TW202128757A - 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白 - Google Patents

具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白

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魯曼那 拉喜德
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Abstract

本發明涉及包含變異體 IL-15 蛋白之融合蛋白、包含變異體抗 PD-1 抗體之融合蛋白以及包含變異體 IL-15 蛋白和變異體抗 PD-1 抗體之融合蛋白。本發明還涉及核酸分子、表現載體、宿主細胞和用於製備該等融合蛋白之方法以及該等融合蛋白在癌症治療中之用途。

Description

具有改善之特性的　PD-1　標靶　IL-15/IL-15Rα　FC　融合蛋白
在癌症免疫治療中，兩種非常有前景的方法包括基於細胞因子的治療以及免疫查核點蛋白諸如 PD-1 的阻斷。
細胞因子諸如 IL-2 和 IL-15 有助於 B 細胞、T 細胞和 NK 細胞的增殖和分化。兩種細胞因子均透過結合由兩種共同受體 (共同 γ 鏈 (γc；CD132) 和 IL-2 受體 ß 鏈 (IL-2Rß；CD122)) 以及每種細胞因子所特有的 α 鏈受體 (IL-2 受體 α (IL-2Rα；CD25) 或 IL-15 受體 α (IL-15Rα；CD215)) 組成的三聚體複合物發揮其細胞訊號傳遞功能。兩種細胞因子均被視為腫瘤學中潛在的有價值的治療劑，並且 IL-2 已被批准用於治療轉移性腎細胞癌和惡性黑色素瘤患者。目前，儘管多項臨床試驗正在進行中，但尚未批准使用重組 IL-15。但是，作為潛在藥物，兩種細胞因子均受累於非常快的清除率，其半衰期以分鐘為單位。大劑量使用 IL-2 免疫療法以解決快速清除問題時，引起全身毒性。在最近的臨床試驗中，也記述了有關 IL-15 免疫療法的該等全身毒性 (Guo 等人，J Immunol，2015，195(5): 2353-64)。
在 T 細胞活化後，免疫查核點蛋白諸如 PD-1 被上調，從而透過與免疫查核點配體諸如 PD-L1 結合而耗盡活化 T 細胞，從而阻止自身免疫。但是，免疫查核點蛋白在腫瘤浸潤淋巴細胞 (TIL) 中也發生上調，並且免疫查核點配體在腫瘤細胞上過度表達，從而促進了腫瘤細胞的免疫逃逸。研究證明，透過藥物 Opdivo® (納武利尤單抗) 和 Keytruda® (帕博利珠單抗) 阻斷免疫查核點交互作用以消除 TIL 之抑制，可有效治療癌症。儘管查核點阻斷療法諸如納武利尤單抗和帕博利珠單抗具有良好的前景，但許多患者仍然無法對單獨查核點阻斷實現足夠的反應。
因此，在腫瘤治療中仍然需要包含細胞因子的治療策略，其無需大劑量投予並且具有抗腫瘤作用，可避免全身毒性。此外，還需要鑑定其他與查核點阻斷相結合的治療方式，以提高患者緩解率。這點可能特別複雜，因為其他治療方式不應與查核點阻斷劑發生競爭。本發明藉由提供 PD-1 標靶 IL-15 融合蛋白解決了這些需求和警告，這些融合蛋白具有延長之半衰期並以更高的選擇性標靶 TIL 以改善安全性特徵，並且它們不與可能結合在一起的查核點阻斷劑抗體發生競爭。
本發明之第一方面提供了標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白。在一些實施例中，該標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白包含：a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含：i) IL-15/Rα sushi 結構域；ii) 第一結構域連接子；iii) IL-15 結構域；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域；以及 c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL；其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域 (ABD)，其中，相比於 SEQ ID NO:5，根據 Kabat 編號，所述 VH 為包含 F32L/W100F 胺基酸取代之變異體重鏈變異域；並且其中，相比於 SEQ ID NO:168，根據 Kabat 編號，所述 VL 為包含 N27dH/K30Y/S93T 之變異體輕鏈變異域。
在一些實施例中，所述 VH 包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述 VL 包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-15 結構域為變異體 IL-15 結構域，其包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：D30N/E64Q/N65D、N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。在一些實施例中，IL-15 結構域為變異體 IL-15 結構域，其包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A 或其組合。在一些實施例中，IL-15 結構域為變異體 IL-15 結構域，其包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q。
本發明之第二方面提供了一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，該融合蛋白包含：a) 第一單體，其包含：i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白；ii) 第一結構域連接子；iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域；c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL；其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域 (ABD)。
在一些實施例中，VH 包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，並且 VL 包含 SEQ ID NO:168 之胺基酸序列。在一些實施例中，VH 包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且 VL 包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。在一些實施例中，ABD 不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1。
本發明之第三方面提供了一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，該融合蛋白包含：a) 第一單體，其包含：i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白；ii) 第一結構域連接子；iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域；c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL；其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域 (ABD)，其中，相比於 SEQ ID NO:5，根據 Kabat 編號，所述 VH 為包含 F32L/W100F 胺基酸取代之變異體重鏈變異域；並且其中，相比於 SEQ ID NO:168，根據 Kabat 編號，所述 VL 為包含 N27dH/K30Y/S93T 之變異體輕鏈變異域。
在一些實施例中，VH 包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且 VL 包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。
本發明之第四方面提供了一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，該融合蛋白包含：a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含：i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白；ii) 第一結構域連接子；iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域；c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL；其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域；其中，根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:5，所述 VH 為包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代的變異體重鏈變異域：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；其中，所述 VL 結構域選自由以下各項所組成之群組：i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W；其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。
本發明之第五方面提供了一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，該融合蛋白包含：a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含：      i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白；ii) 第一結構域連接子；iii) 變異體 IL-15 蛋白；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域；c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL；其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域；其中，根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:5，所述 VH 為包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代的變異體重鏈變異域：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；其中，所述 VL 結構域選自由以下各項所組成之群組: i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W。
本發明之第六方面提供了一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，該融合蛋白包含：a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含：i) IL-15 Rα 壽司結構域蛋白；ii) 第一結構域連接子；iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域；c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL；其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域，並且不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1。
本發明之第七方面提供了一種組成物，該組成物包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD)，該抗 PD-1 抗原結合結構域包含：a) 變異體重鏈變異域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:5，包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；以及 b) 輕鏈變異域，其選自由以下各項所組成之群組：i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W；其中，所述 ABD 與人 PD-1 結合。
本發明之第八方面提供了一種組成物，該組成物相比於 SEQ ID NO:2，包含變異體 IL-15 蛋白；所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A。
本發明之第九方面提供了異二聚體蛋白，該異二聚體蛋白包含：a) 第一融合蛋白，該第一融合蛋白包含：i) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q；ii) 結構域連接子；及 iii) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二融合蛋白，該第二融合蛋白包含：i) IL-15Rα sushi 結構域；ii) 結構域連接子；及 iii) 第二變異體 Fc 結構域。
本發明之附加方面提供了核酸分子、表現載體、宿主細胞以及用於表現本發明之融合蛋白的方法。
本發明之另一些方面提供了包含融合蛋白之醫藥組成物、包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 之組成物、包含變異體 IL-15 蛋白之組成物及本發明之異二聚體蛋白以及透過投予該等融合蛋白、包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 之組成物、包含變異體 IL-15 蛋白之組成物及異二聚體蛋白來治療癌症的方法。其他方面提供了融合蛋白、包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 之組成物、包含變異體 IL-15 蛋白之組成物及本發明之異二聚體蛋白用於生產供治療癌症之藥物之用途，以及在治療癌症中使用的融合蛋白、包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 之組成物、包含變異體 IL-15 蛋白之組成物及本發明之異二聚體蛋白。
I. 命名法
本發明之異二聚體融合蛋白以若干不同形式列出。每種多肽具有唯一的「XENP」編號，儘管在本領域中可以理解，較長的序列可包含較短的序列。例如，包含用於抗 PD-1 的單體的重鏈 (參見例如圖 28C) 將具有第一 XENP 編號，而 VH 和 VL 結構域可具有不同的 XENP 編號。一些分子具有三個多肽，因此將 XENP 編號及其成分用作名稱。因此，「scIL-15/Rα X Fab」中的分子 XENP29484 包含三個序列，通常稱為「XENP29484 鏈 1」、「XENP29484 鏈 2」和「XENP29484 鏈 3」或等同形式，儘管本領域的技術人員將能夠透過序列比對輕鬆識別這些序列。這些 XENP 編號用於序列表和標識符中，並在附圖中使用。此外，一種包含三種成分的分子產生多個序列標識符。例如，Fab 單體列表具有全長序列、變異重鏈序列和變異重鏈序列的三個 CDR；輕鏈具有全長序列、變異輕鏈序列和變異輕鏈序列的三個 CDR 序列；並且 scFv-Fc 結構域具有全長序列、scFv 序列、變異輕鏈序列、3 個輕鏈 CDR、scFv 連接子、變異重鏈序列和 3 個重鏈 CDR；請注意，本文中包含 scFv 結構域的所有分子均使用單個帶電荷的 scFv 連接子 (+H)，但也可以使用其他連接子。此外，特定變異域的命名法使用「Hx.xx_Ly.yy」類型的形式，其中數字是特定變異鏈序列的唯一標識符。因此，XENP30486 (與 PD-1 結合) 的 Fab 側的變異域為「H1.132」，表示其使用的是重鏈變異域 H1.132，而在 XENP30486 中，它與輕鏈結構域 L1.135 結合。因此，名稱「mAbC[PD-1]_ H1.132_L1.135」表示重鏈變異域 H1.132 與輕鏈結構域 L1.134 結合。在這些序列組合成 scFv 的情況下，該名稱表示 scFv 處於從 N 端到 C 端的 VH-連接子-VL 方向上。該分子具有相同的重鏈和輕鏈變異域序列，但順序相反，將稱為「mAbC[PD-1]_ L1.135_H1.132」。同樣，從序列表和附圖中可以明顯看出，不同構建體可「混合並匹配」重鏈和輕鏈。
II. 定義
為更完整地理解本申請，下面列出了若干定義。該等定義意在包含語法上的等同內容。
本文所用之「消融」係指活性的降低或消除。因此，例如，「消融 FcγR 結合」係指相比於不包含特定變異體的 Fc 區域，該 Fc 區域胺基酸變異體具有小於 50% 的起始結合度，其中大於 70-80-90-95-98% 活性喪失是較佳的，並且一般而言，活性應低於 Biacore 測定中可檢出之結合水準。FcγR 結合的消融特別有用，如圖 6 所示。然而，除非另有說明，否則本發明之 Fc 受體保持與 FcRn 受體的結合。
本文所用之「ADCC」或「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」係指細胞介導之反應，其中，表現 FcγR 的非特異性細胞毒性細胞識別標靶細胞上結合之抗體，隨後引起標靶細胞溶解。ADCC 與 FcγRIIIa 的結合相關；與 FcγRIIIa 的結合增加導致 ADCC 活性升高。如本文所述，本發明之許多實施例完全消除 ADCC 活性。
本文所用之「ADCP」或「抗體依賴性細胞介導之吞噬作用」係指細胞介導之反應，其中，表現 FcγR 的非特異性細胞毒性細胞識別標靶細胞上結合之抗體，隨後引起標靶細胞的吞噬作用。
本文所用之「抗原結合結構域」或「ABD」係指一組六個互補決定區 (C omplementaryD eterminingR egion, CDR)，當它們作為多肽序列的一部分存在時，可特異性地結合本文所述之靶抗原。因此，「PD-1 抗原結合結構域」結合如本文所概述之人 PD-1 抗原。如本領域中已知的，這些 CDR 通常以第一組變異重鏈 CDR (vhCDR 或 VH CDR) 和第二組變異輕鏈 CDR (vlCDR 或 VL CDR) 的形式存在，其各自包含重鏈的三個 CDR：vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3 以及輕鏈的三個 CDR：vlCDR1、vlCDR2 和 vlCDR3。CDR 分別存在於重鏈變異域和輕鏈變異域中，並共同形成 Fv 區域。因此，在一些情況下，抗原結合結構域的六個 CDR 由變異重鏈和變異輕鏈貢獻。在「Fab」形式中，由 6 個 CDR 組成組由兩個不同的多肽序列貢獻：重鏈變異域 (vh 或 VH ；包含 vhCDR1、vhCDR2 和 vhCDR3) 和輕鏈變異域 (vl 或 VL ；包含 vlCDR1、vlCDR2 和 vlCDR3)，其中 vh 結構域的 C 端連接至重鏈 CH1 結構域的 N 端，而 vl 結構域的 C 端連接至輕鏈恒定域的 N 端 (並由此形成輕鏈)。在 scFv 形式中，通常透過使用本文所概述之連接子將 VH 和 VL 結構域共價連接至單個多肽序列中，該多肽序列可為 (從 N 端開始) vh-連接子-vl 或 vl-連接子-vh。
高度變異區通常包含輕鏈變異區中的大約胺基酸殘基 24-34 (LCDR1；「L」表示輕鏈)、50-56 (LCDR2) 和 89-97 (LCDR3) 以及重鏈變異區中的大約胺基酸殘基 31-35B (HCDR1；「H」表示重鏈)、50-65 (HCDR2) 和 95-102 (HCDR3)；Kabat 等人 SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST 第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991) 及/或形成輕鏈變異區中的高度變異環的那些殘基 (例如殘基 26-32 (LCDR1)、50-52 (LCDR2) 和 91-96 (LCDR3)) 以及形成重鏈變異區中的高度變異環的那些殘基 (例如殘基 26-32 (HCDR1)、53-55 (HCDR2) 和 96-101 (HCDR3))；Chothia 和 Lesk (1987) J. Mol.Biol.196: 901-917。本發明之特定 CDR 所下文所述。
如本領域的技術人員所認識到的，CDR 的確切編號和位置在不同的編號系統中可能有所不同。但是，應當理解，變異重鏈和/或變異輕鏈序列的公開包括相關的 (固有的) CDR 的公開。因此，每個重鏈變異區的公開為 vhCDR (例如 vhCDR1、vhCDR2 和 vhCDR3) 的公開，並且每個變異輕區的公開為 vlCDR (例如 vlCDR1、vlCDR2 和 vlCDR3) 的公開。
有關 CDR 編號的有用的比較如下所示，參見 Lafranc 等人，Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77 (2003):
表 1
   Kabat+ Chothia IMGT Kabat AbM Chothia 接觸 位置
vhCDR1 26-35 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35 27-35
vhCDR2 50-65 56-65 50-65 50-58 52-56 47-58 54-61
vhCDR3 95-102 105-117 95-102 95-102 95-102 93-101 103-116
vlCDR1 24-34 27-38 24-34 24-34 24-34 30-36 27-38
vlCDR2 50-56 56-65 50-56 50-56 50-56 46-55 56-62
vlCDR3 89-97 105-117 89-97 89-97 89-97 89-96 97-105
在本說明書全文中，當提及變異域中的殘基 (大約為輕鏈變異區的殘基 1-107 和重鏈變異區的殘基 1-113) 時，通常使用 Kabat 編號系統，並且當提及 Fc 區域時，通常 EU 編號系統 (例如，Kabat 等人，同上 (1991))。
本發明提供了大量不同的 CDR 組。在這種情況下，「完整 CDR 組」包含三個變異輕鏈 CDR 和三個變異重鏈 CDR，例如 vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2 和 vhCDR3。它們可分別為較大的輕鏈變異域或重鏈變異域的一部分。此外，如本文所更全面地概述的，當使用重鏈和輕鏈時 (例如，當使用 Fab 時)，重鏈變異域和輕鏈變異域可在單獨的多肽鏈上，或者在 scFv 序列的情況下，可在單個多肽鏈上。
CDR 有助於形成抗原結合，或更具體地，有助於形成抗體的表位結合位點。「表位」係指與抗體分子變異區中的特定抗原結合位點 (稱為互補位) 交互作用的決定簇。表位為分子群組諸如胺基酸或糖側鏈，並且通常具有特定的結構特徵以及特定的電荷特徵。單個抗原可具有多個表位。
表位可包含直接參與結合的胺基酸殘基 (也稱為表位的免疫顯性成分) 和不直接參與結合的其他胺基酸殘基，例如被特異性抗原結合肽有效阻斷的胺基酸殘基；換言之，胺基酸殘基在特異性抗原結合肽的覆蓋範圍內。
表位可為構象表位或線性表位。構象表位由線性多肽鏈的不同片段在空間上並置的胺基酸形成。線性表位由多肽鏈中相鄰的胺基酸殘基形成。構象表位與非構象表位的區別在於，在存在變性溶劑的情況下，失去與前者的結合，而不失去與後者的結合。
一個表位通常包含至少 3 個且更常見地包含至少 5 個或 8~10 個獨特空間構型的胺基酸。識別相同表位的抗體可透過簡單的免疫測定法進行驗證，該測定法顯示一種抗體能夠阻斷另一種抗體與靶抗原結合的能力，例如「聚類」。如下文所概述，本發明不僅包括本文所列舉之抗原結合結構域和抗體，而且包括與列舉之抗原結合結構域結合之表位競爭結合的那些 (或在 NC[PD-1] Fv 的情況下，本發明之抗 PD-1 CDR 不與所列舉之抗體競爭結合相同的表位)。
就本發明中所用之抗體及其成分而言，每條鏈的羧基末端部分定義主要負責效應子功能的恒定區。Kabat 等人收集了重鏈和輕鏈變異區的許多主要序列。基於序列的保守程度，他們將單個主要序列分為 CDR 和構架，並製作了它們的列表 (參見 SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第 5 版，NIH publication，No. 91-3242，E.A.Kabat 等人，其全文以引用方式併入本文)。
在免疫球蛋白的 IgG 亞類中，重鏈中存在若干免疫球蛋白的結構域。本文所用之「免疫球蛋白 (Ig) 結構域」係指具有不同三級結構的免疫球蛋白區域。本發明中關注的是重鏈結構域，其包括重鏈恒定 (CH) 域和鉸鏈結構域。在 IgG 抗體的語境下，IgG 同型各自具有三個 CH 區域。因此，在 IgG 抗體的語境下，「CH」結構域如下：「CH1」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 118-220。「CH2」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 237-340，並且「CH3」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 341-447。如本文所示和下文所述，pI 變異體可在一個或多個 CH 區域以及鉸鏈區中，如下文所述。
重鏈的另一種 Ig 結構域為鉸鏈區。本文所用之「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「抗體鉸鏈區」或「免疫球蛋白鉸鏈區」係指柔性多肽，其包含抗體的第一恒定域和第二恒定域之間的胺基酸。在結構上，IgG CH1 結構域終止於 EU 位置 215 處，而 IgG CH2 結構域則起始於殘基 EU 位置 231。因此，對於 IgG，抗體鉸鏈在本文中定義為包括位置 216 (IgG1 中的 E216) 至 230 (IgG1 中的 P230)，其中，編號根據如 Kabat 所述之 EU 指數進行。在一些實施例中，例如在 Fc 區域的語境下，包括下鉸鏈，其中「下鉸鏈」的起始位置通常係指位置 226。如本文所指出的，pI 變異體也可以在鉸鏈區中製得。
如本領域的技術人員所認識到的，重鏈恒定區的確切編號和位置在不同的編號系統中可能有所不同。根據 EU 和 Kabat 得到的重鏈恒定編號的有用的比較如下所示，參見 Edelman 等人 (1969，Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85) 和 Kabat 等人 (1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，United States Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda)，這兩篇文獻全文以引用方式併入本文。
表 2
   EU 編號 Kabat 編號
CH1 118-215 114-223
鉸鏈 216-230 226-243
CH2 231-340 244-360
CH3 341-447 361-478
輕鏈通常包含兩個結構域，即輕鏈變異域 (包含輕鏈 CDR，並與重鏈變異域一起形成 Fv 區域) 和輕鏈恒定區 (通常稱為 CL 或 Cκ)。
本文所概述之另一個額外的目標取代區域是 Fc 區域。
因此，本發明提供了不同的蛋白結構域。如本文所述及本領域中已知的，本發明之異二聚體蛋白在重鏈和輕鏈內包含不同的結構域，這些結構域也可能發生重疊。這些結構域包括但不限於：Fc 結構域、CH1 結構域、CH2 結構域、CH3 結構域、鉸鏈結構域、重鏈恒定域 (CH1-鉸鏈-Fc 結構域或 CH1-鉸鏈-CH2-CH3)、重鏈變異域、輕鏈變異域、輕鏈恒定域、Fab 結構域和 scFv 結構域。
如本文所用之「Fc」或「Fc 區域」或「Fc 結構域」係指多肽包含抗體的恒定區的多肽，其排除第一恒定區免疫球蛋白結構域 (例如 CH1) 並且在一些情況下排除鉸鏈的一部分。對於 IgG，Fc 結構域包含免疫球蛋白結構域 CH2 和 CH3 (Cγ2 和 Cγ3) 以及介於 CH1 (Cγ1) 和 CH2 (Cγ2) 之間的鉸鏈區。儘管 Fc 區域的邊界可能有所不同，但人 IgG 重鏈 Fc 區域通常被定義為在其羧基端包含殘基 C226 或 P230，其中，編號根據如 Kabat 所述之 EU 指數進行。因此，在 IgG 抗體的語境下，「CH」結構域如下：「CH1」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 118-215。「鉸鏈」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 216-230。「CH2」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 231-340，並且「CH3」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 341-447。因此，「Fc結構域」包括 -CH2-CH3 結構域，並且任選包括鉸鏈結構域 (鉸鏈-CH2-CH3)。
因此，「Fc 結構域」包括 -CH2-CH3 結構域，並且任選包括鉸鏈結構域，其在許多情況下用作結構域連接子。在本文的實施例中，當 scFv 連接至 Fc 結構域時，scFv 構建體的 C 端連接至 Fc 結構域的全部或部分鉸鏈；例如，其通常連接至序列 EPKS (SEQ ID NO: 9)，其為鉸鏈開端。相似地，當 Il-15 成分 (無論是 Il-15 複合物、Il-15 結構域還是 IL-15Rα 結構域) 連接至 Fc 結構域時，其通常類似地連接至 Fc 結構域的全部或部分 (作為結構域連接子)；例如，其通常連接至序列 EPKS (SEQ ID NO: 9)，其為鉸鏈開端。
本發明涉及通常基於 IgG 類的 Fc 結構域，其具有若干亞類，包括但不限於 IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4。一般而言，IgG1、IgG2 和 IgG4 比 IgG3 更常使用。應當指出，IgG1 具有不同的異型，在 356 (D 或 E) 和 358 (L 或 M) 具有多型性。本文所示之序列使用 356E/358M 異型，但其他異型也包括在本文中。亦即，本文所包括的帶有 IgG1 Fc 結構域的任何序列均可具有取代 356E/358M 異型的 356D/358L。
此外，本文中的許多序列在位置 220 處至少有一個半胱胺酸被絲胺酸取代；對於本文所示之大多數序列，其通常在「scFv 單體」或「IL-15 複合物」一側，但它也可以在「Fab 單體」一側或同時在兩側，以減少二硫化物形成。本文的序列中具體包括被取代的這些半胱胺酸中的一個或兩個 (C220S)。
本文所用之「重鏈」或「重鏈結構域」係指從 N 端到 C 端的 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 結構域 (其中，CH2-CH3 包含 Fc 結構域)。重鏈包含重鏈變異域和恒定域，其包括 CH1-任選鉸鏈-Fc 結構域 (包含 CH2-CH3)。輕鏈包含輕鏈變異域和輕鏈恒定域 (VL-CL)。
本文所用之「修飾」係指在多肽序列中胺基酸取代、插入及/或缺失或化學連接至蛋白質的部分的改變。例如，修飾可為連接至蛋白質的改變的碳水化合物或 PEG 結構。本文所用之「胺基酸修飾」係指多肽序列中的胺基酸取代、插入及/或缺失。為清楚起見，除非另有說明，否則胺基酸修飾始終針對由 DNA 編碼的胺基酸，例如 DNA 和 RNA 中具有密碼子的 20 種胺基酸。
本文所用之「胺基酸取代」或「取代」係指用不同胺基酸取代親本多肽序列中特定位置的胺基酸。具體地，在某些實施例中，取代涉及在特定位置並非天然存在或並非天然存在於生物體內或任何生物中的胺基酸。例如，取代 E272Y 或 272Y 係指變異體多肽，在本例中為 Fc 變異體，其中位置 272 處的麩胺酸被酪胺酸取代。為清楚起見，經改造以改變核酸編碼序列但不改變起始胺基酸 (例如 CGG (編碼精胺酸) 交換為 CGA (仍編碼精胺酸) 以增加宿主生物表現水準) 的蛋白質並非「胺基酸取代」；亦即，儘管創建了編碼相同蛋白質的新基因，但是如果該蛋白質在其起始位置的特定位置具有相同的胺基酸，則它並非胺基酸取代。
本文所用之「胺基酸插入」或「插入」係指在親本多肽序列的特定位置添加胺基酸序列。例如，-233E 或 233E 表示位置 233 之後和位置 234 之前插入麩胺酸。此外，-233ADE 或 A233ADE 表示在位置 233 之後和位置 234 之前插入 AlaAspGlu。
如本文所用之「胺基酸缺失」或「缺失」係指去除親本多肽序列中特定位置的胺基酸殘基或序列。例如，E233-、E233#、E233()、E233_ 或 E233del 表示在位置 233 處缺失麩胺酸。此外，EDA233- 或 EDA233# 表示從位置 233 開始缺失序列 GluAspAla。
如本文所用之「變異體蛋白」或「蛋白變異體」或「變異體」係指由於至少一種胺基酸修飾而不同於親本蛋白質的蛋白質。蛋白變異體可以指蛋白質本身、包含蛋白質的組成物或編碼該蛋白質的胺基序列。優選地，蛋白變異體相比於親本蛋白質具有至少一個胺基酸修飾，例如，親本相比，具有約 1 至約 70 個胺基酸修飾，優選約 1 至約 5 個胺基酸修飾。如下文所述，在一些實施例中，親本多肽 (例如 Fc 親本多肽) 為人野生型序列，例如來自 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 的 Fc 區域。本文所述之蛋白變異體序列優選與親本蛋白質序列具有至少約 80% 的同一性，並且最優選具有至少約 90% 的同一性，更優選具有至少約 95-98-99% 的同一性。變異體蛋白可以指變異體蛋白本身、包含蛋白變異體的組成物或編碼該蛋白變異體的 DNA 序列。
因此，如本文所用之「Fc 變異體」或「變異體 Fc」係指包含 Fc 結構域中的胺基酸修飾的蛋白質。本發明之 Fc 變異體根據構成它們的胺基酸修飾來定義。因此，例如，N434S 或 434S 是一個相對於親本 Fc 多肽在位置 434 處具有取代絲胺酸的 Fc 變異體，其中，根據 EU 指數進行編號。同樣，M428L/N434S 定義了相對於親本 Fc 多肽的取代 M428L 和 N434S 的 Fc 變異體。WT 胺基酸的特性可能不確定，在這種情況下，上述變異體稱為 428L/434S。注意，本文所提供之取代基順序為任意的，也就是說，例如，M428L/N434S 是與 N434S/M428L 相同的 Fc 變異體，以此類推。對於本發明中所述之與抗體有關的所有位置，除非另有說明，否則胺基酸位置編號根據 EU 指數進行。EU 指數或如 Kabat 所述之 EU 指數或 EU 編號方案係指 EU 抗體的編號 (Edelman 等人，1969，Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85，該文獻全文以引用方式併入本文)。修飾可為添加、缺失或取代。取代可包括天然存在的胺基酸，並且在一些情況下包括合成胺基酸。實例包括美國專利第 6,586,207 號；WO 98/48032；WO 03/073238；US2004/0214988A1；WO 05/35727A2；WO 05/74524A2；J. W. Chin 等人 (2002)，Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027；J. W. Chin 和 P. G. Schultz (2002)，ChemBioChem 11: 1135-1137；J. W. Chin 等人 (2002)，PICAS United States of America 99: 11020-11024；以及 L. Wang 和 P. G. Schultz (2002)，Chem.1-10，所有均全文以引用方式併入。
如本文所用之「蛋白質」係指至少兩個共價連接的胺基酸，其包括蛋白質、多肽、寡肽和肽。如本文所用之「殘基」係指蛋白質中的位置及其相關的胺基酸特性。例如，天冬醯胺酸 297 (也稱為 Asn297 或 N297) 為人抗體 IgG1 中位置 297 處的殘基。
如本文所用之「Fab」或「Fab 區域」係指包含 VH、CH1、VL 和 CL 免疫球蛋白結構域的多肽。Fab 可以單獨指該區域，也可以指全長抗體、抗體片段或 Fab 融合蛋白。
如本文所用之「Fv」或「Fv 片段」或「Fv 區域」係指包含單個抗體的 VL 和 VH 結構域並形成 ABD 的多肽。如本領域的技術人員所認識到的，它們通常由兩條鏈組成，或者可組合 (通常與此處所討論的連接子一起使用) 以形成 scFv。
本文所用之「單鏈 Fv」或「scFv」係指通常使用如本文所述之 scFv 連接子共價連接至輕鏈變異域的重鏈變異域，以形成 scFv 或 scFv 結構域。scFv 結構域的方向可為從 N 端到 C 端 (vh-連接子-vl 或 vl-連接子-vh)。
如本文所用之「IgG 亞類修飾」或「同型修飾」係指胺基酸修飾，其將一種 IgG 同型的一個胺基酸轉化為不同的匹配的 IgG 同型的對應的胺基酸。例如，由於 IgG1 在 EU 位置 296 處包含酪胺酸，並且 IgG2 在該位置處包含苯丙胺酸，因此 IgG2 中的 F296Y 取代被視為 IgG 亞類修飾。
因此，如本文所用之「同型」係指由其恒定區的化學和抗原特性所定義之免疫球蛋白的任何亞類。應當理解，治療性抗體也可以包含同型及/或亞類的雜合體。
如本文所用之「變異區」係指免疫球蛋白的區域，該區域包含基本上由分別組成 κ、λ 和重鏈免疫球蛋白基因座的任何 Vκ、Vλ 及/或 VH 基因編碼的一個或多個 Ig 結構域。關於本發明之重鏈變異域和輕鏈變異域，每個重鏈和輕鏈抗體的胺基末端部分包括約 100 至 110 個或更多個主要用於抗原識別的胺基酸的變異區，其在本領域及本文中通常稱為「Fv 結構域」或「Fv 區域」。在變異區中，重鏈和輕鏈的每個 V 結構域都聚集了三個環，形成抗原結合位點。每個環稱為互補決定區 (以下稱為「CDR」)，其中胺基酸序列的變化最為明顯。「變異」係指變異區之某些片段在抗體之間的序列中存在很大差異之事實。變異區內的變化並非均勻分佈。相反，V 區域由相對不變的、由 15~30 個胺基酸組成的骨架區 (FR) 的區段組成，這些骨架區由變化極大的較短區域隔開，這些較短的區域稱為“高度變異區”，其各自包含 9~15 個或更多胺基酸。
每個 VH 和 VL 由三個 CDR 和四個骨架區 (FR) 組成，按照以下順序從胺基端到羧基端排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因此，重鏈變異域包含 VHFR1-VHCDR1-VHFR2-VHCDR2-VHFR3-VHCDR3-VHFR4，並且輕鏈變異域包含 VLFR1-VLCDR1-VLFR2-VLCDR2-VLFR3-VLCDR3-VLFR4。
本文所用之「非天然存在的修飾」係指並非同型的胺基酸修飾。例如，由於任何 IgG 在位置 434 處均不含絲胺酸，因此 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 (或其混合體) 中的 434S 取代基被視為非天然修飾。
如本文所用之「胺基酸」和「胺基酸特性」係指由 DNA 和 RNA 編碼的 20 種天然存在的胺基酸之一。
如本文所用之「效應子功能」係指由抗體 Fc 區域與 Fc 受體或配體交互作用而引起的生化事件。效應子功能包括但不限於 ADCC、ADCP 和 CDC。
如本文所用之「Fcγ 受體」、「FcγR」或「FcgammaR」係指結合 IgG 抗體 Fc 區域並由 FcγR 基因編碼的蛋白質家族的任何成員。在人體中，該蛋白質家族包括但不限於 FcγRI (CD64)，其包括同功型 FcγRIa、FcγRIb 和 FcγRIc；FcγRII (CD32)，其包括同功型 FcγRIIa (包括異型 H131 和 R131)、FcγRIIb (包括 FcγRIIb-1 和 FcγRIIb-2) 和 FcγRIIc；以及 FcγRIII (CD16)，其包括同功型 FcγRIIIa (包括異型 V158 和 F158) 和 FcγRIIIb (包括異型 FcγRIIb-NA1 和 FcγRIIb-NA2) (Jefferis 等人，2002，Immunol Lett 82: 57-65，該文獻全文以引用方式併入本文) 以及任何未發現的人 FcγR 或 FcγR 同功型或異型。
如本文所用之「FcRn」或「新生 Fc 受體」係指結合 IgG 抗體 Fc 區域並至少部分由 FcRn 基因編碼的蛋白質。如本領域中已知的，功能 FcRn 蛋白包含兩個多肽，通常稱為重鏈和輕鏈。輕鏈為 β-2-微球蛋白，並且重鏈由 FcRn 基因編碼。除非本文另有說明，否則 FcRn 或 FcRn 蛋白質係指 FcRn 重鏈與 β-2-微球蛋白的複合物。可使用各種 FcRn 變異體以增加與 FcRn 受體的結合，並且在一些情況下，可延長血清半衰期。通常，除非另有說明，否則本發明之 Fc 受體保持與 FcRn 受體的結合 (並且，如下文所述，可包括胺基酸變異體以增加與 FcRn 受體之結合)。
如本文所用之「親本多肽」係指初始多肽，其隨後被修飾以生成變異體。親本多肽可以為天然存在的多肽，也可以是天然多肽的變異體或經改造之形式。親本多肽可以指多肽本身、構成該親本多肽的組成物或編碼該親本多肽的胺基酸序列。
本文所用之「重鏈恒定區」係指抗體的 CH1-鉸鏈-CH2-CH3 部分。
本文所用之「Fc 融合蛋白」或「免疫黏附素」係指包含通常連接 (任選地透過如本文所述之連接子部分連接) 至不同蛋白質諸如本文所述之 IL-15 及/或 IL-15R 的 Fc 區域。在一些實例中，兩個 Fc 融合蛋白可形成同源二聚 Fc 融合蛋白或異二聚體 Fc 融合蛋白，其中後者較佳。在一些情況下，異二聚體 Fc 融合蛋白的一個單體僅包含 Fc 結構域 (例如，空 Fc 結構域)，並且另一個單體為 Fc 融合蛋白，其包含變異體 Fc 結構域和蛋白結構域，諸如 IL-15 複合物。如本文所概述，異二聚體蛋白的一個單體為包含 IL-15 複合物的 Fc 融合蛋白，並且另一個單體為傳統重鏈 (具有相關的輕鏈)。
如本文所用之「位置」係指蛋白質序列中的位置。位置可以按順序編號，也可以根據既定格式 (例如用於抗體編號的 EU 指數) 編號。
在本文所公開之本發明的異二聚體抗體單體的語境下中，「鏈型」係指類似於「匹配」的兩條 DNA 鏈，異二聚化變異體結合到每條單體中，從而保持「匹配」以形成異二聚體的能力。例如，如果將某些 pI 變異體改造為單體 A (例如，提高 pI)，則可以利用的「電荷對」空間變異體也不干擾 pI 變異體，例如提高 pI 的電荷變異體置於相同的「鏈」或「單體」上以保留兩種功能。相似地，對於成對「偏斜」變異體，如下文更全面地概述，本領域的技術人員將在確定結合成對的鏈或單體進入哪個鏈時考慮 pI，使得使用 pI 偏斜變異體的 pI 也使分離最大化。
如本文所用之「標靶細胞」係指表現靶抗原的細胞，在本例中為 PD-1 及/或 IL-15 受體。
本文所用之「野生型或 WT」係指存在於自然界的胺基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因變異。WT 蛋白具有未經故意修飾的胺基酸序列或核苷酸序列。
本發明的雙特異性異二聚體蛋白通常為經單離之蛋白或重組蛋白。當用於描述本文所公開之各種多肽時，「單離」係指已經從表現它的細胞或細胞培養物中鑑定、分離及/或回收之多肽。通常，單離多肽將透過至少一個純化步驟來製備。「經單離之蛋白質」係指基本上不含具有不同結合特異性的其他蛋白質的蛋白質。「重組」係指使用重組核酸技術在外源宿主細胞中生成的蛋白質。
相對於蛋白質序列所述之「百分比 (%) 胺基酸殘基同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與特定 (親本) 序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸百分比序列同一性之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可取得的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR) 軟體。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可確定用於測量比對的合適參數，包括在所比較之序列全長上達成最大比對所需之任何演算法。一種特定程式為 ALIGN-2 程式，其概述於美國專利公開第 20160244525 號第 [0279] 至 [0280] 段，該專利公開以引用方式併入本文。
本發明之胺基酸序列 (「發明序列」) 與親本胺基酸序列之間的同一性程度按兩個序列比對中的精確匹配數除以「發明序列」的長度或親本序列的長度 (以最短者為準) 計算。結果以同一性百分比表示。
在一些實施例中，兩個或更多個胺基酸序列為至少 50%、60%、70%、80% 或 90% 相同。在一些實施例中，兩個或更多個胺基酸序列為至少 95%、97%、98%、99% 或甚至 100% 相同。
「特異性結合」或「與……特異性結合」或「特異於」特定抗原或表位 (在本例中為人 PD-1) 係指與非特異性交互作用明顯不同的結合。可以例如透過相比於對照分子的結合確定分子的結合來測量特異性結合，該對照分子通常是不具有結合活性的相似結構的分子。例如，可以透過與類似於靶點的對照分子競爭來確定特異性結合。
與特定抗原或表位的特異性結合可表現為例如 ABD 對抗原或表位的 KD 為至少約 10-4 M、至少約 10-5 M、至少約 10-6 M、至少約 10-7 M、至少約 10-8 M、至少約 10-9 M 或者至少約 10-10 M、至少約 10-11 M、至少約 10-12 M 或更大，其中 KD 係指特定 ABD-抗原交互作用的解離速率。通常，特異性結合抗原的 ABD 所具有的 KD 相比於對照分子對抗原分子或表位的 KD 提高 20、50、100、500、1000、5,000、10,000 倍或更多倍。
另外，與特定抗原或表位的特異性結合可表現為例如抗體對抗原或表位所具有的 KA 或 Ka 相比於對照對表位的 KA 或 Ka 提高 20、50、100、500、1000、5,000、10,000 倍，其中 KA 或 Ka 係指特定抗體-抗原交互作用的結合速率。結合親和力通常使用基於表面電漿共振 (SPR) 的測定 (例如 Biacore) 或基於生物膜干涉技術 (BLI) 的測定 (例如 Octet) 進行測量。
III. 簡介
本發明的一些方面提供了可與查核點抑制劑 PD-1 抗原結合並且可與常見的 γ鏈 (γc；CD132) 及/或 IL-2 受體 β-鏈 (IL-2Rβ；CD122) 複合 (由於存在 IL-15 複合物) 的標靶異二聚體融合蛋白。通常，本發明之異二聚體融合蛋白具有三個功能成分：IL-15/IL-15Rα(sushi) 成分，在本文中通常稱為「IL-15 複合物」或「IL-15/Rα 複合物」；抗 PD-1 成分，其用作「標靶」部分，將融合蛋白橋接至表現 PD-1 的細胞；以及 Fc 成分，其中每種成分可採取不同的形式，並且各種成分可與任何構型的其他成分組合。
但是，本發明之標靶異二聚體融合蛋白的抗 PD-1 成分不與已知的抗 PD-1 抗體諸如納武利尤單抗或帕博利珠單抗競爭結合。亦即，透過納入不與經批准之 αPD-1 抗體 (「NC[PD-1]」) 競爭結合的抗 PD-1 (αPD-1) 抗原結合結構域 (ABD)，本發明之融合蛋白允許高效結合抗 PD-1 抗體療法。亦即，透過納入不與經批准之療法競爭結合的抗 PD-1 ABD (「NC-αPD-1 ABD」)，非競爭性 ABD 可用於將融合蛋白標靶腫瘤，但仍然允許用於額外的抗 PD-1 抗體的治療，因為兩者都可以非競爭性地結合 PD-1。此外，在一些實施例中，NC-αPD-1 ABD 還可完全阻斷 PD-1:PD-L1 之交互作用 (基於 mAb A 變異體的實施例)、部分阻斷 PD-1:PD-L1 之交互作用 (mAbC 變異體) 或完全不阻斷任何交互作用 (mAbB 變異體)。
如本領域的技術人員所認識到並且如本文所概述，不同標靶異二聚體融合蛋白的許多不同形式的非競爭性構建體「NC-αPD-1 X IL-15/Rα」如圖 28 所示。
此外，本發明的一些方面依賴於本實施例與「非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白」(其不含與人 PD-1 的抗原結合結構域) 的比較，如圖 13 所示。
此外，本發明之非標靶或標靶異二聚體融合蛋白可與查核點受體的其他抗體 (包括抗 PD-1、抗 TIM-3、抗 LAG-3、抗 TIGIT 等) 組合。
因此，本發明提供了許多不同的功能成分，這些功能成分可透過多種不同的方式組裝以生成本發明之異二聚體融合蛋白。如上文所述，融合蛋白包括 IL-15 複合物，該複合物包含 IL-15 結構域和 IL-15 受體成分。
一些方面提供了 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，這些融合蛋白可誘導免疫抑制活性降低或極小的調節性 T 細胞 (Treg) 的增殖。在一個方面，該等異二聚體融合蛋白促進了效應記憶 T 細胞 (TEM ) 擴增。在一個實施例中，異二聚體融合蛋白提高了 Treg 與 TEM (Treg/TEM ) 的比率。在一些實例中，用本文所概述之 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的任何一種進行治療，可使 Treg 從抑制性 Treg 細胞類型轉化為非抑制性活化效應子 CD4 T 細胞。在一個實施例中，效應子 Treg FOXP3高 CD45RA– CD4+ 分化為效應子 CD4 T 細胞FOXP3低 CD45RA– CD4+ 。在一些實施例中，活化的效應子 CD4 T 細胞具有降低的 CCR4 表現。
另外，本文提供了 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，其逆轉了 TGFβ 對 T 細胞增殖的抑制。在腫瘤環境中，TGFβ 由惡性細胞和包括 Treg 在內的免疫細胞表現。TGFβ 還用於抑制 T 細胞增殖，由此抑制抗腫瘤免疫反應。用本發明之 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白進行治療，可防止 TGFβ 抑制 T 細胞的增殖。在一個實施例中，在腫瘤環境中投予 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白可抵消 TGFβ 對 T 細胞的活性，從而促進 T 細胞增殖和抗腫瘤免疫反應。
本發明的一些方面涉及異二聚體 Fc 融合蛋白，其包括在不同方向上的 IL-15 和 IL-15 受體 α (IL-15Rα) 蛋白結構域。Fc 結構域可來源於 IgG Fc 結構域，例如 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 結構域，其中 IgG1 Fc 結構域特別適用於本發明中。
因此，本發明的一些方面提供了不同的抗體結構域。如本文所述及本領域中已知的，本發明之異二聚體蛋白包含不同的結構域，這些結構域也可能發生重疊。這些結構域包括但不限於 Fc 結構域、CH1 結構域、CH2 結構域、CH3 結構域、鉸鏈結構域和重鏈恒定域 (CH1-鉸鏈-Fc 結構域或 CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。
在本文所概述之 Fc 結構域蛋白的一些構建體和序列中，IL-15 或 IL-15Rα 蛋白片段的 C 端連接至結構域連接子的 N 端，其 C 端連接至恒定 Fc 結構域 (N-IL-15 或 IL-15Rα 蛋白片段-連接子-Fc 結構域-C) 的 N 端，但可以切換 (N- Fc 結構域-連接子-IL-15 或 IL-15Rα 蛋白片段-C)。在本文所概述之其他構建體和序列中，第一蛋白片段的 C 端連接至第二蛋白片段的 N 端，任選地透過結構域連接子連接，並且第二蛋白片段的 C 端連接至恒定 Fc 結構域的 N 端，任選透過結構域連接子連接。在本文所概述之其他構建體和序列中，提供了不與第一蛋白片段或第二蛋白片段連接的恒定 Fc 結構域。異二聚體 Fc 融合蛋白可包含兩個或更多個本文所述之例示性單體 Fc 結構域蛋白。在又一個構建體中，第一蛋白片段的 N 端連接至第二蛋白片段的 C 端，任選地透過結構域連接子連接，並且第二蛋白片段的 N 端連接至恒定 Fc 結構域的 C 端，任選透過結構域連接子連接。
A.   IL-15 複合物
如圖中所示，IL-15 複合物可採用多種形式。如上文所述，IL-15 蛋白本身的穩定性低於與 IL-15Rα 蛋白複合後的穩定性。如本領域中已知的，IL-15Rα 蛋白包含「sushi 結構域」，該結構域為受體中保留 IL-15 結合活性的最短區域。因此，雖然可以製得包含整個 IL-15Rα 蛋白的異二聚體融合蛋白，但本文所述之優選實施例包括僅使用 sushi 結構域的複合物，其序列如圖所示。
因此，IL-15 複合物通常包含 IL-15 蛋白和 IL-15Rα 的 sushi 結構域 (除非另外說明使用全長序列，否則「IL-15Rα」、「IL-15Rα (sushi)」和「sushi」在全文中可互換使用)。當複合在一起時，用「斜線」 (「/」) 命名為「IL-15/Rα」，表示存在 IL-15 結構域和 IL-15Rα 結構域。
1.    IL-15 結構域
如本領域的技術人員所認識到的，IL-15 結構域可以是野生型人序列，也可以被改造為包括變異體，特別是下文所述之效力變異體。
在一些實施例中，人 IL-15 蛋白具有如 NCBI 參考序列闡述之胺基酸序列編號 NP_000576.1 或 SEQ ID NO:1 所述之胺基酸序列，該序列為前體序列。在一些情況下，人 IL-15 的編碼序列如 NCBI 參考序列闡述之胺基酸序列編號 NM_000585 所述。本文所概述之 Fc 融合蛋白異二聚體蛋白的例示性 IL-15 蛋白可具有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列 (成熟 IL-15)，其對應於 SEQ ID NO:1 之胺基酸 49-162。在一些實施例中，IL-15 蛋白與 SEQ ID NO:2 具有至少 90% 例如 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性。
在一些實施例中，IL-15 結構域已改造為包含胺基酸取代。
因此，在一些實施例中，IL-15 蛋白為 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的變異體，並且一個或多個胺基酸取代選自由以下各項所組成之群組：C42S、L45C、Q48C、V49C、L52C、E53C、E87C 和 E89C。異二聚體融合蛋白的 IL-15 蛋白可具有 1、2、3、4、5、6、7、8 或 9 個胺基酸取代。
a.    IL-15 效力變異體
此外，在一些實施例中，IL-15 人蛋白被改造為降低效力，如 PCT/US2019/028107 中大致所述，該公開全文以引用方式併入本文。亦即，如本文所述，本發明之異二聚體融合蛋白 (任選地具有和不具有本文所述之 Xtend-Fc 取代，諸如 M428L/N434S) 中 IL-15 的效力下降可增強接受該等蛋白質投予的受試者體內的藥物效力學和藥代動力學特徵。相似地，如 PCT/US2019/028107 的實例 7 所示，效力下降的 IL-15/Rα-Fc 變異體諸如 XENP22821 與本文所述之野生型 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白諸如 XENP20818 相比可在更長的時間內擴增淋巴細胞計數。值得注意的是，XENP23343 為 XENP22821 的 Xtend 類似物，相比於 XENP22821 進一步延長了淋巴細胞擴增的持續時間。此外，IL-15 效力的下降可改善治療指數 (即，在更高劑量下具有較低的毒性)。
如 PCT/US2019/028107 的實例 8 中所示的「非標靶分子」諸如 XmAb24306，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (諸如本文中併入 NC-αPD-1 X IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的那些) 可克服 Treg 抑制經誘導之效應子 T 細胞增殖。
相似地，如下面的實例 4 所示，在一定劑量範圍內，NC-αPD-1 X IL-15/Rα-Fc 融合蛋白可促進白細胞擴增並使異種 GVHD 惡化。值得注意的是，NC-αPD-1 X IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與抗 PD-1 抗體的聯合治療表現出協同作用 (例如，協同效應)，尤其是在低劑量下。
因此，本發明提供了許多合適的 IL-15 胺基酸變異體，其賦予了降低的效力和更高的藥代動力學特徵，包括但不限於包含選自以下項所組成之群組的一個或多個胺基酸取代的變異體 IL-15 蛋白：N1D；N4D；D8N；D30N；D61N；E64Q；N65D；Q108E；N1D/N4D/D8N；N1D/N4D/N65D；N1D/D30N；N1D/D61N；N1D/D61N/E64Q/Q108E；N1D/E64Q；N1D/N65D；N1D/Q108E；N4D；N4D/D30N；N4D/D61N；N4D/D61N/N65D；N4D/D61N/E64Q/Q108E；N4D/E64Q；N4D/N65D；D8N/D61N；D8N/E64Q；D30N/E64Q；D30N/N65D；D30N/E64Q/N65D；D30N/Q180E；D61N/E64Q/N65D；E64Q；E64Q/N65D；E64Q/Q108E；及 N65D/Q108E。在一些實施例中，變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 319。
在一些實施例中，該一個或多個胺基酸取代可為 IL-15:IL-2β 和 IL-15:共有 γ 鏈界面的等排取代。
在一些實施例中，人 IL-15 蛋白諸如 Fc 融合蛋白的人成熟 IL-15 蛋白與 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列相同。在一些情況下，人 IL-15 蛋白諸如人成熟 IL-15 蛋白不含胺基酸取代。
在一些實施例中，人成熟 IL-15 變異體蛋白具有一個或多個胺基酸突變 (例如，取代、插入和/或缺失)。在一些實例中，突變引入半胱胺酸殘基，該殘基可與人 IL-15 受體 α (IL-15Rα) 蛋白形成二硫鍵。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸變異體 D30N 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 D30N 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少一個 D30N 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸取代 N4D/N65D 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 N4D/N65D 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少 N4D/N65D 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸變異體 N1D 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 N1D 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少一個 N1D 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸變異體 N4D 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 N4D 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少一個 N4D 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸變異體 E64Q 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 E64Q 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少一個 E64Q 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸變異體 N65D 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 N65D 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少一個 N65D 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸取代 N1D/D30N 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 N1D/D30N 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少 N1D/D30N 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸取代 N4D/D30N 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 N4D/D30N 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少 N4D/D30N 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸取代 D30N/E64Q 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 D30N/E64Q 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少 D30N/E64Q 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸取代 D30N/N65D 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 D30N/N65D 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少 D30N/N65D 取代。
在一些實施例中，本發明提供了包含人 IL-15 變異體和胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 的蛋白。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和 D30N/E64Q/N65D 取代。在一些實施例中，蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列和至少 D30N/E64Q/N65D 取代。
b.    IL-15 醣基化變異體
此外，IL-15 結構域可具有單獨使用或與效力變異體聯合使用的胺基酸變異體，以減少糖苷化及/或糖苷化的異質性。合適的醣基化變異體包括但不限於相比於 SEQ ID NO:2 的 N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A，可單獨使用或彼此聯合使用。在本發明的許多實施例中特別有用的醣基化變異體組為 N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。在一些實施例中，變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 319。
c.    效力和醣基化變異體的組合
在許多實施例中，效力變異體和醣基化變異體的組合用於 IL-15 結構域中，與 sushi 結構域形成 IL-15 複合物的一部分 (通常為 SEQ ID NO:20 的截短野生型序列)。
因此，在一些實施例中，IL-15 結構域包含效力變異體 D30N/N65D 和醣基化變異體 N71Q/N79Q/N112Q。
在一些方面，IL-15 結構域包含效力變異體 D30N/N65D 和醣基化變異體 N71Q/N79Q。
在一些方面，IL-15 結構域包含效力變異體 D30N/E64Q/N65D 和醣基化變異體 N71Q/N79Q/N112Q。
在一些方面，IL-15 結構域包含效力變異體 D30N/E64Q/N65D 和醣基化變異體 N71Q/N79Q。
2.    IL-15/Rα 結構域
除 IL-15 結構域以外，任選包含如上文所概述之胺基酸變異體，本發明之異二聚體融合蛋白包含「sushi」結構域。
在一些實施例中，人 IL-15 受體 α (IL-15Rα) 蛋白具有如 NCBI 參考序列闡述之胺基酸序列編號 NP_002180.1 或 SEQ ID NO:3 所述之胺基酸序列。在一些情況下，人 IL-15Rα 的編碼序列如 NCBI 參考序列闡述編號 NM_002189.3 所述。本文所概述之 Fc 融合蛋白異二聚體蛋白例示性 IL-15Rα 蛋白可包含 SEQ ID NO:3 之 sushi 結構域 (例如 SEQ ID NO:3 之胺基酸 31-95) 或換句話說 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列或由其組成。亦即，特定實施例利用受體的細胞外結構域的截短版本。
在一些實施例中，IL-15Rα 蛋白具有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列和一或多個胺基酸插入，其選自由以下各項所組成之群組：D96、P97、A98、D96/P97、D96/C97、D96/P97/A98、D96/P97/C98 和 D96/C97/A98，其中，胺基酸位置相對於全長人 IL-15Rα 蛋白或 SEQ ID NO:3 確定。例如，一個或多個胺基酸諸如 D (例如 Asp)、P (例如 Pro)、A (例如 Ala)、DP (例如 Asp-Pro)、DC (例如 Asp-Cys)、DPA (例如 Asp-Pro-Ala)、DPC (例如 Asp-Pro-Cys) 或 DCA (例如 Asp-Cys-Ala) 可添加至 SEQ ID NO:20 之 IL-15Rα 蛋白的 C 端。在一些實施例中，IL-15Rα 蛋白具有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列以及一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代選自由以下各項所組成之群組：K34C、A37C、G38C、S40C 和 L42C，其中，胺基酸位置相對於 SEQ ID NO:20 確定。SEQ ID NO:20 之 IL-15Rα (sushi) 蛋白可具有 1、2、3、4、5、6、7、8 或更多個胺基酸突變 (例如取代、插入及/或缺失)。當胺基酸修飾是對 sushi 結構域進行時，該變異體 sushi 結構域必須保留生物活性。在一些實施例中，IL-15Rα 蛋白具有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列和胺基酸插入，其選自由以下各項所組成之群組：D96、P97、A98、D96/P97、D96/C97、D96/P97/A98、D96/P97/C98 和 D96/C97/A98，其中，胺基酸位置相對於全長人 IL-15Rα 蛋白或 SEQ ID NO:3 確定。在一些實施例中，IL-15Rα 蛋白具有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列以及一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代選自由以下各項所組成之群組：K34C、A37C、G38C、S40C 和 L42C，其中，胺基酸位置相對於 SEQ ID NO:4 確定。
3.    不同形式的 IL-15 複合物
因此，IL-15 複合物通常包含 IL-15 蛋白和 IL-15Rα 的 sushi 結構域。當複合在一起時，用「斜線」 (「/」) 命名為「IL-15/Rα」，表示存在 IL-15 結構域和 IL-15Rα 結構域。
如圖 28 所示，IL-15/Rα 複合物可具有兩種不同的形式；或為非共價結合或共價複合物。如圖 28B、28D、28F 和 28G 所示，IL-15 蛋白和 IL-15Rα(sushi) 未共價連接，而是透過規則的配體-配體交互作用自組裝而成。如本文更全面描述的，IL-15 結構域或 sushi 結構域可共價連接至 Fc 結構域 (通常使用任選的結構域連接子連接)。
或者，如圖 28A、28C、28E 和 28H 所示，IL-15/Rα 複合物為使用結構域連接子的共價連接物。在每種情況下，IL-15 和 IL-15Rα 從 N 端到 C 端的方向可以切換：亦即，在圖 28A 中，本發明還包括 IL-15 結構域位於 N 端的情況，其中 IL-15Rα 結構域使用連接子連接至 Fc 結構域。相似地，在圖 28C 中，本發明還包括 IL-15 結構域位於 N 端的情況，其中 IL-15Rα 結構域使用連接子連接至 Fc 結構域。在圖 28E 中，本發明還包括其中 IL-15 結構域在 Fc 結構域的 C 端 (使用結構域連接子連接) 的情況，且 IL-15Rα 結構域使用連接子連接至 IL-15 結構域。最後，圖 28H 還包括其中 IL-15 結構域在 IL-15Rα 結構域的 N 端的情況。
B.   非競爭性抗 PD-1 抗原結合結構域
本發明之抗 PD-1 成分 (例如，抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD)) 通常為包括在重鏈變異域和輕鏈變異域內的 6 個 CDR 的集合，其形成 Fv 結構域，該結構域可結合人 PD-1 (其序列如圖 2 所示)，但不與商業化抗 PD-1 抗體諸如帕博利珠單抗和納武利尤單抗競爭。這使得本發明之異二聚體融合蛋白對腫瘤具有極好的標靶作用，從而允許 IL-15/Rα 複合物發揮局部作用，而且也允許與有效的抗 PD-1 抗體聯合治療，而不競爭相同的 PD-1 表位。
本發明之 NC-αPD-1 抗原結合結構域可具有兩種通用的形式，如圖 28A 和 28B 所示的 scFv 結構域，或存在於兩種不同的多肽上的 Fab 結構域 (如圖 28C 和 28D (PD-1 的一價結合) 以及圖 28E、28F、28G 和 28H (PD-1 的二價結合) 所示的那些)，如下文更全面地所述。
相比於初始 mAbC H1_L1 序列，鑑定出許多有用的胺基酸變異體。
1.    氧化變異體
本發明的方面涉及以下事實：在 VH-CDR3 中包含色胺酸 (位置編號為 W112；Kabat 編號為 W100) 的特別有用的非競爭性抗 PD-1 Fv「[NC]mAb C」易於氧化 (數據未顯示) 並發生隨後的 PD-1 結合喪失。亦即，消除該位置的潛在氧化的胺基酸取代可降低 ABD 與人 PD-1 的親和力，如圖 151 所示。因此，如上所述，將賦予更高的結合親和力的其他變異體與 W100F 變異體結合，以探討該結合親和力能否恢復，如下文所述。
2.    親和變異體
如圖 65A~65I 所示，重鏈變異域中存在許多相比於 SEQ ID NO:5 可用於增加 W100F 氧化變異體的親和力的合適的變異體，這些變異體包括但不限於：F34L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H 和 L98R (Kabat 編號)，其各自單獨使用或組合使用。
此外，相比於 SEQ ID NO:168，輕鏈變異域中存在許多可單獨使用或組合使用的合適的變異體，其包括但不限於：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W (Kabat 編號)。
3.    氧化和親和力變異體的組合
因此，本發明提供了具有變異體的 NC-mAbC ABD，這些變異體包含 VH 結構域中的氧化變異體 W100F 並結合一種或多種親和力變異體以恢復合適的親和力結合。
在一些實施例中，VH 胺基酸取代 (相比於親本 VH 結構域 SEQ ID NO:5) 選自由以下各項所組成之群組：F32L/W100F；F32L/S52aG/W100F；F32L/S52aG/R97F/W100F；F32L/S52aG/R97Y/W100F；F32L/S52aG/R97E/W100F；F32L/S52aG/R97Q/W100F；F32L/S52aG/R97L/W100F；F32L/S52aG/R97V/W100F；F32L/S52aG/R97D/W100F；F32L/S52aG/R97H/W100F)；F32L/S52aG/R97A/W100F；F32L/S52aG/R97W/W100F；F32L/S52aG/R97T/W100F；L98R/W100F/S100aT；R97A/W100F；V99T/W100F；V99L/W100F/S100aA；L98Q/V99L/W100F；R97Q/W100F；L98Q/W100F；V99F/W100F；V99L/W100F；W100F/S100aN；V99I/W100F/P100bS；G96H/L98V/W100F；V99A/W100F；V99Q/W100F/S100aT；G96V/R97A/V99A/W100F/P100bS；R97Q/L98Q/W100F/S100aA；R97K/W100F/S100aA；W100F；W100F/S100aT；L98S/SW100F；L98F/W100F；R97W/L98H/W100F；W100F/S100aA；R97T/L98K/W100F；L98S/V99I/W100F；R97L/V99I/W100F；G96A/W100F；R97S/L98V/V99L/W100F；V99S/W100F；L98Q/W100F/S100aT；R97S/V99Y/W100F；V99Y/W100F；L98R/W100F；W100F/P100bS；R97H/L98Q/W100F；H1.224 L98R/V99L/W100F。
在一些實施例中，NCPD-1 mAbC ABD 的 VL 具有胺基酸取代 N27dH (相比於親本 VL 結構域 SEQ ID NO:168)，並且 VH 胺基酸取代 (相比於親本 VH 結構域 SEQ ID NO:5) 選自由以下各項所組成之群組：F32L/W100F；F32L/S52aG/W100F；F32L/S52aG/R97F/W100F；F32L/S52aG/R97Y/W100F；F32L/S52aG/R97E/W100F；F32L/S52aG/R97Q/W100F；F32L/S52aG/R97L/W100F；F32L/S52aG/R97V/W100F；F32L/S52aG/R97D/W100F；F32L/S52aG/R97H/W100F)；F32L/S52aG/R97A/W100F；F32L/S52aG/R97W/W100F；F32L/S52aG/R97T/W100F；L98R/W100F/S100aT；R97A/W100F；V99T/W100F；V99L/W100F/S100aA；L98Q/V99L/W100F；R97Q/W100F；L98Q/W100F；V99F/W100F；V99L/W100F；W100F/S100aN；V99I/W100F/P100bS；G96H/L98V/W100F；V99A/W100F；V99Q/W100F/S100aT；G96V/R97A/V99A/W100F/P100bS；R97Q/L98Q/W100F/S100aA；R97K/W100F/S100aA；W100F；W100F/S100aT；L98S/SW100F；L98F/W100F；R97W/L98H/W100F；W100F/S100aA；R97T/L98K/W100F；L98S/V99I/W100F；R97L/V99I/W100F；G96A/W100F；R97S/L98V/V99L/W100F；V99S/W100F；L98Q/W100F/S100aT；R97S/V99Y/W100F；V99Y/W100F；L98R/W100F；W100F/P100bS；R97H/L98Q/W100F；H1.224 L98R/V99L/W100F。
在一些實施例中，NCPD-1 mAbC ABD 的 VL 具有胺基酸取代 N27dH/K30Y/S93T (相比於親本 VL 結構域 SEQ ID NO:168)，並且 VH 胺基酸取代 (相比於親本 VH 結構域 SEQ ID NO:5) 選自由以下各項所組成之群組：F32L/W100F；F32L/S52aG/W100F；F32L/S52aG/R97F/W100F；F32L/S52aG/R97Y/W100F；F32L/S52aG/R97E/W100F；F32L/S52aG/R97Q/W100F；F32L/S52aG/R97L/W100F；F32L/S52aG/R97V/W100F；F32L/S52aG/R97D/W100F；F32L/S52aG/R97H/W100F)；F32L/S52aG/R97A/W100F；F32L/S52aG/R97W/W100F；F32L/S52aG/R97T/W100F；L98R/W100F/S100aT；R97A/W100F；V99T/W100F；V99L/W100F/S100aA；L98Q/V99L/W100F；R97Q/W100F；L98Q/W100F；V99F/W100F；V99L/W100F；W100F/S100aN；V99I/W100F/P100bS；G96H/L98V/W100F；V99A/W100F；V99Q/W100F/S100aT；G96V/R97A/V99A/W100F/P100bS；R97Q/L98Q/W100F/S100aA；R97K/W100F/S100aA；W100F；W100F/S100aT；L98S/SW100F；L98F/W100F；R97W/L98H/W100F；W100F/S100aA；R97T/L98K/W100F；L98S/V99I/W100F；R97L/V99I/W100F；G96A/W100F；R97S/L98V/V99L/W100F；V99S/W100F；L98Q/W100F/S100aT；R97S/V99Y/W100F；V99Y/W100F；L98R/W100F；W100F/P100bS；R97H/L98Q/W100F；H1.224 L98R/V99L/W100F。
在一些實施例中，NC-PD-1 mAbC ABD 具有 VH，該 VH 選自圖 43 中所示的那些，包括但不限於：H1.176、H1.177、H1.178、H1.179、H1.180、H1.181、H1.182、H1.183、H1.184、H1.185、H1.186、H1.187、H1.188、H1.189、H1.190、H1.191、H1.192、H1.193、H1.194、H1.195、H1.196、H1.197、H1.198、H1.199、H1.200、H1.201、H1.202、H1.203、H1.204、H1.205、H1.206、H1.207、H1.208、H1.209、H1.210、H1.211、H1.212、H1.213、H1.214、H1.215、H1.216、H1.217、H1.218、H1.219、H1.220、H1.221、H1.222、H1.223、H1.224。
在一些實施例中，NC-PD-1 mAbC ABD 具有 VL，該 VL 選自圖 43 中所示的那些，包括但不限於：L1.1、L1.3、L1.45、L1.117、L1.129、L1.135、L1.136 和 L1.140。
在一些實施例中，NC-PD-1 mAbC ABD 具有 H1.176_L1.140 序列。
在一些實施例中，NC-PD-1 mAbC ABD 具有 H1.176_L1.1 序列。
應當指出，任何 VH 結構域均可與任何 VL 結構域結合，包括本文所述之有用的特定組合。
如本文所示，除使用「Fab」形式的抗 PD-1 ABD 以外，抗 PD-1 ABD 還可採用 scFv 的形式，其中，vh 和 vl 結構域使用 scFv 連接子相連，該連接子可任選地位帶電荷的 scFv 連接子。如本領域的技術人員所認識到的，scFv 可從 N 端到 C 端組裝為 N-vh-scFv 連接子-vl-C 或N-vl-scFv 連接子-vh-C，其中 scFv 結構域的 C 端通常鏈接至鉸鏈-CH2-CH3 Fc 結構域。合適的 Fv (包括 CDR 組和重鏈/輕鏈變異域) 可用於圖 43 所示的 scFv 形式或 Fab 形式。如本領域中技術人員將進一步理解的，鉸鏈的全部或一部分 (也可以是來源於 IgG1、IgG2 或 IgG4 或其變異體的野生型鉸鏈，諸如 IgG4 S241P 或 S228P 鉸鏈變異體，在位置 228 處具有相對於親本 IgG4 鉸鏈多肽的取代脯胺酸 (其中，編號 S228P 根據 EU 指數得到，並且 S241P 為 Kabat 編號)) 可用作 scFv 和 CH2-CH3 結構域之間的結構域連接子，也可以使用如圖所示的其他結構域連接子。
C.   Fc 結構域
除 IL-15 複合物和標靶 NC-αPD-1 Fv 結構域以外，本發明進一步提供了異二聚體 Fc 結構域作為一種成分。如圖 28 所示，這些異二聚體 Fc 結構域用於將 IL-15/Rα 和標靶抗 PD-1 結構域整合到單個構建體中，其通常包含兩個多肽鏈 (例如圖 28A 所示，其中一個單體包含 IL-15/Rα 複合物，另一個單體包含抗 PD-1 scFv)、三個多肽鏈 (例如圖 28C 所示，其中一個單體包含 IL-15/Rα 複合物，第二單體包含重鏈並且第三單體為輕鏈) 等。
本發明之 Fc 結構域成分如本文所述，其通常包含本文所概述之偏斜變異體及/或任選的 pI 變異體及/或消融變異體。例如，參見標題為「IV 異二聚體抗體」的 WO2017/218707 的公開內容，包括 IV.A、IV.B、IV.C、IV.D、IV.E、IV.F、IV.G、IV.H 和 IV.I 部分，其全文明確地以引用方式併入本文。本文所概述之包含「偏斜變異體」、「pI 變異體」、「消融 變異體」和 FcRn 變異體的 Fc 結構域特別適合用於本發明的異二聚體蛋白中。特別有用的 Fc 結構域為圖 8 所示的那些。
Fc 結構域可來源於 IgG Fc 結構域，例如 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 結構域，其中 IgG1 Fc 結構域特別適用於本發明中。下文描述了可用於本發明之異二聚體 Fc 蛋白的 IL-15/IL-15Rα Fc 融合蛋白單體和查核點抗體片段的 Fc 結構域。
每條鏈的羧基末端部分定義主要負責效應子功能的恒定區。Kabat 等人收集了重鏈和輕鏈變異區的許多主要序列。基於序列的保守程度，他們將單個主要序列分為 CDR 和構架，並製作了它們的列表 (參見 SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第 5 版，NIH publication，No. 91-3242，E.A.Kabat 等人，其全文以引用方式併入本文)。在本說明書全文中，當提及變異域中的殘基 (大約為輕鏈變異區的殘基 1-107 和重鏈變異區的殘基 1-113) 時，通常使用 Kabat 編號系統，並且當提及 Fc 區域時，通常 EU 編號系統 (例如，Kabat 等人，同上 (1991))。
在免疫球蛋白的 IgG 亞類中，重鏈中存在若干免疫球蛋白的結構域。本文所用之「免疫球蛋白 (Ig) 結構域」係指具有不同三級結構的免疫球蛋白區域。本發明中關注的是重鏈結構域，其包括重鏈恒定 (CH) 域和鉸鏈結構域。在 IgG 抗體的語境下，IgG 同型各自具有三個 CH 區域。因此，在 IgG 抗體的語境下，「CH」結構域如下：「CH1」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 118-220。「CH2」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 237-340，並且「CH3」係指根據如 Kabat 所述之 EU 指數的位置 341-447。如本文所示和下文所述，pI 變異體可在一個或多個 CH 區域以及鉸鏈區中，如下文所述。
重鏈的另一種 Ig 結構域為鉸鏈區。本文所用之「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「抗體鉸鏈區」或「免疫球蛋白鉸鏈區」係指柔性多肽，其包含抗體的第一恒定域和第二恒定域之間的胺基酸。在結構上，IgG CH1 結構域終止於 EU 位置 220 處，而 IgG CH2 結構域則起始於殘基 EU 位置 237。因此，對於 IgG，抗體鉸鏈在本文中定義為包括位置 221 (IgG1 中的 D221) 至 236 (IgG1 中的 G236)，其中，編號根據如 Kabat 所述之 EU 指數進行。在一些實施例中，例如在 Fc 區域的語境下，包括下鉸鏈，其中「下鉸鏈」通常係指位置 226 或 230。如本文所指出的，pI 變異體也可以在鉸鏈區中製得。
因此，本發明提供了不同的抗體結構域，例如不同的 Fc 結構域。如本文所述及本領域中已知的，本發明之異二聚體蛋白包含不同的結構域，這些結構域也可能發生重疊。這些結構域包括但不限於 Fc 結構域、CH1 結構域、CH2 結構域、CH3 結構域、鉸鏈結構域和重鏈恒定域 (CH1-鉸鏈-Fc 結構域或 CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。
因此，「Fc 結構域」包括 -CH2-CH3 結構域，並且任選地包括鉸鏈結構域，並且可來自人 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4，其中 Fc 結構域來源於 IgG1。在本文所述之一些實施例中，當蛋白片段 (例如 IL-15 或 IL-15Rα) 連接至 Fc 結構域時，IL-15 或 IL-15Rα 構建體的 C 端連接至 Fc 結構域的全部或部分鉸鏈；例如，其通常連接至序列 EPKS (SEQ ID NO: 9)，其為鉸鏈開端。在其他實施例中，當蛋白片段 (例如 IL-15 或 IL-15Rα) 連接至 Fc 結構域時，IL-15 或 IL-15Rα 構建體的C 端連接至 Fc 結構域的 CH1 結構域。
在本文所概述之 Fc 結構域蛋白的一些構建體和序列中，IL-15 或 IL-15Rα 蛋白片段的 C 端連接至結構域連接子的 N 端，其 C 端連接至恒定 Fc 結構域 (N-IL-15 或 IL-15Rα 蛋白片段-連接子-Fc 結構域-C) 的 N 端，但可以切換 (N- Fc 結構域-連接子-IL-15 或 IL-15Rα 蛋白片段-C)。在本文所概述之其他構建體和序列中，第一蛋白片段的 C 端連接至第二蛋白片段的 N 端，任選地透過結構域連接子連接，並且第二蛋白片段的 C 端連接至恒定 Fc 結構域的 N 端，任選透過結構域連接子連接。在本文所概述之其他構建體和序列中，提供了不與第一蛋白片段或第二蛋白片段連接的恒定 Fc 結構域。異二聚體 Fc 融合蛋白可包含兩個或更多個本文所述之例示性單體 Fc 結構域蛋白。
在一些實施例中，連接子為「結構域連接子」，如下文更全面地概述，用於將本文所概述之任意兩個結構域連接在一起，其中一些如圖 8 所示。雖然可使用任何合適的連接子，但是許多實施例利用甘胺酸-絲胺酸聚合物，包括例如 (GS)n (SEQ ID NO: 10)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 11)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 12) 和 (GGGS)n (SEQ ID NO: 13)，其中 n 為至少 1 的整數 (通常是 1 至 2 至 3 至 4 至 5) 以及允許兩個結構域以足夠的長度和靈活性重組連接以使每個結構域保持其生物學功能的任何肽序列。在一些情況下，並且如本文所概述之對「鏈型」的關注針對的是結構域連接子。
因此，在本發明之一些實施例中，提供了異二聚體 Fc 融合蛋白，該融合蛋白依賴使用兩種不同的重鏈變異體 Fc 序列，其自組裝以形成異二聚體 Fc 結構域融合多肽。
本發明涉及提供允許與一種或多種結合伴侶、配體或受體結合之異二聚體 Fc 融合蛋白的新型構建體。異二聚體 Fc 融合蛋白基於抗體的重鏈的兩個 Fc 結構域 (例如，組裝成「二聚體」的兩個「單體」) 的自組裝。異二聚體 Fc 融合蛋白透過改變每個單體的胺基酸序列來製得，如下文所詳述。因此，本發明總體涉及異二聚體 Fc 融合蛋白的形成，其可以透過多種方式共同接合結合伴侶或配體或受體，依賴於每條鏈上不同恒定區中的胺基酸變異體，以促進異二聚體形成及/或易於從同源二聚體中純化異二聚體。
有許多機制可用於生成本發明之異二聚體。此外，如本領域的技術人員所認識到的，這些機制可組合使用以確保高異二聚化。因此，用於生產異二聚體之胺基酸變異體稱為「異二聚化變異體」。如下文所述，異二聚化變異體可包括立體變異體 (例如下文所述之「杵臼」或「偏斜」變異體和下文所述之「電荷對」變異體) 以及「pI 變異體」，其可以從異二聚體中純化同源二聚體。如 WO2014/145806 (其全文以引用方式併入本文) 中一般性所述並且如下文「異二聚化變異體」所具體討論的，可用的異二聚化機制包括「杵臼」(「KIH」；在本文中有時稱為「偏斜」變異體 (參見 WO2014/145806 的討論))、如 WO2014/145806 所述之「靜電轉向」或「電荷對」、如 WO2014/145806 所述之 pI 變異體以及如 WO2014/145806 及下文所概述之一般的附加 Fc。
在本發明中，可採用多種基本機制簡化對異二聚體抗體的純化；其中一種機制依賴於使用 pI 變異體，使得每個單體具有不同的 pI，從而實現 A-A、A-B 和 B-B 二聚體蛋白的等電純化。或者，某些形式也允許基於大小進行分離。如下文所進一步概述的，也可以「偏斜」形成異二聚體而非同源二聚體。因此，立體異二聚化變異體與 pI 或電荷對變異體的組合可特別用於本發明中。
一般而言，在本發明中特別有用的實施例依賴於包括偏斜變異體的變異體組，與 pI 變異體 (增加兩個單體之間的 pI 差異) 聯用，可促進異二聚化形成而非同源二聚化形成。
此外，如下文所更全面概述的，根據異二聚體 Fc 融合蛋白的形式不同，pI 變異體可包含在單體的恒定域及/或 Fc 結構域中，或者可使用結構域連接子。亦即，本發明提供了一個或兩個單體上的 pI 變異體以及帶電荷的結構域連接子。另外，用於實現替代功能的其他胺基酸改造也可以賦予 pI 變化，諸如 Fc、FcRn 和 KO 變異體。
在本發明中，利用 pI 作為分離機制以純化異二聚體蛋白的情況下，可將胺基酸變異體引入一種或兩種單體多肽中；亦即，一種單體 (為簡單起見，在本文中稱為「單體 A」) 的 pI 可設計為與單體 B 不同，或改變單體 A 和 B 變化，增大單體 A 的 pI，並減小單體 B 的 pI。如本文所述，可透過去除或添加帶電荷的殘基來完成一個或兩個單體的 pI 變化 (例如，中性胺基酸被帶正電荷或負電荷的胺基酸殘基取代，例如甘胺酸被麩胺酸取代)，將帶電荷的殘基由正電荷或負電荷改變為相反電荷 (例如，天冬胺酸被離胺酸取代)，或將帶電荷的殘基改變為中性殘基 (例如，電荷丟失；離胺酸被絲胺酸取代)。圖中顯示了許多這些變異體。
因此，本發明的該實施例提供了在至少一個單體中產生足夠的 pI 變化，從而可以使異二聚體與同源二聚體分離。如本領域的技術人員所認識到的並且如下文進一步所述，可透過使用「野生型」重鏈恒定區和經過改造以增加或減小其 pI 的變異體區域 (wt A-+B 或 wt A - -B) 或增加一個區域並減少另一個區域 (A+-B- 或 A- B+) 來完成。
因此，一般而言，本發明的一些實施例的成分為恒定區中的胺基酸變異體，其旨在透過將胺基酸取代基 (「pI 變異體」或「pI 取代」) 加入一個或兩個單體中來改變二聚體單體的至少一個 (如果不是兩個) 單體的等電點 (pI)。如本文所示，如果兩個單體的 pI 僅相差 0.1 pH 單位 (在本發明中可使用 0.2、0.3、0.4 和 0.5 或更大)，則可以實現異二聚體與兩種同源二聚體分離。
如本領域的技術人員所認識到的，要獲得良好分離，每個或兩個單體中包含的 pI 變異體的數量將部分取決於成分的起始 pI。如本領域中已知的，不同 Fc 具有的起始 pI 不同於本發明中所用的起始 pI。一般而言，如本文所概述，pI 被改造為使得每個單體的總 pI 相差至少約 0.1 log，並且優選相差 0.2 至 0.5，如本文所概述。
如本領域的技術人員所認識到的，要獲得良好分離，每個或兩個單體中包含的 pI 變異體的數量將部分取決於成分的起始 pI。亦即，為確定要改造的單體或確定改造的「方向」(例如，增加或減小)，計算 Fc 結構域的序列並在某些情況下計算連接至 Fc 結構域的蛋白結構域，然後由此做出決策。如本領域中已知的，不同 Fc 結構域及/或蛋白結構域具有的起始 pI 不同於本發明中所用的起始 pI。一般而言，如本文所概述，pI 被改造為使得每個單體的總 pI 相差至少約 0.1 log，並且優選相差 0.2 至 0.5，如本文所概述。
此外，如本領域的技術人員所認識到的並且如本文所概述，在一些實施例中，異二聚體可基於大小與同源二聚體分離。如圖中所示，例如，若干形式允許基於大小分離異二聚體和同源二聚體。
在 pI 變異體用於實現異二聚化的情況下，透過使用 Fc 結構域的恒定區，提供了一種設計並純化異二聚體 Fc 融合蛋白的更加模塊化的方法。因此，在一些實施例中，必須改造異二聚化變異體 (包括偏斜和純化異二聚化變異體)。此外，在一些實施例中，透過引入來自不同 IgG 同型的 pI 變異體，使得在改變 pI 的同時不引起顯著的免疫原性，顯著降低 pI 變異體產生免疫原性的可能性。因此，另一個需要解決的問題是闡明具有高人類序列含量的低 pI 恒定域，例如最小化或避免在任何特定位置出現非人類殘基。
該 pI 改造可能產生的一種附帶益處為血清半衰期的延長以及 FcRn 結合增加。亦即，如 USSN 13/194,904 (全文以引用方式併入本文) 中所述，降低抗體恒定域 (包括存在於抗體和 Fc 融合蛋白中的那些) 的 pI 可導致更長的體內血清保留時間。這些延長血清半衰期的 pI 變異體也有助於改變 pI 以進行純化。
此外，應當指出，異二聚化變異體的 pI 變異體為 Fc 融合蛋白的分析和質量對照過程帶來了額外的益處，因為當存在同源二聚體時，消除、最大程度減少和區分的能力很重要。相似地，可靠地檢測異二聚體 Fc 融合蛋白製備的重現性的能力也很重要。
1.    異二聚化變異體
本發明提供了異二聚體蛋白，包括多種形式的異二聚體 Fc 融合蛋白，其利用異二聚體變異體來實現異二聚體形成及/或從同源二聚體中的純化。異二聚體融合蛋白基於兩個 Fc 結構域 (例如，組裝成「二聚體」的兩個「單體」) 的自組裝。
存在許多對合適的異二聚化偏斜變異體組。這些變異體組成「對」出現。即，一對變異體組結合到第一單體中，而另一對變異體組結合到第二單體中。應當指出，這些組並不一定表現為「杵臼」變異體，其中一個單體上的殘基與另一個單體上的殘基之間一一對應；亦即，這些對組形成兩個單體之間的界面，其有利於異二聚體形成，並阻止同源二聚體形成，使得在生物條件下自發形成的異二聚體的比例超過 90%，而非預期的 50% (25 % 同源二聚體 A/A:50% 異二聚體 A/B:25% 同源二聚體 B/B)。
合適的偏斜變異體的列表參見圖 3。在許多實施例中特別有用的變異體組對包括但不限於：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q 和 T366S/L368A/Y407V : T366W (任選包括橋接二硫化物 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C)。就命名法而言，「S364K/E357Q : L368D/K370S」對係指一個單體具有雙重變異體組 S364K/E357Q，並且另一個具有雙重變異體組 L368D/K370S；如上所述，這些對的「鏈型」取決於起始 pI。
2.    立體變異體
在一些實施例中，可透過添加立體變異體以促進異二聚體的形成。亦即，透過改變每條重鏈中的胺基酸，不同重鏈更可能結合以形成異二聚體結構，而非形成具有相同 Fc 胺基酸序列的同源二聚體。合適的立體變化體顯示在 USSN 15/141,350 (其全文以引用方式併入本文) 的圖 29 以及本文所示之圖 8 中。
一種機制在本領域中通常被稱為「杵臼」，係指還可任選地使用產生有利於異二聚體形成且不利於同源二聚體形成的立體影響的胺基酸改造技術；該技術有時稱為「杵臼」，如以下文獻所述：USSN 61/596,846；Ridgway 等人，Protein Engineering 9(7): 617 (1996)；Atwell 等人，J. Mol.Biol.1997 270: 26；美國第 8,216,805 號專利，這些文獻的全部內容以引用方式併入本文。圖中標識了許多依賴於「杵臼」的「單體 A – 單體 B」對。另外，如 Merchant 等人 (Nature Biotech.16: 677，1998) 所述，這些「杵臼」突變可與二硫鍵結合以偏向形成異二聚化。
可用於生成異二聚體的另一種機制有時稱為「靜電轉向」，如 Gunasekaran e 等人 (J. Biol.Chem.285(25): 19637，2010)) 所述，該文獻全文以引用方式併入本文。它在本文中有時稱為「電荷對」。在該實施例中，使用靜電使形成偏向異二聚化。如本領域中技術人員將理解的，它們也可能影響 pI，從而影響純化，並由此在某些情況下也可以視為 pI 變異體。但是，由於生成這些變異體旨在促進異二聚化而未用作純化工具，因此被歸類為「立體變異體」。其中包括但不限於：與 D221R/P228R/K409R 配對的 D221E/P228E/L368E (例如，這些是「單體對應的組」) 以及與 C220R/E224R/P228R/K409R 配對的 C220E/P228E/368E。
可與其他變異體結合的其他單體 A 和單體 B 變異體可任選地且獨立地以任意量結合使用，例如本文所概述之 pI 變異體或 US 2012/0149876 中圖 37 中所示的其他立體變異體，所有這些文獻明確地以引用方式併入本文。
在一些實施例中，本文所概述之立體變異體可任選地且獨立地與任何 pI 變異體 (或其他變異體，諸如 Fc 變異體、FcRn 變異體等) 結合到一個或兩個單體中，並且可獨立地且任選地包含或排除本發明所述之蛋白質。
3.    異二聚體的 pI (等電點) 變異體
一般而言，如本領域的技術人員所認識到的，pI 變異體分為兩大類：增加蛋白質 pI 的類別 (鹼性變化) 和減少蛋白質 pI 的類別 (酸性變化)。如本文所述，可實現這些變異體的所有組合：一個單體可為野生型，或者未表現出野生型明顯不同的 pI 的變異體，並且另一個可具有更高的鹼性或酸性。或者，可改變每個單體，提高其鹼性或酸性。
pI 變異體的優選組合顯示在 USSN 15/141,350 的圖 30 中，該專利全文以引用方式併入本文。如本文所概述並且如附圖中所示，這些變化相對於 IgG1 顯示，但所有同型以及同型雜合體均可透過這種方式進行修改。在其中重鏈恒定域來自 IgG2-4 的情況下，也可使用 R133E 和 R133Q。
在一個實施例中，如果 Fc 單體中的一種包含 CH1 結構域，pI 變異體的優選組合包括一種單體，該單體包含 208D/295E/384D/418E/421D 變異體 (相對於人 IgG1 為 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)。在一些實例中，第二單體包含帶正電荷的結構域連接子，其包括 (GKPGS)4 (SEQ ID NO: 14)。在一些情況下，第一單體包含 CH1 結構域，包括位置 208 處的該結構域。因此，在不包含 CH1 結構域的構建體中 (例如，對於在結構域之一中不使用 CH1 結構域的異二聚體 Fc 融合蛋白)，優選的負 pI 變異體 Fc 組包括 295E/384D/418E/421D 變異體 (相對於人 IgG1 為 Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
在一些實施例中，突變發生在 Fc 結構域的鉸鏈結構域中，包括位置 221、222、223、224、225、233、234、235 和 236 處。應當指出，可更改 233-236 以增加 IgG2 主鏈中的效應子功能 (以及 327A)。因此，pI 突變且特別是取代可發生在位置 221-225 中的一個或多個處，其中 1、2、3、4 或 5 個突變可用於本發明中。同樣，在其他結構域中可設想所有可能的組合，其單獨使用或與其他 pI 變異體結合使用。
可用於降低鉸鏈結構域的 pI 的特定取代包括但不限於：位置 221 處的缺失、位置 222 處的非天然纈胺酸或蘇胺酸、位置 223 處的缺失、位置 224 處的非天然麩胺酸、位置 225 處的缺失、位置 235 處的缺失或位置 236 處的非天然丙胺酸。在一些情況下，pI 取代僅發生鉸鏈結構域中，而在另一些情況下，這些取代則以任何組合添加到其他結構域中的其他 pI 變異體中。
在一些實施例中，突變可發生在 CH2 區域中，包括位置 274、296、300、309、320、322、326、327、334 和 339。同樣，這 10 個位置可採用所有可能的組合；例如，pI 抗體可具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個 CH2 pI 取代。
可用於降低 CH2 結構域的 pI 的特定取代包括但不限於：位置 274 處的非天然麩醯胺酸或麩胺酸、位置 296 處的非天然苯丙胺酸、位置 300 處的非天然苯丙胺酸、位置 309 處的非天然纈胺酸、位置 320 處的非天然麩胺酸、位置 322 處的非天然麩胺酸、位置 326 處的非天然麩胺酸、位置 327 處的非天然甘胺酸、位置 334 處的天然麩胺酸、位置 339 處的非天然蘇胺酸以及 CH2 內與其他結構域的所有可能的組合。
在該實施例中，突變可獨立地且任選地選自位置 355、359、362、384、389,392、397、418、419、444 和 447。可用於降低 CH3 結構域的 pI 的特定取代包括但不限於：位置 355 處的非天然麩醯胺酸或麩胺酸、位置 384 處的非天然絲胺酸、位置 392 處的非天然天冬醯胺酸或麩胺酸、位置 397 處的非天然甲硫胺酸、位置 419 處的非天然麩胺酸、位置 359 處的非天然麩胺酸、位置 362 處的非天然麩胺酸、位置 389 處的非天然麩胺酸、位置 418 處的非天然麩胺酸、位置 444 處的非天然麩胺酸以及位置 447 處的缺失或非天然天冬胺酸。pI 變異體的例示性實施例提供於圖 (包括圖 5) 中。
此外，在一些情況下，介於 IL-15 和 IL-15Rα 結構域之間的結構域連接子可帶有電荷，並且 scFv 連接子 (如果存在於特定形式中) 可帶有電荷。
4.    同型變異體
另外，本發明之許多實施例依賴於在特定位置處將 pI 胺基酸從一種 IgG 同型「導入」另一種同型中，從而減少或消除將不需要的免疫原性引入變異體的可能性。其中一些顯示於美國專利申請第 2014/0370013 號的圖 21 中，在此以引用方式併入本文。亦即，由於多種原因，包括高效應子功能，IgG1 為治療性抗體的通用同型。但是，IgG1 重鏈恒定區的 pI 高於 IgG2 (8.10 vs 7.31)。透過將 IgG2 殘基引入 IgG1 主鏈的特定位置，所得單體的 pI 降低 (或提高)，並表現出更長的血清半衰期。例如，IgG1 在位置 137 處具有甘胺酸 (pI 5.97)，並且 IgG2 具有麩胺酸 (pI 3.22)；導入麩胺酸將影響所得蛋白質之 pI。如下文所述，通常需要許多胺基酸取代以顯著影響變異體 Fc 融合蛋白的 pI。但是，應當指出，如下文所述，即使 IgG2 分子的變化也可延長血清半衰期。
在其他實施例中，發生非同型胺基酸變化，以降低所得蛋白質之總體電荷狀態 (例如，透過將電荷較高的 pI 胺基酸改變為電荷較低的 pI 胺基酸)，或允許調整結構以提高穩定性等，如下文所詳述。
另外，透過 pI 改造重鏈和輕鏈恒定域，可發現異二聚體的每個單體的顯著變化。如本文所述，具有相差至少 0.5 的 pI 的兩個單體可透過離子交換色譜法或等電聚焦或對等電點靈敏的其他方法得到分離。
5.    計算 pI
每個單體的 pI 取決於變異體重鏈恒定域的 pI 和總單體 (包括變異體重鏈恒定域和融合伴侶) 的 pI。因此，在一些實施例中，基於變異體重鏈恒定域計算 pI 的變化，其使用美國專利申請第 2014/0370013 號的圖 19 中的圖表。如本文所述，要改造的單體通常取決於每個單體的固有 pI。
6.    也可提供更好的 FcRn 體內結合的 pI 變異體
在 pI 變異體降低單體的 pI 的情況下，它們可具有提高體內血清保留率的另外益處。
儘管仍在試驗中，但是據認為 Fc 區域在體內具有更長的半衰期，因為在內體中 pH 6 的條件下與 FcRn 結合使 Fc 發生螯合 (Ghetie 和 Ward，1997 Immunol Today18(12): 592-598，該文獻全文以引用方式併入本文)。然後，內體小室將 Fc 循環到細胞表面。一旦小室向細胞外空間開放，約 7.4 較高的 pH 值誘導 Fc 釋放回到血液中。在小鼠中，Dall’ Acqua 等人發現，在 pH 6 和 pH 7.4 下具有增強的 FcRn 結合力的 Fc 突變體與野生型 Fc 相比實際上具有降低的血清濃度以及相同的半衰期 (Dall'Acqua等人，2002，J. Immunol.169:5171-5180，透過引用整體併入)。在 pH 7.4 的條件下，Fc 對 FcRn 的親和力增加，從而阻止 Fc 釋放回血液中。因此，延長 Fc 的體內半衰期的 Fc 突變將理想地增加在較低 pH 下的 FcRn 結合，同時仍允許在較高 pH 下釋放 Fc。胺基酸組胺酸在 6.0 至 7.4 的 pH 範圍內改變其電荷狀態。因此，在 Fc/FcRn 複合物中的重要位置處發現 His 殘基並不奇怪。
7.    具有附加功能的附加 Fc 變異體
除 pI 胺基酸變異體以外，還出於多種原因實施許多有用的 Fc 胺基酸修飾，其中包括但不限於改變與一種或多種 FcγR 受體的結合、改變與 FcRn 受體的結合等。
因此，本發明之蛋白質可包括胺基酸修飾，包括本文所概述之異二聚化變異體，其包括 pI 變異體和立體變異體。每組變異體可獨立地且任選地包含在任何特定的異二聚體蛋白中或從中排除。
8.    FcγR 變異體
因此，可使用許多有用的 Fc 取代來改變與一種或多種 FcγR 受體的結合。可使用導致結合增加以及減少的取代。例如，已知與 FcγRIIIa 的增加的結合導致 ADCC 升高 (抗體依賴性細胞介導的細胞毒性；細胞介導的反應，其中，表現 FcγR 的非特異性細胞毒性細胞識別標靶細胞上的結合抗體並隨後引起標靶細胞溶解)。相似地，在某些情況下，減少與 FcγRIIb (抑制受體) 的結合可能也是有益的。可用於本發明中的胺基酸取代包括 USSN 11/124,620 (特別是圖 41)、11/174,287、11/396,495、11/538,406 中列出的那些，所有這些專利申請全文均明確地以引用方式併入本文且特別是本文所公開的變異體。可用的特定變異體包括但不限於：236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V 和 299T。
此外，提高 FcγRIIc 之親和力的胺基酸取代也可包括在本文所概述之 Fc 結構域變異體中。可使用描述於例如 USSN 11/124,620 和 14/578,305 中的取代。
另外，存在可用於增加與 FcRn 受體的結合並延長血清半衰期的附加的 Fc 取代，具體地如 USSN 12/341,769 所公開 (其全文以引用方式併入本文)，其中包括但不限於：434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I 或 V/434S、436V/428L 和 259I/308F/428L。
9.    消融變異體
相似地，另一類功能變異體為「FcγR 消融變異體」或「Fc 敲除 (FcKO 或 KO)」變異體。在這些實施例中，對於某些治療應用，期望減少或去除 Fc 結構域與一種或多種或所有 Fcγ 受體 (例如 FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa 等) 的正常結合，以避免額外的作用機制。這在例如許多實施例中特別用於消除 FcγRIIIa 結合所期望的雙特異性免疫調節抗體中，這些抗體用於消除或顯著降低 ADCC 活性，使得 Fc 結構域之一包含一個或多個 Fcγ 受體消融變異體。這些消融變異體在 USSN 15/141,350 的圖 31 中示出，所有這些全文以引用方式併入本文，並且各自可獨立地且任選地包括或排除，其中較佳方面利用選自由以下各項所組成之群組的消融變異體：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 和 E233P/L234V/L235A/G236del (根據 EU 指數)。應當指出，本文所述之消融變異體消除 FcγR 結合，但通常不消除 FcRn 結合。
pI 變異體的例示性實施例提供於圖 (包括圖 5) 中。
10.  異二聚體和 Fc 變異體的組合
如本領域的技術人員所認識到的，列舉的所有異二聚化變異體 (包括偏斜及/或 pI 變異體) 可任選地且獨立地以任意方式組合，只要其保持其「鏈型」或「單體間隔」即可。此外，所有這些變異體均可組合成任意異二聚化形式。
就 pI 變異體而言，雖然在圖中顯示了特別有用的實施例，但是可按照改變兩個單體之間的 pI 差異以促進純化的基本規則形成其他組合。
此外，如本文所總體概述，異二聚化變異體 (偏斜和 pI 變異體) 中的任何一個也獨立地且任選地與 Fc 消融變異體、Fc 變異體、FcRn 變異體結合。
另外，單體 Fc 結構域可包含一組胺基酸取代基，其包括 C220S/S267K/L368D/K370S 或 C220S/S267K/S364K/E357Q。
此外，異二聚體 Fc 融合蛋白可包含偏斜變異體 (例如，如 USSN 15/141,350 之圖 1A~1C 所示的一組胺基酸取代，其全部內容以引用方式併入本文)，其中特別有用的偏斜變異體選自由以下各項所組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C，任選包含消融變異體，任選包含帶電結構域連接子，並且重鏈包含 pI 變異體。
在一些實施例中，Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：236R、239D、239E、243L、M252Y、V259I、267D、267E、298A、V308F、328F、328R、330L、332D、332E、M428L、N434A、N434S、236R/328R、239D/332E、M428L、236R/328F、V259I/V308F、267E/328F、M428L/N434S、Y436I/M428L、Y436V/M428L、Y436I/N434S、Y436V/N434S、239D/332E/330L、M252Y/S254T/T256E、V259I/V308F/M428L、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、G236R/L328R 和 PVA/S267K。在一些情況下，Fc 結構域包含胺基酸取代 239D/332E。在其他情況下，Fc 結構域包含胺基酸取代 G236R/L328R 或 PVA/S267K。
在一個實施例中，可用於本發明中的偏斜和 pI 變異體的特定組合為 T366S/L368A/Y407V : T366W (任選包括橋接二硫化物 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C)，其中一個單體包含 Q295E/N384D/Q418E/N481D，並且另一個為帶有正電荷的結構域連接子。如本領域的技術人員所認識到的，「杵臼」變異體不改變 pI，並由此可用於單體中。
在一個實施例中，可用於本發明中的偏斜和 pI 變異體的特定組合為 L368D/K370S : S364K/E357Q，其中一個單體包含 Q295E/N384D/Q418E/N421D。
可用的 Fc 二聚變異體組 (包括偏斜和 pI 變異體) 對提供於圖 4A~4E 中。其他 pI 變異體提供於圖 5 中。可用的消融變異體提供於圖 6 中。本發明之 IL-15/Rα x 抗 PD1 ABD 異二聚體融合蛋白的非細胞因子成分的有用實施例提供於圖 7A~7E 和圖 8A~8F 中。
D.   結構域連接子
本發明之三種成分 (抗 PD-1 Fv、IL-15/Rα 複合物和本發明之異二聚化 Fc 結構域) 任選地使用結構域連接子連接在一起。雖然可發生直接共價連接 (例如，將 IL-15 複合物的 C 端連接至 Fc 結構域的 CH2 結構域的 N 端)，但通常使用提供靈活性且有時發揮作用的連接子。
在一些實施例中，IL-15 蛋白連接至 Fc 結構域的 N 端，且 IL-15Rα 蛋白連接至 IL-15 蛋白的 N 端。在其他實施例中，IL-15Rα 蛋白連接至 Fc 結構域的 N 端，且 IL-15Rα 蛋白非共價連接至 IL-15 蛋白。在其他實施例中，IL-15Rα 蛋白連接至 Fc 結構域的 C 端，且 IL-15Rα 蛋白非共價連接至 IL-15 蛋白。
在一些實施例中，IL-15 蛋白和 IL-15Rα 蛋白經由結構域連接子連接在一起 (例如，「scIL-15/Rα」形式)。任選地，這些蛋白質不透過連接子連接，而是利用天然的自組裝或二硫鍵，如本文所概述。在其他實施例中，IL-15 蛋白和 IL-15Rα 蛋白非共價連接。在一些實施例中，IL-15 蛋白透過連接子連接至 Fc 結構域。在某些實施例中，IL-15 蛋白直接 (諸如不透過連接子) 連接至 Fc 結構域。在特定實施例中，IL-15 蛋白透過鉸鏈區或其片段連接至 Fc 結構域。在其他實施例中，IL-15Rα 蛋白透過連接子連接至 Fc 結構域。在其他實施例中，IL-15Rα 蛋白直接 (諸如不透過連接子) 連接至 Fc 結構域。在特定實施例中，IL-15Rα 蛋白透過鉸鏈區或其片段連接至 Fc 結構域。任選地，連接子不用於將 IL-15 蛋白或 IL-15Rα 蛋白連接至 Fc 結構域。
在一些情況下，PD-1 ABD 經由結構域連接子共價連接至 Fc 結構域的 N 端。在一些實施例中，PD-1 ABD 直接 (諸如不透過連接子) 連接至 Fc 結構域。在特定實施例中，PD-1 ABD 透過鉸鏈區或其片段連接至 Fc 結構域。
在一些實施例中，連接子為「結構域連接子」，其用於將本文所概述之任何兩個結構域連接在一起。連接子肽可主要包括以下胺基酸殘基：Gly、Ser、Ala 或 Thr。連接子肽的長度應足以連接兩個分子，以使它們彼此之間具有正確的構象，從而保持所需的活性。在一個實施例中，連接子的長度為約 1 至 50 個胺基酸，優選為約 1 至 30 個胺基酸。在一個實施例中，可使用長度為 1 至 20 個胺基酸的連接子，在一些實施例中可使用約 5 至約 10 個胺基酸。有用的連接子包括：甘胺酸-絲胺酸聚合物，包括例如 (GS)n (SEQ ID NO: 15)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 16)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 17) 和 (GGGS)n (SEQ ID NO: 18)，其中 n 為至少 1 的整數 (通常為 3 至 4)；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物及其他撓性連接子。或者，多種非蛋白質聚合物 (包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物) 可用作連接子。
在一些實施例中，該結構域連接子包含所有或部分 IgG1、IgG2 及 IgG4 的鉸鏈區域，前者可用於許多實施例中。數種鉸鏈結構域連接子示於圖 8 中。在一些實施例中，結構域連接子包含下列胺基酸序列之任一者：SEQ ID NO: 311-317。如本技術領域者所理解，圖 8 的結構域連接子亦可組合。
在一些實施例中，結構域連接子是 scFv 連接子。一般來說，scFv 連接子是撓性且足夠長，讓 VH 和 VL 結構域以正確的形式聯結。在一些情況下，scFv 連接子可以帶電荷，大致上如圖 8 和下面討論所概述者，其取決於異二聚體蛋白的形式和組成分的 pI。
在一些實施例中，scFv 連接子為帶電荷的 scFv 連接子，其中許多連接子顯示在 WO2017/218707 的圖 7 中。因此，本發明進一步提供了帶電荷的 scFv 連接子，以促進第一單體和第二單體 (例如，IL-15/IL-15Rα 單體和 PD-1 ABD 單體) 之間的 pI 分離。亦即，透過加入帶正電荷或帶負電荷的 scFv 連接子 (或兩者都包含，在不同單體上使用 scFv 支架及/或在 scFv 中使用一個帶電荷連接子及一個將 IL-15 和 sushi 結構域或者將 IL-15/Rα 組成分連接到 Fc 結構域的情況下)，這使得包含帶電荷連接子的單體改變 pI，而不進一步改變 Fc 結構域。這些帶電荷的連接子可取代為包含標準連接子的任何 scFv。同樣，如本領域的技術人員所認識到的，根據所需的 pI 變化，將帶電荷的 scFv 連接子用於正確的「鏈」或單體上。例如，如本文所述，為製備本發明之異二聚體融合蛋白，計算每個所需的結構域的 Fv 區域的原始 pI，並選擇其中一個來製備 scFv，並且根據 pI 選擇帶正電荷或帶負電荷的連接子。
帶電荷的結構域連接子也可以用於增加本發明之單體的 pI 分離，因此圖 10 中包括的那些可用於本文中使用連接子的任何實施例中。
其他連接子序列可包括任意長度的 CL/CH1 結構域的任何序列，但不包括 CL/CH1 結構域的所有殘基；例如，CL/CH1 結構域的前 5-12 個胺基酸殘基。連接子可來源於免疫球蛋白輕鏈，例如 Cκ 或 Cλ。連接子可來源於任意同型的免疫球蛋白重鏈，包括例如 Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε 和 Cμ。連接子序列也可來源於其他蛋白質，諸如 Ig 樣蛋白質 (例如，TCR、FcR、KIR)、來源於鉸鏈區的序列以及來源於其他蛋白質的其他天然序列。
1.    醣基化變異體連接子
如上文針對抗 PD-1 Fv 所述，醣基化可導致異質性，其在某些情況下可能是不可取的。因此，在一些情況下，對於連接 IL-15 結構域和 IL-15Rα 結構域以形成 IL-15 複合物的結構域連接子，使用 (GGGGA)n 連接子 (SEQ ID NO: 19)，如圖 8 所示，其中，n 為 1 至 5。
Ⅳ. 本發明之有用形式
如圖 28A~28H 所示，本發明有許多可用形式的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα(sushi) Fc 融合蛋白。一般而言，本發明之異二聚體融合蛋白具有三種功能成分：IL-15/IL-15Rα(sushi) 成分、抗 PD-1 成分和 Fc 成分，它們各自可以採取如本文所概述之不同形式，並且每種成分可與其他成分以任意構型組合。
在以下任何形式中，第一 Fc 結構域和第二 Fc 結構域可具有選自由以下各項所組成之群組的一組胺基酸取代：a) S267K/L368D/K370S : S267K/S364K/E357Q；b) S364K/E357Q : L368D/K370S；c) L368D/K370S : S364K；d) L368E/K370S : S364K；e) T411E/K360E/Q362E : D401K；f) L368D/K370S : S364K/E357L 和 g) K370S : S364K/E357Q (根據 EU 編號)。
在一些實施例中，第一 Fc 結構域及/或第二 Fc 結構域可具有額外的一組胺基酸取代，其包含 Q295E/N384D/Q418E/N421D (根據 EU 編號)。
任選地，第一 Fc 結構域及/或第二 Fc 結構域可具有額外的一組胺基酸取代，其由 G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G and E233P/L234V/L235A/G236del 組成 (根據 EU 編號)。
任選地，第一 Fc 結構域及/或第二 Fc 結構域具有 M428L/N434S 變異體以延長半衰期。在一些實施例中，第一 Fc 結構域及/或第二 Fc 結構域具有 428L/434S 變異體以延長半衰期。
因此，用於以下任何形式的特別有用的變異體具有：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D (當單體包含 CH1 結構域時) 或 pI 變異體 Q295E/N384D/Q418E/N421D (當單體不含 CH1 結構域時)。
A.   scIL-15/Rα X scFv
一個實施例如圖 28A 所示，並且包含兩個單體。其通常稱為「scIL-15/Rα X scFv」，其中「sc」代表「單鏈」，係指 IL-15 和 sushi 結構域使用共價結構域連接子的連接。「scIL-15/Rα x scFv」形式 (見圖 28A) 包含透過可變長度之連接子 (稱為「scIL-15/Rα」) 融合至 IL-15 且然後融合至異二聚體 Fc 區域之 N 端的 IL-15Rα(sushi)，其中 scFv 融合至異二聚體 Fc 之另一側。
在圖 28A 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域選自由以下各項所組成之群組：mAbC H.176_L1.140、H1.19_L1.140、H1_L1.1、H1.19_L1、H1.48_L1、H1.125_L1、H1.30_L1、H1.132_L1、H1_L1.1 H1_L1.3、H1_L1.45、H1_L1.117、H1_L1.129、H1.19_L1.1、H1.32_L1.1、H1.169_L1.1、H1.169_L1.1、H1.175_L1.1、H1.175_L1.1、H1_L1.140、H1_L1.135、H1_L1.136、H1.132_L1.135、H1.132_L1.140、H1.175_L1.135 及 H1.175_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合。
在圖 28A 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 N4D/N65D、D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
在圖 28A 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域選自由以下各項所組成之群組：H1_L1.1 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 N4D/N65D、D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
B.   scFv X ncIL-15/Rα
該實施例如圖 28B 所示並且包含三個單體。其通常稱為「ncIL-15/Rα X scFv」或「scFv X ncIL-15/Rα」，其中「nc」表示「非共價」，係指 IL-15 與 sushi 結構域的自組裝非共價連接。「scFv x ncIL-15/Rα」形式 (見圖 34B) 包含融合至異二聚體 Fc 區域之 N 端的 scFv，其中 IL-15Rα(sushi) 融合至異二聚體 Fc 之另一側，而 IL-15 被單獨轉染，由此形成非共價 IL-15/Rα 複合物。
在圖 28B 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 N4D/N65D、D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
在圖 28B 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域選自由以下各項所組成之群組：H1_L1.1 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 N4D/N65D、D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
C.   scIL-15/Rα X Fab
該實施例如圖 28C 所示並且包含三個單體。其通常稱為「scIL-15/Rα X Fab」或「Fab X scIL-15/Rα」，兩者可互換使用，其中「sc」表示「單鏈」。scIL-15/Rα x Fab 形式 (見圖 28C) 包含透過變異長度之連接子 (稱為「scIL-15/Rα」) 融合至 IL-15 且然後融合至異二聚體 Fc 區域之 N 端的 IL-15Rα(sushi) (包含鉸鏈，其在此作為第二結構域連接子)。即，從 N 端至 C 端，第一單體是變異體 IL-15-第一結構域連接子-IL-15Rα sushi 結構域-第二結構域連接子-CH2-CH3。在一些情況下，第二結構域連接子是如圖 8 中的全長鉸鏈結構域。第二單體為重鏈 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，而相應的輕鏈 (第三單體) 被單獨轉染，以便與 VH 形成 Fab。
在一些圖 28C 實施例中，該 抗 PD-1 Fv 結構域是選自由以下各項所組成之群組：mAbC H.176_L1.140、H1_L1、H1.19_L1.140、H1_L1.1、H1.19_L1、H1.48_L1、H1.125_L1、H1.30_L1、H1.132_L1、H1_L1.1 H1_L1.3、H1_L1.45、H1_L1.117、H1_L1.129、H1.19_L1.1、H1.32_L1.1、H1.169_L1.1、H1.169_L1.1、H1.175_L1.1、H1.175_L1.1、H1_L1.140、H1_L1.135、H1_L1.136、H1.132_L1.135、H1.132_L1.140、H1.175_L1.135 及 H1.175_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合。
在圖 28C 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H1.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含用於效力的胺基酸取代 D30N/N65D 和用於醣基化的 N71Q/N79Q/N112Q。此外，介於 IL-15 和 sushi 結構域之間的結構域連接子為 GGGGA (SEQ ID NO: 8)。
在圖 28C 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 Xtend 428L/434S 變異體；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、Xtend 428L/434S 變異體和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H1.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含用於效力的胺基酸取代 D30N/N65D 和用於醣基化的 N71Q/N79Q/N112Q。此外，介於 IL-15 和 sushi 結構域之間的結構域連接子為 GGGGA (SEQ ID NO: 8)。
在圖 28C 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H1.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含用於效力的胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和用於醣基化的 N71Q/N79Q/N112Q。此外，介於 IL-15 和 sushi 結構域之間的結構域連接子為 GGGGA (SEQ ID NO: 8)。
在圖 28C 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 Xtend 428L/434S 變異體；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、Xtend 428L/434S 變異體和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H1.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含用於效力的胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和用於醣基化的 N71Q/N79Q/N112Q。 此外，介於 IL-15 和 sushi 結構域之間的結構域連接子為 GGGGA (SEQ ID NO: 8)。
在一個特別有用的實施例中，融合蛋白為 XENP32435，其序列如圖 138A 所示。
在圖 28C 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中， sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域選自由以下各項所組成之群組：H1_L1.1 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
scIL-15/Rα x Fab 形式的例示性非競爭性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的胺基酸序列 (圖 28C) 提供於圖 30、48、49 和 68 中。
在一些實施例中，第一單體從 N 端到 C 端包含 sushi 結構域-結構域連接子-變異體 IL-15-結構域連接子-CH2-CH3，並且第二單體包含重鏈 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3。第三單體為輕鏈 VL-CL。該實施例的變異體的優選組合參見 PCT/US2017/056826 之圖 7C。
在 scIL-15/Rα X Fab 形式中，一個優選實施例利用偏斜變異體對 S364K/E357Q : L368D/K370S。
在 scIL-15/Rα X Fab 形式中，一個優選實施例利用偏斜變異體 S364K/E357Q (在 scFv-Fc 單體上) 和 L368D/K370S (在 IL-15 複合物單體上)、pI 變異體 Q295E/N384D/Q418E/N421D (在 IL-15 複合物一側)、兩個單體上的消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K 以及任選的兩側 428L/434S 變異體。
D.   ncIL-15/Rα X Fab
該實施例如圖 28D 所示並且包含三個單體。其通常稱為「ncIL-15/Rα X Fab」或「Fab X ncIL-15/Rα」，兩者可互換使用，其中「nc」表示「非共價」，係指 IL-15 與 sushi 結構域的自組裝非共價連接。ncIL-15/Rα x Fab 形式 (見圖 34D) 包含融合至異二聚體 Fc 區域之 N 端的 VH，其中 IL-15Rα(sushi) 融合至異二聚體 Fc 之另一側，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便形成包含 VH 之 Fab，並且同時 IL-15 被單獨轉染，由此形成非共價 IL-15/Rα 複合物。
在一些實施例中，第一單體從 N 端到 C 端包含sushi 結構域-結構域連接子-CH2-CH3，並且第二單體包含重鏈 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3。第三單體為 IL-15 結構域。在 ncIL-15/Rα X Fab 形式中，一個優選實施例利用偏斜變異體對 S364K/E357Q : L368D/K370S。
在圖 28D 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
在圖 28D 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域選自由以下各項所組成之群組：H1_L1.1 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
E.   mAb-scIL-15/Rα
該實施例如圖 28E 所示，並且包含三個單體 (儘管該融合蛋白為四聚體)。這通常稱為「mAb-scIL-15/Rα」，其中「sc」代表「單鏈」。mAb-scIL-15/Rα 形式 (見圖 34E) 包含融合至第一異二聚體 Fc 和第二異二聚體 Fc 之 N 端的 VH，其中 IL-15 融合至 IL-15Rα(sushi)，然後進一步融合至異二聚體 Fc 區域中的一個之 C 端，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便形成包含 VH 之 Fab。
在一些實施例中，第一單體包含重鏈 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3。第二單體包含重鏈，該重鏈包含 scIL-15 複合物、VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-結構域連接子-sushi 結構域-結構域連接子-IL-15。第三 (和第四) 單體為輕鏈 VL-CL。這通常稱為「mAb-scIL-15/Rα」，其中「sc」代表「單鏈」。在 mAb-scIL-15/Rα 形式中，一個優選實施例利用偏斜變異體對 S364K/E357Q : L368D/K370S。
在圖 28E 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
在圖 28E 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域選自由以下各項所組成之群組：H1_L1.1 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
F.    mAb-ncIL-15/Rα
該實施例如圖 28F 所示，並且包含四個單體 (儘管異二聚體融合蛋白為五聚體)。這通常稱為「mAb-ncIL-15/Rα」，其中「sc」代表「非共價」。「mAb-ncIL-15/Rα」形式 (圖 34F) 包含融合至第一異二聚體 Fc 和第二異二聚體 Fc 之 N 端的 VH，其中 IL-15Rα(sushi) 融合至異二聚體 Fc 區域中的一個之 C 端，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便形成包含 VH 之 Fab，而 IL-15 被單獨轉染，由此形成非共價 IL-15/Rα 複合物。
在一些實施例中，第一單體包含重鏈 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3。第二單體包含重鏈，該重鏈包含 IL-15Rα(sushi) 結構域、VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-結構域連接子-sushi 結構域。第三單體為 IL-15 結構域。第四 (和第五) 單體為輕鏈 VL-CL。在 mAb-ncIL-15/Rα 形式中，一個優選實施例利用偏斜變異體對 S364K/E357Q : L368D/K370S。
在圖 28F 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
在圖 28F 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域選自由以下各項所組成之群組：H1_L1.1 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
G.   中心 IL-15/Rα
該實施例如圖 28G 所示並且包含形成四聚體的四個單體。這通常稱為「中心 IL-15/Rα」。中心 IL-15/Rα 形式 (見圖 28G) 包含重組融合至 IL-15 之 N 端且然後融合至異二聚體 Fc 之一側的 VH 以及重組融合至 IL-15Rα(sushi) 之 N 端且然後進一步融合至異二聚體 Fc 之另一側的 VH，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便形成包含 VH 之 Fab。
在圖 28G 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
在圖 28G 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域選自由以下各項所組成之群組：H1_L1.1 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
H.   中心 scIL-15/Rα
該實施例如圖 28H 所示並且包含形成四聚體的四個單體。這通常稱為「中心 scIL-15/Rα」，其中「sc」代表「單鏈」。中心 scIL-15/Rα 形式 (見圖 34H) 包含融合至 IL-15Rα(sushi) 之 N 端的 VH (其融合至 IL-15 且然後進一步融合至異二聚體 Fc 之一側) 以及融合至異二聚體 Fc 之另一側的 VH，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便形成包含 VH 之 Fab。
在圖 28H 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域為 H.176_L1.140 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
在圖 28H 所示之形式中，一些方面包括 Fc 結構域，該 Fc 結構域包含：帶正電荷之單體，其包含偏斜變異體 S364K/E357Q 和消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及帶負電荷之單體，其包含偏斜變異體 L368D/K370S、消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和 pI 變異體 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D 以及任選的 428L/434S FcRn 變異體。在這些實施例中，sushi 結構域為野生型 (SEQ ID NO:20)，並且抗 PD-1 Fv 結構域選自由以下各項所組成之群組：H1_L1.1 的 VH 和 VL 結構域組合，並且 IL-15 結構域包含選自 D30N/N65D 和 D30N/E64Q/N65D 的變異體。
Ⅴ. 本發明之有用實施例
本文提供了包含 IL-15 蛋白的一個或多個經改造之胺基酸取代的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白以及不與選定的經批准之抗 PD-1 競爭結合抗體的抗 PD-1 ABD。在一些實施例中，Fc 融合蛋白的 IL-15 變異體具有 N4D/N65D 取代。在一些實施例中，Fc 融合蛋白的 IL-15 變異體具有 D30N 取代。在一些實施例中，Fc 融合蛋白的 IL-15 變異體具有 D30N/E64Q/N65D 取代。在一些實施例中，Fc 融合蛋白的 IL-15 變異體具有 D30N/N65D 取代。該等包含融合蛋白的 IL-15/Rα-Fc 可誘導或促進免疫細胞 (包括 NK 細胞、CD8+ T 細胞 和 CD4+ T 細胞) 的增殖。值得注意的是，IL-15 Fc 側無外源性連接子 (例如，鉸鏈結構域是結構域連接子) 的包含 IL-15/Rα-Fc 的融合蛋白表現出較弱的增殖活性。
本文提供了具有較低效力、更高的藥代動力學特徵及/或延長的血清半衰期的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。相比於親本構建體，本文所述之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白經改造以降低其效力。在一些實施例中，將一個或多個胺基酸取代引入 IL-15/Rα 複合物及/或異二聚體Fc 融合蛋白的 Fc 結構域中。在一些實施例中，相比於對照構建體 (例如，親本構建體) 具有較低的效力的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白具有大幅延長的血清半衰期。在某些實施例中，血清半衰期增加了 1 倍、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、6 倍、7 倍、8 倍、9 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍或更多倍。
本文提供了相比於經改造以降低效力的對照 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白與抗 PD-1 抗體的聯合治療，動物模型 (例如，人 PBMC 移植的 NSG 小鼠) 中增強 GVHD 的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。相比於 IL-15 和 PD-1 阻斷劑聯合使用，投予例示性的非競爭性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白產生了更大的效應。
本文所述之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (包括非競爭性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 可在免疫細胞中誘導 STAT5 磷酸化，包括但不限於活化的淋巴細胞、活化的 T 細胞 (例如活化的 CD4+T 細胞和活化的 CD8+ 細胞) 以及活化的腫瘤浸潤淋巴細胞 (例如活化的 TIL)。
Ⅵ. 非標靶異二聚體 Fc 融合蛋白
在一個方面，本文提供了用於在有需要的患者中逆轉 TGFβ 介導的 T 細胞增殖抑制的方法，該方法包括向患者投予治療有效量之 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，該融合蛋白包含：(a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含：i) 變異體 IL-15 蛋白；ii) 第一結構域 連接子；及 iii) 第一變異體 Fc 結構域，其包含 CH2-CH3；以及 (b) 第二單體，其從 N 端到 C 端包含：i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白；ii) 第二 結構域連接子；及 iii) 第二變異體 Fc 結構域，其包含 CH2-CH3。
在一些實施例中，異二聚體 Fc 融合蛋白的變異體 IL-15 蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列以及選自由以下各項所組成之群組的一個或多個胺基酸取代：N1D；N4D；D8N；D30N；D61N；E64Q；N65D；Q108E；N1D/N4D/D8N；N1D/N4D/N65D；N1D/D30N；N1D/D61N；N1D/D61N/E64Q/Q108E；N1D/E64Q；N1D/N65D；N1D/Q108E；N4D；N4D/D30N；N4D/D61N；N4D/D61N/N65D；N4D/D61N/E64Q/Q108E；N4D/E64Q；N4D/N65D；D8N/D61N；D8N/E64Q；D30N/E64Q；D30N/N65D；D30N/E64Q/N65D；D30N/Q180E；D61N/E64Q/N65D；E64Q；E64Q/N65D；E64Q/Q108E；及 N65D/Q108E。在一個實施例中，變異體 IL-15 蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列以及選自由以下各項所組成之群組的一個或多個胺基酸取代：N65D；D30N/E64Q/N65D；N4D/N65D；D30N/E64Q；及 D30N/N65D。在一些實施例中，變異體 IL-15 蛋白相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q。在一些實施例中，變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 319。
在一些實施例中，IL-15 Rα sushi 結構域蛋白包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-15 Rα 蛋白包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域具有選自由以下各項所組成之群組的一組胺基酸取代：S267K/L368D/K370S : S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L 和 K370S : S364K/E357Q (根據 EU 編號)。在某些實施例中，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含胺基酸取代 S267K/L368D/K370S : S267K/S364K/E357Q (根據 EU 編號)。在一些實施例中，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S (根據 EU 編號)。
在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白選自圖 115A~115C 所示之 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白群組。在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白選自由以下各項所組成之群組：XENP31967、XENP31968、XENP31969、XENP31970、XENP31971、XENP31972 和 XENP31973。在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白為 XENP31969。在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白為 XENP31972。
在一些實施例中，非標靶異二聚體 Fc 融合蛋白包含第一單體，其包含第一融合蛋白，其包含異構體 IL-15 蛋白 (其包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 及 N71Q/N79Q/N112Q (相較於 SEQ ID NO: 2))，其使用結構域連接子連接至第一變異體 Fc 結構域。第二單體包含第二融合蛋白，其包含 IL-15Rα sushi 結構域，其使用結構域連接子連接至第二變異體 Fc 結構域。在一些實施例中，異二聚體蛋白是選自 XENP 31969 及 XENP31972。
在一些實施例中，患者在接受投藥後表現出增強的 T 細胞增殖。在一個實施例中，T 細胞增殖為 CD4 T 細胞增殖。在一個實施例中，T 細胞增殖為 CD8 T 細胞增殖。在一些實施例中，T 細胞增殖為 CD4 和 CD8 T 細胞增殖。
在一些實施例中，患者患有癌症。
在另一方面，本文提供了用於降低有需要的患者體內 T 細胞中的 FOXP3 表現水準的方法，該方法包括向患者投予治療有效量之 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，該融合蛋白包含：(a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含：i) 變異體 IL-15 蛋白；ii) 第一結構域 連接子；及 iii) 第一變異體 Fc 結構域，其包含 CH2-CH3；以及 (b) 第二單體，其從 N 端到 C 端包含：i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白；ii) 第二 結構域連接子；及 iii) 第二變異體 Fc 結構域，其包含 CH2-CH3。
在一些實施例中，異二聚體 Fc 融合蛋白的變異體 IL-15 蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列以及選自由以下各項所組成之群組的一個或多個胺基酸取代：N1D；N4D；D8N；D30N；D61N；E64Q；N65D；Q108E；N1D/N4D/D8N；N1D/N4D/N65D；N1D/D30N；N1D/D61N；N1D/D61N/E64Q/Q108E；N1D/E64Q；N1D/N65D；N1D/Q108E；N4D；N4D/D30N；N4D/D61N；N4D/D61N/N65D；N4D/D61N/E64Q/Q108E；N4D/E64Q；N4D/N65D；D8N/D61N；D8N/E64Q；D30N/E64Q；D30N/N65D；D30N/E64Q/N65D；D30N/Q180E；D61N/E64Q/N65D；E64Q；E64Q/N65D；E64Q/Q108E；及 N65D/Q108E。在一個實施例中，變異體 IL-15 蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列以及選自由以下各項所組成之群組的一個或多個胺基酸取代：N65D；D30N/E64Q/N65D；N4D/N65D；D30N/E64Q；及 D30N/N65D。在一些實施例中，變異體 IL-15 蛋白相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q。在一些實施例中，變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 319。
在一些實施例中，IL-15 Rα sushi 結構域蛋白包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-15 Rα 蛋白包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域具有選自由以下各項所組成之群組的一組胺基酸取代：S267K/L368D/K370S : S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L 和 K370S : S364K/E357Q (根據 EU 編號)。在某些實施例中，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含胺基酸取代 S267K/L368D/K370S : S267K/S364K/E357Q (根據 EU 編號)。在一些實施例中，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S (根據 EU 編號)。
在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白選自圖 115A~115C 所示之 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白群組。在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白選自由以下各項所組成之群組：XENP31967、XENP31968、XENP31969、XENP31970、XENP31971、XENP31972 和 XENP31973。在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白為 XENP31969。在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白為 XENP31972。
在一些實施例中，患者在接受投藥後表現出非抑制性調節 T 細胞 (Treg) 數量增加。
在一些實施例中，患者在接受投藥後表現出活化的效應子 CD4 T 細胞數量增加。
在一些實施例中，患者在接受投藥後表現出增加的 Treg 與效應記憶 T 細胞比率 (Treg/TEM )。
在本發明之任何實施例中，患者患有癌症。
在又一個方面，本文提供了用於在癌症患者中擴增活化的效應子 CD4 T 細胞的方法，該方法包括向患者投予治療有效量之 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，該融合蛋白包含：(a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含：i) 變異體 IL-15 蛋白；ii) 第一結構域 連接子；及 iii) 第一變異體 Fc 結構域，其包含 CH2-CH3；以及 (b) 第二單體，其從 N 端到 C 端包含：i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白；ii) 第二 結構域連接子；及 iii) 第二變異體 Fc 結構域，其包含 CH2-CH3。
在一些實施例中，異二聚體 Fc 融合蛋白的變異體 IL-15 蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列以及選自由以下各項所組成之群組的一個或多個胺基酸取代：N1D；N4D；D8N；D30N；D61N；E64Q；N65D；Q108E；N1D/N4D/D8N；N1D/N4D/N65D；N1D/D30N；N1D/D61N；N1D/D61N/E64Q/Q108E；N1D/E64Q；N1D/N65D；N1D/Q108E；N4D；N4D/D30N；N4D/D61N；N4D/D61N/N65D；N4D/D61N/E64Q/Q108E；N4D/E64Q；N4D/N65D；D8N/D61N；D8N/E64Q；D30N/E64Q；D30N/N65D；D30N/E64Q/N65D；D30N/Q180E；D61N/E64Q/N65D；E64Q；E64Q/N65D；E64Q/Q108E；及 N65D/Q108E。在一個實施例中，變異體 IL-15 蛋白包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列以及選自由以下各項所組成之群組的一個或多個胺基酸取代：N65D；D30N/E64Q/N65D；N4D/N65D；D30N/E64Q；及 D30N/N65D。在一些實施例中，變異體 IL-15 蛋白相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q。在一些實施例中，變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 319。
在一些實施例中，IL-15 Rα sushi 結構域蛋白包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-15 Rα 蛋白包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域具有選自由以下各項所組成之群組的一組胺基酸取代：S267K/L368D/K370S : S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L 和 K370S : S364K/E357Q (根據 EU 編號)。在某些實施例中，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含胺基酸取代 S267K/L368D/K370S : S267K/S364K/E357Q (根據 EU 編號)。在一些實施例中，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S (根據 EU 編號)。
在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白選自圖 115A~115C 所示之 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白群組。在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白選自由以下各項所組成之群組：XENP31967、XENP31968、XENP31969、XENP31970、XENP31971、XENP31972 和 XENP31973。在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白為 XENP31969。在一些實施例中，IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白為 XENP31972。
在一些實施例中，活化的效應 CD4 T 細胞為 FOXP3低 CD45RA- CD4+ T 細胞。
在一些實施例中，活化的效應 CD4 T 細胞具有減少的 CCR4 表現或為 CCR4lo/- 。
在一些實施例中，患者在接受投藥後表現出增加的 Treg 與效應記憶 T 細胞比率 (Treg/TEM )。
可用的非標靶 IL-15/IL-15Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白詳述於例如：2016 年 10 月 15 日所申請之美國臨時申請案第 62/408,655 號；2016 年 11 月 1 日所申請之美國臨時申請案第 62/416,087 號；2017 年 1 月 6 日所申請之美國臨時申請案第 62/443,465 號；2017 年 3 月 28 日所申請之美國臨時申請案第 62/477,926 號；2017 年 10 月 16 日所申請之美國專利公開號 US2018/0118805；2017 年 10 月 16 日所申請之 WO 公開號 WO2018071919；2018 年 4 月 18 日所申請之美國臨時申請案第 62/659,563 號；2018 年 6 月 12 日所申請之美國臨時申請案第 62/684,143 號；2018 年 8 月 29 日所申請之美國臨時申請案第 62/724,396 號；2018 年 11 月 7 日所申請之美國臨時申請案第 62/756,800 號；2019 年 4 月 18 日所申請之美國專利申請案第 16/388,174 號；以及 2019 年 4 月 18 日所申請之 PCT 專利申請案第 PCT/US19/28107 號，這些專利申請全文以引用方式併入本文，尤其是參考附圖、圖例、序列表及其中的申請專利範圍。
一種特別有用的非標靶 IL-15/IL-15Rα 異源二聚體 Fc 融合蛋白，用於對有需要的患者逆轉 TGFβ 介導的 T 細胞增殖的抑制，為 XmAb24306，其序列如圖 20 所示。
此外，標靶 IL-15/Rα X PD-1 異源二聚體 Fc 融合蛋白還可用於對有需要的患者逆轉 TGFβ 介導的 T 細胞增殖抑制的方法中。圖中的任何標的構建體都可用於本申請中，其中 XENP32435 特別有用。
Ⅶ. 本發明之核酸
本發明進一步提供了編碼本發明之異二聚體Fc 融合蛋白的核酸組成物 (或者，在單體 Fc 結構域蛋白的情況下，還包括編碼它們的核酸)。
如本領域的技術人員所認識到的，核酸組成物將取決於異二聚體 IL-15/Rα Fc 融合蛋白的形式。因此，例如當該形式需要三個胺基酸序列時，可將三個核酸序列併入一種或多種表現載體中進行表現。相似地，某些形式只需兩個核酸；同樣，它們可併入一種或兩種表現載體中。
如本領域中已知的，編碼本發明之成分的核酸可以如本領域中已知的那樣併入表現載體中，並且取決於用於產生本發明之異二聚體Fc 融合蛋白的宿主細胞。一般而言，核酸可操縱地連接至任意數量的調節元件 (啟動子、複製起點、選擇標記、核醣體結合位點、誘導劑等)。表現載體可為染色體外或整合載體。
然後將本發明之核酸及/或表現載體轉化為本領域中習知的任意數量的不同類型的宿主細胞，包括哺乳動物、細菌、酵母、昆蟲及/或真菌細胞，並且哺乳動物細胞 (例如 CHO 細胞) 可用於許多實施例中。
根據形式的不同，編碼各種單體的核酸通常包含在單個表現載體中，其通常受不同或相同的啟動子控制。在本發明之特定用途的實施例中，這兩種或三種核酸中的每一種均包含在不同的表現載體上。
本發明之異二聚體 Fc 融合蛋白透過培養包含本領域中習知的表現載體的宿主細胞而製成。製得後，即可完成傳統的融合蛋白或抗體純化步驟，包括離子交換色譜步驟。如本文所述，具有相差至少 0.5 的 pI 的兩個單體可透過離子交換色譜法或等電聚焦或對等電點靈敏的其他方法得到分離。亦即，包含改變每個單體的等電點 (pI) 的 pI 取代，使得每個單體具有不同的 pI，並且異二聚體也具有不同的 pI，從而有利於等電純化異二聚體 (例如，陰離子交換柱、陽離子交換柱)。這些取代還有助於確定並監測純化後的任何污染性同源二聚體 (例如，IEF 凝膠、cIEF 和分析型 IEX 色譜柱)。
Ⅷ. 雙特異性免疫查核點抗體 x IL-15/IL-15Rα 異二聚體免疫調節融合蛋白的生物學及生化功能
一般而言，將本發明之 Fc 融合蛋白透過本文所述的多種方式投予癌症患者，並評估其療效。因此，儘管可以運行標準療效測定，諸如癌症負荷、腫瘤大小、評估轉移是否存在及其程度等，但也可以根據免疫狀態評價結果來評估免疫腫瘤治療。這可以透過多種方式完成，包括體外和體內測定。例如，可評估免疫狀態的變化 (例如，評估接受 ipi 治療後是否存在 ICOS+CD4+T 細胞) 以及「傳統」測量結果，例如腫瘤負荷、大小、侵襲性、LN 參與、轉移等。因此，可評估以下任何或所有情況：融合蛋白對 CD4+ T 細胞活化或增殖、CD8+ T (CTL) 細胞活化或增殖，CD8+ T 細胞介導的細胞毒活性及/或 CTL 介導的細胞耗竭、NK 細胞活性和 NK 介導的細胞耗竭的抑制效應；融合蛋白對 Treg 細胞分化和增殖以及 Treg 或髓樣衍生抑制細胞 (MDSC) 介導的免疫抑制或免疫耐受的增強效應；及/或融合蛋白對免疫細胞產生的炎症細胞因子 (例如 T 或其他免疫細胞產生的 IL-2、IFN-ɣ 或 TNF-α) 的影響。
在一些實施例中，透過評估免疫細胞增殖 (使用例如 CFSE 稀釋法、免疫效應子細胞的 Ki67 胞內染色和3 H-胸苷結合法) 來評估治療效果。
在一些實施例中，透過評估基因表現的增加或與活化相關的標記的蛋白質水準的升高來來評估治療，這些標記包括以下一種或多種：透過 CD107A 的表面表現所測得之 CD25、CD69、CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40 和細胞脫粒。
一般而言，按照本領域中已知的方法進行基因表現測定。
一般而言，蛋白質表現測量也按照類似於本領域中已知的方法進行。
在一些實施例中，透過評估標靶細胞活力檢測所測得之細胞毒活性 (透過估計許多細胞參數，例如酶活性 (包括蛋白酶活性)、細胞膜通透性、細胞黏附、ATP 產生、輔酶產生和核苷酸攝取活性) 來評估治療效果。這些測定法的特定實例包括但不限於：台盼藍或 PI 染色、51 Cr 或35 S 釋放法、LDH 活性、MTT 及/或 WST 測定法、鈣黃綠素 AM 測定法、基於發光的測定法等。
在一些實施例中，透過評估由細胞因子產生所測得之 T 細胞活性來評估治療效果，其中使用習知的技術透過細胞因子 (包括但不限於 IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13) 對培養基上清液進行細胞測量。
因此，可使用評估一種或多種以下參數的測定法來評估治療效果：(i) 免疫反應增加；(ii) αβ 及/或 γδ T 細胞的活化增加；(iii) 細胞毒性 T 細胞活性升高；(iv) NK 及/或 NKT 細胞活性升高；(v) 減輕 αβ 及/或 γδ T 細胞抑制；(vi) 促炎性細胞因子分泌增加；(vii) IL-2 分泌增加；(viii) 干擾素產生增加；(ix) Th1 反應增加；(x) Th2 反應下降；(xi) 至少一種調節性 T 細胞 (Treg) 的細胞數量及/或活性減少或消除。
A.   競爭結合指標的測定
一般而言，可以運行表位聚類測定法 (例如本文所述) 以及其他競爭性抑制測定法 (例如本領域已知) 來確定 NCPD-1 Fv 是否與已批准的 PD-1 競爭結合抗體。表位聚類為使用競爭性免疫測定以成對組合方式檢測抗體的過程，並將競爭相同結合區 (亦即抗原的相同或密切相關的表位) 的抗體歸為一類。因此，與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗歸為不同表位的抗體被視為與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗不發生競爭。
非競爭性抗體可透過以下測定法進行測定，其中所檢測的抗體或免疫功能片段不阻止或抑制參考抗體與共同抗原的特異性結合。通常，該等測定涉及使用結合到固體表面或細胞上的純化抗原 (例如 PD-1 或結構域或其片段)。透過確定在第二抗體存在下與固體表面或細胞結合的第一抗體的量來測量競爭抑制。通常，當存在過量的競爭性抗體時，它對參考抗體與共同抗原的特異性結合的抑制程度為至少 30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70% 或 75%。在一些實例中，對結合的抑制程度為至少 80%、85%、90%、95% 或 97% 或更高。相反，當結合參考抗體時，它優選地對隨後添加的受試抗體 (即 PD-1 抗體) 的結合的抑制程度為至少 30%、40%、45%、50%、55%、60 %、65%、70% 或 75%。在一些實例中，對受試抗體結合的抑制程度為至少 80%、85%、90%、95% 或 97% 或更高。
一般而言，聚類或競爭性結合可使用多種本領域中公認的技術來確定，例如，免疫測定諸如蛋白質印跡、放射免疫測定、酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、「夾心」免疫測定、免疫沉澱測定、沉澱蛋白反應、凝膠擴散沉澱蛋白反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體固定測定、免疫放射測定、螢光免疫測定和蛋白 A 免疫測定。該等免疫測定為一般且在本領域中所習知 (參見 Ausubel 等人主編，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第 1 卷，John Wiley & Sons, Inc.，New York)。此外，可使用交叉阻斷測定法 (參見例如 WO 2003/48731；及 Harlow 等人(1988) Antibodies, A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow 和 David Lane)。
用於確定競爭性抑制作用 (及由此得到的「聚類」) 的其他技術包括：使用例如 BIAcore™ 2000 系統 (GE Healthcare) 的表面電漿共振；使用例如 ForteBio® Octet RED (ForteBio) 的生物膜干涉技術；或例如 FACSCanto II (BD Biosciences) 或多重 LUMINEX™ 檢測 (Luminex) 的細胞流式微珠陣列。本文實例 2 和實例 7 提供了一種使用生物膜干涉技術測定競爭結合的特定方法。
Luminex 為基於微珠的免疫測定平台，能夠實現大規模多重抗體配對。該測定法對抗體對與靶抗原的同步結合模式進行比較。成對抗體中的一種 (捕獲 mAb) 與 Luminex 微珠結合，其中，每個捕獲 mAb 與不同顏色的微珠結合。另一抗體 (檢測 mAb) 與螢光訊號 (例如藻紅蛋白 (PE)) 結合。該測定法分析抗體與抗原的同步結合 (配對)，並將具有相似配對特徵的抗體組合在一起。檢測 mAb 和捕獲 mAb 的相似特徵表示這兩種抗體結合到相同或密切相關的表位。在一個實施例中，可使用皮爾生相關係數確定配對特徵，以鑑定與供試抗體組中任何特定抗體最密切相關的抗體。在實施例中，如果抗體對的皮爾生相關係數為至少 0.9，則將供試/檢測 mAb 與參考/捕獲 mAb 歸入同一聚類中。在其他實施例中，皮爾生相關係數為至少 0.8、0.85、0.87 或 0.89。在另外的實施例中，皮爾生相關係數為至少 0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99 或 1。分析透過 Luminex 測定法獲得的數據的其他方法如美國專利第 8,568,992 號所述。Luminex 同時分析 100 種或更多不同類型微珠的能力提供了幾乎無限的抗原及/或抗體表面，從而透過生物傳感器測定提高了抗體表位分析的通量和分辨率 (Miller 等人，2011，PMID: 21223970)。
相似地，包含表面電漿共振的聚類技術適用於本發明。如本文所用之「表面電漿共振」係指一種光學現象，其允許透過檢測生物傳感器基質中蛋白質濃度的變化來分析實時特異性交互作用。使用 BIAcore™ 2000 系統等市售設備，可輕鬆確定所選抗體是否相互競爭結合指定的抗原。
在其他實施例中，可用於確定供試抗體是否與參考抗體「競爭」結合的技術為「生物膜干涉技術」，該方法是一種光學分析技術，分析從兩個表面反射的白光的干涉圖樣：生物傳感器尖端上的一層固定化蛋白以及一個內部參考層。結合至生物傳感器尖端的分子數量的任何變化都將導致可實時測量的干涉圖樣的變化。該等生物層干涉測定法可使用 ForteBio® Octet RED 儀器按照以下步驟進行。將參考抗體 (Ab1) 捕獲到抗小鼠捕獲晶片上，然後使用高濃度的非結合抗體將其封閉，並採集基線。然後用特異性抗體 (Ab1) 捕獲單體重組靶蛋白，將尖端浸入包含相同抗體 (Ab1) 作為對照的孔中或浸入具有包含供試抗體 (Ab2) 的孔中。如果未發生進一步結合 (透過比較結合水準與對照 Ab1 來確定)，則將 Ab1 和 Ab2 確定為「競爭」抗體。如果觀察到與 Ab2 的進一步結合，則確定 Ab1 和 Ab2 不相互競爭。可擴展此過程，以在代表獨特聚類的 96 孔板上使用一整排抗體來篩選大型獨特抗體庫。在實施例中，如果參考抗體將供試抗體與共同抗原的特異性結合抑制至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70% 或 75%，則供試抗體將與參考抗體存在競爭關係。在其他實施例中，對結合的抑制程度為至少 80%、85%、90%、95% 或 97% 或更高。
B.   用於測量療效的測定
在一些實施例中，如本領域所已知的，使用混合淋巴細胞反應 (MLR) 測定法來評估 T 細胞活化。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量免疫反應的升高或下降，例如透過不同因子的磷酸化或去磷酸化或透過測量其他翻譯後修飾來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 αβ 及/或 γδ T 細胞活化的增加或減少，例如透過細胞因子分泌或增殖或透過活化標記 (例如 CD137、CD107a、PD1) 的表現變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量細胞毒性 T 細胞活性的升高或下降，例如透過直接殺死標靶細胞 (例如癌細胞) 或透過細胞因子分泌或增殖或透過活化標記 (例如 CD137、CD107a、PD1) 的表現變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 NK 及/或 NKT 細胞活性的升高或下降，例如透過直接殺死標靶細胞 (例如癌細胞) 或透過細胞因子分泌或透過活化標記 (例如 CD107a) 的表現變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 αβ 及/或 γδ T-細胞抑制的增加或減少，例如透過細胞因子分泌或增殖或透過活化標記 (例如 CD137、CD107a、PD1) 的表現變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量促炎細胞因子分泌的增加或減少，例如透過 ELISA 或 Luminex 或基於微珠的多重方法或透過細胞內染色和 FACS 分析或透過 Alispot 等來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 IL-2 分泌的增加或減少，例如透過 ELISA 或 Luminex 或基於微珠的多重方法或透過細胞內染色和 FACS 分析或透過 Alispot 等來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量干擾素-β 產生的增加或減少，例如透過 ELISA 或 Luminex 或基於微珠的多重方法或透過細胞內染色和 FACS 分析或透過 Alispot 等來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 Th1 反應的增加或減少，例如透過細胞因子分泌或活化標記表現的變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 Th2 反應的增加或減少，例如透過細胞因子分泌或活化標記表現的變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量至少一種調節性 T 細胞 (Treg) 的細胞數量及/或活性的增加或減少，例如透過流式細胞分析技術或 IHC 來測量。反應降低表示免疫刺激活性。適當的減少與增加相同，如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 M2 巨噬細胞數量的增加或減少，例如透過流式細胞分析技術或 IHC 來測量。反應降低表示免疫刺激活性。適當的減少與增加相同，如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 M2 巨噬細胞促腫瘤原活性的升高或下降，例如透過細胞因子分泌或活化標記表現的變化來測量。反應降低表示免疫刺激活性。適當的減少與增加相同，如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 N2 中性粒細胞數量的增加或減少，例如透過流式細胞分析技術或 IHC 來測量。反應降低表示免疫刺激活性。適當的減少與增加相同，如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 N2 中性粒細胞促腫瘤原活性的升高或下降，例如透過細胞因子分泌或活化標記表現的變化來測量。反應降低表示免疫刺激活性。適當的減少與增加相同，如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 T 細胞活化抑制的增加或減少，例如透過細胞因子分泌或增殖或透過活化標記 (例如 CD137、CD107a、PD1) 的表現變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 CTL 活化抑制的增加或減少，例如透過直接殺死標靶細胞 (例如癌細胞) 或透過細胞因子分泌或增殖或透過活化標記 (例如 CD137、CD107a、PD1) 的表現變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測 αβ 及/或 γδ T 細胞耗竭的增加或減少，例如透過活化標記表現的變化來測量。反應降低表示免疫刺激活性。適當的減少與增加相同，如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 αβ 及/或 γδ T 細胞應答的增加或減少，例如透過細胞因子分泌或增殖或透過活化標記 (例如 CD137、CD107a、PD1) 的表現變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量抗原特異性記憶應答刺激的增加或減少，例如透過細胞因子分泌或增殖或透過活化標記 (例如 CD45RA、CCR7 等) 的表現變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量細胞凋亡或癌細胞溶解的增加或減少，例如透過細胞毒性測定 (例如 MTT、Cr 釋放、鈣調素 AM) 或基於流式細胞分析技術的測定 (例如 CFSE 稀釋或碘化丙啶染色等) 來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量對癌細胞的細胞毒性或細胞生長抑制作用的刺激的增加或減少，例如透過細胞毒性測定 (例如 MTT、Cr 釋放、鈣調素 AM) 或基於流式細胞分析技術的測定 (例如 CFSE 稀釋或碘化丙啶染色等) 來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量癌細胞直接殺滅的增加或減少，例如透過細胞毒性測定 (例如 MTT、Cr 釋放、鈣調素 AM) 或基於流式細胞分析技術的測定 (例如 CFSE 稀釋或碘化丙啶染色等) 來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量 Th17 活性的升高或下降，例如透過細胞因子分泌或增殖或活化標記表現的變化來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，訊號傳遞通道測定法測量補體依賴性細胞毒性及/或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性的誘導作用的升高或下降，例如透過細胞毒性測定 (例如 MTT、Cr 釋放、鈣調素 AM) 或基於流式細胞分析技術的測定 (例如 CFSE 稀釋或碘化丙啶染色等) 來測量。活性升高表示存在免疫刺激活性。活動的適當升高如下文所概述。
在一個實施例中，透過例如直接殺死標靶細胞 (例如癌細胞) 或透過細胞因子分泌或增殖或透過活化標記 (例如 CD137、CD107a、PD1) 的表現變化來測量 T 細胞活化。對於 T 細胞，增殖、活化的細胞表面標記 (例如 CD25、CD69、CD137、PD1)、細胞毒性 (殺死標靶細胞的能力) 和細胞因子產生 (例如 IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A) 的增加將作為免疫調節的指標，與增強的癌細胞殺滅力一致。
在一個實施例中，透過例如直接殺死標靶細胞 (例如癌細胞) 或透過細胞因子分泌或增殖或透過活化標記 (例如 CD107a) 的表現變化來測量 NK 細胞的活化。對於 NK 細胞，增殖、細胞毒性 (殺死標靶細胞並增加 CD107a、顆粒酶和穿孔素表現的能力) 和細胞因子產生 (例如 IFNγ 和 TNF) 以及細胞表面受體表現 (例如 CD25) 的增加將作為免疫調節的指標，與增強的癌細胞殺滅力一致。
在一個實施例中，透過例如細胞因子分泌或透過增殖或透過活化標記表現的變化來測量 γδ T 細胞活化。
在一個實施例中，透過例如細胞因子分泌或透過活化標記表現的變化來測量 Th1 細胞活化。
活性或反應的適當增加 (或適當減少，如上所述) 是指相對於參考樣本或對照樣本 (例如不含本發明之抗 PVRIG 抗體的供試品) 的訊號增加 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 98% 至 99%。相似地，相比於參考或對照樣本，療效至少增加 1 倍、2 倍、3 倍、4 倍或 5 倍。
Ⅸ. 查核點阻斷抗體
本文所述之本發明的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與其他治療劑聯合使用，這些治療劑包括查核點阻斷抗體，諸如但不限於 PD-1 抑制劑、TIM3 抑制劑、CTLA4 抑制劑、PD-L1 抑制劑、TIGIT 抑制劑、LAG3 抑制劑或其組合。
除下文所述之抗體以外，更多公開的抗體可參見 USSN 62/784,334，該專利申請全文 (特別是有關聯合使用的查核點抗體的討論) 以引用方式併入本文。
A.   抗 PD1 抗體
在一些實施例中，本文所述之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白可與查核點阻斷抗體 (例如抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體) 合並投予患有癌症的受試者。
在許多方面，PD-1 抑制劑為抗 PD-1 抗體，其選自不與本文所概述之抗 PD-1 非競爭性 Fv 序列競爭結合的那些抗體。特別有用的是那些已在美國或海外獲准人用的抗 PD-1 抗體，其中包括但不限於納武利尤單抗和帕博利珠單抗。
在一些實施例中，抗 PD-1 抗體為納武利尤單抗。納武利尤單抗的替代名稱包括 MDX- 1106、MDX-1106-04、ONO-4538 或 BMS-936558。在一些實施例中，抗 PD- 1 抗體為納武利尤單抗 (CAS 登記號：946414-94-4)。納武利尤單抗為特異性阻斷 PD1 的完整人 IgG4 單株抗體。納武利尤單抗 (選殖株 5C4) 以及與 PD1 特異性結合的其他人單株抗體公開於 US 8,008,449 和 WO2006/121168 中。在一個實施例中，PD-1 的抑制劑為納武利尤單抗，並且具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
在一些實施例中，抗 PD-1 抗體為帕博利珠單抗。帕博利珠單抗 (也稱為 Lambrolizumab、MK-3475、MK03475、SCH-900475 或 KEYTRUDA® ；Merck) 為與 PD-1 結合的人源化 IgG4 單株抗體。帕博利珠單抗及其他人源化抗 PD-1 抗體揭示於：Hamid, O. 等人(2013)New England Journal of Medicine 369 (2): 134–44、US 8,354,509 及 WO2009/114335。
在一些實施例中，抗 PD-1 抗體為 Pidilizumab。Pidilizumab (CT-011；Cure Tech) 為與 PD1 結合之人源化 IgG1k 單株抗體。Pidilizumab 及其他人源化抗 PD-1 單株抗體公開於 US 8,747,847 和 WO2009/101611 中。
其他抗 PD1 抗體包括 AMP 514 (Amplimmune)，例如 US 8,609,089、US 2010028330 及/或 US 20120114649 中公開的抗 PD1 抗體。
在一些實施例中，PD-1 抑制劑是一種免疫黏附素 (例如，包含與恒定區 (例如，免疫球蛋白序列的 Fc 區域) 融合的 PD-L1 或 PD-L2 的胞外或 PD-1 結合部分序列的免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1 抑制劑為 AMP-224 (B7-DCIg；Amplimmune；如 WO2010/027827 和 WO2011/066342 所公開)，其為阻斷 PD-1 與 B7-H1 之間的交互作用的 PD-L2 Fc 融合蛋白可溶性受體。
在一些實施例中，抗 PD-1 抗體可與本發明之 IL-15/Rα x 抗 PD1 異二聚體 Fc 融合蛋白聯合使用。存在多種抗 PD-1 抗體，其中包括但不限於目前已獲 FDA 批准的兩種抗體 (帕博利珠單抗和納武利尤單抗) 以及目前正在臨床試驗中的抗體 (包括但不限於 Tislelizumab、Sym021、REGN2810 (由 Rengeneron 開發)、JNJ-63723283 (由 J&J 開發)、SHR-1210、Pidilizumab、AMP-224、MEDIo680、PDR001 和 CT-001 以及 Liu 等人 (J. Hemat.& Oncol.(2017)10: 136)) 所概述的其他抗體 (其中所述的抗體明確地以引用方式併入本文)。
B.   抗 TIM3 抗體
本發明之 IL-15/Rα X [NC]PD-1 異二聚體融合蛋白也可與抗 TIM-3 抗體聯合投予。例示性非限制性抗 TIM-3 抗體分子公開於 2015 年 8 月 6 日公開的標題為「TIM-3 的抗體分子及其用途」的 US 2015/0218274 中，該專利公開全文以引用方式併入本文。
有多種 TIM-3 抗體正在臨床開發中，其中包括但不限於 MBG453、Sym023、BGB-A425 和 TSR-022。
在一個實施例中，抗 TIM-3 抗體分子包含至少一個或兩個重鏈變異域 (任選地包含恒定區)、至少一個或兩個輕鏈變異域 (任選地包含恒定區) 或兩者，其包含以下胺基酸序列：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或如 US 2015/0218274 的表 1-4 所述之序列；或由表 1-4 中的核苷酸序列編碼的序列；或與上述任意序列基本上相同 (例如同一性為 80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99% 或更高) 的序列。抗 TIM-3 抗體分子，任選包含來自 US 2015/0218274 中所示的重鏈、輕鏈或兩者的前導序列；或與其基本上相同的序列。
在又一個實施例中，抗 TIM-3 抗體分子包含來自本文所述之抗體的重鏈變異區及/或輕鏈變異區的至少一個、兩個或三個互補決定區 (CDR)，例如，抗體選自以下任意一者：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或如 US 2015/0218274 的表 1-4 所述之序列；或由表 1-4 中的核苷酸序列編碼的序列；或與上述任意序列基本上相同 (例如同一性為 80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99% 或更高) 的序列。
在又一個實施例中，抗 TIM-3 抗體分子包含來自重鏈變異區的至少一個、兩個或三個 CDR (或統稱所有 CDR)，其包含 US 2015/0218274 的表 1-4 所示或由表 1-4 所示的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。在一個實施例中，相對於表 1-4 所示或由表 1-4 所示的核苷酸序列編碼的胺基酸序列，一個或多個 CDR (或統稱所有 CDR) 具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個變化，例如胺基酸取代或缺失。
在又一個實施例中，抗 TIM-3 抗體分子包含來自輕鏈變異區的至少一個、兩個或三個 CDR (或統稱所有 CDR)，其包含 US 2015/0218274 的表 1-4 所示或由表 1-4 所示的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。在一個實施例中，相對於表 1-4 所示或由表 1-4 所示的核苷酸序列編碼的胺基酸序列，一個或多個 CDR (或統稱所有 CDR) 具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個變化，例如胺基酸取代或缺失。在某些實施例中，抗 TIM-3 抗體分子包括輕鏈 CDR 中的取代，例如輕鏈的 CDR1、CDR2 及/或 CDR3 中的一個或多個取代。
在另一個實施例中，抗 TIM-3 抗體分子包含來自重鏈和輕鏈變異區的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR (或統稱所有 CDR)，其包含 US 2015/0218274 的表 1-4 所示或由表 1-4 所示的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。在一個實施例中，相對於表 1-4 所示或由表 1-4 所示的核苷酸序列編碼的胺基酸序列，一個或多個 CDR (或統稱所有 CDR) 具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個變化，例如胺基酸取代或缺失。
C.   抗 CTLA4 抗體
本發明之 IL-15/Rα X [NC]PD-1 異二聚體融合蛋白也可與抗 CTLA-4 抗體聯合投予。適用於本文所概述的聯合療法的抗 CTLA-4 抗體包括但不限於一種目前已獲 FDA 批准的抗體 Ipilimumab 以及多種正在開發中的抗體 (包括 CP-675,206 和 AGEN-1884)。其他例示性抗 CTLA4 抗體包括 Tremelimumab (可得自 Pfizer 的 IgG2 單株抗體，以前稱為 Ticilimumab、CP-675,206)；和 Dim (CTLA-4 抗體，也稱為 MDX-010，CAS 號 477202-00-9)。其他例示性抗 CTLA-4 抗體揭示於例如美國專利第 5,811,097 號。
在一個實施例中，抗 CTLA4 抗體為 Ipilimumab，其公開於例如 US 5,811,097、US 7,605,238、WO00/32231 和 WO97/20574 中，並具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
在一個實施例中，抗 CTLA4 抗體為 Tremelimumab，其公開於例如 US 6,682,736 和 WO00/37504 中，並具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
D.   抗 PD-L1 抗體
本發明之 IL-15/Rα X [NC]PD-1 異二聚體融合蛋白也可與抗 PD-L1 抗體聯合投予。例示性非限制性抗 PD-L1 抗體分子公開於 2016 年 4 月 21 日公開的標題為「PD-L1 的抗體分子及其用途」的 US 2016/0108123 中，該專利公開全文以引用方式併入本文。
在一個實施例中，抗 PD-L1 抗體分子包含至少一個或兩個重鏈變異域 (任選地包含恒定區)、至少一個或兩個輕鏈變異域 (任選地包含恒定區) 或兩者，其包含以下胺基酸序列：BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N 或 BAP058-Clone-O；或如 US 2016/0108123 的表 1 所述之序列；或由表 1 中的核苷酸序列編碼的序列；或與上述任意序列基本上相同 (例如同一性為 80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99% 或更高) 的序列。
在又一個實施例中，抗 PD-L1 抗體分子包含來自本文所述的抗體的重鏈變異區及/或輕鏈變異區的至少一個、兩個或三個互補決定區 (CDR)，例如，抗體選自以下任意一者：BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N 或 BAP058-Clone-O；或如 US 2016/0108123 的表 1 所述之序列；或由表 1 中的核苷酸序列編碼的序列；或與上述任意序列基本上相同 (例如同一性為 80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99% 或更高) 的序列。
在一些實施例中，PD-L1 抑制劑為抗體分子。在一些實施例中，抗 PD-Ll 抑制劑選自：YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C、MDX-1105、阿特珠單抗、德瓦魯單抗、Avelumab 或 BMS936559。
在一些實施例中，抗 PD-L1 抗體為阿特珠單抗。阿特珠單抗 (也稱為 MPDL3280A 和 Atezo®；Roche) 為與人 PD-L1 結合之單株抗體。阿特珠單抗及其他人源化抗 PD-L1 抗體公開於 US 8,217,149 中，並且具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
在一些實施例中，抗 PD-L1 抗體為 Avelumab。Avelumab (也稱為 A09-246-2；Merck Serono) 為與人 PD-L1 結合之單株抗體。Avelumab及其他人源化抗 PD-L1 抗體公開於 US 9,324,298 和 WO2013/079174 中，並且具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
在一些實施例中，抗 PD-L1 抗體為德瓦魯單抗。德瓦魯單抗 (也稱為 MEDI4736；AstraZeneca) 為與人 PD-L1 結合之單株抗體。德瓦魯單抗及其他人源化抗 PD-L1 抗體公開於 US 8,779,108 中，並且具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
在一些實施例中，抗 PD-L1 抗體為 BMS-936559。BMS-936559 (也稱為 MDX-1105；BMS) 為與人 PD-L1 結合之單株抗體。BMS-936559 及其他人源化抗 PD-L1 抗體公開於 US 7,943,743 和 WO2007005874 中，並且具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
在一些實施例中，抗 PD-L1 抗體可與本發明之 IL-15/Rα x 抗 PD1 異二聚體 Fc 融合蛋白聯合使用。有多種 PD-L1 抗體，其中包括三種目前已獲 FDA 批准的抗體 (阿特珠單抗、Avelumab、德瓦魯單抗) 以及目前正在臨床試驗中的抗體 (包括但不限於 LY33000054 和 CS1001) 以及 Liu 等人 (J. Hemat.& Oncol.(2017)10: 136) 所概述的其他抗體 (其中所述的抗體明確地以引用方式併入本文)。
在一些實施例中，本文所述之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白可與 PD-L1 或 PD-L2 抑制劑 (例如，抗 PD-L1 抗體) 聯合使用。
E.   抗 TIGIT 抗體
本發明之 IL-15/Rα X [NC]PD-1 異二聚體融合蛋白也可與抗 TIGIT 抗體聯合投予。在一些實施例中，抗 TIGIT 抗體為 OMP-313M32。OMP-313M32 (OncoMed Pharmaceuticals) 為與 TIGIT 結合之單株抗體。OMP-313M32 及其他人源化抗 TIGIT 抗體公開於 US20160376365 和 WO2016191643 中，並且具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
在一些實施例中，抗 TIGIT 抗體為 BMS-986207。BMS-986207 (也稱為 ONO-4686；Bristol-Myers Squibb) 為與 TIGIT 結合之單株抗體。BMS-986207 及其他人源化抗 TIGIT 抗體公開於 US20160176963 和 WO2016106302 中，並且具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
在一些實施例中，抗 TIGIT 抗體為 MTIG7192。MTIG7192 (Genentech) 為與 TIGIT 結合之單株抗體。MTIG7192 及其他人源化抗 TIGIT 抗體公開於 US2017088613、WO2017053748 和 WO2016011264 中，並且具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
在一些實施例中，抗 TIGIT 抗體可與本發明之 IL-15/Rα x 抗 PD1 異二聚體 Fc 蛋白聯合使用。有多種 TIGIT 抗體正在臨床開發中，其中包括 BMS-986207、OMP-313M32 和 MTIG7192A。
F.    抗 LAG-3 抗體
本發明之 IL-15/Rα X [NC]PD-1 異二聚體融合蛋白也可與抗 LAG-3 抗體聯合投予。例示性非限制性抗 LAG-3 抗體分子公開於 2015 年 9 月 17 日公開的標題為「LAG-3 的抗體分子及其用途」的 US 2015/0259420 中，該專利公開全文以引用方式併入本文。
在一個實施例中，抗 LAG-3 抗體分子包含至少一個或兩個重鏈變異域 (任選地包含恒定區)、至少一個或兩個輕鏈變異域 (任選地包含恒定區) 或兩者，其包含以下胺基酸序列：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser) (例如 BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser, 或 BAP050-hum20-Ser)、BAP050-Clone-F、BAP050-Clone-G、BAP050-Clone-H、BAP050-Clone-I 或 BAP050-Clone-J；；或如 US 2015/0259420 的表 1 所述之序列；或由表 1 中的核苷酸序列編碼的序列；或與上述任意序列基本上相同 (例如同一性為 80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99% 或更高) 的序列。
在又一個實施例中，抗 LAG-3 抗體分子包含來自本文所述之抗體的重鏈變異區及/或輕鏈變異區的至少一個、兩個或三個互補決定區 (CDR)，例如，抗體選自以下任意一者：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser) (例如 BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser 或 BAP050-hum20-Ser)、BAP050-Clone-F、BAP050-Clone-G、BAP050-Clone-H、BAP050-Clone-I 或 BAP050-Clone-J；或如 US 2015/0259420 的表 1 所述之序列；或由表 1 中的核苷酸序列編碼的序列；或與上述任意序列基本上相同 (例如同一性為 80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99% 或更高) 的序列。
在一些實施例中，抗 LAG-3 抗體為 BMS-986016。BMS-986016 (也稱為 BMS986016；Bristol-Myers Squibb) 為與 LAG-3 結合之單株抗體。BMS-986016 及其他人源化抗 LAG-3 抗體公開於 US 2011/0150892、WO2010/019570 和 WO2014/008218 中。
在一些實施例中，抗 LAG3 抗體為 LAG525。LAG525 (也稱為 IMP701；Novartis) 為與 LAG3 結合之單株抗體。LAG525 及其他人源化抗 LAG3 抗體公開於 US 9,244,059 和 WO2008132601 中，並且具有本文所公開之序列 (或與指定的序列基本上相同或相似，例如序列同一性為至少 85%、90%、95% 或更高)。
其他例示性抗 LAG-3 抗體公開於例如 US2011150892 和 US2018066054 中。
在一些實施例中，抗 LAG-3 抗體可與本發明之 IL-15/Rα x 抗 PD1 雙功能異二聚體融合蛋白聯合使用。有多種抗 LAG-3 抗體正在臨床開發中，其中包括 REGN3767 (Regeneron) 和 TSR-033 (Tesaro)。
Ⅹ. 醫藥調配物
如本文所述之異二聚體 Fc 融合蛋白的醫藥調配物是藉由將具有所需純度的該等異二聚體 Fc 融合蛋白與一種或多種任選的藥學上可接受的載體來製備 (Remington's Pharmaceutical Sciences ，第 16 版，Osol, A 主編 (1980)，以引用方式併入本文) (凍乾製劑或水溶液的形式)。藥學上可接受的載體是大致上在利用之劑量及濃度下對接受者無毒性。
本文所述之製劑還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。例如，可能需要進一步提供查核點阻斷抗體，諸如但不限於 PD-1 抑制劑、TIM3 抑制劑、CTLA4 抑制劑、PD-L1 抑制劑、TIGIT 抑制劑、LAG3 抑制劑或其組合。在一些實施例中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。該等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
欲用於活體內投予之調配物通常係無菌的。無菌性可易於例如透過無菌濾膜過濾來實現。
Ⅺ . 治療方法和組成物
製得後，本發明之組成物可用於許多腫瘤學應用中，包括治療癌症 通常用本發明之異二聚體 Fc 融合蛋白的結合促進 T 細胞活化 (例如，T 細胞不再受到抑制)。
因此，本發明之異二聚體 Fc 蛋白組成物可用於治療這些癌症。
本文所提供之任意異二聚體 Fc 融合蛋白均可用於治療方法中。
在一個方面，提供了用作藥物的異二聚體 Fc 融合蛋白。在另一些方面，提供了用於治療癌症的異二聚體 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，提供了在一種治療方法中使用的異二聚體 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，本發明提供了在用於治療患有癌症的個體的方法中使用的異二聚體 Fc 融合蛋白，該方法包括向該個體投予有效量之異二聚體 Fc 融合蛋白。在一個該等實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外的治療劑 (例如下文所述) 投予個體。在另一些方面，本發明提供了促進 T 細胞活化 (例如，T 細胞不再受到抑制) 的異二聚體 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，本發明提供了在用於促進個體的 T 細胞活化 (例如，T 細胞不再受到抑制) 的方法中使用的異二聚體 Fc 融合蛋白，該方法包括向該個體投予有效量之異二聚體 Fc 融合蛋白以促進 T 細胞活化。根據上述任一實施例的「個體」較佳地為人。
在另一方面，本發明提供了異二聚體 Fc 融合蛋白在藥物生產或製備中的用途。在一個實施例中，該藥物用於治療癌症。在另一個實施例中，藥物用於治療癌症的方法中，該方法包括向患有癌症的個體投予治療有效量之藥物。在一個該等實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外的治療劑 (例如下文所述) 投予個體。在另一個實施例中，藥物用於促進 T 細胞活化 (例如，T 細胞不再受到抑制)。在另一個實施例中，該藥物用於在個體中促進 T 細胞活化 (例如，T 細胞不再受到抑制) 的方法中，該方法包括向個體投予有效量之藥物以促進 T 細胞活化。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
在另一方面，本發明提供了一種治療癌症的方法。在一個實施例中，該方法包括向患有該等癌症的個體投予有效量之異二聚體 Fc 融合蛋白。在一個該等實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外的治療劑 (如下文所述) 投予個體。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
在另一方面，本發明提供了在個體中促進 T 細胞活化 (例如，T 細胞不再受到抑制) 的方法。在一個實施例中，該方法包括向該個體投予有效量之異二聚體 Fc 融合蛋白以促進 T 細胞活化。在一個實施例中，「個體」為人。
在另一方面，本發明提供了包含本文所提供之任何異二聚體 Fc 融合蛋白的醫藥調配物，例如用於以上任何治療方法。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任何異二聚體 Fc 融合蛋白以及藥學上可接受之載體。在另一個實施例中，醫藥調配物包含包含本文所提供之任何異二聚體 Fc 融合蛋白以及至少一種額外的治療劑 (如下文所述)。
本發明之異二聚體 Fc 融合蛋白可單獨或與其他藥劑聯合用於治療中。例如，異二聚體 Fc 融合蛋白可與至少一種額外的治療劑聯合投予。在某些實施例中，額外的治療劑為查核點阻斷抗體，諸如但不限於 PD-1 抑制劑、TIM3 抑制劑、CTLA4 抑制劑、PD-L1 抑制劑、TIGIT 抑制劑、LAG3 抑制劑或其組合。在一些實施例中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
上面提到的該等聯合療法涵蓋聯合施用 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的製劑中)，以及單獨施用，在這種情況下，本發明之異二聚體 Fc 融合蛋白的施用可在施用附加的一種或多種治療劑之前、同時和/或之後發生。在一個實施例中，投於本發明之異二聚體 Fc 融合蛋白及投於額外的治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、二天、三天、四天、五天、或六天內。本發明之異二聚體 Fc 融合蛋白也可與放療聯合使用。
A.   給藥
在本語境下，「聯合」投予係指在受試者患有疾病的過程中向受試者提供兩種治療，例如，在診斷出受試者患有疾病後以及疾病治愈前或因其他原因停止治療之前提供兩種或更多種治療。在一些實施例中，一種治療的提供在第二種治療開始時仍在繼續，因此在投予方面存在重疊。這在本文中有時稱為「同步」或「同時提供」。在其他實施例中，一種治療的提供在另一種治療開始之前結束。在任何一種情況的一些實施例中，由於聯合投予，治療更有效。例如，第二種療法更有效，例如與在不投予第一種療法的情況下進行第二種治療相比，在減少第二種治療時觀察到等效的效果，或者第二種治療在更大程度上減輕症狀，或者在第一種治療中觀察到類似的情況。在一些實施例中，提供治療以使得症狀減少或與疾病相關的其他參數下降的幅度大於在不進行另一種治療的情況下所觀察到的結果。兩種治療的效果可以是部分累加、完全累加或大於累加。提供治療可使得當提供第二種療法時仍可檢測到提供的第一種療法的效果。
B.   用於體內投予的製劑
本發明之異二聚體 Fc 融合蛋白將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥和施用。此背景中考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、施用方法、施用日程及醫療從業者已知的其他因素。該異二聚體 Fc 融合蛋白並非必須、但可以任選與一種或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑一起配製。該等其他藥物的有效量取決於製劑中存在的異二聚體 Fc 融合蛋白的含量、疾病或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些藥物通常以與本文中所述相同的劑量和給藥途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量和透過任意途徑使用。
所使用之根據本發明的抗體製劑是藉由將具有所需純度的抗體與任選的藥物上可接受之載體、賦形劑或穩定劑混合來製備並將其儲存起來 (如以下文獻中所總體概述：Remington's Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol, A. 主編[1980]) (以凍乾製劑或水溶液的形式)。
C.   給藥方式
本發明的異二聚體 Fc 融合蛋白 (和任何附加的治療劑) 可藉由任何合適的方式、例如靜脈內來投予。根據受試者的情況確定合適的投予途徑和給藥時間，屬於技術領域內。
根據已知的方法，例如靜脈推注或在一段時間內連續輸注，將本文所公開之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白和本發明的化學治療劑投於受試者。
Ⅻ. 編號實施例
在以下編號段落中闡述了本公開的特定實施例： A1.一種組成物，其包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD)，該抗 PD-1 抗原結合結構域包含： a) 變異體重鏈變異域，其相比於 SEQ ID NO:5，包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；以及 b) 輕鏈變異域，其選自由以下各項所組成之群組： i) SEQ ID NO:168；及 ⅱ) 變異體輕鏈結構域，其相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W； 其中，所述 ABD 與人 PD-1 結合，並且不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1。 A2.如 A1 所述之組成物，其中，所述變異體重鏈結構域具有胺基酸取代 F32L/W100F，並且所述變異體輕鏈結構域具有胺基酸取代 N27dH/K30Y/S93T。 A3.如任何先前 A 段所述之組成物，其中，所述變異體重鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：H1.176、H1.177、H1.178、H1.179、H1.180、H1.181、H1.182、H1.183、H1.184、H1.185、H1.186、H1.187、H1.188、H1.189、H1.190、H1.191、H1.192、H1.193、H1.194、H1.195、H1.196、H1.197、H1.198、H1.199、H1.200、H1.201、H1.202、H1.203、H1.204、H1.205、H1.206、H1.207、H1.208、H1.209、H1.210、H1.211、H1.212、H1.213、H1.214、H1.215、H1.216、H1.217、H1.218、H1.219、H1.220、H1.221、H1.222、H1.223 和 H1.224。 A4.如任何先前 A 段所述之組成物，其中，所述變異體輕鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：L1.1、L1.3、L1.45、L1.117、L1.129、L1.135、L1.136 和 L1.140。 A5.如任何先前 A 段所述之組成物，其中，所述變異體重鏈結構域為 H1.176，並且所述變異體輕鏈結構域為 L1.140。 A6.如任何先前 A 段所述之組成物，其中，所述融合蛋白為 XENP32435。 A7.一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸，該第一核酸編碼如任何先前 A 段所述之輕鏈變異域；及 b) 第二核酸，該第二核酸編碼如任何先前 A 段所述之重鏈變異域。 A8.一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，該第一表現載體包含 A7 段所述之第一核酸；及 b) 第二表達載體，該第二表達載體包含 A7 段所述之第二核酸。 B1.一種組成物，其包含相比於 SEQ ID NO:2 之變異體 IL-15 蛋白；所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A。 B2.如 B1 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白進一步包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D 和 Q108E。 B3.如任何先前 B 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。 B4.如任何先前 B 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/E64Q/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。 B5.如任何先前 B 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q。 B6.如任何先前 B 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。 B7.如任何先前 B 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。 C1.一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域，並且不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1；其中，相比於 SEQ ID NO:5，所述 VH 為包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代的變異體重鏈變異域：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；其中，所述 VL 結構域選自由以下各項所組成之群組： i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W。 C2.如 C1 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：H1.176、H1.177、H1.178、H1.179、H1.180、H1.181、H1.182、H1.183、H1.184、H1.185、H1.186、H1.187、H1.188、H1.189、H1.190、H1.191、H1.192、H1.193、H1.194、H1.195、H1.196、H1.197、H1.198、H1.199、H1.200、H1.201、H1.202、H1.203、H1.204、H1.205、H1.206、H1.207、H1.208、H1.209、H1.210、H1.211、H1.212、H1.213、H1.214、H1.215、H1.216、H1.217、H1.218、H1.219、H1.220、H1.221、H1.222、H1.223 和 H1.224。 C3.如任何先前 C 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體輕鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：L1.1、L1.3、L1.45、L1.117、L1.129、L1.135、L1.136 和 L1.140。 C4.如任何先前 C 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域為 H1.176，並且所述變異體輕鏈結構域為 L1.140。 D1.一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域，並且不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1。 D2.如任何先前 D 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。 D3.如任何先前 D 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/E64Q/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。 D4.如任何先前 D 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q。 D5.如任何先前 D 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。 D6.如任何先前 D 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。 D7.如任何先前 D 段所述之組成物，其中，所述第一結構域連接子為 GGGGA。 E1.一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域，並且不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1；其中，相比於 SEQ ID NO:5，所述 VH 為包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代的變異體重鏈變異域：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；其中，所述 VL 結構域選自由以下各項所組成之群組： i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W； 其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。 E2.如任何先前 E 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白進一步包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/E64Q/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。 E3.如任何先前 E 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域為 H1.176，並且所述變異體輕鏈結構域為 L1.140。 E4.如任何先前 E 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q。 E5.如任何先前 E 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。 E6.如任何先前 E 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。 E7.如任何先前 E 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域為 H1.176，所述變異體輕鏈結構域為 L1.140，並且所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。 E8.如任何先前 E 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域為 H1.176，所述變異體輕鏈結構域為 L1.140，並且所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。 E9.如任何先前 E 段所述之融合蛋白，其中，所述第一結構域連接子包含 GGGGA。
在以下編號段落中闡述了本公開的特定實施例： 1.一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15/Rα sushi 結構域； ii) 第一結構域連接子； iii) IL-15 結構域；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域； b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域 (ABD)，其中，相比於 SEQ ID NO:5，根據 Kabat 編號，所述 VH 為包含 F32L/W100F 胺基酸取代之變異體重鏈變異域；並且其中，相比於 SEQ ID NO:168，根據 Kabat 編號，所述 VL 為包含 N27dH/K30Y/S93T 之變異體輕鏈變異域。 2.如第 1 段所述之融合蛋白，其中，所述 VH 包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述 VL 包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。 3.如第 1 段或第 2 段所述之融合蛋白，其中，所述 IL-15 結構域為變異體 IL-15 結構域，其包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：D30N/E64Q/N65D、N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。 4.如第 1 段至第 3 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述 IL-15 結構域為變異體 IL-15 結構域，其包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A 或其組合。 5.如第 1~4 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述 IL-15 結構域為變異體 IL-15 結構域，其包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q。 6.如第 1~5 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。 7.如第 1~6 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一單體進一步包含介於 IL-15 結構域與第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。 8.一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域 (ABD)。 9.如第 8 段所述之融合蛋白，其中，所述 VH 包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，並且所述 VL 包含 SEQ ID NO:168 之胺基酸序列。 10.如第 8 段所述之融合蛋白，其中，所述 VH 包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述 VL 包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。 11.如第 8 段所述之融合蛋白，其中，所述 ABD 不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1。 12.如第 8-11 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。 13.如第 8-12 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一單體進一步包含介於 IL-15 結構域與第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。 14.一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域 (ABD)，其中，相比於 SEQ ID NO:5，根據 Kabat 編號，所述 VH 為包含 F32L/W100F 胺基酸取代之變異體重鏈變異域：並且其中，相比於 SEQ ID NO:168，根據 Kabat 編號，所述 VL 為包含 N27dH/K30Y/S93T 之變異體輕鏈變異域。 15.如第 14 段所述之融合蛋白，其中，所述 VH 包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述 VL 包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。 16.如第 14 段或第 15 段所述之融合蛋白，其中，第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。 17.如第 14~16 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一單體進一步包含介於 IL-15 結構域與第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。 18.如第 1~17 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C (根據 EU 編號)。 19.如第 18 段所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。 20.如第 1~19 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自獨立地包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 和 E233P/L234V/L235A/G236del。 21.如第 20 段所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。 22.如第 1~21 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一 Fc 結構域包含胺基酸取代 Q295E/N384D/Q418E/N481D。 23.如第 1~22 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S。 24.如第 1、8 及 14 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 225，該第二單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 244，且該第三單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 196。 25.一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如第 1~24 段中任一項所述之第一單體； b) 第二核酸分子，其編碼如第 1~24 段中任一項所述之第二單體；及/或 c) 第三核酸分子，其編碼如第 1~24 段中任一項所述之第三單體。 26.一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如第 25 段所述之第一核酸分子； b) 第二表現載體，其包含如第 25 段所述之第二核酸分子；及/或 c) 第三表現載體，其包含如第 25 段所述之第三核酸分子。 27.一種表現載體，其包含如第 25 段所述之第一核酸分子、如第 25 段所述之第二核酸分子以及如第 25 段所述之第三核酸分子。 28.一種宿主細胞，其包含如第 26 段所述之表現載體組成物以及如第 27 段所述之表現載體。 29.一種製備融合蛋白之方法，該方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如第 28 段所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。 30.一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域；其中，根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:5，所述 VH 為包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代的變異體重鏈變異域：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；其中，所述 VL 結構域選自由以下各項所組成之群組： i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W； 其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。 31.如第 30 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白進一步包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：D30N/E64Q/N65D、N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。 32.如第 30 段或第 31 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述變異體輕鏈結構域包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。 33.如第 30~32 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q。 34.如第 30~33 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。 35.如第 30~34 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。 36.如第 30~35 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域為 H1.176，所述變異體輕鏈結構域為 L1.140，並且所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。 37.如第 30~36 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域為 H1.176，所述變異體輕鏈結構域為 L1.140，並且所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。 38.如第 30~37 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一結構域連接子包含 GGGGA (SEQ ID NO: 8)。 39.如第 30~38 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。 40.如第 30~39 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一單體進一步包含介於 IL-15 結構域與第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。 41.如第 30~40 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C (根據 EU 編號)。 42.如第 41 段所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。 43.如第 30~42 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自獨立地包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 和 E233P/L234V/L235A/G236del。 44.如第 43 段所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。 45.如第 30~44 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一 Fc 結構域包含胺基酸取代 Q295E/N384D/Q418E/N481D。 46.如第 30~45 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S。 47.如第 30~46 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 225。 48.如第 30~47 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第二單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 244。 49.如第 30~48 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第三單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 196。 50.如第 30~49 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 225；該第二單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 244；且該第三單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 196。 51.一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如第 30~50 段中任一項所述之第一單體； b) 第二核酸分子，其編碼如第 30~50 段中任一項所述之第二單體；及/或 c) 第三核酸分子，其編碼如第 30~50 段中任一項所述之第三單體。 52.一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如第 51 段所述之第一核酸分子； b) 第二表現載體，其包含如第 51 段所述之第二核酸分子；及/或 c) 第三表現載體，其包含如第 51 段所述之第三核酸分子。 53.一種表現載體，其包含如第 51 段所述之第一核酸分子、如第 51 段所述之第二核酸分子以及如第 51 段所述之第三核酸分子。 54.一種宿主細胞，其包含如第 52 段所述之表現載體組成物以及如第 53 段所述之表現載體。 55.一種製備融合蛋白之方法，該方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如第 54 段所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。 56.一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域；其中，根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:5，所述 VH 為包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代的變異體重鏈變異域：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；其中，所述 VL 結構域選自由以下各項所組成之群組： i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W。 57.如第 56 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：H1.176、H1.177、H1.178、H1.179、H1.180、H1.181、H1.182、H1.183、H1.184、H1.185、H1.186、H1.187、H1.188、H1.189、H1.190、H1.191、H1.192、H1.193、H1.194、H1.195、H1.196、H1.197、H1.198、H1.199、H1.200、H1.201、H1.202、H1.203、H1.204、H1.205、H1.206、H1.207、H1.208、H1.209、H1.210、H1.211、H1.212、H1.213、H1.214、H1.215、H1.216、H1.217、H1.218、H1.219、H1.220、H1.221、H1.222、H1.223 和 H1.224。 58.如第 56 段或第 57 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體輕鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：L1.1、L1.3、L1.45、L1.117、L1.129、L1.135、L1.136 和 L1.140。 59.如第 56~58 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述變異體輕鏈結構域包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。 60.如第 56~59 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。 61.如第 56~60 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一單體進一步包含介於 IL-15 結構域與第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。 62.如第 56~61 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C (根據 EU 編號)。 63.如第 62 段所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。 64.如第 56~63 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自獨立地包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 和 E233P/L234V/L235A/G236del。 65.如第 64 段所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。 66.如第 56~65 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一 Fc 結構域包含胺基酸取代 Q295E/N384D/Q418E/N481D。 67.如第 56~66 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S。 68.一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如第 56~67 段中任一項所述之第一單體； b) 第二核酸分子，其編碼如第 56~67 段中任一項所述之第二單體；及/或 c) 第三核酸分子，其編碼如第 56~67 段中任一項所述之第三單體。 69.  一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如第 68 段所述之第一核酸分子； b) 第二表現載體，其包含如第 68 段所述之第二核酸分子；及/或 c) 第三表現載體，其包含如第 68 段所述之第三核酸分子。 70.一種表現載體，其包含如第 68 段所述之第一核酸分子、如第 68 段所述之第二核酸分子以及如第 68 段所述之第三核酸分子。 71.一種宿主細胞，其包含如第 69 段所述之表現載體組成物以及如第 70 段所述之表現載體。 72.一種製備融合蛋白之方法，該方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如第 71 段所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。 73.一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域，並且不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1。 74.如第 73 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。 75.如第 73 段或第 74 段所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/E64Q/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。 76.如第 73~75 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q。 77.如第 73~76 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。 78.如第 73~77 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。 79.如第 73~78 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一結構域連接子為 GGGGA (SEQ ID NO: 8)。 80.如第 73~79 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。 81.如第 73~80 段中任一項所述之融合蛋白，其中，第一單體進一步包含介於 IL-15 結構域與第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。 82.如第 73~81 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C (根據 EU 編號)。 83.如第 82 段所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。 84.如第 73~83 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自獨立地包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 和 E233P/L234V/L235A/G236del。 85.如第 84 段所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。 86.如第 73~85 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一 Fc 結構域包含胺基酸取代 Q295E/N384D/Q418E/N481D。 87.如第 73~86 段中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S。 88.一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如第 73~87 段中任一項所述之第一單體； b) 第二核酸分子，其編碼如第 73~87 段中任一項所述之第二單體；及/或 c) 第三核酸分子，其編碼如第 73~87 段中任一項所述之第三單體。 89.一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如第 88 段所述之第一核酸分子； b) 第二表現載體，其包含如第 88 段所述之第二核酸分子；及/或 c) 第三表現載體，其包含如第 88 段所述之第三核酸分子。 90.一種表現載體，其包含如第 88 段所述之第一核酸分子、如第 88 段所述之第二核酸分子以及如第 88 段所述之第三核酸分子。 91.一種宿主細胞，其包含如第 89 段所述之表現載體組成物以及如第 90 段所述之表現載體。 92.一種製備融合蛋白之方法，該方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如第 91 段所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。 93.一種組成物，其包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD)，該抗 PD-1 抗原結合結構域包含： a) 變異體重鏈變異域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:5，包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；以及 b) 輕鏈變異域，其選自由以下各項所組成之群組： i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W； 其中，所述 ABD 與人 PD-1 結合。 94.如第 93 段所述之組成物，其中，所述變異體重鏈結構域具有根據 Kabat 編號之胺基酸取代 F32L/W100F；並且所述變異體輕鏈結構域具有根據 Kabat 編號之胺基酸取代 N27dH/K30Y/S93T。 95.如第 93 段或第 94 段所述之組成物，其中，所述變異體重鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：H1.176、H1.177、H1.178、H1.179、H1.180、H1.181、H1.182、H1.183、H1.184、H1.185、H1.186、H1.187、H1.188、H1.189、H1.190、H1.191、H1.192、H1.193、H1.194、H1.195、H1.196、H1.197、H1.198、H1.199、H1.200、H1.201、H1.202、H1.203、H1.204、H1.205、H1.206、H1.207、H1.208、H1.209、H1.210、H1.211、H1.212、H1.213、H1.214、H1.215、H1.216、H1.217、H1.218、H1.219、H1.220、H1.221、H1.222、H1.223 和 H1.224。 96.如第 93~95 段中任一項所述之組成物，其中，所述變異體輕鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：L1.1、L1.3、L1.45、L1.117、L1.129、L1.135、L1.136 和 L1.140。 97.如第 93~96 段中任一項所述之組成物，其中，所述變異體重鏈結構域包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述變異體輕鏈結構域包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。 98.如第 93~97 段中任一項所述之組成物，其中，所述組成物包含全長抗 PD-1 抗體。 99.如第 93~98 段中任一項所述之組成物，其中，所述組成物包含融合蛋白。 100.如第 99 段所述之組成物，其中，所述融合蛋白為 XENP32435。 101.一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如第 93~100 段中任一項所述之輕鏈變異域；及/或 b) 第二核酸分子，其編碼如第 93~100 段中任一項所述之重鏈變異域。 102.一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如第 101 段所述之第一核酸分子；及/或 b) 第二表現載體，其包含如第 101 段所述之第二核酸分子。 103.一種表現載體，其包含如第 101 段所述之第一核酸分子以及如第 101 段所述之第二核酸分子。 104.一種宿主細胞，其包含如第 102 段所述之表現載體組成物以及如第 103 段所述之表現載體。 105.一種製備包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 的組成物之方法；所述方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如第 104 段所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。 106.一種組成物，其包含相比於 SEQ ID NO:2 之變異體 IL-15 蛋白；所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A。 107.如第 106 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白進一步包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D 和 Q108E。 108.如第 106 段或第 107 段所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。 109.如第 106~108 段中任一項所述之組成物，其中，所述變異體 IL‑15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/E64Q/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。 110.如第 106~109 段中任一項所述之組成物，其中，所述變異體 IL‑15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q。 111.如第 106~110 段中任一項所述之組成物，其中，所述變異體 IL‑15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。 112.如第 106~111 段中任一項所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。 113.一種核酸組成物，其包含編碼如第 106~112 段中任一項所述之變異體 IL-15 蛋白的核酸分子。 114.一種表現載體，其包含如第 113 段所述之核酸分子。 115.一種宿主細胞，其包含如第 114 段所述之表現載體。 116.一種製備包含變異體 IL-15 蛋白的組成物之方法；所述方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如第 115 段所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。 117.一種異二聚體蛋白，其包含： a) 第一融合蛋白，其包含： i) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q； ii) 結構域連接子；及 iii) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二融合蛋白，其包含： i) IL-15Rα sushi 結構域； ii) 結構域連接子；及 iii) 第二變異體 Fc 結構域。 118.如第 117 段所述之異二聚體蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含 SEQ ID NO:319 之胺基酸序列。 119.如第 117 段或第 118 段所述之異二聚體蛋白，其中，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C (根據 EU 編號)。 120.如第 119 段所述之異二聚體蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。 121.如第 117~120 段中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含 428L/434S。 122.如第 117 段所述之融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白包含 SEQ ID NO:208 之胺基酸序列，並且所述第二融合蛋白包含 SEQ ID NO:95 之胺基酸序列。 123.如第 117 段所述之融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白包含 SEQ ID NO:211 之胺基酸序列，並且所述第二融合蛋白包含 SEQ ID NO:206 之胺基酸序列。 124.一種醫藥組成物，其包含如第 1~24、30~50、56~67 和 73~87 段中任一項所述之融合蛋白以及藥學上可接受之載體。 125.一種醫藥組成物，其包含由如第 93~100 段中任一項所述之抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 所組成之組成物以及藥學上可接受之載體。 126.一種醫藥組成物，其包含由如第 106~112 段中任一項所述之變異體 IL-15 蛋白所組成之組成物以及藥學上可接受之載體。 127.一種醫藥組成物，其包含如第 117~123 段中任一項所述之異二聚體蛋白以及藥學上可接受之載體。 128.一種治療受試者的癌症之方法，該方法包含向有需要彼之受試者投予治療有效量之如第 1~24、30~50、56~67 和 73~87 段中任一項所述之融合蛋白或如第 124 段所述之醫藥組成物。 129.如第 128 段所述之方法，其中，該方法進一步包含投予治療有效量之查核點阻斷抗體。 130.如第 129 段所述之方法，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 131.如第 130 段所述之方法，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 132.一種治療受試者的癌症之方法，該方法包含向有需要彼之受試者投予治療有效量之如第 93~100 段中任一項所述之包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 之組成物或如第 125 段所述之醫藥組成物。 133.如第 132 段所述之方法，其中，該方法進一步包含投予治療有效量之查核點阻斷抗體。 134.如第 133 段所述之方法，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 135.如第 134 段所述之方法，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 136.一種治療受試者的癌症之方法，該方法包含向有需要彼之受試者投予治療有效量之如第 106~112 段中任一項所述之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或如第 126 段所述之醫藥組成物。 137.如第 136 段所述之方法，其中，該方法進一步包含投予治療有效量之查核點阻斷抗體。 138.如第 137 段所述之方法，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 139.如第 138 段所述之方法，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 140.一種治療受試者的癌症之方法，該方法包括向需要彼之受試者投予治療有效量之如第 117~123 段中任一項所述之異二聚體蛋白或如第 127 段所述之醫藥組成物。 141.如第 140 段所述之方法，其中，該方法進一步包含投予治療有效量之查核點阻斷抗體。 142.如第 141 段所述之方法，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 143.如第 142 段所述之方法，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 144.如第 1~24、30~50、56~67 和 73~87 段中任一項所述之融合蛋白或如第 124 段所述之醫藥組成物用於生產供治療有治療需要的受試者之癌症的藥物之用途。 145.如第 144 段所述之用途，其中，藥物配製成與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。 146.如第 145 段所述之用途，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 147.如第 146 段所述之用途，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 148.如第 93~100 段中任一項所述之包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 的組成物或如第 124 段所述之醫藥組成物用於生產供治療有治療需要的受試者之癌症的藥物之用途。 149.如第 148 段所述之用途，其中，藥物配製成與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。 150.如第 149 段所述之用途，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 151.如第 150 段所述之用途，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 152.如第 106~112 段中任一項所述之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或如第 126 段所述之醫藥組成物用於生產供治療有治療需要的受試者之癌症的藥物之用途。 153.如第 152 段所述之用途，其中，藥物配製成與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。 154.如第 153 段所述之用途，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 155.如第 154 段所述之用途，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 156.如第 117~123 段中任一項所述之異二聚體蛋白或如第 127 段所述之醫藥組成物用於生產供治療有治療需要的受試者之癌症的藥物之用途。 157.如第 156 段所述之用途，其中，藥物配製成與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。 158.如第 157 段所述之用途，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 159.如第 158 段所述之用途，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 160.用於治療有治療需要的受試者之癌症的如第 1~24、30~50、56~67 和 73~87 段中任一項所述之融合蛋白或如第 124 段所述之醫藥組成物。 161.如第 160 段所述之融合蛋白或醫藥組成物，其中，融合蛋白或醫藥組成物與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。 162.如第 161 段所述之融合蛋白或醫藥組成物，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 163.如第 162 段所述之融合蛋白或醫藥組成物，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 164.用於治療有治療需要的受試者之癌症的如第 93~100 段中任一項所述之包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 的組成物或如第 125 段所述之醫藥組成物。 165.如第 164 段所述之包含抗 PD-1 ABD 的組成物或醫藥組成物，其中，包含抗 PD-1 ABD 的組成物或醫藥組成物與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。 166.如第 165 段所述之包含抗 PD-1 ABD 的組成物或醫藥組成物，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 167.如第 166 段所述之包含抗 PD-1 ABD 的組成物或醫藥組成物，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 168.用於治療有治療需要的受試者之癌症的如第 106~112 段中任一項所述之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或如第 126 段所述之醫藥組成物。 169.如第 168 段所述之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或醫藥組成物，其中，包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或醫藥組成物與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。 170.如第 169 段所述之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或醫藥組成物，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 171.如第 170 段所述之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或醫藥組成物，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。 172.用於治療有治療需要的受試者之癌症的如第 117~123 段中任一項所述之異二聚體蛋白或如第 126 段所述之醫藥組成物。 173.如第 172 段所述之異二聚體蛋白或醫藥組成物，其中，異二聚體蛋白或醫藥組成物與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。 174.如第 173 段所述之異二聚體蛋白或醫藥組成物，其中，查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。 175.如第 174 段所述之異二聚體蛋白或醫藥組成物，其中，查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
ⅫⅠ. 實例
下面提供實例以說明本發明。這些實例並不意味著將本發明限制於任何特定的應用或操作理論。對於本發明中所討論的所有恒定區位置，均根據如 Kabat 所述之 EU 指數 (Kabat 等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，United States Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，該文獻全文以引用方式併入本文) 進行編號。本發明所屬抗體技術領域中具有通常知識者將理解，該約定由免疫球蛋白序列的特定區域中的非連續編號組成，使得能夠統一引用免疫球蛋白家族中的保守位置。因此，由 EU 指數定義的任何給定的免疫球蛋白的位置都不一定與其順序序列一致。
一般和特定的科學技術概述於美國專利公開 2015/0307629、2014/0288275 和 WO2014/145806 中，所有這些專利公開全文 (特別是其中所概述的技術) 明確地以引用方式併入本文。來自2016 年 11 月 1 日提交的美國第 62,416,087 號專利的實例 1 和實例 2 的全部內容 (包括相應的附圖) 明確地以引用方式併入本文。
實例 1 ： IL-15/Rα-Fc
1A：改造 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白
為解決 IL-15/IL-15Rα 異二聚體的短半衰期，本發明製備作為 Fc 融合蛋白的 IL-15/IL-15Rα(sushi) 複合物 (下文統稱為 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白)，目的是促進製備並促進 FcRn 介導的複合物回收並延長半衰期。
透過標準基因合成構建編碼 IL-15 或 IL-15Rα sushi 結構域的質粒，然後亞克隆到含有 Fc 融合蛋白伴侶 (例如，如圖 10 所示的恒定區) 的 pTT5 表現載體中。例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白形式的卡通示意圖如圖 13A~13G 所示。
IL-15/Rα-heteroFc 形式的一種例示性蛋白 (圖 13A) 為 XENP20818，其序列如圖 14 所示，包含該形式的額外的蛋白質的序列。scIL-15/Rα-Fc 形式的一種例示性蛋白 (圖 13B) 為 XENP21478，其序列如圖 15 所示。ncIL-15/Rα-Fc 形式的一種例示性蛋白 (圖 13C)為 XENP21479，其序列如圖 16 所示。
透過在 HEK293E 細胞中進行瞬時轉染來製備蛋白質，並透過包含蛋白 A 色譜法和離子交換色譜法的兩步純化過程進行純化。
在細胞增殖測定中，對 scIL-15/Rα-Fc 形式的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (XENP21478) 和 ncIL-15/Rα-Fc 形式的融合蛋白 (XENP21479) 進行檢測。用指定濃度的供試品對人 PBMC 進行處理。經過 4 天治療後，用抗 CD8-FITC (RPA-T8)、抗 CD4-PerCP/Cy5.5 (OKT4)、抗 CD27-PE (M-T271)、抗 CD56-BV421 (5.1H11)、抗 CD16-BV421 (3G8) 和抗 CD45RA-BV605 (Hi100) 將 PBMC 染色以篩選以下細胞類型：CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞和 NK 細胞 (CD56+/CD16+)。Ki67 是與細胞增殖密切相關的蛋白質，使用抗 Ki67-APC (Ki-67) 和 Foxp3/轉錄因子染色緩衝液組 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass.) 對細胞內 Ki67 進行染色。使用 FACS (如圖 17A-C 所示) 測量上述細胞類型的 Ki67 的百分比。數據顯示，例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白誘導 CD8+T 細胞和 NK 細胞的強烈增殖。
1B：經改造具有低效力的 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白
為進一步改善 PK 並延長半衰期，我們認為降低 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的效力將減少抗原匯，從而增加循環半衰期。透過檢查 IL-15:IL-2Rß 和 IL-15:共同 γ 鏈界面的晶體結構，以及使用 MOE 軟體進行建模，預測這些界面上的殘基可以被取代以降低效力。圖 18 示出 IL-15:受體複合物的結構模型，其中顯示了我們設計的等排取代的預測殘基的位置 (以降低免疫原性的風險)。旨在降低效力而改造的例示性 IL-15 變異體的序列如圖 19 所示。
透過標準基因合成構建編碼 IL-15 或 IL-15Rα sushi 的質粒，然後亞克隆到含有 Fc 融合蛋白伴侶 (例如，如圖 10 所示的恒定區) 的 pTT5 表現載體中。透過標準誘變技術併入按照上述方法鑑定出的取代。經改造以降低效力的 「scIL-15/Rα-Fc」形式的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白包括 XENP29281、XENP24050、XENP29284、XENP29285、XENP29286，其序列如圖 21 所示。按照實例 1A 總體所述製備並純化蛋白質。
1B(a)：包含經改造以降低效力的 IL-15 變異體 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體外活性
在細胞增殖測定中，對包含 IL-15 變異體的例示性 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白進行檢測。用指定濃度的指定供試品將人 PBMC 孵育 3 天。孵育後，用抗 CD3-PE (OKT3)、抗 CD4-FITC (RPA-T4)、抗 CD8-eF660 (SIDI8BEE)、抗 CD16-BV421 (3G8)、抗 CD45RA-APC/Fire750 (HI100)、抗 CD56-BV605 (5.1H11) 和抗 Ki67-PE/Cy7 (Ki-67) 對 PBMC 染色，並透過流式細胞分析技術進行分析。圖 22 示出表現 Ki67 的 CD4 和 CD8 T 細胞群的百分比 (指示增殖)。
數據顯示，包含為降低效力而改造的 IL-15 變異體的多種例示性 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白相對於包含 WT IL-15 的 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白的確展現出降低的效力。值得注意的是，數據顯示，在 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白的語境下，與包含 IL-15(N4D/N65D) 或 IL-15(D30N/N65D) 變異體的 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白相比，包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白在各種淋巴細胞群的增殖中無活性或活性大大降低。另一方面，相對於包含 WT IL-15 的 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白，包含 IL-15(D30N) 變異體的 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白的效力幾乎沒有降低。
實例 2 ： PD-1 標靶臂
如上所述，PD-1 在活化的腫瘤浸潤淋巴細胞中的表現上調。因此，將本發明之 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白標靶表現 PD-1 的淋巴細胞，可能是將 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白導入腫瘤環境並避免全身性毒性的有效方法。另外，由於將本發明之標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與 PD-1 阻斷劑抗體聯合使用，或在接受 PD-1 阻斷劑抗體治療後投予本發明之標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，因此重要的是標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的 PD-1 標靶臂不與 PD-1 阻斷劑抗體結合相同或相似的表位。本文所設想之 PD-1 阻斷劑抗體包括但不限於納武利尤單抗和帕博利珠單抗。
圖 25-26 示出多種抗 PD-1 mAb 的序列，其變異區設想用於本文中。為研究上述抗 PD-1 結合結構域是否與納武利尤單抗和帕博利珠單抗競爭，對嵌合體 mAb 進行了串聯表位聚類評估。使用 Octet HTX 儀器進行串聯表位聚類。首先使用 HIS1K 生物傳感器捕獲 PD-1-His，然後將其浸入 100 nM 第一抗體中，最後將其浸入 100 nM 第二抗體中。試驗的抗體為 XENP16432 (基於納武利尤單抗之二價抗 PD-1 mAb；序列如圖 24A 所示)、XENP21461 (帕博利珠單抗；序列如圖 24B 所示)、嵌合體 mAb A、嵌合體 mAb B 以及基於 1C11 的 mAb。還包括 PD-L1-Fc 以研究抗體對 PD-1:PD-L1 交互作用的阻斷。BLI 反應針對生物傳感器浸入 HBS-EP 緩衝液後再浸入抗 PD-1 抗體的 BLI 反應進行歸一化。如果抗體對提供的歸一化 BLI 反應小於0.5，則認為該對競爭或部分競爭且位於同一表位聚類中，即識別非常相似或在很大程度上重疊的表位。如果抗體對提供了大於 0.5 的歸一化 BLI 反應，則認為該對不發生競爭並且可結合到不同的表位。圖 27 中總結了每個抗體對的歸一化 BLI 反應。
聚類分析顯示，抗 PD-1 mAb A 和 mAb B 不與納武利尤單抗或帕博利珠單抗發生競爭，而基於 1C11 的 mAb 與納武利尤單抗和帕博利珠單抗均發生競爭。此外，mAb A 似乎不阻斷 PD-1:PD-L1 交互作用，而 mAb B 則阻斷 PD-1:PD-L1 交互作用。
為簡便起見，與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭的 PD-1 結合結構域在本文中稱為抗 PD-1[C]，不與與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭的 PD-1 結合結構域則稱為抗 PD-1[NC]。
實例 3 ： PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白
本文描述了標靶 PD-1 的 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (在本文中統稱為 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 的生成和表徵。
3A：PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的生成和物理表徵
透過標準基因合成構建編碼 IL-15、IL-15Rα sushi 結構域或抗 PD-1 變異區的質粒，然後亞克隆到含有 Fc 融合蛋白伴侶 (例如，如圖 11 所示的恒定區) 的 pTT5 表現載體中。例示性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的卡通示意圖如圖 28 所示。
一種特定的例示性形式 「scIL-15/Rα x Fab」形式 (圖 28C) 包含透過可變長度之連接子 (稱為「scIL-15/Rα」) 融合至 IL-15 且然後融合至異二聚體 Fc 區域之 N 端的 IL-15Rα(sushi)，其中可變重鏈 (VH) 融合至異二聚體 Fc 之另一側，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便與 VH 形成 Fab。
生成該形式的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，其包含抗 PD-1[C] 標靶臂和抗 PD-1[NC] 標靶臂兩者。包含抗 PD-1[C] 標靶臂的融合蛋白在本文中稱為 [C]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，而包含抗 PD-1[NC] 標靶臂的融合蛋白稱為 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。
如實例 1B (a) 所述，包含 IL-15(D30N/D64N/N65D) 效力變異體的 scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白在增殖各種淋巴細胞群中幾乎完全沒有活性。因此，生成原型 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 ([C] 和 [NC] 兩者)，其包含 IL-15(N4D/N65D) 變異體。使用人源化 1C11 的變異區生成原型 [C]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，並使用人源化 mAb A 和 mAb B 製備 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。例示性 [C]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列如圖 29 所示；並且例示性 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列如圖 30 所示。還利用 Xtend Fc (M428L/N434S) 生成例示性 [C]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP25850 和 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。還生成對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP26007，其序列如圖 31 所示。
透過在 HEK293E 細胞中進行瞬時轉染來製備蛋白質，並透過包含蛋白 A 色譜法和離子交換色譜法的兩步純化過程進行純化。
3B：PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在體外具有活性
在第一項研究 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白活性的實驗中，用 100 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 刺激人 PBMC 48 小時，然後 CFSE 進行標記，並用指定的供試品在 37℃ 下孵育 4 天。利用 CFSE 稀釋法檢測 CD8+ 和 CD4+ T 細胞的增殖，並使用 Zombie 染料排除死細胞。顯示了增殖 CD8+T 細胞和 CD4+T 細胞百分比的數據如圖 32 所示。
數據表示，各種 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 ([C] 和 [NC] 兩種形式) 在增殖 CD8+ 和 CD4+ T 細胞中均具有活性。此外，對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在增殖 T 細胞中也具有活性，僅抗 PD-1 mAb XENP28519 無活性。
3C：PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白對活化的淋巴細胞具有選擇性
在細胞因子與其受體結合後，Janus 激酶 (JAKs) 與受體磷酸化 STAT 蛋白質相關，其然後轉移到細胞核中以調節更多後續流程。因此，STAT 蛋白質 (特別是 STAT5，包括 STAT5a 和 STAT5b) 的磷酸化是由 IL-15 與其受體結合觸發的最早的訊號傳遞事件之一。因此，研究了 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白誘導各種細胞中 STAT5 磷酸化的能力。
在該實驗中，同時使用了新鮮和活化的 PBMC。透過用 100 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 刺激新鮮 PBMC 2 天來製備活化的 PBMC，將其用作腫瘤環境中 PD-1 表現上調的活化淋巴細胞的替代物。在 37℃ 下用指定濃度的 XENP25850 將新鮮和活化的 PBMC 孵育 15 分鐘。為了在孵育後篩選各種細胞群，在室溫下用抗 CD3-BUV395 (UCHT1)、抗 CD4-BV605 (RPA-T4) 和抗 CD8-Alexa700 (SK1) 將 PBMC 染色 30-45 分鐘。洗滌細胞，並用預冷卻的 (-20℃) 90% 甲醇孵育 20-60 分鐘。經過甲醇孵育後，再次洗滌細胞，用抗 CD25-BV421 (M-A251)、抗 CD45RA-BV510 (HI100) 和抗 pSTAT5-Alexa647 (pY687) 進行染色，以標記各種細胞群和 STAT5 磷酸化。顯示了對各種 CD8+ 和 CD4+ T 細胞群的 STAT5 磷酸化的誘導的數據如圖 33 所示。值得注意的是，數據顯示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP25850 表現出對來自活化 PBMC 的 T 細胞的增強作用，同時對來自新鮮 PBMC 的 T 細胞的影響極小。這表示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在臨床環境中對腫瘤環境中活化的腫瘤浸潤淋巴細胞具有選擇性。
實例 4 ： [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與 PD-1 阻斷劑聯合使用
4A：PD-1 阻斷劑不干擾 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體外活性
用 100 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 刺激新鮮 PBMC 2 天。用 100 µg/ml XENP16432、帕博利珠單抗或 XENP15074 (抗 RSV mAb，作為對照) 將活化的 PBMC 預孵育 30 分鐘。在預孵育後，在 37℃ 下用指定濃度的指定供試品孵育 PBMC 15分鐘。為了在孵育後篩選各種細胞群，首先用抗 CD3-BUV395 (UCHT1)、抗 CD4-BV605 (RPA-T4)、抗 CD25-BV421 (M-A251) 和抗 CD45RA-BV510 (HI100) 抗體對 PBMC 進行染色。在首次染色後，使用 PerFix EXPOSE (Beckman Coulter, Indianapolis, Ind.) 對細胞進行滲透。滲透後，用抗 CD8-PerCP/Cy5.5 (RPA-T8)、抗 pSTAT5-AF647 和抗 PD-1-APC-Fire750 (EH12.2H7) 對細胞染色。在二次染色後，利用流式細胞分析技術對細胞進行分析，以研究 CD8+CD45RA-CD25+PD-1+(如圖 34 所示) 和 CD4+CD45RA-CD25+PD-1+T 細胞 (數據未顯示) 的 STAT5 磷酸化。
數據顯示，與使用抗 RSV mAb XENP15074 對 PBMC 進行預孵育相比，用 XENP16432 或帕博利珠單抗對 PBMC 進行預孵育，減小了 [C]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP25937 引起的 T 細胞的活化，這一結果符合預期，即抗 PD-1 mAb 阻止 [C]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP25937 與 T 細胞的結合。另一方面，與使用抗 RSV mAb XENP15074 對 PBMC 進行預孵育相比，用 XENP16432 或帕博利珠單抗對 PBMC 進行預孵育，不影響 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP28523 引起的 T 細胞的活化。這表示 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白可以與抗 PD-1 mAb 堆疊在一起而無負面影響。
4B：[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在體內與 PD-1 阻斷劑協同結合
在 NSG (NOD-SCID-γ) 免疫缺陷小鼠移植物抗宿主病 (GVHD) 模型中，對 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白進行評估。將人 PBMC 植入 NSG 小鼠體內時，人 PBMC 形成針對小鼠細胞及隨後的 GVHD 的自身免疫反應。因此，GVHD 為抗腫瘤反應模型。用 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白治療移植 huPBMC 的 NSG 小鼠，應當能夠增強所移植的 T 細胞的增殖並增強 GVHD。
在第一項 GVHD 研究中，在第 -1 天透過 IV-OSP 將 10 x 106 人 PBMC 植入 NSG 小鼠體內，並在第 0、7、14 和 21 天經腹膜投予指定濃度的指定供試品。每週評估兩次體重，將其作為 GVHD 的指標 (體重變化以以佔初始體重的百分比表示，如圖 35 所示)，並在第 7、10 和 14 天抽血以評估各種淋巴細胞的擴增 (第 14 天的數據分貝顯示在圖 36 中)。CD25 在 CD8+ 和 CD4+ T 細胞上的表現也作為 T 細胞活化標記進行評估 (如圖 37 所示)。
數據顯示，與單獨使用 PD-1 阻斷劑 (XENP16432 或 XENP28437) 以及 scIL-15/Rα-Fc XENP24050 單獨使用相比，各種 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 ([C] 和 [NC] 兩者) 增強了 GVHD，如 CD45+細胞、CD3+ T 細胞、CD8+ T 細胞和 CD4+ T 細胞計數所示。然而，與上述體外數據一致，[C]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP25850 與 XENP28437 聯合使用導致各種細胞計數下降，而 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP28532 (基於 mAb A) 與 XENP28692 (基於 mAb B) 聯合使用則導致 GVHD 進一步增強，如細胞計數所示。使用體重變化作為 GVHD 的指標 (如圖 35 所示) 以及作為 CD8+ 和 CD4+ T 細胞活化的指標 (如圖 37 所示)，也觀察到類似的趨勢。另外，如圖 38 所示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白似乎偏好 CD4+ T 細胞，這表現為 CD8+ 與 CD4+ T 細胞的比率較低。
在第二項 GVHD 研究中，在第 -1 天透過 IV-OSP 將 10 x 106 人 PBMC 植入 NSG 小鼠體內，並在第 0、7、14 和 21 天經腹膜投予指定濃度的指定供試品。每週評估兩次體重，將其作為 GVHD 的指標，並在第 7、10 和 14 天抽血以評估各種淋巴細胞的擴增 (第 10 天的結果如圖 39 所示)。如圖 40 所示，還評估了 CD25 在 CD8+ T 和 CD4+ 細胞上的表現。
如上所述，數據顯示與單獨使用抗 PD-1 阻斷劑相比，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白擴增了 T 細胞計數。此外，數據顯示 T 細胞擴增具有明顯的劑量反應，表現為較高濃度 (0.3 mg/kg vs 0.1 mg/kg) 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP28532 導致 GVHD 增強。值得注意的是，XENP28532 (濃度為 0.3 mg/kg) 與 PD-1 阻斷劑 mAb XENP28437 聯合使用增強了 CD25 在 CD8+ 和 CD4+ T 細胞上的表現。
實例 5 ：生成具有替代 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白
5A：包含 IL-15(N4D/N65D) 變異體的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白表現出不良的藥代動力學特徵
在調查包含 Xtend 的 IL-15/Rα-Fc 效力變異體的藥代動力學的研究中，食蟹獼猴接受首次單劑量靜脈 (i.v.) 投予各種濃度的 XENP22853 (包含 Xtend 的 WT IL-15/Rα-heteroFc)、XENP24306 (包含 Xtend 的 IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-heteroFc)、XENP24113 (包含 Xtend 的 IL-15(N4D/N65D)/Rα-heteroFc)、XENP24294 (包含 Xtend 的 scIL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc)、和 XENP25937 (包含 Xtend 的 [C]PD-1 標靶 IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc)。
圖 41 示出首次投藥後供試品的血清濃度隨時間的變化。如預期的那樣，除 Xtend 取代 (如 XENP24306 和 XENP24113) 以外，加入效力變異體可大大改善 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的藥代動力學 (與 XENP22583 相比)。出人意料的是，與 XENP24306 相比，包含 IL-15(N4D/N65D) 變異體的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP25937 展現出明顯較差的藥代動力學特徵。相似地，與 XENP24306 相比，IL-15/Rα-heteroFc 融合蛋白 XENP24113 and scIL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP24294 (其具有相同的 IL-15(N4D/N65D) 效力變異體) 展現出明顯較差的藥代動力學特徵。這表示較差的藥代動力學可能是由於特定的 IL-15 效力變異體，而不是由於 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的形式。雖然基於具有 IL-15(N4D/N65D) 變異體的 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白預期 XENP25937 (以及 XENP24113) 的藥代動力學特徵下降，但其體外效力高於具有 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (如實例 1B (a) 中所述)，藥代動力學特徵的下降出人意料地與效力的增加不成比例。因此，我們試圖鑑定出替代的 IL-15 效力變異體以用於本發明的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。
5B：改造包含 IL-15 變異體 (IL-15:CD132 界面經過修飾) 的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白
我們注意到，IL-15(N4D/N65D) 變異體在 IL-15 界面上具有兩個取代負責與 CD122 結合，而 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 在 IL-15:CD122 上具有兩個取代 (E64Q 和 N65D)；並且 IL-15 界面上有一個取代 (D30N) 負責與 CD132 結合。因此，認為 IL-15:CD132 界面的修飾可能有助於在 XENP24306 中觀察到的優異的藥代動力學特徵。因此，我們製備了額外的包含 IL-15(D30N/N65D) 變異體的例示性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，其序列如圖 42 所示。
實例 6 ： PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白誘導 PD-1 在 T 細胞中的內化
在另一項研究 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白活性的實驗中，在 37℃ 下，用 20 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 及以下供試品將 CFSE 標記的人 PBMC 孵育 4 天：XENP28532 (PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，包含基於 mAb A 的 αPD-1 臂)、XENP24306 (對照非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 和 XENP26007 (對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白)。然後用 αPD-1 XENP16432 標記細胞，如實例 2C 和圖 34 所示，它不與 XENP28532 的 PD-1 標靶臂競爭結合，並利用流式細胞分析技術進行分析。顯示了各種 T 細胞群中 PD-1+ 的百分比的數據如圖 44 所示。出人意料地觀察到與使用對照 XENP24306 和 XENP26007 進行治療相比，在接受 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白治療後，T 細胞上的 PD-1 發生劑量依賴性下降，表示 PD-1 受體發生內化。這表示對 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 的潛在持久作用，其中，在最終清除 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 分子後，PD-1 配體 (例如 PD-L1 和 PD-L2) 引起的免疫抑制可能減少。
實例 7 ：鑑定獼猴交叉反應 [NC]PD-1 mAb C
為便於實施臨床開發，研究 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在食蟹獼猴體內的各種參數諸如藥代動力學、藥物效力學和毒性很有用。因此，我們試圖鑑定與人和獼猴 PD-1 存在交叉反應的 [NC]PD-1 標靶臂。我們鑑定出額外的抗 PD-1 結合結構域 (在本文中稱為 mAb C)，其中使用字符串內容優化進行人源化 (參見例如 2010 年 2 月 2 日授權的美國第 7,657,380 號專利)，其序列如圖 43 (變異域序列) 和圖 45 (二價 mAb，如 XENP28536、XENP28537、XENP28538 和 XENP28539) 所示。
7A：抗 PD-1 mAb C 對人和食蟹獼猴 PD-1 具有交叉反應
使用 Octet 研究 XENP28536、XENP28537、XENP28538 和 XENP28539 與人和獼猴 PD-1 的結合，如上文總體所述。特別是，使用抗人 Fc (AHC) 生物傳感器捕獲抗體並將其浸入多種濃度的人和獼猴 PD-1-His 中以測定 KD，其數據如圖 46 所示。數據表面，人源化變異體 XENP25836 和 XENP25837 均以相似的 KD 與人和獼猴結合。值得注意的是，人源化變異體 XENP25838 和 XENP28539 無法與人和獼猴 PD-1 結合。相比之下，XENP28519 (人源化 mAb A) 與人 PD-1 結合更緊密，但對獼猴 PD-1 無交叉反應。
7B：抗 PD-1 mAb C 不與納武利尤單抗和帕博利珠單抗競爭結合
為研究 mAb C 是否與納武利尤單抗和帕博利珠單抗發生競爭，我們按照實例 2C 所述對嵌合體 mAb C 進行串聯表位聚類。XENP16432、XENP21461 和嵌合體 mAb C 的數據如圖 47 所示。聚類表示，抗 PD-1 mAb C 不與納武利尤單抗或帕博利珠單抗發生競爭，並且是 PD-1:PD-L1 交互作用的部分阻滯劑。
實例 8 ：基於 mAb C 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白
基於 mAb C 和 IL-15 變異體的「scIL-15/Rα x Fab」形式的[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白按照實例 3 總體所述進行設計和生產，其例示性序列如圖 48 所示。應當指出，按照實例 5 所述的概念製得包含 IL-15(N4D/N65D) 變異體以及 IL-15(D30N/N65D) 變異體的融合蛋白，其中包含 IL-15:CD132 界面的修飾的 IL-15 變異體可具有增強的藥代動力學。此外，圖 49 顯示了 Xtend Fc (M428L/N434S) 類似物的序列。
8A：基於 mAb C 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在體內具有活性
8A(a)：誘導 T 細胞增殖
用 500 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 刺激人 PBMC 48 小時，用 CFSE 進行標記，並在 37℃ 下用以下供試品孵育 4 天：XENP28543 (基於 mAb C_H1L1 和 IL-15(N4D/N65D) 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc)、XENP28532 (基於 mAb A_H1L1 和 IL-15(N4D/N65D) 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc)、XENP24306 (基於 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 的 非標靶 IL-15/Rα-heteroFc) 和 XENP26007 (基於 Motavizumab 和 IL-15(N4D/N65D) 的對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc)。孵育後，用以下抗體對細胞染色：抗 LAG-3-PE (3DS223H)、抗 CD8-PerCP-Cy5.5 (SK1)、抗 CD3-PE-Cy7 (OKT3)、抗 PD-1-Alexa647 (XENP16432，用 Alexa Fluor™ 647 抗體標記試劑盒進行染色)、抗 CD45RO-APC-Fire750 (UCHL1)、抗 HLA-DR-Alexa700 (L243)、抗 TIGIT-BV421 (A15153G)、抗 CD16-BV605 (3G6)、抗 CD56-BV605 (HCD56)、抗 CD25-BV711 (M-A251)、抗 CD45RA-BV785 (HI100)、抗 CD4-BUV395 (SK3) 和 Zombie Aqua-BV510，並利用流式細胞分析技術對各種細胞群進行分析。
基於 CFSE 稀釋 (Zombie Aqua 以排除死細胞)，研究了各種 T 細胞群的增殖，其數據如圖 50 所示。兩種 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白均誘導 induced 增殖 of CD8+ 和 CD4+ T 細胞的增殖。值得注意的是，與非標靶 IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc 融合蛋白 (以及對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 相比，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白體在誘導 CD4+ T 細胞增殖方面更有效，但在誘導 CD8+T 細胞的增殖。此外，XENP28532 (基於 mAb A 之 PD-1 標靶臂) 在誘導 CD8+ 和 CD4+ T 細胞的增殖方面似乎比 XENP28543 (基於 mAb C 之 PD-1 標靶臂) 更有效。
有趣的是，如圖 51 所示，與非標靶 IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc 融合蛋白 (以及對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 相比，XENP28532 在誘導 CD8+LAG-3+ T 細胞增殖方面更有效。此外，XENP28543 誘導 CD8+LAG-3+ T 細胞增殖比誘導本體 CD8+ T 細胞增殖更有效 (EC50 276.8 vs. 71.94)。總之，這支持 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白對表現查核點 (如存在於腫瘤環境中的查核點) 之 T 細胞可能具有選擇性的觀點。
還研究了記憶 (CD45RA-) 和初始 (CD45RA+) 細胞群的增殖，如圖 52 所示。值得注意的是，雖然 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在誘導 CD4+CD45RA- T 細胞增殖方面比非標靶 IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc 融合蛋白更有效，但它們在誘導 CD4+CD45RA+ T 細胞增殖方面的效力較弱，表示對記憶 T 細胞具有選擇性。
最後，研究了 PD-1 在各種 T 細胞體中的表現 (使用 XENP16432 染色，如本文所示，其結合至與 mAb A 和 mAb C 不同的表位)。如圖 53 所示的數據顯示，與使用對照 XENP24306 和 XENP26007 進行治療相比，在接受兩種 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白治療後，CD4+CD45RA- T 細胞上的 PD-1 發生劑量依賴性下降，表示 PD-1 受體發生內化。值得注意的是，XENP28532 (包含基於 mAb A 的 PD-1 標靶臂) 可更有效地誘導 PD-1 的下調。
8A(b)：細胞因子分泌的誘導
在 37℃ 下，用各種濃度的結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 預刺激 PBMC 48 小時，用 CFSE 進行標記，並在 37℃ 下用指定的供試品孵育 4 天。收集上清液並透過 V-PLEX Proflame Panel 1 人試劑盒進行評估 (根據生產商方案執行；Meso Scale Discovery，Rockville，Md.)。圖 54 中的數據顯示，XENP28532 和 XENP28543 均能夠有效刺激 IFNγ 分泌。值得注意的是，XENP28532 (基於 mAb A 之 PD-1 標靶臂) 在誘導 IFNγ 分泌方面似乎比 XENP28543 (基於 mAb C 之 PD-1 標靶臂) 活性更高。
8A(c)：PD-1 阻斷劑不干擾基於 mAb C 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體外活性
如實例 4A 中所述，研究了 PD-1 阻斷劑對基於 mAb C 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的活性的潛在干擾。如圖 55 所示的數據顯示，與使用抗 RSV mAb XENP15074 對 PBMC 進行預孵育相比，用 XENP16432 或帕博利珠單抗對 PBMC 進行預孵育，不影響 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP28543引起的 T 細胞的活化。這表示基於 mAb C 的包含 PD-1 標靶臂的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白可以與抗 PD-1 mAb 堆疊在一起而無負面影響。
8B：基於 mAb C 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在體內增強 GVHD 並與 PD-1 阻斷劑聯合使用
在實例 4B 所述的第二項 GVHD 研究中，還研究了各種濃度的 XENP28543 單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合使用時的體內活性。圖 56 顯示了體重 (以佔初始體重的百分比表示) 隨時間的變化，並且圖 57 顯示了第 11、14 和 18 天的體重 (以佔初始體重的百分比表示) 的數據。還研究了各種淋巴細胞群的擴增和活化，第 14 天的數據如圖 58~59 所示。總之，數據顯示，與僅用 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白治療相比，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與 PD-1 阻斷劑的組合顯著增強了 GVHD。在較低濃度 (即 0.1 mg/kg) 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與 PD-1 阻斷劑聯合使用的語境下，該效應的增強尤其明顯。
8C：基於 mAb C 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與 PD-1 阻斷劑聯合使用以增強在 NSG 小鼠體內的抗腫瘤活性
在第 -15 天，將 NSG 小鼠 (每組 10 隻) 透過皮內接種 3 x 106 pp65 轉導的 MCF-7 細胞。然後在小鼠腹膜內注射 5 x 106 人 PBMC (或用於對照的 PBS)，並在第 0 天用指定供試品進行治療，並在第 7、14、21、29 和 36 天用指定供試品進一步治療。每週用卡尺測量三次腫瘤體積，每週測量一次體重，並且每週抽取一次血液。
腫瘤體積隨時間的變化如圖 60 所示，並且第 26、28、30、33、35 和 37 天的腫瘤體積如圖 61 所示。數據顯示，截至第 28 天，與單獨單獨使用 PD-1 阻斷劑治療相比，XENP28543 與 PD-1 阻斷劑聯合治療顯著減小了腫瘤大小。還研究了各種淋巴細胞群的擴增和活化，其數據如圖 62~63 所示。值得注意的是，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，與單獨使用 PD-1 阻斷劑相比，能夠顯著增強使 CD8+ T 細胞活化的早期 (投藥後第 7 天) 誘導；並且兩種 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，與單獨使用 PD-1 阻斷劑相比，能夠顯著增強使 CD4+ T 細胞活化的早期 (投藥後第 7 天) 誘導。另外，截至第 14 天，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，與單獨使用 PD-1 阻斷劑相比，能夠顯著增強大量淋巴細胞群的擴增。
實例 9 ：具有經優化的親和力的 PD-1 標靶臂的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白
9A：基於 mAb C 的 ABD 的親和力優化
如實例 8A 所述，在某些語境下，諸如 PD-1 的體外下調、T 細胞的增殖和細胞因子分泌的誘導，XENP28532 (基於 mAb A 的 PD-1-臂) 相比於 XENP28543 (基於 mAb C 的 PD-1 標靶臂) 表現出更強的效力及/或活性。如實例 7A 中所述，基於人源化 mAb A (XENP28519) 的二價 mAb 與人PD-1的結合比基於人源化 mAb C (XENP28536) 的二價 mAb 更緊密。有鑑於此，我們認為 PD-1 的 PD-1 標靶臂的親和力可能影響 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的活性因此，設計了親和力優化的 mAb C 變異體。透過標準誘變構建了變異體庫，將點突變引入 XENP28536 的重鏈變異區或輕鏈變異區。其例示性序列如圖 43 (變異域序列) 和圖 64 (二價 mAb) 所述。如上文總體所述，在 Octet 上對經過親和力改造的 mAb C[PD-1]_H1L1 變異體 (呈二價 IgG1 形式，包含 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K 消融變異體) 進行親和力篩選，其數據如圖 65 所示。在 304 個重鏈變異區或輕鏈變異區中具有單點突變的變異體中，我們僅鑑定出 11 個變異體 (包括 mAb C[PD-1]_H1_L1.1 和 mab_C[PD-1]_H1_L1.3) 的親和力比 WT 高 2 倍以上。有利的 VH 取代位於位置 32、52A 和 97 (根據 Kabat 進行編號) 處；並且有利的 VL 取代位於位置 27D、30、93 和 94 (根據 Kabat 進行編號) 處。
為進一步增強親和力，將有利的單個取代 VH 變異體和單個取代 VL 變異體結合在一起。在 PD-1 標靶 IL15/Rα-Fc 融合蛋白的語境下構建這些新型 VH/VL 組合變異體。顯示了 PD-1 融合蛋白的親和力的數據如圖 66 所示。值得注意的是，H1.19_L1.1 具有高於 H1.132_L1.1 的親和力，儘管 H1.132_L1 比 H1.19_L1 提供了更高的親和力，但是表示 VH 中的 F32L 取代 (根據 Kabat 進行編號) 提供了親和力協同增強，與 H1.19 相同。
接下來，將 VH 及/或 VL 中有利的單個取代與在 PD-1 標靶 IL15/Rα-Fc 融合蛋白的語境下構建的新型變異體結合。顯示了 PD-1 融合蛋白的親和力的數據如圖 67 所示。三取代 VL 變異體 L1.140 (包含位置 27D 處的組胺酸、位置 30 處的酪胺酸及位置 93 處的蘇胺酸；根據 Kabat 進行編號) 的 KD 相比於野生型提高了 36 倍，並且與 VH 變異體充分結合 (例如 H1.132 和 H1.175)，使 KD 相比於野生型提高了約 100 倍。
值得注意的是，透過結合 VH 或 VL 中的單個取代以及結合 VH 變異體和 VL 變異體生成親和力變異體梯級，可用於調整 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的效力和選擇性。
基於親和力增強的 mAb C 和 IL-15 變異體的「scIL-15/Rα x Fab」形式的[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白按照實例 3 總體所述進行設計和生產，其例示性序列在圖 68 中顯示為 XENP30046、XENP30047、XENP30049 和 XENP30050。此外，圖 69 顯示了 Xtend Fc (M428L/N434S) 類似物的序列。
9B：具有改善之 PD-1 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白表現出增強的體外活性
接下來，研究了親和力增強的 PD-1 標靶臂 (以及 IL-15 (D30N/N65D) 變異體) 對本發明之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的影響。用 500 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 刺激人 PBMC 48 小時，然後用 CFSE 標記，並用供試品在 37℃ 下孵育 4 天。用以下抗體對細胞染色：抗 CD8-PerCP-By5.5 (SK1)、抗 CD3-PE-Cy7 (OKT3)、抗 PD-1-Alexa647 (XENP16432，用 Alexa Fluor™ 647 抗體標記試劑盒進行染色)、抗 CD45RO-APC-Fire750 (UCHL1)、抗 HLA-DR-Alexa700 (L243)、抗 CD107a-BV421 (H4A3)、抗 CD16-BV605 (3G6)、抗 CD56-BV605 (HCD56)、抗 CD25-BV711 (M-A251)、抗 CD45RA-BV785 (M-A251)、抗 CD4-BUV395 (SK3) 和 Zombie Aqua-BV510，並利用流式細胞分析技術對各種細胞群進行分析。
研究了基於 CFSE 稀釋 (Zombie Aqua 以排除死細胞) 的各種 T 細胞群的增殖，其數據如圖 70 所示；基於 CD25 表現的各種 T 細胞群的活化 (晚期 T 細胞活化標記)，其數據如圖 71-72 所示；以及 PD-1 在各種細胞群中的表現，有關 CD4+CD45RA-PD-1+ T 細胞的數據如圖 73 所示。
總之，數據顯示 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的活性與 PD-1 親和力相關。例如，如圖 70 所示，XENP30046 (具有親和力增強之 PD-1 標靶臂) 比 XENP28543 更有效地誘導 CD8+ 和 CD4+ T 細胞增殖 (增加 2 倍)。值得注意的是，甚至 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白引起的 T 細胞上的 PD-1 下調也與 PD-1 親和力相關，如圖 73 所示。此外，數據顯示，IL-15 (D30N/N65D) 變異體對 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白之活性無顯著影響。
9C：具有改善之 PD-1 結合能力的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白表現出增強的體內活性
在第 -1 天透過 IV-OSP 將 10 x 106 人 PBMC 移植到 NSG 小鼠體內，並在第 0、7 和 14 天經腹膜投予以下供試品：XENP28437 (基於帕博利珠單抗的包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S67K 消融變異體的抗 PD-1 mAb) 和 XENP29481 (具有 D30N/N65D IL-15 變異體的對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白；其序列如圖 31 所示)。每週評估兩次體重作為 GVHD 的指標，其數據作為初始體重的變化顯示在圖 74~75 中。值得注意的是，與 PBS 治療相比，單獨接受 XENP30046 (具有親和力增強的 PD-1 標靶臂) 治療可導致第 11 天和第 18 天所測得之體重明顯減輕，而單獨接受 XENP28543 治療則不產生明顯的體重損失 (與 PBS 治療相比)。
在第 7、10 和 14 天抽血以研究人淋巴細胞的擴增以及細胞因子的分泌，其數據如圖 76 所示。總之，數據總體表示，具有親和力增強的 PD-1 標靶臂的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的活性增強。另外，數據顯示 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 能夠與 PD-1 阻斷劑 (XENP28437) 有效結合。
此外，如圖 78 和圖 79 所示，與投予 XENP28543 (對於所有細胞群 (不包括 NK 細胞) 持續至第 14 天) 相比，XENP30046 在第 11 天顯著增強了 CD45+細胞、CD3+ T 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞和 NK 細胞的擴增。另外，如圖 77 所示，與 XENP28543 相比，XENP30046 顯著增強了 CD8+ 和 CD4+ T 細胞的早期 (投藥後第 7 天) 活化 (如 CD25 表現所示)。
實例 10 ：透過調節 PD-1 親和力和 IL-15 效力來微調 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的效力和選擇性
儘管 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的設計目的是透過 PD-1 標靶臂標靶腫瘤環境，但細胞因子部分仍能夠在到達腫瘤部位之前傳遞訊號，並可能導致全身行毒性。因此，試圖透過構建包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白來進一步降低 IL-15 效力，如實例 1B (a) 所述，其活性大大降低。包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的例示性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列在圖 30 和圖 48-49 顯示為 XENP30428、XENP30429、XENP30430、XENP30519、XENP30516、XENP30517 和 XENP30455。另外，我們構建了 XENP30432，一種包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (其序列如圖 32 所示)，將其用作替代物，以研究包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在腫瘤環境以外的行為。
10A：調節 PD-1 親和力和 IL-15 效力的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體外活性
具有各種 PD-1-結合親和力和 IL-15 效力的額外的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體外活性。用 500 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 刺激人 PBMC 48 小時，然後用 CFSE 標記，並用供試品在 37℃ 下孵育 4 天。用以下抗體對細胞染色：抗 CD8-PerCP-Cy5.5 (SK1)、抗 CD3-PE-Cy7 (OKT3)、抗 PD-1-Alexa647 (XENP16432，用 Alexa Fluor™ 647 抗體標記試劑盒進行染色)、抗 CD45RO-APC-Fire750 (UCHL1)、抗 HLA-DR-Alexa700 (L243)、抗 CD107a-BV421 (H4A3)、抗 CD16-BV605 (3G6)、抗 CD56-BV605 (HCD56)、抗 CD25-BV711 (M-A251)、抗 CD45RA-BV785 (M-A251)、抗 CD4-BUV395 (SK3) 和 Zombie Aqua-BV510，並利用流式細胞分析技術對各種細胞群進行分析。
研究了基於 CFSE 稀釋 (Zombie Aqua 以排除死細胞) 的各種 T 細胞群的增殖，其數據如圖 80 所示；基於 CD25 表現的各種 T 細胞群的活化 (晚期 T 細胞活化標記)，其數據如圖 81~82 所示；以及 PD-1 在各種細胞群中的表現，其數據如圖 83~84 所示。
數據顯示，XENP30272 (具有較高親和力的 PD-1 結合) 相比於 XENP30046 (具有較低親和力的 PD-1 結合) 在誘導各種 T 細胞群的增殖和活化方面更有效，證明了調節 PD-1 親和力的重要性。值得注意的是，雖然 XENP30429 (具有 IL-15 (D30N/E64Q/N65D) 變異體的 PD-1-IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 相比於 XENP30046 (具有 IL-15(N4D/N65D) 變異體的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 對 CD8+ 和 CD4+ T 細胞的活性僅低 1.8 至 2.5 倍，但是 XENP30432 (具有 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的替代 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc) 相比於 XENP30046 對 CD8+ T 細胞的活性低 12 倍並且對 CD4+ T 細胞的活性低 530 倍 (基於圖 80 所示的增殖活性)。這表示具有 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在腫瘤環境中保持活性，而在腫瘤環境之外基本上無活性。
10B：IL-15 效力經過調節的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體內活性
在 GVHD 研究中，研究了 IL-15 效力經過調節的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白引起的淋巴細胞的體內擴增。在第 -1 天透過 IV-OSP 將 10 x 106 人 PBMC 植入 NSG 小鼠體內，並在第 0、7 和 14 天經腹膜投予指定濃度的指定供試品。在第 7、10 和 14 天抽血以評估各種淋巴細胞的擴增和活化 (其數據如圖 85~86 所示)。總之，數據顯示，在 PD-1 親和力相當時，效力較高的 IL-15 (例如 XENP30046) 相比於效力較低的 IL-15 (例如 XENP30429) 能夠實現更高的 T 細胞擴增 (及早期活化)。
實例 11 ：包含 Xtend 的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc
為進一步擴展藥代動力學和藥物效力學，設計了 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的 Xtend 類似物，其序列如整個附圖中所示。
11A：Xtend 類似物在體外展現出可比的活性
研究了 Xtend 類似物與非 Xtend 分子是否相當。用 500 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 刺激人 PBMC 48 小時，然後用 CFSE 進行標記，並在 37℃ 下用供試品孵育 4 天。所用供試品為包含 IL-15(N4D/N65D)、IL-15(D30N/N65D) 或 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體和基於 mAb C_H1L1 (低親和力)、mAb C_H1_L1.1 (高親和力)、mAb C_H1_L1.3 (中等親和力) 或 αRSV 的標靶臂的標靶 IL-15/Rα-XtendFc 融合蛋白。用供試品孵育後，用以下抗體對細胞染色：抗 CD25-PE (M-A251)、抗 CD8-PE-Cy7 (SK1)、抗 PD-1-Alexa647 (XENP16432，用 Alexa Fluor™ 647 抗體標記試劑盒進行染色)、抗_CD45RO-APC-Fire750 (UCHL1)、抗 CD16-BV605 (3G6)、抗 CD56-BV605 (HCD56)、抗 CCR7-GV711 (G043H7)、抗 CD45RA-BV785 (HI100)、抗 CD4-BUV395 (SK3)、抗 CD3-BUV496 (UCHT1)、抗 CD95-BUV737 (DX2)、抗 CD28-BV650 (CD28.2) 和 Zombie Aqua-BV510，並利用流式細胞分析技術對各種細胞群進行分析。
研究了基於 CFSE 稀釋 (Zombie Aqua 以排除死細胞) 的各種淋巴細胞群的增殖，其數據如圖 87 所示；基於 CD25 表現的各種 T 細胞群的活化，其數據如圖 88 所示；以及 PD-1 在各種細胞群中的表現，其數據如圖 89 所示。總之，數據表現出與實例 10 相同的趨勢。另外，數據顯示 Xtend 類似物與非 Xtend 類似物相當。例如，XENP30046 的 EC50 與 XENP30290 的EC50 (XENP30046 的 Xtend 類似物) 相當。
11B：Xtend 類似物展現出抗腫瘤活性，並且可與 PD-1 阻斷劑聯合使用
在該研究中，使用 MHC I/II-DKO (NSG-DKO) 的 NSG 小鼠，因此對 GVHD 具有抗性。在第 -15 天，將 NSG-DKO 小鼠 (每組 10 隻) 透過皮內接種 3 x 106 pp65 轉導的 MCF-7 細胞。然後在小鼠腹膜內注射 2.5 x 106 人 PBMC，並在第 0 天用指定供試品/供試品組合進行治療，並在第 7、14 和 21 天用指定供試品進一步治療。每週用卡尺測量三次腫瘤體積，每週測量一次體重，並且每週抽取一次血液。
腫瘤體積隨時間的變化如圖 90 所示，並且第 11、14、17、19、21、24、26 和 28 天的腫瘤體積如圖 91 所示 (使用 Mann-Whitney 檢驗對基線校正後的數據進行統計分析)。數據顯示，截至第 11 天，與單獨使用 PD-1 阻斷劑治療相比，XENP30290 (1 mg/kg) 單獨使用或 XENP30516 (3 mg/kg) 與 PD-1 阻斷劑聯合治療顯著減小了腫瘤大小。截至第 28 天，XENP30290 (0.1、0.3 或 1 mg/kg) 或 XENP30516 (0.3、1 或 3 mg/kg) 與 PD-1 的所有組合相比於單獨使用 PD-1 阻斷劑均明顯減小了腫瘤大小。
顯示了各種淋巴細胞群的擴增的數據如圖 92-93 所示 (使用非配對 t 檢驗對經過對數轉換的數據進行 CD45+ 細胞擴增的統計分析)。值得注意的是，截至第 14 天，與單獨使用 PD-1 阻斷劑治療相比，各種劑量的 XENP30290 或 XENP30516 單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合治療能夠顯著增強淋巴細胞的擴增。儘管對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白也使淋巴細胞擴增，與實例 10 中所示的數據一致，但是RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白誘導的淋巴細胞擴增相比於其對應物 (即具有等效 IL-15 變異體) PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白少得多；並且包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 XENP30518 誘導的淋巴細胞擴增少於包含效力更高的 IL-15(N4D/N65D) 變異體的 XENP30362。如上所述，這些結果表示 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白將在腫瘤環境中具有活性，但在腫瘤環境之外將保持基本上無活性。
實例 12 ： PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白選擇性擴增 PD-1+ 淋巴細胞群
實例 3C 表示，本發明之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白對活化的淋巴細胞具有選擇性。由此進一步證實了 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在體內對 PD-1+ 淋巴細胞群具有特別的選擇性。
CD34+ Hu-NSG 小鼠為移植人 CD34+ 造血幹細胞以便發展對宿主無反應的功能性人類免疫系統的 NSG 小鼠，購自 The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine)。在用供試品投藥之前，研究了從小鼠抽取的血液中各種淋巴細胞群中 PD-1 的表現水準，其數據如圖 94 所示。數據顯示，CD34+ Hu-NSG 小鼠的 PD-1 表現特徵與人相似，亦即在效應子記憶細胞群上的 PD-1 表現更高。CD45+ Hu-NSG 小鼠體內 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的活性應反映該分子在人體內的活性。
在第 0 天，經腹膜向小鼠投予 0.3 mg/kg XENP30046 (包含 mAb C_H1_L1.1 和 IL-15(N4D/N65D) 變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc；n = 5)、0.3 mg/kg XENP30429 (包含 mAb C_H1_L1.1 和 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc；n = 5)、0.3 mg/kg XENP26007 (包含 IL-15(N4D/N65D) 變異體的對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc；n = 4) 或 0.3 mg/kg XENP30432 (包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc；n = 5)。在第 0、4、7 和 10 天抽血以研究各種淋巴細胞群的擴增，其數據如圖 95-102 所示。
數據顯示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (XENP30046 和 XENP30429) 擴增 PD-1+ 細胞群 (例如 CD4 和 CD8 效應記憶細胞群)，其中 XENP30046 使效應記憶細胞群擴增 100 倍以上。圖 102 示出 XENP30046 和 XENP30429 引起的細胞擴增量與各個淋巴細胞群中的基線 PD-1 表現相關。此外，如圖 100 和圖 101 所示，XENP30429 幾乎不誘導 CD4 和 CD8 初始細胞 (PD-1 低) 的擴增，表示降低 IL-15 臂的效力可改善對活化 T 細胞的選擇性。值得注意的是，對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (XENP26007 和 XENP30432) 表現出非常低的擴增水準，表示本發明之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白應具有極小的外周血淋巴細胞擴增。
實例 13 ：經 PD-1 親和力和 IL-15 效力調節的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在食蟹獼猴體內的藥代動力學和藥物效力學
基於對實例 5A 中所述的獼猴研究中收集的數據所做的進一步分析，發現 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在食蟹獼猴體內降低 NK 細胞活化，同時擴增 CD8+ T 細胞 (見圖 103)。值得注意的是，如圖 104 所示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白對 CD8 效應記憶 T 細胞具有選擇性。
在食蟹獼猴的另一項體內研究中，研究了經 PD-1 親和力和 IL-15 效力調節的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的藥代動力學和藥物效力學。食蟹獼猴 (n = 3) 適應 13 天 (從第 -13 天開始)，隨後在第 1 天接受靜脈投予首個低劑量 (3X 劑量) 的指定供試品，並在第 22 天接受靜脈注射較高的第二劑量 (10X dose) 的指定供試品。在整個研究過程中抽血以研究藥代動力學和藥物效力學，其數據如圖 105-106 所示。
圖 105 示出接受投予 XENP30290 (mAb C_H1_L1.1 x IL-15[N4D/N65D]) 或 XENP30362 (αRSV x IL-15[N4D/N65D]) 後食蟹獼猴體內淋巴細胞群的擴增。總之，數據顯示 XENP30290 (具有高 PD-1 親和力和較高的 IL-15 效力) 能夠在 2-3 週內維持周邊的藥物效力學，實現適度的 PD1- 細胞擴增。具體地，γδ T 細胞為擴增程度最高的細胞群；CD4+ 和 CD8+ 初始 T 細胞為擴增程度最低的細胞群；並且 CD8+ 幹細胞記憶細胞為擴增程度最高的相關細胞群。
圖 106 示出接受投予 XENP30516 (mAb C_H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D]) 或 XENP30518 (αRSV x IL-15[D30N/E64Q/N65D]) 後食蟹獼猴體內淋巴細胞群的擴增。總之，數據顯示 XENP30516 (具有高 PD-1 親和力和較低的 IL-15 效力) 能夠維持周邊的藥物效力學，實現不顯著的 PD1- 細胞擴增。與 XENP30290 一致，γδ T 細胞為擴增程度最高的細胞群；CD4+ 和 CD8+ 初始 T 細胞為擴增程度最低的細胞群；並且 CD8+ 幹細胞記憶細胞為擴增程度最高的相關細胞群。
圖 107-111 示出具有不同的 PD-1 親和力 (包括 RSV 標靶對照) 及/或 IL-15 效力的各種供試品的藥代動力學。總之，數據顯示了 PD-1 親和力和 IL-15 效力對 PK 的表觀影響。例如，如圖 107 所示，具有最高 PD-1 親和力和更高 IL-15 效力的 XENP30290 與具有較低 PD-1 親和力的 XENP30291 和 XENP29439 相比，清除更快。但是，具有最高 PD-1 親和力但 IL-15 效力較低的 XENP30516 導致清除速度慢於 XENP30290。在圖 111 中，XENP30362 和 XENP30518 (分別是具有較高和較低 IL-15 效力的 αRSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 表現出相同的趨勢。值得注意的是，包含 IL-15[N4D/N65D] 和包含 IL-15[D30N/N65D] 的供試品的 PK 無任何明顯差異。
最後，圖 112 示出接受 XENP30290、XENP30516 和 XENP30362 治療後 PD1 在各種淋巴細胞群上的表現。數據顯示 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白增加了 PD-1 表現。圖 113 示出所有 T 細胞記憶亞組的峰值擴增倍數與峰值 PD-1 表現之間的相關性。雖然其含義可能需要進一步研究，但增加的 PD-1 表現可能提供一個正反饋迴路，以增強 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的作用。
實例 14 ：改造 IL-15 變異體以去除醣基化
IL-15 的醣基化影響 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (包括 PD-1 標靶融合蛋白) 的異質性，並可能影響其活性及/或產生。因此，IL-15 變異體經改造以降低異質性。為此，探索了各種策略。
IL-15 上的醣基化位點包括 N71、N79 和 N112 (根據人 IL-15 成熟形式序列編號)。去醣苷的第一種方法是在這些位點引入修飾，例示性修飾包括 N71Q、N79Q 及/或 N112Q。另一種方法是在 N71、N70 及/或 N112 周圍引入修飾，以破壞醣基化基序 Asn-Xaa-Ser/Thr，例示性修飾包括 S114_ 和 S114A。
另外，先前已經記述 Fc 融合蛋白中 Gly-Ser 連接子中的絲胺酸可能發生 O-醣基化。因此，最後一種降低異質性的方法 (在 Fc 融合蛋白的語境下) 是將目前為止所用的 Gly-Ser 連接子替換為 Gly-Ala 連接子。
單獨或組合探索了以上各種方法。例示性經糖改造之 IL-15 變異體的序列如圖 114 所示，並且經改造以消融醣基化的例示性非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白和標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列如圖 115-117 所示。
14A：經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的物理表徵
XENP30516 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D] w/ (G4S) 連接子 (SEQ ID NO: 7))、XENP31981 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q] w/ (G4S) 連接子 (SEQ ID NO: 7))、XENP31982 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] w/ (G4S) 連接子 (SEQ ID NO: 7))、XENP31984 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D] w/ (G4A) 連接子 (SEQ ID NO: 8))、XENP31985 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/S114A] w/ (G4A) 連接子 (SEQ ID NO: 8))、XENP31986 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] w/ (G4A) 連接子 (SEQ ID NO: 8)) 和 XENP31987 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/S114_] w/ (G4A) 連接子 (SEQ ID NO: 8)) 是大致上如上述製造且藉由分析型 IEX 來表徵。
透過在 HEK293E 細胞中進行瞬時轉染來製備蛋白質，並透過包含蛋白 A 色譜法 (純化部分 1) 以及隨後的離子交換色譜法 (純化部分 2) 的兩步純化過程進行純化。純化部分 2 的色譜圖如圖 118A 所示。該色譜圖顯示了主峰的分離，該峰的異質性透過分析性陰離子交換色譜 (分析型 AIEX) 得到進一步表徵，如下文總體所述。該分析採用 Agilent 1200 高效液相色譜 (HPLC) 系統。將樣本以 1.0 mL/min 的流速注入 Proteomix SAX-NP5 5 µM無孔色譜柱 (Sepax Technologies, Inc., Newark, Del.) 上，使用 20 mM Tris (pH 8.5 緩衝液) 的 0-40% NaCl 梯度以及 280 nM 的紫外檢測波長。使用 Agilent OpenLAB CDS ChemStation Edition AIC C.01.07 版進行分析。示出峰的分析型 AIEX 表徵結果的色譜圖如圖 118B 所示。XENP30516 和 XENP31984 顯示為寬峰，其特徵在於來源於醣基化的明顯異質性。XENP31982、XENP31985、XENP31986 和 XENP31987 (以及較小程度上的 XENP31981) 顯示為 2 個不同的峰，表示成功去除了來源於醣基化的異質性。
14B：經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體外表徵
在第一項實驗中，用 500 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 mAb (OKT3) 刺激 PBMC 48 小時，然後用 CFSE 進行標記，並在 37℃ 下用供試品 (在 HEK 細胞中產生) 孵育 4 天。基於 CFSE 稀釋 (Zombie Aqua 以排除死細胞) 的測定各種 T 細胞群的增殖，且有關 CD8+ 效應記憶 T 細胞的數據如圖 119 所示。包含經改造以消除醣基化的 IL-15 變異體的各種供試品的活性得以保留，並且其效力意外比未經改造以消除 IL-15 醣基化的 XENP30516 (以及相應的具有 Gly-Ala 連接子的 XENP31984) 更有效。
根據上述實驗的結果，預期分子的效力也將轉移到腫瘤環境之外，並且將失去選擇性。因此，還構建了包含新型 IL-15 變異體的 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白對照，將其用作替代物以研究經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在腫瘤環境之外的行為。在第二項實驗中，按照上文總體所述，研究了包含 IL-15 變異體 (經過和不經糖改造) 的 PD-1 標靶 vs. RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (在 CHO 細胞中產生) 在增殖 T 細胞中的體外活性。顯示了各種供試品 (PD-1 標靶 vs. RSV 標靶) 在 CD4 和 CD8 效應記憶 T 細胞中的 EC50 如圖 120 和圖 121 所示。出乎意料且有利的是，發現 N71Q/N79Q/N112Q 變異體增強了 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 對效應記憶 T 細胞的選擇性 (表現出效力相比於對應的 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 提高了數倍)。結果，具有 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 效力變異體的 XENP31986 進一步包含 N71Q/N79Q/N112Q 以去除 IL-15 中的醣基化，並且 IL-15 和 IL-15Rα(sushi) 之間的 Gly-Ala 連接子在所有供試品中表現出最高的選擇性。
14C：經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體內表徵
在類似於實例 11B 中所述的小鼠腫瘤模型中研究了經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體內活性。具體地，在第 -18 天，將 NSG-DKO 小鼠 (每組 10 隻) 透過皮內接種 3 x 106 pp65 轉導的 MCF-7 細胞。然後在小鼠腹膜內注射 2.5 x 106 人 PBMC，並在第 0 天用指定供試品/供試品組合進行治療，並在第 7、14 和 21 天用指定供試品進一步治療。每週用卡尺測量三次腫瘤體積，每週測量一次體重，並且每週抽取一次血液。腫瘤體積隨時間的變化如圖 122 所示，並且第 17 天的數據如圖 123 所示；示出截至第 14 天的 CD8+ T 細胞的擴增的數據如圖 124 所示。與體外數據一致，經糖改造之變異體展現出增強的 T 細胞擴增和抗腫瘤活性 (即使在低劑量下)，並且與 PD-1 阻斷劑有效結合。
14D：經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在體內展現出增強的藥物效力學、藥代動力學和選擇性
食蟹獼猴 (n = 3) 適應了 13 天 (從第 -13 天開始)，然後接受靜脈投予各種劑量濃度 (1X 低劑量、3X 中等劑量、10X 高劑量或 30X 極高劑量) 的指定 PD-1 標靶 (及對照 RSV 標靶) IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。在整個研究過程中抽血以研究藥代動力學和藥物效力學，其數據如圖 125-133 所示。
獲得以下觀察結果：XENP30290 在 1X 低劑量下誘導 PD1+ 細胞擴增 (圖 125)；XENP30290 在 10X 高劑量下誘導 PD1+ 細胞發生良好的擴增，但對 PD1- 細胞具有中等活性，如 RSV 標靶對照 XENP30362 的活性所示 (圖 126)；XENP30516 在 10X 高劑量下誘導 PD1+ 細胞發生良好的擴增，並具有良好的選擇性 (圖 127)；XENP30516 在 30X 高劑量下誘導 PD1+ 發生更高程度的擴增，同時保持優異的選擇性 (圖 128)；XENP31986 在 1X 低劑量下誘導 PD1+ 細胞發生良好的擴增，並具有優異的選擇性 (圖 129)；XENP31986 在 3X 中等劑量下誘導 PD1+ 細胞發生增強的擴增，同時保持優異的選擇性 (圖 130)；並且 XENP31986 在 10X 高劑量下誘導 PD1+ 細胞發生非常大的擴增，同時保持優異的選擇性 (圖 131)。總之，數據顯示增加劑量可提高選擇性。此外，包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 變異體之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的選擇性高於包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D] 變異體之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，其選擇性繼而高於包含 IL-15[N4D/N65D] 變異體之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。
出人意料的是，圖 134 中的數據顯示，在相同劑量下，相比於包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D] 變異體的醣基化 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc XENP30516，包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 變異體的去醣基化 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc XENP31896 表現出增強的藥代動力學特徵，儘管 XENP31896 相比於 XENP30516 具有增強的效力/藥物效力學特徵。與 PD-1 標靶分子一致，圖 135 中的數據顯示，在相同劑量下，包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 變異體的去醣基化 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc XENP32169 相比於包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D] 變異體的醣基化 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc XENP32169 展現出增強的藥代動力學特徵，表示從 IL-15 中去除 N-連接多聚醣後，曝露量增加。因此，由於 D30N/E64Q/N65D 的效力下降導致曝露量增加，並且去除醣基化可提高曝露量，IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 變異體的組合可實現兩種效應引起的最佳曝露量以及隨後的 T 細胞擴增。
實例 15 ：改造 mAb C[PD-1] 變異體以去除不穩定的色胺酸
mAb C[PD-1] 在 VH-CDR3 中含有色胺酸 (位置編號 W112；根據 Kabat 編號為 W100)，其易於氧化並隨後失去 PD-1 結合 (數據未顯示)。
因此，採取措施以去除不穩定的色胺酸。生成在 VH 中位置 100 處 (Kabat 編號) 包含色胺酸取代 (取代為 F、L、Y、I、H、Q、S、E 和 R) 的 mAb C_H1L1 變異體，並使用 Octet 研究與 PD-1 的結合 (在包含 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K 消融變異體的二價 IgG1 形式的語境下)。圖 136 所示的傳感圖表示，修復不穩定的色氨酸導致與 PD-1 之結合完全丟失或大大減弱。
為恢復親和力，將先前確定的親和力增強的 VH 取代 (參見實例 9) 與 W100F (Kabat 編號) 組合。此外，將新型 VH 與先前確定的 (參見實例 9) 親和力增強的 VL 變異體 L1.140 配對。使用 Octet 研究該新型變異體 (在包含 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K 消融變異體的二價 IgG1形式的語境下) 與 PD-1 的結合，其數據如圖 139 所示。鑑定出多種變異體，其恢復的 PD-1 親和力結合接近 mAb C[PD1]_H1_L1.1 (包括 mAb C[PD1]_H1.176_L1.140、mAb C[PD1]_H1.177_L1.140 和 mAb C[PD1]_H1.180_L1.140)，其序列以二價 mAb 顯示在圖 137 中，並在 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的語境下顯示在圖 138 中。圖 140 示出 XENP31986 和 XENP32435 (其具有經 Trp 改造之/親和力修復的 mAb C[PD1]_H1.176_L1.140) 的傳感圖，並顯示了修復的分子具有與 PD-1 等效的親和力。此外，氧化修復不影響非競爭性表位 (數據未顯示)。
15A：經 Trp 改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的體外表徵
用 500 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 mAb (OKT3) 刺激 PBMC 48 小時，然後用 CFSE 進行標記，並在 37℃ 下用供試品 (在 HEK 細胞中產生) 孵育 4 天。基於 CFSE 稀釋 (Zombie Aqua 以排除死細胞) 的測定各種 T 細胞群的增殖，且有關 CD8+ 效應記憶 T 細胞的數據如圖 141 所示。數據顯示，具有經改造以去除 Trp 的 PD-1 結合結構域的 XENP32435、XENP32436 和 XENP32439 與 XENP31986 相比具有相同或更高的增殖 CD8+ 效應記憶 T 細胞的效力 (儘管對 PD-1 具有相似的親和力)。CD4 效應記憶與總 CD8 T 細胞和總 CD4 T 細胞的增殖趨勢一致 (數據未顯示)。
15B：生成添加經 Trp 改造之 mAb C[PD-1] 變異體以恢復親和力
用於恢復經 Trp 改造之 mAb_C[PD-1] 的親和力的另一種方法為噬菌體活動。基於 mAb_C[PD-1]H1.151_L1.1 (序列在圖 137A 中顯示為 XENP32344) 生成噬菌體文庫，其具有引入變異重鏈 CDR3 中的突變。從文庫中識別出的變異區被格式化為二價 mAb，其序列在圖 152A~152J 中顯示為 XENP32805-XENP32840。
如上文總體所述，利用 Octet 篩選新型 mAb_C[PD-1] 變異體的親和力。具體地，使用抗人 IgG-Fc (AHC) 生物傳感器捕獲供試品並浸入多種濃度的 PD-1 中。示出解離常數 (KD )、結合速率 (ka ) 和解離速率 (kd ) 的數據如圖 65 所示。
然後將上述展現出增強的結合力和特異性親和力增強取代的 mAb_C[PD-1] 變異體的重鏈變異域與先前確定 (參見實例 9) 的親和力增強的 VL 變異體 L1.140 結合，並格式化為二價 mAb，其序列在圖 152J-152M 中顯示為 XENP33441-33455。
實例 16 ： PD-1 標靶 IL-15 逆轉對 T 細胞增殖的抑制
除增殖效應子 T 細胞以外，IL-15 也可與 Treg 上的受體結合並增強其增殖；但是，Treg 抑制免疫反應，因此被視為不利於腫瘤治療。
先前文件記述稱，雷帕黴素在體外促進 CD4+CD25+FOXP3+ Treg 的增殖，並且所得擴增的 Treg 抑制 CD4+ 和 CD8+ T 細胞增殖 (參見，例如 Battaglia 等人(2006) Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients.J Immunol.177(12) 8338-8347；及 Strauss 等人(2007) Selective survival of naturally occurring human CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells cultured with rapamycin.J Immunol.178(1): 320-329)。因此，在本文的實驗中，研究了 IL-15、Treg 與其他 T 細胞之間的關係，其中使用經雷帕黴素擴增之 Treg。使用 EasySep™ 人 CD4+ T 細胞富集試劑盒 (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)，透過陰性選擇從人 PBMC 中富集 CD4+ T 細胞。使用 RPMI1640 + 10% 胎牛血清 + 0.1 μg/ml 雷帕黴素 + 500 U/ml IL-2 中的 Dynabeads™ 人 Treg 擴展劑 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass.) 將 Treg 擴增 1~4 天。將 Treg 轉移至塗有 0.5 µg/ml 抗 CD3 (OKT3, Biolegend, San Diego, Calif.) 的 T75 燒瓶中，並用 RPMI1640 + 10% 胎牛血清 + 0.1 µg/ml 雷帕黴素 + 500 U/ml IL-2 + 0.5 µg/ml 抗 CD28 mAb 進行培養。在最初從 PBMC 中富集 CD4+ T 細胞後至少 8 天，利用經雷帕黴素擴增之 Treg 開展實驗。
16A：PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白減少 Treg 之增殖
為研究 IL-15 引起的 Treg 增殖，用包含 10% 胎牛血清 (無任何其他補充劑) 的 RPMI 中指定劑量的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP20818 (WT IL-15) 或 XENP24045 (IL-15[D30N/E64Q/N65D]) (序列如圖 142 所示) 以及例示性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白將 1.25 x 105 Tag-it Violet 標記的 Treg 孵育 4 天。圖 143 所示的數據顯示，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (標靶及非標靶) 誘導經雷帕黴素擴增之 Treg 的增殖。值得注意的是，與非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白相比，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白誘導 Treg 增殖的效力低得多。
16B：PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白增強效應子 T 細胞增殖並減少 Treg 抑制
用指定比率的 Tag-it Violet 標記的經雷帕黴素擴增之 Treg 和結合在板上的抗 CD3 (OKT3；100 ng/ml) 上的 5 µg/ml 例示性標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白接種 1 x 105 CFSE 標記的 PBMC (固定數量)。在 37℃ 下孵育 4 天後，利用流式細胞分析技術分析細胞。利用 CFSE (用於 T 細胞) 或 Tag-it Violet (用於 Treg) 測量增殖，並利用 Zombie 染料排除死細胞。
圖 144 所示的數據顯示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白改變 (降低) Treg 所誘導之 CD8 和 CD4 效應記憶 T 細胞增殖的抑制效力。值得注意的是，對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白引起的改變小於 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白所誘導之效力下降 (同樣表示這應當是一種對腫瘤環境特異性非常高的效應)。
圖 145 所示的數據顯示了 Treg/CD8 TEM 與 Treg/CD4 TEM 細胞計數之比。數據顯示，與無供試品相比，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白增加了 Treg/TEM 比率，而 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白卻增強了 TEM 細胞增殖。這表示儘管 Treg 得到擴增，但擴增之 Treg 表現出顯著的抑制能力下降。
16C：減少 T 細胞增殖抑制的機制
16C(a)：經 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白處理的 Treg 表現出隨時間推移而減少的 eTreg 種群
在研究抑制作用下降機制的第一項實驗中，將 Treg 在 a) 完全 Treg 培養基 (含 10% FBS、0.5 µg/ml 抗 CD28、100 U/ml IL-2、100 ng/ml 雷帕黴素 的 RPMI)、b) 不含雷帕黴素的完全 Treg 培養基或 c) 含 100 ng/ml IL-15 的培養基 (含 10% FBS 和 0.5 µg/ml 抗 CD28 且不含 IL-2、不含雷帕黴素的 RPMI) 中孵育 6 天。用指定劑量的 Tag-it Violet 標記的 Treg 和結合在板上的抗 CD3 (OKT3；100 ng/ml) 接種 1 x 105 CFSE 標記的 PBMC。確定 CD8+ 和 CD4+ T 細胞的增殖，其數據如圖 146 所示。數據顯示，經 IL-15 預處理的 Treg 的抑制能力受到影響，表示 IL-15 將 Treg 轉化為免疫抑制性較低的表型。
為進一步研究該觀察結果，用 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP22821 (IL-15[N65D]；序列如圖 142 所示) 將經過雷帕黴素擴增之 Treg 處理 14 天，並利用流式細胞分析技術進行分析。出人意料的是，圖 147 所示的數據示出 CD25 和 FOXP3 在 CD4+ 細胞上的表現，表示 XENP22821 處理減少了 FOXP3 表現。雖然 FOXP3 通常是 Treg 的標記，但是 FOXP3高 CD4+CD45RA- 是真正的抑制性 eTreg，而 FOXP3低 CD4+CD45RA- 則是非抑制性活化效應子 CD4 T 細胞 (Miyara 等人(2009) Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor.Immunity.30(6): 899-911)。圖 148 所示的數據示出 CD45RA 和 FOXP3 在 CD4+ 細胞上的表現，表示 XENP22821 處理使 CD4+CD45RA- 群體從 FoxP3高 改變為 FoxP3低，表示 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白處理實際上將種群由 eTreg (種群從 5.24% 減少為 2.72%) 改變為活化的效應 CD4 T 細胞 (種群從18.2% 增加至 28.6%)。
此外，圖 149 所示的數據示出 CD25 和 CCR4 在 CD4+ 細胞上的表現，表示 XENP22821 處理減少了 CCR4 表現。先前有記述稱 CCR4 與免疫抑制有關 (Molinaro 等人(2015) CCR4 Controls the Suppressive Effects of Regulatory T Cells on Early and Late Events during Severe Sepsis.PLoS One.10(7))。
總之，結果表示儘管 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (非標靶和標靶) 擴增了現有的 Treg 種群，但它們透過將 Treg 擴增為非免疫抑制表型 (例如 FoxP3低 和 CCR4低/-) 來逆轉對效應 T 細胞增殖的抑制作用。
16C(b)：IL-15/Rα-Fc 融合蛋白逆轉 TGFβ 對 T 細胞增殖的抑制
在腫瘤環境中，TGFβ 在惡性細胞和免疫細胞 (例如 Treg) 均有表現，並具有抑制 T 細胞增殖從而抑制抗腫瘤免疫反應的功能 (Teicher, BA.(2007) Transforming Growth Factor-ß and the Immune Response to Malignant Disease.  Clin Cancer Res.13(21))。
在一項研究 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與 TGFß 之間的交互作用的實驗中，在 37℃ 下，用指定劑量的 TGFß1 (包含或不含 10 µg/ml 例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP24045 和 100 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3)) 將 CFSE 標記的 PBMC 孵育 4 天。4 天後，利用流式細胞分析技術對細胞進行分析。利用 CFSE 稀釋測定 T 細胞之增殖，其數據如圖 150 所示。數據顯示，TGFß 呈劑量依賴性抑制 T 細胞增殖；然而，值得注意的是，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在所有測試的劑量下均阻止 TGFß 對 T 細胞增殖的抑制。
這表示 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白逆轉 T 細胞增殖的另一種機制是逆轉 TGFβ 的抑制作用。
為進一步探究本發明之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的作用機理，生成 PD-1 標靶小鼠替代 IL-15 分子，其具有 IL-15 變異體，該變異體相對於在人體內具有下降的效力的 IL-15(N4D/E64Q/N65D) 變異體，在小鼠體內具有類似下降的效力，並且具有小鼠 PD-1 結合結構域。在使用小鼠脾細胞進行的體外測定中，發現 PD-1 標靶小鼠替代 IL-15 分子對 PD1+ 小鼠 T 細胞具有高選擇性 (數據未顯示)。
在 MC38 荷瘤小鼠中調查 PD-1 標靶小鼠替代 IL-15 分子的活性，以評估外周和腫瘤內的藥物效力學。未顯示該研究的數據，但結果總結於此處。該研究顯示，PD-1 標靶小鼠替代 IL-15 分子減小了小鼠的腫瘤體積和體重。值得注意的是，在第 6 天，CD8+ T 細胞和顆粒酶 B 在腫瘤中的表現升高。儘管 Treg 在脾臟中得到了擴增，但在腫瘤中明顯減少。總之，這使得腫瘤中的 CD8:Treg 比率增加。另外，發現與非標靶小鼠替代 IL-15 分子 (大幅擴增脾臟 CD8+ T、NK 和 NKT 細胞，但是僅適度擴增腫瘤內的 CD8+ T 和 NK 細胞) 相比，PD-1 標靶小鼠替代 IL-15 分子並不促進 NK 和 NK T 細胞擴增。
16D：非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白增強效應子 T 細胞增殖並減少 Treg 抑制
在 37℃ 下，用 Tag-it Violet 標記的 Treg 的 2 倍稀釋液和結合在板上的抗 CD3 (100 ng/ml；OKT3) 與 10 µg/ml XmAb24306 將 1 x 105 CFSE 標記的 PBMC (自體) 共培養 3 天。利用 CFSE 或 Tag-it Violet 稀釋測量 CD8+ 和 CD4+ 反應細胞的增殖，並用 Zombie Aqua™ Fixable Viability 試劑盒 (BioLegend, San Diego, Calif.) 染色以排除死細胞，其數據如圖 155A~155B 所示。數據顯示，XmAb24306 克服了 Treg 對抗 CD3 誘導的效應 T 細胞增殖的抑制作用。
實例 17 ： PD1 標靶與 IL15 效力下降的組合提高了選擇性
用 500 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 刺激人 PBMC 48 小時，然後用 CFSE 進行標記，並在 37℃ 下用供試品孵育 4 天。數據顯示，單獨使用 PD1 (如圖 154A 中 XENP31326 與 XENP31329 的比較所示) 提供了有限的選擇性 (RSV 標靶與 PD1 標靶的 EC50 相差 2.4 倍)。但是，PD1 標靶與 IL-15 效力的下降相結合 (如圖 154B 中 XENP30516 和 XENP32927 vs XENP30518 的比較以及 154C 中 XENP31986 和 XENP32435 vs XENP32169 的比較所示) 提供了顯著增強的選擇性。在一些實例中，去醣基化變異體進一步提高了選擇性 (去醣基化變異體的選擇性為 246 倍，而不含去醣基化變異體的選擇性僅為 105 倍)。根據一些分析，XENP30516 和 XENP32927 的選擇性為 XENP30518 的大約 339 倍；並且 XENP31986 和 XENP32435 表現出的選擇性為 XENP32169 的大約 299 倍。
實例 18 ： IL-15/Rα-Fc 誘導免疫抑制性較低的 Treg 的增殖
如實施例 16D 以及圖 155A 和 155B 所示，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白能夠克服 Treg 對抗 CD3 誘導的效應 T 細胞增殖的抑制作用。在這一部分，進一步研究了該等逆轉的機制。
第一項研究調查了 Treg 抑制的逆轉是否歸因於 Treg 增殖的減少。用包含 10% 胎牛血清 (無任何其他補充劑) 的 RPMI 中指定劑量的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP20818 (WT IL-15) 或 XENP24045 (IL-15[D30N/E64Q/N65D]) 將 1.25 x 105 Tag-it Violet 標記的 Treg 孵育 4 天。圖 156 所示的數據顯示，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白誘導經雷帕黴素擴增之 Treg 的增殖。值得注意的是，與 XENP20818 相比，XENP24045 在誘導 Treg 增殖方面的效力下降。無論如何，表示 Treg 抑制作用的逆轉並非 Treg 增殖降低的結果。
用指定比率的 Tag-it Violet 標記的經雷帕黴素擴增之 Treg 和結合在板上的抗 CD3 (OKT3；100 ng/ml) 上的 5 µg/ml XENP24045 接種 1 x 105 CFSE 標記的 PBMC (固定數量)。在 37℃ 下孵育 4 天後，利用流式細胞分析技術分析細胞。利用 CFSE (用於 T 細胞) 或 Tag-it Violet (用於 Treg) 測量增殖，並利用 Zombie 染料排除死細胞。圖 157A 和圖 157B 所示的數據顯示，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白改變 (降低) Treg 所誘導之 CD8 和 CD4 效應記憶 T 細胞增殖的抑制效力。圖 158A 和圖 158B 所示的數據顯示了 Treg/CD8 TEM 與 Treg/CD4 TEM 細胞計數的比率。數據顯示，與無供試品相比，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白增加了 Treg/TEM 比率，而 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白卻增強了 TEM 細胞增殖。這表示儘管 Treg 得到擴增，但擴增之 Treg 表現出顯著的抑制能力下降。
為研究抑制能力下降的機制，將 Treg 在 a) 完全 Treg 培養基 (含 10% FBS、0.5 µg/ml 抗 CD28、100 U/ml IL-2、100 ng/ml 雷帕黴素 的 RPMI)、b) 不含雷帕黴素的完全 Treg 培養基或 c) 含 100 ng/ml IL-15 的培養基 (含 10% FBS 和 0.5 µg/ml 抗 CD28 且不含 IL-2、不含雷帕黴素的 RPMI) 中孵育 6 天。用指定劑量的 Tag-it Violet 標記的 Treg 和結合在板上的抗 CD3 (OKT3；100 ng/ml) 接種 1 x 105 CFSE 標記的 PBMC。確定 CD8+ 和 CD4+ T 細胞的增殖，其數據如圖 159A 和圖 159B 所示。數據顯示，經 IL-15 預處理的 Treg 的抑制能力受到影響，表示 IL-15 將 Treg 轉化為免疫抑制性較低的表型。
為進一步研究該觀察結果，用 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP22821 (IL-15[N65D]) 將經過雷帕黴素擴增之 Treg 處理 14 天，並利用流式細胞分析技術進行分析。出人意料的是，圖 160A 和圖 160B 所示的數據示出 CD25 和 FOXP3 在 CD4+ 細胞上的表現，表示 XENP22821 處理減少了 FOXP3 表現。雖然 FOXP3 通常是 Treg 的標記，但是 FOXP3高 CD4+ CD45RA- 是真正的抑制性 eTreg，而 FOXP3低 CD4+ CD45RA- 則是非抑制性活化效應子 CD4 T 細胞 (Miyara 等人(2009) Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor.Immunity.30(6): 899-911)。圖 161A 和圖 161B 所示的數據示出 CD45RA 和 FOXP3 在 CD4+ 細胞上的表現，表示 XENP22821 處理使 CD4+ CD45RA- 群體從 FoxP3高 改變為 FoxP3低 ，表示 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白處理實際上將種群由 eTreg (種群從 5.24% 減少為 2.72%) 改變為活化的效應 CD4 T 細胞 (種群從18.2% 增加至 28.6%)。
此外，圖 162A 和圖 162B 所示的數據示出 CD25 和 CCR4 在 CD4+ 細胞上的表現，表示 XENP22821 處理減少了 CCR4 表現。先前有記述稱 CCR4 與免疫抑制有關 (Molinaro 等人(2015) CCR4 Controls the Suppressive Effects of Regulatory T Cells on Early and Late Events during Severe Sepsis.PLoS One.10(7))。
總之，結果表示儘管 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白擴增了現有的 Treg 種群，但它們透過將 Treg 擴增為非免疫抑制表型 (例如 FoxP3低 和 CCR4低 /- ) 來逆轉對效應 T 細胞增殖的抑制作用。
實例 19 ： IL-15/Rα-Fc 融合蛋白逆轉 TGFß 對 T 細胞增殖的抑制
在腫瘤環境中，TGFß 在惡性細胞和免疫細胞 (例如 Treg) 均有表現，並具有抑制 T 細胞增殖從而抑制抗腫瘤免疫反應的功能 (Teicher, BA.(2007) Transforming Growth Factor-ß and the Immune Response to Malignant Disease.  Clin Cancer Res.13(21))。
在一項研究 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與 TGFß 之間的交互作用的實驗中，在 37℃ 下，用指定劑量的 TGFß1 (包含或不含 10 µg/ml 例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP24045 和 100 ng/ml 結合在板上的抗 CD3 (OKT3)) 將 CFSE 標記的 PBMC 孵育 4 天。4 天後，利用流式細胞分析技術對細胞進行分析。利用 CFSE 稀釋測定 T 細胞之增殖，其數據如圖 163A 和圖 163B 所示。數據顯示，TGFß 呈劑量依賴性抑制 T 細胞增殖；然而，值得注意的是，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在所有測試的劑量下均阻止 TGFß 對 T 細胞增殖的抑制。
這表示 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白逆轉 T 細胞增殖的另一種機制是逆轉 TGFß 的抑制作用。
實例 20：體內活性的進一步表徵
20A ： PD-1 標靶效力下降的經糖改造之 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在 CD34+ Hu-NSG 模型中的體內抗腫瘤活性
如實例 12 所示，在 CD34+ Hu-NSG 小鼠中調查新型 [NC]PD-1 標靶效力下降的經糖改造之 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP32986 的活性 (作為單藥或與 PD-1 聯合使用)，與作為作為單藥或與 PD-1 聯合使用的非標靶 IL-15/Rα-Fc 進行比較，以反映該分子在人體內的活性。在第 -14 天，將小鼠 (每組 9~10 隻) 透過皮內接種 3 x 106 pp65 轉導的 MCF-7 細胞。然後在第 0 天 (及其後每週一次) 用指定供試品經腹膜內治療小鼠。每週用卡尺測量最多三次腫瘤體積，每週測量一次體重，並且每週抽取一次血液。
腫瘤體積隨時間的變化如圖 164 所示。與接受 PBS 對照治療相比，所有組在第 15 天均展現出顯著增強的腫瘤活性 (p ≤ 0.05)。值得注意的是，與 PD-1 阻斷劑聯合使用對抗腫瘤活性具有明顯的益處。亦調查了各種淋巴細胞群的擴增，第 7 天和第 13 天的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞的數據如圖 165 所示，且第 13 天的 CD8:Treg 比率的數據如圖 166 所示。值得注意的是，與非標靶 IL-15-Fc 融合蛋白聯合使用 PD-1 阻斷劑相比，PD-1 標靶 IL-15 與 PD-1 阻斷劑聯合使用時顯著增強了 CD8+ T 細胞和 CD4+ T 細胞兩者的擴增。此外，在該模型中，與 PD-1 標靶 IL-15 單藥相比，PD-1 標靶 IL-15 與 PD-1 阻斷劑聯合使用顯著增強了淋巴細胞擴增。值得注意的是，使用 PD1 標靶 IL15 改善了 CD8:Treg 比率 (並且與 PD-1 阻斷劑聯合使用時得到進一步改善)。
開展另一項類似的研究，以調查該分子在腫瘤環境中的藥物效力學，並調查 XENP32896 在其他劑量水平下的活性。如上所述，在第 -14 天，將 CD34+ Hu-NSG 小鼠透過皮內接種 3 x 106 pp65 轉導的 MCF-7 細胞。然後在第 0 天 (及其後每週一次) 用指定供試品經腹膜內治療小鼠。第 9 天，每組處死 4 隻小鼠以收集腫瘤組織樣本，然後透過流式細胞分析技術進行分析。在該研究中，抗腫瘤療效 (數據未顯示) 相比於先前的研究有所減慢，其原因可能在於 huCD34 供體的差異。但是，該研究顯示在腫瘤環境中具有顯著的藥效。流式細胞分析數據如圖 167 所示，表示：XENP32986 單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，可增加腫瘤組織中的總 CD3+ T 細胞並將 T 細胞表型改變為效應記憶 CD8+；XENP32986 單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，可增加腫瘤組織中的 CD8:Treg 比率；並且低劑量 0.01 mg/kg XENP32986 與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，能夠顯著提高藥效。
20B ： PD-1 標靶效力下降的 IL-15/Rα-Xtend Fc 融合蛋白的體內抗腫瘤活性
在第 -19 天，將 NSG-DKO 小鼠 (每組 10 隻) 透過皮內接種 3 x 106 pp65 轉導的 MCF-7 細胞。然後在小鼠腹膜內注射 2.5 x 106 人 PBMC，並在第 0 天 (及其後每週一次) 用指定濃度的供試品/供試品組合進行治療。每週用卡尺測量三次腫瘤體積，每週測量一次體重，並且每週抽取一次血液。
對於包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的供試品 (包括 RSV 標靶對照)，腫瘤體積隨時間的變化如圖 168A~168G (針對每組小鼠) 和圖 169 (組中位數) 所示。與單獨使用 PD-1 阻斷劑相比，XENP32927 以 0.3 mg/kg 的濃度與 PD-1 拮抗劑聯合使用時導致顯著的腫瘤消退 (第 17、20、22 和 27 天時 p ＜ 0.05)，以 1 mg/kg 的濃度與 PD-1 拮抗劑聯合使用時也導致顯著的腫瘤消退 (第 15 天和第 17 天時 p ＜ 0.05) (使用 Mann-Whitney 檢驗對基線校正後的數據進行統計分析)。應當指出，對於 1 mg/kg XENP32927 + 3 mg/kg XENP16432 組，除一隻無反應的小鼠外，其他所有小鼠均在第 22 天死亡 (參見圖 168F)，因此這些數據無法準確反映該劑量水平下的供試品組合在隨後時間點的療效。
對於包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q) 變異體的供試品 (包括 RSV 標靶對照)，腫瘤體積隨時間的變化如圖 168H-168L (針對每組中的每隻小鼠) 和圖 170 (組中位數) 所示。與單獨使用 PD-1 阻斷劑相比，XENP32435 以 0.1 mg/kg 的濃度與 PD-1 拮抗劑聯合使用時導致顯著的腫瘤消退 (第 13 天和第 15 天時 p ＜ 0.05)，以 0.3 mg/kg 的濃度與 PD-1 拮抗劑聯合使用時也導致顯著的腫瘤消退 (第 13、15 和 17 天時 p ＜ 0.05)。值得注意的是，在該模型中，XENP32435 表現出顯著的腫瘤消退作用 (與 PD-1 阻斷劑單藥相比，第 17 天時 p ＜ 0.05) (使用 Mann-Whitney 檢驗對基線校正後的數據進行統計分析)。應當指出，對於 XENP32435 (0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg) + 3 mg/kg XENP16432 組，所有小鼠均在第 20 天死亡 (參見圖 168J-168K)，因此這些數據未反應這些劑量水平下的供試品組合的全部治療潛力。
對於所有供試品，第 17 天的腫瘤體積變化如圖 171 所示。對於包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體和 IL-15(D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q) 變異體的供試品，CD4+ 和 CD8+ T 細胞活化 (如 CD25 表現所示) 和擴增 (如細胞計數所示) 分別如圖 172A~172D 和圖 173A~173D 所示。最後，對於包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體和 IL-15(D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q) 變異體的供試品，IFNγ 的血清濃度隨時間的變化如圖 174 和圖 175 所示。數據顯示，PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D] XENP32927在 0.1 – 1 mg/kg 的範圍內具有活性，並且 PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] XENP32435 在 0.03 – 0.3 mg/kg 的低得多的濃度範圍內具有活性 (如淋巴細胞活化、增殖和 IFNγ 分泌所示)。值得注意的是，該研究還表示，與單獨使用 PD-1 阻斷劑相比，與 PD-1 抑制劑聯合使用時，RSV 標靶 IL-15 (包含 IL-15 變異體) 並不增強活性，進一步證明了 PD-1 標靶機制的重要性。
實例 21：去除不穩定的色胺酸的 mAb C[Pd-1] 變異體投予食蟹獼猴後的藥物效力學和藥代動力學效應
為確定投予 PD-1xIL-15/IL-15Ra 的藥物效力學，使用流式細胞分析技術對接受 PD-1xIL-15/IL-15Ra 治療的食蟹獼猴的外周血進行免疫表型分析。雄性食蟹獼猴 (n = 4) 接受靜脈注射 (緩慢推注) 各種劑量 (1X 低劑量、12X 高劑量) 的 XENP32435 和各種劑量 (1X 低劑量、20X 高劑量) 的 XENP32927，每兩週投藥一次，共投藥 3 次 (分別在第 1、15 和 29 天投予)。在整個研究過程中抽血以研究藥代動力學和藥物效力學，其數據如圖 166~171 所示。透過靜脈穿刺採集全血樣本。製備用於細胞計數免疫表型分析的樣本用以下螢光染料標記的抗體染色：抗 FoxP3-FITC (259D) 或抗 CD3-FITC (SP34)；抗 CD8b-PE (SIDI8BEE) 或抗 CD45-PE (MB4-6D6)；抗 CD56-PE-CF594 (B159) 或抗 CCR7-PE-Dazzle594 (G043H7)；抗 CD45-PerCP-Cy5.5 (MB4-6D6) 或抗 CD20-PerCP-Cy5.5 (2H7)；抗 CD8a-PE-PE-Vio770 (BW135/80)、抗 CD25-PE-Cy7 (M-A251) 或抗 NKG2D-PE-Cy7 (1D11)；抗 PD-1-APC (EH12.2H7) 或抗 CD8b-eFluor660 (SIDI8BEE)；anti-Ki67-AF700 (B56) 或抗 CD14-AF700 (M5E2)；抗 CD45RA-APC-Cy7 (5H9)；抗 CD3-BV421 (SP34) 或抗 CD8a-BV421 (BM135/80)；抗 CD25-BV510 (M-A251) 或抗 HLA-DR-BV510 (G46-6)；抗 CD14-BV605 (M5E2) 或抗 CD28-BV605 (CD28.2)；抗 CD16-BV650 (3G8)；抗 CD20-BV711 (2H7) 或抗 CD95-BV711 (DX2)；抗 CD4-BV785 (OKT4)。所有抗體均購自 BD Biosciences、BioLegend、Miltenyi Biotec 或 Thermo Fisher Scientific。將 BD TruCountTM (BD Biosciences) 管與 CD45/Side Scatter 控制結合使用，實時定量分析絕對細胞計數。
圖 176A~179E 示出食蟹獼猴接受 XENP32435 或 XENP32927 投予後各種淋巴細胞群的擴增。獲得以下觀察結果：XENP32435 在 1X 劑量下誘導 CD8 T 細胞 (包括幹細胞記憶細胞和初始細胞亞組) 擴增、γδ T 細胞大幅擴增及 NK 細胞極小擴增 (圖 176A~176E)；XENP32435 在較高的 12X 劑量下誘導 CD8 T 細胞和 γδ T 細胞的更大幅度的擴增，並且對 NK 細胞的影響極小 (圖 177A~177E)；XENP32927 在 1X 劑量下誘導 CD8 T 細胞 (包括幹細胞記憶細胞和初始細胞亞組) 擴增、γδ T 細胞大幅擴增及 NK 細胞極小擴增 (圖 178A~178E)；XENP32927 在較高的 20X 劑量下誘導更大幅度的 CD8 T 細胞和 γδ T 細胞發生更大幅度的擴增，並且對 NK 細胞的影響極小 (圖 179A~179E)。總之，數據顯示劑量增加導致 CD8 T 細胞和 γδ T 細胞的擴增幅度更大，並且 NK 細胞的擴增極小。
圖 180 和 181 示出供試品 XENP32435 或 XENP32927 靜脈投予食蟹獼猴後的藥代動力學特徵。獲得以下觀察結果：對於去醣基化變異體 XENP32435，全身曝露量 (首次投藥 AUC；濃度與時間曲線下面積) 的增加幅度 (14X) 略高於 1X 和 12X 劑量之間的比例 (圖 180)。出人意料的是，醣基化變異體 XENP32927 展現出增加的曝露量，全身曝露量 (32X) 的增加幅度超過 1X 與 20X 劑量之間的比例 (圖 181)。對於 1X 劑量的 XENP32435 和 XENP32927，在重複投藥後觀察到 AUC 下降和清除率升高，這可能歸因於觀察到的標靶細胞群擴增導致靶介導的藥物處置 (TMDD) 增加。相比於醣基化變異體，這種 TMDD 現象對於去醣基化變異體更為突出。在重複投予變異體 XENP32435 和 XENP32927 後均未觀察到蓄積。總之，數據顯示 XENP32435 和 XENP32927 在食蟹獼猴中均展現出非線性的時變藥代動力學。
實例 22：小鼠替代 PD-1 標靶 IL-15 分子
為進一步探究本發明之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的作用機理，生成 小鼠替代 PD-1 標靶 IL-15 分子 XENP33869，其 IL-15 變異體，該變異體相對於在人體內具有下降的效力的 IL-15(N4D/E64Q/N65D) 變異體，在小鼠體內具有類似下降的效力，並且具有小鼠 PD-1 結合結構域，該結構域相對於 mAb C_H1.176_L1.140 對人 PD-1 的結合親和力，對小鼠 PD-1 具有類似的結合親和力。為調查與不同 PD-1 表位的結合 (例如就 [NC] PD-1 而言) 是否影響 PD-1 標靶 IL-15 分子的生物學活性，生成另一種小鼠替代 PD-1 標靶 IL-15 分子 XENP36217，其與 XENP33869 結合不同的 muPD-1 表位 (即非競爭性)。
22A ：小鼠替代 PD-1 標靶 IL-15 分子的體外表徵
用指定濃度的小鼠替代非標靶效力下降的 IL-15、小鼠替代 PD-1 標靶效力下降的 IL-15 以及對照小鼠替代 RSV 標靶效力下降的 IL-15 孵育來自小鼠的脾細胞。圖 182A 和圖 182B 所示的數據示出 CD8+ T 細胞增殖 (如 Ki-67 表現和細胞計數所示)，並表示小鼠替代 PD-1 標靶 IL-15 分子 XENP33869 對 PD1+小鼠 T 細胞具有高選擇性。圖 183A 和圖 183B 示出由針對 XENP36217 的獨立實驗得到的相應數據，並表示它對 PD1+ 小鼠 T 細胞也具有高選擇性。
22B ：小鼠替代 PD-1 標靶 IL-15 分子的體內性能
在 MC38 荷瘤小鼠中調查 PD-1 標靶小鼠替代 IL-15 分子的活性，以評估外周和腫瘤內的藥物效力學。透過皮下注射，在 6-12 週齡的雌性 C57BL/6 小鼠 (MC38 腫瘤模型的同系小鼠) 右側腹接種 1 百萬 MC38 細胞。使動物生長腫瘤。在腫瘤大小達到 150~200 mm3 後，將小鼠隨機分入治療組中。荷瘤小鼠透過靜脈尾靜脈注射接受單劑量 XENP33869。投予三種劑量，即低 1X 劑量、中等 3.3X 劑量和高 10X 劑量。治療後第 3 天和第 6 天收集腫瘤和脾臟樣本。對組織進行處理以透過流式細胞分析技術進行分析。透過用以下抗體染色來執行免疫表型分析：抗 granzyme B-FITC (QA16A02)、抗 CD49b-PE (DX5)、抗 Ki67-PerCP-Cy5.5 (16A8)、抗 CD25-PE-Cy7 (PC61)、抗 Foxp3-BV421 (MF-14)、抗 CD69-BV510 (H1.2F3)、抗 CD62L-APC (MEL-14)、抗 CD44-BV605 (IM7)、抗 CD4-BV650 (RM4-5)、抗 CD8-BV711 (53-6.7)、抗 CD3-BV785 (145-2C11)、抗 CD45-BUV395 (30-F11)。所有抗體均購自 BD Biosciences 或 BioLegend。
由該研究得到的數據如圖 184A~184K 所示。獲得以下觀察結果：在開始治療後第 3 天，XENP33869 在 10X 劑量下導致腫瘤重量下降；並且在第 6 天，XENP33869 在所有試驗劑量下均導致腫瘤重量下降。XENP33869 誘導腫瘤中 CD8+ T 細胞頻率和細胞數量增加，但對其他免疫細胞群 (諸如 CD4+ T 細胞、調節性 T 細胞 (Treg)、NK 細胞和 NKT 細胞) 的影響極小。相比於脾，XENP33869 在腫瘤中的效應更明顯。CD8+ T 細胞在腫瘤中穩定擴增，並且對 Treg 的影響極小，導致腫瘤 CD8 T 細胞與 Treg 的比率大幅增加，且具有劑量依賴性。值得注意的是，在第 6 天，XENP33869 增加了顆粒酶 B 在 CD8+ T 細胞以及在腫瘤中檢查的其他免疫細胞群中的表現。
在一項類似的實驗中，MC38 荷瘤小鼠透過尾靜脈靜脈注射接受單劑量的 XENP33869、XENP36213、XENP36216 或 XENP36217。所有供試品均以低 1X 劑量投予，XENP36213、XENP36216 和 XENP36217 也以較高的 3.3X 劑量投予。治療後第 6 天收集腫瘤和脾臟樣本。由該研究得到的數據如圖 185A~185H 所示。獲得以下觀察結果：相比於載體治療組，所有供試品均誘導腫瘤重量下降，並增加腫瘤中 CD8+ T 細胞的數量和頻率。對於 XENP36213、XENP36216 和 XENP36217，腫瘤 CD8 T 細胞:Treg 比率呈劑量依賴性增加。相比之下，脾臟中 CD8 T 細胞:Treg 比率下降，表示 XENP36213、XENP36216 和 XENP36217 具有腫瘤部位特異性作用。所有供試品對腫瘤中 CD4 T 細胞、Treg、NK 細胞或 NKT 細胞的頻率影響極小或有所下降。值得注意的是，接受 XENP36213、XENP36216 和 XENP36217 治療，表現腫瘤酶 B 的腫瘤 CD8+ T 細胞的頻率呈劑量依賴性升高。脾臟中表現顆粒酶 B 的 CD8+ T 細胞總體頻率較低，但在治療後有所升高。
使用 MC38 同系腫瘤模型評估 XENP33869 對腫瘤增長的影響。在 6-12 週齡的雌性 C57Bl/6 小鼠右側腹皮下接種 1 百萬細胞。監測小鼠中是否產生腫瘤，並在形成腫瘤 (約 200 mm3 ) 後開始治療。治療組包括載體、XENP33869 和鼠反應性抗 PDL1。在第 0 天和第 7 天分別投予載體和 XENP33869，並在第 0、3、7 和 11 天投予抗 PDL1。首次投藥透過靜脈內投予，隨後的劑量被輸送至腹膜腔內。每週用數字卡尺測量兩次腫瘤大小，使腫瘤生長至最大體積達到 2000 mm3 ，或形成直徑大於 3 mm 的潰瘍。由該研究得到的數據如圖 186A~186B 所示。在研究結束時 (治療開始後第 13 天)，相比於載體對照，XENP33869 表現出穩定的抗腫瘤活性，並且比抗 PDL1 具有更強的腫瘤生長抑制作用 (TGI 分別為 111% 和 61%)。
在第二項類似的實驗中，在 1X、3.3X 和 10X 的劑量範圍評估 XENP33869 的抗腫瘤活性，並與載體對照或抗 PDL1 進行比較。還將兩種較低劑量 (1X 和 3.3X) 與抗 PDL1 合並投予。由該研究得到的結果如圖 187A 和圖 187B 所示。在 10X 劑量下表現出穩定且持久的活性，80% 的小鼠在治療開始後至少第 42 天表現出完全緩解。在 1X 和 3.3X 劑量下幾乎未觀察到單藥的活性，但與抗 PDL1 聯合使用時，在兩種劑量下均表現出活性的改善。3.3X XENP33869 與抗 PDL1 聯合使用表現出最佳的組合活性，在第 42 天時，10 隻小鼠中的 8 隻發生完全緩解，而單藥抗 PDL1 僅導致 5 隻小鼠發生完全緩解並使 1 隻發生部分緩解。
在第三項實驗中，MC38 荷瘤小鼠接受載體、抗 PDL1、PD-L1 阻斷 muPD1xIL15 替代 XENP33869、PD-L1 非阻斷 muPD1xIL15 XENP36217 治療或 PD1-IL15 分子與抗 PDL1 聯合治療。XENP33869 和 XENP36217 作為單藥以較低的 1X 和較高的 3.3X 的劑量投予。在 1X 劑量下評估與抗 PDL1 的組合。數據如圖 188A 和圖 188B 所示。相比於載體對照，所有治療組在治療後第 14 天均表現出抗腫瘤活性。接受 XENP33869 和 XENP36217 治療的組表現出類似的劑量依賴性腫瘤生長抑制作用。相比於單藥治療，任何一種分子與抗 PDL1 的聯合使用均表現出更多的部分或完全緩解者。
為進一步瞭解治療對 CD8+ T淋巴細胞組織分佈隨時間變化的影響，進行了基於 PET 的成像研究。簡言之，在第 -1 天 (治療前 1 天)、第 4、8 和 12 天使用18 F 標記的抗鼠 CD8 示蹤物並在第 11 天使用非結合對照示蹤物，對載體、XENP33869 和抗 PDL1 治療組中的 4 隻小鼠進行成像。包括非結合對照，以便區分組織中非特異性背景示蹤物攝取和低 CD8 特異性攝取。透過尾靜脈向動物注射放射性示蹤物，並在 1 小時後，在 Inveon PET/計算機斷層掃描 (CT) 掃描儀 (Siemens Preclinical Solutions, Inc.) 上進行 15 分鐘的靜態 PET 掃描。使用 VivoQuant 臨床前圖像後處理軟體 (Invicro) 對組織的多個軸向切片中的感興趣區域 (ROI) 進行測量。測量經過衰減和衰減校正的組織的訊號強度，以每 cc 組織注射劑量的百分比表示，其中假定每 1 cc 當量對應於 1 克軟組織 (%ID/g)。
由該研究得到的數據如圖 189A~189D 所示。每個治療組的代表性圖像，其中腫瘤位置用箭頭指示 (圖 189A)。在所有治療組中，富含 CD8 的組織諸如脾臟和淋巴結清晰可見。儘管 XENP33869 治療引起顯著的腫瘤生長抑制作用，但在第 12 天，在各治療組之間未觀察到示蹤劑攝取的顯著差異。不同組織中 CD8 示蹤物的攝取隨時間變化的結果表示，在 XENP33869 治療組中，最早在第 4 天即可檢測到腫瘤 CD8 訊號的初始增加。在治療組之間，未觀察到血液、脾、肝和淋巴結中的 CD8 濃度隨時間推移而發生顯著變化。
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圖 1A 和圖 1B 示出 IL-15 及其受體的序列。 圖 2 示出人和食蟹獼猴的 PD-1 的序列，其有利於形成抗原結合結構域以結合這兩者，從而易於臨床開發。 圖 3A~3E 示出可用的 Fc 異二聚化變異體組 (包括偏斜和 pI 變異體)。某些變異體無相應的「單體 2」變異體；這些變異體為 pI 變異體，可在任何單體上單獨使用。 圖 4 示出等排變異體抗體恒定區及其相應的取代的列表。pI_(-) 指示 pI 較低的變異體，而 pI_(+) 指示 pI 較高的變異體。其中可任選地並且獨立地與本發明之其他異二聚化變異體 (以及本文概述的其他變異體類型) 組合。 圖 5 示出可消融 FcγR 結合的有用的消融變異體 (有時稱為「敲除」或「KO」變異體)。通常，兩種單體上均存在消融變異體，儘管在某些情況下它們可能僅存在於一個單體上。 圖 6A~6E 顯示了本發明之 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的「非細胞因子」成分的特別有用的實施例。 圖 7A~7F 顯示了本發明之 IL-15/Rα x抗 PD-1 雙功能蛋白的「非細胞因子」/「非 Fv」成分的特別有用的實施例。 圖 8 示出用於 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的許多例示性可變長度結構域連接子。在一些實施例中，這些結構域連接子可用於將 IL-15 及/或 IL-15Rα (sushi) 的 C 端連接至 Fc 區域的 N 端。在一些實施例中，這些結構域連接子可用於將 IL-15 融合至 IL-15Rα(sushi)。在一些實施例中，這些結構域連接子可用於將單鏈 Fv 連接至 Fc 鏈。在一些實施例中，結構域連接子是 scFv 連接子，其用於將 VH 及 VL 結構域連接，且可視需要為帶電荷的。在一些實施例中，這些結構域連接子可組合使用。例如，GGGGS 連接子可與「半鉸鏈」連接子組合使用。 圖 9 示出許多帶電荷的 scFv 連接子，這些連接子可用於增加或減少利用一種或多種 scFv 作為組分的異二聚體抗體的 pI。(+H) 陽性連接子在本文中特別有用。帶有單電荷的單個現有技術 scFv 連接子稱為「Whitlow」，如 Whitlow 等人在 Protein Engineering 6(8): 989-995 (1993) 中所述。應當注意，該連接子用於減少 scFv 中的聚集並增強蛋白水解穩定性。在一些實施例中，這些連接子用於將 IL-15 及/或 IL-15Rα (sushi) 的 C 端連接至 Fc 區域的 N 端；及/或將 IL-15 融合至 IL-15/Rα(sushi)。 圖 10A~10D 顯示了若干基於人 IgG1 的有用 IL-15/Rα-Fc 形式主鏈的序列，其中不含細胞因子序列 (例如，Il-15 及/或 IL-15Rα(sushi))。重要的是注意，這些主鏈也可用於 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的某些實施例中。主鏈 1 基於人 IgG1 (356E/358M 異型)，並且在兩條鏈上均包含 C220S，S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上包含 L368D/K370S 偏斜變異體之 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體) 及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。主鏈 2 基於人 IgG1 (356E/358M 異型)，並且在兩條鏈上均包含 C220S，S364K : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上包含 L368D/K370S 偏斜變異體之 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體) 及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。主鏈 3 基於人 IgG1 (356E/358M 異型)，並且在兩條鏈上均包含 C220S，S364K : L368E/K370S 偏斜變異體 (鏈上包含 L368E/K370S 偏斜變異體之 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體) 及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。主鏈 4 基於人 IgG1 (356E/358M 異型)，並且在兩條鏈上均包含 C220S，D401K : K360E/Q362E/T411E 偏斜變異體 (鏈上包含 K360E/Q362E/T411E 偏斜變異體之 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體) 及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。主鏈 5 基於人 IgG1 (356D/358L 異型)，並且在兩條鏈上均包含 C220S，S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上包含 L368D/K370S 偏斜變異體之 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體) 及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。主鏈 6 基於人 IgG1 (356E/358M 異型)，並且在兩條鏈上均包含 C220S，S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上包含 L368D/K370S 偏斜變異體之 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體) 及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體以及兩條鏈上的 N297A 變異體。主鏈 7 與 6 相同，不同之處僅在於突變為 N297S。主鏈 6 和 7 的替代形式可在兩條鏈中均排除消融變異體 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。主鏈 8 基於人 IgG4，並且包括 S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上帶有 L368D/K370S 偏斜變異體的 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體) 以及兩條鏈上的 S228P (根據 EU 編號，其根據 Kabat 編號為 S241P) 變異體 (其按照本領域中已知的方式消融 Fab 臂互換)。主鏈 9 基於人 IgG2，並且包括 S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上帶有 L368D/K370S 偏斜變異體的 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體)。主鏈 10 基於人 IgG2，並且包括 S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上帶有 L368D/K370S 偏斜變異體的 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體) 以及兩條鏈上的 S267K 變異體。主鏈 11 與主鏈 1 相同，區別在於其包括 M428L/N434S Xtend 突變。主鏈 12 基於人 IgG1 (356E/358M 異型)，並且在兩條相同的鏈上均包括 C220S、兩條相同的鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。主鏈 13 基於人 IgG1 (356E/358M 異型)，並且在兩條鏈上均包含 C220S，S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上包含 S364K/E357Q 偏斜變異體之 P217R/P228R/N276K pI 變異體) 及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。 如本領域中的技術人員將認識到的以及如下文所概述，這些序列可與本文所概述之任何 IL-15 和 IL-15Rα(sushi) 對一起使用，其包括但不限於如圖 14A~14G 中示意性示出之 IL-15/Rα-heteroFc、ncIL-15/Rα 和 scIL-15/Rα。另外，可以將任何 IL-15 及/或 IL-15Rα (sushi) 變異體以任何組合併入這些圖 10A~10C 所示之主鏈中。 在這些主鏈中的每一個內包括與所列舉之序列 90%、95%、98% 和 99% 相同 (如本文所定義) 的序列，及/或包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個額外的胺基酸取代 (相比於圖中之「親本」，如本領域中的技術人員將認識到的，這些胺基酸取代相比於親本人 IgG1 已包含許多胺基酸修飾 (或 IgG2 或 IgG4，取決於主鏈))。亦即，除該圖中主鏈內所含之偏斜、pI 和消融變異體以外，所列舉之主鏈還可包含其他胺基酸修飾 (通常為胺基酸取代)。 圖 11 顯示了基於人 IgG1 的若干有用的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合形式的主鏈的序列，不含細胞因子序列 (例如 Il-15 及/或 IL-15Rα(sushi)) 或 VH，並進一步排除了圖 12 所示之同源輕鏈主鏈。主鏈 1 基於人 IgG1 (356E/358M 異型) 並且包括 S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上包含 L368D/K370S 偏斜變異體的 C220S 和 Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體) 及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。主鏈 2 基於人 IgG1 (356E/358M 異型) 並且包括 S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上包含 L368D/K370S 偏斜變異體的 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體)、鏈上包含 S364K/E357Q 變異體之 C220S 以及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。主鏈 3 基於人 IgG1 (356E/358M 異型) 並且包括 S364K/E357Q : L368D/K370S 偏斜變異體 (鏈上包含 L368D/K370S 偏斜變異體的 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 變異體)、鏈上包含 S364K/E357Q 變異體的 Q196K/I199T/P217R/P228R/N276K pI 變異體以及兩條鏈上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 消融變異體。 在某些實施例中，這些序列可為 356D/358L 異型。在其他實施例中，這些序列可包括 N297A 或 N297S 取代。在一些其他實施例中，這些序列可包括 M428L/N434S Xtend 突變。在其他實施例中，這些序列可替代地基於人 IgG4，並且在兩條鏈上包括 S228P (根據 EU 編號，在 Kabat 編號中為 S241P) 變異體，其消除了 Fab 臂交換，如本領域中所已知。在另一些實施例中，這些序列可替代地基於人 IgG2。此外，這些序列可替代地利用圖 3A~3E、圖 4 和圖 5 中所示之其他偏斜變異體、pI 變異體和消融變異體。 如本領域中的技術人員將認識到的以及如下文所概述，這些序列可與本文所概述之任何 IL-15 和 IL-15Rα(sushi) 對一起使用，其包括但不限於如圖 53 中示意性示出之 scIL-15/Rα、ncIL-15/Rα 和 dsIL-15Rα。此外，如本領域中的技術人員將認識到並且如下文所概述，任何 IL-15 及/或 IL-15Rα (sushi) 變異體均可併入這些主鏈中。此外，如本領域中的技術人員將認識到並且如下文所概述，這些序列可與本文所概述之任何 VH 和 VL 對 (包括 scFv 或 Fab) 一起使用。 在這些主鏈中的每一個內包括與所列舉之序列 90%、95%、98% 和 99% 相同 (如本文所定義) 的序列，及/或包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個額外的胺基酸取代 (相比於圖中之「親本」，如本領域中的技術人員將認識到的，這些胺基酸取代相比於親本人 IgG1 已包含許多胺基酸修飾 (或 IgG2 或 IgG4，取決於主鏈))。亦即，除該圖中主鏈內所含之偏斜、pI 和消融變異體以外，所列舉之主鏈還可包含其他胺基酸修飾 (通常為胺基酸取代)。 圖 12 示出同源輕鏈 (亦即恒定輕鏈) 之「非 Fv」主鏈，其可用於本發明之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中。 圖 13A~13G 示出本發明之 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的若干形式。IL-15Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白「IL-15/Rα-heteroFc」(圖 13A) 包含重組融合至異二聚體 Fc 之一側的 IL-15 和重組融合至異二聚體 Fc 之另一側的 IL-15Rα(sushi)。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 在 Fc 區域的 C 端和 N 端之間可具有可變長度之 Gly-Ser 連接子。單鏈 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白或「scIL-15/Rα-Fc」(圖 13B) 包含透過可變長度之連接子 (稱為「單鏈」IL-15/IL-15Rα(sushi) 複合物或「scIL-15/Rα」) 融合至 IL-15 且然後融合至異二聚體 Fc 區域的 N 端的 IL-15Rα(sushi)，其中該分子的另一側為「僅 Fc」或「空 Fc」。非共價 IL-15/Rα-Fc 或「ncIL-15/Rα-Fc」(圖 13C) 包含融合至異二聚體 Fc 區域之 IL-15Rα(sushi)，而 IL-15 被單獨轉染，由此形成非共價 IL-15/Rα 複合物，其中該分子的另一側為「僅 Fc」或「空 Fc」。二價非共價 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白或「二價 ncIL-15/Rα-Fc」(圖 13D) 包含融合至同源二聚 Fc 區域之 N 端的 IL-15Rα(sushi)，而 IL-15 單獨轉染，由此形成非共價 IL-15/Rα 複合物。二價單鏈 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白或「二價 scIL-15/Rα-Fc」(圖 13E) 包含透過可變長度之連接子 (稱為「單鏈」IL-15/IL-15Rα(sushi) 複合物或「scIL-15/Rα」) 融合至 IL-15Rα(sushi) 且然後融合至異二聚體 Fc 區域的 N 端的 IL-15。Fc-非共價 IL-15/Rα 融合蛋白或「Fc-ncIL-15/Rα」(圖 13F) 包含融合至異二聚體 Fc 區域之 C 端的 IL-15Rα(sushi)，而 IL-15 被單獨轉染，由此形成非共價 IL-15/Rα 複合物，其中該分子的另一側為「僅 Fc」或「空 Fc」。Fc-單鏈 IL-15/Rα 融合蛋白或「Fc-scIL-15/Rα」(圖 13G) 包含透過可變長度之連接子 (稱為「單鏈」IL-15/IL-15Rα(sushi) 複合物或「scIL-15/Rα」) 融合至 IL-15Rα(sushi) 且然後融合至異二聚體 Fc 區域的 C 端的 IL-15，其中該分子的另一側為「僅 Fc」或「空 Fc」。 圖 14 示出「 IL-15/Rα-heteroFc」形式的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 帶有底線，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 8 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子與 Fc 區域之間的邊界。 圖 15 示出「scIL-15/Rα-Fc」形式的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 帶有底線，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 8 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子與 Fc 區域之間的邊界。 圖 16 示出「ncIL-15/Rα-Fc」形式的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 帶有底線，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 8 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子與 Fc 區域之間的邊界。 圖 17A~17C 示出透過 scIL-15/Rα-Fc 形式 (XENP21478) 和 ncIL-15/Rα-Fc 形式 (XENP21479) (基於由 FACS 量測得到之 Ki67 表現) 的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白對 A) NK (CD56+ /CD16+ ) 細胞、B) CD4+ T 細胞和 C) CD8+ T 細胞的誘導。 圖 18 示出與 IL-15Rα、IL-2Rß 和常見 γ 鏈複合之 IL-15 的結構。顯示了旨在降低效力的取代位置。 圖 19A~19C 為降低效力而設計的例示性 IL-15 變異體的序列。這些變異體 IL-15 序列的每一個中均包含與所列舉之序列 90%、95%、98% 和 99% (如本文所定義) 相同的序列，及/或包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個額外的胺基酸取代。如對於本領域的技術人員顯而易見的，IL-15 變異體可用於本文所述之任何 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白和 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。 圖 20 示出「IL-15/Rα-heteroFc」形式 (其包含為降低效力而設計的 IL-15 變異體) 的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 帶有底線，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 65 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子與 Fc 區域之間的邊界。 圖 21A~21B 示出「scIL-15/Rα-Fc」形式 (其包含為降低效力而設計的 IL-15 變異體) 的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 帶有底線，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 65 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子與 Fc 區域之間的邊界。 圖 22A~22B 描繪用指定的供試品孵育後，表現 Ki67 的 A) CD4+ CD45RA- 和 B) CD8+ CD45RA- 細胞的百分比。 圖 23 示出 XENP15074 (基於莫維珠單抗和人 IgG1 Fc 的二價抗 RSV mAb，其包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代) 的胺基酸序列。CDR 帶有底線，並且斜線表示變異區的邊界。 圖 24 示出 A) XENP16432 (基於納武利尤單抗和人 IgG1 Fc 的二價抗 PD-1 mAb，其包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代)、B) XENP21641 (帕博利珠單抗) 以及 C) XENP28437 (基於帕博利珠單抗和人 IgG1 Fc 的二價抗 PD-1 mAb，其包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代) 的胺基酸序列。CDR 帶有底線，並且斜線表示變異區的邊界。 圖 25 示出 XENP21575 (基於雜交瘤克隆 1C11 和人 IgG1 的變異區的嵌合和人源化抗 PD-1 抗體，在重鏈中包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代) 的序列。CDR 帶有底線，並且斜線表示編譯域的邊界。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。如本領域的技術人員將認識到的，VH 和 VL 結構域可格式化為 Fab 或 scFv，以用於本發明的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。 圖 26 示出抗 PD-1 mAb A 和 mAb B 的二價人 IgG1 形式的例示性人源化變異體的序列，其在重鏈中包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代。CDR 帶有底線，並且斜線表示編譯域的邊界。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。如本領域的技術人員將認識到的，VH 和 VL 結構域可格式化為 Fab 或 scFv，以用於本發明的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。 圖 27 示出 XENP16432 (基於納武利尤單抗的二價抗 PD-1 mAb)、XENP21461 (帕博利珠單抗)、嵌合體 mAb A (chmAb A)、嵌合 mAb B (chmAb B) 以及由歸一化 BLI 響應 Octet 表示的基於 1C11 的 mAb 的表位聚類。歸一化 BLI 響應大於 0.5 表示抗體對不結合到同一表位。 圖 28A~28H 示出本發明之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的若干形式。「scIL-15/Rα x scFv」形式 (圖 28A) 包含透過可變長度之連接子 (稱為「scIL-15/Rα」) 融合至 IL-15 且然後融合至異二聚體 Fc 區域之 N 端的 IL-15Rα(sushi)，其中 scFv 融合至異二聚體 Fc 之另一側。「scFv x ncIL-15/Rα」形式 (圖 28B) 包含融合至異二聚體 Fc 區域之 N 端的 scFv，其中 IL-15Rα(sushi) 融合至異二聚體 Fc 之另一側，而 IL-15 被單獨轉染，由此形成非共價 IL-15/Rα 複合物。「scIL-15/Rα x Fab」形式 (圖 28C) 包含透過可變長度之連接子 (稱為「scIL-15/Rα」) 融合至 IL-15 且然後融合至異二聚體 Fc 區域之 N 端的 IL-15Rα(sushi)，其中可變重鏈 (VH) 融合至異二聚體 Fc 之另一側，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便與 VH 形成 Fab。「ncIL-15/Rα x Fab」形式 (圖 28D) 包含融合至異二聚體 Fc 區域之 N 端的 VH，其中 IL-15Rα(sushi) 融合至異二聚體 Fc 之另一側，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便與 VH 形成 Fab，並且同時 IL-15 被單獨轉染，由此形成非共價 IL-15/Rα 複合物。「mAb-scIL-15/Rα」形式 (圖 28E) 包含融合至第一異二聚體 Fc 和第二異二聚體 Fc 之 N 端的 VH，其中 IL-15 融合至 IL-15Rα(sushi)，然後進一步融合至異二聚體 Fc 區域中的一個之 C 端，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便與 VH 形成 Fab。「mAb-ncIL-15/Rα」形式 (圖 28F) 包含融合至第一異二聚體 Fc 和第二異二聚體 Fc 之 N 端的 VH，其中 IL-15Rα(sushi) 融合至異二聚體 Fc 區域中的一個之 C 端，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便與 VH 形成 Fab，而 IL-15 被單獨轉染，由此形成非共價 IL-15/Rα 複合物。「中心 IL-15/Rα」形式 (圖 28G) 包含重組融合至 IL-15 之 N 端且然後融合至異二聚體 Fc 之一側的 VH 以及重組融合至 IL-15Rα(sushi) 之 N 端且然後進一步融合至異二聚體 Fc 之另一側的 VH，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便與 VH 形成 Fab。「中心 scIL-15/Rα」形式 (圖 28H) 包含融合至 IL-15Rα(sushi) 之 N 端的 VH (其融合至 IL-15 且然後進一步融合至異二聚體 Fc 之一側) 以及融合至異二聚體 Fc 之另一側的 VH，而相應的輕鏈被單獨轉染，以便與 VH 形成 Fab。 圖 29 示出「scIL-15/Rα x Fab」形式的例示性 [C]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 以粗體顯示。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 以斜體顯示，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 65 和圖 66 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，所述標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個可包含或排除 Xtend Fc (M428L/N434S)。圖 30A~30B 示出透過 Octet (以及相關的傳感圖) 所測定之 XENP22553 對 PD-1 的親和力。 圖 30A~30C 示出「scIL-15/Rα x Fab」形式的例示性例示性 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 以斜體顯示，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 65 和圖 66 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，所述標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個可包含或排除 Xtend Fc (M428L/N434S)。圖 32A~32D 示出 (A) XENP21641 (帕博利珠單抗) 和 (B) XENP28437 (基於帕博利珠單抗和人 IgG1 Fc 的二價抗 PD-1 mAb，其包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代) 的胺基酸序列。CDR 帶有底線，並且斜線表示變異區的邊界。 圖 31A~31B 示出對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 以斜體顯示，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 65 和圖 66 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個還可包含 Xtend Fc (M428L/N434S)。 圖 32A~32B 示出用 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (XENP28532、XENP28692 和 XENP25850) 以及對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (XENP26007) 和抗 PD-1 mAb (XENP28519) 孵育後 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞的增殖。 圖 33A~33B 示出 XENP25850 (例示性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 對 A) CD4+ CD45RA- CD25+ 和 B) CD8+ CD45RA- CD25+ 的 STAT5 磷酸化的誘導。新鮮細胞以虛線表示，並且活化的細胞以實線表示。新鮮細胞均為 CD25 陰性。 圖 34A 和圖 34B 示出在用基於納武利尤單抗的 XENP16432、帕博利珠單抗或抗 RSV mAb XENP15074 預孵育後，A) [C]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP25937 和 B) [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP28532 對 CD8+ CD45RA- CD25+ PD-1+ T 細胞之 STAT5 磷酸化的誘導。 圖 35 示出在移植 huPBMC 的 NSG 小鼠中投予指定的供試品後體重隨時間的變化 (以佔初始體重的百分比表示)。 圖 36A~36B 示出在移植人 PBMC 的 NSG 小鼠中首次投予指定的供試品後第 14 天的 A) CD8+ T 細胞計數和 B) CD4+ T 細胞計數。 圖 37A~37B 示出在移植人 PBMC 的 NSG 小鼠中首次投予指定的供試品後第 10 天的 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞上的 CD25 表現。 圖 38 示出在移植人 PBMC 的 NSG 小鼠中首次投予指定的供試品後第 10 天的 CD8+ T 細胞與 CD4+ T 細胞的比率。 圖 39A~39B 示出在移植人 PBMC 的 NSG 小鼠中首次投予指定的供試品後第 10 天的 A) CD8+ T 細胞計數和 B) CD4+ T 細胞計數。 圖 40A~40B 示出在移植人 PBMC 的 NSG 小鼠中首次投予指定的供試品後第 10 天的 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞上的 CD25 表現。 圖 41 示出食蟹獼猴中首次投予指定的相對濃度後指定的供試品的血清濃度隨時間的變化。 圖 42 示出 XENP29484 和 XENP29485 (具有 IL-15(D30N/N65D) 變異體的例示性 [NC]PD-1‐標靶 IL‐15/Rα‐Fc 融合蛋白)。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。IL‐15 和 IL-15Rα (sushi) 以斜體顯示，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL‐15、IL‐15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。 圖 43A~43B 示出與納武利尤單抗或帕博利珠單抗不發生競爭的額外的例示性抗 PD-1 ABD 的變異重鏈和變異輕鏈。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。 圖 44A~44B 示出用 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP28532 以及對照 XENP24306 (非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 和 XENP26007 (RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 治療後 PD-1+ A) CD8+ CD45RA- CD45RO+ T 細胞和 B) CD4+ CD45RA- CD45RO+ T 細胞的百分比。 圖 45A~45B 示出二價人 IgG1 形式的抗 PD-1 mAb C 的例示性人源化變異體的序列，其在重鏈中包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代。CDR 帶有底線，並且斜線表示編譯域的邊界。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。如本領域的技術人員所認識到的，VH 和 VL 結構域可格式化為 Fab 或 scFv，以用於本發明之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中。圖 46 示出在移植人 PBMC 的 NSG 小鼠中首次投予指定的供試品後第 14 天的 (A) CD45+ 細胞計數、(B) CD3+ T 細胞計數、(C) CD8+ T 細胞計數和 (D) CD4+ T 細胞計數。 圖 46 示出透過 Octet 所測定之 XENP28536、XENP28537、XENP28538、XENP28539 和 XENP28519 對人和獼猴 PD-1 的親和力。 圖 47 示出 XENP16432 (基於納武利尤單抗之二價抗 PD-1 mAb)、XENP21461 (帕博利珠單抗) 和嵌合體 mAb C (chmAb C) 的表位聚類。歸一化 BLI 響應大於 0.5 表示抗體對不結合到同一表位。數據顯示抗 PD-1 mAb C 與納武利尤單抗和帕博利珠單抗不結合到同一表位。 圖 48A~48C 示出包含基於 mAb C 和各種 IL-15 效力變異體的 PD-1 標靶臂的例示性“scIL-15/Rα x Fab”形式的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 X 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 65 和圖 66 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個還可包含 Xtend Fc (M428L/N434S)。 圖 49A~49C 示出包含基於 mAb C 和各種 IL-15 效力變異體並且還包含 Xtend Fc (M428L/N434S) 的 PD-1 標靶臂的例示性“scIL-15/Rα x Fab”形式的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 65 和圖 66 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。圖 50A~50B 示出在移植人 PBMC 的 NSG 小鼠中首次投予指定的供試品後第 10 天的 (A) CD45+ 細胞計數、(B) CD3+ T 細胞計數、(C) CD8+ T 細胞計數和 D) CD4+ T 細胞計數。 圖 50A~50B 示出 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 對 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞增殖之誘導，如增殖細胞百分比 (基於 CFSE 稀釋測得) 所示。數據顯示，與非標靶 IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc 融合蛋白 (以及對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 相比，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白體在誘導 CD4+ T 細胞增殖方面更有效。 圖 51 示出 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 對 LAG-3 陽性 CD8+ T 細胞之誘導，如增殖細胞百分比 (基於 CFSE 稀釋測得) 所示。數據顯示，與非標靶 IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc 融合蛋白 (以及對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 相比，XENP28532 在誘導 CD8+ LAG-3+ T 細胞增殖方面更有效。此外，XENP28543 誘導 CD8+ LAG-3+ T 細胞增殖比誘導本體 CD8+ T 細胞增殖更有效 (EC50 276.8 vs. 71.94)。總之，這支持 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白對表現查核點 (如存在於腫瘤環境中的查核點) 之 T 細胞可能具有選擇性的觀點。 圖 52A~52B 示出用 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 孵育後的 A) CD4+ CD45RA- 記憶 T 細胞和 B) CD4+ CD45RA+ 初始 T 細胞的活化，如表現 CD25 之細胞的百分比所示。 圖 53A~53B 示出用 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 孵育後表現 PD-1 的 A) CD4+ CD45RA- T 細胞和 B) CD4+ CD45RA+ T 細胞的百分比。 圖 54A~54C 用 A) 50 ng/ml、B) 100 ng/ml 和 C) 500 ng/ml 與結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 預刺激並且用指定的供試品孵育的 PBMC 的 IFNγ 分泌。數據顯示，XENP28532 和 XENP28543 均能有效刺激 IFNγ 分泌。值得注意的是，XENP28532 (基於 mAb A 之 PD-1 標靶臂) 在誘導 IFNγ 分泌方面似乎比 XENP28543 (基於 mAb C 之 PD-1 標靶臂) 活性更高。 圖 55A~55B 示出用基於納武利尤單抗的 XENP16432、帕博利珠單抗或抗 RSV mAb XENP15074 預孵育後，XENP28543 (基於 mAb C 之包含 PD-1 標靶臂的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 對 A) CD8+ CD45RA- CD25+ PD-1+ T 細胞和 B) CD4+ CD45RA- CD25+ PD-1+ T 細胞之 STAT5 磷酸化的誘導。數據顯示，PD-1 阻斷劑不干擾 XENP28543 的活性。 圖 56 示出在移植 huPBMC 的 NSG 小鼠中投予指定的供試品後體重隨時間的變化 (以佔初始體重的百分比表示)。 圖 57A~57C 示出移植 huPBMC 的 NSG 小鼠接受首次投予指定的供試品後 A) 第 11 天、B) 第 14 天和 C) 第 18 天的體重 (以佔初始體重的百分比表示)。p 值使用非配對 t 檢驗測得。數據顯示，截至第 11 天，與僅用 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白治療相比，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白與 PD-1 阻斷劑的組合顯著增強了 GVHD。 圖 58A~58F 示出移植 huPBMC 的 NSG 小鼠接受首次投予指定的供試品後第 14 天的血液中的人 A) CD45+ 細胞、B) CD3+ T 細胞、C) CD4+ T 細胞、D) CD8+ T 細胞、E) γδ T 細胞和 F) NK 細胞的數量。 圖 59A~59B 示出移植 huPBMC 的 NSG 小鼠接受首次投予指定的供試品後第 14 天的血液中的人 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞活化 (如 CD25 MFI 所示)。 圖 60 示出接受 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨或與 PD-1 阻斷劑聯合投藥的移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠體內的腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定) 隨時間的變化。 圖 61 示出接受 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨或與 PD-1 阻斷劑聯合投藥的移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠在第 26、28、30、33、35 和 37 天 (PBMC 移植和首次投予供試品後) 的腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定)。p 值透過非配對 t 檢驗測得。數據顯示，截至第 28 天，與單獨使用 PD-1 阻斷劑治療相比，XENP28543 與 PD-1 阻斷劑聯合治療顯著減小了腫瘤大小。 圖 62A~62B 示出移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠接受首次投予指定的供試品後第 7 天的血液中的人 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞活化 (如 CD25 MFI 所示)。數據顯示，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，能夠顯著增強早期活化的 CD8+ T 細胞。使用非配對 t 檢驗對經過對數轉換的數據進行統計分析。 圖 63A~63E 示出移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠接受首次投予指定的供試品後第 14 天的血液中的人 A) CD45+ 細胞、B) CD3+ T 細胞、C) CD4+ T 細胞、D) CD8+ T 細胞和 E) NK 細胞。數據顯示，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合使用，相比於單獨使用 PD-1 阻斷劑能夠在第 14 天時顯著增強大量淋巴細胞群的擴增。使用非配對 t 檢驗對經過對數轉換的數據進行統計分析。 圖 64A~64B 示出二價人 IgG1 形式的抗 PD-1 mAb C 的例示性經親和力改造的變異體的序列，其在重鏈中包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代。CDR 帶有底線，並且斜線表示編譯域的邊界。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 X 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。如本領域的技術人員所認識到的，VH 和 VL 結構域可格式化為 Fab 或 scFv，以用於本發明之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。圖67A 示出 XENP16432 (基於納武利尤單抗之二價抗 PD-1 mAb)、XENP21461 (帕博利珠單抗) 和嵌合體 mAb C (chmAb C) 的表位聚類。歸一化 BLI 響應大於 0.5 表示抗體對不結合到同一表位。數據顯示抗 PD-1 mAb C 與納武利尤單抗和帕博利珠單抗不結合到同一表位。 圖 65A~65I 示出經親和力改造的 mAb C[PD-1]_H1L1 變異體 (呈二價 IgG1形式，包含 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K 消融變異體) 的表觀解離常數 (KDapp)、結合速率 (ka) 和解離速率 (kd) (如透過 Octet 所測得) 以及相對於 mAb C[PD-1]_H1L1 的倍數改善。所列出之重鏈或輕鏈變異域中的取代基於位置編號 (在下一列中列出了相應的 Kabat 位置)。在 304 個重鏈變異區或輕鏈變異區中具有單點突變的變異體中，我們僅鑑定出 11 個變異體 (包括 mAb C[PD-1]_H1_L1.1 和 mab_C[PD-1]_H1_L1.3) 的親和力比 WT 高 2 倍以上。 圖 66 示出經親和力改造的結合有利的單個取代 VH 變異體和單個取代 VL 變異體 (在 PD-1 標靶 IL15/Rα-Fc 的語境下) 的 mAb C[PD-1]_H1L1 變異體的表觀解離常數 (KDapp)、結合速率 (ka) 和 解離速率 (kd) (如透過 Octet 所測得)。所列出之重鏈或輕鏈變異域中的取代基於位置編號 (在下一列中列出了相應的 Kabat 位置)。儘管 H1.132_L1 提供的親和力高於 H1.19_L1，但 H1.19_L1.1 的親和力高於 H1.132_L1.1。 圖 67 示出經親和力改造的在 VH 及/或 VL 中結合了多個取代 (在 PD-1 標靶 IL15/Rα-Fc 的語境下) 的 mAb C[PD-1]_H1L1 變異體的表觀解離常數 (KDapp)、結合速率 (ka) 和解離速率 (kd) (如透過 Octet 所測得)。所列出之重鏈或輕鏈變異域中的取代基於位置編號 (在下一列中列出了相應的 Kabat 位置)。三取代 VL 變異體 N31H/K36Y/S99T (L1.140；根據 Kabat 編號為 N27dH/K30Y/S93T) 的 KD 較野生型提高了 36 倍，並且與 VH 變異體很好地結合，相比於野生型可實現約 100 倍的改善。 圖 68A~68J 示出包含基於經親和力優化的 mAb C ABD 和各種 IL-15 效力變異體的 PD-1 標靶臂的例示性“scIL-15/Rα x Fab”形式的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 65 和圖 66 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個還可包含或排除 Xtend Fc (M428L/N434S)。 圖 69A~69C 示出包含基於經親和力優化的 mAb C ABD 和各種 IL-15 效力變異體並且還包含 Xtend Fc (M428L/N434S) 的 PD-1 標靶臂的例示性“scIL-15/Rα x Fab”形式的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 X 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 65 和圖 66 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。 圖 70A~70B 示出具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 對 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞增殖之誘導，如增殖細胞百分比 (基於 CFSE 稀釋測得) 所示。數據顯示，XENP30046 (具有親和力增強之 PD-1 標靶臂) 比 XENP28543 更有效地誘導 CD8+ 和 CD4+ T 細胞增殖 (增加 2 倍)。此外，數據顯示，IL-15 (D30N/N65D) 變異體對 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白之活性無顯著影響。 圖 71A~71B 示出用具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 孵育後的 A) CD8+ CD45RA- T 細胞和 B) CD8+ CD45RA+ T 細胞的活化，如表現 CD25 之細胞的百分比所示。 圖 72A~72B 示出用具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 孵育後的 A) CD4+CD45RA- T 細胞和 B) CD4+CD45RA+ T 細胞的活化，如表現 CD25 之細胞百分比所示。 圖 73A~73B 示出用具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 孵育後的表現 PD-1 的 A) CD4+ CD45RA- T 細胞和 B) CD4+ CD45RA+ T 細胞的百分比。數據顯示，[NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白誘導 CD4+ 細胞中 PD-1 的下調，並且下調與 PD-1 的親和力相關。 圖 74 示出接受具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 治療的移植 huPBMC 的 NSG 小鼠體重 (以佔初始體重的百分比表示) 隨時間的變化。對於死亡的小鼠，使用 70%。 圖 75A~75D 示出接受具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 治療的移植 huPBMC 的 NSG 小鼠在 A) 第 11 天、B) 第 14 天、C) 第 18 天和 D) 第 21 天的體重。對於死亡的小鼠，使用 70%。p 值使用非配對 t 檢驗測得。數據顯示，與 PBS 治療相比，單獨接受 XENP30046 (具有親和力增強的 PD-1 標靶臂) 治療可導致第 11 天和第 18 天所測得之體重明顯減輕，而單獨接受 XENP28543 治療則不產生明顯的體重損失 (與 PBS 治療相比)。 圖 76A~76C 示出移植 huPBMC 的 NSG 小鼠接受具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 投藥後第 7 天、第 11 天和第 14 天的 A) IFNγ、B) IL-10 和 C) IL-2Rα 的血清濃度。 圖 77A~77B 示出移植 huPBMC 的 NSG 小鼠接受具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 投藥後第 7 天的血液中 A) CD4+ T 細胞和 B) CD8+ T 細胞的活化 (如 CD25 MFI 所示) (使用非配對 t 檢驗對經過對數轉換的數據進行統計分析)。 圖 78A~78E 示出移植 huPBMC 的 NSG 小鼠接受具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 投藥後第 11 天的血液中的 A) CD45+ 細胞、B) CD3+ T 細胞、C) CD8+ T 細胞、D) CD4+ T 細胞和 E) NK 細胞計數 (使用非配對 t 檢驗對經過對數轉換的數據進行統計分析)。 圖 79A~79E 示出移植 huPBMC 的 NSG 小鼠接受具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 投藥後第 14 天的血液中的 A) CD45+ 細胞、B) CD3+ T 細胞、C) CD8+ T 細胞、D) CD4+ T 細胞和 E) NK 細胞計數。 圖 80A~80B 示出具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 對 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞增殖之誘導，如增殖細胞百分比 (基於 CFSE 稀釋測得) 所示。數據顯示，XENP30272 (對 PD-1 的 KD 為 3.1 nM) 在誘導各種 T 細胞群的增殖和活化方面比 XENP30046 (對 PD-1 的 KD 為 5.4 nM) 更有效。值得注意的是，雖然 XENP30429 (具有 IL-15 (D30N/E64Q/N65D) 變異體的 PD-1-IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 相比於 XENP30046 (具有 IL-15(N4D/N65D) 變異體的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白) 對 CD8+ 和 CD4+ T 細胞的活性僅低 1.8 至 2.5 倍，但是 XENP30432 (具有 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的替代 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc) 相比於 XENP30046 對 CD8+ T 細胞的活性低 12 倍並且對 CD4+ T 細胞的活性低 530 倍 (基於增殖活性)。這表示具有 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在腫瘤環境中保持活性，而在腫瘤環境之外基本上無活性。 圖 81A~81C 示出用具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 孵育後的 A) CD4+ CD45RA- T 細胞和 B) CD4+ CD45RA+ T 細胞的活化，如 CD25 MFI 所示。 圖 82A~82C 示出用具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 孵育後的 A) CD8+ CD45RA- T 細胞和 B) CD8+ CD45RA+ T 細胞的活化，如 CD25 MFI 所示。 圖 83A~83C 示出用具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 孵育後的 A) CD4+ T 細胞、B) CD4+ CD45RA- T 細胞和 C) CD4+ CD45RA+ T 細胞上 PD-1 的表現，如 PD-1 MFI 所示。 圖 84A~84C 示出用具有不同 PD-1 親和力和 IL-15 效力變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (及對照) 孵育後的 A) CD8+ T 細胞、B) CD8+ CD45RA- T 細胞和 C) CD8+ CD45RA+ T 細胞上 PD-1 的表現，如 PD-1 MFI 所示。 圖 85A~85D 示出 NSG 小鼠接受首次投予指定的供試品後第 10 天的 A) CD45 細胞、B) CD3+ T 細胞、C) CD4+ T 細胞和 D) CD8+ T 細胞的擴增 (如細胞計數所示)。數據顯示，IL-15 的效力越高，各種淋巴細胞群的擴增數量越多。 圖 86A~86B 示出 NSG 小鼠接受首次投予指定的供試品後第 10 天的 A) CD4+ T 細胞和 B) CD8+ T 細胞的活化 (如 CD25 染色所示)。數據顯示，IL-15 的效力越高，各種淋巴細胞群的擴增數量越多。 圖 87A~87C 示出 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白及對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (具有 Xtend Fc) 對 A) CD4+ T 細胞增殖、B) CD8+ T 細胞和 C) NK 細胞增殖的誘導，如增殖細胞百分比所示 (基於 CFSE 稀釋測得)。值得注意的是，數據顯示 XENP30046 的 EC50 與 XENP30290 的EC50 (XENP30046 的 Xtend 類似物) 相當。 圖 88A~88B 示出 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白及對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (具有 Xtend Fc) 對 A) CD4+ T 細胞和 B) CD8+ T 細胞的活化，如 CD25 MFI 所示。 圖 89A~89B 示出 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白及對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (具有 Xtend Fc) 對 A) CD4+ T 細胞和 B) CD8+ T 細胞的 PD-1 調節，如 PD-1 MFI 所示。與實例 9B 一致，供試品下調了 T 細胞上的 PD-1。 圖 90 示出接受 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨或與 PD-1 阻斷劑聯合投藥的移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠體內的腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定) 隨時間的變化。 圖 91A~91H 示出接受 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨或與 PD-1 阻斷劑聯合投藥的移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠在第11、14、17、19、21、24、26 和 28 天 (PBMC 移植和首次投予供試品後) 的腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定)。使用 Mann-Whitney 檢驗對經過基線校正的數據進行統計分析。* 表示與 PBS 對照相比，治療顯著 (p ＜ 0.05) 增強了擴增。# 表示與 XENP31123 相比，治療顯著 (p ＜ 0.05) 增強了擴增。† 表示與單獨使用 PD-1 阻斷劑 (XENP16432) 相比，治療顯著 (p ＜ 0.05) 增強了擴增。數據顯示，截至第 28 天，XENP30290 (0.1、0.3 或 1 mg/kg) 或 XENP30516 (0.3、1 或 3 mg/kg) 與 PD-1 的所有組合相比於單獨使用 PD-1 阻斷劑均明顯減小了腫瘤大小。 圖 92A~92F 示出移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠接受首次投予指定的供試品後第 14 天的血液中的 A) CD45+ 細胞、B) CD3+ T 細胞、C) NK 細胞、D) CD4+ T 細胞和 E) CD8+ T 細胞的數量以及 F) CD8 對 CD4 T 細胞比。使用非配對 t 檢驗對經過對數轉換的 CD45+ 細胞擴增進行統計分析。† 表示與單獨使用 PD-1 阻斷劑 (XENP16432) 相比，治療顯著增強了擴增。 圖 93A~93F 示出移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠接受首次投予指定的供試品後第 21 天的血液中的 A) CD45+ 細胞、B) CD3+ T 細胞、C) NK 細胞、D) CD4+ T 細胞和 E) CD8+ T 細胞的數量以及 F) CD8 對 CD4 T 細胞比。† 表示與單獨使用 PD-1 阻斷劑 (XENP16432) 相比，治療顯著增強了擴增。 圖 94 描示出 CD34+ Hu-NSG 小鼠 (在接受任何供試品治療之前) 的各種淋巴細胞上的 PD-1 表現水準 (以 MFI 表示)。數據顯示，小鼠的 PD-1 表現特徵與人相似，亦即在效應記憶細胞群上的表現更高。 圖 95 示出 CD34+ Hu-NSG 小鼠接受 0.3 mg/kg XENP30046 (包含 mAb C_H1_L1.1 和 IL-15(N4D/N65D) 變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc) 治療後第 7 天的各種淋巴細胞群的增加倍數。XENP30046 顯示效應記憶細胞群中的擴增提高了 100 倍。 圖 96 示出 CD34+ Hu-NSG 小鼠接受 0.3 mg/kg XENP30429 (包含 mAb C_H1_L1.1 和 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的 [NC]PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc) 治療後第 7 天的各種淋巴細胞群的增加倍數。 圖 97 示出 CD34+ Hu-NSG 小鼠接受 0.3 mg/kg XENP26007 (包含 IL-15(N4D/N65D) 變異體的對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc) 治療後第 7 天的各種淋巴細胞群的增加倍數。XENP26007 表現出對各種淋巴細胞群非常低的擴增，表示 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的外周淋巴細胞擴增極小。 圖 98 示出 CD34+ Hu-NSG 小鼠接受 0.3 mg/kg XENP30432 (包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D) 變異體的對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc) 治療後第 7 天的各種淋巴細胞群的增加倍數。XENP30432 表現出對各種淋巴細胞群非常低的擴增，表示 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的外周淋巴細胞擴增極小。 圖 99A~99F 示出 CD34+ Hu-NSG 小鼠接受 0.3 mg/kg XENP30046、XENP30429、XENP26007 或 XENP30432 治療後的 A) CD45 細胞、B) CD3+ 細胞、C) CD4+ 細胞、D) CD8+ 細胞、E) γδ 細胞和 F) NK 細胞的倍數變化。 圖 100A~100D 示出 CD34+ Hu-NSG 小鼠接受 0.3 mg/kg XENP30046、XENP30429、XENP26007 或 XENP30432 治療後的 A) CD4 初始細胞、B) CD4 中樞記憶細胞、C) CD4 終末效應細胞和 D) CD4 效應記憶細胞的倍數變化。數據顯示，XENP30046 和 XENP30429 對 PD-1+ 群體諸如 CD4 效應記憶細胞具有選擇性。值得注意的是，CD4 初始細胞的 XENP30429 擴增極少，表示降低 IL-15 臂的效力改善了選擇性。 圖 101A~101D 示出 CD34+ Hu-NSG 小鼠接受 0.3 mg/kg XENP30046、XENP30429、XENP26007 或 XENP30432 治療後的 A) CD8 初始細胞、B) CD8 中樞記憶細胞、C) CD8 終末效應細胞和 D) CD8 效應記憶細胞的倍數變化。數據顯示，XENP30046 和 XENP30429 對 PD-1+ 群體諸如 CD8 效應記憶細胞具有選擇性。值得注意的是，CD8 初始細胞的 XENP30429 擴增極少，表示降低 IL-15 臂的效力改善了選擇性。 圖 102A~102B 示出 CD34+ Hu-NSG 小鼠接受 A) 0.3 mg/kg XENP30046 或 B) 0.3 mg/kg XENP30429 治療後第 7 天的淋巴細胞擴增與基線 PD-1 表現之間的相關性。 圖 103A~103B 示出接受 0.3X XENP22853、1X XENP25937 或 0.3X XENP24306 投藥的食蟹獼猴的 A) CD8+ T 細胞和 B) NK 細胞的擴增。數據顯示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白減少了 NK 細胞擴增，同時保持 CD8+ T 細胞擴增。 圖 104A~104B 示出接受 0.3X XENP22853、1X XENP25937 或 0.3X XENP24306 投藥的食蟹獼猴的 A) CD8+ 初始 T 細胞和 B) CD8+ 效應記憶 T 細胞的擴增。數據顯示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白選擇性擴增了 CD8+ 效應記憶 T 細胞。 圖 105A~105E 示出接受 XENP30290 (mAb C_H1_L1.1 x IL-15[N4D/N65D]) 或 XENP30362 (αRSV x IL-15[N4D/N65D]) 投予的食蟹獼猴的 A) CD8+ PD1+ T 細胞、B) CD8 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始細胞、D) γδ T 細胞和 E) CD56+ NK 細胞的擴增。總之，數據顯示 XENP30290 (具有高 PD-1 親和力和較高的 IL-15 效力) 能夠在 2-3 週內維持周邊的藥物效力學，實現適度的 PD1- 細胞擴增。具體地，γδ T 細胞為擴增程度最高的細胞群；CD4+ 和 CD8+ 初始 T 細胞為擴增程度最低的細胞群；並且 CD8+ 幹細胞記憶細胞為擴增程度最高的相關細胞群。 圖 106A~106E 示出接受 XENP30516 (mAb C_H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D]) 或 XENP30518 (αRSV x IL-15[D30N/E64Q/N65D]) 投予的食蟹獼猴的 A) CD8+ PD1+ T 細胞、B) CD8 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始細胞、D) γδ T 細胞和 E) CD56+ NK 細胞的擴增。總之，數據顯示 XENP30516 (具有高 PD-1 親和力和較低的 IL-15 效力) 能夠維持周邊的藥物效力學，實現不顯著的 PD1- 細胞擴增。具體地，γδ T 細胞為擴增程度最高的細胞群；CD4+ 和 CD8+ 初始 T 細胞為擴增程度最低的細胞群；並且 CD8+ 幹細胞記憶細胞為擴增程度最高的相關細胞群。 圖 107 示出接受 XENP30290、XENP30291、XENP29439 或 XENP30516 投藥的食蟹獼猴的血清濃度隨時間的變化。數據顯示，具有最高 PD-1 親和力和更高 IL-15 效力的 XENP30290 與具有較低 PD-1 親和力的 XENP30291 和 XENP29439 相比，清除速度更快。但是，具有最高 PD-1 親和力但 IL-15 效力較低的 XENP30516 導致清除速度慢於 XENP30290。 圖 108 示出接受 XENP30290、XENP30292 或 XENP30516 投藥的食蟹獼猴的血清濃度隨時間的變化。數據顯示，具有較低 IL-15 效力的 XENP30516 導致清除速度慢於 XENP30290。 圖 109 示出接受 XENP30291 或 XENP30293 投藥的食蟹獼猴的血清濃度隨時間的變化。 圖 110 示出接受 XENP29439 或 XENP30302 投藥的食蟹獼猴的血清濃度隨時間的變化。 圖 111 示出接受 XENP30362 或 XENP30518 投藥的食蟹獼猴的血清濃度隨時間的變化。數據顯示，更高的 IL-15 效力與更快的清除率相關。 圖 112A~112C 示出接受 A) XENP30290、B) XENP30516 或 C) XENP30362 投藥的食蟹獼猴體內各種淋巴細胞群中的 PD-1 表現隨時間的變化。數據顯示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白增加了 PD-1 表現，而對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白則無此效果。 圖 113 示出所有 T 細胞記憶亞組的峰值擴增倍數與 XENP30290 或 XENP30516 所誘導之峰值 PD-1 表現之間的相關性。 圖 114 示出經過改造以消除醣基化的例示性 IL-15 變異體的序列。這些變異體 IL-15 序列的每一個中均包含與所列舉之序列 90%、95%、98% 和 99% (如本文所定義) 相同的序列，及/或包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個額外的胺基酸取代。如對於本領域的技術人員顯而易見的，IL-15 變異體可用於本文所述之任何 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白和 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。此外，本文所述之各種 IL-15 修飾可單獨使用，或與本文所述之任何其他 IL-15 修飾結合使用。 圖 115A~115C 示出經改造以消除醣基化的「IL-15/Rα-heteroFc」形式的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 帶有底線，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 7 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子與 Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個還可包含或排除 Xtend Fc (M428L/N434S)。 圖 116A~116G 示出經改造以消除醣基化的「scIL-15/Rα x Fab」的例示性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 以斜體顯示，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 9 和圖 10A~116G 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個還可包含或排除 Xtend Fc (M428L/N434S)。 圖 117A~117F 示出經改造以消除醣基化的「scIL-15/Rα x Fab」的對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 以斜體顯示，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 9 和圖 10 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個還可包含或排除 Xtend Fc (M428L/N434S)。 圖 118A 和圖118B 示出：i) 色譜圖，展示了 XENP30516、XENP31981、XENP31982、XENP31984、XENP31985、XENP31986 和 XENP31987 的純化部分 2；以及 ii) 由陰離子交換分離得到的主要峰的分析型陰離子交換色譜 (分析型 AIEX) 表徵結果 (如圖 154A 所示)。圖 118A 展示了 XENP30516、XENP31981、XENP31982、XENP31984 和 XENP31985。圖 118B 展示了 XENP31986 和 XENP31987。構建體為 XENP30516 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D] w/ (G4S) 連接子 (SEQ ID NO: 7))、XENP31981 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q] w/ (G4S) 連接子 (SEQ ID NO: 7))、XENP31982 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] w/ (G4S) 連接子 (SEQ ID NO: 7))、XENP31984 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D] w/ (G4A) 連接子 (SEQ ID NO: 8))、XENP31985 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/S114A] w/ (G4A) 連接子 (SEQ ID NO: 8))、XENP31986 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] w/ (G4A) 連接子 (SEQ ID NO: 8)) 和 XENP31987 (mAb C H1_L1.1 x IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/S114_] w/ (G4A) 連接子 (SEQ ID NO: 8))。 圖 119 示出經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白對 CD8 效應記憶 T 細胞增殖的誘導。包含經改造以消除醣基化的 IL-15 變異體的各種供試品的活性得以保留，並且其效力意外比未經改造以消除 IL-15 醣基化的 XENP30516 (以及相應的具有 Gly-Ala 連接子的 XENP31984) 更有效。「(G4S) 連接子」為 SEQ ID NO: 7 且「(G4A) 連接子」為 SEQ ID NO: 8。 圖 120 示出經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白和經糖改造之 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的 CD4 和 CD8 效應記憶 T 細胞增殖的誘導。示出 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白相對於相應的 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的效力增加倍數，表示其具有良好的選擇性 (對 TIL 的選擇性高於外周淋巴細胞)。 圖 121A~121D 示出 A) XENP30290 vs. XENP30362；B) XENP31979 vs. XENP32163；C) XENP30516 vs. XENP30518；及 D) XENP31986 vs. XENP32169 引起的 CD8 效應記憶 T 細胞的增殖。數據顯示，去除 N-連接醣基化可提高效力，而且改善了選擇性。「(G4S) 連接子」為 SEQ ID NO: 7 且「(G4A) 連接子」為 SEQ ID NO: 8。 圖 122 示出接受經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨或與 PD-1 阻斷劑聯合投藥的移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠體內的腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定) 隨時間的變化。經糖改造之變異體 XENP319816 表現出增強的抗腫瘤活性 (即使在較低劑量下)，並與 PD-1 阻斷劑有效結合。「(G4S) 連接子」為 SEQ ID NO: 7 且「(G4A) 連接子」為 SEQ ID NO: 8。 圖 123 示出接受經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨或與 PD-1 阻斷劑聯合投藥的移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠截至第 17 天的體內腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定) 的變化。 圖 124 示出移植 pp65-MCF7 和 huPBMC 的 NSG 小鼠接受經糖改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白單獨或與 PD-1 阻斷劑聯合投藥後第 14 天血液中的 CD8+ 細胞計數。 圖 125A~125E 示出接受 1X 低劑量 XENP30290 (PD1 x IL15[N4D/N65D]) 的食蟹獼猴的 A) CD8+PD1+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始細胞 (PD1低)、D) γδ 細胞和 E) NK 細胞的擴增。數據顯示，XENP30290 在 1X 低劑量下誘導了 PD1+ 細胞擴增。 圖 126A~126E 示出接受 10X 高劑量 XENP30290 (PD1 x IL15[N4D/N65D]) 和對應的 RSV 標靶替代物 XENP30362 的食蟹獼猴的 A) CD8+PD1+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始細胞 (PD1低)、D) γδ 細胞和 E) NK 細胞的擴增。數據顯示，XENP30290 在 10X 高劑量下誘導了良好的 PD1+ 細胞擴增，但是對 PD1 細胞具有中等活性，如 RSV 標靶對照 XENP30362 的活性所示。「(G4S) 連接子」為 SEQ ID NO: 7。 圖 127A~127E 示出接受 10X 高劑量 XENP30516 (PD1 x IL15[D30N/E64Q/N65D]) 投藥的食蟹獼猴的 A) CD8+ PD1+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始 (PD1低 ) 細胞、D) γδ 細胞和 E) NK 細胞的擴增。數據顯示，XENP30516 在 10X 高劑量下誘導了良好的 PD1+ 細胞擴增。 圖 128A~128E 示出接受 30X 極高劑量的 XENP30516 (PD1 x IL15[D30N/E64Q/N65D]) 和對應的 RSV 標靶替代物 XENP30518 投藥的食蟹獼猴的 A) CD8+PD1+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始 (PD1低) 細胞、D) γδ 細胞和 E) NK 細胞的擴增。數據顯示，XENP30516 在 30X 極高劑量下誘導更大的 PD1+ 擴增，同時保持有益的選擇性。「(G4S) 連接子」為 SEQ ID NO: 7。 圖 129A~129E 示出接受 1X 低劑量 XENP31986 (PD1 x IL15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q]) 和對應的 RSV 標靶替代物 XENP32169 投藥的食蟹獼猴的 A) CD8+ PD1+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始 (PD1低 ) 細胞、D) γδ 細胞和 E) NK 細胞的擴增。數據顯示，XENP31986 在 1X 低劑量下誘導良好的 PD1+ 擴增，同時具有優異的選擇性。「(G4A) 連接子」為 SEQ ID NO: 8。 圖 130A~130E 示出接受 3X 中等劑量 XENP31986 (PD1xIL15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q]) 和對應的 RSV 標靶替代物 XENP32169 投藥的食蟹獼猴的 A) CD8+ PD1+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始 (PD1低 ) 細胞、D) γδ 細胞和 E) NK 細胞的擴增。數據顯示，XENP31986 在 3X 中等劑量下誘導了增強的 PD1+ 細胞擴增，同時保持了優異的選擇性。「(G4A) 連接子」為 SEQ ID NO: 8。 圖 131A~131E 示出接受 10X 高劑量 XENP31986 (PD1 x IL15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q]) 和對應的 RSV 標靶替代物 XENP32169 投藥的食蟹獼猴的 A) CD8+ PD1+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始 (PD1低 ) 細胞、D) γδ 細胞和 E) NK 細胞的擴增。數據顯示，XENP31986 在 10X 高劑量下誘導了非常大的 PD1+ 細胞擴增，同時保持了優異的選擇性。「(G4A) 連接子」為 SEQ ID NO: 8。 圖 132 總結了食蟹獼猴接受各種濃度的包含 IL-15[N4D/N65D]、IL-15[D30N/E64Q/N65D] 或 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 的各種 PD-1 標靶或 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白投藥後的 CD8+ PD1+ T 細胞的擴增。 圖 133A~133E 示出接受各種濃度的包含 IL-15[N4D/N65D]、IL-15[D30N/E64Q/N65D] 或 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 的各種 PD-1 標靶或 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的食蟹獼猴體內 A) CD8+ PD1+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶細胞、C) CD8 初始 (PD1低 ) 細胞、D) γδ 細胞和 E) NK 細胞的選擇性比率與峰值擴增倍數之間的相關性。總之，數據顯示增加劑量可提高選擇性。此外，包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 變異體之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的選擇性高於包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D] 變異體之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白，其選擇性繼而高於包含 IL-15[N4D/N65D] 變異體之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。 圖 134 示出食蟹獼猴體內指定供試品的血清濃度隨時間的變化。出人意料的是，在相同劑量下，相比於包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D] 變異體的醣基化 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc XENP30516，包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 變異體的去醣基化 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc XENP31896 表現出增強的藥代動力學特徵，儘管 XENP31896 相比於 XENP30516 具有增強的效力/藥物效力學特徵。「(G4S) 連接子」為 SEQ ID NO: 7 且「(G4A) 連接子」為 SEQ ID NO: 8。 圖 135 示出食蟹獼猴體內指定供試品的血清濃度隨時間的變化。在相同劑量下，相比於包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D] 變異體之醣基化 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc XENP32169，包含 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 變異體之去醣基化 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc XENP32169 表現出增強的藥代動力學特徵。「(G4S) 連接子」為 SEQ ID NO: 7 且「(G4A) 連接子」為 SEQ ID NO: 8。 圖 136 示出 Octet 傳感圖，顯示了經 Trp 改造之 mAb C[PD-1]_H1L1 變異體與 WT mAb C[PD-1]_H1L1 相比的結合。根據 Kabat 進行編號。數據顯示，修復不穩定的色氨酸導致與 PD-1 之結合完全丟失或大大減弱。 圖 137A~137G 示出二價人 IgG1形式的 mAb C[PD-1]_H1L1 的例示性經 Trp 改造和親和力修復的變異體的序列，其在重鏈中包含 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代。CDR 帶有底線，並且斜線表示編譯域的邊界。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。如本領域的技術人員將認識到的，VH 和 VL 結構域可格式化為 Fab 或 scFv，以用於本發明的 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白。 圖 138A~138G 示出包含 mAb C[PD-1]_H1L1 的例示性經 Trp 改造和親和力修復的變異體的「scIL-15/Rα x Fab」的例示性 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白的序列。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 以斜體顯示，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 9 和圖 10 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個還可包含或排除 Xtend Fc (M428L/N434S)。 圖 139 示出包含經修復之 PD-1 結合的經 Trp 改造之 mAb C[PD-1]_H1L1 變異體的表觀解離常數 (KDapp)、結合速率 (ka) 和解離速率 (kd)，如透過 Octet 所測得。所列出之重鏈或輕鏈變異域中的取代基於位置編號 (在下一列中列出了相應的 Kabat 位置)。鑑定出若干變異體，其恢復的 PD-1 親和力結合接近 mAb C_H1_L1.1 (包括 mAb C_H1.176_L1.140、mAb C_H1.177_L1.140 和 mAb C_H1.180_L1.140)。 圖 140A~140B 示出 Octet 傳感圖，顯示了 A) XENP31986 (具有 mAb C[PD1]_H1_L1.1) 和 B) XENP32435 (具有經 Trp 改造/親和力修復之 mAb C[PD1]_H1.176_L1.140) 與 PD-1 之結合。數據顯示，經修復之分子對 PD-1 具有同等親和力。 圖 141 示出經 Trp 改造之 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白對 CD8 效應記憶 T 細胞增殖的誘導。具有經改造以去除 Trp 的 PD-1 結合結構域的 XENP32435、XENP32436 和 XENP32439 與 XENP31986 相比具有相同或更高的增殖 CD8+ 效應記憶 T 細胞的效力 (儘管對 PD-1 具有相似的親和力)。 圖 142 示出作為「IL-15/Rα-heteroFc」形式的例示性 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP20818 (WT IL-15)、XENP22821 (IL-15[N65D]) 和 XENP24045 (IL-15[D30N/E64Q/N65D]) 的序列。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 帶有底線，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 7 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子與 Fc 區域之間的邊界。 圖 143 示出接受非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP20818 和 XENP24045 以及各種 PD-1 標靶或對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白治療後的雷帕黴素擴增之 Treg 的增殖。數據顯示，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 (標靶及非標靶) 誘導雷帕黴素擴增之 Treg 的增殖 (如透過 Tag-it 紫外線稀釋法所測得)。值得注意的是，與非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白相比，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白誘導 Treg 增殖的效力低得多。 圖 144A~144B 示出用 5 µg/ml 指定供試品和數量增加的雷帕黴素擴增之 Treg 孵育 1 x 105 CFSE 標記的 PBMC 後的 A) CD8 效應記憶 T 細胞和 B) CD4 效應記憶 T 細胞的擴增 (如透過 CFSE 稀釋所測得)。數據顯示，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白改變 (降低) Treg 所誘導之 CD8 和 CD4 效應記憶 T 細胞增殖的抑制效力。值得注意的是，對照 RSV 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白引起的改變小於 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白所誘導之效力下降。 圖 145A~145B 示出用 5 µg/ml 指定供試品和數量增加的雷帕黴素擴增之 Treg 孵育 1 x 105 CFSE 標記的 PBMC 後的 A) Treg 與 CD8 效應記憶 T 細胞的比率以及 B) Treg 與 CD4 效應記憶 T 細胞的比率。數據顯示，與無供試品相比，PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白增加了 Treg/TEM 比率，而 PD-1 標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白卻增強了 TEM 細胞增殖。這表示儘管 Treg 得到擴增，但擴增之 Treg 表現出抑制能力下降。 圖 146A~146B 示出用完全 Treg 培養基 (含 10% FBS、0.5 µg/ml 抗 CD28、100 U/ml IL-2、100 ng/ml 雷帕黴素 的 RPMI)；不含雷帕黴素的完全 Treg 培養基；或包含 100 ng/ml IL-15 的完全 Treg 培養基 (在包含 10% FBS、0.5 µg/ml 抗 CD28 且不含 IL-2、不含雷帕黴素的 RPMI 中) 預培養 6 天的雷帕黴素擴增之 Treg 孵育 CD3 刺激的 PBMC 後的增殖 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞的百分比 (如透過 CFSE 稀釋所測得)。數據顯示，用 IL-15 預處理的 Treg 的抑制能力得到削弱。 圖 147A~147B 示出 A) 不經或 B) 經 5 µg/ml IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP22821 處理 14 天後的 PBMC 中 CD4+ T 細胞上 CD25 和 FOXP3 的表現。數據顯示，XENP22821 處理減小了 FOXP3 在 CD4+ T 細胞群上的表現。 圖 148A~148B 示出 A) 不經或 B) 經 5 µg/ml IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP22821 處理 14 天後的 PBMC 中 CD4+ T 細胞上 CD45RA 和 FOXP3 的表現。數據顯示，XENP22821 處理使 CD4+ CD45RA- 群體從 FoxP3高 改變為 FoxP3低 ，表示 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白處理實際上將種群由 eTreg (種群從 5.24% 減少為 2.72%) 改變為活化的效應 CD4 T 細胞 (種群從18.2% 增加至 28.6%)。 圖 149A~149B 示出 A) 不經或 B) 經 5 µg/ml IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP22821 處理 14 天後的 PBMC 中 CD4+ T 細胞上 CD25 和 CCR4 的表現。數據顯示，XENP22821 處理減小了 CCR4 在 CD4+ T 細胞群上的表現。 圖 150A~150B 示出用 10 µg/ml 的 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP24045 和指定濃度的 TGFß1 孵育 100 ng/ml 與結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 上 CFSE 標記的 PBMC 後的 A) CD8 T 細胞和 B) CD4 T 細胞的增殖 (如透過 CFSE 稀釋所測得)。數據顯示，TGFß 呈劑量依賴性抑制 T 細胞增殖；然而，值得注意的是，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在所有測試的劑量下均阻止 TGFß 對 T 細胞增殖的抑制。 圖 151A~151B 示出包含經修復之 PD-1 結合的經 Trp 改造之 mAb C[PD-1]_H1L1 變異體的表觀解離常數 (KDapp )、結合速率 (ka ) 和解離速率 (kd )，如透過 Octet 所測得。所列出之重鏈變異域中的取代基於位置編號 (在下一列中列出了相應的 Kabat 位置)。 圖 152A~152N 示出與納武利尤單抗或帕博利珠單抗不發生競爭的額外的例示性抗 PD-1 ABD 的變異重鏈和變異輕鏈。CDR 帶有底線。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。 圖 153A 和圖 153B 示出例示性 PD-1 標靶 IL-15 構建體的序列。圖 153A 顯示了 XENP31326。圖 153B 顯示了 XENP31329。如本文所述，並且對於本文中包含 CDR 的每個序列都成立的是，CDR 位置的確切標識可能略有不同，具體取決於表 1 中所示的所用編號，因此，本文不僅包括帶有底線的 CDR，而且包括 VH 和 VL 結構域內所含的 CDR (使用其他編號系統)。IL-15 和 IL-15Rα (sushi) 以斜體顯示，連接子帶有雙底線 (儘管如本領域的技術人員所認識到的，連接子可以被其他連接子代替，其中一些在圖 9 和圖 10 中示出)，並且斜線 (/) 表示 IL-15、IL-15Rα、連接子、變異區和恒定/Fc 區域之間的邊界。如對於本領域的技術人員顯而易見的，標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白中的每個還可包含或排除 Xtend Fc (M428L/N434S)。 圖 154A-圖 154C 示出 A) XENP31326 vs. XENP31329、B) XENP30516 和 XENP32927 vs. XENP30518 以及 C) XENP31986 和 XENP32435 vs. XENP32169 對 CD3 效應記憶 T 細胞增殖的誘導。數據顯示，單獨使用標靶融合蛋白 (如 XENP31326 與 XENP31329 的比較所示) 提供了有限的選擇性 (RSV 標靶融合蛋白和 PD1 標靶融合蛋白的 EC50 相差 2.4 倍)。PD1 標靶與 IL-15 效力的下降相結合 (如 XENP30516 和 XENP32927 vs XENP30518 的比較以及 XENP31986 和 XENP32435 vs XENP32169 的比較所示) 提供了顯著增強的選擇性。值得注意並且出人意料的是，去醣基化變異體進一步提高了選擇性 (去醣基化變異體的選擇性為 246 倍，而不含去醣基化變異體的選擇性僅為 105 倍)。 圖 155A 和圖 155B 示出在存在 XmAb24306 和各種濃度的雷帕黴素擴增之 Treg 的情況下 (圖155A) CD8+和 (圖155B) CD4+ 響應 T 細胞的增殖。 圖 156 示出用 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP20818 和 XENP24045 處理後的雷帕黴素擴增之 Treg 的增殖。數據顯示，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白誘導雷帕黴素擴增之 Treg 的增殖 (如透過 Tag-it 紫外線稀釋法所測得)。值得注意的是，與 XENP20818 相比，XENP24045 在誘導 Treg 增殖方面的效力下降。 圖 157A 和 圖 157B 示出用 5 µg/ml 指定供試品和數量增加的雷帕黴素擴增之 Treg 孵育 1 x 105 CFSE 標記的 PBMC 後的 A) CD8 效應記憶 T 細胞和 B) CD4 效應記憶 T 細胞的擴增 (如透過 CFSE 稀釋所測得)。數據顯示，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白改變 (降低) Treg 所誘導之 CD8 和 CD4 效應記憶 T 細胞增殖的抑制效力。 圖 158A 和圖 158B 示出用 5 µg/ml 指定供試品和數量增加的雷帕黴素擴增之 Treg 孵育 1 x 105 CFSE 標記的 PBMC 後的 A) Treg 與 CD8 效應記憶 T 細胞的比率以及 B) Treg 與 CD4 效應記憶 T 細胞的比率。數據顯示，與無供試品相比，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白增加了 Treg/TEM 比率，而 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白卻增強了 TEM 細胞增殖。這表示儘管 Treg 得到擴增，但擴增之 Treg 表現出抑制能力下降。 圖 159A 和圖 159B 示出用完全 Treg 培養基 (含 10% FBS、0.5 µg/ml 抗 CD28、100 U/ml IL-2、100 ng/ml 雷帕黴素 的RPMI)；不含雷帕黴素的完全 Treg 培養基；或包含 100 ng/ml IL-15 的完全 Treg 培養基 (在包含 10% FBS、0.5 µg/ml 抗 CD28 且不含 IL-2、不含雷帕黴素的 RPMI 中) 預培養 6 天的雷帕黴素擴增之 Treg 孵育 CD3 刺激的 PBMC 後的增殖 A) CD8+ T 細胞和 B) CD4+ T 細胞的百分比 (如透過 CFSE 稀釋所測得)。數據顯示，用 IL-15 預處理的 Treg 的抑制能力得到削弱。 圖 160A 和圖 160B 示出 A) 不經或 B) 經 5 µg/ml IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP22821 處理 14 天後的 PBMC 中 CD4+ T 細胞上 CD25 和 FOXP3 的表現。數據顯示，XENP22821 處理減小了 FOXP3 在 CD4+ T 細胞群上的表現。 圖 161A 和圖 161B 示出 A) 不經或 B) 經 5 µg/ml IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP22821 處理 14 天後的 PBMC 中 CD4+ T 細胞上 CD45RA 和 FOXP3 的表現。數據顯示，XENP22821 處理使 CD4+ CD45RA- 群體從 FoxP3高 改變為 FoxP3低 ，表示 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白處理實際上將種群由 eTreg (種群從 5.24% 減少為 2.72%) 改變為活化的效應 CD4 T 細胞 (種群從18.2% 增加至 28.6%)。 圖 162A 和圖 162B 示出 A) 不經或 B) 經 5 µg/ml IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP22821 處理 14 天後的 PBMC 中 CD4+ T 細胞上 CD25 和 CCR4 的表現。數據顯示，XENP22821 處理減小了 CCR4 在 CD4+ T 細胞群上的表現。 圖 163A 和圖 163B 示出用 10 µg/ml 的 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP24045 和指定濃度的 TGFß1 孵育 100 ng/ml 與結合在板上的抗 CD3 (OKT3) 上 CFSE 標記的 PBMC 後的 A) CD8 T 細胞和 B) CD4 T 細胞的增殖 (如透過 CFSE 稀釋所測得)。數據顯示，TGFß 呈劑量依賴性抑制 T 細胞增殖；然而，值得注意的是，IL-15/Rα-Fc 融合蛋白在所有測試的劑量下均阻止 TGFß 對 T 細胞增殖的抑制。 圖 164 示出經 pp65-MCF7 移植的 huCD34+ NSG 小鼠中接受單劑 PD-1 阻斷劑、效力下降的非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP24045 (作為單藥投予或與 PD-1 阻斷劑合並投予) 或 [NC]PD-1 標靶效力下降經糖改造之 IL-15/Rα-Fc 投藥後的腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定) 隨時間的變化。與接受 PBS 治療處理的對照相比，所有組在第 15 天均表現出顯著增強的腫瘤活性 (p ≤ 0.05)，並且與 PD-1 阻斷劑聯合使用時具有明顯的抗腫瘤活性優勢。 圖 165 示出經 pp65-MCF7 移植的 huCD34+ NSG 小鼠中接受單劑 PD-1 阻斷劑、效力下降的非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP24045 (作為單藥投予或與 PD-1 阻斷劑合並投予) 或 [NC]PD-1 標靶效力下降經糖改造之 IL-15/Rα-Fc 投藥後第 7 天和第 13 天的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞的擴增。與非標靶 IL-15-Fc 融合蛋白聯合使用 PD-1 阻斷劑相比，PD-1 標靶 IL-15 與 PD-1 阻斷劑聯合使用時顯著增強了 CD8+ T 細胞和 CD4+ T 細胞兩者的擴增。與 PD-1 標靶 IL-15 單藥相比，PD-1 標靶 IL-15 與 PD-1 阻斷劑聯合使用顯著增強了淋巴細胞擴增。 圖 166 示出經 pp65-MCF7 移植的 huCD34+ NSG 小鼠中接受單劑 PD-1 阻斷劑、效力下降的非標靶 IL-15/Rα-Fc 融合蛋白 XENP24045 (作為單藥投予或與 PD-1 阻斷劑合並投予) 或 [NC]PD-1 標靶效力下降經糖改造之 IL-15/Rα-Fc 投藥後第 13 天的 CD8 T 細胞與 Treg 的比率。使用 PD1 標靶 IL15 改善了 CD8:Treg 比率 (並且與 PD-1 阻斷劑聯合使用時得到進一步改善)。使用非配對 t 檢驗對經過對數轉換的數據進行統計分析。 圖 167A~167E 示出：經 pp65-MCF7 移植的 huCD34+ NSG 小鼠接受接受單劑 PD-1 阻斷劑或 [NC]PD-1 標靶效力下降經糖改造之 IL-15/Rα-Fc (作為單藥投予或與 PD-1 阻斷劑合並投予) 後第 9 天的腫瘤組織中的 A) 總 CD45 淋巴細胞群中 CD3+ T 細胞的百分比、B) 總 CD8 細胞群中效應記憶 CD8 T 細胞的百分比、C) 總 CD8 細胞群中 CD8 初始細胞的百分比、D) 總 CD3 細胞群中 Treg 的百分比以及 E) 效應記憶CD8 T 細胞與 Treg 的比率。數據顯示，XENP32986 單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，可增加腫瘤組織中的總 CD3+ T 細胞並將 T 細胞表型改變為效應記憶 CD8+；XENP32986 單獨使用或與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，可增加腫瘤組織中的 CD8:Treg 比率；並且低劑量 0.01 mg/kg XENP32986 與 PD-1 阻斷劑聯合使用時，能夠顯著提高藥效。 圖 168A~168L 示出經 huPBMC 和 pp65-MCF7 移植的 NSG-DKO 小鼠接受單劑 PD-1 阻斷劑、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D] XENP32927 (以濃度為 0.1、0.3 或 1 mg/kg 的單藥使用或與 0.3 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用)、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] XENP32435 (以濃度為 0.03、0.1 或 0.3 mg/kg 的單藥或與 0.1 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用)、以及 RSV 標靶 IL-15 對照聯合 PD-1 阻斷劑投藥後的腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定) 經基線校正後的隨時間的變化。 圖 169 示出經 huPBMC 和 pp65-MCF7 移植的 NSG-DKO 小鼠接受單劑 PD-1 阻斷劑、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D] XENP32927 (以濃度為 0.1、0.3 或 1 mg/kg 的單藥使用或與 0.3 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用) 以及 RSV 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D] 對照聯合 PD-1 阻斷劑投藥後的腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定) 經基線校正後的隨時間的變化。與單獨使用 PD-1 阻斷劑相比，XENP32927 以 0.3 mg/kg 的濃度與 PD-1 拮抗劑聯合使用時導致顯著的腫瘤消退 (第 17、20、22 和 27 天時 p ＜ 0.05)，以 1 mg/kg 的濃度與 PD-1 拮抗劑聯合使用時也導致顯著的腫瘤消退 (第 15 天和第 17 天時 p ＜ 0.05) (使用 Mann-Whitney 檢驗對基線校正後的數據進行統計分析)。 圖 170 示出經 huPBMC 和 pp65-MCF7 移植的 NSG-DKO 小鼠接受單劑 PD-1 阻斷劑、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] XENP32435 (以濃度為 0.03、0.1 或 0.3 mg/kg 的單藥使用或與 0.1 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用) 以及 RSV 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 對照聯合 PD-1 阻斷劑投藥後的腫瘤體積 (如透過卡尺測量所測定) 經基線校正後的隨時間的變化。與單獨使用 PD-1 阻斷劑相比，XENP32435 以 0.1 mg/kg 的濃度與 PD-1 拮抗劑聯合使用時導致顯著的腫瘤消退 (第 13 天和第 15 天時 p ＜ 0.05)，以 0.3 mg/kg 的濃度與 PD-1 拮抗劑聯合使用時也導致顯著的腫瘤消退 (第 13、15 和 17 天時 p ＜ 0.05)。值得注意的是，在該模型中，XENP32435 表現出顯著的腫瘤消退作用 (與 PD-1 阻斷劑單藥相比，第 17 天時 p ＜ 0.05)。使用 Mann-Whitney 檢驗對經過基線校正的數據進行統計分析。 圖 171 示出經 huPBMC 和 pp65-MCF7 移植的 NSG-DKO 小鼠接受單劑 PD-1 阻斷劑、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D] XENP32927 (以濃度為 0.1、0.3 或 1 mg/kg 的單藥使用或與 0.3 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用)、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] XENP32435 (以濃度為 0.03、0.1 或 0.3 mg/kg 的單藥或與 0.1 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用)、以及 RSV 標靶 IL-15 對照聯合 PD-1 阻斷劑投藥後第 17 天的腫瘤體積變化。使用 Mann-Whitney 檢驗對經過基線校正的數據進行統計分析。數據顯示，與單獨使用 PD-1 阻斷劑相比，與 PD-1 抑制劑聯合使用時，RSV 標靶 IL-15 (包含 IL-15 變異體) 並不增強活性。 圖 172A~172D 示出：經 huPBMC 和 pp65-MCF7 移植的 NSG-DKO 小鼠接受單劑 PD-1 阻斷劑、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D] XENP32927 (以濃度為 0.1、0.3 或 1 mg/kg 的單藥使用或與 0.3 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用) 以及 RSV 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D] 對照聯合 PD-1 阻斷劑投藥後第 7 天的 A) CD4+ T 細胞的活化和 B) CD8+ T 細胞的活化 (如 CD25 表現所示)；以及第 14 天的 C) CD4+ T 細胞計數和 D) CD8+ T 細胞計數。數據顯示，XENP32927 在 0.1 – 1 mg/kg 的濃度範圍內具有活性。 圖 173A~173D 示出：經 huPBMC 和 pp65-MCF7 移植的 NSG-DKO 小鼠接受單劑 PD-1 阻斷劑、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] XENP32435 (以濃度為 0.03、0.1 或 0.3 mg/kg 的單藥使用或與 0.1 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用) 以及 RSV 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 對照聯合 PD-1 阻斷劑投藥後第 7 天的 A) CD4+ T 細胞的活化和 B) CD8+ T 細胞的活化 (如 CD25 表現所示)；以及第 14 天的 C) CD4+ T 細胞計數和 D) CD8+ T 細胞計數。數據顯示，XENP32435 在 0.03 – 0.3 mg/kg 的寬濃度範圍內具有活性。 圖 174 示出經 huPBMC 和 pp65-MCF7 移植的 NSG-DKO 小鼠接受單劑 PD-1 阻斷劑、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D] XENP32927 (以濃度為 0.1、0.3 或 1 mg/kg 的單藥使用或與 0.3 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用) 以及 RSV 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D] 對照聯合 PD-1 阻斷劑投藥後的血清 IFNγ 濃度隨時間的變化。 圖 175 示出經 huPBMC 和 pp65-MCF7 移植的 NSG-DKO 小鼠接受單劑 PD-1 阻斷劑、PD-1 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] XENP32435 (以濃度為 0.03、0.1 或 0.3 mg/kg 的單藥使用或與 0.1 mg/kg 的 PD-1 阻斷劑聯合使用) 以及 RSV 標靶 IL-15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q] 對照聯合 PD-1 阻斷劑投藥後的血清 IFNγ 濃度隨時間的變化。 圖 176A~176E 示出接受靜脈內投予 1X 劑量的 XENP32435 (PD1xIL15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q]) 的食蟹獼猴體內 A) CD8+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶 T 細胞、C) CD8+ 初始T 細胞、D) γδ T 細胞和 E) NK 細胞的擴增。 圖 177A~177E 示出相比於圖 175A~175E，接受靜脈內投予 12X 劑量的 XENP32435 (PD1xIL15[D30N/E64Q/N65D/N71Q/N79Q/N112Q]) 的食蟹獼猴體內 A) CD8+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶 T 細胞、C) CD8+ 初始T 細胞、D) γδ T 細胞和 E) NK 細胞的擴增。 圖 178A~178E 示出接受靜脈內投予 1X 劑量的 XENP32927 (PD1xIL15[D30N/E64Q/N65D]) 的食蟹獼猴體內 A) CD8+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶 T 細胞、C) CD8+ 初始T 細胞、D) γδ T 細胞和 E) NK 細胞的擴增。 圖 179A~179E 示出與圖 177A~177E 相比，接受靜脈內投予 20X 劑量的 XENP32927 (PD1xIL15[D30N/E64Q/N65D]) 的食蟹獼猴體內 A) CD8+ T 細胞、B) CD8+ 幹細胞記憶 T 細胞、C) CD8+ 初始 T 細胞、D) γδ T 細胞和 E) NK 細胞的擴增。 圖 180 示出接受靜脈內投予 1X 和 12X 劑量的去醣基化 XENP32435 治療的食蟹獼猴體內供試品的血清濃度隨時間的變化。 圖 181 示出接受靜脈內投予 1X 和 20X 劑量的醣基化 XENP32927 治療的食蟹獼猴體內供試品的血清濃度隨時間的變化。 圖 182A~182B 示出：用指定的供試品孵育後，小鼠脾細胞中的 A) CD8+ T 細胞計數和 B) CD8+ T 細胞中的 Ki-67 表現百分比。數據顯示，小鼠替代 PD-1 標靶 IL-15 分子對 PD1+ 小鼠 T 細胞具有高選擇性。 圖 183A 和 183B 示出：用指定供試品 (包含另一種小鼠替代 PD-1 標靶 IL-15 分子 XENP36217，其與 XENP33869 結合不同的 muPD-1 表位)(亦即非競爭性) 孵育後，小鼠脾細胞中的 A) CD8+ T 細胞計數和 B) CD8+ T 細胞中的 Ki-67 表現百分比。數據顯示，XENP36217 對 PD1+ 小鼠 T 細胞也具有高選擇性。 圖 184A~184K 示出投予 PD-L1 阻斷 muPD1xIL15 替代物 XENP33869 的抗腫瘤和藥物效力學反應。A) 分組後第 3 天和第 6 天記錄的切除的腫瘤重量；B) 透過流式細胞術所測得之腫瘤中的 CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞計數；C) 腫瘤中的 CD8:Treg 比率；D) 透過流式細胞術所測得之腫瘤中的 CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞頻率；E) 透過流式細胞術所測得之脾臟中的 CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞頻率；F) 透過流式細胞術所測得之脾臟中 CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞計數；G) 脾臟中的 CD8:Treg 比率；H) 透過流式細胞術所測得之腫瘤中的 GranzymeB+ CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞頻率；I) 透過流式細胞術所測得之腫瘤中 GranzymeB+ CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞的 MFI；J) 透過流式細胞術所測得之脾臟中的 GranzymeB+ CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞頻率；K) 透過流式細胞術所測得之脾臟中 GranzymeB+ CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞的 MFI。 圖 185A~185H 示出與 PD-L1 非阻斷 muPD1xIL15 替代物 XENP36213、XENP36216 和 XENP36217 相比，投予 PD-L1 阻斷 muPD1xIL15 替代物 XEN33869 後的抗腫瘤和藥物效力學反應。A) 分組後第 6 天記錄的切除的腫瘤重量；B) 透過流式細胞術所測得之腫瘤中的 CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞計數；C) 透過流式細胞術所測得之腫瘤中的 CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞頻率；D) 腫瘤中的 CD8:Treg 比率；E) 透過流式細胞術所測得之脾臟中的 CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞計數；F) 脾臟中的 CD8:Treg 比率；G) 透過流式細胞術所測得之脾臟中的 CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞頻率；H) 透過流式細胞術所測得之腫瘤和脾臟中的 GranzymeB+ CD8、CD4、Treg、NK 和 NKT 細胞頻率。 圖 186A 和 186B 示出雌性 C57Bl/6 小鼠 MC38 接受靜脈內投予後，相比於對照和鼠反應性 aPD-L1，PD-L1 阻斷 muPD1xIL15 XENP33869 治療對同基因腫瘤模型生長的影響。A) 原始數據和擬合結果。B) 每組擬合生長曲線的疊加。 圖 187A 和 187B 示出雌性 C57Bl/6 小鼠接受各種劑量水平的靜脈內投予後，相比於對照和鼠反應性 aPD-L1，PD-L1 阻斷 muPD1xIL15 XENP33869 治療對 MC38 同基因腫瘤模型生長的影響。還評估了 XENP33869 與抗 PDL1 的組合活性。A) 原始數據和擬合結果。B) 每組擬合生長曲線的疊加。 圖 188A 和 188B 示出相比於對照和鼠反應性 aPD-L1，雌性 C57Bl/6 小鼠接受靜脈內投予 PD-L1 阻斷 muPD1xIL15 替代物 XENP33869 治療相比於接受 PD-L1 非阻斷 muPD1xIL15 XENP36217 治療對 MC38 同基因腫瘤模型生長的影響。還評估了 XENP33869 和 XENP36217 與抗 PDL1 的組合活性。A) 原始數據和擬合結果。B) 每組擬合生長曲線的疊加。 圖 189A~189H 示出荷載 MC38 同基因腫瘤模型的雌性 C57Bl/6 小鼠接受靜脈內投予 muPD1xIL15 替代物 XENP33869 治療相比於接受載體或鼠反應性 aPD-L1 治療後 18F 標記的抗鼠 CD8 示蹤物的正電子發射斷層掃描成像和定量結果。A) 每個治療組的代表性圖像，其中腫瘤位置用箭頭指示。B) 接受治療後第 12 所測得之 CD8 示蹤物吸收腫瘤相比於非結合對照示蹤物。C) 血液、D) 腫瘤、E) 脾臟、F) 腋窩淋巴結、G) 腹股溝淋巴結和 H) 肝臟中 CD8 示蹤物吸收的時程。
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Claims (175)

  1. 一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15/Rα sushi 結構域； ii) 第一結構域連接子； iii) IL-15 結構域；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域； b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域 (ABD)，其中，相比於 SEQ ID NO:5，根據 Kabat 編號，所述 VH 為包含 F32L/W100F 胺基酸取代之變異體重鏈變異域；並且其中，相比於 SEQ ID NO:168，根據 Kabat 編號，所述 VL 為包含 N27dH/K30Y/S93T 之變異體輕鏈變異域。
  2. 如請求項 1 所述之融合蛋白，其中，所述 VH 包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述 VL 包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第 1 項或第 2 項所述之融合蛋白，其中，所述 IL-15 結構域為變異體 IL-15 結構域，其包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：D30N/E64Q/N65D、N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述 IL-15 結構域為變異體 IL-15 結構域，其包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A 或其組合。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述 IL-15 結構域為變異體 IL-15 結構域，其包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一單體進一步包含介於該 IL-15 結構域與該第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。
  8. 一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域 (ABD)。
  9. 如請求項 8 所述之融合蛋白，其中，所述 VH 包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，並且所述 VL 包含 SEQ ID NO:168 之胺基酸序列。
  10. 如請求項 8 所述之融合蛋白，其中，所述 VH 包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述 VL 包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。
  11. 如請求項 8 所述之融合蛋白，其中，所述 ABD 不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1。
  12. 如請求項 8 至 11 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。
  13. 如請求項 8 至 12 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一單體進一步包含介於該 IL-15 結構域與該第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。
  14. 一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域 (ABD)，其中，相比於 SEQ ID NO:5，根據 Kabat 編號，所述 VH 為包含 F32L/W100F 胺基酸取代之變異體重鏈變異域：並且其中，相比於 SEQ ID NO:168，根據 Kabat 編號，所述 VL 為包含 N27dH/K30Y/S93T 之變異體輕鏈變異域。
  15. 如請求項 14 所述之融合蛋白，其中，所述 VH 包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述 VL 包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。
  16. 如請求項 14 或 15 所述之融合蛋白，其中，該第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。
  17. 如請求項 14 至 16 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一單體進一步包含介於該 IL-15 結構域與該第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。
  18. 如請求項 1 至 17 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C。
  19. 如請求項 18 所述之融合蛋白，其中根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。
  20. 如請求項 1 至 19 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自獨立地包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 和 E233P/L234V/L235A/G236del。
  21. 如請求項 20 所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，該第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
  22. 如請求項 1 至 21 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一 Fc 結構域包含胺基酸取代 Q295E/N384D/Q418E/N481D。
  23. 如請求項 1 至 22 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，該第一變異體 Fc 結構域和該第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S。
  24. 如請求項 1、8 及 14 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 225，該第二單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 244，且該第三單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 196。
  25. 一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如請求項 1-24 中任一項所述之第一單體； b) 第二核酸分子，其編碼如請求項 1-24 中任一項所述之第二單體；及/或 c) 第三核酸分子，其編碼如請求項 1-24 中任一項所述之第三單體。
  26. 一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如請求項 25 所述之第一核酸分子； b) 第二表現載體，其包含如請求項 25 所述之第二核酸分子；及/或 c) 第三表現載體，其包含如請求項 25 所述之第三核酸分子。
  27. 一種表現載體，其包含如請求項 25 所述之第一核酸分子、如請求項 25 所述之第二核酸分子以及如請求項 25 所述之第三核酸分子。
  28. 一種宿主細胞，其包含如請求項 26 所述之表現載體組成物以及如請求項 27 所述之表現載體。
  29. 一種製備融合蛋白之方法，該方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如請求項 28 所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。
  30. 一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域；其中，根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:5，所述 VH 為包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代的變異體重鏈變異域：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；其中，所述 VL 結構域選自由以下各項所組成之群組： i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W； 其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。
  31. 如請求項 30 所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白進一步包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：D30N/E64Q/N65D、N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。
  32. 如請求項 30 或 31 所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述變異體輕鏈結構域包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。
  33. 如請求項 30 至 32 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q。
  34. 如請求項 30 至 33 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。
  35. 如請求項 30 至 34 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。
  36. 如請求項 30 至 35 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域為 H1.176，所述變異體輕鏈結構域為 L1.140，並且所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。
  37. 如請求項 30 至 36 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域為 H1.176，所述變異體輕鏈結構域為 L1.140，並且所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。
  38. 如請求項 30 至 37 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一結構域連接子包含 GGGGA (SEQ ID NO: 8)。
  39. 如請求項 30 至 38 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。
  40. 如請求項 30 至 39 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一單體進一步包含介於該 IL-15 結構域與該第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。
  41. 如請求項 30 至 40 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C。
  42. 如請求項 41 所述之融合蛋白，其中根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。
  43. 如請求項 30 至 42 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自獨立地包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 和 E233P/L234V/L235A/G236del。
  44. 如請求項 43 所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，該第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
  45. 如請求項 30 至 44 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一 Fc 結構域包含胺基酸取代 Q295E/N384D/Q418E/N481D。
  46. 如請求項 30 至 45 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，該第一變異體 Fc 結構域和該第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S。
  47. 如請求項 30 至 46 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 225。
  48. 如請求項 30 至 47 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第二單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 244。
  49. 如請求項 30 至 48 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第三單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 196。
  50. 如請求項 30 至 49 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 225；該第二單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 244；且該第三單體包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 196。
  51. 一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如請求項 30-50 中任一項所述之第一單體； b) 第二核酸分子，其編碼如請求項 30-50 中任一項所述之第二單體；及/或 c) 第三核酸分子，其編碼如請求項 30-50 中任一項所述之第三單體。
  52. 一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如請求項 51 所述之第一核酸分子； b) 第二表現載體，其包含如請求項 51 所述之第二核酸分子；及/或 c) 第三表現載體，其包含如請求項 51 所述之第三核酸分子。
  53. 一種表現載體，其包含如請求項 51 所述之第一核酸分子、如請求項 51 所述之第二核酸分子以及如請求項 51 所述之第三核酸分子。
  54. 一種宿主細胞，其包含如請求項 52 所述之表現載體組成物以及如請求項 53 所述之表現載體。
  55. 一種製備融合蛋白之方法，該方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如請求項 54 所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。
  56. 一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域；其中，根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:5，所述 VH 為包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代的變異體重鏈變異域：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；其中，所述 VL 結構域選自由以下各項所組成之群組： i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W。
  57. 如請求項 56 所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：H1.176、H1.177、H1.178、H1.179、H1.180、H1.181、H1.182、H1.183、H1.184、H1.185、H1.186、H1.187、H1.188、H1.189、H1.190、H1.191、H1.192、H1.193、H1.194、H1.195、H1.196、H1.197、H1.198、H1.199、H1.200、H1.201、H1.202、H1.203、H1.204、H1.205、H1.206、H1.207、H1.208、H1.209、H1.210、H1.211、H1.212、H1.213、H1.214、H1.215、H1.216、H1.217、H1.218、H1.219、H1.220、H1.221、H1.222、H1.223 和 H1.224。
  58. 如請求項 56 或 57 所述之融合蛋白，其中，所述變異體輕鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：L1.1、L1.3、L1.45、L1.117、L1.129、L1.135、L1.136 和 L1.140。
  59. 如請求項 56 至 58 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體重鏈結構域包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述變異體輕鏈結構域包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。
  60. 如請求項 56 至 59 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。
  61. 如請求項 56 至 60 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一單體進一步包含介於該 IL-15 結構域與該第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。
  62. 如請求項 56 至 61 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C。
  63. 如請求項 62 所述之融合蛋白，其中根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。
  64. 如請求項 56 至 63 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自獨立地包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 和 E233P/L234V/L235A/G236del。
  65. 如請求項 64 所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，該第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
  66. 如請求項 56 至 65 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一 Fc 結構域包含胺基酸取代 Q295E/N384D/Q418E/N481D。
  67. 如請求項 56 至 66 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，該第一變異體 Fc 結構域和該第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S。
  68. 一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如請求項 56-67 中任一項所述之第一單體； b) 第二核酸分子，其編碼如請求項 56-67 中任一項所述之第二單體；及/或 c) 第三核酸分子，其編碼如請求項 56-67 中任一項所述之第三單體。
  69. 一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如請求項 68 所述之第一核酸分子； b) 第二表現載體，其包含如請求項 68 所述之第二核酸分子；及/或 c) 第三表現載體，其包含如請求項 68 所述之第三核酸分子。
  70. 一種表現載體，其包含如請求項 68 所述之第一核酸分子、如請求項 68 所述之第二核酸分子以及如請求項 68 所述之第三核酸分子。
  71. 一種宿主細胞，其包含如請求項 69 所述之表現載體組成物以及如請求項 70 所述之表現載體。
  72. 一種製備融合蛋白之方法，該方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如請求項 71 所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。
  73. 一種標靶 IL-15/Rα 異二聚體 Fc 融合蛋白，其包含： a) 第一單體，其從 N 端到 C 端包含： i) IL-15 Rα sushi 結構域蛋白； ii) 第一結構域連接子； iii) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A；及 iv) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二單體，其包含重鏈，該重鏈包含 VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，其中，所述 CH2-CH3 為第二變異體 Fc 結構域； c) 第三單體，其包含輕鏈，該輕鏈包含 VL-CL； 其中，所述 VH 和 VL 結構域形成與人 PD-1 結合之抗原結合結構域，並且不與納武利尤單抗及/或帕博利珠單抗競爭性地結合所述人 PD-1。
  74. 如請求項 73 所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。
  75. 如請求項 73 或 74 所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/E64Q/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。
  76. 如請求項 73 至 75 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q。
  77. 如請求項 73 至 76 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。
  78. 如請求項 73 至 77 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。
  79. 如請求項 73 至 78 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一結構域連接子為 GGGGA (SEQ ID NO: 8)。
  80. 如請求項 73 至 79 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一變異體 Fc 結構域包含鉸鏈結構域的全部或一部分。
  81. 如請求項 73 至 80 中任一項所述之融合蛋白，其中，該第一單體進一步包含介於該 IL-15 結構域與該第一變異體 Fc 結構域之間的第二結構域連接子。
  82. 如請求項 73 至 81 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C。
  83. 如請求項 82 所述之融合蛋白，其中根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。
  84. 如請求項 73 至 83 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自獨立地包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 和 E233P/L234V/L235A/G236del。
  85. 如請求項 84 所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，該第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
  86. 如請求項 73 至 85 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一 Fc 結構域包含胺基酸取代 Q295E/N384D/Q418E/N481D。
  87. 如請求項 73 至 86 中任一項所述之融合蛋白，其中，根據 EU 編號，該第一變異體 Fc 結構域和該第二變異體 Fc 結構域各自包含胺基酸取代 M428L/N434S。
  88. 一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如請求項 73 至 87 中任一項所述之第一單體； b) 第二核酸分子，其編碼如請求項 73 至 87 中任一項所述之第二單體；及/或 c) 第三核酸分子，其編碼如請求項 73 至 87 中任一項所述之第三單體。
  89. 一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如請求項 88 所述之第一核酸分子； b) 第二表現載體，其包含如請求項 88 所述之第二核酸分子；及/或 c) 第三表現載體，其包含如請求項 88 所述之第三核酸分子。
  90. 一種表現載體，其包含如請求項 88 所述之第一核酸分子、如請求項 88 所述之第二核酸分子以及如請求項 88 所述之第三核酸分子。
  91. 一種宿主細胞，其包含如請求項 89 所述之表現載體組成物以及如請求項 90 所述之表現載體。
  92. 一種製備融合蛋白之方法，該方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如請求項 91 所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。
  93. 一種組成物，其包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD)，該抗 PD-1 抗原結合結構域包含： a) 變異體重鏈變異域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:5，包含 W100F 胺基酸取代以及選自由以下各項所組成之群組的至少一個額外的胺基酸取代：F32L、S52aG、R97E、R97Y、R97W、L98R、S100aT、R97A、V99T、V99L、S100aA、L98Q、R97Q、V99F、V99L、S100aN、V99I、P100bS、G96H、L98V、V99A、V99Q、G96V、R97K、L98S、L98F、R97T、L98K、L98S、V99I、R97L、G96A、R97A、V99S、R97S、V99Y、R97H、L98R；以及 b) 輕鏈變異域，其選自由以下各項所組成之群組： i) SEQ ID NO:168；及 ii) 變異體輕鏈結構域，其根據 Kabat 編號，相比於 SEQ ID NO:168，包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N27dH、N27dS、K30Y、S93T 和 Y94W； 其中，所述 ABD 與人 PD-1 結合。
  94. 如請求項 93 所述之組成物，其中，所述變異體重鏈結構域具有根據 Kabat 編號之胺基酸取代 F32L/W100F；並且所述變異體輕鏈結構域具有根據 Kabat 編號之胺基酸取代 N27dH/K30Y/S93T。
  95. 如請求項 93 或 94 所述之組成物，其中，所述變異體重鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：H1.176、H1.177、H1.178、H1.179、H1.180、H1.181、H1.182、H1.183、H1.184、H1.185、H1.186、H1.187、H1.188、H1.189、H1.190、H1.191、H1.192、H1.193、H1.194、H1.195、H1.196、H1.197、H1.198、H1.199、H1.200、H1.201、H1.202、H1.203、H1.204、H1.205、H1.206、H1.207、H1.208、H1.209、H1.210、H1.211、H1.212、H1.213、H1.214、H1.215、H1.216、H1.217、H1.218、H1.219、H1.220、H1.221、H1.222、H1.223 和 H1.224。
  96. 如請求項 93 至 95 中任一項所述之組成物，其中，所述變異體輕鏈結構域選自由以下各項所組成之群組：L1.1、L1.3、L1.45、L1.117、L1.129、L1.135、L1.136 和 L1.140。
  97. 如請求項 93 至 96 中任一項所述之組成物，其中，所述變異體重鏈結構域包含 SEQ ID NO:318 之胺基酸序列，並且所述變異體輕鏈結構域包含 SEQ ID NO:176 之胺基酸序列。
  98. 如請求項 93 至 97 中任一項所述之組成物，其中，所述組成物包含全長抗 PD-1 抗體。
  99. 如請求項 93 至 98 中任一項所述之組成物，其中，所述組成物包含融合蛋白。
  100. 如請求項 99 所述之組成物，其中，所述融合蛋白為 XENP32435。
  101. 一種核酸組成物，其包含： a) 第一核酸分子，其編碼如請求項 93 至 100 中任一項所述之輕鏈變異域；及/或 b) 第二核酸分子，其編碼如請求項 93 至 100 中任一項所述之重鏈變異域。
  102. 一種表現載體組成物，其包含： a) 第一表現載體，其包含如請求項 101 所述之第一核酸分子；及/或 b) 第二表現載體，其包含如請求項 101 所述之第二核酸分子。
  103. 一種表現載體，其包含如請求項 101 所述之第一核酸分子以及如請求項 101 所述之第二核酸分子。
  104. 一種宿主細胞，其包含如請求項 102 所述之表現載體組成物以及如請求項 103 所述之表現載體。
  105. 一種製備包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 的組成物之方法；所述方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如請求項 104 所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。
  106. 一種組成物，其包含相比於 SEQ ID NO:2 之變異體 IL-15 蛋白；所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q、N79Q、N112Q、S114del 和 S114A。
  107. 如請求項 106 所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白進一步包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D 和 Q108E。
  108. 如請求項 106 或 107 所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N71Q/N79Q、N71Q/N79Q/N112Q、N71Q/N79Q/S114del 和 N71Q/N79Q/S114A。
  109. 如請求項 106 至 108 中任一項所述之組成物，其中，所述變異體 IL‑15 蛋白包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：N1D/N4D/D8N、N1D/N4D/N65D、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N1D/E64Q、N1D/N65D、N1D/Q108E、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/D61N/N65D、N4D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、D30N/E64Q/N65D、D30N/Q180E、D61N/E64Q/N65D、E64Q/N65D、E64Q/Q108E 和 N65D/Q108E。
  110. 如請求項 106 至 109 中任一項所述之組成物，其中，所述變異體 IL‑15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q。
  111. 如請求項 106 至 110 中任一項所述之組成物，其中，所述變異體 IL‑15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/N65D。
  112. 如請求項 106 至 111 中任一項所述之組成物，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含胺基酸取代 N71Q/N79Q/N112Q 和 D30N/E64Q/N65D。
  113. 一種核酸組成物，其包含編碼如請求項 106 至 112 中任一項所述之變異體 IL-15 蛋白的核酸分子。
  114. 一種表現載體，其包含如請求項 113 所述之核酸分子。
  115. 一種宿主細胞，其包含如請求項 114 所述之表現載體。
  116. 一種製備包含變異體 IL-15 蛋白的組成物之方法；所述方法包含在產生所述融合蛋白的條件下培養如請求項 115 所述之宿主細胞並回收所述融合蛋白。
  117. 一種異二聚體蛋白，其包含： a) 第一融合蛋白，其包含： i) 變異體 IL-15 蛋白，其相比於 SEQ ID NO:2 包含胺基酸取代 D30N/E64Q/N65D 和 N71Q/N79Q/N112Q； ii) 結構域連接子；及 iii) 第一變異體 Fc 結構域；以及 b) 第二融合蛋白，其包含： i) IL-15Rα sushi 結構域； ii) 結構域連接子；及 iii) 第二變異體 Fc 結構域。
  118. 如請求項 117 所述之異二聚體蛋白，其中，所述變異體 IL-15 蛋白包含 SEQ ID NO:319 之胺基酸序列。
  119. 如請求項 117 或 118 所述之異二聚體蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含選自由以下各項所組成之群組的胺基酸取代：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411E/K360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W 及 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C。
  120. 如請求項 119 所述之異二聚體蛋白，其中，根據 EU 編號，所述第一變異體 Fc 結構域包含 L368D/K370S，並且所述第二變異體 Fc 結構域包含 S364K/E357Q。
  121. 如請求項 117 至 120 中任一項所述之融合蛋白，其中，所述第一變異體 Fc 結構域和第二變異體 Fc 結構域包含 428L/434S。
  122. 如請求項 117 所述之融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白包含 SEQ ID NO:208 之胺基酸序列，並且所述第二融合蛋白包含 SEQ ID NO:95 之胺基酸序列。
  123. 如請求項 117 所述之融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白包含 SEQ ID NO:211 之胺基酸序列，並且所述第二融合蛋白包含 SEQ ID NO:206 之胺基酸序列。
  124. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 24、30 至 50、56 至 67 和 73 至 87 中任一項所述之融合蛋白以及藥學上可接受之載體。
  125. 一種醫藥組成物，其包含由如請求項 93 至 100 中任一項所述之抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 所組成之組成物以及藥學上可接受之載體。
  126. 一種醫藥組成物，其包含由如請求項 106 至 112 中任一項所述之變異體 IL-15 蛋白所組成之組成物以及藥學上可接受之載體。
  127. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 117 至 123 中任一項所述之異二聚體蛋白以及藥學上可接受之載體。
  128. 一種治療受試者的癌症之方法，該方法包含向有需要彼之受試者投予治療有效量之如請求項 1 至 24、30 至 50、56 至 67 和 73 至 87 中任一項所述之融合蛋白或如請求項 124 所述之醫藥組成物。
  129. 如請求項 128 所述之方法，其中，該方法進一步包含投予治療有效量之查核點阻斷抗體。
  130. 如請求項 129 所述之方法，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  131. 如請求項 130 所述之方法，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  132. 一種治療受試者的癌症之方法，該方法包含向有需要彼之受試者投予治療有效量之如請求項 93 至 100 中任一項所述之包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 之組成物或如請求項 125 所述之醫藥組成物。
  133. 如請求項 132 所述之方法，其中，該方法進一步包含投予治療有效量之查核點阻斷抗體。
  134. 如請求項 133 所述之方法，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  135. 如請求項 134 所述之方法，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  136. 一種治療受試者的癌症之方法，該方法包含向有需要彼之受試者投予治療有效量之如請求項 106 至 112 中任一項所述之包含變異體 IL-15 蛋白之組成物或如請求項 126 所述之醫藥組成物。
  137. 如請求項 136 所述之方法，其中，該方法進一步包含投予治療有效量之查核點阻斷抗體。
  138. 如請求項 137 所述之方法，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  139. 如請求項 138 所述之方法，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  140. 一種治療受試者的癌症之方法，該方法包括向有需要彼之受試者投予治療有效量之如請求項 117 至 123 中任一項所述之異二聚體蛋白或如請求項 127 所述之醫藥組成物。
  141. 如請求項 140 所述之方法，其中，該方法進一步包含投予治療有效量之查核點阻斷抗體。
  142. 如請求項 141 所述之方法，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  143. 如請求項 142 所述之方法，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  144. 一種如請求項 1 至 24、30 至 50、56 至 67 和 73 至 87 中任一項所述之融合蛋白或如請求項 124 所述之醫藥組成物用於生產供治療有治療需要的受試者之癌症的藥物之用途。
  145. 如請求項 144 所述之用途，其中，該藥物配製成與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。
  146. 如請求項 145 所述之用途，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  147. 如請求項 146 所述之用途，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  148. 一種如請求項 93 至 100 中任一項所述之包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 的組成物或如請求項 124 所述之醫藥組成物用於生產供治療有治療需要的受試者之癌症的藥物之用途。
  149. 如請求項 148 所述之用途，其中，該藥物配製成與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。
  150. 如請求項 149 所述之用途，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  151. 如請求項 150 所述之用途，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  152. 一種如請求項 106 至 112 中任一項所述之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或如請求項 126 所述之醫藥組成物用於生產供治療有治療需要的受試者之癌症的藥物之用途。
  153. 如請求項 152 所述之用途，其中，該藥物配製成與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。
  154. 如請求項 153 所述之用途，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  155. 如請求項 154 所述之用途，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  156. 一種如請求項 117 至 123 中任一項所述之異二聚體蛋白或如請求項 127 所述之醫藥組成物用於生產供治療有治療需要的受試者之癌症的藥物之用途。
  157. 如請求項 156 所述之用途，其中，該藥物配製成與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。
  158. 如請求項 157 所述之用途，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  159. 如請求項 158 所述之用途，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  160. 一種用於治療有治療需要的受試者之癌症的如請求項 1 至 24、30 至 50、56 至 67 和 73 至 87 中任一項所述之融合蛋白或如請求項 124 所述之醫藥組成物。
  161. 如請求項 160 所使用之融合蛋白或醫藥組成物，其中，該融合蛋白或醫藥組成物與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。
  162. 如請求項 161 所使用之融合蛋白或醫藥組成物，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  163. 如請求項 162 所使用之融合蛋白或醫藥組成物，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  164. 一種用於治療有治療需要的受試者之癌症的如請求項 93 至 100 中任一項所述之包含抗 PD-1 抗原結合結構域 (ABD) 的組成物或如請求項 125 所述之醫藥組成物。
  165. 如請求項 164 所使用之包含抗 PD-1 ABD 的組成物或醫藥組成物，其中，該包含抗 PD-1 ABD 的組成物或醫藥組成物與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。
  166. 如請求項 165 所使用之包含抗 PD-1 ABD 的組成物或醫藥組成物，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  167. 如請求項 166 所使用之包含抗 PD-1 ABD 的組成物或醫藥組成物，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  168. 一種用於治療有治療需要的受試者之癌症的如請求項 106 至 112 中任一項所述之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或如請求項 126 所述之醫藥組成物。
  169. 如請求項 168 所使用之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或醫藥組成物，其中，該包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或醫藥組成物與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。
  170. 如請求項 169 所使用之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或醫藥組成物，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  171. 如請求項 170 所使用之包含變異體 IL-15 蛋白的組成物或醫藥組成物，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
  172. 一種用於治療有治療需要的受試者之癌症的如請求項 117 至 123 中任一項所述之異二聚體蛋白或如請求項 126 所述之醫藥組成物。
  173. 如請求項 172 所使用之異二聚體蛋白或醫藥組成物，其中，該異二聚體蛋白或醫藥組成物與治療有效量之查核點阻斷抗體合並投予。
  174. 如請求項 173 所使用之異二聚體蛋白或醫藥組成物，其中，該查核點阻斷抗體為抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體。
  175. 如請求項 174 所使用之異二聚體蛋白或醫藥組成物，其中，該查核點阻斷抗體為納武利尤單抗或帕博利珠單抗。
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