TW524806B - Chemical modification of proteins to improve biocompatibility and bioactivity - Google Patents

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524806 A7 B7 五、發明説明（1 ) ' 免明之範疇 本發明係廣泛地關於生物活性蛋白質或其類似物之化學 改質（本文所用之術語，，蛋白質，，，除非另有說明，否則盥” 多肽”及”肽”係同義字）。更特定而言，本發明係説明各種 蛋白質之部位特異性化學改質之新穎方法，及生成之組合 物。 壁L明之背景 由於近來基因及細胞工程技術之進展，已知在活體内可 王現各種藥理作用之蛋白質能大量生產以供醫藥應用。此 等蛋白溢包括紅血球生成素（EPO)、顆粒性白血球群落-剌 激因子（G-CSF)、干擾素Upr、普遍性）、腫瘤壞死 因子結合蛋白質（TNFbp)、間白素1-受器拮抗劑（IL-lra) 、腦-衍生之親神經因子（BDNF)、角化細胞生長因子 (KGF)、幹細胞生長因子（SCF)、成巨核細胞生長分化因子 (MGDF)、骨原泰格素（〇pg)、衍生自膠質細胞系之親神經 因子（GDNF)、肥胖蛋白質（0B蛋白質）。此處之〇b蛋白 質也可稱爲菜普亭（Leptin)。 經濟部中央標攀局員工消費合作社印製 顆粒性白血球群落-刺激因子（G_CSF)係一種糖蛋白，其 誘發造血先質細胞分化成嗜中性白血球，及刺激成熟之嗜 中性白血球之活性。在大腸桿菌中表現之重組人類G-CSF (rhG-CSF)含有175種胺基酸，分子量爲18,798 Da，並具 有生物活性。目前菲爾葛拉斯汀（，一種重組 G-CSF，已使用於醫藥用途。 G-CSF在各種狀況下之結構已被廣泛地研究[見Lu等 -4- 本纸張尺度適用中國國家標i(CNS )八4規格（210X297公茇） 524806 A7 ------ B7 五、發明説明（2 ) ^一' 人，J. Biol· Chem· Vol·姐，8770_8777 (1992)],而 rhG_
CSF之三次元結構最近已藉χ-射線結晶法測定出來。cSF 係一共有四條“ _螺旋束（伴有二長交聯）之共同結構主要部 位之生長因子族群之一員[Hill等人，P N A s USA, v〇1 5167-5171(1993)]。該族群包括 gm-CSF、生長激素、 間白素-2、間白素-4及干擾素卢。二次元結構之程度對溶 劑之p Η値敏感，因而此蛋白質在酸性ρ η値下甚至需要更 高程度之螺旋含量[Lu等人.，Arch· B1〇chem· Biophys” 迦，81-92 (1989)] 〇 _ 經濟部中央標擎局員工消費合作社印裝 萊晋手在〇b/ob突變鼠（由於在〇Β基因產物之製造上有 缺陷而造成鼠肥胖）與正常野生型鼠之活體中均具活性。生 物活性本身顯示之作用中有一項爲減輕體重。總論見巴林 那格（Barinaga)，”肥胖”蛋白質使鼠體重減輕，Science 475-476 (1995)及福利德曼（Friedman)，”重量控制之 基本原理”，Nature 185: 1 19-120 (1997)。已知在 〇b/〇 b 突變鼠中投與莱普亭之情況下導致血清胰島素濃度及血清 葡萄糖濃度降低。又已知投與萊普亭導致身體肥胖減低。 此在ob/ob突變鼠與非肥胖正常鼠中均被發現 [Pelleymounter 等人，Science 269: 540-543 (1995)：
Halaas 等人，Science 269: 543-546 (1995) : Campfield 等 人，Science 2ϋ: 546-549 (1995)(周圍及中樞投與微克劑 量之莱晋亭降低ob/ob及食物謗發肥胖鼠之食物攝取量及 體重，而db/db肥胖鼠則否）。在此等報告中，無任何一 篇發現毒性，甚至在最高劑量亦復如此。 -5- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公棼） 524806 A7 B7 五、發明説明（3 在動物模型中菜晋亭謗發體重減輕之初步實驗，預測需 要長期投與咼濃度菜普亭配方，方能有效治療人類肥胖 症。關於劑量範圍（以毫克蛋白質/每公斤體重爲單位），較 大哺乳類（如人類）之治療有效注射劑量例如爲〇.5或1〇亳 克/公斤/曰或以下。因此需升高蛋白質濃度以避免注射大 體積，大體積注射可能會造成病患不舒服或疼痛。 不幸地，製備注射於人類之醫藥組合物，發現菜普亭胺 基I系列在較南;辰度（如約2毫克活性蛋白質/毫升液體以 上）時，於生理足 値下不溶解。當低pH配方以高劑量 技與時，由於莱晋苧在生理條件下之溶解度不良，所以在 注射部位以濃度依賴方式形成菜普亭之沉澱。伴隨著觀察 到之菜普亭沉澱，可見到注射部位有發炎反應，其包括以 存在嗜伊紅性白血球、巨噬細胞及巨細胞爲特徵之混合細 胞浸潤。 至今，尚未報告任何有關人類〇B蛋白質在生理pH値及 濃度至少約2毫克/毫升下安定之製銅，再者，亦無任何報 導，到活性人類⑽蛋白質在至少約5Q毫克/毫升或其上 之濃度爲安定。容許投與高劑量但無上文所述問題之菜普 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 亭劑型之開發將具有很大之利益。因此本發明目的之—:
乃在藉蛋白質之部位特異性化學改f之方式而提供菜普亭 之改良形式。 T 已報導有用之治療性蛋白質之化以質之數種方法。此 等万法之一爲琥轴醯化，其係將—或多個琥斑醯基部分鱼 生物活性蛋白質結合。琥始醯化之典型途徑爲採用驗性反 -6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（21〇χ 297公犮 524806 A7 B7 五、發明説明（4 ) 應條件與大量過量之琥珀酸酐。所產生之琥珀醯-蛋白質結 合物通常在多部位改質，常顯示改變之三級及四級結構， 並經常爲非活性。各種琥珀醯化蛋白質之性質如
Holcenberg 等人，J. Biol. Chem, 250: 4165-41 70 (1 975)及 1988年3月10曰公開之WO 88/01511(及其中參考之文獻） 所述。很重要地，迄今尚無任何一篇參考文獻述及將生物 活性蛋白質只在蛋白質之N -端單號拍醯化之方法，及所生 成之組合物呈現改良之溶解度及改良之注射部位毒性。 二伸乙三胺五乙酸酐（DTP Α)與伸乙二胺四乙酸二酐 (EDTA2)過去已被用來將螯合部位引進蛋白質中以供放射 線標記。與琥珀醯化類似，使用DTPA及/或EDTA2之改 質’通常於整個分子之多個部位發生，並改變改質蛋白質 之電荷及等電點。迄今尚無任何述及D τ p A及/或E D T A2 足單體及二聚體呈現改良之溶解度及改良之注射部位毒性 之報導。 發明之摘要説明 本+發明係關於化學改質蛋白質如菜普亭及G-CSF之大體 經濟部中央標導局員工消費合作社印製 =貝製釗及其製備方法。意外地，萊普亭之部位特異性化 子改貝頭7F生物利用性及生物相容性之優點，此等優點在 其他萊普亭種類中未見到。很重要地，本文所述之方法可 2廣地應用於其他蛋白質(或其類似物），且效果與萊普 T 一樣好。因此j 二、 岛 以下更評細之説明，本發明關於許多化 質蛋白質(或其類似物)及特定蛋白質之特異性改質。 、 本&明係關於單琥珀醯化菜普亭（或其類似物） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 524806 A7 B7 五、發明説明（S ) 之大體均質製劑及相關方法。重要地，本文所述之方法， 以高產率得到只在N -端改質之單號珀醯化蛋白質，藉此而 提供其他種類所不及之加工優點。並且，僅管只進行溫和 之N -端改質，該單取代破珀_基-菜普亭意外地顯示：1) 溶解度之實質改良；2 )保留二級結構，試管中之受器結合 活性及活體中之生物效力；及3 )減輕投與高濃度未改質莱 普亭時所觀察到之嚴重注射部位反應。 另一方面，本發明係關於單琥珀醯化G-CSF(及其類似物） 之大體均質製劑及有關方法。重要地，該單取代琥珀醯基-G-CSF及單取代琥珀醯基-G-CSF類似物意外地顯示在溶解 度、4 °C及37 °C物理安定性及試管中生物活性上之實質改 良。 另一方面，本發明係關於DTPA-菜普亭單體及二聚體之 大體均質製劑及相關方法。當與菜普亭在中性P Η値及低 過量之DTPA :蛋白質化學計量比例下反應時，此試劑意 外地以高產率在兩個莱普亭分子Ν-端間形成單交聯。當將 被DTP Α單取代之莱普亭單體及二聚體單離時，相對於未 改質蛋白質，其均顯示實質增加之溶解度。彼等亦均呈現 保留之試管中受器結合活性及活體中生物效力。深具意義 者乃被DTPA單取代之萊普亭之二聚體形式，當其以溶於 PBS之高濃度溶液注射時並不沉澱，並顯示在未改質萊普 亭所觀察到之注射部位反應獲得顯著改善。 又另一方面，本發明係關於EDTA二酐（EDTA2) -莱普亭 單體及二聚體之大體均質製劑及相關方法。EDTA2，結構 -8- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨0X 297公兑） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁
、1T 524806 A7 B7 五、發明説明（6 ) 上類似DTPA，當在中性pH値及化學計量過量下能有效 地經由N-端交聯菜普亭。單離之EDTA2-菜普亭二聚體顯 示，相對於未改質之菜普亭，顯著增加溶解度，並保持完 整之試管中受器結合活性及活體中生物活性。再者，此種 EDTA2-菜普亭之結合體，當其以溶於PBS之高濃度溶液投 與時，不會在注射部位沉澱，並顯示在未改質菜普亭所觀 察到之注射部位不良反應獲得貫質改善。 圖式之簡單説明 圖1係琥珀酸化莱普亭以陰離子交換層析法分離之層析 圖。將280 nm之吸收度對溶析體積毫升數作圖。單琥珀 醯化莱普亭之吸收尖峰以（* )標示。 圖2係pH3-7 IEF-PAGE凝膠圖譜，描繪未改質菜普亭 (行2 )，琥珀醯化萊普亭（行3 )，DTPA改質莱普亭二聚體 (行4)及EDTA2改質菜普亭二聚體（行5)。行1及行6爲等 電點標記。 圖3係被DTPA交聯之萊普亭單體及二聚體，以尺寸排 除層析法分離之層析圖。將280 nm之吸收度對溶析體積毫 升數作圖。被DTP A單取代之菜普亭二聚體形式以（* )標 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之达意事項界填寫本頁) 示0 圖4係4-20% SDS-PAGE凝膠圖譜，描繪未改質菜普亭 (行2 )，琥珀醯化萊普亭（行3 )，DTPA改質莱普亭二聚體 (行4)及EDTA2改質萊普亭二聚體（行5 )。行1及行6爲分 子量標記。 圖5係EDTA2交聯之萊f亭單體及二聚體，以尺寸排除
C -9- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ<4規格（210X 297公犮） 524806 A7 B7 五、發明説明（7 層析法分離之層析圖。將280 nm之吸收度對溶析真 數作圖。被EDTA2單取代之菜普亭之二？ 这貝笔 示。 次植形式以（*)標 圖6係Lys-C消化物之逆相jjPLC層析圖，％ 一 良、不由於藉王卢 珀酸酐將N-端肽（Ml-K6)化學改質所造成 、" 移。 、 < < 停留時間位 圖7係Lys-C消化物之逆相HPLC層析一 DTPA將N-端肽（M卜K6)化學改質所造成之停留時間^ 移。 - 圖8,係Lys-C消化物之逆相HPLC層析圖，顯示由 EDTA2將N-端肽（M 1 -K6 )化學改質所造成之停留時間^ 移。 圖9描繪未改質原始菜普亭及單琥珀醯化萊普亭之遠一 UV CD光譜。此兩樣品均爲室溫下在〇25毫克/毫「升<之^ 酸缓衝食鹽水溶液中測定。 圖10係藉自固定之人類菜普亭受器置換被放射線標記之 ^類萊普亭，而描繪未改質莱普亭（-命0，琥珀醯化菜普 苧（-_-)，DTPA-菜普亭二聚體卜EDTA2_菜普亭二 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 聚體（-··)在試管中受器結合度之圖。配位子濃度（微克/ 毫升）對配位子之結合百分率作圖。 圖1 1係描繪以未改質菜普亭卜♦_)，琥珀醯化菜普亭（_ ) DTPA來普手一聚體（-▲-)或DTP A-菜普亭單體（一 X-)處理之鼠體重減輕之圖。該鼠係以2毫克/毫升之PBS 浴液每曰投與1 0毫克/公斤之劑量。以時間（曰數）對重量 -10 本纸張尺度賴巾目 524806 A7 ----_ 137 _ 五、發明説明（8 ) 一' 減輕百分率作圖。 圖12係描績以20毫克/毫升未改質莱普亭（-▲-)、2毫 克/¾升未改質萊普亭♦勺，2〇毫克/毫升EDTA2-莱普 苧二聚體（-_-)，或2毫克/毫升EDTA2_策普亭二聚體卜 X -)處理之鼠體重減輕之圖。該鼠係以2 〇毫克/毫升之 PBS落液每曰投與1〇〇毫克/公斤之劑量或以2毫克/毫升之 PBS溶液每曰投與1〇毫克/公斤之劑量（未改質菜普亭由於 在PBS中落解性差，其100毫克/公斤及20毫克/毫升之劑 1係在p Η 4.0醋酸緩衝溶液中配製）。以時間（日數）對重 量減輕百分率作圖。 圖1 J係描％未改質G-CSF (-♦_)及琥珀醯化G-CSF (-_-)試官中生物活性之圖。以GpM-BGND對1〇g(微克/每 孔）作圖。 圖14係描繪以未改質匕CSF在4。〇 (_♦_)，琥珀醯化 G-CSF 在 4 C (-_-)，未改質 G-CSF 在 37。〇 (_▲·)或琥 珀醒化G- CSF在37 °C (- ·-)進行物理安定性測試結果之 圖。以蛋白溢濃度（毫克/毫升）對時間（小時）作圖。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 圖1 5係描繪未改質g-CSF (-♦ ·)、未改質G_csf (C17A) 及琥珀醯化G-CSF (C17A) (-▲-)試管中生 物活性之圖。以GPM-BGND對l0g(微克/每孔）作圖。 發明之祥細説明 本發明係關於化學改質蛋白質之大體均質製劑及其相關 方法。此處所使用足大體均質”意、指所觀察到之准一化學 改質蛋白質爲具有一個”改質劑"（例如DTPA、EDTA2、琥 -11 - 本纸乐尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210 X 297公犮） 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 524806 A； ________ _ B7 1 一111 1 —— —— 五、發明説明（9 ) —- 珀醯基）部分者。該製劑可包含未反應（亦即缺少改質劑部 分）蛋白質。經由肽圖及N -端序列確定後，以 、 瓦以下—貫例提 么、含有至少90%改質蛋白質，及至多丨〇0/〇未改質蛋白質之 製別。製劑之化學改質物質以至少95%(如以下之實例）爲 較佳，而又以製劑之化學改質物質爲99%或以上爲更佳。 孩化學改質物質具有生物活性。本發明所提供之，，大體均質 ”單琥珀醯化菜普亭、DTPA-莱普亭、及£0丁八夂萊=亭二 劑具有足夠勻質性，以顯示均質製劑之優點，例如臨床應 用時易於預期各批之藥品動力性質。 ‘ 本文所用術語Γ生物活性劑」係指重組或天然產之蛋白 貝（典論人類或動物），而使用於預防、治療或診斷之應用 者。該生物活性劑可爲天然、合成、半合成或其衍生物。 再者，本發明之生物活性劑爲已知者。涵蓋廣範圍之生物 活性劑。其非限定性地包括激素、組織介素、造血因子、 生長因子、抗肥胖因子、營養因子、抗發炎因子、及酵素 (更.夕有用之生物活性劑亦見於美國專利第號）。 熟悉本技藝者可輕易地選取所需要之生物活性劑用於本發 明之組合物中。 此等蛋白質非限定性地包括干擾素（見美國專利第 d，j72,8G8、），541,293、4,897,471、及 4,695,623 號，其 全又及圖式被列爲本文參考文獻）、間白素（見美國專利第 • 其王文及圖式被列爲本文參考文獻）、紅血 尔生成素（見美國專利第4,7〇3,008 、 5,441,868 、 d，61 8,698、：>，547,933 及 5,621，_ 號，其全文及被列 -12 (請先閱讀背面之主意事項亦填寫本頁)
524806 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 -13 - A7 B7 五、發明説明（1〇 ) 爲本文參考文獻）、顆粒性白血球-群落刺激因子（見美國專 利第 4,810,643、4,999,291、5,581，476、5,582,823 號及 PCT公告第94/1 71δ5號，其全文及圖式被列爲本文參考文 獻）、幹細胞生長因子（PCT公告第91/05795、92/17505及 95/172〇6號，其全文及圖式被列爲本文參考文獻）及菜普亭 (ΟΒ 蛋白質）（PCT 公告第 96/40912 、 96/05309 、 97/00128、97/01010及97/06816號，其全文及圖式被列爲 本文參考文獻）。1996年2月22日公開之PCT公告W〇 96/05 3 09號，題目爲”體重之調節者，對應之核酸及蛋白 貝’及其診斷及治療用途”，其詳述〇 B蛋白質以及相關組 合物及方法，其被列爲本文參考文獻。一種人類〇 B蛋白 貝之胺基酸序列被記載於WO 96/05 3 09序列識別編號4及 6中（該公告之第172及174頁），而該成熟蛋白質之第一個 胺基酸殘基係位於第2 2位之纈胺酸。該成熟蛋白質爲146 歹叉基（或14D—若缺少第4 9位之麩胺酸，序列識別編號 4)。 一般而言，在實施本發明上有用之g-csf可爲分離自哺 扎頜動物之形式，或者爲化學合成步驟之產物，或藉基因 、或cDNA每或DNA合成而得到之外源DNA序列之原 核生物或眞核生物宿主表現產物。合適之原核生物宿主包 括各種細菌（例如大腸菌）：合適之眞核生物宿主包括酵母 菌（例如啤酒釀母菌）及 14 )及哺礼類細胞（例如中華倉鼠子宮細 胞、猴細胞）。依據所使 a、、' 、 1定用〜佰王，孩G-CSF表現產物可 用哺乳類或其他直核4， ^ 生為足妓水化合物糖化，而其也可爲 本紙張尺度適用中國國家標___ 〜裕（210x297公筇） (請先閲讀背面之>1-意事項亦填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 524806 A7 ___ B7 五、發明説明（11 ) 非糖化物。該G-CSF表現產物也可舍括 匕栝起始足甲硫胺酸胺 基酸殘基（在第1位）。本發明涵蓋任—及所有此等 形式之使用，惟就最大市場實用性及其他性質考量時，以 衍生自大腸菌之重組G-CSF爲較佳。 ^ 某些G-CSF類似物據報導具有生物功能，且其也可被化 學改質。G-CSF類似物被記載於美國專利第4,81〇,643號 中。其他被報告具有生物活性之G-CSF類似物之例子被記° 載於 AU-A-76380/91、ΕΡ 〇 459 630、ΕΡ 〇 272 703、ΕΡ Ο 473 268及ΕΡ 0 335 423，惟有關各被報告之類似物之 活性並無代表性例子佐證。也可參考AU-A-10948/92、 PCTUS94/〇〇913及ΕΡ 0 243 153。一般而言，在本發明中 有用之G-CSF及其類似物可藉本文提供之化學改質步驟， 及測試生成產物所期望之生物特性（如本文提供之生物活性 分析）而被確認。當然如果期望治療非人哺乳類，其可使用 重组足非人頦G-CSF’s，例如重組之鼠類、牛類、犬類 等。例如見 PCT W〇 9105798 及 PCT WO 8910932。 再者，生物活性劑非限定性地包括胰島素、胃泌素、催 乳激素、腎上腺皮質素（ACTH)、甲狀腺激素（TSH)、促黃 體激素（LH)、促卵泡成熟激素（Fsh)、人絨毛膜促性腺激 素（HCG)、款動素、干擾素(^、卢、η、間白素至 IL-12)、腫瘤壞死因子（Tnf)、腫瘤壞死因子結合蛋白質 (TNF-bp)、腦-衍生之親神經因子（BdNF)、衍生自膠質細 胞系之親神經因子（GDNF)、親神經因子3 (NT3)、纖維母 細胞生長因子（FGF)、親神經生長因子（NGF)、骨生長因 _ -14- 本纸張尺度適用中國國家標準（C^TI^iT21〇X 297公漦1 '~~' (請先閱讀背面之汰意事項^:填寫本頁)
524806 A 7 _____β7 五、發明説明（12 ) ~ 子，如骨質蛋白整合素（OPG)。類胰島素生長因子 (IGFs)、巨噬細胞群落刺激因子（M_CSF)、顆粒性白血球 巨噬細胞群落刺激因子（GM_CSF)、成巨核細胞衍生之生長 因子（MGDF)、角化細胞生長因子（KGF)、凝血酶生成素、 血小板衍生之生長因子（PGDF)、群落刺激生長因子 (CSFs)、骨形態蛋白質（BMP)、超氧化物歧化酶（s〇D)、 組織纖維蛋白溶酶原活化劑（TP A)、尿激酶、鏈激酶、及 血言舒張素。本文所用蛋白質一詞包括肽、多肽、或其同 義分子、類似物、衍生物或組合物。 一般而言，本發明係涵蓋醫藥組合物，其包含有效量之 化學改質蛋白質或其衍生產物，連帶醫藥允許之稀釋劑、 防腐劑、增〉4制、乳化劑、佐劑及/或投與所需之載劑（見 本文引用之參考文獻PC T 97/0 1 3 3 1 )。所期望生物活性 劑之最佳醫藥配方將由熟習本技藝人士，依據投與途徑及 所需劑量而決定。例示之醫藥組合物被揭示於Remington 之 Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co., 18th Ed.，Easton，pA，pgs 1 43 5 - 1 7 1 2 ( 1 99〇))。本 發明之醫藥組合物可藉口服或非口服製劑[例如經由肌肉、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製， 皮下、皮膚、内臟、IV(靜脈内）、IP(腹膜腔内）、關節 内、安置耳内、1C V(大腦内室）、動脈内、鞘内、囊内、 眼眶内、可汪射、肺部、鼻、直腸及穿過子宮黏膜之製劑] 而投與。 本發明組合物之治療用途取決於所使用之生物活性劑。 熟習此技藝者可輕易地選取所期望之生物活性劑以配合本 __-15_ 本紙張用中國國家標準---- 524806 Α7 Β7 五、發明説明（13 ) 發明所期望之治療用途。此等藥劑之治療用途被在下列文 獻中有更詳盡之説明，此等文獻（包括圖式）被列爲本文參 考文獻。治療用途非限定性地包括下列蛋白質之用途：干 擾素（見美國專利第5,372,8〇8、5,541，293號，其全文及圖 式被列爲本文參考文獻）、間白素（見美國專利第5,075,222 號，其全文及圖式被列爲本文參考文獻）、紅血球生成素 (見美國專利第 4,703,008 、5,441,868 、 5,618,698 、 5，547,933及5,621，080號，其全文及圖式被列爲本文參考 文獻）、顆粒性白血球-群落-刺激因子（見美國專利第
4,810,643、4,999,291、5,581,476、5,582,823 號及 PCT 公告第94/17185號，其全文及圖式被列爲本文參考文 獻）、幹細胞生長因子（PCT公告第91/05795、92/17505及 9 5/17206號，其全文及圖式被列爲本文參考文獻）及〇B蛋 白質（PCT 公告第 96/40912 、96/05309 、97/00128 、 97/0 1 01 0及97/068 1 6號，其全文及圖式被列爲本文參考文 獻）。再者，本發明之組合物也可用來製造一或多種治療藥 劑，以治療或減輕生物活性劑所欲治療之狀況。 經濟部中央標準局買工消费合作社印裂 單玻珀醯化蛋白質之大體均質製劑之製法之主要實施例 包括：（a)將蛋白質與3-7倍莫耳過量之琥珀酸酐反應；（b) 將此反應混合物在4 °C擾拌2 · 1 6小時；（c )將該混合物對 20mMTris-HCl，PH7.2進行透析；及（d)將該單琥珀醯化 蛋白質分離。本方法視需要可在步驟（b )之後包含下列步 驟：在該混合物中加入固體之羥胺，同時將坪値維持在 6.5以上’直主该喪胺充全溶解，繼而用5N之NaOH將 -16 - ( CNS ) ( 210χ797λ>^γ ) ' " '~ 524806 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（14 ) p Η値抚升土 8.5 ’再將該混合物在4。〇另外授摔1 ·» 2小 時。其總體製程在實例1中被圖示説明。 DTPA-蛋白質之大體均質製劑之製法之主要實施例包 括：（a)將蛋白質與1-5倍莫耳過量之〇ΤΡΑ反應；（b)將 此反應混合物在4 °C攪拌2-16小時：（c)將該混合物對2〇 mM Tris-HCl，pH7.2進行透析；及（d)將該DTPA-蛋白質 分離。其總體製程在實例1中被圖示說明。 EDTA2-蛋白質之大體均質製劑之製法之主要實施例包 括：（a)將蛋白質與0.5-5倍莫-耳過量之EDTA2反應；（b) 將此反應混合物在4 °C攪拌2-16小時；將該反應混合 物過滤；（d)將該反應混合物濃縮；及（e )將該edt A2-蛋 白質分離。其總體製程在實例i中被圖示説明。 以下之實例係用於更詳細地説明本發明，然而並不意謂 爲本發明之範圍設限。實例丨係説明單琥珀醯化菜普亭、 單取代ϋΤΡΑ-萊普亭單體及二聚體、及edta2·莱普亭單 體及二聚體之製備。實例2係説明實例丨所製備之改質萊 晋亭物種之生理化學特性。實例3係說明實例丨所製備之 改質莱普亭物種所表現之受體結合之研究。實例4係説明 男例1所製備之改質萊普亭物種所表現之溶解度測試。實 例5係説明實例丨所製備之改質菜普亭物種所表現之活體 生物活性足研究。實例6係説明實例1所製備之改質萊普 亭物種所表現之注射部位評估。實例7係説明單琥珀醯化 G-CSF及單琥珀醯化G_CSF (ci7A)類似物之製備，繼而說 明該製劑之試管中生物活性測試、溶解度分析測試、及物 _ 本纸張尺度適用中國CNS ) Λ4^·^2ι〇 :χ 297公發—----— (請先閲讀背面之法意事項再填寫本頁)
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A 五、發明説明（15 理安定性測試之結果 實例 本貫例係説明單號珀醯化菜普亭、單取代DTP A-萊1古 單體及一聚體、及EDTA~-萊普亭單體及二聚體之製備。 1 .單琥珀醯化菜普辜 本發明之蛋白質醯化方法可概括描述於下： 蛋白質~ΝΗ2 + 〇 〇 W pH 7 II Π -^蛋白質一 N—C—C—C— H2 H2 H2 υ ?\ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將重組人類-甲硫胺醯基-菜普亭（rhu-met-菜普亭）蛋白質 (按照下文"物質與方法"所述之方法製備）溶於2〇 mM NaHP〇4且濃度爲2_3毫克/毫升之溶液（pH 7.0)，與3_7 L莫耳過1 (以5倍莫耳過量爲較佳）之固體琥珀酸酐（密蘇 里州聖路易市西格瑪化學公司）反應，將此反應混合物在4 C攪拌2-16小時。繼而在該混合物中加入固體之羥胺（密 蘇里州聖路易市西格瑪化學公司），同時將pH彳直維持在 6 · 5以上，直至孩經胺完全溶解，繼而使用5 N之將 pH値提升至8· 5，再將該混合物在4另外攪拌卜2小時 (此加入羥胺之步驟也可省略，只是產率稍微降低）。最後 將該混合物對20 mM Tm-HCl，ρΗ7.2進行透析。 將孩單破拍_化rhU-meN菜普亭在高效能瓊脂糖Q管柱 (新澤西州匹士卡塔威市法瑪西亞公司）中，用2〇 mM TrlS- -18- ^纸張尺度制巾關家標率Ycns ) 297公$ 524806 A7 B7 五、發明説明（16 HC1，PH7.2與O-O.SMNaCl藉陰離子交換層析法梯度分離 (見圖1)。使用5%聚丙缔醯胺（pH 3_7)凝膠（加州聖地牙 哥市諾維克斯公司）以等電聚焦（IEF) PAGE觀察，藉等電 點位移爲-0.7 pi單位確認溶析液中存在產物（圖2)。單琥 王白酿化rhu-met-萊普乎之取終回收率通常爲45-47¾。 2.單取代DTPA-菜普亭單體及二 本發明之DTPA改質方法可被概略描述如下··
Prot
C〇2‘—’ ch2 N- C- C- N一 C- C- 'h2 h2 h+ h2 h2
H2P Prot- DTPA 0
HCHV C〇,H CH2 co2h iH2 /f"•s2m. 經濟部中央標導局員工消費合作社印裂
Prot- N 二聚體 * 將重組人類-甲硫胺醯基-菜普亭（rhu_meN萊普亭）蛋白質 (按照下文"物質與方法”所述之方法製備）溶於2〇 mM NaHPCU且濃度爲2-3耄克/毫升之溶液（pH 7.〇)，與ι-5 倍莫耳過量（以2-3倍莫耳過量爲較佳）固體DTpA(密蘇里 州聖路易市西格瑪化學公司）反應，將此反應混合物在4乇 攪拌2-16小時。最後將該混合物對2〇 mM Tns_HC1，pH 人2進行透析。將該單琥珀醯化rhu-met_菜普亭在高效能瓊 脂糖Q管柱（新澤西州匹士卡塔威市法瑪西亞公司）中，用 20mMTris-HCl ’ pH7.2與0-o.5MNaCl藉陰離子交換層 -19- _^纸張尺度適用中^'^準—（〇阳）八4現格（210乂 297公'^ ----— 524806 A7 B7 五、發明説明（17 析法梯度分離（見圖1)3另—方面，單體與二聚體形式之 DTPA-rhu-met_萊普亭或rh㈣e卜菜普亭可藉尺寸排除声析 法以SephaCryl 100管柱（新澤西州匹士卡塔威市法瑪西亞 f司）//BS(新澤西州格蘭島生命科技公司）中分離（見圖 3)。藉著使用5%聚丙烯醯胺（pH 3_7)凝膠（加州聖地牙哥 市諾維克斯公司）以等電聚焦（IEF) pAGE所觀察到之等電 點位移（見圖2)，或者藉著使用4-2〇%聚丙烯醯胺凝膠 (加州聖地牙哥市諾維克斯公司）以SDS_pAGE觀察到之交 聯二聚體之質量增加（見圖4 J，而確認溶析液中存在產 物。DTPA-dm-met-萊普亭之最終回收率大約爲3〇%。 3 •互gTA2-莱普亭單隻！二聚體 本發明之EDTA改質方法可被概括描述於下：
Prot
EDTA2 y^\ HC· NH〇y (一 C-C — M H2 h2
Prot — N〆 H2 單體 〇y~\ HO . κ c- H2 H2 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 -Prot
Prot一 N H2 體 將重组人類-曱硫胺醯基-菜普亭（rhu_met-莱普亭）蛋白質 (按照下文π物質與方法，，所述之方法製備）溶於2〇 mN NaHP〇4且;▲度爲2-3毫克/ ¾升之溶液（pH 7.0)，與〇.5-: -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2IOX297公炱） 524806 A7 〜 ------B7 五、發明説明（1〇 · 一--- 倍莫耳過量之edta2(威斯康辛州密爾瓦基市阿吉並化興 公司）固體或DMSO溶液（以〇75倍莫耳過量之EDTA^ DMSO溶液爲較佳）反應，將此反應混合物在4 t攪拌2_ 1 6小時。 繼而將此反應物通過0 45微米過濾器，藉攪拌 小至在10 kDa分子量排除膜上濃縮至〜2〇毫克/毫升，繼 而將單取代-EDTA2 -rhU-met-莱普亭單體及二聚體形式以 尺寸排層析法在以PBS平衡之Sephacryl 100管柱（新澤 西州匹士卡塔威市法瑪西亞公司）中分離（見圖5)。另一方 面，本反應產物可以在高性能苯基瓊脂糖管柱（新澤西州匹 士卡塔威市法瑪西亞公司）中，藉疏水性交互作用層析法用 0.8-0M硫酸銨（溶於20 Mm NaHp〇4，pH 7 〇)梯度溶析而 刀離純化。藉著使用5 %聚丙烯醯胺（p H 3 _ 7 )凝膠（加州聖 地牙可市語維克斯公司）以等電聚焦（IEF) PAGE所觀察到 之〒電點位移（見圖2)，或者藉著使用4-20〇/()聚丙烯醯胺 叙私（加州聖地牙哥市諾維克斯公司）以sDS_page觀察到 •^父聯二聚體之質量增加（見圖4 )，而確認溶析液中存在 產4。EDTA2-rhu-met-莱普亭之最終回收率超過50%。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 實例2 本實例係說明實例1所製備之莱普亭結合物之生理化學 特性。琥珀醯化菜普亭、DTP A-萊普亭單體及二聚體、及 EDT A2-萊普亭單體及二聚體之改質係藉Lys_ c消化物在逆 相HPLC上之肽圖譜，MALDITOF質譜及肽序列之決定而 評估。 ___ -21 - 本紙張尺度適财( CNS ) （21Qx 297公於）~ 524806 A7 B7 五、發明説明（19 ) 未改質菜晋亭及各種改質萊普亭之Lys-C消化物，係將 1〇〇微克蛋白質與4微克内切蛋白質酶Lys-C(百靈佳·曼 海姆公司）在50mMTris-HCl，pH 8.5(200微升）中及室溫 下反應4小時而得到。各種樣品之肽圖譜係藉逆相 1^1^，在以0.1%三氟醋酸（丁？八）平衡之4.6\250毫米， 5 " C 4管柱（加州赫士波力亞市惟達克公司）中，用〇 _ 9 〇 〇々 乙睛梯度溶析而產生（見圖—6 - 8 )。如圖6 - 8所示，只有n -端肽（Μ 1 - K 6 )顯示由於改質而造成停留時間改變。此結果 顯示在第6位之離胺酸未改質而可被Lys-C消化，並顯示 化學改質發生在N -端之> -胺基。n -端改質藉n -端序列 之決定而獲得進一步支持，其顯示N-端被封端（未示 據）。 琥始酿化莱普亭、DTPA-及EDTA2-萊普亭單體及二聚㈣ 之質量測定，係在Kompact Maldi IV(新澤西州蘭姆樹市克 拉多士公司）上使用12 pmol樣品（在齐子酸基質中）進行T 母一結合物顯示每一分子中有單一之化學改質。 表1 結合物 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 預期質量 ill!子質量 (Da) (Da) 16,157 0 !6,156 16,258 101 !6,254 32,671 357 32,7〇5 32,570 256 32,5〇6 並使用圓形兩色光譜儀評 思珀醯化 -22- 未改質萊普亭 琥珀醯化菜普亭 DTPA-萊普亭二聚體 EDTA2-莱普亭二聚體 除以上分析之外 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ 297公犮） 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 524806 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 莱普亭之二級結構。未改質及琥珀醯化菜普亭在磷酸緩衝 食鹽水中之遠-UV圓形兩色光譜，係在Jasco J-710圓形兩 色光譜儀（加斯可公司，東京，日本）中以〇.〇5公分小格收 集。該光譜被示於圖9中，其顯示琥珀醯化莱普亭之二級 結構被保留。 總言之，實例2數據確定琥珀醯化菜普亭、DTPA-萊普 亭單體及二聚體、及EDTA2-菜普亭單體及二聚體之改質 係在N-端，以及琥珀醯化菜普亭保留二級結構。 實例3 本實例係説明對於實例1所製備之各莱普亭結合物所進 行之受體結合研究。實例1所製備之各菜普亭結合物均藉 .試管中受體結合分析而評估，該分析法係依據從固定細胞 膜上所表現之人類莱普亭受器中置換放射線標記之人類莱 普亭之能力，而測量菜普亭結合物之相對親和性。如圖1 〇 數據所證實，化學改質異型物、琥珀醯基-、DTPA-及 EDTA2-萊普亭，各顯示在配位子結合之全範圍（〜1-100微 克/毫升），對人類莱普亭受器之相對親和性與未改質萊普 亭相等，其之ED5(}大約爲10微克/毫升。 因此，實例3數據顯示單取代琥珀醯化萊普亭、單取代 DTPA-萊普亭二聚體、及EDTA2-菜普亭二聚體，與未改質 莱普亭相較，顯示保留試管中受體結合活性。 實例4 本實例係説明對於實例1所製備之各莱普亭結合物進行 溶解度測試。萊普亭結合物被透析進入PB S中，繼而以 -23- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公犮） ^-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\=口 _. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 524806 A7 B7 五、發明説明（21 )
Centriprep濃縮器濃縮（10 kDa分子量排除（Amicon))至觀 察到沉澱。將樣品以離心法澄清，並測定上清液之結合蛋 白質濃度。然後將樣品置於室溫（〜22 °C) 48小時，於規定 之時點離心，並再度測定上清液之結合蛋白質濃度。結合 蛋白質在PBS中之溶解度被定義爲離心後，於是溫下，在 上清液中所觀察到之蛋白質濃度（見表2 )。 表2 樣品 PBS中最大溶解度(毫克/毫升) 未改質莱普亭 - 3.2 琥珀醯化菜普亭 8.4 DTPA-菜普亭 31.6 EDTA2-萊普亭 59.9 表2之數據顯示單取代破珀醯化萊普亭、單取代DTP A-莱普亭、及單取代EDTA2-萊普亭，與未改質莱普亭相 較，溶解度實質改善，而單取代EDTA2-莱普亭顯示溶解 度大幅增加。 實例5 本實例係説明對於實例1所製備之菜普亭結合物進行之 活體生物活性研究。所述之菜普亭結合物係在鼠及狗動物 模型中測試，以測定相對於未改質萊普亭之生物效力。將 老鼠連續5 - 7天每天注射劑量爲1、ΐ 0、及5 0毫克/公斤 體重之單取代琥珀醯化萊普亭、DTPA-莱普亭二聚體、 DTPA-萊普亭單體、及EDTA2-莱普亭二聚體。生物效力 係以自第0曰起之重量減輕百分率表示且用單獨使用溶劑 -24- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公^ ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
524806 Μ Β7 五 經濟部中央標嗥局員工消费合作社印製 、發明説明（22 之對照組修正，並與未改f蛋白質所―到之重量減 較。劑量爲j及10毫克/公斤之所有樣品，分別在PBS中 配製成濃度爲G.2及2.G毫克/毫升。化學改質形式之較$ 劑量則在—PBS巾§己製成濃度爲2〇-5〇冑克/毫升，不過: 改質萊普亭由於溶解度之限制，其之高濃度配方必須以邱 4之醋酸緩衝液調配。再者，將狗以超過28天之時間每天 注射劑量爲0.05、0.15、及〇·5毫克/公斤之5毫克/亳升 之琥珀醯化萊普亭，同時觀察體重減輕，然後給予一回復 期。 - 琥珀醯化莱晋亭之生物活性（藉著在動物模型中藥物誘發 之體重減輕而判定），在狗及鼠中相當於未改質菜普亭（圖 1 1 )。同樣地’ DTPA-菜普亭單體及二聚體以及EDTA2-菜 ej π — ？κ體，與未改質莱晋亭相較，在鼠中造成相等之體 重減輕（圖1 1及1 2)。 由圖1 1及1 2之數據顯示單取代破珀醯化菜普亭、單取 代DTPA-菜普亭單體及二聚體、及edTA2-菜普亭二聚 體’與未改質莱普亭相較，顯示保留活體生物活性。 實例6 本實例係説明對於實例1所製備之菜普亭結合物所進行 之注射邵位評估。從各給藥組之三隻老鼠之注射部位取得 之组織切片作組織化學測定。被鑑定及計分之注射部位病 理現象有組織壞此、化膿（包含嗜伊紅血球及嗜中性白血球 之混合細胞浸潤）、單核細胞（巨噬細胞）、莱普亭沉澱物 (以細沉澱及較大之沉積物/圑塊爲特徵）及巨大細胞。每— -25-本纸乐尺度適用中國國彖標準（CNS ) A4規格（21 〇 X 297公;^ 524806 A7
---——--〜_E 五、發明説明（23 ) 反應採用下列分級系統計分： 0.5- 1 微量改變 1.5-2 溫和改變 2.5-3 中度改變 3.5-4 顯著改變 4.5-5 重大改變 每一動物分數總和之平均係按照卞列计刀之規足，用以 定義综合生物相容性： 0-2 正常 _ 3-5 微量改變 6-10 溫和改變 11-20 中度改變 2 1-30 顯著改變 >3 0 嚴重改變 雖然高濃度之琥珀醯化莱普亭可邊際地溶解於pH 7.0之 PBS中，但爲了注射部位測試，琥珀醯化菜普亭樣品中2 0 毫克/毫升者溶解於pH 7.2之PBS，而50毫克/毫升者溶 解於pH 7.5之PBS。 表3顯示注射部位評估，其係7日 經濟部中央標準局員工消费合作社印¾ 後，50毫克/毫升未改質莱普亭在pH 4.0醋酸緩衝液中輸 送與5 0毫克/毫升單取代5虎珀醯化菜普亭在pH 7.5之PBS 中輸送之比較結果。 表3 治療 劑量體積壞死化膿單核細沉大沉巨大 ______mg/kg mL_積物 乙酸鹽緩衝液 〇 20 0 0.5 1 〇 0 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公犮） 524806 A7 B7 五、發明説明（24 ) 0 20 0 0 0.5 0 0 0 0 20 0 0.5 1 0 0 0 未改質菜普亭 50 20 0 3 2 1 4 1 50 20 0 2.5 2 1 4 2.5 50 20 0 1.5 2 0 1.5 1 PBS緩衝液 0 20 0 0.5 0.5 0 0 0 0 20 0 0.5 0.5 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 琥珀醯化菜普亭 50 20 0 _ 1 1.5 0 0 0 50 20 0 2 1 0 0.5 0.5 50 20 0 1.5 0.5 0 0 0 如表3所示，單取代琥珀醯化莱普亭在高濃度劑量時， 相對於未改質萊普亭，顯示每一類注射部位病理現象均有 改善，而最大之改善乃在於完全消除注射部位之菜普亭沉 澱及巨細胞。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表4顯示注射部位評估，係7日後，4 3毫克/毫升未改 質萊普亭在pH 4.0之醋酸緩衝液中輸送與43毫克/毫升單 取代琥珀醯化萊普亭在pH 4.0之醋酸緩衝液中輸送之比較 結果。 表4 治療 劑量體積壞死化膿單核生物化合總分反應 _mg/kg mL_細月包 4勿：ί冗;殿_ 乙酸鹽緩衝液 0 20 0 1 1 0 2 正常 -27- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公犮） 524806 A7 B7 五、發明説明（25 未改質莱普亭 玻拍酿萊普亭 0 0 43 43 43 43 43 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 2 1 1.5 0.5 0.5 0 0 4 3 3.5 2 1.5 1 0 0.5 2.5 1.5 1.5 1 0 0 3.5 2.5 3 0.5 0 0 2 2 27 27 27 10 10 10 正常 正常 顯著 顯著 顯著 溫和 溫和 溫和 請 閱 讀 背 面 之 >主►· 意 審 本 頁 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 表4數據顯示驚奇地觀察到高濃度之單取代琥珀醯化菜 普亭也可在pH 4·0之醋酸緩衝液中輸送，並與單取代琥珀 醯化菜普亭在PBS中輸送時一樣，可觀察到注射部位反應 大幅改善。 表5顯示注射部位評估，其係7曰後，2 0毫克/毫升未 改質菜普亭在pH 4.0醋酸緩衝液中輸送，與20亳克/毫升 單取代DTPA-莱普亭二聚體在PBS中輸送之比較結果。 表5 治療 劑量 mg/kg 骨豊積壞死 mL 化膿 單核生物化合總分 細胞物沉殿 反應 乙酸鹽缓衝液 0 80 0 0.25 1 0 3 極微 0 80 0 0 0.5 0 1 正常 0 80 0.25 0.25 1 0 4 極微 DTPA-萊普亭二聚體 20 80 0 2.5 2.5 2 16 中度 20 80 0.25 3.5 3 2 22 顯著 20 80 0.25 3 〇 2.5 21 顯著 28 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X29?公犮） 524806 A7 B7 五、發明説明（27 16 中度 100 100 0.5 2.5 請 先 閱 讀 背 1¾ 之 注- 意 事 項 填 寫 本 頁 如表5及6所示，DTP A-萊普亭二聚體（表5)或EDTA2-菜普亭二聚體（表6)可在PBS中以高濃度投與老鼠，並顯 示如用琥珀醯化莱普亭所觀察到對注射部位病理現象之同 樣改善效果。然而此等結合物實質上更能溶於pH 7之 PBS，因此可在此缓衝液中提供更高濃度之配方。 總而言之，實例6數據顯示單取代琥珀醯化莱普亭、單 取代DTPA-菜普亭單體及二聚-體、及EDTA2-菜普亭單體 及二聚體，當劑量爲高濃度時在注射部位不沉澱，更重要 地，其顯示使用未改質菜普亭所觀察到之注射部位不良反 應獲得實質改善。 實例7 本實例係説明單琥珀醯化G-CSF及單琥珀醯化G-CSF (ci7A)類似物之製備，繼而説明該G-CSF製劑之試管中生 物活性測試、溶解度分析測試、及物理安定性測試之結 果。 經濟部中央標攀局員工消費合作社印51
將重組人類-曱硫胺醯基-G-CSF (rhu-met- G-CSF)蛋白質 及G-CSF(ci7A)類似物（如下文”材料與方法”所述之方法製 備）溶於20 mM NaHP〇4且濃度爲2-3毫克/毫升之溶液（pH 7.0)，與3-7倍莫耳過量（而以5倍莫耳過量爲較佳）固體 琥珀酸酐（密蘇里州聖路易市西格瑪化學公司）反應，將此 反應混合物在4 Ό攪拌2 - 1 6小時。繼而在該混合物中加入 固體之羥胺（密蘇里州聖路易市西格瑪化學公司），維持pH 30 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210 X 297公犮） 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 524806 A7 _ B7 五、發明説明（28 ) 一" 値在6.5以上。直至該經胺完全〉谷解’再使用5N之NaOH 提升p Η値至8.5，再將該混合物在4 °C另外攪掉1 _ 2小時 (此經胺之步驟也可省略，只是產率稍微降低）。最後將該 混合物對20 mM Tris-HCl，pH 7.2進行透析。 將該單玻抬醯化rhu-met- G-CSF(及其類似物）在高效能 瓊脂糖Q管柱（新澤西州匹士卡塔威市法瑪西亞公司）中， 用 20mMTris-HCl，pH7.2與0-0.5MNaCl藉陰離子交換 層析法悌度分離。使用5 %聚丙烯醯胺（p Η 3 - 7 )凝膠（加州 聖地牙哥市諾維克斯公司）以等電聚焦（I]EF) page觀察， 藉等電點位移爲-0.7 p I單位確認溶析液中存在產物。單破 珀醯化rhu-met- G-CSF(及其類似物）之最終回收率通常爲 45-47%。 將未改質G-CSF及琥珀醯化rhu-met- G-CSF之樣品在試 管中生物分析中進行測試，其中G_CSF依賴性鼠類造血遠 祖細胞之增殖爲放射線標記之胸苷攝取量及G-CSF濃度之 函數。其顯示生物活性完全被保留（見圖1 3及1 5 )。 將琥始醯化異形物之溶解度與未改質rhu-met- G-CSF及 rhu-met- G-CSF類似物比較。將G-CSF樣品透析進入PBS 中’繼而以Centriprep濃縮器濃縮（1 〇 kDa分子量排除 (Aimcon))至觀察到沉澱。將樣品以離心法澄清，並測定上 清液之結合蛋白質濃度。然後將樣品置於37。〇歷22小 時在说足之時間離心’並再度測定上清液之結合蛋白質 濃度。蛋白質在PBS中之溶解度被定義爲離心後，於室溫 下’在上清液中所觀察到之蛋白質濃度（見表7)。 ___ -31 - 本^I 適用—中國 --— (請先閱讀背面之运意事項_再填寫本頁)
524806 A7 ----- - 五、發明説明（29 ) 表7 中最；容解度（亳U毫升） 未改質G-CSF 〇.7 琥珀醯化G-CSF 8.2 未改質 G-CSF(C17A) 13.8 琥珀醯化 G-CSF(C17A) 19.2 未改質及琥珀醯化G-CSF及G-CSF (Cl7A)之物理安定 性’係將樣品濃縮至5 - 6亳克/毫升之pb S溶液，並將此樣 品保持在4 °C及37 °C後作比較-。殘留在溶液中之蛋白質含 量’係將樣品離心後以分光光度計法量測濃度而決定。琥 珀醯化G-CSF之物理安定性（4及37乇），相對於未改質 G-CSF，實質上有所改善（見圖14)。 ϋϋϋ方法 1.重iL人類-甲硫胺醯基-萊善辜蛋白質之製備 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明之重組人類-曱硫胺酿基-菜普亭（化卜met-萊普亭） 係根據上文引用文獻PCT公告，WO 96/053 09第151-159 頁而製備。本貫例所使用之rhu-met-莱普亭（與158頁之胺 基酸序列相較）之第3 5位爲離胺酸而取代精胺酸，及第74 佼爲異白胺酸而取代異白胺酸。其他重組人類萊普亭蛋白 質可按照本技藝熟知之方法，使用重組DNA技術表現蛋白 質而製備。 2·重急A類二^迄迭醯基-G-CSF蛋白質及G-CSFmtj^^ 製備 本發明之重組人類-甲硫胺酿基-G-CSF (rhu-met- G-CSF) -32-
-J 家標準 524806 A7 -----__ _B: __ ____ 五、發明説明（30 ) —— ~ "
係根據上文引用文獻PCT公告，w〇 94Π7185而製備。本 貫例所使用之rhu-met- G-CSF類似物，G-CSF (ci7A):，之 第位爲丙胺酸而取代半恍氨酸。其他重組人類g-CSF 忠白貝可按照本技蟄熟知之方法，使用重組DNA技術表現 蛋白質而製備。 -雖然本發明已藉由較佳實施例加以說明，然而眾所週知 熟悉本技藝人士可做許多變化及修改。因此，隨附之申社 f利範圍意欲涵蓋本發明申請專利範圍内所有對等之^ (請先閱讀背面之注土思事項再填寫本頁〕 -•沿衣
經濟部中央標準局負工消費合作社印製 -33- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210/ 297公兑）

Claims (1)

  1. 524806
    申請專利範圍 91. 5· 2〇 年月曰 第〇87113123號專利申請案 中文申請專利範圍修正本(91年5月） 修正 補充i 1. 一種單琥珀醯化蛋白質之大體均質製劑，其中該單琥珀 醯化蛋白質係限於在N-端經修飾之萊普亭（leptin)*G_ CSF - 2. 根據申請專利範圍第丨項之大體均質製劑，其中該蛋白質 係莱普亭。 3· —種單琥珀醯化蛋白質，其之製法包含下列步驟：（&)將 蛋白質與3-7倍莫耳過量之琥珀酸酐反應，形成反應混合 物，（b)將該反應混合物在4它攪拌2 - 1 6小時；（c)將該 混合物對20 mM Tds-HCl , pH 7.2進行透析；及（d)將該 單琥珀醯化蛋白質自該反應混合物中分離，其中該單琥 珀醯化蛋白質係在N-端經修飾之莱普亭（ieptin)或G-CSF。 4. 根據申請專利範圍第3項之單琥珀醯化蛋白質，其中該蛋 白質係菜普亭。 5. 根據申請專利範圍第3項之單琥珀酿化蛋白質，其中該蛋 白質係G-CSF。 6· —種製造單琥珀醯化蛋白質之大體均製劑之方法，其中 該蛋白質係限於在N -端經修飾之萊普亭（ieptin)或g-CSF ’其包含下列步驟：（a)將蛋白質與3-7倍莫耳過量 之琥拍酸酐反應，形成反應混合物；將該反應混合物 在4t：攪掉2-16小時；（c)用5N之NaOH將該反應混合物 之pH值提升至8·5 ; (d)將該反應混合物在4°C另外攪拌 卜2小時；（e)將該混合物對20 mM Tris-HCl，pH 7.2進行 透析；及（f)將該單琥珀醯化蛋白質自該反應混合物中分 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
    裝 訂
    524806 A8 B8 _____ C8 、 ------------ D8 穴、申請專利範3 離。 7·根據申請專利範圍第6項之方法，其中在步騾（b)之後進 一步包含下列步驟：1)在該混合物中加入固體之羥胺， 同時將pH值維持在65以上，直至該羥胺完全溶解；2) 用5N之NaOH將pH值提升至8.5 ; 3)將該混合物在4cC另 外攪掉1 - 2小時。 · 8· —種具改良之生物相容性及生物活性之醫藥組合物，其 包含根據申請專利範圍第.3項之單琥珀醯化蛋白質。 9·根據申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該蛋白質係 萊普亭（leptin)。 10·根據申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該蛋白質係 G-CSF。 11. 根據申凊專利範圍第9項之醫藥組合物，其係用於誘發體 重減輕。 12. 根據申請專利範圍第10項之醫藥組合物，其係用於謗發 造血先質細胞分化成嗜中性白血球，及刺激成熟嗜中性 白血球之活性。 -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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