TW202548005A - 三維細胞培養體的冷凍物、包含三維細胞培養體的冷凍物的容器、細胞冷凍套件、冷凍保存液、冷凍物的製造方法、冷凍物的使用方法、三維細胞培養體之解凍物的製造方法及冷凍保存液的使用方法 - Google Patents

三維細胞培養體的冷凍物、包含三維細胞培養體的冷凍物的容器、細胞冷凍套件、冷凍保存液、冷凍物的製造方法、冷凍物的使用方法、三維細胞培養體之解凍物的製造方法及冷凍保存液的使用方法

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Abstract

本發明之三維細胞培養體的冷凍物係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液之冷凍物，其中冷凍保存液包含鈣鹽及水，鈣鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計滿足3.5 ppm以上且500 ppm以下。

Description

三維細胞培養體的冷凍物、包含三維細胞培養體的冷凍物的容器、細胞冷凍套件、冷凍保存液、冷凍物的製造方法、冷凍物的使用方法、三維細胞培養體之解凍物的製造方法及冷凍保存液的使用方法
本發明係關於三維細胞培養體的冷凍物、包含三維細胞培養體的冷凍物之容器、細胞冷凍套件、冷凍保存液、三維細胞培養體之冷凍物的製造方法、三維細胞培養體之冷凍物的使用方法及冷凍保存液的使用方法。
已知有專利文獻1～3所記載之技術作為細胞的冷凍保存方法。
於專利文獻1記載有將細胞懸浮液中所包含之單一細胞在包含純化白蛋白、二甲亞碸（DMSO）、鈣及鎂之冷凍保存液中冷凍的手法。
於專利文獻2記載有用以稀釋將冷凍保存細胞融解而獲得之細胞懸浮液的緩衝液。記載有由於細胞懸浮液可能包含細胞毒性成分（例如DMSO等），故可藉由使用包含人類血清白蛋白的緩衝液稀釋來減低細胞毒性成分的影響。
於專利文獻3記載有將細胞層片冷凍的手法。記載有使用含有DMSO的STEM-CELLBANKER（註冊商標）作為冷凍保存液。
『專利文獻』《專利文獻1》：日本專利第4385158號說明書《專利文獻2》：國際公開第2021/065971號《專利文獻3》：日本專利公開第2022-8269號公報
於單一細胞的冷凍時，細胞外的滲透壓會變高，發生脫水與收縮。
於細胞層片的冷凍時，與單一細胞相同，會發生脫水與收縮的現象，但除此之外，報告有細胞層片所具有之細胞間結合或細胞外基質因冰晶形成而受到破壊。
此機制並不確定，但可推想在產生由冷凍時的脫水／收縮所致之應變時，在單一細胞中，由於周圍無由細胞所致之束縛，故細胞膜的自由度高，但另一方面，在如細胞層片般的具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體中，由於細胞周圍受到其他細胞束縛，個別細胞膜的自由度低，故有易於發生如同上述之膜破壊的傾向。
根據本發明人等的研究，明白在三維細胞培養體中，第一在冷凍融解後之細胞生存率一點上有改善的餘地，第二在代謝活性率一點上有改善的餘地。
針對細胞膜的修復，已知有下述機制：若細胞膜局部性損傷，則Ca2+會由斷裂部位流入至細胞內，透過高濃度的Ca2+訊號，細胞內的小胞與細胞膜融合（胞吐作用）會活性化，藉由此取決於Ca2+的胞吐作用，會供應新的膜成分，促進斷裂部的修復。
然而，上述細胞膜修復的機制並非已充分查明。
舉例而言，可假定若係單一細胞，則由於周圍接觸至冷凍保存液，故在細胞膜之任何破損部位中，鈣離子（Ca2+）均可輕易滲透，但在三維細胞培養體中之細胞彼此之連結部分（細胞外基質等）係破損部位之情況下，鈣離子或冷凍保存液難以滲透於此部分。
本發明人等潛心研究的結果，得知藉由使用較市售品的冷凍保存液所包含之鈣離子濃度還高之濃度者，可提升第一點在冷凍融解後之細胞生存率，進而完成本發明。
詳細的機制並不確定，但可推想在冷凍細胞的融解時，細胞膜外的鈣離子會自承受機械性壓力或障礙的細胞膜部分之周邊流入至內部；藉由使用高濃度的鈣離子，在未相接至冷凍保存液（鈣離子未流入）之細胞彼此之連結部分（細胞外基質等）的破損部位中亦會發生由取決於Ca2+的胞吐作用所致之細胞膜修復，在三維細胞培養體中，可提升在冷凍融解後之細胞生存率。
並且，同理，得知藉由使用較市售品的冷凍保存液所包含之鎂離子濃度還高之濃度者，可提升第二點在冷凍融解後之代謝活性率，進而完成本發明。
並且，藉由併用高濃度的鈣離子與高濃度的鎂離子來提升代謝活性，藉此變得能夠進一步提高細胞生存率。
根據本發明之一態樣，可提供以下之三維細胞培養體的冷凍物、包含三維細胞培養體的冷凍物之容器、細胞冷凍套件、冷凍保存液、三維細胞培養體之冷凍物的製造方法、三維細胞培養體之冷凍物的使用方法及冷凍保存液的使用方法。
1. 一種三維細胞培養體的冷凍物，其係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保存液包含鈣鹽及水，前述鈣鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下。
2. 一種三維細胞培養體的冷凍物，其係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保存液包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
3. 如1.所記載之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保存液包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
4. 如1.～3.之任一項所記載之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保存液包含冷凍保護劑。
5. 如4.所記載之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保護劑包含選自由DMSO、丙三醇、丙二醇及乙二醇而成之群組之一種或二種以上。
6. 如1.～5.之任一項所記載之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述三維細胞培養體包含細胞層片或球狀體。
7. 如6.所記載之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述三維細胞培養體包含基材與接合至前述基材上的前述細胞層片。
8. 如1.～7.之任一項所記載之三維細胞培養體的冷凍物，其中在將該冷凍物解凍後之前述三維細胞培養體所包含之細胞的生存率為35%以上。
9. 一種容器，其包含如1.～8.之任一項所記載之三維細胞培養體的冷凍物。
10. 一種細胞冷凍套件，其係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液之細胞冷凍套件，其中前述冷凍保存液係滿足下述（i）及（ii）之至少一項者：（i）包含鈣鹽及水，前述鈣鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm 以上且500 ppm以下；（ii）包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
11. 一種冷凍保存液，其係用以將具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體冷凍的冷凍保存液，其中該冷凍保存液係滿足下述（i）及（ii）之至少一項者：（i）包含鈣鹽及水，前述鈣鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下；（ii）包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
12. 一種冷凍物的製造方法，其係包含使具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體在冷凍保存液中冷凍之冷凍工序的三維細胞培養體之冷凍物的製造方法，其中前述冷凍保存液係滿足下述（i）及（ii）之至少一項者：（i）包含鈣鹽及水，前述鈣鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下；（ii）包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
13. 如12.所記載之冷凍物的製造方法，其中前述冷凍工序使前述三維細胞培養體在未達前述冷凍保存液的凝固溫度下冷凍。
14. 一種三維細胞培養體之解凍物的製造方法，其包含解凍工序，將在如12.或13.所記載之冷凍物的製造方法中獲得之三維細胞培養體的冷凍物解凍。
15. 如14.所記載之三維細胞培養體之解凍物的製造方法，其中前述解凍工序維持在將前述三維細胞培養體的至少一部分接觸至液體狀態之前述冷凍保存液的狀態。
16. 如1.～8.之任一項所記載之三維細胞培養體之冷凍物的使用方法，其中在將前述冷凍物解凍時，維持在將前述三維細胞培養體的至少一部分接觸至液體狀態之前述冷凍保存液的狀態。
17. 一種冷凍保存液的使用方法，其係如11.所記載之冷凍保存液的使用方法，包含藉由維持使前述冷凍保存液接觸至在冷凍及解凍時之前述三維細胞培養體的至少一部分之狀態，改善前述三維細胞培養體之中的細胞之生存率的工序。
18. 一種冷凍保存液的使用方法，其係如11.所記載之冷凍保存液的使用方法，包含藉由維持使前述冷凍保存液接觸至在冷凍及解凍時之前述三維細胞培養體的至少一部分之狀態，保護前述三維細胞培養體之中之細胞免於隨冷凍而生之細胞損傷的工序。
根據本發明，可提供在冷凍融解後之三維細胞培養體的細胞生存率及／或代謝活性率優異之三維細胞培養體的冷凍物、使用其之包含三維細胞培養體的冷凍物之容器、細胞冷凍套件、冷凍保存液、三維細胞培養體之冷凍物的製造方法、三維細胞培養體之冷凍物的使用方法及冷凍保存液的使用方法。
茲說明本實施方式之三維細胞培養體的冷凍物之概要。
第一實施方式之三維細胞培養體的冷凍物係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液之三維細胞培養體的冷凍物，其中冷凍保存液包含鈣鹽及水，鈣鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計滿足3.5 ppm以上且500 ppm以下。
第二實施方式之三維細胞培養體的冷凍物係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液之三維細胞培養體的冷凍物，冷凍保存液包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在冷凍保存液包含鎂鹽之情況下，鎂鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之二價金屬鹽之情況下，二價金屬鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計滿足0.01 ppm以上且100 ppm以下。
所謂第一實施方式及第二實施方式之冷凍物，包含將三維細胞培養體在冷凍保存液中冷凍者。
冷凍保存液所包含之鈣鹽或鈣鹽以外之二價金屬鹽在冷凍前或冷凍解凍後，在水中至少一部分或幾乎全部電離，以鈣離子或二價金屬離子的離子狀態之形式存在。
根據第一實施方式，藉由將鈣離子濃度做成上述下限值以上且上述上限值以下，可提升冷凍解凍後之三維細胞培養體的細胞生存率。
在冷凍保存液中之鈣濃度，舉例而言，能夠透過指定之鈣鹽的添加量來調整，良佳亦可為將市售的冷凍保存液與指定之鈣鹽混合來調整。
市售的冷凍保存液實質上並不包含鈣離子，但即使包含亦不過為3.0 ppm程度以下。藉由於市售的冷凍保存液加入指定之鈣鹽，可調整鈣離子濃度至上述下限值以上。
並且，於冷凍保存液亦可包含有冷凍保護劑，但作為良佳型態之一，亦可包含有DMSO。
在第一實施方式中，即使在使用包含DMSO的冷凍保存液之情況下，亦可抑制細胞生存率的降低。
詳細的機制並不確定，但可推想在冷凍解凍時，雖有可能承受由DMSO所致之毒性障礙，但由於透過由高濃度的鈣離子所致之胞吐作用，細胞膜修復會提前顯現，可抑制毒性障礙，故可抑制細胞生存率的降低。
根據第二實施方式，藉由將鎂離子濃度做成上述下限值以上且上述上限值以下，可提升冷凍解凍後之三維細胞培養體的代謝活性率。並且，根據第二實施方式，藉由將鎂離子以外之其他二價金屬離子濃度做成上述下限值以上且上述上限值以下，可提升冷凍解凍後之三維細胞培養體的代謝活性率。
詳細的機制並不確定，但可推想鎂離子或其他二價金屬離子與代謝酵素有關，可提前細胞膜的恢復，藉此代謝活性會上升。
在冷凍保存液中之鎂濃度，舉例而言，能夠透過指定之鎂鹽的添加量來調整，良佳亦可為將市售的冷凍保存液與指定之鎂鹽混合來調整。於市售的冷凍保存液實質上不包含鎂離子，但即使包含亦不過為1.0 ppm程度以下。藉由對市售的冷凍保存液加入指定之鎂鹽，可將鈣離子濃度調整至上述下限值以上。
在第三實施方式中，冷凍保存液包含鈣鹽與選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽。
在第三實施方式之冷凍保存液中之鈣鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下，且在第三實施方式之冷凍保存液包含鎂鹽之情況下，鎂鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在第三實施方式之冷凍保存液包含鎂鹽以外之二價金屬鹽之情況下，此二價金屬鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計滿足0.01 ppm以上且100 ppm以下。
根據第三實施方式，由於可期待由鎂離子或其他二價金屬離子所致之代謝活性的提升，故藉由與鈣離子的相乘效果可更進一步實現細胞生存率的提升或代謝活性率的提升。
在再生醫療等醫療領域中，為了損傷之組織的修復等，製作將細胞形成為片狀的細胞層片等三維細胞培養體，將此移植至患部，藉此進行細胞移植的醫療技術近年正在急速進歩。在此種細胞移植中，培養三維細胞培養體使細胞增殖後至對患者進行細胞移植之間，要求長時間保存同時維持良好的細胞生存性。
相對於此，藉由使用本實施方式之三維細胞培養體的冷凍物，由於即使在冷凍解凍後，亦可提供細胞生存率及／或代謝活性率優異的三維細胞培養體，故可將此合宜使用於移植用。
並且，本發明人等為了獲得冷凍保存後之細胞生存率經改善的三維細胞培養體，針對冷凍保存液所包含之成分，以及三維細胞培養體的冷凍及解凍方法潛心進行研究。其結果，發現若使冷凍保存液中含有特定濃度的鈣鹽，且在冷凍保存後的解凍時，將使之冷凍解凍的冷凍保存液與三維細胞培養體置於接觸狀態，則令人驚訝，相較於於冷凍保存液中不包含上述特定濃度的鈣鹽之情形，剛冷凍解凍後的細胞生存率大幅改善，再者，自冷凍解凍經過一定時間後的細胞生存率會進一步上升或高度維持，使本發明臻至完成。並且，除了上述特定濃度的鈣鹽之外，亦發現藉由額外添加鎂鹽，冷凍解凍後的細胞生存率得進一步改善。
並且，根據本發明，在使用包含指定濃度之鈣鹽及任意選擇之指定濃度之鎂鹽的冷凍保存液將三維細胞培養體冷凍保存之情況下，相較於除了冷凍保存液包含鈣鹽及任意選擇之指定濃度之鎂鹽以外以相同條件獲得之經冷凍解凍的三維細胞培養體中之細胞的生存率，在冷凍解凍後，前者的細胞生存率顯著改善。並且，根據本發明，由於在冷凍解凍後三維細胞培養體中的細胞會維持高的細胞生存率，故變得亦無須在冷凍解凍後再次進行細胞培養使細胞增殖，進一步而言，由於亦無須在細胞解凍後去除包含如DMSO之細胞毒性物質的冷凍保存液，故工序會簡化，亦可減低製造成本。
並且，在本實施方式中，可提供三維細胞培養體的冷凍物、使用其之包含三維細胞培養體的冷凍物之容器、細胞冷凍套件、冷凍保存液、三維細胞培養體之冷凍物的製造方法、三維細胞培養體之冷凍物的使用方法、冷凍保存液的使用方法。
本實施方式之容器只要係包含上述三維細胞培養體的冷凍物者即可，亦可包含將三維細胞培養體的冷凍物以包裝體包裝者。
本實施方式之細胞冷凍套件係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液者。
細胞冷凍套件中之冷凍保存液係滿足下述（i）及（ii）之至少一項者。（i）包含鈣鹽及水，鈣鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下（ii）包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在冷凍保存液包含鎂鹽之情況下，鎂鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在冷凍保存液包含鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此二價金屬鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下
本實施方式之冷凍保存液係用以將具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體冷凍者，該冷凍保存液係滿足下述（i）及（ii）之至少一項者。（i）包含鈣鹽及水，鈣鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下（ii）包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在冷凍保存液包含鎂鹽之情況下，鎂鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在冷凍保存液包含鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此二價金屬鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下
本實施方式之三維細胞培養體之冷凍物的製造方法包含使具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體在冷凍保存液中冷凍的冷凍工序。
使用於該冷凍工序的冷凍保存液係滿足下述（i）及（ii）之至少一項者。（i）包含鈣鹽及水，鈣鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下（ii）包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在冷凍保存液包含鎂鹽之情況下，鎂鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在冷凍保存液包含鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此二價金屬鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下
本實施方式之三維細胞培養體之冷凍物的使用方法包含在將三維細胞培養體的冷凍物解凍時，維持在將三維細胞培養體的至少一部分接觸至液體狀態之冷凍保存液的狀態之工序。
本實施方式之冷凍保存液的使用方法包含藉由維持使冷凍保存液接觸至在冷凍及解凍時之三維細胞培養體的至少一部分之狀態，改善三維細胞培養體之中的細胞之生存率的工序。
本實施方式之冷凍保存液的使用方法包含藉由維持使冷凍保存液接觸至在冷凍及解凍時之三維細胞培養體的至少一部分之狀態，保護三維細胞培養體之中之細胞免於隨冷凍而生之細胞損傷的工序。
以下詳述本實施方式之三維細胞培養體的冷凍物等之各構成。
（定義）
在本說明書中，所謂「冷凍」狀態，意謂以於細胞內未形成冰晶或於細胞內形成有少量之冰晶之方式冰凍起來的固體狀態。就減低由冷凍或解凍所致之對細胞的損傷之觀點而言，以於細胞內未形成冰晶為佳。
所謂三維細胞培養體「與冷凍保存液同時冷凍」，係謂藉由對於配置或浸漬於冷凍保存液中之三維細胞培養體或者與冷凍保存液以任意方式處於接觸狀態的三維細胞培養體施以冷凍處理，三維細胞培養體及冷凍保存液一同受到冷凍。
「冷凍」物除了三維細胞培養體及冷凍保存液全部受到冷凍之情形之外，亦包含此等之一部分受到冷凍之情形。
此外，冷凍物所包含之水分子可為結晶（冰晶），亦可為至少一部分為非晶質。
在本說明書中，所謂「冷凍處理」，係指用以使細胞冷凍的處理，具體而言，係指將冷凍保存液中之三維細胞培養體置於未達冷凍保存液之凝固溫度的環境下，將存在於三維細胞培養體的細胞冷凍。並且，所謂使冷凍保存液中之三維細胞培養體「在未達冷凍保存液之凝固溫度下冷凍」，與將冷凍保存液中之三維細胞培養體置於未達冷凍保存液之凝固溫度的環境下將存在於三維細胞培養體的細胞冷凍同義。並且，所謂「冷凍保存」，意謂持續保存冷凍的細胞一定期間（包含長時間或短時間之任一者）。
在本說明書中，所謂「冷凍解凍」，係指將經冷凍的細胞解凍。冷凍解凍，具體而言，係將與冷凍保存液同時冷凍的三維細胞培養體放置於冷凍保存液之凝固溫度以上的環境以將三維細胞培養體中的細胞解凍一事。在經冷凍的冷凍保存液成為經解凍的液體狀態（此確認亦可以目視進行），該液體狀態的冷凍保存液與三維細胞培養體處於接觸狀態之情況下，亦可視為三維細胞培養體中的細胞已解凍。
在本說明書中，「冷凍解凍時」的用語除了冷凍解凍後冷凍保存液全部為液體狀態時之外，亦可包含冷凍保存液之一部分成為液體狀態之情形。
所謂「置於接觸狀態」，係指三維細胞培養體與冷凍保存液接觸之任意狀態持續維持指定之時間，典型上指三維細胞培養體（其全部或一部分）配置或浸漬於冷凍保存液中的狀態。
該「置於接觸狀態」為了迴避冷凍保存液中之細胞毒性物質（DMSO等）的不良影響等，在經冷凍之冷凍保存液的解凍後，亦可為區分成（i）立刻將包含細胞毒性物質的冷凍保存液廢棄，不做成細胞毒性物質與三維細胞培養體接觸之狀態的態樣者。並且，該「置於接觸狀態」在經冷凍之冷凍保存液的解凍後，亦可為區分成（ii）做成稀釋了細胞毒性物質之濃度的冷凍保存液之稀釋液與三維細胞培養體接觸之狀態的態樣者。
此外，冷凍方法及冷凍解凍方法的細節如同於後述所說明。
（冷凍保存液）
在本說明書中，「冷凍保存液」（亦稱作「細胞冷凍保存液」）係指使用於細胞之冷凍保存的溶液。
第一實施方式之冷凍保存液包含鈣鹽及水，前述鈣鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計滿足3.5 ppm以上且500 ppm以下。
惟在第一實施方式之冷凍保存液中，可包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽，亦可不包含上述二價金屬鹽，但在包含鎂鹽之情況下，鎂鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計可未達2 ppm，亦可為1.9 ppm以下。
第二實施方式之冷凍保存液包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，滿足：在冷凍保存液包含鎂鹽之情況下，鎂鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在冷凍保存液包含鎂鹽以外之二價金屬鹽之情況下，此二價金屬鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
惟在第二實施方式之冷凍保存液中，可包含鈣鹽，亦可不包含鈣鹽，但在包含鈣鹽之情況下，鈣鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計可未達3.5 ppm，亦可為3.4 ppm以下。
第三實施方式之冷凍保存液包含鈣鹽與選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽，鈣鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下，且在冷凍保存液包含鎂鹽之情況下，鎂鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在冷凍保存液包含鎂鹽以外之二價金屬鹽之情況下，此二價金屬鹽的含量以冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計滿足0.01 ppm以上且100 ppm以下。
於在本實施方式中之三維細胞培養體的冷凍物、包含三維細胞培養體的冷凍物之容器、細胞冷凍套件、冷凍保存液、三維細胞培養體之冷凍物的製造方法、三維細胞培養體之冷凍物的使用方法及冷凍保存液的使用方法中，亦可應用第一實施方式之冷凍保存液、第二實施方式之冷凍保存液、第三實施方式之冷凍保存液之任一者。
所謂鈣離子換算之鈣鹽的含量，即意謂鈣離子的濃度。對於鎂鹽的含量及二價金屬鹽的含量，所謂離子換算，同理，亦分別意謂鎂離子的濃度、二價金屬離子的濃度。
以下，鈣鹽的含量、鎂鹽的含量、二價金屬鹽的含量有時亦會分別稱呼為鈣離子濃度、鎂離子濃度、二價金屬離子濃度。
所謂「以冷凍保存液之總重量為基準的含量」，意謂以冷凍保存液的100質量%為基準，對總量100質量%中所包含之存在比例進行質量換算者。
鈣鹽亦可為與鹽酸、硝酸、硫酸等陰離子的鈣鹽，可使用例如：氯化鈣或硝酸鈣等。
鎂鹽亦可為與鹽酸、硝酸、硫酸等陰離子的鎂鹽，舉例而言，可使用硫酸鎂或氯化鎂等。
鎂鹽以外之其他二價金屬鹽可使用鹽酸、硝酸、硫酸、氨等陰離子與銅離子、錳離子、鐵離子、鉬離子、鎳離子、鈷離子等其他陽離子的二價金屬鹽。
冷凍保存液中之鈣離子濃度、鎂離子濃度、其他二價金屬離子濃度亦可由原料比例來計算，若係冷凍前或冷凍解凍後的狀態，則能夠透過離子層析法來量測。
此外，在由原料比例來計算之情形中，亦可在存在於冷凍保存液中的所有鹽解離為離子之前提下計算鈣離子濃度、鎂離子濃度、其他二價金屬離子濃度。
〈離子層析法分析〉
冷凍保存液中的鈣離子及鎂離子之利用離子層析法的量測方法之一例係如同以下。
關於冷凍保存液中的鈣離子及鎂離子，以離子層析法（ICS2100，Thermo Fisher Scientific公司製）量測。量測試樣使用以超過濾除去了蛋白質者，以基質照明（MI）模式量測。離子層析法以以下參數實施。分離管柱：Ion Pac CS16（內徑4 mm×250 mm）保護管柱：Ion Pac CG16（內徑4 mm×250 mm） 頂部管柱：TCC-LP1（內徑4 mm×35 mm）抑制器：CDRS600（外部模式） 管柱溫度：35℃偵測器：導電度溶析液流量：1.0 mL／min溶析液：30 mM甲磺酸水溶液MI條件：溶析液：水；MI用流量：1 mL／min；MI用輸液時間：−1～0 min試樣導入量：25 μL標準曲線：將陽離子混合標準液II（07197-96，關東化學公司製）以超純水任意稀釋來製作
上述3.5 ppm～500 ppm之鈣離子濃度包含此等數值範圍內的由每0.1 ppm或1 ppm之任意值之間界定之濃度範圍。舉例而言，鈣離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準為3.5～500 ppm、3.5～450 ppm、3.5～400 ppm、3.5～350 ppm、3.5～300 ppm、3.5～250 ppm、3.5～200 ppm、3.5～150 ppm、3.5～100 ppm、5～500 ppm、5～450 ppm、5～400 ppm、5～350 ppm、5～300 ppm、5～250 ppm、5～200 ppm、5～150 ppm、5～100 ppm、7～500 ppm、7～450 ppm、7～400 ppm、7～350 ppm、7～300 ppm、7～250 ppm、7～200 ppm、7～150 ppm、7～100 ppm等。或者，鈣離子濃度之下限以冷凍保存液的總重量為基準，亦可為例如：3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm之任意值），鈣離子濃度之上限以冷凍保存液的總重量為基準，亦可為例如：100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm之任意值）。
鎂離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準，有2～300 ppm、2～200 ppm、2～150 ppm、2～100 ppm、2～20 ppm，並且，包含此等數值範圍內的由每0.1 ppm或1 ppm之任意值之間界定之濃度範圍。或者，鎂離子濃度之下限以冷凍保存液的總重量為基準，亦可為：2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7. 5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、1 5、16、17、18、19 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm之任意值），鎂離子濃度之上限亦可為：20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm之任意值）。
鎂離子以外之其他二價金屬離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準為0.01 ppm～100 ppm。
其他二價金屬離子濃度亦可定為銅離子、錳離子、鋅離子、鐵離子、鉬離子、鎳離子及鈷離子的合計濃度。
銅離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準，為0.01 ppm以上、0.02 ppm以上、0.02～100 ppm、0.02～50 ppm、0.02～10 ppm、0.02～8 ppm、0.02～5 ppm，並且，包含此等的數量值範圍內的由每0.01 ppm、0.1 ppm或1 ppm之任意值之間界定之濃度範圍。或者，銅離子濃度之下限以冷凍保存液的總重量為基準，亦可為：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 ppm（此包含此等值之間的每0.01 ppm或0.1 ppm之任意值），銅離子濃度之上限亦可為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm 之任意值）。
錳離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準為0.01 ppm以上、0.02 ppm以上、0.02～100 ppm、0.02～50 ppm、0.02～10 ppm、0.02～8 ppm、0.02～5 ppm，並且，包含此等數值範圍內的由每0.01 ppm、0.1 ppm或1 ppm之任意值之間界定之濃度範圍。或者，錳離子濃度之下限以冷凍保存液的總重量為基準。亦可為：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 ppm（包含此等值之間的每0.01 ppm或0.1 ppm之任意值），錳離子濃度之上限亦可為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm 之任意值）。
鋅離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準為0.01 ppm以上、0.02 ppm以上、0.02～100 ppm、0.02～50 ppm、0.02～10 ppm、0.02～8 ppm、0.02～5 ppm，並且，包含此等數值範圍內的由每0.01 ppm、0.1 ppm或1 ppm之任意值之間界定之濃度範圍。或者，鋅離子濃度之下限以冷凍保存液的總重量為基準，亦可為：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 ppm（包含此等值之間的每0.01 ppm或0.1 ppm之任意值），鋅離子濃度之上限亦可為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm之任意值）。
鐵（II）離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準為0.01 ppm以上、0.02 ppm以上、0.02～100 ppm、0.02～50 ppm、0.02～10 ppm、0.02～8 ppm、0.02～5 ppm，並且，包含此等數值範圍內的由每0.01 ppm、0.1 ppm或1 ppm之任意值之間界定之濃度範圍。或者，鐵（II）離子濃度之下限以冷凍保存液的總重量為基準，亦可為：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 ppm（包含此等值之間的每0.01 ppm或0.1 ppm之任意值），鐵（II）離子濃度之上限亦可為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ppm（此包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm之任意值）。
鉬（II）離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準為0.01 ppm以上、0.02 ppm以上、0.02～100 ppm、0.02～50 ppm、0.02～10 ppm、0.02～8 ppm、0.02～5 ppm，並且，包含此等數值範圍內的由每0.01 ppm、0.1 ppm或1 ppm之任意值之間界定之濃度範圍。或者，鉬（II）離子濃度之下限以冷凍保存液的總重量為基準，亦可為：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 ppm（包含此等值之間的每0.01 ppm或0.1 ppm之任意值），鉬（II）離子濃度之上限亦可為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm之任意值）。
鎳離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準為0.01 ppm以上、0.02 ppm以上、0.02～100 ppm、0.02～50 ppm、0.02～10 ppm、0.02～8 ppm、0.02～5 ppm，並且，包含此等數值範圍內的由每0.01 ppm、0.1 ppm或1 ppm之任意值之間界定之濃度範圍。或者，鎳離子濃度之下限以冷凍保存液的總重量為基準，亦可為：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 ppm（包含此等值之間的每0.01 ppm或0.1 ppm之任意值），鎳離子濃度之上限亦可為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm之任意值）。
鈷（II）離子濃度以冷凍保存液的總重量為基準為0.01 ppm以上、0.02 ppm以上、0.02～100 ppm、0.02～50 ppm、0.02～10 ppm、0.02～8 ppm、0.02～5 ppm，並且，包含此等數值範圍內的由每0.01 ppm、0.1 ppm或1 ppm之任意值之間界定之濃度範圍。或者，鈷（II）離子濃度之下限以冷凍保存液的總重量為基準，亦可為：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 ppm（包含此等值之間的每0.01 ppm或0.1 ppm之任意值），鈷（II）離子濃度之上限亦可為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ppm（包含此等值之間的每0.1 ppm或1 ppm之任意值）。
於冷凍保存液，亦可進一步添加有鈣鹽及鎂鹽、上述二價金屬離子以外之無機鹽。作為無機鹽，可舉出金屬鹽，於此可包含鹼金屬鹽（鈉鹽、鉀鹽等）、鹼土金屬鹽（排除鈣鹽及鎂鹽）等鹽。金屬鹽亦可為二價或三價的金屬鹽。具體而言，可以鹽酸、硝酸、硫酸等的金屬鹽之形式使用，可列舉：氯化鉀、氯化鈉等。此等得有別於細胞培養液中所包含之金屬鹽而添加。金屬鹽的種類或濃度可適當使用對細胞的生存呈有利者，但濃度並非受限者，但得在0.01～10000 ppm──以1～1000 ppm為佳──之範圍使用。
冷凍保存液亦可包含冷凍保護劑。
「冷凍保護劑」係用以減低冷凍保存時之由冷凍或解凍所致之對細胞的損傷之物質。
作為冷凍保護劑，可列舉例如：細胞非滲透性冷凍保護劑及細胞滲透性冷凍保護劑。作為細胞非滲透性冷凍保護劑的具體例，可列舉例如：白蛋白、蔗糖、海藻糖、聚葡糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚離胺酸等。作為細胞滲透性冷凍保護劑的具體例，可列舉例如：DMSO、多元醇、丙三醇（甘油）、乙二醇、丙二醇等。並且，此等冷凍保護劑可單獨摻合，亦可組合二種以上而摻合。
良佳為冷凍保護劑亦可包含選自由DMSO、丙三醇、丙二醇及乙二醇而成之群組之一種或二種以上。
此等冷凍保護劑，只要因應細胞的種類、冷凍保存液的組成等由眾所周知者適當設定即可。冷凍保護劑的含量能夠透過使用之成分的種類來適當變更。
此外，在以往技術中，由於DMSO有可能對細胞分化造成影響，故就細胞生存率之觀點而言，教示以不包含DMSO為佳，但在本發明中，即使加入DMSO亦可獲得良好的細胞生存率。在DMSO為冷凍保存液所包含之情況下，DMSO的重量以冷凍保存液的體積為基準，其上限值為30 w／v%，以25 w／v%為佳，以20 w／v%為較佳，以15 w／v%為更佳，且其下限值為1 w／v%，以2 w／v%為較佳，以3 w／v%為更佳。因此，DMSO的重量以冷凍保存液的體積為基準，良佳為透過1～30 w／v%及此範圍所包含之每1 w／v%的任意數值所規定之數值範圍，亦可為例如：1～25 w／v%、2～25 w／v%、3～20 w／v%、4～20 w／v%、5～20 w／v%、5～15 w／v%、5～10 w／v%等的數值範圍。
冷凍保存液亦可包含市售的冷凍保存液。
作為包含DMSO之市售的冷凍保存液，可列舉例如：STEM-CELLBANKER（註冊商標）GMP等級（日本全藥工業公司）、BAMBANKER（註冊商標）hRM（GC LYMPHOTEC INC.）、BAMBANKER（註冊商標）（GC LYMPHOTEC INC.）、iStock（註冊商標）（GC LYMPHOTEC INC.）等。
並且，作為不包含DMSO之市售的冷凍保存液，可列舉例如：STEM-CELLBANKER（註冊商標）無DMSO GMP等級（日本全藥工業公司）、BAMBANKER（註冊商標）無DMSO（GC LYMPHOTEC INC.）、CryoScarless（註冊商標）無DMSO（Bioverde Co., Ltd.）、StemCell Keep（Bioverde Co., Ltd.）、CryoNovo（註冊商標）X12（Akron BioProducts LLC）、CryoNovo（註冊商標）P24（Akron BioProducts LLC）、人類ES／iPS細胞冷凍保存用無DMSO冷凍保存液（REPROCELL Inc.）、Cell Reservoir One（NACALAI TESQUE, Inc.）、ThelioKeep（註冊商標：Bioverde Co., Ltd.）、Cellvation（註冊商標：Protide Pharmaceuticals, Inc.）、ReproCryo RM（REPROCELL Inc.）、SOFORO Cryo（SARAYA公司）等。
冷凍保存液亦可包含天然之源自動物的成分，但舉例而言，就於後所述之觀點而言，以不包含天然之源自動物的成分為佳。作為天然之源自動物的成分，可列舉例如：白蛋白、血清（小牛血清、新生小牛血清、胎牛血清、馬血清等）、血漿及基礎培養基等。在不包含天然之源自動物的成分之情況下，可迴避由血清所包含之各種細胞介素、生長因子等原本於細胞保存非必需的成分所致之細胞的性質之變化或者由來源不明之基礎培養基中的成分所致之影響，在可在臨床使用中安全應用於生物這樣的觀點下實為有用。並且，如同於後所述之實施例10及11所示，發現到即使不包含白蛋白等天然之源自動物的成分，在本發明中，冷凍解凍後的細胞生存率亦良好。
冷凍保存液亦可包含pH調整劑。
作為「pH調整劑」，係指在水性溶液中將pH維持在一定範圍內的物質，係指對水性溶液帶來緩衝作用的物質。作為pH調整劑，可列舉例如：碳酸緩衝液（碳酸鈉、碳酸氫鈉）、磷酸緩衝液（磷酸、磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸三鈉、磷酸二氫鉀、磷酸三鉀）、Tris、古德氏緩衝液（Good’s buffer）（HEPES、MES、PIPES等）、檸檬酸緩衝液（檸檬酸三鈉）、醋酸緩衝液（醋酸鈉、醋酸鉀）、硼酸緩衝液（硼酸鈉、四硼酸鈉）、酒石酸（酒石酸鈉）、胺基酸的緩衝液（組胺酸、牛磺酸、天冬胺酸）等，但並不受限於此等。pH調整劑亦可包含二種以上之pH調整劑的組合。pH調整劑可用以將冷凍保存液的pH調整成例如約6.0～9.0，以6.5～8為佳。
此外，作為pH調整劑，亦可使用不包含選自由鈣元素、鎂元素、銅元素、錳元素、鋅元素、鐵元素、鉬元素、鎳元素及鈷元素而成之群組之至少一種以上者，良佳亦可使用不包含鈣元素及鎂元素者。
於冷凍保存液，除了上述物質或成分之外，為了提升細胞冷凍保存後的細胞生存率，亦可進一步包含在本業界已知的任意其他物質或成分。
冷凍保存液的凝固溫度並不受限，但亦可為−30℃～0℃、−25℃～0℃、−20℃～0℃、−20℃～−5℃或−15℃～−5℃，以−15℃～−5℃為佳。
此外，冷凍前的冷凍保存液亦可提供至耐寒性容器等容器或包裝體（包含套件）中，於容器或包裝體亦可附加或附帶有記載有冷凍保存方法等的使用說明書。
（細胞）
三維細胞培養體所包含之「細胞」只要係具有細胞彼此之連結結構的三維結構之細胞集合體的型態即可，得為可使用於移植的任意細胞。
細胞並非受限者，但舉例而言，係用以治療或預防與細胞、組織、器官的缺損及功能異常、功能不全相關的症狀之臨床上有用的細胞、在非臨床試驗等使用之能夠培養的細胞，係分離自生物的細胞，可列舉例如：生物組織細胞、具有分化成屬於間葉系組織的細胞之能力的間葉系幹細胞、具有分化成各式各樣的生物組織之能力的多潛能幹細胞、誘導分化之幹細胞或前驅細胞等。使用於細胞移植的細胞亦可為自體細胞、同種異體細胞、異種細胞。並且，作為良佳細胞，就臨床應用及安全性之觀點而言為人類自體細胞，就臨床應用及生產性之觀點而言為人類異體細胞。
作為生物組織細胞的具體例，可列舉例如：纖維母細胞、肌纖維母細胞、角膜上皮細胞、視網膜細胞、神經細胞、肌細胞、心肌細胞、肌母細胞、骨細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝臟細胞、胰臟細胞、腎臟細胞、牙齦細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、內皮細胞等。作為間葉系幹細胞的具體例，可列舉例如：源自脂肪組織的間葉系幹細胞、源自骨髓的間葉系幹細胞、源自臍帶血的間葉系幹細胞、源自臍帶的間葉系幹細胞等。作為多潛能幹細胞的具體例，可列舉例如：誘導多潛能幹細胞、胚胎幹細胞、核移植胚胎幹細胞、胚胎腫瘤細胞、胚胎生殖细胞等。並且，此等細胞可單獨培養，亦可組合二種以上來培養。針對此等細胞，只要因應於細胞的用途等由眾所周知者適當設定即可。
細胞的來源並非特別受限者，但可列舉例如：哺乳動物、鳥類、兩棲類、魚類、昆蟲、植物、微生物等。作為哺乳動物及鳥類的具體例，可列舉例如：人類、猴子、黑猩猩、牛、馬、豬、綿羊、山羊、兔子、狗、貓、天竺鼠、倉鼠、小鼠、大鼠、雞等。
（三維細胞培養體）
「三維細胞培養體」以使用於用以治療疾病或障礙或者改善其症狀之移植的三維細胞培養體為佳。受到移植的對象，以哺乳動物──例如人類及家庭用寵物（狗、貓等）──為佳，尤其以人類為佳。
「三維細胞培養體」包含細胞彼此經由接合分子或細胞外基質等物理性及／或功能性連結而具有三維結構之培養細胞的集合體作為具體例。
於「三維細胞培養體」包含有三維細胞層片、球狀體、類器官等，但並非受限於此等者。
作為三維細胞培養體的形狀，可列舉：三維層片、臟器狀、球狀、組織狀、中空狀或塊狀等，但並不受限於此等。此外，典型上如細胞層片，附著式細胞（附著於培養基材而增殖的細胞，例如纖維芽細胞）中細胞彼此會物理性及／或功能性連結而易於形成三維結構的細胞集合體，但舉例而言，在如球狀體，即使係懸浮式細胞（即懸浮於培養基中而增殖的細胞，例如造血細胞、血球），細胞彼此亦會物理性及／或功能性連結而形成三維結構的細胞集合體之情形中，符合三維細胞培養體。
三維細胞培養體的製造方法可以本發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知的方法來進行，並非特別受限者。作為三維細胞培養體的製造方法，可列舉例如：日本專利公開第2012-120696號公報、日本專利公開第2017-176025號公報、日本專利公開第2015-149905號公報等文獻所教示的方法。於在三維細胞培養體培養中之培養的細胞之密度，只要係適於培養之細胞、培養容器（例如細胞培養多孔盤）或培養細胞的用途者，即非特別受限者，但為例如5×102個細胞／cm2以上且1×109個細胞／cm2以下。作為下限值，以1×103個細胞／cm2以上為較佳，以5×103個細胞／cm2以上為更佳，以5×104個細胞／cm2以上為尤佳。另一方面，作為上限值，以1×108個細胞／cm2以下為較佳，以5×107個細胞／cm2以下為更佳，以1×107個細胞／cm2以下為尤佳。
作為可使用於三維細胞培養體的細胞培養用培養基，可使用以下者。
細胞培養用培養基並不特別受限，可適當選擇能夠培養此細胞的培養基。作為培養基，可列舉例如：AIM V培養基、HFDM-1培養基、DMEM、EMEM、α-MEM、IMDM、GMEM、Ham’s F-10培養基、Ham’s F-12培養基、Ham’s F-12K培養基、RPMI培養基1640、M-199培養基、L-15培養基、McCoy’s 5A培養基、MCDB105培養基、MCDB107培養基、MCDB131培養基、MCDB153培養基、MCDB201培養基、NCTC109培養基、NCTC135培養基、Waymouth’s MB752/1培養基、CMRL-1066培養基、Williams’培養基E、Brinster’s BMOC-3培養基、E8培養基等基礎培養基等。並且，此等基礎培養液可單獨使用，亦可組合二種以上而使用。再者，基礎培養液亦可因應細胞的種類或狀態而將培養液成分追加、去除、增量、減量。此等基礎培養液只要因應培養的細胞等由眾所周知者適當設定即可。
細胞培養用培養基所包含之物質或成分只要係適於培養的細胞者即非特別受限者，可包含例如：胺基酸、醣類、維生素類、無機鹽、抗氧化劑等。作為「胺基酸」，亦可為天然或非天然的胺基酸，可列舉例如：麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、胱胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、丙胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、脯胺酸、羥脯胺酸等。作為「醣類」，可列舉例如：葡萄糖或果糖、甘露糖、半乳糖等單醣類；蔗糖或蔗糖素、海藻糖、麥芽糖、乳糖等雙醣類；葡苷基蔗糖或乳果寡糖、棉子糖等參醣類；阿卡波糖或麥芽四糖等肆醣類；環糊精；寡醣等。作為「維生素類」，可列舉例如：L-抗壞血酸鈉、L-抗壞血酸-2-磷酸、膽鹼、葉酸、菸鹼酸、生物素、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、胸苷、維生素B12等。作為無機鹽，尤其可舉出金屬鹽，於此包含鹼金屬鹽（鈉鹽、鉀鹽等）、鹼土金屬鹽（鈣鹽、鎂鹽等）、銅、鋅、鐵等的鹽。金屬鹽亦可為二價或三價的金屬鹽。具體而言，可以鹽酸鹽、碳酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽等的金屬鹽之形式使用，可列舉：氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鈉、硫酸鎂、碳酸鎂、硝酸鐵、硫酸銅、硝酸銅、硫酸鋅等。此外，如此於在細胞培養基包含有鈣鹽及鎂鹽之情況下，冷凍保存液所包含之在上述規定的鈣鹽及鎂鹽之濃度係亦包含該培養基所包含之鈣鹽及鎂鹽的濃度。作為「抗氧化劑」，可列舉：抗壞血酸、麩胱甘肽等。作為對培養基的其他添加劑，可列舉：青黴素或鏈黴素等抗生素；膽固醇等脂質；次亞麻油酸等脂肪酸；乙醇胺或丁二胺等胺類；巰基乙醇或3-巰基-1,2-丙二醇等還原劑；藻酸鈉或聚乙烯吡咯啶酮、羧甲纖維素、聚三葡萄糖等增黏劑；酚紅等pH指示劑等。此外，此等成分亦可有別於細胞培養用培養基，以外因之形式添加。
三維細胞培養體亦可為包含基材與形成於基材上之三維結構的細胞集合體者。三維結構的細胞集合體包含細胞層片或球狀體。
作為基材，可使用於後所述之基礎或培養載體基材。
三維細胞培養體亦可為使用基礎進行三維培養者，舉例而言，附著式細胞可於具有網格結構等之基礎上接合而增殖。使用於基礎的基礎材料係可接合或支承培養之細胞，並提高細胞間相互作用而培養的材料。基礎材料只要因應培養之細胞等由眾所周知者適當設定即可，但可列舉例如：膠原、聚酯、聚異戊二烯、聚丁二烯、聚胺甲酸酯、聚脲、聚四氟乙烯、聚環氧乙烷、聚乙二醇、聚己內酯、絲蛋白、聚醚醚酮（PEEK）、聚對酞酸乙二酯（PET）、聚對酞酸丁二酯（PBT）、聚苯乙烯（PS）、聚碳酸酯（PC）、改質聚苯醚（mPPE）、聚苯硫醚（PPS）、聚碸（PSU）、聚芳酯（PAR）、液晶聚合物（LCP）、聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、耐綸66（N66）、乙烯－四氟乙烯共聚物（ETFE）、四氟乙烯－全氟烷基乙烯基醚共聚物（PFA）、丙烯腈－丁二烯－苯乙烯共聚物（ABS）、聚醚碸（PES）、聚矽氧、聚二氟亞乙烯（PVDF）、聚縮醛（POM）、聚醯亞胺（PI）、聚醯胺（PA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、絲纖維蛋白、纖維素、再生纖維素、環烯烴聚合物、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂及此等的衍生物、共聚物等。基礎材料可以單獨之材料來使用，亦可組合二種以上之材料而使用。其形狀並不特別受限，可列舉：薄膜、纖維、不織布等。為了進一步提升細胞的接合性或進展性，亦可使用與細胞親和性高的細胞外基質（ECM）。細胞外基質係存在於所有組織、臟器中之非細胞性的構成成分，主要由纖維狀蛋白質及蛋白多醣之二種高分子構成。ECM中之主要的纖維狀蛋白質係膠原、彈性蛋白、纖網蛋白、層連結蛋白。另一方面，三維細胞培養體亦可為未使用基礎（無基礎）進行三維培養者。無基礎的三維細胞培養體，舉例而言，藉由培養懸浮式細胞而獲得之無基礎的球狀體有降低由使用基礎時之異物混入所致之發炎反應及感染的風險等的益處。
「細胞層片」係細胞彼此經由接合分子或細胞外基質等來物理性及／或功能性連結而具有層片結構者。細胞層片的製造方法可以本發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知的方法來進行，並非特別受限者。作為細胞層片的製造方法，可列舉例如：國際公開第2016/068217號冊子、日本專利公開第2019-000038號公報、日本專利公開第2011-006490號公報、國際公開第2015/068505號冊子等文獻所教示的方法。細胞層片可為由1個細胞層構成的單層結構，亦可為由2個以上之細胞層（2層、3層、4層、5層等的細胞層）構成的堆疊結構。細胞層片的厚度可為了發揮細胞層片中的細胞之高的生存率及對細胞移植有利之優異的形狀維持能力而適當設定，但亦可為例如0.001 mm～2.0 mm。
（培養載體基材）
在使用細胞層片作為三維細胞培養體之情況下，以細胞層片形成於培養載體基材上為佳。藉由細胞層片形成在培養載體基材上，可減低由培養容器或冷凍保存容器取出細胞層片時破裂的可能性，可輕易取出。培養載體基材係一種基材，其用於用以培養細胞以形成細胞層片的細胞層片基礎材及搬運經培養之細胞層片的細胞層片支撐體之兩者，於細胞層片貼附至被移植部後自細胞層片剝離。培養載體基材的面積並非特別受限者，但期望小於培養容器且與細胞層片相同或大於細胞層片，為例如0.3 cm2～1000 cm2以下。並且，培養載體基材的厚度以5 μm～250 μm以下為佳。培養載體基材的培養面為了提升細胞密合性，以施有例如利用UV臭氧處理、電漿處理等之親水化處理為佳。可使用與可使用在基礎材之材料相同的材料作為構成培養載體基材的材料。尤其，以聚醚醚酮（PEEK）、聚對酞酸乙二酯（PET）、聚對酞酸丁二酯（PBT）為佳。此外，使用於細胞層片的培養前之培養載體基材可做成包裝於包裝材料的包裝體。
附有細胞層片之培養載體基材的製造方法之一例，舉例而言，亦可包含：培養工序，於培養容器的內部（例如細胞培養多孔盤的各孔）導入多個細胞、培養基（培養液）及培養載體基材，在培養載體基材上培養細胞層片；以及取出工序，自培養液取出附有細胞層片的培養載體基材。細胞層片自附有細胞層片的培養載體基材剝離後，可使用於細胞移植療法等治療、預防等。
「球狀體」一般而言係指成為細胞彼此凝集的塊體（典型為球狀的形狀）者或細胞之單純的群集（集合體）。球狀體典型上係數千個細胞凝集而組織化成球形者，三維培養體相較於二維細胞培養，可持續長時間維持高的功能顯現。球狀體亦可由例如1000個以上、10000個以上或10000個以上之細胞所構成，並且，球狀體的製作及培養可使用眾所周知的方法來進行，可舉出例如：Scientific Reports 6(1):31063,「Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells」,DOI:10.1038/srep31063所教示的方法。球狀體以透過維持在生物內的形狀就此立體增殖的三維培養來培養為佳。
「類器官」係指擁有作為臟器之功能的細胞之集合體。實際之臟器由於難以持續供應營養故無法培養，但類器官由較實際之臟器還小型且單純故能夠培養。舉例而言，類器官可將人類臟器幹細胞繼代，或者可使臟器幹細胞分化而獲得由臟器特有的多種細胞而成之中空狀的結構。此外，作為類器官與球狀體的差異，相對於球狀體典型上係將單純之種類的細胞進行典型為三維培養的塊體，細胞塞滿中心部分，類器官典型上係為了具有作為臟器之特定的功能而係由多個細胞構成之更加複雜的組織，採取中空的結構。類器官的製作及培養可使用眾所周知的方法來進行，可舉出例如：Stem Cells Internatinal, Volume 2021, Article ID:9929461,「Development of a Human Intestinal Organoid Model for In Vitro Studies on Gut Inflammation and Fibrosis」,doi:10.1155/2021/9929461所教示的方法。
以下說明三維細胞培養體的自冷凍至解凍的工序。
（冷凍準備工序）
三維細胞培養體可藉由將成形為三維層片、球狀、中空狀等期望之三維形狀的移植用細胞以包含上述培養液的培養基培養來獲得（舉例而言，參照在上述示例之細胞層片、球狀體、類器官的製造相關之眾所周知的文獻）。並且，準備上述冷凍保存液。隨後，細胞培養後進行於包含三維細胞培養體的培養容器添加冷凍保存液等，使三維細胞培養體配置或浸漬於冷凍保存液中，或者將三維細胞培養體與冷凍保存液以任意形式置於接觸狀態。在以如細胞層片般接合至培養容器的狀態培養細胞之情況下，亦可以接合至培養容器的狀態於培養容器加入冷凍保存液而無須將培養之細胞自培養容器剝離。或者，為了於解凍後做成細胞層片等三維細胞培養體易於自培養容器剝離，亦可將三維細胞培養體暫時自培養容器剝離，再將剝離之三維細胞培養體靜置於培養容器。作為剝離的方法，亦可使用使用胰蛋白酶等之酵素處理或直接使用鑷子等物理性的手法。
作為使培養細胞配置或浸漬於冷凍保存液中的方法，可舉出將培養容器內的培養液置換成冷凍保存液以使培養細胞配置或浸漬於冷凍保存液的方法。上述將培養容器內的培養液置換成冷凍保存液的方法並非特別受限者，可使用眾所周知的手段。作為置換方法的具體例，可列舉：若培養細胞成為期望之狀態則使用移液管自培養容器除去培養液將冷凍保存液加入至培養容器的方法、自培養容器除去培養液之一部分添加冷凍保存液的方法或對培養容器的培養液添加冷凍保存液的方法等。並且，亦可準備與使用於三維細胞培養體之培養的培養容器相異的培養容器，將培養之三維細胞培養體剝離移至另一培養容器，在此另一培養容器使三維細胞培養體浸漬於冷凍保存液。
（冷凍工序）
冷凍工序係與冷凍保存液同時將三維細胞培養體冷凍的工序，藉由將配置或浸漬於凝固溫度以上之冷凍保存液中的三維細胞培養體或者與冷凍保存液以任意形式置於接觸狀態的三維細胞培養體置於未達冷凍保存液之凝固溫度的環境下來施以冷凍處理，藉此使三維細胞培養體及冷凍保存液一同冷凍。藉此，可獲得三維細胞培養體的冷凍物。
冷凍處理方法並非特別受限者，可使用眾所周知的冷凍處理方法，但可舉出例如：將處於凝固溫度以上之環境下的包含冷凍保存液及三維細胞培養體的培養容器急速冷卻至冷凍處理溫度的方法等。
冷凍處理的溫度係未達冷凍保存液之凝固溫度的任意溫度，只要可將培養細胞及冷凍保存液冷凍，即非特別受限者。舉例而言，冷凍處理溫度之下限值亦可選自−220℃以上、−196℃以上、−180℃以上、−165℃以上或−150℃以上。另一方面，冷凍處理溫度之上限值亦可選自−120℃以下、−100℃以下、−80℃以下、−50℃以下、−30℃以下、−25℃以下或−20℃以下，舉例而言，冷凍處理溫度為−196℃～−25℃。
冷凍處理的方法並非特別受限者，可使用眾所周知的冷凍處理方法。可舉出例如：與冷卻劑之液相或者氣相的接觸或冷卻裝置的使用等。作為使用於冷凍處理的冷卻劑，可列舉例如：液態氮、液態乙烷、液態丙烷、液態氦、乾冰等。使用於冷凍處理的冷卻裝置並非特別受限者，可列舉例如：急速冷凍裝置、極低溫冷藏裝置等。此外，作為冷卻裝置，相較於使導熱手段接觸培養容器來使培養容器及細胞冷凍的冷卻裝置，與導熱手段為非接觸且由多向而非單向──以全向為佳──對培養容器噴吹冷氣來冷凍的冷凍裝置就以均勻的溫度將細胞冷凍以提高解凍後之細胞的生存率之觀點而言為佳。並且，冷凍處理後的保存時間可因應用途來適當選擇，但為例如30分鐘、1小時以上、2小時以上、3小時以上、4小時以上、5小時以上、10小時以上、20小時以上、1天以上，5天以上、10天以上、1個月以上、6個月以上、1年以上或5年以上。此外，與冷凍保存液同時冷凍的三維細胞培養體可以包含此等的容器或包裝體的型態來儲存及搬運。
（冷凍解凍工序）
冷凍解凍方法並非特別受限者，可使用眾所周知的解凍方法之手段。
作為冷凍解凍的方法，除了使放入了包含三維細胞培養體及冷凍保存液之冷凍物的容器單純靜置於冷凍保存液之凝固點以上的環境之外，亦可使用例如：水浴、培養器、加熱板等。
解凍溫度或相接於解凍時之冷凍物的環境溫度只要係冷凍保存液的凝固溫度以上之溫度且45℃以下，即非特別受限者。在解凍溫度高於45℃之情況下，由於有於細胞產生熱傷害之可能性，故不樂見。解凍溫度在細胞保存液的凝結溫度以上這樣的條件下，解凍溫度之上限值亦可選自45℃、40℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃或25℃，解凍溫度之下限值亦可選自0℃、5℃、10℃、15℃或20℃，或者解凍溫度在細胞保存液的凝結溫度以上這樣的條件下為0～45℃之範圍（包含此等值所包含之每1℃之任意值），以10～35℃或15～30℃為較佳，以15～25℃或20～25℃為更佳。
在本發明之冷凍解凍工序中，包含將經解凍之三維細胞培養體與經解凍之冷凍保存液置於接觸狀態一事。典型上包含將於經解凍之液體狀態的冷凍保存液中配置或浸漬有經解凍之三維細胞培養體之狀態持續維持指定之時間的工序。
如此，將三維細胞培養體與冷凍保存液置於接觸狀態的優點，係因下述之故：如同於後所述之實施例所示般，與除了包含特定濃度的鈣鹽（及在追加包含鎂鹽之情況下為特定濃度的鎂鹽）以外以相同條件冷凍保存之情形相比，可獲得由利用台盼藍染色的細胞生存率之量測而來的細胞生存率之顯著或大幅的改善。於此種冷凍保存後獲得的細胞生存率係可充分用於臨床使用之實用化之程度者，係在以往技術中未能夠達成者。並且，在以往的冷凍保存技術中，在如冷凍保存液包含DMSO等對細胞為毒性的成分之情形中，以於解凍後提早去除冷凍保存液為普遍，但本發明人等反其道而行，於解凍後反而維持接觸狀態，結果意外發現即使經過一定時間後細胞生存率亦會顯著改善這樣的優異之效果，因此，亦有即使在如包含如DMSO之對細胞為毒性的成分之情形亦可使用，於解凍後亦無須進行去除冷凍保存液之處理這樣的優點。作為更進一步之優點，在以往之冷凍保存技術中，冷凍解凍後的細胞生存率低，有必要於冷凍解凍後培養使細胞增殖，但由於在本發明中，於冷凍解凍後可獲得高的細胞生存率，故於解凍後亦無須進行培養（惟並非排除於解凍後進行培養的意圖）。作為更進一步之優點，在本發明中，可使用眾所周知的簡便之冷凍處理或解凍處理，亦無須使用複雜的冷凍處理或解凍處理，故處理工序可簡化，亦可減低成本。
此外，亦如同於後所述之實施例所示，伴隨如自「起算點」（冷凍之冷凍保存液經解凍而完全成為液體狀態的時點）60分鐘後等時間經過，細胞解凍後的細胞生存率會上升一事可設想係下述者：在剛解凍後實際上並未死亡而在台盼藍染色中計算為（看上去）死亡的細胞伴隨時間經過，細胞透過某種作用機制以在台盼藍染色中之復活之狀態之形式計算作為新的活細胞。另一方面，若考慮如在以往技術中通常可見，於在保存液中放入有細胞毒性物質之情況下，伴隨時間結果細胞生存率會下降，則在本發明中，可想見下述情事作為一個原因：藉由特定濃度之鈣鹽（及以任意選擇特定濃度之鎂鹽）的添加，透過某種作用機制，細胞會更加妥善受到保護而細胞生存率會上升，而在上述特定濃度以外之情形會因某種事由而此種細胞保護的作用機制變得不會發揮功能或功能變弱，惟本發明並非束縛於此種理論者。
將解凍之細胞培養體與解凍之冷凍保存液置於接觸狀態的時間可適當選擇，亦可為例如：自經冷凍的冷凍保存液經解凍而完全成為液體狀態的時點（「起算點」）至少0.5分鐘、1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時或其以上等。並且，置於接觸狀態的時間，舉例而言，在利用台盼藍染色之細胞生存率的量測中，亦可使之接觸直到細胞生存率變得更高。
此外，於解凍後使之接觸後，亦可將三維細胞培養體自培養器等取出以培養基等清洗。
在本發明中，冷凍解凍後之三維細胞培養體中的細胞生存率於起算時及／或自起算時經過一定時間後（例如經過30分鐘、60分鐘、120分鐘、180分鐘或240分鐘後）以35%以上或40%以上為佳，以45%以上、50%以上或55%以上為較佳，以60%以上、65%以上或70%以上為更佳，以75%以上或80%以上為尤佳。
此外，「細胞生存率」可以眾所周知的方法來評價，但舉例而言，可以台盼藍來染色並使用血球計算盤來計算活細胞和死細胞，評價細胞生存率，在本發明中使用「使用以台盼藍染色」的細胞評價方法。在此情形中，定義為細胞生存率＝活細胞的數量／（活細胞的數量+死細胞的數量）×100%。更具體而言，如同於後所述之實施例所記載。
藉由將三維細胞培養體浸泡於本發明之液體狀的冷凍保存液，可獲得解凍後之細胞生存率或代謝活性率經改善的移植用三維細胞培養體。
於此，浸泡於本發明之溶液之情形的「代謝活性率」定義為將三維細胞培養體的代謝活性C1除以代謝活性C0的值（C1／C0），所述C1係藉由將三維細胞培養體浸泡於本發明之溶液而獲得，所述C0係藉由將移植用三維培養體浸泡於對照之溶液（係不包含本發明之溶液相關規定之上述指定濃度之鈣鹽及鎂鹽的溶液；不包含指定濃度之鈣鹽及鎂鹽的對照之溶液的典型例可舉出未添加指定之金屬鹽之市售的冷凍保存液）而獲得。
在本說明書中，具體而言，使用係為活細胞數量量測試藥的四唑鎓鹽WST-8（Cell Count Reagent SF，NACALAI TESQUE, Inc.製，產品編號07553-44）來量測代謝活性。此係以細胞內還原酵素活性為指標的細胞數量量測法，利用在電子載體的存在下還原時，會生成高水溶性之橘色的甲䐶染料一事。相對於對照的溶液使用本發明之溶液之情形的「代謝活性率」成為判斷「細胞生存率」（定義為活細胞數量相對於基準值（在本說明書係謂C0）之比）是否受到改善的指標一事為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解。
作為「代謝活性」的量測之具體程序，將上述移植用三維培養體進行浸泡於本發明之溶液的工序後，首先，將本發明之溶液去除，隨後，加入含2%血清培養基，在37℃、5%CO2的環境下進行再培養24小時。再培養結束後，將活細胞數量量測試藥WST-8以含2%血清培養基稀釋20倍（試藥／培養基＝1／19體積比），製作試驗溶液。隨後，於放入有三維細胞培養體的容器中添加一定量之上述試驗溶液，在37℃、5%CO2的環境下培養1小時。培養後，於細胞培養多孔盤添加試驗溶液的上清液，隨後，以盤分析儀量測此上清液，透過以下式求出代謝活性：代謝活性C＝〔量測試樣的吸光度（450 nm）−量測試樣的吸光度（630 nm）〕−〔空白的吸光度（450 nm）−空白的吸光度（630 nm）］。此外，空白使用試驗溶液。在於後所述之實施例中，皆使用上述量測方法。
並且，「代謝活性」亦可以ATP assay來評價，所述ATP assay利用由螢火蟲螢光素酶所致之發光反應來量測源自活細胞的ATP。
如同以上，在本發明中，利用上述冷凍工序及冷凍解凍工序，可獲得冷凍解凍後之細胞生存率經改善的三維細胞培養體。因此，在本發明之一態樣中，可提供一種三維細胞培養體，其係與冷凍保存液同時冷凍的三維細胞培養體，其中冷凍保存液以冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽（及在進一步包含鎂鹽之情況下包含1 ppm以上之鎂鹽）。
再者，在本發明之一態樣中，可提供一種三維細胞培養體，其係使三維細胞培養體與冷凍保存液同時冷凍後，於在冷凍解凍時將三維細胞培養體與全部或一部分為液體狀態的冷凍保存液置於接觸狀態後的三維細胞培養體，其中冷凍保存液以冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽（及在進一步包含鎂鹽之情況下包含1 ppm以上之鎂鹽）。於此態樣，如同上述，除了將於冷凍解凍時全部為液體狀態的冷凍保存液與三維細胞培養體置於接觸狀態的三維細胞培養體之外，亦包含有於冷凍解凍時將一部分為液體狀態的冷凍保存液與三維細胞培養體置於接觸狀態的三維細胞培養體（亦即，即使係冷凍保存液的冰未完全融化的狀態，冰之一部分融化成為液體狀態的冷凍保存液亦正與經解凍之三維細胞培養體接觸之情況的三維細胞培養體）。
並且，利用上述冷凍工序及冷凍解凍工序，在本發明之一態樣中，使用以冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣離子（及在進一步包含鎂鹽之情況下包含1 ppm以上之鎂鹽）的冷凍保存液，使冷凍保存液中的三維細胞培養體在未達冷凍保存液的凝固溫度下冷凍，藉此可製造上述之經冷凍的三維細胞培養體。因此，在本發明之一態樣中，可提供一種方法，其係用以製造經冷凍的三維細胞培養體之方法，包含使冷凍保存液中之三維細胞培養體在未達冷凍保存液之凝固溫度下冷凍的工序，其中冷凍保存液以冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣離子（及在進一步包含鎂鹽之情況下包含1 ppm以上之鎂鹽）。
再者，利用上述冷凍工序及冷凍解凍工序，使用以冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣離子（及在進一步包含鎂鹽之情況下包含1 ppm以上之鎂鹽）的冷凍保存液，使三維細胞培養體與冷凍保存液同時冷凍，隨後，將經冷凍解凍的三維細胞培養體與經冷凍解凍的冷凍保存液置於接觸狀態，藉此可獲得上述之本發明之經冷凍解凍的三維細胞培養體。因此，在本發明之一態樣中，可提供一種方法，其包含：使用以冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣離子（及在進一步包含鎂鹽之情況下包含1 ppm以上之鎂鹽）的冷凍保存液並使冷凍保存液中的三維細胞培養體在未達冷凍保存液之凝固溫度下冷凍的工序，以及將經冷凍的三維細胞培養體及冷凍保存液在冷凍保存液之凝固溫度以上冷凍解凍並將經冷凍解凍的三維細胞培養體與經冷凍解凍的冷凍保存液置於接觸狀態的工序。
再者，與上述冷凍保存液同時冷凍的三維細胞培養體或者上述之經冷凍解凍的三維細胞培養體及經冷凍解凍的冷凍保存液（或經解凍的冷凍保存液中之三維細胞培養體）亦可提供於耐寒性容器、培養容器（例如細胞培養多孔盤）等容器或包裝體中。於「包裝體」包含有可收納上述三維細胞培養體及冷凍保存液的任意包裝體，亦可包含有套件等。並且，於容器或包裝體亦可附加或附帶有記載有冷凍保存方法等的使用說明書。因此，在本發明之一態樣中，可提供一種容器或包裝體，其係包含經冷凍解凍的三維細胞培養體與經冷凍解凍的冷凍保存液之容器或包裝體，經冷凍解凍的三維細胞培養體與經冷凍解凍的冷凍保存液置於接觸狀態，冷凍保存液以冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣離子（及在進一步包含鎂鹽之情況下包含1 ppm以上之鎂鹽）。
再者，在本發明之一態樣中，可提供一種改善經冷凍解凍的三維細胞培養體中之細胞的生存率之方法，其包含上述冷凍工序及冷凍解凍工序。於此，所謂細胞生存率的改善，係指相較於除了冷凍保存液以冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣離子（及在進一步包含鎂鹽之情況下包含特定濃度之鎂鹽）以外以相同條件獲得之經冷凍解凍的三維細胞培養體中之細胞的生存率受到改善。
再者，在本發明之一態樣中，可提供一種用以保護經冷凍的三維細胞培養體中之細胞免於隨冷凍而生之細胞損傷的方法，其包含上述冷凍工序及冷凍解凍工序。所謂隨冷凍而生之細胞損傷，係指由冷凍時之冷凍保存液的冰晶形成所致之細胞損傷等隨冷凍而生之任意細胞損傷，亦包含由使用於細胞冷凍保存之有毒性的冷凍保存液所致之細胞損傷。
以上，已描述本發明之實施方式，但此等係本發明之示例，可採用上述以外之各式各樣的構成。並且，本發明並非受限於於上所述之實施方式者，在可達成本發明之目的之範圍的變形、改良等為本發明所包含。
以下附註參考型態之例。
［實施方式1］一種前述移植用三維細胞培養體，其係經冷凍的移植用三維細胞培養體，其中前述經冷凍的移植用三維細胞培養體與冷凍保存液同時冷凍，前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽。
［實施方式2］一種前述移植用三維細胞培養體，其係經冷凍解凍的移植用三維細胞培養體，其中前述經冷凍解凍的移植用三維細胞培養體係使移植用三維細胞培養體與冷凍保存液同時冷凍後，於在冷凍解凍時將前述移植用三維細胞培養體與全部或一部分為液體狀態之前述冷凍保存液置於接觸狀態後之移植用三維細胞培養體，前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽。
［實施方式3］如實施方式1或2所記載之三維細胞培養體，其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含5～300 ppm之鈣鹽。
［實施方式4］如實施方式1或2所記載之三維細胞培養體，其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含7～100 ppm之鈣鹽。
［實施方式5］如實施方式1～4之任一項所記載之三維細胞培養體，其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準進一步包含1 ppm以上之鎂鹽。
［實施方式6］如實施方式1～4之任一項所記載之三維細胞培養體，其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準進一步包含2～100 ppm之鎂鹽。
［實施方式7］如實施方式1～4之任一項所記載之三維細胞培養體，其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準進一步包含2～20 ppm之鎂鹽。
［實施方式8］如實施方式1～7之任一項所記載之三維細胞培養體，其中前述冷凍保存液包含冷凍保護劑。
［實施方式9］如實施方式8所記載之三維細胞培養體，其中前述冷凍保護劑包含DMSO、丙三醇、丙二醇、乙二醇及此等的組合。
［實施方式10］如實施方式1～9之任一項所記載之三維細胞培養體，其中前述三維細胞培養體係細胞層片、球狀體、類器官或此等的組合。
［實施方式11］如實施方式10所記載之三維細胞培養體，其中前述細胞層片位於基礎或培養載體基材。
［實施方式12］如實施方式1～11之任一項所記載之三維細胞培養體，其中前述三維細胞培養體中之細胞係源自哺乳動物的細胞。
［實施方式13］如實施方式12所記載之三維細胞培養體，其中前述源自哺乳動物的細胞選自由生物組織細胞、間葉系幹細胞及多潛能幹細胞而成之群組之至少1者。
［實施方式14］如請求項13所記載之三維細胞培養體，其中前述生物組織細胞係纖維芽細胞。
［實施方式15］如實施方式1～14之任一項所記載之三維細胞培養體，其中經冷凍解凍後的前述三維細胞培養體或前述經冷凍解凍的三維細胞培養體中之細胞的生存率為35%以上。
［實施方式16］如實施方式1～14之任一項所記載之三維細胞培養體，其中經冷凍解凍後的前述三維細胞培養體或前述經冷凍解凍的三維細胞培養體中之細胞的生存率50%以上。
［實施方式17］如實施方式1～14之任一項所記載之三維細胞培養體，其中經冷凍解凍後的前述三維細胞培養體或前述經冷凍解凍的三維細胞培養體中之細胞的生存率60%以上。
［實施方式18］如實施方式1～17之任一項所記載之三維細胞培養體，其中將經冷凍的前述三維細胞培養體及經冷凍的前述冷凍保存液在0～45℃下解凍。
［實施方式19］如實施方式1～18之任一項所記載之三維細胞培養體，其中於冷凍解凍後未進行培養。
［實施方式20］一種容器或包裝體，其係包含經冷凍解凍的移植用三維細胞培養體與經冷凍解凍的冷凍保存液的容器或包裝體，其中前述移植用三維細胞培養體與前述冷凍保存液置於接觸狀態，前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽。
［實施方式21］如實施方式20所記載之容器或包裝體，其中以前述冷凍保存液的總重量為基準包含5～300 ppm之鈣鹽。
［實施方式22］如實施方式20所記載之容器或包裝體，其中以前述冷凍保存液的總重量為基準包含7～100 ppm之鈣鹽。
［實施方式23］如實施方式20～22之任一項所記載之容器或包裝體，其中以前述冷凍保存液的總重量為基準進一步包含1 ppm以上之鎂鹽。
［實施方式24］一種冷凍保存液，其係用於移植用三維細胞培養體之冷凍保存的冷凍保存液，其中以前述冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽。
［實施方式25］如實施方式24所記載之冷凍保存液，其中以前述冷凍保存液的總重量為基準包含5～300 ppm之鈣鹽。
［實施方式26］如實施方式24所記載之冷凍保存液，其中以前述冷凍保存液的總重量為基準包含7～100 ppm之鈣鹽。
［實施方式27］如實施方式24～26之任一項所記載之冷凍保存液，其中以前述冷凍保存液的總重量為基準進一步包含1 ppm以上之鎂鹽。
［實施方式28］一種方法，其係用以製造經冷凍之移植用三維細胞培養體的方法，其包含使冷凍保存液中之移植用三維細胞培養體在未達前述冷凍保存液之凝固溫度下冷凍的工序，前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽。
［實施方式29］一種方法，其係用以製造經冷凍解凍的移植用三維細胞培養體的方法，包含：使冷凍保存液中之移植用三維細胞培養體在未達前述冷凍保存液之凝固溫度下冷凍的工序，以及將經冷凍的前述移植用三維細胞培養體及前述冷凍保存液在前述冷凍保存液之凝固溫度以上冷凍解凍並將經冷凍解凍的前述移植用三維細胞培養體與經冷凍解凍的前述冷凍保存液置於接觸狀態的工序；其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽。
［實施方式30］一種方法，其係改善經冷凍解凍的移植用三維細胞培養體中之細胞的生存率之方法，包含：使冷凍保存液中之移植用三維細胞培養體在未達前述冷凍保存液之凝固溫度下冷凍的工序，以及將經冷凍的前述移植用三維細胞培養體及經冷凍的前述冷凍保存液在前述冷凍保存液之凝固溫度以上冷凍解凍並將經冷凍解凍的前述移植用三維細胞培養體與經冷凍解凍的前述冷凍保存液置於接觸狀態的工序；其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽，前述細胞的生存率相較於除了前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽以外以相同條件獲得之經冷凍解凍的移植用三維細胞培養體中之細胞的生存率受到改善。
［實施方式31］一種方法，其係用以保護經冷凍的移植用三維細胞培養體中之細胞免於隨冷凍而生之細胞損傷的方法，包含：使冷凍保存液中之移植用三維細胞培養體在未達前述冷凍保存液之凝固溫度下冷凍的工序，以及將經冷凍的前述移植用三維細胞培養體及前述冷凍保存液在前述冷凍保存液之凝固溫度以上冷凍解凍並將經冷凍解凍的前述移植用三維細胞培養體與經冷凍解凍的前述冷凍保存液置於接觸狀態的工序；其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含3.5～500 ppm之鈣鹽。
［實施方式32］如實施方式28～31之任一項所記載之方法，其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含5～300 ppm之鈣鹽。
［實施方式33］如實施方式28～31之任一項所記載之方法，其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準包含7～100 ppm之鈣鹽。
［實施方式34］如實施方式28～31之任一項所記載之方法，其中前述冷凍保存液以前述冷凍保存液的總重量為基準進一步包含1 ppm以上之鎂鹽。
［實施方式35］如實施方式28～34之任一項所記載之方法，其使前述冷凍保存液中之前述移植用三維細胞培養體在−196℃～−25℃下冷凍。
『實施例』
以下參照實施例詳細說明本發明，但本發明並非受此等實施例之記載任何限定者。
〔在冷凍融解後之細胞層片之細胞生存率的評價〕
［實施例1］
〈培養載體基材的製造〉
對PEEK薄膜（信越聚合物公司製，聚醚醚酮薄膜，Shin-Etsu Sepla Film（註冊商標），低結晶型，12 μm厚度）的培養面（表面）實施電漿處理。之後，將所獲得之表面處理完的薄膜裁切成⌀14.0 mm尺寸，獲得圓盤狀的培養載體基材。
〈細胞層片的製造〉
將以上述〈培養載體基材的製造〉所記載之方式製造的培養載體基材按70%乙醇、磷酸緩衝液、培養基之順序清洗後，分別設置於在細胞培養多孔盤（24孔）中之各孔的平底。此時，以培養載體基材的培養面朝向孔盤的開口之方式──亦即，以培養載體基材的背面與細胞培養多孔盤之各孔的平底接觸之方式──配置。
將經冷凍保存的人類纖維芽細胞（源自人類口腔內組織）在37℃下解凍，並使用培養基清洗。將5×105個細胞懸浮於含5%血清培養基，於2張衛生紙（60.1 cm2）各接種2.5×105個後，培養3天。將培養之細胞回收，懸浮於含5%血清培養基，於10個燒瓶（培養面積150 cm2）各接種2.5×105個進行繼代後，培養4天。
將培養之細胞回收，懸浮於含2%血清培養基，於設置完培養載體基材之細胞培養多孔盤中的各孔以27.9×104個／cm2之接種密度接種，在37℃、5%CO2的環境下培養1天，於培養載體基材的培養面上製作細胞層片。
〈冷凍保存液的製備〉
使用電子天平（Balance XS104，11106012，梅特勒–托利多公司製）分別秤量CaCl2．2H2O（031-25035，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）及MgSO4（137-12335，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製），添加至市售的冷凍保存液A（BAMBANKER（註冊商標）hRM，GC LYMPHOTEC INC.製，含有含10 w／v%DMSO（冷凍保護劑）水溶液及源自人類之白蛋白1重量%）1 L，製備冷凍保存液。此時，以製備後之冷凍保存液中所包含之鈣鹽及鎂鹽的含量分別以「以鈣離子及鎂離子換算之濃度」之形式成為下述表1所示之Ca2+濃度、Mg2+濃度之方式變更CaCl2．2H2O及MgSO4的添加量。
〈細胞層片的冷凍〉
上述〈細胞層片的製造〉之後，將細胞培養多孔盤設置於冰上，並將附有培養載體基材的細胞層片以磷酸緩衝液清洗後，以表1所示之冷凍保存液成為0.22 mL／孔之方式添加，在各孔中使細胞層片浸漬於冷凍保存液中。
之後，將以夾鏈袋包裝細胞培養多孔盤的包裝體放入冷卻至−35℃的非貫流方式之冷卻裝置（3D Freezer（註冊商標），KSS-40BLW-2400V，KOGASUN公司製），維持30分鐘。此外，在0～−5℃中之冷卻速度為3.4℃／分鐘。
之後，將經冷卻處理的包裝體迅速放入−150℃的冷凍庫（冷凍超低溫槽CLN-17000WE，NIHON FREEZER CO., LTD.製），維持24小時。
藉由以上內容，製造出包含經冷凍的細胞層片之三維細胞培養體的冷凍物。
〈細胞層片的解凍〉
上述冷凍期間之後，將包裝體自−150℃的冷凍庫取出，使位於其中的細胞培養多孔盤在室溫（20～25℃）下靜置而解凍。
將以目視確認到經冷凍的冷凍保存液全部成為液體狀態（亦即，冷凍保存液的冰完全消失）的時點定為「起算點」（0分鐘），自起算點至60分鐘後，使細胞層片靜置於經解凍的冷凍保存液中，藉此將細胞層片與冷凍保存液置於接觸狀態。
此外，溫度的量測於細胞培養多孔盤之未使用的孔僅放入冷凍保存液，於此冷凍保存液設置熱電偶來量測溫度，將此量測到之溫度視為與放入有細胞層片及冷凍保存液的孔中之冷凍保存液的溫度相同。
隨後，存在於在解凍後之細胞層片中之細胞的生存率依循以下〈細胞生存率的量測〉所示之程序來量測。
〈細胞生存率的量測〉
以磷酸緩衝液清洗在〈細胞層片的解凍〉獲得之解凍後的細胞層片，以r-TE（1210，細胞科學研究所公司製）處理3分鐘，並進行吸排液，藉此分散成單一細胞。於所獲得之單一細胞懸浮液加入s-TI（1220，細胞科學研究所公司製）後，以台盼藍染色，使用血球計算盤計算活細胞及死細胞，評價細胞生存率（%）。
［實施例2～9及比較例1～2］
實施例2～9及比較例1～2，除了在上述〈冷凍保存液的製備〉中將冷凍保存溶液中所包含之鈣鹽及鎂鹽之各者變更成表1所示之Ca2+濃度及Mg2+濃度以外，比照實施例1操作，實施〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉。
對於各實施例及各比較例，針對解凍後之細胞生存率如同上述〈細胞生存率的量測〉進行評價。結果揭示於表1。
『表1』
冷凍保存液 解凍後的細胞生存率(%)
Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 起算點 (0分鐘) 自起算點 +60分鐘
實施例1 70 1.3 54 63
實施例2 70 19 59 79
實施例3 10 3.1 55 79
實施例4 3.6 1.3 44 55
實施例5 7.6 1.3 59 68
實施例6 13 1.3 60 72
實施例7 50 1.3 67 74
實施例8 100 1.3 70 71
實施例9 300 1.3 60 35
比較例1 3.0 1.3 2 23
比較例2 700 189 30 7
如表1所示，在實施例1～8中，比較作為比較例1及2的結果，在起算點及自起算點60分鐘後之二者上，除了可獲得非常良好之細胞生存率的改善（亦即，在此等實施例中，在起算點上細胞生存率為44～70%，並且，在自起算點60分鐘後細胞生存率為55～74%）之外，亦意外發現到自起算點60分鐘時之細胞生存率較起算點時之細胞生存率還上升。
並且，若要更詳細描述，則舉例而言，如同由實施例4及比較例1的結果之比較可知（在此等實施例中鎂鹽濃度相同），使保存液中之Ca2+濃度自3 ppm增加至3.6 ppm，藉此細胞生存率由2%顯著提升至55%一事實屬令人意外且驚訝。
並且，在實施例9中，與實施例1～8相同，在起算點上可獲得高的細胞生存率（60%），另一方面，於自起算點60分鐘時細胞生存率減少，但依然具有較在比較例1及2中量測到之細胞生存率還高的細胞生存率。
再者，在實施例2中，除了上述起算點及自起算點60分鐘後之細胞生存率的量測之外，亦量測了自起算點30分鐘後、180分鐘後及240分鐘後的細胞生存率。結果如同以下表2。
舉例而言，在表2的「自起算點+240分鐘」中，自起算點至240分鐘後，在〈細胞層片的解凍〉中，使細胞層片靜置於經解凍的冷凍保存液中，藉此將細胞層片與冷凍保存液置於接觸狀態後，實施〈細胞生存率的量測〉。
並且，在表2的「冷凍1天前」中，於實施〈細胞層片的冷凍〉之1天前，對在〈細胞層片的製造〉獲得之細胞層片實施〈細胞生存率的量測〉。
『表2』
量測時 細胞生存率(%)
實施例2 冷凍1天前 87
起算點(0分鐘) 59
自起算點+30分鐘 72
自起算點+60分鐘 77
自起算點+180分鐘 84
自起算點+240分鐘 79
比較例1 起算點(0分鐘) 2
自起算點+60分鐘 23
自起算點+180分鐘 11
自起算點+240分鐘 9
如同上述表2的結果所示，發現到自起算點至180分鐘時，細胞生存率會上升，再者，自起算點至240分鐘後亦依然維持高的細胞生存率。
再來，在比較例1中，亦比照實施例2操作，進一步量測自起算點經過180分鐘及240分鐘後的細胞生存率。結果揭示於表2。
如表2所示，在比較例1中，自起算時60分鐘時之細胞生存率在自起算時180分鐘及240分鐘後顯著減少。
另一方面，在實施例2中，發現到自起算點至180分鐘～240分鐘時亦依然維持高的細胞生存率，發現到可持續更長時間維持高的細胞生存率。
［實施例10～11］
實施例10～11，除了使用市售的冷凍保存液B（STEM-CELLBANKER（註冊商標）EX GMP等級（11936，日本全藥工業公司製），含10 w／v%DMSO（冷凍保護劑）水溶液，不含源自人類之白蛋白）代替冷凍保存液A，在上述〈冷凍保存液的製備〉中，將冷凍保存溶液中所包含之鈣鹽及鎂鹽之各者變更成表3所示之Ca2+濃度及Mg2+濃度以外，比照實施例1操作，如〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉所記載來實施。
［比較例3～4］
比較例3～4，除了將在上述〈冷凍保存液的製備〉中之冷凍保存液中之Ca2+濃度及Mg2+濃度變更成表3所示之值以外，比照實施例10操作，如〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉所記載來實施。
［實施例12～13］
實施例12～13，除了使用市售的冷凍保存液C（iStock（385-19451，GC LYMPHOTEC INC.製），含11 w／v%DMSO（冷凍保護劑）水溶液）代替冷凍保存液A，在上述〈冷凍保存液的製備〉中，將冷凍保存溶液中所包含之鈣鹽及鎂鹽之各者變更成表4所示之Ca2+濃度及Mg2+濃度以外，比照實施例1操作，如〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉所記載來實施。
［比較例5～6］
比較例5～6，除了將在上述〈冷凍保存液的製備〉中之冷凍溶液中之Ca2+濃度及Mg2+濃度變更成表4所示之值以外，比照實施例12操作，如〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉所記載來實施。
對於實施例10～13及比較例3～6之解凍後的細胞生存率，如〈細胞生存率的量測〉所記載操作進行評價。各自的結果揭示於表3及4。
『表3』
冷凍保存液 解凍後的細胞生存率(%)
Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 起算點 (0分鐘) 自起算點 +60分鐘
實施例10 7.1 1.9 54 62
實施例11 70 19 41 51
比較例3 ＜1 ＜1 3 1
比較例4 699 189 14 3
『表4』
冷凍保存液 解凍後的細胞生存率(%)
Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 起算點 (0分鐘) 自起算點 +60分鐘
實施例12 8.4 1.9 47 66
實施例13 70 19 49 66
比較例5 1.4 ＜1 4 27
比較例6 699 189 11 22
由上述表3及4所示之實施例10～13的結果，發現到即使將使用之冷凍保存液A變更成B或C，藉由將冷凍保存液中之鈣鹽做成表3、4中所記載之濃度，解凍後的細胞生存率亦會上升。
並且，如同實施例10及11所示，發現到即使冷凍保存液不含白蛋白於解凍後亦可獲得高的細胞生存率。
［實施例14～35］
實施例14～35，除了在上述〈冷凍保存液的製備〉中，以冷凍保存液中之X2+濃度成為表5所示之值之方式添加選自鎂鹽（MgSO4，137-12335，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）、銅鹽（CuSO4．5H2O，031-044115，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）、錳鹽（MnSO4．5H2O，1139-0082，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）、鋅鹽（ZnSO4．7H2O，268-00405，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）、鐵鹽（FeSO4．7H2O，098-01085，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）、鉬鹽（(NH4)6Mo7O24．4H2O，010-06905，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）、鎳鹽（NiCl2．6H2O，147-01042，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）及鈷鹽（CoCl2．6H2O，036-03682，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）之二價金屬鹽以外，比照實施例7操作，如〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉所記載來實施。
製備後之冷凍保存液中所包含之二價金屬鹽的含量在將使用之二價金屬鹽所包含之金屬元素定為X時，定為以X之二價金屬離子換算的濃度。
對於實施例14～35之解凍後的細胞生存率，如〈細胞生存率的量測〉所記載操作進行評價。各自的結果揭示於表5。
『表5』
冷凍保存液 解凍後的細胞生存率(%)
Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 金屬X X2+濃度 (ppm) 自起算點 +60分鐘
實施例14 50 1.3 Cu 0.05 79
實施例15 50 1.3 0.2 80
實施例16 50 1.3 0.5 76
實施例17 50 1.3 Mn 0.05 85
實施例18 50 1.3 0.2 84
實施例19 50 1.3 0.5 82
實施例20 50 1.3 Zn 0.05 91
實施例21 50 1.3 0.2 83
實施例22 50 1.3 0.5 81
實施例23 50 1.3 Fe 0.05 86
實施例24 50 1.3 0.2 81
實施例25 50 1.3 0.5 84
實施例26 50 1.3 5 76
實施例27 50 1.3 Mo 0.05 80
實施例28 50 1.3 0.2 82
實施例29 50 1.3 0.5 76
實施例30 50 1.3 Ni 0.05 86
實施例31 50 1.3 0.2 88
實施例32 50 1.3 0.5 85
實施例33 50 1.3 Co 0.05 82
實施例34 50 1.3 0.2 83
實施例35 50 1.3 0.5 81
〔在冷凍融解後之細胞層片之代謝活性率的評價〕
［實施例36～40］
實施例36～40，除了在上述〈冷凍保存液的製備〉中，藉由進一步添加MgSO4，將冷凍保存溶液中所包含之鎂鹽變更成表6所示之Mg2+濃度以外，比照比較例1操作，如〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉所記載來實施。
〈代謝活性的量測（WST-8 assay）〉
在比較例1及實施例36～40中，自包含透過〈細胞層片的解凍〉獲得之細胞層片的細胞培養多孔盤將冷凍保存液去除，隨後，加入含2%血清培養基，在37℃、5%CO2之環境下進行再培養24小時。
再培養結束後，將活細胞數量量測試藥WST-8以含2%血清培養基稀釋20倍（試藥／培養基＝1／19體積比）製作試驗溶液。
隨後，於包含細胞層片的細胞培養多孔盤中添加一定量的上述試驗溶液，在37℃、5%CO2之環境下培養1小時。
在培養後，於另一細胞培養多孔盤（MS-8096R、Sumitomo Bakelite Co., Ltd.製）添加試驗溶液的上清液100 μL，隨後，以盤分析儀量測此上清液，透過以下式求出代謝活性。
代謝活性C＝〔量測試樣的吸光度（450 nm）−量測試樣的吸光度（630 nm）］−〔空白的吸光度（450 nm）−空白的吸光度（630 nm）］。
此外，空白使用試驗溶液。
〈代謝活性率的計算〉
在實施例36～40中，在〈細胞層片的解凍〉中，使用下述細胞層片遵循上述〈代謝活性的量測〉來量測代謝活性C1，所述細胞層片使用表6所示之冷凍保存液，自起算點至60分鐘，使細胞層片靜置於冷凍保存液中，藉此與冷凍保存液置於接觸狀態。
將比較例1的代謝活性C0比照上述實施例操作遵循上述〈代謝活性的量測〉來量測。
使用量測到之代謝活性C1及C0，依據式「C1／C0」計算在各實施例中之代謝活性率。結果揭示於表6。
『表6』
冷凍保存液 代謝活性率
Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 自起算點 +60分鐘
實施例36 3.0 10 1.69
實施例37 3.0 19 1.90
實施例38 3.0 38 1.95
實施例39 3.0 95 1.85
實施例40 3.0 190 1.80
［實施例41～44］
實施例41～44，除了在上述〈冷凍保存液的製備〉中，以冷凍保存液中之X2+濃度成為表7所示之值之方式進一步添加選自銅鹽（CuSO4．5H2O，031-044115，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）、錳鹽（MnSO4．5H2O，1139-0082，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）、鐵鹽（FeSO4．7H2O，098-01085，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）及鎳鹽（NiCl2．6H2O，147-01042，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）之表7中之二價金屬鹽以外，比照比較例1操作，如〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉所記載來實施。
在實施例41～44中，比照上述〈代謝活性率的計算〉操作，計算代謝活性率（%）。結果揭示於表7。
『表7』
冷凍保存液 代謝活性率
Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 金屬X X2+濃度 (ppm) 自起算點 +60分鐘
實施例41 3.0 1.3 Cu 5 1.01
實施例42 3.0 1.3 Mn 5 1.80
實施例43 3.0 1.3 Fe 5 1.51
實施例44 3.0 1.3 Ni 5 1.39
［實施例45、47］
實施例45，除了在上述〈冷凍保存液的製備〉中，添加Ca(NO3)2．4H2O（039-00735，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）代替CaCl2．2H2O作為鈣鹽以外，比照比較例1操作，實施例47，除了在上述〈冷凍保存液的製備〉中，添加MgCl2．6H2O（135-00165，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）代替MgSO4作為鎂鹽以外，比照比較例1操作，如〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉所記載來實施。
在實施例45、47中，比照上述〈代謝活性率的計算〉操作，計算代謝活性率（%）。結果揭示於表8。
『表8』
冷凍保存液 代謝活性率
添加金屬鹽 Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 自起算點 +60分鐘
實施例45 Ca(NO3)2．4H2O 50 1.3 1.29
實施例47 MgCl2．6H2O 3.0 19 1.85
［實施例48～54］
實施例48～54，除了在上述〈冷凍保存液的製備〉中，以冷凍保存液中之X2+濃度成為表9所示之值之方式進一步添加選自錳鹽（MnSO4．5H2O，1139-0082，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）、鋅鹽（ZnSO4．7H2O，268-00405，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）及鎳鹽（NiCl2．6H2O，147-01042，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）的二價金屬鹽以外，比照比較例1操作，如〈培養載體基材的製造〉、〈細胞層片的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈細胞層片的冷凍〉及〈細胞層片的解凍〉所記載來實施。
在實施例48～54中，比照上述〈代謝活性率〉操作，計算代謝活性率（%）。結果揭示於表9。
『表9』
冷凍保存液 代謝活性率
Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 金屬X X2+濃度 (ppm) 自起算點 +60分鐘
實施例48 50 1.3 Mn 0.05 1.47
實施例49 50 1.3 0.2 1.49
實施例50 50 1.3 0.5 1.51
實施例51 50 1.3 Zn 0.05 1.40
實施例52 50 1.3 Ni 0.2 1.42
實施例53 50 1.3 0.5 1.60
實施例54 50 1.3 5 1.44
［實施例1～3、比較例1～2］
對於實施例1～3及比較例1～2，比照上述〈代謝活性率的計算〉操作，計算代謝活性率（%）。結果揭示於表10。
『表10』
冷凍保存液 代謝活性率
Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 自起算點 +60分鐘
實施例1 70 1.3 1.83
實施例2 70 19 1.94
實施例3 10 3.1 1.75
比較例1 3.0 1.3 1.00
比較例2 700 189 0.02
〔在冷凍融解後之球狀體之代謝活性率的評價〕
［實施例55］
〈球狀體的製造〉
將經冷凍保存的人類纖維芽細胞（源自人類口腔內組織）在37℃下解凍，使用培養基清洗。將5×105個細胞懸浮於含5%血清培養基，於2張衛生紙（60.1 cm2）各接種2.5×105個後，培養3天。將培養之細胞回收，懸浮於含5%血清培養基，於10個燒瓶（培養面積150 cm2）各接種2.5×105個進行繼代後，培養4天。
將培養之細胞回收，懸浮於含2%血清培養基，以1000個／孔／0.15mL接種於細胞培養多孔盤（MS-9096U，Sumitomo Bakelite Co., Ltd.製，U底）中之各孔，在37℃、5%CO2之環境下培養2天，於孔內的U底上製作球狀體（細胞凝集塊）。
〈冷凍保存液的製備〉
透過電子天平（Balance XS104，11106012，梅特勒-托利多公司製），分別秤量CaCl2．2H2O（031-25035，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製）及MgSO4（137-12335，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation製），添加至市售的冷凍保存液A（BAMBANKER（註冊商標）hRM，GC LYMPHOTEC INC.製，含有含10 w／v%DMSO（冷凍保護劑）水溶液及源自人類之白蛋白1重量%）1 L，以添加後之冷凍保存液中之鈣鹽（Ca2+）濃度及鎂鹽（Mg2+）濃度成為下述表11所示之濃度之方式製備。
〈球狀體的冷凍〉
於上述〈球狀體的製造〉之後，將細胞培養多孔盤中的球狀體加入至1.5 mL試管（131-7155CS-N，WATSON公司製）。以磷酸緩衝液清洗球狀體後，以成為0.2 mL／試管之方式添加在〈冷凍保存液的製備〉製備的冷凍保存液，在各試管中，使球狀體浸漬於冷凍保存液中。
之後，將放入有球狀體的試管放入包裝體（AFB-25，AS ONE CORPORATION製）中，放入冷卻至−35℃的非貫流方式之冷卻裝置（3D Freezer（註冊商標），KSS-40BLW-2400V，KOGASUN公司製），維持30分鐘。此外，在0～−5℃中之冷卻速度為3.4℃／分鐘。
之後，將經冷卻處理的包裝體迅速放入−150℃之冷凍庫（冷凍超低溫槽CLN-17000WE，NIHON FREEZER CO., LTD.製），維持24小時。
〈球狀體的解凍〉
上述冷凍期間之後，將包裝體自−150℃之冷凍庫取出，使位於其中的1.5 mL試管在室溫（20～25℃）下靜置而解凍。
將以目視確認到經冷凍的冷凍保存液全部成為液體狀態（亦即，保存液的冰完全消失）的時點定為「起算點」（0分鐘），自起算點至90分鐘後，使細胞層片靜置於經解凍的冷凍保存液中，藉此將細胞層片與冷凍保存液置於接觸狀態。此外，溫度的量測，於1.5 mL試管僅放入冷凍保存液，於此冷凍保存液設置熱電偶來量測溫度，將此量測到之溫度視為與放入有球狀體及冷凍保存液的孔中之冷凍保存液的溫度相同。
於解凍後，於1.5 mL試管加入含2%血清培養基1 mL。之後，吸引上清液，再次加入含2%血清培養基1 mL。分離取出試管內之上清液與球狀體0.15 mL，加入至細胞培養多孔盤（MS-8048R，Sumitomo Bakelite Co., Ltd.製）。每1孔加入4個球狀體，在37℃、5%CO2之環境下培養2天。關於細胞生存率，由於球狀體無法剝離成單一細胞，故無法量測。
〈代謝活性的量測（ATP assay）〉
球狀體的代謝活性使用ATP試藥（『塊體的』ATP量測試藥Ver.2.1，東洋B-Net公司製，KA2.1-100）及盤分析儀（iMark，Bio-Rad Laboratories, Inc製）來量測。ATP試藥使用以培養基稀釋10倍（試藥／培養基＝1／9體積比）者作為試驗溶液。
於在上述〈球狀體的解凍〉解凍之1.5 mL試管加入含2%血清培養基1 mL。之後，吸引上清液，再次加入含2%血清培養基1 mL。分離取出試管內之上清液與球狀體0.15 mL，加入至細胞培養多孔盤（MS-8048R，Sumitomo Bakelite Co., Ltd.製）。每1孔加入4個球狀體，在37℃、5%CO2之環境下培養2天。培養後，將0.09 mL之上清液與4個球狀體加入至發光量測盤（MS-8096W，Sumitomo Bakelite Co., Ltd.製）。於此孔加入試驗溶液0.01 mL／孔。之後，於振動1分鐘、靜置9分鐘後，將發光量測盤設置於盤分析儀量測發光量。代謝活性的計算如同以下。空白使用試驗溶液。量測時的累積時間定為1000 ms。代謝活性［RLU］＝（量測試樣的發光量−空白的發光量）／4
［比較例7］
比較例7除了在上述〈冷凍保存液的製備〉中，將保存溶液中之Ca2+濃度及Mg2+濃度變更成表11所示之值以外，比照實施例55操作，如〈球狀體的製造〉、〈冷凍保存液的製備〉、〈球狀體的冷凍〉及〈球狀體的解凍〉所記載來實施。
對於各實施例及各比較例，針對解凍後之比較例7的代謝活性C0及實施例55的代謝活性C1如同上述〈代謝活性的量測（ATP assay）〉進行評價。針對代謝活性率，使用量測到之代謝活性C1及C0，依據式「C1／C0」來計算。結果揭示於表11。
『表11』
冷凍保存液 代謝活性率
Ca2+濃度 (ppm) Mg2+濃度 (ppm) 自起算點 +60分鐘
實施例55 35.4 19.3 12.60
比較例7 3 1.3 1.00
如表11所示，在實施例55中，相較於比較例7的結果，在起算點及自起算點90分鐘後，可獲得非常良好之代謝活性率的改善。
如同以上，發現到藉由使冷凍保存液包含特定濃度的鈣鹽及鎂鹽，相較於不包含此等鹽之情形，不僅如細胞層片之2維上有廣度的細胞結構體，即使係如球狀體之立體的細胞結構體，解凍後的代謝活性率亦良好，且可持續長時間維持高的代謝活性。
此申請案主張以於2024年3月1日申請之日本專利申請第2024-031022號為基礎案的優先權，將其所揭露之所有內容援引於此。
無
無
無。

Claims (18)

  1. 一種三維細胞培養體的冷凍物，其係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保存液包含鈣鹽及水，前述鈣鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下。
  2. 一種三維細胞培養體的冷凍物，其係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保存液包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
  3. 如請求項1所述之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保存液包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
  4. 如請求項1或2所述之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保存液包含冷凍保護劑。
  5. 如請求項4所述之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述冷凍保護劑包含選自由DMSO、丙三醇、丙二醇及乙二醇而成之群組之一種或二種以上。
  6. 如請求項1或2所述之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述三維細胞培養體包含細胞層片或球狀體。
  7. 如請求項6所述之三維細胞培養體的冷凍物，其中前述三維細胞培養體包含基材與接合至前述基材上的前述細胞層片。
  8. 如請求項1或2所述之三維細胞培養體的冷凍物，其中在將該冷凍物解凍後之前述三維細胞培養體所包含之細胞的生存率為35%以上。
  9. 一種容器，其包含如請求項1或2所述之三維細胞培養體的冷凍物。
  10. 一種細胞冷凍套件，其係包含具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體與冷凍保存液之細胞冷凍套件，其中前述冷凍保存液係滿足下述（i）及（ii）之至少一項者：（i）包含鈣鹽及水，前述鈣鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下；（ii）包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
  11. 一種冷凍保存液，其係用以將具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體冷凍的冷凍保存液，其中該冷凍保存液係滿足下述（i）及（ii）之至少一項者：（i）包含鈣鹽及水，前述鈣鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下；（ii）包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
  12. 一種冷凍物的製造方法，其係包含使具有細胞彼此之連結結構的三維細胞培養體在冷凍保存液中冷凍之冷凍工序的三維細胞培養體之冷凍物的製造方法，其中前述冷凍保存液係滿足下述（i）及（ii）之至少一項者：（i）包含鈣鹽及水，前述鈣鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鈣離子換算計為3.5 ppm以上且500 ppm以下；（ii）包含選自由鎂鹽、銅鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、鉬鹽、鎳鹽及鈷鹽而成之群組之一種或二種以上的二價金屬鹽及水，在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽之情況下，前述鎂鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以鎂離子換算計為2 ppm以上且300 ppm以下及／或在前述冷凍保存液包含前述鎂鹽以外之前述二價金屬鹽之情況下，此前述二價金屬鹽的含量以前述冷凍保存液的總重量為基準，以金屬離子換算計為0.01 ppm以上且100 ppm以下。
  13. 如請求項12所述之冷凍物的製造方法，其中前述冷凍工序使前述三維細胞培養體在未達前述冷凍保存液的凝固溫度下冷凍。
  14. 一種三維細胞培養體之解凍物的製造方法，其包含解凍工序，將在如請求項12所述之冷凍物的製造方法中獲得之三維細胞培養體的冷凍物解凍。
  15. 如請求項14所述之三維細胞培養體之解凍物的製造方法，其中前述解凍工序維持在將前述三維細胞培養體的至少一部分接觸至液體狀態之前述冷凍保存液的狀態。
  16. 一種冷凍物的使用方法，其係如請求項1或2所述之三維細胞培養體之冷凍物的使用方法，其中在將前述冷凍物解凍時，維持在將前述三維細胞培養體的至少一部分接觸至液體狀態之前述冷凍保存液的狀態。
  17. 一種冷凍保存液的使用方法，其係如請求項11所述之冷凍保存液的使用方法，包含藉由維持使前述冷凍保存液接觸至在冷凍及解凍時之前述三維細胞培養體之至少一部分的狀態，改善前述三維細胞培養體之中的細胞之生存率的工序。
  18. 一種冷凍保存液的使用方法，其係如請求項11所述之冷凍保存液的使用方法，包含藉由維持使前述冷凍保存液接觸至在冷凍及解凍時之前述三維細胞培養體之至少一部分的狀態，保護前述三維細胞培養體之中之細胞免於隨冷凍而生之細胞損傷的工序。
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