TW202602931A

TW202602931A - 生產分子之方法

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Publication number: TW202602931A
Application number: TW114110739A
Authority: TW
Inventors: 倪爾斯包爾; 馬可博特格; 奧利佛帕普
Original assignee: 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date: 2024-03-22
Filing date: 2025-03-21
Publication date: 2026-01-16
Also published as: WO2025196259A1

Abstract

所揭露者為生產多肽之方法，該多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基，該方法包含將包含用於表現該多肽的核酸的細胞培養在具有小於 60 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中持續大部分之培養週期。

Description

生產分子之方法

本揭露涉及分子生物學及重組多肽生產技術之領域。

治療性醫藥通常顯示出微異質性，需要詳細表徵以判定其對藥功效、安全性的影響，並確立分析控制策略以維持一致之產品品質 (世界衛生組織：針對人類用單株抗體之安全生產及品質控制的 WHO 指南)。特定而言，從培養物中的細胞進行的多肽表現包含因轉譯後修飾 (諸如 N 型及 O 型醣基化、半胱胺酸修飾、半乳醣基化、羰基化、氧化、醣化、天冬胺酸異構化及 C 端離胺酸變異) 而導致之酶促性的及非生物性的化學驅動製程誘致的微異質性 (Geist等人，MAbs (2013) 5(1):150-161；Luo等人Biotechnol Bioeng. (2012) 109(9):2306-2315；Raju等人，MAbs (2012) 4(3):385-391；Gramer等人，Adv Biochem Eng Biot.(2014) 139:123-166)。

離胺酸為生物學中化學反應性最強之胺基酸中之一者，且特化細胞酶會確保離胺酸修飾之空間及時間調整 (Abbasov等人Nat Chem. (2021) 13(11):1081-1092)。離胺酸羥基化為羥基離胺酸 (HyL) 係眾所周知的對內源性蛋白質的分子修飾，且通常係重要下游調整事件及結構組織化所必需的 (Markolovic等人，Nat Chem Biol. (2018) 14(7):688-695；Zurlo等人，Biochim Biophys Acta.(2016) 1866(2):208-220；Cockman等人，Proc Natl Acad Sci U S A. (2022) 119(32):e2201483119)。

在經重組表現之組織纖維蛋白溶酶原活化劑 (rtPA)、可溶性及嵌合 CD4 受體變異體、海芋螺之 De13a 毒素、生長抑素中以及在 IgG1 mAb 中業已鑑定出離胺酸羥基化修飾 (Molony等人，Tech Prot Chem. (1995) 6:91-98；Aguilar等人，Biochemistry.(2005) 44(33):11130-11136；Andrews等人，J Biol Chem. (1984) 259(24):5021-5024；Xie等人，MAbs. (2016) 8(2): 371-378)。重組 IgG1 mAb 中的羥基化業已藉由 +16 Da 質量偏移鑑定，且係與包含 Xaa-Lys-Gly (XKG；SEQ ID NO:2) 共同模體之離胺酸之羥基化的其他蛋白質相當的 (Xie等人，MAbs.(2016) 8(2): 371-378)。

蛋白質中 HyL 之存在會改變蛋白質的化學物理性質，因為額外之羥基基團可能影響疏水性及電荷的局部變化，以及充當針對後續修飾 (如醣基化) 的可及活性基團(回顧於例如de Giorgi等人，Biochem Soc Trans.(2021) 49(2):855-866)。此等改變有可能在生物系統中充當傳訊調節物，且可能在治療性蛋白質之技術開發及生產中誘致不良複雜性。此外，由於 HyL 殘基用於膠原蛋白中的交聯，因此經修飾之治療性蛋白質之 HyL 之意外聚集及/或新表位形成可能會例如藉由調節標靶蛋白結合功效且可能調節受體個體的免疫原性而影響蛋白質之穩定性及功能性。此外，HyL 可以被離胺醯基氧化酶靶向以藉由氧化去胺、氨及強氧化劑 H₂O₂形成羥基離胺酸，或者用作針對下游 O-醣基化事件的模體 (Abbasov等人Nat Chem. (2021) 13(11):1081-1092)。

WO 2023/232961 A1 描述了一種經由遺傳修飾來降低從培養物中的細胞表現的多肽中 HyL 之水平以防止具有離胺醯基羥化酶活性的 PLOD 酶的表現之方法。所屬技術領域中仍需要控製經表現之多肽中離胺酸殘基的羥基化之技術。

在第一態樣中，本揭露提供一種生產的多肽之方法，該多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基，其中該方法包含將包含用於表現該多肽的核酸的細胞培養在具有小於 60 µM (例如小於 45 µM，例如小於 30 µM，例如小於 15 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之培養週期。

在一些實施例中，該方法包含將該等細胞接種於包含小於 60 µM (例如小於 45 µM，例如小於 30 µM，例如小於 15 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中。

在一些實施例中，該方法包含將包含用於表現該多肽的核酸的細胞培養在包含小於 45 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之該培養週期。在一些實施例中，該方法包含將包含用於表現該多肽的核酸的細胞培養在包含小於 30 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之該培養週期。在一些實施例中，該方法包含將包含用於表現該多肽的核酸的細胞培養在包含小於 15 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之該培養週期。在一些實施例中，該方法包含將包含用於表現該多肽的核酸的細胞培養在包含小於 10 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之該培養週期。

在一些實施例中，該方法包含將該等細胞接種於包含小於 45 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中。在一些實施例中，該方法包含將該等細胞接種於包含小於 30 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中。在一些實施例中，該方法包含將該等細胞接種於包含小於 15 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中。在一些實施例中，該方法包含將該等細胞接種於包含小於 10 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中。

在一些實施例中，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列，且包括易發生羥基化的離胺酸殘基的該胺基酸序列包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列。

在一些實施例中，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列，且該多肽包含選自 SEQ ID NO:5、7、9 及 11 的胺基酸序列。

在一些實施例中，該多肽包含 crossFab 部分之 VL-CH1 區。

在一些實施例中，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列，且該多肽包含選自 SEQ ID NO:106、107 及 108 的胺基酸序列。

在一些實施例中，該多肽為多特異性抗原結合分子之組成多肽。

本申請案主張 2024 年 3 月 22 日提交之 EP24165466.4 之優先權，其內容及要素出於所有目的藉由引用併入本文。

離胺酸羥基化

本揭露之態樣及實施例涉及多肽之生產，該多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列包括易發生羥基化的離胺酸殘基。

離胺酸羥基化為羥基離胺酸 (HyL) 為細胞外基質之形成中的重要步驟。膠原蛋白及膠原蛋白原之羥基離胺酸藉由 O-醣基化來對該等膠原蛋白及膠原蛋白原之交聯進行供給 (參見例如Pornprasertsuk等人，J Bone Miner Res. (2004) 19(8):1349-1355 以及 Schegg等人，Mol Cell Biol. (2009) 29(4):943-952)。離胺酸羥基化係在內質網中由膠原蛋白原-離胺酸 2-側氧戊二酸 5-二氧酶 (PLOD) 催化。

在人類中，三種基因——PLOD1、PLOD2及PLOD3——編碼蛋白質離胺醯基羥化酶，該等蛋白質離胺醯基羥化酶催化膠原蛋白原及膠原蛋白樣蛋白質中的 5R-羥基離胺酸形成 (由離胺酸)。對於 PLOD2，存在兩種剪接變異體；LH2a (PLOD2A) 及 LH2b (PLOD2B)，兩者不同之處在於 LH2b 含有小外顯子 13A (Valtavaara等人J Biol Chem. (1997) 272(11):6831-6834)。PLOD 基因產物及剪接變異體之多樣性表明 (病理) 生理過程中有不同之調整層，但尚未完全瞭解該等調整層之作用 (Qi等人，Front Cell Dev Biol. (2018) 6:66)。例如，在哺乳動物系統中，包含 PLOD1 以及脯胺酸羥化酶 P3H3 及 P3H4 的多蛋白複合物負責膠原蛋白纖維之準確組裝及交聯所必需的膠原蛋白原 α 鏈中 C5 離胺醯基殘基及 C4 脯胺醯基殘基的羥基化。

PLOD 1 至 3 (EC 1.14.11.4) 為 2-側氧戊二酸 (2OG) 二氧酶酶類 (EC 1.14.11.-) 之成員。具有離胺醯基羥化酶活性的此類之其他成員包括含有 Jumonji 域 (JmjC) 的酶 JMJD4、JMJD6 (EC 1.14.11.4) 及 JMJD7 (EC 1.14.11.63)。PLOD1、PLOD2 及 PLOD3 催化離胺酸修飾為 5R-羥基-L-離胺酸。JMJD4 催化離胺酸修飾為 4RS-羥基-L-離胺酸，而 JMJD6 催化離胺酸修飾為 5S-羥基-L-離胺酸，且 JMJD7 催化離胺酸修飾為 3S-羥基-L-離胺酸。

PLOD1、PLOD2、PLOD3、JMJD4、JMJD6 及 JMJD7 全部皆需要 Fe²⁺作為輔因子。在順序結合機制中，2OG 首先與受質結合，且之後與氧結合，且活性高價鐵中間體係由 2OG 之氧化去羧形成。高價鐵中間體然後與受質反應，引起羥基化。

根據本揭露之離胺酸羥基化為經酶催化之離胺酸羥基化，其由需要 Fe²⁺作為輔因子的酶催化。在一些實施例中，離胺酸羥基化係由 2-側氧戊二酸 (2OG) 二氧酶 (亦即EC 1.14.11.- 之酶) 催化。

在一些實施例中，離胺酸羥基化係由 PLOD (例如PLOD1、PLOD2 或 PLOD3)、JMJD4、JMJD6 或 JMJD7 催化。在一些實施例中，離胺酸羥基化係離胺酸羥基化為 5R-羥基-L-離胺酸、4RS-羥基-L-離胺酸、5S-羥基-L-離胺酸或 3S-羥基-L-離胺酸。

在一些實施例中，離胺酸羥基化係由例如選自 PLOD1、PLOD2、及 PLOD3 的 PLOD 催化。在一些實施例中，離胺酸羥基化係離胺酸羥基化為 5R-羥基-L-離胺酸。

脯胺酸羥基化

本揭露之態樣及實施例涉及具有胺基酸序列的多肽，該等胺基酸序列包含易發生羥基化的脯胺酸殘基。

羥基脯胺酸為膠原蛋白之主要成分；羥基脯胺酸羥基基團參與氫鍵之形成，且因此對膠原蛋白的結構完整性有貢獻。脯胺酸轉移後修飾為羥基脯胺酸係在內質網中由脯胺醯基羥化酶催化。脯胺醯基羥化酶包括膠原蛋白原-脯胺酸 4-二氧酶 (P3H4；EC 1.14.11.2) 及膠原蛋白原-脯胺酸 3-二氧酶 (P3H3；EC 1.14.11.7)。脯胺醯基羥化酶為 2-側氧戊二酸 (2OG) 二氧酶酶類 (EC 1.14.11.-) 之成員，且需要 Fe²⁺作為輔因子。膠原蛋白原-脯胺酸 4-二氧酶催化脯胺酸修飾為 (2S,4R)-4-羥基脯胺酸，且膠原蛋白原-脯胺酸 3-二氧酶催化脯胺酸修飾為 (2S,3S)-3-羥基脯胺酸。

根據本揭露之脯胺酸羥基化係經酶催化之脯胺酸羥基化，其由需要 Fe²⁺作為輔因子的酶催化。在一些實施例中，脯胺酸羥基化係由 2-側氧戊二酸 (2OG) 二氧酶 (亦即EC 1.14.11.- 之酶) 催化。

在一些實施例中，脯胺酸羥基化係由膠原蛋白原-脯胺酸 4-二氧酶、膠原蛋白原-脯胺酸 3-二氧酶或脯胺酸 3-羥化酶催化。在一些實施例中，脯胺酸羥基化係脯胺酸羥基化為反式-4-羥基脯胺酸、反式-3-羥基脯胺酸或順式-3-羥基脯胺酸。在一些實施例中，脯胺酸羥基化係由膠原蛋白原-脯胺酸 4-二氧酶催化。在一些實施例中，脯胺酸羥基化係脯胺酸羥基化為反式-4-羥基脯胺酸。

多肽及多肽複合物

如上文所解釋，本揭露之態樣及實施例涉及多肽之生產，該等多肽包含：包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列，及/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。

如本文所使用，「肽」係指藉由肽鍵連接的兩個或更多個胺基酸單體的鏈。肽通常具有約 2 個至約 50 個胺基酸之區域內的長度。「多肽」包含多於一個肽鍵，且包含 3 個或更多個胺基酸。

根據本揭露之多肽可以為包含下列的任何多肽：包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列 (例如，如上文所描述)，及/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列 (例如，如上文所描述)。

本揭露之態樣及實施例涉及具有胺基酸序列的多肽，該等胺基酸序列包含易發生羥基化的離胺酸殘基。

離胺酸的經酶催化之羥基化需要三維蛋白質結構，容許酶接近離胺酸殘基。Xie等人，MAbs.(2016) 8(2): 371-378 報道了 SEQ ID NO:2 作為用於離胺酸的經離胺醯基羥化酶催化之羥基化製 5-羥基離胺酸的共同序列，且亦描述位於 SEQ ID NO:16 之位置 24 處的離胺酸之羥基化，該位置位於從培養物中的中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞生產的 IgG1 抗體之 CH1 域的起點處。

通常含有羥基離胺酸 (HyL) 殘基的蛋白質包括膠原蛋白及含有膠原蛋白樣域的蛋白質。Molony等人，Tech Prot Chem. (1995) 6:91-98 報道了重組人纖維蛋白溶酶原活化劑之高達 20% 中在 SEQ ID NO:12 之位置 2 處的離胺酸之羥基化，以及在從培養物中的細胞生產的重組抗體 CD4/rCD4IgG 之高達 10% 中在 SEQ ID NO:13 之位置 11 處的離胺酸之羥基化。Aguilar等人，Biochemistry.(2005) 44(33):11130-11136 報道了在 De13a (海芋螺毒素) 之高達 100% 中，在 SEQ ID NO:14 之位置 18 及 25 處的離胺酸被羥基化。Andrews等人，J Biol Chem. (1984) 259(24):5021-5024 報道了在生長抑素-28 (來自鮟鱇魚的肽激素) 之高達 40% 中，在 SEQ ID NO:15 之位置 24 處的離胺酸被羥基化。

本揭露之實驗實例亦觀測到在依 Fab-Fc(KiH)-crossFab-Fab 形式提供的三種不同雙特異性抗體之下列位置及多肽處的離胺酸殘基之羥基化：SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:18 之位置 13 (SEQ ID NO:24 之位置 12)，在 Fab 部分之輕鏈之 VH 區內；SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:23 之位置 14，在 Fab 及 crossFab 部分之輕鏈之 κCL 區內；SEQ ID NO:20 之位置 10，在 crossFab 部分之重鏈之 CH1 域內；SEQ ID NO:26 之位置 21，在 crossFab 部分之重鏈之 CH1 域內；SEQ ID NO:21 之位置 21，在 Fab 部分之重鏈之 CH1 域內；SEQ ID NO:22 之位置 2，在 crossFab 部分之輕鏈之 κCL 區內；SEQ ID NO:25 之位置 10，在 TCB2 (亦即本文中的 T 細胞雙特異性抗體 2) 之重鏈「臼」多肽上的 Fab 部分之 VH 區內。

在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO：1。在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO：2。在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO：3。在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO：4。在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO：5。

在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列包含選自下列的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 及 SEQ ID NO:26。在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列包含選自下列的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173 及 SEQ ID NO:174。在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO：9。在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO：11。

脯胺酸的經酶催化之羥基化需要三維蛋白質結構，容許酶接近脯胺酸殘基。用於脯胺酸的經膠原蛋白原-脯胺酸 4-二氧酶催化的羥基化製反式-4-羥基脯胺酸的共同序列示出於 SEQ ID NO：27 中。通常含有羥基脯胺酸殘基的蛋白質包括膠原蛋白及含有膠原蛋白樣域的蛋白質、C1q 複合物之組成多肽、乙醯膽鹼酯酶、凝集素 (collectin)、彈性蛋白、PrP、Argonaute 2 及芋螺毒素 (參見例如Gorres 及 Raines, Crit Rev Biochem Mol Biol. (2010) 45(2): 106-124)。

在一些實施例中，包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO：27。

具有通常知識者能夠鑑定包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列以及包含此等序列的多肽。例如，包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列可以為從科學文獻已知包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列。具有通常知識者亦能夠經由如 Hu等人，PLoS One. (2010) 5(12): e15917 所描述的胺基酸序列之在電腦中分析或使用以下來鑑定包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列以及包含此等序列的多肽：用於鑑定/預測羥基離胺酸/羥基脯胺酸位點的工具，諸如 HydLoc (描述於例如Huang等人，Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems (2020) 202: 104035 中)、iHyd-PseAAC (描述於例如Xu等人，Int. J. Mol. Sci. (2014) 15(5), 7594-7610 中) 或 OH-PRED (描述於例如Jia等人，J Biomol Struct Dyn.(2017) 35(4):829-835)。

具有通常知識者亦能夠經由經驗性地判定重組地表現於離胺醯基羥化酶及/或脯胺醯基羥化酶細胞中的多肽中羥基離胺酸/羥基脯胺酸之存在來鑑定包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列以及包含此等序列的多肽。

例如，指定胺基酸序列是否包括易發生羥基化的離胺酸殘基可以藉由以下來評估：在容許離胺酸羥基化的條件下在表現離胺醯基羥化酶的細胞中表現包含該胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的多肽，且隨後分析經表現之多肽以判定其是否含有羥基離胺酸。在經表現之多肽經判定為含有羥基離胺酸的情況下，胺基酸序列經判定為包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列。類似地，指定胺基酸序列是否包括易發生羥基化的脯胺酸殘基可以藉由以下來評估：在容許脯胺酸羥基化的條件下在表現脯胺醯基羥化酶的細胞中表現包含該胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的多肽，且隨後分析經表現之多肽以判定其是否含有羥基脯胺酸。在經表現之多肽經判定為含有羥基脯胺酸的情況下，胺基酸序列經判定為包含包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。

指定多肽可以藉由從編碼多肽的 DNA 進行轉錄且隨後轉譯經轉錄之 RNA 來表現。隨後可以在分析前分離/純化經表現之多肽以判定其是否包含羥基離胺酸/羥基脯胺酸。判定經表現之多肽包含羥基離胺酸/羥基脯胺酸的評估可以包含藉由液相層析與串聯質譜法 (LC-MS/MS) 進行分析。此種分析容許鑑定多肽之胺基酸序列內的特定位置處的羥基離胺酸/羥基脯胺酸。

舉例而言，可以分析指定多肽以判定其是否包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列，基本上如本文中的實例 1 所描述。

在一些實施例中，包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列或者包含此種序列的多肽可以藉由以下來鑑定：在電腦中分析以鑑定/預測羥基離胺酸/羥基脯胺酸位點，且藉由經驗性評估進行隨後之確認。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為多肽複合物之組成多肽。在一些實施例中，本揭露之方法為生產多肽複合物之方法，其中該多肽複合物包含根據本揭露之多肽。此等方法可以包含在適合於表現多肽以及適合於締合多肽以形成多肽複合物的條件下培養包含編碼多肽複合物之組成多肽的核酸的細胞，該多肽複合物包含根據本揭露之多肽。「多肽複合物」之特徵在於其組成多肽之間的蛋白質:蛋白質交互作用。在一些實施例中，蛋白質:蛋白質交互作用包括非共價交互作用，例如靜電交互作用 (例如，離子鍵結、氫鍵結) 及/或凡得瓦 (Van der Waals) 力。在一些實施例中，蛋白質:蛋白質交互作用包括共價交互作用 (例如，二硫鍵、電子共享)。舉例而言，本揭露之實驗實例描述了包含多肽的多肽複合物之生產，該等多肽包含易發生羥基化的離胺酸殘基，該等多肽複合物係藉由包含 CH3 區的第一多肽及包含 CH3 區的第二多肽之 CH3 區之間的交互作用而形成。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為適合使用於治療或預防疾病/病狀中的多肽。適合使用於治療或預防疾病/病症中的多肽可以為其投予可用於治療或預防疾病/病症的任何多肽。在一些實施例中，適合使用於治療或預防疾病/病症中的多肽可以為其缺乏與疾病或病症之病理學正相關或牽涉其中的多肽。在一些實施例中，適合使用於治療或預防疾病/病症中的多肽可以為抑制因子的表現及/或活性的多肽，該因子之表現或活性其缺乏與疾病或病症之病理學正相關或牽涉其中。

在一些實施例中，該多肽為：抗原結合多肽、適體、抗原結合多肽複合物之組成多肽、Fc 融合蛋白、抗凝血劑、血液因子、骨成形性蛋白、針對配體的誘餌受體、針對受體的誘餌配體、酶、生長因子、激素、干擾素、白介素、血栓溶解因子、轉錄因子、表觀遺傳修飾劑、位點特異性核酸酶核酸編輯系統 (例如CRISPR/Cas9 系統、CRISPR/Cpf1 系統、CRISPR/C2c1 系統、CRISPR/C2c2 系統、CRISPR/C2c3 系統、ZFN 系統或 TALEN 系統) 之組成多肽、核糖核蛋白之組成多肽或者病毒蛋白 (例如衣殼蛋白或病毒酶)。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為以下或衍生自以下：抗原結合多肽。在一些實施例中，根據本揭露之多肽為以下或衍生自以下：抗原結合多肽複合物之組成多肽。

抗原結合多肽及抗原結合多肽複合物能夠與標靶抗原結合。抗原結合多肽及抗原結合多肽複合物包括抗體 (亦即免疫球蛋白 (Ig)) 及其抗原結合片段及衍生物。如本文所使用，「抗體」包括單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性 (例如，雙特異性、三特異性等) 抗體以及抗體衍生之抗原結合分子 (諸如 scFv、scFab、雙體抗體、三體抗體、scFv-Fc、迷你抗體、單域抗體 (例如VhH) 等 )。抗體之抗原結合片段包括例如Fv、Fab、F(ab')₂及 F(ab') 片段。在一些實施例中，抗原結合分子可以為抗體或其抗原結合片段。抗原結合多肽可以為例如肽適體、硫氧化還原蛋白、單體抗體、抗運載蛋白 (anticalin)、孔尼茲域 (Kunitz domain)、高親和多聚體 (avimer)、半胱胺酸結肽 (knottin)、非諾莫 (fynomer)、阿特里體 (atrimer)、DARPin、親和體 (affibody)、奈米抗體 (亦即單域抗體 (sdAb))、阿非林 (affilin)、犰狳重複蛋白 (armadillo repeat protein) (ArmRP)、OBody 或纖維接合素 (fibronectin)——於例如Reverdatto等人, Curr Top Med Chem. 2015; 15(12): 1082–1101 中回顧，其特此藉由引用整體併入 (亦參見例如Boersma等人, J Biol Chem (2011) 286:41273-85 及 Emanuel等人, Mabs (2011) 3:38-48)。

在一些實施例中，標靶抗原為疾病相關抗原。「疾病相關抗原」係指其存在指示給定疾病/疾病狀態的抗原，或者對其而言抗原位準升高與給定疾病/疾病狀態呈正相關的抗原。疾病相關抗原可以為其表現與給定疾病之症狀的發展、進展或嚴重程度相關的抗原。疾病相關抗原可以與疾病之病因或病理學相關，或者可以由於疾病而異常表現。疾病相關抗原可以為傳染原或病原體之抗原、癌症相關抗原或自體免疫疾病相關抗原。

在一些實施例中，疾病相關抗原為病原體之抗原。病原體可以為原核生物 (細菌)、真核生物 (例如原生動物、蠕蟲、真菌)、病毒或傳染性蛋白顆粒。在一些實施例中，病原體為細胞內病原體。在一些實施例中，病原體為病毒，例如，如上文所述之病毒。在一些實施例中，病原體為細菌。

在一些實施例中，標靶抗原為癌症相關抗原。癌症相關抗原為其表現或過表現與癌症相關聯之抗原。在一些實施例中，癌症相關抗原為受體分子，例如細胞表面受體。在一些實施例中，癌症相關抗原為細胞傳訊分子，例如細胞激素、趨化介素、幹擾素、白介素或淋巴激素。在一些實施例中，癌症相關抗原為生長因子或激素。在一些實施例中，癌症相關抗原為病毒抗原。癌細胞抗原可以由癌細胞異常表現 (例如，癌細胞抗原可以以異常定位表現)，或者可以由癌細胞以異常結構表現。癌細胞抗原可能能夠引發免疫反應。在一些實施例中，抗原在癌細胞之細胞表面處表現 (亦即癌細胞抗原為癌細胞表面抗原)。在一些實施例中，由本文所述的抗原結合分子結合的抗原部分展示在癌細胞之外表面上 (亦即在細胞外)。癌細胞抗原可以為癌症相關抗原。在一些實施例中，癌細胞抗原為其表現與癌症之症狀的發展、進展或嚴重性相關聯的抗原。癌症相關抗原可能與癌症之病因或病理學相關聯，或者可以由於癌症而異常表現。在一些實施例中，癌細胞抗原為其表現藉由癌細胞而上調 (例如在 RNA 及/或蛋白質位準) 的抗原，例如當與相當之非癌細胞 (例如源自相同組織/細胞類型的非癌細胞) 的表現位準相比時。在一些實施例中，癌症相關抗原可以優先由癌細胞表現，且不由相當之非癌細胞 (例如源自相同組織/細胞類型的非癌細胞) 表現。在一些實施例中，癌症相關抗原可以為經突變之癌基因或經突變之腫瘤抑制基因的產物。在一些實施例中，癌症相關抗原可以為經過表現之細胞蛋白的產物、由致癌病毒產生的癌抗原、癌胚抗原、或細胞表面醣脂或醣蛋白。

癌症相關抗原由 Zarour HM, DeLeo A, Finn OJ等人Categories of Tumor Antigens.於：Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR,等人編輯.Holland-Frei Cancer Medicine.第6 版.Hamilton (ON): BC Decker; 2003 中綜述。癌症相關抗原包括癌胚抗原：CEA、不成熟層粘連蛋白受體、TAG-72；腫瘤病毒抗原，諸如 HPV E6 及 E7；過表現之蛋白：纖維母細胞活化蛋白 (FAP)、B 細胞成熟抗原 (BCMA)、CD19、HER2/neu、EGFR、TYRP1、GPRC5D、BING-4、鈣活化之氯離子通道 2、週期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、端粒酶、間皮素、SAP-1、生存素、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白多醣 (MCSP)；睪丸癌抗原：BAGE、CAGE、GAGE、MAGE、SAGE、XAGE、CT9、CT10、NY-ESO-1、PRAME、SSX-2；譜系限制性抗原：MART1、Gp100、酪胺酸酶、TRP-½、MC1R、前列腺特異性抗原；經突變之抗原：β-鏈蛋白、BRCA½、CDK4、CML66、纖連蛋白、MART-2、p53、Ras、TGF-βRII；經轉譯後改變之抗原：MUC1；獨特型抗原：Ig、TCR。其他癌細胞抗原包括熱休克蛋白 70 (HSP70)、熱休克蛋白 90 (HSP90)、葡萄糖調節蛋白 78 (GRP78)、波形蛋白 (vimentin)、核仁素、胎兒腺泡胰臟蛋白 (FAPP)、鹼性磷酸酶胎盤樣蛋白 2 (ALPPL-2)、siglec-5、經應激誘導之磷蛋白 1 (STIP1)、蛋白酪胺酸激酶 7 (PTK7) 及親環蛋白 (cyclophilin) B。在一些實施例中，癌細胞抗原為 Zhao 及 Cao, Front Immunol. (2019) 10:2250 中描述的癌細胞抗原，其藉由引用以其整體併入本文。

在一些實施例中，標靶抗原係選自 MCSP、EGFR、FAP、CEA、TYRP1、GPRC5D 及 CD19。在一些實施例中，標靶抗原為 MCSP。在一些實施例中，標靶抗原為 EGFR。在一些實施例中，標靶抗原為 FAP。在一些實施例中，標靶抗原為 CEA。在一些實施例中，標靶抗原為 TYRP1。在一些實施例中，標靶抗原為 GPRC5D。在一些實施例中，標靶抗原為 CD19。

在一些實施例中，標靶抗原為免疫細胞表面分子。免疫細胞表面分子為在免疫細胞之細胞膜中或細胞膜處表現的任何分子。在一些實施例中，由抗原結合分子結合的免疫細胞表面分子之一部分係在免疫細胞之外表面上 (亦即在細胞外)。免疫細胞表面分子可在任何免疫細胞之細胞表面上表現。在一些實施例中，免疫細胞可以為造血來源的細胞，例如嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、樹突細胞、淋巴球或單核球。淋巴球可以為例如T 細胞、B 細胞、自然殺手 (NK) 細胞、NKT 細胞或先天性淋巴細胞 (ILC) 或其前驅物 (例如胸腺細胞或前 B 細胞)。免疫細胞可表現 CD3 多肽 (例如，CD3γ CD3ε CD3ζ 或 CD3δ)、TCR 多肽 (TCRα 或 TCRβ)、CD27、CD28、CD4 或 CD8。在一些實施例中，免疫細胞為 T 細胞，例如CD3+ T 細胞。在一些實施例中，T 細胞為 CD3+、CD4+ T 細胞。在一些實施例中，T 細胞為 CD3+、CD8+ T 細胞。在一些實施例中，T 細胞為 T 輔助細胞 (TH 細胞)。在一些實施例中，T 細胞為細胞毒性 T 細胞 (例如細胞毒 T 淋巴細胞 (CTL))。在一些實施例中，免疫細胞為 T 細胞或 NK 細胞。

在一些實施例中，免疫細胞表面分子可以為 CD3-TCR 複合物多肽，例如，TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TRAC、TRBC1、TRBC2、TRGC1、TRGC2、TRDC、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ 或 CD3η。在一些實施例中，免疫細胞表面分子為 CD3、CD8、CD4 或 CD28。在一些實施例中，免疫細胞表面分子為查核點分子 (例如，PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、TIGIT 或 BTLA) 或查核點分子的配體 (例如，PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、MHC I 類、MHC II 類、Galectin 9、VSIG3、VSIG8、LRIG1、PSGL1、CD155 或 HVEM)。在一些實施例中，免疫細胞表面分子為共刺激分子 (例如，CD28、OX40、4-1BB、ICOS 或 CD27) 或針對共刺激分子的配體 (例如，CD86、CD80、OX40L 4-1BBL、ICOSL 或 CD70)。

免疫球蛋白及其結構描述於例如Schroeder 及 Cavacini J Allergy Clin Immunol. (2010) 125(202):S41-S52 中，其藉由引用以其整體併入本文。G 型免疫球蛋白 (亦即IgG) 為約 150 kDa 的醣蛋白，包含兩條重鏈及兩條輕鏈。從 N 端至 C 端，免疫球蛋白重鏈包含重鏈可變區 (VH)，隨後包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含三個恆定區 (CH1、CH2 及 CH3，其中 CH1-CH2 鉸鏈區提供在 CH1 與 CH2 之間)。免疫球蛋白輕鏈包含輕鏈可變區 (VL)，其後為輕鏈恆定區 (CL)。根據重鏈，免疫球蛋白可分類為 IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA (例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE 或 IgM。輕鏈可以為 kappa (κ) 或 lambda (λ)。

本文中，「CH1 區」係指與依據 EU 編號系統由位置 118 至 215 形成的 Ig 重鏈恆定區 (IGHG) 之區域相對應的胺基酸序列 (該區域描述於 Edelman等人，Proc Natl Acad Sci USA.(1969) 63(1):78-85)。「CH1 至 CH2 鉸鏈區」係指與依據 EU 編號系統由位置 216 至 230 形成的 Ig 重鏈恆定區 (IGHG) 之區域相對應的胺基酸序列。「CH2 區」係指與依據 EU 編號系統由位置 231 至 340 形成的 Ig 重鏈恆定區 (IGHG) 之區域相對應的胺基酸序列。「CH2-CH3 區」係指與依據 EU 編號系統由位置 231 至 447 形成的 Ig 重鏈恆定區 (IGHG) 之區域相對應的胺基酸序列。「CH3 區」係指與依據 EU 編號系統由位置 341 至 447 形成的 Ig 重鏈恆定區 (IGHG) 之區域相對應的胺基酸序列。「CL 區」係指與下列相對應的胺基酸序列：(i) 依據 EU 編號系統由位置 108 至 214 形成的 Ig 輕鏈 κ 恆定區 (IGKC) 之區域，或者 (ii) 依據 Kabat 編號系統由位置 107A 至 216 形成的 Ig 輕鏈 λ 恆定區 (IGLC) 之區域 (Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest.第 5 版，US Department of Health and Human Services, NIH 出版物第 91-3242 號，第 647 頁 (1991))。

根據本揭露之抗原結合多肽及抗原結合多肽複合物亦包括包含衍生自抗體的抗原結合區/域的分子。抗體衍生之抗原結合分子可包含抗原結合區/域，該抗原結合區/域包含抗體之抗原結合區 (例如，抗體之抗原結合片段) 或由其組成。在一些實施例中，抗體衍生之抗原結合分子的抗原結合區/域可以為或包含抗體之 Fv (例如作為 scFv 提供) 或 Fab 區、或整個抗體。例如，根據本揭露之抗原結合分子包括包含 (細胞毒性) 藥物部分的抗體-藥物結合物 (ADC)。

根據本揭露之抗原結合多肽及抗原結合多肽複合物亦包括嵌合抗原受體 (CAR)，該等嵌合抗原受體為提供抗原結合及 T 細胞活化功能的重組受體 (CAR 結構、功能及工程係回顧於例如Dotti等人，Immunol Rev (2014) 257(1) 及 Jayaraman等人，EBioMedicine (2020) 58:102931 中，該兩個文獻均特此藉由引用以其整體併入)。

根據本揭露之抗原結合多肽及抗原結合多肽複合物包括多特異性抗原結合多肽及多特異性抗原結合多肽複合物。「多特異性」意謂抗原結合多肽/多肽複合物顯示出與多於一種 (例如2、3、4、5、6、7、8等種) 標靶抗原的特異性結合。在一些實施例中，抗原結合多肽/多肽複合物為雙特異性抗原結合多肽/多肽複合物。在一些實施例中，抗原結合多肽/多肽複合物包含至少兩個不同的抗原結合域 (亦即至少兩個抗原結合域，例如包含不相同的 VH 及 VL)。

根據本揭露之多特異性抗原結合多肽/多肽複合物可以依任何適合形式來提供，諸如描述於以下中的彼等形式來提供：Brinkmann 及 Kontermann，MAbs (2017) 9(2): 182-212 中描述，該文獻以引用方式以其全部內容特此併入。適合形式包括示出於 Brinkmann 及 Kontermann, MAbs (2017) 9(2): 182-212 之圖 2 中的彼等形式：抗體結合物，例如IgG₂、F(ab')₂或 CovX-Body；IgG 或 IgG 樣分子，例如IgG、嵌合 IgG、κλ-抗體共有 HC；CH1/CL 融合蛋白，例如scFv2-CH1/CL、VHH2-CH1/CL；「純可變域」雙特異性抗原結合分子，例如串聯 scFv (taFV)、三體抗體、雙體抗體 (Db)、dsDb、Db(kih)、DART、scDB、dsFv-dsFv、tandAbs、三頭 (triple heads)、串聯 dAb/VHH、四價 dAb.VHH；非 Ig 融合蛋白，例如scFv₂-白蛋白、scDb-白蛋白、taFv-白蛋白、taFv-毒素、迷你抗體、DNL-Fab₂、DNL-Fab₂-scFv、DNL-Fab₂-IgG-細胞激素₂、ImmTAC (TCR-scFv)；經修飾之 Fc 及 CH3 融合蛋白，例如scFv-Fc(kih)、scFv-Fc (CH3 電荷對)、scFv-Fc (EW-RVT)、scFv-fc (HA-TF)、scFv-Fc (SEEDbody)、taFv-Fc(kih)、scFv-Fc(kih)-Fv、Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc (SEEDbody)、DART-Fc、scFv-CH3(kih)、TriFab；Fc 融合體，例如雙-雙體抗體、scDb-Fc、taFv-Fc、scFv-Fc-scFv、HCAb-VHH、Fab-scFv-Fc、scFv₄-Ig、scFv₂-Fcab；CH3 融合體，例如雙-雙抗體、scDb-CH3；IgE/IgM CH2 融合體，例如scFv-EHD2-scFv、scFvMHD2-scFv；Fab 融合蛋白，例如Fab-scFv (雙體 (bibody))、Fab-scFv₂(三體 (tribody))、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-VHH、正交 Fab-Fab；非 Ig 融合蛋白，例如DNL-Fab₃、DNL-Fab₂-scFv、DNL-Fab₂-IgG-細胞激素₂；不對稱 IgG 或 IgG 樣分子，例如IgG(kih)、IgG(kih) 共有 LC、ZW1 IgG 共有 LC、Biclonics 共有 LC、CrossMab、CrossMab(kih)、scFab-IgG(kih)、Fab-scFab-IgG(kih)、正交 Fab IgG(kih)、DuetMab、CH3 電荷對 + CH1/CL 電荷對、鉸鍊/CH3 電荷對、SEED-body、Duobody、四合一-CrossMab(kih)、LUZ-Y 共有 LC；LUZ-Y scFab-IgG、FcFc*；附加的及經 Fc 修飾的 IgG，例如IgG(kih)-Fv、IgG HA-TF-Fv、IgG(kih)scFab、scFab-Fc(kih)-scFv2、scFab-Fc(kih)-scFv、半 DVD-Ig、DVI-Ig (四合一)、CrossMab-Fab；經修飾之 Fc 及 CH3 融合蛋白，例如Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc-SEEDbody、TriFab；附加的 IgG - HC 融合體，例如IgG-HC、scFv、IgG-dAb、IgG-taFV、IgG-CrossFab、IgG-正交 Fab、IgG-(CαCβ)Fab、scFv-HC-IgG、串聯 Fab-IgG (正交 Fab)、Fab-IgG(CαCβ Fab)、Fab-IgG(CR3)、Fab-鉸鍊-IgG(CR3)；附加的 IgG - LC 融合，例如IgG-scFv(LC)、scFv(LC)-IgG、dAb-IgG；附加的 IgG - HC 及 LC 融合體，例如DVD-Ig、TVD-Ig、CODV-Ig、scFv₄-IgG、Zybody；Fc 融合體，例如Fab-scFv-Fc、scFv₄-Ig；F(ab')2 融合體，例如F(ab')₂-scFv₂；CH1/CL 融合蛋白，例如scFv₂-CH1-鉸鏈/CL；經修飾之 IgG，例如DAF (二合一-IgG)、DutaMab、Mab²；以及非 Ig 融合體，例如DNL-Fab₄-IgG。具有通常知識者能夠輕鬆地設計並生產多特異性抗原結合多肽/多肽複合物。

在一些實施例中，抗原結合多肽/多肽複合物為免疫細胞銜接子 (immune cell engager)。免疫細胞銜接子係回顧於例如Goebeler 及 Bargou，Nat. Rev. Clin. Oncol.(2020) 17: 418–434 以及 Ellerman, Methods (2019) 154:102-117 中，該兩個文獻均特此藉由引用以其整體併入。免疫細胞銜接子包含針對所關注標靶抗原的抗原結合區以及用於募集/銜接所關注免疫細胞的抗原結合區。免疫細胞銜接子透過對免疫細胞表面分子特異性的抗原結合區來募集/銜接免疫細胞。

經最充分研究之免疫細胞銜接子為包含下列的雙特異性 T 細胞銜接子 (BiTE)：(i) 標靶抗原結合域以及 (ii) BiTE 透過其來募集 T 細胞的 CD3 多肽 (通常為 CD3ε) 結合域。BiTE 與其標靶抗原 (亦即透過域 (i)) 以及與由 T 細胞表現的 CD3 多肽 (亦即透過域 (ii)) 的結合引起 T 細胞之活化，且最終引導針對表現標靶抗原的細胞的 T 細胞效應子活性。其他種類之免疫細胞銜接子係所屬技術領域中眾所周知的，且包括募集並活化 NK 細胞的自然殺手細胞銜接子，諸如雙特異性殺手細胞銜接子 (BiKE) 及三特異性殺手細胞銜接子 (TriKE)。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為多特異性抗原結合多肽或多特異性抗原結合多肽複合物之組成多肽。在一些實施例中，多肽為雙特異性抗原結合多肽或雙特異性抗原結合多肽複合物之組成多肽。在一些實施例中，多肽為雙特異性 T 細胞銜接子或雙特異性 T 細胞銜接子之組成多肽。

多特異性抗原結合多肽複合物之組成多肽之重組共表現及其隨後之締合可能產生若干可能之組合。可以有利的是，在免疫球蛋白恆定區中引入胺基酸取代以提高所欲多肽組合之產率。修飾可會促進例如不同多肽鏈之 CH2 及/或 CH3 區之間之疏水及/或靜電交互作用。適合的修飾係描述於例如Ha等人，Front. Immunol (2016) 7:394 (其特此藉由引用以其整體併入) 中，且包括如 Ha等人，Front. Immunol (2016) 7:394 的表 1 中所示之下列形式：KiH、KiHs-s、HA-TF、ZW1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s、SEED 或 A107。

CrossMab 技術有利於多特異性抗原結合多肽複合物中的正確的重鏈及輕鏈配對。CrossMab 技術係描述於例如Klein等人，MAbs. 2016 Aug-Sep; 8(6): 1010-1020 中描述，該文獻以引用方式以其全部內容特此併入。在 CrossMab 分子中，將 VH/VL 及/或 CL/CH1 區在抗原結合部分中交換，以將與另一抗原結合部分之多肽錯配的機會最小化。參見例如 Klein等人，MAbs.2016 Aug-Sep; 8(6): 1010-1020 之圖 1。CrossFab 係指 CrossMab 技術之實施例，在該實施例中，Fab 部分係藉由包含 VL 域及 CH1 域的第一多肽與包含 VH 域及 CL 域的第二多肽之間的締合而形成 (參見例如Fenn等人，PLoS One.(2013) 8(4): e61953)。因此，根據本揭露之 crossFab 部分係指包含下列的部分：(i) 包含 VL 域及 CH1 域的多肽及 (ii) 包含 VH 域及 CL 域的多肽。

在本揭露之實驗實例中，發明人判定，當 (在多肽之胺基酸序列中) 在緊鄰其 N 末端提供的 VL 的背景下提供時，在與 CH1 位置121 (EU 編號) 相對應的位置處的離胺酸殘基特別容易發生羥基化。亦即，在 (從 N 端至 C 端) 包含 VL、之後的 CH1 的多肽中，發現在 CH1 之位置 121 (EU 編號) 處的離胺酸特別容易發生羥基化。

因此，在一些實施例中，根據本揭露之包含易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列 (例如依據 SEQ ID NO:1、2、6、7、10 或 11 的胺基酸序列) 係包含於作為 crossFab 部分之組成多肽的多肽中。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為 crossFab 部分之組成多肽。因此，在一些實施例中，根據本揭露之多肽包含以下或由以下組成：VL-CH1 區。在一些實施例中，該多肽包含以下或由以下組成：crossFab 部分之 VL-CH1 區。

亦即，在一些實施例中，該多肽為形成 crossFab 部分的多肽複合物之組成多肽。依據此等實施例，在一些實施例中，形成 crossFab 部分的多肽複合物不包含進一步之抗原結合部分 (亦即，不包含除 crossFab 部分之外的抗原結合部分)。

包含 VL-CH1 區的多肽之實例包括由以下所組成之多肽：SEQ ID NO:42、45、57、62、66、70、78、81、90、93、96、97、100、101 或 104 之胺基酸序列。由 VL-CH1 區組成的多肽之實例包括由以下所組成之多肽：SEQ ID NO:62、70 或 78 之胺基酸序列。在一些實施例中，根據本揭露之多肽包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO:62、70、或 78 具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施例中，多肽包含以下結構：N-端-[…]-[VL]-[CH1]-[…]-C-端；其中「N-端」表示多肽之 N-端，「C-端」表示多肽之 C-端，「[...]」指示視情況存在進一步的胺基酸序列/蛋白質域，各「-」指示視情況選用的連接子序列，「[VL]」指示抗體之輕鏈可變區 (VL) 之胺基酸序列，且「CH1」指示 Ig 重鏈恆定區之 CH1 區之胺基酸序列。

在一些實施例中，多肽包含以下結構：N-端-[…]-[LC-FR4]-[CH1]-[…]-C-端；其中「N-端」表示多肽之 N-端，「C-端」表示多肽之 C-端，「[...]」指示視情況存在進一步的胺基酸序列/蛋白質域，各「-」指示視情況選用的連接子序列，「[LC-FR4]」指示抗體之輕鏈可變區 (VL) 之骨架區 4 之胺基酸序列，且「CH1」指示 Ig 重鏈恆定區之 CH1 區之胺基酸序列。

在一些實施例中，包含 VL--CH1 區的多肽進一步包含 CH2 區，例如至 CH1 區的 C 末端。在一些實施例中，包含 VL--CH1 區的多肽進一步包含 CH3 區，例如至 CH1 區的 C 末端。在一些實施例中，包含 VL--CH1 區的多肽進一步包含 CH2-CH3 區，例如至 CH1 區的 C 末端。

在一些實施例中，多肽包含以下結構：N-端-[…]-[VL]-[CH1]-[CH2]-[…]-C-端；其中「N-端」表示多肽之 N-端，「C-端」表示多肽之 C-端，「[...]」指示視情況存在進一步的胺基酸序列/蛋白質域，各「-」指示視情況選用的連接子序列，「[VL]」指示抗體之輕鏈可變區 (VL) 之胺基酸序列，「CH1」指示 Ig 重鏈恆定區之 CH1 區之胺基酸序列，且「CH2」指示 Ig 重鏈恆定區之 CH2 區之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含以下結構：N-端-[…]-[VL]-[CH1]-[CH2-CH3]-[…]-C-端；其中「N-端」表示多肽之 N-端，「C-端」表示多肽之 C-端，「[...]」指示視情況存在進一步的胺基酸序列/蛋白質域，各「-」指示視情況選用的連接子序列，「[VL]」指示抗體之輕鏈可變區 (VL) 之胺基酸序列，「CH1」指示 Ig 重鏈恆定區之 CH1 區之胺基酸序列，且「CH2-CH3」指示 Ig 重鏈恆定區之 CH2-CH3 區之胺基酸序列。

在一些實施例中，包含 VL-CH1 區的多肽缺乏形成至 VL 區的抗原結合部分 N-末端的全部或部分的胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含以下結構：N-端-[VL]-[CH1]-[…]-C-端；其中「N-端」表示多肽之 N-端，「C-端」表示多肽之 C-端，「[...]」指示視情況存在進一步的胺基酸序列/蛋白質域，各「-」指示視情況選用的連接子序列，「[VL]」指示抗體之輕鏈可變區 (VL) 之胺基酸序列，且「CH1」指示 Ig 重鏈恆定區之 CH1 區之胺基酸序列。在一些實施例中，包含 VL-CH1 區的多肽缺乏形成另一抗原結合部分 (亦即，除其中包含/待包含 VL-CH1 區的抗原結合部分之外的抗原結合部分) 的全部或部分的胺基酸序列。

連接子序列為本領域技術人員已知的，並在例如 Chen等人, Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369 中描述，該文獻以引用方式以其全部內容特此併入。在一些實施例中，連接子序列可以為柔性連接子序列。柔性連接子序列允許由該連接子序列連接的胺基酸序列的相對移動。柔性連接子為本領域技術人員已知的，並在 Chen等人, Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369 中鑑定。柔性連接子序列通常包含高比例的甘胺酸及/或絲胺酸殘基。在一些實施例中，VL 區 (例如其 LC-FR4) 與 CH1 區之間的連接子由兩個絲胺酸殘基組成。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽包含以下或由以下組成：與 SEQ ID NO:106、107、或 108 具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的胺基酸序列。

特定例示性多肽及多肽複合物

在一些實施例中，多肽為根據本揭露之多肽複合物之組成多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽或多勝肽複合物包含與 CD3 結合的抗原結合分子之包含重鏈 CDR 的 VH 區及包含輕鏈 CDR 的 VL 區，例如如本文中表 A 所示。在一些實施例中，根據本揭露之多肽或多肽複合物包含與 CD3 結合的抗原結合分子之 VH 區及 VL 區，例如如本文中表 A 所示。

在一些實施例中，多肽或多肽複合物包含：(i) VH 區，其包含 HC-CDR1、HC-CDR2 及 HC-CDR3，如表 A 之列 A 所指示；及 (ii) VL 區，其包含 LC-CDR1、LC-CDR2 及 LC-CDR3，如表 A 之列 B 所指示，其中列 A 及 B 之序列係選自表 A 之同一行。舉例而言，在一些實施例中，多肽或多肽複合物包含：VH 區，其包含 HC-CDR1 = SEQ ID NO:124、HC-CDR2 = SEQ ID NO:125 及 HC-CDR3 = SEQ ID NO:126；及 VL 區，其包含 LC-CDR1 = SEQ ID NO:128、LC-CDR2 = SEQ ID NO:129 及 LC-CDR3 = SEQ ID NO:130 (亦即CH2527 之包含 HC-CDR1 至 HC-CDR3 的 VH 及包含 LC-CDR1 至 LC-CDR3 的 VL，如表 A 之行 1 所示)。

在一些實施例中，多肽或多肽複合物包含：(i) VH 區，其包含以下或由以下組成：與表 B 之列 A 所指示之胺基酸序列具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的胺基酸序列；及 (ii) VL 區，其包含以下或由以下組成：與表 B 之列 B 所指示之胺基酸序列具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的胺基酸序列，其中列 A 及 B 之序列係選自表 B 之同一行。在一些實施例中，多肽或多肽複合物包含：(i) VH 區，其包含以下或由以下組成：表 B 之列 A 所指示的胺基酸序列；及 (ii) VL 區，其包含表 B 之列 B 所指示的胺基酸序列，其中列 A 及 B 之序列係選自表 B 之同一行。舉例而言，在一些實施例中，多肽或多勝肽複合物包含：包含 SEQ ID NO:120 的 VH 區及包含 SEQ ID NO:127 的 VL 區 (亦即CH2527 之 VH 及 VL，如表 B 之行 1 所示)。

表 A

		A 列	B 列
行	殖株	VH	VL
HC-CDR1	HC-CDR2	HC-CDR3	LC-CDR1	LC-CDR2	LC-CDR3
1	CH2527	SEQ ID NO:124	SEQ ID NO:125	SEQ ID NO:126	SEQ ID NO:128	SEQ ID NO:129	SEQ ID NO:130
2	殖株 22	SEQ ID NO:132	SEQ ID NO:125	SEQ ID NO:133	SEQ ID NO:128	SEQ ID NO:129	SEQ ID NO:130
3	P035.093	SEQ ID NO:135	SEQ ID NO:125	SEQ ID NO:136	SEQ ID NO:128	SEQ ID NO:129	SEQ ID NO:130
4	P035.093 (Kabat)	SEQ ID NO:164	SEQ ID NO:165	SEQ ID NO:166	SEQ ID NO:167	SEQ ID NO:168	SEQ ID NO:130
5	40G5c	SEQ ID NO:138	SEQ ID NO:139	SEQ ID NO:140	SEQ ID NO:142	SEQ ID NO:143	SEQ ID NO:144
6	V9	SEQ ID NO:146	SEQ ID NO:147	SEQ ID NO:148	SEQ ID NO:150	SEQ ID NO:151	SEQ ID NO:152

表 B

		A 列	B 列
行	殖株	VH	VL
1	CH2527	SEQ ID NO:120	SEQ ID NO:127
2	殖株 22	SEQ ID NO:131	SEQ ID NO:127
3	P035.093	SEQ ID NO:134	SEQ ID NO:127
4	40G5c	SEQ ID NO:137	SEQ ID NO:141
5	V9	SEQ ID NO:145	SEQ ID NO:149

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為 WO 2013/026833 A1 所描述之多肽，該文獻特此藉由引用以其整體併入。在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物為 WO 2013/026833 A1 所描述之多肽複合物。在一些實施例中，多肽為 WO 2013/026833 A1 所描述之抗原結合多肽複合物之組成多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為與 SEQ ID NO:28 至 80 中之一者具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為與 SEQ ID NO:42、45、57、62、66、70 或 78 具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物為包含下列的多肽複合物：

(i) 與 SEQ ID NO:29 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:42 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:44 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(ii) 與 SEQ ID NO:29 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:45 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:46 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(iii) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:38 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:39 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(iv) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:36 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:37 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(v) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:40 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:41 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(vi) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:34 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:35 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(vii) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:38 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:77 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(viii) 與 SEQ ID NO:28 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:29 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(ix) 與 SEQ ID NO:31 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:32 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:33 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(x) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:42 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:43 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:44 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xi) 與 SEQ ID NO:29 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:42 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:60 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xii) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:42 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:44 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:61 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xiii) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:39 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:62 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:63 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xiv) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:39 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:62 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:64 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xv) 與 SEQ ID NO:44 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:65 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:66 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:67 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xvi) 與 SEQ ID NO:62 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:65 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:67 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:68 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xvii) 與 SEQ ID NO:65 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:67 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:70 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:71 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xviii) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:39 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:78 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:79 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xix) 與 SEQ ID NO:30 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:39 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:78 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:80 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xx) 與 SEQ ID NO:48 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:49 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:52 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xxi) 與 SEQ ID NO:49 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:52 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:77 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xxii) 與 SEQ ID NO:47 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:48 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:49 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xxiii) 與 SEQ ID NO:33 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:50 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:51 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xxiv) 與 SEQ ID NO:54 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:55 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:56 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xxv) 與 SEQ ID NO:54 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:56 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:77 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xxvi) 與 SEQ ID NO:33 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:51 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:53 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xxvii) 與 SEQ ID NO:44 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:57 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:58 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:59 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xxviii) 與 SEQ ID NO:58 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:59 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:62 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:69 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xxix) 與 SEQ ID NO:62 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:72 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:73 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:74 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；或者

(xxx) 與 SEQ ID NO:62 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:75 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:76 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:77 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為 WO 2021/255142 A1 所描述之多肽，該文獻特此藉由引用以其整體併入。在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物為 WO 2021/255142 A1 所描述之多肽複合物。在一些實施例中，多肽為 WO 2021/255142 A1 所描述之抗原結合多肽複合物之組成多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為與 SEQ ID NO:81 至 105 或 153 至 155 中之一者具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為與 SEQ ID NO:81、90、93、96、97、100、101、104 或 153 具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

(i) 與 SEQ ID NO:81 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:82 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:83 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:85 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(ii) 與 SEQ ID NO:81 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:82 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:83 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:86 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(iii) 與 SEQ ID NO:81 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:82 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:83 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:87 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(iv) 與 SEQ ID NO:81 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:82 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:83 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:88 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(v) 與 SEQ ID NO:81 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:82 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:83 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:89 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(vi) 與 SEQ ID NO:85 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:90 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:91 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:92 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(vii) 與 SEQ ID NO:86 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:90 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:91 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:92 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(viii) 與 SEQ ID NO:89 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:90 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:91 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:92 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(ix) 與 SEQ ID NO:85 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:93 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:94 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:95 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(x) 與 SEQ ID NO:86 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:93 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:94 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:95 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xi) 與 SEQ ID NO:89 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:93 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:94 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:95 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xii) 與 SEQ ID NO:86 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:96 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:98 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:99 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xiii) 與 SEQ ID NO:86 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:100 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:102 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:103 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xiv) 與 SEQ ID NO:84 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:97 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:98 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:99 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xv) 與 SEQ ID NO:84 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:101 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:102 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:103 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xvi) 與 SEQ ID NO:85 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:104 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:105 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(xvii) 與 SEQ ID NO:86 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:104 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:105 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；或者

(xviii) 與 SEQ ID NO:89 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:104 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:105 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；或者

(xix) 與 SEQ ID NO:97 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:98 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:99 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:116 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；或者

(xx) 與 SEQ ID NO:93 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:94 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:95 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:116 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；或者

(xxi) 與 SEQ ID NO:83 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:153 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:154 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:155 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為 WO 2014/131712 A1 所描述之多肽，該文獻特此藉由引用以其整體併入。在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物為 WO 2014/131712 A1 所描述之多肽複合物。在一些實施例中，多肽為 WO 2014/131712 A1 所描述之抗原結合多肽複合物之組成多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為與 SEQ ID NO:58 或 109 至 114 中之一者具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為與 SEQ ID NO:110 具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

(i) 與 SEQ ID NO:109 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:110 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:111 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:112 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；或者

(ii) 與 SEQ ID NO:113 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:110 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:114 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:58 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為 WO 2020/127619 A1 所描述之多肽，該文獻特此藉由引用以其整體併入。在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物為 WO 2020/127619 A1 所描述之多肽複合物。在一些實施例中，多肽為 WO 2020/127619 A1 所描述之抗原結合多肽複合物之組成多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為與 SEQ ID NO:82 至 84 或 115 至 119 中之一者具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為與 SEQ ID NO:115 或 117 具有至少 70% (例如，≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

(i) 與 SEQ ID NO:115 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:82 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:83 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:116 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(ii) 與 SEQ ID NO:115 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:82 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:83 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:84 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；

(iii) 與 SEQ ID NO:117 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:118 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:119 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:116 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；或者

(iv) 與 SEQ ID NO:117 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:118 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；與 SEQ ID NO:119 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽；及與 SEQ ID NO:84 具有至少 70% (例如≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者) 胺基酸序列同一性的多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽為 WO 2015/095392 A1 所描述之多肽，該文獻特此藉由引用以其整體併入。在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物為 WO 2015/095392 A1 所描述之多肽複合物。在一些實施例中，多肽為 WO 2015/095392 A1 所描述之抗原結合多肽複合物之組成多肽。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物為伏利妥米單抗 (forimtamig)。伏利妥米單抗 (亦稱為 RG6234 或 RO7425781) 為藉由以下形成的 GPRC5DxCD3 T 細胞銜接雙特異性抗體：(i) 具有 SEQ ID NO:93 之胺基酸序列的多肽、(ii) 具有 SEQ ID NO:94 之胺基酸序列的多肽、(iii) 具有 SEQ ID NO:95 之胺基酸序列的多肽及 (iv) 具有 SEQ ID NO:116 之胺基酸序列的多肽之間的締合。

Fe 濃度

本揭露之態樣及實施例涉及藉由在某些鐵 (Fe) 濃度的存在下培養包含編碼多肽的核酸的細胞來生產多肽。

本揭露係部分地基於發明人的發現，亦即在包含相對低 Fe 濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞有利於生產包含非羥基化形式的多肽，該等多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列。

舉例而言，本揭露之實驗實例證明，在維持細胞培養物中相對低 Fe 濃度的同時培養包含編碼多肽 (包含具有易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列) 的核酸的細胞會增加經表現之多肽當中包含離胺酸的多肽之比例並降低在相關位置處包含羥基離胺酸的多肽之比例。不受任何特定理論之束縛，發明人認為在相關位置處包含離胺酸 (而非羥基離胺酸) 的多肽之比例的相對增加可能由於 Fe²⁺充當用於離胺醯基羥化酶的輔因子的降低之可用率而出現，該等離胺醯基羥化酶會催化離胺酸羥基化為羥基離胺酸。發明人推斷，Fe²⁺的降低之可用率將以相同的方式影響脯胺醯基羥化酶，因為它們類似地為需要 Fe²⁺作為輔因子的 2OG 二氧酶。

因此，本揭露提供了從細胞培養物中的包含編碼多肽的核酸的細胞生產包含胺基酸序列的多肽，該胺基酸序列包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基，其中細胞培養基中 Fe 離子 (例如Fe²⁺、Fe³⁺) 之濃度被提供及/或被維持於低水平 (例如＜60 µM、＜40 µM、＜15 µM)。

本文中，在提及 Fe 離子之濃度時，應理解該濃度考慮相關溶液 (亦即細胞培養基) 中的所有 Fe 離子——包括二價鐵 (Fe²⁺) 及三價鐵 (Fe³⁺) 離子。

判定指定溶液(例如細胞培養基) 的鐵濃度之技術係具有通常知識者已知的，且係描述於例如Mohite，Asian J. Research Chem. (2011) 4(3): 348-361 中。該等技術包括比色方法、原子吸收光譜法 (AAS)、感應耦合電漿質譜法 (ICP-MS)、感應耦合電漿發射光譜法 (ICP-OES)、火焰發射光譜法、X 射線螢光方法及電化學方法。比色方法包括藉由菲洛𠯤(ferrozine ) 測定 (參見例如Viollier 等人，Applied Geochemistry (2000) 15(6): 785-790)、紅啡啉 (bathophenanthroline) 測定及三𠯤測定 (參見例如Verschoor 及 Molot，Limnol. Oceanogr.: Methods (2013) 11: 113-112) 進行分析。菲洛𠯤、紅啡啉及三𠯤各自與 Fe 離子反應以形成可以用分光光度法檢測的著色複合物。Iron Bio 測試套組 (Roche，目錄 #06990045001) 提供了用於使用 Cedex Bio 或 Cedex Bio HT 分析儀來評估菲洛𠯤測定中溶液之鐵濃度的試劑及說明。基於 AAS 的方法包括火焰 AAS (參見例如Wu等人，Applied Spectroscopy Reviews (2009) 44(5):411-437) 及石墨爐 AAS (參見例如Borges，“Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry”, in “Encyclopedia of Analytical Chemistry: Applications, Theory, and Instrumentation”; Wiley, 2022)，兩者皆涉及將樣品霧化且測量針對鐵的特徵波長下的光之吸光度。ICP-MS 係描述於例如Wilschefski 及 Baxter，Clin Biochem Rev. (2019) 40(3): 115-133 以及 Michalke等人，Front. Chem. (2019) 7: 136 中，且可以藉由將樣品離子化且測量離子之質荷比來測量樣品中鐵之痕量含量。ICP-OES 係描述於例如Oral等人，Atomic Spectroscopy 37(4):142-149 中，且對由電漿源內的原子或離子在特定波長下發射的光進行測量，這會指示鐵之濃度。火焰發射光譜法涉及將樣品噴霧至火焰中，以及測量與鐵相對應的特定波長下的經發射之光之強度。X 射線螢光係描述於例如Marguí等人，Chemosphere.(2022) 303(Pt 1):135006 中。評估鐵濃度之電化學技術係描述於 Min, Electroanalysis (2012) 24(8): 1693-1702 及 Ahour, Scientific Reports (2023)13:1557 中，且包括基於電流分析法 (流體動力電流分析法) 及伏安法 (例如吸附剝除伏安法 (AdSV)、循環伏安法、方波伏安法) 的方法。此等方法涉及向樣品施加電勢且測量所得電流，該電流係與樣品中鐵之濃度相關。

在本揭露之一些態樣及實施例中，指定細胞培養物之鐵濃度可以依照每個細胞的 Fe 之可用量來表達，該 Fe 之可用量係計算為細胞培養基中的 Fe 之量除以培養物中的細胞之數目。

判定細胞之鐵含量之技術係描述於例如Abbasi等人，Scientific Reports (2021) 11: 6008、Kakhlon 及 Cabantchik，Free Radic Biol Med. (2002) 33(8):1037-1046 以及 Pourcelot等人，Biochim Biophys Acta.(2015) 1853(7):1596-1605 以及 Amor等人，Environ Microbiol. (2020) 22(3): 823–831。在指定細胞群體 (例如指定細胞培養物之細胞) 中 Fe 之平均濃度可以藉由測量從群體取樣的複數個細胞中 Fe 之濃度且判定經取樣之細胞之 Fe 之平均 (均值) 濃度來判定。

在本揭露之態樣及實施例中，該等方法包含在具有小於 60 µM (例如小於 40 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些態樣及實施例中，該等方法包含在具有小於 45 µM (例如小於 15 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，細胞培養基具有下列中之一者之 Fe 離子濃度：≤55 µM、≤50 µM、≤45 µM、≤40 µM、≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM。在一些實施例中，細胞培養基具有下列中之一者之 Fe 離子濃度：≤45 µM、≤30 µM 或 ≤15 µM。在一些實施例中，細胞培養基具有 ≤10 µM 之 Fe 離子濃度。在一些實施例中，細胞培養基具有 ≤15 µM 之 Fe 離子濃度。在一些實施例中，細胞培養基具有＞0 µM 之 Fe 離子濃度。在一些實施例中，細胞培養基具有下列中之一者之 Fe 離子濃度：＞0 µM 且 ≤55 µM、＞0 µM 且 ≤50 µM、＞0 µM 且 ≤45 µM、＞0 µM 且 ≤40 µM、＞0 µM 且 ≤37.5 µM、＞0 µM 且 ≤35 µM、＞0 µM 且 ≤32.5 µM、＞0 µM 且 ≤30 µM、＞0 µM 且 ≤27.5 µM、＞0 µM 且 ≤25 µM、＞0 µM 且 ≤22.5 µM、＞0 µM 且 ≤20 µM、＞0 µM 且 ≤17.5 µM、＞0 µM 且 ≤15 µM、＞0 µM 且 ≤12.5 µM、＞0 µM 且 ≤10 µM、＞0 µM 且 ≤7.5 µM、＞0 µM 且 ≤5 µM 或＞0 µM 且 ≤2.5 µM。在一些實施例中，細胞培養基具有下列中之一者之 Fe 離子濃度：＞0 µM 且 ≤45 µM、＞0 µM 且 ≤30 µM 或＞0 µM 且 ≤15 µM。

在本揭露之態樣及實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些態樣及實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1.125 fmol/細胞 (例如≤0.375 fmol/細胞) 的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，細胞培養物中 Fe 之濃度為下列中之一者：≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞。在一些實施例中，細胞培養物中 Fe 之濃度為下列中之一者：≤1.125 fmol/細胞、≤0.75 fmol/細胞或 ≤0.375 fmol/細胞。在一些實施例中，細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1 fmol/細胞。在一些實施例中，細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤0.375 fmol/細胞。在一些實施例中，細胞培養物中 Fe 之濃度為＞0 fmol/細胞。在一些實施例中，細胞培養物中 Fe 之濃度為下列中之一者：＞0 fmol/細胞且 ≤1.4 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.3 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.2 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.1 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.9 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.8 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.7 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.6 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.5 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.4 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.3 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.2 fmol/細胞或＞0 fmol/細胞且 ≤0.1 fmol/細胞。在一些實施例中，細胞培養物中 Fe 之濃度為下列中之一者：＞0 fmol/細胞且 ≤1.125 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.75 fmol/細胞或＞0 fmol/細胞且 ≤0.375 fmol/細胞。

在一些實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞培養在具有小於 60 µM (例如小於 40 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞培養在具有等於或小於 45 µM (例如小於 15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞培養在具有 ≤55 µM、≤50 µM、≤45 µM、≤40 µM、≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞培養在具有 ≤45 µM、≤30 µM 或 ≤15 µM 中之一者之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞培養在具有 ≤10 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞培養在具有 ≤15 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞培養在具有＞0 µM 且 ≤55 µM、＞0 µM 且 ≤50 µM、＞0 µM 且 ≤45 µM、＞0 µM 且 ≤40 µM、＞0 µM 且 ≤37.5 µM、＞0 µM 且 ≤35 µM、＞0 µM 且 ≤32.5 µM、＞0 µM 且 ≤30 µM、＞0 µM 且 ≤27.5 µM、＞0 µM 且 ≤25 µM、＞0 µM 且 ≤22.5 µM、＞0 µM 且 ≤20 µM、＞0 µM 且 ≤17.5 µM、＞0 µM 且 ≤15 µM、＞0 µM 且 ≤12.5 µM、＞0 µM 且 ≤10 µM、＞0 µM 且 ≤7.5 µM、＞0 µM 且 ≤5 µM 或＞0 µM 且 ≤2.5 µM 中之一者之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞培養在具有＞0 µM 且 ≤45 µM、＞0 µM 且 ≤30 µM 或＞0 µM 且 ≤15 µM 中之一者之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。

在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1.125 fmol/細胞的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞中之一者的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1.125 fmol/細胞、≤0.75 fmol/細胞或 ≤0.375 fmol/細胞中之一者的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1 fmol/細胞的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤0.375 fmol/細胞的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＞0 fmol/細胞且 ≤1.4 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.3 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.2 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.1 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.9 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.8 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.7 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.6 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.5 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.4 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.3 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.2 fmol/細胞或＞0 fmol/細胞且 ≤0.1 fmol/細胞中之一者的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＞0 fmol/細胞且 ≤1.125 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.75 fmol/細胞或＞0 fmol/細胞且 ≤0.375 fmol/細胞中之一者的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續大部分之培養週期，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。

在本文中，「培養週期的大部分時間」為培養週期的＞50%。舉例而言，當培養週期為 14 天時，該培養週期的大部分時間為 14 天週期中的＞7 天。在一些實施例中，培養物中的 Fe 離子濃度係維持於相關濃度持續大部分之培養週期。

在一些實施例中，該等方法包含在具有小於 60 µM (例如小於 40 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在具有等於或小於 45 µM (例如小於 15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在具有 ≤55 µM、≤50 µM、≤45 µM、≤40 µM、≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在具有 ≤45 µM、≤30 µM 或 ≤15 µM 中之一者之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在具有 ≤10 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在具有 ≤15 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在具有＞0 µM 且 ≤55 µM、＞0 µM 且 ≤50 µM、＞0 µM 且 ≤45 µM、＞0 µM 且 ≤40 µM、＞0 µM 且 ≤37.5 µM、＞0 µM 且 ≤35 µM、＞0 µM 且 ≤32.5 µM、＞0 µM 且 ≤30 µM、＞0 µM 且 ≤27.5 µM、＞0 µM 且 ≤25 µM、＞0 µM 且 ≤22.5 µM、＞0 µM 且 ≤20 µM、＞0 µM 且 ≤17.5 µM、＞0 µM 且 ≤15 µM、＞0 µM 且 ≤12.5 µM、＞0 µM 且 ≤10 µM、＞0 µM 且 ≤7.5 µM、＞0 µM 且 ≤5 µM 或＞0 µM 且 ≤2.5 µM 中之一者之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在具有＞0 µM 且 ≤45 µM、＞0 µM 且 ≤30 µM 或＞0 µM 且 ≤15 µM 中之一者之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。

在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1.125 fmol/細胞的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞中之一者的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1.125 fmol/細胞、≤0.75 fmol/細胞或 ≤0.375 fmol/細胞中之一者的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1 fmol/細胞的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤0.375 fmol/細胞的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＞0 fmol/細胞且 ≤1.4 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.3 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.2 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.1 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.9 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.8 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.7 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.6 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.5 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.4 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.3 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.2 fmol/細胞或＞0 fmol/細胞且 ≤0.1 fmol/細胞中之一者的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等方法包含在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＞0 fmol/細胞且 ≤1.125 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.75 fmol/細胞或＞0 fmol/細胞且 ≤0.375 fmol/細胞中之一者的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞，持續培養週期之＞50% (例如≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者) 或者持續培養週期之持續時間，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。

在本揭露之一些態樣及實施例中，細胞培養物可以在具有小於 60 µM (例如小於 40 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中確立 (亦即「設定」)。在本揭露之一些態樣及實施例中，細胞培養物可以在細胞培養基中確立，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞。該等方法可以包含將細胞「接種」於具有特定 Fe 離子濃度的細胞培養基中。應當理解，「確立」細胞培養物或「接種」細胞包含使細胞與細胞培養基接觸，例如在適當的細胞培養容器內接觸。

因此，在本揭露之一些態樣及實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞接種於具有小於 60 µM (例如小於 40 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些態樣及實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞接種於具有小於 45 µM (例如小於 15 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，該細胞培養基具有下列中之一者之 Fe 離子濃度：≤55 µM、≤50 µM、≤45 µM、≤40 µM、≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，該細胞培養基具有下列中之一者之 Fe 離子濃度：≤45 µM、≤30 µM 或 ≤15 µM。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，該細胞培養基具有 ≤10 µM 之 Fe 離子濃度。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，該細胞培養基具有 ≤15 µM 之 Fe 離子濃度。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，細胞培養基具有下列中之一者之 Fe 離子濃度：＞0 µM 且 ≤55 µM、＞0 µM 且 ≤50 µM、＞0 µM 且 ≤45 µM、＞0 µM 且 ≤40 µM、＞0 µM 且 ≤37.5 µM、＞0 µM 且 ≤35 µM、＞0 µM 且 ≤32.5 µM、＞0 µM 且 ≤30 µM、＞0 µM 且 ≤27.5 µM、＞0 µM 且 ≤25 µM、＞0 µM 且 ≤22.5 µM、＞0 µM 且 ≤20 µM、＞0 µM 且 ≤17.5 µM、＞0 µM 且 ≤15 µM、＞0 µM 且 ≤12.5 µM、＞0 µM 且 ≤10 µM、＞0 µM 且 ≤7.5 µM、＞0 µM 且 ≤5 µM 或＞0 µM 且 ≤2.5 µM。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，該細胞培養基具有下列中之一者之 Fe 離子濃度：＞0 µM 且 ≤45 µM、＞0 µM 且 ≤30 µM 或＞0 µM 且 ≤15 µM。

在根據本揭露之一些態樣及實施例中，該等方法包含維持細胞培養基內的 Fe 離子濃度小於 60 µM (例如小於 40 µM，例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM)，持續大部分之培養週期 (例如培養週期之 ≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者，或者持續培養週期之持續時間)。在一些態樣及實施例中，該等方法包含維持細胞培養基內的 Fe 離子濃度小於 45 µM (例如≤30 µM，例如≤15 µM)，持續大部分之培養週期 (例如培養週期之 ≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者，或者持續培養週期之持續時間)。

在本揭露之態樣及實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞接種於細胞培養基中使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些態樣及實施例中，該等方法包含將包含編碼多肽的核酸的細胞接種於細胞培養基中使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1.125 fmol/細胞，該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為下列中之一者：≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為下列中之一者：≤1.125 fmol/細胞、≤0.75 fmol/細胞或 ≤0.375 fmol/細胞。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1 fmol/細胞。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤0.375 fmol/細胞。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為下列中之一者：＞0 fmol/細胞且 ≤1.4 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.3 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.2 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1.1 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤1 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.9 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.8 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.7 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.6 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.5 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.4 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.3 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.2 fmol/細胞或＞0 fmol/細胞且 ≤0.1 fmol/細胞。在一些實施例中，該等細胞係接種於細胞培養基中，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為下列中之一者：＞0 fmol/細胞且 ≤1.125 fmol/細胞、＞0 fmol/細胞且 ≤0.75 fmol/細胞或＞0 fmol/細胞且 ≤0.375 fmol/細胞。

在根據本揭露之一些態樣及實施例中，該等方法包含維持細胞培養基內的 Fe 離子濃度，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞 (例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞)，持續大部分之培養週期 (例如培養週期之 ≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者，或者持續培養週期之持續時間)。在一些態樣及實施例中，該等方法包含維持細胞培養基內的 Fe 離子濃度，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≤1.125 fmol/細胞 (例如≤0.75 fmol/細胞，例如≤0.375 fmol/細胞)，持續大部分之培養週期 (例如培養週期之 ≥60%、≥70%、≥80%、≥90% 或 ≥95% 中之一者，或者持續培養週期之持續時間)。

由於被培養物中的細胞吸收且利用，指定細胞培養物之培養基中的 Fe 離子濃度隨著時間而自然地降低 (亦即，在不向培養物添加進一步的 Fe 的情況下)。

藉由以下可以維持指定細胞培養物之細胞培養基中的 Fe 離子濃度低於某個閾值 (例如＜60 µM；例如＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者，例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 且/或可以維持細胞培養物中 Fe 之濃度低於某個閾值 (例如＜1.5 fmol/細胞；例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如.≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞)：在培養週期期間不向細胞培養物添加 Fe 或含 Fe 化合物，或者在培養週期期間僅將 Fe/含 Fe 化合物引入至細胞培養物，使得細胞培養基中的 Fe 離子濃度/細胞培養物中 Fe 之濃度不超過相關閾值。例如，在其中培養物為饋料批式或連續培養物的實施例中，在培養週期期間向細胞培養物添加的細胞培養基可能缺乏 Fe/含 Fe 化合物 (亦即可能為無 Fe 的)，或者可以依此種量包含 Fe/含 Fe 化合物，使得在向培養物添加細胞培養基後，細胞培養物之細胞培養基中的 Fe 離子濃度不超過相關閾值 (亦即＜60 µM；＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM)，且/或使得在向培養物添加細胞培養基後，細胞培養物中 Fe 之濃度不超過相關閾值 (亦即＜1.5 fmol/細胞；例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞)。

相反，藉由以下可以維持指定細胞培養物之細胞培養基中的 Fe 離子濃度處於或高於某個閾值 (例如＞0 µM) 且/或可以維持細胞培養物中 Fe 之濃度高於某個閾值 (例如＞0 fmol/細胞)：在培養週期期間以某一濃度向細胞培養物添加 Fe/含 Fe 化合物，使得在添加後，細胞培養物之細胞培養基中的 Fe 離子濃度/細胞培養物中 Fe 之濃度係處於或高於相關閾值。例如，在其中培養物為饋料批式或連續培養物的實施例中，在培養週期期間向細胞培養物添加的細胞培養基可以依某一濃度包含 Fe/含 Fe 化合物，使得在向培養物添加細胞培養基後，細胞培養物之細胞培養基中的 Fe 離子濃度為＞0 µM，且/或使得在向培養物添加細胞培養基後，細胞培養物中 Fe 之濃度為＞0 fmol/細胞。

在依據本揭露向細胞培養物提供 Fe 或含 Fe 化合物的情況下，它們可以依包含 Fe (例如在基礎調配物中) 或含 Fe 化合物的細胞培養基之形式或者依包含 Fe 或含 Fe 化合物的細胞培養基補充劑或添加劑之形式來提供。例如，Fe 可以依硝酸鐵、硫酸亞鐵及/或檸檬酸鐵之形式來提供。本文描述了在基礎調配物中包含 Fe 的細胞培養基。

可以在包含硝酸鐵的細胞培養基中提供硝酸鐵。包含硝酸鐵的細胞培養基包括達爾柏克氏改良型伊格爾氏培養基 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、格拉斯哥氏改良型伊格爾氏培養基 (Glascow Modified Eagle's Medium，GMEM)、H-Y 培養基、培養基 199、威廉氏培養基 E 及 DMEM/漢氏營養混合物 F-12 (50:50)。可以在包含硫酸亞鐵的細胞培養基中提供硫酸亞鐵。包含硫酸亞鐵的細胞培養基包括 F-12 庫恩氏改良物 (F-12 Coon's Modification)、漢氏 F-10 (Ham's F-10)、漢氏 F-12、漢氏 F-12 凱恩氏改良物 (Ham's F-12 Kaighn's Modification，F12K)、MCDB 培養基及 DMEM/漢氏營養混合物 F-12 (50:50)。

包含編碼根據本揭露之多肽的核酸的細胞

生產根據本揭露之多肽 (亦即，包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列的多肽) 之方法包含培養包含編碼該多肽的核酸的細胞。生產根據本揭露之多肽複合物 (亦即，包含組成多肽，該組成多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列) 之方法包含培養包含編碼該多肽複合物之組成多肽的核酸的細胞。

本揭露提供了方法，該等方法包含培養包含編碼根據本揭露之多肽的核酸或複數種核酸的細胞。在一些實施例中，核酸包含以下或由以下組成：DNA 及/或 RNA。

本揭露之多肽可藉由編碼多肽之 RNA 的轉譯來在細胞內產生。本揭露之多肽可藉由來自編碼多肽之核酸的轉錄以及隨後經轉錄之 RNA 的轉譯來在細胞內產生。

在一些實施例中，細胞包含編碼根據本揭露之多肽的核酸或複數種核酸，以及根據本揭露之多肽與其締合以形成多肽複合物的一種或多種附加多肽。亦即，在一些實施例中，細胞包含編碼多肽複合物之組成多肽的核酸或複數種核酸，其中多肽複合物之組成多肽中之一者或多者為包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列的多肽。例如，在一些實施例中，細胞包含編碼抗原結合多肽複合物的核酸或複數種核酸，其中抗原結合多肽複合物之組成多肽中之一者或多者為包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列的多肽。

在一些實施例中，核酸可以為一種載體或複數種載體，或者可以包含/含有在一種載體或複數種載體中。本文所用的「載體」係用作將外源性核酸轉移至細胞內的媒介物的核酸分子。因此，根據本揭露之細胞可包含一種載體或複數種載體，其包含根據本揭露之一種核酸或複數種核酸。

根據本揭露之多肽複合物可以由不同載體中提供的核酸編碼。例如，多肽複合物之組成多肽中之一者或多者可以由第一載體之核酸編碼，且多肽複合物之組成多肽中之一者或多者可以由第二載體之核酸編碼。在一些實施例中，載體可以包含編碼根據本揭露之多肽複合物之組成多肽的核酸的多個非重疊拷貝。

載體可促進將核酸輸送至細胞，該等核酸編碼根據本揭露之多肽。載體可以為表現載體，其包含表現根據本揭露之多肽所需的元件。載體可包含促進將核酸整合到向其中引入載體的細胞的基因體 DNA 中的元件。

載體可以為用於在細胞中表現核酸的載體(亦即表現載體)。此類載體可以包含啟動子序列，該啟動子序列可操作地連接至編碼根據本揭露之多肽的核苷酸序列。載體亦可以包含終止密碼子 (亦即，載體之核苷酸序列中的 3' 至編碼多肽的核苷酸序列) 及表現增強子。本領域已知的任何合適的載體、啟動子、增強子及終止密碼子可用於從根據本揭露之載體表現肽或多肽。

術語「可操作地連接」可以包括以下情況：其中編碼根據本揭露之多肽的核酸以及調節核酸序列 (例如，啟動子及/或增強子) 以此類方式共價連接，以將編碼多肽的核酸之表現置於調節核酸序列之影響或控制下 (從而形成表現卡匣)。因此，如果調節性序列能夠影響核酸序列的轉錄，則該調節性序列可操作連接至所選擇的核酸序列。然後可以將所得轉錄本轉譯為所期望之多肽。

預期與本揭露相關之載體包括 DNA 載體、RNA 載體、質體 (例如結合質體 (例如F 質體)、非結合質體、R 質體、col 質體、因子副體)、病毒載體 (例如逆轉錄病毒載體，例如γ 逆轉錄病毒載體 (例如鼠白血病病毒 (MLV) 衍生的載體，例如SFG 載體)、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、牛痘病毒載體及疱疹病毒載體)、基於轉位子之載體及人工染色體 (例如酵母人工染色體)，例如，如 Maus等人, Annu Rev Immunol. (2014) 32:189-225 以及 Morgan 及 Boyerinas, Biomedicines (2016) 4:9 中所述，兩者均特此藉由引用整體併入。在一些實施例中，根據本揭露的載體為慢病毒載體。

在一些實施例中，載體可以為真核細胞載體，亦即包含在真核細胞中從載體表現蛋白質所必需的元件的載體。在一些實施例中，載體可以為哺乳動物載體，例如包含細胞巨大病毒 (CMV) 或 SV40 啟動子以驅動蛋白質表現。

應當理解，當本文中以單數形式提及細胞 (亦即「一/該細胞」)時，亦涵蓋此類細胞的複數/群體。

根據本揭露之細胞可為真核細胞，例如哺乳動物細胞。哺乳動物可以為靈長類動物 (恒河獼猴、食蟹獼猴、非人類靈長類動物或人類) 或非人類哺乳動物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他囓齒動物 (包括囓齒目中之任何動物)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛類(包括牛，例如奶牛，或牛目中之任何動物)、馬 (包括馬科中之任何動物)、驢及非人類靈長類動物)。在較佳實施例中，細胞為人類細胞。

在一些實施例中，細胞為或源自通常用於多肽之表現的細胞類型，該等多肽用於人類之療法。例示性細胞係描述於例如Kunert 及 Reinhart, Appl Microbiol Biotechnol. (2016) 100:3451–3461 (特此藉由引用以其整體併入)，且包括例如CHO (CVCL_0213)、HEK 293 (CVCL_0045)、PER.C6 (CVCL_G704)、NS0 (CVCL_3940) 及 BHK (CVCL_1914) 細胞。在較佳的實施例中，細胞為或源自 CHO 細胞。

應瞭解，細胞較佳地為表現離胺醯基羥化酶及/或脯胺醯基羥化酶的細胞。在一些實施例中，細胞會表現 PLOD (例如PLOD1、PLOD2 或 PLOD3)、JMJD4、JMJD6 及/或 JMJD7。在一些實施例中，細胞會表現 PLOD (例如PLOD1、PLOD2 及/或 PLOD3)。在一些實施例中，細胞會表現膠原蛋白原-脯胺酸 4-二氧酶、膠原蛋白原-脯胺酸 3-二氧酶及/或脯胺酸 3-羥化酶。

可採用任何合適的方法來生產用於本揭露之方法中的細胞。此類方法可包含核酸轉移以用於所轉移之核酸的永久(亦即穩定) 或瞬時表現。在一些實施例中，在引入到細胞內之後，編碼感興趣之多肽的核酸可以被整合到細胞之基因體 DNA 中或形成細胞之基因體 DNA 之一部分。在一些實施例中，在引入到細胞內之後，編碼感興趣之多肽的核酸可以被維持在染色體外。

任何合適的基因工程平台皆可以使用，且包括 γ 逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、DNA 轉染、基於轉位子的基因遞送及 RNA 轉染，例如，如在 Maus等人, Annu Rev Immunol. (2014) 32:189-225 中所述，其藉由引用以其整體併入本文。方法亦包括彼等例如在Wang 與 Rivière Mol Ther Oncolytics.(2016) 3:16015 中所述者，其藉由引用以其整體併入本文。用於將核酸/載體引入細胞內的合適方法包括轉導、轉染及電穿孔。

生產多肽之方法

本揭露之態樣及實施例涉及生產多肽之方法，且涉及生產多肽複合物之方法。

該等方法包含在適合於表現多肽的條件下培養包含編碼多肽的核酸的細胞。在涉及多肽複合物之生產的實施例中，該等方法可以包含在適合於多肽複合物之組成多肽彼此締合的條件下培養細胞，以形成多肽複合物。

適合的培養條件對於所屬技術領域中具有通常知識者而言係顯而易見的。適合的培養條件包括用於從哺乳動物細胞表現抗體的條件，如描述於例如Birch 及 Racher, Adv Drug Deliv Rev. (2006) 58(5-6):671-85 及 Li等人，MAbs (2010) 2(5):466-477 中，兩個文獻皆特此藉由引用以其整體併入。適合的培養條件亦包括適合於在活體外培養物中維持 CHO-K1 細胞株 (ATCC，目錄號 CCL-61；CVCL_0214) 的細胞的條件。

將細胞在包含胺基酸、維生素、無機鹽及糖的細胞培養基中培養。在某些實施例中，細胞培養基包含選自以下之胺基酸：L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-胱胺酸/L-半胱胺酸、L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸及 L-纈胺酸。在某些實施例中，細胞培養基包含選自以下之維生素及/或類維生素：D-生物素、氯化膽鹼、D-泛酸鈣、葉酸、肌醇、菸鹼醯胺、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺素及維生素 B12。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含選自下列之成分：氯化鈣、次黃嘌呤、亞麻油酸、鹽酸腐胺、丙酮酸、硫酸鎂、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、硫辛酸及胸苷。在某些實施例中，細胞培養基包含 D-葡萄糖。

在一些實施例中，細胞培養基包含硝酸鐵及/或硫酸亞鐵。在一些實施例中，細胞培養基缺乏硝酸鐵及/或硫酸亞鐵。

在一些實施例中，細胞培養基為無血清的。在一些實施例中，細胞培養基為無蛋白質的。在一些實施例中，細胞培養基為 DMEM/F12 (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 11320033 之組成的 DMEM/F12) 或其功能等效物。在針對本發明的意義內，DMEM 之功能等效物係指具有與 DMEM/F12 相似的組成且支援表現所關注蛋白質的重組 CHO 細胞之例示性培養物之生長的培養基。在一些實施例中，細胞培養基具有於 DMEM/F12 類似的組成。在一些實施例中，細胞培養基包含：(i) 胺基酸，例如甘胺酸、L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬胺酸、L-半胱胺酸、L-胱胺酸、L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸及 L-纈胺酸；(ii) 維生素及/或類維生素，例如生物素、氯化膽鹼、D-泛酸鈣、葉酸、菸鹼醯胺、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素 B12 及肌醇；氯化鈣、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉及硫酸鋅；以及 D-葡萄糖 (右旋糖)、次黃嘌呤鈉、亞麻油酸、硫辛酸、酚紅、腐胺 2HCl、丙酮酸鈉及胸苷。

在某些實施例中，細胞培養基為適合於哺乳動物細胞培養之細胞培養基。此等細胞培養基包括洛斯維·帕克紀念研究所 (Roswell Park Memorial Institute，RPMI) 1640 培養基 (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 11875093 之組成)、達爾柏克氏改良型伊格爾氏培養基 (DMEM；例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 11965084 之組成)、F-12 培養基 (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 11765047 之組成)、DMEM/F12 (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 11320033 之組成)、CD-CHO 培養基 (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 10743011 之組成)、PowerCHO 培養基 (例如具有 Lonza 目錄號 BELN12-771Q 之組成) 以及 HyClone™ ActiPro™ 細胞培養基 (例如具有 Cytiva 目錄號 SH31039.01 之組成)。

在較佳實施例中，細胞培養基為用於培養細胞以生產用於人類療法中之分子的適合的細胞培養基。此種培養基包括例如EX-CELL Advanced CHO 饋料批式培養基 (例如具有 Sigma-Aldrich 目錄號 14366C 之組成)。

在一些實施例中，細胞培養基為基礎配方中缺乏鐵的細胞培養基。此等細胞培養基包括 α-MEM 培養基 (亦稱為 MEMα；例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 21010046 之組成)、艾姆斯氏培養基 (Ames' Medium) (例如具有 Sigma-Aldrich 目錄號 A1420 之組成)、伊格爾氏基礎培養基 (BME；例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 21010046 之組成)、BGJb 培養基菲頓-傑克孫改良物 (BGJb Medium Fitton-Jackson Modification) (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 12591038 之組成)、克利克氏培養基 (Click's Medium) (例如具有 Sigma-Aldrich 目錄號 C5572 之組成)、CMRL-1066 培養基 (例如具有 Sigma-Aldrich 目錄號 C0422 之組成)、費雪氏培養基 (Fischer's Medium) (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 21475025 之組成)、伊斯科夫氏改良型達爾柏克氏培養基 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) (IMDM；例如具有 Sigma-Aldrich 目錄號 I3390 之組成)、L-15 (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 11415064 之組成)、邁克伊氏 5A 改良型培養基 (McCoy's 5A Modified Medium) (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 16600082 之組成)、RPMI-1640 (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 11875093 之組成)、斯維姆氏 S-77 培養基 (Swim's S-77 Medium) (例如具有 Sigma-Aldrich 目錄號 S2513 之組成) 以及威貿司培養基 MB (Waymouth Medium MB) (例如具有 ThermoFisher Scientific 目錄號 11220035 之組成)。

在一些實施例中，該等方法包含：

在包含鐵 (例如在基礎配方中包含鐵) 的細胞培養基中或在具有 ≥40 µM (例如≥45 µM、≥60 µM) 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養包含用於表現根據本揭露之多肽的核酸的細胞；以及

隨後在缺乏鐵 (例如在基礎配方中缺乏鐵) 的細胞培養基中或在具有＜60 µM (例如＜40 µM；例如，≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者，例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養該等細胞。

在一些實施例中，該等方法包含：

在細胞培養基中培養包含用於表現根據本揭露之多肽的核酸的細胞，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≥1.5 fmol/細胞；以及

隨後在細胞培養基中培養該等細胞，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞 (例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞)。

依據此等實施例，該等方法可以包含從細胞培養物去除包含鐵的細胞培養基或具有 ≥40 µM (例如≥45 µM、≥60 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基，且將其替換為缺乏鐵的細胞培養基或具有＜60 µM (例如＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者，例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基。

在一些實施例中，具有 ≥40 µM 的 Fe 離子濃度的細胞培養基可以藉由添加缺乏鐵的細胞培養基或具有＜60 µM (例如＜45 µM、＜40 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基而被調整為具有 60 µM (例如＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者，例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度，由此將細胞培養物之細胞培養基之 Fe 離子濃度降低至低於相關閾值。亦即，具有 ≥40 µM (例如≥45 µM、≥60 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基可以利用缺乏鐵的細胞培養基或具有＜60 µM (例如＜45 µM、＜40 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基來稀釋以達到具有＜60 µM (例如＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者，例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度。

在一些實施例中，缺乏鐵的細胞培養基或具有＜60 µM (例如＜45 µM、＜40 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基可以添加至具有 ≥1.5 fmol/細胞的平均 Fe 濃度的培養物中的細胞培養，以便在細胞培養物中達到＜1.5 fmol/細胞 (例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞) 的 Fe 之濃度。

將細胞培養在包含鐵的細胞培養基或具有 ≥40 µM (例如≥45 µM、≥60 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基中持續一時間週期可以向細胞提供重要細胞過程在缺乏鐵的細胞培養基或具有＜60 µM (例如＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者，例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基中的隨後培養期間所需要的足夠之鐵。亦即，包含鐵的細胞培養基或具有 ≥40 µM 的 Fe 離子濃度的細胞培養基中的初始培養週期可以向培養物中的細胞提供足夠之鐵，以便在缺乏鐵的細胞培養基或具有＜60 µM (例如＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者，例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基中的隨後培養週期期間不會實質地損害重要細胞過程。

在一些實施例中，該等方法包含：在細胞培養基中培養包含用於表現根據本揭露之多肽的核酸的細胞，該細胞培養基係選自達爾柏克氏改良型伊格爾氏培養基 (DMEM)、格拉斯哥氏改良型伊格爾氏培養基 (GMEM)、H-Y 培養基、培養基 199、威廉氏培養基 E、DMEM/漢氏營養混合物 F-12 (50:50)、F-12 庫恩氏改良物、漢氏 F-10、漢氏 F-12、漢氏 F-12 凱恩氏改良物 (F12K) 及 MCDB 培養基；以及隨後在細胞培養基中培養該等細胞，該細胞培養基係選自 α-MEM 培養基、艾姆斯氏培養基、伊格爾氏基礎培養基 (BME)、BGJb 培養基菲頓-傑克孫改良物、克利克氏培養基、CMRL-1066 培養基：費雪氏培養基、伊斯科夫氏改良型達爾柏克氏培養基 (IMDM)、L-15、邁克伊氏 5A 改良型培養基、RPMI-1640、斯維姆氏 S-77 培養基、威貿司培養基 MB 及 HyClone™ ActiPro™ 細胞培養基。

應瞭解，將細胞在適合的環境條件下培養。

可以於 29℃ 至 38℃ (例如34.5℃ 至 37.5℃)，例如於約 34.5℃、約 35℃、約 35.5℃、約 36℃、約 36.5℃、約 37℃ 或約 37.5℃ 中之一者培養該等細胞。在一些實施例中，可以於 35℃ (±1℃) 培養該等細胞。

可以在 4% 至 10% CO₂(例如，5% 至 8% CO₂) 中培養細胞。

細胞可在例如 ≥90% 濕度，例如約 95% 濕度下培養。

可在不攪拌的情況下或在攪拌的情況下培養細胞。攪拌可以 75 rpm 至 175 rpm，例如90 rpm 至 130 rpm，例如約 110 rpm 進行。

細胞培養物之 pH 可在 6.8 至 7.4 之間，例如約 6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3 或 7.4 中之一者。在某些實施例中，細胞培養物之 pH 為約 7.0。在某些實施例中，細胞培養物之 pH 為約 7.2。

細胞培養可在提供有適當供應的營養物、空氣/氧氣及/或生長因子之生物反應器中進行。生物反應器可監測且控制環境條件，諸如 pH、氧氣、進出容器之流速以及容器內之攪拌，從而為所培養的細胞提供最佳條件。

培養可為連續培養，其中細胞培養基連續流入細胞培養容器，並且所培養的細胞連續流出細胞培養容器。在某些實施例中，培養可為分批培養，採用封閉系統及限量的細胞培養基。在某些實施例中，培養可為補料生長培養，其中在培養期間將細胞培養基供應至細胞培養容器，但其中與連續培養不同，在細胞培養過程中不自細胞培養容器中移除材料。

在某些實施例中，方法包含在培養週期期間向細胞培養物添加一或多種組分。在某些實施例中，方法包含在培養週期期間向細胞培養物添加細胞培養基。在某些實施例中，方法包含在培養週期期間向細胞培養物添加營養物。在某些實施例中，方法包含在培養週期期間向細胞培養物添加胺基酸。

在一些實施例中，在如前一段落所描述之培養週期期間向細胞培養物添加的成分不包含硝酸鐵或硫酸亞鐵。在一些實施例中，在如前一段落所描述之培養週期期間向細胞培養物添加的成分不包含 Fe 或含 Fe 化合物。亦即，在一些實施例中，在培養週期期間向細胞培養物添加的細胞培養基、營養物及/或胺基酸不包含 Fe 或含 Fe 化合物 (亦即為無 Fe 的)。

在一細胞培養週期後，可以例如從細胞培養物或細胞培養基分開/分離/純化經表現之所關注多肽或多肽複合物。

在一些實施例中，從具有＜60 µM (例如＜40 µM；例如，≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者，例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基分開/分離/純化所關注多肽或多肽複合物。在一些實施例中，沒有從具有 ≥40 µM 的 Fe 離子濃度的細胞培養基分開/分離/純化所關注多肽或多肽複合物。在一些實施例中，該方法包含從培養於缺乏鐵的細胞培養基或具有＜60 µM (例如＜40 µM；例如，≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者，例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基中的細胞分開/分離/純化經表現之所關注多肽或多肽複合物。

在一些實施例中，從具有＜1.5 fmol/細胞 (例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞) 的 Fe 之濃度的細胞培養物中的細胞之細胞培養基分開/分離/純化所關注多肽或多肽複合物。在一些實施例中，沒有從具有 ≥1.5 fmol/細胞的 Fe 之濃度的細胞培養物中的細胞之細胞培養基分開/分離/純化所關注多肽或多肽複合物。在一些實施例中，該方法包含從具有＜1.5 fmol/細胞 (例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞) 的 Fe 之濃度的細胞培養物中的細胞分開/分離/純化經表現之所關注多肽或多肽複合物。

經表現之所關注多肽或多肽複合物可以從培養物中的細胞分泌至細胞培養基中。可以藉由將培養基與細胞分隔 (例如藉由離心) 來收集所分泌的多肽或多肽複合物，且隨後從細胞培養基分離/純化所分泌的多肽或多肽複合物。

從包含異質蛋白質群體的組成物分離/純化經表現之所關注多肽或多肽複合物之技術為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的，且係描述於例如下列文獻中：Green 及 Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第 4 版)；Birch 及 Racher, Adv Drug Deliv Rev. (2006) 58(5-6):671-85；及 Murphy等人, Antibody Technology Journal (2016) 6:17-32，所有這些文獻藉由引用以其整體併入本文。

多肽/多肽複合物之大規模純化係通常基於親和層析法 (例如使用與所關注多肽/多肽複合物之組成多肽的一部分特異性結合的藥劑)。替代性地或另外，純化可包含藉由本領域技術人員所熟知之陰離子/陽離子交換層析、疏水交互作用層析及/或粒徑排阻層析進行純化。

各種純化步驟經設計為將細胞或培養基中的污染物蛋白質去除至 ppm 位準，並將 DNA 降低至 ppb 位準。根據所使用之製程，可能需要去除額外的特定污染物 (例如，浸出之蛋白 A/G)。純化可包含過濾 (例如使用 0.22 µm 過濾器) 以去除潛在的生物污染物。

除了污染物之外，亦可能期望或有必要去除不期望之產物，諸如聚集體及降解產物。

在一些實施例中，分離或純化根據本揭露之多肽/多肽複合物包含藉由下列中之一者或多者的分離/純化：親和層析法 (例如，蛋白 G 層析法或蛋白 A 層析法)、粒徑排阻層析法、高效液相層析法、超高效液相層析法及離子交換層析法。在一些實施例中，本揭露之方法包含藉由粒徑排阻層析法及/或毛細管電泳法來分開/分離/純化多肽/多肽複合物。

在分離/純化後，可以於適合之緩衝液中提供多肽/多肽複合物，例如用於儲存。如本文中所使用，「緩衝液」係指藉由酸-鹼結合物組分之作用來抵抗 pH 變化的緩衝溶液。包含根據本揭露之多肽的組成物可以包含緩衝液中的多肽 (例如，依包含該多肽的多肽複合物之形式)。

適當的緩衝液之實例包括乙酸鹽、組胺酸、組胺酸-精胺酸、組胺酸-甲硫胺酸及其他有機酸緩衝液。可以藉由緩衝液透析，將多肽緩衝液交換至所關注緩衝液中。

在一些實施例中，本揭露之方法包含將根據本揭露之多肽/多肽複合物調配為組成物，例如醫藥組成物。在一些實施例中，該等方法包含將多肽/多肽複合物或將包含多肽/多肽複合物的組成物與醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑混合。

進一步方法及用途

本揭露進一步提供了涉及包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列及/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列的多肽之生產以及包含此等多肽的多肽複合物之生產的方法。

提供了一種增加從培養物中的細胞生產的包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的胺基酸序列的多肽的產率 (或增加包含此種多肽的多肽複合物的產率) 之方法，其中該方法包含在細胞培養基中培養包含用於表現該多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞，且其中該方法包含將細胞培養基中的 Fe 離子濃度維持或調整為＜60 µM (例如＜40 µM；例如，≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM)。

亦提供了一種增加從培養物中的細胞生產的包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的胺基酸序列的多肽的產率 (或增加包含此種多肽的多肽複合物的產率) 之方法，其中該方法包含在細胞培養基中培養包含用於表現該多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞，且其中該方法包含維持或調整細胞培養基中的 Fe 離子濃度，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞 (例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞)。

亦提供了一種增加藉由在細胞培養基中培養包含用於表現多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞來生產的多肽 (或多肽複合物) 當中的包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的多肽的比例 (或增加包含此種多肽的多肽複合物的比例) 之方法，其中該方法包含將細胞培養基中的 Fe 離子濃度維持或調整為＜60 µM (例如＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM)。

亦提供了一種增加藉由在細胞培養基中培養包含用於表現多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞來生產的多肽 (或多肽複合物) 當中的包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的多肽的比例 (或增加包含此種多肽的多肽複合物的比例) 之方法，其中該方法包含維持或調整細胞培養基中的 Fe 離子濃度，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞 (例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞)。

亦提供了一種降低從培養物中的細胞生產的包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其羥基化之形式) 的胺基酸序列的多肽的產率 (或降低包含此種多肽的多肽複合物的產率) 之方法，其中該方法包含在細胞培養基中培養包含用於表現該多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞，且其中該方法包含將細胞培養基中的 Fe 離子濃度維持或調整為＜60 µM (例如＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM)。

亦提供了一種降低從培養物中的細胞生產的包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其羥基化之形式) 的胺基酸序列的多肽的產率 (或降低包含此種多肽的多肽複合物的產率) 之方法，其中該方法包含在細胞培養基中培養包含用於表現該多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞，且其中該方法包含維持或調整細胞培養基中的 Fe 離子濃度，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞 (例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞)。

亦提供了一種降低藉由在細胞培養基中培養包含用於表現多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞來生產的多肽 (或多肽複合物) 當中的包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其羥基化之形式) 的多肽的比例 (或降低包含此種多肽的多肽複合物的比例) 之方法，其中該方法包含將細胞培養基中的 Fe 離子濃度維持或調整為＜60 µM (例如＜40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM)。

亦提供了一種降低藉由在細胞培養基中培養包含用於表現多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞來生產的多肽 (或多肽複合物) 當中的包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其羥基化之形式) 的多肽的比例 (或降低包含此種多肽的多肽複合物的比例) 之方法，其中該方法包含維持或調整細胞培養基中的 Fe 離子濃度，使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞 (例如≤1.4 fmol/細胞、≤1.3 fmol/細胞、≤1.2 fmol/細胞、≤1.1 fmol/細胞、≤1 fmol/細胞、≤0.9 fmol/細胞、≤0.8 fmol/細胞、≤0.7 fmol/細胞、≤0.6 fmol/細胞、≤0.5 fmol/細胞、≤0.4 fmol/細胞、≤0.3 fmol/細胞、≤0.2 fmol/細胞或 ≤0.1 fmol/細胞；例如≤1 fmol/細胞；例如≤1.125 fmol/細胞；例如≤0.75 fmol/細胞；例如≤0.375 fmol/細胞)。

在一些實施例中，「維持或調整細胞培養基中的 Fe 離子濃度」可以包含減小細胞培養基中的 Fe 離子濃度。在此等實施例中，該等方法可以包含添加細胞培養基 (該細胞培養基具有低於向其添加該細胞培養基的細胞培養基的 Fe 離子濃度的 Fe 離子濃度)，或向細胞培養物添加缺乏 Fe 的細胞培養基 (或適當的緩衝液或水) (藉此稀釋細胞培養物之細胞培養基中的 Fe 離子，且因此減小 Fe 離子濃度)。

本揭露進一步提供了包含 Fe 離子之某些濃度的細胞培養基在涉及包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列及/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列的多肽之生產以及包含此等多肽的多肽複合物之生產的方法中之用途。

亦提供了具有小於 60 µM (例如小於 40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基用以增加從培養物中的細胞生產的包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的胺基酸序列的多肽的產率 (或用以增加包含此種多肽的多肽複合物的產率) 之用途。

亦提供了具有小於 60 µM (例如小於 40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基用以增加藉由培養包含用於表現多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞來生產的多肽 (或多肽複合物) 當中的包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的多肽的比例 (或用以增加包含此種多肽的多肽複合物的比例) 之用途。

亦提供了具有小於 60 µM (例如小於 40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基用以降低從培養物中的細胞生產的包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其羥基化之形式) 的胺基酸序列的多肽的產率 (或用以降低包含此種多肽的多肽複合物的產率) 之用途。

亦提供了具有小於 60 µM (例如小於 40 µM；例如≤37.5 µM、≤35 µM、≤32.5 µM、≤30 µM、≤27.5 µM、≤25 µM、≤22.5 µM、≤20 µM、≤17.5 µM、≤15 µM、≤12.5 µM、≤10 µM、≤7.5 µM、≤5 µM 或 ≤2.5 µM 中之一者；例如≤10 µM；例如≤45 µM；例如≤30 µM；例如≤15 µM) 的 Fe 離子濃度的細胞培養基用以降低藉由培養包含用於表現多肽 (或多肽複合物) 的核酸的細胞來生產的多肽 (或多肽複合物) 當中的包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其羥基化之形式) 的多肽的比例 (或用以降低包含此種多肽的多肽複合物的比例) 之用途。

包含易發生羥基化的非羥基化之形式的離胺酸 / 脯胺酸殘基的多肽 / 多肽複合物的增加之產率及比例，以及包含易發生羥基化的羥基化之形式的離胺酸 / 脯胺酸殘基的多肽 / 多肽複合物的降低之產率及比例

如本文所解釋，依據本文所描述之培養條件來培養包含編碼多肽 (包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列及/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基的胺基酸序列) 的核酸的細胞會增加包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的多肽之產率 (或增加包含此種多肽的多肽複合物之產率)，且/或會增加藉由培養物中的細胞生產的多肽/多肽複合物當中的包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的多肽之比例 (或增加包含此等多肽的多肽複合物之比例)，且/或會降低包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其羥基化之形式) 的多肽之產率 (或降低包含此種多肽的多肽複合物之產率)，且/或會降低藉由培養物中的細胞生產的多肽/多肽複合物當中的包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其羥基化之形式) 的多肽之比例 (或降低包含此等多肽的多肽複合物之比例)。

應瞭解，指定形式 (例如，包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基 (依其羥基化或非羥基化之形式) 的形式) 之指定多肽/多肽複合物之「產率」係指所生產的指定多肽/多肽複合物之量/數量。類似地應瞭解，指定形式之指定多肽/多肽複合物在不同形式之指定多肽/多肽複合物當中的「比例」係指該指定形式之指定多肽/多肽複合物在所生產的不同形式之指定多肽/多肽複合物之總合計量/數量內的分數/百分比。

舉例而言，在包含多肽 (包含包括易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基的胺基酸序列) 的多肽複合物之群體內，包含具有離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的多肽的多肽複合物之比例為多肽複合物之群體中的多肽複合物 (其等為包含具有離胺酸/脯胺酸殘基 (依其非羥基化之形式) 的多肽的多肽複合物) 之總量/數量之分數/百分比。

指定形式之指定多肽的或包含指定形式之指定多肽的多肽複合物的「增加」或「減小」之產率/比例可以相對於藉由依據從培養物中的細胞表現多肽/多肽複合物之參考方法培養相同種類之細胞獲得的此等多肽/多肽複合物之產率/比例來增加/減小。

從培養物中的細胞表現多肽/多肽複合物之參考方法可以為其中不在具有小於 40 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養細胞持續大部分之培養週期之方法。例如，在參考方法中，可以在具有 ≥40 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中培養細胞，持續大部分之培養週期。

從培養物中的細胞表現多肽/多肽複合物之參考方法可以為其中不在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為＜1.5 fmol/細胞的條件下培養細胞持續大部分之培養週期之方法。例如，在參考方法中，可以在使得細胞培養物中 Fe 之濃度為 ≥1.5 fmol/細胞的條件下培養細胞，持續大部分之培養週期。

指定形式之指定多肽的或包含指定形式之指定多肽的多肽複合物的「增加」之產率/比例係指這樣的產率/比例，其為藉由依據從培養物中的細胞表現多肽/多肽複合物之參考方法進行培養來獲得的產率/比例的大於 1 倍，例如≥1.01 倍、≥1.02 倍、≥1.03 倍、≥1.04 倍、≥1.05 倍、≥1.1 倍、≥1.2 倍、≥1.3 倍、≥1.4 倍、≥1.5 倍、≥1.6 倍、≥1.7 倍、≥1.8 倍、≥1.9 倍、≥2 倍、≥3 倍、≥4 倍、≥5 倍、≥6 倍、≥7 倍、≥8 倍、≥9 倍或 ≥10 倍中之一者。

指定形式之指定多肽的或包含指定形式之指定多肽的多肽複合物的「減小」之產率/比例係指這樣的產率/比例，其為藉由依據從培養物中的細胞表現多肽/多肽複合物之參考方法進行培養來獲得的產率/比例的小於 1 倍，例如≤0.99 倍、≤0.95 倍、≤0.9 倍、≤0.85 倍、≤0.8 倍、≤0.75 倍、≤0.7 倍、≤0.65 倍、≤0.6 倍、≤0.55 倍、≤0.5 倍、≤0.45 倍、≤0.4 倍、≤0.35 倍、≤0.3 倍、≤0.25 倍、≤0.2 倍、≤0.15 倍、≤0.1 倍、≤0.05 倍或 ≤0.01 倍中之一者。

在一些實施例中，本揭露之方法產生包含胺基酸序列 (包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基) 的多肽之群體 (或產生包含此等多肽的多肽複合物之群體)，其中包含胺基酸序列 (包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基) 的多肽中 ≤25% 之多肽包含在相關位置處的羥基化之形式的殘基。在一些實施例中，多肽之 ≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1% 包含在相關位置處的羥基化之形式的殘基。在一些實施例中，多肽之 ≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10% 包含在相關位置處的羥基化之形式的殘基。在一些實施例中，多肽之 ≤20% 且 ≥5% (例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在相關位置處的羥基化之形式的殘基。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽包含如 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，且生產如本披露之多肽之方法 (或生產包含該多肽的多肽複合物之方法) 產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含如 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。在一些實施例中，根據本揭露之多肽包含如 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列，且生產如本披露之多肽之方法 (或生產包含該多肽的多肽複合物之方法) 產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含如 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:2 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽包含如 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，且生產如本披露之多肽之方法 (或生產包含該多肽的多肽複合物之方法) 產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含如 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:5 之位置 3 相對應的位置處的羥基離胺酸。在一些實施例中，根據本揭露之多肽包含如 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列，且生產如本披露之多肽之方法 (或生產包含該多肽的多肽複合物之方法) 產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含如 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:7 之位置 6 相對應的位置處的羥基離胺酸。在一些實施例中，根據本揭露之多肽包含如 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列，且生產如本披露之多肽之方法 (或生產包含該多肽的多肽複合物之方法) 產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含如 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:9 之位置 11 相對應的位置處的羥基離胺酸。在一些實施例中，根據本揭露之多肽包含如 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列，且生產如本披露之多肽之方法 (或生產包含該多肽的多肽複合物之方法) 產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含如 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:11 之位置 10 相對應的位置處的羥基離胺酸。

在一些實施例中，如本揭露之多肽/多肽複合物包含如 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，且包含：(i) VH 區，其包含 HC-CDR1、HC-CDR2 及 HC-CDR3，如表 A 之列 A 所指示；及 (ii) VL 區，其包含 LC-CDR1、LC-CDR2 及 LC-CDR3，如表 A 之列 B 所指示，其中列 A 及 B 之序列係選自表 A 之同一行；且生產如本披露之多肽/多肽複合物之方法產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含如 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽/多肽複合物包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，且包含：(i) VH 區，其包含 SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:125 及 SEQ ID NO:133；及 (ii) VL 區，其包含 SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130；且生產根據本披露之多肽/多肽複合物之方法產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽/多肽複合物包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，且包含：(i) VH 區，其包含表 B 之列 A 所指示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；及 (ii) VL 區，其包含表 B 之列 B 所指示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，其中列 A 及 B 之序列係選自表 B 之同一行；且生產根據本披露之多肽/多肽複合物之方法產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽/多肽複合物包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，且包含：(i) VH 區，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:131；及 (ii) VL 區，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:127；且生產根據本披露之多肽/多肽複合物之方法產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物包含：(i) 具有 SEQ ID NO:93 之胺基酸序列的多肽、(ii) 具有 SEQ ID NO:94 之胺基酸序列的多肽、(iii) 具有 SEQ ID NO:95 之胺基酸序列的多肽及 (iv) 具有 SEQ ID NO:116 之胺基酸序列的多肽；且生產根據本披露之多肽複合物之方法產生多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:93 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:93 之位置 346 相對應的位置處的羥基離胺酸。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物包含：(i) 具有 SEQ ID NO:97 之胺基酸序列的多肽、(ii) 具有 SEQ ID NO:98 之胺基酸序列的多肽、(iii) 具有 SEQ ID NO:99 之胺基酸序列的多肽及 (iv) 具有 SEQ ID NO:116 之胺基酸序列的多肽；且生產根據本披露之多肽複合物之方法產生多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:97 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:97 之位置 350 相對應的位置處的羥基離胺酸。

在一些實施例中，根據本揭露之多肽複合物包含：(i) 具有 SEQ ID NO:86 之胺基酸序列的多肽、(ii) 具有 SEQ ID NO:153 之胺基酸序列的多肽、(iii) 具有 SEQ ID NO:154 之胺基酸序列的多肽及 (iv) 具有 SEQ ID NO:155 之胺基酸序列的多肽；且生產根據本披露之多肽複合物之方法產生多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:153 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:153 之位置 350 相對應的位置處的羥基離胺酸。

多肽及多肽複合物之群體

本揭露提供了根據本揭露之多肽之群體以及根據本揭露之多肽複合物之群體。應瞭解，此等多肽/多肽複合物之群體包含複數種相關多肽/多肽複合物。

舉例而言，具有如 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的根據本揭露之多肽之群體包含各自具有根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的複數種 (亦即，兩種或更多種) 多肽。在較佳實施例中，複數種多肽中之多肽具有相同的胺基酸序列。依據前一句，「相同的胺基酸序列」忽略多肽之胺基酸序列之胺基酸的羥基化狀態。因此，兩種多肽 (其除多肽中之一者在指定位置處包含羥基離胺酸殘基而另一種多肽在指定位置處包含離胺酸殘基之外係相同的) 仍然被認為具有「相同的胺基酸序列」。

進一步舉例而言，包含具有根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的多肽的根據本揭露之多肽複合物之群體包含各自包含具有根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的多肽的複數種 (亦即，兩種或更多種) 多肽複合物。在較佳實施例中，複數種多肽複合物包含相同的多肽；亦即，各多肽複合物包含具有相同的胺基酸序列的相同的多肽組合。例如，在藉由 (i) 具有 SEQ ID NO:93 之胺基酸序列的多肽、(ii) 具有 SEQ ID NO:94 之胺基酸序列的多肽、(iii) 具有 SEQ ID NO:95 之胺基酸序列的多肽及 (iv) 具有 SEQ ID NO:116 之胺基酸序列的多肽之間的締合形成的多肽複合物之群體中，各多肽複合物包含多肽 (i) 至 (iv)。

本揭露提供了藉由根據本揭露之方法獲得的或可獲得的多肽之群體及多肽複合物之群體。

本揭露提供了包含胺基酸序列 (包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基) 的多肽之群體或包含此種多肽的多肽複合物之群體，其中包含胺基酸序列 (包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基) 的多肽之 ≤25% 包含在相關位置處的羥基化之形式的殘基。在一些實施例中，多肽之 ≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1% 包含在相關位置處的羥基化之形式的殘基。在一些實施例中，多肽之 ≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10% 包含在相關位置處的羥基化之形式的殘基。在一些實施例中，多肽之 ≤20% 且 ≥5% (例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在相關位置處的羥基化之形式的殘基。

依據前一段落，「包含胺基酸序列 (包含易發生羥基化的離胺酸/脯胺酸殘基) 的多肽之群體」中的多肽可以選自本文所描述之多肽之任何實施例，例如，在上文標題為「多肽及多肽複合物」的章節或標題為「特定例示性多肽及多肽複合物」的章節中描述的多肽。類似地，在前一段落中提到的多肽複合物可以選自本文所描述之多肽複合物之任何實施例，例如，在上文標題為「多肽及多肽複合物」的章節或標題為「特定例示性多肽及多肽複合物」的章節中描述的多肽複合物。

本揭露提供了包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的多肽之群體或包含此種多肽的多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的群體中的多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。本揭露提供了包含根據 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的多肽之群體或包含此種多肽的多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的群體中的多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:2 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

本揭露提供了包含根據 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的多肽之群體或包含此種多肽的多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的群體中的多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:5 之位置 4 相對應的位置處的羥基離胺酸。本揭露提供了包含根據 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列的多肽之群體或包含此種多肽的多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列的群體中的多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:7 之位置 6 相對應的位置處的羥基離胺酸。本揭露提供了包含根據 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的多肽之群體或包含此種多肽的多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的群體中的多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:9 之位置 11 相對應的位置處的羥基離胺酸。本揭露提供了包含根據 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的多肽之群體或包含此種多肽的多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的群體中的多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:11 之位置 10 相對應的位置處的羥基離胺酸。

亦提供了多肽/多肽複合物之群體，其包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，且包含：(i) VH 區，其包含 HC-CDR1、HC-CDR2 及 HC-CDR3，如表 A 之列 A 所指示；及 (ii) VL 區，其包含 LC-CDR1、LC-CDR2 及 LC-CDR3，如表 A 之列 B 所指示，其中列 A 及 B 之序列係選自表 A 之同一行；其中包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

亦提供了多肽/多肽複合物之群體，其包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，且包含：(i) VH 區，其包含 SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:125 及 SEQ ID NO:133；及 (ii) VL 區，其包含 SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130；其中包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

亦提供了多肽/多肽複合物之群體，其包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，且包含：(i) VH 區，其包含表 B 之列 A 所指示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；及 (ii) VL 區，其包含表 B 之列 B 所指示之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，其中列 A 及 B 之序列係選自表 B 之同一行；其中包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

亦提供了多肽/多肽複合物之群體，其包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，且包含：(i) VH 區，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:131；及 (ii) VL 區，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:127；且生產根據本揭露之多肽/多肽複合物之方法產生多肽/多肽複合物之群體，其中包含根據 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:1 之位置 2 相對應的位置處的羥基離胺酸。

亦提供了多肽複合物之群體，該等多肽複合物包含：(i) 具有 SEQ ID NO:93 之胺基酸序列的多肽、(ii) 具有 SEQ ID NO:94 之胺基酸序列的多肽、(iii) 具有 SEQ ID NO:95 之胺基酸序列的多肽及 (iv) 具有 SEQ ID NO:116 之胺基酸序列的多肽；其中包含根據 SEQ ID NO:93 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:93 之位置 346 相對應的位置處的羥基離胺酸。

亦提供了多肽複合物之群體，該等多肽複合物包含：(i) 具有 SEQ ID NO:97 之胺基酸序列的多肽、(ii) 具有 SEQ ID NO:98 之胺基酸序列的多肽、(iii) 具有 SEQ ID NO:99 之胺基酸序列的多肽及 (iv) 具有 SEQ ID NO:116 之胺基酸序列的多肽；其中包含根據 SEQ ID NO:97 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:97 之位置 350 相對應的位置處的羥基離胺酸。

亦提供了多肽複合物之群體，該等多肽複合物包含：(i) 具有 SEQ ID NO:86 之胺基酸序列的多肽、(ii) 具有 SEQ ID NO:153 之胺基酸序列的多肽、(iii) 具有 SEQ ID NO:154 之胺基酸序列的多肽及 (iv) 具有 SEQ ID NO:155 之胺基酸序列的多肽；其中包含根據 SEQ ID NO:153 之胺基酸序列的該等多肽之 ≤25% (例如≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2% 或 ≤1%；例如≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11% 或 ≤10%；≤20% 且 ≥5%，例如≤19% 且 ≥6%、≤18% 且 ≥7%、≤17% 且 ≥8%、≤16% 且 ≥9% 或 ≤15% 且 ≥10% 中之一者) 包含在與 SEQ ID NO:153 之位置 350 相對應的位置處的羥基離胺酸。

可以在組成物中提供根據本揭露之多肽之群體或多肽複合物之群體。此等組成物可以包含在適合於臨床使用的調配物中的多肽/多肽複合物。此等組成物可以稱為「醫藥組成物」或「藥物」。根據本揭露之組成物可以包含一種或多種醫藥上可接受之載劑 (例如脂質體、微胞、微球、奈米顆粒)、稀釋劑/賦形劑 (例如澱粉、纖維素、纖維素衍生物、多元醇、右旋糖、麥芽糖糊精、硬脂酸鎂)、佐劑、填充劑、緩沖劑、防腐劑 (例如維生素 A、維生素 E、維生素 C、棕櫚酸視黃酯、硒、半胱胺酸、甲硫胺酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、抗氧化劑 (例如維生素 A、維生素 E、維生素 C、棕櫚酸視黃酯、硒)、潤滑劑 (例如硬脂酸鎂、滑石粉、二氧化矽、硬脂酸、植物硬脂)、粘合劑 (例如蔗糖、乳糖、澱粉、纖維素、明膠、聚乙二醇 (PEG)、聚乙烯吡咯啶酮 (PVP)、木糖醇、山梨醇、甘露醇)、穩定劑、增溶劑、界面活性劑 (例如，潤濕劑)、掩蔽劑或著色劑 (例如二氧化鈦)。

本文使用的術語「醫藥上可接受之」涉及化合物、成分、材料、組成物、劑型等，其在合理的醫學判斷之範圍內適合與所討論的個體之組織接觸使用(例如人類個體)而沒有過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的益處/風險比相稱。根據本揭露之組成物之各載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑、填充劑、緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、粘合劑、穩定劑、增溶劑、界面活性劑、掩蔽劑、著色劑、矯味劑或甜味劑亦必須在與調配物之其他組分相容的意義上為「可接受」的。適合的載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑、填充劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、粘合劑、穩定劑、增溶劑、界面活性劑、掩蔽劑、著色劑、矯味劑或甜味劑可以在例如標準醫藥教科書例如雷明頓 (Remington) 的「藥學科學與實踐」(The Science and Practice of Pharmacy) (A. Adejare 編) 第 23 版 (2020), Academic Press 中找到。

根據本揭露之組成物可以經調配用於向個體投予，例如，經由適於組成物之性質以及待治療/預防之疾病/病狀的投予途徑進行投予。在一些實施例中，組成物可以經調配用於腸胃外、全身性、局部、腔內、血管內、靜脈內、動脈內、肌內、鞘內腔、眼內、結膜內、腫瘤內、皮下、皮內、口服或經皮投予。在一些實施例中，組成物可以經調配用於藉由注射或輸注投予，或藉由攝入投予。組成物可以包含在無菌或等滲壓媒介物中的多肽/多肽複合物。組成物可以依流體 (包括凝膠) 形式來提供。流體調配物可以經調配用於藉由注射或輸注 (例如經由導管) 向人類或動物身體的血管或選定區域或者向腫瘤投予。組成物可以依固體形式 (例如依凍乾形式) 來提供。

序列同一性

如本文所用，「序列同一性」係指在比對序列並且如果需要的話引入缺口以實現序列之間的最大序列同一性百分比之後，個體序列中與參考序列中之核苷酸/胺基酸殘基相同的核苷酸/胺基酸殘基的百分比。為了確定兩個或更多個胺基酸或核酸序列之間的序列同一性百分比的目的的成對及多個序列比對可以以本領域技術人員已知的各種方式實現，例如，使用可公開獲得之電腦軟體諸如 ClustalOmega (Söding, J. Bioinformatics (2005) 21:951-960)、T-coffee (Notredame等人J Mol Biol (2000) 302:205-217)、Kalign (Lassmann 及 Sonnhammer BMC Bioinformatics (2005) 6(298)) 及 MAFFT (Katoh 及 Standley Molecular Biology and Evolution (2013) 30(4):772–780) 軟體。使用此類軟體時，較佳係使用默認參數，例如對於空位罰分及延伸罰分。

在較佳實施例中，為了評估胺基酸序列之間的序列同一性，忽略序列之胺基酸殘基的羥基化狀態。因此，例如，為了序列比較之目的，離胺酸及羥基離胺酸殘基被視為相同的胺基酸，且類似地，脯胺酸及羥基脯胺酸殘基被視為相同的胺基酸。

序列

SEQ ID NO:	描述	序列
1	離胺酸羥基化位點共同	X₁KX₂ 其中 X₁ = 任何胺基酸，X₂ = G、S 或 A
2	離胺酸羥基化位點共同 –位置 3 處的 G	X₁KG 其中 X₁ = 任何胺基酸
3	離胺酸羥基化位點共同 –位置 3 處的 A	X₁KA 其中 X₁ = 任何胺基酸
4	離胺酸羥基化位點共同 –位置 3 處的 S	X₁KS 其中 X₁ = 任何胺基酸
5	TCB mAb 離胺酸羥基化位點共同	STKGP
6	離胺酸羥基化肽序列 1	SSASTK
7	離胺酸羥基化肽序列 1 + G	SSASTKG
8	離胺酸羥基化肽序列 2	TLVTVSSASTK
9	離胺酸羥基化肽序列 2 + G	TLVTVSSASTKG
10	離胺酸羥基化肽序列 3	LTVLSSASTK
11	離胺酸羥基化肽序列 3 + G	LTVLSSASTKG
12	離胺酸羥基化肽序列 4	IKGGLFADIASHPWQAAIFAK
13	離胺酸羥基化肽序列 5	ILGNEGSFLTKGFSK
14	離胺酸羥基化肽序列 6	DCPTSCPTTCANGWECCKGYPCVNKACSGCTH
15	離胺酸羥基化肽序列 7	RSVDSTNNLPPRERKAGCKNFYWKGFTSC
16	離胺酸羥基化肽序列 8	X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉WGQGTLVTVSSASTK 其中 X₁ = 任何胺基酸，X₂ = 任何胺基酸，X₃ = 任何胺基酸，X₄ = 任何胺基酸，X₅ = 任何胺基酸，X₆ = 任何胺基酸，X₇ = 任何胺基酸，X₈ = 任何胺基酸，X₉ = 任何胺基酸
17	離胺酸羥基化肽序列 9	X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂KGR 其中 X₁ = 任何胺基酸，X₂ = 任何胺基酸，X₃ = 任何胺基酸，X₄ = 任何胺基酸，X₅ = 任何胺基酸，X₆ = 任何胺基酸，X₇ = 任何胺基酸，X₈ = 任何胺基酸，X₉ = 任何胺基酸，X₁₀ = 任何胺基酸，X₁₁ = 任何胺基酸，X₁₂ = 任何胺基酸
18	離胺酸羥基化肽序列 10	X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂K 其中 X₁ = 任何胺基酸，X₂ = 任何胺基酸，X₃ = 任何胺基酸，X₄ = 任何胺基酸，X₅ = 任何胺基酸，X₆ = 任何胺基酸，X₇ = 任何胺基酸，X₈ = 任何胺基酸，X₉ = 任何胺基酸，X₁₀ = 任何胺基酸，X₁₁ = 任何胺基酸，X₁₂ = 任何胺基酸
19	離胺酸羥基化肽序列 11	DSTYSLSSTLTLSK
20	離胺酸羥基化肽序列 12	LTVLSSASTKGPSVFPLAPSSK
21	離胺酸羥基化肽序列 13	X₁X₂X₃X₄X₅X₆WGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK 其中 X₁ = 任何胺基酸，X₂ = 任何胺基酸，X₃ = 任何胺基酸，X₄ = 任何胺基酸，X₅ = 任何胺基酸，X₆ = 任何胺基酸
22	離胺酸羥基化肽序列 14	LKSGTASVVCLLNNFYPR
23	離胺酸羥基化肽序列 15	DSTYSLSSTLTLSKADYEK
24	離胺酸羥基化肽序列 16	X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁KGR 其中 X₁ = 任何胺基酸，X₂ = 任何胺基酸，X₃ = 任何胺基酸，X₄ = 任何胺基酸，X₅ = 任何胺基酸，X₆ = 任何胺基酸，X₇ = 任何胺基酸，X₈ = 任何胺基酸，X₉ = 任何胺基酸，X₁₀ = 任何胺基酸，X₁₁ = 任何胺基酸
25	離胺酸羥基化肽序列 17	NQVSLSCAVK
26	離胺酸羥基化肽序列 18	X₁X₂X₃X₄X₅X₆WGQGVLVTVSSASTK 其中 X₁ = 任何胺基酸，X₂ = 任何胺基酸，X₃ = 任何胺基酸，X₄ = 任何胺基酸，X₅ = 任何胺基酸，X₆ = 任何胺基酸
27	脯胺酸羥基化位點共同	X₁PG 其中 X₁ = 任何胺基酸
28	V9 (scFab)-Fc(臼) P329G LALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
29	LC007 (VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
30	LC007 (VL-CL)	DIVLTQSPSSLSASLGDRVTISCSASQGIRNYLNWYQQRPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
31	LC007 (scFab)-Fc(臼) P329G LALA	DIVLTQSPSSLSASLGDRVTISCSASQGIRNYLNWYQQRPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSGAQDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
32	V9 (VH-CH1) -Fc(杵) LALA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSGAQDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
33	V9 (VL-CL)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
34	V9 (scFab)-LC007 (VH-CH1)-Fc(杵) wt	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
35	LC007 (VH-CH1)-Fc(臼) wt	EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
36	V9 (scFab)-LC007 (VH-CH1)-Fc(杵) LALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
37	LC007 (VH-CH1)-Fc(臼) LALA	EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
38	V9 (scFab)-LC007 (VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
39	LC007 (VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA	EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
40	V9 (scFab)-LC007 (VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA N297D	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
41	LC007 (VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA N297D	EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
42	V9 (VL-CH1)-LC007 (VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
43	Fc(杵) wt	DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
44	V9 (VH-CL)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
45	FN18 (VL-CH1)-LC007 (VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA	DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLINWASTRESGVPDRFTGSGSRTDFTLTISSVKAEDLAVYFCQQFYSYPPTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
46	FN18 (VH-CL)	QVQLQQSEAELARPGASVKMSCKASGYTFTDYTIHWLKQRPGQGLDWIGYFNPSSESTEYNRKFKDRTILTADRSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSRKGEKLLGNRYWYFDVWGAGTSVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
47	V9 (scFab)-Fc(杵) P329G LALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
48	GA201 (VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGYSTYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
49	GA201 (VL-CL)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINNYLNWYQQKPGKAPKRLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSFPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
50	GA201 (scFab)-Fc(杵) P329G LALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINNYLNWYQQKPGKAPKRLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSFPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGYSTYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
51	V9 (VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
52	V9 (scFab)-GA201 (VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGYSTYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
53	3F2 (scFab)-Fc(杵) P329G LALA	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
54	V9 (scFab)-3F2 (VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
55	3F2 (VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
56	3F2 (VL-CL)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
57	CH1A1A (VH-CH1)- V9 (VL-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
58	CH1A1A (VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
59	CH1A1A (VL-CL)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
60	V9(VH-CL)-LC007(VL-CL)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDGGGGSGGGGSDIVLTQSPSSLSASLGDRVTISCSASQGIRNYLNWYQQRPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
61	Fc(杵) P329G LALA	DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
62	V9(VL-CH1)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
63	V9(VH-CL)-Fc(杵) P329G LALA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
64	LC007(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(杵) P329G LALA	EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
65	M4-3 ML2(VL-CL)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
66	V9(VL-CH1)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67	M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
68	V9(VH-CL)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
69	CH1A1A(VH-CH1)- V9(VH-CL)-Fc(杵) P329G LALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
70	H2C(VL-CH1)	QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
71	H2C(VH-CL)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
72	431/26(VL-CL)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSTSSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQWSSYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
73	431/26(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(杵) P329G LALA	QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTISSGYSWHWVRQPPGRGLEWIGYIQYSGITNYNPSLKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCAREDYDYHWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
74	431/26(VH-CH1)-Fc(臼) P329G LALA	QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTISSGYSWHWVRQPPGRGLEWIGYIQYSGITNYNPSLKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCAREDYDYHWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
75	CH1A1A(VL-CL)-V9 (VH-CL)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
76	CH1A1A(VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
77	Fc(臼) P329G LALA	DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
78	CH2527(VL-CH1)	QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
79	CH2527(VH-CL)-LC007(VH-CH1)-Fc(杵) P329G LALA	EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
80	LC007(VH-CH1)-CH2527(VH-CL)-Fc(杵) P329G LALA	EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
81	TYRP1 VH-CH1 (EE) – CD3_原始/CD3_優化 VL-CH1 – Fc (杵, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYFLHWVRQAPGQGLEWMGWINPDNGNTVYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDYTYEKAALDYVVGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
82	TYRP1 VH-CH1 (EE) – Fc (臼, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYFLHWVRQAPGQGLEWMGWINPDNGNTVYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDYTYEKAALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
83	TYRP1 VL-CL (RK)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIYNYLAWYQQKPGKVPKLLIYDAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHFWSLPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
84	CD3_原始 VH-CL	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
85	CD3_優化(P033.078) VH-CL	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTPESYAMNVVVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNEYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPSSFVSYFGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
86	CD3_優化(P035.093) VH-CL	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
87	CD3_優化(P035.064) VH-CL	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFDNYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKHNGYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPSSYVSYFGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
88	CD3_優化(P021.045) VH-CL	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPSSYVSYFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
89	CD3_優化(P004.042) VH-CL	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFDNYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRTKYNEYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPQSYVSYFGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
90	CEACAM5 VH-CH1 (EE) – CD3_原始/CD3_優化 VL-CH1 – Fc (杵, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEICPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
91	CEACAM5 VH-CH1 (EE) – Fc (臼, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
92	CEACAM5 VL-CL (RK)	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
93	GPRC5D VH-CH1 (EE) – CD3_原始/CD3_優化 VL-CH1 – Fc (杵, PGLALA)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
94	GPRC5D VH-CH1 (EE) – Fc (臼, PGLALA)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
95	GPRC5D VL-CL (RK)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
96	CD19(2B11) VH-CH1 (EE) – CD3_原始/CD3_優化 VL-CH1 – Fc (杵, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
97	CD19(2B11) VH-CH1 (EE) – CD3_原始/CD3_優化 VL-CH1 – Fc (杵, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
98	CD19(2B11) VH-CH1 (EE) – Fc (臼, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
99	CD19 VL-CL (RK)	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
100	CD19(018) VH-CH1 (EE) – CD3_原始/CD3_優化 VL-CH1 – Fc (杵, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
101	CD19(018) VH-CH1 (EE) – CD3_原始/CD3_優化 VL-CH1 – Fc (杵, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPlEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
102	CD19(018) VH-CH1 (EE) – Fc (臼, PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
103	CD19(018) VL-CL (RK)	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
104	CD3_原始/CD3_優化VL-CH1 – Fc (杵，PGLALA)	QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
105	Fc (臼，PGLALA)	DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLEPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
106	LCFR4-CH1_1	FGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
107	LCFR4-CH1_2	FGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
108	LCFR4-CH1_2	FGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
109	LC MCSP ML2 (G3)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSALPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
110	LC CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)	QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
111	MCSP M4-3 (C1) (VH-CH1) - CD3 CH2527 (Crossfab VH-Ck) - Fc(杵) P329GLALA	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITFDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
112	MCSP M4-3 (C1) (VH-CH1) - Fc(臼) P329GLALA	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITFDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
113	LC CEA 2F1	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
114	CEA CH1A1A 98/99 - CD3 CH2527 (Crossfab VH-Ck) - Fc(臼) P329GLALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
115	TYRP1 VH-CH1(EE) - CD3 原始/CD3 優化 VL-CH1 - Fc (杵，PGLALA)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYFLHWVRQAPGQGLEWMGWINPDNGNTVYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDYTYEKAALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
116	CD3優化VH-CL	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
117	EGFRvIII VH-CH1(EE) - CD3 原始/CD3 優化 VL-CH1 - Fc (杵，PGLALA)	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFDSYWIAWVRQMPGKGLEWMGVIHPYDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRSSYAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
118	EGFRvIII VH-CH1(EE) -Fc (臼，PGLALA)	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFDSYWIAWVRQMPGKGLEWMGVIHPYDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRSSYAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
119	EGFRvIII VL-CL(RK)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQQRDGPPVTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
120	CH2527 VH	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
124	CH2527 HC-CDR1	GFTFSTYA
125	CH2527, 殖株 22, P035.093 HC-CDR2	IRSKYNNYAT
126	CH2527 HC-CDR3	VRHGNFGNSYVSWFAY
127	CH2527, 殖株 22, P035.093 VL	QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
128	CH2527, 殖株 22, P035.093 LC-CDR1	TGAVTTSNY
129	CH2527, 殖株 22, P035.093 LC-CDR2	GTN
130	CH2527, 殖株 22, P035.093 LC-CDR3	ALWYSNLWV
131	殖株 22 VH	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSS
132	殖株 22 HC-CDR1	GFQFSSYA
133	殖株 22 HC-CDR3	VRHTTFPSSYVSYYGY
134	P035.093 VH	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSS
135	P035.093 HC-CDR1	GFTFSSYA
136	P035.093 HC-CDR3	VRASNFPASYVSYFAY
137	40G5C VH	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSS
138	40G5C HC-CDR1	GYTFTNYY
139	40G5C HC-CDR2	IYPGDGNT
140	40G5C HC-CDR3	ARDSYSNYYFDY
141	40G5C VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIK
142	40G5C LC-CDR1	QSLLNSRTRKNY
143	40G5C LC-CDR2	WAS
144	40G5C LC-CDR3	TQSFILRT
145	V9 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
146	V9 HC-CDR1	GYSFTGYT
147	V9 HC-CDR2	INPYKGVS
148	V9 HC-CDR3	ARSGYYGDSDWYFDV
149	V9 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK
150	V9 LC-CDR1	QDIRNY
151	V9 LC-CDR2	YTS
152	V9 LC-CDR3	QQGNTLPWT
153	HLA-G VH-CH1 (EE) – CD3_原始/CD3_優化 VL-CH1 – Fc (杵, PGLALA)	QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
154	HLA-G VL-CL(RK)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNPSNNKNNLAWYQQQPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYYRTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
155	HLA-G VH-CH1(EE) -Fc (臼, PGLALA)	QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
156	HLA-G VH	QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPFDYWGQGVLVTVSS
157	HLA-G HC-CDR1	SNRAAWN
158	HLA-G HC-CDR2	RTYYRSKWYNDYAVSVQG
159	HLA-G HC-CDR3	VRAVAPFDY
160	HLA-G VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNPSNNKNNLAWYQQQPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYYRTPWTFGQGTKVEIK
161	HLA-G LC-CDR1	KSSQSVLNPSNNKNNLA
162	HLA-G LC-CDR2	WASTRES
163	HLA-G LC-CDR3	QQYYRTPWT
164	P035.093 HC-CDR1 (Kabat)	SYAMN
165	P035.093 HC-CDR2 (Kabat)	RIRSKYNNYATYYADSVKG
166	P035.093 HC-CDR3 (Kabat)	ASNFPASYVSYFAY
167	P035.093 LC-CDR1 (Kabat)	GSSTGAVTTSNYAN
168	P035.093 LC-CDR2 (Kabat)	GTNKRAP
169	離胺酸羥基化肽序列 19	YNNYATYYADSVK
170	離胺酸羥基化肽序列 19 + G	YNNYATYYADSVKG
171	離胺酸羥基化肽序列 20	GTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTK
172	離胺酸羥基化肽序列 20 + G	GTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKG
173	離胺酸羥基化肽序列 21	AEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTK
174	離胺酸羥基化肽序列 21 + G	AEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKG

***

本揭露包括所描述的態樣及較佳特徵之組合，除非此類組合明顯不允許或明確避免。

本文使用的章節標題僅用於組織目的，而不應被解釋為限制所描述的標的。

現在將參考圖式以示例的方式說明本揭露之態樣及實施例。進一步之態樣及實施例對於本領域技術人員而言將為顯而易見。本文中提及的全部檔案皆藉由引用併入本文。

貫穿本說明書，包括隨附申請專利範圍，除非上下文另有要求，否則詞語「包含」以及變型 (comprise/comprises/comprising) 將被理解為暗示包括所規定的整數或步驟或數或步驟組，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟組。

如本文所用，『對應』於指定參考胺基酸序列或多肽之區域的胺基酸序列或多肽之區域與該胺基酸序列/多肽/區域之胺基酸序列具有至少 60%，例如至少 ≥65%、≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99% 或 100% 中之一者的序列同一性。『對應』於指定參考胺基酸序列/多肽/胺基酸序列之區域/位置的胺基酸序列/多肽/胺基酸序列之區域/位置可藉由將個體序列與參考序列比對來鑑定，例如使用序列比對軟體諸如 ClustalOmega (Söding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960) 來鑑定。

在本文提及胺基酸 (除甘胺酸之外) 的情況下，明確考慮相關胺基酸之 L 及 D 鏡像異構物。在某些實施例中，除非另外具體指示，否則本文提及的胺基酸特別係指 L 鏡像異構物，此係胺基酸天然存在之形式。

亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式『一 (a/an)』及『該』包括複數個提及物。範圍在本文中可以表達為「約」一個特定值及/或至「約」另一特定值。當表現此類範圍時，另一實施例包括一個特定值及/或至另一特定值。類似地，當藉由使用先行詞『約』來將值表示為近似值時，應當理解該特定值形成另一實施例。

當本文揭露核酸序列時，亦明確考慮了其反向互補序列。

本文描述的方法可以較佳在活體外進行。術語「活體外」旨在涵蓋用培養物中之細胞進行的程序，而術語「活體內」旨在涵蓋使用/在完整多細胞生物體上進行的程序。

值在本文中可表示為『約』特定值。類似地，範圍在本文中可表示為『約』一特定值及/或至『約』另一特定值。與數值相關之術語『約』係可選的，並且意謂例如 +/- 10%。舉例來說，提及例如『約 10%』應解釋為 9% 至 11%。在本文提及『約』的情況下，其前面的值亦為特別考慮的。舉例來說，提及例如『約 10%』亦特別考慮了 10%。

現在將參照附圖討論說明本揭露之原理的實施例及實驗。圖 1A 至 1G. 羥基離胺酸修飾之構形及針對胰蛋白酶消化之相關性。 1A) 2+1 T 細胞 bsmAb (TCB) 之示意性模型 (虛線：二硫鍵)。1B) GPRC5D TCB (TCB mAb 3) 的具有零個漏切的經修飾之 (上圖) 及未經修飾之 (下圖) 胰蛋白酶肽 HCAA-350 LTVLSSASTK (SEQ ID NO:10) 以及具有一個漏切的胰蛋白酶肽 LTVLSSASTKGPSVFPLAPSSK (SEQ ID NO:20) 之實例 XIC。粗體圓點指示前驅物之 MS/MS 片段化業已觸發的時間點，該等時間點表示各別 XIC 訊號之主要種類。需注意兩種未經修飾之肽與各別經修飾之肽相比的強度標度的差異。1C) GPRC5D TCB 之經修飾之肽 (上圖) 及未經修飾之肽 (下圖) HCAA-350 之 HCD 片段譜圖之概覽。1D) 經修飾之肽 (上圖) 及未經修飾之肽 (下圖) 之放大視圖。y1 離子之 15.9950 Da 之偏移證實對離胺酸之修飾。1E) 具有一個漏切的經修飾之肽 (上圖) 及未經修飾之肽 (下圖) 之 HCD 片段譜圖之實例概覽。1F) 相同 MS/MS 掃描之放大視圖，其中聚焦於屬於 KG 模體的片段離子 y12 及 y13。兩個片段之間的距離相當於偏差為 -5.6 ppm 的 HyL 殘基之質量 (HyL 之理論質量 = 144.0899)。1G) 三種不同 TCB 分子之酶切及漏切胰蛋白酶肽的經鑑定之位點及水平 (箭頭指示各別 TCB 分子中的 HyL 修飾位點)。圖 2A 至 2G.TCB mAb 中 HyL 修飾熱點及結構後果之定位。 2A) 在 TCB mAb 中檢測到若干經曝露之離胺酸殘基被羥基化 (箭頭)。具有最高 HyL 修飾水平的熱點 (深色箭頭) 與 Xie等人，MAbs.(2016) 8(2): 371-378 的先前觀測 (深色箭頭) 相似。2B) 對在藉由 LC-MS 鑑定的羥基化之肽中鑑定的位置 -2 至 +2 中的胺基酸的概率分析。2C) 對於三種經分析之 TCB mAb，檢測到的經 HyL 修飾之肽之百分比分布不同。HLA-G TCB (TCB mAb 2) 為相同熱點模體 LTVLSSASTK (SEQ ID NO:10) 及經修飾之 K125 位於 N 末端 Fab 結合物中的唯一分子。2D) 交叉 Fab 之結構，如以具有 HyL350 (球及棍) 及各別域註釋的絛帶所示。經鑑定之熱點 HyL350 TCB mAb 係定位為緊鄰 HC 杵多肽鏈中 VL 至 CH1 之界面的 C 末端。2E) 羥基離胺酸修飾對疏水性、正及負電荷斑塊的預測影響。預測係基於 MOE 2022 中的電腦中質子化、能量最小化及蛋白質斑塊計算。2F) 曲妥珠單抗 (trastuzumab ) Fab 域 (PDB 代碼：1n8z) (作為通用 IgG Fab 之例示性實例) 之結構係針對 HC 及 LC 分別以深灰色及淺灰色來表示。2G) 使用兩個恆定區 CH1 及 κCL 對交叉 Fab 及通用 Fab 的疊合。結構之疊合顯示肘狀片段及鄰近環之取向的差異。圖 3A 至 3J 。細胞培養期間的 HyL 修飾之變異性係相依於鐵可用率。 3A) CD19 TCB (TCB mAb 1) 在代表性饋料批式發酵製程期間的 HyL350 水平的時間進程示出了在後期製程階段中的下降。水平條表示 HyL 修飾水平發生轉變的時間週期 (亦即「轉變階段」)。3B) 發酵製程之每日增量產物增加之動力學特性在製程之中間達到峰值。3C) 新生產的 %HyL350 水平之模擬動力學特性，以描述 3A 中產物 HyL30 修飾的觀測到的動力學特性。3D) PLOD 之酶促性反應之機制描述。在蛋白質中，XKG (SEQ ID NO：2) 共同序列係由 PLOD 酶識別，且藉由使用 2-側氧戊二酸及氧以及輔因子 Fe²⁺而羥基化為 5R-羥基-L-離胺醯基殘基、琥珀酸鹽及二氧化碳。3E) 在饋料批式培養製程期間在無細胞細胞培養物上清液中測量的遊離鐵 (Fe²⁺) 濃度。使用特定製程時間點的鐵細胞密度濃度來計算每細胞鐵可用率 (3F) 及細胞特異性鐵攝取率 (3G)。兩者皆指示後期製程階段中的趨勢的停滯，且表明鐵代謝突然改變，這在全球鐵濃度測量中係未見的。針對 K350 熱點模體 (3H) 及較低豐度 K67 模體 (3I) 分析鐵濃度對 CD19 TCB 羥基化的影響。3J) 藉由擬合針對所測試鐵濃度的歸一化 K350 及 K67 羥基化水平來創建針對 HyL 修飾刺激的鐵反應曲線。圖 4A 至 4C. 細胞培養期間的 HyL 修飾之變異性係相依於鐵可用率。分析鐵濃度對熱點模體之離胺酸之羥基化的影響。圖表示出了 CD19 TCB (TCB mAb 1) (4A)、HLA-G TCB (TCB mAb 2) (4B) 及 GPRC5D TCB (TCB mAb 3) (4C) 的針對所指示離胺酸殘基處 HyL 修飾之歸一化水平的資料點及擬合式鐵濃度:反應曲線。圖 5A 至 5C. 細胞培養期間的 HyL 修飾之變異性係相依於鐵可用率。針對 K67 模體 (5A)、K125 模體 (5B) 及 K350 基序 (5C) 分析鐵濃度對 CD19 TCB 羥基化的影響。圖 6A 至 6C. 細胞培養期間的 HyL 修飾之變異性係相依於鐵可用率。針對 K67 模體 (6A)、K121 模體 (6B) 及 K346 基序 (6C) 分析鐵濃度對 GPRC5D TCB 羥基化的影響。

實例

實例 1 ： 材料與方法1.1 細胞培養

在 125 至 500 mL 搖瓶器皿中於基於 DMEM/F12 之專屬培養基中在 150 rpm、37℃、80% rH 及 5% CO₂下培養 CHO 細胞。每 3-4 天以 3-6 x 10⁵個細胞/mL 之接種密度使細胞傳代。如以下所描述產生穩定表現雙特異性抗體分子之細胞池：Carver等人，Biotechnol Prog.(2020) 36(4):e2967。簡言之，藉由 MaxCyte STX 電穿孔 (MaxCyte Inc., Rockville, Maryland, USA) 將表現質體轉染至 CHO 細胞中。然後選擇經轉染之細胞，且藉由分析 (藉由使用 BD FACS Canto II 流式細胞儀 (BD, Eysins, Switzerland) 對以人類 IgG 特異性的抗體染色的細胞的流式細胞分析技術) 來確認抗體表現。在藉由極限稀釋進行單細胞選殖、藉由 ELISA 進行效價及結合物驗證以及在 ambr250 生物反應器 (Sartorius AG, Göttingen, Germany) 中的饋料批式生產測定中評估細胞生長及生產性能後，選擇表現抗體的 CHO 細胞殖株。1.2 饋料批式培養

在 24 深孔盤、搖瓶或 ambr250 生物反應器 (Sartorius AG, Göttingen, Germany) 中利用專有的化學性界定的生產培養基進行饋料批式生產培養。亦可以在可商購獲得的細胞培養基，諸如 CD-CHO、ProCHO 或 DMEM/F12 培養基中培養細胞。在 2 次傳代期間適應生產培養基後，在生產階段之第 0 天以 2 至 15 × 10⁶個細胞/ml 接種細胞。在第 3 天后，培養物每日接受專有饋料培養基，且在第 3 天及第 7 天接受額外之团注饋料 (bolus feed)，在第 10 天接受視情況選用的团注饋料。將細胞培養 14 天。ambr250 系統中之生產係在 35℃、DO 30%、pH 7.0 及 1300 rpm (在第 3.5 天轉變至 1600 rpm) 之攪動速率之設定點下操作的。1.3 批式培養

利用缺乏鐵的專有化學性界定的生產培養基在 24 深孔盤中進行批式生產培養。在生產階段之第 0 天，以 5 x 10⁶個細胞/ml 接種細胞。在第 3 天后，培養物接受每日培養基饋料，且在第 3 天及第 7 天接受額外之团注饋料。將細胞培養 5 天。在第 0 天將鐵手動添加至培養物 (以達到圖 4A 至 4C 所示之所指示濃度)。1.4 離線樣品分析

利用 Cedex Bio HT 分析儀 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 分析製程參數，以實現抗體生產之測量以及選定的代謝物濃度 (包括鐵)。藉由 Cedex HiRes 分析儀 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 測量總細胞計數、活細胞濃度及平均細胞直徑。對每種條件下的整合活細胞密度 (IVCD) 及特定生產率進行如下計算：(等式 1)

對細胞特定生產率 qP 及細胞特定鐵消耗率 qS_鐵進行如下計算：(等式 2)(等式 3)(等式 4)

針對 qS 及 qP 的負值及正值分別表示化合物之消耗及生產。1.5 結構建模分析

利用 MoFvAb/IgNORANT 構建 CrossFab 部分之同源模型，同時透過 MOE 2022 實現羥基離胺酸之摻入。該製程涉及 K350 之質子化及隨後之能量最小化。曲妥珠單抗 Fab 域 (PDB 代碼 1n8z) 充電通用 IgG Fab 部分之代表性實例。

為了評估化學物理參數，諸如疏水性及正或負電荷斑塊之存在性，使用 MOE 2022 來分析 VL-CH1 之 SSASTK360 模體 (SEQ ID NO:6) 之離胺酸及羥基離胺酸形式。1.6 TCB mAb 聚集體及片段分析

將細胞培養物上清液澄清 (藉由於 4℃ 以 1000 xg離心 30 min，且使用 Pall Cooperation 的 AcroPrep 96 過濾盤進行 1.2 µM 過濾)。分析蛋白 A 層析係藉由 UV 檢測的 UHPLC (配備 POROS™ A 20 µm 管柱之 Dionex Ultimate 3000 UHPLC，Thermo Fisher Scientific Inc.) 進行。

在蛋白質 A 親和層析 (PreDictor RoboColumn MabSelect SuRe, Cytiva) 及使用 UV 測量 (Nanoquant Infinite M200, Tecan) 的蛋白質定量正規化後，分析抗體完整性。在非還原條件下，藉由 CE-SDS (LabChip GXII 系統上的 HT Antibody Analysis 200 測定，PerkinElmer) 經由預期蛋白質大小與總蛋白質含量之相對定量來評定正確組裝的抗體 (主峰) 之百分比。

藉由 HPLC 層析進行用於測定重組免疫球蛋白之聚集及寡聚狀態之粒徑排阻層析 (SEC)。簡言之，將經蛋白 A 純化之產物施加至 Dionex Ultimate® HPLC 系統 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) 上的 TSKgel QC-PAK GFC 300 管柱 (Tosoh Bioscience) 或 Tosoh TSKgel UP-SW3000 管柱 (於 250 mM KCl、200 mM K2HPO4/KH2PO4 緩衝液 (pH 6.2) 中)。藉由 UV 吸光度和峰面積積分對溶析的抗體進行定量。BioRad Gel Filtration Standard #151–1901 用作凝膠過濾校正標準。1.7 用於羥基離胺酸分析的 LC-MS 肽圖程序

將經表現的且經蛋白 A 純化的抗體變性且用 6 M 胍及 16 mM DTT 在 pH 7、37℃ 下還原 1 小時。然後使用 73 mM IAA-C12 (Fluka) 將經變性之還原蛋白羧甲基化，且隨後在 NAP-5 (GE Healthcare Life Sciences) 上將其緩衝液交換至 pH 7.5 的 50 mM TRIS、2 mM CaCl2 中，且於 37℃ 藉由胰蛋白酶 (Promega) 消化 1 小時。

然後藉由液相層析串聯質譜法 (LC-MS-MS) 分析所消化之樣品。利用逆相管柱 Acquity CSH C18, 1.7 µM, 130A, 2.1 x 150mm (Waters) 在 Waters Acquity UPLC (Waters) 上進行液相層析。水性流動相 (流動相 A) 含有在 HPLC 級水中之 0.1% (v/v) 甲酸 (FA)。有機流動相 (流動相 B) 含有在乙腈中之 0.1% (v/v) FA。本實驗中利用的梯度使用以下 2 步驟線性梯度：從 2 min 至 33 min 流動相 B 為 1% 至 30%，且在 42 min 之前至 60%，之後在 42.5 與 44.5 min 之間增加至 90%，在 44.6 min 與 50 min 之間降低回 50%，之後從 50 min 至 56 min 在 1% 溶析液 B 下重新平衡。管柱溫度設定為 65℃。

將 UPLC 與 Orbitrap FusionTM 質譜儀 (Thermo Scientific) 耦合。利用解析度為 120000 的 Orbitrap 質譜儀獲取 MS1 譜圖，而在解析度為 50000 的 Orbitrap 中獲取 MS/MS 資料。在啟用 4.5 sec 之動態排阻的情況下，對 topN 前驅物離子重複 Orbitrap 上的 MS/MS 事件。藉由 ByosTM & ByonicTM (Protein Metrics Inc) 處理所得 MS 資料。使用 ByologicTM (Protein Metrics Inc) 進行手動資料解釋。MS/MS ByosTM 搜尋設定包括 5 ppm 之前驅物質量容差及 20 ppm 之片段質量容差。將酶特異性設定為完全特異性，同時允許一個漏切。對考慮漏切產物 (0 mc 及 1 mc)的對相對羥基離胺酸 (HyL；「Kox」，離胺酸氧化的) 修飾型胰蛋白酶肽相較於未經修飾之肽 (「K」)的量化進行如下計算：(等式 5)

實例 2 ：結果2.1 TCB mAb 中羥基離胺酸修飾之鑑定

使用光譜胰蛋白酶肽圖譜方法，發明人在由三種不同的重組 CHO 細胞株表現的三種不同的重組生產的 2+1 IgG 形式 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體中鑑定出若干 +15.9950 Da 質量偏移：CD19 TCB (本文亦稱為「TCB mAb 1」)、HLA-G TCB (本文亦稱為「TCB mAb 2」) 及 GPRC5D TCB (伏利妥米單抗；本文亦稱為「TCB mAb 3」) (圖 1B)。

TCB	組成多肽
CD19 TCB (TCB mAb 1)	SEQ ID NO:97 + SEQ ID NO:98 + SEQ ID NO:99 + SEQ ID NO:116
HLA-G TCB (TCB mAb 2)	SEQ ID NO:86 + SEQ ID NO:153 + SEQ ID NO:154 + SEQ ID NO:155
GPRC5D TCB (TCB mAb 3)	SEQ ID NO:93 + SEQ ID NO:94 + SEQ ID NO:95 + SEQ ID NO:116

肽修飾之水平會基於 TCB 分子中的位置而改變 (參見表 1)。

CD19 TCB
CD19 TCB 域	經切割的	序列	起始 AA	結束 AA	變異位置	CD19 TCB [%]
LC-B	nd	XXXXXXXXXXXXKGR (SEQ ID NO:17)	55	69	67	＜ 0.1
LC-B	nd	XXXXXXXXXXXXK(SEQ ID NO:18)	53	67	54	＜ 0.1
LC-A 及 B	nd	DSTYSLSSTLTLSK(SEQ ID NO:19)	175/188	188/201	188/201	＜ 0.1
HC-K	s	LTVLSSASTK(SEQ ID NO:10)	341	350	350	4.9
l	LTVLSSASTKGPSVFPLAPSSK (SEQ ID NO:20)	341	362	350	7.4
				總和	12.3
HLA-G TCB
HLA-G TCB 域	經切割的	序列	起始 AA	結束 AA	變異位置	HLA-G TCB [%]
LC-A	nd	XXXXXXXXXXXXKGR (SEQ ID NO:17)	55	69	67	＜ 0.1
HC-K	s	XXXXXXWGQGVLVTVSSASTK(SEQ ID NO:26)	104	125	125	0.5
l	XXXXXXWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK (SEQ ID NO:21)	104	137	125	＜ 0.1
				總和	0.6
LC-B	nd	LKSGTASVVCLLNNFYPR (SEQ ID NO:22)	131	148	132	＜ 0.1
LC-A 及 B	s	DSTYSLSSTLTLSK(SEQ ID NO:19)	188/176	201/189	201/189	＜ 0.1
l	DSTYSLSSTLTLSKADYEK (SEQ ID NO:23)	188/176	206/198	201/198	＜ 0.1
				總和	＜ 0.1
HC-K	s	LTVLSSASTK(SEQ ID NO:10)	341	350	350	1.1
l	LTVLSSASTKGPSVFPLAPSSK (SEQ ID NO:20)	341	362	350	1.2
				總和	2.2574
GPRC5D TCB
GPRC5D TCB 域	經切割的	序列	起始 AA	結束 AA	變異位置	GPRC5D TCB [%]
LC-A	s	XXXXXXXXXXXXK(SEQ ID NO:18)	55	67	67	0.1
l	XXXXXXXXXXXXKGR (SEQ ID NO:17)	55	69	67	＜ 0.1
				總和	0.1
HC-H	nd	NQVSLSCAVK(SEQ ID NO:25)	361	370	370	0.1
HC-K	s	LTVLSSASTK(SEQ ID NO:10)	337	346	346	3.6
l	LTVLSSASTKGPSVFPLAPSSK (SEQ ID NO:20)	337	358	346	3.2
				總和	6.8

表 1 ：藉由重組表現生產的 TCB 之羥基離胺酸 (HyL) 水平。經修飾之離胺酸殘基以粗體突出顯示。若不同的切割型式被一起量化，則將單一數量合計以建構針對各別位點的總數。經切割之肽標記有「s」(短)，而未經切割之肽標記有「l」(長)。需注意，並非對於每個位點皆檢測到具有漏切的肽，且在表中以「nd」(未檢測到) 指示；「＜0.1」意謂確認檢測到修飾，但無法產生有效濃度；*半定量

在 TCB 之可變區中，觀測到 HyL 處於低水平 (＜1%)，且在 crossFab 部分之 VL 區的 C 末端的重鏈杵 (HC-K) 多肽之 CH1 區中觀測到處於高水平 (高達 12.3%) (表 1，圖 1G)。在顯著 CH1 元件中具有 +15.9950 Da 修飾的檢測到模體係與藉由以下鑑定的模體相似：Xie等人，MAbs.(2016) 8(2): 371-378，但不同之處在於，在本揭露之 TCB 分子中，CH1 區係依 VL-CH1 形式提供 (圖 1A)。

Xi等人將 +16 Da 修飾歸因於 SEQ ID NO:16 之末端離胺酸處的離胺酸殘基之羥基化。基於這一先前觀測，發明人研究了 HyL 修飾作為在三種經分析之 TCB mAb 中觀測到的質量偏移的原因的可能性。為此，藉由分析 HCD (較高能碰撞解離) 片段化資料來判定修飾的確切胺基酸位置 (表 1)。HC-K 之顯著 LTVLSSASTK 肽 (胺基酸 341 至 350；SEQ ID NO:10) 中 +15.9950 Da 修飾之位置係歸因於氧化，且藉由針對有及沒有漏切使用經修飾之及未經修飾之肽 LTVLSSASTK350 (SEQ ID NO:10) 的經萃取之離子層析圖來在經分析之肽中的離胺酸 K350 處進行確認 (圖 1C)。離胺酸之羥基化導致胰蛋白酶肽的降低之疏水性，相較於未經修飾之肽，具有預期的較早保留時間。這一點藉由兩者之 XIC 比較而得到證實，且與 Xie等人所報道之資料一致(圖 1B)。

先前已報道 HyL 殘基對胰蛋白酶之選擇性的影響 (Molony等人，Tech Prot Chem. (1995) 6:91-98，Molony等人，Anal Biochem. (1998) 258(1):136-137)。為了研究由於離胺酸羥基化為 HyL 而導致的胰蛋白酶選擇性的可能之喪失，亦針對 HyL 之存在性評估具有一個漏切的胰蛋白酶肽 LTVLSSASTKGPSVFPLAPSSK350 (SEQ ID NO:20)。對 XIC 強度標度的比較以及針對不同切割種類的比率的分別計算顯示，HyL 存在於大約 99% 的具有漏切的肽中，而 HyL 僅存在於大約 5% 的正確切割之肽中 (圖 1B)。這些資料表明離胺酸羥基化會影響胰蛋白酶切割之效率。

對於一些樣品而言，無法基於 MS2 來檢具有漏切的未經修飾之肽 (SEQ ID NO:20) ，因為前驅物強度低於 MS2 觸發極限。只發現具有一個漏切的胰蛋白酶肽 (依其經修飾之形式)。無法基於 XIC 及保留時間來對經修飾之及未經修飾之肽進行比較。然而，經修飾之肽的 MS/MS 片段譜圖顯示幾乎 100% 覆蓋率，且確認了位於 HC-K CH1 域中的針對同一離胺酸 K350 的修飾位置 (圖 1C 至 1F)。2.2 TCB mAb 中杵重鏈之交叉 CH1-VL 域中的離胺酸 350 之熱點修飾

TCB mAb 在三個 Fab 部分中之每一者中包含離胺酸羥基化熱點肽 LTVLSSASTK (SEQ ID NO:10)。Xie等人，MAbs.(2016) 8(2): 371-378 先前報道了經分析之 IgG 中 CH1 離胺酸之羥基化修飾，且將這一點歸因於 XKG (SEQ ID NO:2) 共同序列之存在，該共同序列為若干內源性羥基化之多肽中的修飾之位點。值得注意的是，僅位於 C_H1 重鏈中的 XKG 模體中的離胺酸被 Xie等人鑒定為用於羥基化之位點，儘管事實上 IgG 中存在若干符合 XKG 模體的進一步序列。

有趣的是，位於 (亦即crossFab 部分之 VL-CH1 區的) 交叉 HC CH1 Fab 域中的 LTVLSSASTK350 (SEQ ID NO:10) 肽之 C 末端離胺酸似乎特別容易發生羥基化。在所研究的所有三種 TCB mAb 分子中的 crossFab 部分之 CH1 區中均檢測到 HyL。

儘管熱點模體係存在於本研究中所探究的不同 TCB mAb 分子中所有三個 Fab 部分 (亦即兩個傳統 Fab 部分及 crossFab 部分) 之 CH1 域中，但僅在 HLA-G TCB 中除 crossFab 部分以外的 Fab 部分中檢測到 HyL 修飾 (特定而言在 Fab 部分之 HC-K 鏈之 CH1 域中的 LTVLSSASTK125 處；參見圖 1G 及圖 2C)。位於 crossFab 部分之 VL-CH1 區中的 LTVLSSASTK350 肽係 LTVLSSASTK125 肽中的 HyL 修飾的 5 倍，指示相比單獨的胺基酸序列，HyL 修飾效率有額外之結構需求。在 CD19 TCB 及 GPRC5D TCB 中未檢測到 LTVLSSASTK125 之 HyL 修飾，儘管它們包含相同的共同序列 STKGP (SEQ ID NO:5) 模體。

在三種不同 TCB mAb 中，在分子之替代的、類似的含 XKG (SEQ ID NO:2) 的區域內，以及在表示 XKA (SEQ ID NO:3) 及 XKS (SEQ ID NO:4) 的序列模體處，亦檢測到輕微但可測量的離胺酸羥基化——參見圖 2A。然而，STKGP (SEQ ID NO:5) 序列模體在所有檢測到的羥基化之肽序列中占主導地位 (圖 2B)。

杵重鏈之交叉 VL-CH1 區中的 K350 處的顯著熱點接近分子內 CDR 下游的嵌合 VL 域的過渡處 (圖 2D)。K350 位於非結構化 CL-CH1 界面內，接近 CH1 域中的經曝露之環。發明人研究了在該位置處引入羥基基團是否會改變 CH1 域之緊密空間結構以及化學物理參數。使用利用人工離胺酸質子化、能量最小化及隨後之蛋白質斑塊計算的分子預測方法，針對表面疏水性以及正及負電荷斑塊沒有觀測到顯著差異，指示 K350 處的羥基化對整體分子性質沒有影響或只有很小的影響 (圖 2E)。

發明人使用結構模型比較方法研究了 LTVLSSASTK350 與 LTVLSSASTK125 模體之間的潛在結構差異，試圖說明在 K350 處的觀測到的優先羥基化。曲妥珠單抗 Fab 域作為例示性通用 IgG Fab 結構係與 crossFab 域疊合，使用兩個恆定區 CH1 及 κ CL 進行取向對準。藉由與曲妥珠單抗之 Fab 域之結構組織化的比較對 crossFab 域的結構分析顯示出上游肘狀片段的以及針對鄰近的經曝露之環的顯著差異 (圖 2G)。相較於規範的 Fab 結構，crossFab 中肘狀片段似乎被曝露得更多，這可能係由於 crossFab 在該區域中包含額外之胺基酸。此外，crossFab 結構之 CH1 中的 K350 鄰近環採用不同的構形，指示一定的結構靈活性。這可以向離胺醯基羥化酶提供 K350 區之更大的空間可及性。2.3 離胺酸羥基化為動態的且相依於細胞培養物中的鐵可用率

在檢查製程持續時間內的 CD19 TCB 之 HyL 水平時，發明人觀測到所生產的分子中 HyL 水平降低之趨向，特定而言在後期製程階段 (從第 6 天開始直至第 10 天採集日) 期間位於相交 VL-CH1 域中的顯著 K350 殘基處 (圖 3A)。測得值亦示出於表 2 中。

資料點	製程時間 [d]	Hyl350 [%]
d2	1.80	16.855
d6	5.80	15.504
d8	7.80	11.974
d9	8.80	10.872
d10	9.80	12.249

表 2 ：在代表性饋料批式發酵製程期間，測量 TCB1 之 Hyl350 水平以產生圖 3A 所示之時間進程。

藉由計算新產物之每日形成率來判定不同時間點處的製程生產率，這對採集當天的累積最終產物濃度有貢獻。觀測到新形成之產物之水平的持續增大，直至第 6 天轉變階段之初始，之後係隨後的下降 (圖 3B)。有趣的是，透過使用 sigmoid 內插函數來模擬取樣日之間新修飾之 HyL350 肽之時間解析水平，發明人發現隨著第 6 天全局 HyL350 轉變之開始，當天的水平有特定時間降低，之後係隨後的再次增長 (圖 3B)。

發明人先前已判定 TCB mAb 之 HyL 修飾係由於酶促性 PLOD 活性而出現的 (參見例如WO 2023/232961 A1)。鑑於 PLOD 需要 Fe²⁺離子作為針對催化活性的輔因子 (圖 3D)，發明人嘗試分析製程持續期間的可用細胞培養物鐵水平。隨著時間的推移，觀測到細胞培養物鐵水平的明顯降低，當檢查每細胞鐵可用率時該明顯降低變得更加顯著，其中鐵水平從第 6 天開始停滯在低水平 (圖 3E、3F)。從第 6 天開始至第 10 天製程結束，低鐵水平亦伴隨有非常低之穩態水平的細胞特異性鐵消耗率 qS_鐵(圖 3G)。降低之鐵可用率及較低細胞鐵攝取會與向從細胞生產的抗體中 HyL350 之較低水平的轉變階段同時發生。

在進一步之實驗中，發明人研究了細胞培養基中鐵之初始水平是否會影響 TCB mAb 模體之 HyL 修飾。在亞鐵離子水平範圍為 0 至 200 µM 的情況下培養表現 CD19 TCB 的 CHO 細胞株，且隨後針對 HyL350 豐度來分析所生產的產物之樣品。對熱點模體 K350 及較低豐度 K67 位置 (位於 N 末端 Fab 域之 CDR 區附近) 的 HyL 修飾水平的分析顯示出 HyL 修飾的劑量相依性增加，在培養物中以 80 µM 鐵達到飽和 (圖 3H、3I)。0 µM 鐵補充時的 HyL 修飾之低水平可能係由用於接種實驗的前驅培養物轉移的殘餘鐵誘致的。

該等資料表明，在 Fe 離子濃度低於 40 µM 時，鐵之可用率為針對從培養物中的細胞表現的多肽之 HyL 修飾的限速因素。擬合模型表明，小於 10 µM 之細胞培養基 Fe 離子濃度足以引發羥基化反應之半數最大活化 (圖 3J)。2.4 離胺酸羥基化係鐵濃度相依性的

在進一步之實驗中，發明人進行了批式培養 (參見實例 1.3)，其中表現 CD19 TCB、HLA-G TCB 或 GPRC5D TCB 的細胞係在包含一系列鐵濃度的細胞培養基中培養的。隨後如實例 1.6 及 1.7 所描述來純化且分析經表現之 TCB mAb，以判定 TCB mAb 的易發生羥基化的離胺酸殘基處的 HyL 修飾之程度。將濃度-反應曲線與資料進行擬合，且判定對不同 TCB mAb 之指定離胺酸殘基實現 HyL 修飾之半數最大水平 (亦即EC50 值) 的鐵濃度。

結果示出於圖 4A 至 4C 中。對於所有所分析的位置，且在所有所表徵的 TCB mAb 中，發現在相關位置處包含 HyL 修飾的種類之比例係鐵濃度相依性的。對於不同離胺酸殘基且在不同 TCB mAb 之間，實現半數最大 HyL 修飾的鐵濃度非常相似，且範圍為 3.58 µM 至 7.43 µM。

實例 3 ：討論

發現經表現之 TCB mAb 之 HyL 修飾主要位於 LTVLSSASTK 肽 (位於重杵鏈內的 crossFab 部分之非結構化 VL-CH1 界面內) 之 C 末端 K350 處，且在位於 N 末端 Fab 部分中的類似肽 LTVLSSASTK 中的 K125 處含量要小得多。熱點位置係與先前藉由以下鑑定的模體相似，但在上游序列及結構鄰域方面並不相同：Xie等人，MAbs.(2016) 8(2): 371-378 (SEQ ID NO:16)。相較於 Fab 部分中的規範 VH-CH1 界面，cross-Fab 部分中的鏈之交叉似乎使得形成更靈活的、經曝露的熱點模體 LTVLSSASTK350。相較於 Fab 部分之等效位置，這一點可能係 crossFab 部分中該位置處的增加之 HyL 修飾的原因。

相對於 TCB mAb 分子中的規範 Fab 部分中的等效位置，crossFab 部分之 K350 處的高 HyL 修飾的原因可能係 VL-CH1 提供促進離胺醯基羥化酶 PLOD 酶接近 K350 的結構。資料表明，高階結構特徵對於酶標靶識別係非常重要的，而非簡化的、短的共同序列定義。

除了先前鑑定之 XKG 模體 (SEQ ID NO:2) 處的羥基化之外，本研究亦在 XKA (SEQ ID NO:3) 及 XKS (SEQ ID NO:4) 模體處檢測到 HyL，表明用於 PLOD 酶的共同序列受質有一定級別的靈活性。

肽中 HyL 之存在能夠消除胰蛋白酶消化 (Markolovic 等人，(2018) Nat Chem Biol. 14(7):688-695)。與 Xie等人相反，在本研究中，TCB mAb 之肽圖譜分析表現出 HyL 對消化效率的明顯影響 (表 1)。大約一半具有 HyL 修飾的顯著、高豐度肽表現出胰蛋白酶錯誤切割事件。

大多數治療性蛋白質 (諸如 TCB mAb 及通用 IgG) 使用動態細胞培養製程及高性能 CHO 生產細胞株 (參見 Kim等人Appl Microbiol Biotechnol. (2012) 93(3):917-930 之回顧)。儘管該等 CHO 生產細胞株源自相同的 CHO 祖先細胞株及相關的 CHO 宿主細胞亞譜系，但各最終生產殖株皆表現出或多或少獨特之代謝特徵 (Popp等人，Biotechnol Bioeng. (2016) 113(9):2005-2019)。因此，生物催化製程所需的特定受質及輔因子之可用性係與於細胞培養物中的小分子之細胞特異性消耗率緊密相關。在本研究中，發明人證明，鐵作為針對 PLOD 中的酶促性羥基化活性的輔因子會調節重組表現之 TCB mAb 中的共同模體內離胺酸殘基之羥基化水平。觀測到每細胞鐵可用率及消耗率之動態改變，同時在細胞培養製程之後期階段期間減小。

實例 4 ： 對細胞培養基中的鐵濃度對離胺酸羥基化之水平的影響的進一步分析

在進一步之實驗中，進一步評估了細胞培養基中的鐵濃度對從 CHO 細胞表現的 CD19 TCB 或 GPRC5D TCB 之離胺酸之羥基化水平的影響。

將利用編碼 TCB mAb1 或 TCB mAb3 的載體轉染的 CHO 細胞在補充有嘌呤黴素的種子訓練培養基 (專有的基於 DMEM/F12 的培養基，包括鐵) 中使用常規的 3 至 4 天分裝方法進行培養，以獲得穩定表現 CD19 TCB 或 GPRC5D TCB 的殖株。

在表現實驗之前，將穩定表現 TCB mAb1 或 TCB mAb3 的 CHO 殖株在含有 25 mL 之工作容積的 125 mL 搖瓶中在種子訓練培養基中培養四天，且隨後分裝至具有高達 150 mL 之工作容積的 500 mL 搖瓶中。

簡言之，培養係在具有 25 mL 之工作容積的 125 mL 搖瓶中進行。標靶接種細胞密度設定為 2.5 x 10⁶個細胞/mL。經由以 220 xg離心 5 min 來進行培養基交換，殘餘種子訓練培養基最多剩餘 5%。將細胞重懸於細胞培養基中，以評估鐵濃度對從細胞表現的分子中離胺酸羥基化之水平的影響。

使用兩種不同的化學性界定的基礎細胞培養基：(i) 專有的基於 DMEM/F12 的培養基，其缺乏鐵，以及 (ii) 可商購獲得的 α-MEM 培養基 (ThermoFisher Scientific，目錄號 12000014)，其亦缺乏鐵。使用缺乏鐵的細胞培養基，以藉由補充來實現對培養物中鐵之水平的控制。在對細胞進行培養物培養以表現 CD19 TCB 或 GPRC5D TCB 前，向 α-MEM 培養基補充 10 g/L 葡萄糖及 4 mM L-麩醯胺酸。

從在沒有鐵補充 (0 µM) 的細胞培養基中，或在從 5 mM 鐵儲備溶液補充至培養物之終濃度 0 µM、15 µM、30 µM 或 45 µM 的培養基中培養的細胞表現 CD19 TCB 或 GPRC5D TCB 分子。藉由感應耦合電漿質譜法 (ICP-MS) 分析來評估細胞培養基中的鐵濃度。

如實例 1.6 所描述將細胞培養物上清液澄清且進行分析蛋白 A 層析。如實例 1.7 所描述藉由 LC-MS 肽圖譜來分析經表現之 CD19 TCB 及 GPRC5D TCB 分子中的離胺酸羥基化。

結果示出於下表以及圖 5A 至 5C 及 6A 至 6C 中。在藉由在專有培養基及可商購獲得的 α-MEM 培養基中的表現來生產的 CD19 TCB 及 GPRC5D TCB 分子中觀測到離胺酸羥基化的 Fe 濃度相依性增加。跨包含易發生羥基化的離胺酸殘基的所有位點，隨著細胞培養基中的增加的 Fe 濃度，觀測到增加的離胺酸羥基化之水平，但相關性對於豐度最大的肽 LTVLSSASTK (SEQ ID NO:10；C 末端 K = 位置 350 (對於 CD19 TCB) 以及位置 346 (對於 GPRC5D TCB)) 而言係最特別突出的。HyL 之水平在所測試的整個鐵濃度範圍 (高達 45 µM) 內增加，表明可能需要甚至更高之鐵濃度才能觀測到 HyL 形成之飽和或停滯。在「0 µM」鐵時觀測到的 HyL 可能係由於從種子訓練培養剩餘的殘餘鐵 (進入 TCB mAb 表現培養物) 所致。

CD19 TCB ：

培養基	Fe 濃度 (μM)	YNNYATYYADSVK67 (SEQ ID NO:169)	GTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTK125 (SEQ ID NO:171)	LTVLSSASTK350 (SEQ ID NO:10)
alpha_MEM_0µM	＜ LOD (1.369)	0.06%	0.33%	8.46%
alpha_MEM_15µM	17.272	0.1%	0.55%	15.33%
alpha_MEM_30µM	33.439	0.09%	0.44%	17.76%
alpha_MEM_45µM	49.111	0.1%	0.70%	18.36%
Prop_0µM	＜LOD (0.936)	0.06%	0.22%	9.5%
Prop_15µM	16.58	0.11%	0.52%	17.04%
Prop_30µM	32.537	0.14%	0.58%	19.53%
Prop_45µM	43.07	0.16%	0.57%	21.39%

GPRC5D TCB ：

培養基	Fe 濃度 (μM)	YNNYATYYADSVK67 (SEQ ID NO:169)	AEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTK121 (SEQ ID NO:173)	LTVLSSASTK346 (SEQ ID NO:10)
alpha_MEM_0µM	3.148	0.08%	0.13%	7.76%
alpha_MEM_15µM	15.765	0.11%	0.21%	12.86%
alpha_MEM_30µM	21.562	0.13%	0.26%	15.02%
alpha_MEM_45µM	49.433	0.14%	0.29%	13.32%
Prop_0µM	2.467	0.08%	0.13%	6.27%
Prop_15µM	17.068	0.14%	0.23%	13.31%
Prop_30µM	32.963	0.19%	0.24%	16.63%
Prop_45µM	49.113	0.20%	0.20%	17.04%

該等資料指示，在具有＜50 μM (例如＜45 μM) 之鐵濃度的細胞培養基中表現包含易發生羥基化的離胺酸殘基的多肽會減小在相關位置處包含 HyL 的經表現之分子的比例。該等資料亦表明，在從培養於不同類型之培養基中的細胞表現後，觀測到這種技術效果。

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Claims

一種生產多肽之方法，該多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列包括易發生羥基化的離胺酸殘基，且/或包括易發生羥基化的脯胺酸殘基，其中該方法包含將包含用於表現該多肽的核酸的細胞培養在具有小於 60 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中持續大部分之培養週期。
如請求項 1 之方法，其中該方法包含將該等細胞接種於包含小於 60 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中。
如請求項 1 或請求項 2 之方法，其中該方法包含將包含用於表現該多肽的核酸的細胞培養在包含小於 10 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中，持續大部分之該培養週期。
如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該方法包含將該等細胞接種於包含小於 10 µM 之 Fe 離子濃度的細胞培養基中。
如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列，且其中包括易發生羥基化的離胺酸殘基的該胺基酸序列包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列。
如請求項 1 至 5 中任一項之方法，其中該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列，且其中該多肽包含選自 SEQ ID NO:5、7、9 及 11 的胺基酸序列。
如請求項 1 至 6 中任一項之方法，其中該多肽包含 crossFab 部分之 VL-CH1 區。
如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其中該多肽包含包括易發生羥基化的離胺酸殘基的胺基酸序列，且其中該多肽包含選自 SEQ ID NO:106、107 及 108 的胺基酸序列。
如請求項 1 至 8 中任一項之方法，其中該多肽為多特異性抗原結合分子之組成多肽 (constituent polypeptide)。