TW202128772A - 一種bcma結合蛋白及其製備方法和應用 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種BCMA結合蛋白及其製備方法和應用。所述BCMA結合蛋白包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3。所述LCDR1、LCDR2和LCDR3以及所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列詳見本發明。本發明的BCMA結合蛋白具有良好特異性親合力，其在腫瘤細胞株上比對照抗體結合更好，且其內化效應優於對照，因此可以作為ADC候選物進一步開發。經ELISA試驗，抗體都有部分阻斷功能，在作為mAbs或CAR-T治療時可能獲得額外的療效。

Description

一種BCMA結合蛋白及其製備方法和應用
本申請主張申請日為2020/1/23的中國專利申請202010076287.1的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明屬於生物大分子領域，具體涉及一種BCMA結合蛋白及其製備方法和應用。
多發性骨髓瘤(MM)一直以骨髓來源的漿細胞增殖失控為特徵，伴有異常分泌的免疫球蛋白或游離輕鏈，在最常見的血液系統惡性腫瘤中居第二位，約占所有血液腫瘤的10%。在美國，每年新診斷的患者超過30000人，死亡人數超過12000人。儘管有了蛋白酶抑制劑(Bortezomb)等新的標靶療法，但人們普遍認為它是無法治癒的，因此需要在藥物開發方面做出更多的努力。
B細胞成熟抗原(BCMA)，又稱TNFRSF17或CD269，是一種僅在B細胞譜系，尤其是末端分化的B細胞中表現的特異性抗原。它通常不存在於初始和記憶B細胞，並在多發性骨髓瘤細胞上高度表現。BCMA與其配體BAFF和APRIL相互作用時，可透過NF-kB和JNK途徑的訊息傳導，誘導B細胞成熟、增殖和存活。作為一種I型跨膜蛋白，在體液免疫中起著重要的作用，是抗體衍生免疫治療的理想標的。
然而現有技術中的抗BCMA的抗體存在內化作用弱以及與293T-huBCMA細胞結合弱等缺陷，因此極需一種抗BCMA的抗體其既具有足以成藥的親和力又具有優異的內化作用。
發明概要
本發明所要解決的技術問題是為克服現有技術中存在的已有抗BCMA的抗體內化作用弱以及與293T-huBCMA細胞結合弱等缺陷，提供一種BCMA結合蛋白及其製備方法和應用。
為解決以上技術問題，本發明提供一種BCMA結合蛋白，其包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述的LCDR1的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示或為其變體，所述的LCDR2的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示或為其變體，所述的LCDR3的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 3所示或為其變體；所述的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的HCDR1的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示或為其變體，所述的HCDR2的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示或為其變體，所述的HCDR3的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 6所示或為其變體。其中，所述變體為分別在SEQ ID NO:1~6所示的胺基酸序列的基礎上發生3、2或者1個突變後獲得的胺基酸序列。
在類似“具有3、2或1個胺基酸突變”中“胺基酸突變”是指相較於原胺基酸序列而言，變體的序列存在胺基酸的突變，包括在原胺基酸序列的基礎上發生胺基酸的插入、缺失或替換。示例性的解釋是對CDR的突變可以包含3個、2個或1個胺基酸的突變，這些CDR之間可以任選地選擇相同或不同數目的胺基酸殘基進行突變，例如可以是對CDR1進行1個胺基酸的突變，對CDR2和CDR3不進行胺基酸突變。
本發明中所述的突變可以包括目前如本領域技術人員公知的突變，例如在抗體的生產或者應用過程中，可能會對抗體進行的一些突變，例如對可能存在的，特別是CDR區的轉錄後修飾(Potential post-translational modifications, PTMs)的位址進行突變，包括抗體的聚集、脫醯胺基敏感(asparagine deamidation)位址(NG、NS和/或NH等)、天門冬胺酸異構(DG、DP)敏感位址、N糖基化(N-{P}S/T)敏感位址及氧化敏感位址等相關突變。
較佳地，本發明中所述的BCMA結合蛋白還包括抗BCMA抗體的框架區，所述框架區包括重鏈框架區(HFWR)和/或輕鏈框架區(LFWR)；
所述的重鏈框架區優選人源重鏈框架區，所述的人源重鏈框架區HFWR1~4優選分別包含分別如序列表中SEQ ID NO: 13~16所示的胺基酸序列，或者分別為SEQ ID NO: 13~16所示的胺基酸序列的變體；
所述的輕鏈框架區優選人源輕鏈框架區，所述的人源輕鏈框架區LFWR1~4優選分別包含分別如序列表中SEQ ID NO: 17~20所示的胺基酸序列，或者分別為SEQ ID NO: 17~20所示的胺基酸序列的變體。
在本發明一較佳實施例中，所述的重鏈可變區包括如序列表中SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列或其變體，和/或，所述的輕鏈可變區包括如序列表中SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列或其變體。所述的變體為基於如SEQ ID NO: 11或者SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列發生一個或者多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加，且所述突變的胺基酸序列與所述VH和/或VL的胺基酸序列具有至少85%序列同一性，並保持或改善了所述BCMA結合蛋白與BCMA的結合；所述至少85%序列同一性優選為至少90%序列同一性，更優選為至少95%序列同一性，最優選為至少99%序列同一性。
在本發明一更佳的實施例中，所述的重鏈可變區的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示，且所述的輕鏈可變區的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示。
在本申請中，上述所列CDR的胺基酸序列均是按照Kabat定義規則所示出的(本發明的申請專利範圍中也是按照Kabat定義規則所示出的序列)。但是，本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Biol 273:927-48,1997)。在本申請中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍，詳見表1-1。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明的申請專利範圍中請求保護的範圍是基於Kabat定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。
本發明中所述的BCMA結合蛋白，較佳地還包括重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區；較佳地，所述重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其突變，所述輕鏈恆定區選自κ鏈或者λ鏈或其突變；其中所述κ鏈或者λ鏈優選人源抗體輕鏈κ鏈或者λ鏈。
在本發明一較佳實施例中，所述的重鏈恆定區為hIgG1，且所述輕鏈恆定區為人源抗體的輕鏈κ鏈。
本發明中所述的BCMA結合蛋白可為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、雙特異性抗體、多特異性抗體、單域抗體或單區抗體，或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。所述單株抗體可以由多種途徑和技術進行研製，包括雜交瘤技術、噬菌體展示技術、單淋巴細胞基因轉殖技術等，主流是透過雜交瘤技術從野生型或轉基因小鼠製備單株抗體。
在本發明一具體實施例中，所述的BCMA結合蛋白為全長抗體，所述全長抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈包括如SEQ ID NO: 9所示的胺基酸序列，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列。
本發明還提供一種分離的核酸，其編碼如上所述的BCMA結合蛋白。
本發明還提供一種包含如上所述的分離的核酸的表現載體。
本發明還提供一種宿主細胞，其包含如上所述的表現載體；優選地，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。所述宿主細胞的製備方法可為本領域常規的製備方法，例如為：將上述表現載體轉化至宿主細胞中製得。所述的宿主細胞為本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述表現載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核酸可被有效表現即可。優選地，所述宿主細胞為E.coli TG1或BL21細胞(表現單鏈抗體或Fab抗體)，或者CHO-K1細胞(表現全長IgG抗體)。其中所述轉化方法為本領域常規轉化方法，較佳地為化學轉化法，熱刺激法或電轉形法。
本發明還提供一種BCMA結合蛋白的製備方法，其包含培養如上所述的宿主細胞，從培養物中獲得所述BCMA結合蛋白。
本發明還提供一種免疫偶聯物，其包含細胞毒性劑，以及如上所述的BCMA結合蛋白。
本發明還提供一種藥物組成物，其包含如上所述的BCMA結合蛋白或如上所述的免疫偶聯物。
本發明還提供如上所述的BCMA結合蛋白、如上所述的免疫偶聯物和如上所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物中的應用；優選地，所述癌症為骨髓瘤、結腸癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、乳腺癌、子宮頸癌或卵巢癌。
此外，為解決上述技術問題，本發明還提供一種藥盒組合，其包括藥盒A和藥盒B；所述藥盒A包含本發明所述的BCMA結合蛋白、所述的宿主細胞、所述的免疫偶聯物和所述的藥物組成物；所述藥盒B包含其它標靶的或相同標靶的抗體、雙特異性抗體、基因修飾的細胞或藥物組成物。所述藥盒A和藥盒B的使用不分先後順序，或先使用藥盒A再使用藥盒B，或先使用藥盒B再使用藥盒A。
本發明所述的BCMA結合蛋白、所述的免疫偶聯物和所述的藥物組成物或所述的藥盒組合可施用於病人，用於治療相關腫瘤。
在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如本領域技術人員知曉，或J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)中所述。
如本文使用的，術語“包括”或“包含”旨在表示組成物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根據上下文的理解，也包括“由……組成”的情況。
本發明所述的術語“抗體”包括免疫球蛋白(Ig)，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈透過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈透過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源的κ、λ鏈或其變體。在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源的IgG1、2、3、4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個互補決定區(CDR)和4個框架區(FWR)組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。輕鏈的3個CDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重鏈的3個CDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
術語“突變”包括胺基酸或核苷酸的取代、添加和/或缺失，“胺基酸的取代”是其中胺基酸殘基以另一種胺基酸殘基置換和以具有相似側鏈的胺基酸殘基置換。
本文使用的術語“載體”或“表現載體”是包含分離的核酸並可用於將分離的核酸遞送至細胞內部的組成物。在本領域中已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關的多核苷酸、質體和病毒。因此，術語“載體”包括自主複製的質體或病毒。該術語還應被解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、脂質體等。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體等。
術語“轉染”是指將外源核酸引入真核細胞。轉染可以透過本領域已知的各種手段來實現，包括磷酸鈣-DNA共沉澱、DEAE-葡聚糖媒介的轉染、聚凝胺媒介的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質轉染、原生質體融合、反轉錄病毒感染和生物彈道技術(biolistics)。
所述的免疫偶聯物的製備方法可為本領域常規，較佳地採用Doronina, 2006, Bioconjugate Chem.17, 114-124所記載的製備方法。優選地，所述的製備方法產生具有最低限度的低偶聯級分(LCF)小於10%的抗體藥物偶聯物。所述的免疫偶聯物能夠以本領域所知的任何物理形態而存在，較佳地為澄清溶液。
如本發明所用，術語“癌”、“癌症”、“腫瘤”意在包括全部類型的癌性生長物或致瘤過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，無論組織病理學類型或侵襲力階段是什麼。例子包括但不限於實體瘤、血液學癌、軟組織腫瘤和轉移性病灶。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於： 本發明免疫篩選出1種與hBCMA具有良好特異性親合力的全人源抗體，其在腫瘤細胞株上比對照抗體結合更好。抗體具有內化效應且優於對照，因此可以作為ADC候選物進一步開發。經ELISA試驗，抗體都有部分阻斷功能，在作為mAbs或CAR-T治療時可能獲得額外的療效。
發明的詳細說明
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
以下實施例中所使用的陽性對照(亦稱對照抗體)為GSK臨床II期ADC藥物GSK2857916(即美國專利申請US9273141B2中的CA8 J6M0人源化抗體)。對照抗體的各功能區胺基酸序列如下表所示(依據Kabat編號規則)：
功能區 胺基酸序列
VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 21)
HCDR1 NYWMH (SEQ ID NO: 22)
HCDR2 ATYRGHSDTYYNQKFKG (SEQ ID NO: 23)
HCDR3 GAIYDGYDVLDN (SEQ ID NO: 24)
VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 25)
LCDR1 SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 26)
LCDR2 YTSNLHS (SEQ ID NO: 27)
LCDR3 QQYRKLPWT (SEQ ID NO: 28)
重鏈胺基酸序列： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 7)
輕鏈胺基酸序列： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 8)較佳實施例之詳細說明 實施例 實施例 1. 抗原製備、小鼠免疫及雜交瘤製備 1.  抗原製備 (ACRO cat.no: BCA-C52H7)
供應商 名稱 NCBI ID Cat#
Acrobio huBCMA-ECD-Fc Q02223 BCA-H522y
Acrobio BCMA-His   BCA-C52H7
Acrobio CynoBCMA-Fc G7NPN8 BCA-C5253
Acrobio CynoBCMA-His   BCA-C5225
Acrobio BAFF-his-avitag Q9Y275 BAF-H82Q2
2.  免疫
從用BCMA-ECD-Fc蛋白免疫的H2L2小鼠(和鉑醫藥，EP2379727B1)產生的雜交瘤中鑑定出全人源抗BCMA抗體。第一次注射50 μg上述融合蛋白，以CFA為免疫佐劑進行免疫，然後在第15、29、43、57、71和86天以25 μg蛋白和Ribi佐劑(Sigma-Aldrich; Sigma Adjuvant System; Catalog Number S6322)再加強7次。在第50、78和107天採血測試，小鼠血清的結合親和力透過FACS使用表現人BCMA的HEK293T細胞或腫瘤細胞株(HEK293T-BCMA，購買自kyinno或Capan-2細胞，購自ATCC)進行檢測，同時平行使用BCMA-His蛋白進行ELISA檢測。根據免疫小鼠血清效價的檢測結果，挑選小鼠進行雜交瘤融合，融合前3天，即第132天，以25 μg蛋白和Ribi佐劑進行最後一次加強。 3.  融合
雜交瘤用常規方法產生和選殖，即透過電融合法，萃取小鼠脾臟和淋巴結，研碎萃取單細胞，裂解紅血球並洗滌後與sp2/0細胞混合。細胞混懸液放入電融合槽電擊融合，靜置後換20% FBS的HT培養基，之後更換HAT培養基培養。
將收集的脾臟B細胞與小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/0按2:1 (細胞數量比)的比例混合，混合後的細胞用電融合儀(BTX ECM2001)進行細胞融合，將融合後的細胞鋪在96孔細胞培養盤，在二氧化碳培養箱中37℃培養10天後進行雜交瘤的初篩。過夜復原後，將融合細胞以有限稀釋法接種到96孔盤中，並用次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷進行篩選。透過ELISA試驗和流式細胞術檢測雜交瘤培養上清液中抗BCMA抗體的存在。實施例 2. 抗體篩選及定序 1.  ELISA篩選
在96孔盤(Corning 9018)中加入在PBS中1 μg/ml的新製備的hBCMA ECD-Fc蛋白或hFc，在4℃下塗覆過夜，然後棄去並用PBST清洗3次。在室溫下用5%的牛奶封阻培養盤2小時，並用PBST清洗3次。加入100 μl/孔的雜交瘤上清液並在室溫下培育1小時，然後用PBST清洗3次。加入100 μl/孔的第二抗體並在室溫下培育1小時，隨後清洗。培養盤中加入100 μl/孔的TMB並在室溫下培育15min，然後停止並讀取。 2.  FACS篩選
對於流式細胞術篩選，用TypLE (CAT#12605010, Gibco)在37℃消化粘附細胞3分鐘後，用含10% FBS的完全培養基終止消化。用FACS緩衝液(CAT#14190250, Gibco)清洗細胞並計數，然後稀釋至3~5×106 /ml密度。將細胞按100 μl/孔添加到96孔盤(Corning 3894)。阻斷3~4分鐘後，加入100 μl/孔雜交瘤上清液，在4℃培育1小時。洗滌後加入二抗，在4℃培育一個小時。然後洗滌細胞並進行FACS分析。 3.  次選殖及篩選
用有限稀釋法 用ELISA法進行阻斷試驗。
阻斷篩選： 對於阻斷酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)，用在PBS中2 μg/ml 的hBCMA-ECD-FC塗覆培養盤過夜，洗滌、封阻和培育與上述 步驟相同。然後在培養盤中加入6 ng/ml的生物素化的BAFF，在室溫下培育1小時。第二抗體的培育和檢測的後續步驟與以上相同。 4.  定序
挑選陽性單轉殖株，萃取總RNA。RT-PCR產生cDNA，隨後重鏈和輕鏈分別用PCR擴增(RT-PCR來自賽默飛的SuperScript®第一鏈合成系統，Cat#：11904018，具體操作見產品說明書。PCR使用的是NEB的高保真DNA聚合酶，Cat#：M0530L，具體操作見產品說明書)。然後將PCR產物構建到T載體上，並進行定序(北京擎科生物科技有限公司上海分公司)，同時進行抗體亞型測定。 5.  抗體序列資訊
定序結果如下所示(根據Kabat編號規則)： 輕鏈可變區中的LCDR1~3的胺基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO: 1~3所示；重鏈可變區中的HCDR1~3的胺基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO: 4~6所示。具體胺基酸序列見下表：
功能區 胺基酸序列 SEQ ID NO:
LCDR1 RASQSISSWLA 1
LCDR2 KASSLES 2
LCDR3 QQYNSYLFT 3
HCDR1 SYGMY 4
HCDR2 AIWNDGSNNYYADSVKG 5
HCDR3 DRLPMASLRYFDWLGVMDA 6
實施例 3. 抗體生產、純化和驗證 1.  重組抗體生產和純化
在得到編碼抗體分子的輕、重鏈可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將輕、重鏈可變結構域序列和相應的人的抗體輕、重鏈恆定結構域序列進行融合表現，得到重組抗體分子。在本實施例中，抗體重鏈可變結構域序列(VH)透過基因合成並克隆到編碼人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生IgG1抗體的全長重鏈。抗體輕鏈可變結構域序列(VL)透過基因合成並轉殖到編碼人抗體Igκ輕鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生抗體的全長輕鏈。在本實施例中，由於從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列，因而本實施例也得到全人源的抗BCMA重組IgG1抗體。
例如，本發明人源化抗體的重鏈序列為：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAATGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAAIWNDGSNNYYADSVKGRFTISRDDSKNTLNLQMNSLRAEDTAMYYCARDRLPMASLRYFDWLGVMDAWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9)
本發明人源化抗體輕鏈序列為： DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQTDDFATYYCQQYNSYLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 10)
本發明人源化抗體的重鏈可變區的胺基酸序列為： QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAATGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAAIWNDGSNNYYADSVKGRFTISRDDSKNTLNLQMNSLRAEDTAMYYCARDRLPMASLRYFDWLGVMDAWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 11)
本發明人源化抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列為： DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQTDDFATYYCQQYNSYLFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 12)
將編碼抗體重鏈的質體(Genscript US)和編碼抗體輕鏈的質體(Genscript US)同時轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到具有輕重鏈正確配對組裝的純化的重組抗體。具體來說，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo, Cat#：A1383504)中擴充培養。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6~8×105 細胞/ml，於37℃ 8% CO2 搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2×106 細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將上述編碼抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體以2:3 (品質比)的比例混合共計30 μg質體溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo, Cat#：31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM 溶入1 mg/ml PEI (Polysciences, Cat#：23966-2) 120 µl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2 搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300 g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS (pH7.4)平衡含有MabSelect ™ (GE Healthcare Life Science, Cat#：71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad, Cat#：7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱；用5-10倍柱體積的PBS沖洗柱子，再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗提目標蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore, Cat#：UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗體溶液。最後用NanoDrop (Thermo Scientific™ NanoDrop™ One)測定濃度，分裝、存儲備用。
取上述純化的樣品適量分別上樣至分析型SEC柱TSKgel G3000SWxl (HPLC儀器型號: 安捷倫1260 Infinity II)，檢測樣品的純度，保證均一樣品的純度在95%以上。該方法流動相為1X PBS，pH7.4 (生工，Cat#：E607016)，室溫，流速 1.0 ml/min，樣品濃度1 mg/ml，進樣體積 20 μl，檢測波長280 nm。採集後用ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關資料。 2.  重組抗體驗證
FACS鑑定：重組抗體依次稀釋至9種不同濃度，並在293T-huBCMA、293T-cynoBCMA和NCI-H929細胞株上進行1小時培育，然後第二抗體進行1小時培育後檢測，驗證結果如圖1所示。在圖1a中，PR000892結合293T-huBCMA細胞[購自康源博創生物科技(北京)有限公司；貨號為：CAT#KC-0233]有顯著結合，且親和力要優於對照抗體；圖1b中，PR000892結合293T-cynoBCMA[購自康源博創生物科技(北京)有限公司；貨號為：CAT#KC-0979]的親和力與對照抗體相當；在圖1c中，PR000892與腫瘤細胞株NCI-H929的親和力與對照抗體相當。
阻斷：重組抗體被連續稀釋至7種不同濃度，在預先塗覆2 μg/ml的huBCMA-ECD-FC的Corning 9018盤上檢測，後續步驟與以上相同。如圖2所示，PR000892可以部分阻斷BAFF與BCMA在體外條件下的結合。
內化：計數293T-huBCMA細胞或NCI-H929細胞，接種5000或10000個/孔至96孔黑壁透明底的培養盤(PE6005225)。重組抗體連續稀釋至9種不同濃度並加入，最終濃度從100 nM開始。加入a-hFc-MMAF使最終濃度為1 μg/ml。培養盤在37℃、5% CO2 條件下培育72小時，然後用CTG套組裂解，並用Enspire檢測發光。如圖3a中所示，在293T-huBCMA細胞株中，PR000892的內化作用與對照抗體相當；如圖3b中所示，PR000892在NCI-H929細胞株中的內化作用顯著優於對照抗體。
另外：經驗證，本發明抗體和對照抗體與BCMA抗原(Cat. BCA-H522y)的親和力相當。
圖1為重組抗體與表現BCMA的細胞株結合強度的測試結果圖；a.重組抗體與293T-huBCMA細胞株的結合b.重組抗體與293T-cynoBCMA細胞株的結合，c.重組抗體與NCI-H929細胞株的結合。
圖2為BCMA重組抗體阻斷BAFF與BCMA結合的測試。
圖3為重組抗體內化至BCMA細胞株的測定。a.重組抗體內化至293T-huBCMA細胞株，b.重組抗體內化至NCI-H929細胞株。

Claims (12)

  1. 一種BCMA結合蛋白，其特徵在於，其包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述的LCDR1的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示，所述的LCDR2的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示，所述的LCDR3的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 3所示； 所述的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的HCDR1的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示，所述的HCDR2的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示，所述的HCDR3的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 6所示。
  2. 如請求項1所述的BCMA結合蛋白，其特徵在於，所述的BCMA結合蛋白還包括抗BCMA抗體的框架區，所述框架區包括重鏈框架區和/或輕鏈框架區； 所述的重鏈框架區優選人源重鏈框架區，所述的人源重鏈框架區HFWR1~4包含分別如序列表中SEQ ID NO: 13~16所示的胺基酸序列； 所述的輕鏈框架區優選人源輕鏈框架區，所述的人源輕鏈框架區LFWR1~4包含分別如序列表中SEQ ID NO: 17~20所示的胺基酸序列。
  3. 如請求項2所述的BCMA結合蛋白，其特徵在於，所述的重鏈可變區包括如序列表中SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列，且所述的輕鏈可變區包括如序列表中SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1~3任一項所述的BCMA結合蛋白，其特徵在於，還包括重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區；較佳地，所述重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其突變，所述輕鏈恆定區選自κ鏈或者λ鏈或其突變。
  5. 如請求項1~4任一項所述的BCMA結合蛋白，其特徵在於，其為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、雙特異性抗體、多特異性抗體、單域抗體或單區抗體，或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。
  6. 如請求項5所述的BCMA結合蛋白，其特徵在於，所述全長抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈包括如SEQ ID NO: 9所示的胺基酸序列，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列。
  7. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1~6任一項所述的BCMA結合蛋白。
  8. 一種包含如請求項7所述的分離的核酸的表現載體。
  9. 一種宿主細胞，其包含根據請求項8所述的表現載體；優選地，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
  10. 一種BCMA結合蛋白的製備方法，其包含培養如請求項9所述的宿主細胞，從培養物中獲得所述BCMA結合蛋白。
  11. 一種藥物組成物，其包含如請求項1~6任一項所述的BCMA結合蛋白。
  12. 如請求項1~6任一項所述的BCMA結合蛋白和如請求項11所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物中的應用；優選地，所述癌症為骨髓瘤、結腸癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、乳腺癌、子宮頸癌或卵巢癌。
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