TW202115111A

TW202115111A - 靶向bcma的抗體及嵌合抗原受體

Info

Publication number: TW202115111A
Application number: TW109130746A
Authority: TW
Inventors: 杜靚; 牟男; 張紅豔; 金理娜; 于躍; 袁紀軍
Original assignee: 大陸商上海吉倍生物技術有限公司
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2020-09-08
Publication date: 2021-04-16
Also published as: US20220331363A1; CN114401989A; EP4032907A1; EP4032907A9; JP2023501871A; CN114401989B; EP4032907A4; WO2021051390A1

Abstract

本發明涉及疾病治療及免疫學領域，具體而言，本發明涉及特異性結合BCMA的抗體及其抗原結合片段以及包含其的嵌合抗原受體(CAR)。本發明還涉及編碼這種CAR的核酸分子、表達這種CAR的免疫效應細胞以及製備這種免疫效應細胞的方法。本發明還涉及這些CAR和免疫效應細胞用於預防和/或治療B細胞相關病況（例如B細胞惡性腫瘤、自身免疫疾病）的用途以及預防和/或治療該B細胞相關病況的方法。

Description

靶向BCMA的抗體及嵌合抗原受體

B細胞是一種淋巴細胞，來源於骨髓的多能幹細胞，其在產生抗體介導體液免疫應答，提呈可溶性抗原，以及產生大量細胞因數、參與免疫調節、炎症反應及造血中發揮重要的作用（1）。一些重大疾病涉及B細胞。B細胞的惡性轉化導致癌症，包括一些淋巴瘤如霍奇金氏淋巴瘤和多發性骨髓瘤。B細胞生理學異常可能導致自身免疫性疾病，包括系統性紅斑狼瘡的發展。以上這兩類涉及B細胞的疾病可以被認為是因為B細胞生長過度和/或不適當的攻擊身體的部分，可能的控制策略是使用靶向病理B細胞的抗體或抗體的抗原結合部分，或者是基於這些抗體或抗體的抗原結合部分的其他藥物形式。

B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)，又稱TNFRSF17或CD269，由184個氨基酸組成，屬於缺少訊號肽的I型跨膜訊號蛋白。BCMA是腫瘤壞死因數受體家族(TNFR)的成員，並且結合TNF家族配體BAFF（B細胞啟動因數）和APRIL（增殖誘導配體）(2）。多種B細胞系的分析表明BCMA表達於成熟B細胞和漿細胞表面(3),對人體正常組織的基因水準/蛋白水準研究表明BCMA不表達於除成熟B細胞和漿細胞的其他人體正常組織，且不表達於CD34+造血細胞中(4)。BCMA基因敲除小鼠具有正常的淋巴器官和免疫系統(5)，B淋巴細胞的發育正常，但漿細胞數量明顯減少，證明BCMA在維持漿細胞的存活中起了重要的作用，其機制主要包括BCMA與BAFF蛋白結合，傳導訊號啟動NF-κB通路，並上調抗凋亡基因Bcl-2，Mcl-1及Bclw等，維持細胞生長(6)。研究表明，BCMA在B細胞惡性腫瘤如多發性骨髓瘤（MM）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）中普遍表達，並且對腫瘤細胞的惡性增生起了重要的促進作用 (7)，綜上所述 BCMA可以作為B細胞惡性腫瘤的靶點之一用於多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤的治療。

BCMA靶向治療的作用首先表現在多發性骨髓瘤的進展中。多發性骨髓瘤是一種惡性漿細胞疾病，表現為骨髓漿細胞惡性殖株性增生，分泌單殖株免疫球蛋白或其片段(M蛋白)，導致骨骼、腎臟等相關靶器官或組織損傷，常見臨床表現為骨痛、貧血、腎功能不全、感染等（8）。目前，多發性骨髓瘤為血液系統第二大惡性腫瘤，占血液系統惡性腫瘤的13％，其發病率隨著年齡的增長逐年增高，近幾年更是有年輕化的趨勢（9）。目前，研究人員正積極參與開發針對BCMA的三種主要類型的免疫療法，他們分別是嵌合抗原受體T細胞（CAR-T細胞），雙特異性抗體和抗體藥物偶聯物（ADC），臨床前和臨床研究的結果證明了以BCMA為靶點的這幾類療法的安全性及有效性。

上述這些靶向BCMA的藥物中進展最快的是Blue Bird的bb2121。bb2121藥物形式中所用胞外結構域包含結合人BCMA的鼠抗抗原結合片段（CN 201580073309.6），其來源為Biogen Idec公司所研發的殖株號為C11D5.3的抗BCMA抗體（CN 201510142069.2）。C11D5.3在BCMA-CAR T細胞治療中的應用廣泛，除了bb2121外，bb21217、NCI的BCMA-CAR T、以及恆潤達生的BCMA-CAR T（CN 201610932365.7）都藉由這個殖株的抗原結合片段來達到和BCMA靶點的結合，並且在上述提到的這些CAR T裡用的都是這個殖株的鼠源形式。

人源化抗體可以大大減少異源抗體對人類機體造成的免疫副反應。鼠源抗體人源化的一個經典方法是CDR植入，抗體可變區的CDR是抗體識別和結合抗原的區域，直接決定抗體的特異性。將鼠源單抗的CDR移植至人源抗體可變區，替代人源抗體CDR，使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結合特異性，同時減少其異源性。然而，抗原雖然主要和抗體的CDR接觸，但FR區也常參與作用，影響CDR的空間構型。因此換成人源FR區後，這種鼠源CDR和人源FR相嵌的V區，可能改變了單抗原有的CDR構型，結合抗原的能力會下降甚至明顯下降，此外，甚至可能帶來明顯的不期望的活性。例如，Blue Bird在其專利申請中（CN 201580050638.9）發現以人源化的C11D5.3為抗原結合部分建構的CAR T會引起明顯的抗原非依賴性的細胞因數釋放，同時觀察到該人源化CAR的導入會誘導T細胞的持續啟動和衰竭。對非BCMA結合部分的CAR進行結構改造並不能解決上述問題，使得此人源化的抗C11D5.3抗BCMA CAR不適用於T細胞療法。

本發明人對特異性識別BCMA的鼠源抗體C11D5.3進行了深入的研究和改造，開發了該鼠源抗體的人源化抗體，該人源化抗體在保持了與鼠源抗體相當的結合表達BCMA腫瘤細胞的活性的同時，對於正常組織細胞的非特異性結合明顯降低。在此基礎上，本發明人又付出了大量的創造性勞動，進一步建構獲得了能夠特異性結合BCMA的嵌合抗原受體（CAR）。本發明的CAR能夠以非MHC限制的方式將免疫效應細胞特異性和反應性指向表達BCMA的細胞從而使其被清除，並且不會引起抗原非依賴性的細胞因數釋放，並且不會誘導T細胞的持續啟動和衰竭。因此，本發明的人源化抗體及CAR具有用於預防和/或治療B細胞相關病況（例如B細胞惡性腫瘤、自身免疫疾病等）的潛力，具有重大的臨床價值。本發明的抗體

因此，在第一方面，本發明提供了能夠特異性結合BCMA的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含： (a) 重鏈可變區（VH），其包含選自下列的氨基酸序列： (i) SEQ ID NO: 1或3所示的序列； (ii) 與SEQ ID NO: 1或3所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (iii) 與SEQ ID NO: 1或3所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；和/或， (b) 輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的氨基酸序列： (iv) SEQ ID NO: 2或4所示的序列； (v) 與SEQ ID NO: 2或4所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (vi) 與SEQ ID NO: 2或4所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。

在某些實施方案中，(ii)或(v)中該的置換是保守置換。

在某些實施方案中，該抗體或其抗原結合片段包含： (a) 重鏈可變區（VH），其包含選自下列的氨基酸序列： (i) SEQ ID NO: 1所示的序列； (ii) 與SEQ ID NO: 1所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (iii) 與SEQ ID NO: 1所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；和/或， (b) 輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的氨基酸序列： (iv) SEQ ID NO: 2所示的序列； (v) 與SEQ ID NO: 2所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (vi) 與SEQ ID NO: 2所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。

在某些實施方案中，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換。

在某些實施方案中，該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），該VH包含如SEQ ID NO: 1所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 2所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。

在某些實施方案中，該抗體或其抗原結合片段包含： (a) 重鏈可變區（VH），其包含選自下列的氨基酸序列： (i) SEQ ID NO: 3所示的序列； (ii) 與SEQ ID NO: 3所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (iii) 與SEQ ID NO: 3所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；和/或， (b) 輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的氨基酸序列： (iv) SEQ ID NO: 4所示的序列； (v) 與SEQ ID NO: 4所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (vi) 與SEQ ID NO: 4所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。

在某些實施方案中，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換。

在某些實施方案中，該抗體或其抗原結合片段包含包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），該VH包含如SEQ ID NO: 3所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 4所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。

在某些實施方案中，該抗體或其抗原結合片段具備以下生物學功能中的一項或多項： (a)與分離的人BCMA蛋白結合的親和力不低於鼠源抗體C11D5.3；表述“分離的”是指該蛋白不包含於細胞中或細胞表面；該親和力可以藉由例如術語ka(來自抗體/抗原複合物的抗體的結合的速率常數)、kD(解離常數)和/或KD(kD/ka)來定義； (b)以0.05 μg/ml或更小（例如，0.04 μg/ml，0.03 μg/ml，0.02 μg/ml或更小）的EC50結合分離的人BCMA蛋白；例如，該EC50藉由ELISA技術測得； (c)與表達人BCMA的細胞結合的親和力不低於鼠源抗體C11D5.3；該親和力可以藉由例如術語ka(來自抗體/抗原複合物的抗體的結合的速率常數)、kD(解離常數)和/或KD(kD/ka)來定義； (d)以8 μg/ml或更小（例如，5 μg/ml，4 μg/ml，3 μg/ml，2 μg/ml，1 μg/ml或更小）的EC50結合表達人BCMA的細胞；例如，該EC50藉由流式細胞技術測得； (e)與正常組織（例如非腫瘤組織）細胞結合的親和力低於鼠源抗體C11D5.3； (f)表達包含該抗體或其抗原結合片段的CAR的T細胞基本不引起抗原非依賴性的細胞因數釋放。

在某些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段可以進一步包含來源於哺乳動物（例如，鼠或人）免疫球蛋白的恆定區序列或其變體，該變體與其所源自的序列相比具有一個或複數個氨基酸的置換、缺失或添加。在某些實施方案中，該變體與其所源自的序列相比具有一個或複數個氨基酸的保守置換。

某些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段的重鏈包含人免疫球蛋白的重鏈恆定區（CH）或其變體，該變體與其所源自的序列相比具有一個或複數個氨基酸的置換、缺失或添加（例如，至多20個、至多15個、至多10個、或至多5個氨基酸的置換、缺失或添加；例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）；和/或，本發明的抗體或其抗原結合片段的輕鏈包含人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CL）或其變體，該變體與其所源自的序列相比具有至多20個氨基酸的保守置換（例如至多15個、至多10個、或至多5個氨基酸的保守置換；例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的保守置換）。

在某些實施方案中，該重鏈恆定區選自IgG、IgM、IgE、IgD或IgA。

在某些實施方案中，該重鏈恆定區是IgG重鏈恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區。在某些實施方案中，該重鏈恆定區是鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區。在某些實施方案中，該重鏈恆定區是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區。在某些實施方案中，較佳地該重鏈恆定區是人IgG1或IgG4重鏈恆定區。

在某些實施方案中，該輕鏈恆定區選自κ或λ。

在某些實施方案中，該輕鏈恆定區是κ輕鏈恆定區。在某些實施方案中，該輕鏈恆定區是鼠κ輕鏈恆定區。在某些實施方案中，該輕鏈恆定區是人κ輕鏈恆定區。

在某些實施方案中，本發明的抗體是人源化抗體。在某些實施方案中，本發明的抗原結合片段選自Fab、Fab’、(Fab’)₂ 、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、di-scFv、(scFv)₂ 。

在本發明中，本發明的抗體或其抗原結合片段可以包括這樣的變體，該變體與其所源自的抗體或其抗原結合片段相比差異僅在於一個或複數個（例如，至多20個、至多15個、至多10個、或至多5個氨基酸的保守置換）氨基酸殘基的保守置換，或者與其所源自的抗體或其抗原結合片段具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗體或其抗原結合片段的上述生物學功能。抗體的製備

本發明的抗體可以本領域已知的各種方法來製備，例如藉由基因工程重組技術來獲得。例如，藉由化學合成或PCR擴增獲得編碼本發明抗體的重鏈和輕鏈基因的DNA分子。將所得DNA分子插入表達載體內，然後轉染宿主細胞。然後，在特定條件下培養轉染後的宿主細胞，並表達本發明的抗體。

本發明的抗原結合片段可以藉由水解完整的抗體分子獲得（參見Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992) and Brennan et al., Science 229:81 (1985)）。另外，這些抗原結合片段也可以直接由重組宿主細胞產生（reviewed in Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)）。比如，Fab’片段可以直接從宿主細胞中獲得；可以將Fab’片段化學偶聯形成F(ab’)₂ 片段(Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)₂ 片段也可以直接從重組宿主細胞培養液中直接分離得到。本領域的普通技術人員完全知曉製備這些抗原結合片段的其它技術。

因此，在第二方面，本發明提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼本發明的抗體或其抗原結合片段，或其重鏈可變區和/或輕鏈可變區的核苷酸序列。在某些較佳的實施方案中，該分離的核酸分子編碼本發明的抗體或其抗原結合片段，或其重鏈可變區和/或輕鏈可變區。

在第三方面，本發明提供了一種載體（例如殖株載體或表達載體），其包含本發明的分離的核酸分子。在某些較佳的實施方案中，本發明的載體是例如質粒，黏粒，噬菌體等。在某些較佳的實施方案中，該載體能夠在受試者（例如哺乳動物，例如人）體內表達本發明的抗體或其抗原結合片段。

在第四方面，本發明提供了一種宿主細胞，其包含本發明的分離的核酸分子或本發明的載體。此類宿主細胞包括但不限於，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲細胞，植物細胞和動物細胞（如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等）。在某些較佳的實施方案中，本發明的宿主細胞是哺乳動物細胞，例如CHO（例如CHO-K1、CHO-S、CHO DG44）。

在另一個方面，還提供了製備本發明的抗體或其抗原結合片段的方法，其包括，在允許該抗體或其抗原結合片段表達的條件下，培養第四方面所述的宿主細胞，和從培養的宿主細胞培養物中回收該抗體或其抗原結合片段。綴合物

本發明的抗體或其抗原結合片段可進行衍生化，例如被連接至另一個分子（例如另一個多肽或蛋白）。通常，抗體或其抗原結合片段的衍生化（例如，標記）不會不利影響其對BCMA（特別是人BCMA）的結合。因此，本發明的抗體或其抗原結合片段還意欲包括此類衍生化的形式。例如，可以將本發明的抗體或其抗原結合片段功能性連接（藉由化學偶合、基因融合、非共價連接或其它方式）於一個或複數個其它分子基團，例如另一個抗體（例如，形成雙特異性抗體），檢測試劑，藥用試劑，和/或能夠介導抗體或抗原結合片段與另一個分子結合的蛋白或多肽（例如，抗生物素蛋白或多組氨酸標籤）。

因此，在第五方面，本發明提供了綴合物，其包含本發明的抗體或其抗原結合片段以及連接於該抗體或其抗原結合片段的修飾部分。

在某些實施方案中，該修飾部分是可檢測的標記，例如酶、放射性核素、螢光染料、發光物質（如化學發光物質）或生物素。在某些實施方案中，該綴合物包含本發明的抗體或其抗原結合片段以及連接於該抗體或其抗原結合片段的可檢測的標記。本發明所述的可檢測的標記可以是可藉由螢光、光譜、光化學、生物化學、免疫學、電學、光學或化學手段檢測的任何物質。這類標記是本領域熟知的，其實例包括但不限於，酶（例如，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等）、放射性核素（例如，³ H、¹²⁵ I、³⁵ S、¹⁴ C或³² P）、螢光染料（例如，異硫氰酸螢光素（FITC）、螢光素、異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）、藻紅蛋白（PE）、德克薩斯紅、羅丹明、量子點或花菁染料衍生物（例如Cy7、Alexa 750））、發光物質（例如化學發光物質，如吖啶酯類化合物）、磁珠（例如，Dynabeads^® ）、測熱標記物例如膠體金或有色玻璃或塑膠（例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠，等）珠、以及用於結合上述標記物修飾的親和素（例如，鏈黴親和素）的生物素。教導該標記物的使用的專利包括，但不限於，美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241（全部藉由引用併入本文）。如上該的可檢測的標記可藉由本領域已知的方法檢測。例如，放射性標記可使用攝影膠片或閃爍計算器檢測，螢光標記物可使用光檢測器檢測，以檢測發射的光。酶標記物一般藉由給酶提供底物及檢測藉由酶對底物的作用產生的反應產物來檢測，及測熱標記物藉由簡單視覺化著色標記物來檢測。在某些實施方案中，此類標記能夠適用於免疫學檢測（例如，酶聯免疫測定法、放射免疫測定法、螢光免疫測定法、化學發光免疫測定法等）。在某些實施方案中，可藉由不同長度的接頭（linker）將如上所述的可檢測的標記連接至本發明的抗體或其抗原結合片段，以降低潛在的位阻。

在某些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段可以與治療部分連接。在此類實施方案中，由於該綴合物具有選擇性遞送一種或多種治療劑至靶組織（例如表達BCMA的細胞）的能力，因此，該綴合物可以提高本發明的抗體或其抗原結合片段在治療疾病（例如B細胞相關病況）中的治療效力。

因此，在某些實施方案中，該修飾部分是治療劑。在某些實施方案中，該綴合物包含本發明的抗體或其抗原結合片段以及連接於該抗體或其抗原結合片段的治療劑。

在某些實施方案中，該綴合物是抗體-藥物偶聯物(ADC)。

在某些實施方案中，該治療劑是細胞毒劑。在本發明中，該細胞毒劑包括對細胞有害(例如殺傷細胞)的任何試劑。

在某些實施方案中，該治療劑選自烷化劑、有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、放射性核素劑，及其任意組合。

可用於本發明的綴合物的烷化劑的實例包括但不限於氮芥類（如雙氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、美法侖、環磷醯胺等）、乙烯亞胺類（如塞替呱等）、硫酸酯及多元醇類（如白消安、二溴甘露醇）、亞硝基脲類（如卡莫司汀、洛莫司汀等）、鉑類抗腫瘤劑（如順鉑、奧沙利鉑、卡鉑等）等。

可用於本發明的綴合物的有絲分裂抑制劑的實例包括但不限於美登素類（例如美登素、美登醇、美登醇的C-3酯等）、紫杉烷類（例如多西他賽、紫杉醇或納米顆粒紫杉醇等）、長春花生物鹼類（例如硫酸長春地辛、長春新堿、長春花堿或長春瑞濱等）

可用於本發明的綴合物的抗腫瘤抗生素的實例包括但不限於放線菌素、蒽環類抗生素（例如柔紅黴素、阿黴素、表柔比星、伊達比星等）、卡利奇黴素、倍癌黴素等。

可用於本發明的綴合物的抗代謝物的實例包括但不限於葉酸拮抗劑（例如甲氨蝶呤等）、嘧啶拮抗劑（例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他濱、吉西他濱等）、嘌呤拮抗劑（例如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤等）、腺苷脫氨酶抑制劑（例如克拉屈濱、氟達拉濱、奈拉濱、噴司他丁等）。

可用於本發明的綴合物的拓撲異構酶抑制劑的實例包括但不限於（喜樹堿類及其衍生物（例如伊立替康、托泊替康等）、安吖啶、道諾黴素、阿黴素、表鬼臼毒素類、玫瑰樹堿類、表柔比星、依託泊苷、丙亞胺、替尼泊苷等。

可用於本發明的綴合物的酪氨酸激酶抑制劑的實例包括但不限於阿西替尼、博舒替尼、西地尼布、達沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊馬替尼、拉帕替尼、來妥替尼、尼洛替尼、司馬沙尼、舒尼替尼、凡德他尼等。

可用於本發明的綴合物的放射性核素劑的實例包括但不限於於I¹³¹ 、In¹¹¹ 、Y⁹⁰ 、Lu¹⁷⁷ 等。

在某些實例性實施方案中，該治療劑選自鉑類抗腫瘤劑、蒽環類抗生素、紫杉烷類化合物、核苷類似物、喜樹堿類化合物，及其類似物或同系物，及其任意組合。

在某些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段任選地藉由接頭與修飾部分（例如可檢測的標記或治療劑）綴合。

在本發明中，使用本領域現有的接頭技術可以將細胞毒劑偶聯至本發明的抗體或其抗原結合片段。已經用於將細胞毒劑偶聯至抗體的接頭類型的實例包括但不限於腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接頭。可以選擇例如易於在溶酶體隔室內被低pH切割或易於被蛋白酶（例如優先在腫瘤組織中表達的蛋白酶，如組織蛋白酶，諸如組織蛋白酶B、C、D）切割的接頭。

關於細胞毒劑的類型、接頭及將治療劑偶聯至抗體的方法的進一步討論還可參見Saito，G.等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.and Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.and Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。嵌合抗原受體

本發明的抗體或其抗原結合片段可用於建構嵌合抗原受體(CAR)，本發明CAR的特徵包括非MHC限制的BCMA識別能力，其賦予表達該CAR的免疫效應細胞（例如，T細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞）不依賴於抗原加工及提呈而識別表達BCMA的細胞的能力。

因此，在第六方面，本發明提供了一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外抗原結合結構域、間隔結構域、跨膜結構域以及胞內訊號傳導結構域，其中該胞外抗原結合結構域包含本發明的抗體或其抗原結合片段。在某些實施方案中，該CAR從N端至C端包含胞外抗原結合結構域、間隔結構域、跨膜結構域以及胞內訊號傳導結構域。 1、胞外抗原結合結構域

本發明的CAR中所包含的胞外抗原結合結構域賦予該CAR識別BCMA的能力。

在某些實施方案中，該胞外抗原結合結構域包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），該VH包含如SEQ ID NO: 1所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 2所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。

在某些實施方案中，該胞外抗原結合結構域包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），該VH包含如SEQ ID NO: 3所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 4所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。

在某些實施方案中，該胞外抗原結合結構域包括但不限於Fab片段、Fab'片段、F(ab)'₂ 片段、Fv、二硫鍵穩定的Fv蛋白(“dsFv”)、scFv、di-scFv、(scFv)₂ 。

在某些實施方案中，該抗體或其抗原結合片段是scFv、di-scFv或(scFv)₂ 。

在某些實施方案中，該胞外抗原結合結構域包含還包含連接子。在某些實施方案中，該胞外抗原結合結構域所包含的VH和VL藉由連接子連接。在某些示例性實施方案中，該連接子具有SEQ ID NO：5的序列。 2、跨膜結構域

本發明的CAR所包含的跨膜結構域可以是本領域已知的任何蛋白結構，只要其能夠在細胞膜（特別是真核細胞膜）中熱力學穩定。適用於本發明的CAR的跨膜結構域可衍生自天然來源。在此類實施方案中，該跨膜結構域可衍生自任何膜結合的或跨膜的蛋白質。或者，該跨膜結構域可為合成的非天然存在的蛋白質區段，例如主要包含疏水殘基例如亮氨酸和纈氨酸的蛋白質區段。

在某些實施方案中，該跨膜結構域是選自下列蛋白的跨膜區：T細胞受體的α、β或ζ鏈、CD8α、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、DAP10及其任意組合。在某些示例性實施方案中，該跨膜結構域包含CD8α的跨膜區。在某些示例性實施方案中，該跨膜結構域包含T細胞共刺激分子（例如CD137或CD28）的跨膜結構域。

在某些示例性實施方案中，該跨膜結構域包含如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。 3、間隔結構域

本發明的嵌合抗原受體可以在胞外抗原結合結構域與跨膜結構域之間包含間隔結構域。

在某些實施方案中，該間隔結構域包含免疫球蛋白（例如IgG1或IgG4）的CH2和CH3區。在此類實施方案中，不受特定理論的約束，認為CH2和CH3使該CAR的抗原結合結構域從表達CAR的細胞的細胞膜延伸出去，並且可更精確地模擬天然TCR的大小和結構域結構。

在某些實施方案中，該間隔結構域包含鉸鏈結構域。鉸鏈結構域可以是通常在蛋白質的兩個結構域之間發現的氨基酸區段，其可以允許蛋白質具有柔性並且允許一個或兩個結構域相對於彼此的運動。因此，該鉸鏈結構域可以是任何氨基酸序列，只要其能夠提供胞外抗原結合結構域的這種柔性以及其相對於跨膜結構域的這種運動性。

在某些實施方案中，該鉸鏈結構域是天然存在的蛋白質的鉸鏈區或其部分。在某些實施方案中，該鉸鏈結構域包含CD8α的鉸鏈區或其部分，例如含有CD8α的鉸鏈區的至少15個（例如20、25、30、35或40個）連續氨基酸的片段。在某些示例性實施方案中，該間隔結構域包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。 4、胞內訊號傳導結構域

本發明的CAR中所包含的胞內訊號傳導結構域參與將有效的抗原受體結合（本發明的CAR與BCMA的結合）的訊號傳導進免疫效應細胞內部，啟動表達CAR的免疫效應細胞的至少一種正常效應子功能，或增強表達CAR的免疫效應細胞的至少一種細胞因數的分泌（例如IL-2，IFN-γ）。

在某些實施方案中，該胞內訊號傳導結構域包含初級訊號傳導結構域和/或共刺激訊號傳導結構域。

在本發明中，該初級訊號傳導結構域可以是包含免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）的任何胞內訊號傳導結構域。在某些實施方案中，該初級訊號傳導結構域包含免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）。在某些實施方案中，該初級訊號傳導結構域包含選自下列的蛋白的胞內訊號傳導結構域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、DAP10、CD79b或CD66d。在某些實施方案中，該初級訊號傳導結構域包含CD3ζ的胞內訊號傳導結構域。

在本發明中，該共刺激訊號傳導結構域可以是來自共刺激分子的胞內訊號傳導結構域。在某些實施方案中，該共刺激訊號傳導結構域包含選自下列的蛋白的胞內訊號傳導結構域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD270(HVEM)或DAP10。

在某些實施方案中，該共刺激訊號傳導結構域選自CD28的胞內訊號傳導結構域、或CD137(4-1BB)的胞內訊號傳導結構域、或二者片段的組合。

在某些實施方案中，該胞內訊號傳導結構域包含一個共刺激訊號傳導結構域。在某些實施方案中，該胞內訊號傳導結構域包含兩個或更複數個共刺激訊號傳導結構域。在此類實施方案中，該兩個或更複數個共刺激訊號傳導結構域可以是相同的，也可以是不同的。

在某些實施方案中，該胞內訊號傳導結構域包含初級訊號傳導結構域以及至少一個共刺激訊號傳導結構域。該初級訊號傳導結構域以及至少一個共刺激訊號傳導結構域可以以任意順序串聯至跨膜結構域的羧基端。

在某些實施方案中，該胞內訊號傳導結構域可包含CD3ζ的胞內訊號傳導結構域和CD137的胞內訊號傳導結構域。在某些示例性實施方案中，該CD3ζ的胞內訊號傳導結構域包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列。在某些示例性實施方案中，該CD137的胞內訊號傳導結構域包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。

在某些實施方案中，本發明的CAR可進一步在其N端包含訊號肽。通常，訊號肽是將與其連接的序列靶向至細胞中所需位點的多肽序列。在某些實施方案中，該訊號肽可以將與其連接的CAR靶向至細胞的分泌途徑，並允許該CAR進一步整合並錨定到脂質雙分子層中。可用於CAR的訊號肽是本領域技術人員已知的。在某些實施方案中，該訊號肽包含重鏈訊號肽（例如IgG1的重鏈訊號肽）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因數受體2(GM-CSFR2)訊號肽、或CD8α訊號肽。 5、全長CAR

本發明提供了能夠特異性地結合BCMA的嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體從其N端至C端依次包含胞外抗原結合結構域、間隔結構域、跨膜結構域、胞內訊號傳導結構域。在某些較佳實施方案中，其中該胞內訊號傳導結構域從N端到C端為共刺激訊號傳導結構域和初級訊號傳導結構域。

在某些實施方案中，該間隔結構域包含CD8（例如CD8α）的鉸鏈區，其具有SEQ ID NO：6所示序列。在某些實施方案中，該跨膜結構域包含CD8（例如CD8α）的跨膜區，其具有SEQ ID NO：7所示序列。

在某些實施方案中，該胞內訊號傳導結構域包含初級訊號傳導結構域和共刺激訊號傳導結構域，其中初級訊號傳導結構域包含CD3ζ的胞內訊號傳導結構域，其具有SEQ ID NO：9所示序列。共刺激訊號傳導結構域包含CD137的胞內訊號傳導結構域，其具有SEQ ID NO：8所示序列。

在某些示例性實施方案中，該CAR具有選自下列的氨基酸序列：(1) SEQ ID NO: 10或12所示的氨基酸序列，(2) 與SEQ ID NO: 10或12所示的氨基酸序列相比具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列，並且該序列基本保留了其所源自的氨基酸序列的至少一種生物學活性（例如，能夠以非MHC限制的方式將免疫效應細胞的特異性和反應性指向表達BCMA的細胞的能力）。嵌合抗原受體的製備

產生嵌合抗原受體、包含該嵌合抗原受體的免疫效應細胞（例如T細胞）的方法是本領域已知的，其詳細描述可參見，例如，Brentjens等人, 2010, Molecular Therapy, 18:4,666-668；Morgan等人, 2010, Molecular Therapy, published online February 23, 2010, 第1-9頁；Till等人, 2008, Blood, 112:2261-2271；Park等人, Trends Biotechnol.,29:550-557,2011；Grupp等人, NEnglJMed., 368:1509-1518,2013；Han等人, J.Hematol Oncol.,6:47,2013；PCT專利公開文本WO2012/079000、WO2013/126726；和U.S.專利公開文本2012/0213783，其全部藉由引用整體併入本文)。例如，可包括用至少一種編碼CAR的核酸分子導入細胞，並在細胞中表達該核酸分子。例如，可將編碼本發明的CAR的核酸分子包含於表達載體(例如，慢病毒載體)中，該表達載體能夠在宿主細胞例如T細胞中表達，以製造該CAR。

因此，在第七方面，本發明提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼本發明的嵌合抗原受體的核苷酸序列。在某些實施方案中，該分離的核酸分子編碼本發明的嵌合抗原受體。

在某些實施方案中，該分離的核酸分子編碼的CAR包括具有重鏈可變區（VH）和／或輕鏈可變區（VL）的胞外抗原結合結構域，其中：該VH包含如SEQ ID NO: 1所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 2所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。

在某些實施方案中，該分離的核酸分子編碼的CAR包括具有重鏈可變區（VH）和／或輕鏈可變區（VL）的胞外抗原結合結構域，其中：該VH包含如SEQ ID NO: 3所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 4所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。

在某些示例性實施方案中，該分離的核酸分子編碼的CAR具有選自下列的氨基酸序列：(1) SEQ ID NO: 10或12所示的氨基酸序列，(2) 與SEQ ID NO: 10或12所示的氨基酸序列相比具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列，並且該序列基本保留了其所源自的氨基酸序列的至少一種生物學活性（例如，能夠以非MHC限制的方式將免疫效應細胞的特異性和反應性指向表達BCMA的細胞的能力）。

本領域技術人員理解，由於遺傳密碼的簡併性，編碼一種本發明的嵌合抗原受體的核苷酸序列可以具有多種不同的序列。因此，除非另有說明，否則“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括作為彼此的簡併形式且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。

在某些示例性實施方案中，該編碼本發明的嵌合抗原受體的核苷酸序列選自：(1) SEQ ID NO: 11或13所示的核苷酸序列；(2) 與SEQ ID NO: 11或13所示的核苷酸序列相比具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的序列，並且該序列基本保留了其所源自的核苷酸序列的至少一種生物學活性（例如，能夠編碼具有以非MHC限制的方式將免疫效應細胞的特異性和反應性指向表達BCMA的細胞的能力的CAR）。

在第八方面，本發明提供了一種載體（例如殖株載體或表達載體），其包含如上所述的分離的核酸分子。

在某些實施方案中，該載體包含編碼本發明的嵌合抗原受體的核苷酸序列。

在某些示例性實施方案中，該CAR具有選自下列的氨基酸序列：(1) SEQ ID NO: 10或12所示的氨基酸序列，(2) 與SEQ ID NO: 10或12所示的氨基酸序列相比具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列，並且該序列基本保留了其所源自的氨基酸序列的至少一種生物學活性（例如，能夠以非MHC限制的方式將免疫效應細胞的特異性和反應性指向表達BCMA的細胞的能力）。

在某些實施方案中，該載體選自DNA載體，RNA載體，質粒，轉座子載體，CRISPR/Cas9載體，病毒載體。

在某些實施方案中，該載體是表達載體。

在某些實施方案中，該載體是游離型載體。

在某些實施方案中，該載體是病毒載體。

在某些示例性實施方案中，該病毒載體是慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。

在某些實施方案中，該載體是游離型或非整合病毒載體，例如整合缺陷型逆轉錄病毒或慢病毒。修飾的免疫效應細胞及製備方法

在第九方面，本發明提供了一種免疫效應細胞，其表達本發明的嵌合抗原受體。可以用多種方法將編碼CAR的多核苷酸引入細胞後，也可以在細胞中原位合成CAR。或者，可以在細胞外生產CAR，然後將其引入細胞。

在某些實施方案中，該免疫效應細胞包含第七方面所述的分離的核酸分子或第八方面所述的載體。

可以藉由各種合適的方式將如上所述的分離的核酸分子或載體引入免疫效應細胞，例如磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、顯微注射、電穿孔、TALEN方法、ZFN方法、非病毒載體介導的轉染（例如脂質體）或病毒載體介導的轉染（如慢病毒感染，逆轉錄病毒感染，腺病毒感染），以及其他用於轉移入宿主細胞的物理、化學或生物學手段，如轉座子技術，CRISPR-Cas9等技術。

在某些實施方案中，該免疫效應細胞來源於患者或健康供體。在某些實施方案中，該免疫效應細胞選自T淋巴細胞、自然殺傷（NK）細胞、單核細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞及其任意組合。在某些實施方案中，該免疫效應細胞選自T淋巴細胞和/或自然殺傷（NK）細胞。

在另一方面，本發明還提供了製備表達本發明的嵌合抗原受體的免疫效應細胞的方法，其包括：(1)提供免疫效應細胞；(2) 將第六方面所述的分離的核酸分子或第七方面所述的載體引入該免疫效應細胞。該分離的核酸分子或載體包含編碼本發明的嵌合抗原受體的核苷酸序列。

在某些實施方案中，該免疫效應細胞選自T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及其任意組合。

在某些實施方案中，在步驟(1)中，該免疫效應細胞經過預處理；該預處理包括免疫效應細胞的分選、啟動和/或增殖。在某些實施方案中，該預處理包括將免疫效應細胞與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸，從而刺激該免疫效應細胞並誘導其增殖，由此產生經預處理的免疫效應細胞。

在一些實施方案中，在步驟(2)中，將核酸分子或載體藉由病毒感染引入免疫效應細胞。在另一些實施方案中，在步驟(2)中，將核酸分子或載體藉由非病毒載體轉染的方式引入免疫效應細胞，如藉由轉座子的載體系統、CRISPR/Cas9載體、TALEN方法、ZFN方法、電穿孔方法、磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染或顯微注射等方法。

在某些實施方案中，在步驟(2)之後，該方法還包括：擴增步驟(2)獲得的免疫效應細胞。

在另一方面，本發明還提供了用於製備能夠特異性結合BCMA的嵌合抗原受體或表達該嵌合抗原受體的試劑盒，該試劑盒包括如第七方面所述的分離的核酸分子，或第八方面所述的載體，和必要的溶劑（例如，如無菌水或生理鹽水，或細胞培養液）。該試劑盒任選地包括使用說明書。

在另一方面，本發明提供了上述試劑盒用於製備能夠特異性結合BCMA的嵌合抗原受體或表達該嵌合抗原受體的細胞的用途。藥物組合物

在第十方面，本發明提供了一種藥物組合物，其含有本發明第一方面所述的抗體或其抗原結合片段、第五方面所述的綴合物、第六方面所述的嵌合抗原受體、第二方面或第七方面所述的分離的核酸分子、協力廠商面或第八方面所述的載體、第四方面所述的宿主細胞或第九方面所述的免疫效應細胞，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。

在一些實施方案中，本發明的藥物組合物包含本發明的抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，本發明的藥物組合物包含本發明的綴合物。在此類實施方案中，該綴合物包含本發明的抗體或其抗原結合片段以及連接於該抗體或其抗原結合片段的治療劑。

在一些實施方案中，本發明的藥物組合物包含第七方面所述的分離的核酸分子、第八方面所述的載體、或第九方面所述的免疫效應細胞。該核酸分子、載體包含編碼本發明的嵌合抗原受體的核苷酸序列，該免疫效應細胞表達該嵌合抗原受體。

在某些實施方案中，該藥物組合物還可以包含另外的藥學活性劑。

在某些實施方案中，該另外的藥學活性劑是具有抗腫瘤活性的藥物，例如烷化劑、有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、放射性核素劑、放射增敏劑（例如吉西他濱、5-氟尿嘧啶、紫杉烷、順鉑等）、抗血管產生劑、細胞因數（例如GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21等）、特異性靶向腫瘤細胞抗體（例如，CD20抗體如利妥昔單抗、Her2抗體如曲妥珠單抗、VEGF抗體如貝伐珠單抗、EGFR抗體如西妥昔單抗等）、免疫檢查點抑制劑（例如，PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體、LAG-3抗體等）等。

在某些實施方案中，在該藥物組合物中，本發明的抗體或其抗原結合片段、綴合物、分離的核酸分子、載體或免疫效應細胞與該另外的藥學活性劑可以作為分離的組分或作為混合的組分提供。因此，本發明的抗體或其抗原結合片段、綴合物、分離的核酸分子、載體或免疫效應細胞與該另外的藥學活性劑可以同時、分開或相繼施用。

本發明的抗體或其抗原結合片段、綴合物、免疫效應細胞或藥物組合物可以配製成醫學領域已知的任何劑型，例如，片劑、丸劑、混懸劑、乳劑、溶液、凝膠劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、酏劑、錠劑、栓劑、注射劑（包括注射液、注射用無菌粉末與注射用濃溶液）、吸入劑、噴霧劑等。較佳劑型取決於預期的給藥方式和治療用途。本發明的藥物組合物應當是無菌的並在生產和儲存條件下穩定。一種較佳的劑型是注射劑。此類注射劑可以是無菌注射溶液。例如，可藉由下述方法來製備無菌注射溶液：在適當的溶劑中摻入必需劑量的本發明的抗體或其抗原結合片段、綴合物、免疫效應細胞或藥物組合物，以及任選地，同時摻入其他期望的成分(包括但不限於，pH調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑，等滲劑、防腐劑、稀釋劑，或其任何組合)，隨後過濾除菌。此外，可以將無菌注射溶液製備為無菌凍幹粉劑(例如，藉由真空乾燥或冷凍乾燥)以便於儲存和使用。此類無菌凍幹粉劑可在使用前分散於合適的載體中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液（例如0.9% (w/v)NaCl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性劑的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、pH緩衝溶液（例如磷酸鹽緩衝溶液）、Ringer氏溶液及其任意組合。

因此，在某些示例性實施方案中，本發明的藥物組合物包含無菌可注射液體（如水性或非水性懸浮液或溶液）。在某些示例性實施方案中，此類無菌可注射液體選自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液（例如0.9% (w/v)NaCl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性劑的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、pH緩衝溶液（例如磷酸鹽緩衝溶液）、Ringer氏溶液及其任意組合。

本發明的抗體或其抗原結合片段、綴合物、免疫效應細胞、或藥物組合物可以藉由本領域已知的任何合適的方法來施用，包括但不限於，口服、口腔、舌下、眼球、局部、腸胃外、直腸、葉鞘內、內胞漿網槽內、腹股溝、膀胱內、局部（如，粉劑、藥膏或滴劑），或鼻腔途徑。但是，對於許多治療用途而言，較佳的給藥途徑/方式是胃腸外給藥（例如靜脈注射或推注，皮下注射，腹膜內注射，肌內注射）。技術人員應理解，給藥途徑和/或方式將根據預期目的而發生變化。在某些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段、綴合物、免疫效應細胞、或藥物組合物藉由靜脈注射或推注給予。

本發明的藥物組合物可以包括“治療有效量”或“預防有效量”的本發明第一方面所述的抗體或其抗原結合片段、第五方面所述的綴合物或第八方面所述的免疫效應細胞。“預防有效量”是指，足以預防，阻止，或延遲疾病的發生的量。“治療有效量”是指，足以治癒或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其併發症的量。本發明的抗體或其抗原結合片段、第五方面所述的綴合物或第八方面所述的免疫效應細胞的治療有效量可根據如下因素發生變化：待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。治療方法及用途

在另一方面，本發明提供了一種用於在受試者（例如人）中預防和/或治療B細胞相關病況的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用有效量的第一方面所述的抗體或其抗原結合片段、第五方面所述的綴合物、第八方面所述的免疫效應細胞或本發明的藥物組合物。在此類實施方案中，所述綴合物包含本發明的抗體或其抗原結合片段以及連接於該抗體或其抗原結合片段的治療劑。

在某些實施方案中，該方法包括向該受試者施用有效量的本發明的抗體或其抗原結合片段或綴合物。

在某些實施方案中，該方法包括向該受試者施用有效量的第八方面所述的免疫效應細胞或包含該免疫效應細胞的藥物組合物。

在某些實施方案中，該方法包括以下步驟：(1) 提供免疫效應細胞（例如T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、或這些細胞的任意組合）；(2) 將包含編碼本發明第六方面所述的嵌合抗原受體的核酸分子導入步驟(1)所述的免疫效應細胞，以獲得表達該嵌合抗原受體的免疫效應細胞；(3) 將步驟(2)中獲得的免疫效應細胞施用至該受試者以進行治療。

在某些實施方案中，在步驟(1)之前包括從該受試者獲得該免疫效應細胞的步驟。在某些實施方案中，該免疫效應細胞選自T淋巴細胞和/或NK細胞。

在某些實例性實施方案中，從該受試者獲得外週血單核細胞(PBMC)，並對PBMC直接進行遺傳修飾，以表達CAR。

在某些實例性實施方案中，從該受試者獲得T細胞。T細胞可獲自多種來源，包括但不限於：外週血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織以及腫瘤。在某些實施方案中，可以利用技術人員已知的多種技術(如沉積，例如FICOLLTM分離)從收集自物件的血液單位獲得T細胞。在一個實施方案中，藉由血漿分離置換法(apheresis)獲得來自個體循環血的細胞。血漿分離置換法的產物通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其它有核白細胞、紅細胞和血小板。在一個實施方案中，可以對藉由血漿分離置換法收集的細胞進行洗滌，以移除血漿級分，並將細胞置於合適的緩衝劑或介質中用於隨後處理。可以用PBS或者用缺乏鈣、鎂以及大部分二價陽離子(如果不是所有其它二價陽離子)的其它合適的溶液洗滌細胞。如本領域普通技術人員所理解，可以藉由本領域技術人員已知的方法，如藉由使用半自動流通式離心機，來完成洗滌步驟。例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate等。洗滌之後，可在多種生物相容的緩衝劑或者含有或不含緩衝劑的其它鹽溶液中重懸細胞。在某些實施方案中，可在細胞直接重懸的培養基中移除血漿分離置換法樣品中不想要的組分。

在某些實施方案中，藉由裂解紅細胞並耗盡單核細胞(例如，藉由經PERCOLLTM梯度離心)，從外週血單核細胞(PBMC)分離T細胞。可以藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離表達下述標誌物中的一種或多種的特定T細胞亞群：CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO。在一個實施方案中，藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離表達CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO的特定T細胞亞群。例如，可以用針對陰性選擇的細胞特有的表面標誌物的抗體組合來完成藉由陰性選擇的T細胞群的富集。一種實例性方法是經負磁性免疫黏附或流式細胞術進行細胞分選和/或選擇，該負磁性免疫黏附或流式細胞術利用針對被陰性選擇的細胞上存在的細胞表面標誌物的單殖株抗體的混合物。例如，為了藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單殖株抗體混合物通常包含針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。也可將流式細胞術和細胞分選用於分離本發明使用的目的細胞群。

在分離之後，對免疫效應細胞(如T細胞)進行遺傳修飾，或者可在進行遺傳修飾之前，在體外活化並擴增(或者在祖細胞的情況下，分化)免疫效應細胞。在某些實例性實施方案中，將免疫效應細胞(如T細胞)用本發明的嵌合抗原受體進行遺傳修飾(例如，用包含編碼CAR的核酸的病毒載體轉導)，然後在體外進行活化並擴增。

在某些實施方案中，該B細胞相關病況是B細胞惡性腫瘤，例如多發性骨髓瘤（MM）或非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）。在某些實施方案中，該多發性骨髓瘤（MM）選自：明顯多發性骨髓瘤、冒煙型多發性骨髓瘤、漿細胞白血病、非分泌型骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性漿細胞瘤以及髓外漿細胞瘤。在某些實施方案中，該非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）選自：伯基特淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤以及套細胞淋巴瘤。

在某些實施方案中，該B細胞相關病況是漿細胞惡性腫瘤。

在某些實施方案中，該B細胞相關病況是自身免疫性疾病。在某些實施方案中，該自身免疫性疾病選自：全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎、特發性血小板減少性紫癜或重症肌無力或自身免疫性溶血性貧血。

在某些實施方案中，該B細胞相關病況選自多發性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、具有不確定的惡性潛能的B細胞增殖、淋巴瘤樣肉芽腫病、移植後淋巴增生性病症、免疫調節病症、風濕性關節炎、重症肌無力、特發性血小板減少性紫癜、抗磷脂症候群、恰加斯氏病、格雷夫斯氏病、韋格納肉芽腫、結節性多動脈炎、斯耶葛籣氏症候群、尋常天皰瘡、硬皮病、多發性硬化、抗磷脂症候群、ANCA相關性小血管炎、古德帕斯徹病、川崎病、自身免疫性溶血性貧血以及急進性腎小球腎炎、重鏈疾病、原發性或免疫細胞相關澱粉樣變性或者意義未明的單殖株丙種球蛋白血症。

在某些實施方案中，將本發明的抗體或其抗原結合片段、綴合物、免疫效應細胞、或藥物組合物與額外的療法組合施用。這種額外的療法可以是已知用於腫瘤的任何療法，例如手術、化學治療、放射治療、靶向治療、免疫治療、激素治療、基因治療或姑息治療。這種額外的療法可以在施用本發明的抗體或其抗原結合片段、綴合物、免疫效應細胞、或藥物組合物之前、同時或之後施用。

在某些實施方案中，該受試者可以為哺乳動物，例如人。

在另一個方面，提供了本發明第一方面所述的抗體或其抗原結合片段、第五方面所述的綴合物、第六方面所述的嵌合抗原受體、第二方面或第七方面所述的分離的核酸分子、協力廠商面或第八方面所述的載體、第四方面所述的宿主細胞、第九方面所述的免疫效應細胞、或本發明的藥物組合物在製備藥物中的用途，該藥物用於在受試者（例如人）中預防和/或治療B細胞相關病況。在此類實施方案中，該綴合物包含本發明的抗體或其抗原結合片段以及連接於該抗體或其抗原結合片段的治療劑。檢測方法和試劑盒

本發明的抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合BCMA，從而可用於檢測BCMA在樣品中的存在或其水準。

因此，在另一個方面，本發明提供了一種試劑盒，其包括本發明的抗體或其抗原結合片段。

在某些實施方案中，該試劑盒用於診斷受試者是否患有表達BCMA的腫瘤。某些實施方案中，該表達BCMA的腫瘤選自B細胞惡性腫瘤，例如多發性骨髓瘤（MM）或非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）。在某些實施方案中，該表達BCMA的腫瘤是漿細胞惡性腫瘤。

在某些較佳的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段帶有可檢測的標記。

在某些較佳的實施方案中，該試劑盒還包括第二抗體，其特異性識別本發明的抗體或其抗原結合片段。較佳地，該第二抗體還包括可檢測的標記。

在本發明中，該可檢測的標記可以是可藉由螢光、光譜、光化學、生物化學、免疫學、電學、光學或化學手段檢測的任何物質。特別較佳的是，此類標記能夠適用於免疫學檢測（例如，酶聯免疫測定法、放射免疫測定法、螢光免疫測定法、化學發光免疫測定法等）。

在另一個方面，本發明提供了檢測BCMA在樣品中的存在或其量的方法，其包括以下步驟： (1) 將該樣品與本發明的抗體或其抗原結合片段接觸； (2) 檢測該抗體或其抗原結合片段與BCMA之間複合物的形成或檢測該複合物的量。

該複合物的形成表明存在BCMA或表達BCMA的細胞。

在某些實施方案中，該樣品是細胞樣品，即包含細胞(例如腫瘤細胞)的樣品。在此類實施方案中，較佳地，該複合物是由該抗體、抗原結合片段或綴合物與該樣品中的細胞所表達的BCMA之間形成的。

在某些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段還帶有可檢測的標記。在某些實施方案中，在步驟(2)中，使用帶有可檢測的標記的試劑來檢測本發明的抗體或其抗原結合片段。

該方法可以用於診斷目的，或者非診斷目的（例如，該樣品是細胞樣品，而非來自患者的樣品）。在某些實施方案中，該BCMA是人BCMA。

在另一個方面，提供了本發明的抗體或其抗原結合片段在製備試劑盒中的用途，該試劑盒用於檢測BCMA在樣品中的存在或其量。在某些實施方案中，該BCMA是人BCMA。

在另一方面，本發明提供了一種用於診斷受試者是否患有表達BCMA的腫瘤的方法，其包括使用本發明第一方面所述的抗體或其抗原結合片段檢測BCMA在來自該受試者的樣品中的量。

在某些實施方案中，該表達BCMA的腫瘤選自B細胞惡性腫瘤，例如多發性骨髓瘤（MM）或非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）。在某些實施方案中，該表達BCMA的腫瘤是漿細胞惡性腫瘤。

在某些實施方案中，該方法還包括：將該BCMA在來自該受試者的樣品中的量與參考值進行比較的步驟。

該參考值是指BCMA在來自已知不具有表達BCMA的腫瘤的受試者的樣品中的水準(也稱作“陰性參考值”)，或者是指BCMA在已知患有表達BCMA的腫瘤的受試者的樣品中的水準(也稱作“陽性參考值”)。例如，如果該BCMA在來自該受試者的樣品中的量與陰性參考值相似(或者無顯著差異)，則指示該受試者未患有表達BCMA的腫瘤，以及如果該BCMA在來自該受試者的樣品中的量相對於陰性參考值升高時，則指示該受試者患有表達BCMA的腫瘤。此外，如果該BCMA在來自該受試者的樣品中的量與陽性參考值相似(或者無顯著差異)，則指示該受試者患有表達BCMA的腫瘤。

在某些實施方案中，藉由以下步驟檢測BCMA在來自該受試者的樣品中的量： (1) 將來自該受試者的樣品與本發明的抗體或其抗原結合片段接觸； (2) 檢測該抗體或其抗原結合片段與BCMA所形成的複合物的量。

在某些實施方案中，在步驟(1)中，本發明的抗體或其抗原結合片段還帶有可檢測的標記。在某些實施方案中，在步驟(2)中，使用帶有可檢測的標記的試劑來檢測本發明的抗體或其抗原結合片段。

在某些實施方案中，該樣品可以選自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、迴圈細胞、迴圈腫瘤細胞、非組織締合的細胞(即游離細胞)、組織(例如手術切除的腫瘤組織、活體組織切片或細針抽吸組織)、組織學製備物等。

在某些實施方案中，該方法還包括給被診斷為患有表達BCMA的腫瘤的受試者施用靶向BCMA的免疫療法。

在某些實施方案中，該靶向BCMA的免疫療法包括施用本發明的抗體或其抗原結合片段、或綴合物。

在某些實施方案中，該靶向BCMA的免疫療法包括施用本發明的免疫效應細胞。

在某些實施方案中，該靶向BCMA的免疫療法包括施用表達本發明第六方面所述的嵌合抗原受體的免疫效應細胞。該方法包括以下步驟：(1) 提供免疫效應細胞；(2) 將編碼本發明的嵌合抗原受體的核苷酸序列導入步驟(1)該的免疫效應細胞，以獲得表達該嵌合抗原受體的免疫效應細胞；(3) 將步驟(2)中獲得的免疫效應細胞以及可選的未改造和/或未成功改造的免疫效應細胞施用至該受試者。在某些實施方案中，在步驟(1)之前，該方法還包括從該受試者獲得該免疫效應細胞的步驟。

在另一個方面，提供了本發明的抗體或其抗原結合片段在製備試劑盒中的用途，該試劑盒用於診斷受試者是否患有表達BCMA的腫瘤或者用於檢測腫瘤是否能夠藉由靶向BCMA的抗腫瘤療法來治療。術語定義

在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的細胞培養、分子生物學、生物化學、核酸化學、免疫學等操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。

如本文中所使用的，術語“BCMA (B-cell maturation antigen)”是指B細胞成熟抗原，又稱TNFRSF17或CD269。BCMA是腫瘤壞死因數受體家族(TNFR)的成員，結合TNF家族配體BAFF（B細胞啟動因數）和APRIL（增殖誘導配體），並且主要在終末分化的B細胞，例如記憶B細胞和漿細胞上表達。BCMA的基因在染色體16上編碼，產生長度為994個核苷酸的初級mRNA轉錄物(NCBI登錄號NM_001192.2)，其編碼184個氨基酸的蛋白質(NP_001183.2)。

如本文中所使用的，術語“抗體”是指，通常由兩對多肽鏈（每對具有一條輕鏈(LC)和一條重鏈(HC)）組成的免疫球蛋白分子。抗體輕鏈可分類為κ（kappa）和λ（lambda）輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、γ、α或ε，並且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區藉由大約12或更複數個氨基酸的“J”區連接，重鏈還包含大約3個或更複數個氨基酸的“D”區。各重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。恆定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應子功能，如可介導免疫球蛋白與宿主組織或因數，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)的結合。VH和VL區還可被細分為具有高變性的區域(稱為互補決定區(CDR))，其間散佈有較保守的稱為構架區(FR)的區域。各V_H 和V_L 由按下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4從氨基末端至羧基末端排列的3個CDR和4個FR組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(VH和VL)分別形成抗原結合部位。氨基酸在各區域或結構域的分配可遵循Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))，或Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia等人 (1989) Nature 342:878-883的定義。

如本文中所使用的，術語“互補決定區”或“CDR”是指抗體可變區中負責抗原結合的氨基酸殘基。在重鏈和輕鏈的可變區中各含有三個CDR，命名為CDR1、CDR2和CDR3。這些CDR的精確邊界可根據本領域已知的各種編號系統進行定義，例如可按照Kabat編號系統（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）、Chothia編號系統（Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia等人 (1989) Nature 342:878-883）或IMGT編號系統（Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003）中的定義。對於給定的抗體，本領域技術人員將容易地鑒別各編號系統所定義的CDR。並且，不同編號系統之間的對應關係是本領域技術人員熟知的（例如，可參見Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003）。

在本發明中，本發明的抗體或其抗原結合片段含有的CDR可根據本領域已知的各種編號系統確定。在某些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段含有的CDR較佳地藉由Kabat、Chothia或IMGT編號系統確定。在某些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段含有的CDR較佳地藉由Kabat編號系統確定。

如本文中所使用的，術語“構架區（framework region）”或“FR”殘基是指，抗體可變區中除了如上定義的CDR殘基以外的那些氨基酸殘基。

術語“抗體”不受任何特定的產生抗體的方法限制。例如，其包括，重組抗體、單殖株抗體和多殖株抗體。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG (例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。

如本文中所使用的，術語抗體的“抗原結合片段”是指包含全長抗體的片段的多肽，其保持特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合，其也被稱為“抗原結合部分”。通常參見，Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 第2版，Raven Press, N.Y. (1989)，其以其全文藉由引用合併入本文，用於所有目的。可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗體的抗原結合片段。抗原結合片段的非限制性實例包括Fab、Fab’、(Fab’)₂ 、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、di-scFv、(scFv)₂ 和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部分。工程改造的抗體變體綜述於Holliger等, 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136中。

如本文中所使用的，術語“全長抗體”意指，由兩條“全長重鏈”和兩條“全長輕鏈”組成的抗體。其中，“全長重鏈”是指這樣的多肽鏈，其在N端到C端的方向上由重鏈可變區（VH）、重鏈恆定區CH1結構域、鉸鏈區（HR）、重鏈恆定區CH2結構域、重鏈恆定區CH3結構域組成；並且，當該全長抗體為IgE同種型時，任選地還包括重鏈恆定區CH4結構域。較佳地，“全長重鏈”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3組成的多肽鏈。“全長輕鏈”是在N端到C端方向上由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區（CL）組成的多肽鏈。兩對全長抗體鏈藉由在CL和CH1之間的二硫鍵和兩條全長重鏈的HR之間的二硫鍵連接在一起。本發明的全長抗體可以來自單一物種，例如人；也可以是嵌合抗體或人源化抗體。本發明的全長抗體包含分別由VH和VL對形成的兩個抗原結合部位，這兩個抗原結合部位特異性識別/結合相同的抗原。

如本文中所使用的，術語“Fd”意指由VH和CH1結構域組成的抗體片段；術語“dAb片段”意指由VH結構域組成的抗體片段（Ward 等人, Nature 341:544 546 (1989)）；術語“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1結構域組成的抗體片段；術語“F(ab’)₂ 片段”意指包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段；術語“Fab’片段”意指還原連接F(ab’)₂ 片段中兩個重鏈片段的二硫鍵後所獲片段，由一條完整的輕鏈和重鏈的Fd片段（由VH和CH1結構域組成）組成。

如本文中所使用的，術語“Fv”意指由抗體的單臂的VL和VH結構域組成的抗體片段。Fv片段通常被認為是，能形成完整的抗原結合位點的最小抗體片段。一般認為，六個CDR賦予抗體的抗原結合特異性。然而，即便是一個可變區（例如Fd片段，其僅僅含有三個對抗原特異的CDR）也能夠識別並結合抗原，儘管其親和力可能低於完整的結合位點。

如本文中所使用的，術語“Fc”意指，由抗體的第一重鏈的第二、第三恆定區與第二重鏈的第二、第三恆定區經二硫鍵結合而形成的抗體片段。抗體的Fc片段具有多種不同的功能，但不參與抗原的結合。

如本文中所使用的，術語“scFv”是指，包含VL和VH結構域的單個多肽鏈，其中該VL和VH藉由接頭（linker）相連（參見，例如, Bird等人, Science 242:423-426 (1988)；Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷， Roseburg 和Moore 編，Springer-Verlag，紐約，第269-315頁(1994)）。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂ -VL-接頭-VH-COOH或NH₂ -VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS氨基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄ 的接頭，但也可使用其變體（Holliger等人(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448）。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng. 8:725-731，Choi等人(2001)，Eur. J. Immunol. 31: 94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res. 56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J. Mol. Biol. 293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情況下，scFv的VH與VL之間還可以存在二硫鍵。在本發明的某些實施方案中，scFv可形成di-scFv，其指的是兩個或兩個以上單個scFv串聯而形成抗體。在本發明的某些實施方案中，scFv可形成(scFv)₂ ，其指的是兩個或兩個以上單個scFv並聯而形成抗體。

上述各個抗體片段均保持了特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合。

可使用本領域技術人員已知的常規技術（例如，重組DNA技術或酶促或化學斷裂法）從給定的抗體（例如本發明提供的抗體）獲得抗體的抗原結合片段（例如，上述抗體片段），並且以與用於完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結合片段。

在本文中，除非上下文明確指出，否則當提及術語“抗體”時，其不僅包括完整抗體，而且包括抗體的抗原結合片段。

如本文中所使用的，術語“人源化抗體”是指，經基因工程改造的非人源抗體，其氨基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體（供體抗體），全部或部分的非CDR區（例如，可變區FR和/或恆定區）來自於人源免疫球蛋白（受體抗體）。人源化抗體通常保留了供體抗體的預期性質，包括但不限於，抗原特異性、親和性、反應性等。供體抗體可以是有預期性質（例如，抗原特異性、親和性、反應性等）的小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物（例如，食蟹猴）抗體。

人源化抗體既能夠保留非人源供體抗體（例如鼠源抗體）的預期性質，又能夠有效降低非人源供體抗體（例如鼠源抗體）在人受試者中的免疫原性，因此，是特別有利的。然而，由於供體抗體的CDR與受體抗體的FR之間的匹配問題，人源化抗體的預期性質（例如，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力和/或增強免疫應答的能力）通常低於非人源供體抗體（例如鼠源抗體）。

因此，儘管本領域的研究人員已對抗體的人源化展開了深入的研究，並取得了一些進展，但是，如何對某一供體抗體進行充分的人源化，以使得所產生的人源化抗體既具有盡可能高的人源化程度，又能夠盡可能地保留供體抗體的預期性質，現有技術並沒有提供詳盡的指導。技術人員需要針對具體供體抗體進行摸索、探究和改造，付出大量的創造性勞動才有可能獲得，既具有高人源化程度、又保留具體供體抗體的預期性質的人源化抗體。

如本文中所使用的，術語“胚系抗體基因（germline antibody gene）”或“胚系抗體基因片段（germline antibody gene segment）”是指，存在於生物體的基因組中的編碼免疫球蛋白的序列，其沒有經歷過能夠導致表達特異性免疫球蛋白的遺傳學重排及突變的成熟過程。在本發明中，表述“重鏈胚系基因”是指，編碼免疫球蛋白重鏈的胚系抗體基因或基因片段，其包括V基因(variable)、D基因(diversity)、J基因(joining)和C基因(constant)；類似地，表述“輕鏈胚系基因”是指，編碼免疫球蛋白輕鏈的胚系抗體基因或基因片段，其包括V基因(variable)、J基因(joining)和C基因(constant)。在本發明中，由該胚系抗體基因或胚系抗體基因片段所編碼的氨基酸序列也稱為“胚系序列（germline sequence）”。胚系抗體基因或胚系抗體基因片段及其相應的胚系序列是本領域技術人員熟知的，並且可從專業資料庫（例如，IMGT、UNSWIg、NCBI或VBASE2）獲得或查詢。

如本文中所使用的，術語“特異性結合”是指，兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。特異性結合相互作用的強度或親和力可以該相互作用的平衡解離常數(K_D )表示。在本發明中，術語“K_D ”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。

兩分子間的特異性結合性質可使用本領域公知的方法進行測定。一種方法涉及測量抗原結合位點/抗原複合物形成和解離的速度。“結合速率常數”（ka或kon）和“解離速率常數”（kdis或koff）兩者都可藉由濃度及締合和解離的實際速率而計算得出（參見Malmqvist M, Nature,1993, 361:186-187）。kdis/kon的比率等於解離常數K_D （參見Davies等人, Annual Rev Biochem, 1990; 59:439-473）。可用任何有效的方法測量K_D 、kon和kdis值。在某些實施方案中，可以使用表面電漿共振術(SPR)在Biacore中來測量解離常數。除此以外還可用生物發光干涉測量法或Kinexa來測量解離常數。

如本文中所使用的，術語“嵌合抗原受體（CAR）”是指包含至少一個細胞外抗原結合結構域、間隔結構域、跨膜結構域和胞內訊號傳導結構域的重組多肽建構體，其將針對目的抗原(例如BCMA)的基於抗體的特異性與免疫效應細胞活化胞內結構域組合以展現針對表達該目的抗原（例如BCMA）細胞的特異性免疫活性。在本發明中，表述“表達CAR的免疫效應細胞”是指表達CAR並且具有由該CAR的靶向結構域決定的抗原特異性的免疫效應細胞。製造CAR(例如，用於癌症治療)的方法是本領域已知的，可參見例如，Park等人，TrendsBiotechnol.,29:550-557,2011；Grupp等人，NEnglJMed.,368:1509-1518,2013；Han等人，J.HematolOncol.,6:47,2013；PCT專利公開文本WO2012/079000、WO2013/059593；和美國專利公開文本2012/0213783，其全部藉由引用整體併入本文。在本文中，表述“抗BCMA CAR”是指，所包含的細胞外抗原結合結構域能夠能夠特異性結合BCMA的CAR；表述“抗BCMA CAR-T”是指，表達上述CAR的免疫效應細胞（例如PBMC，例如T細胞）。在本文中，表述“人源化的CAR”是指，所包含的細胞外抗原結合結構域源自人源化抗體的CAR；類似地，表述“鼠源CAR”是指，所包含的細胞外抗原結合結構域源自鼠源抗體的CAR。

如本文中所使用的，術語“胞外抗原結合結構域”是指能夠特異性結合目的抗原或受體的多肽。該結構域將能夠與細胞表面分子相互作用。例如，可以選擇胞外抗原結合結構域來識別作為與特定疾病狀態相關的靶細胞細胞表面標誌物的抗原。典型地，該胞外抗原結合結構域是抗體衍生的靶向結構域。

如本文中所使用的，術語“胞內訊號傳導結構域”是指傳導效應訊號功能訊號並引導細胞進行專門的功能的蛋白質部分。因此，胞內訊號傳導結構域具有啟動表達CAR的免疫效應細胞的至少一種正常效應子功能的能力。例如，T細胞的效應子功能可以是細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞因數的分泌。

如本文中所使用的，術語“初級訊號傳導結構域”是指能夠以刺激方式或以抑制方式調節TCR複合物的初級活化的蛋白質部分。以刺激方式作用的初級訊號傳導結構域通常含有已知為基於免疫受體酪氨酸的活化基序（ITAM）的訊號傳導基序。含有特別用於本發明中的初級訊號傳導結構域的ITAM的非限制性實例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、DAP10、CD79a、CD79b和CD66d的那些。

如本文中所使用的，術語“共刺激訊號傳導結構域”是指共刺激分子的胞內訊號傳導結構域。共刺激分子是除抗原受體或Fc受體以外的在結合到抗原後提供T淋巴細胞的高效活化和功能所需的第二訊號的細胞表面分子。該共刺激分子的非限制性實例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1) CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、DAP10。

如本文中使用的，術語“免疫效應細胞”是指具有一種或多種效應功能(例如，細胞毒性細胞殺傷活性、細胞因數的分泌、ADCC和/或CDC的誘導)的免疫系統的任何細胞。典型地，免疫效應細胞是具有造血的起源並在免疫應答中起作用的細胞。術語“效應功能”指免疫效應細胞的特化功能，例如增強或促進對靶細胞的免疫攻擊（例如對靶細胞的殺傷，或者抑制其生長或增殖）的功能或反應。T細胞的效應功能，例如，可以是細胞溶解活性或者輔助或者包括細胞因數的分泌在內的活性。免疫效應細胞的實例包括T細胞(例如α/βT細胞和γ/δT細胞)、B細胞、天然殺傷(NK)細胞、天然殺傷T(NKT)細胞、肥大細胞和骨髓來源巨噬細胞。

本發明所述的免疫效應細胞可以是自身的/自體的(“自我”)或非自身的(“非自我”，例如同種異體的、同基因的或異基因的)。如本文中使用的，“自身的”是指來自同一受試者的細胞；“同種異體的”是指與比較細胞遺傳不同的同一物種的細胞；“同基因的”是指與比較細胞遺傳相同的來自不同受試者的細胞；“異基因的”是指與比較細胞來自不同物種的細胞。在較佳實施例中，本發明的細胞是同種異體的。

可用於本文所述的CAR的示例性免疫效應細胞包括T淋巴細胞。術語“T細胞”或“T淋巴細胞”是本領域公知的並且意圖包括胸腺細胞、未成熟的T淋巴細胞、成熟T淋巴細胞、靜息T淋巴細胞或活化的T淋巴細胞。T細胞可以是T輔助(Th)細胞，例如T輔助1(Th1)或T輔助2(Th2)細胞。T細胞可以是輔助T細胞(HTL；CD4T細胞)CD4T細胞、細胞毒性T細胞(CTL；CD8T細胞)、CD4CD8T細胞、CD4CD8T細胞或任何其它T細胞子組。在某些實施方案中，T細胞可以包括原初T細胞和記憶T細胞。

本領域技術人員將理解，其它細胞也可以用作具有如本文所述的CAR的免疫效應細胞，例如NK細胞。具體來說，免疫效應細胞還包括NK細胞、單核細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞、NKT細胞、嗜中性白細胞和巨噬細胞。免疫效應細胞還包括免疫效應細胞的祖細胞，其中該祖細胞可以在體內或體外經誘導以分化成免疫效應細胞。因此，在某些實施方案中，免疫效應細胞包括免疫效應細胞的祖細胞，例如含於衍生自臍血、骨髓或流動週邊血液的CD34+細胞群體內的造血幹細胞(HSC)，其在受試者中投與後分化成成熟免疫效應細胞，或其可以在體外經誘導以分化成成熟免疫效應細胞。

如本文中所使用的，術語“細胞毒劑”包括對細胞有害(例如殺死細胞)的任何試劑，例如化療藥物、細菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。

如本文中所使用的，術語“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以藉由轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限於：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。可用作載體的動物病毒包括但不限於，逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可以含有多種控制表達的元件，包括但不限於，啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。

如本文中所使用的，術語 “游離型載體”中游離型是指載體能夠複製而不整合到宿主的染色體DNA中並且不由分裂宿主細胞逐漸喪失，還意指該載體在染色體外或游離地複製。

如本文中所使用的，術語“病毒載體”廣泛用以指包括典型地促進核酸分子轉移或整合到細胞的基因組中的病毒衍生的核酸元件的核酸分子(例如轉移質粒)，或介導核酸轉移的病毒顆粒。除了核酸之外，病毒顆粒典型地將包括各種病毒組分並且有時還包括宿主細胞組分。術語“病毒載體”可以指能夠將核酸轉移到細胞中的病毒或病毒顆粒，或指轉移的核酸本身。病毒載體和轉移質粒含有主要衍生自病毒的結構和/或功能遺傳元件。

如本文中所使用的，術語“逆轉錄病毒載體”是指含有主要衍生自逆轉錄病毒的結構和功能遺傳元件或其部分的病毒載體或質粒。

如本文中所使用的，術語“慢病毒載體”是指含有主要衍生自慢病毒的結構和功能遺傳元件或其部分(包括LTR)的病毒載體或質粒。在某些實施方案中，術語“慢病毒載體”、“慢病毒表達載體”可以用以指慢病毒轉移質粒和/或感染性慢病毒顆粒。在本文提及元件(例如殖株位點、啟動子、調節元件、異源核酸等)時，應理解，這些元件的序列以RNA形式存在於本發明的慢病毒顆粒中並且以DNA形式存在於本發明的DNA質粒中。

如本文中所使用的，“整合缺陷型”逆轉錄病毒或慢病毒是指具有不能將病毒基因組整合到宿主細胞的基因組中的整合酶的逆轉錄病毒或慢病毒。在某些實施方案中，整合酶蛋白突變以特異性降低其整合酶活性。整合缺陷型慢病毒載體可以藉由修飾編碼整合酶蛋白的pol基因，產生編碼整合缺陷型整合酶的突變pol基因而獲得。該整合缺陷型病毒載體已經描述於專利申請WO 2006/010834中，該專利申請以全文引用的方式併入本文中。

如本文中所使用的，術語“宿主細胞”是指，可用於導入載體的細胞，其包括但不限於，如大腸桿菌或枯草菌等的原核細胞，如酵母細胞或曲黴菌等的真菌細胞，如S2果蠅細胞或Sf9等的昆蟲細胞，或者如纖維原細胞，CHO細胞，COS細胞，NSO細胞，HeLa細胞，BHK細胞，HEK 293細胞或人細胞等的動物細胞，免疫細胞（如T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞等）。宿主細胞可以包括單個細胞或細胞群體。

如本文中所使用的，術語“同一性”用於指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當兩個進行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元佔據時(例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤佔據，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸佔據)，那麼各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分數同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數目除以進行比較的位置數目×100的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那麼這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可藉由使用，例如，可藉由電腦程式例如Align程式(DNAstar, Inc.)方便地進行的Needleman等人(1970)J. Mol. Biol. 48：443-453的方法來實現。還可使用已整合入ALIGN程式(版本2.0)的E. Meyers和W. Miller (Comput. Appl Biosci.，4:11-17 (1988))的演算法，使用PAM120權重殘基表(weight residue table)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一性。此外，可使用已整合入GCG套裝軟體(可在www.gcg.com上獲得)的GAP程式中的Needleman和Wunsch (J MoI Biol. 48:444-453 (1970))演算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的長度權重來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一性。

如本文中所使用的，術語“保守置換”意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的預期性質的氨基酸置換。例如，可藉由本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學上或功能上與相應的氨基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，較佳用來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領域內是熟知的(參見，例如，Brummell等人，Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi等人Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 和Burks等人Proc. Natl Acad. Set USA 94:412-417 (1997)，其藉由引用併入本文)。

本文涉及的二十個常規氨基酸的編寫遵循常規用法。參見例如，Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates , Sunderland, Mass. (1991))，其以引用的方式併入本文中。在本發明中，術語“多肽”和“蛋白質”具有相同的含義且可互換使用。並且在本發明中，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，術語“藥學上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995)，並且包括但不限於：pH調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑，稀釋劑，維持滲透壓的試劑，延遲吸收的試劑，防腐劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液。表面活性劑包括但不限於陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80。離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。防腐劑包括但不限於各種抗細菌試劑和抗真菌試劑，例如對羥苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。維持滲透壓的試劑包括但不限於糖、NaCl及其類似物。延遲吸收的試劑包括但不限於單硬脂酸鹽和明膠。稀釋劑包括但不限於水，水性緩衝液(如緩衝鹽水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐劑包括但不限於各種抗細菌試劑和抗真菌試劑，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，對羥苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。穩定劑具有本領域技術人員通常理解的含義，其能夠穩定藥物中的活性成分的期望活性，包括但不限於谷氨酸鈉，明膠，SPGA，糖類（如山梨醇，甘露醇，澱粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖），氨基酸（如谷氨酸，甘氨酸），蛋白質（如乾燥乳清，白蛋白或酪蛋白）或其降解產物（如乳白蛋白水解物）等。在某些示例性實施方案中，該藥學上可接受的載體或賦形劑包括無菌可注射液體（如水性或非水性懸浮液或溶液）。在某些示例性實施方案中，此類無菌可注射液體選自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液（例如0.9% (w/v)NaCl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性劑的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、pH緩衝溶液（例如磷酸鹽緩衝溶液）、Ringer氏溶液及其任意組合。

如本文中所使用的，術語“預防”是指，為了阻止或延遲疾病或病症或症狀（例如，腫瘤）在受試者體內的發生而實施的方法。如本文中所使用的，術語“治療”是指，為了獲得有益或所需臨床結果而實施的方法。為了本發明的目的，有益或所需的臨床結果包括但不限於，減輕症狀、縮小疾病的範圍、穩定（即，不再惡化）疾病的狀態，延遲或減緩疾病的發展、改善或減輕疾病的狀態、和緩解症狀（無論部分或全部），無論是可檢測或是不可檢測的。此外，“治療”還可以指，與期望的存活期相比（如果未接受治療），延長存活期。

如本文中使用的，術語“受試者”是指哺乳動物，例如靈長類哺乳動物，例如人。在某些實施方式中，術語“受試者”是指包括其中可以引出免疫應答的活生物體。在某些實施方式中，該受試者（例如人）患有B細胞相關病況（例如B細胞惡性腫瘤），或者，具有患有上述疾病的風險。

如本文中所使用的，術語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預防疾病（例如，B細胞相關病況）有效量是指，足以預防，阻止，或延遲疾病（例如，B細胞相關病況）的發生的量；治療疾病有效量是指，足以治癒或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其併發症的量。測定這樣的有效量完全在本領域技術人員的能力範圍之內。例如，對於治療用途有效的量將取決於待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。

如本文中使用的，術語“B細胞相關病況”是指涉及不當B細胞活性和B細胞惡性腫瘤的病況，包括但不限於B細胞惡性腫瘤或與B細胞相關的自身免疫疾病。在本文中，術語“B細胞惡性腫瘤”包括在B細胞(免疫系統細胞類型)中形成的癌症類型，例如，多發性骨髓瘤(MM)和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。發明的有益效果

本發明提供了一種靶向BCMA的人源化抗體，其在保持了與鼠源抗體相當的結合表達BCMA腫瘤細胞的活性的同時，對於正常組織細胞的非特異性結合明顯降低，有利於減少非特異性毒性，提高藥物的安全性。本發明進一步提供了包含該人源化抗體的靶向BCMA的嵌合抗原受體。表達本發明的嵌合抗原受體的免疫效應細胞基本不會引起抗原非依賴性的細胞因數釋放，並且不會誘導T細胞的持續啟動和衰竭，具備明顯提高的安全性。因此，本發明的人源化抗體及CAR具有用於預防和/或治療B細胞相關病況（例如B細胞惡性腫瘤、自身免疫疾病等）的潛力，具有重大的臨床價值。[01]

下面將結合附圖和實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列附圖和實施例僅用於說明本發明，而不是對本發明的範圍的限定。根據附圖和較佳實施方案的下列詳細描述，本發明的各種目的和有利方面對於本領域技術人員來說將變得可實施。

序列資訊

本發明涉及的部分序列的資訊提供於下面的表1中。表1：序列的描述

SEQ ID NO	描述	SEQ ID NO	描述
1	C11D5.3-03 VH	9	CD3ζITAM
2	C11D5.3-03 VL	10	C11D5.3-03-CAR全長氨基酸序列
3	C11D5.3-04 VH	11	C11D5.3-03-CAR編碼核酸序列
4	C11D5.3-04 VL	12	C11D5.3-04-CAR全長氨基酸序列
5	連接子	13	C11D5.3-04-CAR編碼核酸序列
6	鉸鏈區	14	C11D5.3-CAR全長氨基酸序列
7	跨膜區	15	C11D5.3-CAR編碼核酸序列
8	CD137胞內訊號傳導結構域	16	P2A-tEGFR編碼核酸序列

現參照下列意在舉例說明本發明(而非限定本發明)的實施例來描述本發明。

除非特別指明，本發明中所使用的分子生物學實驗方法和免疫檢測法，基本上參照J. Sambrook等人，分子殖株：實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及F. M. Ausubel等人，精編分子生物學實驗指南，第3版，John Wiley & Sons, Inc.，1995中所述的方法進行；限制性內切酶的使用依照產品製造商推薦的條件。本領域技術人員知曉，實施例以舉例方式描述本發明，且不意欲限制本發明所要求保護的範圍。實施例1：抗BCMA鼠源抗體的人源化及人源化抗體的製備

為提高抗體與人源抗體的序列的同源性，減少抗體對人的免疫原性，對鼠源抗體C11D5.3（其重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列分別參見中國專利申請CN 201510142069.2中的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：12）進行人源化設計，使用本領域已知的方法將鼠CDR區插入人源框架序列（參見Winter的美國專利No.5,225,539；Queen等人的美國專利Nos.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762和6,180,370；以及Lo, Benny, K.C., editor, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004）。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體（供體抗體），全部或部分的非CDR區（例如，可變區FR和/或恆定區）來自於人源免疫球蛋白（受體抗體）。根據以上方法，並經過大量篩選，以鼠源抗體C11D5.3的CDR為基礎，共建構了2株人源化抗體（scFv），分別命名為C11D5.3-03和C11D5.3-04。C11D5.3-03的VH和VL分別如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示；C11D5.3-04的VH和VL分別如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示。此外，製備鼠源抗體C11D5.3（scFv）作為參比抗體。

用Freestyle 293表達培養基（Invitrogen, 12338018）培養編碼上述抗體的表達質粒暫態轉染的HEK293-F細胞（Invitrogen, R7907），在37ºC的CO₂ 培養箱中溫育5-7天。離心去除細胞以及細胞碎片，收集培養上清，使用0.22μm薄膜過濾後，使用蛋白A柱（GE Life Science，17127901）進行純化，遵循製造商指導，用PBS洗滌，在含有20mM 檸檬酸鹽、150mM NaCl的酸性緩衝液（pH3.5）中洗脫抗體，用1M Tris (pH8.0)中和洗脫物，使用PBS透析。藉由測量280nm處吸光度來測定抗體濃度，分裝好的抗體儲存於-80ºC冰箱。實施例2：抗BCMA人源化抗體對重組人源BCMA蛋白的親和力評估

使用ELISA方法評估抗體對人源BCMA蛋白的結合活性，使用ELISA中的劑量依耐性結合曲線比較抗體效能。

在PBS總稀釋BCMA蛋白（Sino Biological,10620-H08H）至1μg/mL, 在ELISA板上的每孔中加入100μL蛋白溶液，在4℃下過夜。將板在洗滌緩衝液(PBS，0 .05％吐溫20)中洗滌3次，並且藉由添加200μl/w PBS+ 2% BSA阻斷使非特異性位點飽和。加入C11D5.3-03、C11D5.3-04或鼠源抗體C11D5.3，在37℃下孵育2h。將板在洗滌緩衝液中洗滌3次，並且在室溫下添加HRP偶聯的山羊抗人二抗，孵育1h。將板在洗滌緩衝液中洗滌3次，藉由添加TMB(HRP底物)並且在室溫下在黑暗中孵育板5至10分鐘來檢測結合的二抗。藉由添加硫酸溶液 1M終止酶反應，並且在450 nm處測量光吸收。

結果如圖1所示，人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04分別具有0.011μg/mL和0.011μg/mL的EC50（50%活性時的有效濃度），與鼠源抗體C11D5.3（EC50=0.011μg/mL）具有同等的結合活性。實施例3：抗BCMA人源化抗體對表達BCMA的腫瘤細胞的親和力評估

使用FACS方法評估實施例1獲得的人源化抗體對表達BCMA細胞的結合活性，使用FACS中的劑量依耐性結合曲線比較抗體效能。

消化細胞（BCMA表達的人源骨髓瘤細胞或者BCMA不表達的組織細胞），將500000個細胞鋪於50μL含2%FBS的PBS中（FACS buffer），使用U形底96孔板。藉由將1/3體積(100μL)稀釋於200μL FACS buffer中來對測試樣品實施3倍梯度稀釋，起始抗體濃度為300μg/mL（終濃度）。細胞板的每一孔中加入50μL經稀釋的抗體4ºC孵育1小時。用FACS buffer清洗兩次後，每孔加入100μL第二抗體(Abcam ab97003，5μg/mL，稀釋於FACS buffer中)，4ºC孵育0.5小時。染色完成後，用FACS buffer清洗兩次後，每孔加入200μLFACS buffer，然後上機器（BD C6plus）進行讀數。

圖2、圖3、圖4、圖5分別顯示了抗體與人多發性骨髓瘤細胞U266、MM.1S、RPMI8226，以及不表達BCMA的人Burkitt's淋巴瘤細胞Daudi結合的劑量依賴性結合曲線，具體EC50值如表2所示。結果表明，對於表達BCMA的3種腫瘤細胞，人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04均具備與鼠源抗體相當的高親和力；同時，對於不表達BCMA的腫瘤細胞，人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04也展現了與鼠源抗體相當的低親和力。表2：抗BCMA抗體結合表達BCMA的腫瘤細胞的EC50值

	EC50 (μg/ml)
C11D5.3	C11D5.3-03	C11D5.3-04
U266	4.4	7.57	1.99
MM.1S	1.62	0.81	0.47
RPMI8226	3.81	2.25	0.82
Daudi	58.25	36.32	30.71

實施例4：抗BCMA人源化抗體與非腫瘤組織細胞的非特異性結合的評估

使用FACS方法評估純化的實施例1獲得的人源化抗體與非腫瘤的組織細胞之間的非特異性結合，使用BCMA不表達的組織細胞，具體方法如前文所描述。圖6至圖7分別顯示了抗體與人永生化角質形成細胞Hacat，人胃黏膜上皮細胞GES的結合曲線。如圖所示，鼠源抗體C11D5.3在高濃度（100μg/mL）下與Hacat和GES細胞均存在結合，相比之下，兩個人源化抗體C11D5.3-03和C11D5.3-04在所測濃度下（0.003-100μg/mL）與兩種非腫瘤組織細胞都沒有結合。以上結果表明，本發明的人源化抗體相比於鼠源抗體C11D5.3具備降低的非特異性結合，這樣的技術效果是顯著的和出人意料的。實施例5：嵌合抗原受體（CAR）慢病毒表達載體的建構及製備

基於上述實施例中獲得的人源化抗體，進一步建構CAR慢病毒表達載體。建構的嵌合抗原受體慢病毒表達載體中，從N端到C端各元件氨基酸序列分別如下表3所示。該CAR包含以上述人源化抗體的scFv（VH+VL）、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜區、CD137的胞內結構域和CD3ζ的ITAM區。將編碼上述CAR的核酸序列與編碼P2A-tEGFR的序列（SEQ ID NO: 16）連接並插入GV401載體（吉凱基因），其表達框為EF1a Promoter-BCMA CAR-P2A-tEGFR-WPRE，可藉由檢測tEGFR表達監測BCMA CAR表達。表3：嵌合抗原受體中從N端到C端各元件的氨基酸序列

CAR名稱	N端→C端各元件的氨基酸序列（SEQ ID NO: ）	全長序列	編碼核酸序列
VH	連接子	VL	鉸鏈區	跨膜區	CD137	CD3ζ
C11D5.3-03	1	5	2	6	7	8	9	10	11
C11D5.3-04	3	4	12	13
C11D5.3	CN201510142069.2的SEQ ID NO：3	CN201510142069.2的SEQ ID NO：12	14	15

實施例6：CAR-T細胞製備

採集自健康人的PBMC細胞（軒鋒生物，SLB-HP010）；在6孔板中包被1μg/ml CD3（Miltenyi ，170-076-124）抗體和1μg/ml CD28（Miltenyi ，170-076-117）抗體；向包被後的6孔板中加入PBMC，培養過夜。將實施例5所述的CAR慢病毒載體按照MOI=3加至PBMC，2000rpm離心60分鐘，以進行轉導，分別獲得轉導了鼠源C11D5.3-CAR的T細胞（C11D5.3 CAR-T）、轉導了人源化的C11D5.3-03-CAR的T細胞（C11D5.3-03 CAR-T）以及轉導了人源化的C11D5.3-04-CAR的T細胞（C11D5.3-04 CAR-T）。培養48小時後，用標記PE螢光的Cetuximab檢測tEGFR表達。

圖8顯示了未經轉染的對照PBMC、以及上述三種CAR-T細胞上BCMA-CAR的表達情況。結果顯示，上述三種CAR-T均能夠表達相應的抗BCMA CAR，表明抗BCMA CAR-T建構成功。實施例7：抗BCMA CAR-T體外抗腫瘤能力的評估

細胞因數釋放測定：將實施例6製備獲得的抗BCMA CAR-T細胞收集後，用DPBS溶液清洗2次，重懸至含2% FBS RPMI1640培養基中；將腫瘤細胞收集後，清洗後重選至含2% FBS RPMI1640培養基中，該腫瘤細胞包括：不表達BCMA的腫瘤細胞（293T，K562）、表達BCMA的腫瘤細胞（M1ss，U266，RPMI8226，Daudi）。

將抗BCMA CAR-T細胞與上述腫瘤細胞系按E:T（效應細胞/靶細胞）=1：1混合培養16小時，取上清利用BD CBA assay測定上清中細胞因數釋放，對照PBMC、C11D5.3 CAR-T、C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T的IFNγ和IL2釋放結果分別如圖9和圖10所示。

以上結果表明，人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T與鼠源C11D5.3 CAR-T類似，均能夠特異性識別BCMA+細胞系，並釋放IFNγ和IL2。

腫瘤細胞裂解實驗：將表達BCMA細胞系（U266、Daudi）與抗BCMA CAR-T細胞分別按照E:T=30:1、10:1、3:1混合培養4小時，取上清檢測LDH釋放（CytoTox96 Non Radioactive Cytotoxicity Assay），對照PBMC、C11D5.3 CAR-T、C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T對U266和Daudi殺傷的LDH釋放結果分別如圖11和圖12所示。

以上結果表明，人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T與鼠源C11D5.3 CAR-T類似，均可識別並殺傷BCMA+腫瘤細胞。實施例8：人源化的抗BCMA CAR-T細胞的細胞因數釋放

研究發現，抗BCMA CAR-T細胞可能在不存BCMA抗原的情況下釋放細胞因數，這一釋放隨抗BCMA CAR分子的結構差異水準不同；強化的細胞因數釋放引起的毒性是已知抗BCMA CAR T細胞臨床治療的毒性問題之一。已知基於鼠源抗體C11D5.3的CAR-T細胞治療在目前進行的臨床中未發現顯著的強化的細胞因數釋放問題，然而研究進一步發現，某些人源化的抗BCMA CAR引起抗原非依賴性的細胞因數釋放，該特徵將使得人源化的抗BCMA CAR不適用於T細胞療法。為此，本實施例評價了人源化的抗BCMA CAR-T細胞的抗原非依賴性的細胞因數釋放情況。

在含有60 IU/mL的IL2（Miltenyi ，130-097-748）的AIM-V培養基（Gibco，A3021002）中，於5% CO₂ ，37℃培養箱中靜置培養實施例6獲得的CAR-T或PBMC對照，在不同的培養時間點檢測不存在刺激情況下的細胞因數釋放。將對照PBMC、C11D5.3 CAR-T、C11D5.3-03 CAR-T、或C11D5.3-04 CAR-T進行培養，在第一天（第一次換液前）、第二天、第三天、第五天（第二次換液前）、第七天、以及第九天取上清，使用多元磁珠方法（TH1/TH2 cytokine CBA kit，BD，#550749）測定釋放至上清液中的5種細胞因數，包括IL4、IL6、IL10、TNFα以及IFNγ的水準。圖13-17分別顯示了上述三種CAR-T細胞和未轉染的PBMC細胞在不存在抗原刺激的無血清培養體系中在不同培養時間點的IL4、IL6、IL10、TNFα以及IFNγ釋放水準的一個比較。可以看到，不存在刺激情況下，人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T的一型炎症因數的釋放相比較未轉染的PBMC細胞並沒有明顯變化。

以上結果表明，本發明的人源化的抗BCMA CAR-T細胞沒有引發明顯的抗原非依賴性的細胞因數釋放。

在含有人血清（Corning，MT35060CI）但沒有BCMA抗原的AIM-V培養基（Gibco，A3021002）中將1×10⁵ 的對照PBMC、C11D5.3 CAR-T、C11D5.3-03 CAR-T、或C11D5.3-04 CAR-T培養48小時，使用多元磁珠方法測定釋放至上清液中的5種細胞因數，包括IL4、IL6、IL10、TNFα以及IFNγ的水準，對比上述三種CAR-T細胞的釋放的細胞因數區別，評估為人源化對C11D5.3進行的序列改變是否會引入在小鼠抗BCMA CAR-T細胞中未見的對人血清中蛋白的新生的反應性。圖18顯示了上述三種CAR-T細胞和未轉染的PBMC細胞在不存在抗原刺激的含有5%人血清的培養體系中的IL4、IL6、IL10、TNFα以及IFNγ釋放水準的一個比較。可以看到，兩種人源化抗BCMA CAR-T細胞的一型炎症因數的釋放相比較鼠源CAR-T細胞並沒有顯著變化，並且與未轉染的PBMC細胞在一型炎症因數釋放方面也沒有顯著變化。

上述結果表明，C11D5.3-03 和C11D5.3-04的人源化對C11D5.3進行的序列改變不會引入在小鼠抗BCMA CAR-T細胞中未見的對人血清中蛋白的新生的反應性。

綜上，基於本發明的人源化抗體C11D5.3-03和C11D5.3-04獲得的CAR在能夠降低由小鼠序列的免疫反應引起的潛在的免疫原性的同時，未展現明顯的抗原非依賴性的細胞因數釋放以及對人血清中蛋白的新生的反應性，具備顯著提高的安全性。這樣的技術效果是顯著的和出人意料的。實施例9：人源化的抗BCMA CAR T細胞的啟動狀態評價

在實施例8所述的培養體系中培養實施例6製備獲得的CAR-T或PBMC對照，在培養第五天和第九天（終點）檢測三種CAR-T細胞表面的T細胞活化表型標誌物的表達區別，以評估人源化對C11D5.3進行的序列改變是否會引入在小鼠抗BCMA CAR-T細胞中未見的CAR-T細胞的過度活化。使用FACS方法檢測CAR T細胞表面HLA-DR（APC anti-human HLA-DR Antibody，Biolegend）和CD25(FITC anti-human CD25 Antibody，Biolegend)的表達水準。

結果分別如圖19和圖20所示。結果顯示，人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T相比於鼠源C11D5.3 CAR-T未出現CAR-T細胞的過度活化。實施例10：人源化的抗BCMA CAR T細胞的凋亡評價

T細胞的衰竭通常與細胞凋亡引起的活化誘導的細胞死亡有關。測量活化的Caspase-3（CaspGLOW™ Fluorescein Active Caspase-3 Staining Kit，Invitrogen）的水準，檢查抗BCMA CAR的導入是否可導致更高的T細胞凋亡水準。使用FACS方法檢測C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T、C11D5.3 CAR-T以及對照PBMC的活化的Caspase-3的表達水準，結果分別如圖21所示。結果顯示，人源化的C11D5.3-03 CAR、 C11D5.3-04 CAR的導入都不影響T細胞中的活化Caspase-3的表達水準，不導致T細胞凋亡引起的細胞死亡。

儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，但本領域技術人員將理解：根據已經公佈的所有教導，可以對細節進行各種修改和變動，並且這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部分為由所附請求項及其任何等同物給出。

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PBMC:外週血單核細胞

圖1顯示了人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04及母本鼠源抗體C11D5.3對重組人源BCMA蛋白的結合曲線。圖2顯示了人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04及母本鼠源抗體C11D5.3與人多發性骨髓瘤細胞U266結合的劑量依賴性結合曲線。圖3顯示了人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04及母本鼠源抗體C11D5.3與人多發性骨髓瘤細胞MM.1S結合的劑量依賴性結合曲線。圖4顯示了人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04及母本鼠源抗體C11D5.3與人多發性骨髓瘤細胞RPMI8226結合的劑量依賴性結合曲線。圖5顯示了人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04及母本鼠源抗體C11D5.3與不表達BCMA的人Burkitt's淋巴瘤細胞Daudi結合的劑量依賴性結合曲線。圖6顯示了人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04及母本鼠源抗體C11D5.3與人永生化角質形成細胞Hacat的結合曲線。圖7顯示了人源化抗體C11D5.3-03、C11D5.3-04及母本鼠源抗體C11D5.3與人胃黏膜上皮細胞GES的結合曲線。圖8顯示了轉導了C11D5.3-CAR、或者人源化的C11D5.3-03-CAR、C11D5.3-04-CAR的T細胞上BCMA-CAR的表達情況。圖9顯示了C11D5.3 CAR-T或者人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T的IFNγ釋放測定結果。圖10顯示了C11D5.3 CAR-T或者人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T的IL2釋放測定結果。圖11顯示了C11D5.3 CAR-T或者人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T對U266殺傷的LDH釋放結果。圖12顯示了C11D5.3 CAR-T或者人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T對Daudi殺傷的LDH釋放結果。圖13-17分別顯示了C11D5.3 CAR-T或者人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T和未轉染的PBMC細胞在不存在抗原刺激的無血清培養體系中的IL4（圖13）、IL6（圖14）、IL10（圖15）、TNFα（圖16）以及IFNγ（圖17）釋放水準檢測結果。圖18顯示了C11D5.3 CAR-T或者人源化的C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T和未轉染的PBMC細胞在不存在抗原刺激的含有5%人血清的培養體系中的IL4、IL6、IL10、TNFα以及IFNγ釋放水準檢測結果。圖19顯示了CAR-T細胞表面HLA-DR的表達水準檢測結果。圖20顯示了CAR-T細胞表面CD25的表達水準檢測結果。[02] 圖21顯示了C11D5.3-03 CAR-T、C11D5.3-04 CAR-T、C11D5.3 CAR-T以及對照PBMC中的活化的Caspase-3的表達水準檢測結果。

Claims

一種能夠特異性結合BCMA的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含： (a) 重鏈可變區（VH），其包含選自下列的氨基酸序列： (i) SEQ ID NO: 1或3所示的序列； (ii) 與SEQ ID NO: 1或3所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (iii) 與SEQ ID NO: 1或3所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；和/或， (b) 輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的氨基酸序列： (iv) SEQ ID NO: 2或4所示的序列； (v) 與SEQ ID NO: 2或4所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (vi) 與SEQ ID NO: 2或4所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；較佳地，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換。
如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段包含： (a) 重鏈可變區（VH），其包含選自下列的氨基酸序列： (i) SEQ ID NO: 1所示的序列； (ii) 與SEQ ID NO: 1所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (iii) 與SEQ ID NO: 1所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；和， (b) 輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的氨基酸序列： (iv) SEQ ID NO: 2所示的序列； (v) 與SEQ ID NO: 2所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (vi) 與SEQ ID NO: 2所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；較佳地，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換；較佳地，該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），該VH包含如SEQ ID NO: 1所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 2所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段包含： (a) 重鏈可變區（VH），其包含選自下列的氨基酸序列： (i) SEQ ID NO: 3所示的序列； (ii) 與SEQ ID NO: 3所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (iii) 與SEQ ID NO: 3所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；和， (b) 輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的氨基酸序列： (iv) SEQ ID NO: 4所示的序列； (v) 與SEQ ID NO: 4所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個氨基酸的置換、缺失或添加）的序列；或 (vi) 與SEQ ID NO: 4所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；較佳地，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換；較佳地，該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），該VH包含如SEQ ID NO: 3所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 4所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
如請求項1至請求項3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段進一步包含一重鏈恆定區（CH）和一輕鏈恆定區（CL）；較佳地，該重鏈恆定區選自IgG、IgM、IgE、IgD或IgA；較佳地，該重鏈恆定區是IgG重鏈恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區；較佳地，該輕鏈恆定區選自κ或λ；較佳地，該輕鏈恆定區是κ輕鏈恆定區。
如請求項1至請求項4任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段選自scFv、di-scFv、(scFv)₂ 、Fab、Fab’、(Fab’)₂ 、Fv、二硫鍵連接的Fv。
一種嵌合抗原受體（CAR），其包含一胞外抗原結合結構域、一間隔結構域、一跨膜結構域以及一胞內訊號傳導結構域，其中該胞外抗原結合結構域包含如請求項1至請求項5任一項所述的抗體或其抗原結合片段；較佳地，該抗體或其抗原結合片段選自Fab片段、Fab'片段、F(ab)'₂ 片段、Fv、二硫鍵穩定的Fv蛋白(“dsFv”)、scFv、di-scFv、(scFv)₂ ；較佳地，該抗體或其抗原結合片段選自scFv、di-scFv、(scFv)₂ 。
如請求項6所述的嵌合抗原受體，其中，該胞外抗原結合結構域包含一重鏈可變區（VH）和一輕鏈可變區（VL），該VH包含如SEQ ID NO: 1所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 2所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；較佳地，該VH和VL藉由一連接子連接；較佳地，該連接子具有SEQ ID NO：5所示的序列。
如請求項6所述的嵌合抗原受體，其中，該胞外抗原結合結構域包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），該VH包含如SEQ ID NO: 3所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性，該VL包含如SEQ ID NO: 4所示的序列或與其相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；較佳地，該VH和VL藉由連接子連接；較佳地，該連接子具有SEQ ID NO：5所示的序列。
請求項6至請求項8中任一項所述的嵌合抗原受體，其中，該間隔結構域選自鉸鏈結構域和/或免疫球蛋白（例如IgG1或IgG4）的CH2和CH3區；較佳地，該間隔結構域包含CD8α的鉸鏈區；較佳地，該間隔結構域包含SEQ ID NO: 6所示的序列。
請求項6至請求項9中任一項所述的嵌合抗原受體，其中，該跨膜結構域是選自下列蛋白的跨膜區：T細胞受體的α、β或ζ鏈、CD8α、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、DAP10；較佳地，該跨膜結構域包含CD8α的跨膜區；較佳地，該跨膜結構域包含SEQ ID NO: 7所示的序列。
如請求項6至請求項10中任一項所述的嵌合抗原受體，其中，該胞內訊號傳導結構域包含一初級訊號傳導結構域以及任選的一共刺激訊號傳導結構域；較佳地，該胞內訊號傳導結構域從N端到C端依次包含共刺激訊號傳導結構域和初級訊號傳導結構域；較佳地，該胞內訊號傳導結構域包含初級訊號傳導結構域以及至少一個共刺激訊號傳導結構域；較佳地，該初級訊號傳導結構域包含免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）；較佳地，該初級訊號傳導結構域包含選自以下蛋白的胞內訊號傳導結構域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、DAP10、CD79b或CD66d；較佳地，該初級訊號傳導結構域包含CD3ζ的胞內訊號傳導結構域；較佳地，該初級訊號傳導結構域包含SEQ ID NO: 9所示的序列；較佳地，該共刺激訊號傳導結構域包含選自下列蛋白的胞內訊號傳導結構域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)或DAP10；較佳地，該共刺激訊號傳導結構域選自CD28的胞內訊號傳導結構域或CD137(4-1BB)的胞內訊號傳導結構域或其組合；較佳地，該共刺激訊號傳導結構域包含SEQ ID NO: 8所示的序列。
如請求項6至請求項11中任一項所述的嵌合抗原受體，其中，該嵌合抗原受體從其N端至C端依次包含該胞外抗原結合結構域、間隔結構域、跨膜結構域、胞內訊號傳導結構域；較佳地，該間隔結構域包含CD8α的鉸鏈區（例如，如SEQ ID NO：6所示序列）；較佳地，該跨膜結構域包含CD8α的跨膜區（例如，如SEQ ID NO：7所示序列）；較佳地，該胞內訊號傳導結構域包含初級訊號傳導結構域和共刺激訊號傳導結構域，其中該初級訊號傳導結構域包含CD3ζ的胞內訊號傳導結構域（例如，如SEQ ID NO：9所示序列），該共刺激訊號傳導結構域包含CD137的胞內訊號傳導結構域（例如，如SEQ ID NO：8所示序列）；較佳地，該嵌合抗原受體具有選自下列的氨基酸序列：(1) SEQ ID NO: 10或12所示的氨基酸序列；(2) 與SEQ ID NO: 10或12所示的氨基酸序列相比具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
一種分離的核酸分子，其包含編碼如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列，或者編碼如請求項6至請求項12中任一項所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列；較佳地，該分離的核酸分子包含編碼如請求項6至請求項12中任一項所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列，該分離的核酸分子包含選自下列的核苷酸序列：(1) SEQ ID NO: 11或13所示的核苷酸序列；(2) 與SEQ ID NO: 11或13所示的核苷酸序列相比具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的序列。
一種載體，其包含請求項13所述的分離的核酸分子；較佳地，該載體包含編碼如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列；較佳地，該載體包含編碼如請求項6至請求項12中任一項所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列；較佳地，該載體選自DNA載體，RNA載體，質粒，轉座子載體，CRISPR/Cas9載體，或病毒載體；較佳的，該載體是表達載體；較佳地，該載體是游離型載體；較佳地，該載體是病毒載體，例如慢病毒載體，腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。
一種宿主細胞，其包含如請求項13所述的分離的核酸分子，或如請求項14所述的載體；較佳地，該宿主細胞包含編碼如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的一核苷酸序列或包含該核苷酸序列的載體；較佳地，該宿主細胞包含大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞，或哺乳動物細胞；較佳地，該宿主細胞包含編碼如請求項6至請求項12中任一項所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列或包含該核苷酸序列的載體；較佳地，該宿主細胞包含一免疫細胞（例如人免疫細胞）；更較佳地，該免疫細胞選自T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞及其任意組合。
一種製備如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的方法，其包括，在允許該抗體或其抗原結合片段表達的條件下，培養請求項15所述的宿主細胞，和從培養的宿主細胞培養物中回收該抗體或其抗原結合片段；其中該宿主細胞包含編碼請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列或包含該核苷酸序列的載體。
一種免疫效應細胞，其表達如請求項6至請求項12中任一項所述的嵌合抗原受體；較佳地，該免疫效應細胞包含編碼如請求項6至請求項12任一項所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列或包含該核苷酸序列的載體；較佳地，該免疫效應細胞選自T淋巴細胞、NK細胞，單核細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞及其任意組合；較佳地，該免疫效應細胞選自T淋巴細胞和/或NK細胞。
一種製備如請求項17所述的免疫效應細胞的方法，其包括：(1)提供免疫效應細胞；(2) 將如請求項13所述的分離的核酸分子或如請求項14所述的載體引入該免疫效應細胞；其中，該分離的核酸分子或載體包含編碼如請求項6至請求項12中任一項中所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列；較佳地，該免疫效應細胞選自T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及其任意組合；較佳地，該免疫效應細胞選自T淋巴細胞和/或NK細胞；較佳地，在步驟(1)中，該免疫效應細胞經一預處理，該預處理包括免疫效應細胞的分選、啟動和/或增殖；較佳地，該預處理包括將免疫效應細胞與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸；較佳地，在步驟(2)中將該核酸分子或載體藉由病毒感染引入免疫效應細胞；較佳地，在步驟(2)中將該核酸分子或載體藉由非病毒載體轉染的方式引入免疫效應細胞，如藉由磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、顯微注射、轉座子的載體系統、CRISPR/Cas9載體、TALEN方法、ZFN方法或電穿孔方法；較佳地，在步驟(2)之後還包括擴增步驟(2)獲得的免疫效應細胞的步驟。
一種試劑盒，其包括如請求項13所述的分離的核酸分子或請求項14所述的載體；較佳地，該分離的核酸分子或載體包含編碼如請求項6至請求項12中任一項所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列。
如請求項19所述的試劑盒用於製備特異性結合BCMA的嵌合抗原受體或表達該嵌合抗原受體的細胞的用途；較佳地，該細胞是免疫效應細胞，例如T淋巴細胞和/或NK細胞。
一種綴合物，其包含如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段以及連接於該抗體或其抗原結合片段的一修飾部分；較佳地，該修飾部分選自可檢測的標記，例如酶、放射性核素、螢光染料、發光物質（如化學發光物質）或生物素；較佳地，該修飾部分選自治療劑，例如具有抗腫瘤活性的藥物或細胞毒劑。
一種藥物組合物，其含有如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，或如請求項6至請求項12中任一項所述的嵌合抗原受體，或請求項13所述的分離的核酸分子，或請求項14所述的載體，或請求項15所述的宿主細胞，或請求項17所述的免疫效應細胞，或請求項21所述的綴合物，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑；較佳地，該藥物組合物還包含一另外的藥學活性劑；較佳地，該另外的藥學活性劑是具有抗腫瘤活性的藥物，例如烷化劑、有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、放射性核素劑、放射增敏劑、抗血管產生劑、細胞因數、特異性靶向腫瘤細胞抗體或免疫檢查點抑制劑。
如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，或如請求項6至請求項12中任一項所述的嵌合抗原受體，或如請求項13所述的分離的核酸分子，或如請求項14所述的載體，或如請求項15所述的宿主細胞，或如請求項17所述的免疫效應細胞，或請求項21所述的綴合物，或如請求項22所述的藥物組合物，在製備用於在受試者（例如人）中預防和/或治療B細胞相關病況的藥物中的用途；較佳地，該B相關病況是B細胞惡性腫瘤，例如，多發性骨髓瘤(MM)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)；較佳地，該B細胞相關病況是自身免疫性疾病，例如全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎、特發性血小板減少性紫癜或重症肌無力或自身免疫性溶血性貧血；較佳地，該B細胞相關病況選自多發性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、具有不確定的惡性潛能的B細胞增殖、淋巴瘤樣肉芽腫病、移植後淋巴增生性病症、免疫調節病症、風濕性關節炎、重症肌無力、特發性血小板減少性紫癜、抗磷脂症候群、恰加斯氏病、格雷夫斯氏病、韋格納肉芽腫、結節性多動脈炎、斯耶葛籣氏症候群、尋常天皰瘡、硬皮病、多發性硬化、抗磷脂症候群、ANCA相關性小血管炎、古德帕斯徹病、川崎病、自身免疫性溶血性貧血以及急進性腎小球腎炎、重鏈疾病、原發性或免疫細胞相關澱粉樣變性或者意義未明的單殖株丙種球蛋白血症。
一種用於在受試者（例如人）中預防和/或治療B細胞相關病況的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用有效量的如請求項1中請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、如請求項17所述的免疫效應細胞、或如請求項21所述的綴合物、或如請求項22所述的藥物組合物；較佳地，該B相關病況是B細胞惡性腫瘤，例如，多發性骨髓瘤(MM)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)；較佳地，該B細胞相關病況是自身免疫性疾病，例如全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎、特發性血小板減少性紫癜或重症肌無力或自身免疫性溶血性貧血；較佳地，該B細胞相關病況選自多發性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、具有不確定的惡性潛能的B細胞增殖、淋巴瘤樣肉芽腫病、移植後淋巴增生性病症、免疫調節病症、風濕性關節炎、重症肌無力、特發性血小板減少性紫癜、抗磷脂症候群、恰加斯氏病、格雷夫斯氏病、韋格納肉芽腫、結節性多動脈炎、斯耶葛籣氏症候群、尋常天皰瘡、硬皮病、多發性硬化、抗磷脂症候群、ANCA相關性小血管炎、古德帕斯徹病、川崎病、自身免疫性溶血性貧血以及急進性腎小球腎炎、重鏈疾病、原發性或免疫細胞相關澱粉樣變性或者意義未明的單殖株丙種球蛋白血症。
用於在一受試者（例如人）中預防和/或治療B細胞相關病況的方法，該方法包括以下步驟： (1) 提供一免疫效應細胞； (2) 將包含編碼如請求項6至請求項12中任一項所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列的分離的核酸分子或載體導入步驟(1) 所述的免疫效應細胞，以獲得表達該嵌合抗原受體的免疫效應細胞； (3) 將步驟(2)中獲得的免疫效應細胞施用至該受試者以進行治療；較佳地，該免疫效應細胞選自T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、或這些細胞的任意組合；較佳地，在步驟(1)之前，該方法還包括從該受試者獲得該免疫效應細胞的步驟。
用於診斷一受試者（例如人）是否患有一表達BCMA的腫瘤的方法，其包括使用如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段檢測BCMA在來自該受試者的一樣品中的量；較佳地，該方法還包括：將該BCMA在來自該受試者的樣品中的量與參考值進行比較的步驟；較佳地，藉由以下步驟檢測BCMA在來自該受試者的樣品中的量： (1) 將來自該受試者的樣品與如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段接觸； (2) 檢測該抗體或其抗原結合片段與BCMA所形成的複合物的量；較佳地，在步驟(1)中，該抗體或其抗原結合片段還帶有可檢測的標記；較佳地，該樣品選自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、迴圈細胞、迴圈腫瘤細胞、非組織締合的細胞、組織(例如手術切除的腫瘤組織、活體組織切片或細針抽吸組織)、組織學製備物；較佳地，該表達BCMA的腫瘤選自B細胞惡性腫瘤，例如多發性骨髓瘤（MM）或非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）；較佳地，該方法還包括給被診斷為患有表達BCMA的腫瘤的受試者施用一靶向BCMA的免疫療法；較佳地，該靶向BCMA的免疫療法為如請求項24或請求項25所述的方法。