TWI247012B - Process for rapid solution synthesis of peptides - Google Patents

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1247012 A7 B7 五、發明説明（1) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於一種肽類之快速溶液合成的新穎且多用 途的方法，其中在完成組合所要的序列前不需要分離成長 中的肽。 肽是在固體支撐物上或在溶液中合成，兩種方式中， 偶合及去保護步驟重複交替且可經由間歇性的純化分隔， 在固相方式中，在連結的固體支撐物上完成序列組合後， 最終才從該支撐物分離，去除過量的試劑及副產物是經由 過濾進行，固相合成之明顯優點是：或多或少地普遍適用 且容易自動化，但是其也有部份嚴重的缺點，例如反應是 擴散控制且在施加的不均勻情形下通常相當緩慢：爲了防 止刪除序列，使用相當大量的試劑。此外，必須保護成長 中的肽之全部反應性側鏈：因爲沒有進行間歇性的純化， 由於存在未經保護的側鏈而產生之副反應可導致最終產物 之雜質。固相方式不容易增大規模且試劑及原料成本昂貴 〇 經濟部智慧財產局a (工消費合作社印製 反之，傳統的液相方式容易增大規模且試劑及原料成 本較便宜，通常不需要完全保護的胺基酸，因爲從未經保 護的側鏈之副反應產生的副產品可經由間歇性的純化去除 ，但是，液相方式需要特定序列之方法且生產完整的序列 非常耗時。由於這些方式之缺點，存在需要可結合這兩種 傳統方法的優點之方法，尤其是大規模之肽合成，新的方 法必須快速、容易增大規模且普遍適用。 在液相合成終，在各偶合步驟中較宜使用稍微過量的 活化羧酸成份，使得可確實定量偶合至胺基成份，因此可 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210>< 297公釐） -4 - 1247012 A7 B7 五、發明説明（2) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以避免發生在最終產物中刪除序列，在間歇性水性處理過 程中通常假設破壞及去除殘留之經活化的羧酸成份’但是 偶合步驟後殘留的（活化）羧酸成份沒有完全去除’其隨 後在去保護後偶合，使得插入肽序列經常成爲最終肽之雜 質，爲了防止出現該副反應，在偶合步驟後直接插入淸除 步驟以淸除（減活化）殘留之經活化的羧酸官能基，通常 使用胺類作爲淸除劑，使用多元胺作爲淸除劑，導致淸除 的化合物決定於其極性可活化地萃取至較宜是酸性之水相 〔例如 Kisfaludy，L. et al· ( 1974) Tetrahedron Lett· 19, 1 785- 1 786〕，此萃取通常是在去保護步驟前進行，以避免 成長中的肽損失至液相內，但是發現此步驟在許多情形下 因爲淸除的化合物之疏水性而導致不完全的間歇性純化： 羧酸成份胺基醯基部份之本質疏水性是經由仍然存在的胺 基保護基而增強，水性萃取因此不完全有效。 最近，Carpino，L. A. et al. ( (1999) J. Org. Chem. 64, 4 3 24-433 8〕報導一種改良的淸除方法，除了使用多元胺作 爲淸除劑之外，在此方法中使用胺基保護基1 ，1 -二氧 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 苯並〔d〕噻吩—2 —基甲氧醯基（Bsmoc ) ，Bsmoc官能 基對鹼有非常強烈的不穩定性，由於此結果，殘留的活化 羧酸官能基經淸除且在同一個步驟中使用多元胺去除Bsmoc 官能基，Bsmoc官能基之使用經敘述可明顯改良用於生產（ 寡聚）肽，使用快速連續液相技術可在相當短暫的時間內 在單一序列中組合肽。 現經發現一個新的方法用於肽類之快速連續溶液合成 1紙張尺度適用中國國家標準了〇奶）八4規格（210父297公釐） 1247012 A7 _ B7 五、發明説明（3) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，其中使用的淸除劑可實質上任意選擇胺基保護基（在活 化的羧酸成份N —末端之保護基），不同於Carpin0方法， N -末端官能基之去保護不需要在與淸除過量之經活化的 羧酸官能基相同的反應條件下進行，因此，本發明方法遠 比C a 1· p i η 〇方法普遍適用。 根據本發明之新方法是在有機溶劑或有機溶劑混合物 中的肽類之快速溶液合成的方法，包括重複循環步驟（a )-(d )： (a )偶合步驟，使用過量之經活化的羧酸成份將胺 基成份醯基化， (b )驟停步驟，其中使用淸除劑去除殘留之經活化 的羧酸官能基，其中該淸除劑也用於使成長中的肽去保護 (c ) 一或多次水性萃取，及 任意地，（d )在一或多次水性萃取後，各別的去保護 步驟， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其特徵是此方法包括至少一個步驟（b )，稱爲步驟 (b > )，其中含自由態陰離子或潛在陰離子之胺作爲殘 留之經活化的羧酸官能基之淸除劑使用。 在本發明方法之過程中，得到最終肽序列（也就是本 發明方法之最終產物）前不需要分離成長中的肽，因此， 本方法明顯比傳統液相法耗時更低且容易增大規模，本發 明方法可高度有效地去除殘留之經活化的羧酸成份，沒有 其他先前技藝方法其中使用多元胺作爲淸除劑使用之疏水 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公蔆） 1247012 A7 B7 五、發明説明（4) 性問題，因此可得到高純度之肽。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在本方法之步驟（a )中，使用的試劑之莫耳量在遞 減的順序下較宜是：羧酸成份，偶合添加劑 > 偶合試劑> 胺基成份，更佳的方法是其中步驟（a )使用預先活化的 羧酸成份。 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 在另一個較佳具體實施例中，步驟（b /)使用含至 少一個潛在陰離子之胺作爲淸除劑，較宜在淸除用的胺的 潛在陰離子中帶有暫時性保護基，其可在連接至成長中的 肽之任何永久性保護基存在下選擇性地去除。在特別較佳 具體實施例中，在淸除用的胺的潛在陰離子之保護基顯示 具有與存在於成長中的肽N -末端之暫時性保護基類似之 不穩定性，此使得淸除劑去保護而產生陰離子及成長中的 肽之N -末端去保護可在單一步驟中進行，尤其較宜的是 本發明方法其中存在於成長中的肽N -末端及視需要存在 於淸除劑之暫時性保護基是氫解可去除的基，而永久性保 護基是酸解可去除的保護基，較宜該暫時性保護基是苄基 型’例如（經取代）苄基及苄酯基，較佳的淸除劑是含自 由態陰離子或潛在陰離子之一級胺，且尤其是C 一末端經 保護的胺基酸衍生物。除了羧酸根以外，淸除用的胺可含 其他陰離子性官能基，例如（但不限於）磺酸根、硫酸根 、膦酸根、磷酸根或酚根，非常較佳可作爲淸除劑使用的 胺基酸是/3 -胺基丙酸或其衍生物（例如酯或甲矽烷基酯 衍生物）’最佳的淸除劑是/3 -胺基丙酸爷酯或其鹽類。 根據本發明方法，含自由態或潛在陰離子之硫醇也可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X：297公釐） -/ ~ 1247012 經濟部智慈財產局员工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) 代替含自由態或潛在陰離子之胺作爲淸除劑使用。 淸除劑較宜使用二至六倍莫耳量相對於需要淸除的殘 留活化成份。 根據本發明使用的淸除劑導致親水性去除化合物，其 可在去保護步驟後活化地萃取至鹼性水相：去保護（如果 適用）時’親水性經由存在於淸除物種中的自由態胺基官 能基及自由態羧酸官能基增強，據此，本發明方法由於活 化地萃取親水性淸除的化合物之可能性而導致非常有效的 間歇性純化’此外，可能存在的過量羧酸成份，其未經活 化且其暫時性保護基也在去保護過程中去除，同時從反應 混合物中被萃取。 根據本發明方法，至少一個循環但可能多個循環之方 法含步驟（b /)其中自由態陰離子或潛在陰離子是作爲 殘留之經活化的羧酸官能基之淸除劑使用，但是根據本發 明之另一個具體實施例，本方法也可含一或多個循環，其 中在步驟（b )中使用多元胺例如3 —二甲胺基一 1 一丙 胺作爲淸除劑。 本發明之另一個較佳方法包括一或多個循環，其中在 步驟（b )中沒有發生去保護（據此選擇此情形是淸除劑 只作爲驟停使用，例如使用Z保護基且含潛在陰離子之胺 作爲淸除劑使用），且在後續步驟（c )依序包括鹼性、 酸性及鹼性萃取，其較宜在氯化鈉或硝酸鉀存在下進行， 此方法包括後續步驟（d )包括去保護及依序的鹼性及中 性萃取；這些萃取較宜在氯化鈉或硝酸鉀存在下進行。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】OX 297公慶） ^ IT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本覓) -8- 1247012 A7 B7 五、發明説明（6) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 本發明之另一個較佳方法包括一或多個循環，其中在 步驟（b )中同時發生驟停及去保護（例如使用Bsmoc保 護基及多元胺作爲淸除劑）且在後續步驟（c )依序包括 鹼性及中性萃取，其較宜在氯化鈉或硝酸鉀存在下進行。 也較宜的方法是其中在最後循環中，在步驟（a )中 ’羧酸成份之保護基顯示具有與胺基成份永久性保護基類 似的不穩定性且在步驟（b )之淸除劑是多元胺。 根據本發明之方法可在通常用於生產肽之數種有機溶 劑中進行，非常較佳的有機溶劑是乙酸乙酯，也較宜是乙 酸乙酯與其他有機溶劑例如二氯甲烷、1 -甲基一 2 -吼 咯烷酮、N，N -二甲基甲醯胺或四氫呋喃之混合物。 本發明方法可在熟知於此項技藝在傳統液相肽合成中 用於此步驟之溫度進行，但是此方法較宜在〇至5 〇 °c之 溫度範圍內進行’且尤其是在環境溫度，本發明方法非常 合適使用分開及混合方法用於肽分子庫之組合式合成，分 別進行偶合且各偶合混合物經混合後用於萃取及去保護。 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 本發明方法因爲使用標準步驟而非常合適自動化，本 發明之新方法是一種非常有效的方法，其可方便地用於生 產高純度寡聚-及多肽類。 根據本發明之合適方法是偶合過量的羧酸成份至胺基 成份，其中羧酸官能基是預先活化或使用偶合試劑及視需 要選用的添加劑當場活化，在偶合步驟後，通常在水性萃 取後經由在反應混合物中添加淸除劑將殘留之經活化的殘 酸官能基淸除’隨後或在淸除過程中，通常在經由水性萃 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247012 A7 B7 五、發明説明（7) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 取將淸除的化合物去除後，使用此項技藝中已知的合適方 法將暫時性保護基去除，同時，未經活化且其暫時性保護 基也在去保護過程中去除之可能存在的過量羧酸成份，以 及其他水丨谷性g式劑及副產物從反應混合物萃取，決定於所 女的肽長度’可以進行另一循環之偶合、驟停、去保護及 萃取步驟。 名詞胺基成份係指分子中含自由態胺基官能基，具體 地說’胺基成份可以是任何胺、胺基酸或寡聚肽其含有一 個自由態胺基官能基且其他官能基經保護的方式是不會影 響所要的偶合反應，使用的胺基酸或寡聚肽之C 一末端官 能基可以保護成經取代或未經取代之醯胺或酯，後者實例 包括但不限於甲基、乙基、第三丁基、苄基、苯醯甲基、 3 -（3 —甲基）戊基（Mpe)、2— (2 -苯基）丙 基（Pp)、2 —氯三苯甲基（Clt)、二苯基（4 一吡啶 基）甲基（PyBzh)、二環丙基甲基（Dcpm)、9 —芴基甲 基（Fm)、烯丙基（All)、 2三甲矽烷基）乙 基（Tmse)、4 — { N — 〔 1— (4，4 —二曱基一2， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 —二氧亞環己基）—3 -甲基丁基丨胺基丨苄基（Dm a b )酯類及可酵素分解的酯類〔R0eske，R . W · (1981) in: f丁lie Peptides' vol · 3 (Gross, E . and Meienhofer, J ., eds . ) Academic Press, New York, pp . 101-136; for Mpe:

Kar 1 strom, A . and Unden， A . ( 1 996) Tetrahedron Lett . 37, 4343-4246; for Pp: Yue, C . et al · ( 1 993) Tetrahedron

Lett . 34，323-326; for Clt: At ha nassopoulos, P. et al. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -10- 1247012 A7 B7 五、發明説明（8 ) ( 1 9 9 5) Tetrahedron Lett . 36, 5645-5648; for PyBzh:

Mergler, Μ _ et al · (2001) P154, 2nd International Peptide (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Symposium & 17th American Peptide Symposium; for Dcmp: Carpi no, L . A . et al . ( 1 995) J .〇rg· Chem . 60, 77 1 8-77 1 9; for Fm: Al-Obeidi, F . et al · ( 1990) Int . J .

Peptide Protein Res . 35，215-218; for All: Kunz，H . et al • ( 1 9 8 5) Int. J . Peptide Protein Res . 26, 493-497; for Tmes: Sieber, P . ( 1 977) Helv . Chim. Acta 60, 27 11-2716; for Dmab: Chan，W. C. et al . ( 1 995) J .

Chem . Soc .，Chem. Commun .，2209-2210〕，第三丁 基型官能基或類似不穩定性官能基較宜在胺基成份中用於 其他官能基之永久性保護，這些包括但不限於第三丁基（ tBu)用於保護Asp、 Glu、 Ser、 Thr及 T y r側鏈，第三丁酯基（B o c )用於保護L y s及 T r p側鏈，三苯甲基（T r t )用於保護A s η、 G1 n及Hi s側鏈且2，2，5，7，8 —五甲基苯並 二氫哌喃基—6 —磺醯基（P m c )或2，2，4，6， 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 7 -五甲基二氫苯並呋喃基一 5 -磺醯基（Pb f )用於 保護 A r g 側鏈〔Barany，G. and Merrifield，R. Β· ( 1 980) in ,rThe Peptides、vol. 2 (Gross, E* and Meienhofei·，J.，eds.) Academic Press, New York, pp. 1 -284; for 丁rp(Boc): Franzen, H. et al. (1984) J. Chem. Soc.? Chem. Commun. 1699-1700; for Asn(Trt) and Gln(Trt): Sieber, P. and Riniker, B. (1991) Tetrahedron Lett. 32, 739-742; for His(Trt): Sieber, P. and 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -11 - 1247012 A7 B7 五、發明説明（9) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Riniker, B. ( 1 987) Tetrahedron Lett. 28, 603 1 -6034; for Pmc: Ram age, R. and Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; for Pbf: Carpino, L. A. et al. ( 1 993) Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832 〕。 名詞羧酸成份係指含自由態羧酸官能基之分子，具體 地說，羧酸成份可以是任何羧酸、胺基酸或寡聚肽其含有 一個自由態羧酸官能基且其他官能基經保護的方式是不會 影響所要的偶合反應，在一個較佳具體實施例中，使用的 胺基酸或寡聚肽之胺基是經由苄酯基（Z )官能基暫時性 保護；其他實例包括但不限於B 〇 c、T r t、芴—9 一 基甲酯基（Fmoc )、2 —(甲基磺醯基）乙酯基（Msc)、 烯丙酯基（A11 〇 c )官能基、芳基碯醯基型官能基例如鄰-硝基苯磺醯基（〇 - N B S )及可酵素分解的官能基〔 Barany, G. and Merrifield, R. B. (1 980) in fThe Peptides,J vol. 3 (Gross, E. and Meienhofer, J.，eds.) Academic Press, New York, pp. 1-99; for Alloc: Kunz, H. and Unverzagt, C . (1984) Angew. Che m. 96， 426-427; for a r y 1 s u 1 f ο n y 1: 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Fukuyama, T. et al. ( 1 997) Tetrahedron Lett. 38，583 1 -5834〕 ，第三丁基型官能基或類似不穩定性官能基較宜在羧酸成 份中用於其他官能基之永久性保護，如同上述用於胺基成 份，羧酸成份可保護成活性酯，較宜是N -羥基琥珀醯亞 胺、苯並三唑- 1 -基、五氟苯基或4 -硝基苯基酯、鹵 化物、N -羧酸酐或對稱酸酐，或者是，羧酸成份可當場 活化成混合的酸酐或使用偶合試劑例如碳化二亞胺，較宜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0Χ 297公釐） - 12- 1247012 Μ Β7 五、發明説明（1() 是N，二環己基碳化二亞胺（DCC)或1 一（ 3 / -二甲胺基丙基）一 3 -乙基碳化二亞胺鹽酸鹽（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) E D C )、鋸或鳞鹽在可能存在的偶合添加劑，較宜是n 一羥基琥珀醯亞胺（Η〇N S u )、1 一羥基苯並三唑（ H〇Bt)、 3 —羥基—4 —氧一3，4 —二氫一1，2 ，3 —苯並三啡（H〇〇Bt)、 1—羥基一7 —氮雜苯 並三唑（H〇A t )或6 -氯一 1 一羥基苯並三唑（C 1 一 Η〇B t )且視需要存在三級胺〔，The peptides，，ν〇1. ι (1979)(Gross，E. and Meienhofei·，J.，eds.) Academic Press， New York, Li, P. and Xu, J.-C. (2000) Chin. J. Chem. 18, 456-466〕。 暫時性保護基可根據此項技藝中已知的方法去除（見 上文），Z官能基可使用（標準）方法施加例如氫氣或甲 酸鹽作爲氫氣供體經由氫解作用去除，在此方法中，全部 的苄基型保護基經去除且第三丁基型保護基或類似不穩定 性的官能基被保留，後者可根據此項技藝中已知的方法經 由酸解去除。 經濟部智慈財產苟貞工消費合作社印製 熟諳此項技藝者將了解名詞鹼性水性萃取之意義，但 是鹼性水性萃取較宜使用碳酸氫鈉或碳酸鈉之水溶液進行 ，視需要在氯化鈉或硝酸鉀存在下，名詞活性水性萃取係 指一種萃取其中胺基成份在酸性情形下在質子化形式（銨 )被萃取或羧酸成份在鹼性情形下在去質子化形式（羧酸 根）被萃取。 本發明經由下列實例進一步說明，但其不能作爲本發 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -13- 1247012 A7 B7 五、發明説明（11) 明之限制。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例1

Boc — G1 y — Phe— Asp ( 0 1 B u )—

Ser (tBu) — C^Bu 第一個循環:在4·34克H — SerCtBu) — 〇t Β u於乙酸乙酯與二氯甲烷之混合物並在2 0°C之攪拌 溶液中加入3 _ 24克1—羥基苯並三唑、7 · 76克Z -Α8ρ(〇ιΒυ)-〇Η, 4.20克1—(3一一二 甲胺基丙基）—3 -乙基碳化二亞胺鹽酸鹽及2 · 4 2毫 升4 -甲基嗎福啉，攪拌所得的溶液直到完成反應，加入 1 · 2 1毫升4 一甲基嗎福啉及3 · 5 1克/3 -胺基丙酸 苄酯對甲苯磺酸鹽，將混合物再攪拌3 0分鐘並用5 % Na2C〇3/10%NaCl、 5 % K H S 0 4 / 1 0%Na C 1 及 5%Na2C〇3/l 0%Na C 1 萃取 ο 經濟部智慧財產局员工消費合作社印製 將含經保護的二肽Ζ - A s ρ (〇1 B u ) — S e r CBu)—〇tBu之有機層在Pd/C存在下進行催化 氫解，完成反應後，加入5%Na2C〇3/l 〇% N a C 1並過濾所得的懸浮液，將殘留物用乙酸乙酯與二 氯甲烷之混合物淸洗，並將合倂的有機過濾液用5 % Na2C〇3/l〇%NaC 1 及 30%NaC 1 萃取。 第二個循環:在含二肽Η — A s p (〇1 B u )— 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -14- 1247012 A7 B7_ ___ 五、發明説明（θ

Se r CBu) — C^Bu之20°C有機層中加入 3 · 24克1—經基苯並三D坐、7 · 18克Z - Phe 〇H、 4 · 20克1— (3 / —二甲胺基丙基）一 3 一乙 基碳化二亞胺鹽酸鹽及2 · 4 2毫升4 -甲基嗎福琳’援 拌所得的溶液直到完成反應，加入1 · 2 1毫升4 一甲基 嗎福啉及3 · 5 1克々-胺基丙酸苄酯對甲苯磺酸鹽’將 混合物再攪拌3 0分鐘並用5%Na2C〇3/l 0% NaCl、 5 % KHS〇4/l〇%NaCl 及 5% Na2C〇s/10%NaCl萃取。 將含經保護的三肽Z — P h e — A s p ( 0 t B u ) 一 S e r CBu) -〇tBu之有機層在Pd/C存在下進 行催化氫解，完成反應後，加入5 %· N a 2 C〇3 / 1 0 % N a C 1並過濾所得的懸浮液，將殘留物用乙酸乙酯與= 氯甲烷之混合物淸洗，並將合倂的有機過濾液用5 % Na2C〇3/l 0%Na C 1 及 30%Na C 1 萃取。 第三個循環:在含三肽H — Phe— Asp (〇tBU )—Se r (tBu)—〇1已11之20°C有機層中加入 3 . 24克1 一羥基苯並三唑、4 . 21克：6〇〇 —

Gly —〇H、 4.20克1— (3，一二甲胺基丙基） - 3 -乙基碳化二亞胺鹽酸鹽及2，4 2毫升4 一甲基嗎 福啉，攪拌所得的溶液直到完成反應，加入1 . 2 5毫升 3 -二甲胺基一 1 -丙基胺，將混合物再攪拌3 〇分鐘並 用 5%Na2C〇3/l〇％NaCl、 5 % K H S 0 4 / 1 0 % N a C 1 , 5%Na2C03//l 〇%Na C 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I I —I- I ! - ——I I- 1— I I (请先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 訂 f 經濟部智慧財產局a(工消費合作社印製 -15- 1247012 A7 B7 五、發明説明（ 3 0 % N a C 1及水萃取，將有機層蒸乾並將殘留物用甲 基第三丁基醚碾製並乾燥，得到所要的經保護四肽，產量 爲9 5%，以起始物質11—3€1' ('Bu) — Ο'Βιι 爲 基準，此方法在6小時內完成。 純度：98·1%經由逆相HPLC(24至68% 乙腈於0·1%三氟乙酸在29分鐘在220毫微米， 2 · 0毫升/分鐘，5微米C ! 8管柱），鑑定：m/ ζ 425 . 4 (M-Boc-3tBu+H) + j 469 . 4 [M-4tBu+H] + ^ 525 . 4 [M-3tBu + H] + ^581 .4 [M-2tBu + H] + ^637.4 〔M— ^Bu+H〕+，693 · 4 〔M+H〕+經由電子 霧化MS，1!! NMR(CDCl3) 51 · 16 (s ， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) rH d d κί\ 9 5 2 \)y H 7 2m /l\ 4 4

H H 2m /IV 9 o 3 Nly H 1—_ d d 9 7 2 m 6 8 3 I 9 6 3 \ly H 1 d d rv 1 5 3 8 7 4 - 7 6 4 H rHm /IV 7 4 4 nm/ H 3 d rv 8 6 6 NMy H s b o 2 5 H 2 m 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 \)y H 7 m r\ 4 3 7- 2 1 7 \ly H 1± 2例

Γ 6 s- p Γ T- s •1 H I H

u B

u 6 L I u 6 L- D u B 〇 I 〇 Γ p B r t 〇 \)/ u n

Γ VJ o T o _ B 0 Γ p 1 H克 0 〇 3 1—I在環循個 1第 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -16- 1247012 A7 B7 五、發明説明（1今 〇1 B u · H C 1於乙酸乙酯並在2 〇 t之攪拌溶液中加入

B 〇14克1 一羥基苯並三唑、2756克Z —〇rn 〇c) —〇H、 1378克1— (3 一一二甲胺某丙 (3 -二甲胺基丙基 )—3 -乙基碳化一亞胺鹽酸鹽及1 4 9 5毫升4 一甲基 嗎福啉’攪拌所得的溶液直到完成反應，加入3 7 7毫升 4 一甲基嗎福啉及1 1 0 5克/3 -胺基丙酸苄酯對甲苯磺 酸鹽，將混合物再攪拌3 0分鐘並用5 % N a 2 C 0 3 / 1 0 % N a C 1 , 5 % KHS〇4/l〇%NaCl 及 5%Na2C〇3/l 〇%Na C 1 萃取。

將含經保護的二肽Z —〇r n ( b o c ) — P r 〇 — I —-----#! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 〇tB u之有機層在P d/C存在下進行催化氫解，完成反 應後，加入5 % N a 2 C〇3 / 1 5 % N a C 1並過濾所得 的懸浮液，將殘留物用乙酸乙酯淸洗，並將合倂的有機過 濾液用5%Na2C〇3/l5%NaC1及30% N a C 1萃取，將分離的水層再度用乙酸乙酯萃取。 第二個循環:在含二肽H —〇rn(Boc) — Pr o — (^Bu之20°C合倂的有機層中加入1〇14克 1—羥基苯並三唑、1993克Z — Leu —〇H、 1 320克1 一（3 / -二甲胺基丙基）一 3 一乙基碳化 二亞胺鹽酸鹽及7 5 4毫升4 -甲基嗎福啉，攪拌所得的 i谷液直到完成反應’加入3 7 7毫升4 -甲基嗎福啉及 1 1 0 5克沒-胺基丙酸苄酯對甲苯磺酸鹽，將混合物再 攪拌3〇分鐘並用5%Na2C〇3/l 〇%Na C 1、 5 % KHS〇4/l〇%NaCl 及 5%Na2C〇3/ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 訂 f -17- 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 1247012 Μ ___Β7_ 五、發明説明（1导 1〇％ N a C 1萃取。 將含經保護的三肽Z — L e u —〇r n ( B 〇 c )— P r ο — O'B u之有機層在P d/C存在下進行催化氫解 ，完成反應後，加入5%Na2C〇3/l 5%Na C 1並 過濾所得的懸浮液，將殘留物用乙酸乙酯淸洗，並將合倂 的有機過濾液用5%Na2C〇3/l 0%Na C 1及3 0 % N a C 1萃取。 簠.三個.循—璟:在含三肽H — Leu —〇rn (Boc )—Pro — QtBu之2〇°C有機層中加入1014克1 —羥基苯並三唑、1 9 9 3克2 — 0 — 1^6 11 —〇11、 1 3 20克1— (3 二甲胺基丙基）一 3 —乙基碳化 二亞胺鹽酸鹽及7 5 4毫升4 -曱基嗎福啉，攪拌所得的 溶液直到完成反應，加入3 7 7毫升4 -甲基嗎福啉及 1 1 0 5克/3 -胺基丙酸苄酯對曱苯磺酸鹽，將混合物再 攪拌30分鐘並用5%Na2C〇3、 5% KHS〇4及 5%N a2C〇3 /萃取。 將含經保護的二肽Z — D — L e u — L e u —〇r η (Bo c) — pr 〇 —〇tBu之有機層在Pci/C存在下 進行催化氫解，完成反應後，加入5 % N a 2 C ◦ 3並過濾 所得的懸浮液’將殘留物用乙酸乙酯淸洗，並將合倂的有 機過濾液用5 % N a 2 C〇3及1 〇 % N a C 1萃取。 墓·.四至第七侗環••根據第三個循環之步驟進行這些 循環’分別用1993克Z — Tyr (tBu) —〇H( 從4 4 9 7克對應的二環己基銨鹽釋出）、2 2 1 8克Z ----------- 本紙 1尺度顧巾關家辟（CNS ) A4規^77^X297公" -18 - ^ 、訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247012 ΑΊ _ Β7_ 五、發明説明（巧 —Ser (tBu)—〇H、 2535 克 Z — Tirp-QH 及 2172 克 Z— Hi s— 〇H 取代 Z— D— Leu -〇Η，但是從第五個循環開始，淸除過程中的4 -甲基 嗎福啉及/3 -胺基丙酸苄酯對甲苯磺酸鹽之量加倍，在第 五個循環中，淸除後的萃取是在3 5 °C進行，在第七個循 環中，偶合是在3 °C進行，1 0 1 4克1 一羥基苯並三唑 換成2561克6-氯一1一羥基苯並三唑並在偶合1小 時後補充加入]_ 3 2克1 一（ 3 - 一甲胺基丙基）一 3 -乙基碳化二亞胺鹽酸鹽，同時在第七個循環中，氫解後 的萃取是在3 5 °C進行，在第七個循環結束時，將有機層 蒸乾，得到所要的經保護九肽，產量爲7 3 %，以起始物 質H—P r 〇 — c^Bu. HC 1爲基準（也就是每個化學 步驟平均9 8 % )。 純度：90.6%經由逆相HPLC(24至68% 乙腈於0·1%三氟乙酸在29分鐘在220毫微米， 2 · 0毫升/分鐘，5微米C18管柱），鑑定：m/z 543.6 [M-Boc-2tBu + 2H]2+^ 5 7 1 · 6 [M— Boc— tBu + 2H) 599 · 6〔M- B〇c + 2H〕2+，649 · 8 〔M+2H〕2+，1298 . 0 〔M + H〕+經由電子霧 化M S。 結論：在沒有間歇性分離中間物下生產經保護之肽類 ，從第一個實例所得產物之純度及鑑定證明過量（活化） 羧酸成份在此方法之全部步驟中完全去除且使用本發明方 本纸張尺度適用中國國家檩準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Ψ 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 •19- 1247012 A7 B7 五、發明説明（1乃 法沒有形成插入序列，而且從第二個實例之合成，證明根 據本發明之合成很容易增大規模，兩個實例都可在相當短 的時間內得到高產量及高純度之產物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -20 -

Claims (1)

1. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247012 种年6月A日修(笑)正本 C8 ___ _ D8 ------- 々、申請專利範圍 1 1 . 一種在有機溶劑或有機溶劑混合物中肽類之快速 溶液合成的方法，其包括重複循環步驟（a ) 一（ d ) ·· (a )偶n步驟’使用過量之經活化的羧酸成份將胺 基成份醯基化， (b )驟停步驟，其中使用淸除劑去除殘留之經活化 的竣酸官能基’其中該淸除劑也用於使成長中的肽去保護 (c ) 一或多次水性萃取，及 任意地’ （d )在一或多次水性萃取後，各別的去保護 步驟， 其特徵是此方法包括至少一個步驟（b )，稱爲步驟 (b / )，其中含自由態陰離子或潛在陰離子之胺作爲殘 留之經活化的羧酸官能基之淸除劑使用。 2 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（a )中，經活化的羧酸成份係經由令羧酸成份、偶合添加劑 和偶合試劑反應而製得，及其中使用的試劑之莫耳量在遞 減的順序下是： 羧酸成份，偶合添加劑 > 偶合試劑 > 胺基成份。 3 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（a )中使用預先活化的羧酸成份。 4 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（ b /)中使用含潛在陰離子之胺作爲淸除劑。 5 .根據申請專利範圍第4項之方法，其中在淸除用 的胺中之潛在陰離子帶有暫時性保護基，其可在連接至成 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

   本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） - 21 - 1247012 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2 長中的肽之任何永久性保護基存在下選擇性地去除。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 6 .根據申請專利範圍第4或5項之方法，其中在淸 除用的胺中之潛在陰離子帶有暫時性保護基，其顯示具有 與存在於成長中的肽的N -末端之暫時性保護基類似之不 穩定性。 7 ·根據申請專利範圍第5項之方法，其中暫時性保 護基是可氫解去除的基，而永久性保護基是可酸解去除的 基。 8 .根據申請專利範圍第7項之方法，其中暫時性保 護基是苄基型。 9 ·根據申請專利範圍第4項之方法，其中淸除劑是 含一個自由態陰離子或潛在陰離子之一級胺。 1 0 .根據申請專利範圍第9項之方法，其中一級胺 是C -末端經保護的胺基酸衍生物。 1 1 ·根據申請專利範圍第1 0項之方法，其中胺基 酸是/3 -胺基丙酸或其衍生物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 2 .根據申請專利範圍第1 1項之方法，其中淸除 劑是/5 -胺基丙酸苄酯或其鹽類。 1 3 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中使用含 一個自由態或潛在陰離子之硫醇代替含一個自由態或潛在 陰離子之胺。 1 4 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中此方法 包括一或多次循環，其中在步驟（b )中使用多元胺作爲 淸除劑。 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -22- 1247012 A8 ， B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 5 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中此方法 包括一或多次循環，其中在步驟（b )中沒有進行去保護 且後續步驟（c )依序包括鹼性、酸性及鹼性萃取。 1 6 ·根據申請專利範圍第1 5項之方法，其中萃取 是在氯化鈉或硝酸鉀存在下進行。 1 7 ·根據申請專利範圍第1 5項之方法，其包括後 續步驟（d )，其包括去保護及依序的鹼性及中性萃取。 1 8 .根據申請專利範圍第1 7項之方法，其中萃取 是在氯化鈉或硝酸鉀存在下進行。 1 9 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其包括一或 多次循Ϊ5 5其中在步驟（b )中進彳了驟停及去保護作用， 且後續步驟（c )依序包括鹼性及中性萃取。 2 0 .根據申請專利範圍第1 9項之方法，其中萃取 是在氯化鈉或硝酸鉀存在下進行。 2 1 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中最後_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 次循環中，在步驟（a )中，羧酸成份之保護基顯示具有 有與成長中的肽之永久性保護基類似的不穩定性，且在步 驟（b )中之淸除劑是多元胺。 2 2 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中有機溶 劑或有機溶劑混合物是乙酸乙酯或乙酸乙酯與二氯甲院& 混合物、乙酸乙酯與1 -甲基- 2 -吡咯烷酮之混合物、 乙酸乙酯與N，N -二甲基甲醯胺之混合物、或乙酸乙酉旨 與四氫呋喃之混合物。 2 3 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中此方法 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23- 1247012 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 4 是在0至5 0 °C之溫度範圍內進行。 2 4 ·根據申請專利範圍第2 3項之方法，其中此方 法是在室溫下進行。 2 5 · —種使用分離及混合方法之肽分子庫之組合式 合成的方法，其中施行根據申請專利範圍第2項之方法。 2 6 · —種肽類之自動化溶液合成的方法，其中施行 根據申請專利範圍第1項之方法。 2 7 · —種肽或肽類之混合物，其係根據申請專利範 圍第1項之方法製備。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -24-