TW202128264A - 使用經預測之溶離緩衝鹽濃度的陽離子層析法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種產生包含第一目標蛋白及第二目標蛋白(P1、P2)之目標溶離體積(238)的層析法。該方法包含： -   提供陽離子交換層析管柱(230) (100)； -   將蛋白質溶液(202)施加於該管柱上(102)，該蛋白質溶液包含該第一目標蛋白(P1)、第二目標蛋白及視情況選用之一或多種其他蛋白質(P3、P4、P5、P6)； -   輸入最佳化準則(106)； -   計算層析模擬以供計算適於提供最佳符合該最佳化準則之目標溶離體積之溶離緩衝鹽濃度(222) (108)； -   計算該目標溶離體積至少隨所計算之鹽濃度及所輸入之最佳化準則而變之彙集邊界(110)； -   將具有所計算鹽濃度之溶離緩衝液(226)施加於該層析管柱上(112)； -   執行溶離(114)；及 -   收集所計算之目標溶離體積(116)。

Description

使用經預測之溶離緩衝鹽濃度的陽離子層析法
本發明係關於層析領域，且更特定言之係關於用於獲得特定蛋白質之陽離子層析領域。
陽離子交換層析法為一種通常用於基於其淨表面電荷而分離分子之離子交換層析法的形式。出於製備及分析目的兩者，使用對具有淨正表面電荷之分子(例如，蛋白質或肽)具有親和力的帶負電荷之離子交換樹脂。
蛋白質之淨表面電荷以由蛋白質之等電點(「pI」)決定之方式隨pH而改變。具有不同pI值之蛋白質將在給定pH下具有不同程度之電荷，且藉此對層析管柱中離子交換介質之粒子上之帶負電荷表面基團具有不同親和力。因此，具有不同pI值之蛋白質將結合至具有不同強度之層析樹脂，從而有助於其分離。
然而，並非所有需要分離之蛋白質及肽具有足夠不同之pI值，以允許於層析管柱中明確分離。此外，分離可另外取決於與管柱相互作用之胺基酸側殘基之數目：由於立體因素，蛋白質中並非所有帶電基團可以參與結合。特定言之，層析管柱中蛋白質醣型及包含其他類型之轉譯後修飾(PTM)之蛋白質的解析係一種挑戰。
醣基化為蛋白質之最常見轉譯後修飾(PTM)中之一者。醣基化涉及將寡醣(聚醣)共價連接至蛋白質之胺基酸主鏈，特定言之至絲胺酸/蘇胺酸(O-醣基化)或天冬醯胺(N-醣基化)胺基酸殘基。聚醣殘基對蛋白質之生物功能具有主要影響，因為其可以影響蛋白質穩定性、溶解度、抗原性、摺疊及血清半衰期。蛋白質醣基化及許多其他形式之PTM (例如，磷酸化、甲基化、琥珀醯亞胺化(succinimidation)、氧化、N端甲硫胺酸缺失及其他)產生於涉及各種酶及基質之複雜製程中，且視宿主生物體、生產細胞株及培養條件而定。
醣基化及其他類型之PTM為治療蛋白之關鍵品質屬性。經由構形變化之PTM可調節蛋白質及肽之治療價值(效力)，例如MAb之補體依賴性細胞細胞毒性(complement dependent cell cytotoxicity；CDCC)及抗體依賴性細胞細胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity；ADCC)活性。
因此，當談及選擇性溶離具有特定PTM之蛋白質時，或當談及獲得包含僅關於PTM之類型、數目及/或位置而彼此不同的兩種或更多種蛋白質變體之所需比率的溶離時，目前用於分離經受醣基化及/或其他形式之PTM的蛋白質變體之層析技術之問題係一個嚴重問題。
本發明之一目標為提供一種用於使用離子交換層析法及如獨立申請專利範圍中所指定之對應層析控制系統獲得包含兩種或更多種目標蛋白之目標溶離體積的方法。本發明之實施例給定於附屬申請專利範圍中。若本發明之實施例彼此不互斥，則其可彼此自由組合。
在一個態樣中，本發明係關於一種產生包含第一目標蛋白及第二目標蛋白之目標溶離體積之層析法。該方法包含： -  提供陽離子交換層析管柱； -  將蛋白質溶液施加於該管柱上；該蛋白質溶液至少包含該第一目標蛋白、該第二目標蛋白及視情況選用之一或多種其他蛋白質； -  將最佳化準則輸入至層析模擬軟體中；該最佳化準則為關於包含於該目標溶離體積中之該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之目標溶離體積的所需特性；舉例而言，該最佳化準則可為包含於溶離體積中之該兩種或更多種目標蛋白之定量特性及/或定性特性；舉例而言，該定量特性可為該等目標蛋白在溶離體積中之絕對量(例如濃度)或該兩種或更多種目標蛋白之相對量(例如比率)；另外或可替代地，該準則可為或包含一或多種定性特性，例如該等目標蛋白中之一者或兩者的純度；該最佳化準則亦可為作為該兩種目標蛋白之一或多種定性特性及一或多種定量特性的函數而計算之導數評分值。
該層析模擬軟體經組態以計算適於自該層析管柱溶離該第一目標蛋白及該第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合該最佳化準則之目標溶離體積之溶離緩衝鹽濃度。該計算包含計算複數個隨多個不同溶離緩衝鹽濃度而變之層析模擬。
該層析模擬軟體進一步經組態以計算該目標溶離體積至少隨所計算之鹽濃度及所輸入之最佳化準則而變之彙集邊界。
該方法進一步包含： -  將具有所計算鹽濃度之溶離緩衝液施加於該層析管柱上； -  用所施加之溶離緩衝液執行溶離；及 -  使用所計算之彙集邊界收集呈單獨溶離份形式的所計算之目標溶離體積。
此等特徵可能為有利的，因為本發明之實施例允許獲得包含預定義量、比率及/或純度之兩種或更多種所關注蛋白質的目標溶離體積，即使此等蛋白質可具有高度類似之pI值且可在一些溶離條件下具有重疊之溶離概況。
在不意欲受任何理論束縛之情況下，申請人假設達成此效果，因為溶離緩衝液之鹽濃度不為一成不變(one-fits-all)之溶離鹽濃度。相反地，鹽濃度為針對所需最佳化準則，特定言之兩種或更多種所關注目標蛋白之絕對或相對量及/或純度以計算方式特定預測的濃度。此可使得避免用於移除或減少溶離液中一定量之特定目標蛋白之額外方法步驟及/或避免濃縮所關注特定目標蛋白以便重新組合呈所需比率的兩種或更多種單獨溶離之目標蛋白之額外方法步驟。
申請人觀測到在一些醫藥應用情境中，需要提供由兩種或更多種以預定義比率及/或純度提供之目標蛋白的混合物組成之藥物。舉例而言，藥物可由特定蛋白質P之兩種PTM變體(稱為P1及P2)之混合物組成，其中若以特定量比率提供變體P1及P2，則藥物為最有效的。本發明之實施例可允許執行層析步驟，不論自細胞之蛋白質總體萃取及/或上濃縮(up-concentrating)所關注特定蛋白質如何，可執行該層析步驟以使得以單次層析運行容易地溶離呈所需比率、量及/或純度的兩種或更多種所關注蛋白質。
層析模擬軟體可藉由模擬施加於不同(假設/候選)溶離緩衝鹽濃度之管柱上之蛋白質之多次層析運行，以鑑別最佳用於最佳化準則之鹽濃度來達成此所要效果。接著，此以計算方式鑑別之鹽濃度用於產生或選擇待用於實際層析製程之溶離緩衝液，使得所產生或所選溶離緩衝液之鹽濃度與所計算之鹽濃度一致。
藉由本發明之實施例獲得之溶離緩衝液不為「標準」/「一成不變」之溶離緩衝液，而實際上為特定適於可基於具體情況而可靈活定義之最佳化準則之溶離緩衝液。
根據實施例，該最佳化準則係選自包含以下之群： a) 該目標溶離體積中該第一目標蛋白之量與該第二目標蛋白之量的所需比率或比率範圍；特定言之，該比率可為在5:95至1:1，特定言之1:95至1:1範圍內之任何比率； b)該目標溶離體積中該第一目標蛋白之所需量或量範圍與該第二目標蛋白之所需量或量範圍組合；例如，該量可為絕對量或濃度； c) 該第一目標蛋白之所需純度或純度範圍與以下組合： ■  該目標溶離體積中該第一蛋白質之量與該第二蛋白質之量的所需比率 ■  該目標溶離體積中該第二目標蛋白之所需量或量範圍； ■  該目標溶離體積中該第二目標蛋白之所需純度或純度範圍； d)上文所提及之準則中之兩者或更多者之組合。舉例而言，複雜之評分計算演算法可用於計算溶離緩衝液之評分值，該溶離緩衝液具有關於所需目標蛋白比率之匹配M1且具有關於兩種或更多種目標蛋白之所需純度的匹配M2，其中M1對總分之影響為約70%且M2對總分之影響為約30%。根據另一實例，最佳化準則為目標蛋白中之一或多者的所要求之最小絕對量、目標蛋白中之一或多者之所需比率範圍(例如，1:2.0至1:2.5)及最小純度評分的組合。
此可允許使用者鑑別且使用溶離緩衝液，其鹽濃度對於各別使用案例情境為最佳化的。舉例而言，在研究背景中，蛋白質純度態樣可能不如在臨床使用案例情境中重要。根據較佳實施例，模擬軟體經組態以產生使得使用者能夠鍵入及/或修改最佳化準則之GUI，例如用於各個別層析運行。此可允許使層析製程靈活地適應於不同使用案例情境、不同目標蛋白及目標蛋白組合以及許多其他因素。
根據實施例，所施加蛋白質溶液包含一或多種其他蛋白質。其他蛋白質可與目標蛋白具有重疊之溶離概況且可污染溶離液。藉由考慮目標蛋白之純度，特定言之模擬及/或彙集邊界之計算中目標蛋白之量及/或化學特性，有可能鑑別且使用允許溶離目標蛋白及污染其他蛋白質之溶離緩衝鹽濃度，使得達成可接受的目標蛋白之純度水準。
根據實施例，例如基於用於產生具有不同鹽濃度但其他方面(例如，關於pH值)相同之鹽緩衝液規格的預定義程式常式，自動地產生多個不同溶離緩衝鹽濃度。此等自動產生之緩衝鹽濃度亦可稱作「假設」或「候選」之溶離緩衝鹽濃度。舉例而言，所計算鹽濃度為出自複數個候選溶離鹽濃度中之一者，其以計算方式鑑別出最佳符合最佳化準則。舉例而言，計算溶離緩衝鹽濃度可包含預測隨複數個不同候選溶離鹽濃度而變的目標溶離體積中一或多種目標蛋白之量及/或純度，且將最佳適合於收集包含一或多種呈所需量及/或純度之目標蛋白的目標溶離體積之候選溶離緩衝鹽濃度中之一者鑑別為溶離緩衝鹽濃度。此所鑑別之鹽濃度用作「所計算」溶離緩衝鹽濃度且用於選擇或產生其鹽濃度與所計算及所鑑別之溶離緩衝鹽濃度一致的溶離緩衝液。此選擇或產生之溶離緩衝液用於實際上用所施加溶離緩衝液執行溶離。
輸入至層析模擬軟體中之所需最佳化準則可依據實施例而指定為絕對量(例如，目標蛋白中之每一者之濃度)或相對量(例如，兩種或更多種目標蛋白之濃度比或質量比)。
根據實施例，出於分析目的而使用該方法。根據較佳實施例，出於製備目的而使用該方法。
根據較佳實施例，適於溶離第一目標蛋白之所計算鹽濃度為出自複數個候選鹽濃度中之一者，其最佳適合於將第一目標蛋白及/或第二目標蛋白與含於所施加蛋白質溶液中之其他蛋白質中之任一者分離。
此等特徵可能為有利的，因為申請人觀測到有可能基於一組已知或容易獲得之輸入資料值而極充分地模擬層析製程，以便允許預測溶離緩衝液中之鹽濃度，該鹽濃度適合於溶離兩種或更多種所關注蛋白質(「目標蛋白」)，使得此等目標蛋白以所需量、比率及/或純度包含於目標溶離體積中。較佳地，所計算鹽濃度為最佳的或大致最佳適合於將第一目標蛋白與含於蛋白質溶液中之其他蛋白質分離。
藉由用其鹽濃度對應於經預測之適合或最佳鹽濃度之溶離緩衝液溶離所施加蛋白質溶液，有可能執行能夠分離具有高度類似之化學特性(包括高度類似之極性)的蛋白質及蛋白質變體之高解析度蛋白質層析。此外，所計算之溶離緩衝鹽濃度本身可用作輸入以用於執行其他預測，特定言之用於高度精確地預測將包含一或多種呈所需量之目標蛋白的溶離體積之彙集邊界。預測為適合或最佳鹽濃度之溶離緩衝鹽濃度可以計算為出自複數個候選溶離鹽濃度中之一者，其經預測以提供兩種或更多種呈所需絕對或相對量及/或呈所需純度之目標蛋白。因此，基於預測隨以計算方式鑑別之「最佳」溶離緩衝鹽濃度而變之彙集邊界，有可能特定地收集包含一或多種呈所需量、比率及/或純度之目標蛋白的總溶離體積之溶離份。
當一或多種目標蛋白需要與一或多種高度類似之其他蛋白質(例如，與其他醣型)進行分離時，或在應獲得具有所需比率(相對量)的兩種或更多種高度類似之目標蛋白之混合物時，此可能尤其適用。
根據本發明之實施例之方法的優勢可能在於：先前不可由陽離子層析法分離的高度類似之蛋白質變體現在可以在單一層析運行中進行分離：在第一步驟中，預測適合的溶離緩衝鹽濃度且接著使用具有經預測之鹽濃度之溶離緩衝液執行溶離。此可能在任何情形中高度有利，在該情形中蛋白質需要與其他化學上高度類似之蛋白質進行分離，或需要以特定相對量獲得兩種或更多種具有高度類似之化學特性的蛋白質。舉例而言，醣基化型態之重組醫藥蛋白質通常對彼等蛋白質之品質及功效具有強影響。通常，用於產生特定目標蛋白之細胞株(例如，具有特定醣基化型態之抗體或抗體片段)不僅產生此特定醣型，且亦產生一或多種其他醣型，包括不含任何醣基化之彼等糖型。藉由首先預測適合的溶離緩衝鹽濃度，用具有經預測之鹽濃度之溶離緩衝液執行溶離且接著預測並收集彙集邊界，本發明之實施例可允許特定地一或多種所關注醣型且獲得已經處於適合濃度之此等醣型。
預測目標溶離體積之彙集邊界以使得此目標溶離體積包含兩種或更多種呈所需量、比率及/或純度之目標蛋白可為有益的，因為可避免用於增加或降低目標蛋白之濃度的額外步驟。此加快獲得一或多種呈所需濃度之目標蛋白之製程且亦增加目標蛋白之品質，因為可避免之每一額外處理步驟降低污染或以其他方式損害含於目標溶離體積中之目標蛋白的風險。
本發明之實施例尤其適合於分離治療或診斷蛋白質或蛋白質片段，諸如抗體或抗體片段。本發明之實施例可用於藉由使用根據本發明之實施例的用於選擇性獲得一或多種呈所需量之目標蛋白之層析法來確保生物醫藥產品之品質、純度、安全性及功效。
根據實施例，施加於管柱上之蛋白質溶液為基於水之溶液，其包含一或多種鹽及一或多種蛋白質。
根據實施例，複數個層析模擬係作為多個不同溶離緩衝鹽濃度之函數且作為多個不同溶離緩衝液pH值之函數來進行計算。計算鹽濃度包含計算溶離緩衝鹽濃度及溶離緩衝液pH值之組合，其以組合方式適於自層析管柱溶離第一目標蛋白及第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合最佳化準則之目標溶離體積。層析模擬經執行以鑑別溶離緩衝鹽濃度及溶離緩衝液pH值之組合的組合。目標溶離體積之彙集邊界係至少作為溶離緩衝鹽濃度及溶離緩衝液pH值之所計算組合以及輸入之最佳化準則的函數來進行計算。施加於管柱上之溶離緩衝液具有所計算鹽濃度及所計算pH值。
申請人觀測到除鹽濃度以外，pH值亦對不同蛋白質之溶離概況具有顯著影響。與鹽濃度一樣，pH值可容易地設定為特定之所需值。一或多種用於執行模擬之模型通常考慮緩衝液之鹽濃度及pH值兩者，以便可執行基於不同鹽濃度及不同pH值之組合來計算多次層析運行及/或層析溶離步驟而不需要適配模型或實施複雜之額外程式例程。另外，可在模擬製程中考慮鹽濃度與pH值之間的複雜相互關係及其對溶離概況之組合影響。此外，基於鹽濃度及pH值兩者之變化的模擬可能覆蓋巨大資料空間，且因此增加了鑑別能夠符合最佳化準則之溶液緩衝液的可能性。舉例而言，若對10種不同鹽濃度執行模擬且基於10個不同pH值模擬各鹽濃度，則模擬包含10×10=100種不同模擬及對應理論/候選溶離緩衝液規格。
根據實施例，方法包含自動或人工選擇或製備溶離緩衝液以使得選擇或製備之溶離緩衝液具有已在模擬中鑑別最佳符合最佳化準則之鹽濃度及pH值。選擇或製備之溶離緩衝液用作施加於管柱上以溶離蛋白質之緩衝液。
單一目標蛋白案例情境 根據本文中所描述之另一使用案例情境，目標溶離體積包含僅單一(第一)目標蛋白及視情況選用之一或多種其他(污染)蛋白質。最佳化準則為所需目標蛋白之所需絕對量及/或目標蛋白之所需純度。特定言之，可以第一蛋白質在溶離緩衝液之所收集體積中之所需濃度或其導數值形式指定第一目標蛋白之所需量。
舉例而言，在提供所需濃度之情況下，可將目標溶離體積計算為包含呈所需濃度之目標蛋白之溶離體積，藉此選擇彙集邊界以使得目標溶離體積中所溶離目標蛋白之平均濃度與所需濃度一致。有可能在收集目標溶離體積期間，離開管柱之溶離緩衝液中之第一目標蛋白濃度高於或低於所需濃度。
在提供所需絕對量之情況下，可將目標溶離體積計算為包含呈所需量之第一目標蛋白之最小溶離體積。
使用本發明之實施例以用於計算單一目標蛋白之目標溶離體積的彙集邊界可能為有利的，因為其允許收集目標蛋白以使得所收集之目標溶離體積已經包含呈所需濃度及/或絕對量之(單一)目標蛋白，因此可避免用於濃縮或稀釋目標蛋白之額外步驟。另外，申請人觀測到根據本發明之實施例之層析法允許高度精確地預測目標溶離體積之彙集邊界，藉此以純粹可預測方式提供目標蛋白且最小化因開始收集離開管柱之溶離緩衝液過晚或停止收集過早而損失大部分之目標蛋白的風險。
多個目標蛋白案例，一般態樣 根據實施例，所施加蛋白質溶液包含第一目標蛋白、第二目標蛋白及零種、一或多種其他蛋白質。將最佳化準則以第一目標蛋白及第二目標蛋白之相對量形式，例如以第一目標蛋白及第二目標蛋白之比率形式輸入至層析模擬軟體中。層析模擬軟體計算目標溶離體積至少隨所計算鹽濃度及輸入之所需比率而變之彙集邊界。該方法用於產生包含所需比率之第一目標蛋白及第二目標蛋白之目標溶離體積。
特定言之在具有高度類似之化學特性(例如兩種醣型)之兩種蛋白質應與所有其他蛋白質分離且應以特定比率獲得的使用案例情境中，此可能為有利的。舉例而言，若以特定比率施加兩種或更多種不同醣型，則已觀測到生物醫學上活性之化合物(諸如抗體或抗體片段)之一些醣型尤其有效。在目前先進技術方法中，在此等目標蛋白具有高度類似之化學特性的情況下，獲得具有所定義之相對量的兩種或更多種目標蛋白之純蛋白質溶液通常非常費時且有時不可行。此係因為習知層析方法不能夠將此等蛋白質彼此分離。相反地，在溶離緩衝液中獲得兩種蛋白質，其比率隨溶離進展而改變且不可設定為所需值。本發明之實施例利用層析模擬軟體，其經組態以執行第一目標蛋白之溶離行為之計算及預測，執行第二目標蛋白(及至少在考慮一或多種目標蛋白之純度的情況下施加於管柱上之其他蛋白質中之任一者(若存在))之溶離行為的計算及預測，及自動計算並預測包含呈所需比率、量及/或純度之第一目標蛋白及第二目標蛋白的目標溶離體積之彙集邊界。舉例而言，對於第一目標蛋白及第二目標蛋白兩者之一系列將來時間點(例如，每秒或每分鐘)，可預測第一目標蛋白及第二目標蛋白以及視情況選用的包含於所施加蛋白質溶液中之其他蛋白質中之每一者(若存在)在離開管柱之溶離緩衝液中的濃度。可內插及/或外推所獲得之經預測濃度值，且可獲得對於各種候選彙集邊界之兩種或更多種目標蛋白之絕對及/或相對量及/或純度。接著，界定包含呈所需量及/或純度之第一目標蛋白及第二目標蛋白之目標溶離體積的彙集邊界可以輸出且用於根據彙集邊界開始及結束目標溶離體積之收集。
根據實施例，第一目標蛋白及第二目標蛋白為具有低解析度因數(特定言之，解析度因數小於0.75且在一些實例中小於0.6或甚至小於0.5)之蛋白質。
如本文中所使用之解析度因數為數值(諸如0.8、1.0或3.0)，其指示層析管柱之溶離液中兩種類型之分子的峰分離程度。一般而言，解析度為分離兩種信號之能力。關於層析，此為分離兩種不同分子類型之兩種峰之能力。藉由以下給定解析度R
Figure 02_image001
， 其中tr 1 及tr 2 以及w 1 及w 2 分別為兩個緊鄰峰之時間t及寬度w。若峰足夠接近(其為相關問題)，則兩個峰之寬度w幾乎相同。假設兩種類型之分子之高斯分佈(Gaussian distribution)，解析度因數1指示第一峰之2.5%區域與第二峰之區域重疊。類似地，解析度1.5指示滯留時間差為1.5×4×σ，其中σ為高斯分佈之標準差，其對應於0.15%之重疊。一般而言，解析度因數愈高，兩個分子可能分離得愈好。觀測到本發明之實施例能夠分離甚至具有極低解析度因數(例如，解析度因數小於0.5)之蛋白質。
觀測到本發明之實施例能夠分離蛋白質，即使在其具有極低解析度因數之情況下。藉由亦考慮負載至管柱上之個別蛋白質之化學性質及量，藉由以計算方式預測特定針對待施加之蛋白質類型及量的最佳之溶離緩衝鹽濃度，且藉由用具有經預測之最佳鹽濃度的溶離緩衝液執行溶離，觀測到本發明之實施例能夠分離彼此甚至高度類似之蛋白質及/或精確地預測包含一或多種恰好呈所需量及/或純度之目標蛋白的目標溶離體積。
根據實施例，第一目標蛋白及第二目標蛋白為具有相同胺基酸序列但不同類型、數目或位置之PTM的蛋白質之變體。特定言之，第一目標蛋白及第二目標蛋白為醣型。
根據實施例，第一目標蛋白及第二目標蛋白為具有相同胺基酸序列且FAB片段上包含不同數目個醣基的抗體單體。
根據一些實施例，溶離製程為逐步溶離製程，其中依序施加多個不同溶離緩衝液(「步驟」)。在此情況下，對於步驟中之每一者，執行計算鑑別(最適合)溶離鹽濃度、計算目標溶離體積隨所計算之溶離鹽濃度而變之彙集邊界及施加具有所計算鹽濃度之溶離緩衝液。
舉例而言，複數個層析模擬中之每一者可為使用兩個或更多個溶離步驟之層析製程的模擬，從而在各溶離步驟中，使用具有不同溶離鹽濃度之溶離緩衝液。所計算之溶離緩衝鹽濃度為一系列不同的溶離步驟特定之溶離緩衝鹽濃度。將具有所計算鹽濃度之溶離緩衝液施加於層析管柱上包含根據所計算的系列溶離步驟特定鹽濃度逐步施加一系列具有不同鹽濃度之溶離緩衝液。
根據實施例，所施加蛋白質溶液包含兩種或更多種目標蛋白中之每一者及一或多種其他蛋白質中之每一者(若存在)，其各別濃度為至少0.5重量%，特定言之至少1重量%，特定言之至少2重量%。
申請人觀測到蛋白質濃度(特定言之，在上文指定之範圍內之情況下)對蛋白質之溶離行為具有影響。藉由考慮施加於管柱上之蛋白質溶液中所含有的蛋白質中之每一者之濃度(其超出上文所提及之臨限值(亦稱作「最小量臨限值」))，可以增加適合之溶離緩衝鹽濃度之預測準確度。施加於管柱上之蛋白質可彼此相互作用且以多種方式與固定相相互作用。一些蛋白質可阻斷其他結合至管柱樹脂，可在結合至固定相方面與其他蛋白質競爭，或促進其結合。藉由考慮含於蛋白質溶液中之所有蛋白質(亦即，所有目標蛋白及其濃度超過上文所提及之最小量臨限值之所有其他蛋白質(若存在))的化學特性以及濃度，可顯著增加層析模擬軟體之計算及預測之準確度。
較佳地，施加於管柱上之蛋白質溶液為預純化蛋白質溶液，其僅包含一或多種目標蛋白且通常亦包含一或多種非目標蛋白。舉例而言，首先可自細胞培養物(例如，經修飾以便產生一或多種所關注目標蛋白之細胞培養物)萃取蛋白質總體。在下一步驟中，預純化此細胞培養蛋白質提取物以便獲得僅小數目之蛋白質，較佳僅一或多種目標蛋白及儘可能少之其他蛋白質。然而，通常在預純化步驟中不大可能獲得一或多種純形式之目標蛋白。舉例而言，細胞培養蛋白質提取物可包含數千種不同類型之蛋白質。在預純化步驟中，將蛋白質提取物施加於親和層析管柱上以獲得一組有限之蛋白質，例如所有具有特定蛋白質序列或具有特定抗原決定基的蛋白質。因此，施加於陽離子層析管柱上之蛋白質溶液可為藉由對細胞培養提取物或其他來源執行預純化製程(諸如親和性層析法)而獲得之蛋白質溶液。
舉例而言，藉由預純化方法用親和層析管柱獲得之蛋白質溶液中之蛋白質可由特定蛋白質之所有醣型組成，該等醣型例如不含任何醣基之醣型、包含一個醣基之第一醣型、包含不同類型之醣基之第二醣型、包含與第一醣型相同但在不同位置上之醣基的第三醣型等。視情況，蛋白質溶液可另外包含非所要/並非所關注的但在預純化步驟期間其移除因任何原因而失效之其他蛋白質。
通常，施加於陽離子層析管柱上之蛋白質溶液中所含有之蛋白質類型的數目受到限制且比細胞培養提取物中蛋白質數目小得多。舉例而言，施加於陽離子層析管柱上之蛋白質溶液中所含有之蛋白質類型的數目通常低於10，往往低於5。
根據實施例，施加於管柱上之蛋白質溶液包含第一P1及第二P2目標蛋白以及另一蛋白質P3 (被視為污染蛋白質)。第二目標蛋白P2及另一蛋白質P3對管柱之固定相的親和力類似於第一目標蛋白對固定相之親和力，從而導致P1、P2及P3之重疊溶離行為。
舉例而言，蛋白質P1、P2及P3為相同蛋白質之醣型或其他PTM變體且因此對固定相具有類似親和力。將P1及P2與P3分離且以所需比率提供P1及P2對於目前先進技術之陽離子層析方法通常為不可行的。本發明之實施例可允許首先預測適合的溶離鹽濃度且接著基於此最佳鹽濃度及其他參數值，以尤其準確的方式預測彙集邊界，該方式允許將目標蛋白與其他蛋白質更精確地分離或(當峰強烈重疊，此在物理上不可能的情況下)至少允許收集包含呈所需比率之兩種具有可接受之純度(關於具有P3之污染物)的目標蛋白P1及P2之目標溶離體積。
根據實施例，施加至管柱之蛋白質溶液中之蛋白質總量等同於或小於管柱之最大蛋白質負載容量，且特定言之在最大蛋白質負載容量之50%至100% (例如50%至90%)範圍內。
申請人觀測到在此量範圍內，層析程序對含於所施加蛋白質溶液中之蛋白質之濃度及化學特性尤其敏感。藉由考慮含於所施加蛋白質溶液中之蛋白質中之每一者的量，觀測到關於最適合溶離鹽濃度之預測準確度顯著增加。
根據實施例，以收集開始時間偏移及收集停止時間偏移之形式指定目標溶離體積之所計算彙集邊界。該方法包含： -  藉由包含層析管柱之自動層析系統連續監測自開始溶離而流逝之時間； -  當流逝時間等於收集開始時間偏移時，自動開始藉由層析系統進行所溶離之溶離緩衝液的收集；及 -  當流逝時間等於收集停止時間偏移時，停止藉由層析系統進行所溶離之溶離緩衝液的收集。
根據實施例，該方法包含將包含於所施加蛋白質溶液中之第一目標蛋白及第二目標蛋白中之每一者的量以及視情況選用之一或多種包含於所施加蛋白質溶液中之其他蛋白質中之每一者的量(若存在)輸入至層析模擬軟體中。
該等模擬係作為一組至少包含以下之參數值之函數來進行計算： -  所提供之陽離子交換層析管柱之尺寸；例如，可提供長度、直徑及高度或總容積；亦有可能選擇一組層析模擬軟體已知其尺寸之預定義管柱類型中之一者；及 -  第一目標蛋白及第二目標蛋白之量以及視情況選用的一或多種施加於該管柱上之其他蛋白質之量。舉例而言，可在藉由適合蛋白質分析來計算模擬之前量測第一目標蛋白及第二目標蛋白及包含於蛋白質溶液中之任何其他蛋白質的量(例如，在280 nm下藉由UV量測之總蛋白質量)；可藉由陽離子交換高效液相層析法(CEX-HPLC)來測定施加於管柱上之不同蛋白質之略微不同的分子量(其由不同醣基化型態引起)。可使用此分子量資訊，例如以便計算蛋白質分子之數目/施加於管柱上之特定蛋白質的莫耳濃度及/或驗證目標溶離體積中之目標蛋白比率是否符合例如所要求之量、比率或純度。
申請人觀測到施加於管柱上之蛋白質之量可能因情況而顯著變化。考慮施加於管柱上之個別蛋白質之量以及管柱尺寸可允許計算及預測溶離緩衝鹽濃度，其最佳適合於獲得尤其精確包含呈所需量及/或純度之目標蛋白的目標溶離體積。隨後，此特定以計算方式確定之鹽濃度用作實際上用於執行層析程序之溶離緩衝液之鹽濃度。另外，以計算方式確定之溶離緩衝鹽濃度用於預測包含呈所需量及/或純度之目標蛋白之目標溶離體積的彙集邊界。可將以計算方式預測之彙集邊界輸出至人工或自動化溶離緩衝液收集單元，藉此有助於獲得一或多種呈所需量及/或純度之目標蛋白。
因此，由本發明之實施例獲得之溶離緩衝液不為「標準」/「一成不變」之溶離緩衝液，而實際上為特定適於蛋白質溶液中所含有之蛋白質的類型及量且適於管柱尺寸之溶離緩衝液。申請人觀測到使溶離鹽濃度適於所使用之管柱及在各個別情況下施加於管柱上之蛋白質的量可極大地增加層析管柱分離不同蛋白質之能力。
根據實施例，執行隨多個不同鹽濃度(其亦可稱作「候選鹽濃度」)及多個不同溶離緩衝液pH值(其亦可稱作「候選pH值」)兩者而變之模擬。作為模擬之結果，鑑別最佳符合最佳化準則之特定鹽濃度及pH值之組合。此鹽濃度及pH值之配對用作實際上用於溶離蛋白質之溶離緩衝液之鹽濃度及pH值。
根據實施例，該組參數進一步包含： -  溶離緩衝液之預定義pH值；例如，pH值可為先前已經成功用於溶離目標蛋白或類似蛋白質之溶離緩衝液的pH值； -  溶離緩衝液穿過管柱之流動速率； -  所施加蛋白質溶液中之蛋白質之化學特性。
溶離緩衝液穿過管柱之流動速率可為藉由經組態成以預設速率泵送溶離緩衝液穿過管柱之溶離緩衝泵設定之流動速率。可指定流動速率，例如以毫升/分鐘為單位。亦可指定流動速率，例如以毫米/秒為單位，因為管柱直徑為已知的且允許由毫米/秒值推導出以ml/min為單位之流動速率。
在一些實施例中，可藉由組態泵由使用者設定由泵產生之流動速率。在一些實施例中，使用者在層析模擬軟體中手動鍵入溶離緩衝液流動速率(其可顯示於泵之顯示器上)以供各層析運行。在其他實施例中，溶離緩衝液流動速率經儲存於層析模擬軟體之組態檔案中，且再用於多次層析運行直至使用者修改層析模擬軟體之組態檔案及泵之設置中之溶離緩衝液流動速率。
不僅考慮量且亦考慮目標蛋白以及視情況選用的一或多種施加至管柱之其他蛋白質的化學特性可進一步增加模擬及預測之準確度。
根據實施例，可將實際上輸出至使用者之彙集邊界轉換成不同格式以容易理解。舉例而言，收集開始時間偏移及收集停止時間偏移可指定為始於「280 nm峰」 (指示溶離液中總蛋白質濃度之峰)開始之時間偏移，其亦可經預測且可憑經驗與光學上量測之280 nm峰信號相比較。同樣地，可以「管柱體積」形式指定收集開始時間偏移及收集停止時間偏移。
用於模擬陽離子層析運行且用於預測特定蛋白質之溶離概況的許多不同之計算方法存在且可用於執行模擬及用於預測根據本發明之實施例之目標溶離邊界。
舉例而言，Wittkopp F, Peeck L, Hafner M, Frech C.在J Chromatogr A. 2018;1545:32-47. 數位物件識別碼:10.1016中之「Modeling and simulation of protein elution in linear pH and salt gradients on weak, strong and mixed cation exchange resins applying an extended Donnan ion exchange model」描述應用Donnan平衡離子交換(DIX)模型，以供線性層析中單株抗體之離子交換層析法的建模及模擬。公開案涉及在低蛋白質濃度下之層析管柱內之條件描述，但與蛋白質分離之最佳化不相關。
根據另一實例，Müller-Späth T, Ströhlein G, Aumann L等人之「Model simulation and experimental verification of a cation-exchange IgG capture step in batch and continuous chromatography」, J Chromatogr A. 2011;1218(31):5195-5204, 數位物件識別碼:10.1016描述基於集總動力學模型(lumped kinetic model)，使用模型參數(諸如孔隙率、滯留因子及純化mAb之質量轉移參數)，使用單管柱分批(single column batch)及多管柱連續層析(multicolumn continuous chromatography，MCSGP)來模擬單株抗體(mAb)純化製程之陽離子交換捕獲步驟。
根據實施例，層析模擬軟體經組態以使用用於計算模擬及/或用於計算目標溶離體積之彙集邊界的數學模型之組合。該等模型包含： -  管柱模型，其經組態以使蛋白質中之每一者之濃度、管柱之間隙體積中溶離緩衝液的鹽濃度及pH值相互關聯；及 -  孔隙模型，其經組態以使蛋白質中之每一者之濃度、管柱之固定相之孔隙體積中溶離緩衝液的鹽濃度及pH值相互關聯；及 -  反應模型，其經組態以使固定相中蛋白質中之每一者之濃度、溶離緩衝鹽濃度及蛋白質溶液中(目標及視情況選用之其他)蛋白質中之每一者的化學特性中之至少一些相互關聯。
複數個不同管柱模型、孔隙模型及反應模型描述於文獻中。不斷改進許多此等模型。描述可用於本發明之上下文中之模型之實例的參考文獻之清單揭示於例如圖4C之描述中。
舉例而言，可根據Schmidt Traub等人, 「Preparative Chromatography」 2012, Viley-VCH來實施管柱模型。可根據Schmidt Traub等人, 「Preparative Chromatography」 2012, Viley-VCH來實施孔隙模型。可根據Kluters等人, 「Application of linear pH gradients for the modeling of ion exchange chromatography: separation of monoclonal antibody monomer」, J Sep Sci, 2016年2月, 93(4), 663-675來實施反應模型。反應模型及/或模型本身之參數可在各種複雜程度上進行修改以有助於實驗資料之描述。舉例而言，此在Huuk等人之「Modeling of complex antibody elution behavior under high protein load densities in ion exchange chromatography using an asymmetric activity coefficient」 Biotechnol. J., 12: 1600336. 數位物件識別碼:10.1002/biot.201600336中得到證實。此公開案描述可如何使用通用離子交換等溫線來在高蛋白質負載條件下建模單一蛋白質物種之分離。
孔隙模型、管柱模型及反應模型經由鹽濃度及蛋白質濃度互連。管柱模型及孔隙模型由鹽濃度
Figure 02_image003
互連，因此孔隙模型之方程式可插入至管柱模型中。
反應模型之第一方程式可經由
Figure 02_image005
項而插入至管柱模型中。描述結合強度且因此描述蛋白質之化學特性的參數為平衡常數Keq 及結合位點v之數目。兩者均經由v而依賴於pH (反應模型之第二方程式)。
因此，溶離所需量、比率及/或純度之目標蛋白所需的溶離緩衝液之鹽濃度可基於一組參數(如pH值、所施加蛋白質之量及化學特性、管柱尺寸及由泵界定之溶離緩衝液流動速率)來進行計算。
目標蛋白或視情況選用之其他蛋白質的蛋白質量為此蛋白質在離開層析管柱之移動相中之濃度隨時間推移的積分。計算軟體改變鹽濃度cSALT 且執行目標蛋白以及視情況選用之一或多種其他蛋白質之作為該鹽濃度函數之 溶離概況的預測，以用於鑑別提供最佳匹配最佳化準則之蛋白質溶離概況的鹽濃度。
管柱模型 根據實施例，管柱模型中所指定之相互關係包含根據以下之管柱模型公式：
Figure 02_image007
Figure 02_image009
。
藉此，i為特定蛋白質之指標，t為時間，x為管柱中沿豎直管柱軸線之位置，cSALT 為管柱之移動相(亦即，包含可忽略量之所施加蛋白質溶液的溶離緩衝相)中游離(非結合)鹽離子(對於陽離子交換層析法，通常為Na+)之濃度，cPROT_i 為管柱之移動相中蛋白質i之濃度，qPROT_i 為固定相中所結合之蛋白質i之濃度，uint 為定義為藉由流動穿過固定相粒子之間的管柱而獲得之速度的間隙流速，εcol 為間隙孔隙率(管柱之橫截面中之開放孔面積)(其定義為間隙體積與管柱體積之比率，其中間隙體積為粒子外部之管柱中之溶離緩衝液體積)，εp 為粒子孔隙率(定義為粒子自身之內部孔隙率(孔隙體積))，Dax 為軸向分散係數。軸向分散係數為惰性示蹤材料沿管柱之縱向方向之擴散程度的量測。Dax 描述如菲克定律(Fick's law)中所描述之在軸向方向上之分散。
孔隙率εcol 、ε_p 及分散係數Dax 為可影響溶離蛋白質峰之分離的參數。孔隙率通常為固定的且由包含於管柱中之層析樹脂測定。較佳地，其作為預設值儲存於例如組態檔案中，但在使用不同固定相材料之情況下可進行修改。
因此，根據本發明之實施例，經由間隙流速(在孔隙模型中將流量標準化為管柱直徑)以及由豎直管柱位置x反映的管柱中之位置來考慮陽離子交換層析管柱之尺寸。管柱之長度及直徑的組合界定管柱之總容積。
自溶離緩衝液穿過管柱之流動速率以計算方式推導出間隙流速。
舉例而言，使用者可將以[mm/s]為單位之溶離緩衝液流動速率「ebfr」鍵入至層析模擬軟體中。層析模擬軟體根據下式計算間隙流速u(int) [mm/s]： u(int) = ebfr/εcol 其中εcol 為間隙管柱孔隙率(不含單位)。
如何自溶離緩衝液流動速率(其可由經組態以泵送溶離緩衝液穿過管柱之泵定義)獲得間隙流速之具體實例描述於Schmidt-Traub, Henner編之「Preparative chromatography: of fine chemicals and pharmaceutical agents」, John Wiley & Sons, 2006中。
孔隙模型 根據實施例，孔隙模型中所指定之相互關係包含根據以下之孔隙模型公式：
Figure 02_image011
。
藉此，i為特定蛋白質之指標，t為時間，x為管柱中沿豎直管柱軸線之位置，cSALT 為管柱之移動相中游離(非結合)鹽離子之濃度，cPROT_i 為管柱之移動相中蛋白質i之濃度，qPROT_i 為固定相中所結合之蛋白質i之濃度，εcol 為間隙管柱孔隙率，ε_p 為粒子孔隙率，keff 為有效質量轉移係數(描述蛋白質自間隙移動相移動至孔隙體積中)，z為在2.7至3.3範圍內，特定言之3.0之數值，rp 為層析珠粒之半徑。參數z視管柱材料之幾何形狀態樣而定。如何獲得參數z之具體實例描述於Schmidt-Traub, Henner, 編 Preparative chromatography: of fine chemicals and pharmaceutical agents. John Wiley & Sons, 2006, page 338-339中。
根據一個實例，間隙流速可能如下與溶離緩衝液穿過管柱之流動速率有關： 穿過管柱之流動速率(亦稱作體積流量up (mL/min))描述泵送穿過管柱之移動相之體積。對於將流動速率標準化為層析管柱尺寸，可使用管柱體積及長度根據管柱直徑對流動速率進行標準化。流速u之單位根據下式變化為(mm/s)：
Figure 02_image013
。
間隙流速藉由僅考慮間隙管柱體積
Figure 02_image015
(亦即，僅多孔層析珠粒之間的體積)而另外標準化關於層析珠粒之孔隙率的流速。所使用之層析管柱之間隙體積及總管柱體積的比率為
Figure 02_image017
：
Figure 02_image019
參數
Figure 02_image021
藉此為間隙體積及總管柱體積之分數。
管柱之固定相可描述為珠粒之基質。管柱中之所有珠粒之總體積稱作「珠粒體積」
Figure 02_image023
，其中各珠粒之體積包含由珠粒之固定相材料消耗之體積及包含於珠粒中之孔隙之體積兩者。層析管柱的間隙體積
Figure 02_image025
定義為管柱之總容積
Figure 02_image027
減去包含於管柱中之所有珠粒之總珠粒體積
Figure 02_image029
。根據實施例，組合管柱模型及孔隙模型。舉例而言，根據實施例，計算至少隨所計算鹽濃度而變之目標溶離體積包含使用管柱模型公式及孔隙模型公式，以供計算可隨鹽濃度
Figure 02_image031
及固定相中蛋白質i之濃度
Figure 02_image033
而變的間隙體積中蛋白質i之濃度。
根據實施例，計算目標溶離體積至少隨所計算鹽濃度而變之彙集邊界包含使用管柱模型公式及孔隙模型公式，以供計算在多個不同溶離時間t處在位置x=管柱長度處之第一目標蛋白之濃度。
反應模型 根據實施例，反應模型中所指定之相互關係包含： -  根據以下之第一反應模型公式：
Figure 02_image035
-  根據以下之第二反應模型公式：
Figure 02_image037
-  根據以下之第三反應模型公式：
Figure 02_image039
。
藉此，i為特定蛋白質之指標，t為時間，x為管柱中沿豎直管柱軸線之位置，cSALT 為管柱之移動相中游離(非結合)鹽離子之濃度，cPROT_i 為管柱之移動相中蛋白質i之濃度，qPROT_i 為固定相中所結合之蛋白質i之濃度，Kkin 為動力學速率(定義為解吸附速率之倒數值且描述自固定相之配位體置換離子的蛋白質之反應速度)，Keq為平衡常數(亦即，固定相中特定蛋白質i之莫耳濃度除以移動相中蛋白質i之莫耳濃度)，Λ為配位體密度(定義為以莫耳/管柱體積為單位之配位體之數目)，ν_i 為結合位點之數目(亦即，參與與蛋白質固定相結合的蛋白質i之結合位點之數目)，σ_i為屏蔽因子(亦即，在蛋白質i結合至固定相時所屏蔽的蛋白質i之每結合蛋白質分子之配位體數目)，N_(carb,i)為與固定相相互作用之蛋白質i之羧基位點數目，N_(his,i)為與固定相相互作用之蛋白質i之組胺酸位點數目，N_(N-term,i)為與固定相相互作用之蛋白質i之N端位點數目，N_(ami,i)為與固定相相互作用之蛋白質i之胺基位點數目，pH為溶離緩衝液之pH值，
Figure 02_image041
為蛋白質i之吸附態與非結合態之間的標準自由吉布斯焓差(difference in standard free Gibbs enthalpy)，
Figure 02_image043
為鹽之吸附態與非結合態之間的標準自由吉布斯焓差，
Figure 02_image045
為與固定相相互作用之蛋白質i之所有羧基的平均酸解離常數(Ka)，
Figure 02_image047
為與固定相相互作用之蛋白質i之所有組胺酸胺基酸的平均Ka，
Figure 02_image049
為與固定相相互作用之蛋白質i之所有N端α-胺基的平均Ka，
Figure 02_image051
為蛋白質i之所有胺基之平均Ka，R為氣體常數，且T為管柱及溶離緩衝液之溫度。藉由使用第一目標蛋白及第二反應模型公式將第三反應模型公式解算為qPROT (i)來計算隨溶離緩衝液之pH值而變的固定相中特定蛋白質「i」之濃度(「qPROT (i)」)。
鹽濃度cSALT 經由第一反應模型公式影響固定相中所結合之蛋白質qPROT_i 之量：在低鹽濃度下蛋白質結合至層析管柱，在較高鹽濃度下蛋白質藉由鹽離子置換且將其溶離。視蛋白質之結合強度(其在反應模型中由結合位點之數目ν及平衡常數Keq 構成)而定，蛋白質在不同鹽濃度下溶離。藉由選擇適當鹽濃度，可溶離目標蛋白，而非所要蛋白質保持結合於層析管柱上。此等參數值中之一些為蛋白質特定的且可自文獻推導出。此等參數中之一些為蛋白質及模型特定的。其亦可自文獻推導出或可藉由執行一些通常由公開所使用之各別模型的作者描述之初步實驗校準步驟來獲得。舉例而言，參數(如指示與固定相相互作用之蛋白質i之羧基位點數目的N_(carb,i))為蛋白質特定的且亦視用於執行模擬之模型而定。實際上與固定相相互作用之羧基位點之數目受到描述於所使用之反應模型中之空間效應限制。使用蛋白質特定的及模型特定的實驗測試來確定與固定相相互作用之各別位點之數目。對於一些蛋白質，已經可以自文獻推導出參數值。針對蛋白質溶液中蛋白質中之每一者，吉布斯能量ΔG0 P /RT及ΔG0 s /RT亦可憑經驗進行確定或可自文獻推導出。
pH值影響蛋白質之結合位點v之數目(第二方程式)。結合位點v之數目影響平衡常數Keq (第三方程式)。藉此，pH值與反應模型之方程式1之鹽濃度有關。
因此，反應模型考慮pH值及蛋白質之化學特性之貢獻，例如關於蛋白質中之某些基團之pKa且關於蛋白質之結合位點v。反應模型亦考慮鹽濃度，藉此使溶離緩衝鹽濃度與待溶離之蛋白質之化學特性相互關連。鹽濃度cSALT 為第一方程式之一部分，其中其經由結合位點v之數目直接連接至蛋白質結合特徵。
然而，上文所描述之反應模型僅為出自可如何實施反應模型之許多可能方式中之一者。陽離子層析運行之建模及模擬為進行中之研究領域，因此可同樣地使用用於執行模擬的本文中所描述之公式及模型之各種修改。亦有可能使用目前描述於文獻中之替代管柱、孔隙及反應模型，且有可能在將來新的管柱中，將研發並且公開可有可能用於執行層析模擬之孔隙及反應模型，該等層析模擬至少隨若干不同溶離緩衝鹽濃度而變且較佳隨其他參數(諸如待施加於管柱上之蛋白質之量及化學特性)而變。
根據一個實施例，提供例如參考圖7所描述之蛋白質P1至P3之以下模型特定的化學特性值且在計算適合的溶離緩衝鹽濃度及彙集邊界期間將其用作反應模型之輸入：
   變體 P1 變體 P2 變體 P3
膜分散keff [mm/s] 0.0026 0.0452 0.0159
動力學[s(M)ν ] 0.0069 0.0023 0.0051
ΔGp 0 /RT 2.05 2.28 -0.05
ΔGs 0 /RT 0.08 0.08 0.08
N_(carb,i) 6.09 5.10 6.95
N_(his,i) 0.83 2.71 1.52
N_(ami,i) 9.94 11.71 12.80
N_(N-term,i) 1.43 2.43 2.49
屏蔽σ_i 120.58 98.07 92.45
另外，可例如經由GUI、組態檔案或其他資料源而將以下輸入參數值提供至反應模型：
變數 值 單位
軸向分散係數Dax 0.2 mm2/s
珠粒孔隙率εP 0.69 -
間隙管柱孔隙率εcol 0.43 -
配位體密度 0.673 mol/L固體吸附劑
屏蔽因子自變體1至變體3不斷變小，此與降低醣基化之級別且因此與變體1至變體3之蛋白質大小一致。
上文所提及之參數值可由使用者經由GUI提供及/或可在層析模擬軟體之組態檔案中進行指定。
存在各種用於獲得及/或估計模型參數之方法。舉例而言，Simon Kluters等人在2015年11月09日第一次公開之研究論文「Application of linear pH gradients for the modeling of ion exchange chromatography: Separation of monoclonal antibody monomer from aggregates」 (https://doi.org/10.1002/jssc.201500994)描述層析管柱中之離子交換之機理模型及可如何獲得此模型之參數。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含模擬軟體之層析控制系統。舉例而言，該層析控制系統可用於導引層析系統之手動控制，或用於提供該控制系統之完全自動或半自動控制。該模擬軟體經組態以用於執行一種獲得包含所需第一量之第一目標蛋白的目標溶離體積之彙集邊界之方法。該層析控制系統經組態以用於： -  接收最佳化準則且將該最佳化準則輸入至該層析模擬軟體中，該最佳化準則為關於包含於該目標溶離體積中之該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之目標溶離體積的所需特性； -  使用該層析模擬軟體計算適於自該層析管柱溶離該第一目標蛋白及該第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合該最佳化準則之目標溶離體積之溶離緩衝鹽濃度，該計算包含計算複數個隨多個不同溶離緩衝鹽濃度而變之層析模擬； -  計算該目標溶離體積至少隨該所計算鹽濃度及該輸入之最佳化準則而變之彙集邊界； -  輸出所計算鹽濃度及彙集邊界及/或 -  控制溶離體積收集單元，使得所計算之目標溶離體積係根據所計算之彙集邊界自動收集呈單獨溶離份形式。
根據實施例，該系統進一步經組態以用於： -  接收陽離子交換層析管柱之尺寸；及 -  接收該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之量以及視情況選用的該一或多種施加於該管柱上之其他蛋白質之量。
模擬及/或彙集邊界係作為一組至少包含以下之參數值之函數來進行計算： ●  所提供之陽離子交換層析管柱之尺寸；及 ●  第一目標蛋白及第二目標蛋白之量以及視情況選用的一或多種施加於管柱上之其他蛋白質之量。
根據實施例，該組參數進一步包含： ●  溶離緩衝液之預定義pH值， ●  溶離緩衝液穿過管柱之流動速率； ●  所施加蛋白質溶液中之蛋白質之化學特性。
根據本發明之實施例，將第一蛋白質之所需第一量指定為所需第一蛋白質之所需絕對量。特定言之，可以第一蛋白質在溶離緩衝液之所收集體積中之所需濃度或其導數值形式指定第一目標蛋白之所需量。
根據其他實施例，所施加蛋白質溶液包含第一目標蛋白、第二目標蛋白及零種、一或多種其他蛋白質。將第一蛋白質之所需第一量以相對量之形式輸入至層析模擬軟體中。相對量為第一目標蛋白及第二目標蛋白之比率。層析模擬軟體計算目標溶離體積至少隨所計算鹽濃度及輸入之所需比率而變之彙集邊界。方法用於產生包含所需比率之第一目標蛋白及第二目標蛋白之目標溶離體積。
根據實施例，複數個層析模擬係作為多個不同溶離緩衝鹽濃度之函數且作為多個不同溶離緩衝液pH值之函數來進行計算。計算鹽濃度包含計算溶離緩衝鹽濃度及溶離緩衝液pH值之組合，其以組合方式適於自層析管柱溶離第一目標蛋白及第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合最佳化準則之目標溶離體積。層析模擬經執行以鑑別溶離緩衝鹽濃度及溶離緩衝液pH值之組合的組合。目標溶離體積之彙集邊界的計算係至少作為溶離緩衝鹽濃度及溶離緩衝液pH值之所計算組合以及輸入之最佳化準則的函數來進行計算。除所計算溶離緩衝液以外，輸出所計算pH值。
根據實施例，層析控制系統經組態以控制緩衝液混合單元，以便自動產生具有所輸出溶離鹽濃度之溶離緩衝液。
另外或可替代地，層析控制系統經組態以控制適於自複數個可獲得的具有不同鹽濃度之溶離緩衝液自動選出一者之溶離緩衝液選擇單元，所選溶離緩衝液具有所輸出之鹽濃度。
另外或可替代地，層析控制系統經組態以控制緩衝液混合單元，以便自動產生具有以組合方式計算及輸出之鹽濃度及pH值兩者的溶離緩衝液。
另外或可替代地，層析控制系統經組態以控制層析系統之溶離體積收集單元，使得所計算之目標溶離體積係根據所計算之彙集邊界自動收集呈單獨溶離份形式。
另外或可替代地，該層析控制系統經組態以控制適用於自複數個可獲得的具有不同鹽濃度及不同pH值之溶離緩衝液自動選出一者之溶離緩衝液選擇單元，所選溶離緩衝液具有以組合方式計算及輸出之鹽濃度及pH值兩者。
另外或可替代地，層析控制系統經組態以控制經組態以將自動產生或選擇之溶離緩衝液自動施加於層析管柱上之緩衝液施加單元，所施加溶離緩衝液具有輸出之鹽濃度或具有以組合方式計算及輸出之鹽濃度及pH值兩者。
在另一態樣中，本發明係關於一種層析系統，其包含層析控制系統且進一步包含上文所提及之緩衝液混合單元及/或溶離緩衝液選擇單元及/或緩衝液施加單元及/或自動溶離體積收集單元。
在另一態樣中，本發明係關於一種層析系統，其包含層析控制系統且進一步包含適於自動產生具有輸出之溶離鹽濃度之溶離緩衝液的緩衝液混合單元。
另外或可替代地，層析系統進一步包含適於自複數個可獲得的具有不同鹽濃度之溶離緩衝液自動選出一者之溶離緩衝液選擇單元，所選溶離緩衝液具有輸出之鹽濃度。
另外或可替代地，層析系統進一步包含經組態以將自動產生或選擇之溶離緩衝液自動施加於層析管柱上之緩衝液應用單元。
另外或可替代地，層析系統進一步包含經組態以根據輸出之彙集邊界自動開始及停止收集離開管柱之所溶離緩衝液之溶離份之自動溶離體積收集單元。
在另一態樣中，本發明係關於一種電腦程式，其用於管理層析製程以使得獲得包含第一目標蛋白及第二目標蛋白之目標溶離體積。該電腦程式包含層析模擬軟體且經組態以用於： -  接收最佳化準則，其為關於包含於該目標溶離體積中之第一目標蛋白及第二目標蛋白之目標溶離體積的所需特性； -  使用層析模擬軟體計算適於自層析管柱溶離第一目標蛋白及第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合最佳化準則之目標溶離體積之溶離緩衝鹽濃度，該計算包含計算複數個隨多個不同溶離緩衝鹽濃度而變之層析模擬； -  計算目標溶離體積至少隨所計算鹽濃度及所輸入之最佳化準則而變之彙集邊界；及 -  輸出所計算鹽濃度及/或彙集邊界以供使用者能夠控制層析系統，使得獲得根據最佳化準則的包含第一目標蛋白及第二目標蛋白之目標溶離體積，及/或使用所計算鹽濃度及/或彙集邊界以供自動或半自動控制層析系統，使得獲得根據最佳化準則的包含第一目標蛋白及第二目標蛋白之目標溶離體積。
根據實施例，該電腦程式進一步經組態以供產生用於自動或半自動控制層析系統之一或多個單元之控制命令。
根據實施例，該電腦程式進一步經組態以供產生用於自動或半自動控制層析系統之一或多個單元之控制命令。
如本文中所使用之「目標蛋白 」為具有特定PTM之蛋白質或蛋白質變體，其應藉助於陽離子層析法以所需絕對或相對量形式獲得。
如本文中所使用之蛋白質的「溶離概況 」為歷經一段時間溶離液中蛋白質之濃度之指示。
一或多種含於所施加蛋白質溶液中之「其他蛋白質 」可包含一或多種其他目標蛋白及/或一或多種非目標蛋白，其中「非目標蛋白」為其存在為非所要之蛋白質，例如此係因為將其視為在層析運行期間自一或多種目標蛋白移除之污染物。
如本文中所使用之「目標溶離體積 」為穿過層析管柱且隨後在離開管柱後收集之目標緩衝液的特定體積。目標溶離體積包含一或多種呈所需絕對或相對量之目標蛋白。
如本文中所使用之「離子交換層析法 」為基於其對離子交換劑之親和力來分離離子及極性分子(諸如蛋白質或肽)之層析方法。然而，必須在遠離蛋白質之等電點一個單位的條件下進行離子層析法。因此，分離在給定條件下具有高度類似之等電點的分子係一大挑戰。
術語「陽離子交換層析法 」係指在所關注分子帶正電荷或具有正極性時使用之一種類型離子交換層析法。分子由於層析之pH小於pI而帶正電荷或具有正極性。在此類型之層析中，固定相帶負電荷且負載與其吸引之帶正電荷之分子。當分離之所需分子為陽離子時，使用陽離子交換層析法。結合分子接著可自管柱溶離且使用本文中稱為「溶離緩衝液」之溶離劑進行收集。使用離子層析法之主要優勢之一係與其他分離技術相反，在分離期間涉及僅一種相互作用。
如本文中所使用之「層析模擬軟體 」為任何類型之軟體，例如應用程式、指令碼、較大軟體套件之軟體模組或軟體平台，其包含用於模擬(預測)層析製程之一些態樣(特定言之，溶離緩衝液之所推薦鹽濃度及/或包含所需量之一或多種目標蛋白的溶離體積之所推薦溶離邊界)的電腦可解譯碼。
如本文中所使用之「溶離緩衝液 」係指基於水之溶液(亦稱作「溶離劑」)，其施加於層析管柱上以便自管柱溶離一或多種結合至層析管柱之分子，使得所溶離之蛋白質含於離開管柱之溶離緩衝液中且可與以溶離液之不同溶離份形式離開管柱的其他蛋白質單獨收集。
「所計算之目標溶離體積 」為經預測以包含一或多種呈輸入之所需絕對或相對量的目標蛋白之溶離體積。舉例而言，可經由經預測之彙集邊界指定所計算之目標溶離體積。
經預測之「彙集邊界 」為資料值，其指示需要單獨收集離開層析管柱之目標溶離緩衝液體積之部分，以便獲得包含一或多種呈所需量之目標蛋白之溶離體積。根據一些實施例，以指示開始收集目標溶離緩衝液體積之時間的開始時間形式及以指示停止收集目標體積之時間的停止時間形式指定彙集邊界。根據其他實施例，以指示開始收集目標體積時已橫穿且離開管柱之溶離緩衝液體積的開始溶離緩衝液體積形式及以指示停止收集目標體積時已橫穿且離開管柱之溶離緩衝液體積的停止溶離緩衝液體積形式指定彙集邊界。舉例而言，目標溶離體積之彙集邊界可為「3.5倍管柱體積」及「4.6倍管柱體積」，且目標溶離體積可藉由在已經將3.5倍管柱體積之溶離緩衝液施加至管柱上且離開管柱之後，選擇性收集離開管柱之溶離緩衝液並且在將超過4.6倍管柱體積施加至管柱上且大致離開管柱時停止收集來獲得。經預測之彙集邊界是否指定為時間或體積視各別實施方案而定。
如本文中所使用之「醣型 」為具有所連接之不同聚醣或具有不同數目或位置之聚醣的醣蛋白(或醣肽或其他生物學醣苷)之若干不同形式中之任一者。
蛋白質之「純度 」指示此蛋白質不與任何其他物質，特定言之不與其他蛋白質混合之狀態之程度。舉例而言，在溶離體積中具有99%純度之特定蛋白質P1暗示溶離體積由溶離緩衝液溶離份及非溶離緩衝液溶離份組成，其中99%之非溶離緩衝液溶離份由蛋白質P1組成且1%之非溶離緩衝液溶離份由其他物質(例如，含於所施加蛋白質溶液中之一或多種其他蛋白質P2、P3等)組成。若已知(例如，預測或憑經驗確定)所有蛋白質在給定彙集邊界內收集的溶離液中之濃度，則暗含地給定蛋白質之純度。純度可用作關於一或多種目標蛋白之最佳化準則。舉例而言，在理想情況下，在目標溶離體積中獲得之所有目標蛋白之純度為100%，但實際上，最佳化準則可能需要視個別情況而定之最低純度準則，例如99%或更低。
圖 1 描繪根據本發明之一實施例之層析方法的流程圖。
方法可用於獲得包含所需絕對或相對量及/或純度之兩種或更多種目標蛋白之目標溶離體積。舉例而言，方法可經執行以用於分別獲得呈一定濃度或量之目標蛋白P1及目標蛋白P2，其中目標蛋白P1在目標溶離體積內較佳具有最小純度。另外或可替代地，方法可用於獲得包含所需比率之兩種或更多種目標蛋白之目標溶離體積。
在第一步驟100中，方法包含提供如描繪於例如圖2及圖3中之陽離子交換層析管柱230。存在大量可商購之可用於製造自動填充管柱以及預填充管柱之層析樹脂材料。
舉例而言，Poros™ XS (Thermo Scientific™)可用作自動填充管柱，例如購自KronLab之層析管柱中之層析樹脂材料。替代地，可使用例如自購自KronLab之Repligen® (例如，其中尺寸長度=5 cm且直徑=0.5 cm或長度=10 cm且直徑=0.5 cm)購得之預填充管柱。對於大規模運行，管柱尺寸可能與較小實驗室規模運行之管柱尺寸顯著不同。舉例而言，用於大規模運行中之管柱之管柱尺寸可為長度=22.5 cm及直徑=25 cm。
可將層析管柱安裝於具有樣品泵及內部分級分離之自動或半自動層析系統(諸如ÄKTA Avant 25及150層析系統(GE Healthcare))內。
隨後在102步驟中，將包含兩種或更多種目標蛋白及視情況選用的一或多種非目標蛋白(被視為雜質)之蛋白質溶液施加於管柱上。蛋白質溶液包含第一目標蛋白P1、第二目標蛋白P2及視情況選用的一或多種作為非目標蛋白之其他蛋白質P3、P4、P5、P6。
為產生待施加於層析管柱上之蛋白質溶液，執行一或多個預處理及預純化步驟。首先，收穫細胞培養物且獲得所收穫細胞之蛋白質體。其包含醣基化抗體及許多其他類型之蛋白質之複雜混合物。為了選擇性獲得抗體溶離份，將細胞培養提取物施加於適於選擇性結合抗體及抗體片段之第一預純化管柱上。
根據一個實例，第一預純化管柱包含用於單株抗體(mAb)純化之樹脂，例如在負載樣品之前平衡之蛋白質A樹脂。此實例及許多其他實例中之第一預純化管柱之負載密度為約23公克蛋白質/公升樹脂。溶離抗體溶離份且在病毒不活化步驟之後再次增大溶離液之pH。將溶液在4℃下培育隔夜且經0.2 µm無菌過濾器過濾。所過濾之蛋白質A溶離液作為負載材料用於第二預純化管柱，例如填充有混合模式層析樹脂之管柱。為移除蛋白質雜質，使用混合模式層析。在負載之前，平衡管柱。負載密度為25公克蛋白質/公升樹脂且流動速率為150公分/小時。隨後，降低流通物溶離液之pH且池經0.2 µm無菌過濾器過濾。
作為此等預處理及預純化步驟之結果，獲得待施加於層析管柱230上之蛋白質溶液。蛋白質溶液由於所使用之預純化步驟之次數及性質而僅包含數種類型之蛋白質，其化學性質通常為熟知的。預處理及預純化步驟之性質及次數可視細胞培養物之類型及用於提供細胞培養蛋白質提取物的細胞而定及/或可視一或多種類型之所關注蛋白質而定。通常，一系列多個純化步驟亦將不能完全純化一或多種目標蛋白，尤其不會在一或多種目標蛋白為醣型或其他類型的基於PTM之蛋白質變體的情況下，該蛋白質變體之化學特性高度類似於細胞培養提取物中之一或多種其他蛋白質。
另外，可使用分析測試(諸如質譜分析)以便不僅測定待施加於管柱230上之蛋白質溶液中所含有之各蛋白質類型的數目且亦測定其量。
隨後在步驟104中，將已經施加或待施加於管柱上之蛋白質溶液中之各蛋白質的量輸入至層析模擬軟體204中。
另外，在步驟106中，第一目標蛋白及第二目標蛋白之所需第一量214以及視情況選用的非目標蛋白之各別量(若存在)藉由使用者輸入至層析模擬軟體中。另外，一些其他值可經由使用者介面輸入至層析模擬軟體或可經由組態檔案或其他方法提供。舉例而言，此等其他值可包含所需最佳化準則(第一目標蛋白及/或第二目標蛋白之量及/或純度)、溶離緩衝液之pH值、待用於經由管柱泵送溶離緩衝液之泵中所指定的溶離緩衝液流動速率、蛋白質溶液中蛋白質中之每一者之化學特性、已經施加或待施加於管柱上之蛋白質溶液中之個別蛋白質的量及管柱之尺寸。參數之數目及性質可視由模擬軟體所使用的用於在多個不同溶離緩衝鹽濃度下模擬層析運行之模型而定。
一些輸入參數(諸如蛋白質量、管柱尺寸、溶離緩衝液之pH值、固定相之孔隙率、溶離緩衝液流動速率等)可儲存於組態檔案中或經由GUI鍵入且可適於各別應用情境及蛋白質溶液。可再使用如經校準之模型參數(例如等溫線、N、ΔGp0 、ΔGs0 、pKa、配位體密度)的一些參數且通常將其儲存於組態檔案中。
此可使得層析模擬軟體能夠針對隨許多不同候選溶離緩衝鹽濃度而變之一或多個不同候選溶離體積且特定地基於待負載至管柱上之蛋白質的量及化學特性而模擬一或多種目標蛋白之濃度及/或純度值。
舉例而言，溶離緩衝液(其濃度經計算)中之鹽可為鈉鹽，例如乙酸鈉。
可例如自文獻或初步實驗測試推導出溶離緩衝液之所推薦pH值。一般而言，對於蛋白質層析，溶離緩衝液在pH 2.5與10之間的pH範圍為常見的。對於陽離子交換層析法，溶離緩衝液在pH 4至9之間的pH範圍為常見的。較佳地，輸入至模擬軟體之pH值為已知充分作用以供執行類似蛋白質(如目前待分離之彼等蛋白質)之層析分離或分析的pH值。在本文所描述之實例中，輸入至層析模擬軟體且亦為實際上使用之溶離緩衝液之pH值的pH值在5.30至5.70之範圍內。
通常，在模擬期間不會改變pH值。可例如用pH計，例如用WTW Sentix Mic探針控制實際上使用之溶離緩衝液之pH值。
蛋白質之化學特性可包含獨立於用於模擬計算適合的溶離緩衝鹽濃度之層析製程之任何預測模型的特性(例如pKs或胺基酸部分之數目及性質)。
蛋白質之化學特性可另外包含特定針對用於模擬層析製程之預測模型之特性。
為了獲得蛋白質之模型特定化學特性，可使用層析資料(層析圖)以及對應離線分析資料(例如HPLC資料)。
舉例而言，不同層析建模工作流程描述於文獻中以便獲得蛋白質之層析模型特定特性值。當在等溫線之非線性範圍中在較高蛋白質濃度下工作時，不同模型可以相同方式影響層析圖。舉例而言，峰最大值之位置依賴於屏蔽因子ν或Keq而變化。對於等溫線之線性範圍中之參數估計，可以應用Yamamoto方程式，如例如以下中所描述：M. Rüdt, F. Gillet, S. Heege, J. Hitzler, B. Kalbfuss, B. Guélat, 「Combined Yamamoto approach for simultaneous estimation of adsorption isotherm and kinetic parameters in ion-exchange chromatography」, Journal of Chromatography A, 1413 (2015) 68-76及S. Yamamoto, K. Nakanishi, R. Matsuno, T. Kamikuno, 「Ion-exchange chromatography of proteins - Prediction of Elution Curves and Operating Conditions」, I. Theoredical Considerations, Biotechnology and Bioengineering, 25 (1983) 1465-1483。
根據實施例，利用以下三種方法中之一或多者評估等溫線之線性範圍中之實驗：1)利用層析圖之曲線擬合之參數估計(T. Hahn, T. Huuk, V. Heuveline, J. Hubbuch, Simulating and Optimizing Preparative Protein Chromatography with ChromX, Journal of Chemical Education, 92 (2015) 1497-1502)；2)使用由Yamamoto等人描述之log(GH)/log(c(Na+))曲線的對數圖形評估(T. Ishihara, T. Kadoya, H. Yoshida, T. Tamada, S. Yamamoto, Rational methods for predicting human monoclonal antibodies retention in protein A affinity chromatography and cation exchange chromatography: Structure-based chromatography design for monoclonal antibodies, Journal of Chromatography A, 1093 (2005) 126-138.)；及3) GH(c(Na+))曲線之非對數圖形評估(M. Schmidt, M. Hafner, C. Frech, Modeling of salt and pH gradient elution in ion-exchange chromatography, Journal of Separation Science, 37 (2014) 5-13)。若此時沒有觀測到良好相關性，則所選擇之模型可能不適合於應用。
下一步驟為添加高蛋白質之實驗，其中線性梯度資料之評估結果可用於改良參數估計。若層析圖曲線擬合產生模型與實驗資料之間的良好相關性，則可藉由以不包括於校準資料設定中之重要製程參數組合執行驗證運行來測試參數集。若沒有找到令人滿意之模型，則必須擴展模型方程式或必須使資料集降低至較小設計空間。在下文中，將描述獲得根據本發明之實施例之蛋白質的模型特定化學特性中之一些。
根據一些實施例，執行Yamamoto評估以用於獲得模型特定蛋白質特性。舉例而言，如在別處所描述來執行線性梯度溶離實驗之圖形log(GH)/log(c(Na+))評估(M. Schmidt, M. Hafner, C. Frech, Modeling of salt and pH gradient elution in ion-exchange chromatography, Journal of Separation Science, 37 (2014) 5-13.；T. Ishihara, T. Kadoya, H. Yoshida, T. Tamada, S. Yamamoto, Rational methods for predicting human monoclonal antibodies retention in protein A affinity chromatography and cation exchange chromatography: Structure-based chromatography design for monoclonal antibodies, Journal of Chromatography A, 1093 (2005) 126-138)。可如下計算鹽梯度之標準化梯度斜率GH：
Figure 02_image053
VG 為梯度體積，VC 為管柱體積，εcol 為間隙管柱孔隙率，εp 為珠粒孔隙率且kD 為排斥因子。假設KD 為0.6 (F. Wittkopp, L. Peeck, M. Hafner, C. Frech, Modeling and simulation of protein elution in linear pH and salt gradients on weak, strong and mixed cation exchange resins applying an extended Donnan ion exchange model, J Chromatogr A, 1545 (2018) 32-47)。可藉由繪製log(GH)/log(c(Na+ ))且自斜率減去1來測定結合位點之數目(M. Schmidt, M. Hafner, C. Frech, Modeling of salt and pH gradient elution in ion-exchange chromatography, Journal of Separation Science, 37 (2014) 5-13)。可利用單價鹽之相同圖計算平衡常數：
Figure 02_image055
。
蛋白質之自由吉布斯能量ΔG0 P /RT及鹽之自由吉布斯能量ΔG0 s /RT可藉由根據以下方程式繪製ln(Keq )/ν，由斜率及y截距確定：
Figure 02_image057
。
在Microsoft Excel中，應用軟體之內部線性回歸函數執行所有計算。
根據實施例，在另一步驟中，執行GH/c(Na+)曲線擬合。根據先前公開案，藉由計算微分方程式執行GH/c(Na+)曲線(S. Kluters, F. Wittkopp, M. Johnck, C. Frech, Application of linear pH gradients for the modeling of ion exchange chromatography: Separation of monoclonal antibody monomer from aggregates, J Sep Sci, 39 (2016) 663-675；及M. Schmidt, M. Hafner, C. Frech, Modeling of salt and pH gradient elution in ion-exchange chromatography, Journal of Separation Science, 37 (2014) 5-13)：
Figure 02_image059
其中GHsalt 為鹽梯度之標準化梯度斜率，cSALT 為管柱之移動相中游離(非結合)鹽離子之濃度，
Figure 02_image061
為在溶離峰最大值處溶離緩衝液中之鹽濃度，qPROT_i 為固定相中所結合之蛋白質i之濃度，Keq_i 為平衡常數(亦即，固定相中特定蛋白質i之莫耳濃度除以移動相中蛋白質i之莫耳濃度)，Λ為配位體密度(定義為以莫耳/管柱體積為單位之配位體數目)，νi 為結合位點之數目(亦即，參與與蛋白質結合固定相的蛋白質i之結合位點之數目)，σi 為屏蔽因子。
可例如在Berkeley Madonna®中，例如藉由應用軟體之內部四階龍格-庫塔演算法(fourth order Runge-Kutta algorithm)及0.01 mol/L Na+ 之時間步長(time stepping)來執行上文所提及之計算。根據Yamamoto評估之經先前判定的參數選擇且改變參數推測值，直至沒有進一步改良達成為止。
根據實施例，在下一步驟中，執行層析圖曲線擬合。可例如在來自GoSilico之ChromX中執行此步驟。應用集總速率傳遞分散模型(lumped rate transport dispersive model)，例如具有30個胞元之Linear SUPG空間離散化。使用IDAS函數將初始時間步長設定為0.2 s。對於全局最佳化，使用具有軟體標準值之ASA演算法。對於確定性最佳化，使用IOPT演算法。以由ÄKTA系統量測之絕對UV信號之百分比形式導入溶離份資料。藉由使鹽實驗與模擬資料相關聯來確認實驗資料與模擬之暫態對應關係。參數估計之限值可根據先前結果來選擇且在最佳化函數計算值接近於界限時進行調適。使用軟體之估計函數確定模型參數。使用具有各別彙集準則之最佳化函數考慮池分析量測。藉由在具有不同長度之管柱前添加連續攪拌槽反應器來考慮不同Äkta系統對分散之影響。使用取樣函數執行拉丁超立方體取樣(Latin hypercube sampling)，其中群體大小為1000。亦可在其他套裝軟體(例如CADET)中執行所有計算。
在其他情況下，模型特定蛋白質參數可自文獻直接獲得且儲存於例如層析模擬軟體之組態檔案中。
在將所有輸入參數例如經由GUI及/或經由組態檔案或經由另一資料源提供至層析模擬軟體之後，層析模擬軟體在步驟108中計算適於自層析管柱溶離第一目標蛋白之溶離緩衝鹽濃度。
特定言之，根據本發明之實施例，計算溶離緩衝鹽濃度可包含計算一或多種目標蛋白隨複數個候選溶離緩衝鹽濃度中之每一者而變的量及/或純度、輸出針對候選溶離鹽濃度中之每一者而計算的一或多種目標蛋白之與各別候選溶離鹽濃度相關聯之量及/或純度且自使用者或自軟體功能接收選擇的候選溶離鹽濃度中之一者，其中一或多種目標蛋白之量及/或純度最佳符合步驟106中輸入之一或多種目標蛋白的所需量及/或純度。
層析模擬軟體經組態以計算隨一組至少包含以下之參數值而變之鹽濃度：溶離緩衝液之預定義pH值；所提供之陽離子交換層析管柱之尺寸；所施加蛋白質(P1至P6)之輸入量；及所施加蛋白質溶液之蛋白質之化學特性。如上文所提及，可經由GUI及/或經由組態檔案或經由其他資料源提供此等參數值。
在計算(最佳)適合於獲得包含呈所需絕對或相對量及/或純度的第一目標蛋白及/或第二目標蛋白之溶離目標體積之溶離鹽濃度之後，層析模擬軟體在步驟110中計算目標溶離體積至少隨所計算鹽濃度及第一目標蛋白之輸入所需量而變的彙集邊界，該目標溶離體積包含一或多種呈所需量及/或呈所需純度之目標蛋白。較佳地，在基於針對許多不同候選溶離鹽濃度而獲得之蛋白質量及純度來計算最佳適合的溶離鹽濃度時及/或在基於步驟108中獲得之溶離鹽濃度來計算目標溶離體積時，層析模擬程式使用一或多個層析模型。
隨後在步驟112中，包含於自動或半自動層析系統中之泵施加溶離緩衝液，其pH值等同於輸入於層析模擬軟體中之pH值且其鹽濃度等同於步驟108中所計算之鹽濃度。
根據一個實例，根據所計算鹽濃度製備「溶離緩衝液A」，其中緩衝液由0.04 mol/L乙酸鈉組成。
根據另一實例，根據所計算鹽濃度製備「溶離緩衝液B」，其中緩衝液由1 mol/L乙酸鈉溶液組成。緩衝液可例如用30%乙酸(Merck Chemicals GmbH)及乙酸鈉*3H20 (Merck Chemicals GmbH)製備，從而產生5.30及5.70之pH值。
在步驟114中，藉由將溶離緩衝液連續施加於管柱上且以由層析模擬軟體使用以預測彙集邊界之速率將溶離緩衝液泵送穿過管柱來執行層析。通常，需要施加直至達至開始彙集邊界之溶離緩衝液之體積為許多倍層析管柱體積。
接著在步驟116中，人類使用者或自動或半自動層析系統使用步驟110中計算之彙集邊界收集呈單獨溶離份形式的所計算之目標溶離體積。舉例而言，固持空容器之機器人臂可經組態以將容器移動於管柱之出口下方，使得容器在所計算之目標溶離體積之開始彙集邊界處開始收集離開管柱之溶離液，且自出口移除容器以使得在達至停止彙集邊界時停止溶離液之收集。容器中所收集之溶離液為包含一或多種呈所需量及/或純度之目標蛋白的目標溶離體積。
根據一些實施例，在將蛋白質溶液實際上施加於管柱上之前，執行步驟104至110。在此情況下，有可能執行一或多個視情況選用之步驟。舉例而言，管柱230可利用步驟112中所使用之溶離緩衝液平衡，直至pH及導電率讀數在將蛋白質溶液實際上施加於樣品上之前穩定。舉例而言，管柱之平衡可能需要3至5個管柱體積之溶離緩衝液，該溶離緩衝液出於平衡目的而在施加實際蛋白質溶液之前施加。
圖2展示包含具有層析模擬軟體204之電腦系統200及陽離子層析管柱230的層析系統。在圖2中所描繪之實施例中，層析系統用於選擇性獲得第一目標蛋白P1及第二目標蛋白P2。目標蛋白含於包含額外蛋白質P3至P6之蛋白質溶液202中，該等額外蛋白質在此圖式中所說明之應用情境中為非目標蛋白。在將蛋白質溶液施加於管柱上之前，確定各蛋白質P1至P6於蛋白質溶液202中之濃度。另外，自文獻推導出或以實驗方式確定個別蛋白質P1至P6之若干化學特性。
層析模擬程式204包含GUI 212，其使得使用者能夠例如經由輸入欄214指定所需最佳化準則，例如第一目標蛋白及第二目標蛋白P1、P2之量及/或所需純度或量及純度之導數值。另外，GUI包含一或多個額外資料鍵入欄215、216，從而使得使用者能夠指定含於蛋白質溶液202中之蛋白質P2至P6中之每一者的性質及量，指定管柱230之尺寸及額外參數值(諸如溶離緩衝液之pH、蛋白質P1至P6中之每一者的某些化學特性、用於模擬層析之預測模型之類型及其類似者)。
層析模擬軟體可包含複數個經組態以用於建模層析製程之一或多個態樣的預測模型206至210。可在組態檔案220中指定由模擬軟體204或層析模擬模型206至210使用之參數中之一些。
層析模擬軟體204經組態以預測最佳適合於獲得目標溶離體積內呈所需量及/或純度之目標蛋白P1、P2的溶離緩衝鹽濃度222。舉例而言，模擬軟體204可經組態以針對複數個不同候選溶離緩衝鹽濃度中之每一者模擬含於蛋白質溶液中之蛋白質中之每一者的預期溶離曲線，該預期溶離曲線在整個溶離製程期間暗含地提供蛋白質中之每一者之量及純度概況。模擬可基於多個分別描述層析製程之不同態樣的不同模型之組合。基於此等模擬，使用者或軟體功能可選擇候選溶離緩衝鹽濃度中之一者，其最佳適合於溶離呈所需量及/或純度之目標蛋白P1。
根據一個實施例，所計算之溶離鹽濃度222經由GUI 212、218輸出至使用者且使用者建立具有輸入至模擬軟體之pH且具有由軟體204輸出之鹽濃度222的溶離緩衝液226。另外，GUI可輸出經預測以包含呈所需量及/或純度之目標蛋白的目標溶離體積之彙集邊界224。
溶離緩衝液226尤其適合於將目標蛋白P1、P2與所有其他蛋白質分離，因為溶離緩衝鹽濃度係針對施加至管柱之蛋白質P1至P6中之每一者的量來特定計算的。因此，溶離緩衝液不為「標準」/「一成不變」之溶離緩衝液，而實際上為特定適於含於蛋白質溶液中之蛋白質之類型及量的溶離緩衝液。申請人觀測到使溶離鹽濃度適配於在各個別情況下施加至管柱之蛋白質之性質及量(其同樣可視細胞培養提取物及預純化程序之各種態樣而定)可極大地增加層析管柱230分離不同蛋白質之能力。
使用者首先將蛋白質溶液202施加於管柱230上且接著施加溶離緩衝液226。溶離緩衝液226及蛋白質溶液202滲出穿過管柱230。藉此，不同蛋白質P1至P6之分子依賴於其化學特性而與管柱230之固定相228相互作用。蛋白質分子與固定相以及與溶離緩衝液之相互作用決定其溶離概況，亦即，在給定時間離開管柱之各別蛋白質之量。藉由改變用於收集離開管柱之出口之溶離液的容器232、234、236，可獲得溶離液之不同溶離份238、240。根據較佳實施例，容器之交換經協調以使得將經預測以包含呈所需量及/或純度之目標蛋白的目標溶離體積收集於相同容器內。此意謂經預測之目標溶離體積之彙集邊界測定將收集物置放於管柱之出口下方且自其下方移除的時間。
蛋白質溶液之體積比所施加溶離緩衝液之體積小得多且因此在許多層析模擬模型中將其忽略。
在一些實施例中，溶離緩衝液226實際上為兩種或更多種具有相同pH值但具有不同鹽濃度之一系列不同溶離緩衝液。此等不同溶離緩衝液亦稱作「溶離步驟」。舉例而言，層析模擬軟體可經組態以計算用於不同溶離步驟之最適合鹽濃度。
圖3描繪另一層析系統。圖3中所描繪之層析系統可與圖2中所描繪之層析系統相同，其中軟體204不用於獲得呈所需量之單一目標蛋白，而用於獲得呈所需比率之兩種目標蛋白P1、P2。
圖3中所描繪之系統的組件及特徵基本上對應於圖2中所描繪之系統之組件及特徵。因此，將不重複圖2之描述中關於此等特徵而提供之解釋。
與圖2中所描繪之GUI相比，由模擬軟體204產生且圖3中所描繪之GUI 212使得使用者能夠經由資料鍵入欄304指定兩種目標蛋白P1、P2的所需相對量。視情況，使用者可指定目標蛋白P1、P2中之每一者的所需最小純度水準。計算最佳適合於提供包含呈所需比率及(視情況)呈所需純度之兩種目標蛋白的目標溶離體積之溶離緩衝鹽濃度222，包含基於複數個不同候選溶離緩衝鹽濃度模擬複數個層析製程、測定目標溶離體積中兩種目標蛋白之相對量以及視情況選用之純度，及輸出候選溶離緩衝鹽濃度中之一者，其最佳適合於提供包含呈所需相對量及純度之P1及P2的目標溶離體積。各模擬可包含基於給定之候選溶離緩衝鹽濃度預測蛋白質P1至P6中之每一者之溶離概況，且接著分析蛋白質P1至P6中之每一者的溶離概況以供測定目標溶離體積之彙集邊界，該目標溶離體積之蛋白質含量滿足使用者定義之關於相對目標蛋白量及純度的要求。
圖4A描繪使得使用者能夠針對層析製程之不同態樣選擇複數個不同層析製程模擬模型的GUI 400。圖4B說明由各別模型模擬之層析製程的態樣。
舉例而言，GUI使得使用者能夠自複數個替代管柱模型選擇模型「傳遞分散(transport dispersive)」。如本文中所使用之「管柱模型」為描述蛋白質中之每一者之濃度、管柱之間隙體積中溶離緩衝液之鹽濃度及pH值的相互關係之模型。
GUI 400進一步使得使用者能夠自複數個替代孔隙模型選擇模型「集總速率(LumpedRate)」。如本文中所使用之「孔隙模型」係描述蛋白質中之每一者之濃度、管柱之固定相228之孔隙體積中溶離緩衝液之鹽濃度及pH值的相互關係。
GUI 400進一步使得使用者能夠自複數個替代反應模型(亦稱作「等溫線模型」)選擇模型「IEC 2015」。如本文中所使用之「反應模型」係描述固定相228中蛋白質中之每一者之濃度、溶離緩衝鹽濃度及蛋白質溶液中蛋白質中之每一者的化學特性中之至少一些的相互關係。
不同模型可來源於文獻及/或可基於以實驗方式確定之蛋白質特異性模型參數。
圖4C更詳細地說明可經由根據本發明之一個實施例的GUI 400選擇之模型類型中之每一者背後的數學概念。然而，已公開替代模型且有可能圖4B中所描繪之模型中之至少一些可能在將來經調適及改良。因此，本發明不限於本文中出於說明性目的而描述之任何特定模型或數學式。
圖4D描繪圖形使用者介面402，其由層析模擬軟體204產生且使得使用者能夠指定層析管柱230及其中所含有之固定相228的細節。舉例而言，使用者可指定管柱230之長度及體積以及固定相228之間隙管柱孔隙率、軸向分散、珠粒半徑及珠粒孔隙率。由層析模擬軟體204產生之另一圖形使用者介面404使得使用者能夠指定模型特定化學特性，例如固定相之離子容量(其對應於配位體密度)，羧基、組胺酸基團、胺基之酸解離常數等。GUI之資料鍵入欄可視使用者經由GUI 400選擇之模型類型而定。
圖4E描繪GUI 406，其使得使用者能夠指定溶離緩衝液之鹽類型、溶離緩衝液之pH值、包含於蛋白質溶液中之蛋白質之數目及類型以及一或多種蛋白質特定的所需絕對或相對量、所需純度水準以及模型特定的或模型非依賴性化學特性值。
圖5A為展示施加於管柱上之蛋白質溶液中所包含之多種蛋白質P1、P2及P3之經模擬溶離概況的溶離繪圖500。舉例而言，蛋白質P1、P2及P3可為參考圖7A至7D更詳細地描述之蛋白質P1、P2及P3。
蛋白質P1係作為目標蛋白提供且使用者指定應獲得呈預定義濃度及預定義純度之P1。其他蛋白質P2及P3為非目標蛋白。此意謂P2及P3被視為非所要污染物，其濃度應儘可能低以確保足夠純度之P1。
繪圖500包含指示用於提供繪圖500之模擬中之候選溶離鹽濃度的曲線502。如可自繪圖推導出，候選溶離緩衝液實際上為具有不同鹽濃度之一系列多個不同候選溶離緩衝液(「溶離步驟」)。一旦溶離緩衝鹽濃度上升超過0.35 mol/l，則目標蛋白P1以及非目標蛋白P2開始自管柱脫離且在溶離液中為可觀測的。此可自蛋白質P1之各別溶離概況508及蛋白質P2之各別溶離概況506推導出。一旦鹽濃度上升超過0.9 mol/l，則亦溶離P3，如自溶離概況504推導出。
層析模擬軟體經組態以在各別步驟中模擬(預測)候選溶離鹽濃度中之每一者的溶離概況504至508且用於測定包括溶離體積之彙集邊界，該溶離體積之蛋白質含量滿足使用者定義之關於目標蛋白量及純度的要求。由點線512、514指示經測定之彙集邊界。兩條線界定包含蛋白質P1之峰的目標溶離體積。目標溶離體積亦包含一定量之蛋白質P2。然而，藉由在彙集邊界514處停止溶離液之收集，可以確保P1於目標溶離體積中之純度符合使用者定義之純度要求，此係因為在此點之後，增加相對量的非目標蛋白P2將含於目標溶離體積中。
參考針對單一目標蛋白P1之最佳化準則來描述圖5A中所描繪之繪圖。然而，在其他使用案例情境中，蛋白質P2亦可被視為目標蛋白(參見例如圖6A)且最佳化準則可為與兩種目標蛋白P1、P2之量及/或純度有關之準則，而僅P3被視為污染物。在此情況下，彙集邊界將適於新的最佳化準則。
圖5B描繪鑒於多個不同候選溶離鹽濃度，第一蛋白質溶液中目標蛋白P1之產率及純度以及組合純度-產率-客觀參數的經預測結果。「純度」指示鑒於候選鹽濃度，目標溶離體積中P1之經預測純度。「產率」指示鑒於候選鹽濃度，目標溶離體積中目標蛋白P1之經預測量。「客觀值」為自P1之經預測量及純度之組合推導出的總值。舉例而言，圖5B中所描繪之「客觀值」為如下計算之「複合客觀值」： 單一客觀值SO=F * (客觀值)Power + A，其中F (「因子」)為數值，POWER為數值，且A (「加數」)亦為數值。
可藉由利用乘法或加法組合單一客觀值來產生複合客觀值。
舉例而言，可以選擇以下參數：POWER=1，F=1且A=0。然而，此等參數中之每一者亦可具有不同值。
針對溶離緩衝鹽濃度0.342544以迭代(iteration) 10計算之客觀值SO1為目標溶離體積中蛋白質P1之經預測純度，其中溶離池體積在135 mL開始且在147 mL結束。經預測純度SO1具有值0.751832。客觀值SO2為針對溶離緩衝鹽濃度0.342544以在迭代10計算之蛋白質P1之產率。經預測產率SO2具有值0.836734。
可藉由彙總SO1及SO2，例如計算SO1 + SO2來計算複合客觀值CO1。根據另一實例，複合客觀值CO2係以SO1 * SO2形式進行計算。
結果係以表510之形式呈現。表之第一行(「迭代」)包含候選溶離緩衝鹽濃度或一組候選溶離緩衝鹽濃度(用於多個步驟)之標識符，其用作各別層析模擬之依據。另一行(「鹽濃度」)指示用於特定溶離步驟中之候選溶離緩衝鹽濃度。另一行(「純度蛋白質1」)指示針對給定之候選溶離緩衝鹽濃度而預測之純度值。另一行(「產率蛋白質1」)指示針對給定之候選溶離緩衝鹽濃度而預測之蛋白質P1之量(例如濃度)。另一行(「客觀值」)指示經最佳化(此處：最小化)且作為目標蛋白P1之經預測純度及經預測產率之函數進行計算的客觀值。
表510中之每一列對應於一種候選溶離緩衝鹽濃度及各別預測。表510中之列根據客觀值進行排序，且具有最佳(此處：最小) 客觀值並因此具有最高純度及產率之列作為表中之第一列呈現。在此圖式中所描繪之實例中，「純度」或「產率」之數值儘可能低意謂純度或產率儘可能高。此暗示「迭代」編號23之模擬的候選溶離緩衝鹽濃度0.345被視為給定蛋白質溶液之最佳鹽濃度。因此，選擇實際上用於「真實」溶離之溶離緩衝液以使得其具有0.345之鹽濃度。亦存在其中單一值較高之模擬，例如迭代10。此處之純度比在迭代23中高，但產率較低。純度與產率之間的最佳折中方案(帕累托原理(Pareto principle))為迭代23。
圖5C描繪鑒於多個不同候選溶離鹽濃度，具有第一蛋白質溶液中目標蛋白之組合純度/產率-客觀參數的經預測結果之繪圖518。曲線520表示參考圖5B描述之純度/產率導出的客觀值。因此，圖5C之繪圖518以曲線而非表510之行形式說明基於複數個不同候選溶離緩衝鹽濃度及各別模擬而獲得的純度-產率客觀值。資料點516指示在迭代23獲得此客觀值之最小值且用於此特定模擬#23之候選溶離緩衝鹽濃度應用作用於獲得目標溶離體積之實際溶離緩衝鹽濃度。對應於由繪圖5A中之彙集邊界512、514定界的溶離目標體積之溶離緩衝步驟之溶離緩衝鹽濃度對應於編號為#23之模擬中所預測的最佳鹽濃度。
圖6A為針對第二蛋白質溶液所獲得的溶離繪圖600。第二蛋白質溶液亦包含三種蛋白質P1、P2及P3。舉例而言，蛋白質P1、P2及P3可為參考圖7A至7D更詳細地描述之蛋白質P1、P2及P3。
與圖5A中所描述之情形相比，兩種蛋白質P1及P2被視為目標蛋白。使用者經由圖形使用者介面指定其(he/she)對獲得呈55:45之比率的蛋白質P1及P2感興趣。另外，所獲得之目標溶離體積應儘可能純，從而意謂目標溶離體積應包含儘可能少之P3及任何其他蛋白質。
蛋白質P1之經模擬溶離概況描繪為曲線608，蛋白質P2之經模擬溶離概況描繪為曲線606，蛋白質P3之經模擬溶離概況描繪為曲線604，且溶離緩衝鹽濃度步驟描繪為曲線602。模擬兩種目標蛋白P1及P2之量及純度以及針對複數個不同候選溶離緩衝濃度中之每一者的量與純度導出客觀值揭示多個步驟中之每一者的最佳溶離緩衝鹽濃度，且揭示界定目標溶離體積並且滿足所指定純度要求的彙集邊界612、614，該目標溶離體積包含呈所需相對量之第一目標蛋白P1及第二目標蛋白P2。另外，繪圖600包含經模擬之和信號610，其指示可用於在溶離製程期間比較經預測之蛋白質峰與憑經驗獲得之總蛋白質峰的蛋白質之總量。
圖6B描繪鑒於多個不同候選溶離鹽濃度，第二蛋白質溶液中目標蛋白P1及P2之產率及純度以及組合純度-產率-客觀參數的經預測結果。「純度」指示針對候選溶離緩衝鹽濃度中之每一者預測的目標溶離體積中之各別目標蛋白P1、P2之純度。
結果係以表617之形式呈現。表之第一行(「迭代」)包含候選溶離緩衝鹽濃度或一組候選溶離緩衝鹽濃度(用於多個步驟)之標識符，其用作各別層析模擬之依據。另一行(「鹽濃度」)指示用於特定溶離步驟中之候選溶離緩衝鹽濃度。另一行(「純度蛋白質1」、「純度蛋白質2」)指示針對給定之候選溶離緩衝鹽濃度而對蛋白質P1、P2中之每一者進行預測之純度值。另一行(「客觀值」)指示經最佳化(此處：最小化)且作為目標蛋白P1及P2之經預測純度及經預測相對量之函數來進行計算的客觀值。
舉例而言，「客觀值」 (亦稱作「複合客觀值」)可為自P1及P2之經預測相對量之組合及P1及P2之所需純度水準之組合推導出的總值。舉例而言，可由兩個單一客觀值SO1、SO2，藉由將兩個單一客觀值相加或相乘來計算「客觀值」 CO。舉例而言，CO可計算為CO = SO1 + SO2或計算為CO = SO1 * SO2。
藉此，SO1為針對給定之候選溶離緩衝鹽濃度預測之目標溶離體積中之P1的純度，例如1:0.55，其中預測溶離目標體積在112 mL開始且在127 mL結束。SO2為2:0.45，其為溶離目標體積中P2之所需純度，其中預測溶離目標體積在112 mL開始且在127 mL結束。
視情況，所計算之客觀值CO與目標值之間的誤差可使用計算客觀值與目標值之間的逐點平方差(point-wise squared deviation)之「參考比較」成本函數來進行計算。
表617中之每一列對應於一種候選溶離緩衝鹽濃度及各別預測。表617中之列根據客觀值進行排序，且具有最佳(此處：最小) 客觀值並因此具有最高純度且最佳符合P1:P2比率之列作為表中之第一列呈現。儘可能小之「客觀」參數之值意謂單一客觀值與對應目標值之間的差異儘可能小。此暗示「迭代」編號35之模擬的候選溶離緩衝鹽濃度0.388被視為給定之蛋白質溶液之最佳鹽濃度。因此，選擇實際上用於「真實」溶離之溶離緩衝液以使得其具有0.388之鹽濃度。
圖6C描繪鑒於多個不同候選溶離鹽濃度，具有第一蛋白質溶液中目標蛋白之組合純度/產率-客觀參數的經預測結果之繪圖618。曲線620表示參考圖6B描述之純度/產率導出客觀值。因此，圖6C之繪圖618以曲線而非表617之行形式說明基於複數個不同候選溶離緩衝鹽濃度及各別模擬而獲得的純度-產率客觀值。資料點616指示在迭代35獲得此客觀值之最小值且用於此特定模擬#35之候選溶離緩衝鹽濃度應用作實際溶離緩衝鹽濃度。對應於由繪圖6A中之彙集邊界612、614定界的溶離目標體積之溶離緩衝步驟之溶離緩衝鹽濃度對應於編號為#35之模擬中所預測的最佳鹽濃度。
圖6D描繪針對第二蛋白質溶液獲得之P1及P2之經預測及經量測之蛋白質比率的比較。由彙集邊界612、614定界的目標溶離體積中蛋白質P1之經預測濃度基於用於模擬#35中之0.388莫耳/公升之候選溶離緩衝液濃度而預測為51%。當用鹽濃度為0.388莫耳/公升之溶離緩衝液執行溶離時，目標溶離體積中P1之憑經驗量測之濃度為56%。同樣地，目標溶離體積中蛋白質P2之經預測濃度為49%。目標溶離體積中P2之憑經驗量測之濃度為44%。因此，由經預測之彙集邊界定義的目標溶離體積中之經預測濃度之準確度非常高。
圖6E描繪蛋白質P1、P2及P3之憑經驗獲得之解析度。繪圖624說明由各別蛋白質P1、P2、P3之溶離誘導的光學峰626、628、630。如可自繪圖推斷出，P1及P2之峰強烈重疊。觀測到在45公克/公升之蛋白質負載下，在40管柱體積之梯度中兩種蛋白質P1、P2之解析度R為約0.43，亦即，非常低。本發明之實施例可用於獲得呈所需比率之兩種或更多種蛋白質，即使在此等蛋白質具有低解析度值之情況下且在不需要首先分離兩種蛋白質且接著以所需比率重新組合蛋白質的情況下。
圖7描繪兩種目標蛋白P1、P2及被視為非所要污染物之另一蛋白質P3的一實例。
圖7A展示由大腦穿梭分子(brain shuttle molecule，稱作(「BSM」)組成之蛋白質700 「bsGant」的說明，該大腦穿梭分子連接至本文中稱作「Gant」之抗體。大腦穿梭分子為能夠增加大分子(諸如抗體)滲透至大腦中之分子。大分子進入大腦受血腦屏障(blood brain barrier；BBB)限制，該血腦屏障係血液與腦組織之間的看門因子(gatekeeper)，其謹慎地過濾哪些分子可以進入腦部。由本申請人工程改造之一些抗體能夠藉由結合至位於血腦屏障表面上之蛋白質受體中之一者而跨過血腦屏障。大腦穿梭分子可潛在地將一或多種治療分子傳遞至大腦中，不論其跨過血腦屏障之內在能力如何。bsGant蛋白質詳細描述於國際專利申請案WO 2017/055540中，其以全文引用之方式併入本文中。
「bsGant」抗體為單體免疫球蛋白G (IgG) Fc融合蛋白。用於產生「bsGant」抗體之細胞培養物產生此抗體在其Fab醣基化程度上不同之三種不同變體。Fab醣基化不完全，從而產生非醣基化、單醣基化及雙醣基化抗體之混合物。
根據實施例，一或多種目標蛋白為不同醣型之單體bsGant蛋白質(如上文所定義)。
根據一個實例，一或多種目標蛋白為不同醣型之bsGant 「抗體0015」，其描述於專利申請案WO 2017/055540中。此抗體為雙特異性抗體，其包含具有SEQ ID NO: 01之胺基酸序列之輕鏈、具有SEQ ID NO: 02之胺基酸序列之重鏈、具有SEQ ID NO: 03之胺基酸序列的輕鏈及包含揭示於WO 2017/055540中之SEQ ID NO: 04之胺基酸序列的抗體Fab片段。SEQ ID NO: 01係關於對應於N端fab之非域交換輕鏈的215 aa殘基多肽，SEQ ID NO: 02為對應於兩個重鏈之455 aa殘基多肽，SEQ ID NO: 03為對應於額外C端fab片段之域交換輕鏈fab片段的215 aa殘基多肽，且SEQ ID NO: 04為對應於額外C端fab片段之域交換重鏈fab片段的229 aa殘基片段。
圖7B展示雙醣基化抗體變體，本文中亦稱作「蛋白質P1」。
圖7C展示單醣基化抗體變體，本文中亦稱作「蛋白質P2」。
圖7D展示非醣基化抗體變體，本文中亦稱作「蛋白質P3」。
三種變體之緊密溶離條件對用於分離及/或進一步純化所需抗體變體之層析方案帶來了特殊挑戰。
抗體之Fc區之醣基化型態的差異可引起構形、藥物動力學以及結合特徵之差異。Fab區之醣基化可影響配位體結合強度及組織滲透。因此，醣基化型態對複數個醫療領域中所使用之抗體具有特殊意義。醣基化型態可視表現載體、細胞株、細胞培養模式以及細胞培養條件、純化製程及其他因素而定。由於醣基化變化形式可能在電荷方面僅略有不同，使用離子交換樹脂之分離為可能的但必須最佳化溶離條件。
申請人觀測到施加於層析管柱上之蛋白質負載密度為影響產物池組成的另一關鍵製程參數。本發明之實施例可允許獲得所需比率之抗體變體(例如，P1:P2之比率為55:45)，其在醫藥學上尤其有效。
分離包含三種蛋白質P1、P2及P3之蛋白質溶液的挑戰在於產物池(「目標溶離體積」)應含有約55%:45%之P1與P2之比率。此分離之產率由於此相對量準則而受到限制，因為蛋白質溶液含有超過50%之P2 (參見表1)。蛋白質P3在此情況下為產物特異性雜質，亦即不具有醣基化之蛋白質700。
申請人觀測到蛋白質P1、P2及P3在施加於管柱上之蛋白質溶液中之相對及絕對量可能因情況而顯著變化且此可能帶來另一挑戰，因為對特定蛋白質製備充分作用之層析方案可能無法在此等三種蛋白質變體之不同製備上分離蛋白質。
舉例而言，選擇性包含三種蛋白質P1、P2及P3之蛋白質溶液可藉由收穫經基因工程改造以產生三種醣基化變體之蛋白質700的細胞培養物來獲得。將所有醣型捕獲於在負載之前平衡之蛋白質A樹脂上。粗蛋白質提取物之負載密度為23公克蛋白質/公升樹脂。溶離抗體且在病毒不活化步驟之後，再次增加溶離液之pH且將溶液在4℃下培育隔夜並且經0.2 µm無菌過濾器過濾。所過濾之蛋白質A溶離液作為負載材料用於混合模式層析樹脂。為移除蛋白質雜質，使用混合模式層析樹脂。在負載之前，平衡管柱。負載密度為25公克蛋白質/公升樹脂且流動速率為150公分/小時。隨後，降低流通物溶離液之pH且池經0.2 µm無菌過濾器過濾。
該方法在六種不同細胞培養提取物上重複多次且施加於陽離子管柱上的分別獲得之蛋白質溶液概述於下文「表1」中：
   變體P1 [%] 變體P2 [%] 變體P3 [%]
蛋白質溶液1 36.2 50.8 13.0
蛋白質溶液2 38.5 52.0 9.5
蛋白質溶液3 34.2 52.5 13.3
蛋白質溶液4 98.0 2.0 0.0
蛋白質溶液5 2.4 97.6 0.0
蛋白質溶液6 0.0 3.5 96.5
為分離單一醣基化變體，PorosXS池用水稀釋且在高蛋白質負載密度下使用PorosXS樹脂以結合及溶離模式進行再處理。管柱用376 mM乙酸鈉pH 5.5平衡且負載密度為80公克/公升樹脂。分級分離且分析流通物。流通物開始時之溶離份含有純度為98.0%之變體1 (蛋白質溶液4)。為了溶離變體2及3，使用於6.25 CV中自376 mM乙酸鈉pH 5.5至616 mM乙酸鈉pH 5.5之梯度。溶離峰含有純度為97.6%之變體2 (蛋白質溶液5)及純度為96.5%之變體3 (蛋白質溶液6)。
藉由將100 µg樣品注射於分析型陽離子交換層析管柱(Mono S 5/50 GL，GE Healthcare)上，利用在pH 5.3下在1 ml/min流速下之鹽梯度溶離來執行醣基化變體分析。由質譜分析進行前述峰鑑別。
模型206至210之各種模型參數之機理建模所要求的系統及樹脂參數係藉由具有不同示蹤劑的脈衝實驗測定，該等示蹤劑如A. Osberghaus, S. Hepbildikler, S. Nath, M. Haindl, E. von Lieres, J. Hubbuch, Determination of parameters for the steric mass action model--a comparison between two approaches, Journal of Chromatography A, 1233 (2012) 54-65中所描述。執行大小1000之拉丁超立方體取樣以研究製程參數(pH值、負載組成、溶離步驟之鹽濃度)對溶離池中之雜質概況之影響。為了使負載密度變化，改變注射體積。採用5秒時間步長、30個軸向胞元、5 cm管柱長度，在300 cm/h之流動速率下使用ChromX執行模擬。對於各電子雜交實驗(in silico experiment)，使用具有固定體積之彙集決策計算溶離池中個別蛋白質之雜質概況及溶離概況。在MATLAB中，使用以雜質池濃度為因變數且以製程參數為自變數之線性回歸分析來分析結果。
圖8A展示說明蛋白質負載對溶離目標體積中之相對蛋白質組成之影響的繪圖802。假設溶離緩衝鹽濃度為40%，在曲線804中說明了在不同蛋白質負載下溶離液中蛋白質P1之相對量。在曲線806中說明溶離液中蛋白質P2之相對量。
圖8B展示說明溶離緩衝鹽濃度對溶離目標體積中之相對蛋白質組成之影響的繪圖808。假設在管柱上施加45 g/L之總蛋白質負載，在曲線810中說明在不同鹽濃度下溶離液中蛋白質P1之相對量。在曲線812中說明溶離液中蛋白質P2之相對量。本發明之實施例允許以計算方式鑑別特定適於負載於管柱上之個別蛋白質之量及類型的溶離緩衝鹽濃度，藉此顯著改良預測各蛋白質之溶離概況且收集目標溶離體積的能力，該等目標溶離體積包含呈所需量及所需純度之所需蛋白質。
實驗測試展示根據本發明之實施例的層析法能夠預測所需池組成且因此預測可能對分子表徵及製程設計空間之定義至關重要的產物品質。
圖9為說明藉由調適溶離緩衝鹽濃度補償蛋白質負載之影響的繪圖900。層析模擬軟體用於針對複數種增加量的負載於管柱上之蛋白質(x軸)中之每一者，以計算方式預測能夠提供以55:45之所需比率包含兩種目標蛋白P1、P2之目標溶離體積的溶離緩衝鹽濃度902。如可自繪圖900推導出，指示兩種目標蛋白P1、P2之相對量的經預測曲線904、906基本上等同於憑經驗量測之相對量910、908。經預測之溶離鹽濃度能夠確保無論藉由製備細胞培養蛋白質提取物獲得之蛋白質量及預純化步驟(其可因情況而顯著變化)如何，恆定所需比率之兩種目標蛋白P1及P2包含於目標溶離體積中。
申請人觀測到依賴於蛋白質負載而模擬及選擇溶離緩衝鹽濃度可顯著增加模擬準確度且允許鑑別支援許多類型之目標蛋白之最佳化準則的鹽濃度。申請人觀測到蛋白質負載密度及鹽莫耳濃度兩者均對蛋白質溶離概況具有強烈影響。藉由結合此知識，鹽濃度可用作針對個別蛋白質負載密度特定選擇之製程導向參數。根據蛋白質負載密度最佳化溶離鹽莫耳濃度亦可允許確保恆定產物品質。
圖10A至C描繪溶離緩衝鹽濃度對兩種蛋白質P1、P2之溶離概況之影響。
舉例而言，第一模擬可假設如圖10A中所描繪之低溶離緩衝鹽濃度。溶離緩衝液不能完全地或根據作為最佳化準則提供之所需蛋白質比率分離蛋白質P1及P2。在管柱清潔(CIP)步驟中溶離兩種蛋白質。「彙集」階段中獲得之溶離液基本上不含蛋白質P1及P2。
第二模擬可基於如圖10B中所描繪之高溶離緩衝鹽濃度。此溶離緩衝液亦不可能完全分離兩種蛋白質或提供包含呈所需比率之兩種蛋白質的溶離液。彙集階段中獲得之溶離液包含大量的蛋白質P1及P2兩者，但不呈所需比率(假設所需比率不為1:1)。
第三模擬可基於如圖10C中所描繪之中等溶離緩衝鹽濃度。此溶離緩衝液完全分離兩種蛋白質。彙集階段中獲得之溶離液包含大量蛋白質P1且基本上不含蛋白質P2。
在P1:P2之所需比率為例如約1:2的情況下，模擬軟體可經組態以基於小於圖10B中所描繪但高於圖10C中所描繪之若干不同溶離緩衝鹽濃度而執行其他模擬，以獲得蛋白質P1及P2之經預測的溶離概況且鑑別提供所彙集溶離體積的鹽濃度中之一者，該所彙集溶離體積之P1:P2蛋白質比率最佳符合所需比率。
100:步驟 102:步驟 104:步驟 106:步驟 108:步驟 110:步驟 112:步驟 114:步驟 116:步驟 200:電腦系統 202:蛋白質溶液 204:層析模擬軟體/層析模擬程式 206:預測模型 208:預測模型 210:預測模型 212:圖形使用者介面 214:第一量/輸入欄 215:額外資料鍵入欄 216:額外資料鍵入欄 218:圖形使用者介面 220:組態檔案 222:溶離緩衝鹽濃度 224:彙集邊界 226:溶離緩衝液 228:固定相 230:陽離子層析管柱 232:容器 234:容器 236:容器 238:溶離份 240:溶離份 304:資料鍵入欄 400:圖形使用者介面 402:圖形使用者介面 404:圖形使用者介面 406:圖形使用者介面 500:溶離繪圖 502:曲線 504:溶離概況 506:溶離概況 508:溶離概況 510:表 512:點線/彙集邊界 514:點線/彙集邊界 516:資料點 518:繪圖 520:曲線 600:溶離繪圖 602:曲線 604:曲線 606:曲線 608:曲線 610:和信號 612:彙集邊界 614:彙集邊界 616:資料點 617:表 618:繪圖 620:曲線 624:繪圖 626:光學峰 628:光學峰 630:光學峰 700:蛋白質 802:繪圖 804:曲線 806:曲線 808:繪圖 810:曲線 812:曲線 900:繪圖 902:溶離緩衝鹽濃度 904:經預測曲線 906:經預測曲線 908:憑經驗量測之相對量 910:憑經驗量測之相對量 P1:第一目標蛋白 P2:第二目標蛋白 P3:額外蛋白質 P4:額外蛋白質 P5:額外蛋白質 P6:額外蛋白質
在下文中，僅藉助於實例參考圖式更詳細地解釋本發明之實施例，在該等圖式中： 圖1            描繪根據本發明之一實施例之方法的流程圖； 圖2            描繪一層析系統； 圖3            描繪另一層析系統； 圖4A         描繪用於選擇由層析模擬軟體使用之模型的GUI； 圖4B、C    進一步說明各別模型類型； 圖4D至E    描繪用於將資料鍵入於層析模擬軟體中之GUI； 圖5A         為針對第一蛋白質溶液所獲得的溶離繪圖； 圖5B          描繪鑒於多個不同候選溶離鹽濃度，第一蛋白質溶液中目標蛋白之產率及純度以及組合純度-產率-客觀參數的經預測結果； 圖5C          描繪鑒於多個不同候選溶離鹽濃度，具有第一蛋白質溶液中目標蛋白之組合純度/產率-客觀參數的經預測結果之繪圖； 圖6A         為針對第二蛋白質溶液所獲得的溶離繪圖； 圖6B          描繪鑒於多個不同候選溶離鹽濃度，第二蛋白質溶液中第一目標蛋白及第二目標蛋白之產率及純度以及組合純度-產率-客觀參數的經預測結果； 圖6C          描繪鑒於多個不同候選溶離鹽濃度，具有第二蛋白質溶液中第一目標蛋白及第二目標蛋白之組合純度/產率-客觀參數的經預測結果之繪圖； 圖6D         描繪經預測及經量測之蛋白質比率的比較； 圖6E          描繪蛋白質P1及P2之解析度； 圖7            描繪兩種目標蛋白P1、P2及另一蛋白質P3之一實例； 圖8A         為說明蛋白質負載對相對池組成之影響的繪圖； 圖8B          為說明溶離緩衝鹽濃度對相對池組成之影響的繪圖； 圖9            為說明藉由經預測之溶離緩衝鹽濃度來補償蛋白質負載對目標蛋白比率之影響的繪圖；及 圖10A至C  描繪不同鹽濃度對兩種蛋白質之溶離概況的影響。
200:電腦系統
202:蛋白質溶液
204:層析模擬軟體/層析模擬程式
206:預測模型
208:預測模型
210:預測模型
212:圖形使用者介面
214:第一量/輸入欄
215:額外資料鍵入欄
216:額外資料鍵入欄
218:圖形使用者介面
220:組態檔案
222:溶離緩衝鹽濃度
224:彙集邊界
226:溶離緩衝液
228:固定相
230:陽離子層析管柱
232:容器
234:容器
236:容器
238:溶離份
240:溶離份

Claims (22)

  1. 一種產生包含第一(P1)及第二(P2)目標蛋白之目標溶離體積(238)的層析法，該方法包含： 提供陽離子交換層析管柱(230) (100)； 將蛋白質溶液(202)施加於該管柱上(102)，該蛋白質溶液至少包含該第一目標蛋白(P1)及該第二目標蛋白(P2)以及視情況選用之一或多種其他蛋白質(P3、P4、P5、P6)； 將最佳化準則輸入至層析模擬軟體(204)中(106)，該最佳化準則為關於包含於該目標溶離體積中之該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之目標溶離體積的所需特性； 藉由該層析模擬軟體計算適於自該層析管柱溶離該第一目標蛋白及該第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合該最佳化準則之目標溶離體積之溶離緩衝鹽濃度(222) (108)，該計算包含計算複數個隨多個不同溶離緩衝鹽濃度而變之層析模擬； 藉由該層析模擬軟體計算該目標溶離體積至少隨所計算之鹽濃度及所輸入之最佳化準則而變之彙集邊界(110)； 將具有所計算鹽濃度之溶離緩衝液(226)施加於該層析管柱上(112)； 使用所施加之溶離緩衝液執行溶離(114)；及 使用所計算之彙集邊界收集呈單獨溶離份形式的所計算之目標溶離體積(116)。
  2. 如請求項1之層析法，該最佳化準則係選自包含以下之群： a) 該目標溶離體積中該第一目標蛋白之量與該第二目標蛋白之量的所需比率或比率範圍； b) 該目標溶離體積中該第一目標蛋白之所需量或量範圍與該第二目標蛋白之所需量或量範圍組合； c) 該第一目標蛋白之所需純度或純度範圍與以下組合： 該目標溶離體積中該第一蛋白質之量與該第二蛋白質之量的所需比率 該目標溶離體積中該第二目標蛋白之所需量或量範圍； 該目標溶離體積中該第二目標蛋白之所需純度或純度範圍； d) 上文所提及之準則中之兩者或更多者之組合。
  3. 如前述請求項中任一項之層析法， 其中所施加之蛋白質溶液(202)包含該一或多種其他蛋白質(P3、P4、P5、P6)。
  4. 如前述請求項中任一項之層析法， 其中該複數個層析模擬係作為該多個不同溶離緩衝鹽濃度之函數且作為多個不同溶離緩衝液pH值之函數來進行計算，該方法進一步包含： 其中該計算(108)包含計算溶離緩衝鹽濃度(222)及溶離緩衝液pH值之組合，其以組合方式適於自該層析管柱溶離該第一目標蛋白及該第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合該最佳化準則之目標溶離體積，其中該等層析模擬經執行以用於鑑別該溶離緩衝鹽濃度(222)及該溶離緩衝液pH之該組合的組合； 其中該目標溶離體積之彙集邊界係至少作為該溶離緩衝鹽濃度及該溶離緩衝液pH值之所計算組合以及所輸入之最佳化準則的函數來進行計算；及 其中施加於該管柱上之該溶離緩衝液(226)具有所計算之鹽濃度及所計算之pH值。
  5. 如前述請求項中任一項之方法，該第一目標蛋白及該第二目標蛋白為解析度因數小於0.75及/或小於0.5之蛋白質。
  6. 如前述請求項中任一項之方法，該第一目標蛋白及該第二目標蛋白為具有相同胺基酸序列之蛋白質之醣基化變體。
  7. 如前述請求項中任一項之方法，該第一目標蛋白及該第二目標蛋白為具有相同胺基酸序列且FAB片段上包含不同數目個醣基之抗體單體。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中所施加蛋白質溶液包含該等目標蛋白(P1、P2)中之每一者及該等其他蛋白質(P3至P6)中之每一者(若存在)，其各別濃度為至少0.5重量%，特定言之至少1重量%，特定言之至少2重量%。
  9. 如前述請求項中任一項之方法，其中包含於所施加蛋白質溶液中之該第二目標蛋白(P2)及該等其他蛋白質(P3至P6)中之一或多者(若存在)對該管柱之固定相具有與該第一目標蛋白對固定相之親和力類似的親和力，從而產生重疊之溶離行為。
  10. 如前述請求項中任一項之方法，其中施加至該管柱之該蛋白質溶液中蛋白質之總量等同於或小於該管柱之最大蛋白質負載容量，且特定言之在該最大蛋白質負載容量之50%至100%，例如50%至90%範圍內。
  11. 如前述請求項中任一項之方法，其中以收集開始時間偏移及收集停止時間偏移之形式指定該目標溶離體積之所計算彙集邊界，該方法包含： 藉由包含該層析管柱之自動層析系統連續監測自開始該溶離所流逝之時間； 當流逝時間等於該收集開始時間偏移時，自動開始藉由該層析系統進行所溶離之溶離緩衝液的收集；及 當流逝時間等於該收集停止時間偏移時，停止藉由該層析系統進行所溶離之溶離緩衝液的收集。
  12. 如前述請求項中任一項之層析法， 其中該複數個層析模擬中之每一者為使用兩個或更多個溶離步驟之層析製程的模擬，從而在各溶離步驟中，使用具有不同溶離鹽濃度之溶離緩衝液， 其中所計算之溶離緩衝鹽濃度為一系列不同的溶離步驟特定之溶離緩衝鹽濃度，及 其中將具有所計算鹽濃度之該溶離緩衝液施加於該層析管柱上包含根據所計算的該系列溶離步驟特定之鹽濃度逐步施加一系列具有不同鹽濃度之溶離緩衝液。
  13. 如前述請求項中任一項之層析法，該方法包含： 將包含於所施加蛋白質溶液中之該第一目標蛋白及該第二目標蛋白(P1至P2)中之每一者的量以及視情況選用的包含於所施加蛋白質溶液中之一或多種其他蛋白質(P3至P6)中之每一者的量(若存在)輸入至該層析模擬軟體(204)中(104)； 該等模擬係作為一組至少包含以下之參數值之函數來進行計算： 所提供之陽離子交換層析管柱之尺寸；及 該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之量以及視情況選用的該一或多種施加於該管柱上之其他蛋白質之量。
  14. 如請求項12之層析法，該組參數進一步包含： 該溶離緩衝液之預定義pH值， 該溶離緩衝液穿過該管柱之流動速率； 所施加蛋白質溶液中之該等蛋白質(P1、P2、P3至P6)之化學特性。
  15. 如前述請求項中任一項之方法，其中該層析模擬軟體經組態以使用用於計算該等模擬r及/或計算該目標溶離體積之彙集邊界之數學模型的組合，該等模型包含： 管柱模型(206)，其經組態以使該等蛋白質中之每一者之濃度、該管柱(230)之間隙體積中該溶離緩衝液的鹽濃度及pH值相互關聯；及 孔隙模型(208)，其經組態以使該等蛋白質中之每一者之濃度、該管柱(230)之固定相之孔隙體積中該溶離緩衝液的鹽濃度及pH值相互關聯；及 反應模型(210)，其經組態以使固定相(228)中該等蛋白質中之每一者之濃度、該溶離緩衝鹽濃度及該蛋白質溶液中該等蛋白質中之每一者的化學特性中之至少一些相互關聯。
  16. 一種包含模擬軟體之層析控制系統，該模擬軟體經組態以用於執行獲得包含第一(P1)及第二(P2)目標蛋白之目標溶離體積(238)之彙集邊界的方法，該層析控制系統經組態以用於： 接收最佳化準則且將該最佳化準則輸入至該層析模擬軟體(204)中(106)，該最佳化準則為關於包含於該目標溶離體積中之該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之目標溶離體積的所需特性； 使用該層析模擬軟體計算適於自該層析管柱溶離該第一目標蛋白及該第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合該最佳化準則之目標溶離體積之溶離緩衝鹽濃度(222) (108)，該計算包含計算複數個隨多個不同溶離緩衝鹽濃度而變之層析模擬； 計算該目標溶離體積至少隨所計算之鹽濃度及所輸入之最佳化準則而變之彙集邊界(110)； 輸出所計算之鹽濃度及彙集邊界。
  17. 如請求項16之層析控制系統，該系統進一步經組態以用於： 接收陽離子交換層析管柱(230)之尺寸； 接收該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之量以及視情況選用的該一或多種施加於該管柱上之其他蛋白質之量(105)； 其中該等模擬及/或該等彙集邊界係作為一組至少包含以下之參數值之函數來進行計算： 所提供之陽離子交換層析管柱之尺寸；及 該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之量以及視情況選用的該一或多種施加於該管柱上之其他蛋白質之量。
  18. 如請求項16至17中任一項之層析控制系統， 其中該複數個層析模擬係作為該多個不同溶離緩衝鹽濃度之函數且作為多個不同溶離緩衝液pH值之函數來進行計算，該方法進一步包含： 其中該計算(108)包含計算溶離緩衝鹽濃度(222)及溶離緩衝液pH值之組合，其以組合方式適於自該層析管柱溶離該第一目標蛋白及該第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合該最佳化準則之目標溶離體積； 其中該目標溶離體積之該等彙集邊界的該計算(110)係至少作為該溶離緩衝鹽濃度及該溶離緩衝液pH值之所計算組合以及所輸入之最佳化準則的函數來進行計算；及 其中除所計算之溶離緩衝液(226)以外，輸出所計算之pH值。
  19. 如請求項16至18中任一項之層析控制系統，其中 該層析控制系統經組態以控制緩衝液混合單元，以便自動產生具有所輸出溶離鹽濃度之溶離緩衝液；及/或 該層析控制系統經組態以控制緩衝液混合單元，以便自動產生具有如請求項18組合計算且輸出之鹽濃度及pH值兩者的溶離緩衝液；及/或 該層析控制系統經組態以控制適於自複數種可獲得的具有不同鹽濃度之溶離緩衝液自動選出一者之溶離緩衝液選擇單元，所選溶離緩衝液具有所輸出之鹽濃度；及/或 該層析控制系統經組態以控制適於自複數種可獲得的具有不同鹽濃度及不同pH值之溶離緩衝液自動選出一者之溶離緩衝液選擇單元，所選溶離緩衝液具有如請求項18組合計算且輸出之鹽濃度及pH值兩者；及/或 該層析控制系統經組態以控制經組態以將自動產生或選擇之溶離緩衝液自動施加於該層析管柱上之緩衝液施加單元，所施加之溶離緩衝液具有所輸出之鹽濃度或具有如請求項18組合計算且輸出之鹽濃度及pH值兩者； 該層析控制系統經組態以控制層析系統之溶離體積收集單元，使得所計算之目標溶離體積係根據所計算之彙集邊界自動收集呈單獨溶離份形式。
  20. 一種層析系統，其包含如請求項19之層析控制系統，且進一步包含該緩衝液混合單元及/或該溶離緩衝液選擇單元及/或該緩衝液施加單元及/或該自動化溶離體積收集單元。
  21. 一種電腦程式，其用於管理層析製程以使得獲得包含第一(P1)及第二(P2)目標蛋白之目標溶離體積(238)，該電腦程式包含層析模擬軟體且經組態以用於： 接收最佳化準則(106)，其為關於包含於該目標溶離體積中之第一目標蛋白及第二目標蛋白之目標溶離體積的所需特性； 使用該層析模擬軟體計算適於自該層析管柱溶離該第一目標蛋白及該第二目標蛋白以使得可獲得最佳符合該最佳化準則之目標溶離體積之溶離緩衝鹽濃度(222) (108)，該計算包含計算複數個隨多個不同溶離緩衝鹽濃度而變之層析模擬； 計算該目標溶離體積至少隨所計算之鹽濃度及所輸入之最佳化準則而變之彙集邊界(110)；及 輸出所計算之鹽濃度及/或彙集邊界以供使用者能夠控制層析系統，使得獲得根據該最佳化準則的包含該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之目標溶離體積，及/或使用所計算之鹽濃度及/或彙集邊界以供自動或半自動控制層析系統，使得獲得根據該最佳化準則的包含該第一目標蛋白及該第二目標蛋白之目標溶離體積。
  22. 如請求項21之電腦程式，其進一步經組態以產生用於自動或半自動控制層析系統之一或多個單元的控制命令。
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