用公知之圖像測定方法而進行定量。 [實施例]
以下，基於實施例對本發明更詳細地進行說明，但該等並不對本發明進行任何限定。
1.使用之材料及方法 1-1.纖維母細胞之培養及PUVA處理 將1×105 個正常人類纖維母細胞於增殖用培養基(DMEM+10%胎牛血清)中進行培養。於100%融合之前置換於添加有補骨脂素(最終濃度為25 ng/mL)(SigmaAldrich公司製造)之增殖用培養基並進行培養。於24小時後以1 mL之磷酸緩衝液(PBS)使其膨潤之後，去除PBS，置換於添加有補骨脂素(最終濃度為25 ng/mL)之1 mL之PBS中並進行6 J/cm2 之UVA照射(SAN-EI UVE-502S)(以下，稱為「PUVA處理」)。其後，以1 mL之PBS使其膨潤之後，去除PBS，置換於增殖用培養基並培養2～7天左右。於其過程中，因PUVA處理之影響而造成細胞一部分死滅，但其後，生存之纖維母細胞增殖。將未經PUVA處理之源自同一供體之纖維母細胞作為相對於上述經PUVA處理之纖維母細胞之對照(圖2～5)。
1-2.真皮模型之製作 分別使用上述1-1.中經PUVA處理或未經PUVA處理(對照)之纖維母細胞而製作真皮模型。簡單而言，於上述1.之順序後，去除增殖用培養基，以1 mL之PBS使其膨潤。其後，去除PBS，於6孔盤之每一孔添加300 μL細胞剝離劑(TrypLE SELECT，Thermo Fisher Scientific公司製造)，且於37℃、5%CO2 之培養箱內靜置5分鐘，進行細胞剝離處理。添加增殖用培養基而使反應停止，於15 ml離心管回收細胞懸濁液。以1000 rpm離心5分鐘後，去除上清液，利用增殖用培養基將細胞顆粒再懸濁，且以成為5×105 個細胞/mL之方式調整。於製作可應用於6孔盤之各孔之真皮模型時，於冰上製備包含表1之組成之凝膠懸濁液。 [表1]
表1：包含纖維母細胞之真皮模型用凝膠懸濁液之組成
試劑 量
豬皮膠原蛋白(最終濃度0.5%(w/v)) (NH Foods Ltd.，309-31595) 1.5 mL
5×DMEM 0.6 mL
胎牛血清(最終濃度10%(v/v)) 0.3 mL
L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷(AA2G) (最終濃度250 μM) (Sigma-Aldrich， SMB00390) 3 μL
纖維母細胞懸濁液 0.6 mL
總容量 3 mL
於6孔盤設置真皮模型製作用插入式細胞培養容器，於插入式細胞培養容器內添加3 mL凝膠懸濁液。於37℃、5%CO2 之培養箱中使凝膠懸濁液固化之後，於6孔盤添加2 mL含有抗壞血酸(AA2G)之增殖用培養基，並於37℃、5%CO2 之培養箱中培養24小時。
1-3.與表皮模型組合之色素沉著皮膚模型 與上述真皮模型不同地，使用包含黑色素細胞與角質細胞之市售之表皮模型(MatTek公司製造)(參照圖1(C))。
將表皮模型載於上述1-2.之真皮模型上而組合(參照圖1(D))，並設置於專用容器(Corning/Biocoat，深孔盤，6孔用)(Corning #355467)中，添加9.5 mL之三維皮膚模型用培養基(表皮模型專用培養基(MatTek #EPI-100-NMM-113)與DMEM以1：1混合而成者)，且以3～4天1次之頻度利用該培養基進行培養基交換。
1-4.替換真皮模型之色素沉著皮膚模型 針對與使用經PUVA處理之纖維母細胞所製作之真皮模型組合並培養10天之表皮模型，與使用未經PUVA處理之正常纖維母細胞所製作之真皮模型替換，進而進行10天之培養(參照圖1(E)及(F))。再者，替換用真皮模型(使用未經PUVA處理之纖維母細胞所製作之真皮模型)係於替換之前一天製作。
2.結果 2-1.經PUVA處理後之纖維母細胞 圖2表示經PUVA處理後及未經處理之纖維母細胞。經PUVA處理後之纖維母細胞伸長(圖2(A))。調查經PUVA處理後及未經處理之纖維母細胞之增殖數之變動，結果經PUVA處理後之纖維母細胞之增殖速度顯著下降(圖2(B))。
2-2.經PUVA處理後之纖維母細胞之衰老程度 對經PUVA處理後及未經處理之纖維母細胞各自之細胞溶解物中之衰老相關因子SA-β-gal的酶活性值進行調查，結果經PUVA處理後之纖維母細胞之SA-β-gal之酶活性值顯著增加(圖3(A))。又，進行SA-β-gal之染色，結果於經PUVA處理後之纖維母細胞中觀察到明顯較多之SA-β-gal陽性細胞(青綠色)(圖3(B))。
2-3.經PUVA處理後之纖維母細胞之黑色素生成因子/SCF之產生程度 將經PUVA處理後及未經處理之纖維母細胞分別單層培養，於PUVA處理1天前、PUVA處理第0、1、3、7、14、21天，利用ELISA法測定培養上清液中所包含之SCF量，且計算為每一細胞之分泌量，結果經PUVA處理後之纖維母細胞之SCF程度顯著增加(圖4(A))。又，使用SCF抗體進行SCF染色，進行利用DAPI之核染色，製作SCF染色及核染色之融合圖像(合併)，結果於經PUVA處理後之纖維母細胞中觀察到許多SCF陽性細胞(圖4(B))。
2-4.經PUVA處理後之纖維母細胞之黑色素生成因子/HGF之產生程度 將經PUVA處理後及未經處理之纖維母細胞分別單層培養，使用HGF抗體進行HGF染色，進行利用DAPI之核染色，製作HGF染色及核染色之融合圖像(合併)，結果於經PUVA處理後之纖維母細胞中觀察到許多HGF陽性細胞(圖5(A))。
2-5.經PUVA處理後之纖維母細胞之黑色素生成因子/HGF之產生程度 圖6係表示經PUVA處理後(A)或未經處理(B)之色素沉著皮膚模型中之表皮模型之色素沉著的圖。於經PUVA處理之色素沉著皮膚模型中之表皮模型中，觀察到色素沉著得到促進。
2-6.替換真皮模型之色素沉著皮膚模型 針對與使用經PUVA處理之纖維母細胞所製作之真皮模型組合並培養10天之表皮模型，與使用未經PUVA處理之正常纖維母細胞所製作之真皮模型替換，進而進行10天之培養，結果與經PUVA處理之色素沉著皮膚模型中之表皮模型之色素沉著(圖6(A))相比，觀察到色素沉著得以抑制(圖7)。
2-7.經PUVA處理、未經處理、替換真皮模型之色素沉著皮膚模型之色素沉著 對於經PUVA處理或未經處理(對照)之色素沉著皮膚模型、及將經PUVA處理之色素沉著皮膚模型之表皮模型轉移至未經PUVA處理之真皮模型上並培養之表皮模型(替換)之外觀進行觀察，結果經PUVA處理之色素沉著皮膚模型之表皮模型中色素沉著得到促進，相對於此，於替換條件之表皮模型中觀察到色素沉著得到緩和之情況(圖8(A))。基於圖8(A)之圖像進行定量化，結果於經PUVA處理之色素沉著皮膚模型中，色素濃化區域之比率最高，相對於此，於替換條件之色素沉著皮膚模型中，呈現色素濃化區域減少(圖8(B))。
2-8.經PUVA處理、未經處理、替換真皮模型之色素沉著皮膚模型之黑色素生成 藉由經PUVA處理或未經處理(對照)之色素沉著皮膚模型、及將經PUVA處理之色素沉著皮膚模型之表皮模型轉移至未經PUVA處理之真皮模型上並培養之表皮模型(替換)而製作切片，利用卡塔納馬森染色法對表皮模型切片之黑色素顆粒進行染色(圖9(A))。又，對圖9(A)之染色圖像進行二值化處理，將黑色素顆粒區域之比率定量化，結果於經PUVA處理之色素沉著皮膚模型中，黑色素區域之比率最高，相對於此，於替換條件之色素沉著皮膚模型中，呈現黑色素區域減少(圖9(B))。
2-9.經PUVA處理、未經處理、替換真皮模型之色素沉著皮膚模型之黑色素細胞數 藉由經PUVA處理或未經處理(對照)之色素沉著皮膚模型、及將經PUVA處理之色素沉著皮膚模型之表皮模型轉移至未經PUVA處理之真皮模型上並培養之表皮模型(替換)而製作切片，使用TRP2抗體將表皮模型切片之活化黑色素細胞染色，且利用蘇木精染色法將核染色(圖10(A))。根據圖10(A)之圖像將活化黑色素細胞之比率定量化，結果於經PUVA處理之色素沉著皮膚模型中，活化黑色素細胞數之比率最高，相對於此，於替換條件之色素沉著皮膚模型中，呈現活化黑色素細胞數減少(圖10(B))。
1、1a:色素沉著皮膚模型 10:第1真皮模型 11:第1插入式細胞培養容器 12:第1細胞培養容器 13:第1培養基 14:第2培養基 20:表皮模型 21:第2插入式細胞培養容器 22:第2細胞培養容器 23:第3培養基 24:第4培養基 30:第2真皮模型 31:第3插入式細胞培養容器 32:第3細胞培養容器 100:纖維母細胞 200:包含黑色素細胞與角質細胞之細胞群 201:角質細胞 202:黑色素細胞 300:組合物 dFB:藉由光照射而受到損傷之纖維母細胞 FB:纖維母細胞 KC:角質細胞
圖1(A)～(F)係表示評價本發明之組合物之方法之概略圖。各構成要素主要表示剖面。 圖2係表示經PUVA(Psoralen plus Ultraviolet A，補骨脂素聯合長波紫外線)處理或未經處理之纖維母細胞之增殖性之差異。(A)係單層培養之經PUVA處理或未經處理(對照)之纖維母細胞之圖像(培養第1天、第4天、第7天)。(B)係經PUVA處理後之纖維母細胞之增殖圖表。 圖3係表示經PUVA處理或未經處理(對照)之纖維母細胞中之衰老相關因子SA-β-gal之產生程度之差異。(A)係單層培養之纖維母細胞之溶解物中之SA-β-gal之酶活性值。(B)係SA-β-gal之染色圖像。SA-β-gal陽性細胞染成青綠色。 圖4係表示經PUVA處理或未經處理(對照)之纖維母細胞中之黑色素生成促進因子SCF(Stem Cell Factor，幹細胞因子)之產生程度的差異。(A)係SCF產生量之經時變動之圖表。(B)係使用SCF抗體之SCF染色、使用DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)之核染色、SCF染色及核染色之融合圖像(合併)(各2片)。 圖5係表示經PUVA處理或未經處理(對照)之纖維母細胞中之黑色素生成促進因子HGF(Hepatocyte growth factor，肝細胞生長因子)之產生程度之差異。(A)係使用HGF抗體之HGF染色、使用DAPI之核染色、HGF染色及核染色之融合圖像(合併)(各2片)。 圖6係表示經PUVA處理或未經處理之色素沉著皮膚模型之色素沉著之圖。(A)係經PUVA處理之色素沉著皮膚模型中之表皮模型之圖像(培養第0天、培養第21天)。(B)係未經PUVA處理之色素沉著皮膚模型中之表皮模型之圖像(培養第0天、培養第21天)。 圖7係將與經PUVA處理之真皮模型共同培養約10天之表皮模型轉移至未經PUVA處理之真皮模型上並培養約10天後之表皮模型之圖像。 圖8係表示經PUVA處理或未經處理(對照)之色素沉著皮膚模型、及將經PUVA處理之色素沉著皮膚模型之表皮模型轉移至未經PUVA處理之真皮模型上並培養之表皮模型(替換)之色素沉著。(A)係於相位差顯微鏡之明視野下固定觀察條件而攝影之表皮模型之圖像。(B)係對(A)之圖像進行二值化處理而將色素沉著區域之比率定量化之圖表。 圖9係表示經PUVA處理或未經處理(對照)之色素沉著皮膚模型、及將經PUVA處理之色素沉著皮膚模型之表皮模型轉移至未經PUVA處理之真皮模型上並培養之表皮模型(替換)中之黑色素顆粒。(A)係藉由卡塔納馬森染色法(Fontana Masson Staining)將表皮模型切片之黑色素顆粒染色。(B)係對(A)之圖像進行二值化處理而將黑色素顆粒區域之比率定量化之圖表。 圖10係表示經PUVA處理或未經處理(對照)之色素沉著皮膚模型、及將經PUVA處理之色素沉著皮膚模型之表皮模型轉移至未經PUVA處理之真皮模型上並培養之表皮模型(替換)中之活化黑色素細胞。(A)係使用TRP2(Tyrosine Related Protein 2，酪胺酸相關蛋白2)抗體將表皮模型切片之活化黑色素細胞染色、及利用蘇木精染色法進行核染色之圖像。(B)係自(A)之圖像將活化黑色素細胞之比率定量化之圖表。

Claims (9)

  1. 一種用以治療或預防皮膚之色素沉著之組合物，其特徵在於：其係包含纖維母細胞作為有效成分者， 此處，上述纖維母細胞係損傷較局部存在於上述皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞少之纖維母細胞， 上述組合物係應用於上述色素沉著部位或其附近之真皮組織。
  2. 如請求項1之組合物，其中上述色素沉著源自從由老年性色素斑、脂溢性角化症、黃褐斑、雀斑及花瓣狀色素斑所組成之群中選擇1種以上之疾病。
  3. 如請求項1或2之組合物，其中上述纖維母細胞源自生物體之低曝光部位或非曝光部位之組織。
  4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中上述纖維母細胞源自選自由臀部、腹部、胸部、大腿部、上臂部、背部、牙齦、口腔黏膜、頭部、手掌、足底及耳廓後部所組成之群中之組織。
  5. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中上述纖維母細胞為自體之纖維母細胞。
  6. 如請求項1或2之組合物，其中上述纖維母細胞為自多能性幹細胞或組織幹細胞分化之纖維母細胞。
  7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中上述纖維母細胞之細胞衰老標記物之表現較局部存在於上述皮膚之色素沉著部位之纖維母細胞低。
  8. 如請求項7之組合物，其中上述細胞衰老標記物係從由衰老相關酸性β-半乳糖苷酶(SA-βgal)、細胞週期檢查機制相關因子及細胞衰老相關分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype(SASP))因子所組成之群中選擇1種或2種以上。
  9. 如請求項1至8中任一項之組合物，其係藉由細胞治療而應用。
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