TW202425951A - 脂質奈米顆粒藥物綴合物 - Google Patents

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Abstract

本公開文本提供了包含靶向部分例如抗體、Fab片段或單鏈可變片段（ScFv）和包封治療劑（即有效載荷）的脂質奈米顆粒（LNP）的綴合物，其中所述靶向部分例如抗體、Fab片段或所述ScFv通過連接子與所述脂質奈米顆粒綴合，並且其中所述連接子包含酶識別序列以及由所述靶向部分例如抗體、Fab片段或ScFv上的第一點擊柄與所述LNP上的第二點擊柄之間的點擊反應形成的點擊產物。

Description

脂質奈米顆粒藥物綴合物
[ 相關申請的交叉引用 ]本申請要求2022年11月7日提交的美國臨時專利申請號63/423,188和2023年1月8日提交的美國臨時申請號63/478,974的優先權，出於所有目的將每個申請的公開內容通過引用以其整體特此併入。 [ 對電子序列表的引用 ]將電子序列表（252052000640SEQLIST.xml；大小：128,635位元組；以及創建日期：2023年11月6日）的內容通過引用以其整體併入本文。
脂質奈米顆粒（LNP）的開發最近對於有效載荷如核酸（例如mRNA或siRNA）的細胞內遞送取得了顯著進展。LNP通常由包括可電離脂質、聚乙二醇化脂質、輔助脂質和膽固醇在內的多種組分組成，所有這些在將有效載荷有效遞送至患病組織中起重要作用。儘管如此，仍然存在重要的安全問題。例如，LNP可能積累有效載荷並將其遞送至除預期靶標之外的細胞，這導致潛在的毒性。因此，一個重要的目標是開發靶向患病組織並且可以以無毒劑量投予的LNP。
一種用於改善LNP的毒理學特徵和增加LNP功效的方法是用靶向特定細胞（如患病細胞）的靶向部分修飾LNP的表面。例如，LNP可以用靶向部分（如抗體或其抗原結合部分）包被，所述靶向部分與靶細胞上的特定細胞受體結合，導致有效載荷在靶向的組織中相對於體內其他組織得到積累。已經使用不同的方法將靶向部分引入LNP的表面上。例如，一種方法依賴於用靶向部分官能化預先形成的LNP。LNP通常包含具有用反應性部分如硫醇、胺、馬來醯亞胺或羧酸基團官能化的聚乙二醇（PEG）間隔基的脂質。LNP的官能化脂質與共價鍵合至靶向部分的互補基團反應，因此產生LNP和靶向部分的綴合物。
使用更溫和反應條件的更近期的綴合方法是基於雙正交化學反應如點擊化學。由LNP上的點擊柄和鍵合至靶向部分的點擊柄形成的所謂點擊產物將LNP與靶向部分連接。已經用於產生LNP/靶向部分綴合物的一種雙正交方法包括銅催化的點擊反應，如迭氮化物與炔烴之間的Huisgen 1,3-偶極環加成（CuAAC）。其他雙正交方法依賴於使用無銅點擊化學，例如，可以在迭氮化物與二苯並環辛烯（DBCO）之間形成點擊產物，使用反式環辛烯（TCO）部分與四嗪環之間的反電子需求的狄爾斯-阿爾德環加成（IEDDA）形成點擊產物，或在迭氮化物與膦之間的施陶丁格反應中形成點擊產物。
通常，包括雙正交方法的上述綴合方法當應用於抗體或抗原結合片段時產生以非均勻方式與抗體綴合的LNP。通常，當將抗體或抗原結合片段用反應基團或點擊柄官能化時，這種官能化以隨機方式發生，導致顯示顯著的批次間可變性的異質抗體群體。隨機修飾的抗體或抗原結合片段產生其表面以隨機方式修飾的LNP。隨機修飾的抗體或抗原結合片段與LNP之間的反應可能不以最佳效率發生。此外，以這種方式修飾的LNP可能含有一定比例的這樣的抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段由於它們在綴合後在LNP的表面上取向的無效方式而不能有效地結合其在細胞上的靶受體。此外，在特定胺基酸殘基處與抗體或抗原結合片段綴合的抗體可能以未優化的方式這樣做，這可能損害抗體結合能力，從而導致次優的治療效果。
因此，需要開發具有用靶向部分（如抗體或抗原結合片段）修飾的表面的LNP，其中抗體或抗原結合片段以高度位點特異性的方式與LNP連接，從而導致更大比例的以有效結合其靶受體取向的靶向部分。
在一個態樣，本公開文本提供了包含靶向部分如抗體、Fab片段或單鏈可變片段（ScFv）和包封治療劑（即，有效載荷）的脂質奈米顆粒（LNP）的綴合物，其中所述靶向部分例如抗體、Fab片段或所述ScFv通過連接子與所述脂質奈米顆粒綴合，其中所述連接子包含由所述抗體、Fab片段或ScFv上的第一點擊柄與所述LNP上的第二點擊柄之間的點擊反應形成的點擊產物，並且其中所述第一點擊柄包含四嗪（Tz）環並且所述第二點擊柄包含反式環辛烯（TCO）部分。由Tz環與TCO部分之間的反電子需求的狄爾斯-阿爾德反應形成所述點擊產物。所得點擊產物包含二氫嗒嗪部分。在特定實施例中，所述二氫嗒嗪部分是1,4-二氫嗒嗪部分。在某些實施例中，所述有效載荷可以是小分子、肽或蛋白質、siRNA或miRNA、核酸（例如，DNA或RNA分子，例如mRNA分子）、編碼用於改變或修飾基因組的系統的組分的核酸或其組合。在一些實施例中，所述有效載荷是編碼或包含治療劑的DNA或RNA分子（例如，mRNA）。在一些實施例中，所述有效載荷是如本文所述的基因修飾系統。
諸位發明人已發現點擊柄的取向是綴合效率的重要決定因素。例如，當LNP用Tz環修飾並且靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）用TCO部分修飾時的綴合效率顯著低於當LNP用TCO部分修飾並且靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）用Tz環修飾時的綴合效率。此外，與其他點擊對相比，特定Tz/TCO點擊對在處於適當的取向時提供顯著更高的綴合效率。
在特定實施例中，包含所述點擊產物的所述連接子以位點特異性方式共價鍵合至所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或所述ScFv）。例如，在一些實施例中，所述連接子共價鍵合至所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或所述ScFv）的C末端或N末端。在一些實施例中，將所述連接子添加至所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或所述ScFv）的部分，其已用非天然胺基酸進行位點特異性修飾。在一些實施例中，將所述連接子添加至糖基化靶向部分（例如，抗體）的糖部分。如本文所公開，除了基於用於將所述連接子引入所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或所述ScFv）的方法產生的點擊產物之外，所述連接子將通常包含另外的組分（例如，胺基酸殘基）。
在一些實施例中，所述四嗪環是未取代的。在一些此類實施例中，所述四嗪環是甲基四嗪（MeTz）。在一些實施例中，所述四嗪環是6-甲基取代的四嗪。
在一些實施例中，所述綴合物具有結構靶向部分-二氫嗒嗪-LNP，例如抗體-間隔基-二氫嗒嗪-LNP、Fab片段-間隔基-二氫嗒嗪-LNP或ScFv-間隔基-二氫嗒嗪-LNP。在特定實施例中，所述二氫嗒嗪部分是1,4-二氫嗒嗪。所述間隔基是連接子的一部分，其將所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與所述LNP連接。在一些實施例中，所述間隔基包含酶識別序列如分選酶識別基序或硫辛酸連接酶（LplA）受體肽。在此類實施例中，所述間隔基可以在所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與所述酶識別序列之間包含另外的胺基酸殘基。此類另外的胺基酸包括但不限於(GGGGS) v、(G) v、(EAAAK) v、(PAPAP) v、(AP) v和A(EAAAK) uALEA(EAAAK) vA，其中u是1-10並且v是1-10。
在某些實施例中，所述有效載荷可以是小分子、肽或蛋白質、siRNA或miRNA、編碼治療劑的核酸（例如，mRNA分子）、編碼用於改變基因組的系統的組分的核酸或其組合。
在一個實施例中，所述綴合物包含靶向部分（例如，抗體、Fab片段或單鏈可變片段（ScFv））和脂質奈米顆粒（LNP），其中所述抗體的一條或多條重鏈或輕鏈的C末端、所述Fab片段的重鏈或輕鏈的C末端或所述ScFv的C末端通過連接子與所述脂質奈米顆粒綴合，並且其中所述連接子包含分選酶識別基序以及由所述抗體、Fab片段或ScFv上的包含Tz環的第一點擊柄與所述LNP上的包含TCO部分的第二點擊柄之間的點擊反應形成的點擊產物。在特定實施例中，所述分選酶識別基序包括LPXT基序，其中X是任何胺基酸殘基。在一些此類實施例中，所述分選酶識別基序包括LPET基序。在一些實施例中，所述連接子包含分選酶識別基序與點擊產物之間的3個或更多個甘胺酸殘基。在一些實施例中，所述連接子包含所述分選酶識別基序與所述點擊產物之間的3至10個之間的甘胺酸殘基。在一些此類實施例中，所述連接子包含所述分選酶識別基序與所述點擊產物之間的3、4、5或6個甘胺酸殘基。在一些實施例中，所述連接子進一步包含所述抗體、Fab片段或ScFv與所述分選酶識別基序之間的一個或多個另外的胺基酸殘基。在一些此類實施例中，所述抗體、Fab片段或ScFv與所述分選酶識別基序之間的胺基酸殘基選自(GGGGS) v、(G) v、(EAAAK) v、(PAPAP) v、(AP) v和A(EAAAK) uALEA(EAAAK) vA，其中u是1-10並且v是1-10。
在另一個實施例中，所述綴合物包含靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）和脂質奈米顆粒（LNP），其中所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）通過連接子與所述脂質奈米顆粒綴合，並且其中所述連接子包含硫辛酸連接酶（LplA）受體肽以及由所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）上的包含Tz環的第一點擊柄與所述LNP上的包含TCO部分的第二點擊柄之間的點擊反應形成的點擊產物。在一些實施例中，所述綴合物包含抗體，其中所述抗體的一條或多條重鏈或輕鏈的C末端與所述連接子鍵合。在一些實施例中，所述綴合物包含Fab片段，所述Fab片段的重鏈或輕鏈的C末端與所述連接子鍵合。在一些實施例中，所述綴合物包含ScFv，其中所述ScFv的C末端與所述連接子鍵合。在一些實施例中，所述LplA受體肽具有序列GFEDKVWYDLDA。在一些實施例中，所述連接子在所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與所述LplA受體肽之間進一步包含一個或多個另外的胺基酸殘基。在一些此類實施例中，所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與所述LplA受體肽之間的胺基酸殘基選自(GGGGS) v、(G) v、(EAAAK) v、(PAPAP) v、(AP) v和A(EAAAK) uALEA(EAAAK) vA，其中u是1-10並且v是1-10。
構成所公開的綴合物的LNP通常包含多個（例如，3、4、5或6個）脂質分子。在特定實施例中，所述點擊產物與構成所述LNP的一個或多個脂質鍵合。在此類實施例中，由鍵合至所述靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）的第一點擊柄與鍵合至構成所述LNP的所述一個或多個脂質的第二點擊柄之間的反應形成所述點擊產物。
在任何前述實施例中，所述綴合物可以包含一個或多個聚乙二醇化脂質分子。在一些實施例中，所述第二點擊柄共價鍵合至所述聚乙二醇化脂質分子中的至少一個，因此產生結構脂質-PEG x-點擊柄，其中x是5-120。在此類實施例中，由鍵合至所述抗體的第一點擊柄與鍵合至構成所述LNP的一個或多個所述聚乙二醇化脂質的第二點擊柄之間的反應形成所述點擊產物。在一些實施例中，所述LNP包含約0.05 mol%至約2 mol%的鍵合至所述第二點擊柄的所述聚乙二醇化脂質。在一些實施例中，所述脂質與所述第二點擊柄之間的PEG間隔基包含至少約5、10、20、30、50、50、60、70、80、90、200或110個乙二醇單元。在一些實施例中，所述PEG間隔基包含約10-120個乙二醇單元。在一些實施例中，鍵合至所述第二點擊柄的所述聚乙二醇化脂質的分子量是約500（即，PEG500）至約5,000（即，PEG5000）。在一些實施例中，鍵合至第二點擊柄的聚乙二醇化脂質的分子量是約1,000（即，PEG1000）至約3,000（即，PEG5300）。在一些實施例中，鍵合至所述第二點擊柄的所述聚乙二醇化脂質的脂質組分選自DMG、DPG、DSG、DTA、DOPE、DPPE、DMPE、DSPE、鞘胺醇、鞘磷脂和硬脂酸。
在任何前述實施例中，所述綴合物可以包含一個或多個膽固醇分子。在一些實施例中，所述第二點擊柄鍵合至構成所述LNP的所述膽固醇分子中的至少一個。在一些此類實施例中，所述第二點擊柄鍵合至β-穀甾醇、羥基膽固醇或豆甾烷醇。
在任何前述實施例中，所述綴合物可以包含一個或多個非聚乙二醇化磷脂。在一些實施例中，所述第二點擊柄鍵合至所述非聚乙二醇化磷脂中的至少一個。在一些實施例中，所述非聚乙二醇化磷脂選自POPC、DOPC、DOPE和DSPC。此類脂質通常被稱為輔助脂質。
在任何前述實施例中，所述綴合物可以包含一個或多個可電離脂質。在一些實施例中，所述第二點擊柄鍵合至所述可電離脂質中的至少一個。在一些實施例中，所述可電離脂質選自V003、V004、V005和V040。
在一些實施例中，所述LNP組分包含如下所述的可電離脂質V003。 V003
在一些實施例中，所述LNP是脂質體。在一些實施例中，所述脂質體包含磷脂，如磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸和磷脂醯甘油。在一些實施例中，所述脂質體包含穩定劑如膽固醇。
已經出乎意料地發現，本文公開的綴合物中增加量的非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）改善有效載荷（例如，mRNA）向目的細胞（例如，T細胞或HSC）的遞送。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約7 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約4 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約3 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約2.5 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約2 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1.5 : 1至約2.5 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約2 : 1至約2.5 : 1。
另外，本文公開的綴合物中非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）與所述膽固醇分子的增加的比率可以導致有效載荷（例如，mRNA）向目的細胞（例如，T細胞或HSC）的增加的遞送。在一些實施例中，所述膽固醇分子與所述非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約6 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，所述膽固醇分子與所述非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約3 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，所述膽固醇分子與所述非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約2 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，所述膽固醇分子與所述非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1.5 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，所述膽固醇分子與所述非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，所述膽固醇分子與所述非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 2至約0.8 : 1。
在任何前述實施例中，所述綴合物可以每個LNP包含多於一個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，所述綴合物可以每個LNP包含超過10個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，所述綴合物可以每個LNP包含超過20個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，所述綴合物可以每個LNP包含超過30個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，所述綴合物可以每個LNP包含超過50個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，所述綴合物可以每個LNP包含約50至約200個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，所述綴合物可以每個LNP包含約100至約200個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。
在任何前述實施例中，本公開文本的綴合物的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）組分可以靶向細胞表面受體。在一些實施例中，本公開文本的綴合物的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）組分靶向T細胞受體，包括但不限於CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7或CD8。在其他實施例中，本公開文本的綴合物的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）組分靶向造血幹細胞（HSC）。在一些實施例中，本公開文本的綴合物的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）組分靶向HSC受體，包括但不限於CD90或CD117。在任何前述實施例中，向所述LNP的表面添加靶向部分導致靶向性LNP（tLNP），其可以相對於沒有靶向部分的LNP更有效地將有效載荷遞送至靶細胞（即，包含與所述靶向部分結合的細胞表面受體的細胞）。在一些實施例中，包含與CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7或CD8結合的靶向部分的綴合物包含可將有效載荷遞送至T細胞的靶向性LNP。在一些實施例中，包含與CD90或CD117結合的靶向部分的綴合物包含可將有效載荷遞送至HSC的靶向性LNP。
本公開文本的綴合物可以用於將有效載荷遞送至細胞、特別是表現被所述綴合物的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）組分靶向的細胞表面受體的細胞。在一些實施例中，所述有效載荷是一種或多種核酸分子，例如一種或多種DNA分子、一種或多種RNA分子（例如，mRNA）或其組合。在一些實施例中，所述有效載荷是siRNA或微小RNA。在其他實施例中，所述有效載荷是反義寡核苷酸（ASO）。在其他實施例中，所述有效載荷是tRNA。在其他實施例中，所述有效載荷是DNA質體。在其他實施例中，所述有效載荷是小分子。在其他實施例中，所述有效載荷是CRISPR/Cas系統的一種或多種組分，例如CRISPR/Cas核酸酶或編碼CRISPR/Cas核酸酶的核酸和/或指導RNA。在一些實施例中，所述有效載荷是CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a或CRISPR-Cas12b系統的一種或多種組分。例如，本公開文本的綴合物可以用於遞送CRISPR-Cas9基因組編輯組分。在一些實施例中，所述有效載荷包括CRISPR/Cas切口酶或編碼CRISPR-Cas切口酶（例如，CRISPR-Cas9切口酶）的核酸。在一些此類實施例中，所述綴合物可以遞送編碼Cas9的mRNA和指導RNA。在一些實施例中，所述有效載荷可以是如本文所述的基因修飾系統的一種或多種組分，包括基因修飾多肽或編碼基因修飾多肽的核酸。其他有效載荷可以選自：小或大的有機或無機分子、單糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白質、肽類似物及其衍生物、肽模擬物、核酸、核酸類似物和衍生物、從生物材料製備的提取物、或它們的任何組合。在一些實施例中，所述有效載荷可以是酶或編碼酶的核酸，例如用於酶替代基因療法。
在一些實施例中，本公開文本的綴合物可以用於遞送能夠將異源目標序列插入細胞的基因組中的系統。在一些實施例中，所述系統包含：(A) 基因修飾多肽或編碼所述基因修飾多肽的核酸，其中所述基因修飾多肽包含：(i) 核酸內切酶和/或DNA結合結構域；和 (ii) 反轉錄酶（RT）結構域，其中 (i) 和 (ii) 兩者均源自反轉錄轉座子（例如，源自相同的反轉錄轉座子或不同的反轉錄轉座子）；以及 (B) 範本RNA（或編碼所述範本RNA的DNA），其包含 (i) 結合所述多肽的序列和 (ii) 異源目標序列。在一些實施例中，基因修飾多肽充當基本上自主的蛋白質機器，其能夠在基本上不依賴於宿主機制的情況下將範本核酸序列整合到靶DNA分子（例如，在哺乳動物宿主細胞中，如宿主細胞中的基因組DNA分子）中。所述異源目標序列可以包括例如編碼序列、調節序列、基因表現單元。在一些實施例中，所述基因修飾多肽可以是反轉錄轉座子，例如選自表7的反轉錄轉座子。在一些實施例中，所述基因修飾多肽可以是選自而不限於以下反轉錄轉座子類別的反轉錄轉座子：RTE（例如，RTE-1_MD、RTE-3_BF和RTE-25_LMi）、CR1（例如，CR1-1_PH）、Crack（例如，Crack-28_RF）、L2（例如，L2-2_Dre和L2-5_GA）和Vingi（例如，Vingi-1_Acar）。
在另一個態樣，包含通過本文公開的方法產生的第一點擊柄（Tz環）的修飾的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與包含第二點擊柄（TCO部分）的脂質反應以形成點擊產物，從而產生在其表面上用靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）修飾的脂質。隨後，將修飾的脂質插入前體LNP中，從而形成在其表面上用靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）修飾的LNP。在一些實施例中，包含所述第二點擊柄的所述脂質是聚乙二醇化脂質。
I. 定義
抗原結合結構域：如本文所用的術語「抗原結合結構域」是指靶向部分（例如結合抗原的抗體或嵌合抗原受體）的部分。在一些實施例中，抗原結合結構域與細胞的細胞表面抗原結合。在一些實施例中，抗原結合結構域結合癌症的抗原特徵，例如贅生性細胞中的腫瘤相關抗原。在一些實施例中，抗原結合結構域結合感染性疾病的抗原特徵，例如病毒感染的細胞中的病毒相關抗原。在一些實施例中，抗原結合結構域結合自身免疫疾病中被受試者的免疫系統靶向的細胞的抗原特徵，例如自身抗原。在一些實施例中，抗原結合結構域是或包含抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，抗原結合結構域是或包含scFv或Fab。
結構域：如本文所用的術語「結構域」是指生物分子中有助於生物分子的特定功能的結構。結構域可以包含生物分子的連續區域（例如，連續序列）或不同的非連續區域（例如，非連續序列）。蛋白質結構域的例子包括但不限於核酸內切酶結構域、DNA結合結構域、反轉錄酶結構域；核酸的結構域的例子是調節結構域，如轉錄因子結合結構域。
外源的：如本文所用，術語「外源的」當關於生物分子（如核酸序列或多肽）使用時意指通過人工將生物分子引入宿主基因組、細胞或生物體中。例如，使用重組DNA技術或其他方法添加至現有基因組、細胞、組織或受試者中的核酸對於現有核酸序列、細胞、組織或受試者是外源的。
表現盒：如本文所用的術語「表現盒」是指核酸構建體，其包含足以表現本發明的核酸分子的核酸元件。
gRNA 間隔子：如本文所用的「gRNA間隔子」是指與靶核酸具有互補性並且可以與gRNA支架一起將Cas蛋白靶向靶核酸的核酸的一部分。
gRNA 支架：如本文所用的「gRNA支架」是指可以結合Cas蛋白並且可以與gRNA間隔子一起將Cas蛋白靶向靶核酸的核酸的一部分。在一些實施例中，gRNA支架包含crRNA序列、四環和tracrRNA序列。
基因修飾多肽：如本文可互換使用的「基因修飾多肽」和「反轉錄轉座子基因修飾多肽」是指包含反轉錄轉座酶反轉錄酶結構域和反轉錄轉座酶核酸內切酶結構域的多肽，或包含與所述結構域具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列同一性的胺基酸序列的多肽，所述多肽能夠將核酸序列（例如，範本核酸上提供的序列）整合到靶DNA分子（例如，在哺乳動物宿主細胞中，如宿主細胞中的基因組DNA分子）中。在一些實施例中，核酸內切酶結構域是無催化活性的核酸內切酶結構域。在一些實施例中，反轉錄轉座酶反轉錄酶結構域和反轉錄轉座酶核酸內切酶結構域源自相同的反轉錄轉座酶。在一些實施例中，基因修飾多肽能夠在基本上不依賴於宿主機制的情況下整合序列。在一些實施例中，基因修飾多肽將序列整合到基因組中的隨機位置中，並且在一些實施例中，基因修飾多肽將序列整合到特定靶位點中。在一些實施例中，基因修飾多肽包含一個或多個結構域，其共同促進1) 結合範本核酸，2) 結合靶DNA分子，以及3) 促進範本核酸的至少一部分整合到靶DNA中。基因修飾多肽包括天然存在的多肽以及前述多肽的工程化變體，例如具有針對天然存在的序列的一個或多個胺基酸取代。基因修飾多肽還包括異源構建體，例如，其中一個或多個上述結構域彼此異源，無論是通過原本野生型結構域的異源融合物（或其他綴合物）以及修飾的結構域的融合物，例如通過異源亞結構域或其他取代的結構域的替代或融合。可用於本文提供的方法中的示例性基因修飾多肽以及包含它們的系統和使用它們的方法描述於例如WO/2021/178717中，將其（包括其中的表10、表11、表X、表3A、表3B和表Z1）通過引用併入本文。在一些實施例中，基因修飾多肽將序列整合到基因中。在一些實施例中，基因修飾多肽將序列整合到基因外的序列中。如本文所用的「基因修飾系統」是指包含基因修飾多肽和範本核酸的系統。
基因修飾系統：如本文所用的「基因修飾系統」是指包含基因修飾多肽或編碼基因修飾多肽的核酸（例如，mRNA）和範本核酸的系統。
異源的：術語「異源的」當用於描述與第二要素相關的第一要素時是指第一要素和第二要素不以所描述的佈置存在於自然界中。例如，異源多肽、核酸分子、構建體或序列是指 (a) 對於其在其中表現的細胞不是天然的多肽、核酸分子或者多肽或核酸分子序列的一部分，(b) 相對於其天然狀態已經改變或突變的多肽或核酸分子或者多肽或核酸分子的一部分，或 (c) 在相似條件下與天然表現水準相比具有改變的表現的多肽或核酸分子。例如，異源調節序列（例如，啟動子、增強子）可以用於以不同於在自然界中通常表現基因或核酸分子的方式調節基因或核酸分子的表現。在另一個例子中，多肽或核酸序列的異源結構域（例如，多肽的DNA結合結構域或編碼多肽的DNA結合結構域的核酸）可以是相對於其他結構域佈置的，或者可以是相對於多肽或其編碼核酸的其他結構域或部分的不同序列或相對於多肽或其編碼核酸的其他結構域或部分來自不同來源。在某些實施例中，異源核酸分子可以存在於天然宿主細胞基因組中，但可以具有改變的表現水準或具有不同的序列或兩者。在其他實施例中，異源核酸分子可以不是對於宿主細胞或宿主基因組內源的，而是可以通過轉化（例如，轉染、電穿孔）引入宿主細胞中，其中添加的分子可以整合到宿主基因組中，或者可以作為染色體外遺傳物質短暫地存在（例如，mRNA）或半穩定地存在超過一代（例如，附加型病毒載體、質體或其他自我複製載體）。在一些實施例中，如果第一結構域不是天然地與另一結構域包含在同一多肽中，則該結構域相對於另一結構域是異源的（例如，來自相同生物體的不同蛋白質的兩個結構域之間的融合物）。
突變或突變的：術語「突變的」當應用於核酸序列時意指與參考（例如，天然）核酸序列相比，核酸序列中的核苷酸可以被插入、缺失或改變。可以在基因座處進行單個改變（點突變），或者可以在單個基因座處插入、缺失或改變多個核苷酸。此外，可以在核酸序列內的任何數量的基因座處進行一個或多個改變。可以通過本領域已知的任何方法使核酸序列突變。在一些實施例中，突變天然發生。在一些實施例中，期望的突變可以通過本文所述的系統產生。
核酸分子：「核酸分子」是指RNA和DNA分子兩者，包括但不限於互補DNA（「cDNA」）、基因組DNA（「gDNA」）和信使RNA（「mRNA」），並且還包括合成核酸分子，如本文所述的化學合成或重組產生的那些，如RNA範本。核酸分子可以是雙鏈的或單鏈的、環狀的或線性的。如果是單鏈的，則核酸分子可以是有義鏈或反義鏈。除非另有說明，否則作為本文中以一般格式「SEQ ID NO:」描述的所有序列的例子或「包含SEQ ID NO: 1的核酸」是指這樣的核酸，其至少一部分具有 (i) SEQ ID NO: 1的序列，或 (ii) 與SEQ ID NO: 1互補的序列。兩者之間的選擇由SEQ ID NO: 1所在的上下文決定。例如，如果將核酸用作探針，則兩者之間的選擇由探針與期望的靶標互補的要求來決定。本公開文本的核酸序列可以被化學修飾或生物化學修飾，或者可以含有非天然或衍生的核苷酸鹼基，如本領域技術人員將容易理解的。此類修飾包括例如標記、甲基化、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾（如不帶電荷的連接（例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等）、帶電荷的連接（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等））、側基部分（例如，多肽）、嵌入劑（例如，吖啶、補骨脂素等）、螯合劑、烷基化劑和修飾的連接（例如，α異頭核酸等）。還包括化學修飾的鹼基、骨架和修飾的帽。還包括類比多核苷酸經由氫鍵合和其他化學相互作用與指定序列結合的能力的合成分子。此類分子是本領域已知的，並且包括例如其中肽連接取代分子骨架中的磷酸連接的那些分子，例如肽核酸（PNA）。其他修飾可以包括例如其中核糖環含有橋接部分或其他結構（如在「鎖」核酸（LNA）中發現的修飾）的類似物。在各種實施例中，核酸與以下項操作性地締合：另外的遺傳元件，如一個或多個組織特異性表現控制序列（例如，組織特異性啟動子和組織特異性微小RNA識別序列）；以及另外的元件，如反向重複（例如，反向末端重複，如來自或源自病毒的元件，例如AAV ITR）和串聯重複、反向重複/同向重複、同源區（與靶DNA具有不同程度同源性的區段）、非轉譯區（UTR）（5'、3' UTR或5'和3' UTR兩者）以及前述項的各種組合。本發明提供的系統的核酸元件可以以多種拓撲結構提供，包括單鏈的、雙鏈的、環狀的、線性的且具有開放端、線性的且具有封閉端以及這些的特定形式，如狗骨頭狀（doggybone）DNA（dbDNA）、封閉端DNA（ceDNA）。
引子結合序列：如本文所用的術語「引子結合位點序列」或「PBS序列」是指能夠結合靶核酸序列中包含的區域的範本RNA的一部分。在一些情況下，PBS序列是包含與靶核酸序列中包含的區域具有100%同一性的至少3、4、5、6、7或8個鹼基的核酸序列。在一些實施例中，引子區包含與靶核酸序列中包含的區域具有100%同一性的至少5、6、7、8個鹼基。不希望受理論束縛，在一些實施例中，當範本RNA包含PBS序列和異源目標序列時，PBS序列與靶核酸序列中包含的區域結合，從而允許反轉錄酶結構域使用該區域作為反轉錄的引子並將異源目標序列用作反轉錄的範本。
應理解，本文描述為「包含」的態樣和實施例包括「由......組成」和「基本上由......組成」實施例。
II. 綴合物
在一個態樣，如本章節中所述，本公開文本提供了包含靶向部分和包封治療劑（即，有效載荷）的脂質奈米顆粒（LNP）的綴合物，其中所述靶向部分通過連接子與所述脂質奈米顆粒綴合，並且其中所述連接子包含由所述靶向部分上的第一點擊柄與所述LNP上的第二點擊柄之間的點擊反應形成的點擊產物，並且其中第一點擊柄是四嗪（Tz）環並且第二點擊柄是反式環辛烯（TCO）部分。使用本公開文本的綴合物的方法的具體實施例描述於章節III中。有待於通過本公開文本的綴合物遞送的有效載荷的具體實施例描述於章節IV中。關於本公開文本的綴合物的LNP部分的進一步細節描述於章節V中。
在一些實施例中，靶向部分是抗體或其抗原結合片段。在一些情況下，靶向部分是抗體、Fab片段、ScFv、DARPIN、VHH結構域抗體、FN3結構域、奈米抗體、單結構域抗體或Centyrin。在其他實施例中，靶向部分是葉酸部分、抗生素類比物、多核苷酸（如DNA或RNA適體）、碳水化合物、維生素或N-乙醯半乳糖胺（GalNac）。靶向部分與LNP的綴合產生靶向性LNP（tLNP）。在一些實施例中，靶向部分是與細胞表面上的受體結合的配體。在一些實施例中，配體可以是受體的天然配體。在一些實施例中，配體可以是受體的合成配體。在一些實施例中，靶向部分是小分子，例如細胞表面上的受體的小分子配體。在一些實施例中，靶向部分是肽或多肽，例如細胞表面上的受體的肽或多肽配體。在一些實施例中，肽或多肽是線性的。在其它實施例中，肽或多肽是環狀的。在一些實施例中，靶向部分是細胞介素，例如使得細胞介素靶向部分與細胞表面上的細胞介素受體結合。靶向部分與LNP的綴合產生靶向性LNP（tLNP）。
在一些實施例中，連接子進一步包含在靶向部分與點擊產物之間的間隔基。間隔基可以包含將靶向部分與Tz基團間接連接的另外的官能團。間隔基可以還包含將靶向部分與Tz基團間接連接的另外的胺基酸。
在一些實施例中，第一點擊柄或第二點擊柄是具有以下結構之一的四嗪衍生物： 其中 表示與綴合物的連接子或與LNP的附接點。
在一些實施例中，第一點擊柄或第二點擊柄是具有以下結構之一的TCO衍生物：
在一些實施例中，將靶向部分與Tz環連接的間隔基是酶識別序列。因此，本公開文本提供了將LNP與用酶識別序列修飾的靶向部分綴合的方法，其中所述綴合是經由共價結合至靶向部分的Tz環與結合至LNP的TCO部分之間的點擊反應實現的。例如，本公開文本提供了將LNP與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或單鏈可變片段（ScFv））綴合的方法，其中靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）通過包含酶識別序列的連接子與第一點擊柄（Tz環）共價連接，並且所述LNP與第二點擊柄（TCO部分）共價連接，所述方法包括使LNP與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）接觸，使得第一點擊柄與所述第二點擊柄反應以形成將靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與LNP綴合的點擊反應產物（二氫嗒嗪）。在一些實施例中，靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）直接鍵合至酶識別序列。在一些實施例中，靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）經由一個或多個胺基酸殘基鍵合至酶識別序列。可共價附接至抗體、Fab片段或ScFv的C末端的特定胺基酸殘基包括但不限於(GGGGS) v（SEQ ID NO: 9）、(G) v（SEQ ID NO: 10）、(EAAAK) v（SEQ ID NO: 11）、(PAPAP) v（SEQ ID NO: 12）、(AP) v（SEQ ID NO: 13）和A(EAAAK) uALEA(EAAAK) vA（SEQ ID NO: 14），其中u是1-10並且v是1-10。
在一些實施例中，酶識別序列是分選酶識別基序或LplA受體肽。在所述LNP與抗體綴合的一些實施例中，所述抗體的一條或多條重鏈或輕鏈的C末端如本文所述直接或通過包含一個或多個胺基酸殘基的連接子共價鍵合至酶識別序列（例如，分選酶識別基序或LplA受體肽）。在LNP與Fab片段綴合的一些實施例中，Fab片段的重鏈或輕鏈的C末端共價鍵合至酶識別序列（例如，分選酶識別基序或LplA受體肽）。在所述LNP與ScFv綴合的一些實施例中，所述ScFv的C末端共價鍵合至所述酶識別序列（例如，分選酶識別基序或LplA受體肽）。在一些實施例中，通過所公開的方法實現的綴合效率是大於50%、大於60%、大於70%、大於80%或大於90%。在一些實施例中，通過所公開的方法實現的綴合效率是從約60%至約95%。在一些實施例中，通過所公開的方法實現的綴合效率是從約70%至約85%。
在一個實施例中，本公開文本提供了一種製造以位點特異性方式與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）綴合的脂質奈米顆粒的方法，所述方法包括 (i) 使具有分選酶識別位點的肽共價鍵合至靶向部分（例如，抗體或Fab片段）的一個或多個C末端或ScFv的C末端； (ii) 在存在分選酶的情況下，在適於分選酶將抗體、Fab片段或ScFv與第一點擊柄連接的條件下，使步驟(i)的產物與共價結合至三個或更多個甘胺酸殘基的包含Tz環的第一點擊柄接觸； (iii) 使步驟(ii)的產物與脂質奈米顆粒（LNP）接觸，其中構成LNP的一個或多個脂質包含能夠與第一點擊柄反應的第二點擊柄，其中第二點擊柄包含TCO部分，從而產生點擊產物。
在一些實施例中，步驟(i)涉及使具有分選酶識別位點的肽共價鍵合至連接子，所述連接子共價鍵合至抗體或Fab片段的一個或多個C末端或ScFv的C末端。在一些實施例中，連接子包含一個或多個胺基酸殘基。可共價附接至抗體、Fab片段或ScFv的C末端的特定胺基酸殘基包括但不限於(GGGGS) v、(G) v、(EAAAK) v、(PAPAP) v、(AP) v和A(EAAAK) uALEA(EAAAK) vA，其中u是1-10並且v是1-10。
在一些實施例中，鍵合至靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）的C末端的分選酶識別基序與一個或多個胺基酸殘基鍵合。例如，在一些實施例中，LPXTG基序的甘胺酸（G）可以鍵合至一個或多個（例如，1-10個）組胺酸（H）殘基（參見 圖 1）。在轉肽反應期間去除甘胺酸和組胺酸殘基。
在一些實施例中，步驟 (ii)（即，分選酶催化的反應）在存在分選酶A5的情況下進行。分選酶A5是來自金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）的野生型分選酶的工程化五突變體變體，其活性顯著高於野生型分選酶。參見美國專利號9,267,227。在此類實施例中，在步驟 (i) 中與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）鍵合的分選酶識別位點具有序列LPXTG，其中X是任何胺基酸殘基。在步驟 (ii) 中，分選酶A通過切割蘇胺酸與甘胺酸殘基之間的分選酶識別位點來催化LPXTG識別基序與結合至第一點擊柄的甘胺酸殘基之間的轉肽反應。
在其他實施例中，步驟 (ii) 在存在分選酶化膿鏈球菌分選酶A（SpSrtA WT）的情況下進行。在此類實施例中，在步驟 (i) 中與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）結合的分選酶識別位點具有序列LPXTA，其中X是任何胺基酸殘基。在步驟 (ii) 中，SpSrtA通過切割蘇胺酸與丙胺酸殘基之間的分選酶識別位點來催化LPXTA識別基序與結合至第一點擊柄的甘胺酸殘基之間的轉肽反應。
圖 1示出了通過分選酶介導的連接和隨後的點擊反應形成與Fab片段的C末端綴合的LNP。在示意圖中，Fab片段的C末端首先用共價鍵合至六個組胺酸（H）殘基的分選酶識別基序共價修飾。然後分選酶修飾的Fab片段與共價鍵合至甘胺酸（G）殘基的第一點擊柄（點擊柄1）反應。然後將所得的用第一點擊柄修飾的Fab片段與包含共價鍵合至第二點擊柄（點擊柄2）的至少一個脂質的LNP反應，從而提供與Fab片段位點特異性綴合的LNP。
在一個實施例中，綴合物包含如上所述的蛋白質靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）和脂質奈米顆粒（LNP），其中靶向部分的C末端通過連接子與脂質奈米顆粒綴合，並且其中所述連接子包含分選酶識別基序以及由靶向部分上的第一點擊柄與所述LNP上的第二點擊柄之間的點擊反應形成的點擊產物。在一些實施例中，抗體的一條或多條重鏈或輕鏈的C末端、Fab片段的重鏈或輕鏈的C末端或ScFv的C末端通過連接子與脂質奈米顆粒綴合，並且其中連接子包含分選酶識別基序以及由靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）上的第一點擊柄與LNP上的第二點擊柄之間的點擊反應形成的點擊產物。在特定實施例中，分選酶識別基序包括LPXT基序，其中X是任何胺基酸殘基。在一些此類實施例中，分選酶識別基序包括LPET基序。在一些實施例中，連接子包含分選酶識別基序與點擊產物之間的3個或更多個甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接子包含3至50個甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接子包含3與10個之間的甘胺酸殘基。在一些此類實施例中，連接子包含3、4、5或6個甘胺酸殘基。
在一些實施例中，綴合物具有結構靶向部分-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-點擊產物-LNP，例如抗體-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-點擊產物-LNP、Fab片段-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-點擊產物-LNP或ScFv-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-點擊產物-LNP，其中X是任何胺基酸殘基，並且n在1與20之間（例如，在3與10之間或在3與6之間）。在這些實施例中，分選酶識別基序的白胺酸（L）殘基鍵合至抗體或Fab片段的至少一個C末端或ScFv的C末端。在一些此類實施例中，X是E。在一些實施例中，抗體（或Fab片段或ScFv）與點擊之間的連接子包含以下胺基酸殘基：LPETGGG（SEQ ID NO: 20）、LPETGGGG（SEQ ID NO: 21）、LPETGGGGG（SEQ ID NO: 22）、LPETAGGG（SEQ ID NO: 23）或LPETGGGGGG（SEQ ID NO: 24）。
在一些實施例中，連接子在靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與分選酶識別基序之間包含另外的胺基酸殘基。在此類實施例中，在共價連接分選酶識別基序之前，可以用一個或多個胺基酸殘基共價修飾靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）的C末端。例如，在特定實施例中，綴合物具有結構靶向部分-Z-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-點擊產物-LNP，例如抗體-Z-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-點擊產物-LNP、Fab片段-Z-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-點擊產物-LNP或ScFv-Z-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-點擊產物-LNP，其中Z是抗體（或Fab片段或ScFv）與分選酶識別基序的白胺酸之間的連接子。在一些實施例中，Z包含一個或多個胺基酸殘基。在一些實施例中，Z是(GGGGS) v（SEQ ID NO: 9）、(G) v（SEQ ID NO: 10）、(EAAAK) v（SEQ ID NO: 11）、(PAPAP) v（SEQ ID NO: 12）、(AP) v（SEQ ID NO: 13）和A(EAAAK) uALEA(EAAAK) vA（SEQ ID NO: 14），其中u是1-10並且v是1-10。在一些實施例中，Z是GG、GGG、GGGG（SEQ ID NO: 25）、GGGGG（SEQ ID NO: 26）、GGGGGG（SEQ ID NO: 27）、和GGGGGGG（SEQ ID NO: 28）或GGGGGS（SEQ ID NO: 29）。
在一些實施例中，綴合物具有結構靶向部分-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-二氫嗒嗪-LNP，例如抗體-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-二氫嗒嗪-LNP、Fab片段-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-二氫嗒嗪-LNP或ScFv-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-二氫嗒嗪-LNP，抗體-Z-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-二氫嗒嗪-LNP、Fab片段-Z-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-二氫嗒嗪-LNP或ScFv-Z-LPXT(G) n（SEQ ID NO: 19）-二氫嗒嗪-LNP，其中變數n和Z如上所定義。在特定實施例中，二氫嗒嗪部分是1,4-二氫嗒嗪。
在另一個實施例中，本公開文本提供了一種製造以位點特異性方式與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）綴合的脂質奈米顆粒的方法，所述方法包括 (i) 使LplA受體肽位點共價鍵合至靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）； (ii) 在存在硫辛酸連接酶的情況下，在適於硫辛酸連接酶將靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與第一點擊柄連接的條件下，使步驟(i)的產物與包含含有Tz環的第一點擊柄的羧酸化合物接觸；以及 (iii) 使步驟(ii)的產物與脂質奈米顆粒（LNP）接觸，其中構成LNP的一個或多個脂質包含能夠與第一點擊柄反應的第二點擊柄，其中第二點擊柄包含TCO部分，從而產生點擊產物。
在步驟(i)的一些實施例中，Lp1A受體肽共價鍵合至抗體或Fab片段的一個或多個C末端。在步驟(i)的其他實施例中，Lp1A受體肽共價鍵合至ScFv的C末端。
在一些實施例中，步驟(i)涉及使具有LplA受體肽的肽共價鍵合至連接子，所述連接子共價鍵合至抗體或Fab片段的一個或多個C末端或ScFv的C末端。在一些實施例中，連接子包含一個或多個胺基酸殘基。可共價附接至抗體、Fab片段或ScFv的C末端的特定胺基酸殘基包括但不限於(GGGGS) v（SEQ ID NO: 9）、(G) v（SEQ ID NO: 10）、(EAAAK) v（SEQ ID NO: 11）、(PAPAP) v（SEQ ID NO: 12）、(AP) v（SEQ ID NO: 13）和A(EAAAK) uALEA(EAAAK) vA（SEQ ID NO: 14），其中u是1-10並且v是1-10。
在一些實施例中，步驟(ii)（即，硫辛酸連接酶催化的反應）在存在突變的硫辛酸連接酶的情況下進行，其中在硫辛酸連接酶的位置處的色胺酸殘基（W）發生突變。具體的W37突變體描述於Cohen等人, 2012, ChemBioChem, 13, 888-894。在一些實施例中，突變體硫辛酸連接酶選自W37V、W37I、W37T、W37L、W37C、W37A和W37G。
在一些實施例中，步驟(ii)（即，硫辛酸連接酶催化的反應）中的羧酸是C 3-C 20羧酸。在一些實施例中，步驟(ii)中的羧酸是脂肪酸，例如C 7-C 19脂肪酸。在一些此類實施例中，脂肪酸選自癸酸、棕櫚酸、月桂酸或辛酸。
在其他實施例中，步驟(ii)中的羧酸具有式COOH-R-點擊柄，其中R包含兩個脂質尾。在一些此類實施例中，羧酸如下所示，其中n = 1-120。
圖 2描繪了通過LplA連接和隨後的點擊反應形成與Fab片段的C末端綴合的LNP。在示意圖中，Fab片段的C末端首先用LplA受體肽共價修飾。具體地，首先通過使羧酸與LplA受體肽的離胺酸殘基化學反應引入包含Tz環的第一點擊柄（點擊柄1）。然後將所得的用第一點擊柄修飾的Fab片段與包含共價鍵合至包含TCO部分的第二點擊柄（點擊柄2）的至少一個脂質的LNP反應，從而提供與Fab片段位點特異性綴合的LNP。
在一些實施例中，通過本文公開的方法產生的綴合物包含通過連接子與脂質奈米顆粒綴合的如上所述的蛋白質靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv），並且其中連接子包含硫辛酸連接酶（LplA）受體肽以及由靶向部分上的第一點擊柄與LNP上的第二點擊柄之間的點擊反應形成的點擊產物。在一些實施例中，連接子在蛋白質靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與LplA受體肽之間進一步包含一個或多個另外的胺基酸殘基。在一些實施例中，LplA受體肽具有序列GFEDKVWYDLDA（SEQ ID NO: 15）。在一些實施例中，綴合物包含抗體，其中抗體的一條或多條重鏈或輕鏈的C末端與連接子鍵合。在一些實施例中，綴合物包含Fab片段，所述Fab片段的重鏈或輕鏈的C末端與連接子鍵合。在一些實施例中，所述綴合物包含ScFv，其中所述ScFv的C末端與所述連接子鍵合。
在一些實施例中，連接子在靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與LplA受體肽之間包含另外的胺基酸殘基。在此類實施例中，在共價連接LplA受體肽之前，可以用一個或多個胺基酸殘基共價修飾抗體、Fab片段或ScFv的C末端。例如，在特定實施例中，綴合物具有結構靶向部分-Z-LplA受體肽-點擊產物-LNP，例如抗體-Z-LplA受體肽-點擊產物-LNP、Fab片段-Z-LplA受體肽-點擊產物-LNP或ScFv-Z-LplA受體肽-點擊產物-LNP，其中Z是抗體（或Fab片段或ScFv）與LplA受體肽的甘胺酸殘基之間的連接子。在一些實施例中，Z包含一個或多個胺基酸殘基。在一些實施例中，Z是(GGGGS) v（SEQ ID NO: 9）、(G) v（SEQ ID NO: 10）、(EAAAK) v（SEQ ID NO: 11）、(PAPAP) v（SEQ ID NO: 12）、(AP) v（SEQ ID NO: 13）和A(EAAAK) uALEA(EAAAK) vA（SEQ ID NO: 14），其中u是1-10並且v是1-10。在一些實施例中，Z是GG、GGG、GGGG（SEQ ID NO: 25）、GGGGG（SEQ ID NO: 26）、GGGGGG（SEQ ID NO: 27）、和GGGGGGG（SEQ ID NO: 28）或GGGGGS（SEQ ID NO: 29）。
應理解，在前述實施例中，LplA受體肽的離胺酸（K）殘基共價連接至點擊產物，所述點擊產物共價連接至LNP。具體地，為了產生綴合物，使側鏈離胺醯基與包含第一點擊柄的羧酸化合物反應。使所得的修飾的抗體（或Fab片段或ScFv）與如本文所公開的已經用第二點擊柄修飾的LNP反應，從而產生點擊產物。下面描繪了用Fab片段修飾的LNP表面，其中R是脂質基團（C 2-C 30烷基）。
在其他實施例中，所述酶識別序列是轉麩醯胺酸酶酶識別序列（LLQG（SEQ ID NO: 16））。轉麩醯胺酸酶酶識別序列（LLQG（SEQ ID NO: 16））也稱為Q標籤。Q標籤可以存在於或者可以被插入靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）的一個或多個位置處，例如在C末端處。轉麩醯胺酸酶催化Q標籤上的側鏈醯胺基團與LNP的組分（例如，脂質）上的烷基-伯胺之間的反應，從而通過醯胺鍵將抗體與LNP連接。
在其他實施例中，酶識別序列是由甲醯甘胺酸生成酶識別的序列、特別是CXPXR，其中每個X是任何胺基酸。在此類實施例中，CXPXR序列可以被插入抗體、Fab片段或ScFv的一個或多個位置處，例如在C末端處。甲醯甘胺酸生成酶將CXPXR的半胱胺酸硫醇轉化為醛基團，其可以與共價鍵合至LNP的組分的胺基氧基或肼基團反應。
在另一個實施例中，本公開文本提供了一種製造以位點特異性方式通過糖基化抗體上的糖部分與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）綴合的脂質奈米顆粒的方法。 圖 3示出了將Tz點擊柄通過糖部分引入抗體的一個特定實施例。在步驟1中，通過酶半乳糖苷酶和轉移酶催化，將迭氮化物部分位點特異性地引入靶向抗體的糖部分中。迭氮化物官能性隨後經由點擊反應與聯苯環辛烯（DBCO）-MeTz反應。點擊反應用於將Tz環（在此情況下為MeTz）引入抗體，其隨後與LNP上的TCO部分（未示出）在第二點擊反應中反應，從而提供綴合物。
在另一個實施例中，本公開文本提供了一種製造以位點特異性方式通過光誘導的交聯反應與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）綴合的脂質奈米顆粒的方法。 圖 4示出了使用oYo-Link Tz的一個特定實施例。在 圖 4中，Tz環（例如，MeTz）共價結合至位點特異性抗體標記（oYo link），其與抗體的重鏈上的殘基特異性地反應。共價結合至抗體的oYo-Link四嗪與結合至LNP的TCO（未示出）反應，從而產生表面修飾的LNP。
在另一個實施例中，本公開文本提供了一種通過以下步驟製造與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）以位點特異性方式綴合的脂質奈米顆粒的方法：使靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）上的胺基酸殘基突變，以及隨後使突變的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）與包含Tz環的化合物反應。 圖 5示出了一個特定實施例，其中在抗體（或Fab片段）產生期間將迭氮化物官能性引入。迭氮化物基團隨後與連接至四嗪環的DBCO基團經歷點擊反應。共價結合至抗體的四嗪環與結合至LNP的TCO（未示出）反應，從而產生表面修飾的LNP。
在另一個實施例中，本公開文本提供了一種使用用於將第一點擊柄（Tz）引入抗體、Fab片段或ScFv的半胱胺酸-馬來醯亞胺反應製造與靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）綴合的脂質奈米顆粒的方法。 圖 6示出了將第一點擊柄（Tz）引入Fab片段的一個特定實施例。在 圖 6中，首先將具有游離半胱胺酸的鉸鏈引入Fab片段的C末端處。在一些此類實施例中，將遠離C末端並掩埋在CL-CH1介面中的工程化鏈間二硫鍵引入以獲得改善的穩定性（ 圖 7）。使所得的修飾的Fab片段與具有共價鍵合至馬來醯亞胺氮的Tz環（點擊柄1）的馬來醯亞胺部分反應。第一點擊柄隨後與LNP上的第二點擊柄（TCO部分）反應，從而產生表面修飾的LNP。
通過本文公開的位點特異性方法製備的綴合物在LNP的表面上具有高密度的靶向劑。例如，綴合物可以每個LNP包含多於一個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以每個LNP包含超過10個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以每個LNP包含超過20個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以包含超過30個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以每個LNP包含超過50個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以每個LNP包含超過75個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以包含超過100個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以每個LNP包含約50至約200個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以每個LNP包含約100至約200個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以每個LNP包含約100至約230個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以每個LNP包含約10至約150個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。在一些實施例中，綴合物可以每個LNP包含約10至約30個靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）。
III. 使用方法
在任何前述實施例中，本公開文本的綴合物的靶向部分組分可以靶向細胞表面抗原或受體。在一些實施例中，綴合物的靶向部分組分通過靶向細胞表面抗原或細胞上的受體增強在綴合物的LNP組分中配製的有效載荷（例如，治療性有效載荷）的遞送。在一些實施例中，相對於缺乏靶向部分的綴合物，本文所述的綴合物將有效載荷遞送至更多的靶細胞和/或將更大量的有效載荷遞送至靶細胞。使用如本文所述的靶向性綴合物（LNP）將治療性有效載荷增強地遞送至靶細胞（例如，免疫細胞或者患病或功能失調細胞）可以改善患者的疾病或病痛的治療。
在任何前述實施例中，本公開文本的綴合物的靶向部分組分可以靶向細胞表面抗原或受體。在一些實施例中，本公開文本的綴合物的靶向部分組分靶向T細胞受體，包括但不限於CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7或CD8。在其他實施例中，本公開文本的綴合物的靶向部分組分靶向造血幹細胞（HSC）。在一些實施例中，本公開文本的綴合物的靶向部分組分靶向HSC受體，包括但不限於CD90或CD117。在其他實施例中，綴合物的靶向部分組分與CD8、TCRα、TCRβ、CD10、CD33、CD34、CD68、CD19、CD62L、CD25、CXCR3、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6或CCR7結合。
在某些實施例中，靶向部分與CD4+或CD8+ T細胞結合。在其他實施例中，靶向部分與自然殺傷（NK）細胞結合。在其它實施例中，靶向部分與造血幹細胞結合。在其它實施例中，靶向部分與淋巴祖細胞結合。在其他實施例中，靶向部分與髓樣細胞結合。在其它實施例中，靶向部分與巨噬細胞結合。
本公開文本的綴合物可以用於將特異性有效載荷遞送至細胞、特別是表現被所述綴合物的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）組分靶向的細胞表面受體的細胞。在一些實施例中，有效載荷是RNA。在一些實施例中，有效載荷是mRNA。在其他實施例中，有效載荷是siRNA或微小RNA（miRNA）。在其他實施例中，有效載荷是反義寡核苷酸（ASO）。在其他實施例中，有效載荷是tRNA。在其他實施例中，有效載荷是DNA載體，例如DNA質體、封閉端DNA（ceDNA）或小環狀DNA（例如，奈米質體）。在其他實施例中，有效載荷是小分子。在其他實施例中，有效載荷是指導RNA。在一些實施例中，有效載荷是肽或蛋白質。在一些實施例中，本文公開的綴合物可以包含兩種或更多種有效載荷，例如選自mRNA、指導RNA、siRNA、miRNA、ASO、DNA載體、小分子、肽或蛋白質。
本文公開的綴合物可以用於將目的治療劑遞送至細胞。例如，在一些實施例中，本文公開的綴合物可以用於遞送編碼疫苗的核酸（例如，mRNA）。在其他實施例中，本文公開的綴合物可以用於遞送編碼酶的核酸（例如，mRNA）。在其他實施例中，本文公開的綴合物可以用於將編碼嵌合抗原受體（CAR）的核酸（例如，DNA或RNA分子）遞送至T細胞。
本文所述的綴合物可以用於靶向和修飾免疫細胞。在一些實施例中，綴合物可以用於修飾T細胞。在一些實施例中，T細胞可以包括T細胞的任何亞群，例如CD4+、CD8+、γ-δ、幼稚T細胞、幹細胞記憶T細胞、中央記憶T細胞或亞群的混合物。在一些實施例中，綴合物可以用於遞送或修飾T細胞中的T細胞受體（TCR）。在一些實施例中，綴合物可以用於將至少一種嵌合抗原受體（CAR）遞送至T細胞。例如，在具體實施例中，綴合物可以用於將編碼CAR的mRNA遞送至T細胞。在一些實施例中，綴合物可以用於將至少一種CAR遞送至自然殺傷（NK）細胞。在一些實施例中，綴合物可以用於將至少一種CAR遞送至自然殺傷T（NKT）細胞。在一些實施例中，綴合物可以用於將至少一種CAR遞送至祖細胞，例如，T、NK或NKT細胞的祖細胞。在一些實施例中，用至少一種CAR修飾的細胞（例如，CAR-T細胞、CAR-NK細胞、CAR-NKT細胞）或用至少一種CAR修飾的細胞的組合（例如，CAR-NK/T細胞的混合物）用於治療如在通過引用以其整體併入本文的MacKay等人 Nat Biotechnol 38, 233-244 (2020)中的CAR療法的可靶向情形中鑒定的病症。在一些實施例中，免疫細胞包含對選自以下的腫瘤或病原體抗原具有特異性的CAR：AChR（胎兒乙醯膽鹼受體）、ADGRE2、AFP（甲胎蛋白）、BAFF-R、BCMA、CAIX（碳酸酐酶IX）、CCR1、CCR4、CEA（癌胚抗原）、CD3、CD5、CD8、CD7、CD10、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CLLI、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD61、CD64、CD68、CD70,CD74、CD99,CD117、CD123、CD133、CD138、CD44v6、CD267、CD269、CDS、CLEC12A、CS1、EGP-2（表皮糖蛋白-2）、EGP-40（表皮糖蛋白-40）、EGFR（HER1）、EGFR-VIII、EpCAM（上皮細胞粘附分子）、EphA2、ERBB2（HER2、人表皮生長因子受體2）、ERBB3、ERBB4、FBP（葉酸結合蛋白）、Flt3受體、葉酸受體-a、GD2（神經節苷脂G2）、GD3（神經節苷脂G3）、GPC3（磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3）、GPI00、hTERT（人端粒酶反轉錄酶）、ICAM-1、整合素B7、白介素6受體、IL13Ra2（白介素-13受體30次單元α-2）、κ輕鏈、KDR（激酶插入結構域受體）、LeY（Lewis Y）、L1CAM（LI細胞粘附分子）、LILRB2（白細胞免疫球蛋白樣受體B2）、MARTI、MAGE-A1（黑色素瘤相關抗原A1）、MAGE-A3、MSLN（間皮素）、MUC16（粘蛋白16）、MUCI（粘蛋白I）、KG2D配體、NY-ESO-1（癌症-睾丸抗原）、PRI（蛋白酶3）、TRBCI、TRBC2、TFM-3、TACI、酪胺酸酶、存活素、hTERT、癌胚胎抗原（h5T4）、p53、PSCA（前列腺幹細胞抗原）、PSMA（前列腺特異性膜抗原）、hROR1、TAG-72（腫瘤相關糖蛋白72）、VEGF-R2（血管內皮生長因子R2）、WT-1（腎母細胞瘤蛋白）以及HIV（人類免疫缺陷病毒）、乙型肝炎、丙型肝炎、CMV（巨細胞病毒）、EBV（EB病毒）、HPV（人乳頭瘤病毒）的抗原。
在一些實施例中，將如本文所述的綴合物離體或體外投予至免疫細胞，例如T細胞、NK細胞、NKT細胞或祖細胞，以遞送治療性有效載荷（例如，基因修飾系統），然後將細胞遞送至患者。在一些實施例中，將免疫細胞（例如，T細胞、NK細胞、NKT細胞或祖細胞）離體或體外修飾，然後遞送至患者。在一些實施例中，通過本文提及的方法之一遞送核酸（例如，DNA或RNA，如mRNA），並且在患者體內修飾免疫細胞（例如，T細胞、NK細胞、NKT細胞或祖細胞）。
在某些實施例中，靶向部分是T細胞靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv），其結合選自以下的T細胞抗原：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD28、CD137、CD45、T細胞受體（TCR）β、TCR-α、TCR-α/β、TCR-γ/δ、PD1、CTLA4、TIM3、LAG3、CD18、IL-2受體、CD11a、TLR2、TLR4、TLR5、IL-7受體、or IL-15受體。
在一些實施例中，將如本文所述的綴合物離體或體外投予至HSC（例如，LT-HSC）或HSC祖細胞以遞送治療性有效載荷（例如，基因修飾系統），然後將細胞遞送至患者。在一些實施例中，將如本文所述的綴合物在體內投予至HSC（例如，LT-HSC）或HSC祖細胞以遞送治療性有效載荷（例如，基因修飾系統）。在一些實施例中，將HSC（例如，LT-HSC）或HSC祖細胞離體或體外修飾，然後遞送至患者。在一些實施例中，將HSC（例如，LT-HSC）或HSC祖細胞在患者體內修飾。
在某些實施例中，靶向部分是HSC靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv），其結合選自CD90和CD117的HSC抗原。
可以將如本文所公開的綴合物引入細胞、組織和多細胞生物體中。在一些實施例中，將系統或系統的組分經由機械手段或物理手段遞送至細胞。
在一些實施例中，將本文所述的綴合物遞送至來自以下的組織或細胞：大腦、小腦、腎上腺、卵巢、胰腺、甲狀旁腺、垂體、睾丸、甲狀腺、乳腺、脾、扁桃體、胸腺、淋巴結、骨髓、肺、心肌、食道、胃、小腸、結腸、肝、唾液腺、腎、前列腺、血液或其他細胞或組織類型。在一些實施例中，本文所述的綴合物用於治療疾病，如癌症、炎性疾病、感染性疾病、遺傳缺陷或其他疾病。癌症可以是大腦癌症、小腦癌症、腎上腺癌、卵巢癌、胰腺癌、甲狀旁腺癌、垂體癌、睾丸癌、甲狀腺癌、乳腺癌、脾癌、扁桃體癌、胸腺癌、淋巴結癌、骨髓癌、肺癌、心肌癌、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸癌、肝癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、血液癌症或者其他細胞或組織類型的癌症，並且可以包括多種癌症。
在一些實施例中，將本文所述的綴合物通過腸內投予（例如，口服、直腸、胃腸、舌下、唇下或頰投予）投予。在一些實施例中，將本文所述的綴合物系統通過腸胃外投予（例如，靜脈內、肌內、皮下、真皮內、硬膜外、大腦內、腦室內、表皮、鼻、動脈內、關節內、海綿體內、眼內、骨內輸注、腹膜內、鞘內、子宮內、陰道內、膀胱內、血管周圍或透粘膜投予）投予。在一些實施例中，將本文所述的綴合物通過局部投予（例如，透皮投予）投予。
在一些實施例中，本文所述的綴合物用於治療疾病、障礙或病症。在一些實施例中，本文所述的綴合物或其組分或部分用於治療表1-表6的任一個中所列的疾病、障礙或病症。在一些實施例中，本文所述的綴合物用於治療造血幹細胞（HSC）疾病、障礙或病症，例如，如表1中所列。在一些實施例中，本文所述的綴合物用於治療腎臟疾病、障礙或病症，例如，如表2中所列。在一些實施例中，本文所述的綴合物用於治療肝臟疾病、障礙或病症，例如，如表3中所列。在一些實施例中，本文所述的綴合物用於治療肺疾病、障礙或病症，例如，如表4中所列。在一些實施例中，本文所述的綴合物用於治療骨骼肌疾病、障礙或病症，例如，如表5中所列。在一些實施例中，本文所述的綴合物用於治療皮膚疾病、障礙或病症，例如，如表6中所列。
表 1- 表 6 ：特定適應證
表 1：HSC
疾病 受影響的基因
腎上腺腦白質營養不良(CALD) ABCD1
α-甘露糖苷貯積症 MAN2B1
範科尼貧血 FANCA；FANCC；FANCG
戈謝病 GBA
球狀細胞腦白質營養不良(克拉伯病) GALC
噬血細胞性淋巴組織細胞增生症 PRF1；STX11；STXBP2；UNC13D
惡性嬰兒石骨症-常染色體隱性石骨症 TCIRG1；涉及許多基因
異染性腦白質營養不良 ARSA；PSAP
MPS 1S(施艾氏症候群) IDUA
MPS2 IDS
MPS7 GUSB
粘脂質貯積症II GNPTAB
尼曼-皮克病A和B SMPD1
尼曼-皮克病C NPC1
龐貝病 GAA
鐮狀細胞病(SCD) HBB
泰-薩克斯病 HEXA
地中海貧血 HBB
表 2：腎臟
疾病 受影響的基因
先天性腎病症候群 NPHS2
胱胺酸病 CTNS
表 3：肝臟
疾病 受影響的基因
急性間歇性卟啉症 HMBS
阿拉日耶症候群 JAG1
α-1抗胰蛋白酶缺乏症 SERPINA1
胺甲醯磷酸合成酶I缺乏症 CPS1
瓜胺酸血症I ASS1
克-納症候群 UGT1A1
法布裡病 LPL
家族性乳糜微粒血症症候群 GLA
戈謝病 GBE1
GSD1a G6Pase
GSD IV GBA
血紅素A F8
血紅素B F9
HoFH LDLRAP1
甲基丙二酸血症 MMUT
MPS II IDS
MPS III IIIa型：SGSH IIIb型：NAGLU IIIc型：HGSNAT IIId型：GNS S
MPS IV IVA型：GALNS IVB型：GLB1
MPS VI ARSB
MSUD Ia型：BCKDHA Ib型：BCKDHB II型：DBT
OTC缺乏症 OTC
多囊肝病 PRKCSH
龐貝病 GAA
原發性高草酸尿症1 AGXT(用於CRISPR的HAO1或LDHA)
進行性家族性肝內膽汁淤積1型 ATP8B1
進行性家族性肝內膽汁淤積2型 ABCB11
進行性家族性肝內膽汁淤積3型 ABCB4
丙酸血症 PCCB；PCCA
威爾遜氏病 ATP7B
表 4 ：肺
疾病 受影響的基因
α-1抗胰蛋白酶缺乏症 SERPINA1
囊性纖維化 CFTR
原發性纖毛運動障礙 DNAI1
原發性纖毛運動障礙 DNAH5
原發性肺動脈高壓I BMPR2
表面活性蛋白B(SP-B)缺乏症(肺表面活性物質代謝功能障礙1) SFTPB
表 5：骨骼肌
疾病 受影響的基因
貝克肌營養不良 DMD
貝克肌強直 CLCN1
貝特萊姆肌病 COL6A2
中央核肌病，X連鎖(肌管性) MTM1
先天性肌無力症候群 CHRNE
杜氏肌營養不良 DMD
埃-德二氏肌營養不良，AD LMNA
肢帶型肌營養不良2A CAPN3
肢帶型肌營養不良，2D型 SGCA
表 6：皮膚
疾病 受影響的基因
隱性營養不良性大皰性表皮松解症(Hallopeau-Siemens) COL7A1
交界型大皰性表皮松解症 LAMB3
表皮松解性魚鱗病 KRT1；KRT10
家族性良性天皰瘡 ATP2C1
片層狀魚鱗病/非大皰性先天性魚鱗病樣紅皮病(ARCI) TGM1
內瑟頓症候群 SPINK5
IV. 治療性有效載荷
本文所述的綴合物（靶向性LNP）可以用於將有效載荷（例如，包含治療劑）遞送至細胞，如但不限於免疫細胞（例如，T細胞）或HSC（例如，LT-HSC）或HSC祖細胞。
在一些實施例中，有效載荷是一種或多種核酸。在一些實施例中，有效載荷是一種或多種RNA分子。在一些實施例中，有效載荷是mRNA（例如，編碼酶的mRNA）。在一些實施例中，RNA分子是非編碼RNA（ncRNA）。在一些實施例中，有效載荷是RNA範本（例如，用於反轉錄的RNA範本，例如，靶標引發的反轉錄（TPRT））。在其他實施例中，有效載荷是siRNA或微小RNA（miRNA）。在其他實施例中，有效載荷包括用於CRISPR-Cas系統的指導RNA。在其他實施例中，有效載荷是tRNA。在其他實施例中，有效載荷是反義寡核苷酸（ASO）。在其他實施例中，有效載荷是DNA分子，例如DNA質體、封閉端DNA（ceDNA）或小環狀DNA（例如，微環或奈米質體）。核酸有效載荷可以是線性的、環狀的、共價封閉的、單鏈的、雙鏈的或雜合的RNA/DNA分子。在其他實施例中，有效載荷是小分子。在一些實施例中，有效載荷是肽或蛋白質。在一些實施例中，本文公開的綴合物可以包含兩種或更多種有效載荷，例如選自RNA（如mRNA、ncRNA、指導RNA、siRNA、miRNA）、ASO、DNA載體、小分子、肽或蛋白質。
本文所述的綴合物（靶向性LNP）可以用於將目的治療劑遞送至細胞，如但不限於免疫細胞（例如，T細胞）、HSC或HSC祖細胞。在一些實施例中，綴合物（靶向性LNP）含有作為治療劑的有效載荷。在一些實施例中，治療劑可以是治療性肽或蛋白質、包含治療劑的核酸或編碼治療劑的核酸。在一些實施例中，治療劑可以是基因藥物（例如，用於基因療法或基因編輯），其中治療劑能夠修飾、改變受試者中的細胞（如但不限於免疫細胞（如T細胞）、HSC（例如，LT-HSC）或HSC祖細胞）的基因組DNA或實現所述基因組DNA的變化。在一些實施例中，治療劑是基因治療劑或基因編輯劑。在一些實施例中，治療劑是如本文所述的基因修飾多肽。在一些實施例中，治療劑是如本文所述的基因修飾系統。
在一些實施例中，治療劑可以是肽或蛋白質（如酶）或者編碼肽或蛋白質（例如，酶）的核酸（例如，mRNA或DNA）。在一些實施例中，酶可以是或包含核酸酶、重組酶、整合酶、轉座酶、反轉錄轉座酶、解旋酶、轉錄酶、聚合酶、反轉錄酶、脫胺酶、甲基化酶、去甲基化酶或連接酶或者可以具有其酶促活性的組合。在一些實施例中，治療劑可以是肽或蛋白質或者用作置換基因療法的編碼肽或蛋白質的核酸。在一些實施例中，治療劑可以是肽或蛋白質，或者編碼肽或蛋白質的核酸以用於修飾或改變受試者的細胞（如但不限於免疫細胞（如T細胞）、HSC或HSC祖細胞）的基因組或表觀基因組。在一些實施例中，治療劑可以包含用於修飾或改變受試者的細胞（如但不限於免疫細胞（如T細胞）、HSC或HSC祖細胞）的基因組或表觀基因組的系統的一種或多種組分。在一些實施例中，用於修飾或改變受試者的細胞的基因組或表觀基因組的系統包含一種或多種蛋白質、一種或多種核酸（例如，RNA和/或DNA）或其組合。在一些實施例中，治療劑可以是融合蛋白，例如包含核酸酶（例如，核酸內切酶如Cas9或其功能部分）和蛋白質結構域的融合蛋白，所述蛋白質結構域包含重組酶、整合酶、轉座酶、反轉錄轉座酶、解旋酶、轉錄酶、聚合酶、反轉錄酶、脫胺酶、甲基化酶、去甲基化酶或連接酶活性。
在一些實施例中，治療劑可以是用於修飾或改變細胞（如但不限於免疫細胞（如T細胞）、HSC或HSC祖細胞）的基因組或表觀基因組的核糖核蛋白（RNP）複合物的一種或多種組分。例如，在一些情況下，治療劑可以是蛋白質或編碼蛋白質的核酸（例如，mRNA）和/或用於將蛋白質引導至基因組或表觀基因組中的特定位置的RNA分子（例如，gRNA或包含gRNA的RNA），其中蛋白質能夠作為核酸酶、重組酶、整合酶、轉座酶、解旋酶、轉錄酶、聚合酶、反轉錄酶、脫胺酶、甲基化酶、去甲基化酶或連接酶或其組合來修飾或改變基因組或表觀基因組。
在某些實施例中，治療劑包括核酸酶（例如，核酸內切酶）或編碼核酸酶的核酸（例如，核酸內切酶）。在一些實施例中，核酸酶切割DNA以產生雙鏈斷裂，從而導致在DNA（例如，基因組DNA）中引入插入和/或缺失（插入缺失）突變。在某些實施例中，核酸酶是切口酶（即，其切割DNA的單鏈）。在某些實施例中，使核酸酶突變，使得其無活性或包含降低的核酸酶活性。在一些實施例中，核酸酶是CRISPR-Cas蛋白。在一些實施例中，核酸酶是重組核酸酶。在一些實施例中，核酸酶是限制性核酸內切酶、兆核酸酶、歸巢核酸內切酶、鋅指核酸酶（ZFN）或轉錄啟動因子樣效應物核酸酶（TALEN）。
在一些實施例中，本公開文本的綴合物（靶向性LNP）可以用於將基因編輯組分遞送至細胞中。在一些實施例中，本文所述的綴合物可以用於將包含CRISPR-Cas系統或其組分的治療劑遞送至細胞中。在一些實施例中，治療劑包括1類（I型、III型或IV型）CRISPR-Cas蛋白或編碼CRISPR-Cas蛋白的核酸。在一些實施例中，治療劑包括2類（II型、V型或VI型）CRISPR-Cas蛋白或編碼CRISPR-Cas蛋白的核酸。在一些實施例中，治療劑包括CRISPR-Cas9系統或編碼CRISPR-Cas9系統的一種或多種組分的核酸。在一些實施例中，治療劑包括CRISPR-Cas12系統（例如，Cas12a系統）或編碼CRISPR-Cas12系統的一種或多種組分的核酸。在一些此類實施例中，本文所述的綴合物可以包含兩個RNA分子，如包含指導RNA（gRNA）的RNA和編碼CRISPR-Cas蛋白的mRNA。在一些實施例中，Cas是Cas9或Cas12a。在一些實施例中，Cas是Cas9。在一些實施例中，Cas是Cas12a。在一些實施例中，gRNA是單指導RNA（sgRNA）。在一些實施例中，LNP（例如靶向性LNP）包含由Cas9或編碼Cas9的mRNA組成或者含有Cas9或編碼Cas9的mRNA的有效載荷。
在一些實施例中，治療劑包括以下CRISPR-Cas蛋白之一或編碼以下CRISPR-Cas蛋白之一的核酸（例如，mRNA）：Cas9（例如，dCas9和nCas9）、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h或Cas12i。在一些實施例中，治療劑包括化膿鏈球菌（S. pyogenes）或嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）Cas9或其功能片段或者編碼Cas9或其功能片段的核酸。在一些實施例中，治療劑包括Cas9序列，例如，如通過引用併入本文的Chylinski, Rhun和Charpentier (2013) RNA Biology 10:5, 726-737中所述。在實施例中，治療劑包括以下CRISPR-Cas蛋白之一或編碼以下CRISPR-Cas蛋白之一的核酸（例如，mRNA）：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9（例如，Csn1或Csx12）、Cas10、Cas10d、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csx11、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、II型Cas效應蛋白、V型Cas效應蛋白、VI型Cas效應蛋白、CARF、DinG、Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、SpCas9(K855A)、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1、超精確Cas9變體（HypaCas9）、SpRYCas9、其同源物、其修飾形式或工程化形式和/或其功能片段。在實施例中，Cas9包含一個或多個取代，例如選自H840A、D10A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A和D1127A。在實施例中，Cas9包含選自以下的位置處的一個或多個突變：D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986和/或A987，例如，選自D10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A和/或D986A的一個或多個取代。在一些實施例中，治療劑包括Cas（例如，Cas9）或編碼來自以下的Cas或其片段或變體的核酸：潰瘍棒狀桿菌（Corynebacterium ulcerans）、白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheria）、棲蚜蠅螺原體（Spiroplasma syrphidicola）、中間普雷沃菌（Prevotella intermedia）、臺灣螺原體（Spiroplasma taiwanense）、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）、波羅的海貝爾氏菌（Belliella baltica）、扭曲冷彎麴菌（Psychroflexus torquis）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、英諾克李斯特菌（Listeria innocua）、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）、腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）、化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）或金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
在一些實施例中，治療劑包括Cpf1結構域或編碼其的核酸，例如包含一個或多個取代，例如在位置D917、E1006A、D1255或其任何組合，例如選自D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A和D917A/E1006A/D1255A。
在一些實施例中，治療劑包括spCas9、spCas9-VRQR、spCas9-VRER、xCas9、saCas9、saCas9-KKH、spCas9-MQKSER、spCas9-LRKIQK或spCas9-LRVSQL或者編碼其的核酸。
在一些實施例中，治療劑包括Cas9切口酶（nCas9），如化膿鏈球菌nCas9，例如其中Cas9包含位置D10或H840處的胺基酸取代，例如D10A或H840A；或編碼Cas9切口酶（nCas9）的核酸（例如，mRNA）。在一些實施例中，治療劑包括無催化活性或「死亡」Cas9（dCas9），如化膿鏈球菌Cas9，例如其中Cas9包含位置D10和H840處的胺基酸取代，例如D10A和H840A；或編碼無催化活性的Cas9（dCas9）的核酸（例如，mRNA）。
在某些實施例中，治療劑包括脫胺酶（如胞嘧啶脫胺酶或腺嘌呤脫胺酶）或編碼脫胺酶的核酸（例如，mRNA）。在一些實施例中，本文所述的綴合物（靶向性LNP）將脫胺酶遞送至靶細胞以在細胞的DNA（例如，基因組DNA）中產生取代突變。在一些實施例中，治療劑是如本領域所述的鹼基編輯器，例如胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）或腺嘌呤核鹼基編輯器（ABE）。包含脫胺酶或編碼脫胺酶的核酸的治療劑的例子可以在以下文獻中找到：通過引用以其整體併入本文的PCT申請號PCT/US 2014/038359、PCT/US 2017/045381、PCT/US 2018/024208、PCT/US 2018/056146和PCT/US 2019/050112，包括序列表和其中的序列。
在某些實施例中，治療劑可以用於表觀基因組編輯。在一些實施例中，治療劑包括甲基化酶和/或去甲基化酶，或編碼去甲基化酶和/或甲基化酶的一種或多種核酸（例如，一種或多種mRNA）。在一些實施例中，治療劑使DNA（例如，基因組DNA）和/或組蛋白去甲基化。在一些實施例中，治療劑使DNA（例如，基因組DNA）和/或組蛋白甲基化。在一些實施例中，治療劑可以用於改變基因的轉錄（例如，經由使用CRISPRoff和/或CRISPRon的基因沈默或基因啟動）。在一些實施例中，治療劑可以包含DNA甲基轉移酶結構域或編碼DNA甲基轉移酶結構域的核酸。在一些實施例中，治療劑可以包含KRAB結構域、DNMT3A結構域、DNMT3B結構域、DNMT1結構域、DNMMT3L結構域或SETDB1結構域，或者可以包含編碼KRAB結構域、DNMT3A結構域、DNMT3B結構域、DNMT1結構域、DNMMT3L結構域、SETDB1結構域、VP64結構域、p65結構域、TET1結構域、TET2結構域或TET3結構域的核酸。包括甲基化酶和/或去甲基化酶或編碼甲基化酶和/或去甲基化酶的核酸的治療劑的例子可以在以下文獻中找到：通過引用以其整體併入本文的PCT申請號PCT/IB 2015/058202、PCT/US 2021/035244和PCT/US 2021/035937，包括其中的序列表和序列。
在某些實施例中，治療劑可以用於改變或修飾核酸序列，例如，以通過誘導靶標引發的反轉錄（TPRT）將插入缺失或取代引入DNA（例如，基因組DNA）中從而將異源序列插入DNA中。在某些實施例中，治療劑（即，有效載荷）可以是基因修飾蛋白、編碼基因修飾蛋白的核酸或基因修飾系統，如本文所述。在一些實施例中，治療劑可以是基因修飾多肽或編碼基因修飾多肽的核酸。在一些實施例中，治療劑可以是與基因修飾多肽一起使用的範本RNA。在一些實施例中，通過本文所述的綴合物（靶向性LNP）遞送的治療劑是基因修飾系統的一種或多種組分，例如基因修飾多肽（或編碼基因修飾多肽的核酸）和/或與基因修飾多肽一起使用的範本RNA。在一些實施例中，治療劑包括或源自反轉錄轉座子或可移動遺傳元件（MGE）。在一些實施例中，治療劑可以是異源基因修飾多肽或編碼異源基因修飾多肽的核酸，如本文所述。在一些實施例中，治療劑可以是與異源基因修飾多肽一起使用的RNA。在一些實施例中，通過本文所述的綴合物（靶向性LNP）遞送的治療劑是異源基因修飾系統的一種或多種組分，例如異源基因修飾多肽（或編碼異源基因修飾多肽的核酸）和/或與異源基因修飾多肽一起使用的RNA。在一些實施例中，治療劑是融合蛋白，例如與反轉錄酶融合的核酸內切酶蛋白，例如與反轉錄酶融合的核酸內切酶切口酶。在一些實施例中，治療劑是融合蛋白，例如與聚合酶融合的核酸內切酶蛋白，例如與聚合酶融合的核酸內切酶切口酶。
治療劑的其他例子可以在以下文獻中找到：通過引用以其整體併入本文的PCT申請號PCT/US 2020/023730、PCT/US 2021/031439、PCT/US 2020/055156、PCT/US 2021/052097、PCT/US 2022/012054、PCT/US 2022/023175、PCT/US 2022/074628和PCT/US 2023/065947，包括其中的序列表和序列。
在一些實施例中，基因修飾系統的mRNA組分包含重組核酸酶或編碼核酸酶的核酸，所述核酸酶例如CRISPR-Cas核酸酶（如切口酶）、限制性核酸內切酶、兆核酸酶、歸巢核酸內切酶、鋅指核酸酶（ZFN）或轉錄啟動因子樣效應物核酸酶（TALEN）。
在某些實施例中，治療劑可以是小分子。在某些實施例中，治療劑可以是siRNA或miRNA。
基因修飾系統
本文所述的綴合物（靶向性LNP）可以被配製為包含基因修飾系統的一種或多種組分或編碼所述組分的一種或多種核酸。因此，在一些實施例中，有效載荷包括基因修飾系統或者編碼基因修飾系統的組分的一種或多種核酸。例如，在一些實施例中，有效載荷包括範本RNA和編碼基因修飾多肽的mRNA。在一些實施例中，根據本公開文本製備的綴合物用於向靶細胞遞送能夠將異源目標序列（例如，編碼CAR的序列）插入細胞（例如，免疫細胞，如T細胞）的基因組中的系統。在一些實施例中，系統包含：(A) 基因修飾多肽或編碼基因修飾多肽的核酸，其中基因修飾多肽包含：(i) 核酸內切酶和/或DNA結合結構域；和 (ii) 反轉錄酶（RT）結構域，其中 (i) 和 (ii) 兩者均源自反轉錄轉座子（例如，源自相同的反轉錄轉座子或不同的反轉錄轉座子）；以及 (B) 範本RNA（或編碼範本RNA的DNA），其包含 (i) 結合多肽的序列和 (ii) 異源目標序列。在一些實施例中，基因修飾多肽充當基本上自主的蛋白質機器，其能夠在基本上不依賴於宿主機制的情況下將範本核酸序列整合到靶DNA分子（例如，在哺乳動物宿主細胞中，如宿主細胞中的基因組DNA分子）中。所述異源目標序列可以包括例如編碼序列、調節序列、基因表現單元。
在一些實施例中，本文描述的系統相對於各種早期系統可以具有許多優點。例如，本公開文本描述了能夠將異源核酸的長序列插入基因組中的反轉錄轉座酶。此外，本文所述的反轉錄轉座酶可以將異源核酸插入基因組中的內源位點，如rDNA基因座。這與Cre/loxP系統形成對照，所述系統需要第一步驟是插入外源loxP位點，然後第二步驟是將目的序列插入loxP位點。
基因修飾多肽
非長末端重複（LTR）反轉錄轉座子是一類在真核基因組中廣泛存在的可移動遺傳元件。它們包括例如無嘌呤/無嘧啶核酸內切酶（APE）類型、限制酶樣核酸內切酶（RLE）類型和Penelope樣元件（PLE）類型。
APE類反轉錄轉座子由兩個功能結構域構成：核酸內切酶/DNA結合結構域和反轉錄酶結構域。APE類反轉錄轉座子的例子可以例如在PCT申請號PCT/US 2019/048607、US 2023/0235358、US 2023/0242899和US 2020/0109398的表1中找到，將這些申請的披露內容通過引用以其整體（包括PCT/US 2019/048607和US 2020/0109398的表1中提及的序列表和序列）併入本文。
RLE類由三個功能結構域構成：DNA結合結構域、反轉錄結構域和核酸內切酶結構域。RLE類反轉錄轉座子的例子可以例如在PCT申請號PCT/US 2019/048607、US 2023/0235358、US 2023/0242899和US 2020/0109398的表2中找到，將這些申請的披露內容通過引用以其整體（包括PCT/US 2019/048607和US 2020/0109398的表2中提及的序列表和序列）併入本文。
非LTR反轉錄轉座子的反轉錄酶結構域通過結合RNA序列範本並將其反轉錄到宿主基因組的靶DNA中而起作用。RNA序列範本具有與反轉錄轉座酶特異性結合的3'非轉譯區以及通常含有編碼反轉錄轉座酶蛋白質的一個或多個開放閱讀框（「ORF」）的可變5'區。RNA序列範本還可以包含特異性結合反轉錄轉座酶的5'非轉譯區。
Penelope樣元件（PLE）不同於LTR和非LTR反轉錄轉座子兩者。PLE通常包含與APE和RLE元件的反轉錄酶結構域不同但與端粒酶和II型內含子的反轉錄酶結構域相似的反轉錄酶結構域，以及任選的GIY-YIG核酸內切酶結構域。
反轉錄轉座子的其他示例性類別包括而不限於RTE（例如，RTE-1_MD、RTE-3_BF和RTE-25_LMi）、CR1（例如，CR1-1_PH）、Crack（例如，Crack-28_RF）、L2（例如，L2-2_Dre和L2-5_GA）和Vingi（例如，Vingi-1_Acar）反轉錄轉座子。
如本文所述，此類反轉錄轉座子的元件可以被功能模組化和/或修飾以靶向、編輯、修飾或操縱靶DNA序列，例如以通過反轉錄將目標（例如，異源）核酸序列插入靶基因組（例如，哺乳動物基因組）中。在一些實施例中，基因修飾系統包含：(A) 多肽或編碼多肽的核酸，其中多肽包含 (i) 反轉錄轉座酶反轉錄酶結構域，和 (ii) 含有DNA結合功能性的反轉錄轉座酶核酸內切酶結構域；以及 (B) 範本RNA（或編碼範本RNA的DNA），其包含 (i) 結合多肽的序列和 (ii) 異源目標序列。基因修飾系統的RNA範本元件通常對於多肽元件是異源的，並提供待插入（反轉錄）到宿主基因組中的目標序列。
在一些實施例中，基因修飾系統包含PCT公開案WO/2021/178717、US 2023/0235358和US 2023/0242899的表10、表11、表X、表Z1、表3A或3B的任一個中列出的元件的反轉錄轉座酶序列，由於這些公開案涉及來自反轉錄轉座子的結構域，因此將它們通過引用併入本文。
在一些實施例中，由表7的元件編碼的胺基酸序列是由表7中列出的元件的全長序列編碼的胺基酸序列，或者與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列。在一些實施例中，表7中列出的元件的全長序列可以包含如本文所述的反轉錄轉座子的5' UTR、多肽編碼序列或3' UTR中的一個或多個（例如，全部）。在一些實施例中，表7的胺基酸序列是由表7中列出的元件的全長序列編碼的胺基酸序列，或者與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列。在一些實施例中，表7的元件的5' UTR包含表7中列出的元件的全長序列的5' UTR，或者與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列。在一些實施例中，表7的元件的3' UTR包含表7中列出的元件的全長序列的3' UTR，或者與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列。
表7中還指示了從中獲得核酸序列的宿主生物體以及由核酸序列的開放閱讀框編碼的多肽記憶體在的結構域的清單。
在某些實施例中，基因修飾多肽進一步包含異源蛋白質結構域。
表7提供了包含反轉錄轉座子元件的基因修飾多肽，其被改變以提高整合到人基因組中的效率。通過一致性映射改進反轉錄轉座酶多肽以重新獲得最佳胺基酸序列。將與同源反轉錄轉座酶一起使用的範本分子映射回其宿主基因組，並使用側翼基因組DNA闡明靶位點基序。當可檢測時，將來自元件的內源出現的側翼基因組DNA的保守序列基序與人基因組比對，並且新序列源自人基因組，作為5'或3'「人同源臂」。在一些實施例中，本文所述的範本RNA包含第一同源結構域和第二同源結構域中的一者或兩者，所述第一同源結構域包含表7的5'人同源臂的序列（或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列），所述第二同源結構域包含表7的3'人同源臂的序列（或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列）。
表 7 ：具有改進的整合活性的反轉錄轉座酶系統
元件 生物體 結構域 靶基序 一致性優化的蛋白質序列 5' 人同源臂 3' 人同源臂 5' UTR 3' UTR
L2-2_DRe (1) 斑馬魚 RT和EN TGAGCACGGTAGCATTAGTCGa (SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 31) MCFLIPVVTNTRKTREVRCRRNPHNLRSIHVSTISQLSLSVGLWNCQSAVNKADFITSIATYSDYNLMALTETWLRPEDTATHATLSANFSFSHTPRQTGRGGGTGLLISKEWKFTLIPSLPTISSFEFHAVTIIHPFYINVVVIYRPPGKLGHFLDELDVLLSSFSNFATPLLVLGDFNIYVDKPQAADFQTLLASFDLKRAPTSATHKSGNQLDLIYTRHCFTDQTIVTPLQISDHFLLSLNIHITPEPPHTPTLVTFRRNLRSLSPNRLSTIVSDSLPPSRKLTALDSNSATNTLCSTLASCLDRLCPLASRPARASPPAPWLSDALREHRSKLRAAERIWRKTKNPAHLLTYQTLLSSFSAEVTSAKQTYYRLKINNATNPRLLFKTFSSLLYPPPPPASSTLTTDDFATFFCTKTAKISAQFAAPTTNTQDTTPTPHTLTSFSQLSESEVSKLVLSSHATTCPLDPIPSHLLQAISPAVIPTLTHIINTSLDSGLFPTTFKQARVTPLLKKPNLDHTLLENYRPVSLLPFMAKILEKVVFNQVLDFLTQNNLMDNKQSGFKKGHSTETALLSVVEDLRLAKADSKSSVLILLDLSAAFDTVNHQILLSTLESLGVAGTVIQWFRSYLSDRSFRVSWRGEVSNLQHLNTGVPQGSVLGPLLFSIYTSSLGPVIQRHGFSYHCYADDTQLYLSFHPDDPSVPARISACLLDISHWMKDHHLQLNLAKTEMLVVSANPTLHHNFSIQMDGATITASKMVKSLGVTIDDQLNFSDHISRTARSCRFALYNIRKIRPFLSEHAAQLLVQALVLSKLDYCNSLLAGLPANSIKPLQLLQNAAARVVFNEPKRAHVTPLLVRLHWLPVAARIKFKTLMFAYKVTSGLAPSYLHSLLQIYVPSRNLRSVNERRLVVPSQRGKKSLSRTLTLNLPSWWNELPNCIRTAESLAIFKKRLKTQLFSLHFTS (SEQ ID NO: 32) GTTTCGCGTCGTCCGCCTCAGTTTCGGCCCTTGTTTTGACTCGGGAGGCGTGTCCAAACGCCAGGTAACCACTATATAGTGAGCACGGTAGCATTAGTCG A (SEQ ID NO: 34) GCAGGAGAAGCACTTTAGCAGCATCTAGAACAGCAGCCTGTAAGTACATTTAAGATTTGTTTCAGTTGTTGTGTATGGTTTGAGGACTTGTTTCCAGCTGTTTGTGTAAAGTTGTAGGACATTTAAACTTGCTTTCAGTTGTGTATAATACTAGAAGTTGTTTAGCCACTGTTTCCTTGGTTACTATAAGAGCTTGTGTAGCGAACGCAGACGCGGTTCGCGTCGTCCGCCTCAGTTTCGGCCCTTGTTTTGACTCGGGAGGCGTGTCCAAACGCCAGGTAACCACTATATAGTGAGCACGGTAGCATTAGTCGGCAGGAGAAGCACTTTAGCAGCATCTAGAACAGCAGCCTGTAAGTACATTTAAGATTTGTTTCAGTTGTTGTGTATGGTTTGAGGACTTGTTTCCAGCTGTTTGTGTAAAGTTGTAGGACATTTAAACTTGCTTTCAGTTGTGTATAATACTAGAAGTTGTTTAGCCACTGTTTCCTTGGTTACTATAAGAGCTTGTGTAGCGAACGCAGACGCGGTTCGCGTCGTCCGCCTCAGTTTCGGCCCTTGTTTTGACTCGGGAGGCGTGTCCAAACGCCAGGTAACCACTATATAGTGAGCACGGTAGCATTAGTCGGCAGGAGAAGCACTTTAGCAGCATCTAGAACAGCAGCCTGTAAGTACATTTAAGATTTGTTTCAGTTGTTGTGTATGGTTTGAGGACTTGTTTCCAGCTGTTTGTGTAAAGTTGTAGGACATTTAAACTTGCTTTCAGTTGTGTATAATACTAGAAGTTGTTTAGCCACTGTTTCCTTGGTTACTATAAGAGCTTGTGTAGCGAACGCAGACGCGGTTCGCGTCGTCCGCCTCAGTTTCGGCCCTTGTTTTGACTCTCGAGGCGTGTCCAGCTGAATTCAATCAGCTAGTGCTTTGGGGTTATATAAACAACTAGTTCACCGCGGCAGCGGTCGCGGCAGCCTCGTGTGAAGACCGACGAGGGTAAAGACCATCGACTCTACCTGCGCGACTCCACCGAGCAAAGACACCGACAAAGCACTTGAGTACTTTACTGTATTGTTTTACTTTACACTTATTTTTTGTTGTCAGTGCACTTTTATT (SEQ ID NO: 35) TAATCTGCAATTGCCTCTCTGAATATCACACTAACTGTACCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAAAWACTACTAATACTTCCCTTCTTAGACTTTACAGACCTGAAACTTGCCTATAGCACTTATTCATTGTTGCTCTTAGTTGTGTAAATTGCTTCCTTGTCCTCATTTGTAAGTCGCTTTGGATAAAAGCGTCTGCTAAATGACTAAATGTAAATGTAAATGT
L2-2_Dre (2) 斑馬魚 RT和EN TGAGCACGGTAGCATTAGTCGa (SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 36) MCFLIPVVTNTRKTREVRCRRNPHNLRSIHVSTISQLSLSVGLWNCQSAVNKADFITSIATYSDYNLMALTETWLRPEDTATHATLSANFSFSHTPRQTGRGGGTGLLISKEWKFTLIPSLPTISSFEFHAVTIIHPFYINVVVIYRPPGKLGHFLDELDVLLSSFSNFATPLLVLGDFNIYVDKPQAADFQTLLASFDLKRAPTSATHKSGNQLDLIYTRHCFTDQTIVTPLQISDHFLLSLNIHITPEPPHTPTLVTFRRNLRSLSPNRLSTIVSDSLPPSRKLTALDSNSATNTLCSTLASCLDRLCPLASRPARASPPAPWLSDALREHRSKLRAAERIWRKTKNPAHLLTYQTLLSSFSAEVTSAKQTYYRLKINNATNPRLLFKTFSSLLYPPPPPASSTLTTDDFATFFCTKTAKISAQFAAPTTNTQDTTPTPHTLTSFSQLSESEVSKLVLSSHATTCPLDPIPSHLLQAISPAVIPTLTHIINTSLDSGLFPTTFKQARVTPLLKKPNLDHTLLENYRPVSLLPFMAKILEKVVFNQVLDFLTQNNLMDNKQSGFKKGHSTETALLSVVEDLRLAKADSKSSVLILLDLSAAFDTVNHQILLSTLESLGVAGTVIQWFRSYLSDRSFRVSWRGEVSNLQHLNTGVPQGSVLGPLLFSIYTSSLGPVIQRHGFSYHCYADDTQLYLSFHPDDPSVPARISACLLDISHWMKDHHLQLNLAKTEMLVVSANPTLHHNFSIQMDGATITASKMVKSLGVTIDDQLNFSDHISRTARSCRFALYNIRKIRPFLSEHAAQLLVQALVLSKLDYCNSLLAGLPANSIKPLQLLQNAAARVVFNEPKRAHVTPLLVRLHWLPVAARIKFKALMFAYKVTSGLAPSYLLSLLQIYVPSRNLRSVNERRLVVPSQRGKKSLSRTLTLNLPSWWNELPNCIRTAESLAIFKKRLKTQLFSLHFTS (SEQ ID NO: 32) GTTTCGCGTCGTCCGCCTCAGTTTCGGCCCTTGTTTTGACTCGGGAGGCGTGTCCAAACGCCAGGTAACCACTATATAGTGAGCACGGTAGCATTAGTCG (SEQ ID NO: 33) a (SEQ ID NO: 37) GCAGGAGAAGCACTTTAGCAGCATCTAGAACAGCAGCCTGTAAGTACATTTAAGATTTGTTTCAGTTGTTGTGTATGGTTTGAGGACTTGTTTCCAGCTGTTTGTGTAAAGTTGTAGGACATTTAAACTTGCTTTCAGTTGTGTATAATACTAGAAGTTGTTTAGCCACTGTTTCCTTGGTTACTATAAGAGCTTGTGTAGCGAACGCAGACGCGGTTCGCGTCGTCCGCCTCAGTTTCGGCCCTTGTTTTGACTCGGGAGGCGTGTCCAAACGCCAGGTAACCACTATATAGTGAGCACGGTAGCATTAGTCGGCAGGAGAAGCACTTTAGCAGCATCTAGAACAGCAGCCTGTAAGTACATTTAAGATTTGTTTCAGTTGTTGTGTATGGTTTGAGGACTTGTTTCCAGCTGTTTGTGTAAAGTTGTAGGACATTTAAACTTGCTTTCAGTTGTGTATAATACTAGAAGTTGTTTAGCCACTGTTTCCTTGGTTACTATAAGAGCTTGTGTAGCGAACGCAGACGCGGTTCGCGTCGTCCGCCTCAGTTTCGGCCCTTGTTTTGACTCGGGAGGCGTGTCCAAACGCCAGGTAACCACTATATAGTGAGCACGGTAGCATTAGTCGGCAGGAGAAGCACTTTAGCAGCATCTAGAACAGCAGCCTGTAAGTACATTTAAGATTTGTTTCAGTTGTTGTGTATGGTTTGAGGACTTGTTTCCAGCTGTTTGTGTAAAGTTGTAGGACATTTAAACTTGCTTTCAGTTGTGTATAATACTAGAAGTTGTTTAGCCACTGTTTCCTTGGTTACTATAAGAGCTTGTGTAGCGAACGCAGACGCGGTTCGCGTCGTCCGCCTCAGTTTCGGCCCTTGTTTTGACTCTCGAGGCGTGTCCAGCTGAATTCAATCAGCTAGTGCTTTGGGGTTATATAAACAACTAGTTCACCGCGGCAGCGGTCGCGGCAGCCTCGTGTGAAGACCGACGAGGGTAAAGACCATCGACTCTACCTGCGCGACTCCACCGAGCAAAGACACCGACAAAGCACTTGAGTACTTTACTGTATTGTTTTACTTTACACTTATTTTTTGTTGTCAGTGCACTTTTATT (SEQ ID NO: 38) TAATCTGCAATTGCCTCTCTGAATATCACACTAACTGTACCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAAAWACTACTAATACTTCCCTTCTTAGACTTTACAGACCTGAAACTTGCCTATAGCACTTATTCATTGTTGCTCTTAGTTGTGTAAATTGCTTCCTTGTCCTCATTTGTAAGTCGCTTTGGATAAAAGCGTCTGCTAAATGACTAAATGTAAATGTAAATGT
RTE-1_MD (1) 灰色短尾負鼠(Monodelphis domestica) L1-EN、RT、ZF NA (SEQ ID NO: 39) MDSTAHPNQGRGLEKVSQTLPALQTPGQHTAAGGSSPLSGRNQRKNTKKLLLGAWNIRTLLDRENTPRPERRTALIGKELARYNIDIAALSETRLPEEGSLSEPTTGYTFFWKGRASNEDRIHGVGLAIKTSLLKQLPDLPVGISERLMKIRLPLSKDRYATIISAYAPTLTSTEETIEQFYSDLSAVLHSVPTNDKLILLGDFNARVGQDHERWKGVLGKHGVGKMNNNGLLLLSKCSEFELTITNTVFRMANKYKTTWMHPRSKQWHLIDYIIVRRRDIQDVKITRAMRGAECWTDHRLVRATLQMRIAPRHPKRAQTVRAFYNVSRLRDPSYLQTFQSCLDDKLSAKGPLTGSSTEKWNQFRDAVKETSKAVLGPKQRNHQDWFDENNTAIEDLLSKKNKAFMEWQNNPNSAPKKDRFKSLQATAQREIRKMQDRWWEKKAEEIQRFADMKNYKQFFSALKTVYGPLKPTTTPLLSSDGDTLIKDKKGISNRWKEHFSQLLNRPSSVDQSALDQIPQNRTIEQLDVPPSIEEVQKAIKQMSAGKAPGKDGIPTEVYKALNGKALQAFHIVLTSIWEEEDMPPELRDASIVALYKNKGSRAACDNYRGISLLSTAGKILARVILNRLLSSVSEQNLPESQCGFRPDRSTIDMVFTVRQMQEKCLEQNLSLYIVFIDLTKAFDTVNRDALWVILSKLGCPAKFVKLIQLFHVDMTGEVLSGGETSDRFNISNGVKQGCVLAPVLFNLFFTQVLRHAVMDLDLGVYIKYRLDGSLFDLRRLTAKTKTTERLILEALFADDCALMAHQENHLQTIVDRFSTATKLFGLTISLSKTEVLFQPAPGRPTNQPCITIDGTQLSNVNTFKYLGSTIANDGSLDHEINARIQKASQALGRLRCKVLQHRGVSTATKLKVYNAVVLSSLLYGCETWTLYRKHMKQLEQFHQRSLRSIMRIRWQDRITNQEVLDRANSTSIEVMVLKTQLRWSGHVIRMDPQRIPRQVFYGELSAGLRKQGRPKKRFKDQLKSNLKWAGITPKQLELAASDRSSWRTHINHAATTFEDERRRRLAAARERRHQATTAPPVTTGVPCPMCHKLCASAFGLQSHMRVHRR (SEQ ID NO: 40) gggtgtatggggtgctcagggaggggtagtatctctggtatggagggcttgtcgtgccctcctagggcagctctccagcctctgacccccacctgacacccagctctcacttgtggctcccagtagctgctagcatgtggcagcggccacaccccgggcaacggcttcgacaggccggctaaaccttgtgagggtagccatcgggtcatcgacccctggtgaaccagggctttgctcacccagcatgtgaagactgcttcggctgaacagacggaagaaaccaataagaaggttcaacggctgagagggcgacgcagcaaagcactgtggagtgcttagggcgtgttggagcacaaaggacaacacggccatccaatgcagctgaggaagtctccagatgtaacaatttttcgtgccactggacccaggcttccaacgccgagagagtgggactgtctctgtgcatcggcttttccacttaaatctctttcacgcacaagtatctttgtgcacactcatctatcctaaccccgtccaccctcttcaagacctgcggcgatgggggagtggcgacgcaacaggtggaggtgaccactggcagttgtagtcacgatcctgcacgtaggcggcccacggaccagtggtcgctcggccctgtgggcagcagggacgttcggcagcatcctgggcgactgagcagccctctctag (SEQ ID NO: 41) tgaaactgcacaaagacaatagtcattctcgatcaccgagagactaccact
RTE-1_MD (2) 灰色短尾負鼠 L1-EN、RT、ZF NA (SEQ ID NO: 42) MDSTAHPNQGRGLEKVSQTLPALQTPGQHTAAGGSSPLSGRNQRKNTKKLLLGAWNIRTLLDRENTPRPERRTALIGKELARYNIDIAALSETRLPEEGSLSEPTTGYTFFWKGRASNEDRIHGVGLAIKTSLLKQLPDLPVGISERLMKIRLPLSKDRYATIISAYAPTLTSTEETIEQFYSDLSAVLHSVPTNDKLILLGDFNARVGQDHERWKGVLGKHGVGKMNNNGLLLLSKCSEFELTITNTVFRMANKYKTTWMHPRSKQWHLIDYIIVRRRDIQDVKITRAMRGAECWTDHRLVRATLQMRIAPRHPKRAQTVRAFYNVSRLRDPSYLQTFQSCLDNKLSAKGPLTGSSTEKWNQFRDAVKETSKAVLGPKQRNHQDWFDENNTAIEDLLSKKNKAFMEWQNNPNSAPKKDRFKSLQATAQREIRKMQDRWWEKKAEEIQRFADMKNYKQFFSALKTVYGPLKPTTTPLLSSDGDTLIKDKKGISNRWKEHFSQLLNRPSSVDQSALDQIPQNRSIEQLDVPPSIEEVQKAIKQMSAGKAPGKDGIPTEVYKALNGKALQAFHIVLTSIWEEEDMPPELRDASIVALYKNKGSRAACDNYRGISLLSTAGKILARVILNRLLSSVSEQNLPESQCGFRPDRSTIDMVFTVRQMQEKCLEQNLSLYIVFIDLTKAFDTVNRDALWVILSKLGCPAKFVKLIQLFHVDMTGEVLSGGETSDRFNISNGVKQGCVLAPVLFNLFFTQVLRHAVMDLDLGVYIKYRLDGSLFDLRRLTAKTKTTERLILEALFADDCALMAHQENHLQTIVDRFSTATKLFGLTISLSKTEVLFQPAPGRPTNQPCITIDGTQLSNVNTFKYLGSTIANDGSLDHEINARIQKASQALGRLRCKVLQHRGVSTATKLKVYNAVVLSSLLYGCETWTLYRKHMKQLEQFHQRSLRSIMRIRWQDRITNQEVLDRANSTSIEVMVLKTQLRWSGHVIRMDPQRIPRQVFYGELSAGLRKQGRPKKRFKDQLKSNLKWAGITPKQLELAASDRSSWRTHINHAATTFEDERRRRLAAARERRHQATTAPPVTTGVPCPMCHKLCASAFGLQSHMRVHRR (SEQ ID NO: 43) gggtgtatggggtgctcagggaggggtagtatctctggtatggagggcttgtcgtgccctcctagggcagctctccagcctctgacccccacctgacacccagctctcacttgtggctcccagtagctgctagcatgtggcagcggccacaccccgggcaacggcttcgacaggccggctaaaccttgtgagggtagccatcgggtcatcgacccctggtgaaccagggctttgctcacccagcatgtgaagactgcttcggctgaacagacggaagaaaccaataagaaggttcaacggctgagagggcgacgcagcaaagcactgtggagtgcttagggcgtgttggagcacaaaggacaacacggccatccaatgcagctgaggaagtctccagatgtaacaatttttcgtgccactggacccaggcttccaacgccgagagagtgggactgtctctgtgcatcggcttttccacttaaatctctttcacgcacaagtatctttgtgcacactcatctatcctaaccccgtccaccctcttcaagacctgcggcgatgggggagtggcgacgcaacaggtggaggtgaccactggcagttgtagtcacgatcctgcacgtaggcggcccacggaccagtggtcgctcggccctgtgggcagcagggacgttcggcagcatcctgggcgactgagcagccctctctag (SEQ ID NO: 44) tgaaactgcacaaagacaatagtcattctcgatcaccgagagactaccact
Vingi-1_Acar (1) 安樂蜥(Anolis carolinensis) DNA酶樣，RT NA (SEQ ID NO: 45) MDEYQRSLSRPLLTIMSINIEGLSLAKEELLAKMSEDISCDILCIQETHRDITMRRPKILGMQLAVERPHRQYGSAIFVRSGVAISATSLTEVNNIEILSVELDSCTVSSLYKPPGADFYFTPPTSCHNHEAHFVVGDFNSHSCVWGYDEDDRNGEAVLTWADNSRMSLLHDSKLPPSFNSGRWKRGYNPDLIFVKESISHQCTKRVLNPIPNTQHRPICCVAYAAVRPKSVPFRRRYNFNKANWTKFTETLEAAISDIEPSIENYDLFVEAVKRSSRLSIPRGCRTSYLPGLNEESLNQLQEYLRLFQENPYSDGTIAAGQKLSTALANAKKDRWIELLENLDMSKSSRKAWQLLRRLDSDPLVNPGHANVTPDQIAHQLIQNGKTNCSRIKMKINRVPELETHQLSSPLNLKELREAIKRCKTGKAPGLDDLMMEQIKHLGPKAENWLLKFYNQCLAHKQIPRAWRKTKIIAILKPGKDASNARNYRPISLLCHLYKVYERMLLNRLGPVIEPKLIAQQAGFRPGKNCTGQILHLTEHIEEGYEKGCITGTVFVDLTAAYDTVQHRKMLHKVYHITRDFDFTKTVQTLLENRSFYVEFQGQKSRWRRQKNGLPQGSVLAPTLFNIFTNDQPQPPLTKSFIYADDLGLTTQAKDFETVEKQLTNALKDLSSYYKENHLKPNPAKTQVCAFHLRNREANRKLKVTWEGQELEHCFHPKYLGVTLDRTLTYRKHCMNTKHKVAARNNILRKLTGSAWGADPQVIRTSALALSFSTAEYACPVWHKSAHAKQVDIALNETCRIITGCLKPTPVDKLYKLAGIAPPDVRREVAANGERKKVEHCESHPLHDYHPPPTRLKSRKGFMRTTTPLDVPPATARVSLWAAKPGNSNWMAPQEGLPPGANQEWATWKSLNRLRSGVGRSKDNLARWHYLEESSTLCDCGAEQTTQHMYACPQCPASCTEEELFKATDNAVAVARFWSKTI (SEQ ID NO: 46) GGGGGACACGGAAAGAGCCTCCCCGAAGATTGAGTGAATTCAGTCGGGCGTCCCCTGGGCAACGTTTCTTGTAAGCGGCCGATCTTTCCACCCCAAAAGCATTGGATGA (SEQ ID NO: 47) TAGTTGCTTGTGATTTCTTTTCTTTTTTATTTTATTTCCATTATTTGAAATGTATTTGCTGTACCAATGCTTTTGACACGAAATAAATAAA
Vingi-1_Acar (2) 安樂蜥(Anolis carolinensis) DNA酶樣，RT NA (SEQ ID NO: 48) MDEYQRSLSRPLLTIMSINIEGLSLAKEELLAKMSEDISCDILCIQETHRDITMRRPKILGMQLAVERPHRQYGSAIFVRSGVAISATSLTEVNNIEILSVELDSCTVSSLYKPPGADFYFTPPTSCHNHEAHFVVGDFNSHSCVWGYDEDDRNGEAVLTWADNSRMSLLHDSKLPPSFNSGRWKRGYNPDLIFVKESISHQCTKRVLNPIPNTQHRPICCVAYAAVRPKSVPFRRRYNFNKANWTKFTETLEAAISDIEPSIENYDLFVEAVKRSSRLSIPRGCRTSYLPGLNEESLNQLQEYLRLFQENPYSDGTIAAGQKLSTALANAKKDRWIELLENLDMSKSSRKAWQLLRRLDSDPLVNPGHANVTPDQIAHQLIQNGKTNCSRIKMKINRVPELETHQLSSPLNLKELREAIKRCKTGKAPGLDDLMMEQIKHLGAKAENWLLKFYNQCLAHKQIPRAWRKTKIIAILKPGKDASNARNYRPISLLCHLYKVYERMLLNRLGPVIEPKLIAQQAGFRPGKNCTGQILHLTEHIEEGYEKGCITGTVFVDLTAAYDTVQHRKMLHKVYHITRDFDFTKTVQTLLENRSFYVEFQGQKSRWRRQKNGLPQGSVLAPTLFNIFTNDQPQPPLTKSFIYADDLGLTTQAKDFETVEKQLTNALKDLSSYYKENHLKPNPAKTQVCAFHLRNREANRKLKVTWEGQELEHCFHPKYLGVTLDRTLTYRKHCMNTKHKVAARNNILRKLTGSAWGADPQVIRTSALALSFSTAEYACPVWHKSAHAKQVDIALNETCRIITGCLKPTPVDKLYKLAGIAPPDVRREVAANGERKKVEHCESHPLHGYHPPPTRLKSRKGFMRTTTPLDVPPAAARVSLWAAKPGNSNWMAPQEGLPPGANQEWATWKSLNRLRSGVGRSKDNLARWHYLEESSTLCDCGAEQTTQHMYACPQCPASCTEEELFKATDNAVAVARFWSKTI (SEQ ID NO: 49) GGGGGACACGGAAAGAGCCTCCCCGAAGATTGAGTGAATTCAGTCGGGCGTCCCCTGGGCAACGTTTCTTGTAAGCGGCCGATCTTTCCACCCCAAAAGCATTGGATGA (SEQ ID NO: 50) TAGTTGCTTGTGATTTCTTTTCTTTTTTATTTTATTTCCATTATTTGAAATGTATTTGTTGTAGCAATGCTTTTGACACGAAATAAATAAA
CR1-1_PH 夏威夷明鉤蝦(Parhyale hawaiensis) DNA酶I樣，RT NA (SEQ ID NO: 51) MLYTIFLVYGILCFFFVYFCIYLYITVYLCFLFFLFLLLCGDVESNPGPGRARGCRLLYCNIRGLHANLAELDFVSRGVDVVCCSETLVAGRRHDAELALAGFQSPFRRLCGSGPGFRGMAVYVRSGFCAYRQSVHECACHEIIVVRVCGRLNNYYLFSLYRSPATDDSLYDCLLTAMASIQSTDPKAAFVFVGDVNAHHRDWLGSASPTDCHGVAALDFCTLSSCVQLVRGSTHIAGNCLDLVMTDVPDLMTVTVGSPIGSSDHSHLVVSLDLNQVVPVVDTRRVVFVKSRANWVAITRAVRTLPWRQIIHSEDPVSELNDLTVSILERFVPKRTILVRSRDKPWFDDQCRLAFEAKQAAYRAWRRSRDRTLWQTYVDRRAEAKRVYEEAQRRLRQRSRESLLSIDHPHRWWSELKGSVFGAEPSLPPLVGPGGGIITDPLARAELLSAHFDGKQSRDVIALPHGCHPEPRLTSLAFRSGAIKVLLEGLDPYGGVDPVGMFPLFYKQLADVLAPKLAVIFRRLIRLGNFPRCWRTGNITPIPKGPVSPYVANYRPITLTPILSKVFEKLIAGKLGRFAEVTGLLPAGQFAYRIGLGCCDALLSVSHHLQSALDCRSEARLVQLDFSAAFDRVNHRGLLYKLESFGVGGRVLSIIRDFVSERTQSVSVDGVLSASVGVVSGVPQGSVLGPLLFVLYTSDMFSSLENTLINYADDSTLMAVIPAPRLRDAVAQSLNRDLSRISAWCSAWSMKLNASKTKSMIISRSRTLVPQHPQLEIDDTLLQESSSLEILGVVFDEKLTFEPHIRRLVSRASTKIGLLRKVNSVFGDSQVARRCFYAFLLPVLEYCSPVWASAADTHLRLLDRLVSSASRLCADNDLVNLSHRRRVAELCMFYKVYNNERHWLYSSLPALKVFGRETRAACGAHSFTLEAVRCRTNQFCRCFVPWSAKVWNLLPASAFGRIGLQAFKSAVNGFLLDFL (SEQ ID NO: 52) gcgtggcctgcgcgttatcaggccgcccccattgtccggccaccggacgcctctttgtttgtatgagctggctttgggtttggggctctgggtagcccctgagttggaggaaatgccactctaaaggcggatgagacctcttttggtccaacggcatccctgagaggagatgaacaggctggtgccatagctgggtactcagtcttccgcagtctgctcctctctctcttccatcaggtagtaccacctgatgctcttttcctttcctttctcttcttcttcttttcggccaaagcctgtactggtgatggcagggtctggggcgcgtagatagctggccgctttcgtagctatcgttactgtcgatttgtttttgctttatt (SEQ ID NO: 53) tagcagcgttttgggcttcccggtgttgcaagatgcttcatttgggttgtattacctgtccgtgggagctcaagcgtgaagttttaataataataataa
Crack-28_BF 佛羅里達文昌魚(Branchiostoma floridae) RT和EN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNCNNGTNNNNANNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNnntnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncnnnnnnnnnnnnnnnnnngcnnnnnnnntnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnntnnnnnnnnnnnannnnnnnnn (SEQ ID NO: 54) (SEQ ID NO: 55) MWEKATSNVHLQSGTWITQNAYSVKINPGLSGVRLIGRSTTCTERTERTLNLLVCATLLLAGDVSPNPGPDTGGLPVWRKGIVYAFYNVVSLPRHLDEIQQLLLRNTRIHVLGLNETRLSDSIPDSSVDINGYTLYRTDRDRQGGGVGVYVKQTIASQRRCELEQEDLEVCCVEIKPEKARKTLLTCVYRPPTSGPDWRNSAESLVHKLNQTAEKENADVAIMGDFNSDLLTSTQAMSSVEFLMGLYQLVPVIREPTRITEKTESCIDNIFVSNPDRYKSSASVAWGPSDHNLILTCAKAGSEAGAAHRCEYRSYKLYTQQSFIDSLKSVRWDTVFDCTDVSEAWNAFKDIFLNVADEHAPLRTKTARENNRPAPWMTDTVKNMMGRRDAARRKAIRTKDVQDWDTYRSLRNQTTSIIRKEKKSHFATAVSEAKGDQSLMWKIINSFTGKSKSTKRVQKLLRADNTSMSDPGEMAQEFNDYFTSCASRLTDGMPDSEEDPLRHIPDSTTKFSFDCVEETEVLNELQKLKTKKATGLDKIPAKLLKDSAPVVAKPLAHIFNLSLASGEVPSDWKEAQITPVHKSGSCADVGNYRPVSVLSVTSKVMEKLVCNQVTRYLTRCKLLTTHQSGFRRHHSTATAVQKVVEDITSGYNCSKVTVALFLDLRKAFDSVNHEIMLSKLKKFGFDSDAMKWFTSYLSERLQCTCLQGQYSSKTRVSCGVPQGSVLGPLLFCLYVNDLPNVIQKCSIHMYADDTVLYYSAVSVKVCEETVSMDMKRVVKWLSENRLLLHPDKTKSMLFGLPQKLKHAGTTVNITDGVNVYEQVDSFTYLGITLDPALRWAAHVQKITKKLLSGLGAMGRARAFVTNEVLKTMYQTLLLAHLEYCATAWLPSLAQGNKTLMLQLDRLVNRAARLITGHKLRDHVTVDNLRAEAGIDSVRKRTEITTLVTVFKTIRGKAPAYLASLFKWEAPPTMSVRPTRSEVKRLRDYDPHLLWCPPARVIAFRNSLQSYGPFLWNSLPLKQRQLLSLRTFKKFIEN (SEQ ID NO: 56) AGCCCTAGTCCCT (SEQ ID NO: 57) AACTTGATCTGGCTGATGCTCCGTAGTCTGGACTTTGATATTGGATAATTTTATTATGTATTGTATATGTGCTATGTGTACTTTGTACTTTTATGTCCAGGATTACCTGAAAAGCAGGCCGATTTCCGGCCTGAGATGTAATTACTGGTAAAATAAATAAAGTGAAGTGAA
L2-5_GA 三刺魚(Gasterosteus aculeatus) RT和EN，信號肽 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn (SEQ ID NO: 58) MRRLLLLFLIMCLTPSPVPVRISSRRYYRPRARSALYRNLSSLSYPTRSTHVQHLVTGGLWNCQSATRKADFISGFAIQQSLDFLALTETWITPENTSTPAALSSAFSFSHTPRPTGRGGGTGLLISPKWSFSLYPLPPSTPLSFEFHAVTITHPVQLTIIVLYRPPGSLGHFLEELDILLSNFPENGPPLILLGDFNIQTEKSSDLLHLLSSFALSLSPSPPTHKAGNHLDYIFTRNCSTTNLSVTPLHVSDHFFISYSLPLSITNKPPSLTNSIPARRNIRSLSPSSLASSVLSALPSTDSFSLLHPNAAAETLLSTLSSSLDSLCPLTTRRTGKSPPAPWLSQPVRAMRATMRASERRWRKYKRPDDLLEFQSLLSSFSASISAAKSSFYQSKIESSFSNPKKLFSIFSNLLEPPTPPPPSTLLPGDFVNYFTKKIADIRSSFSNPPPTSRVPPTSPLSPSLSSFTALSPNQILTLVTSARPTTCPLDPIPSHLLQSIAPDLLPFLTCLINNALSSGCFPNSLKEARVNPLLKKPTLNPSEENNYRPVSLLPFLSKTLERAIFNQLSSYLHCNNLLDPHQSGFKAGHSTETALLAVSEQLHTARAASLSSVLILLDLSAAFDTVNHQILISSLQELGVTGSALSLLSSYLDGRTYRVTWRGSVSEPCPLTTGVPQGSVLGPLLFSLYTNSLGAVIRSHGFSYHSYADDTQLILSFPHSDTQVAARISACLTDISQWMSAHHLKINPDKTELLLFPGKDSLTQDLTVNFGNSVLTPTSTAKNLGVTLDSQLSLTPNITATTRSCRYTLYNIRRIRPLLTQKAAQVLIQALVISRLDYCNSLLAGLPATAIRPLQLIQNAAARLVFNLPKFSHTTPLLRSLHWLPVAARIQFKTLVLTYHAVNGSGPAYIQDMVKPYIPTRTLRSASAKLLVPPSLRAKHSTRSRLFAVLAPKWWNELSEDTRTAESLHIFRRKLKTHLFRLYLD (SEQ ID NO: 59) CAGTGTGCATCTCTTCTACAAGGCCACCAGACATCCAGGCGACCTGAAATCGGACTAAGTATCTCTTTCTTTAAACCAAGCTAGTCTGCTAAATTTGCTGTTGATTCTAGTGTCTTAAGTTAATTTGATTGCTGATTTGCTTTAGTTTTTGTCGTCTCACGGCCAGTTCTCTTTGTTTGAAGTTATCTTGGTTGCTAGTTTGCTCAAGCTCTTTCAGTCTTTTAGTGCCAGTTTGTGTTCTAGATTCTACTATTAAGTTAACTGCCAGTGTGCCCTCCTAACTCTGCTAGGTTTTGACCTGATCTAAGTCTGTTTTGCCTTGTTTTCTGAAGCAAATAAGACTTGTATCCTTAAACTCTCATTTTGTCAAAACACCACATGGTGTTTGTTCACTGATTAGGGTGTCAAGCTATTGGTGCTTTGCATTTTGAGGAGTTTCTGTCGAGGCCAATCGACCTTTTGTCTCCTAAACGACGGGGGAGCGGCCAGCGCAGCCGCAGCCGACTTCCACTAACGAGGGAGTATTTAACTAGAAATCGTGGGAAGCGTTAGCTTATCCTCGCAGCACGAAGACGAGCAGAACAAAGACCAGGGAGTCTTTCGTGGAGTCAAGACGAGAGACAAAGACCAGGGAGTCTTTCGTGGAGTCAAGACGAGCAGAACAAAGACAAGGGAGTCTTTCGTGGCAGTCTTCGGGGCGGCTGA (SEQ ID NO: 60) TAAAGACTAACAAATTGTAGCACTTAAATTGTACTTGTAACGTCACTCATCTATAGCAAATTGTAAATTGGCTTATTTGAGGAAATTGCACTTTCTTGTTTCTTGTTCTCCTGAGTTTGTACCCTATGGTTGAATGCACTTATTGTACGTCGCTTTGGATAAAAGCGTCAGCTAAATGACATGTAATGTAATGTAATGTAATG
RTE-3_BF 佛羅里達文昌魚 RT和EN NTNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNTNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNnnnnnnnnnnnntnnnnnnnnnnnnnngngnnnnnntnnnnncnnnnnnnntnnnnnnnnnnnnnntnnnnnnnnnnnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnn (SEQ ID NO: 61 (SEQ ID NO: 62) MSGTPRVAFDSGKDLRNPIGQSPPALSRAAPGQLGTDPSRSACFIGCLELRVLLDKWIVCRAPDKQESKEKRRQKTQPIRIGSWNVRTMRTGLSDDLTVIEDIRKTAAIDRELYRLNIDIVALQETRLPDSGSLKEDSYTFFWQGKGMEETREHGVGFAVRNTLLHMIEPPTGGTERIITLRLSTHEGPVNLLCVYAPTLQATSEVKDQFYGQLDSAIKKIPVSEHIFILGDFNARVGTDQESWQTVLGHHGIGKMNENGQRLLELCCYHNLCVTNTFFQNKAIHKASWRHPRSQRWHQLDLVITRRTSLNSVCNTRAYHSADCDTDHSLIAARIKLRPKKLHHMKKKGQPKIDVSKTMLPDRNQKFLECLEGTLNNIQPQDAEHRWETLSKTIYSAAAQSYGKKERKNTDWFEAYISELEPVMDTKRKALVSYKQNPSSQNLQALKAARQEAQRASRRCANNYWLLLSERIQLASATGDIRRMYEGIKQATGKPIKKSAPLKAKSGEIITDKDKQMARWVEHYLDIYSTENSVSQDALDNIEDFSVLAELDADPTIEELSKAIDSMSNGKAPGEDNIPAEIIKSGKSVLLEPLHELLRLCWKEGKVPQSMRNSKIVTLYKNKGDRTDCNSYRGISLLSIVGKVFAKVVLTRLQVLADRVYPESQCGFRAERSTTDMIFSVRQLQEKCREQQRPLYIAFIDLTKAFDLVSRRGLFQLLRKIGCPPQLLDIIISFHEDMKGVVSFDGETSEPFAIRSGVKQGCVLAPTLFGIFFSLLLKSAFGHSTQGVHLHTRSDGKLFNLARLRAKTKVRSVLIRDMLFADDAALVAHVEDELQQLLNQFAHACSEFALTISIKKTVVMGQDVPQPPVVTIGSEVLEVTDHFTYLGSTVTSNLSLDKEIDRRIARAAGVMTKLGTRVWNNSHLTLNTKLEVYRSCVLSTLLYGSETWTTYAKQENRLESFHLRCLRRILGISWRDRVPNTTVLERSCSLSIHLLLCQRRLRWLGHVSRMKDGRIPKDILFGELATGKRPVGRPALRFRDVCKRDLKLTDIDPASWEQIAADRNRWRHTVKDGLAKGQERRTEHLESRRRKRKEKPQQGNPSAFICPNCGRDCHARIGLQSHSRRCQPP - (SEQ ID NO: 63) TCTGTAAATGGCTGTGTGATGCGTCTAGTGTGTAGGCGTAGCGGTAGTGTGCTTGCCACTTCTCGCTTTCAGCCCTCACCGCTGGCTAGCGGAGCTGCATGCAGCACTGCGAAAAGAGAGCCGAGTGCGTAAGTCTCTCCTGCCAGTACATAGCCTCTCCACAGCAAGTCCCCATTGCAGTGCCTCCTCGTGGCTACAGACGGAAACTGGGCACCGTAAGGCCCCAGGCTAAACTGCAGGGAGCTCGGAGGAGGTCTGGCCCCCAGACGCACGGCATGCATGGCCCACCGGCGTGTGGACACGCCCTGATGCCTGCGAACCAGACCCCCAGCTATGGGCAAATAGCACGGGTAGACGGAGCTCGTCAGCCTTGGATGGCAGTTCGTCTAGGGGAAGGAAAACCCTGATTCAAAAACCTCCGCTGCCTTGCGGCTATACCCAGTCCTGGGAAAGGCTACGGGAGTTAACCCAGAGAGAAAATCCGGAGTGGAGTACGTGAGGCGGTTGGCTGTCAAACTCTGTCATCCTTCCGGCAACTCCTGCAGCCAAACCAACGCCAAGTGTCACGCCTCGCGTTCCCTTGGACCACGTCGGTGAGGTCGAGAGGGGGGTCCTGTTGTGTTTTTGGGCAGCGCAGGTCCTCCATAAACCTGCCCAGGCTAGCGCTCTGGAGAGGCCACTCCAGTCGCCCCCATCACTGGGGGTGAGAAACAAACCGGGAGACAGCAGTTTACGGGTTATAAGTCCTTGCTAAATTGACGTAA (SEQ ID NO: 64) TGACCTGATACAGAGCGCTACCATCATCTGGAAAGATGGAAGGATGCCTACTAC
RTE-25_LMi 東亞飛蝗(Locusta migratoria) RT和EN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNCNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNnnnnnnnnnnnannnnnnnnnnnnnantnntnnnnnnnnnnnnnnnnannnnnnnnnnnnngnnnnnnannnnntnnnnnnannnnnnnnnnnannnnnn (SEQ ID NO: 65) (SEQ ID NO: 66) MPRKNWNCGRRTGDEKRKMMFGCWNVQGISTKIDLLPAELDMFNIDVVVLSETKRKGKGEEELDNYVHIWSGVSKAVRAKAGVSIMIQKKWKKRITNWTFINERIITVEMTLFAREVVIIGVYAPTNDTKDKEKDAFWDTLRETIEKIPRRKELIIMGDMNGRVGIRESCKIVGKHGEAEYNDNGERLIDICAQFDLKITNTFFKHKDIHKYTWQQNTKELRSIIDYIIIRQTSSFKAADVRSYRGAQCGSDHYLVKMKSFWPWKNATNDTSNINKMNCSEKVQNVHFNIDSLQDESIRTFFKARMERTLDESFEGSTEEIYEYIKTKVKNVASEVLGIKENNPKRAAEWWSEEIETSVKEKRNAFVQWLNDKSEGTRSKYKEKKNEVEKKIRLAKNEAWERTCANVNSKLGFGRAKEAWSVLKALRQDTKGKSNLQLVTQKEWEEYFKKLLNEDRDEYLEEGTVEENEHHDDEILISESEVLQVLRTGKNGKSPGPGNINMEFLKYGGDKIVKLILQLFNKMLHGDSVPKEMKLGYISTIFKKGDRKICSNYRGICVTNTLMRIFGKIIKNKLEKNFRTQQEQCGFTAGRSCVDHIFTLRQILEKHREKSKNVGLIFIDLEKAYDTVPRKLLWRALHRANINTSLIKIIEQMYKDNICQVKIGNTLSQKFRTSKGLLQGCPMSPTLFKIYIDICLRTWSQKCNSMGLEIRDGVYLHHLLFADDQVVIAQDGEDANYMCNQLAIAYKNWGLKINYQKTEYLTNDPHELRIEGKKIKKVNTFCYLGSILETEGKSDSEINKRISSGRKVIGMLNSVLWSRNVMNRTKKIIYKSIFESAVLYGAETWTINQKHTKKLQALEMDFWRRSARISRKEKRRNTEVIKRMEIIERIDEVMDRKKLRWYGHVRRMEDTRIPKLVLEWQPEGRRRRGRPVTTWIKNVQLTMNRLGAEEEDTQDRHTWRNIVNN (SEQ ID NO: 67) CCCGTGTGGAGTTTGCTGGTCTTCCATCGGGCACCTCCCCAGGTGGCGGATAGGGGAATGCTCACCAGATATGGTGGGTACCGGGGAAATAAAATACCCGGGGTGGACCAAAACCAGCAACTGCTGCCTTGTAGTATGATATTGGCTTATCAAAGGCTAAAGGAAGAAAACCTTGAATACAAATTACCTGGTCCTCCAGGTTGGGGGTTGTGCAGTGGGCCAGCTCCTCACTCACATAAAAATATAAAATGCTAAAAAACCTAATAAT (SEQ ID NO: 68) TAGTGTAAAACCTTATGTACTAGGTGTATTCATTTCTGGGCGTATTAGTATGTTGGAGGTAAACCTCTGTAATGAGGACAATCTCAATAATAAAATAAAATAAA
反轉錄轉座子發現工具
作為隨時間反復移動的結果，基因組DNA中的轉座元件通常以串聯或穿插重複的形式存在（Jurka Curr Opin Struct Biol 8, 333-337 (1998)）。能夠識別此類重複的工具可以用於鑒定來自基因組DNA的新元件並用於填充資料庫，例如Repbase（Jurka等人 Cytogenet Genome Res 110, 462-467 (2005)）。用於鑒定可包含轉座元件的重複的一種這樣的工具是RepeatFinder（Volfovsky等人 Genome Biol 2 (2001)），其分析基因組序列的重複結構。可以使用另外的工具（例如Censor）進一步收集和分析重複（Kohany等人 BMC Bioinformatics 7, 474 (2006)）。Censor套裝軟體獲取基因組重複，並使用各種BLAST方法針對已知的轉座元件對它們進行注釋。可以使用全部框轉譯（all-frames translation）來生成一個或多個ORF以供比較。
用於鑒定轉座元件的其他示例性方法包括RepeatModeler2，其使基因組序列中的轉座元件的發現和注釋自動化（Flynn等人 bioRxiv (2019)）。這除了通過可用套裝軟體（如Censor）實現以外，還可以執行給定基因組或序列的全部框轉譯，並使用蛋白質結構域工具（如InterProScan）進行注釋，所述工具使用InterPro資料庫標記給定胺基酸序列的結構域（Mitchell等人 Nucleic Acids Res 47, D351-360 (2019)），從而允許鑒定包含與已知轉座元件相關的結構域的潛在蛋白質。
可以使用工具（如RTclass1）根據反轉錄酶結構域進一步分類反轉錄轉座子（Kapitonov等人 Gene 448, 207-213 (2009)）。
基因修飾系統的多肽組分
RT 結構域
在某些態樣，基因修飾系統的反轉錄酶結構域基於APE型或RLE型非LTR反轉錄轉座子或者PLE型反轉錄轉座子的反轉錄酶結構域。APE型、RLE型或PLE型反轉錄轉座子的野生型反轉錄酶結構域可以用於基因修飾系統中或可以被修飾（例如，通過一個或多個殘基的插入、缺失或取代）以改變對於靶DNA序列的反轉錄酶活性。在一些實施例中，反轉錄酶從其天然序列改變為具有改變的密碼子使用，例如被改進以用於人細胞。在一些實施例中，反轉錄酶結構域是來自不同LTR反轉錄轉座子、非LTR反轉錄轉座子或其他來源的異源反轉錄酶。在某些實施例中，基因修飾系統包含多肽，所述多肽包含RTE（例如，RTE-1_MD、RTE-3_BF和RTE-25_LMi）、CR1（例如，CR1-1_PH）、Crack（例如，Crack-28_RF）、L2（例如，L2-2_Dre和L2-5_GA）和Vingi（例如，Vingi-1_Acar）反轉錄轉座子的反轉錄酶結構域。
在某些實施例中，基因修飾系統包含多肽，所述多肽包含PCT公開號WO/2021/178717的表10、表11、表X、表Z1、表Z2或表3A或表3B中列出的反轉錄轉座子的反轉錄酶結構域。
在某些實施例中，基因修飾系統包含多肽，所述多肽包含表7中列出的反轉錄轉座子的反轉錄酶結構域。在一些實施例中，基因修飾系統的反轉錄酶結構域的胺基酸序列與反轉錄轉座子的反轉錄酶結構域的胺基酸序列（其DNA序列參見表7）至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%相同。例如，可以使用常規工具如基本局部比對搜索工具（BLAST），基於與其他已知反轉錄結構域的同源性來鑒定反轉錄酶結構域。在一些實施例中，反轉錄酶結構域被修飾，例如通過位點特異性突變。在一些實施例中，將反轉錄酶結構域工程化以結合異源範本RNA。
在一些實施例中，多肽（例如，RT結構域）包含RNA結合結構域，例如，與RNA序列特異性結合的RNA結合結構域。在一些實施例中，範本RNA包含被RNA結合結構域特異性結合的RNA序列。
在一些實施例中，RT結構域形成二聚體（例如，異二聚體或同二聚體）。在一些實施例中，RT結構域是單體的。在一些實施例中，RT結構域天然地作為單體或作為二聚體（例如，異二聚體或同二聚體）起作用。在一些實施例中，RT結構域天然地作為單體起作用。在一些實施例中，天然異二聚體RT結構域也可以作為同二聚體起作用。在一些實施例中，二聚體RT結構域表現為融合蛋白，例如，表現為同二聚體融合蛋白或異二聚體融合蛋白。在一些實施例中，系統的RT功能由多個RT結構域實現（例如，如本文所述）。在進一步的實施例中，多個RT結構域是融合的或分開的，例如，可以在同一多肽上或在不同的多肽上。
在一些實施例中，本文所述的基因修飾多肽包含RNA酶H結構域，例如，其中RNA酶H結構域可以是RT結構域的一部分。在一些實施例中，RT結構域（例如，如本文所述）包含RNA酶H結構域，例如內源RNA酶H結構域或異源RNA酶H結構域。在一些實施例中，RT結構域（例如，如本文所述）缺乏RNA酶H結構域。在一些實施例中，RT結構域（例如，如本文所述）包含已被添加、缺失、突變或替換為異源RNA酶H結構域的RNA酶H結構域。在一些實施例中，RNA酶H結構域的突變產生展現出較低RNA酶活性的多肽，如通過Kotewicz等人 Nucleic Acids Res 16(1):265-277 (1988)中所述的方法所測定，例如與不含突變且其他方面相似的結構域相比降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一些實施例中，RNA酶H活性被消除。
在一些實施例中，使RT結構域突變以與不含突變且其他方面相似的結構域相比增加保真度。例如，在一些實施例中，RT結構域中（例如，反轉錄酶中）的YADD（SEQ ID NO: 69）或YMDD（SEQ ID NO: 70）基序被YVDD替代。在實施例中，YADD（SEQ ID NO: 69）或YMDD（SEQ ID NO: 70）或YVDD（SEQ ID NO: 71）的替代導致反轉錄病毒反轉錄酶活性的更高保真度（例如，如Jamburuthugoda and Eickbush J Mol Biol 2011中所述）。
核酸內切酶結構域：
在一些實施例中，多肽包含核酸內切酶結構域（例如，異源核酸內切酶結構域）。在某些實施例中，在本文所述的基因修飾系統中可以使用APE型反轉錄轉座子的核酸內切酶/DNA結合結構域、RLE型反轉錄轉座子的核酸內切酶結構域或PLE型反轉錄轉座子的核酸內切酶結構域，或者可以修飾（例如，通過一個或多個殘基的插入、缺失或取代）這些結構域。在一些實施例中，核酸內切酶結構域或核酸內切酶/DNA結合結構域從其天然序列改變為具有改變的密碼子使用，例如被改進以用於人細胞。在一些實施例中，核酸內切酶元件是異源核酸內切酶元件。本文所述的基因修飾系統的核酸內切酶結構域的胺基酸序列可以與反轉錄轉座子的核酸內切酶結構域的胺基酸序列（其DNA序列參見PCT公開號WO/2021/178717的表X、表Z1、表Z2、表3A或表3B）至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%相同。
在某些實施例中，基因修飾系統包含多肽，所述多肽包含表7中列出的反轉錄轉座子的核酸內切酶結構域。在一些實施例中，基因修飾系統的核酸內切酶結構域的胺基酸序列與反轉錄轉座子的核酸內切酶結構域的胺基酸序列（其DNA序列參見表7）至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%相同。例如，可以使用工具如基本局部比對搜索工具（BLAST），基於與其他已知核酸內切酶結構域的同源性來鑒定核酸內切酶結構域。
在一些實施例中，基因修飾多肽具有經由核酸內切酶結構域切割DNA靶位點的功能。在一些實施例中，核酸內切酶結構域也是DNA結合結構域。在一些實施例中，核酸內切酶結構域也是範本核酸（例如，範本RNA）結合結構域。在某些實施例中，在本文所述的基因修飾系統中可以使用APE型反轉錄轉座子的核酸內切酶/DNA結合結構域或RLE型反轉錄轉座子的核酸內切酶結構域，或者可以修飾（例如，通過一個或多個殘基的插入、缺失或取代）這些結構域。
範本核酸結合結構域：
基因修飾多肽通常含有能夠與範本核酸（例如，範本RNA）締合的區域。在一些實施例中，範本核酸結合結構域是RNA結合結構域。在一些實施例中，RNA結合結構域是模組化結構域，其可以與含有特定特徵（例如結構基序，例如存在於非LTR反轉錄轉座子中的3' UTR中的二級結構）的RNA分子締合。在其他實施例中，範本核酸結合結構域（例如，RNA結合結構域）RNA結合結構域包含在反轉錄結構域內，例如，反轉錄酶來源的組分具有RNA偏好的已知特徵，例如，存在於非LTR反轉錄轉座子的3' UTR中的二級結構。
DNA 結合結構域：
在某些態樣，選擇、設計或構建本文所述的基因修飾多肽的DNA結合結構域以用於結合期望的宿主DNA靶序列。在某些實施例中，工程化反轉錄轉座子的DNA結合結構域是相對於天然反轉錄轉座子序列的異源DNA結合蛋白或結構域。在某些實施例中，異源DNA結合結構域是本文的表7或者PCT公開號WO/2021/178717的表X、表Z1、表Z2或表3A或表3B中所述的反轉錄轉座子的DNA結合結構域。在一些實施例中，可以使用工具如基本局部比對搜索工具（BLAST），基於與其他已知DNA結合結構域的同源性來鑒定DNA結合結構域。在仍其他實施例中，例如通過位點特異性突變修飾DNA結合結構域。在一些實施例中，DNA結合結構域從其天然序列改變為具有改變的密碼子使用，例如被改進以用於人細胞。
在實施例中，DNA結合結構域包含相對於野生型DNA結合結構域的一個或多個修飾，例如經由定向進化（例如，噬菌體輔助連續進化（PACE））的修飾。
在本發明的某些態樣，通過基因修飾系統整合的宿主DNA結合位點可以在基因中、在內含子中、在外顯子中、在ORF中、在任何基因的編碼區之外、在基因的調節區中、或在基因的調節區之外。在其他態樣，工程化反轉錄轉座子可以結合一個或多於一個宿主DNA序列。在其他態樣，工程化反轉錄轉座子可以具有低序列特異性，例如結合多個序列或缺乏序列偏好。
在一些實施例中，基因修飾系統用於編輯多個等位基因中的靶基因座。在一些實施例中，設計基因修飾系統以編輯特定等位基因。例如，基因修飾多肽可以針對這樣的特定序列，所述特定序列僅存在於一個等位基因上，例如包含與靶等位基因（例如，退火結構域）具有同源性但與第二同源等位基因不具有同源性的範本RNA。在一些實施例中，基因修飾系統可以改變單體型特異性等位基因。在一些實施例中，靶向特定等位基因的基因修飾系統優先靶向該等位基因，例如，對靶等位基因具有至少2、4、6、8或10倍偏好。
基因修飾系統的定位序列
在某些實施例中，基因修飾系統RNA進一步包含細胞內定位序列，例如核定位序列。
核定位序列可以是促進RNA輸入細胞核中的RNA序列。在某些實施例中，核定位信號位於範本RNA上。在某些實施例中，反轉錄轉座酶多肽被編碼在第一RNA上，並且範本RNA是分開的第二RNA，並且核定位信號位於範本RNA上而不位於編碼反轉錄轉座酶多肽的RNA上。雖然不希望受理論束縛，但在一些實施例中，編碼反轉錄轉座酶的RNA主要靶向細胞質以促進其轉譯，而範本RNA主要靶向細胞核以促進其反轉錄轉座到基因組中。在一些實施例中，核定位信號在範本RNA的3'端、5'端或內部區域中。在一些實施例中，核定位信號在異源序列的3'端（例如，直接是異源序列的3'端）或在異源序列的5'端（例如，直接是異源序列的5'端）。在一些實施例中，將核定位信號置於範本RNA的5' UTR之外或3' UTR之外。在一些實施例中，將核定位信號置於5' UTR與3' UTR之間，其中任選地，核定位信號不與轉基因一起轉錄（例如，核定位信號是反義取向或在轉錄終止信號或聚腺苷酸化信號的下游）。在一些實施例中，核定位序列位於內含子內部。在一些實施例中，多個相同或不同的核定位信號在RNA中，例如在範本RNA中。在一些實施例中，核定位信號的長度小於5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000 bp。可以使用各種RNA核定位序列。例如，Lubelsky和Ulitsky, Nature555 (107-111), 2018描述了驅動RNA定位到細胞核中的RNA序列。在一些實施例中，核定位信號是SINE來源的核RNA定位（SIRLOIN）信號。在一些實施例中，核定位信號結合核富集蛋白。在一些實施例中，核定位信號結合HNRNPK蛋白。在一些實施例中，核定位信號富含嘧啶，例如是富含C/T、富含C/U、富含C、富含T或富含U的區域。在一些實施例中，核定位信號源自長非編碼RNA。在一些實施例中，核定位信號源自MALAT1長非編碼RNA或者是MALAT1的600個核苷酸的M區（描述於Miyagawa等人, RNA18, (738-751), 2012中）。在一些實施例中，核定位信號源自BORG長非編碼RNA或者是AGCCC基序（描述於Zhang等人, Molecular and Cellular Biology34, 2318-2329 (2014)中）。在一些實施例中，核定位序列描述於Shukla等人, The EMBO Journale98452 (2018)中。在一些實施例中，核定位信號源自非LTR反轉錄轉座子、LTR反轉錄轉座子、反轉錄病毒或內源反轉錄病毒。
在一些實施例中，本文所述的多肽包含一個或多個（例如，2、3、4、5個）核靶向序列，例如，如本文所述的核定位序列（NLS）。在一些實施例中，NLS是二分式NLS。在一些實施例中，NLS促進包含NLS的蛋白質輸入到細胞核中。在一些實施例中，NLS與本文所述的基因修飾多肽的N末端融合。在一些實施例中，NLS與基因修飾多肽的C末端融合。在一些實施例中，連接子序列位於NLS與基因修飾多肽的相鄰結構域之間。在一些實施例中，NLS包含本文所述的NLS的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所述的核酸（例如，編碼基因修飾多肽的RNA或編碼RNA的DNA）包含微小RNA結合位點。在一些實施例中，微小RNA結合位點用於增加基因修飾系統的靶細胞特異性。例如，基於由存在於非靶細胞類型中但不存在於靶細胞類型中（或者相對於非靶細胞以降低的水準存在）的miRNA識別，可以選擇微小RNA結合位點。因此，當編碼基因修飾多肽的RNA存在於非靶細胞中時，它將被miRNA結合，並且當編碼基因修飾多肽的RNA存在於靶細胞中時，它不會被miRNA結合（或結合但相對於非靶細胞以降低的水準結合）。雖然不希望受理論束縛，但miRNA與編碼基因修飾多肽的RNA的結合可以降低基因修飾多肽的產生，例如通過降解編碼多肽的mRNA或通過干擾轉譯。因此，相比於非靶細胞的基因組，異源目標序列將更有效地插入靶細胞的基因組中。在編碼基因修飾多肽（或在編碼RNA的DNA中編碼）的RNA中具有微小RNA結合位點的系統也可以與由第二微小RNA結合位點調節的範本RNA組合使用。
在一些實施例中，用於本文所述的任何系統的多肽可以是基於多個反轉錄轉座子的比對多肽序列的分子重建或祖先重建。在一些實施例中，用於本文所述的任何系統中的5'或3'非轉譯區可以是基於多個反轉錄轉座子的比對的5'或3'非轉譯區的分子重建。基於登錄號，可以比對多肽或核酸序列，例如通過使用常規序列分析工具如基本局部比對搜索工具（BLAST）或用於保守結構域分析的CD-Search。可以基於序列一致性創建分子重建，例如使用描述於 Ivics 等人 , Cell 1997, 501 - 510 ； Wagstaff 等人 , Molecular Biology and Evolution 2013, 88-99中的方法。在一些實施例中，5'或3'非轉譯區或多肽所來源的反轉錄轉座子是年輕的或最近活躍的移動元件，如經由系統發育方法（如描述於Boissinot等人, Molecular Biology and Evolution 2000, 915-928中的那些）評估的。
內含肽
在一些實施例中，基因修飾系統包含內含肽。通常，內含肽包含具有經由肽鍵將兩個多肽或多肽片段連接在一起的能力的多肽。在一些實施例中，內含肽是反式剪接內含肽，其可以連接兩個多肽片段，例如以形成如本文所述的系統的多肽組分。
啟動子
在一些實施例中，一個或多個啟動子或增強子元件與編碼基因修飾蛋白的核酸或範本核酸可操作地連接，例如，從而控制異源目標序列的表現。在某些實施例中，所述一個或多個啟動子或增強子元件包含細胞類型或組織特異性元件。在一些實施例中，啟動子或增強子與天然控制異源目標序列的表現的啟動子或增強子相同或者源自天然控制異源目標序列的表現的啟動子或增強子。
在一些實施例中，基因修飾系統能夠在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100個或更多個核苷酸的靶位點中產生取代。在一些實施例中，取代是轉換突變。在一些實施例中，取代是顛換突變。在一些實施例中，取代將腺嘌呤轉化為胸腺嘧啶、腺嘌呤轉化為鳥嘌呤、腺嘌呤轉化為胞嘧啶、鳥嘌呤轉化為胸腺嘧啶、鳥嘌呤轉化為胞嘧啶、鳥嘌呤轉化為腺嘌呤、胸腺嘧啶轉化為胞嘧啶、胸腺嘧啶轉化為腺嘌呤、胸腺嘧啶轉化為鳥嘌呤、胞嘧啶到腺嘌呤、胞嘧啶轉化為鳥嘌呤、或胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶。
在一些實施例中，基因修飾系統能夠在至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300、200或100個核苷酸）的靶位點中產生插入。在一些實施例中，基因修飾系統能夠在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300、200或100個核苷酸）的靶位點中產生插入。在一些實施例中，基因修飾系統能夠在至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10千鹼基（並且任選地不超過1、5、10或20千鹼基）的靶位點中產生插入。在一些實施例中，基因修飾系統能夠產生至少81、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300或200個核苷酸）的缺失。在一些實施例中，基因修飾系統能夠產生至少81、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300或200個核苷酸）的缺失。在一些實施例中，基因修飾系統能夠產生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300或200個核苷酸）的缺失。在一些實施例中，基因修飾系統能夠產生至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10千鹼基（並且任選地不超過1、5、10或20千鹼基）的缺失。
在一些實施例中，插入、缺失、取代或其組合增加或減少基因的表現（例如轉錄或轉譯）。在一些實施例中，插入、缺失、取代或其組合通過改變、添加或缺失啟動子或增強子中的序列（例如結合轉錄因子的序列）來增加或減少基因的表現（例如轉錄或轉譯）。在一些實施例中，插入、缺失、取代或其組合改變基因的轉譯（例如改變胺基酸序列），插入或缺失起始或終止密碼子，改變或固定基因的轉譯框。在一些實施例中，插入、缺失、取代或其組合改變基因的剪接，例如通過插入、缺失或改變剪接受體或供體位點。在一些實施例中，插入、缺失、取代或其組合改變轉錄物或蛋白質半衰期。在一些實施例中，插入、缺失、取代或其組合改變細胞中的蛋白質定位（例如從細胞質到線粒體、從細胞質進入細胞外間隙（例如添加分泌標籤））。在一些實施例中，插入、缺失、取代或其組合改變（例如改進）蛋白質折疊（例如以防止錯誤折疊蛋白質的積累）。在一些實施例中，插入、缺失、取代或其組合改變、增加、降低基因（例如由基因編碼的蛋白質）的活性。
在一些實施例中，本文所述的系統或方法導致異源目標序列的「無痕」插入，而在一些實施例中，靶位點可能顯示由於異源序列的插入而導致的內源DNA的缺失或重複。不同反轉錄轉座子的機制可能導致在靶位點處反轉錄轉座期間在宿主基因組中發生不同模式的重複或缺失。在一些實施例中，系統導致無痕插入，並且在周圍基因組DNA中沒有重複或缺失。在一些實施例中，系統導致在插入上游小於1、2、3、4、5、10、50或100 bp的基因組DNA缺失。在一些實施例中，系統導致在插入下游小於1、2、3、4、5、10、50或100 bp的基因組DNA缺失。在一些實施例中，系統導致在插入上游小於1、2、3、4、5、10、50或100 bp的基因組DNA重複。在一些實施例中，系統導致在插入下游小於1、2、3、4、5、10、50或100 bp的基因組DNA重複。
在一些實施例中，本文所述的基因修飾系統或其DNA結合結構域特異性結合其靶位點，例如，如使用PCT申請號PCT/US 2019/048607的實例21的測定測量的。在一些實施例中，基因修飾多肽或其DNA結合結構域與其靶位點的結合比與人基因組中的任何其他結合位點的結合更強。例如，在一些實施例中，在PCT申請號PCT/US 2019/048607的實例21的測定中，靶位點代表超過50%、60%、70%、80%、90%或95%的基因修飾多肽或其DNA結合結構域與人基因組DNA的結合事件。在一些實施例中，基因修飾多肽的DNA結合結構域對於基因修飾多肽的其餘部分是異源的，例如使得基因修飾多肽靶向不同於與基因修飾多肽的其餘部分締合的內源DNA結合結構域的靶位點。
基因工程化例如二聚化基因修飾多肽
一些非LTR反轉錄轉座子利用兩個次單元來完成反轉錄轉座（Christensen等人 PNAS 2006）。在一些實施例中，本文所述的反轉錄轉座酶包含作為單個多肽的兩個連接的次單元。例如，兩個野生型反轉錄轉座酶可以與連接子連接以形成共價「二聚化」蛋白質。在一些實施例中，編碼反轉錄轉座酶的核酸編碼待表現為單個多肽的兩個反轉錄轉座酶次單元。在一些實施例中，次單元通過肽連接子來連接。基於機制，並不需要來自兩個反轉錄轉座酶次單元的所有功能。在一些實施例中，融合蛋白可以由全功能次單元和缺乏一個或多個功能結構域的第二次單元組成。在一些實施例中，一個次單元可以缺乏反轉錄酶功能性。在一些實施例中，一個次單元可以缺乏反轉錄酶結構域。在一些實施例中，一個次單元可以僅具有核酸內切酶活性。在一些實施例中，一個次單元可以僅具有核酸內切酶結構域。在一些實施例中，構成單個多肽的兩個次單元可以提供互補功能。
在一些實施例中，一個次單元可以缺乏核酸內切酶功能性。在一些實施例中，一個次單元可以缺乏核酸內切酶結構域。在一些實施例中，一個次單元可以僅具有反轉錄酶活性。在一些實施例中，一個次單元可以僅具有反轉錄酶結構域。在一些實施例中，一個次單元可以僅具有DNA依賴性DNA合成功能性。
基因修飾多肽的進化變體
在一些實施例中，本發明提供了基因修飾多肽的進化變體。進化的變體描述於例如PCT申請WO/2021/178720的第1179至1182頁。
基因修飾系統的範本 RNA 組分
本文所述的基因修飾系統可以通過靶標引發的反轉錄將RNA序列範本轉錄至宿主靶DNA位點中。通過經由將RNA序列範本直接反轉錄至宿主基因組中寫入一個或多個DNA序列，基因修飾系統可以將目標序列插入靶基因組中而不需要將外源DNA序列引入宿主細胞中（不同於例如CRISPR系統），並且消除外源DNA插入步驟。因此，基因修飾系統提供了用於使用含有目標序列（例如，包含異源基因編碼和/或功能資訊的序列）的定制RNA序列範本的平臺。
在一些實施例中，範本RNA編碼與異源目標序列呈順式的基因修飾蛋白。例如，在Kuroki-Kami等人 (2019) Mobile DNA10:23（通過引用以其整體併入本文）中描述了各種順式構建體，並且它們可以與本文所述的任何實施例組合使用。例如，在一些實施例中，範本RNA包含異源目標序列、編碼基因修飾蛋白（例如，包含 (i) 反轉錄酶結構域和 (ii) 核酸內切酶結構域的蛋白，例如，如本文所述）的序列、5'非轉譯區和3'非轉譯區。組分可以以各種順序被包含在內。在一些實施例中，例如使用Kuroki-Kami等人（同上）的圖3A中所示的排列，以不同的方向（有義相比於反義）編碼基因修飾蛋白和異源目標序列。在一些實施例中，以相同的方向編碼基因修飾蛋白和異源目標序列。在一些實施例中，編碼多肽的核酸和範本RNA或編碼範本RNA的核酸共價連接，例如是融合核酸的一部分，和/或是同一轉錄物的一部分。在一些實施例中，融合核酸包含RNA或DNA。
在一些情況下，編碼基因修飾多肽的核酸可以在異源目標序列的5'端。例如，在一些實施例中，範本RNA從5'至3'包含5'非轉譯區、有義編碼的基因修飾多肽、有義編碼的異源目標序列和3'非轉譯區。在一些實施例中，範本RNA從5'至3'包含5'非轉譯區、有義編碼的基因修飾多肽、反義編碼的異源目標序列和3'非轉譯區。
應當理解，當範本RNA被描述為包含開放閱讀框或其反向互補體時，在一些實施例中，在開放閱讀框可以被轉錄和轉譯之前，範本RNA必須被轉化為雙鏈DNA（例如，通過反轉錄）。
在某些實施例中，可以鑒定、設計、工程化和構建定制RNA序列範本以含有改變或指定宿主基因組功能的序列，例如通過將異源編碼區引入基因組中；影響或引起外顯子結構/選擇性剪接；引起內源基因的破壞；引起內源基因的轉錄啟動；引起內源DNA的表觀遺傳調節；引起可操作連接的基因的上調或下調等。在某些實施例中，定制RNA序列範本可以被工程化以含有編碼外顯子和/或轉基因的序列，提供與轉錄因子啟動物、阻遏物、增強子等的結合位點，及其組合。在其他實施例中，編碼序列可以進一步用剪接受體位點、聚A尾定制。在某些實施例中，RNA序列可以含有對於反轉錄轉座酶同源的編碼RNA序列範本的序列，經工程化以含有異源編碼序列，或其組合。
範本RNA可以與靶DNA具有一些同源性。在一些實施例中，範本RNA在RNA的3'端與靶DNA具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200個或更多個鹼基的確切同源性。在一些實施例中，範本RNA（例如，在範本RNA的5'端）與靶DNA具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、175、180或200個或更多個鹼基的至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同源性。在一些實施例中，範本RNA具有源自反轉錄轉座子（例如本文所述的反轉錄轉座子）的3'非轉譯區。在一些實施例中，範本RNA具有這樣的3'區，其與反轉錄轉座子（例如，本文所述的反轉錄轉座子，例如表7中的反轉錄轉座子）的3'序列具有至少10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200個或更多個鹼基的至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同源性。在一些實施例中，範本RNA具有源自反轉錄轉座子（例如本文所述的反轉錄轉座子）的5'非轉譯區。在一些實施例中，範本RNA具有這樣的5'區，其與反轉錄轉座子（例如，本文所述的反轉錄轉座子，例如表7中所述的反轉錄轉座子）的5'序列具有至少10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180或200個或更多個鹼基的至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高同源性。
本文所述的基因修飾系統的範本RNA組分通常能夠結合系統的基因修飾蛋白。在一些實施例中，範本RNA具有能夠結合基因修飾基因組編輯蛋白的3'區。結合區（例如，3'區）可以是結構化RNA區，例如具有至少1、2或3個髮夾環，能夠結合系統的基因修飾蛋白。
本文所述的基因修飾系統的範本RNA組分通常能夠結合系統的基因修飾蛋白。在一些實施例中，範本RNA具有能夠結合基因修飾蛋白的5'區。結合區（例如，5'區）可以是結構化RNA區，例如具有至少1、2或3個髮夾環，能夠結合系統的基因修飾蛋白。在一些實施例中，5'非轉譯區包含假結，例如能夠與基因修飾蛋白結合的假結。
在一些實施例中，範本RNA（例如髮夾RNA的非轉譯區，例如5'非轉譯區）包含莖環序列。在一些實施例中，範本RNA（例如髮夾RNA的非轉譯區，例如5'非轉譯區）包含髮夾。在一些實施例中，範本RNA（例如髮夾RNA的非轉譯區，例如5'非轉譯區）包含螺旋。在一些實施例中，範本RNA（例如髮夾RNA的非轉譯區，例如5'非轉譯區）包含假結。在一些實施例中，範本RNA包含核酶。在一些實施例中，核酶類似於丁型肝炎病毒（HDV）核酶，例如具有類似於HDV核酶的二級結構和/或具有HDV核酶的一種或多種活性，例如自切割活性。參見例如，Eickbush等人, Molecular and Cellular Biology, 2010, 3142-3150。
在一些實施例中，範本RNA（例如髮夾RNA的非轉譯區，例如3'非轉譯區）包含一個或多個莖環或螺旋。R2 3' UTR的示例性結構示於例如以下文獻中：Ruschak等人 「Secondary structure models of the 3' untranslated regions of diverse R2 RNAs」 RNA. 2004年6月; 10(6): 978-987，例如其中的圖3；以及Eikbush和Eikbush, 「R2 and R2/R1 hybrid non-autonomous retrotransposons derived by internal deletions of full-length elements」 Mobile DNA (2012) 3:10，例如其中的圖3，將這些文章通過引用以其整體特此併入。
在一些實施例中，本文所述的範本RNA包含能夠與本文所述的基因修飾蛋白結合的序列。例如，在一些實施例中，範本RNA包含能夠與基因修飾蛋白中的MS2外殼蛋白序列結合的MS2 RNA序列。在一些實施例中，範本RNA包含能夠與B-box序列結合的RNA序列。在一些實施例中，除了UTR之外或代替UTR，範本RNA與非RNA UTR（例如，蛋白質或小分子）連接（例如，共價連接）。
在一些實施例中，範本RNA在3'端具有聚A尾。在一些實施例中，範本RNA在3'端不具有聚A尾。
在一些實施例中，範本RNA具有這樣的5'區，其與反轉錄轉座子（例如，本文所述的反轉錄轉座子）的5'序列具有至少10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200個或更多個鹼基的至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高同源性。
系統的範本RNA通常包含用於插入靶DNA中的目標序列。目標序列可以是編碼的或非編碼的。
在一些實施例中，本文所述的系統或方法包含單個範本RNA。在一些實施例中，本文所述的系統或方法包含多個範本RNA。
在一些實施例中，目標序列可以含有開放閱讀框。在一些實施例中，範本RNA具有科紮克序列。在一些實施例中，範本RNA具有內部核糖體進入位點。在一些實施例中，範本RNA具有自切割肽，如T2A或P2A位點。在一些實施例中，範本RNA具有起始密碼子。在一些實施例中，範本RNA具有剪接受體位點。在一些實施例中，範本RNA具有剪接供體位點。示例性剪接受體和剪接供體位點描述於US 10435677中，將其通過引用以其整體併入本文。示例性剪接受體位點序列是本領域技術人員已知的，並且僅通過舉例的方式，包括CTGACCCTTCTCTCTCTCCCCCAGAG（SEQ ID NO: 72）（來自人HBB基因）和TTTCTCTCCCACAAG（SEQ ID NO: 73）（來自人免疫球蛋白γ基因）。在一些實施例中，範本RNA具有在終止密碼子下游的微小RNA結合位點。在一些實施例中，範本RNA具有在開放閱讀框的終止密碼子下游的聚A尾。在一些實施例中，範本RNA包含一個或多個外顯子。在一些實施例中，範本RNA包含一個或多個內含子。在一些實施例中，範本RNA包含真核轉錄終止子。在一些實施例中，範本RNA包含增強的轉譯元件或轉譯增強元件。在一些實施例中，RNA包含人T細胞白血病病毒（HTLV-1）R區。在一些實施例中，RNA包含增強核輸出的轉錄後調節元件，如乙型肝炎病毒（HPRE）或土撥鼠肝炎病毒（WPRE）的轉錄後調節元件。在一些實施例中，在範本RNA中，異源目標序列編碼多肽並且以相對於5'和3' UTR的反義方向編碼。在一些實施例中，在範本RNA中，異源目標序列編碼多肽並且以相對於5'和3' UTR的有義方向編碼。
在一些實施例中，本文所述的核酸（例如，範本RNA或編碼範本RNA的DNA）包含微小RNA結合位點。在一些實施例中，微小RNA結合位點用於增加基因修飾系統的靶細胞特異性。例如，基於由存在於非靶細胞類型中但不存在於靶細胞類型中（或者相對於非靶細胞以降低的水準存在）的miRNA識別，可以選擇微小RNA結合位點。因此，當範本RNA存在於非靶細胞中時，它將被miRNA結合，並且當範本RNA存在於靶細胞中時，它將不被miRNA結合（或結合但相對於非靶細胞以降低的水準結合）。雖然不希望受理論束縛，但miRNA與範本RNA的結合可能干擾異源目標序列向基因組中的插入。因此，相比於非靶細胞的基因組，異源目標序列將更有效地插入靶細胞的基因組中。在範本RNA（或編碼它的DNA）中具有微小RNA結合位點的系統也可以與編碼基因修飾多肽的核酸組合使用，其中基因修飾多肽的表現由第二微小RNA結合位點調節，例如，如本文（例如在標題為「基因修飾系統的多肽組分」的章節中）所述。
在一些實施例中，目標序列可以含有非編碼序列。例如，範本RNA可以包含啟動子或增強子序列。在一些實施例中，範本RNA包含組織特異性啟動子或增強子，其每一個可以是單向的或雙向的。在一些實施例中，啟動子是RNA聚合酶I啟動子、RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶III啟動子。在一些實施例中，啟動子包含TATA元件。在一些實施例中，啟動子包含B識別元件。在一些實施例中，啟動子具有轉錄因子的一個或多個結合位點。在一些實施例中，非編碼序列以相對於5'和3' UTR的反義方向轉錄。在一些實施例中，非編碼序列以相對於5'和3' UTR的有義方向轉錄。
在一些實施例中，本文所述的核酸（例如，範本RNA或編碼範本RNA的DNA）包含啟動子序列，例如組織特異性啟動子序列。在一些實施例中，組織特異性啟動子用於增加基因修飾系統的靶細胞特異性。例如，可以基於以下來選擇啟動子：其在靶細胞類型中有活性但在非靶細胞類型中無活性（或具有較低水準的活性）。因此，即使啟動子整合到非靶細胞的基因組中，它也不會驅動整合基因的表現（或僅驅動低水準表現）。在範本RNA中具有組織特異性啟動子序列的系統也可以與微小RNA結合位點（例如，在範本RNA或編碼基因修飾蛋白的核酸中）組合使用，例如，如本文所述。在範本RNA中具有組織特異性啟動子序列的系統也可以與由組織特異性啟動子驅動的編碼基因修飾多肽的DNA組合使用，例如以在靶細胞中相比於在非靶細胞中實現更高水準的基因修飾蛋白。
在一些實施例中，範本RNA（或編碼範本RNA的DNA）包含的異源目標序列與至少一個調節序列可操作地連接。在一些實施例中，異源目標序列與組織特異性啟動子可操作地連接，使得異源目標序列的表現（例如，治療性蛋白質）在靶細胞中上調，如上所述。在一些實施例中，異源目標序列與miRNA結合位點可操作地連接，使得異源目標序列的表現（例如，治療性蛋白質）在具有較高水準的相應miRNA的細胞（例如，非靶細胞）中下調，如上所述。
在一些實施例中，範本RNA包含微小RNA序列、siRNA序列、指導RNA序列、piwi RNA序列。
在一些實施例中，範本RNA包含非編碼異源目標序列，例如調節序列。在一些實施例中，異源目標序列的整合因此改變內源基因的表現。在一些實施例中，異源目標序列的整合上調內源基因的表現。在一些實施例中，異源目標序列的整合下調內源基因的表現。
在一些實施例中，範本RNA包含協調表觀遺傳修飾的位點。在一些實施例中，範本RNA包含抑制（例如，防止）表觀遺傳沈默的元件。在一些實施例中，範本RNA包含染色質隔離子。例如，範本RNA包含CTCF位點或針對DNA甲基化而被靶向的位點。
為了促進更高水準或更穩定的基因表現，範本RNA可以包括防止或抑制基因沈默的特徵。在一些實施例中，這些特徵防止或抑制DNA甲基化。在一些實施例中，這些特徵促進DNA去甲基化。在一些實施例中，這些特徵防止或抑制組蛋白脫乙醯化。在一些實施例中，這些特徵防止或抑制組蛋白甲基化。在一些實施例中，這些特徵促進組蛋白乙醯化。在一些實施例中，這些特徵促進組蛋白去甲基化。在一些實施例中，可以將多個特徵摻入範本RNA中以促進這些修飾中的一種或多種。CpG二核苷酸通過宿主甲基轉移酶進行甲基化。在一些實施例中，範本RNA耗盡CpG二核苷酸，例如，與相應的未改變的序列相比，不包含CpG核苷酸或包含減少數量的CpG二核苷酸。在一些實施例中，驅動從整合的DNA的轉基因表現的啟動子耗盡CpG二核苷酸。
在一些實施例中，範本RNA包含由與效應子序列可操作連接的至少一個調節區組成的基因表現單元。效應子序列可以是轉錄至RNA中的序列（例如，編碼序列或非編碼序列，如編碼微小RNA的序列）。
在一些實施例中，將範本RNA的目標序列插入靶基因組中的內源內含子中。在一些實施例中，將範本RNA的目標序列插入靶基因組中，從而充當新的外顯子。在一些實施例中，目標序列插入靶基因組中導致替代天然外顯子或跳過天然外顯子。
在一些實施例中，將範本RNA的目標序列插入靶基因組中的基因組安全港位點（如AAVS1、CCR5或ROSA26）中。在一些實施例中，將範本RNA的目標序列插入白蛋白基因座中。在一些實施例中，將範本RNA的目標序列插入TRAC基因座中。在一些實施例中，將範本RNA的目標序列添加至基因組的基因間或基因內區域中。在一些實施例中，將範本RNA的目標序列添加至基因組中，在內源活性基因的5'或3'端的0.1 kb、0.25 kb、0.5 kb、0.75、kb、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、7.5 kb、10 kb、15 kb、20 kb、25 kb、50、75 kb或100 kb內。在一些實施例中，將範本RNA的目標序列添加至基因組中，在內源啟動子或增強子的5'或3'端的0.1 kb、0.25 kb、0.5 kb、0.75、kb、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、7.5 kb、10 kb、15 kb、20 kb、25 kb、50、75 kb或100 kb內。在一些實施例中，範本RNA的目標序列可以是例如50-50,000個鹼基對（例如，在50-40,000 bp之間、在500-30,000 bp之間、在500-20,000 bp之間、在100-15,000 bp之間、在500-10,000 bp之間、在50-10,000 bp之間、在50-5,000 bp之間）。在一些實施例中，異源目標序列的長度小於1,000、1,300、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000或7,500個核苷酸。
本文所述的基因修飾系統的範本核酸（例如，範本RNA）組分通常能夠結合系統的基因修飾蛋白。在一些實施例中，範本核酸（例如，範本RNA）具有能夠結合基因修飾蛋白的3'區。結合區（例如，3'區）可以是結構化RNA區，例如具有至少1、2或3個髮夾環，能夠結合系統的基因修飾蛋白。結合區可以將範本核酸（例如，範本RNA）與任何多肽模組締合。在一些實施例中，範本核酸（例如，範本RNA）的結合區可以與多肽中的RNA結合結構域締合。在一些實施例中，範本核酸（例如，範本RNA）的結合區可以與多肽的反轉錄結構域締合（例如，與RT結構域特異性結合）。例如，在反轉錄結構域源自非LTR反轉錄轉座子的情況下，範本核酸（例如，範本RNA）可以含有源自非LTR反轉錄轉座子的結合區，例如來自非LTR反轉錄轉座子的3' UTR。在一些實施例中，本文所述的系統或方法包含單個範本核酸（例如，範本RNA）。在一些實施例中，本文所述的系統或方法包含多個範本核酸（例如，範本RNA）。在一些實施例中，當系統包含多個核酸時，每個核酸包含綴合結構域。在一些實施例中，綴合結構域使得核酸分子能夠締合，例如通過互補序列的雜交進行締合。
在一些實施例中，範本核酸可以包含一個或多個UTR（例如5' UTR或3' UTR，例如來自R2型反轉錄轉座子）。在一些實施例中，UTR促進範本與多肽的反轉錄酶結構域的相互作用。在一些實施例中，範本具有説明範本與基因修飾多肽締合的一個或多個序列。在一些實施例中，這些序列可以源自反轉錄轉座子UTR。在一些實施例中，UTR可以位於所需插入序列的側翼。在一些實施例中，具有靶位點同源性的序列可以位於一個或兩個UTR之外。在一些實施例中，具有靶位點同源性的序列可以退火至靶序列以引發反轉錄。在一些實施例中，5'和/或3' UTR可以位於靶位點同源序列的末端。在一些實施例中，基因修飾系統可以導致插入不含任何另外的序列的所需有效載荷（例如，不含用於結合基因修飾蛋白的UTR的基因表現單元）。
範本核酸（例如，範本RNA）可以被設計為導致靶DNA基因座處的插入、突變或缺失。在一些實施例中，範本核酸（例如，範本RNA）可以被設計為引起靶DNA中的插入。例如，範本核酸（例如，範本RNA）可以含有異源序列，其中反轉錄將導致異源序列插入靶DNA中。在其他實施例中，RNA範本可以被設計為將缺失寫入靶DNA中。例如，範本核酸（例如，範本RNA）可以匹配在所需缺失的上游和下游的靶DNA，其中反轉錄將導致來自不含間插序列的範本核酸（例如，範本RNA）的上游和下游序列的拷貝，例如，引起間插序列的缺失。在其他實施例中，範本核酸（例如，範本RNA）可以被設計為將編輯寫入靶DNA中。例如，範本RNA可以匹配靶DNA序列，除了一個或多個核苷酸之外，其中反轉錄將導致這些編輯拷貝至靶DNA中，例如導致突變，例如轉換或顛換突變。
在一些實施例中，基因修飾系統能夠在至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300、200或100個核苷酸）的靶位點中產生插入。在一些實施例中，基因修飾系統能夠在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300、200或100個核苷酸）的靶位點中產生插入。在一些實施例中，基因修飾系統能夠在至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10千鹼基（並且任選地不超過1、5、10或20千鹼基）的靶位點中產生插入。在一些實施例中，基因修飾系統能夠產生至少81、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300或200個核苷酸）的缺失。在一些實施例中，基因修飾系統能夠產生至少81、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300或200個核苷酸）的缺失。在一些實施例中，基因修飾系統能夠產生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個核苷酸（並且任選地不超過500、400、300或200個核苷酸）的缺失。在一些實施例中，基因修飾系統能夠產生至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10千鹼基（並且任選地不超過1、5、10或20千鹼基）的缺失。
用於修飾的 RNA （例如，範本 RNA ）的方法和組合物
在一些實施例中，系統的RNA組分（例如，如本文所述的範本RNA）包含一個或多個核苷酸修飾。在一些實施例中，與未修飾或末端修飾的指導相比，範本RNA的修飾模式可以顯著影響體內活性。不希望受理論束縛，該過程可能至少部分是由於由修飾賦予的RNA的穩定化所致。此類修飾的非限制性例子可以包括2'-O-甲基（2'-O-Me）、2'-O-(2-甲氧基乙基)（2'-O-MOE）、2'-氟（2'-F）、核苷酸之間的硫代磷酸酯（PS）鍵、G-C取代以及核苷酸及其等同物之間的反向脫鹼基連接。
在一些實施例中，範本RNA（例如，在其結合靶位點的部分處）包含5'末端區。在一些實施例中，範本RNA不包含5'末端區。在一些實施例中，5'末端區域包含5'端修飾。在一些實施例中，範本RNA包含2'-O-甲基（2'-O-Me）修飾的核苷酸。在一些實施例中，範本RNA包含2'-O-(2-甲氧基乙基)（2'-O-moe）修飾的核苷酸。在一些實施例中，範本RNA包含2'-氟（2'-F）修飾的核苷酸。在一些實施例中，範本RNA包含核苷酸之間的硫代磷酸酯（PS）鍵。在一些實施例中，範本RNA包含5'端修飾、3'端修飾或5'和3'端修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯（PS）鍵。在一些實施例中，5'端修飾包含2'-O-甲基（2'-O-Me）、2'-O-(2-甲氧基乙基)（2'-O-MOE）和/或2'-氟（2'-F）修飾的核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含至少一個硫代磷酸酯（PS）鍵以及2'-O-甲基（2'-O-Me）、2'-O-(2-甲氧基乙基)（2'-O-MOE）和/或2'-氟（2'-F）修飾的核苷酸中的一個或多個。末端修飾可以包含硫代磷酸酯（PS）、2'-O-甲基（2'-O-Me）、2'-O-(2-甲氧基乙基)（2'-O-MOE）和/或2'-氟（2'-F）修飾。等效的末端修飾也包括在本文所述的實施例中。在一些實施例中，範本RNA包含與範本RNA的一個或多個區域的修飾組合的末端修飾。在一些實施例中，結構指導的和系統的方法用於向範本RNA引入修飾（例如，2'-OMe-RNA、2'-F-RNA和PS修飾），例如，如Mir等人 Nat Commun9:2641 (2018)（將其通過引用以其整體併入本文）中所述。在一些實施例中，摻入2'-F-RNA增加RNA:RNA或RNA:DNA雙鏈體的熱穩定性和核酸酶穩定性，例如，同時最低限度地干擾C3'-內切糖縮攏。在一些實施例中，在2'-OH對RNA:DNA雙鏈體穩定性而言重要的位置處，2'-F可以比2'-OMe更好地耐受。在一些實施例中，採用結構指導的和系統的方法（例如，如Mir等人 Nat Commun9:2641 (2018)所述；通過引用以其整體併入本文）發現範本RNA的修飾。在一些實施例中，與範本RNA結合的多肽的結構用於確定RNA中隨後可被選擇用於修飾的非蛋白質接觸的核苷酸（例如，其破壞RNA與多肽的締合的風險較低）。範本RNA中的二級結構也可以通過軟體工具使用電腦類比來預測，例如以確定用於選擇修飾的二級結構，例如，髮夾、莖和/或凸起，所述軟體工具例如在rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb上可獲得的RNAstructure工具（Bellaousov等人 Nucleic Acids Res41:W471-W474 (2013)；通過引用以其整體併入本文）。
預期在靶細胞內的配製、遞送或基因修飾反應期間採用環狀和/或線性RNA狀態可能是有用的。因此，在本文所述任何態樣的一些實施例中，基因修飾系統包含一個或多個環狀RNA（circRNA）。在本文所述任何態樣的一些實施例中，基因修飾系統包含一個或多個線性RNA。在一些實施例中，如本文所述的核酸（例如，範本核酸、編碼基因修飾多肽的核酸分子或兩者）是circRNA。在一些實施例中，環狀RNA分子編碼基因修飾多肽。在一些實施例中，將編碼基因修飾多肽的circRNA分子遞送至宿主細胞。在一些實施例中，編碼基因修飾多肽的circRNA分子在轉譯之前被線性化（例如在宿主細胞中，例如在宿主細胞的細胞核中）。環狀RNA描述於例如PCT公開號WO/2021/178720的第1215-1218頁。
本文進一步包括用於組裝完整或部分範本RNA分子的組合物和方法。製備範本RNA的方法描述於例如PCT公開號WO/2021/178720的第1150-1155頁。
另外的範本特徵
在一些實施例中，範本（例如，範本RNA）包含某些結構特徵，例如使用電腦類比確定的。在實施例中，預測範本RNA具有在-280與-480 kcal/mol之間（例如，在-280與-300 kcal/mol、-300與-350 kcal/mol、-350與-400 kcal/mol、-400與-450 kcal/mol或-450與-480 kcal/mol之間）的最小能量結構，例如，如通過RNAstructure所測量，例如，如Turner和Mathews Nucleic Acids Res38:D280-282 (2009)（通過引用以其整體併入本文）中所述。
在一些實施例中，範本（例如，範本RNA）包含某些結構特徵，例如在體外測定的。在實施例中，範本RNA經序列優化，例如以減少如體外確定的二級結構，例如通過SHAPE-MaP體外確定的二級結構（例如，如Siegfried等人 Nat Methods 11:959-965 (2014)中所述；通過引用以其整體併入本文）。在一些實施例中，範本（例如，範本RNA）包含某些結構特徵，例如在細胞中測定的。在實施例中，範本RNA經序列優化，例如以減少如在細胞中測量的二級結構，例如通過DMS-MaPseq測量的二級結構（例如，如Zubradt等人 Nat Methods 14:75-82 (2017)中所述；通過引用以其整體併入本文）。
基因修飾系統的另外的功能特徵和特點
在一些情形下，如本文所述的基因修飾系統可以通過一個或多個功能測量值或特徵來表徵。在一些實施例中，DNA結合結構域具有下文所述的功能特徵中的一種或多種。在一些實施例中，RNA結合結構域具有下文所述的功能特徵中的一種或多種。在一些實施例中，核酸內切酶結構域具有下文所述的功能特徵中的一種或多種。在一些實施例中，反轉錄酶結構域具有下文所述的功能特徵中的一種或多種。在一些實施例中，範本（例如，範本RNA）具有下文所述的功能特徵中的一種或多種。在一些實施例中，由基因修飾多肽結合的靶位點具有下文所述的功能特徵中的一種或多種。
基因修飾多肽
DNA結合結構域
在一些實施例中，DNA結合結構域能夠以比參考DNA結合結構域更大的親和力與靶序列（例如，dsDNA靶序列）結合。在一些實施例中，參考DNA結合結構域是來自家蠶（B. mori）的R2_BM的DNA結合結構域。在一些實施例中，DNA結合結構域能夠以100 pM - 10 nM之間（例如，100 pM - 1 nM或1 nM - 10 nM之間）的親和力與靶序列（例如，dsDNA靶序列）結合。
在一些實施例中，在體外測量DNA結合結構域對其靶序列（例如，dsDNA靶序列）的親和力，例如通過熱泳測量，例如，如Asmari等人 Methods 146:107-119 (2018)（通過引用以其整體併入本文）中所述。
在實施例中，在存在莫耳過量（例如，約100倍莫耳過量）的加擾序列競爭物dsDNA的情況下，DNA結合結構域能夠例如以100 pM - 10 nM之間（例如，100 pM - 1 nM或1 nM - 10 nM之間）的親和力與其靶序列（例如，dsDNA靶序列）結合。
在一些實施例中，發現DNA結合結構域與其靶序列（例如，dsDNA靶序列）的締合比與靶細胞（例如，人靶細胞）的基因組中的任何其他序列的締合更頻繁，例如，如通過ChIP-seq（例如，在HEK293T細胞中）測量，例如，如He和Pu (2010) Curr. Protoc Mol Biol第21章（通過引用以其整體併入本文）中所述。在一些實施例中，發現DNA結合結構域與其靶序列（例如，dsDNA靶序列）的締合比與靶細胞的基因組中的任何其他序列的締合頻繁至少約5倍或10倍，如通過ChIP-seq（例如，在HEK293T細胞中）測量，例如，如He和Pu (2010), 同上中所述。
在一些實施例中，基因修飾多肽包含例如相對於野生型多肽的對DNA結合結構域的修飾。在一些實施例中，DNA結合結構域包含對原始DNA結合結構域的胺基酸序列的添加、缺失、替代或修飾。在一些實施例中，DNA結合結構域被修飾以包含特異性結合目的靶核酸（例如，DNA）序列的異源功能結構域。在一些實施例中，功能結構域替代多肽的先前DNA結合結構域的至少一部分（例如，全部）。在一些實施例中，基因修飾多肽包含例如相對於野生型多肽的對核酸內切酶結構域的修飾。在一些實施例中，核酸內切酶結構域包含對原始核酸內切酶結構域的胺基酸序列的添加、缺失、替代或修飾。在一些實施例中，核酸內切酶結構域被修飾以包含特異性結合目的靶核酸（例如，DNA）序列和/或誘導核酸內切酶對所述序列進行切割的異源功能結構域。
RNA結合結構域
在一些實施例中，RNA結合結構域能夠以比參考RNA結合結構域更大的親和力與範本RNA結合。在一些實施例中，參考RNA結合結構域是來自家蠶的R2_BM的RNA結合結構域。在一些實施例中，RNA結合結構域能夠以100 pM - 10 nM之間（例如，100 pM - 1 nM或1 nM - 10 nM之間）的親和力與範本RNA結合。在一些實施例中，在體外測量RNA結合結構域對其範本RNA的親和力，例如通過熱泳測量，例如，如Asmari等人 Methods 146:107-119 (2018)（通過引用以其整體併入本文）中所述。在一些實施例中，在細胞中測量RNA結合結構域對其範本RNA的親和力（例如，通過FRET或CLIP-Seq）。
在一些實施例中，RNA結合結構域在體外以比加擾RNA高至少約5倍或10倍的頻率與範本RNA締合。在一些實施例中，通過CLIP-seq測量RNA結合結構域與範本RNA或加擾RNA之間的締合頻率，例如，如Lin和Miles (2019) Nucleic Acids Res47(11):5490-5501（通過引用以其整體併入本文）中所述。在一些實施例中，RNA結合結構域在細胞中（例如，在HEK293T細胞中）以比加擾RNA高至少約5倍或10倍的頻率與範本RNA締合。在一些實施例中，通過CLIP-seq測量RNA結合結構域與範本RNA或加擾RNA之間的締合頻率，例如，如Lin和Miles (2019) 同上中所述。
核酸內切酶結構域
在一些實施例中，核酸內切酶結構域在體外以比與加擾dsDNA締合頻率高至少約5倍或10倍的頻率與靶dsDNA締合。在一些實施例中，核酸內切酶結構域在體外（例如在細胞（例如，HEK293T細胞）中）以比與加擾dsDNA締合頻率高至少約5倍或10倍的頻率與靶dsDNA締合。在一些實施例中，通過ChIP-seq測量核酸內切酶結構域與靶DNA或加擾DNA之間的締合頻率，例如，如He和Pu (2010) Curr. Protoc Mol Biol第21章（通過引用以其整體併入本文）中所述。
在一些實施例中，核酸內切酶結構域可以催化在靶序列處切口的形成，例如達到相對於非靶序列（例如，相對於靶細胞基因組中的任何其他基因組序列）增加至少約5倍或10倍。在一些實施例中，使用NickSeq測定切口形成的水準，例如，如Elacqua等人 (2019) bioRxivdoi.org/10.1101/867937（通過引用以其整體併入本文）中所述。
在一些實施例中，核酸內切酶結構域能夠在體外產生有切口的DNA。在實施例中，切口導致暴露的鹼基。在實施例中，可以使用核酸酶敏感性測定來檢測暴露的鹼基，例如，如Chaudhry和Weinfeld (1995) Nucleic Acids Res23(19):3805-3809（通過引用以其整體併入本文）中所述。在實施例中，相對於參考核酸內切酶結構域，暴露的鹼基的水準（例如，通過核酸酶敏感性測定檢測）增加至少10%、50%或更多。在一些實施例中，參考核酸內切酶結構域是來自家蠶的R2_BM的核酸內切酶結構域。
在一些實施例中，核酸內切酶結構域能夠在細胞中產生有切口的DNA。在實施例中，核酸內切酶結構域能夠在HEK293T細胞中產生有切口的DNA。在實施例中，在不存在Rad51的情況下經歷複製的未修復的切口導致切口位點處的NHEJ率增加，這可以例如通過使用Rad51抑制測定來檢測，例如，如Bothmer等人 (2017) Nat Commun8:13905（通過引用以其整體併入本文）中所述。在實施例中，NHEJ率增加超過0-5%。在實施例中，例如在Rad51抑制後，NHEJ率增加至20%-70%（例如，在30%-60%或40%-50%之間）。
在一些實施例中，核酸內切酶結構域在切割後釋放靶標。在一些實施例中，通過評估酶的多次周轉來間接指示靶標的釋放，例如，如Yourik等人 RNA 25(1):35-44 (2019)（通過引用以其整體併入本文）中所述以及在圖2中所示。在一些實施例中，核酸內切酶結構域的k exp是如通過此類方法測量的1 x 10 -3- 1 x 10 -5min-1。
在一些實施例中，核酸內切酶結構域在體外具有大於約1 x 10 8s -1M -1的催化效率（ k cat/ K m）。在實施例中，核酸內切酶結構域在體外具有大於約1 x 10 5、1 x 10 6、1 x 10 7或1 x 10 8s -1M -1的催化效率。在實施例中，如Chen等人 (2018) Science360(6387):436-439（通過引用以其整體併入本文）中所述測定催化效率。在一些實施例中，核酸內切酶結構域在細胞中具有大於約1 x 10 8s -1M -1的催化效率（ k cat/ K m）。在實施例中，核酸內切酶結構域在細胞中具有大於約1 x 10 5、1 x 10 6、1 x 10 7或1 x 10 8s -1M -1的催化效率。
反轉錄酶結構域
在一些實施例中，相對於參考反轉錄酶結構域，反轉錄酶結構域在體外具有較低的提前終止率的可能性（ P off）。在一些實施例中，參考反轉錄酶結構域是來自家蠶的R2_BM的反轉錄酶結構域或病毒反轉錄酶結構域，例如來自M-MLV的RT結構域。
在一些實施例中，反轉錄酶結構域在體外具有小於約5 x 10 -3/nt、5 x 10 -4/nt或5 x 10 -6/nt的較低的提前終止率的可能性（ P 關），例如，如在1094 nt RNA上測量的。在實施例中，如Bibillo和Eickbush (2002) J Biol Chem 277(38):34836-34845（通過引用以其整體併入本文）中所述來測定體外提前終止率。
在一些實施例中，反轉錄酶結構域能夠在細胞中完成至少約30%或50%的整合。完全整合的百分比可以通過以下來測量：將細胞群體中基本上全長的整合事件（例如，包含至少98%的預期整合序列的基因組位點）的數量除以全部（包括基本上全長的和部分的）整合事件的數量。在實施例中，使用長讀擴增子測序確定（例如，跨整合位點）細胞中的整合，例如，如Karst等人 (2020) bioRxivdoi.org/10.1101/645903（通過引用以其整體併入本文）中所述。
在實施例中，定量細胞中的整合包括計數整合的分數，所述整合含有對應於範本RNA的至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的DNA序列（例如，具有至少0.05、0.1、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4或5 kb的長度，例如在0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、1.0-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2.0、2-3、3-4或4-5 kb之間的長度的範本RNA）。
在一些實施例中，反轉錄酶結構域能夠在體外聚合dNTP。在實施例中，反轉錄酶結構域能夠在體外以0.1 - 50 nt/sec之間（例如，0.1-1、1-10或10-50 nt/sec之間）的速率聚合dNTP。在實施例中，通過單分子測定來測量通過反轉錄酶結構域實現的dNTP聚合，例如，如Schwartz和Quake (2009) PNAS106(48):20294-20299（通過引用以其整體併入）中所述。
在一些實施例中，反轉錄酶結構域具有在1 x 10 -3- 1 x 10 -4或1 x 10 -4- 1 x 10 -5個取代/nt之間的體外錯誤率（例如，核苷酸的錯誤摻入），例如，如Yasukawa等人 (2017) Biochem Biophys Res Commun492(2):147-153（通過引用以其整體併入本文）中所述。在一些實施例中，反轉錄酶結構域在細胞（例如，HEK293T細胞）中具有在1 x 10 -3- 1 x 10 -4或1 x 10 -4- 1 x 10 -5個取代/nt之間的錯誤率（例如，核苷酸的錯誤摻入），例如通過長讀擴增子測序測得，例如，如Karst等人 (2020) bioRxivdoi.org/10.1101/645903（通過引用以其整體併入本文）。
在一些實施例中，反轉錄酶結構域能夠在體外進行靶RNA的反轉錄。在一些實施例中，反轉錄酶需要至少3 nt的引子來啟動範本的反轉錄。在一些實施例中，通過檢測來自靶RNA的cDNA來確定靶RNA的反轉錄（例如，當與ssDNA引子一起提供時，例如，其退火至靶標且在3'端具有至少3、4、5、6、7、8、9或10 nt），例如，如Bibillo和Eickbush (2002) J Biol Chem277(38):34836-34845（通過引用以其整體併入本文）中所述。
在一些實施例中，與缺乏蛋白質結合基序（例如，3' UTR）的RNA範本相比，反轉錄酶結構域例如當將其RNA範本轉化為cDNA時以高至少5或10倍的效率（例如，通過cDNA產生測得）進行反轉錄。在實施例中，如Yasukawa等人 (2017) Biochem Biophys Res Commun492(2):147-153（通過引用以其整體併入本文）中所述測量反轉錄的效率。
在一些實施例中，相比於任何內源細胞RNA，反轉錄酶結構域例如當在細胞（例如，HEK293T細胞）中表現時以更高的頻率（例如，高約5或10倍的頻率）特異性結合特定RNA範本。在實施例中，通過CLIP-seq測量反轉錄酶結構域與範本RNA之間的特異性結合的頻率，例如，如Lin和Miles (2019) Nucleic Acids Res47(11):5490-5501（通過引用以其整體併入本文）中所述。
靶位點和整合
在一些實施例中，在基因編輯後，整合序列周圍的靶位點例如在少於約50%或10%的整合事件中含有有限數量的插入或缺失，例如，如通過靶位點的長讀擴增子測序確定，例如，如Karst等人 (2020) bioRxivdoi.org/10.1101/645903（通過引用以其整體併入本文）中所述。在一些實施例中，靶位點不顯示多個插入事件，例如頭至尾或頭至頭重複，例如，如通過靶位點的長讀擴增子測序確定，例如，如Karst等人 bioRxivdoi.org/10.1101/645903 (2020)（通過引用以其整體併入本文）中所述。在一些實施例中，靶位點含有對應於範本RNA的整合序列。在一些實施例中，靶位點在超過約1%或10%的事件中不含有從內源RNA產生的插入，例如，如通過靶位點的長讀擴增子測序確定，例如，如Karst等人 bioRxivdoi.org/10.1101/645903 (2020)（通過引用以其整體併入本文）中所述。在一些實施例中，靶位點含有對應於範本RNA的整合序列。
在一些實施例中，靶位點含有對應於範本RNA的整合序列。在實施例中，靶位點不包含範本之外的序列，例如，如通過靶位點的長讀擴增子測序確定（例如，如Karst等人 bioRxiv doi.org/10.1101/645903 (2020)中所述；通過引用以其整體併入本文）。
DNA 損傷應答
在一些實施例中，使用基因修飾系統修飾細胞（例如原代細胞，例如T細胞）的基因組不導致內源DNA損傷應答（DDR）途徑的啟動。在一些實施例中，使用基因修飾系統修飾細胞（例如，原代細胞）的基因組導致細胞的內源DDR途徑的啟動少於在用Cas9處理的在其他方面相似的細胞中的啟動。
在一些實施例中，使用基因修飾系統修飾細胞（例如原代細胞，例如T細胞）的基因組不導致內源干擾素應答的啟動。在一些實施例中，使用基因修飾系統修飾細胞的基因組導致細胞的干擾素應答的啟動少於在用包含來自LINE-1反轉錄轉座酶的元件的基因修飾系統處理的在其他方面相似的細胞中的啟動。
在一些實施例中，本文所述的基因修飾多肽系統包含自失活模組。自失活模組導致表現的基因修飾多肽表現、基因修飾範本表現或兩者的減少。自失活模組描述於例如PCT公開號WO/2021/178720的第1200-1201頁。
在一些實施例中，本文所述的多肽（例如，基因修飾多肽）可經由小分子控制。在一些實施例中，多肽經由小分子二聚化。這種類型的多肽描述於例如WO/2021/178720的第1201-1203頁。
異源基因修飾系統
本文所述的綴合物（靶向性LNP）可以被配製為包含異源基因修飾系統的一種或多種組分或編碼所述組分的一種或多種核酸。因此，在一些實施例中，有效載荷包括異源基因修飾系統或者編碼異源基因修飾多肽的組分的一種或多種核酸。例如，在一些實施例中，有效載荷包括範本RNA和編碼異源基因修飾多肽的mRNA。
異源基因修飾系統可以包含異源基因修飾多肽和範本RNA。異源基因修飾多肽可以包含核酸內切酶結構域、DNA結合結構域、連接子和源自反轉錄病毒的反轉錄酶結構域。異源基因修飾多肽可以包含Cas結構域、連接子和源自反轉錄病毒的反轉錄酶結構域。與異源基因修飾多肽相容的範本RNA可以包含（例如，從5'至3'） (i) 結合靶位點的gRNA間隔子，(ii) 結合異源基因修飾多肽（例如，異源基因修飾多肽的Cas結構域）的gRNA支架，(iii) 異源目標序列，和 (iv) 引子結合位點（PBS）序列。現在更詳細地描述這些組分。
在一些態樣，本文所述的異源基因修飾多肽包含（例如，本文所述的系統包含基因修飾多肽，所述基因修飾多肽包含）：1) Cas結構域（例如Cas切口酶結構域，例如Cas9切口酶結構域）；2) 反轉錄酶（RT）結構域，其中RT結構域是Cas結構域的C末端；以及位於RT結構域與Cas結構域之間的連接子。
在一些實施例中，異源基因修飾多肽包含含有第一NLS和Cas結構域的SEQ ID NO: 4000的序列，或者與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的序列。在一些實施例中，異源基因修飾多肽包含含有第二NLS的SEQ ID NO: 4001的序列，或者與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的序列。
示例性N末端NLS-Cas9結構域：
MPAAKRVKLDGGDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKARGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGG (SEQ ID NO: 74)
包含NLS的示例性C末端序列：
AGKRTADGSEFEKRTADGSEFESPKKKAKVE (SEQ ID NO: 75)
在一些實施例中，本文所述的異源基因修飾多肽包含RT結構域，所述RT結構域具有根據國際申請WO/2023/039440的表6（該表通過引用以其整體併入本文）的胺基酸序列，或者與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的序列。
在一些實施例中，異源基因修飾多肽包含：(i) 連接子，其含有如表8的一行中所列的連接子序列，或者與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列；和 (ii) RT結構域，其含有如表8的同一行中所列的RT結構域序列，或者與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，異源基因修飾多肽包含根據表9的胺基酸序列，或者與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。
表 8. 示例性基因修飾多肽的選擇
完整多肽序列的 SEQ ID NO: 連接子序列 RT 名稱和序列
81 AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 76) AVIRE_P03360_3mutA TAPLEEEYRLFLEAPIQNVTLLEQWKREIPKVWAEINPPGLASTQAPIHVQLLSTALPVRVRQYPITLEAKRSLRETIRKFRAAGILRPVHSPWNTPLLPVRKSGTSEYRMVQDLREVNKRVETIHPTVPNPYTLLSLLPPDRIWYSVLDLKDAFFCIPLAPESQLIFAFEWADAEEGESGQLTWTRLPQGFKNSPTLFNEALNRDLQGFRLDHPSVSLLQYVDDLLIAADTQAACLSATRDLLMTLAELGYRVSGKKAQLCQEEVTYLGFKIHKGSRSLSNSRTQAILQIPVPKTKRQVREFLGKIGYCRLFIPGFAELAQPLYAATRPGNDPLVWGEKEEEAFQSLKLALTQPPALALPSLDKPFQLFVEETSGAAKGVLTQALGPWKRPVAYLSKRLDPVAAGWPRCLRAIAAAALLTREASKLTFGQDIEITSSHNLESLLRSPPDKWLTNARITQYQVLLLDPPRVRFKQTAALNPATLLPETDDTLPIHHCLDTLDSLTSTRPDLTDQPLAQAEATLFTDGSSYIRDGKRYAGAAVVTLDSVIWAEPLPIGTSAQKAELIALTKALEWSKDKSVNIYTDSRYAFATLHVHGMIYRERGWLTAGGKAIKNAPEILALLTAVWLPKRVAVMHCKGHQKDDAPTSTGNRRADEVAREVAIRPLSTQATIS (SEQ ID NO: 77)
82 AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 76) FLV_P10273_3mutA TLQLEEEYRLFEPESTQKQEMDIWLKNFPQAWAETGGMGTAHCQAPVLIQLKATATPISIRQYPMPHEAYQGIKPHIRRMLDQGILKPCQSPWNTPLLPVKKPGTEDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSTLPPSHPWYTVLDLKDAFFCLRLHSESQLLFAFEWRDPEIGLSGQLTWTRLPQGFKNSPTLFNEALHSDLADFRVRYPALVLLQYVDDLLLAAATRTECLEGTKALLETLGNKGYRASAKKAQICLQEVTYLGYSLKDGQRWLTKARKEAILSIPVPKNSRQVREFLGKAGYCRLFIPGFAELAAPLYPLTRPGTLFQWGTEQQLAFEDIKKALLSSPALGLPDITKPFELFIDENSGFAKGVLVQKLGPWKRPVAYLSKKLDTVASGWPPCLRMVAAIAILVKDAGKLTLGQPLTILTSHPVEALVRQPPNKWLSNARMTHYQAMLLDAERVHFGPTVSLNPATLLPLPSGGNHHDCLQILAETHGTRPDLTDQPLPDADLTWYTDGSSFIRNGEREAGAAVTTESEVIWAAPLPPGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLTVYTDSRYAFATTHVHGEIYRRRGWLTSEGKEIKNKNEILALLEALFLPKRLSIIHCPGHQKGDSPQAKGNRLADDTAKKAATETHSSLTVLP (SEQ ID NO: 78)
83 AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 76) MLVMS_P03355_3mutA_WS TLNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFNEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGKAGFCRLFIPGFAEMAAPLYPLTKPGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGWLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLL (SEQ ID NO: 79)
84 AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 76) SFV3L_P27401_2mutA MDPLQLLQPLEAEIKGTKLKAHWNSGATITCVPQAFLEEEVPIKNIWIKTIHGEKEQPVYYLTFKIQGRKVEAEVISSPYDYILVSPSDIPWLMKKPLQLTTLVPLQEYEERLLKQTMLTGSYKEKLQSLFLKYDALWQHWENQVGHRRIKPHHIATGTVNPRPQKQYPINPKAKASIQTVINDLLKQGVLIQQNSIMNTPVYPVPKPDGKWRMVLDYREVNKTIPLIAAQNQHSAGILSSIFRGKYKTTLDLSNGFWAHSITPESYWLTAFTWLGQQYCWTRLPQGFLNSPALFNADVVDLLKEVPNVQVYVDDIYISHDDPREHLEQLEKVFSLLLNAGYVVSLKKSEIAQHEVEFLGFNITKEGRGLTETFKQKLLNITPPRDLKQLQSILGKLNFARNFIPNFSELVKPLYNIIATAPGKYITWTTDNSQQLQNIISMLNSAENLEERNPEVRLIMKVNTSPSAGYIRFYNEFAKRPIMYLNYVYTKAEVKFTNTEKLLTTIHKGLIKALDLGMGQEILVYSPIVSMTKIQKTPLPERKALPIRWITWMSYLEDPRIQFHYDKTLPELQQVPTVTDDIIAKIKHPSEFSMVFYTDGSAIKHPNVNKSHNAGMGIAQVQFKPEFTVINTWSIPLGDHTAQLAEVAAVEFACKKALKIDGPVLIVTDSFYVAESVNKELPYWQSNGFFNNKKKPLKHVSKWKSIADCIQLKPDIIIIHEKGHQPTASTFHTEGNNLADKLATQGSYVVN (SEQ ID NO: 80)
表 9. 對應於表 8 的全長胺基酸序列
SEQ ID NO: 胺基酸序列
81 MPAAKRVKLDGGDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKARGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAGGTAPLEEEYRLFLEAPIQNVTLLEQWKREIPKVWAEINPPGLASTQAPIHVQLLSTALPVRVRQYPITLEAKRSLRETIRKFRAAGILRPVHSPWNTPLLPVRKSGTSEYRMVQDLREVNKRVETIHPTVPNPYTLLSLLPPDRIWYSVLDLKDAFFCIPLAPESQLIFAFEWADAEEGESGQLTWTRLPQGFKNSPTLFNEALNRDLQGFRLDHPSVSLLQYVDDLLIAADTQAACLSATRDLLMTLAELGYRVSGKKAQLCQEEVTYLGFKIHKGSRSLSNSRTQAILQIPVPKTKRQVREFLGKIGYCRLFIPGFAELAQPLYAATRPGNDPLVWGEKEEEAFQSLKLALTQPPALALPSLDKPFQLFVEETSGAAKGVLTQALGPWKRPVAYLSKRLDPVAAGWPRCLRAIAAAALLTREASKLTFGQDIEITSSHNLESLLRSPPDKWLTNARITQYQVLLLDPPRVRFKQTAALNPATLLPETDDTLPIHHCLDTLDSLTSTRPDLTDQPLAQAEATLFTDGSSYIRDGKRYAGAAVVTLDSVIWAEPLPIGTSAQKAELIALTKALEWSKDKSVNIYTDSRYAFATLHVHGMIYRERGWLTAGGKAIKNAPEILALLTAVWLPKRVAVMHCKGHQKDDAPTSTGNRRADEVAREVAIRPLSTQATISAGKRTADGSEFEKRTADGSEFESPKKKAKVE
82 MPAAKRVKLDGGDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKARGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAGGTLQLEEEYRLFEPESTQKQEMDIWLKNFPQAWAETGGMGTAHCQAPVLIQLKATATPISIRQYPMPHEAYQGIKPHIRRMLDQGILKPCQSPWNTPLLPVKKPGTEDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSTLPPSHPWYTVLDLKDAFFCLRLHSESQLLFAFEWRDPEIGLSGQLTWTRLPQGFKNSPTLFNEALHSDLADFRVRYPALVLLQYVDDLLLAAATRTECLEGTKALLETLGNKGYRASAKKAQICLQEVTYLGYSLKDGQRWLTKARKEAILSIPVPKNSRQVREFLGKAGYCRLFIPGFAELAAPLYPLTRPGTLFQWGTEQQLAFEDIKKALLSSPALGLPDITKPFELFIDENSGFAKGVLVQKLGPWKRPVAYLSKKLDTVASGWPPCLRMVAAIAILVKDAGKLTLGQPLTILTSHPVEALVRQPPNKWLSNARMTHYQAMLLDAERVHFGPTVSLNPATLLPLPSGGNHHDCLQILAETHGTRPDLTDQPLPDADLTWYTDGSSFIRNGEREAGAAVTTESEVIWAAPLPPGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLTVYTDSRYAFATTHVHGEIYRRRGWLTSEGKEIKNKNEILALLEALFLPKRLSIIHCPGHQKGDSPQAKGNRLADDTAKKAATETHSSLTVLPAGKRTADGSEFEKRTADGSEFESPKKKAKVE
83 MPAAKRVKLDGGDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKARGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAGGTLNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFNEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGKAGFCRLFIPGFAEMAAPLYPLTKPGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGWLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLAGKRTADGSEFEKRTADGSEFESPKKKAKVE
84 MPAAKRVKLDGGDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKARGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAGGMDPLQLLQPLEAEIKGTKLKAHWNSGATITCVPQAFLEEEVPIKNIWIKTIHGEKEQPVYYLTFKIQGRKVEAEVISSPYDYILVSPSDIPWLMKKPLQLTTLVPLQEYEERLLKQTMLTGSYKEKLQSLFLKYDALWQHWENQVGHRRIKPHHIATGTVNPRPQKQYPINPKAKASIQTVINDLLKQGVLIQQNSIMNTPVYPVPKPDGKWRMVLDYREVNKTIPLIAAQNQHSAGILSSIFRGKYKTTLDLSNGFWAHSITPESYWLTAFTWLGQQYCWTRLPQGFLNSPALFNADVVDLLKEVPNVQVYVDDIYISHDDPREHLEQLEKVFSLLLNAGYVVSLKKSEIAQHEVEFLGFNITKEGRGLTETFKQKLLNITPPRDLKQLQSILGKLNFARNFIPNFSELVKPLYNIIATAPGKYITWTTDNSQQLQNIISMLNSAENLEERNPEVRLIMKVNTSPSAGYIRFYNEFAKRPIMYLNYVYTKAEVKFTNTEKLLTTIHKGLIKALDLGMGQEILVYSPIVSMTKIQKTPLPERKALPIRWITWMSYLEDPRIQFHYDKTLPELQQVPTVTDDIIAKIKHPSEFSMVFYTDGSAIKHPNVNKSHNAGMGIAQVQFKPEFTVINTWSIPLGDHTAQLAEVAAVEFACKKALKIDGPVLIVTDSFYVAESVNKELPYWQSNGFFNNKKKPLKHVSKWKSIADCIQLKPDIIIIHEKGHQPTASTFHTEGNNLADKLATQGSYVVNAGKRTADGSEFEKRTADGSEFESPKKKAKVE
在一些實施例中，異源基因修飾多肽具有國際申請WO/2023/039424（將其通過引用以其整體併入本文）中披露的序列，或者與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的序列。例如，在一些實施例中，異源基因修飾多肽具有如國際申請WO/2023/039424的表6（將該表通過引用以其整體併入本文）中所述的RT結構域，或者與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的序列。在一些實施例中，異源基因修飾多肽可以包含連接子，例如肽連接子，例如如國際申請WO/2023/039424的表10（將該表通過引用以其整體併入本文）中所述的連接子。在一些實施例中，異源基因修飾多肽具有根據國際申請WO/2023/039424的表T2（將該表通過引用以其整體併入本文）的序列，或者與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的序列。在一些實施例中，異源基因修飾多肽具有根據國際申請WO/2023/039424的表A1（將該表通過引用以其整體併入本文）的序列，或者與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的序列。
在一些實施例中，基因修飾多肽包含來自反轉錄病毒反轉錄酶的RT結構域，例如M-MLV RT，例如包含以下序列：
TLNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLL（SEQ ID NO: 85），或者與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的序列。
在一些實施例中，相對於上述M-MLV（WT）序列，M-MLV RT結構域包含一個或多個突變，例如選自D200N、L603W、T330P、T306K、W313F、D524G、E562Q、D583N、P51L、S67R、E67K、T197A、H204R、E302K、F309N、L435G、N454K、H594Q、D653N、R110S、K103L，例如突變的組合，如D200N、L603W和T330P，任選地進一步包括T306K和W313F。在一些實施例中，本文使用的M-MLV RT包含突變D200N、L603W、T330P、T306K和W313F。在實施例中，突變體M-MLV RT包含以下胺基酸序列：
TLNIEDEYRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFNEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGKAGFCRLFIPGFAEMAAPLYPLTKPGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGWLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLI (SEQ ID NO: 86)
示例性基因修飾系統包含突變體M-MLV RT區：
MPAAKRVKLDGGDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKARGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGTLNIEDEYRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFNEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGKAGFCRLFIPGFAEMAAPLYPLTKPGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGWLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLIENSSPSGGSKRTADGSEFEAGKRTADGSEFEKRTADGSEFESPKKKAKVE (SEQ ID NO: 87)
在一些實施例中，異源基因修飾多肽包含根據SEQ ID NO: 4002的胺基酸序列，或者與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的序列。
在一些實施例中，用於系統的範本RNA分子從5'至3'包含 (1) gRNA間隔子；(2) gRNA支架；(3) 異源目標序列；(4) 引子結合位點（PBS）序列。在一些實施例中： (1) 是約18-22 nt的gRNA間隔子，例如是20 nt； (2) 是gRNA支架，其包含一個或多個髮夾環，例如用於將範本與Cas結構域（例如，切口酶Cas9結構域）締合的1、2或3個環。在一些實施例中，gRNA支架從5'至3'包含序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCC（SEQ ID NO: 88）。 (3) 在一些實施例中，異源目標序列的長度是例如7-74，例如10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70或70-80 nt或80-90 nt。 (4) 在一些實施例中，在產生切口後結合靶引發序列的PBS序列是例如3-20 nt，例如7-15 nt，例如12-14 nt。在一些實施例中，PBS序列具有40-60% GC含量。
V. 脂質奈米顆粒
本公開文本提供了脂質奈米顆粒（LNP），其通過如本文所公開的特異性酶識別的連接子以位點特異性方式與靶向部分綴合。在一些實施例中，脂質奈米顆粒包含一個或多個離子脂質，如非陽離子脂質（例如，中性或陰離子或兩性離子脂質）；一個或多個綴合的脂質（如PEG綴合的脂質或與WO 2019217941的表5中所述的聚合物綴合的脂質；通過引用以其整體併入本文）；一個或多個甾醇（例如，膽固醇）；或前述項的組合。本文所述的綴合方法可以用於將靶向部分（或多個靶向部分）位點特異性地綴合至構成各種配製品和特定脂質組合物的LNP的表面。
可用於形成奈米顆粒（例如，脂質奈米顆粒）的脂質包括例如通過引用併入的US 20210371858的表4中所述的那些，例如含脂質的奈米顆粒可以包含US 20210371858的表4中的脂質中的一個或多個。脂質奈米顆粒可以包含另外的要素，如聚合物，如通過引用併入的US 20210371858的表5中所述的聚合物。
在一些實施例中，綴合的脂質（當存在時）可以包括以下中的一個或多個：PEG-二醯基甘油（DAG）（例如1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（如4-O-(2',3'-二(十四碳醯氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基威百畝、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽和US 20210059953（通過引用併入）的表2中所述的那些，以及前述項的組合。
在一些實施例中，可以摻入脂質奈米顆粒中的甾醇包括膽固醇或膽固醇衍生物中的一種或多種，如通過引用併入的US 11141378或US 2010/0130588中的那些。另外的示例性甾醇包括植物甾醇，包括通過引用併入本文的Eygeris等人 (2020), dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中所述的那些。
在一些實施例中，脂質顆粒包含可電離脂質、非陽離子脂質、抑制顆粒聚集的綴合的脂質以及甾醇。這些組分的量可以單獨地變化以獲得所需的特性。例如，在一些實施例中，脂質奈米顆粒包含：總脂質的約20 mol%至約90 mol%（在其他實施例中，其可以是脂質奈米顆粒中存在的總脂質的20%-70%（mol）、30%-60%（mol）或40%-50%（mol）；約50 mol%至約90 mol%）的量的可電離脂質、總脂質的約5 mol%至約30 mol%的量的非陽離子脂質、總脂質的約0.5 mol%至約20 mol%的量的綴合脂質以及總脂質的約20 mol%至約50 mol%的量的甾醇。總脂質與核酸的比率可以根據需要變化。例如，總脂質與核酸（質量或重量）比率可以是約10 : 1至約30 : 1。
在一些實施例中，脂質與核酸的比率（質量/質量比率；w/w比率）可以在約1 : 1至約25 : 1、約10 : 1至約14 : 1、約3 : 1至約15 : 1、約4 : 1至約10 : 1、約5 : 1至約9 : 1或約6 : 1至約9 : 1的範圍內。  可以調節脂質和核酸的量以提供所需的N/P比率，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比率。通常，脂質奈米顆粒配製品的總脂質含量可以在約5 mg/mL至約30 mg/mL的範圍內。
可用於（例如，與其他脂質組分組合使用）形成用於本文所述綴合物的脂質奈米顆粒的脂質化合物的一些非限制性例子包括式(i)-(ix)中任一個的脂質。 (i) (ii) \ (iii) (iv) (v) (vi) (vii) (viii) (ix)
可用於（例如，與其他脂質組分組合使用）形成用於本文所述綴合物的脂質奈米顆粒的脂質化合物的另一個非限制性例子包括式(x)的脂質： (x) 其中 X 1是O、NR 1或直接的鍵，X 2是C2-5亞烷基，X 3是C(=0)或直接的鍵，R 1是H或Me，R 3是C1-3烷基，R 2是C1-3烷基，或R 2與其所附接的氮原子和X 2的1-3個碳原子一起形成4、5或6元環，或X 1是NR 1，R 1和R 2與它們所附接的氮原子一起形成5或6元環，或R 2與R 3和它們所附接的氮原子一起形成5、6或7元環，Y 1是C2-12亞烷基，Y 2選自 （任一取向）、   （任一取向）、    （任一取向）、 n是0至3，R 4是C1-15烷基，Z 1是C1-6亞烷基或直接的鍵， （任一取向）或不存在，條件是如果Z 1是直接的鍵，則Z 2不存在； R 5是C5-9烷基或C6-10烷氧基，R 6是C5-9烷基或C6-10烷氧基，W是亞甲基或直接的鍵，並且R 7是H或Me或其鹽，條件是如果R 3和R 2是C2烷基，則X 1是O，X 2是線性C3亞烷基，X 3是C(=0)，Y 1是線性Ce亞烷基，(Y 2)n-R 4是 ，R 4是線性C5烷基，Z 1是C2亞烷基，Z 2不存在，W是亞甲基，並且R 7是H，則R 5和R 6不是Cx烷氧基。
可用於（例如，與其他脂質組分組合使用）形成用於本文所述綴合物的脂質奈米顆粒的脂質化合物的另一個非限制性例子包括式(xi)的脂質： (xi)
可用於（例如，與其他脂質組分組合使用）形成用於本文所述綴合物的脂質奈米顆粒的脂質化合物的另一個非限制性例子包括式 (xii)-(xiv) 中任一個的脂質： 其中R = (xii) (xiii) (xiv)
可用於（例如，與其他脂質組分組合使用）形成用於本文所述綴合物的脂質奈米顆粒的脂質化合物的另一個非限制性例子包括式 (xv) 的脂質： (xv)
可用於（例如，與其他脂質組分組合使用）形成用於本文所述綴合物的脂質奈米顆粒的脂質化合物的另一個非限制性例子包括式 (xvi) 的脂質： (xvi)
可用於（例如，與其他脂質組分組合使用）形成用於本文所述綴合物的脂質奈米顆粒的脂質化合物的另一個非限制性例子包括式 (xvii)-(xix) 中任一個的脂質： (xvii) 其中X = (xviii) (a) (xviii)(b) (xix)
可用於（例如，與其他脂質組分組合使用）形成用於本文所述綴合物的脂質奈米顆粒的脂質化合物的另一個非限制性例子包括式 (xx)(a) 或 (xx)(b) 中任一個的脂質： + (xx) (a) + (xx)(b)
在一些實施例中，本文所述的綴合物包含LNP，所述LNP包含可電離脂質。在一些實施例中，可電離脂質是十七烷-9-基 8-((2-羥基乙基)(6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基)胺基)辛酸酯（SM-102）；例如，如US 9,867,888（通過引用以其整體併入本文）的實例1中所述。在一些實施例中，可電離脂質是(9Z,12Z)-3-((4,4-二(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基 十八碳-9,12-二烯酸酯（LP01），例如，如US 11420933（通過引用以其整體併入本文）的實例13中合成的。在一些實施例中，可電離脂質是二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸酯（L319），例如，如US 2012/0027803（通過引用以其整體併入本文）的實例7、8或9中合成的。在一些實施例中，可電離脂質是1,1'-((2-(4-(2-((2-(二(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)二(十二烷-2-醇)（C12-200），例如，如US 8450298（通過引用以其整體併入本文）的實例14和16中合成的。在一些實施例中，可電離脂質是咪唑膽固醇酯（ICE）脂質(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基 3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，例如，來自US 2022/0324926（通過引用以其整體併入本文）的結構 (I)。
在一些實施例中，可電離脂質可以是陽離子脂質、可電離陽離子脂質（例如，取決於pH可以以帶正電荷或中性形式存在的陽離子脂質）或可以容易質子化的含胺脂質。在一些實施例中，陽離子脂質是例如在生理條件下能夠帶正電荷的脂質。示例性陽離子脂質包括一個或多個帶正電荷的胺基團。在一些實施例中，脂質顆粒在配製品中包含陽離子脂質，所述配製品具有以下中的一種或多種：中性脂質、可電離含胺脂質、可生物降解的鏈烷脂質、類固醇、磷脂（包括多不飽和脂質）、結構脂質（例如，甾醇）、PEG、膽固醇和聚合物綴合的脂質。在一些實施例中，陽離子脂質可以是可電離陽離子脂質。如本文所公開的示例性陽離子脂質可以具有超過6.0的有效pKa。在實施例中，脂質奈米顆粒可以包含具有與第一陽離子脂質不同的有效pKa（例如，大於第一有效pKa）的第二陽離子脂質。脂質奈米顆粒可以包含的30 mol%與60 mol%之間的陽離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物綴合的脂質以及包封在脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒締合的治療劑，例如本文所述的核酸（例如，RNA）（例如，範本核酸或編碼所需多肽的核酸）。在一些實施例中，將核酸與陽離子脂質共配製。核酸可以被吸附到LNP（例如，包含陽離子脂質的LNP）的表面。在一些實施例中，核酸可以被包封在LNP（例如，包含陽離子脂質的LNP）中。在一些實施例中，脂質奈米顆粒可以包含靶向部分（例如，用靶向劑包被）。在實施例中，LNP配製品是可生物降解的。在一些實施例中，包含本文所述的一種或多種脂質（例如，式 (i)、(ii)、(ii)、(vii) 和/或 (ix)）的脂質奈米顆粒包封至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%或100%的RNA分子，例如範本RNA和/或編碼所需多肽的mRNA。
可用於所公開的綴合物中的示例性可電離脂質包括而不限於通過引用併入本文的US 20210059953的表1中列出的那些。另外的示例性脂質包括而不限於下式中的一種或多種：US 2016/0311759的X；US 20150376115或US 2016/0376224的I；US 20160151284的I、II或III；US 20170210967的I、IA、II或IIA；US 20150140070的Iincorpo-c；US 2013/0178541的A；US 2013/0303587或US 2013/0123338的I；US 2015/0141678的I；US 2015/0239926的II、III、IV或V；US 2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US 2012/0149894的A；US 2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US 2013/0090372的A；US 2013/0274523的A；US 2013/0274504的A；US 2013/0053572的A；W0 2013/016058的A；W0 2012/162210的A；US 2008/042973的I；US 2012/01287670的I、II、III或IV；US 2014/0200257的I或II；US 2015/0203446的I、II或III；US 2015/0005363的I或III；US 2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III-XXIV；US 2013/0338210的；W0 2009/132131的I、II、III或IV；US 2012/01011478的A；US 2012/0027796的I或XXXV；US 2012/0058144的XIV或XVII；US 2013/0323269的；US 2011/0117125的I；US 2011/0256175的I、II或III；US 2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US 2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；US 2006/008378的I或II；US 2013/0123338的I；US 2015/0064242的I或X-A-Y-Z；US 2013/0022649的XVI、XVII或XVIII；US 2013/0116307的I、II或III；US 2013/0116307的I、II或III；US 2010/0062967的I或II；US 2013/0189351的I-X；US 2014/0039032的I；US 2018/0028664的V；US 2016/0317458的I；US 2013/0195920的I；US 10,221,127的5、6或10；WO 2018/081480的III-3；WO 2020/081938的I-5或I-8；US9,867,888的18或25；US 2019/0136231的A；WO 2020/219876的II；US 2012/0027803的1；US 2019/0240349的OF-02；US10,086,013的23；Miao等人 (2020)的cKK-E12/A6；WO2010/053572的C12-200；Dahlman等人 (2017)的7C1；Whitehead等人的304-O13或503-O13；US9,708,628的TS-P4C2；WO 2020/106946的I；WO 2020/106946的I。
在一些實施例中，可電離脂質是MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基胺基)丁酸甲酯（DLin-MC3-DMA或MC3），例如，如US 2021/0059953（通過引用以其整體併入本文）的實例9中所述。在一些實施例中，可電離脂質是脂質ATX-002，例如，如US 2021/0059953（通過引用以其整體併入本文）的實例10中所述。在一些實施例中，可電離脂質是(13Z,16Z)-A,A-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺（化合物32），例如，如US 2021/0059953（通過引用以其整體併入本文）的實例11中所述。在一些實施例中，可電離脂質是化合物6或化合物22，例如，如US 2021/0059953（通過引用以其整體併入本文）的實例12中所述。
具體的可電離脂質示於表10中。
表 10 ：可電離脂質
脂質ID 化學名稱 分子量 結構
LIPIDV003 (9Z,12Z)-3-((4,4-二(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基 十八碳-9,12-二烯酸酯 852.29
LIPIDV004 十七烷-9-基 8-((2-羥基乙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)胺基)辛酸酯 710.18
LIPIDV005 919.56
示例性非陽離子脂質包括但不限於二硬脂醯-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、二油醯基磷脂醯膽鹼（DOPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二油醯基磷脂醯甘油（DOPG）、二棕櫚醯磷脂醯甘油（DPPG）、二油醯基-磷脂醯乙醇胺棕（DOPE）、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼（POPC）、棕櫚醯油醯基磷脂醯乙醇胺（POPE）、二油醯基-磷脂醯乙醇胺 4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯（DOPE-mal）、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-磷脂醯-乙醇胺（DSPE）、單甲基-磷脂醯乙醇胺（如16-O-單甲基PE）、二甲基-磷脂醯乙醇胺（如16-O-二甲基PE）、18-1-反式PE、1-硬脂醯-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺（SOPE）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、蛋磷脂醯膽鹼（EPC）、二油醯基磷脂醯絲胺酸（DOPS）、鞘磷脂（SM）、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼（DMPC）、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油（DMPG）、二硬脂醯磷脂醯甘油（DSPG）、二芥醯磷脂醯膽鹼（DEPC）、棕櫚醯油醯基磷脂醯甘油（POPG）、二反油醯基-磷脂醯乙醇胺（DEPE）、卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、鞘磷脂、蛋鞘磷脂（ESM）、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、雙十六烷基磷酸酯、溶血磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼或其混合物。應當理解，也可以使用其他二醯基磷脂醯膽鹼和二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂。這些脂質中的醯基優選地是源自具有C10-C24碳鏈的脂肪酸的醯基，例如月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基或油醯基。在某些實施例中，另外的示例性脂質包括而不限於通過引用併入本文的Kim等人 (2020) dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中所述的那些。在一些實施例中，此類脂質包括發現改善mRNA的肝臟轉染的植物脂質（例如，DGTS）。
適用於脂質奈米顆粒的非陽離子脂質的其他例子包括而不限於非磷酸脂質，例如像硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙醯基棕櫚酸酯、甘油蓖麻油酸酯、十六烷基硬脂酸酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、硫酸三乙醇胺月桂酯、烷基-芳基硫酸聚乙氧基化脂肪酸醯胺、雙十八烷基二甲基溴化銨、神經醯胺、鞘磷脂等。其他非陽離子脂質描述於WO 2017/099823或美國專利公開案US 2018/0028664中，將其內容通過引用以其整體併入本文。
在一些實施例中，非陽離子脂質是油酸或通過引用以其整體併入本文的US 2018/0028664的式I、II或IV的化合物。非陽離子脂質可以占例如脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0-30%（mol）。在一些實施例中，非陽離子脂質含量是脂質奈米顆粒中存在的總脂質的5%-20%（mol）或10%-15%（mol）。在實施例中，可電離脂質與中性脂質的莫耳比率範圍是從約2 : 1至約8 : 1（例如，約2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1、6 : 1、7 : 1或8 : 1）。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒不包含任何磷脂。
在一些態樣，脂質奈米顆粒可以進一步包含組分（如甾醇）以提供膜完整性。可用於脂質奈米顆粒中的一種示例性甾醇是膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物的非限制性例子包括極性類似物，如5a-膽甾烷醇、53-糞甾烷醇、膽甾醇基-(2'-羥基)-乙基醚、膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚和6-酮膽甾烷醇；非極性類似物，如5a-膽甾烷、膽甾酮、5a-膽甾酮、5p-膽甾酮和膽甾醇基癸酸酯；及其混合物。在一些實施例中，膽固醇衍生物是極性類似物，例如膽固醇-(4'-羥基)-丁基醚。示例性膽固醇衍生物描述於通過引用以其整體併入本文的PCT公開案W0 2009/127060和美國專利公開案US 2010/0130588中。
在一些實施例中，提供膜完整性的組分（如甾醇）可以占脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0-50%（mol）（例如，0-10%、10%-20%、20%-30%、30%-40%或40%-50%）。在一些實施例中，這種組分是脂質奈米顆粒的總脂質含量的20%-50%（mol）、30%-40%（mol）。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒可以包含聚乙二醇（PEG）或綴合脂質分子。通常，這些用於抑制脂質奈米顆粒的聚集和/或提供空間穩定。示例性的綴合脂質包括但不限於PEG-脂質綴合物、聚噁唑啉（POZ）-脂質綴合物、聚醯胺-脂質綴合物（如ATTA-脂質綴合物）、陽離子-聚合物脂質（CPL）綴合物及其混合物。在一些實施例中，綴合脂質分子是PEG-脂質綴合物，例如(甲氧基聚乙二醇)綴合脂質。
示例性PEG-脂質綴合物包括但不限於：PEG-二醯基甘油（DAG）（例如1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（如4-O-(2',3'-二(十四碳醯氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基威百畝、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽或其混合物。另外的示例性PEG-脂質綴合物描述於例如US5,885,613、US6,287,591、US 2003/0077829、US 2003/0077829、US 2005/0175682、US 2008/0020058、US 2011/0117125、US 2010/0130588、US2 016/0376224、US 2017/0119904和US/099823中，將所有這些專利的內容通過引用以其整體併入本文。在一些實施例中，PEG-脂質是US 2018/0028664的式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2或V的化合物，將所述專利通過引用以其整體併入本文。在一些實施例中，PEG-脂質具有US 20150376115或US 2016/0376224的式II，其兩者的內容通過引用以其整體併入本文。在一些實施例中，PEG-DAA綴合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕櫚醯氧基丙基或PEG-二硬脂醯氧基丙基。PEG-脂質可以是以下中的一種或多種：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕櫚醯甘油、PEG-二硬脂醯甘油、PEG-二月桂基甘醯胺、PEG-二肉豆蔻基甘醯胺、PEG-二棕櫚醯甘醯胺、PEG-二硬脂醯甘醯胺、PEG-膽固醇（1-[8'-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛烷基]胺基甲醯基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB（3,4-雙十四烷氧基苄基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)乙醚）以及1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施例中，PEG-脂質包含PEG-DMG，1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施例中，PEG-脂質包含選自以下的結構：
在一些實施例中，還可以使用與PEG以外的分子綴合的脂質代替PEG-脂質。例如，聚噁唑啉（POZ）-脂質綴合物、聚醯胺-脂質綴合物（如ATTA-脂質綴合物）和陽離子-聚合物脂質（GPL）綴合物可以代替PEG-脂質或與PEG-脂質組合使用。
示例性的綴合脂質，即PEG-脂質、(POZ)-脂質綴合物、ATTA-脂質綴合物和陽離子聚合物-脂質描述於US 2021/0059953的表2中列出的PCT和LIS專利申請中，將所有這些專利申請通過引用以其整體併入本文。
在一些實施例中，PEG或綴合脂質可以占脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0-20%（mol）。在一些實施例中，PEG或綴合脂質含量是脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0.5%-10%或2%-5%（mol）。可電離脂質、非陽離子脂質、甾醇和PEG/綴合脂質的莫耳比率可以根據需要變化。例如，脂質顆粒可以包含按莫耳計或按組合物的總重量計30%-70%可電離脂質、按莫耳計或按組合物的總重量計0-60%膽固醇、按莫耳計或按組合物的總重量計0-30%非陽離子脂質以及按莫耳計或按組合物的總重量計1%-10%綴合脂質。優選地，組合物包含按莫耳計或按組合物的總重量計30%-40%可電離脂質、按莫耳計或按組合物的總重量計40%-50%膽固醇以及按莫耳計或按組合物的總重量計10%-20%非陽離子脂質。在一些其他實施例中，組合物包含按莫耳計或按組合物的總重量計50%-75%可電離脂質、按莫耳計或按組合物的總重量計20%-40%膽固醇、和按莫耳計或按組合物的總重量計5%至10%非陽離子脂質以及按莫耳計或按組合物的總重量計1%-10%綴合脂質。組合物可以含有按莫耳計或按組合物的總重量計60%-70%可電離脂質、按莫耳計或按組合物的總重量計25%-35%膽固醇以及按莫耳計或按組合物的總重量計5%-10%非陽離子脂質。組合物還可以含有按莫耳計或按組合物的總重量計多達90%可電離脂質和按莫耳計或按組合物的總重量計2%至15%非陽離子脂質。配製品還可以是脂質奈米顆粒配製品，例如包含按莫耳計或按組合物的總重量計8-30%可電離脂質、按莫耳計或按組合物的總重量計5%-30%非陽離子脂質和按莫耳計或按組合物的總重量計0-20%膽固醇；按莫耳計或按組合物的總重量計4%-25%可電離脂質、按莫耳計或按組合物的總重量計4%-25%非陽離子脂質、按莫耳計或按組合物的總重量計2%至25%膽固醇、按莫耳計或按組合物的總重量計10%至35%綴合脂質和按莫耳計或按組合物的總重量計5%膽固醇；或按莫耳計或按組合物的總重量計2%-30%可電離脂質、按莫耳計或按組合物的總重量計2%-30%非陽離子脂質、按莫耳計或按組合物的總重量計1%至15%膽固醇、按莫耳計或按組合物的總重量計2%至35%綴合脂質和按莫耳計或按組合物的總重量計1%-20%膽固醇；或按莫耳計或按組合物的總重量計甚至多達90%可電離脂質和按莫耳計或按組合物的總重量計2%-10%非陽離子脂質或按莫耳計或按組合物的總重量計甚至100%陽離子脂質。在一些實施例中，脂質顆粒配製品包含莫耳比率為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質、磷脂、膽固醇和聚乙二醇化脂質。在一些其他實施例中，脂質顆粒配製品包含莫耳比率為60 : 38.5 : 1.5的可電離脂質、膽固醇和聚乙二醇化脂質。
在一些實施例中，脂質顆粒包含可電離脂質、非陽離子脂質（例如磷脂）、甾醇（例如，膽固醇）和聚乙二醇化脂質，其中脂質的莫耳比率範圍是從20莫耳%至70莫耳%（目標是40莫耳%-60莫耳%），非陽離子脂質的莫耳百分比範圍是從0至30莫耳%（目標是0至15莫耳%），甾醇的莫耳百分比範圍是從20莫耳%至70莫耳%（目標是從30莫耳%至50莫耳%），並且聚乙二醇化脂質的莫耳百分比範圍是從1莫耳%至6莫耳%（目標是2莫耳%至5莫耳%）。
在一些實施例中，脂質顆粒包含莫耳比率為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質/非陽離子脂質/甾醇/綴合脂質。
在一個態樣，本公開文本提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂醯膽鹼和磷脂醯乙醇胺的脂質奈米顆粒配製品。
在一些實施例中，通過添加靶向結構域（除了所公開的綴合物的靶向部分之外）將LNP定向至特定細胞類型或組織。例如，生物配體可以展示在LNP的表面上，以增強與展示同源受體的細胞的相互作用，從而驅動與組織（其中細胞表現受體）的締合以及向組織的貨物遞送。在一些實施例中，生物配體可以是驅動遞送至肝臟的配體，例如，展示GalNAc的LNP導致將核酸貨物遞送至展示脫唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）的肝細胞。Akinc等人 Mol Ther18(7):1357-1364 (2010)的工作教導了三價GalNAc配體與PEG-脂質的綴合（GalNAc-PEG-DSG）以產生依賴於ASGPR的LNP，以用於可觀察到的LNP貨物效應（參見例如，Akinc等人 2010, 同上的圖6）。其他配體展示LNP配製品（例如，摻入了葉酸、轉鐵蛋白或抗體）在WO 2017223135中進行了討論，將所述專利以及其中所用的參考文獻通過引用以其整體併入本文，參考文獻即Kolhatkar等人, Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206；Musacchio和Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388-1412；Yu等人, Mol Membr Biol. 2010 27:286-298；Patil等人, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61 ；Benoit等人, Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714；Zhao等人, Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:309-319；Akinc等人, Mol Ther. 2010 18:1357-1364；Srinivasan等人, Methods Mol Biol. 2012 820:105-116；Ben-Arie等人, Methods Mol Biol. 2012 757:497-507；Peer 2010 J Control Release. 20:63-68；Peer等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:4095-4100；Kim等人, Methods Mol Biol. 2011 721:339-353；Subramanya等人, Mol Ther. 2010 18:2028-2037；Song等人, Nat Biotechnol. 2005 23:709-717；Peer等人, Science. 2008 319:627-630；以及Peer和Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133。
在一些實施例中，通過將選擇性器官靶向（SORT）分子添加到包含傳統組分（如可電離陽離子脂質、兩親性磷脂、膽固醇和聚(乙二醇)（PEG）脂質）的配製品中，針對組織特異性活性選擇LNP。Cheng等人 Nat Nanotechnol 15(4):313-320 (2020)的教導證明，添加補充的「SORT」組分精確地改變體內RNA遞送譜並介導隨著SORT分子的百分比和生物物理特性而變化的組織特異性（例如，肺、肝、脾）基因遞送和編輯。
在一些實施例中，LNP包含可生物降解的、可電離脂質。在一些實施例中，LNP包含(9Z,12Z)-3-((4,4-二(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基 十八碳-9,12-二烯酸酯，也稱為3-((4,4-二(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基 (9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯)或另一種可電離脂質。參見例如，WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340和WO 2014/136086以及其中提供的參考文獻的脂質。在一些實施例中，在LNP脂質的上下文中，術語陽離子和可電離是可互換的，例如，其中可電離脂質取決於pH是陽離子脂質。
在一些實施例中，LNP配製品的平均LNP直徑可以在10 nm與150 nm之間，例如通過動態光散射（DLS）測量。在一些實施例中，LNP配製品的平均LNP直徑可以在10 nm與100 nm之間，例如通過動態光散射（DLS）測量。在一些實施例中，LNP配製品的平均LNP直徑可以是從約40 nm至約150 nm，如約40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm。在一些實施例中，LNP配製品的平均LNP直徑可以是從約70 nm至約150 nm、從約80 nm至約120 nm、從約80 nm至約110 nm、從約50 nm至約100 nm、從約50 nm至約90 nm、從約50 nm至約80 nm、從約50 nm至約70 nm、從約50 nm至約60 nm、從約60 nm至約100 nm、從約60 nm至約90 nm、從約60 nm至約80 nm、從約60 nm至約70 nm、從約70 nm至約100 nm、從約70 nm至約90 nm、從約70 nm至約80 nm、從約80 nm至約100 nm、從約80 nm至約90 nm、或從約90 nm至約100 nm。在一些實施例中，LNP配製品的平均LNP直徑可以是從約70 nm至約100 nm。在特定實施例中，LNP配製品的平均LNP直徑可以是約80 nm。在一些實施例中，LNP配製品的平均LNP直徑可以是約100 nm。在一些實施例中，LNP配製品的平均LNP直徑範圍是從約1 mm至約500 mm、從約5 mm至約200 mm、從約10 mm至約100 mm、從約20 mm至約80 mm、從約25 mm至約60 mm、從約30 mm至約55 mm、從約35 mm至約50 mm或從約38 mm至約42 mm。
在一些情況下，LNP可以是相對均勻的。多分散性指數可以用於指示LNP的均勻性，例如脂質奈米顆粒的細微性分佈。小（例如，小於0.3）的多分散性指數通常指示窄的細微性分佈。LNP可以具有從約0至約0.25的多分散性指數，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些實施例中，LNP的多分散性指數可以是從約0.10至約0.20。
LNP的ζ電勢可以用於指示組合物的電動電勢。在一些實施例中，ζ電勢可以描述LNP的表面電荷。具有相對低電荷（正或負）的脂質奈米顆粒通常是所期望的，因為更高電荷的種類可能與體內的細胞、組織和其他要素不期望地相互作用。在一些實施例中，LNP的ζ電勢可以是從約-10 mV至約+20 mV、從約-10 mV至約+15 mV、從約-10 mV至約+10 mV、從約-10 mV至約+5 mV、從約-10 mV至約0 mV、從約-10 mV至約-5 mV、從約-5 mV至約+20 mV、從約-5 mV至約+15 mV、從約-5 mV至約+10 mV、從約-5 mV至約+5 mV、從約-5 mV至約0 mV、從約0 mV至約+20 mV、從約0 mV至約+15 mV、從約0 mV至約+10 mV、從約0 mV至約+5 mV、從約+5 mV至約+20 mV、從約+5 mV至約+15 mV或從約+5 mV至約+10 mV。
蛋白質和/或編碼多肽的核酸（例如，DNA或RNA，如mRNA）的包封效率描述了相對於所提供的初始量，在製備後被包封或以其他方式與LNP締合的蛋白質和/或核酸的量。期望包封效率是高的（例如，接近100%）。可以例如通過以下方式測量包封效率：比較在用一種或多種有機溶劑或洗滌劑分解脂質奈米顆粒之前和之後含有脂質奈米顆粒的溶液中蛋白質或核酸的量。陰離子交換樹脂可以用於測量溶液中游離蛋白質或核酸（例如，RNA）的量。螢光可以用於測量溶液中游離蛋白質和/或核酸（例如，RNA）的量。對於本文所述的脂質奈米顆粒，蛋白質和/或核酸的包封效率可以是至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，包封效率可以是至少80%。在一些實施例中，包封效率可以是至少90%。在一些實施例中，包封效率可以是至少95%。
LNP可以任選地包含一個或多個包衣。在一些實施例中，LNP可以配製在具有包衣的膠囊、薄膜或片劑中。包含本文所述的組合物的膠囊、薄膜或片劑可以具有任何有用的尺寸、抗拉強度、硬度或密度。
可用於遞送核酸的另外的特定LNP配製品描述於US8158601和US8168775中，將兩者均通過引用併入，其包括在以名稱ONPATTRO出售的帕蒂西蘭（patisiran）中使用的配製品。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒（或包含脂質奈米顆粒的配製品）缺乏反應性雜質（例如，醛或酮），或包含小於預選水準的反應性雜質（例如，醛或酮）。雖然不希望受理論束縛，但在一些實施例中，脂質試劑用於製備脂質奈米顆粒配製品，並且脂質試劑可以包含污染性反應性雜質（例如，醛或酮）。可以基於具有小於預選水準的反應性雜質（例如，醛或酮）來選擇用於製造的脂質試劑。不希望受理論束縛，在一些實施例中，醛可以引起RNA的修飾和損傷，例如鹼基之間的交聯和/或脂質與RNA的共價綴合（例如，形成脂質-RNA加合物）。在一些情況下，這可能導致反轉錄酶反應的失敗和/或不適當鹼基的摻入，例如在一個或多個病變的一個或多個位點處，例如新合成的靶DNA中的突變。
在一些實施例中，使用包含少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%總反應性雜質（例如，醛）含量的脂質試劑產生脂質奈米顆粒配製品。在一些實施例中，使用包含少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%任何單一反應性雜質（例如，醛）種類的脂質試劑產生脂質奈米顆粒配製品。在一些實施例中，使用脂質試劑產生脂質奈米顆粒配製品，所述脂質試劑包含：(i) 少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%總反應性雜質（例如，醛）含量；以及 (ii) 少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%任何單一反應性雜質（例如，醛）種類。在一些實施例中，使用多種脂質試劑產生脂質奈米顆粒配製品，並且多種脂質試劑中的每種脂質試劑獨立地滿足本段中描述的一個或多個標準。在一些實施例中，多種脂質試劑中的每種脂質試劑滿足相同的標準，例如本段的標準。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒配製品包含少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%總反應性雜質（例如，醛）含量。在一些實施例中，脂質奈米顆粒配製品包含少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%任何單一反應性雜質（例如，醛）種類。在一些實施例中，脂質奈米顆粒配製品包含：(i) 少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%總反應性雜質（例如，醛）含量；以及 (ii) 少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%任何單一反應性雜質（例如，醛）種類。
在一些實施例中，用於如本文所述的脂質奈米顆粒或其配製品的脂質試劑中的一種或多種或任選地全部包含少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%總反應性雜質（例如，醛）含量。在一些實施例中，用於如本文所述的脂質奈米顆粒或其配製品的脂質試劑中的一種或多種或任選地全部包含少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%任何單一反應性雜質（例如，醛）種類。在一些實施例中，用於如本文所述的脂質奈米顆粒或其配製品的脂質試劑中的一種或多種或任選地全部包含：(i) 少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%總反應性雜質（例如，醛）含量；以及 (ii) 少於5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%任何單一反應性雜質（例如，醛）種類。
在一些實施例中，通過液相層析法（LC）（例如，與串聯質譜法（MS/MS）耦合）測定總醛含量和/或任何單一反應性雜質（例如，醛）種類的量，例如，如本文所述。在一些實施例中，通過以下方式測定反應性雜質（例如，醛）含量和/或反應性雜質（例如，醛）種類的量：檢測與例如脂質試劑中反應性雜質（例如，醛）的存在有關的核酸分子（例如，RNA分子，例如，如本文所述）的一種或多種化學修飾。在一些實施例中，通過以下方式測定反應性雜質（例如，醛）含量和/或反應性雜質（例如，醛）種類的量：檢測與例如脂質試劑中反應性雜質（例如，醛）的存在有關的核苷酸或核苷（例如，核糖核苷酸或核糖核苷，例如，包含在範本核酸中的或從範本核酸分離的，例如，如本文所述）的一種或多種化學修飾，例如，如本文所述。在實施例中，例如，使用LC-MS/MS分析，通過確定一種或多種修飾的核苷酸或核苷的存在來檢測核酸分子、核苷酸或核苷的化學修飾，例如，如本文所述。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒是脂質體或其他類似的囊泡。脂質體是由包圍內部水性隔室的單層或多層脂質雙層和相對不可滲透的外部親脂性磷脂雙層組成的球形囊泡結構。脂質體可以是陰離子的、中性的或陽離子的。脂質體是生物相容的、無毒的，可以遞送親水性和親脂性藥物分子，保護其貨物免受血漿酶的降解，並將其載荷運輸穿過生物膜和血腦障壁（BBB）（參見例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, Article ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679以供查閱）。
囊泡可以由幾種不同類型的脂質製成；然而，磷脂最常用於產生作為藥物載體的脂質體。用於製備多層囊泡脂質的方法是本領域已知的（參見例如，美國專利號6,693,086，將其涉及多層囊泡脂質製備的教導通過引用併入本文）。儘管當脂質膜與水溶液混合時囊泡形成可以是自發的，但也可以通過使用均化器、超聲波發生器或擠壓裝置以搖動的形式施加力來加快進行（參見例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, Article ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679以供查閱）。可以通過擠壓通過尺寸漸減的過濾器來製備擠壓的脂質，如Templeton等人, Nature Biotech, 15:647-652, 1997中所述，將其涉及擠出的脂質製備的教導通過引用併入本文。
已經出乎意料地發現，本文公開的綴合物中增加量的非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）改善有效載荷（例如，mRNA）向目的細胞（例如，T細胞或HSC）的遞送。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約7 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約4 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約3 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約2.5 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約2 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1.5 : 1至約2.5 : 1。在一些實施例中，可電離脂質與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約2 : 1至約2.5 : 1。
另外，本文公開的綴合物中非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）與所述膽固醇分子的增加的比率可以導致有效載荷（例如，mRNA）向目的細胞（例如，T細胞或HSC）的增加的遞送。在一些實施例中，膽固醇分子與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約6 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，膽固醇分子與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約3 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，膽固醇分子與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約2 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，膽固醇分子與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1.5 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，膽固醇分子與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 1至約0.5 : 1。在一些實施例中，膽固醇分子與非聚乙二醇化磷脂（例如，DSPC）之間的比率是從約1 : 2至約0.8 : 1。
與點擊柄結合的脂質
根據本公開文本，點擊柄（即，第二點擊柄）可以與脂質分子化學反應以提供能夠與互補點擊柄（即，第一點擊柄）反應的修飾的脂質，所述互補點擊柄已被位點特異性地引入至靶向部分（例如抗體、Fab片段或ScFv）。第一點擊柄與第二點擊柄之間的點擊反應可以在LNP形成之前或之後完成。例如，在一個實施例中（ 圖 27），可以將構成LNP的各種組分（例如，脂質）與包含第二點擊柄的脂質分子混合，從而產生包含第二柄的LNP。然後，該LNP可以在點擊反應中與包含第一點擊柄的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）反應，從而產生綴合物。可替代地，已經用第二點擊柄修飾的脂質可以直接與已經位點特異性地引入至靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）上的第一點擊柄反應。然後可以將所得的修飾的脂質插入尚未進行表面修飾的預形成的LNP中。該程序允許在單個脂質分子上而不是在LNP的表面上進行點擊反應。
可以將第二點擊柄引入至構成LNP的任何脂質上。在一些實施例中，綴合物可以包含一個或多個聚乙二醇化脂質分子。在一些實施例中，第二點擊柄共價鍵合至聚乙二醇化脂質分子中的至少一個，因此產生結構脂質-PEG x-點擊柄，其中x是5-120。在此類實施例中，由鍵合至抗體的第一點擊柄與鍵合至構成LNP的一個或多個聚乙二醇化脂質的第二點擊柄之間的反應形成點擊產物。在一些實施例中，LNP包含約0.05 mol%至約2 mol%的鍵合至第二點擊柄的聚乙二醇化脂質。在一些實施例中，脂質與第二點擊柄之間的PEG間隔基包含至少約5、10、20、30、50、50、60、70、80、90、200或110個乙二醇單元。在一些實施例中，PEG間隔基包含約10-120個乙二醇單元。在一些實施例中，鍵合至所述第二點擊柄的所述聚乙二醇化脂質的分子量是約500（即，PEG500）至約5,000（即，PEG5000）。在一些實施例中，鍵合至第二點擊柄的聚乙二醇化脂質的分子量是約1,000（即，PEG1000）至約3,000（即，PEG5300）。在一些實施例中，鍵合至第二點擊柄的聚乙二醇化脂質的脂質組分選自DMG、DPG、DSG、DTA、DOPE、DPPE、DMPE、DSPE、鞘胺醇、鞘磷脂和硬脂酸。 圖 8示出了鍵合至第二點擊柄（TCO）的聚乙二醇化脂質的一些例子。
在一些實施例中，第二點擊柄鍵合至構成LNP的非聚乙二醇化磷脂中的至少一個。 圖 9示出了鍵合至第二點擊柄（TCO）的非聚乙二醇化脂質的一些例子。
在一些實施例中，第二點擊柄鍵合至構成LNP的可電離脂質中的至少一個。 圖 10示出了鍵合至第二點擊柄（TCO）的可電離脂質的一些例子。
在一些實施例中，第二點擊柄鍵合至構成LNP的甾醇分子中的至少一個。 圖 11示出了鍵合至第二點擊柄（TCO）的甾醇的一些例子。
實例
實例 1 ： CD3 Fab 修飾和分析方案
產生在重鏈的C末端具有分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的抗CD3 Fab片段。在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM抗CD3 Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪（GGG-meTz）。然後添加分選酶A5（2 uM）以引發轉肽反應（ 圖 12）。將上述溶液在30ºC下並且以800 rpm搖動培育3小時。去除過量的試劑，並通過10K Amicon離心過濾器將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。使用完整質譜法分析Metz修飾的Fab。
使用完整質譜法分析分選酶修飾的Fab。修飾僅發生在Fab的C末端，並且成功的修飾導致363 Da質量偏移。如 圖 13中所示，分選酶介導的反應實現大約92%位點特異性修飾（即，92%的Fab片段被分選酶標籤修飾）。
實例 2 ： Fab- 分選酶的修飾和 DOL （標記程度）分析
產生在重鏈的C末端具有分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的不同Fab片段（抗CD117、抗CD3、抗CD5）。對於每種Fab，在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪（GGG-meTz）。然後添加分選酶A5（2 uM）以引發反應。將上述溶液在30ºC下並且以800 rpm搖動培育3小時。去除過量的試劑，並通過10K Amicon離心過濾器將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。為了分析DOL，使meTz修飾的Fab與含有TCO基團的5eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。
作為對照，設計實驗以產生隨機設計的抗體。濃縮至約5 mg/ml，並使用Amicon離心過濾器（對於IgG，50K MWCO）將緩衝液更換為PBS。然後添加含有meTz的NHS酯，並將反應在室溫下培育1小時。反應後，通過Zeba脫鹽柱去除過量的NHS酯。為了分析DOL，使NHS酯修飾的IgG與含有TCO基團的5eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。
表11顯示了使用不同修飾的Fab片段的結果，其中使用基於分選酶的位點特異性修飾製備Fab片段。結果顯示位點特異性修飾產生接近目標的DOL值（DOL = 1）。表12顯示了使用NHS酯反應通過隨機修飾來修飾抗體的實驗的結果。表11和表12中的結果顯示，使用基於分選酶的方法的位點特異性修飾產生更接近目標的DOL值（DOL = 1），其標準差比使用隨機修飾方法時小得多（0.0045相比於0.266）。
表 11 ：分選酶/meTz修飾的抗體與點擊配偶體反應後的標記程度
實驗日期 Ab 構建體 DOL
1 Ab67 Fab-分選酶 1.01
2 Ab67 Fab-分選酶 1.02
3 CD117 Fab分選酶 0.99
4 CD3 Fab分選酶 0.93
5 CD5 Fab分選酶 1.04
表 12：包含隨機meTz基團的隨機修飾的抗體與點擊配偶體反應後的標記程度
實驗日期 Ab 構建體 DOL
1 CD117 IgG 0.84
2 CD117 IgG 01.33
3 CD5 IgG 0.83
4 CD117 IgG 0.6
5 CD117 IgG 0.88
實例 3 ：位點特異性修飾的 LNP 在 T 細胞中的轉染
不具有抗 CD5 抗體的 LNP （ LNP-TCO ，無綴合）的產生：用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 43.5% : 1% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的編碼綠色螢光蛋白（eGFP）的mRNA組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將3x體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。將所得LNP用儲存緩衝液（50 mM tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2）透析隔夜，並通過Amicon離心過濾器（50K MWCO）濃縮。
具有抗 CD5 IgG 的 LNP （隨機綴合）的產生：將抗CD5 IgG濃縮至約5 mg/ml，並使用Amicon離心過濾器（對於IgG，50K MWCO）與PBS進行緩衝液更換。然後添加含有meTz的NHS酯，並將反應在室溫下培育1小時。反應後，通過Zeba脫鹽柱去除過量的NHS酯。為了確認接近1 meTz/抗體的DOL（標記程度），使NHS酯修飾的抗CD5 IgG與含有TCO基團的5 eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。將所得meTz修飾的抗CD5 IgG添加至TCO修飾的LNP溶液中以進行抗體-LNP綴合反應，其中抗體與mRNA（eGFP）之間的質量比率為1.5 : 1。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。通過300K MPES TFF膜去除任何未反應的抗CD5 IgG，使用amicon柱進一步濃縮所得抗體-LNP產物。
具有抗 CD5 Fab 的 LNP （位點特異性綴合）的產生：產生在重鏈的C末端具有另外的分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的抗 -CD5 Fab。在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM抗CD5 Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪（GGG-meTz）。然後添加2 uM分選酶A5以引發反應。將上述溶液在30ºC下同時以800 rpm搖動培育3小時。去除過量的試劑，並通過10K Amicon離心過濾器將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。為了確認接近1 meTz/抗體的DOL（標記程度），使分選酶修飾的抗CD5 Fab與含有TCO基團的5 eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。將所得meTz修飾的抗CD5 Fab添加至TCO修飾的LNP溶液中以進行Fab-LNP綴合，其中Fab與mRNA（eGFP）之間的質量比率為1 : 1。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。通過300K MPES TFF膜去除任何未反應的抗CD5 Fab。使用amicon柱進一步濃縮所得Fab-LNP產物。
轉染實驗：用缺乏抗CD5靶向部分的對照LNP或用通過上述方法產生的包含靶向部分的綴合物（分選酶介導的位點特異性綴合的抗CD5 Fab LNP或隨機綴合的抗CD5 IgG LNP）處理啟動和未啟動的人T細胞。處理24小時後，通過測定表現GFP的細胞的百分比（GFP+%）（ 圖 14A和 圖 14C）和GFP表現的量（中值螢光強度，MFI）（ 圖 14B和 圖 14D），通過流式細胞術定量mRNA轉染功效。結果顯示，在啟動和未啟動的T細胞中，用抗CD5 Fab位點特異性標記的LNP比用抗CD5 IgG隨機標記的LNP誘導更強的轉染。缺乏抗CD5靶向部分的對照LNP最低程度地將GFP mRNA遞送至啟動或未啟動的細胞。
實例 4 ：位點特異性修飾的 LNP 在 CD34+ 細胞中的轉染
不具有抗體的 LNP （ LNP-TCO ，無綴合）的產生：用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 43.5% : 1% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的mRNA（編碼eGFP）組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將3x體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。將所得LNP用儲存緩衝液（50 mM tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2）透析隔夜，並通過Amicon離心過濾器（50K MWCO）濃縮。
具有抗 CD117 IgG NHS 修飾的 LNP （隨機綴合）的產生：將抗CD117 IgG濃縮至約5 mg/ml，並使用Amicon離心過濾器（對於IgG，50K MWCO）與PBS進行緩衝液更換。然後添加含有meTz的NHS酯，並將反應在室溫下培育1小時。反應後，通過Zeba脫鹽柱去除過量的NHS酯。為了確認接近1 meTz/抗體的DOL（標記程度），使NHS酯修飾的抗CD117 IgG與含有TCO基團的5 eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。如先前段落中所述將所得meTz修飾的抗CD117 IgG添加至TCO修飾的LNP溶液中以進行抗體-LNP綴合反應，其中抗體與mRNA（編碼eGFP）之間的質量比率為1.5 : 1。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。通過300K MPES TFF膜去除任何未反應的抗CD117 IgG，使用amicon柱進一步濃縮所得抗體-LNP產物。
具有抗 CD117 Fab 的 LNP （位點特異性綴合）的產生：產生在重鏈的C末端具有另外的分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的抗CD117 Fab。在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM抗CD117 Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪（GGG-meTz）。然後添加2 uM分選酶A5以引發反應。將上述溶液在30ºC下並且以800 rpm搖動培育3小時。去除過量的試劑，並通過10K Amicon離心過濾器將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。為了確認接近1 meTz/抗體的DOL（標記程度），使分選酶修飾的抗CD117 Fab與含有TCO基團的5 eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。將所得meTz修飾的抗CD117 Fab添加至TCO修飾的LNP溶液（如上製備）以進行Fab-LNP綴合，其中抗體與mRNA（編碼eGFP）之間的質量比率為1 : 1。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。通過300K MPES TFF膜去除任何未反應的抗CD117 Fab。使用amicon柱進一步濃縮所得Fab-LNP產物。
轉染實驗：用抗CD117 IgG-LNP、抗CD117 Fab-LNP或裸LNP（無抗體）處理人CD34+ 細胞，在處理8 h後，定量mRNA轉染的功效。具體地，使用流式細胞術評估表現GFP的CD34+細胞的百分比（GFP+細胞%）（ 圖 15A）和GFP的中值螢光強度（MFI）（ 圖 15B）。與具有隨機綴合的抗CD117 IgG的LNP相比，具有抗CD117 Fab的位點特異性綴合的LNP在CD34+細胞中誘導更強的轉染和更高的MFI。與不具有綴合的抗CD117靶向部分的對照LNP相比，具有綴合的抗CD117（位點特異性和隨機綴合）的兩種類型的LNP在CD34+細胞中誘導更強的轉染和更高的MFI水準。
實例 5 ：用隨機修飾和位點特異性修飾的（分選酶方法） Fab 片段裝飾的 LNP 的比較
不具有 Fab 的 LNP （ LNP-TCO ）的產生：用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 43.5% : 1% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的mRNA（編碼eGFP）組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將3x體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。將所得LNP用儲存緩衝液（50 mM tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2）透析隔夜，並通過Amicon離心過濾器（50K MWCO）濃縮。
具有抗 CD117 Fab 的 LNP （位點特異性綴合）的產生（圖 16A ）：產生在重鏈的C末端具有另外的分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的抗-CD117 Fab。在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM抗CD117 Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪（GGG-meTz）。然後添加2 uM分選酶A5以引發反應。將上述溶液在30ºC下並且以800 rpm搖動培育3小時。去除過量的試劑，並通過10K Amicon離心過濾器將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。為了確認接近1 meTz/抗體的DOL（標記程度），使分選酶修飾的抗CD117 Fab與含有TCO基團的5 eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。將所得meTz修飾的抗CD117 Fab添加至上述TCO修飾的LNP溶液以進行Fab-LNP綴合，其中抗體與mRNA（編碼eGFP）之間的質量比率為1 : 1。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。通過300K MPES TFF膜去除任何未反應的抗CD117 Fab。使用amicon柱進一步濃縮所得Fab-LNP產物。如圖9A所示，用於將靶向部分與LNP綴合的位點特異性分選酶方法產生這樣的LNP，其中僅綴合的Fab片段的C末端殘基與LNP結合。
具有抗 CD117 Fab 的 LNP （隨機綴合）的產生（圖 16B ）：將抗CD117 Fab濃縮至約5 mg/ml，並使用Amicon離心過濾器（對於IgG，50K MWCO）與PBS進行緩衝液更換。然後添加含有meTz的NHS酯，並將反應在室溫下培育1小時。反應後，通過Zeba脫鹽柱去除過量的NHS酯。為了確認接近1 meTz/抗體的DOL（標記程度），使NHS酯修飾的抗CD117 Fab與含有TCO基團的5 eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。將所得meTz修飾的抗CD117 Fab添加至上述TCO修飾的LNP溶液以進行Fab-LNP綴合反應，其中抗體與mRNA（編碼eGFP）之間的質量比率為1.5 : 1。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。通過300K MPES TFF膜去除任何未反應的抗CD117 Fab，使用Amicon柱進一步濃縮所得Fab-LNP產物。如圖9B所示，用於將靶向部分與LNP綴合的隨機修飾方法產生這樣的LNP，其中Fab片段的不同胺基酸殘基與LNP綴合。
轉染實驗：用與隨機修飾的Fab、位點特異性修飾的Fab綴合的或無Fab綴合的LNP處理Kasumi-1細胞（CD117+細胞株）。處理8小時後，定量mRNA轉染的功效。具體地，使用流式細胞術評估表現GFP的細胞的百分比（GFP+細胞%）（ 圖 17A）和GFP的中值螢光強度（MFI）（ 圖 17B）。與具有隨機綴合的抗CD117 Fab的LNP相比，具有抗CD117 Fab的位點特異性綴合的LNP在Kasumi-1細胞中誘導更強的轉染和更高的MFI。與不具有綴合的抗CD117靶向部分的LNP相比，具有綴合的抗CD117 Fab（位點特異性和隨機綴合）的兩種類型的LNP在細胞中誘導更強的轉染和更高的MFI水準。
實例 6 ：體內實驗（小鼠） - 特異性靶向性 LNP （分選酶方法）相比於非特異性靶向性 LNP 將 GFP mRNA 遞送至 HSC
不具有 Fab 的 LNP （ LNP-TCO ）的產生：用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 43.5% : 1% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的編碼GFP的mRNA組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將3x體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。將所得LNP用儲存緩衝液（50 mM tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2）透析隔夜，並通過Amicon離心過濾器（50K MWCO）濃縮。
具有 Fab 1 、 Fab 5 和 Fab 6 的 LNP （位點特異性綴合）的產生：產生在重鏈的C末端具有另外的分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的對CD117具有特異性的不同Fab（Fab 1、Fab 5和Fab 6）。在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM抗CD117 Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪（GGG-meTz）。然後添加2 uM分選酶A5以引發反應。將上述溶液在30ºC下並且以800 rpm搖動培育3小時。去除過量的試劑，並通過10K Amicon離心過濾器將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。為了確認接近1 meTz/抗體的DOL（標記程度），使meTz修飾的Fab與含有TCO基團的5 eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。將所得meTz修飾的Fab添加至TCO修飾的LNP溶液以進行Fab-LNP綴合，其中抗體與mRNA（編碼GFP）之間的質量比率為1 : 1。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。通過300K MPES TFF膜去除任何未反應的Fab。使用Amicon柱進一步濃縮所得Fab-LNP產物。
向小鼠的投予：向人HSPC移植（＞ 12週）NBSGW小鼠靜脈內注射攜帶編碼GFP的mRNA的抗CD117 Fab官能化LNP（包含Fab 6、Fab 5或Fab 1的LNP）或非官能化LNP（如上所述，沒有綴合抗CD117 Fab的基礎LNP）。在用劑後16小時處死小鼠，並收集骨髓細胞以用於染色。HSC和早期祖細胞（HSPC）被定義為Hcd45+/Lin-/CD34+/CD38-，而長期HSC（LT-HSC）被定義為Hcd45+/Lin-/CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-。
結果：圖 18A顯示多達58%的HSC加早期祖細胞接受具有分選酶修飾的Fab片段的LNP，相比之下，約20%的HSC加早期祖細胞接受基礎LNP，如通過表現GFP的細胞的百分比（GFP+細胞%）確定。未暴露於LNP的對照小鼠顯示無GFP表現。 圖 18B顯示多達62%的長期（LT）-HSC接受具有分選酶修飾的Fab片段的LNP，相比之下，略高於20%的LT-HSC暴露於基礎LNP。因此，相對於不具有位點特異性綴合的抗CD117 Fab片段的LNP，具有分選酶修飾的Fab片段的LNP在HSC加早期祖細胞中以及在LT-HSC中均展現出明顯更高的體內轉染水準。此外，如 圖 18C中所示，原代HSPC的體外轉導與HSPC中的體內靶向之間存在良好的相關性。也如 圖 18C中所示，在非特異性IgG與位點特異性綴合的（分選酶方法）Fab LNP之間存在分離。
實例 7 ：體內實驗（小鼠） - 將構成替代性配製品的 LNP （分選酶方法）靶向遞送至 HSC
不具有 Fab 的 LNP （ LNP-TCO ）（ LNP A ）的產生：用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 22%: 28.5% : 2% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。LNP相對於實例6中製備的LNP包含增加百分比的輔助脂質（DSPC）（分別為22%與8% DSPC）和降低百分比的膽固醇。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的編碼GFP的mRNA組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將3x體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。將所得LNP用儲存緩衝液（50 mM tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2）透析隔夜，並通過Amicon離心過濾器（50K MWCO）濃縮。
具有抗 CD117 Fab 的 LNP （ LNP B ）的產生：如實例6中所述產生與抗CD117 Fab綴合的LNP，但莫耳比率分別為47% : 22% : 28.5% : 2% : 0.5%可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。
向小鼠的投予：向8-10週齡的NBSGW小鼠（NOD.Cg- Kit W-41JTyr + Prkdc scidIl2rg tm1Wjl /ThomJ）經由尾靜脈注射移植0.5 X 10 6個CD34+人骨髓造血幹細胞。允許HSPC移植12週，然後經由尾靜脈注射用2.0 mg/kg的LNP A（不具有綴合的Fab片段）或LNP B（具有綴合的抗CD117 Fab）處理3只動物的佇列。在注射後16小時，將處理佇列和未處理動物的佇列安樂死，通過離心收集股骨骨髓，並將細胞染色並通過FACS分析以鑒定對GFP蛋白表現呈陽性的人HSPC的百分比。
結果：圖 19展示LNP A（不具有抗CD117 Fab）將GFP mRNA遞送至小鼠中的約38%人HSPC，而LNP B（與抗CD117 Fab綴合）將GFP mRNA遞送至小鼠中的約82%人HSPC。這些結果顯示，相對於不具有靶向部分的綴合物，具有本公開文本的靶向部分的綴合物可以將mRNA遞送至骨髓微環境中的更多HSPC。令人驚訝的是，相對於具有8% DSPC的LNP，增加LNP中輔助脂質的百分比至22%導致遞送至HSPC的GFP的顯著增加（比較結果與實例6， 圖 18A）。
實例 8 ：體內實驗（非人靈長類動物） - 靶向性 LNP （分選酶方法）將 GFP mRNA 遞送至 HSC
本實例證明本公開文本的綴合物能夠將GFP mRNA有效載荷遞送至食蟹猴中的HSC。
為了用點擊柄甲基四嗪（meTz）修飾抗CD117 Fab，產生在重鏈的C末端具有另外的分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的抗CD117 Fab。在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM CD117 Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪。然後添加2 uM分選酶A5以引發反應。將上述溶液在室溫下並且以800 rpm搖動培育4小時。去除過量的試劑，並通過切向流過濾（10K MWCO）將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。
為了配製具有點擊柄的LNP，用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 42.5% : 2% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的eGFP mRNA組成。使用多通道渦流混合器（MIVM）以120 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將所得LNP通過線上稀釋用3X體積的CBS稀釋。在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。在中和之後，將修飾的抗CD117 Fab添加至溶液（Fab : mRNA = 1 : 1重量比率）以在室溫下與TCO修飾的LNP反應2小時，隨後在4ºC冰箱中培育隔夜。隔夜反應後，進行切向流過濾（300K MWCO）以將緩衝液更換為儲存緩衝液（50 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2），將Fab-LNP濃縮至所需濃度，並去除任何未反應的Fab。將最終的Fab綴合的LNP在-80ºC下儲存直至進一步使用。
對3-5歲的食蟹猴進行預處理以將骨髓HSC動員到外周血中（NHP #3和#4）或不進行HSC動員處理（NHP #1和 #2）。為了動員HSC，在LNP輸注之前一小時，在第-4天至第1天用G-CSF處理動物以及在第1天用普樂沙福處理動物。在LNP輸注之前一小時，在第1天用地塞米松、法莫替丁和苯海拉明處理所有動物。LNP輸注後十六小時，將動物麻醉並從肱骨收集骨髓抽吸物。在紅細胞低滲裂解後，將剩餘的骨髓細胞染色並通過FACS分析以鑒定對GFP蛋白表現呈陽性的HSPC的百分比。
圖 20展示例示的LNP將GFP mRNA遞送至大於20%的HSPC。這些結果顯示，本公開文本的綴合物可以將mRNA遞送至NHP骨髓微環境中的HSPC。
實例 9 ：體內實驗（小鼠） - 靶向性 LNP （分選酶方法）將 GFP mRNA 遞送至「人類化」小鼠中的人 T 細胞
本實例證明本公開文本的綴合物可以將GFP mRNA遞送至人類化小鼠模型中的人T細胞。
為了用點擊柄甲基四嗪（meTz）修飾抗CD3和抗CD5 Fab片段，產生在重鏈的C末端具有另外的分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的Fab片段。在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪。然後添加2 uM分選酶A5以引發反應。將上述溶液在室溫下並且以800 rpm搖動培育4小時。去除過量的試劑，並通過Amicon柱（10K MWCO）將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。
為了配製具有點擊柄的LNP，用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 42.5% : 2% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的eGFP mRNA組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將3X體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。在中和之後，將修飾的抗CD3或抗CD5 Fab添加至溶液（Fab : mRNA = 1 : 1重量比率）以在室溫下與TCO修飾的LNP反應2小時，隨後在4ºC冰箱中培育隔夜。隔夜反應後，進行切向流過濾（300K MWCO）以將緩衝液更換為儲存緩衝液（50 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2），將Fab-LNP濃縮至所需濃度，並去除任何未反應的Fab。將最終的Fab綴合的LNP在-80ºC下儲存直至進一步使用。
從Jackson Labs（緬因州巴爾港）獲得9週齡的雌性NSG小鼠。在動物飼養所適應幾天後，經由尾靜脈向動物靜脈內注射5 X 10 6個幼稚人T細胞（Hemacare，加利福尼亞州北嶺市）以引發移植物抗宿主病（GVHD）。參與GVHD應答的人細胞因小鼠抗原而被啟動，增殖並分泌可在小鼠血清中測量的人細胞介素。在注射人T細胞之後兩週，動物組不進行處理，或經由靜脈內尾靜脈注射用含有GFP mRNA（1 mg/kg或2 mg/kg）的LNP A（具有抗CD3 Fab）和LNP B（具有抗CD5 Fab）處理。在處理後十六小時，將動物安樂死，並經由FACS針對在huCD45+ T細胞中的GFP蛋白表現分析其脾臟。
圖 21顯示LNP A（具有抗CD3 Fab）和LNP B（具有抗CD5 Fab）分別將GFP mRNA遞送至人類化NSG小鼠中的78%和84%脾huCD45+ T細胞。這些資料顯示，例示的LNP將RNA遞送至位於次級淋巴組織內的人淋巴細胞。
實例 10 ： LNP 將 GFP mRNA 遞送至非人靈長類動物外周血和淋巴組織 T 細胞（ CD3+ ）
本實例證明本公開文本的綴合物可以將GFP mRNA有效載荷遞送至食蟹猴中的外周血淋巴細胞。
為了用點擊柄甲基四嗪（meTz）修飾抗CD5 Fab，產生在重鏈的C末端具有另外的分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的Fab。在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪。然後添加2 uM分選酶A5以引發反應。將上述溶液在室溫下同時以800 rpm搖動培育4小時。去除過量的試劑，並通過切向流過濾（10K MWCO）將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。
為了配製具有點擊柄的LNP，用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 42.5% : 2% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的eGFP mRNA組成。使用多通道渦流混合器（MIVM）以120 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將所得LNP通過線上稀釋用3X體積的CBS稀釋。在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。在中和之後，將修飾的抗CD5 Fab添加至溶液（Fab : mRNA = 1 : 1重量比率）以在室溫下與TCO修飾的LNP反應2小時，隨後在4ºC冰箱中培育隔夜。隔夜反應後，進行切向流過濾（300K MWCO）以將緩衝液更換為儲存緩衝液（50 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2），將Fab-LNP濃縮至所需濃度，並去除任何未反應的Fab。將最終的Fab綴合的LNP在-80ºC下儲存直至進一步使用。
在LNP輸注之前一小時，在第1天用地塞米松、法莫替丁和苯海拉明處理約5歲的食蟹猴。隨後經由靜脈內輸注用1 mg/kg的T細胞特異性LNP處理動物，如上所述。LNP輸注後十六小時，將動物麻醉，收集外周血樣品和淋巴結活檢物，並經由FACS分析以鑒定每個隔室中對GFP蛋白表現呈陽性的CD3+ T細胞的百分比。
圖 22展示例示的綴合物將GFP mRNA分別遞送至淋巴結和外周血中的約10%和約37% CD3+ T細胞。這些結果顯示，所公開的綴合物可以將mRNA至少遞送至外周血和次級淋巴組織中的T細胞。
實例 11 ： LNP 將 GFP mRNA 遞送至非人靈長類動物外周血 T 細胞（ CD4+ 和 CD8+ ）
如實例10中所述製備和配製LNP，不同之處在於LNP與抗CD3 Fab片段綴合。在LNP輸注之前一小時，在第1天用法莫替丁和苯海拉明處理兩隻約5歲的食蟹猴。隨後經由靜脈內輸注1 mg/kg的用抗CD3 Fab修飾的T細胞特異性LNP處理動物。LNP輸注後十六小時，將動物麻醉，收集外周血樣品並經由FACS分析以鑒定對GFP蛋白表現呈陽性的T細胞（包括CD4+和CD8+ T細胞）的百分比。總T細胞被定義為CD45+CD3+CD5+。CD4+和CD8+ T細胞分別被定義為CD45+CD3+CD5+CD4+和CD45+CD3+CD5+CD8+。
圖 23展示例示的綴合物有效地將GFP mRNA遞送至NHP的外周血中的CD4+ T和CD8+ T細胞。在投予包含位點特異性綴合的抗CD3靶向部分的綴合物後，平均超過20%的CD4+ T細胞表現GFP，並且平均約60%的CD8+ T細胞表現GFP。
實例 12 ：使抗體與 LNP 綴合的不同點擊化學反應的評價
本實驗的目的是評價使用所公開的方法將抗體與LNP綴合以產生本文所述的綴合物的效率。通過使用基於螢光的方法定量綴合的抗體相比於未綴合的抗體來確定綴合效率。如果綴合效率是80%，則當每個LNP有100個抗體反應時，最終的綴合物將每個LNP包含80個抗體。提高綴合效率增加了LNP表面上的抗體密度（ 圖 24A）。高抗體密度（每個LNP的抗體數量）對於靶向特定細胞類型是所期望的。高綴合效率可以促進具有高抗體密度的LNP的製造。
評價不同的點擊化學對（迭氮化物-BCN、迭氮化物-DBCO、Tz-TCO和meTz-TCO）（ 圖 24B）以確定哪些配對導致最高綴合效率。用匹配的點擊柄修飾LNP和抗體。還用螢光染料標記抗體。在抗體-LNP綴合反應之後，使用尺寸排阻層析法（SEC）分離剩餘的未綴合的抗體。由於用螢光染料標記抗體，因此通過螢光讀板儀定量抗體綴合效率。一般程序概述如下。
實驗程序
步驟 1 ：用點擊配體修飾 LNP：用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 43.5% : 1% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-點擊配體。附接至LNP的點擊配體是迭氮化物、Tz或TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的編碼eGFP的mRNA組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-點擊配體。將3x體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。將所得LNP用儲存緩衝液（50 mM tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2）透析隔夜，並通過Amicon離心過濾器（50K MWCO）濃縮。
步驟 2 ：用點擊配體使用 NHS 酯修飾抗體：將螢光標記的模型IgG濃縮至約5 mg/ml，並使用50K MWCO Amicon離心過濾器用PBS更換緩衝液。然後添加含有點擊基團的NHS酯，並將反應在室溫下培育1小時。附接至抗體的點擊配體是BCN、DBCO、TCO、mTz或Tz。NHS酯的量相對於抗體的莫耳數在1.5-5 eq之間，以實現接近1的DOL。反應後，通過Zeba脫鹽柱去除過量的NHS酯。
步驟 3 ：抗體 -LNP 綴合：將修飾的抗體添加至修飾的LNP溶液以進行抗體-LNP綴合。抗體與mRNA的質量比率為1.5 : 1。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。
步驟 4 ：使用尺寸排阻層析法（ SEC ）定量未綴合的抗體：使用瓊脂糖CL-4B樹脂通過SEC純化抗體-LNP。將5 ml樹脂載入至柱並用25 ml PBS平衡。然後將500 ul抗體-LNP溶液載入至柱上，隨後用PBS作為流動相進行重力SEC。每個級分收集250 ul洗脫液。抗體-LNP通常在級分6至級分10中洗脫，這可以通過Ribogreen測定來證實，並且未綴合的抗體在更晚的級分中被洗脫。使用讀板儀通過抗體螢光測量綴合效率。
結果
如 圖 25中所示，點擊柄的取向是綴合效率的重要決定因素。例如，當用Tz修飾LNP並且用TCO修飾抗體時，綴合效率是35%；而當這種取向反轉使得用TCO修飾LNP並且用Tz修飾抗體時，則綴合效率是90%。所使用的點擊柄的類型和反應也決定了綴合效率。例如，迭氮化物-BCN和迭氮化物-DBCO反應僅產生約10%-20%綴合效率。相比之下，TCO-mTz和TCO-Tz反應產生高得多的綴合效率。
實例 13 ： LNP 組成可以影響綴合效率
本實驗評價LNP組成是否會影響綴合效率。產生不同的四組LNP以比較DSPE-PEG-TCO含量（0.1%相比於0.5%）和PEG長度（PEG2000相比於PEG5000）對綴合效率的影響。 圖 26示出了所評價的四個LNP組中每一組的具體組分。用螢光染料標記抗體。在抗體-LNP綴合反應之後，使用尺寸排阻層析法（SEC）分離未綴合的抗體（ 圖 27）。然後使用螢光讀板儀定量抗體綴合效率。一般程序詳述如下。
實驗程序
步驟 1 ：用點擊配體修飾 LNP：用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率為47% : 8% : 43.5% : 1% : 0.5%或47% : 8% : 43.5% : 1.4% : 0.1%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2000-TCO或DSPE-PEG5000-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的mRNA（eGFP）組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將3x體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。將所得LNP用儲存緩衝液（50 mM tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2）透析隔夜，並通過Amicon離心過濾器（50K MWCO）濃縮。
步驟 2 ：用點擊配體使用 NHS 酯修飾抗體：將螢光標記的模型IgG濃縮至約5 mg/ml，並使用50K MWCO Amicon離心過濾器用PBS更換緩衝液。然後添加含有MeTz的NHS酯，並將反應在室溫下培育1小時。NHS酯的量相對於抗體的莫耳數在1.5-5 eq之間，以實現接近1的DOL。反應後，通過Zeba脫鹽柱去除過量的NHS酯。
步驟 3 ：抗體 -LNP 綴合：將修飾的抗體添加至修飾的LNP溶液以進行抗體-LNP綴合。抗體與mRNA的質量比率為1.5 : 1。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。
步驟 4 ：使用尺寸排阻層析法（ SEC ）定量未綴合的抗體：使用瓊脂糖CL-4B樹脂通過SEC純化抗體-LNP。將5 ml樹脂載入至柱上並用25 ml PBS平衡。然後將500 ul抗體-LNP溶液載入至柱上，隨後用PBS作為流動相進行重力SEC。每個級分收集250 ul洗脫液。抗體-LNP通常在級分6至級分10中洗脫，這可以通過Ribogreen測定來證實，並且未綴合的抗體在更晚的級分中被洗脫。使用讀板儀通過抗體螢光測量綴合效率。
結果
如 圖 28中所示，用DSPE-PEG2000-TCO修飾的LNP比用DSPE-PEG5000-TCO修飾的LNP具有更高的綴合效率。此外，具有更高百分比的DSPE-PEG-TCO（0.5%）的LNP比具有更低百分比的DSPE-PEG-TCO（0.1%）的那些LNP具有更高的綴合效率。
實例 14 ：通過硫辛酸連接酶實現的位點特異性綴合
產生在重鏈的C末端具有另外的LplA受體肽（LAP）標籤的CD117 Fab。將含有20 uM CD117 Fab-LAP標籤、2 uM LplA酶硫辛酸連接酶W37V、200 μM 10-迭氮基癸酸、1 mM ATP和5 mM乙酸鎂的在PBS（pH 7.4）中的溶液在37ºC下同時以800 rpm搖動培育1.5小時。去除過量的試劑，並通過Amicon離心過濾器將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。為了確認接近1 meTz/抗體的DOL（標記程度），使meTz修飾的Fab與含有DBCO基團的5 eq AF594在PBS中在室溫下反應2小時。反應後，用Zeba脫鹽柱運行兩次以去除過量的染料。使用DOL計算器通過在A280和A590處的吸光度測量DOL。DOL被確定為97%，表明97%反應效率。
在下一步中，現在包含末端點擊柄的修飾的Fab片段可以與如本文所述共價鍵合至LNP的互補點擊柄反應，以產生位點特異性修飾的綴合物。可替代地，迭氮基團可以被Fab片段上的另一個點擊柄（例如，Tz或meTz基團）取代，並與共價鍵合至LNP的TCO基團反應。
實例 15 ：靶向性 LNP 將基於反轉錄轉座子的基因修飾系統遞送至原代人 T 細胞
本實例證明，如本文所述的示例性基因修飾系統（如基於反轉錄轉座子的基因修飾系統）可以用於將異源嵌合抗原受體（CAR）序列引入原代人T細胞的基因組中。基因修飾系統包含編碼基因修飾多肽的mRNA和範本RNA。編碼基因修飾多肽的mRNA和範本RNA可以與一個或多個LNP一起遞送至T細胞，所述一個或多個LNP用結合T細胞上的受體的靶向部分（例如，抗體、Fab片段或ScFv）進行表面修飾。顯示LNP遞送基因修飾系統的一般示意圖描繪於 圖 29A中。在遞送至T細胞後，CAR序列被插入細胞基因組中，CAR被表現，從而產生能夠殺傷靶腫瘤細胞的CAR-T細胞。
基因修飾系統
本實例中使用的基因修飾系統包含編碼示例性RTE1_MD基因修飾多肽的核酸，所述示例性RTE1_MD基因修飾多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，如下所示： MDSTAHPNQGRGLEKVSQTLPALQTPGQHTAAGGSSPLSGRNQRKNTKKLLLGAWNIRTLLDRENTPRPERRTALIGKELARYNIDIAALSETRLPEEGSLSEPTTGYTFFWKGRASNEDRIHGVGLAIKTSLLKQLPDLPVGISERLMKIRLPLSKDRYATIISAYAPTLTSTEETIEQFYSDLSAVLHSVPTNDKLILLGDFNARVGQDHERWKGVLGKHGVGKMNNNGLLLLSKCSEFELTITNTVFRMANKYKTTWMHPRSKQWHLIDYIIVRRRDIQDVKITRAMRGAECWTDHRLVRATLQMRIAPRHPKRAQTVRAFYNVSRLRDPSYLQTFQSCLDDKLSAKGPLTGSSTEKWNQFRDAVKETSKAVLGPKQRNHQDWFDENNTAIEDLLSKKNKAFMEWQNNPNSAPKKDRFKSLQATAQREIRKMQDRWWEKKAEEIQRFADMKNYKQFFSALKTVYGPLKPTTTPLLSSDGDTLIKDKKGISNRWKEHFSQLLNRPSSVDQSALDQIPQNRTIEQLDVPPSIEEVQKAIKQMSAGKAPGKDGIPTEVYKALNGKALQAFHIVLTSIWEEEDMPPELRDASIVALYKNKGSRAACDNYRGISLLSTAGKILARVILNRLLSSVSEQNLPESQCGFRPDRSTIDMVFTVRQMQEKCLEQNLSLYIVFIDLTKAFDTVNRDALWVILSKLGCPAKFVKLIQLFHVDMTGEVLSGGETSDRFNISNGVKQGCVLAPVLFNLFFTQVLRHAVMDLDLGVYIKYRLDGSLFDLRRLTAKTKTTERLILEALFADDCALMAHQENHLQTIVDRFSTATKLFGLTISLSKTEVLFQPAPGRPTNQPCITIDGTQLSNVNTFKYLGSTIANDGSLDHEINARIQKASQALGRLRCKVLQHRGVSTATKLKVYNAVVLSSLLYGCETWTLYRKHMKQLEQFHQRSLRSIMRIRWQDRITNQEVLDRANSTSIEVMVLKTQLRWSGHVIRMDPQRIPRQVFYGELSAGLRKQGRPKKRFKDQLKSNLKWAGITPKQLELAASDRSSWRTHINHAATTFEDERRRRLAAARERRHQATTAPPVTTGVPCPMCHKLCASAFGLQSHMRVHRR  (SEQ ID NO: 1)
基因修飾多肽包含具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的3GS連接子，如下所示 GGGS  (SEQ ID NO: 2)
基因修飾多肽包含具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的SV40 NLS，如下所示： PKKKRKV  (SEQ ID NO: 3)
基因修飾多肽包含具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的XTEN連接子，如下所示： SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 4)
本實例中使用的基因修飾多肽包含具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的HiBit標籤，如下所示： VSGWRLFKKIS  (SEQ ID NO: 5)
基因修飾系統進一步包含編碼BCMA-CAR融合多肽的範本RNA，所述範本RNA包含SEQ ID NO: 6的核酸序列，如下所示： auggcucugccggugaccgcccugcuucugccucuugcccugcucuugcaugccgcucgcccgcaggugcagcuuguucaguccggcgcggagguaaaaaagccuggcgccagcgugaaagugagcuguaaggcuuccggcuacagcuucccagauuacuauaucaauugggugcggcaggcucccgggcagggacucgaguggauggguuggaucuauuuugcgagcggaaacucugaguacaaccagaaguucaccggcaggguuaccaugacccgcgacacgucaaguucuacggcauacauggagcugucuagucucagguccgaagauaccgccguguauuucugcgccucccuguaugauuaugacugguacuucgacgucuggggccagggcaccauggugacagugucuuccgguggcgguggcuccggcggagguggcucuggaggggguggcagcgauaucgugaugacccagacuccacugucucugucugugaccccuggugagccggcgagcaucuccugcaagaguucccagagucugguccacucuaacggcaacaccuaccugcacugguaucugcagaagccgggccaaaguccacagcuccugaucuacaagguuuccaaccguuucagcggggucccggaucgcuuuuccggcucagguagcggugccgauuucacccugaagauuagucgggucgaggcugaggacgucggcgucuacuauugugcagagaccagucacguccccuggacuuucggucaggggaccaaacuggagaucaagaccacaacaccugcuccaaggccccccacacccgcuccaacuauagccagccaaccauugagccucagaccugaagcuugcaggcccgcagcaggaggcgccguccauacgcgaggccuggacuucgcgugugauauuuauauuugggccccuuuggccggaacaugugggguguugcuucucucccuugugaucacucuguauuguaggaguaagaggagcaggcuccugcacagugacuacaugaacaugacuccccgccgccccgggcccacccgcaagcauuaccagcccuaugccccaccacgcgacuucgcagccuaucgcuccagggugaaauuuucuagaagcgccgaugcucccgcauaucagcagggucagaaucagcucuacaaugaauugaaucucggcaggcgagaagaguacgauguucuggacaagagacggggcagggaucccgagauggggggaaagccccggagaaaaaauccucaggagggguuguacaaugagcugcagaaggacaagauggcugaagccuauagcgagaucggaaugaaaggcgaaagacgcagaggcaaggggcaugacggucuguaccagggucucucuacagccaccaaggacacuuaugaugcguugcauaugcaagccuugccaccccgc   (SEQ ID NO: 6)
BCMA-CAR融合多肽包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，如下所示： MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR  (SEQ ID NO: 7)
BCMA-CAR融合多肽包含具有SEQ ID NO: 90的胺基酸序列的CD8鉸鏈結構域，如下所示： TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 90)
BCMA-CAR融合多肽包含具有SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的CD8跨膜結構域，如下所示： IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 91)
BCMA-CAR融合多肽包含具有SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的CD28z共刺激結構域，如下所示： RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 92)
BCMA-CAR融合多肽包含具有SEQ ID NO: 93的胺基酸序列的CD3z信號傳導結構域，如下所示： RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 93)
BCMA-CAR融合多肽包含具有 GSG的胺基酸序列的GSG連接子。
BCMA-CAR融合多肽包含具有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的T2A肽，如下所示： EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 95)
簡言之，用於與RTE1_MD基因修飾系統一起使用的範本RNA從5'到3'具有以下序列： 5' UTR retro、bGH聚A、WPRE、BCMA-CAR、科紮克序列、MND啟動子、3' UTR retro。
通過LNP（如本文所述）或通過電穿孔將包含BCMA-CAR範本RNA的RTE1_MD基因修飾系統引入原代人CD3+ T細胞中。然後在腫瘤細胞殺傷測定中比較T細胞的CAR表現和細胞毒性。
LNP 產生
為了用點擊柄甲基四嗪（meTz）修飾抗CD3 Fab，產生在重鏈的C末端具有另外的分選酶標籤（LPETG（SEQ ID NO: 89））的Fab。在分選酶緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.4）中製備10 uM Fab-LPETG和1 mM三甘胺酸甲基四嗪。然後添加2 uM分選酶A5以引發反應。將上述溶液在室溫下同時以800 rpm搖動培育4小時。去除過量的試劑，並通過Amicon柱（10K MWCO）將緩衝液更換為含有10 mM EDTA的PBS。
為了配製具有點擊柄的LNP，用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 42.5% : 2% : 0.5%的可電離脂質（V003）、DSPC、膽固醇、DMG-PEG和DSPE-PEG2K-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的編碼基因修飾多肽的mRNA或CAR範本RNA組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將3X體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。在中和之後，將修飾的抗CD3 Fab添加至溶液（Fab : mRNA = 1 : 1重量比率）以在室溫下與TCO修飾的LNP反應2小時，隨後在4ºC冰箱中培育隔夜。隔夜反應後，進行切向流過濾（300K MWCO）以將緩衝液更換為儲存緩衝液（50 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、9%蔗糖，pH 7.2），將Fab-LNP濃縮至所需濃度，並去除任何未反應的Fab。將最終的Fab綴合的LNP在-80ºC下儲存直至進一步使用。
T 細胞工程化
將冷凍保存的人T細胞緩慢解凍至補充有AB血清和細胞介素（TexMACS培養基（Miltenyi）、100 IU/mL IL2（Miltenyi）、10 ng/mL IL7（Miltenyi）、5 ng/mL IL15（Miltenyi）和5%人AB血清（Miltenyi））的培養基中，並使用TransAct微珠（Miltenyi）啟動，同時將其接種至T-75培養瓶中。在啟動之後三天，對細胞進行計數，並在每種條件下將2 x 10 6個T細胞接種至24孔培養皿上。將補充有IL-2、IL-7和IL-15的T細胞培養基添加至細胞中，以使每種條件的最終工作體積為1.25 mL。在添加培養基後，首先用含有RTE1 mRNA的抗CD靶向性LNP向T細胞用劑，然後用含有BCMA CAR範本RNA的抗CD3靶向性LNP用劑。在用劑後四小時，將細胞轉移至無菌錐形管中並離心。通過添加2 mL新鮮T細胞培養基移取殘留的LNP，並轉移至24孔GRex板並在37ºC下培育。作為對照，還使用相同的程序用單獨的含有RTE1 mRNA的抗CD3靶向性LNP或單獨的含有BCMA CAR範本RNA的抗CD3靶向性LNP向T細胞用劑。
為了比較，還用編碼RTE1_MD基因修飾多肽的mRNA和BCMA CAR範本RNA對T細胞進行電穿孔。對於電穿孔，將總共5-7億個T細胞用500 ug/mL的RNA（200範本 : 1驅動子的質量比率）在400-450 uL體積的OptiMEM中進行電穿孔，以維持4 x 10 8個細胞/mL的細胞濃度。在T細胞培養基中淬滅電穿孔。作為對照，還使用相同的程序用單獨的編碼RET1_MD基因修飾多肽的mRNA或單獨的BCMA CAR範本RNA對T細胞進行電穿孔。在培養的第五天，對T細胞進行計數，並添加另外的培養基以達到5 x 10 5個細胞/mL的最終培養物濃度。在培養的第七天，通過流式細胞術分析T細胞以評價細胞表面上的BCMA CAR表現。
腫瘤細胞殺傷測定
在第9天，LNP暴露後第六天，收穫細胞，並使用BCMA靶細胞殺傷測定評估CAR-T細胞毒性功能。將通過電穿孔或LNP暴露產生的BCMA-CAR-T細胞與BCMA陽性腫瘤細胞株（H929）以連續漸減的T細胞與腫瘤比率一起共培養24小時。將來自共培養物的細胞用抗體染色以鑒定靶細胞和效應細胞的表面標記物。在流式細胞儀上獲得染色的共培養物，並且通過活體染料排除死細胞。在分析期間陽性鑒定靶標，並且通過流式細胞儀的體積讀數產生每種條件的靶細胞的絕對計數。使用以下等式將所有條件相對於僅靶標的孔（用於形成腫瘤生長的對照）歸一化：殺傷% = 1- (測試條件中的靶細胞數/歸一化對照中的靶細胞數) * 100。
結果
如 圖 29B中所示，用編碼基因修飾多肽的mRNA和BCMA CAR範本RNA兩者電穿孔的超過4%的T細胞展現出BCMA CAR表現。用含有基因修飾多肽和BCMA CAR範本RNA的抗CD3靶向性LNP用劑的超過7%的T細胞展現出BCMA CAR表現。結果證明，通過電穿孔或抗CD3靶向性LNP將基因修飾系統全RNA遞送至T細胞可以用於在細胞中插入和表現治療性轉基因，如CAR。通過比較，用單獨的編碼基因修飾多肽的mRNA或單獨的BCMA CAR範本處理的細胞不顯示任何BCMA CAR表現，無論多肽或範本是通過電穿孔還是LNP在細胞中遞送。
如 圖 29C中所示，表現BCMA-CAR（使用基因修飾系統工程化）的原代人T細胞以劑量依賴性方式殺傷BCMA陽性腫瘤細胞。在效應T細胞與腫瘤細胞的2 : 1比率下觀察到超過20%殺傷，並且在效應T細胞與腫瘤細胞的4 : 1比率下觀察到大約40%殺傷。
無論是使用電穿孔還是抗CD3靶向性LNP遞送基因修飾系統RNA，結果都非常相似。這些資料一起顯示，基因修飾系統的LNP遞送可以產生BCMA CAR-T細胞，其在體外減少腫瘤細胞生長態樣是功能性的和有效的。
實例 16 ：抗 CD3-LNP 在小鼠模型中遞送用於工程化 CAR-T 細胞的基因修飾系統
如實例15中製備用基因修飾系統配製的靶向性綴合物（LNP）。從Jackson Labs（緬因州巴爾港）獲得9週齡的雌性NSG小鼠。在動物飼養所適應幾天後，經由尾靜脈向動物靜脈內注射5 X 10 6個幼稚人T細胞（Hemacare，加利福尼亞州北嶺市）以引發移植物抗宿主病（GVHD）。參與GVHD應答的人細胞因小鼠抗原而被啟動，增殖並分泌可在小鼠血清中測量的人細胞介素。注射人T細胞之後兩週，不處理各組動物，或用含有基因修飾多肽（4 mg/kg）、抗BCMA CAR T範本mRNA（4 mg/kg）或基因修飾多肽和抗BCMA CAR T範本（1 mg/kg或4 mg/kg）的組合的抗CD3靶向性LNP經由靜脈內尾靜脈注射處理各組動物。處理後五天，將動物安樂死，並收集它們的脾臟，通過金屬絲網研磨，經由低滲裂解去除紅細胞，並經由FACS分析剩餘的白細胞的CAR-T表現或將剩餘的白細胞冷凍以用於以後的體外研究。在安樂死時收集小鼠血清以用於潛在的血清細胞介素和/或臨床化學分析。
實例 17 ：綴合物合成 -Fab 片段
本文公開的方法適合於將抗體或其抗原結合片段（如Fab片段、scFv或VHH（奈米抗體））與脂質奈米顆粒（LNP）的表面綴合以產生靶向性LNP（tLNP）。抗體或其抗原結合片段被工程化以在其C末端包含序列，如鉸鏈區序列，其中序列被工程化以在其C末端處或附近包含單個游離半胱胺酸。隨後抗體或抗原結合片段被暴露於還原反應以去除二硫化物連接，從而產生游離半胱胺酸。游離半胱胺酸基團隨後與如本文所述的反應配偶體如馬來醯亞胺偶聯。例如，將還原的半胱胺酸末端化的抗體或其抗原結合片段與LNP的表面綴合可以使用如本文所述的兩步式方法來完成。
包含單個游離C末端半胱胺酸的工程化Fab
將抗CD117 Fab序列工程化以在重鏈的C末端處包含含有序列DKTHTCAA（SEQ ID NO: 99）的鉸鏈區序列。該序列包含人IgG1鉸鏈區的一部分，其中半胱胺酸在序列的C末端附近，接著是兩個另外的丙胺酸殘基。表11提供了具有工程化鉸鏈區序列（DKTHTCAA）（SEQ ID NO: 99）的工程化Fab片段的重鏈和輕鏈序列。將工程化Fab序列克隆至pcDNA3.1哺乳動物表現質體中，在ExpiCHO細胞中表現，隨後用CH1XL樹脂純化。
表 13 ：包含游離 C 末端半胱胺酸的工程化抗 CD117 Fab 片段
Fab構建體 HC LC
具有C末端半胱胺酸的抗CD117 Fab(Wt) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDADMDWVRQAPGKGLEWVGRTRNKAGSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAREPKYWIDFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCAA (SEQ ID NO: 108) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIAPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 109)
在與LNP綴合之前將純化的Fab片段還原。為了還原二硫鍵，將Fab溶液用含有10 mM EDTA的PBS通過脫鹽柱進行緩衝液交換。將10當量的三(2-羧基乙基)膦（TCEP）添加至溶液，並且在室溫下還原1小時。反應後，使用脫鹽柱去除TCEP。通過SDS PAGE凝膠確認完全還原。
用於將包含還原游離半胱胺酸的 Fab 片段與 LNP 綴合的兩步式方法
步驟 1 ：用點擊配體對半胱胺酸末端化的 Fab 進行位點特異性修飾
在如上所述還原二硫鍵後，使工程化Fab（表13）與含有馬來醯亞胺和點擊配體甲基四嗪（MeTz）的雙官能性連接子反應。具體地，將三當量的Mal-PEG-MeTz添加至新還原的抗CD117 Fab的溶液，從而產生Fab-MeTz以用於以下所述的方法的步驟2中。反應在室溫下進行2小時。反應後，使用zeba旋轉脫鹽柱（截斷值為7 KDa）去除過量的馬來醯亞胺連接子。
步驟 2 ： Fab 片段與基礎 LNP 之間的綴合
如本文所述類似地配製LNP-TCO。簡言之，：用五種脂質製備乙醇相，其含有莫耳比率分別為47% : 8%: 42.5% : 2% : 0.5%的可電離脂質、DSPC、膽固醇、PEG-DMG和DSPE-PEG2K-TCO。水相由溶解在25 mM乙酸鹽緩衝液中的GFP mRNA組成。使用微流體裝置以18 ml/min的總流速混合兩相（水相 : 乙醇相 = 3 : 1）以配製LNP-TCO。將3x體積的CBS添加至LNP溶液中，並在15分鐘後用1 vol%的1 M Tris-HCl（pH 8）中和所得溶液。
將步驟1中製備的Fab-MeTz添加至LNP-TCO的溶液以產生抗CD117 Fab-LNP綴合物。將溶液在室溫下培育2小時，然後在4ºC下培育隔夜。將靶向性LNP濃縮並通過離心過濾器（100K MWCO）去除任何未結合的Fab。在所述方法期間將溶液用含有9%蔗糖的Tris緩衝液進行交換。將所得的tLNP通過Zetasizer表徵大小和PDI並且通過Ribogreen測定表徵mRNA濃度。
用使用兩步式方法製造的靶向性LNP（tLNP）將GFP mRNA遞送至原代CD34+細胞
將使用上述兩步式方法產生的抗CD117靶向性LNP投予至原代CD34+細胞以確定它們是否能夠有效地將mRNA有效載荷遞送至細胞。還用未與抗CD117 Fab綴合的基礎LNP轉染原代CD34+細胞作為基線對照以進行GFP mRNA遞送。 圖 30A和 圖 30B顯示在具有和不具有血清的培養條件下，相對於用基礎LNP轉染的細胞，靶向性LNP的投予導致顯著更高的表現GFP的細胞的數量以及更高的GFP表現水準（MFI）。
無
圖 1示出了通過分選酶介導的連接和隨後的點擊反應形成與Fab片段的C末端綴合的LNP。 圖 2示出了通過硫辛酸連接酶介導的連接和隨後的點擊反應形成與Fab片段的C末端綴合的LNP。 圖 3示出了將Tz環位點特異性地引入抗體的糖部分的酶促方法。 圖 4示出了將Tz環位點特異性地引入抗體的光誘導的交聯方法的例子。 圖 5示出了使用非天然胺基酸將Tz環位點特異性地引入抗體或Fab片段的例子。 圖 6示出了使用半胱胺酸-馬來醯亞胺將第一點擊柄（Tz）位點特異性地引入Fab片段的例子，所述Fab片段隨後與鍵合至第二點擊柄（TCO）的LNP反應，從而產生綴合物。 圖 7示出了用被設計為與馬來醯亞胺基團反應的游離半胱胺酸修飾的Fab片段。 圖 8示出了鍵合至第二點擊柄（TCO）的聚乙二醇化脂質的例子。 圖 9示出了鍵合至第二點擊柄（TCO）的非聚乙二醇化脂質的例子。 圖 10示出了鍵合至第二點擊柄（TCO）的可電離脂質的例子。 圖 11示出了鍵合至第二點擊柄（TCO）的甾醇的一些例子。 圖 12示出了用於將點擊柄與Fab片段綴合的分選酶A5催化的轉肽反應的示意圖。 圖 13示出了分選酶A5催化Fab片段在三甘胺酸（tryglicine）殘基處與點擊柄鍵合的反應的解卷積MS光譜。 圖 14示出了使用通過分選酶介導的連接與抗CD5 Fab片段綴合的LNP在T細胞中的轉染實驗的結果。將轉染結果與未修飾的（對照）LNP和用使用隨機修飾方法產生的抗CD5抗體修飾的LNP進行比較。 圖 14A和 圖 14C顯示通過流式細胞術定量mRNA轉染，以綠色螢光蛋白細胞%（GFP+%）表示。 圖 14B和 圖 14D示出了以中值螢光強度（MFI）表示的轉染。 圖 15示出了使用通過分選酶介導的連接與抗CD117 Fab片段綴合的LNP在人CD34+細胞中的轉染實驗的結果。將轉染結果與未修飾的（對照）LNP和用使用隨機修飾方法產生的抗CD117抗體修飾的LNP進行比較。 圖 15A顯示通過流式細胞術定量mRNA轉染，以綠色螢光蛋白細胞%（GFP+%）表示。 圖 15B示出了以中值螢光強度（MFI）表示的轉染。 圖 16A示出了通過具有位點特異性分選酶識別基序的抗CD117 Fab與LNP的反應產生位點特異性綴合物的示意圖。在示意圖中，彎曲的線表示鍵合至LNP的脂質的PEG。 圖 16B示出了通過已使用隨機方法（NHS修飾）修飾的Fab片段與LNP的反應產生綴合物的示意圖。 圖 17示出了使用與通過位點特異性（分選酶介導的）修飾或通過隨機修飾產生的抗CD117 Fab片段綴合的LNP轉染至Kasumi-1細胞（CD117+細胞株）中的結果。 圖 17A顯示通過流式細胞術定量mRNA轉染，以綠色螢光蛋白細胞%（GFP+%）表示。 圖 17B示出了以中值螢光強度（MFI）表示的轉染。 圖 18示出了體內實驗的結果，所述體內實驗評價與使用缺乏綴合的抗CD117 Fab片段的基礎LNP的轉導相比，與對CD117具有特異性的三種測試Fab片段（Fab 1、Fab 5或Fab 6）中的一種綴合的LNP在HSC和早期祖細胞（HSC + 早期祖細胞）（也稱為HSPC）中的轉導。 圖 18A顯示多達58%的HSC + 早期祖細胞接受具有分選酶修飾的Fab片段的LNP。 圖 18B顯示多達62%的長期（LT）-HSC接受具有分選酶修飾的Fab片段的LNP。相對於不具有抗CD117 Fab片段的LNP，具有分選酶修飾的Fab片段的LNP在HSC + 早期祖細胞中以及在LT-HSC中均展現出明顯更高的體內轉染水準。此外，如 圖 18C中所示，原代HSC的體外轉導與HSC中的體內靶向之間存在良好的相關性。另一態樣，也如 圖 18C中所示，在非特異性IgG與位點特異性綴合的（分選酶方法）Fab LNP之間存在分離。 圖 19示出了增加與對CD117具有特異性的Fab片段綴合的靶向性LNP中輔助脂質的mol%對HSC和早期祖細胞（HSC + 早期祖細胞）（也稱為HSPC）中編碼GFP的mRNA的轉導和表現的影響。具體地， 圖 19示出了比較含有兩種不同量的輔助脂質的靶向性LNP（LNP A和LNP B）的轉導的體內實驗的結果。LNP A和B分別包含8%輔助脂質（DSPC）和22%輔助脂質。超過80%的HSC + 早期祖細胞被LNP B轉導。 圖 20示出了基於FACS的分選的結果，所述基於FACS的分選用於鑒定在向3-5歲的食蟹猴投予本公開文本的綴合物後對GFP蛋白表現呈陽性的HSPC的百分比。 圖 21顯示LNP A（具有抗CD3 Fab）和LNP B（具有抗CD5 Fab）分別將GFP mRNA遞送至人類化NSG小鼠中的78%和84%脾huCD45+ T細胞。該資料顯示，例示的LNP將RNA遞送至位於次級淋巴組織內的人淋巴細胞。 圖 22展示本公開文本的例示的綴合物在投予至食蟹猴後將GFP mRNA分別遞送至淋巴結和外周血中的約10%和37%的CD3+ T細胞。 圖 23展示本公開文本的例示的綴合物在投予至食蟹猴後將GFP mRNA遞送至外周血中的CD4+ T細胞和CD8+ T細胞。 圖 24A示出了LNP經由抗體上的第一點擊柄與LNP上的第二點擊柄之間的反應與位點特異性修飾的抗體的綴合。 圖 24B示出了用於合成本公開文本的綴合物的幾種不同的互補點擊柄。 圖 25示出了在使用分選酶連接產生的位點特異性修飾的抗體與LNP之間使用抗體和LNP上不同的互補點擊柄的示例性反應的綴合效率。 圖 26示出了在用於評估聚乙二醇化脂質濃度對綴合效率的影響的研究中LNP的組分和LNP中聚乙二醇化脂質的不同比率。 圖 27示出了製備和純化本公開文本的綴合物的一般方法。 圖 28示出了聚乙二醇化脂質濃度對綴合效率的影響。 圖 29A示出了示例性基因修飾系統可以用於將嵌合抗原受體（CAR）分子引入原代人T細胞的基因組中。 圖 29B示出了在電穿孔或LNP將基因修飾系統遞送至T細胞後的BMCA CAR表現。 圖 29C示出了CAR T細胞對BCMA陽性腫瘤細胞的功效。 圖 30A- 圖 30B示出了用靶向性LNP或基礎LNP轉染的CD34+細胞的FACs分析結果，其顯示了表現GFP的細胞的百分比（GFP+%）（ 圖 30A）和GFP表現水準（MFI）（ 圖 30B）。
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Claims (93)

  1. 一種綴合物，所述綴合物包含靶向部分和包封治療劑的脂質奈米顆粒（LNP），其中所述靶向部分通過連接子與所述脂質奈米顆粒綴合，並且其中所述連接子包含由所述靶向部分上的第一點擊柄與所述LNP上的第二點擊柄之間的點擊反應形成的點擊產物，其中所述第一點擊柄包含四嗪（Tz）環並且所述第二點擊柄包含反式環辛烯（TCO）部分。
  2. 如請求項1所述的綴合物，其中所述靶向部分是包含至少一個C末端和至少一個N末端的蛋白質。
  3. 如請求項2所述的綴合物，其中所述蛋白質是抗體。
  4. 如請求項2所述的綴合物，其中所述蛋白質是Fab片段。
  5. 如請求項3所述的綴合物，其中所述蛋白質是單鏈可變片段（ScFv）。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的綴合物，其中所述四嗪環是未取代的。
  7. 如請求項1至5中任一項所述的綴合物，其中所述四嗪環是甲基四嗪。
  8. 如請求項7所述的綴合物，其中所述四嗪環是6-甲基四嗪。
  9. 如請求項1至5中任一項所述的綴合物，其中所述四嗪環具有以下結構之一： 。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的綴合物，其中所述LNP包含一個或多個脂質分子。
  11. 如請求項10所述的綴合物，其中所述第二點擊柄共價鍵合至所述脂質分子中的至少一個。
  12. 如請求項11所述的綴合物，其中鍵合至所述第二點擊柄的所述脂質分子是聚乙二醇化脂質。
  13. 如請求項12所述的綴合物，其中所述聚乙二醇化脂質的脂質組分選自DMG、DPG、DSG、DTA、DOPE、DPPE、DMPE、DSPE、鞘胺醇、鞘磷脂和硬脂酸。
  14. 如請求項12或請求項13所述的綴合物，其中所述LNP包含約0.05 mol%至約2 mol%的鍵合至所述第二點擊產物的所述聚乙二醇化脂質。
  15. 如請求項12或請求項13所述的綴合物，其中所述LNP包含約0.1 mol%至約1 mol%的鍵合至所述第二點擊產物的所述聚乙二醇化脂質。
  16. 如請求項12或請求項13所述的綴合物，其中所述LNP包含約0.5 mol%至約1 mol%的鍵合至所述第二點擊產物的所述聚乙二醇化脂質。
  17. 如請求項12至16中任一項所述的綴合物，其中鍵合至所述第二點擊產物的所述聚乙二醇化脂質具有約500至約5,000的分子量。
  18. 如請求項12至16中任一項所述的綴合物，其中鍵合至所述第二點擊產物的所述聚乙二醇化脂質具有約1,000至約3,000的分子量。
  19. 如請求項12所述的綴合物，其中所述聚乙二醇化脂質具有式DSPE-PEG2000-第二點擊產物。
  20. 如請求項12所述的綴合物，其中所述聚乙二醇化脂質具有式DSPE-PEG3000-第二點擊產物。
  21. 如請求項12所述的綴合物，其中所述聚乙二醇化脂質具有式DSPE-PEG5000-第二點擊產物。
  22. 如請求項1至21中任一項所述的綴合物，其中所述LNP包含一個或多個膽固醇分子。
  23. 如請求項22所述的綴合物，其中所述第二點擊柄共價鍵合至所述膽固醇分子中的至少一個。
  24. 如請求項23所述的綴合物，其中鍵合至所述第二點擊柄的所述膽固醇分子是β-谷甾醇、羥基膽固醇或豆甾烷醇。
  25. 如請求項1至24中任一項所述的綴合物，其中所述LNP包含至少一個未聚乙二醇化的磷脂。
  26. 如請求項25所述的綴合物，其中所述第二點擊柄鍵合至所述未聚乙二醇化的磷脂。
  27. 如請求項25所述的綴合物，其中所述未聚乙二醇化的磷脂是POPC、DOPC、DOPE或DSPC。
  28. 如請求項1至27中任一項所述的綴合物，其中所述LNP包含至少一個可電離脂質分子。
  29. 如請求項28所述的綴合物，其中所述第二點擊柄共價鍵合至所述可電離脂質分子。
  30. 如請求項29所述的綴合物，其中所述可電離脂質選自V003、V004、V005和V040。
  31. 如請求項1至30中任一項所述的綴合物，其中所述靶向部分與T細胞上的抗原結合。
  32. 如請求項31所述的綴合物，其中所述靶向部分與CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7或CD8結合。
  33. 如請求項1至32中任一項所述的綴合物，其中所述靶向部分與造血幹細胞（HSC）上的抗原結合。
  34. 如請求項33所述的綴合物，其中所述靶向部分與CD90或CD117結合。
  35. 如請求項1至34中任一項所述的綴合物，其中與每個LNP綴合的靶向部分的數量大於10。
  36. 如請求項1至34中任一項所述的綴合物，其中與每個LNP綴合的靶向部分的數量大於20。
  37. 如請求項1至34中任一項所述的綴合物，其中與每個LNP綴合的靶向部分的數量大於50。
  38. 如請求項1至34中任一項所述的綴合物，其中與每個LNP綴合的靶向部分的數量大於100。
  39. 如請求項1至34中任一項所述的綴合物，其中與每個LNP綴合的靶向部分的數量是從約10至約150。
  40. 如請求項1至34中任一項所述的綴合物，其中與每個LNP綴合的靶向部分的數量是從約10至約30。
  41. 如請求項1至34中任一項所述的綴合物，其中與每個LNP綴合的靶向部分的數量是從約50至約100。
  42. 如請求項1至34中任一項所述的綴合物，其中與每個LNP綴合的靶向部分的數量是從約100至約130。
  43. 如請求項1至42中任一項所述的綴合物，其中所述綴合物包含治療劑。
  44. 如請求項43所述的綴合物，其中所述治療劑包括核酸分子。
  45. 如請求項44所述的綴合物，其中所述核酸分子是DNA分子，例如DNA質體、封閉端DNA（ceDNA）或小環狀DNA。
  46. 如請求項44所述的綴合物，其中所述核酸分子是mRNA分子。
  47. 如請求項46所述的綴合物，其中所述mRNA編碼嵌合抗原受體（CAR）。
  48. 如請求項46所述的綴合物，其中所述mRNA編碼酶。
  49. 如請求項48所述的綴合物，其中所述酶包括核酸酶、重組酶、整合酶、轉座酶、反轉錄轉座酶、解旋酶、轉錄酶、聚合酶、反轉錄酶、脫胺酶、甲基化酶、去甲基化酶或連接酶或其組合。
  50. 如請求項49所述的綴合物，其中所述酶包括核酸酶。
  51. 如請求項50所述的綴合物，其中所述核酸酶包括CRISPR-Cas核酸酶。
  52. 如請求項51所述的綴合物，其中所述CRISPR-Cas核酸酶是切口酶。
  53. 如請求項51或請求項52所述的綴合物，其中所述CRISPR-Cas核酸酶是Cas9。
  54. 如請求項51所述的綴合物，其中所述CRISPR-Cas核酸酶是Cas12a。
  55. 如請求項51至54中任一項所述的綴合物，其中所述綴合物進一步包含gRNA分子。
  56. 如請求項43所述的綴合物，其中所述治療劑包括gRNA分子。
  57. 如請求項43所述的綴合物，其中所述治療劑包括基因修飾多肽。
  58. 如請求項57所述的綴合物，其中所述基因修飾多肽包含反轉錄轉座子。
  59. 如請求項57或請求項58所述的綴合物，其中所述綴合物進一步包含與所述基因修飾多肽結合的範本RNA。
  60. 如請求項59所述的綴合物，其中所述範本RNA編碼CAR。
  61. 如請求項59所述的綴合物，其中所述治療劑包括範本RNA分子，例如與基因修飾多肽結合的範本RNA。
  62. 如請求項61所述的綴合物，其中所述範本RNA分子編碼CAR。
  63. 如請求項43所述的綴合物，其中所述治療劑包括基因修飾系統。
  64. 如請求項63所述的綴合物，其中所述基因修飾系統包含基因修飾多肽和範本RNA。
  65. 如請求項64所述的綴合物，其中所述基因修飾多肽包含反轉錄轉座子。
  66. 如請求項64所述的綴合物，其中所述範本RNA編碼CAR。
  67. 如請求項44所述的綴合物，其中所述核酸分子包括siRNA或miRNA。
  68. 如請求項44所述的綴合物，其中所述核酸分子包括非編碼RNA（ncRNA）分子。
  69. 如請求項43所述的綴合物，其中所述治療劑包括肽、蛋白質或小分子。
  70. 如請求項43所述的綴合物，其中所述治療劑包括異源基因修飾系統或其組分。
  71. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如請求項1至70中任一項所述的綴合物。
  72. 一種細胞，所述細胞包含如請求項1至70中任一項所述的綴合物。
  73. 一種治療癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者投予如請求項71所述的藥物組合物。
  74. 如請求項73所述的方法，其中所述癌症是血液癌症。
  75. 如請求項74所述的方法，其中所述血液癌症是多發性黑色素瘤。
  76. 一種治療鐮狀細胞疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者投予如請求項71所述的藥物組合物。
  77. 一種將LNP與抗體、Fab片段或單鏈可變片段（ScFv）綴合的方法，其中所述抗體、Fab片段或ScFv與包含四嗪環的第一點擊柄共價連接並且所述LNP與包含TCO部分的第二點擊柄共價連接，所述方法包括使所述LNP與抗體、Fab片段或ScFv接觸，使得第一點擊柄與所述第二點擊柄反應以形成將所述抗體、Fab片段或ScFv與所述LNP綴合的點擊反應產物。
  78. 如請求項77所述的方法，其中所述四嗪環是未取代的。
  79. 如請求項77所述的方法，其中所述四嗪環是甲基四嗪。
  80. 如請求項77至79中任一項所述的方法，其中所述第二點擊柄共價鍵合至聚乙二醇化脂質分子。
  81. 如請求項80所述的方法，其中所述聚乙二醇化脂質的脂質組分選自DMG、DPG、DSG、DTA、DOPE、DPPE、DMPE、DSPE和硬脂酸。
  82. 如請求項81所述的方法，其中所述聚乙二醇化脂質的脂質組分是DSPE。
  83. 如請求項77至82中任一項所述的方法，其中綴合效率大於50%。
  84. 如請求項77至82中任一項所述的方法，其中綴合效率大於70%。
  85. 如請求項77至82中任一項所述的方法，其中綴合效率大於80%。
  86. 如請求項77至82中任一項所述的方法，其中綴合效率大於90%。
  87. 如請求項77至82中任一項所述的方法，其中綴合效率是從約60%至約95%。
  88. 如請求項77至82中任一項所述的方法，其中綴合效率是從約75%至約90%。
  89. 如請求項77至88中任一項所述的方法，其中所述綴合物每個LNP包含多於10個抗體、Fab片段或ScFv分子。
  90. 如請求項77至88中任一項所述的方法，其中所述綴合物每個LNP包含多於20個抗體、Fab片段或ScFv分子。
  91. 如請求項77至88中任一項所述的方法，其中所述綴合物每個LNP包含多於100個抗體、Fab片段或ScFv分子。
  92. 如請求項77至88中任一項所述的方法，其中所述綴合物每個LNP包含約50至約200個抗體、Fab片段或ScFv分子。
  93. 一種通過如請求項77至92中任一項所述的方法製備的綴合物。
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