TW202607014A - 用於主動脈剝離檢測的蛋白抗原組合及應用 - Google Patents
用於主動脈剝離檢測的蛋白抗原組合及應用Info
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本發明屬於生物檢測領域，具體涉及一種用於主動脈剝離檢測的蛋白抗原組合及應用。具體技術方案包括：抗原組合物，其包括FBN2蛋白質的片段和SPEG蛋白質，FBN2蛋白質的片段胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，SPEG蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示。本發明提供了一種蛋白質抗原及特定的抗原組合，通過檢測其對應的自體抗體，可用於主動脈剝離的檢測或診斷，尤其適用於主動脈剝離發病前的風險評估和預測；並可根據需要進一步製備為相關試劑或試劑組。
Description
本發明屬於生物檢測領域，具體涉及一種用於主動脈剝離檢測的蛋白抗原組合及應用。
主動脈由內膜、中膜和外膜三層組成。其中內膜與血管內的血液直接接觸，主要由基底膜上的一層內皮細胞組成。主動脈剝離(aortic dissection)是一種急症，其特點是主動脈壁的壁膜之間分離，隨後形成假腔。一方面，假腔可能壓迫真正的主動脈腔，造成血流不順暢，甚至堵塞血管；另一方面，假腔內血液淤堵，容易形成血栓；同時，主動脈剝離極易造成動脈破裂，給病人帶來生命危險。
主動脈剝離一般由主動脈內膜的撕裂造成。主動脈內的高壓使得動脈內的血液從內膜撕裂處進入中膜，使中膜分離，並沿主動脈長軸方向擴展，形成主動脈壁的真假兩腔分離狀態。另外，約13%的主動脈剝離患者並未發現內膜撕裂，誘因可能是壁內血腫(由中膜內出血引起)。由於壁內血腫導致的主動脈剝離，其真腔和假腔間不存在直接聯繫，因此很難通過主動脈造影準確診斷。
主動脈剝離發展迅速，早期死亡率很高，許多患者在確診前就已經死亡，因此很難確定總體發病率。未經治療，主動脈剝離是一種致命的疾病，初次發病時的死亡率估計為40%；如未及時診治，患者發病後的48小時內，死亡率每小時增加1%，年死亡率可達90%以上。因此，快速、準確診斷主動脈剝離具有重要的臨床價值。
目前，臨床上主要依靠臨床症狀結合影像學方法來診斷主動脈剝離。根據主動脈剝離診斷和治療指南，突然發生的嚴重胸痛和/或後背痛是主動脈剝離的最典型表現。指南建議將出現急性胸痛的病人作為主動脈剝離的疑似病人，進一步進行實驗室檢查和影像學檢查。
主動脈剝離的影像學檢查，首推電腦斷層血管攝影術(computed tomography angiography，CTA)和磁振造影(magnetic Resonance Imaging，MRI)。CTA屬於介入檢查，需要注射碘造影劑，難以用於碘過敏、腎功能損害、妊娠及甲狀腺功能亢進等患者。MRI掃描時間較長，循環不穩定的患者配合程度低，且對體內置入生命輔助裝置和金屬物的患者是禁忌。因此，影像學檢查的應用受限。
還可以通過檢測血液中的生物標記物來診斷主動脈剝離。指南推薦檢測的生物標記物為D-二聚體。血液中D-二聚體升高時，特別是短時間內快速升高時，擬診主動脈剝離的可能性增大，但仍需與肺栓塞做鑑別診斷，D-二聚體可作為急性主動脈剝離診斷的排除指標。
自體抗體(autoantibody，AAB)是由個體免疫系統產生的、針對個體自體蛋白抗原的抗體。正常情況下，免疫系統根據體內的外源性蛋白或物質而產生抗體，而對個體自體的細胞和成分，並不會產生抗體。但是，在某些特別情況下，特別是病理病況下，免疫系統也會識別個體的一種或多種內源性組分，導致產生自體抗體。
自體抗體檢測在臨床診斷上的應用已經較為廣泛，比如抗甲狀腺自體抗體檢測，抗核抗體檢測，抗磷脂抗體檢測等。疾病相關自體抗體是重要的生物標誌物，不僅可用於診斷特定疾病，還可用於診斷疾病的早期階段(單發或少發症狀)或診斷無典型臨床表現的疾病(非典型形式)，甚至在疾病發病之前數年就作出預警。
目前臨床上尚無針對主動脈剝離的特異性生物標記物。因此，如果能開發提供檢測準確、檢測效果高的特異性生物標記物，將具有廣泛的臨床應用前景。
本發明的目的是提供一種用於主動脈剝離檢測的蛋白抗原組合及應用。
為實現上述發明目的，本發明所採用的技術方案是：一種抗原，所述抗原為FBN2蛋白質的片段，其胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
另外，本發明還提供一種抗原組合，其包含上述抗原以及SPEG蛋白質，所述SPEG蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
優選的，上述抗原組合還包括SGCD蛋白質的片段，所述SGCD蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
優選的，上述抗原組合還包括SMTN蛋白質的片段，所述SMTN蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示；或上述抗原組合還包括COL3A1蛋白質的片段，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
優選的，上述抗原組合還包括SMTN蛋白質的片段和COL3A1蛋白質的片段，所述SMTN蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
優選的，上述抗原組合還包括MAT2A蛋白質的片段和CNN2蛋白質的片段，所述MAT2A蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
優選的，上述抗原組合還包括COL3A1蛋白質的片段、MAT2A蛋白質的片段和CNN2蛋白質的片段，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述MAT2A蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示；或上述抗原組合還包括EFEMP2蛋白質的片段、COL3A1蛋白質的片段、MAT2A蛋白質的片段和CNN2蛋白質的片段，所述EFEMP2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述MAT2A蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示；或上述抗原組合還包括FBN1蛋白質的片段、ACTA2蛋白質的片段、COL3A1蛋白質的片段、MAT2A蛋白質的片段和CNN2蛋白質的片段，所述FBN1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述ACTA2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述MAT2A蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
另外，本發明還提供一種抗原組合，所述抗原組合包括ACTA2蛋白質的片段、COL3A1蛋白質的片段、CNN2蛋白質的片段、SMTN蛋白質的片段和ROBO4蛋白質的片段；所述ACTA2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述SMTN蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述ROBO4蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
相應的，另外，本發明還提供一種抗原，所述抗原為SPEG蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示；或所述抗原為EFEMP2蛋白質的片段，其胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
另外，本發明還提供一種利用所述抗原和/或所述抗原組合製備的檢測或鑑定主動脈剝離、動脈撕裂、動脈損傷的產品。
本發明具有以下有益效果：本發明提供了與主動脈剝離、動脈撕裂、動脈損傷相關的特異性蛋白標記物。通過檢測人體內這些蛋白標記物對應的自體抗體的存在情況，可以有效評估被檢測者罹患主動脈剝離的風險。本發明提供的蛋白標記物，尤其是蛋白標記物組合物，既保證了檢測的高特異性，又極大的提高了檢測的敏感性，在臨床應用上具有極其重要現實的意義。
其中，檢測用的生物學樣品可以是血清、血漿、全血、唾液、口腔黏膜拭子、尿液、淋巴液、腦脊液等。根據具體情況，所述生物學樣品可經提取、稀釋、富集等手段進行預處理。使用方法多樣、簡便易操作。
本發明提供的抗原或抗原組合還可用於製備主動脈剝離、動脈撕裂、動脈損傷相關自體抗體檢測試劑或主動脈剝離診斷試劑。應當理解的是，所述蛋白質抗原組合還可用於製備主動脈剝離相關自體抗體檢測試劑組，所述試劑組可以參照本發明實施例中使用所述蛋白質抗原組合進行主動脈剝離相關自體抗體檢測時的方法和試劑製備，也可根據需要進行相應調整。
綜上，本發明提供了一種蛋白質抗原及特定的抗原組合，其可用於主動脈剝離、動脈撕裂、動脈損傷的檢測或輔助診斷，也適用於主動脈剝離發病的風險評估和預測；並可根據需要進一步製備為相關試劑或試劑組。
本發明發現蛋白質FBN2、ACTA2、MAT2A、SMTN、SPEG、FBN1、EFEMP2、COL3A1、CNN2、SGCD和ROBO4與主動脈剝離的診斷密切相關。
本發明還進一步發現，上述蛋白質的特定蛋白片段或全蛋白，在主動脈剝離診斷上具有突出優勢。具體蛋白片段包括：FBN2(29-50)、ACTA2(30-120)、MAT2A(238-290)、SMTN(106-310)、SPEG(1-113，全蛋白)、FBN1(2235-2294)、EFEMP2(24-51)、COL3A1(90-152)、CNN2(148-309)、SGCD(1-35)、ROBO4(451-733)。其中，所述FBN2蛋白片段序列如SEQ ID NO：1所示。所述ACTA2蛋白片段序列如SEQ ID NO：2所示。所述MAT2A蛋白片段序列如SEQ ID NO：3所示。所述SMTN蛋白片段序列如SEQ ID NO：4所示。所述SPEG蛋白序列如SEQ ID NO：5所示。所述FBN1蛋白片段序列如SEQ ID NO：6所示。所述EFEMP2蛋白片段序列如SEQ ID NO：7所示。所述COL3A1蛋白片段序列如SEQ ID NO：8所示。所述CNN2蛋白片段序列如SEQ ID NO：9所示。所述SGCD蛋白片段序列如SEQ ID NO：10所示。所述ROBO4蛋白片段序列如SEQ ID NO：11所示。
基於該新發現，本發明提供了上述蛋白質在製備檢測、診斷主動脈剝離相關產品(例如試劑組)中的應用。上述各蛋白質、蛋白質片段可單獨進行使用，也可以聯合形成蛋白質(片段)組合物後進行使用。
下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的常規手段。所獲得的數據均為進行至少3次重複後獲得的平均值，且各重複獲得的均為有效數據。
實施例一：蛋白質抗原的重組載體構築、表達、純化和性能展示
1、抗原重組載體的構築和表達。選擇表1中的蛋白質抗原，通過分析它們的序列、結構、功能和表達分佈情況，進行選殖(cloning)。
表1：蛋白質抗原的數據庫ID對應表
| 蛋白名 | Uniprot數據庫ID |
| FBN2 | P35556 |
| ACTA2 | P62736 |
| MAT2A | P31153 |
| SMTN | P53814-2 |
| SPEG | Q15772-4 |
| FBN1 | P35555 |
| EFEMP2 | O95967 |
| COL3A1 | P02461 |
| CNN2 | Q99439 |
| SGCD | Q92629 |
| ROBO4 | Q8WZ75 |
以人類cDNA文庫(購自Invitrogen公司)或者全基因合成DNA為模板，分別設計引子，通過PCR、酶切、連接等分子選殖手段，將所述蛋白的基因選殖到pET28質體上。同時，在蛋白N-端增加HIS、c-myc等標籤，形成融合蛋白。將得到的重組表達載體通過DNA測序鑑定，確認包含正確的蛋白基因。需要說明的是，添加的標籤只是方便識別和提取蛋白，並未對蛋白作為抗原時的功能產生決定性影響，使用時，不添加標籤或根據需要添加其它標籤均可。
將上述包含蛋白基因的重組質體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)勝任細胞中，挑取菌落接種至LB培養基中，37℃搖床培養。當菌體密度達到OD
600約為0.8時，降溫至16℃，在每個LB培養基中加入0.1 mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，誘導表達過夜，獲得菌體。
2、抗原的純化。離心收集誘導表達的所述菌體，用PBS漂洗兩遍。用裂解液(每公克菌體加5 mL至10 mL裂解液)重新懸浮並分散菌體，冰浴，超音波破碎菌體(超音波功率為200瓦，破碎5秒，休息5秒)。破碎後13000 rpm，10℃，離心20分鐘，取上清，經Ni管柱親和層析和分子篩層析兩步純化後，採用SDS-PAGE電泳分析，確認蛋白的分子量、純度，用Bradford法測定濃度後，保存在-80℃備用。獲得純化後的待測蛋白，並計算產率(產率結果如表2)。
3、ELISA檢測蛋白質(片段)抗原的性能。
檢測使用的溶液和試劑如下：
被覆緩衝液(coating buffer)為PBS緩衝液，pH=7.4。其製備方法為：準確稱取3.58 g Na
2HPO
4·12H
2O、0.23 g KH
2PO
4·2H
2O、0.2 g KCl、8.0 g NaCl，溶解於水中，加水至定容量1 L。
封阻液(blocking solution)/樣本稀釋液/抗體稀釋液：將10 g BSA (牛血清白蛋白)溶解於被覆緩衝液中，加水至定容量1 L。
洗滌液：現配現用。使用前在被覆緩衝液中加入0.05%的Tween20 (V/V)，pH=7.4。
TMB顯色劑，購自KPL公司。
終止液：1 M鹽酸。
(1)固相被覆待測蛋白。用被覆緩衝液將步驟2獲得的純化後的待測抗原稀釋至5 μg/mL，加至96孔盤，每孔50 μL，4℃反應過夜。次日倒掉溶液，甩乾，用洗滌液洗三次，每次每孔200 μL。然後每孔加入200 μL封阻液，室溫反應1小時後，將封阻液倒掉，甩乾，再用洗滌液洗三次，每次每孔200 μL，並再次甩乾；獲得位於96孔盤中的固相被覆的抗原。
(2)加入待測樣本。將待測人血清用樣本稀釋液稀釋100倍後，加入所述含待測蛋白的96孔盤，每孔加稀釋後的待測樣本50 μL。隨後將96孔盤置於微孔盤振盪儀上，室溫振盪反應1小時；甩乾，用洗滌液洗三次，每次每孔200 μL，並再次甩乾。
(3)加入酶標記之二抗。將1.0 mg/mL辣根過氧化物酶標記的重組羊抗人免疫球蛋白G抗體(購自Jackson ImmunoResearch Inc.)用抗體稀釋液稀釋20000倍後，加入步驟3處理後的96孔盤中，每孔加50 μL。隨後將96孔盤置於微孔盤振盪儀上，室溫振盪反應0.5小時，將盤甩乾，用洗滌液洗三次，每次每孔200 μL，並再次甩乾。
(4)顯色反應及光密度值讀數。在步驟(3)處理後的96孔盤中，每孔加50 μL的TMB顯色劑，振盪15秒，室溫下避光反應15分鐘，再加入50 μL終止液；然後用酵素免疫分析儀讀取450 nm波長的吸收值，獲得每個待測樣本的檢測信號(S)。
(5)敏感性和特異性分析。分別取48例陽性樣本(確診為主動脈剝離患者的血清)和46例陰性樣本(健康受試者血清)，按上述方法(450 nm波長的吸收值)測定每個樣本的檢測信號(S)。需要說明的是：本發明中的檢測，均是檢測抗原或抗原組合對應的自體抗體，後文不再贅述。以陰性樣本為陰性參考樣本，計算所有陰性參考樣本檢測信號(S)的平均值(M)及標準差(SD)，以M+2SD為Cut Off值。將檢測信號(S)≥Cut Off值的樣本(S≥M+2SD)定義為陽性；將檢測信號(S)＜Cut Off值的樣本(S＜M+2SD)定義為陰性。
基於樣本陽性和陰性結果計算特異性和敏感性。其中，特異性是指健康受試者樣本被正確地判定為陰性的比例，即在陰性樣本中被正確地判定為陰性的數量除以陰性樣本總數。敏感性是指主動脈剝離患者樣本被正確地判定為陽性的比例，即在陽性樣本中被判定為陽性的數量除以陽性樣本總數。通過計算得出每個被測抗原單獨進行樣本檢測時的敏感性和特異性。結果如表2所示。其中，未獲得FBN2、FBN1、COL3A1和ROBO4蛋白質的全蛋白。
表2：各蛋白質抗原的敏感性和特異性展示表
| 蛋白名 | 產率 | 敏感性 | 特異性 |
| FBN2 | 0 (未得到蛋白) | N/A | N/A |
| ACTA2 | 2.4 mg/L | 6.3% | 93.5% |
| MAT2A | 5.2 mg/L | 4.2% | 93.5% |
| SMTN | 8.5 mg/L | 20.8% | 91.3% |
| SPEG | 34.6 mg/L | 45.8% | 95.7% |
| FBN1 | 0 (未得到蛋白) | N/A | N/A |
| EFEMP2 | 6.3 mg/L | 14.6% | 87.0% |
| COL3A1 | 0 (未得到蛋白) | N/A | N/A |
| CNN2 | 17.4 mg/L | 6.3% | 89.1% |
| SGCD | 5.3 mg/L | 4.2% | 97.8% |
| ROBO4 | 0 (未得到蛋白) | N/A | N/A |
實施例二：蛋白片段的選擇和性能展示
參照實施例一的方法，分析表1中的蛋白質的序列、結構、功能和表達分佈情況，分別選擇不同的片段進行選殖，其中，蛋白質SPEG未選殖片段，而是使用全蛋白。具體選擇的蛋白質片段如表3所示。
表3：蛋白質抗原片段的選殖序列對應表
| 蛋白名稱 | 選擇片段 | 蛋白名稱 | 選擇片段 |
| FBN2 | 29-77 | FBN1 | 25-450 |
| 29-50 | 25-44 | ||
| 2780-2912 | 2725-2861 | ||
| 45-77 | 2748-2798 | ||
| ACTA2 | 3-375 | 2789-2844 | |
| 6-152 | 2836-2861 | ||
| 146-338 | 2235-2294 | ||
| 337-375 | 2062-2082 | ||
| 30-120 | EFEMP2 | 24-86 | |
| MAT2A | 1-182 | 282-442 | |
| 169-289 | 331-442 | ||
| 275-395 | 341-430 | ||
| 93-194 | 24-51 | ||
| 238-290 | 337-412 | ||
| 285-395 | COL3A1 | 24-1221 | |
| SMTN | 344-461 | 24-153 | |
| 106-310 | 154-597 | ||
| SPEG | 1-113 | 591-898 | |
| CNN2 | 11-150 | 885-1221 | |
| 148-309 | 591-837 | ||
| ROBO4 | 1-446 | 90-152 | |
| 439-1007 | 1253-1435 | ||
| 39-446 | SGCD | 1-35 | |
| 451-733 | 57-289 |
參照實施例一的方法，計算各片段的產率。使用與實施例一相同的樣本，檢測和計算表3中各抗原單獨進行樣本檢測時的敏感性和特異性。結果如表4所示。
表4：各抗原的敏感性和特異性展示表
| 蛋白名 | 選擇片段 | 產率 | 敏感性 | 特異性 |
| FBN2 | 29-77 | 31.3 mg/L | 6.3% | 80.4% |
| 29-50 | 35.4 mg/L | 47.9% | 93.5% | |
| 2780-2912 | 5.8 mg/L | 10.4% | 84.8% | |
| 45-77 | 43.6 mg/L | 4.2% | 84.8% | |
| ACTA2 | 3-375 | 1.7 mg/L | 8.3% | 93.5% |
| 6-152 | 10.4 mg/L | 2.1% | 89.1% | |
| 146-338 | 1.3 mg/L | 6.3% | 95.7% | |
| 337-375 | 1.2 mg/L | 6.3% | 93.5% | |
| 30-120 | 30.4 mg/L | 31.3% | 95.7% | |
| MAT2A | 1-182 | 3.4 mg/L | 10.4% | 78.3% |
| 169-289 | 1.4 mg/L | 4.2% | 84.8% | |
| 275-395 | 1.5 mg/L | 8.3% | 84.8% | |
| 93-194 | 8.4 mg/L | 18.8% | 95.7% | |
| 238-290 | 15.8 mg/L | 33.3% | 93.5% | |
| 285-395 | 2.3 mg/L | 10.4% | 95.7% | |
| SMTN | 344-461 | 35.5 mg/L | 14.6% | 95.7% |
| 106-310 | 27.6 mg/L | 41.7% | 97.8% | |
| SPEG | 1-113 (全長) | 34.6 mg/L | 45.8% | 95.7% |
| CNN2 | 11-150 | 28.5 mg/L | 14.6% | 91.3% |
| 148-309 | 21.3 mg/L | 37.5% | 91.3% | |
| SGCD | 1-35 | 26.5 mg/L | 27.1% | 95.7% |
| 57-289 | 11.4 mg/L | 12.5% | 93.5% | |
| FBN1 | 25-450 | 1.5 mg/L | 2.1% | 93.5% |
| 25-44 | 23.4 mg/L | 4.2% | 93.5% | |
| 2725-2861 | 14.8 mg/L | 2.1% | 89.1% | |
| 2748-2798 | 4.6 mg/L | 18.8% | 93.5% | |
| 2789-2844 | 15.5 mg/L | 10.4% | 97.8% | |
| 2836-2861 | 16.7 mg/L | 20.8% | 95.7% | |
| 2235-2294 | 32.5 mg/L | 35.4% | 95.7% | |
| 2062-2082 | 35.3 mg/L | 14.6% | 93.5% | |
| EFEMP2 | 24-86 | 21.4 mg/L | 10.4% | 89.1% |
| 282-442 | 5.8 mg/L | 6.3% | 93.5% | |
| 331-442 | 5.5 mg/L | 8.3% | 97.8% | |
| 341-430 | 15.5 mg/L | 4.2% | 97.8% | |
| 24-51 | 28.8 mg/L | 43.8% | 95.7% | |
| 337-412 | 10.4 mg/L | 16.7% | 95.7% | |
| COL3A1 | 24-1221 | 2.7 mg/L | 10.4% | 93.5% |
| 24-153 | 3.5 mg/L | 4.2% | 89.1% | |
| 154-597 | 11.6 mg/L | 8.3% | 93.5% | |
| 591-898 | 10.5 mg/L | 8.3% | 89.1% | |
| 885-1221 | 14.6 mg/L | 8.3% | 87.0% | |
| 591-837 | 19.4 mg/L | 2.1% | 95.7% | |
| 90-152 | 24.2 mg/L | 35.4% | 95.7% | |
| 1253-1435 | 3.1 mg/L | 16.7% | 93.5% | |
| ROBO4 | 1-446 | 2.5 mg/L | 8.3% | 95.7% |
| 439-1007 | 6.8 mg/L | 6.3% | 95.7% | |
| 39-446 | 2.0 mg/L | 10.4% | 100% | |
| 451-733 | 18.5 mg/L | 43.8% | 95.7% |
根據表4的結果，分別從各個蛋白質抗原中選出1個最優的片段，結果如表5所示。優選的蛋白質抗原片段不僅特異性和敏感性都很好，而且產率也較高，有利於後續放大和生產。
表5：優選的抗原片段敏感性和特異性展示表
| 抗原 | 產率 | 敏感性 | 特異性 |
| FBN2 (29-50) | 35.4 mg/L | 47.9% | 93.5% |
| ACTA2 (30-120) | 30.4 mg/L | 31.3% | 95.7% |
| MAT2A (238-290) | 15.8 mg/L | 33.3% | 93.5% |
| SMTN (106-310) | 27.6 mg/L | 41.7% | 97.8% |
| SPEG (1-113) | 34.6 mg/L | 45.8% | 95.7% |
| CNN2 (148-309) | 21.3 mg/L | 37.5% | 91.3% |
| SGCD (1-35) | 26.5 mg/L | 27.1% | 95.7% |
| FBN1 (2235-2294) | 32.5 mg/L | 35.4% | 95.7% |
| EFEMP2 (24-51) | 28.8 mg/L | 43.8% | 95.7% |
| COL3A1 (90-152) | 24.2 mg/L | 35.4% | 95.7% |
| ROBO4 (451-733) | 18.5 mg/L | 43.8% | 95.7% |
實施例三：抗原組合的檢測效果展示
從實施例二表5中選擇不同的抗原片段，形成不同的抗原組合，抗原組合如表6所示。需要說明的是，發明人並非只進行了表6的組合試驗；發明人經過大量前期試驗後才獲得表6中所示的各抗原組合，因篇幅限制，只選取了部分效果較優的組合。
表6：各抗原組合對照表
| 組合 | 組合中包含的候選蛋白抗原 |
| 組合1 | FBN2 (29-50)，SPEG (1-113) |
| 組合2 | FBN2 (29-50)，SPEG (1-113)，SGCD (1-35) |
| 組合3 | FBN2 (29-50)，SPEG (1-113)，SGCD (1-35)，SMTN (106-310) |
| 組合4 | FBN2 (29-50)，SPEG (1-113)，SGCD (1-35)，COL3A1 (90-152) |
| 組合5 | FBN2 (29-50)，SPEG (1-113)，COL3A1 (90-152)，MAT2A (238-290)，CNN2 (148-309) |
| 組合6 | FBN2 (29-50)，SPEG (1-113)，SGCD (1-35)，COL3A1 (90-152)，SMTN (106-310) |
| 組合7 | FBN2 (29-50)，SPEG (1-113)， SGCD (1-35)，COL3A1 (90-152)，SMTN (106-310)，MAT2A (238-290)，CNN2 (148-309) |
| 組合8 | FBN2 (29-50)，SPEG (1-113)，CNN2 (148-309)，EFEMP2 (24-51)，COL3A1 (90-152)，MAT2A (238-290) |
| 組合9 | FBN2 (29-50)，SPEG (1-113)，CNN2 (148-309)，FBN1 (2235-2294)，ACTA2 (30-120)，COL3A1 (90-152)，MAT2A (238-290) |
| 組合10 | ACTA2 (30-120)，COL3A1 (90-152)，CNN2 (148-309)，SMTN (106-310)，ROBO4 (451-733) |
2、分別取48例陽性(主動脈剝離患者)樣本和46例陰性(健康受試者)樣本，參照實施例一的檢測方法，分別使用表6中各組抗原組合對上述各樣本進行敏感性和特異性檢測。
抗原組合中，單個抗原的陽性和陰性的定義方法參照實施例一。抗原組合的整體敏感性和特異性定義方法如下：
對於一個抗原組合，當某個血清樣本採用該組合中的任意一個抗原得到的檢測信號為陽性檢測信號時，該血清樣本為陽性樣本；否則該血清樣本為陰性樣本。
基於上述陽性和陰性定義方法，檢測獲得一個抗原組合檢測得到的陽性和陰性結果，進而計算該抗原組合在患者樣本中的敏感性。
其中，敏感性是指主動脈剝離患者樣本總共被正確地判定為陽性的比例，即在所有主動脈剝離患者樣本中被判定為陽性的數量除以所有主動脈剝離患者樣本總數；特異性是指健康受試者樣本被正確地判定為陰性的比例，即在健康受試者樣本中，健康受試者樣本中被判定為陰性的數量除以健康受試者樣本總數。
各組抗原組合檢測獲得的敏感性和特異性結果如表7所示。
表7：各組抗原組合的敏感性和特異性檢測結果對照表
| 組合 | 敏感性 | 特異性 |
| 組合1 | 62.5% | 93.5% |
| 組合2 | 66.7% | 93.5% |
| 組合3 | 70.8% | 93.5% |
| 組合4 | 68.8% | 91.3% |
| 組合5 | 72.9% | 84.8% |
| 組合6 | 72.9% | 91.3% |
| 組合7 | 79.2% | 84.8% |
| 組合8 | 75.0% | 84.8% |
| 組合9 | 72.9% | 84.8% |
| 組合10 | 70.8% | 87.0% |
在後期應用時，還可根據需要，從本發明提供的理想候選抗原中選擇一種或多種，製作成診斷試劑組。
以上所述的實施例僅是對本發明的優選方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，所屬技術領域中具有通常知識者對本發明的技術方案做出的各種變形、變型、修改、替換，均應落入本發明申請專利範圍確定的保護範圍內。
無
無
無
TW202607014A_114112576_SEQL.xml
無。
Claims (10)
- 一種抗原，所述抗原為FBN2蛋白質的片段，其胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
- 一種抗原組合，其包含如請求項1所述之抗原以及SPEG蛋白質，所述SPEG蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
- 如請求項2所述之抗原組合，其中，所述抗原組合還包括SGCD蛋白質的片段，所述SGCD蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
- 如請求項3所述之抗原組合，其中，所述抗原組合還包括SMTN蛋白質的片段，所述SMTN蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示；或所述抗原組合還包括COL3A1蛋白質的片段，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
- 如請求項3所述之抗原組合，其中，所述抗原組合還包括SMTN蛋白質的片段和COL3A1蛋白質的片段，所述SMTN蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
- 如請求項5所述之抗原組合，其中，所述抗原組合還包括MAT2A蛋白質的片段和CNN2蛋白質的片段，所述MAT2A蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
- 如請求項2所述之抗原組合，其中： 所述抗原組合還包括COL3A1蛋白質的片段、MAT2A蛋白質的片段和CNN2蛋白質的片段，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述MAT2A蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示；或 所述抗原組合還包括EFEMP2蛋白質的片段、COL3A1蛋白質的片段、MAT2A蛋白質的片段和CNN2蛋白質的片段，所述EFEMP2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述MAT2A蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示；或 所述抗原組合還包括FBN1蛋白質的片段、ACTA2蛋白質的片段、COL3A1蛋白質的片段、MAT2A蛋白質的片段和CNN2蛋白質的片段，所述FBN1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述ACTA2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述MAT2A蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
- 一種抗原組合，其中，所述抗原組合包括ACTA2蛋白質的片段、COL3A1蛋白質的片段、CNN2蛋白質的片段、SMTN蛋白質的片段和ROBO4蛋白質的片段；所述ACTA2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述COL3A1蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CNN2蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述SMTN蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述ROBO4蛋白質的片段的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
- 一種用於檢測或鑑定主動脈剝離、動脈撕裂、動脈損傷的抗原，其中，所述抗原為EFEMP2蛋白質的片段，其胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
- 一種利用如請求項1或9所述之抗原和/或如請求項2至8中任一項所述之抗原組合或SPEG蛋白質所製備的檢測或鑑定主動脈剝離、動脈撕裂、動脈損傷的產品，所述SPEG蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2024110667373 | 2024-08-06 |
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